CENTRE SCIENTIFIQUE ET POLYTECHNIQUE DE L'UNI VERSITE PARIS-NORD

LABORATOI RE DE RECHERCHES SUR LES MACROMOLECULES

THESE
presentée par

DIDIER LETOURNEUR

pour l'obtention du grade de docteur l'Université PARIS-NORD

Spécialité: Chimie
Mention: Génie BiologiQue et Médical

POL YMERES FONCTIONNELS PHOSPHORYLES .

INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES AVEC DES PROTEINES HUMAINES:
ANTICORPS ANTI-ADN • ANTIPHOSPHOLIPIDES
ET FACTEURS DE TRANSCRI PTiON

Soutenue pUbliQuement le 28 Novembre 1988 devant la commision d'examen:

Président: Mr M. JOZEFOWICZ
Examinateurs: Mmes J. JOZEFONVICZ
M.J. LARRIEU
A. MARQUET
Mrs J.M.EGL Y
D. MANSUY
F. TRON
 1

Ce travail, réalisé au Laboratoire de Recherches sur les

Macromolécules à l'Université PARIS XIII, a été dirigé par le
Professeur M. JOZEFOWICZ. Je tiens à lui exprimer ma profonde
reconnaissance pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et
conseillé tout au long de cette thèse.
J'adresse mes plus vifs remerciements à Mme J. JOZEFONVICZ
Directeur de Recherche au C.N.R.S., pour l'attention particuliè-
re qu'elle a portée à cette recherche. Je lui suis particulière-
ment reconnaissant ainsi qu'à Messieurs F. TRON, Professeur
ci' Immunologie, et J. M. EGLY, Dh:ecteur de Recherche INSERM,
d'avoir accept~ de juger ce mémoire.

J'exprime également mes remerciements respectueux à

Mesdames les Professeurs M.J. LARRIEU, A. MARQUET et à Monsieur
D. MANSUY, Directeur de Recherche au C.N.R.S., dont je suis très
honoré qu'ils aient accepté d'être membre du jury chargé
d'~xamjn~r mon travail.

Que M'idame C. DOUZON pour son enthousiasme, sa sympathie

et sans qui tcut le travail des synthèses chimiques n'aurait pu
~tre effectué, trouve ici mes chaleureux remerciements.

Je suis très reconnaissant de l'aide que m'ont apportée

les personnes du Lahoratoire d'Immunologie du Professeur J.F.
BA~H à l'Hôpital NECKER; je n'oublierai pas non plus l'impor-
tance pour ce travail du sang des anonymes patients lupiques de
CP service dinsi que ceux du Laboratoire d'Hématologie du
Professeur G. TOBELEM à l'Hôpital LARIBOISIERE. Je tiens égale-
ment à ~xprimer de sincères remerciements à toute l'équipe du
Docteur J.M. E~LY à STRASBOURG pour leur amicale collaboration.

Je souha terais que Madame V. MIGONNEY reçoive ici la

mention spéciale de remerciements que mérite notre collaboration
au cours des années écoulées. Que Mademoiselle C. FOUGNOT avec
qui j'ai débuté ma découverte des joies de la recherche,
Mesdemoiselles C. LERET et N. PRADERE-NIQUET et Messieurs D.
MULLER et A. SZUBARGA soient remerciés pour leur contribution à
ce travail. Merci aussi à tous les amis du Laboratoire pour leur
soutien quotidien.

Je ne saurais terminer sans exprimer mes plus vifs remer-

ciements à Mad.~me A. VASNIER pour avoir assuré la frappe de ce
mémoire et .li M<':msieur M. BOURBION et ses Collègues du Service de
Reprographie p.:mr la mise en forme de ce document.
 2

SOMMAIRE

Pages

INTRODUCTION 9

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 12

1 - INTRODUCTION .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

II - LE LUPUS BRYTHEMATEUX DISSEMINE CL.E.D.) . . . . . . . . . . . . . 13

11-1 - IMMUNOLOGIE........................................ 13
11-1-1 - Production d'anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
11-1-2 - Structures des anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
II-1-3- Les immunoglobulines G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

II-2 - LES MALADIES AUTO-IMMUNES.......................... 16

11-3 - CARACTERISTIQUES CLINIQUES ET IMMUNOLOG1QUES

DU L. E. D. ••..•••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
11-3-1 - Anomalies immunologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
11-3-1-1 - Les autoanticorps . . . . . . . . . . . . . . 18
a) Les anticorps antinucléaires . . . . . . . . . . . 18
a-1) Les anticorps anti-ADN . . . . . . . . . . . . 18
a-2) Dosage des anticorps anti-ADN ..... 19
a-3) Les anticorps anti-ARN . . . . . . . . . . . . 20
a-4) Les anticorps anti-histones ....... 20
a-5) Les anticorps dirigés contre des
antigènes nucléaires hydrosolubles. 21
a-6) Les anticorps anti-Ro et anti-La .. 21
b) Les anticoagulants circulants .......... 22
c) Autres autoanticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
c-l) Les anticorps antilymphocytaires .. 24
c-2) Les facteurs rhumatoïdes . . . . . . . . . . 25'
c-3) Les "faux B.W. positifs" . . . . . . . . . . 25
11-3-1-2 - Sites antigéniques et réactions
croi sées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
I1-3-1-3 - Le complément au cours du L.E.D. 27
11-3-1-4 - Anomalies de l'immunité
cellulaire.. .. .. . .. .... .•..... . 28
11-)-2 - Et.iologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
11-3-3 - Thérapeutiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
11-3-4 - Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

III - MECANISMES D'ADSORPTION DES PROTEINES SUR LES

POLYMERES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

111-1 - PRINCIPE DE L'ADSORPTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

 3

111-2 - ISOTHERME DE LANGMUIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

a) Adscrption des protéines sur un site unique.... 34
b) Adsorption des protéines sur n sites identiques
mais indépendants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
c) Adscrplion des protéines sur des sites
différents mais indépendants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

111-3 - ISOTHERME DE TEMPKIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

a) Loi d'adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
b) Interprétation par le modèle des équilibres
mult.iples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

111-4 - ISOTHERME DE FREUNDLICH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

111-5 - CONCLUSION........................................ 40

IV - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE DES PROTEINES . . . . . . . . . . . . . . . . 40

A - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE DES PROTEINES: GENERALITES ... 40

A-l - Chromatographie d'exclusion stérique . . . . . . . . . . . . 41
A-2 - Chromatographie de type hydrophobe . . . . . . . . . . . . . . 42
A-] - Chromatographie d'échange d'ions . . . . . . . . . . . . . . . . 43
A-4 - Chromatographie d'affinité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

B - SUPPORTS CHROMATOGRAPHIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
B-1 - Principaux supports . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
a) Matériaux organiques naturels et semi
synthétiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
b) Matériaux organiques synthétiques . . . . . . . . . . . . 45
c) Supports minéraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
d) Supports de diverses natures . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
B-2 - Obtention de la phase stationnaire . . . . . . . . . . . . . . 47

V - PURIFICATION DES FACTEURS DE TRANSCRIPTION . . . . . . . . . . . . 48

SYNTHESE ET CARACTERISATION 51

1 - SYNTHE SES . • . . • • • . . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 52

A - RESINES HYDROXYLEES DERIVEES DU POLY(CHLOROMETHYL

STYRF.NE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
A-1 - Polylchlorométhyl ~tyrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
A-2 - Poly(hydroxyméthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
A-3 - Polylhydroxyéthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
a) Poly(cyanométhyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
h) Poly(carboxyméthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
c) P(,ly (hydroxyéthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
A-4 - Poly(hydroxypropyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
B) Poly(diéthylmalonate de méthyle styrène) ..... 56
b) Poly(carboxyéthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
c) Pc.ly (hydroxypropyl st.yrène) .................. 57
 4

B - RESINES HYDROXYLEES DERIVEES DU POLY(CHLOROSULFONYL

STYRENE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
B-1 - PolyCchlorosulfonyJ. styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
B-2 - Poly(N-hydroxyéthyl sulfamide styrène) . . . . . . . . . . 58
B-3 - Poly(N-hydroxypropyl sulfamide styrène) . . . . . . . . . 59
B-4 - Poly(2,3-dihydroxypropyl sulfamide styrène) ..... 59

C - PHOSPHORYLATION DES POLYSTYRENES HYDROXYLES . . . . . . . . . . . 60

C-l - Phosphorylation à l'aide de l'acide phosphoreux. 60
C-2 - Phosphorylation par le dichlorophosphate de
m"so thyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
C-3 - Phnsphorylation avpc l'oxychlorure de phosphore 61

D - CONDENSATION DES BASES DES ACIDES NUCLEIQUES AVEC LE

POLYSTYRENE CHLOROMETHYLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

E - PHOSPHODIESTERS OBTENUS A PARTIR DE DERIVES DES BASES

PURIQUES ET PYRIMIDIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
E-l - Dérivés des bases des acides nucléiques . . . . . . . . . 64
a) Bases hydroxyéthylées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
b) 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthylJ-Adénine .. 65
E-2 - Condensation de bases hydroxyéthylées avec les
polystyrènes phosphorylés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
E-3 - Condensation de dérivés phosphorylés des bases
avec les polystyrènes hydroxylés . . . . . . . . . . . . . . . . 66

F - POLYSTYRENES SUBSTITUES PAR DES NUCLEOTIDES . . . . . . . . . . . 67

G - FIXATION DE COMPOSANTS DE~ PHOSPHOLIPIDES SUR LE

POLYSTYRENE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
G-l - Condensdtion de la phosphosérine sur le
polyChydroxyéthyl styrène) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
G-2 - Polystyrène substitué par la phosphocholine ..... 69
a) A partir de 2-chloro-2-oxo-dioxaphospholane .. 69
b) Avec le bromoéthyl dichlorophosphate .•....... 69

II - CARACTERISATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

TI-1 - METHODES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
a) Argentimétrie potentiométrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
b) Spectroscopie Infra-Rouge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
c) Dosage acidimétrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
d) Analyse élémentaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

II-2 - RESULTATS ET DISCUSSION..................... . . . . . . . 73

A - Les dérivés chlorés du polystyrène . . . . . . . . . . . . . 73
B - Les dérivés carboxy]iques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
C - Les dérivés hydroxylés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
a) PS-CHzOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
b) Résines hydroxylées dérivées du PS-SOzCl .... 75
c) PS-(CHz)z-OH et PS-(CH Z )3-0H . . . . . . . . . . . . . . . . 75
D - Résines phosphorylées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
E - Résin~s du type PS-CHz-B où B est une base ..... 79
 5

OH
..
1
F - Rési~es du type PS-(CH2}2-0-P-O-(CH2)2-B où B
o
est '.Ine base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
G - Résines fonctionnalisées par des nucléotides ... 80
H - Résines constitué~s d'analogues de
phospholipides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

11-3 - DISCUSSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

INTERACTIONS DES ANTICORPS ~UPIQUES (ANTI-ADN ET ANTICOAGULANTS

CIRCULANTS) AVEC LES POLYMERES FONCTIONNELS 83

1 - INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

11 - METHODES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

A - LES ANTICORPS ANTI-ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

A - 1 - P r i ne j pe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
A-2 - Influence des conditions opératoires sur le test
de FARR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
a) Cinét ique à 4°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . 85
b) Di Inti on du sérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
c) Décomplémentatinn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
n) Conservation du sérum lupique . . . . . . . . . . . . . . . . 87
A-3 - Expression des résultats en grandeurs molaires .. 87
a) Première méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
bl Méthnde thermodynamique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
A-4 - Isothermes d'adsorption des anti-ADN . . . . . . . . . . . . 91

B - LES ANTICOAGULANTS CIRCULANTS 91

B-1 - Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
a) Préparation des sérums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
b) Mesure des TCK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
c) Influence des conditions opératoires sur la
valeur du TCK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
c-l) Concentration de Ca 2 + • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 93
c-2) Décomplémentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
B-2 - Isothermes d'adsorption des ACC . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

C - LES IMMUNOGLOBULINES G NORMALES . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . 94

C-l - Immunodiffusion radiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
C-2 - Dosage protéique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
C-3 - Radioimmunoessai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

III - AFFINITE DES ANTICORPS ANTI-ADN POUR LES RESINES .... 95

111-1 - INTERACTIONS DES RESINES PHOSPHORYLEES AVEC LES

ANTI-ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

111-2 - LES RESINES SUBSTITUEES PAR LES BASES . . . . . . . . . . . . . 98

 6

IV - AFFINITE DES ANTICOAGULANTS CIRCULANTS LUPIQUES POUR

LES RESINES.. . . .. .. . . .. . . . . . . . . . .. .. .. . . . . .. .. .... . . . 101

IV-1 - INTERACTIONS DES RESINES PHOSPHORYLEES AVEC LES ACC. 102

IV-2 - INTERACTIONS DES DERIVES DU POLYSTYRENE AVEC LE

SERUM "SF" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
al Les résines phosphorylées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
h) Dérivés du polystyrène porteurs de phosphocholine
et de phosphosérine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

IV-3 - INTERACTIONS DES DERIVES DU POLYSTYRENE AVEC LE

SERUM "GE" . . . . . . • . • . • . . . • . . . . . . • . . • . . • • • • • • • . • • • . • • 105
a) Les résines phosphorylées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
b) Dérivés du polystyrène porteurs de phosphocholine
et de phosphosérine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

V - METHODE DE DOSAGE DES ANTICORPS LUPIQUES . . . . . . . . . . . . . . 108

V-l - PRINCIPE 108

V-2 - RESULTATS ET DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

VI - AFFINITE ORS IgG NO~.ES POUR LES RESINES 110

VTI - DISCUSSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

POLYSTYRENES PHOSPHORYLES EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

A HAUTE PERFORMANCE 115

T - PRINCIPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

II - RESULTATS ET DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

II-l - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE D'ECHANGE D'IONS A HAUTE

PERFORMANCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

TI-2 - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE D'AFFINITE A HAUTE

PERFORMANCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

INTERACTIONS DE DERIVES DU POLYSTYRENE

AVEC LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION 120

T _. INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
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 7

II - RESULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

lIT - CONCLUSIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

CONCLUSIONS 125

PARTIE EXPERIMENTALE 129

l - SYNTHESE ET CARACTERISATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

1-1 - REACTIFS UTILISES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

1--2 - SYNTHESES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

1-2-1 - PS-CHaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
1-2-2 - PS-CHaOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
T-2-3 - PS-CH 2 -C:;N .... 'II ..................................................... .. 131
1-2-4 - PS-CHa -COOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
1-2-5 - PS- (CHa) a -OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l.31
1-2-5'- PS- (CHa) 3 -OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
COOC a H5
1-2-6 - PS-CHa-CH( 132
COOCaHs
T-2-7 - PS- (CH2) a -COOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
I-2-8 - PS-S0 2 Cl .................................................................... .. 132
1-2-9 - PS-SOaNH-(CHa' a-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
1-2-9'- PS-S0 2 NH- (CHa) 3 -OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
1-2-9"- PS-S02NH-CHa-CHOH-CHaOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
1-2-10 - Résines phosphorylées (synthèse Cl) . . . . . . . . 133
T-2-11 - Résines phosphorylées (synthèse C2) . . . . . . . . 133
1-2-12 - Résines phosphorylées (synthèse C3) . . . . . . . . 134
1-2-13 - PS-CH 2 -B où B est une base . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
1-2-14 - Bases hydroxyéthylées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
1-2-15 - 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthylJ-Adénine. 135
1-2-16 - Condensation des bases hydroxyéthylées . . . . . 135
I-2-17 - Condensation des bases phosphorylées • . . . . . . 136
1-2-18 - Polystyrènes substitués par des nucléotides. 136
1-2-19 - Condensation de phosphosérine . . . . . . . . . . . . . . 137
1-2-20 - Condensation de phosphocholine
(synthèse G2a) •.•.••••••••••••••••••••••••• 137
1-2-7.1 - Condensation de phosphocholine
(synthèse G2b) •••..••••••••.•.••••••••••••• 138

I-1 - rARACTERISATION 138

1-4 - CONDITIONNEMENT 139

TI - ADSORPTION DES ANTICOAGULANTS CIRCULANTS . . . . . . . . . . . . . 139

A - REACTIFS UTILISES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

 8

B - MODE OPERATOIRE ••••••••.•••••••.••••••••.••••••••••••. 140

III - ADSORPTION DES ANTICORPS ANTI-ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

A - REACTIFS UTILISES ••...•.•..••••..•..•••..•••••.•••••.. 141

B - MODE OPERATOIRE ..•..••..••••.••••••••.••.••••••••••••• 142

TV - ADSORPTION D'IMMUNOGLOBl~INES NORMALES . . . . . . . . . . . . . . . 142

IV--1 - DOSAGE DES PROTE INES .•••••••••••••••••••••••••••••• 142

IV-2 - UTILISATION D'IgG RADIOMARQUEES ..•••••••••••••••••• 143

IV-3 - UTILISATION D' IgG ANTI-Fc •••••••••••••••••••••••••• 143

V - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE . . . . . . . . . . . 144

A - SOLUTIONS TAMPONS ••••••.•••••••••.•••••.•••••••••••••• 144

B - PROTEINES 145

C - PHASES STATIONNAIRF.S •••.•.•••••••••••••••••••••••••••• 145

D - APPAREILLAGE CHROMATOGRAPHIQUE ••.•••••••••...••••••••• 146

VI - FACTEURS DE TRANSCRIPTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

VI-l - CHROMATOGRAPHIE ..•••••••••••••••••••.••.••••••••••• 147

VI - 2 - ELECTROPHORESE ••.•......•.•••••••••....•••••••••••• 148

VII - PROGRAMMES DE CALCUL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150

VtI-j - CALCUL DE LA CONCENTRATION A SATURATION (LANGMUIR). 151

VII-2 - LOI DE POISSON .••••....•••.••••••••••••••••••••••• 151

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 152

 9

1NTRODUCTI ON

Le Lupus Erythémateux Disséminé (L.E.D.) est une maladie

auto-immune caractérisée par des manifestations cliniques pluri-
focales, au cours de laquelle l'organisme produit différents
types d'anticorps et tout particulièrement des anticorps anti-
ADN ; il est à noter que des anticorps anti-phospholipides sont
également fréquf~mment détectés au cours de cette affection. Les
moyens thérapeui:iques utilisés actuellement, associant échanges
plasmatiques, immunosuppresseurs et corticothérapie, diminuent
de manière globale les défenses de l'organisme. Les échanges
plasmatiques en raison de leurs inconvénients et de leurs
risques sont pratiquement abandonnés. Une alternative intéres-
sante pourrait être l'épuration plasmatique mettant en oeuvre
des immuno-adsorptions sélectives. Des recherches dans ,ce sens
ont débuté ayallt pour objectif la mise au point de supports sur
lesquels l'ADN ou la protéine A ont été couplés. Malgré des
résultats encoUloageants, l'utilisation d'antigènes d'origine
naturelle pose inévitablement de nombreux problèmes liés à la
stabilité, à l'homogénéité et au relargage de l'antigène.
En reVanChE!, des études concernant les polymères fonction-
nels ont démontré qu'il était possible de réaliser des polymères
synthétiques capables de développer des interactions spécifiques
vis-à-vis de c],asses particulières de constituants des systèmes
vivants telles que les protéases et antiprotéases, les récep-
t.eurs membranail'€'s cellulair~s et les immunoglobulines.
Dans ce contexte, nous avons entrepris la synthèse de poly-
mères fonctionnE~ls insolubles susceptibles d'interagir spécifi-
quement avec l~s anticorps du L.E.D., et de ce fait utilisables
pour l'épuratiofl plasmatique; nous avons choisi pour ce faire,
une méthode de fubstitution statistique des polymères permettant
 10

de fixer sur les chaînes macromoléculaires, les groupements chi-

miques caractéristiques de l'ADN et des phospholipides.

Nous avons dans un premier temps étudié les interactions

des polymères synthétisés avec les anticorps lupiques. D'après
les résultats ootenus, nous avons pensé que les polymères fonc-
tionnels pouvaient présenter des interactions spécifiques avec
les constituants des complexes impliqués dans la reconnaissance
et la transcription des acides nucléiques. Afin d'explorer cette
voie de recherche, nous avons retenu comme modèle les consti-
tuants du complexe de transcription de l'ARN polymérase B.
Les synthèses ayant conduit à l'obtention de polymères
dérivés du polystyrène réticulé, dotés d'excellentes propriétés
mécaniques, les polymères fonctionnels pouvaient servir à la
réalisation de phases stationnaires en Chromatographie Liquide à
Haute Performance ; dans un dernier temps nous nous sommes atta-
chés à préciser ces possibilités d'applications au fractionne-
ment de mélanges de protéines par chromatographie d'affinité et
d'échange d'ions.

Dans la suite, nous analyserons tout d'abord les données

publiées relatives :
- au Lupus Erythémateux Disséminé
- à l'adsorption des protéines sur les polymères
- aux méthodes de chromatographie liquide
- à la purification des facteurs de transcription de l'ADN.

Nous décrirons ensuite, dans un deuxième temps, les synthè-

ses des polymères fonctionnels et leur caractérisation. Nous
poursuivrons par la description de l'étude des interactions
développées entre ces
résines et les anticorps du lupus, et
discuterons les résultats.
Nous rapporterons enfin les premières utilisations des
résines synthétisées en chromatographie liquide d'échange d'ions
et d'affinité. Ddns ce dernier cas, nous décrirons les résultats
préliminaires que nous avons obtenus concernant la purification
des facteurs de coagulation non activés et des constituants du
 Il

complexe de transcription de l'ADN. Dans la partie expérimentale

présentée à la. fin de ce mémoire, sera reportée la description
détaillée des méthodes mises en oeuvre au cours de ces études.
 12

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I INTRODUCTION

Notre travail a porté sur l'élaboration de dérivés bio-

fonctionnels insolubles du polystyrène et l'étude de leurs
interactions avec des protéines notamment les immunoglobulines
autoimmunes du Lupus Erythémateux Disséminé (L.E.D.) et les
constituants du complexe de transcription de l'ARN polymérase B.
Une revue bibliographique détaillée et complète des résultats
obtenus dans ces différents domaines dépasserait largement le
cadre de ce mémoire. Au surplus, des publications récentes
analysent et présentent ces sUjets (1,2,3,4).
Dans ces conditions, nous nous bornerons à une revue
critique des articles publiés nécessaires pour comprendre et
situer notre travail.
Dans un pn~mier temps, après de brefs rappels d'immunologie,
nous rapporterons les données essentielles du Lupus Erythémateux
Disséminé (L.E.D.), qu'il s'agisse de la description clinique et
thérapeutique de cette maladie auto-immune ou de ses caractéris-
tiques immunologiques.
Dans un deuxième temps, nous rappellerons les théories
relatives à :L'adsorption des protéines à l'interface solide-
solution.
Nous poursuivrons par une discussion des méthodes
chromatographiques appliquées à la purification des protéines.
Nous décrirons enfin, un exemple de l'utilisation de ces
techniques pour la purification des facteurs de transcription de
l'ADN en raison de l'intérêt particulier que présente cette
étude dans le contexte de notre travail.
LYMPHOCYTES B LYMPHOCYTES T

fonction amplificatrica
... 1 + 1
®
~

....
4II--_fo_nC_ti_on_s_u_pp_r_es_si_ve_ C~
fonction
d'immunité
cellulaire

• ANTl6ENE •
~
~~

+ e ®e
PLASMOCYTE cQ}}

l EPITOPE

~61
COMPLEXE IMMUN
>- ANTICORPS
~e
A --<\ +
~
6e e • ey ~
IDIOTYPE

figure 1 : la réponse immunitaire

 13

II LE LUPUS ERYTHEMATEUX
DISSIMINE <L_E_D_>

11-1 - IMMUNOLOGIE

La réponse immunitaire c'est-à-dire la mise en place des

défenses d'un organisme contre toute molécule étrangère fait
intervenir différents protagonistes.
D'une part, la reconnaissance spécifique proprement dite
implique la production et l'action des anticorps, protéines
susceptibles de former avec un antigène particulier des com-
plexes immuns. Elle constitue l'acte primaire de la réponse
immunitaire spécifique en induisant l'activation du complément
par la voie classique et/ou une réponse cellulaire.
D'autre part, l'activation du complément est un médiateur
et un effecteur de la réponse immunitaire; elle peut être spé-
cifique d'un antigène déterminé ou non spécifique.

II-1-1 - PRODUCTION D'ANTICORPS

La spécificité immunologique est assurée par les cellules

lymphoïdes: lymphocytes B et T, lymphoblastes, plasmocytes.

Les lymphocytes B et T résultent de la différenciation et

de la maturation de cellules souches de la moelle osseuse.
Une cellule B présente à sa surface une IgM membranaire
qui constitue un récepteur spécifique pour un antigène donné. Le
contact du récepteur avec un épi tope spécifique, c'est-à-dire
une région précise de l'antigène, induit la transformation du
lymphocyte en plasmocyte producteur d'anticorps (Fig. 1).
Les lymphocytes T ont un rôle essentiel dans la régula-
tion des réponses immunitaires ; ils agissent soit par cytolyse
directe des cellules porteuses de l'antigène soit en coopération
 -_ .. _1-
llltigtnique Fob

=--__ Jf ____ _
intercat',..irll -

:" ~~I:i:~I _____ _

M'dilleur dei Fe

disulfure
inlr_linaires
-----
Y. et YM : Ngions VIriIbIes
c.. et c..: lWgions COftI1Mt8I

figure 2: (d'aprè~, ref.2) topologie et architecture fonctionne:'e

de la molécule d'lgG

Ig6 IgR IgM IgD IgE

, 1
; Taux, seriO,i)e ( n/l '),'1
1 - 1
1 i , 1
1 i 150 000
1 1

l1 tv1:~sserr12Sl,~~~laire 1 150 000 là 600 000 900 000 1EO 00(\ 190 00',)
' \..;1 1
l';U, )
1
1

19 5 7 S
sédimeritat iOIi 17 5
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Fl.xationauC l 0
' + +

Phacocvtes
...- 1
+

+
i 2i 1
J € i;l i - vie ( j 0 ~ r:=, ) 1 (laG ~ 7) ! 6 5 2,8
.' • 1 ~
!
+
 14

avec les macrophages, les lymphocytes B et des médiateurs

chimiques.
Il faut également mentionner l'obtention en 1975 (6)
d'anticorps monoclonaux ils sont produits par des hybridomes
qui se multiplient en culture en donnant naissance à une lignée
cellulaire ne produisant qu'une seule sorte d'anticorps.

11-1-2 - STRUCTURE DES ANTICORPS

Les anticorps sont des protéines globulaires d'o~ leur

nom générique d'Immunoglobulines (Ig). Ces protéines plasmati-
ques présentent toutes une structure générale commune
Les immunoglobulines sont constituées de quatre chaînes
polypeptidiques, deux chaînes lourdes (H pour "Heavy") et deux
chaînes légères (L pour "Light") identiques deux à deux elles
sont solidement associées par des ponts di sulfures entre résidus
cystéiques. Chaque chaîne comporte une région variable (V) et
une région constante (C) la séquence d'acides aminés de la
région variable est différente dans chaque anticorps, mais les
régions constantes sont identiques dans tous les anticorps d'une
classe donnée (Fig. 2).
Il existe deux types de chaînes légères, kappa (k) ou
lambda (À), mais une molécule d'anticorps n'en comporte qu'une
seule.
Les différentes classes d'Ig sont dénommées à partir de
la nature de la chaîne lourde qui les constitue: on distingue
ainsi par ordre de concentrations décroissantes dans le sérum
humain normal, les IgG, IgA, IgM, IgD et IgE dont les chaînes
lourdes respe'ctives sont désignées par Gamma (y), Alpha (cx), Mu
(pol, Delta (t), Epsilon (€).

Les chaînes légères sont communes aux 5 classes d'immuno-

globulines. En revanche, les chaînes lourdes diffèrent par leurs
composition, séquence et masse moléculaire. De ce fait les Ig
des différentes classes sont dotées de propriétés biologiques
particulière~ (Tableau 1).
fjgure 3 : effets de la papaïne et de 1a pepsine sur la ;)lolécu~e d'Ige, ( 2 )

papaïne +

1 Fe

pep sin epsine

...,
4 ....
.. . ","
... ~

,.'" ",,.,.
~ ~
.'~
" ~4 ,. , peptides
~~:~ "4
..

reduetion douce
..... >
.//' / .....",
 15

La comparaison des régions variables des chaînes légères

et des chaînes lourdes montre qu'il existe des zones hypervaria-
bles; la combinaison des zones hypervariables d'une chaîne
lourde et d'une chaîne légère constitue l'idiotype, c'est-à-dire
le site spécifique de reconnaissance de l'antigène.

11-1-3 - LES IMMUNOGLOBULINES G IgG

La structure des IgG a servi de modèle pour l'analyse des

caractéristiques des immunoglobulines des autres classes.
Les IgG sont des glycoprotéines de masse molaire voisine
de 150.000 grarr®es par mole présentes en moyenne à 12 grammes
par litre dans le sérum humain normal; elles constituent ainsi
plus de 80 , des immunoglobulines du sérum.

La réduction des ponts di sulfures a permis à EDELMAN (5)

de déterminer la structure des IgG : celles-ci sont constituées
par deux chaînes lourdes et deux chaînes légères de masses
respectives voisines de 50.000 et 25.000 g.mole- 1 •

La dégra.dation enzymatique par la papaïne permet de

distinguer 3 fragments
- 2 fragments identiques monovalents (Fab) de masse 45.000
g. mole- 1 ; c€!s fragments gardent l' acti vi té anticorps de l' IgG
mais du fait de leur univalence (liaison avec une seule molé-
cule d'antigène) perdent les propriétés agglutinantes de l'im-
munoglobulinE~ G,
- un fragment (Fc) qui n'a pas d'activité anticorps.
La dige~tion des IgG par la pepsine conduit à la forma-
tion d'un fragment F(ab')z divalent de masse moléculaire 100.000
g.mole- 1 ; celui-ci après réduction donne naissance à 2 frag-
ments Fab' de propriétés analogues aux Fab mais de masses légè-
rement supérieures. Au cours de la digestion par la pepsine le
Fc est dégradé en petits composés peptidiques (Figure 3).

Il est possible de distinguer 4 sous-classes d'IgG (IgG 1 ,

IgG z , IgG 3 , IgCi4, possédant des chaînes lourdes différentes

 IgG 1 IgG 2 IgG 3 IgG 4

% des IgG totales 61 31 5 3

chaînes légères (KI À) 2,4 1, 1 1,4 8
tansfert placentaire + + +
liaison avec la protéine A + + +
fixation au C1q ++ + ++
demie-vie ( jours) 21 21 7 21

TABLEAU Il : PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DISTINCTIVES

DES 4 SOUS-CLASSES D' 1gG
 16

( Y:1., Y2, Y3, y,,). Le nombre et la disposition des ponts disulfu-

res reliant les chaînes lourdes entre elles, ainsi que certaines
fonctions effectrices sont différents dans ces sous-classes
(Tableau II).

En résumé, les IgG sont formées de trois fragments. Deux

fragments univalents (Fab ou Fab'), possédant chacun le site de
reconnaissance de l'antigène situé à l'extrémité des parties
variables des chaînes légères et lourdes, sont liés au troisième
fragment nomn:.é Fc.

11-2 - LES MALADIES AUTO-IMMUNES

Dès 1897, Paul ERLICH (7) attirait l'attention sur la

possibilité pour un organisme vivant de s'autodétruire. Mais il
fallut attendre 1956 pour que E. WITEBSKY et N. ROSE (8) défi-
nissent clairement les maladies auto- immunes. Celles-ci
résultent de la sollicitation inappropriée du système immunitai-
re ou du dérèglement des organes lymphoïdes par hypo ou hyper
fonctionnement qui entraînent une production d'autoanticorps
dirigés contre des déterminants spécifiques d'un organe (coeur,
rein, foie) ou de nombreux organes (9).

Il faut cependant noter que la relation de causalité

entre la présence des autoanticorps et les manifestations
cliniques des maladies auto-immunes n'est pas toujours établie.
En effet, le!s manifestations observées peuvent découler d'une
action directe de l'autoanticorps sur un site antigénique
déterminé elles peuvent également résulter d'une réponse
indirecte de l'organisme (activation de l'immunité cellulaire,
dépôt de complexes immuns pathogènes) associée à des facteurs
endocriniens et génétiques.
TABLEAU III : CRITERES DE CLASSIFICATION DU LUPUS
ERYTHEMATEUX DISSEMINE (2,14)

Le diagnostic de lupus érythémateux disséminé peut être porté

lorsque quatre des onzes critères suivants ont été réunis de façon
simultanée ou séquentielle.

1. Erythème nasa l
2. Erythème discoïde
3. Photosensibilité
4. Ulcères bucaux
5. Arthrite non érosive touchant au moins 2 articulations
6. Sérlte ( pleurésie,péricardite )
7. Atteinte rénale ( protéinurie ou cylindrurie )
8. Atteinte neurologique ( épilepsie,troubles psycrliques )
9. Cytopénie sanguine (anémie hémolytique,leucopénie,
lymphopénie,thrombopénie )
10. Anomalies immunologiques : - cellules LE
- anticorps anti-ADN natif
- anticorps anti-Sm
-faux BW positifs
11. Facteurs antinucléaires détectés par immunofluorescence
 17

Peu de données précises sont disponibles concernant la

nature moléculaire des autoantigènes (9). Dans le cas de
maladies autoimmunes telles que le L.B.D. ou la myasthénie, il a
été proposé qu~~ des variations de la structure primaire de
protéines soient; à l'origine de l'apparition des autoanticorps
(10). Dans ces conditions la distinction du système immunitaire
entre le "soi" et le "soi modifié" pourrait être à l'origine de
certaines des mëLladies observées.

11-3 - CARACTERISTIQUES CLINIQUES ET IMMONOLOGIQUES DU L.E.D.

Le Lupus Erythémateux Disséminé (L.E.D.) est une maladie

autoimmune caractérisée par des manifestations cliniques pluri-
focales, associée à de multiples anomalies immunologiques (11) ;
elle évolue sous la forme de poussées aigu~s séparées par des
rémissions.
Cette a.ffection dont l'incidence est d'environ
8 cas/l00.000 survient dans 90 , des cas chez la femme (12). Une
éruption en ailes de papillon sur la peau du nez et des joues
(13) a donné à la maladie son nom de Lupus Erythémateux ou "Loup
rouge". Pourtant cette dénomination ne reflète pas l'étendue
réelle ni les multiples atteintes constitutives de cette mala-
die. Ainsi, le L.E.D. affecte la peau mais aussi les articula-
tions, les vaisseaux sanguins, le coeur, le cerveau et les reins
(Tableau III>.
On définit habituellement (2) le L.E.D. par l'association
de manifestations cliniques (14) à la présence d'anticorps anti-
ADN natif. En effet, il n'a pas été établi que la présence des
anticorps anti -A,DN soit directement ou exclusivement responsable
de la maladie.
 18

11-3-1 - ANOMALIES IMMUNOLOGIQUES

11-3-1-1 - Les autoanticorps

La présence de nombreux autoanticorps, et plus

particulièrement d'anticorps antinucléaires est la principale
caractéristique biologique du L.E.D .. La recherche des anticorps
antinucléaires est en effet positive dans pratiquement tous les
cas de L.E.D. en absence de traitement (15); elle n'est cepen-
dant pas spécifique et s'observe dans d'autres affections telles
que la polyarthrite rhumatoïde (16), la sclérodermie (17), le
syndrome de Sjëgren (18).

Toutefois, les anticorps réagissant avec l'ADN

natif ne sont qu'exceptionnellement mentionnés en dehors du
L.E.D. leur détection, notamment à des titres élevés lorsqu'il
existe une atteinte rénale, n'est cependant pas toujours
associée à des manifestations pathologiques.

Les anticoagulants circulants et plus générale-

ment les anticorps antiphospholipides jouent également un rôle
important dans le diagnostic de cette maladie; en effet, la
présence de manifestations hémorragiques ou thromboemboliques
conduisent à la recherche de ces anticorps dans le sérum des
patients; leur détection évoque très fréquemment un L.E.D ..

a) Les anticorps antinucléaires

a-l) Les anticorps anti-ADN

Les anticorps anti-ADN natif (double brin ou

bicaténaire) sont présents dans environ 70 , des cas de L.E.D.
"actifs" (19,20). Ils servent ainsi au diagnostic et au suivi de
l'évolution de la maladie (21,22,23).
 lM 1

figure 4: ( d'après ref. 27 ) dimensions et structures des molécules

d'igG et d'ADN

TABLEAU IV: détection des anticorps anti-ADN ( 1 )

1 ) Précipitation:
a) précipitation Quantitative
b) immunodiffusion
c) immunoélectrophorèse
2 ) Hémagglutination passive
3 ) Fixation du complément
4 ) ADN radiomarQué avec séparation de l'ADN libre par:
a) filtre millipore
b) fibre de verre
c) précipitation par du sulfate d'ammonium ( FARR )
d) rouble anticorps ( anti-Ig )
e) protéine A
f) pOlyéthylène glycol
5) Antigène immobilisé sur des phases solides et détection par:
a) immunofluorescence : 1) "DNA. spot"
2) Crit171dia II/ciliee
b) anti-Ig ( ou protéine A) radiomarQuè
c) anti-Ig couplé à une enZ'y'me ( ELISA )
 19

Il a été montré à l'aide d'anticorps monoclo-

naux (26) qu'il existe des déterminants propres à l'ADN natif et
à l'ADN dénaturé (simple brin ou monocaténaire). Dans l'ADN
double brin (Fig. 4), les bases puriques et pyrimidiques ne
semblent pas accessibles aux anticorps (27) dans ce cas,
l'armature sucre-phosphate est le seul site antigénique
possible.
Cependant, des anticorps anti-ADN dénaturé
sont également mis en évidence dans le sérum de patients
lupiques. La polyspécificité de ces anticorps, qui sont présents
dans d'autres affections rhumatismales, peut être à l'origine de
certaines des manifestations cliniques observées au cours du
Lupus ; en effet, des anticorps monoclonaux humains et/ou murins
dirigés contre l'ADN simple brin réagissent de façon croisée
avec d'autres antigènes cibles (28,29,30,31).

a-2) Dosage des anticorps anti-ADN

Les techniques de recherche des anticorps

anti-ADN sont résumées dans le tableau IV; ces procédures
varient considérablement en sensibilité, en précision ainsi
qu'avec l'origine de l'antigène. Parmi toutes ces méthodes, le
test de FARR (24) permet la détection la plus spécifique (25)
des anticorps anti-ADN.
Le test de FARR (99) consiste en une précipi-
tation par du sulfate d'ammonium à 50 , de saturation, des com-
plexes ADN/anti-ADN formés
après incubation du sérum lupique
avec de l'ADN radiomarqué ( 14e, 3H, 125 1, 32P) dans ce cas,
l'ADN non complexé par les anticorps ne précipite pas et seule-
ment 5 ' environ de l'ADN est précipité par du sérum humain
normal.

Une description détaillée du test de FARR est

reportée dans le tableau XIX. La spécificité, la reproductibili-
té du test sont liées aux conditions opératoires (24,150,151).
 NUCLEOSOME

figur-e 5 : ( d'apres ref.43 ) chaque nucléosome est formé d'un centre

comprenant deux molécules de chacune des histones suiv:3ntes : H2,A, ,
H2B, H3 et H4 ; ce centre est entouré d'ADN; l'histone H: est
extra-nue l éosom i que
 20

Cependant, par exemple, la période d'incubation à 4°C est très

variable suivant les auteurs
- L. AARDEN et coll (24,158) ne la réalisent pas
- T. PINCUS (1~1) définit des condit.ions optimales avec 24
heures à 4°C et. R. MANTHORPE et coll (150) recommandent, dans
un article consacré aux conditions de réalisation du test de
PARR, une période à 4°C supérieure à 15 heures.

a-3) Les anticorps anti-ARN

Des anticorps dirigés contre l'ARN sont très

souvent détect<~F. dans le sérum des malades lupiques (32,33)
ils sont plus Apécifiques des ARN viraux que ceux des mammifères
(2). Les reche~ches concernant une origine virale au L.E.D. sont
cependant peu ,~oncl\1ant.es (34) les anticorps anti-ARN sont, de
plus, observés dans des affpctions (35) telles que la polyar-
thrite rhumatnide, la sclérodermie, la myasthénie, le lupus
di. scoï de.

a-4) - Les anticorps antl-histones

Les histones (Fig. 5) sont des protéines

basiques liées à l'ADN et riches en Argjnine et en Lysine. Il a
été isolé 5 classes d'histones: H1' HzA, HzB, H3 et H.. Les
anticorps dirigés contre le complexe HzA-HzB s'observent dans
9":, ~ (36, 37) des cas de Lupus indui t.s chez l ' homme par la
procainamide (voir 11-3-2) on trouve dans ce cas également
des anti-ryuanosine. Dans les Lupus humains induits par
l'hydralazine, les anticorps sont des anti-HzA et H3 ; cependant
des anticorps anti-H 1 et HzB (38,39) ou HzA-HzB (20) ne sont
mis en évidence que dans un tiers des Lupus idiopathiques.
 21

a-5) - Les anticorps dirigés contre des

antigènes nucléaires hydrosolubles :

Les antigènes nucléaires hydrosolubles sont

de deux types: RNP -pour RiboNucléoProtéine- (40,41) et Sm
(42). Ces complexes constitués de ribonucléoprotéines riches en
Uridine (43) sont extraits de cellules nuclées.
Les anticorps anti-Sm ne se retrouvent qu'au
cours du Lupus (44). Malgré cette très grande spécificité, ils
ne sont cependant présents que dans 25 à 30 , des cas de L.E.D.
(20) .
Les anti-RNP sont détectés au cours du Lupus
mais également dans tous les cas de maladie du tissu conjonctif,
ainsi que dans certains cas de syndrome de Sjëgren et de
sclérodermie.

a-6) - Les anticorps anti-Ro et anti-La

Ro et La sont les noms donnés à des ribonu-

cléoprotéines cytoplasmiques ( 1) d'environ 60 000 et 50 000
g.mole- 1 respectivement qui ont d'abord été définis comme des
antigènes du Syndrome de Sjëgren SS-A et SS-B (46,47).
Les anticorps anti-Ro et anti-La sont suppo-
sés intervenir dans les structures vasculaires par le biais de
complexes immuns (46) ils créeraient ainsi des dommages tissu-
laires. On associe la présence de ces anticorps à des lésions
cutanées photosensibles ainsi qu'à des troubles cardiaques chez
le nouveau-né lupique (48).
Les anti-Ro s'observent selon les techniques
mises en oeuvre, dans 25 à 45 , des cas de L.E.D. les anti-La
sont présents uniquement chez 10 à 20' des lupiques, alors
qu'ils le sont dans plus de la moitié des cas de syndrome de
Sjëgren (13,20).
 LESION VASCULAIRE
PHASE PLASf"iATIQUE PHAs e
L
'il
,... L
AO'U
.\ ' .t. TTA' r,C
I i i I""L

voie intrinsèque voie extrinsèque

SURFACE
HMWK XII Vil plaquettes

w-"l
act ivée::.

~
2+
Ca
l....XI
t X!'a facteur
adhésion
tissulaire

l
Xia
VIla

IV+
• f\ ~ IX,2 secret ion de

Villa facteur séro:::: line

phospho 1ipides tissu;aire

X --------I~. Xa ... +
~t------- X

Ca"-'!+
h . , ..•
pllospno 11pioes

+
i i -----I~. i la - - - - - - -...~~
réversib ie

1=": asrn i noqènf Fi bii noaène

1 -
activateur du Pg
~~ irrévers jt, le

kallikrèine Fibrine

urok1na:.s soluble ~ Fibrine thrombus

!smme ---~.t
insolJtde blanc
'A. CA! LLOT~
Dégradat ion Fi E.Ri i~O-

PL.ACUETT AiRE

figure 6 : SCfiÉ'ma de la coagulat ion sanguine

 '22

b) Les anticoagulants circulants

Les anticoagulants circulants CA.C.C.) de

"type lupique" (50) sont des immunoglobulines G (51) et/ou M
(52,53) qui empêchent in vitro, par une réaction rapide, la
constitution de la prothrombinase au cours de la coagulation
sanguine (Fig. 6).
La prothrombinase est un complexe plurimolé-
culaire à action enzymatique dont la fonction est de catalyser
l'hydrolyse du facteur II (prothrombine) en facteur lIa (throm-
bine); ce complexe protéique est constitué d'une surface phos-
pholipidique sur laquelle se fixent le facteur Xa, par l'inter-
médiaire d'ions Ca 2 + et de ses résidus dicarboxyliques, et le
facteur V (Fig. 7).
L'inhibition de la formation de la prothrom-
binase résulterait de l'action antiphospholipide des A.C.C •. En
effet, il a été démontré qu'in vitro, cet anti-prothrombinase se
lie avec différents phospholipides (Fig. 8) utilisés dans les
tests de coagulation (54,55,56) une affinité spécifique pour
les phospholipides anioniques (52,57) et plus particulière~ent

pour la phosphatidylsérine (50,64) a même été déterminée.

Les A.C.C. sont mis en évidence in vitro par
un allongement des temps de coagulation (53,57), non corrigé par
l'adjonction à parties égales de plasma normal ces allonge-
ments sont donc caractéristiques de la présence d'un inhibiteur
et non d'un déficit en facteurs de coagulation (60).
Cependant, les méthodes de détection des
A.C.C. diffèrent considérablement en sensibilité et en spécifi-
cité (49,50,54,57,170). L'hétérogénéité des réactifs utilisés et
les différents protocoles employés accentuent les difficultés
rencontrées lors de la détection des A.C.C. qui semblent en
outre de spécificités diverses. On peut toutefois mentionner
parmi les techniques de coagulation, les temps partiels de
thromboplastine activée (A. P.T.T.,) et non activée CP.T.T.), les
tests d'inhibition de thromboplastine tissulaire et de neutrali-
sation plaquettaire (170).
 Facteur Il Facteur X a

III
III
III

PHOSPHOL 1PI DES

f1gure 7 : act1vat1on de la Prothromb1ne ( Il ) par le complexe Prothromb1nase

PHOSPHATIDYL -
+
-CH2-CH2-N-(CHl )l -CHOLINE

-ETHANOLAMI NE

-SERINE

-GLYCEROL

: Tête polaIre ••
, -INOSITOL

-H ACIDE PHOSPHATIDIQUE

figure B : structures chimiques des princfpau)( phospholipides

 23

In vivo, la présence d'anticoagulants circu-

lants chez les patients 1upiques est associée à un fort risque
dp thrombosps (55,58,60,61), veineuses mais aussi artérielles,
placentaire~ avec avortements spontanés éventuellement à répéti-
tion (62) e~ accidents vasculaires cérébraux (63).

Cette tendance thrombotique chez les patients

lupiques présentant un A.C.e. a été interprétée de façons diver-
ses (51,57,:1.08)
- L'action des A.C.C. sur les plaquettes sanguines est évoquée
par certains auteurs (20,55); la fixation des anticorps sur
le facteur 3 plaquettaire entraînerait une lésion des plaquet-
t,es et par suite un accroissement de leur adhésivité (59) et
du taux dA thromboxane Az re1argué (51).
- Il a été suggéré également que les tendances thrombotiques
puissent résulter d'une action sur l'endothélium (66) :
L'dction inhibitrice des A.C.e. sur la libération de
prostacycline (PGI 2 ) , puissant anti-agrégeant plaquettai-
rt';-, I~st souvent supposée (51,53,61> le mécanisme repo-
serait sur un blocage de la libération d'acide arachido-
niqu~ provenant des phospholipides de la membrane
endothéliale (57,59) cette interprétation a cependant
été yécemment réfutée (65).
L'inhibition de l'activation de la protéine C par action
directe de l'anticorps sur la thrombomoduline a été
décrite (66) la protéine C est une protéine vitamine-K
dépendallte qui est transformée en sérine-protéase par la
thrOJÎlbine (lIa) en présence d'un récepteur membranaire de
la cellule endothéliale, la thrombomoduline (69) la
protéine C activée exerce une activité anticoagulante
(67,68) par action anti Va, anti VIlla et également
proflbrinolytique. Chez les patients lupiques avec
A. C. C., les IgG trouvées par R. CARIOU et coll. (66,130)
ou les IgM par J.M. FREYSSINET (69) empêchent la thrombo-
moduline de jouer son rôle d'inhibiteur physiologique de
la coagulation.
 24

- D'autres explications à l'action thrombotique des A.C.C. ont

été avancées telles qu'un défaut de libération de l'activateur
tissulaire du plasminogène (50,57), un excès, cependant récem-
ment contredit (45), de la production de l'inhibiteur endothé-
lial de ce même activateur (50), ou une diminution de l'acti-
vité fibrinolytique par inhibition de la prékallicréine (20,
59). Un déséquilibre créé par une déficience de protacycline
allié à un excès de thromboxane Az relargué qui avait été
mentionné (51) a été mis en doute (70).

Aucune de ces explications n'est encore

pleinement satisfaisante et chacune ne peut convenir tout au
plus qu'à une partie des accidents observés; toutefois, des
mécanismes différents peuvent être responsables des thromboses
artérielles, des thromboses veineuses et des avortements
spontanés. Une identificatilon des risques thrombotiques dépend
d'une meilleure détection des anticorps concernés et d'une étude
plus précise de leur spécificité.

c) Autres autoanticorps

De nombreux autoanticorps dirigés contre les

membranes cellulaires (érythrocytes, plaquettes, granulocytes)
(21) sont fréquemment retrouvés au cours du L.E.D .. D'autres
autoanticorps non dirigés contre les antigènes nucléaires sont
aussi mentionnés; non spécifiques au Lupus, ils sont cependant
très souvent présents au cours de cette affection.

c-l) Les anticorps antilymphocytaires

Les anticorps antilymphocytaires sont obser-

vés avec une grande fréquence dans le Lupus (71). Contrairement
au cas des anticorps antilymphocytaires présents après
transfusion, grossesse ou greffe d'organes, ces anticorps
lupiques ont une lymphocytotoxicité plus élevée à 150C qu'à 370C
(2) en présence des protéines du complément.
 25

Ces anticorps semblent atteindre préféren-

tiellement les lymphocytes T (2). Ce mécanisme d'action peut
êt.re dO. à une r.éaction croif-ée entre des motifs communs à l'ADN
et à la membrane des lymphocytes, comme cela a été montré à
l'aide d'anticorps monoclonaux humains anti-ADN (72).

c-2) Les facteurs rhumato~des

Dans plus du tiers des cas de L.E.D. (2) on

détecte par la réaction de WAALER-ROSE ou par la technique au
latex de SINGER et PLOTZ (12) des facteurs rhumato~des.

Les facteurs rhumato~des sont des anticorps

anti-immunoglobulines G, dont les plus courants sont des
anticorps IgM anti-IgG réagissant avec le fragment Fc des IgG ;
ces anticorps, qui sont également présents dans la majorité des
cas de polyarthrite rhumato~de (12), sont retrouvés au sein des
cryoglobulines, Une telle réponse auto-immune peut être à
l'origine de l'apparition des complexes immuns circulants.

c-3) Les "faux B.W. positifs"

La réaction de Bordet-Wassermann utilisée

dans la recherche des anticorps antisyphilitiques résulte de la
fixation des facteurs du complément sur des extraits alcooliques
de divers organes dont le coeur ; la nature phospholipidique de
ces extraits leur a valu le nom de cardiolipine (2).

Cette réaction peut être positive dans le cas

de patients atteints de L.E.D. car, des anticorps "anti-cardio-
lipine" peuvent apparaître précocement au cours de cette
maladie ces anticorps se distinguent de ceux observés dans la
syphilis par la négativité du test d'immobilisation des tréponè-
mes de Nelson (2) c'est souvent un "faux B.W. positif" qui
attire l'attention sur la possibilité d'un L.E.D. (2).
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Il

dONA Cardialipin Pllasphalid,1 Phaspllalidic Pllaspha/id" Pl/aspha/id" Pllaspl/aNd,1

61,c"al Ac,d [/llanalamint Clla/int Strint

figure 9 : ( d'après ref. 28 ) comparaison des structures chtmiques

de l'ADN et des phospholipides
 26

Cependant, il est possible que la détection

d'anticorps alticardiolipine résulte d'une réaction croisée des
anticorps dirLgés contre l'ADN simple brin avec la cardiolipine
(voir 11-3-1-2) une corrélation a en effet été établie entre
le taux d'an':i-cardiolipine dans le sérum de patients lupiques
et le titre d'anticorps anti-ADN dénaturé (50) ; il a été montré
également que des anticorps monoclonaux anti-ADN monocaténaire
réagissaient avec la cardiolipine (28,29) ; il semble ainsi que
les anticorps anticardiolipine et les anti-ADN simple brin
possèdent des idiotypes communs (31,73).

Toutefois, les anticorps anticardiolipine

purifiés par E.N. HARRIS et coll. (53) se fixent aux phospholi-
pides anioniqlles mais pas à l'ADN dénaturé. Plus récemment,
J. C. EDBERG ;~t R. P. TAYLOR (74), ainsi que R. T. SMEENK et coll.
(86) en util:~sant repecti vement des anti-ADN polyclonaux et 55
anticorps ant.~ -ADN monoclonaux, n'ont mis en évidence que très
peu de réactions croisées avec la cardiolipine.

11-3-1-2 - Sites antigéniques et réactions

croisées

Des anticorps anti-ADN monoclonaux humains (29,

85) et murins (28,30) présentent de multiples réactions croisées
avec les polyrLucléotides et les phospholipides ainsi qu'une lar-
ge diversité j.diotypique (75).
LAFER et coll. (28) ont attiré l'attention sur
la similitude des structures chimiques de l'ADN et des phospho-
lipides (Fig. 9); ils suggèrent qu'un espacement régulier de
groupes phosphate, présent en particulier dans l'ADN comme dans
la cardiolipine, constitue l'épitope de ces anticorps; la
diversité des manifestations cliniques serait ainsi attribuée à
la polyspécificité des anticorps lupiques qui se complexeraient
à des molécules très variées.
 27

Il a été démontré de même, que des anticorps lu-

piques monoclonaux anti-cardiolipine (31,73) et anticoagulant
circulant (76) possèdent des propriétés polyspécifiques.

Plus récemment, R.S. SCHWARTZ et B.D. STOLLAR

ont établi que les anticorps anti-ADN monoclonaux se fixent
également sur df~s protéines du cytosquelette (21,77) et sur des
bactéries (78).
Les anticorps du Lupus semblent donc reconnaître
comme cible anti9énique des éléments contenus dans les membranes
cellulaires des bactéries ou des protéines de surfaces cellulai-
res (79,80,81). L. JACOB et coll. indiquent qu'une protéine
membranaire altérée partage des épitopes commun avec l'ADN
natif cette protéine est immunogène (82), contrairement à
l'ADN double brir" (83); de plus, les 19G éluées des reins de
souris lupiques reconnaissent spécifiquement cette protéine
(84): ces résultats suggèrent le rÔle pathogène de ce type de
protéines dans le L.E.D. (161).
Il faut également mentionner qu'une mutation
d'un seul acide aminé a transformé un anticorps antibactérie
(87) en une immunoglobuline réagissant avec l'ADN (88).

De plus amples informations sur les structures

moléculaires reconnues par les anticorps lupiques permettront de
préciser si de tels composés, et non l'ADN, peuvent engendrer
une réponse autoimmune. En particulier, une analyse précise des
spécificités des anticorps lupiques, aussi bien monoclonaux que
polyclonaux (22,89) devra être effectuée en association avec
l'étude de leur éventuel rÔle pathogène.

11-3-1-3 - Le complément au cours du L.E.D.

Le complément est un ensemble de protéines

plasmatiques et d;~ récepteurs cellulaires ; i l est impliqué dans
la défense contre l'infection, la reconnaissance des surfaces
 28

étrangères, le m~~tabolisme des complexes antigène-anticorps et

la régulation de la réponse immunitaire (90).

Au cours du L.E.D., le taux de complément

sérique est souvünt diminué (23) surtout dans les formes actives
avec atteintes rénales (91) cette hypocomplémentémie est
vraisemblablement: due à la consommation du complément par des
complexes immuns (92), d'autant que la présence de ceux-ci dans
le sérum (93), la peau et les reins est fréquemment détectée
(94) .
On ne peut cependant affirmer que les anomalies
du complément n€~ soit qu'une conséquence de la maladie. En
effets des déficits génétiques des composants du complément,
tels que les C1r, C1s, C1q, C2 et C4 (2) sont également associés
au L.E.D. ces déficits, souvent héréditaires, associés à un
gène de la réponse immune pourraient alors représenter une cause
de la survenue du syndrome lupique ces anomalies du complément
peuvent en particulier conduire à des pathologies infectieuses,
notamment virales; l'absence des composants du complément
nécessaires à la solubilisation des complexes immuns permettrait
alors la persistance d'un agent viral dans l'organisme; cette
rupture dans l'équilibre immunologique pourrait ensuite faire
évoluer les patients génétiquement "prédisposés" vers la maladie
auto-immune.

11-3-1-4 - Anomalies de l'immunité cellulaire

Les anomalies immunologiques observées dans le

cadre du L.E.D. concernent à un degré moindre l'immunité cellu-
laire. Des étudeE. nombreuses et contradictoires ont été consa-
crées aux sous-pe.pulations de cellules T (2,95) une diminution
de l'activité des cellules K, un déficit en cellules T8+ (qui
incluent les cell.ules T suppressives) sont ainsi signalés.

Les données actuelles ne permettent pas d'affir-

mer de façon définitive l'existence dans le L.E.D. humain d'une
TABLE.A,U V : FACTEURS ETIOLOGIQUES DU LUPUS
ERYTHEMATEUX DISSEt-"lINE ( 2 )

FACTEURS IMMUNOLOGIQUES :
Anomalies des cellules souches B et T
Déficit des cellules T suppressives
Hyperactivité intrinsèque des cellules B
Déficit fonctionnel de l'épithélium thymique
Déficit de certains facteur'5- du complément
Anoma 1ies du récepteur pour Je C3b ( CR3 )
Anticorps ant i-idiotypiques
FACTEURS ENDOCR 1N1ENS :
Sexe-Grossesse
Hydroxylat ion des œstrogères
FACTEURS DE L'ENVIRONNEMENT:
Virus à ARN de type C
Rayons UV
Médicaments inducteurs de lupus
AUTRES FACTEURS:
Défaut de réparation de J'A[:N
 29

carence des cellules T analogue à celle pourtant démontré chez

les souris "NZB" spontanément auto-immunes (2).

II-3-2 - HTIOLOGIE

Les raisolls de la formation d'autoanticorps dans le cadre

du L.E.D. ne son: pas connues; on ne peut que constater l'in-
tervention simuli:anée de facteurs génétiques, hormonaux et immu-
nologiques (Tablt~au V).

La prise de certains médicaments peut aussi induire un

syndrome biologique (anti-histones, anti-ADN) et même clinique
du Lupus (37,96,~17) la procaïnamide, l'hydralazine, l'isonia-
zide (36), la D-pénicillamine (100), la chlorpromazine sont ceux
pour lesquels la survenue d'un Lupus, nommé iatrogène, est la
mieux établie.
A nouveau, de nombreuses hypothèses (27) sont évoquées
pour expliquer :.'apparition d'un Lupus induit: déficit en
cellules T supprE~ssives, hyperactivité des cellules B, modifica-
tions chimiques E~t physiques de l'ADN et des nucléoprotéines ;
il faut toutefois remarquer la similitude des structures
chimiques entre les bases puriques et pyrimidiques et, les
médicaments inducteurs (Fig. 10). Le médicament pourrait servir
d'haptène et induire la production d'anticorps réagissant de
façon croisée aVE~C des antigènes nucléaires.

II-3-3 - ']'HERAPEUTIQUES

Devant la pluralité des manifestations cliniques et

biologiques, plusieurs types de traitements sont proposés
(2,11)
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (aspirine) et les
antipaludéens de synthèse (hydroxychloroquine) constituent le
premier palier thérapeutique ; ils sont utilisés dans les mani-
 .. . .. . . . .

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...... : ,':'.':

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. . ... . ....,...'...
. . ,. ..
.. ..
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flgure 10: comparaison des structures chimiques entre les bases

puriques et pyrimidiques et l'hydralazine et l'isoniazide
 30

festations articulaires et cutanées ainsi qu'entre les

"poussées" de la maladie toutefois, ces traitements sont res-
ponsables d'effets secondaires: intolérance digestive, rénale,
hépatique et problèmes ophtalmologiques.
Les corticoïdes (prednisone) représentent souvent un
traitement efficace contre le L.E.D. avec atteintes rénales,
hématologiques et du système nerveux central (101) cette
thérapie d'une grande toxicité entraîne à long terme des effets
secondaires graves : immunosuppression qui agrave les infections
fréquentes (une des principales causes de décès), ostéonécrose
aseptique, hypertension.
Les immunosuppresseurs (azathioprine et cyclophosphamide)
associés aux corticoïdes, ne sont utilisés qu'en cas d'atteintes
vasculaires graves (148) l'utilisation de cette thérapie immu-
nosuppressive est cependant controversée (11) en effet, pour
le cyclophosphamide viennent s'ajouter aux effets secondaires
des corticoïdes, des cystites hémorragiques et des risques onco-
géniques (101).
Les plasmaphérèses sont un recours thérapeutique dans les
formes aiguës très évolutives (102,103). Bien que l'efficacité
de l'échange plasmatique (103) ou de l'immunoadsorption extra-
corporelle (104,105) ne soit pas encore démontrée (106), ces
techniques associées à un traitement immunosuppresseur (103,104,
105) représentent une alternative intéressante.

L'évolution à long terme du L.E.D. est en fait, extrême-

ment variable; le pronostic dépend surtout de la gravité des
atteintes viscérales, notamment neurologiques (107) et rénales
(148). Le choix des thérapeutiques à suivre est évidemment
difficile dans une maladie mal définie dont l'étiologie demeure
inconnue. Une meilleure corrélation entre les résultats des
tests immunologiques et les données cliniques devrait permettre
d'orienter le protocole des traitements de façon plus précise.
 31

11-3-4 - CONCLUSIONS

Le Lupus Erythémateux Disséminé est le prototype des

maladies auto-immunes ; la symbiose fragile des divers éléments
qui réagissent les uns avec les autres -cellules B, T,
anticorps, composants du complément- a été déréglée sans que
la(ou les) cause(s) soit(ent) connue(s).
Les anticorps peuvent être directement responsables de
manifestations pathologiques (antihématies, antiplaquettes), in-
tervenir dans la formation de complexes immuns et agir contre
des organes présentant des sites antigéniques communs avec
l'ADN. On assiste ainsi à la plurifocalisation des manifesta-
tions cliniques et à la difficulté de définir cette maladie (14)

Du point de vue biologique, les anticorps anti-ADN natif

et les anti-Sm, la présence d'un anticoagulant circulant et, à
un moindre degré, d'anticorps anti-Ro sont de première importan-
ce dans l'établissement du diagnostic du L.E.D. cependant
les trois derniers ne se retrouvent que dans 20 à 30 t des cas
de Lupus (20). On accordera également une importance aux anti-
corps anti-histone dans le cas des Lupus induits par des
médicaments.

Le mode d'action des autoanticorps lupiques et la

relation avec les manifestations cliniques sont insuffisamment
élucidés aUjourd'hui pour permettre de répondre aux questions
qui restent posées telles que celles relatives :
- au processus de stimulation des gènes de la région variable
des IgG dans le L. E. D. (88),
- à la nature de la régulation de la production d'autoanticorps
(109) et en particulier à son contrôle par une expression
anti-idiotypique (110,111,197).
Une meilleure connaissance de la maladie et par consé-
quence de son contrôle nécessitera au préalable, des informa-
tions sur les mécanismes d'action pathogène de populations
d'anticorps lupiques ayant des spécificités bien caractérisées.
 32

III MECANISMES DPADSORPTION

DES PROTEINES SUR LES POLYMERES

111-1 - PRINCIPE DE L·ADSORPTION

L'adsorption des protéines est un processus inéluctable

qui se réalise dès qu'un matériau synthétique est en contact
avec un milieu protéique tel que le sang (112).

Comme tout phénomène naturel, l'adsorption des protéines

sur une surface peut être considérée d'un point de vue cinétique
et thermodynamique. Dans ce dernier cas, le processus d'adsorp-
tion s'analyse par des variations ~G d'énergie libre, ~H d'en-
thalpie et ~S d'entropie qui se produisent au cours de la trans-
formation. La variation d'énergie libre en fonction de la
température T permet de relier ces trois grandeurs suivant les
relations :
~G = ~H - T ~S

d ~G
d'où =- ~S
dT

d ~G/T - ~H
et =
dT T2

Dans le cas de l'adsorption de protéines sur des

polymères, le changement de conformation de la protéine favorise
généralement une augmentation de l'entropie (~S>O), tandis que
la valeur de 6G est toujours négative et celle de ~H positive
(adsorption endothermique) ou négative (exothermique).
Ces grandeurs thermodynamiques dépendent de beaucoup de
paramètres liés à la nature de la protéine (m~sse moléculaire,
 33

taille, géométrie du site d'interaction), à la nature des

interactions développées à l'interface polymère-protéine (forces
de Van der Waals et électrostatiques, liaisons hydrogènes et
hydrophobes) et aux conditions physicochimiques (pH, force
ionique, température, cinétique).

Différentes lois régissant l'adsorption des protéines

ont été proposées (114) par Langmuir, Tempkin et Freundlich pour
rendre compte des observations expérimentales. Nous analyserons
ces lois ainsi que leur interprétation au niveau moléculaire.
Le paramètre pris en compte dans les différents modèles
-
d'équilibre d'adsorption des protéines est souvent le rapport v
du nombre de moles de protéines adsorbées au nombre total de
moles de sites d'adsorption présents à la surface du polymère
(3) la concentration en sites est exprimée en densité de sites
c'est-à-dire en nombre de moles par unité de volume ou de masse
du support. Le nombre total de sites (n) correspond en fait à la
valeur maximale de v; on peut alors exprimer la fraction de
surface recouverte, 9, par l'expression V = n9 on a ainsi la

V 9
relation = 9 représente le rapport du nombre de sites
n-v 1-9

occupés par la protéine au nombre total de sites que peut occu-

per cette protéine; ces différentes valeurs sont obtenues
expérimentalement par le tracé des isothermes d'adsorption.

111-2 - ISOTHERME DE LANGMUIR

La théorie de LANGMUIR établie dans le cas de l'adsorp-

tion des gaz, peut être également appliquée à l'adsorption de
protéines en solution avec les hypothèses suivantes
- la substance adsorbée forme une monocouche sur la surface,
- l'adsorption implique une seule molécule adsorbée par site du
matériau
 34

- un seul type de site d'adsorption est présent à la surface

(surface homogène)
- l'adsorption d'une molécule de protéine n'est pas influencée
par l'adsorption des autres molécules (pas d'effet coopéra-
tif) ; elle est donc indépendante de la fraction de la surface
recouverte par la protéine.

a) Adsor.ption des protéines sur un site unique

L'adsorption peut être symbolisée par l'équilibre

S + P ~ s-P
où S représente les sites d'adsorption présents à la surface
P la protéine libre en solution
et S-P les sites d'adsorption occupés par une protéine.
Dans le cas simple 00 une protéine (P) se lie de
façon réversible avec un site (S) et où la solution de protéine
est suffisamment. diluée, la 101 de Langmuir, par analogie avec
la loi d'action de masse, s'exprime par:

[S-PJ - llG
.- exp ( - - - =K
(s] :x (P] RT

avec R constante des gaz parfaits (1,987 cal/mol)

( P] la concentration molaire à l'équilibre de la
protéine en solution
(S] et rS-p] les densités respectives des sites libres
et occupés
K la constante d'affinité de la protéine pour le
matériau, exprimée en litre par mole (M-1).

On obtient ainsi une relation entre la concentration

de protéine libre [Pl, la constante d'affinité K, et la fraction
de surface recouverte S(v= e avec n=1) :

K[PJ
s = Equation 1
1 + K(PJ
 Protéine liée

8 /
1-8

Proteine libre
Protéine initiale

C l concentration en proteine initiale

rl concentration en protéine liée

9 = r l' r sat Fraction de surface recouverte

figure 11 : Isotherme d'adsorption de type Langmuir

 35

Cette ~qu4tion péut encore J'éorire sous la forme

e
li!! tHPJ E'lU& t.1 on 2
1-9

Dans le Gas où l'adsorption obéit à la loi de

LANGMUIR, l'~xplo1tation de l'jsothérme d'adsorption (Fig. 11)
obt~nu~ pour un~ ooncentration fixe de polym~re en suspension,
p~rmet de calculer la constante d'afflnit'; celle-ci Qst en
.flet la. pentl* dt!! lA droite du diagramme repr4hentant la varia-
t.lon ch~ 9/1-$ '* f(CPJ) (Fig. 11). La valeur de e tut égale,
pour ch4que conc~ntration de polymère en suspension dans la
solution de prat'ine, et pour chaque concentration initialement
Introduite (Cl) de la protéine dans le système, au rapport
r1/rsI\t (Fig. 11>.
Si le plateau de saturation ne peut être atteint
exrérimentalement, on peut tout~foi. calculer par extrapolation
1& vAleur de la oonoentration en protéine lié. obtenue ~

En effet, d'apr •• l'équation 1

K •

Commà K et r.at .ont dei oonltante. (pour une lurlace

donn".), • ehaque oonoentration de protéine libre CPJ! oorrea-
pond Ufi8 valeur de cone.ntr.tion en protéine liée r 1 J . l'aide
d·\lh~ autre ooncentration en protéine libre CPl, (j'l) on a la
r~lAtlon .u1vante 1

rl 1 • r1 j
<
(CP1 i -CPJ.'
J
*
r.at Iii
'TT
 n SITES IDENTIQUES fT INDEPENDANTS 1 SITE UNIQUE DE FIXATION
-
U == n8
-
U-8
-
U 'F-'-I.-----
-
U~ _ _ __
ü_ nK.P -
U= K.P
I+K.P I+K.P
P P
isotherme

1
1lnk ~"",",--lIK

I/P
.-1+ -
1 1
K.P
if
I/P
double inuerse

- -
~=K.P U
--=- = K.P
n-U l-U
I.angmuir

-U u
- P p
R- nK -KÜ : == K- KÜ
P
Ü
n Stettherd
-
ln it
n-U Ln
....IL
1-U
- - Ln K
Ln --'l.= Ln --IL - Ln K + Ln P
n-U ln K + Ln. P Ln P 1-0

TABLEAU VI : représentations mathématiques et graphiques

de l'adsorption selon une loi de type Langmuir
 36

la valeur extrapolée de r t est ainsi calculée (par ordinateur)

sa
à l'aide de tous les couples de points expérimentaux.

h) Adsorption des protéines sur n sites identiques mais

indépendants

Si le polymère dispose de n sites identiques de fixa-

tion de la prot~ine et que les sites n'interagissent pas entre
eux, on a la relation suivante S + iP ~ S-P. avec osisn et
l
donc (11.5)
- nK[PJ
Equation 3
" = l+K[PJ

On obtient à nouveau l'équation 2 car

e
= K[PJ =
n- 'V 1-e

A titre d'exemple, la Protéine Réactive C (C.R.P.)

humaine, protéine de la réaction inflammatoire est constituée de
5 sous-unités identiques ; chaque unité possède un site de liai-
son calcium-dépendant pour les esters phosphoriques (116,117).
Différentes transformations mathématiques et repré-
sentations graphiques (3) des isothermes de Langmuir permettent
d'obtenir les valeurs de K et de n; elles sont reportées dans
le tableau VI. En exprimant les relations à l'aide de la frac-
tion de surface recouverte e, certaines représentations ne
nécessitent pas le calcul du nombre de sites de liaisons n.

c) Adsorption des protéines sur des sites différents

mais indépendants

Un polymère peut aussi avoir plusieurs (n), sites

différents de fixation pour une même protéine; la théorie des
- 1 (PI
u
2 sites de fixation
différents mals
Indépendants

-
u
figure 12 : représentation de Scatchard
 37

équiljbres multiples permet d'ét~ndre le cas h) afin d'obtenir

)a relation (3,118)

n. K.[P]
" __ r ~ J. Equation 4
i 1 + Ki [P]

Dans le cas de 2 sit~s de fixations différents, n1,

K1 , n2 ~t K2 sont obtenus à l'aide d'une représentation de
SCATCHARD (115) (Fjg. 12). Les :sites de haute affinité détermi-
nent l'adsorption pour les faibles concentrations initiales en
protéine alors que l'influence des sites de plus faibl~ affinité
est déterminante pour des valeurs élevées de la concentration
lni tiale.
G.D. GRIFFITHS et coll. (119) décrivent deux popula-
tions distinctes d'anticorps anti-ADN simple brin dits de
"haute" et de "faible" affinité; cependant l'équivalence entre
l'interaction d'une protéine p0ssédant n sites de fixation au
polymère et un polymère disposant de n sites d'adsorption pour
une protéine, permet également d'interpréter le cas des anti-ADN
comme une seule populatIon d'anticorps reconnaIssant 2 types de
sites présents sur l'ADN.

111-3 - ISOTHERME DE TEMPKIN

La loi de TEMPKIN (114) est une modification de l'équa-

tion de LANGMUIR proposée pour les cas oQ l'adsorption des
protéines à la surface des matériaux est coopérative. Elle
résulte de la prise en compte d'une enthalpie de formation (âH >
f
du ~omplexe site-protéine qui décroît linéairement avec la frac-
tion de surface recouverte CS> :
ainsi âH
f
= âHo (l - aS>
La décroissance de l'enthalpie liée à l'adsorption peut
être interprétée en termes d'hétérogénéité de surface et/ou de
répulsion latérale entEe les espèces adsorbées.
 B

1- e

1- ---------------------------- KT (Templcin)

(Pl

figure. 13 :détermination de la constante

d'affinité KT
 38

a) Loi d'adsorption

La loi de TEMPKIN permet d'écrire

-~Gf e
exp (----) . CP] = Equation 5
RT

<x9~H

RT
où KT = K . e

e <x9 MI e
On a ainsi Ln (---) = Ln K + Ln P + or Ln(--)
1-9 RT 1-9

devient négligeable quand le recouvrement est voisin de la

moitié de la surface (9 : 1/2) et donc

-RT
9 1/ 2 = . Ln(K. P) Equation 6
<x~H

9
La variation de en fonction de la concentra-
1-9

en protéine libre CP] est représentée sur la figure 13. On

détermine une valeur de KT (KT = f(9» comme la pente de la
tangente à la courbe pour 9 = 1/2.

b) Interprétation par le modèle des équilibres multiples

L'adsorption de type TEMPKIN peut être analysée par

la présence sur un polymère (ou sur la protéine) de n sites
identiques mais non indépendants; dans ce cas la fixation de
la première protéine modifie l'adsorption de la deuxième et ceci
jusqu'à ce que n protéines soient fixées. Cette coopérativité
favorise (coopération positive) ou gène la fixation des protéi-
nes (coopération négative) (3) ; le premier cas peut s'expliquer
 e
-u 1-8
n= 4

",
"
"
"
,/
4 sites indépendants

".
[Pl
" 4 sites non indépendants

n= t

PROTEINE INTRODUITE -Ln K Ln [Pl

n

CD
figure t 4: adsorption sur n sites identiques mais non indépendants
 39

par une modification de la surface liée à une réorientation

spatiale des sites de fixation; la coopération négative
s'interprète en particulier comme le résultat d'encombrement
stérique ou de répulsion latérale entre les espèces adsorbées.

On considère ainsi l'équilibre

n P + S ~ P-s n avec

v = (3,120) Equation 7
1 + KCP]n

Ce mécanisme coopératif correspond à une courbe

sigmoïde lors de la représentation de l'isotherme (Fig. 14A). On
détermine les valeurs de K et de n par une représentation de
HILL (Fig. 14B, 14C): en effet l'équation 7 peut encore
s'écrire:

8 v V
= = kCP]n et ainsi Ln(---) = Ln K + n LnlPI
1-8 n-V n-v

III-4 - ISOTHERME DE FREUNDLICH

L'équation de FREUNDLICH (114), originellement empiri-

que, s'écrit sous la forme

e = K.CP]1/n Equation 8

où n est une constante généralement supérieure à 1 (121).

On peut alors également écrire Ln e = Ln K + 1/n LnCP] ce qui
permet de calculer la valeur de la constante K en traçant
Ln 8 = f<LnCP]).
 40

Cette loi peut être interprétée par une décroissance

exponentielle de l'enthalpie de formation du complexe en fonc-
= -6H log e);
tion de la surface recouverte par la protéine (6H
f
la diminution de l'énergie traduit un processus d'adsorption
hétérogène (3,121) plutôt qu'une action de forces répulsives
entre les protéines.

111-5 - CONCLUSION

Au terme de cette revue rapide des lois d'adsorption, il

est intéressant de noter que l'adsorption des protéines obéit en
général aux lois de LANGMUIR (121). Ce fait peut s'interpréter
en considérant, ce que confirment les études cinétiques, que
l'adsorption des protéines est dans une première étape un
processus réversible sous contrôle thermodynamique; l'interac-
tion de la protéine dans sa configuration native avec le
polymère serait déterminante pour l'adsorption initiale de la
protéine. Les étapes ultérieures, irréversibles, concerneraient
le changement de conformation de la protéine adsorbée; un pro-
cessus cinétique s'exercerait alors pour la désorption de la
première couche monomoléculaire de protéines adsorbées.

IV CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
DES PROTEINES

A - CBROMATOORAPHIE LIQUIDE DES PROTEINES: GENERALITES

 41

La chromatographie liquide, déjà utilisée par le botaniste

russe TSWETT en 1903, est devenue un outil performant pour
l'analyse et le fractionnement de mélanges de macromolécules
d'origine biologique.
La séparation est toujours effectuée par un échange entre
une phase stationnaire et une phase mobile. La caractéristique
majeure des systèmes chromatographiques classiques est cependant
la faible résistance mécanique de la phase stationnaire qui ne
permet la réalisation des fractionnements qu'avec des débits
faibles.
Vers 1970, la Chromatographie Liquide Haute Performance
<C.L.H.P.) a fait son apparition, permettant un gain de temps,
de résolution et de rendement par accélération des échanges
entre les deux phases. L'augmentation de la surface réactive de
la phase stationnaire et de sa résistance mécanique ont permis
l'utilisation des différents modes de Chromatographie Liquide
tout d'abord sous Haute Pression les progrès considérables
réalisés dans l'élaboration des supports chromatographiques
actuels permettent à la C.L.H.P. (ou "HPLC" pour "High Perfor-
mance Liquid Chromatography") d'occuper une place privilégiée
dans le fractionnement et l'analyse des mélanges de protéines.

Généralement, on peut distinguer quatre types de chromato-

graphie liquide selon les mécanismes d'interaction entre la
phase mobile et la phase stationnaire exclusion stérique,
hydrophobe, échange d'ions et affinité.

A-l - CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION STERIQUE

La chromatographie d'exclusion stérique (123) est aussi

nommée Chromatographie par Perméation de Gel (G.P.C.) elle
permet la séparation des macromolécules par élution dans l'ordre
inverse de leur taille, selon qu'elles pénètrent plus ou moins
dans les pores de la phase stationnaire.
Les molécules ayant un volume hydrodynamique suffisamment
petit pour pénétrer dans la totalité des pores du gel seront
masse
molaire
( log)

6
10

5
10
/)$/'. .

exclusion 0·$tJt·
lOt;
M
$(j1.
4 $et·
10 11;$ perméatl0n
totale

+
3
10
volume

Vo Vt Vc
..
d'élution

IVe
l

Vc : Volume total de la colonne vide

Vo: Volume d'élution des macromolécules de très grande taille
ou volume interstitiel
Vp : Volume poreux
Vt : Vo + Vp : Volume d'élutlon des molécules de trè:3 petite taille
Ve : Volume d'élution des macromolécules de masse molaire M

figure 15: allures théoriques d'une courbe d'étalonnage en chromatographie

d'exclusion stérique et d'un chromatogramme ( 123 )
 42

éluées à un volum~ VT repr~sentant la somme du volume poreux

IV r ) et du volume interstitil"'l (ou volume "mort" V o ). En revan-
che, l@s macromolécules de volume hydrodynamique suffisamment
grand et totalement exclues des pores, seront éluées à un volume
Vo . Les composés de taille intermédiaire seront élués à un
volume d'élution V., compris entre Vo et VT , suivant la
relation: V. = Vo + KD(VT-V O ) avec KD coefficient de partage
entre les 2 phases (compris entre 0 et 1)
Pour une série de composés de conformations voisines, Il est
possible d'estimer (Fig. 15) dans un certain domaine, la masse
moléculaire M par la relation
KD = A.Log M + B où A eL B sont des constantes.
Mais c'est en fait le rayon de giration de la molécule solvatée
(ou rayon de Stockes) qui est le paramètre caractéristique de la
sAparation (124).

A-2 - CHROMATOGRAPHIE DE TYPE HYDROPHOBE

La chromatographie de type hydrophobe met en jeu les diffé-

rences entre les interactions de type hydrophobe existant entre
les molécules à purifier et le support chromatographique (125).
On distingue en fait deux catégories de séparation selon
l'hydrophobie
La chromatographie de partage dans laquelle la phase sta-
tjonnaire comporte des radicaux polaires, permet d'effectuer
l'élution des molAcules adsorbées par un solvant peu polaire tel
que l'hexane ou le chloroforme.
La chromatogr.:.l.phie di te en phase inversée (126) utilise une
phase stationnaire constituée d'une forte densité de chaines
hydrophobes (groupes alkyles souvent en Ce ou C1 s) et un éluant
~e polarité variable (gradient d'acétonitrile ou de n propanol).
L'élution par une solution à gradient décroissant en force
ionique sur des supports moins hydrophobes (alkyles de C 1 à Cs
ou phényles) est également réalisée pour la purification de
 1

force ionique pH
...
pl pl pl
A B C

e = RESINE ECHANGE USE D'IONS

figure 16 : schémas du mécanisme d'élution par accroissement de la

force ionique ou par changement du pH
 43

protéines; dans ce cas, en présence d'un éluant de force ioni-

que élevée (NaCl 3M) qui augmente les interactions non polaires
et masque les effets électrostatiques, la protéine interagit
avec le support par l'intermédiaire de quelques groupes
hydrophiles localisés à sa surface.

A-3 - CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS

Dans le cas des protéines, certains acides aminés possèdent

dans leur chaîne latérale des groupements acides ou basiques. La
somme algébrique des charges portées par une protéine constitue
sa charge nette et i l existe un pH pour lequel la charge nette
est nulle: c'est le point isoélectrique (pl).
Selon leur charge nette, les protéines peuvent ainsi
développer des interactions avec un support sur lequel sont
fixés des groupes chargés à caractère acide ou basique ; la neu-
tralité électrique est assurée par des ions de signes contraires
(contre-ions) aux groupes anioniques ou cationiques greffés sur
la phase stationnaire.

L'élution peut s'effectuer (Fig. 16)

- par augmentation de la force ionique ce qui revient à augmen-
ter le nombre de contre-ions entrant en compétition avec la
protéine
- et/ou par variation de pH (128) qui modifie la charge nette de
la molécule et l'ionisation des groupes du support. En
conséquence, les supports doivent être stables dans un large
domaine de pH; il est à noter que les supports de silice ne
le sont que dans une gamme de pH compris entre 2 et 8.

Les groupements fixés sur les phases stationnaires sont

classiquement des sulfonates (SulfoPropyle), des carboxyles
(CarboxyMéthyle) , des amines tertiaires (DiEthyIAminoEthyle) ou
quaternaires, ainsi que quelquefois des phosphates (Tableau VII>
 tampon modifiant
la morphologie
- ~ +
0 tampen
• 0
!
de la protéine d'équilibrage

~
substance entrant
0,If
-
en compétition
avec le
ligand fixé
.bL +
cO • 0
~ substance
entrant en compé- {]
tition
avec la molécule
à purifier
-=-- +
0

figure 17 : ( d'après ref 141 ) élution de la molécule à purifler

en chromatographie d'affinité.
 44

Certains supports peuvent également allier à un caractère

ionique des propriétés faiblement hydrophobes (126,129).

A-4 - CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE

La chromatographie d'affinité utilise la propriété essen-

tielle des molécules biologiques leur aptitude à reconnaître
spécifiquement des ligands.
Lorsqu'un ligand présentant une forte affinité pour une
protéine est immobilisé sur un support insoluble, l'espèce à
purifier va être retenue sur la phase stationnaire en formant un
complexe avec le ligand; ce complexe peut être dissocié soit en
modifiant la composition de l'éluant (pH, force ionique) soit en
ajoutant un composé compétiteur du ligand immobilisé ou de
l'espèce adsorbée (Fig. 17).

Dans la chromatographie d'affinité des ligands à spécificité

très large sont également utilisés; on parle alors de "pseudo-
affinité" (131). Ces ligands peuvent être des colorants (compo-
sés aromatiques sulfonés) de diverses natures induisant des
interactions multiples avec des groupes d'enzymes et de protéi-
nes (132,133). Des lectines (134) utilisées pour la purification
de glycoprotéines ou des chelates métalliques (135) peuvent éga-
lement être couplés sur un support chromatographique.

B - SUPPORTS CBROMATOGRAPHIQUES

Les matériaux (organiques et minéraux> sont utilisés soit

directement (exclusion stérique), soit modifiés chimiquement par
l'introduction de composés ioniques ou de ligands; les ligands
sont éventuellement fixés par l'intermédiaire d'un bras espaceur
sur le support.
 NATURE CHIMIQUE GROUPES
NOM COMMERCI AL PRODUCTEUR
DU SUPPORT IONISABLES
DEAE -CELLULOSE 52 CELLULOSE WATHMANN

DEAE-lRISACRYL (M,LS) POL YMERE ACRYLIQUE IBF

DEAE-SEPHAROSE CL 6B AGAR OSE PHARMACIA

DEAE -SEPHADEX A 50 DEXTRANE

..
RMINE
DEAE-5 PW POLYMERE VINYLIQUE lOYO-SODA

DEAE-SEPHACEL CELLULOSE PHARMACIA

TERTIRIRE
DEAE-SPHERODEX SILICE IBF

DEAE-BIOOEL A AGAR OSE BIO-RAD

IEX-DEAE Sil 540 SILICE lOYO-SODA

DEAE-FRAClOOEL 650 POLYMERE VINYLIQUE

..
CM-CELLULOSE 52 CELLULOSE WATHMANN

CM-TRISACRYL (M,LS) POL YMERE ACRYLIQUE IBF

CM-SEPHAROSE CL 6B AGAR OSE PHARMACIA

CM-SEPHADEX C 50 DEXTRANE .
CRRBOHYLE
CM-FAST FLOW AGAROSE ..
CM-SPHERODEX SILICE IBF

CM-BIOOELA AGAR OSE BIO-RAD

CM-FRACTOGEL 650 POLYMERE VINYLIQUE TOYO-SODA

SP-5 PW POLYMERE VINYLIQUE TOYO-SODA

SP-CELLULOSE 53 CELLULOSE WATHMANN

SILICE PIERCE
SP -GL YCOPHASE
SULfONRTE
POL YMERE ACRYLIQUE IBF
SP-lRISACRYL (M,LS)
SP-FRAClOOEL 650 POLYMERE VINYLIQUE lOYO-SODA

SP-SEPHADEX C 50 DEXTRANE PHARMACIA

QAE-SEPHADEX A 50 DEXTRANE PHARMACIA RMINE
QURTERNR 1RE
QA-CELLULOSE CELLULOSE WATHMANN
P-ULTROOEL A 6 R AGAR OSE IBF

P-CELLULOSE 11 CELLULOSE WAlHMANN PHOSPHRTE

TABLEAU VII: liste des principaux supports échangeurs d'i,:>ns

pour la séparation de macromolécules biologiques
 45

B-1 - PRINCIPAUX SUPPORTS

a) Matériaux organiques naturels et semi synthétiques

Il s'agit en fait de supports polysaccharidiques

Les polymèr~s connus sous le nom de SEPHADEXlI\, sont

cnnstitués par du dextrane (90) Cpolyglycose 1-6 produit par des
bA~téries) réticulé en milieu basique par l'épichlorydrine. Très
utilisés comme gel perméable en G.P.C., leurs dérivés polycatio-
niques sont également employés comme phases stationnaires en
chl'omatographi~ d'échange d'ions (Tableau VII).
Un dérivé semi-synthétique du dextrane, le SEPHA-
CRVLlI\ comportant. des groupements allyles copolymérisés en
pr~5ence de N,N'-méthylène-his-acrylamide constitue aussi un
suppnrt pour la chromatographie d'exclusion stérique.
Les gels d'agarose (BIO-GELlI\ A, SEPHAROSElI\ B,
ULTROGELlI\ A) copolymères de D-galactose et d'anhydrogalactose
(122) sont des structures tridimensionnelles obtenues soit par
réticulation chimique (par le dibromopropanol pour le SEPHA-
ROSElI\ CL), soit par l'établissement entre les chaînes de liai-
sons hydrogènes stables. Ces supports, malgré leur faible résis-
tance mécanique (cependant supérieure à celle des SEPHADEXlI\),
sont parmi les plus utilisés en chromatographie d'exclusion
stérique, d'échange d'ions et d'affinité.
Après modification chimique, les supports à base de
cellulose (poly-D glucose 1-4) (122) sont encore quelquefois
employés en chromatographie d'échange d'ions.

b) Matériaux organiques synthétiques

Les gels de polyacrylamide (BIOGELlI\ P) obtenus par

cop01ymérisdtion de l'acrylamide et du N,N'-méthylène-bis-acry-
lamide sont des polymères insolllbies synthétiques (insensibles
aux mjcroorganismes) résistants aux éluants classiques et aux
milieux acides. Des polymères acryliques (TRISACRYLlI\) et leurs
 46

copolymères obtenus avec un dérivé acrylique anionique ou

cationique sont utilisés en G.P.C., échange d'ions et après
fixation d'un ligand en chromatographie d'affinité; il existe
également des supports mixtes Agarose-polyacrylamide (ULTROGELft
AcA) pour chromatographie d'exclusion stérique.
D'autres groupes de polymères synthétiques comme
celui des polyhydroxyméthylmétacrylates-SPHERONS- (122) ou des
polymères de nature vinylique -FRACTOGELft- (136) sont dotés de
propriétés intéressantes sur le plan physique, chimique et
biologique tout en conservant cependant un certain caractère
hydrophobe.

c) Supports minéraux

La silice est le support minéral le plus étudié et

le plus utilisé en chromatographie liquide à haute performance.
Cependant dans le cas des gels de silice comme celui du verre
poreux, les groupes silanols présents à la surface induisent des
interactions non spécifiques importantes. Afin de les réduire,
ces supports doivent être modifiés d'autant plus que la sensibi-
lité aux milieux alcalins de la silice vierge commence à pH=8 ;
l'adsorption de polymères organiques conduisant à la réalisation
de supports mixtes (157) tels que silice-dextrane (SPHERODEX ft )
ou silice-polyvinylimidazole (P.V.D.I.) tente de pallier ces
inconvénients.
Les hydroxyapatites ont été mises en oeuvre depuis
longtemps à des fins chromatographiques ; il s'agit de cristaux
de phosphate de calcium qui confèrent à ces supports, par
l'intermédiaire des groupements phosphates et des ions calcium,
des possibilités d'interactions avec de nombreuses protéines.
L'incorporation de mono-cristaux d'hydroxyapatite dans des poly-
mères organiques (HA-ULTROGELft, BIO-GELft HT) permet leur utili-
sation en chromatographie d'affinité (137).
r-------·----·-----,.--
1 FO~·ICTIONS CHil'-11QUES DU LIGAND
!"-lETHODES D'ACT ! VAT 1ON 1 .____ --.-_ _ _ _ _--,-_ _ _ _, - -_ _ _--!

OLI DE COUPLAGE j Af"1!~~b 1 HYDROXYLES/ THIOLS PHENOLS

r---- glutaraldèt-\Y~-~----r,,~~ 1 1

-~
1 bromure de cyanogène!
r:::: .J'~î----~Ii----~--~
l
"-...,. 1 1

1 hYdr~Zine r~~~- ----1 1---

~_biséPoxirane I"",,~~ I~~_
" "~
divinylsulfone -, ~
L- ~'~-~--~----I
! épicl'llorhydrine l "'""'~'~ '"
r-
1- carbonyldi im idazo 1 ~-~=.=-.
l '~.

trictiloro--s-triazine . --.'''-.- 1 ~
'''-.
diazoniurfl l '-.......
1 (aromatique>: i
~----------------lo<1, - - - - - - - - " ' 1 - - - - - - - + 0 . : - - -
1 I~,
! ct'dorure de to,::,yl LI "~
L ... _ _ _ _ _ _ _ ___ ~ _ _ _ _. L _ __ _ _ __""'__ _ _ _- - - - '

T ABLE.AU VIII: principales méthodes d'activation (! 41, 175 )

 47

d) Supports de diverses natures

Les résines de polystyrène réticulé par le divi-

nylbenzène sont connues pour être à la base des résines échan-
geuses d'ions (BIO-BEAOSft). Mais leur fort caractère hydrophobe
a limité leur utilisation dans la biochimie des protéines malgré
de remarquables propriétés mécaniques et une très grande inertie
chimique et thermique.
Cependant certains polystyrènes fonctionnalisés
(138,175) ont des propriétés voisines de celles des supports
d'affinité traditionnels obtenus par fixation sur une matrice
d'un ligand actif vis-à-vis de la protéine à séparer ainsi la
substitution de polystyrène par des dérivés d'acides aminés
fournit des résines qui présentent une affinité spécifique pour
certaines protéines plasmatiques (138,139); ces phases solides
possèdent un site d'interaction qui imite le site de fixation de
la protéine sur son ligand naturel.
Récemment, l'adsorption de polyéthylèneimine sur du
polystyrène (156) a permis l'utilisation en HPLC de ce support
pour la chromatographie de protéines par échange d'ions.
D'autres polymères tels que le poly(acétate de
vinyl) (MERCKOGELft) ou des copolymères vinyliques (122) ont été
signalés; des supports d'affinité ont également été obtenus par
réticulation de molécules entre elles grâce à des réactifs
polyfonctionnels (140).

B-2 - OBTENTION DE LA PHASE STATIONNAIRE

La réalisation d'un support chromatographique d'affinité ou

d'échange d'ions nécessite la modification chimique du support.
Afin d'établir une liaison covalente entre le ligand et le
support, de nombreuses méthodes ont été proposées (141). Le
tableau VIII résume les principales méthodes utilisées pour réa-
liser ces modifications nommées "activation" ; des supports pré-
activés sont également commercialisés.
"ENHANCER" "UPSTREAM ELEMENT" "TATA BOX"

Zï'l2'a,~?Z> <ifZE'Err:':, ":{1;t':nmVnm.mr:mz::Cw,. ,·;·········;····f ... ARN ni

------+1--------1--+-1- - - . . ! . - - - - - - - - A . D . N .
-110 -40 -30 +1
site d'initiation
de la transcript ion

figure 18 : les promoteurs de classe Il (B)

 48

Afin de résoudre le problème d'accessibilité stérique de la

protAinp. à purifier au ligand immobilisé, celui-ci peut être
fix~ sur le support par l'intermédiaire d'un bras espaceur (98,
141). La longueur et la nature du bras espaceur (généralement
une chaine aliphatique) sont importantes car elles conditionnent
] 'apparition d'éventuelles interactions non spécifiques.

V PURIFICATION DES FACTEURS

DE TRANSCRIPTION

La synthè5~ des protéines résulte dans les cellules eucaryo-

tps de la tr~nscription de l'ADN ce mécanisme nécessite
plusieurs étapes impliquant la participation des trois types
d'ARN
- r RNA, L'ARN ribosomal
- m RNA, l'ARN messager
- t RNA, l'ARN de transfert.
C'est à un complexe pluri-moléculaire constitué des facteurs
de transcription et de 1'ARN polymérase B(II) qu'incombe
l'initiation spécifique de t.ranscription de l'ADN en ARN (143).
l.es facteurs de transcription se fixent sur des éléments spéci-
fiques de l'ADN qui défini~sent le promoteur (Fig. 18) ils
sont nécessaires à l'initation et à l'amplification de la
transcription par les promoteurs eucaryotes de classe II.

En utilisant comme modèle le promoteur tardif majeur de

l'Adénovirus 2 (Ad2MLP) 1 4 séquences importantes de l'ADN ont
ainsi pu être définies (144) (Fig. 18) :
le site d'initiation de la transcription (noté +1), contient
les bases cod~nt pour les nucléotides du mRNA
Exemple: le promoteur tardif majeur de l'Adénovirus 2 (Ad2 MLP )

UEF: facteur de l'élément "UPSTREAM" ( M = 45 kD )

5TF: facteur de stimulation de la transcription (M" 43 KD )

BTF: facteur de transcription de l'ARN. polymérase B

BTF 1 : M = 120 KD BTF 3: M - 27 KD

figure 19 : interactions avec l'ADN des constituants du complexe

de transcription de l'ARN polymérase B

HELA lICE
+
1Hop.r •• -Ult...... 1
, , lltl IluU ...

O••M ,Mfll 0.1411 .Mi

+
1l0.15

,
0.0lIl
j
O.I!II IOI:O.ISI

1SoIf.,..,,1 SPI! 1
O...
j

....
i
0.2111 IOI:O.HI
i
.M IIl.MI
lIi!i1U!W

o.i..
1 ICI .,.tt..
...
I~ ISIIIM'

o...
O... O...
--.
lM IUlMl

..,.4,...,1.,,\. U
.,.tt..
...
""' ...... tt

O.OIM 0.1111 I_.UI O.Z" O... 1_.11

figure 20 : ( d'après ref.144 ) schéma de la purification du facteur UEF

 49

la séquence TATA ("TATA box") enchaînement répétitif de Thymi-

ne et d'Adénine, située 30 nucléotides avant le site d'initia-
tion, est indispensable à la transcription (14S).
la séquence amont ou "UPSTREAM", de 40 à 110 paires de bases
en amont du site d'initiation est nécessaire à l'efficacité de
la transcription.
la séquence stimulatrice de la transcription est nommée
"ENHANCER" (4).

Le fractionnement, réalisé par l'équipe du Dr J.M. EGLY

(144) à partir de cultures de cellules tumorales humaines de la
lignée HeLa, a permis l'isolement de l'ARN polymérase B et la
séparation de 4 facteurs de transcription (Figure 19) :
BTF1. se fixe au niveau de la séquence "TATA"; i l interagit
spécifiquement, même en absence de l'ARN polymérase B, avec
cette séquence ainsi qu'avec le site d'initiation; i l forme
un complexe de préinitiation (14S).
. STF stabilise le complexe BTF-ADN par une interaction
protéine-protéine.
UEF se fixe au niveau de la séquence amont même en absence des
autres facteurs; il n'est pas indispensable à l'initiation de
la transcription (144) mais amplifie le processus
. BTF a et BTF3 qui sont absolument nécessaires à l'initiation
ont un rÔle qui reste à déterminer ; on sait cependant que
BTF 3 est non spécifique de l'ADN mais interagit avec l'ARN
polymérase B (146).
Le fractionnement de ces différents facteurs est long et
difficile il nécessite plusieurs étapes chromatographiques
(Fig. 20) sur des supports tels que l'Héparine Ultrogel, le DEAE
cellulose, le DEAE SPW, le Sulfopropyl SPW, le Rouge Trisacryl,
l'Hydroxyapatite.
Son rendement est faible (144) puisqu'à partir de 3 grammes
de protéines d'un extrait cellulaire obtenu à partir de 100
litres de cellules HeLa, 2 ~g de protéines sont recueillis,
après les différentes étapes chromatographiques, avec une pureté
de l'ordre de 10 , en UEF.
 50

Des facteurs nécessaires à l'initiation spécifique de la

transcription du promoteur majeur tardif de l'Adénovirus ont
également été mis en évidence par M. SAWADOGO et R.G. ROEDER
(154) par chromatographie d'un extrait cellulaire sur phospho-
cellulose, DEAE-cellulose, DNA-Agarose et Bio-GEL A. On peut
aussi mentionner la purification de SP1 (155), facteur de trans-
cription du promoteur SV 40 , qui est réalisée à partir d'un
extrait de cellules HeLa par chromatographie sur Sephacryl
S-300, DEAE Sepharose CL6B, Heparine-Agarose, Mono-S et colonne
d'affinité à oligodéoxyribonucléotides.

Par ailleurs, les mécanismes moléculaires qui contrôlent

l'initiation de la transcription ont été conservés au cours de
l'évolution des espèces; ainsi, il a été montré qu'une protéi-
ne provenant de levure pouvait se substituer aux facteurs issus
de cellules humaines (142).
 OH
1
PS-S0 2NH-c:J-O-P-OH

OH
P5-502NH-CCH2)2-0H PS-S02NH-(CH2>3-0H
1
- - - - - - - - - PS-S02CL

1
PS
PS-CH2-GUAN 1NE
1
PS-CH2-THYMINE

,
OH
PS-CH2-0-P-OH
Il
o

OH
,
PS-( CH 1"\ )3 -0-P-OH
L Il
o
9H
PS-( CH2>2-0-P-0-CHOL 1NE OH -CYTOSINE
Il 1
o PS-(CH2)2-0-P-0-(CH2)2-ADENINE
Il
o -THYMINE
OH -CYTIDINE
PS-CCH 2}2-0 -Ft-O-ADENOSINE
1

o -THYMIDINE
-GUANOSINE

TABLEAU IX: POLYMERES FONCTIONNELS DERIVES DU POLYSTYRENE CPS )

 51

SYNTHESE ET CARACTERISATION

L'objectif de notre travail consistant en la réalisation de

polymères fonctionnels susceptibles, comme l'ADN ou les phospho-
lipides, d'interactions spécifiques avec les anticorps lupiques
et les constituants du complexe de transcription de l'ADN, nous
avons choisi comme matériau de départ le polystyrène réticulé à
2 ~ de divinylbenzène. Ce choix est conditionné par deux consi-
dérations :
- La modification chimique du polystyrène est relativement aisée
en raison de la relative facilité des substitutions électro-
philes du noyau aromatique du motif monomère et de la remar-
quable stabilité des chaînes du polymère.
- Les propriétés mécaniques des résines dérivées de ce polymère
tridimensionnel sont excellentes et le rendent tout à fait
apte à un usage en H.P.L.C. en tant que phase stationnaire.

Le copolymère de départ <styrène-divinylbenzène) se présente

sous la forme de particules sphériques de diamètre compris entre
35 et 75 ~m à l'état sec (200-400 mesh) c'est à partir de
celui-ci que toutes les synthèses ont été réalisées.
Nous avons donc effectué la substitution chimique sur le
noyau phényl du polystyrène, des composants de l'ADN (bases pu-
riques et pyrimidiques, pentose et ester phosphorique) seuls ou
associés ainsi que des constituants de phospholipides.
La phosphorylation du polystyrène réalisée à des taux de
substitution variables, a été obtenue à partir des polymères
préalablement hydroxylés (Tableau IX). Dans ces conditions, les
 /COOC 2HS

!
PS-CH 2-CH, .
COOC2HS

PS-<r2 )2- COOH

PS-(CH2 )3-0H

SCHEMA 1 : RESINES HYDROXYLEES DERIVEES DU PS-CH2C1

 52

groupements phosphate sont fixés sur le polystyrène par l'inter-

médiaire de bras espaceurs de nature et de longueur variables.
Dans ce chapitre nous décrirons tout d'abord les méthodes de
synthèse utilisées puis la caractérisation des résines obte-
nues; en Annexe C!-2 : de 1 à 21) seront reportées les condi-
tions opératoires des différentes synthèses.

I SYNTHE SES

A - RESINES BYDROXYLEES DERIVEES DU POLY(CBLOROMBTBYL STYRERE)

Les fonctions hydroxyles sont fixées sur la plupart des

noyaux aromatiques du polystyrène par l'intermédiaire de groupe-
ments méthyle, éthyle ou propyle ; la première étape commune est
la préparation du polyCchlorométhyl styrène) : PS-CH Cl. Ensui-
2
te, pour chaque type de bras espaceur une suite de réactions
chimiques quantitatives conduit à la réalisation des résines
hydroxylées décrites dans le schéma 1.

A-l - POLYCCHLOROMETHYL STYRENE) PS-CH -Cl

2
Annexe 1

La réaction du monochloro diméthyl éther sur le polyCstyrè-

ne) s'effectue dans le dichlorométhane en présence de chlorure
stannlque comme catalyseur; cette synthèse décrite antérieure-
ment C176,177,178) est contrôlée par les quantités d'éther et de
catalyseur; la substitution peut conduire à plus d'un substi-
tuant par cycle aromatique.
 53

-CH -CH-
2

A-2 - POLY(HYDROXYMETHYL STYRENE) : PS-CH -OH

2
Annexe 2

La préparation du poly(hydroxyméthyl styrène) s'effectue en

deux étapes (179) :
- Tout d'abord, dans l'ortho-dichlorobenzène, le polyCchloromé-
thyl styrène) est condensé avec de l'acétate de potassium en
solution aqueuse, en présence d'un Catalyseur Transfert de
Phase; ce catalyseur facilite les échanges entre la phase
organique du solvant, la phase aqueuse du réactif et la phase
solide constitué du polymère.
- L'acétate de méthyle est ensuite hydrolysé par la potasse pour
donner le dérivé hydroxyméthyle

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

C. T. P.
+ CH COOK
3 • + KCl

CH -O-C-CH
2 Il 3
o

+ CH -COOK
3
 54

A-3 - POLYCHYDROXYETHYL STYRENE)

La synthèse de ce polymère est réalisée en trois étapes à

partir du polystyrène chlorométhyle elle nécessite la prépara-
tion de polystyrène cyanométhyle qui est ensuite hydrolysé en
carboxyméthyl.e puis réduit en son hydroxyle correspondant
Cschéma 1).

a) PolyCcyanométhyJ styrène)
Annexe 3

Dans le N,N'-diméthylformamide (D.M.F.), le polystyrè-

ne chlorométhylé réagit en présence d'un sel de tétrabutylammo-
niurn (179) avec du cyanure de sodium pour conduire à la forma-
tion de polyCcyanométhyl styrène)

-CH -CH-
2

C. T. P.
+ Na-C:::N + NaCl

Cette synthèse réalisée dans le diméthylsulfoxide

avai.t été décrite par AYRES et MANN (180) et par FRECHET et
coll. (179) dans le diméthylformamide mais à partir de poly-
Cchlorométhyl styrène) beaucoup moins substitué.

b) PolyCcarboxyméthyl styrène) : PS-CH -COOH

2
Annexe 4

Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique hydrolyse

tot.alement danf; nOf; conditions Ctempérature, temps, concentra-
tjon) le polymère précédent en son dérivé carboxylique. Cette
réaction fait Intervenir une espèce intermédiaire -le poly(car-
bamoylméthyl styrène) : PS-CH -CONH - que l'on a ainsi complè-
2 2
tement hydrolysée.
 55

-CH -CH- -CH -CH- -CH -CH-

2 2 2

HCl
- NH 3 +

CH -COOH
2

c) Poly(hydroxyéthyl styrène) PS-CH -CH -OH

2 2 Annexe 5

Deux procédés de réduction par le diborane sont utili-

sés pour obtenir le poly(hydroxyéthy1 styrène) :
- le premier utilise une solution commerciale molaire de dibora-
ne CB H ) dans le T.H.F. à DOC (181)
2 6
- le second nécessi te la préparation du diborane "in situ" (182,
183) par action, dans le 2-méthoxyéthyléther ("Dig1yme"), du
borohydrure de sodium (NaBH ) sur du tri fluorure de bore (BF )
4 3

-
Les boranes réagissent bien avec les acides carboxyli-
ques (182,184) alors que les borohydrures tels que NaBH sont
4
sans action sur ceux-ci ; la réaction conduit alors aux alcools
primaires; le mécanisme fait vraisemblablement intervenir un
trialoxyborane qui est ensuite hydrolysé (184).
A partir du po1y(carboxyméthy1 styrène) on peut glo-
balement représenter la réaction par

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

CH -COOH
2
 56

A-4 - POLY(HYDROXYPROPYL STYRENE)

Ce polymère est synthétisé en 3 étapes successives à partir

du poly(chlorométhyl styrène) (schéma 1). Une synthèse malonique
suivie d'une décarboxylation puis d'une réduction de l'acide
carboxylique conduisent à l'obtention d'un dérivé du polystyrène
où les motifs hydroxyles sont fixés sur le polymère par l'inter-
médiaire d'une chaîne à 3 atomes de carbone.

a) Poly(diéthylmalonate de méthyle styrène)

COOC H
PS-CH -CH / 2 5 Annexe 6
2 ,",COOC H
2 S
On réalise dans cette première étape une synthèse
malonique à partir de poly(chlorométhyl styrène) en condensant
le malonate d'éthyle en présence de carbonate de potassium et
d'un Catalyseur Transfert de Phase cette synthèse est effec-
tuée dans le diméthylformamide.

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

C. T. P.

b) Poly(carboxyéthyl styrène) PS-CH -CH -COOH

2 2
Annexe 7

Le diester précédent est hydrolysé par la soude, puis

après neutralisation, le diacide obtenu subit une décarboxyla-
tion en milieu acide fort le schéma décrivant cette synthèse
est :
 57

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

COONa
+ 2 NaOH CH -CH
2 < COONa
+ 2 C 2H SOH

2 HCl 1
-CH -CH-
2

<
COOH
CH -CH + 2 NaCl
2
COOH

c) Poly(hydroxypropyl styrène) PS-CH -CH -CH -OH

2 2 2
Annexe 5'

Une procédure identique à la réduction du carboxymé-

thyl polystyrène est utilisée pour obtenir le poly(hydroxypropyl
styrène) à partir du précédent dérivé synthétisé

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

CH -CH -CH -OH

222
SCHEMA 2 : RESINES HYDROXYLEES DERI VEES DU PS-S0 2Cl
 58

B - RESINES HYDROXYLEES DERIVEES DU POLY(CHLOROSULFONYL STYRENE)

La fonctionnalisation du polystyrène est dans ce cas obtenue

par l'intermédjaire d'une fonction sulfamide, par condensation
sur le poly(chlorosulfonyl styrène) d'un aminoalcool; l'éloi-
gnement du groupe hydroxyle de 1·1, chaine macromoléculaire dépend
de l'aminoalcool utilisé (schéma 2).

B-1 - POLY(CHLOROSULFONYL STYRENE)

Annexe 8

L'acide monochlorosulfonique réagit sur le poly(styrène)

réticulé pour donner dans une réaction classique (185,186), le
poly(chlorosulfonyl styrène); la synthèse effectuée dans le
dichlorométhane est décrite (187) en deux étapes:

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

+ HCI

B-2 - POLY(N-HYDROXYETHYL SULFAMIDE STYRENE)

PS-S0 NH-CH -CH -OH Annexe 9
2 2 2

L'éthanolamine est condensée dans le dichlorométhane avec le

polystyrène chlorosulfoné. La synthèse est effectuée à 50°C avec
des rendements supérieurs à 90 , suivant le schéma :

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

+ + HCI
 59

B-3 - POLYCN-HYDROXYPROPYL SULFAMIDE STYRENE)

PS-S0 NH-CH -CH -CH -OH Annexe 9'
2 2 2 2

La propanolamine réagit sur le polyCchlorosulfonyl styrène)

dans des conditions identiques à la synthèse précédente.

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

+ HCI

S02CI

B-4 - POLYC2,3-DIHYDROXYPROPYL SULFAMIDE STYRENE)

PS-SO NH-CH -CH-CH OH Annexe 9"
2 2 OH2

La réaction dans la pyridine ou le dichlorométhane, du

3-amino-l,2-propanediol sur le polyCchlorosulfonyl styrène) con-
duit à la formation d'un dio! :

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

+ HCI

S02CI + H N-CH -CH-CH OH SO NH-CH -CH-CH -OH

2 2 1 2 2 2 1 2
OH OH
 60

C - PHOSPHORYLATION DES POLYSTYRENES HYDROXYLES

Des polystyrènes phosphorylés ont été obtenus par la substi-

tution des fonctions hydroxyles présentes sur les dérivés du
polystyrène (schéma 3). Des taux variables en groupes phosphates
ont également été réalisés modifiant ainsi les propriétés des
polymères phosphorylés (acidité, hydrophilie, charge ionique,
sites chimiques environnants) et donc leurs interactions avec
des molécules d'origine biologique.
La phosphorylation complète du poly(hydroxyéthyl"stryrène) a
pu être réalisée conférant ainsi au polymère une capacité
d'échange d'ions importante.
Trois agents de phosphorylation ont été utilisés.

C-1 - PHOSPHORYLATION A L'AIDE DE L'ACIDE PHOSPHOREUX

Annexe 10

L'acide phosphoreux avait été utilisé par H. TAKAKU et coll.

(188,189) pour la phosphorylation de divers alcools l'acide
phosphoreux (H P0 ) réagit dans un premier temps sur le N-
3 3
méthylimidazole en présence de chlorure mercurique (HgCI ) pour
2
former un sel de N-phosphoryl-N'-méthylimidazole; la réaction
de ce dernier sur un alcool conduit à la réalisation de phospho-
monoester

o o
~F-\
Il
HO-P-H
1
OH
+ NO-CH) Hg ( II)
o
R-OH 1\
HO-~-~N-CH3 - -... OH-P-OR
1
l
Hg(O)
OH

La réaction dans le N-méthylimidazole sur un polystyrène

hydroxyméthyle a été réalisée. Cependant, nos conditions ne nous
permettent d'atteindre que des taux de susbstitution faibles
(15 ,) comparés à ceux obtenus par la deuxième (CH 0P(O)CI ) et
3 2
surtout la troisième méthode de phosphorylation (P(O)C1 ).
3
SCHEMA 3: PHOSPHORYLATION DES RESINES HYDROXYLEES
 61

c-2 - PHOSPHORYLATION PAR LE DICHLOROPHOSPHATE DE METHYLE

Annexe 11

La réaction du dichlorophosphate de méthyle dans la pyridine

sur un alcool a été décrite par J. SMRT et J. CATLIN (190) puis
par M. RUBINSTEIN et coll. (191). Il se forme ainsi dans une
première étape le sel de N-méthylpyridinium dichlorophosphate
qui réagit ensuite avec un alcool primaire selon le schéma
suivant :

CH
3
-O-P<
o
Il Cl
Cl
+
o - R-OH

I r.<
R-O -
OH

Il OH
o

Nous avons utilisé cette méthode sur différentes résines

hydroxylées. Les synthèses, réalisées en milieu anhydre, permet-
tent l'obtention de polystyrène où les groupements phosphorylés
représentent jusqu'à 50 , du poids de la résine. Cependant, les
produits finaux contiennent encore des traces de pyridine pié-
gées dans la résine et présentent un taux de chlore assez impor-
tant, ce qui nous a conduit à ne pas retenir ce mode de
synthèse.

C-3 - PHOSPHORYLATION AVEC L'OXYCHLORURE DE PHOSPHORE

Annexe 12

Toutes les résines hydroxylées décrites précédemment (schéma

1 et 2) ont été phosphorylées par cette dernière méthode (schéma
3) •

Les conditions de synthèse nous permettent, en particulier,

la substitution totale des groupes hydroxyéthyles par des grou-
pements phosphate.
 62

La réaction de
l'oxychlorure de phosphore (POC1 ) avec les
3
polystyrènes hydroxylés, effectuée dans le triméthyl phosphate,
conduit à un dichlorophosphate qui est ensuite hydrolysé par de
l'eau afin d'obtenir le groupe dihydrogène phosphate fixé sur la
résine.

-CH -CH- -CH -CH- -CH -CH-

2 2 2

PO(OCH 3 )3
--_.....=:.~ .•

OH o o
1 1
O=P-Cl O=P-OH
1 1
Cl OH

Le taux de phosphorylation est directement proportionnel à

la quantité de POC1 introduite des taux de substitution va-
3
riables ont ainsi été réalisés.

L'oxychlorure de phosphore a aussi été utilisé pour la phos-

phorylation des dérivés hydroxylés des bases puriques et pyrimi-
diques.
Nous avons également obtenu dans ces mêmes conditions, la
phosphorylation de polymères hydroxylés dérivés du carboxyméthyl
R
Séphadex (199).

Il faut toutefois mentionner que la phosphorylation du poly

(hydroxy méthyl styrène) et uniquement de ce polymère doit s'ef-
fectuer en présence d'un agent capable de piéger l'acide chlo-
rhydrique formé i la pyridine ou la triéthylamine ont ainsi été
utilisée pour prévenir l'hydrolyse du groupement phosphate néo-
formé.
 l'Adénine

PS-CH Cl >
2

et ) bases pyrimidiques majeures t

la cytosine, la thymine et l'uracile

(pas dans l'A,R,N.) (pas dans l'A.D.N.)

t;
o~j O~
0
HN)CHl HN:)
O~N
0

N
~. 4 +

SCHEMA 4: CONDENSATION DES BASES DES ACIDES NUCLEIQUES

SUR PS-CH 2Cl
 63

D - CONDENSATION DES BASES DES ACIDES NUCLEIQUES AVEC LE

POLYSTYREHE CBLOROMETBYLE
Annexe 13

Toutes les bases puriques (Adénine, Guanine) et pyrimidiques

majeures (Cytosine, Thymine et Uracile) ont été greffées respec-
tivement par l'azote-9 et l'azote-1 sur le polystyrène chloromé-
thylé (schéma 4).

La substitution est réalisée dans le diméthylsulfoxide en

présence de carbonate de potassium.
On peut également greffer l'Adénine en effectuant la
réaction dans l'orthodichlorobenzène en présence de potasse.

Avec la cytosine, par exemple, on représente le schéma de

synthèse ainsi :

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

o
cytosine Il
/C-N~
CH 2 -N " C-NH 2
C=C/
l ,
H H

E - PBOSPBODIESTERS OBTENUS A PARTIR DE DERIVES DES BASES .

PURIQUES ET PYRIMIDIQUES

Les phosphodiesters présents sur le polystyrène sont obtenus

soit par couplage des bases puriques et pyrimidiques hydroxy-
éthyles sur les polystyrènes phosphorylés, soit par la fixation
 pH
PS-CH 2 -CH 2 -O-P-O-CH 2-CH 2 -Adén1ne
Il
o

SCHEMA 5: PH05PHODIESTERS OBTENl.!S A PARTIR DE DERIVES DES BASES

PURIQUES ET PYRIMIDIQUES ( ex : Adénine)
 64

de dérivés phosphorylés des bases sur les polystyrènes hydroxy-

lés (schéma 5).

E-1 - DERIVES DES BASES DES ACIDES NUCLEIQUES

L'obtention des phosphodiesters nécessite la préparation de

dérivés des bases des acides nucléiques bases hydroxyéthylées
et leurs analogues phosphorylés.

a) Bases hydroxyéthylées
Annexe 14

9-(2-hydroxyéthyl)-Adenine, 1-(2-hydroxyéthyl)-Thymine
et 1-(2-hydroxyéthyl)-cytosine sont obtenues par action dans le
diméthylformamide anhydre, du carbonate d'éthylène sur l'Adéni-
ne, la Thymine et la Cytosine en présence d'un Catalyseur
Transfert de Phase (192,193). Les produits hydroxyéthylés sont
ensuite précipités à froid puis purifiés à l'éthanol.
Le schéma de la réaction peut être représenté, par
exemple avec la cytosine, par :

NH
2
1
~C",
C. T. P.
N CH
+
99 , 1 Il
o 9" /
",C
N
1
CH

CH -CH -OH
2 2

Les bases puriques et pyrimidiques peuvent également

être substituées (192,193) par la 2,3-dihydroxypropyl de façon à
obtenir des dérivés des bases portant des fonctions diols.
 65

b) 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthyIJ-Adenine
Annexe 15

L'Adenine hydroxyéthyle dans le triméthyl phosphate

est phosphorylée à ooC par l'oxychlorure de phosphore suivant
la méthode de T. SEITA et coll. (194). Après évaporation et
redis-solution, la 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthyIJ-
Adenine est précipitée par addition d'eau.

NH
2
N C
./"c/
HC Il
~N
1
C. T. P.
...

'" /c, ~CH CH -

2
CH
2
N N \ \
1 o 0
H '\./
C

"
o

POCl
3

N C
. / "c/ ~N
HC Il 1
" C CH
OH
' \N . / " N ~
1 1
HO-P-O-CH -CH
1/ 2 2
o
 HO-(CH2)2-0
( Adénine. Thymine. Cytosine r

P5-(C~) 20-~-O-(C~)
OH
2NO + <Q-NH-Ç.-NH-C>
0

SCHEMA 6 : CONDENSATI ON DE BASES HYDROXYETHYLEES

A VEC LES POL YSTYRENES PHOSPHORYLES
 66

E-2 - CONDENSATION DE BASES HYDROXYETHYLEES AVEC LES

POLYSTYRENES PHOSPHORYLES
Annexe 16

Les bases N-hydroxyéthylées précédemment synthétisées

(Adénine, Thymine, Cytosine) sont condensées dans le diméthyl-
formamide avec le poly(dihydrogène phosphate éthyl styrène) à
l'aide de la N,N'-DiCyclohexylCarbodilmide (D.C.C.I.); la
D.C.C.I. (90) agit comme agent de condensation en formant un
produit d'addition avec l'eau; la N,N'-dicyclohexylurée formée
est ensuite solubilisée dans le diméthylformamide et l'éthanol à
chaud.
Le mécanisme de la réaction est représenté sur le schéma 6.

Cette condensation permet de fixer les bases puriques et

pyrimidiques sur les polystyrènes phosphorylés tout en laissant
sur le polymère des groupements phosphomonoesters non substi-
tués.

E-3 - CONDENSATION DE DERIVES PHOSPHORYLES DES BASES AVEC

LES POLYSTYRENES HYDROXYLES
Annexe 17
La 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthylJ-Adénine est condensée
dans le diméthylformamide avec le poly(hydroxyéthyl styrène) à
l'aide de la D.C.C.I. suivant le schéma suivant:

-CH -CH- -CH -CH-

2 2

OH
1 D.C.C.1.
+ OH-P-O-CH -CH -Adénine
Il 2 2 OH
o 1
CH -CH -OH Adénine-CH -CH -O-P-O-CH -CH
2 2 2 2 Il 2 2
o
.diaine Adenosine

SCHEMA 7: BASE PURIQUE ( Adénine) , NUCLEOSIDE ( Adénosine) ,

NUCLEOTIDE ( Adénosine S'-phosphate)

qH
PS-(CH2)2-0-~-OH
o
NH2
1

~\/\
ADENOSINE

\ I! CH
HC ~ /
9H ~N/ 'N
PS-CCH2)2-0-P-0-CH? /0 /
Il 17"
o HC
\
-
1
CH
HC-CH
1 1
OH OH

ADENOSINE-S'-MONOPHOSPHATE

1
PS-(CH 2 )2-0H

SCHEMA 8 : POLVSTVRENES SUBSTITUES PAR DES NUCLEOTIDES

( ex : Adénosine CA) , Adénosine-S'-MonoPhosphate (B> )
 67

Dans ce cas, le taux de groupements phosphodiesters est

identique à celui de la base les autres sites chimiques
présents sur le polymère sont alors des fonctions hydroxyles.

Les mêmes taux de substitution en phosphoéthyladénine ont pu

être obtenus par les synthèses E2 et E3.

F - POLYSTYRENES SUBSTITUES PAR DES NUCLEOTIDES

Annexe 18

Le nucléotide est l'unité chimique de base dans la constitu-

tion des acides nucléiques: il est formé d'une base purique
(Adenine, Guanine) ou pyrimidique (Cytosine, Thymine, Uracile) à
laquelle est rattachée par un lien glycosidique, un sucre (le 0-
ribose, 2-désoxy-D-ribose) combiné à une molécule d'acide phos-
phorique (schéma 7); la perte du groupement phosphorylé d'un
nucléotide donne naissance à un nucléoside.

La fixation de ribonucléosides (Adénosine, Guanosine, Cyti-

dine, Thymidine) sur un polystyrène phosphorylé a été réalisée
(schéma 8A). Le couplage des ribonucléosides-5'-monophosphate :
Adénosine-5'-MonoPhosphate et Guanosine-5'-MonoPhosphate sur le
poly<hydroxyéthyl styrène) a également été effectué (schéma 8B).

Ces deux types de condensation ont été réalisés à l'aide de

la D.C.C.I. dans le diméthylformamide par la même procédure que
celle décrite précédemment (Chapitre E-2). Ces synthèses permet-
tent d'obtenir un même nucléotide (A.M.P. ou G.M.P.> présent à
la surface des résines mais avec un environnement constitué soit
de motifs phosphate <A), soit de groupes hydroxyles (B).
 68

G - FIXATION DE COMPOSANTS DES PHOSPHOLIPIDES SOR LE POLYSTYRENE

Les phospholipides intervenant dans le processus de la coa-

gulation sanguine sont composés de chalnes aliphatiques d'acide
gras, de glycérol et d'acide phosphorique ils comportent une
tête polaire dans leur structure (cf. Fig. 8).

Afin de réaliser des analogues de phospholipides nous avons

condensé sur le poly(hydroxyéthyl styrène) la monophospho-sérlne
et la phospho-choline.

G-1 - CONDENSATION DE LA PHOSPHOSERINE SUR LE POLY(HYDROXY

ETHYL STYRENE)
Annexe 19

La monophosphosérine est condensée dans le dimétylformamide

sur le polystyrène hydroxylé à l'aide de la D.C.C.I. ; le proto-
cole expérimental est identique à celui de la fixation des
nucléotides. Cette synthèse permet d'obtenir avec un très bon
rendement un polystyrène constitué de phosphosérine ; les autres
fonctions présentes sur la résine sont des groupements hydroxy-
les.

OH NH
-CH -CH- 2 -CH -CH-
2 1 1 2
OH-P-O-CH -CH-COOH
Il 2
o
•
D.C.C.I. NH OH
2
1 1
CH -CH -OH COOH-CH-CH -O-P-O-CH -CH
2 2 2 Il 2 2
o
 ..... "
\._ 1

-t
/>-. ~-'1
\"
,_1
_..- . -_. -- _.',
(1)
Cl

(II)

O-CH,..,
/ L

• ;)~>;CH,-,j,-,-(i'-l-·_·--/
L L
PS-(CH-,:'~,-O-P (III)
.::. L \

i~1 O-CH.o:'"-
\".

o
1
CH 3 +
/

_._- --> PS--( Ct-<-; )~,'-O- P-·O-(CH.":, )2-N-CH"'j

.:.. ~ Il ~,

o CH~
-'

(IV)
 69

G-2 - POLYSTYRENE SUBSTITUE PAR LA PHOSPHOCHOLINE

a) A partir de 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane

Annexe 20

Cette réaction se déroule en quatre étapes comme indi-

qué sur le schéma 9
- Tout d'abord, la réaction du trichlorure de phosphore sur
l'éthylène glycol conduit à l'obtention de 2-chloro-1,3,2-dio-
xaphospholane (1) comme indiqué par H.J. LUCAS et coll. (195).
- Après oxydation par l'oxygène (196) dans le benzène anhydre,
on obtient le 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane (II).
- Ce composé est ensuite condensé à -10°C dans le dichlorométha-
ne sur le poly(hydroxyéthyl styrène) (III).
- Enfin, l'ouverture du cycle est réalisée par action de trimé-
thylamine dans le T.H.F. (IV).

b) Avec le bromoéthyl dichlorophosphate

Annexe 21

Le polymère précédemment synthétisé (Schéma 9 IV) peut

également être obtenu par une autre méthode :
On prépare dans un premier temps le bromoéthyl dichlo-
rophosphate par réaction dans le dichlorométhane de l'oxychloru-
re de phosphore sur le bromoéthanol :

Cl
1
----.~ Br-CH -CH -O-P-Cl + HCI
22"
o

La réaction de ce dérivé chloré avec le poly(hydroxy-

éthyl styrène) dans le dichlorométhane, conduit avec un très bon
rendement au produit de condensation; l'hydrolyse de ce dernier
en présence de triéthylamine conduit au polymère phosphorylé :
1"
 70

Cl Cl
1 1
PS-CH -CH -OH + Br-CH -CH -O-P-CI --'PS-CH -CH -O-P-O-CH -CH -Br
2 j:20~
2 2 22
11
o 2 2
OH
1
PS-CH -CH -O-P-O-CH -CH -Br
2 2 /1 2 2
o

Enfin, une substitution totale du brome par la trimé-

thylamine en solution conduit à la synthèse de polystyrène
porteur de la fonction phosphocholine au bout d'un bras éthyl :

OH
1
PS-(CH ) -O-P-O-(CH ) -Br
221/ 2 2
o

II CARACTERISATION

La caractérisation des résines synthétisées a été effec-

tuée à l'aide de 4 méthodes argentimétrie potentiométrique,
spectroscopie Infra-Rouge, dosage acidimétrique et analyse élé-
mentaire.

11-1 - METHODES

a) Argentimétrie potentiométrique

L'argentimétrie potentiométrique permet le dosage du

chlore des résines de polystyrène chlorométhylé et chlorosul-
 - "- --.-- __...., ----
. "
- -'" - ~- ;'-'- -

- --:-_ -:L__-._--._-_.-_-_-_-.-~-"........-c'

''':'':''1 '__ .; _t'..-:'=::::- _ ..•

u_,~-;~~:_~_~';_~=~ /r;~}:~:;~~tj:~Î~i~~?:i~
-CH -CH- -~--~~~~~~/~~~~ ~~~~
2© ': -: '::c.,:. , - ,--,-,-'
'.-
_.~--.;..-:--
:::.. -'.=:.~-:-o=-;:
.. --:_-.::':=-~...::..-.

...- -
... __.
"_._.- - .-
• -:"'-.1-::..:.:

--
-CH -
,'.. -
.- ~-
-".'.-
'1 -,
,3<;>90 _____ _ 2500, :;000 1800

figure 21
 71

foné i il est effectué après hydrolyse par la soude pour les

groupes chlorosulfonyle et par la butylamine pour les groupes
chlorométhyle (174) i les ions chlorures libérés sont titrés
après acidification, par une solution de nitrate d'argent au
moyen d'une électrode indicatrice d'argent.

b) Spectroscopie Infra-Rouge

L'analyse spectroscopique Infra-Rouge permet une identi-

fication rapide des fonctions présentes dans les différents
polymères. Après chaque étape de synthèse, la disparition
complète de la bande d'absorption caractéristique de la fonction
à substituer, et l'absence de produits intermédiaires
(PS-CH -
2
CONH ) permettent, dans les limites de la sensibilité de cette
2
méthode, de conclure à une substitution totale.
Les spectres IR sont obtenus au moyen d'un spectromètre à
double faisceau, type PERKIN ELMER 580 sur des pastilles d'envi-
ron 100 mg obtenues par compression d'une poudre de polymère
dispersée à 2 , dans du bromure de potassium anhydre.
Malgré de très nombreuses bandes d'absorption (Fig. 21)
du poly (styrène), on distingue cependant très nettement les
bandes caractéristiques des différentes substitutions réalisées
i les fonctions suivantes sont ainsi observées :

C-Cl COOH COONa -COOR P=O C=N N-H

c) Dosage acidimétrique

Les résines possédant des propriétés acide-base peuvent

être caractérisées par acidimétrie potentiométrique i les dosa-
ges sont effectués sous atmosphère d'azote en phase hétérogène
aqueuse à l'aide d'une électrode indicatrice de verre et d'une
électrode de référence au calomel i l'ajout de solution titrante
est contrÔlé par un banc de titration automatique (TACUSSEL
TT100, TT~OO) permettant l'addition, uniquement quand l'équili-
 72

bre est atteint, de 10- 3 ml de solution d'acide ou de base à une

normalité voisine de 10- 1 N.
Des difficultés peuvent apparaître dans la réalisation de
ces dosages j elles sont liées principalement à la lenteur des
échang~s entre les phases, à une mauvaise mouillabilité de cer-
ta.i.nes résines et à la valeur trop élevée des pK apparents de
A
l'acidité de certains groupes fonctionnels. Elles ont été levées
par l'utilisation de vitesse d'addition des agents titrants très
faibles (1 ml en 48 à 72 heures), l'adjonction d'un agent ten-
sioactif -le triton Xl00- neutre du point de vue acide-base, et
p~r l'addition de concentration élevée (2M de chlorure de so-
dium) qui a pOUl' effet d'abaisser le pK apparent des polymères
A
chargés négativement (173).
Dans ces conditions, les dosages acidimétriques permet-
tent de déterminer le taux de fonctions carboxyles et phosphates
présentes dans les résines avec une erreur relative faible
(envir.on 5 ,).

d) Analyse élémentaire

Toutes les r~sines et composés solubles intermédiaires

ont été caractérisés par analyse élémentaire j les résultats ob-
tenus en gramme di~ l'élément pour 100 grammes de rés ine, sont
convertis en taux de substitution exprimés en milliéquivalent de
la fonction considérée par gramme de polymère (meq/g). La deter-
nlination des autres éléments présents permet, en se référant à
la composition idéale de la résine ainsi substituée, de vérifier
la nature chimique du polymère obtenu, de s'assurer de l'homogé-
néité de la résine synthétisée et d'exclure la présence de
composants résultant de réactions parasites éventuelles.
Les déterminations analytiques pondérales du chlore, de
l'azote, du soufre, du phosphore, de l'oxygène, du carbone et de
l'hydrogène seront donc reportées dans les différents tableaux
pour chaque type de polymère avec le plus important taux de
substitution réalisé.
 TABLEAU X
Caractéristiques des résines PS-CH Cl
2

Analyse élémentaire , de sites substitués Dosage argentimétrique

(meq/g) (meq/g)

5,08 73,3
5,15 73,5 5,33
5,3 74 5,1
5,4 75,6 5,6
5,66 81,1 5,52
5,67 81,3 5,77
5,86 88

TABLEAU XI
Bandes d'absorption IR des fonctions fixées sur le polystyrène

Fonctions Fréquence (cm -1 )

CH Cl 665 ; 1265
2
C=N 2225

CH -OH 3400
2
COOH 1710

COONa 1690

COOC H 1730
2 5
p=o 1230

C=N 1590

N-H 3250

-@- 810
 73

11-2 - RESULTATS ET DISCUSSION

Les différentes méthodes de caractérisation ont permis

d'établir pour chaque étape de synthèse, et par des résultats
concordants, l'obtention effective des fonctions chimiques
désirées sur la chaîne de polymère. Les diverses substitutions,
dont la plupart n'avaient jusqu'alors jamais été réalisées (198,
199) ont conduit à disposer de polymères dérivés du polystyrène
réticulé comportant à des taux importants, les constituants chi-
miques des nucléotides (bases puriques et pyrimidiques, ribose,
phosphate) et de phospholipides (phosphate, sérine, choline).
Les résultats reportés sont discutés par groupes fonc-
tionnels présents sur les résines (Tableau IX). La phosphoryla-
tion ainsi que certaines condensations sont effectuées sur les
résines hydroxylées ; celles-ci sont obtenues à partir des poly-
mères chlorés par une suite de réactions chimiques.

A - LES DERIVES CHLORES DU POLYSTYRENE

Dans les intermédiaires de synthèse, les polymères du

type PS-CH Cl et PS-S0 Cl sont les seuls contenant du chlore en
2 2
quantité importante. Dans ce cas, les dosages du chlore ont été
effectués par la méthode argentimétrique et la microanalyse. Les
résultats obtenus par les deux méthodes sont concordants
(Tableau X).
Il apparaît ainsi que le taux de substitution du polysty-
rène par les groupements chlorométhyle peut ainsi atteindre
(Tableau XIII) 90' des noyaux aromatiques. La spectroscopie
(Tableau XI) indique en outre que la substitution s'effectue
principalement en position para, conformément aux observations
antérieures (178).
Dans le cas du PS-S0 CI, plus de 80 , des noyaux phényles
2
(Tableau XIII) sont porteurs d'une fonction chlorosulfonyle.
 % %
~Oles
1
%C %H %0 %N %C1 %S mt~q/g en
RESINES en masse

PS 91,8 7,5 0,3 <0,01 <0,02 9.5 98 98

PS-C~-Cl 72 6, 1 20,8 ,), 9

c- 90 88

PS-C~-OH 79,4 7 10 0,5 6,3 84 80

PS-CH -CSN 82,2 6,5 2 8,16 <0,1 ~5,8 83 79 1

2

PS-CHTCOOH 73,S 6,3 18,6 0,2 ~5, 1 81 76

PS-(CHi zOH 80,2 7,8 9,3 0,2 <0, 1 ~5,8 86 83

COOC H
PS-CH -CH' 2 5 71,6 6,9 16,4 0,2 3 83 74
2 'caoc H
2 6
PS-( CHz> iCOOH 74,1 6,9 16,4 0,3 5, 1 89 86

PS-(CHti OH 80,2 7,7 8,3 0,3 5,2 84 81

PS-S0i.JH-(CHZ> i OH 50,8 5,8 22,4 5,9 <0,2 13, 1 3,9 88 80

PS-S0j'JH-(CHi ;SOH 52,4 6,2 20,7 5,4 <0,2 12,2 3,8 92 83

PS-SO NH-CHz-ÇH-C~OH 48,4 5,8 27,7 4,1 <0,2 12,3 2,9 75 62

2 OH
'----

TABLEAU XIII: résultats de rnicroana1yse (synthèses A et B )

 74

B - LES DERIVES CARBOXYLIQUES

Les fonctions acide carboxylique sont présentes sur le

polystyrène par l'intermédiaire d'un bras espaceur à 1 ou 2 ato-
mes de carbone.
Nous avons vu
précédemment que PS-CH -COOH est obtenu à
2
partir du nitrile correspondant j ce dernier résulte de l'hydro-
lyse de PS-CH Cl qui est totale puisque le taux de chlore dans
2
PS-CH -C:N est inférieur à 0,1 ' ; le taux de nitrile dans ce
2
polymère est élevé (5,8 meq/g) ; sa conversion en fonction car-
boxylique est quasi totale. D'une part, en effet, le spectre IR
contient les bandes caractéristiques (Tableau XI) des groupe-
ments carboxyliques et/ou des sels de sodium (Fig. 22) mais
indique également la disparition complète de la bande d'absorp-
tion des nitriles (Fig. 23). D'autre part, la microanalyse
(Tableau XIII) conduit à un taux de substitution de 5,1 meq/g
(et 0,2 , d'azote).
PS-(CH2)2-COOH résulte d'une synthèse malonique sur le
polystyrène chlorométhylé; le taux résiduel de chlore détermi-
née par microanalyse est faible (Tableau XIII). Les bandes d'ab-
sorption IR des groupements carboxyliques sont observées aux
mêmes fréquences que précédemment. Les taux de substitution sont
déterminés par microanalyse (Tableau XIII).

Les dosages acidimétriques effectués (Fig. 24) sur des

échantillons de ces résines ont donné des résultats décevants.
Si, en effet les courbes font apparaître un palier acide faible
de pK apparent à 7,3 (NaCl 0,05 M), les déterminations des taux
A
de fonctions acide carboxylique résultant de ces dosages sont
systématiquement inférieurs d'environ 30 à 40' à ceux indiqués
par la microanalyse. Ceci pourrait résulter d'une grande lenteur
des échanges, liée à la faible mouillabilité de ces résines, qui
ne permettrait pas d'atteindre la neutralisation quantitative
des fonctions acides. C'est pourquoi, nous n'avons retenu dans
ce cas, que les valeurs résultant de la microanalyse.
-",-CH-- /-~----v,

~'OO"
' .
1
,
~.-
_
...
--
1
";0.
Vi·. ·,
.
.. •
:.

,. \/';

'''0(.1

..;COOH
00·'

figure 22: spectre.s IR de PS-CH 2-COOH , de PS-CH 2-COONa

-
et de PS-(CH2)2-COOH

.'(. ", - \ ."

.. - .. .. - -_ ..

-_.. -:-..:
~::..;.:-:--
.
- _. - -
--_
.
..

figure 23 spectres IR de PS-CH 2-ON et de PS··(CH )2- 0H

2

figure 24: courbe de dosage acidimHriQue de PS-CH 2-COOH

 75

C - LES DERIVES HYDROXYLES

La substitution nucléophile du poly(chlorométhyl sty-

rène) a été réalisée. Les rendements obtenus sont, d'après la
microanalyse (Tableau XIII) supérieurs à ceux antérieurement
publiés (179).
Ces résultats sont confirmés par la spectroscopie IR.
En effet, les spectres IR de ces polymères présentent la large
bande d'absorption caractéristique des groupements hydroxyle à
3400 cm- 1 par ailleurs, aucune autre bande (carboxyle) n'est
observée.

b) Résines hydroxylées dérivées du PS-S0 Cl

2

Les spectres IR de ces différentes résines permettent

de constater par la présence des fonctions hydroxyles (Tableau
XI), la substitution effective du groupement chlorosulfonyle par
des aminoalcools.
La microanalyse permet la détermination quantitative
à partir des taux de soufre, d'oxygène et surtout d'azote
(Tableau XIII). 80 , des motifs monomères portent ainsi la fonc-
tion hydroxyéthyl sulfamide.

La comparaison du spectre Infra Rouge des polymères

hydroxylés (Fig. 23) avec celui de leurs précurseurs carboxyli-
ques (Fig. 22) indique que la réduction est totale.
La microanalyse (Tableau XIII) permet de confirmer
les taux de substitution très importants réalisés qui sont
supérieurs à 5 meq/g (70 à 80 , des motifs styrène); il est à
noter cependant que ces taux sont légèrement surestimés en rai-
son de la présence parasite de groupements hydroxyméthyle formés
au cours des étapes antérieures.
 TABLEAU XIV
Comparaison des trois méthodes de phosphorylation

moles d'agent phosphorylant introduit

Résine hydroxylée Méthodes r = équivalents hydroxyle
Substitution
en meq/g

H P0
T 1,43 0,68
3 3

PS-CH -OH
2
i
ICH 0-P(O)CI
3 2
T 1,35 0,82

2,8 1,4

P(O)CI 2,2 1,2

3
ICH 3 0-P(O)C1 2 5,7 1,9

P(O)C1 0,86 1,9

PS-CH -CH -OH 3
2 2
1,46 3,4

CH O-P(O)C1 5,7 1,9

PS-CH -CH -CH -OH 3 2
222
P(O)C1 1,8 2,6
3
PS-S0 NH-(CH )2-0H P(O)CI 1,3 2,55
2 2 3
PS-SO NH-CH -CHOH-CH -OH P(O)C1 1,7 0,9
222 3
CH O-P(O)C1 2 0,37
PS-S0 NH-(CH )3-0H 3 2
2 2
P(O)C1 1,3 2,4
3
~- -~
 76

meq/ç % %
RESINES ~C ~H ~O ~N ~ Cl ~S %P
IBn msss en moles
0Il
PS-CH ~-~-OH 66 J3 7 J6 16 J4 1,,8 1,6 3,8 1J2 38 22
OH
0Il
PS-( C~ ) -O~ ~-OH 53,8 6,5 24 0, 1 2,6 10,5 3 J4 78 67
2 OH

PS-(CHi -O-P-OH
..
0
61 /9 6 J6 19 J2 <0, 1 1,7 7,9 2,55 62 54
:3 OH
0
"
PS-SO NH-(C~) -O-r-OH 40,7 5 J1 28,5 4,2 0,2 10 /2 7 /9 2,55 78 65
2 2 OH
R
i
PS-SO ~H-( CH 3- 0 - ~-Ol- 42,5 5,5 26,9 3,9 2,3 9,7 7,5 2,4 78 65
OH Q
PS-5C2NH-CH2-~H-C~-O-J 44J~ 5,5 28,~ 3 J7 0,9 1 1J2 2,9 0,9 31 21
OH 2(HOI

TABLEAU XV : résultats de mlcroanalyse (synthèse C )

3
 0
31J ' 1
PS-(C~ )-O-P.-OH
2 OH 60
1" mtq/g ..... poids

-"
CD
CI 0 0 0
"- 21J C 0,29 0,36
cr 8,3
•E 40 Co

..
1:
0Ji7
0,86
1,42
1,9
32,4
43,4
1,1 2p 60
te 1,3 2,8 64
1,0 1,46 3,4
20 78

r -mmol POCI 3 Imeq -OH

01J 0
0,0 0,5 11J 1,5

figure 25: variation du taux de substitution

en groupements phosphate en fonction de r. TABLEAU XVI

t HaOH
figure 26 : courbe de dosage acidirnÉ'trique
o
"
de PS-(CH2)2-0-P-OH
1
OH

H 9 7 5 3
 77

o - RESINES PHOSPHORYLEES

Les spectres IR des résines phosphorylées (Fig. 28) pré-

sentent une bande d'absorption caractéristique (Tableau XI) des
fonctions P=O.

Les taux de phosphorylation des différents polystyrènes

hydroxylés obtenus par les trois méthodes de synthèse (Cl,C2,C3)
et déterminés par microanalyse, sont reportés dans le tableau
XIV. Les résultats montrent que seule la phosphorylation par
l'oxychlorure de phosphore (POCI 3 ) permet la substitution com-
plète des unités hydroxyéthyles; en conséquence, c'est celle
que nous avons retenue. L'ensemble des résultats d'analyse pour
les différentes résines est indiqué dans le tableau XV ; le taux
maximal obtenu est de 3,4 milliéquivalents de phosphate par
gramme de résine.
Le taux de substitution est linéairement dépendant (Fig.
25) du rapport r du nombre de moles de POCl introduit par équi-
3
valent hydroxyle (Tableau XVI). Ceci permet de faire varier à
volonté le taux de substitution en groupements phosphate de 0 à
80 • en poids.

L'analyse par acidimétrie potentiométrique en phase hété-

rogène est effectuée sur une résine résultant d'une préparation
type mettant en oeuvre POCl comme agent phosphorylant. Le dosa-
3
ge conduit à une courbe de neutralisation (fig. 26) qui présente
deux paliers de neutralisation de longueurs voisines.
La différence observée <11 ,) entre la première et la se-
conde acidité ne peut résulter de différences dans les cinéti-
ques de neutralisation, celles-ci se conduisant dans des
conditions identiques pour les deux acidités. Elle pourrait être
dttribuée à une incertitude systématique lors de l'évaluation du
troisième point d'équivalence en effet, la fin de la courbe
correspondant à la deuxième neutralisation se confond <pH>11)
avec celle de la soude en excès. Cependant, cette différence
pourrait également provenir de la présence de fonctions phospho-
die~ter formées entre deuK ~roupe~ hydroxyleD voiDinD et un
 (!) ~)
[ NaCl ] pH 1/2 pK app meq/g
pH 1/2 A .
~~ 6 - 2, t
OM ..., 7,8-7,9
_ 9,8 "'2 , 0

5,6 2,47
0,2 M 7,6
9,6 2,13
5,1 2,47
0,5 M 7,4
9,7 2,27
5 2,48
lM 7,3
9,5 ,
225
5 2,51
2M 7,2
9,44 2,18
2,48
( microanalyse : 3,1 meq/g ) moyenne sur 4 po1nts 2,2
TABLEAU XII: caractéristiques acidimétriques d'une résine
ÇJ
P5-(CH )-O-P-OH
22 6H

..,C
8,0

PS-(CH )-O-P-OH
.o
f., 7~ 22 bH
~
.,
~ 7,6
C
K
~ 7,4

7;2
O,2M O,5H 1M 2H
OM
7,0
Ln ( .aCI )
figure 27 : variat ion du pK A apparent.
 78

groupement phosphate; comme par ailleurs, l'ordre de grandeur

de la différence observée est relativement important par rapport
aux incertitudes expérimentales des dosages acides-bases, et que
l'obtention de phosphodiesters est probable, nous avons inter-
prété ce résultat en admettant qu'environ 10 , des groupes phos-
phate sont sous forme de phosphodiester par cette voie de
synthèse et pour ces taux de substitution.
Il en découle que la phosphorylation des dérivés hydroxy-
les conduit essentiellement à la formation de phosphomonoester ;
nous n'avons pas effectué systématiquement cette analyse pour
les différentes méthodes de synthèse ni pour les divers taux de
substitution. Cette caractérisation devra être réalisée"in fine",
sur les résines présentant les caractères biologiques les plus
intéressants.
Comme mentionné précédemment, le comportement potentiomé-
trique de tels polyélectrolytes est lié à de nombreux paramètres
{173}: la constante d'ionisation varie en fonction du degré
d'avancement du dosage et le pK apparent du polyacide diminue
A
par exemple lorsque l'on augmente la force ionique du milieu.
Nous avons pu observer que les polymères que nous avons synthé-
tisés ont bien le comportement attendu; les pH de demi-neutra-
lisation (pH~) et les pK
apparents sont indiqués dans le
A
tableau XII la variation du pK apparent en fonction de la
A
concentration saline est représentée sur la figure 27.

Le taux de phosphore déterminé par microanalyse, indique

des taux supérieurs d'environ 20 , à ceux résultant de l'analyse
acidimétrique {Tableau XII}. Comme nous l'avions évoqué précé-
demment pour le dosage de fonctions acide carboxylique, cette
différence résulte probablement de la lenteur des cinétiques
d'échange ne permettant pas d'atteindre les valeurs d'équili-
bre; le dosage pourtant effectué à vitesse très faible, ne
prend en compte qu'un pseudo-équilibre thermodynamique. Dans ces
conditions nous avons retenu comme exact le taux indiqué par la
microanalyse avec une proportion de phosphomono et diester
déterminée par le dosage acidimétrique.
 RESINES ~ ~
~C XH XO ~N " Cl meQ/g
en masse en moles

ç'S-C~-guanine 71,7 6,2 6,76 5,8 8 0,8 22 13

PS-CH 2-urac il e 71,8 5,7 13,1 7,2 1,9 2,6 59 44

PS-C~-thym ine 74,4 6,3 7 4,3 6 1,6 39 28

PS-CH -cytosint 70,4 6,4 8,8 9,8 3,4 2,3 53 41

2
PS-CH '5'adénine 637 5,2 --- 20,7 5,2 3 74 66

TABLEAU XVII: résultats de microanalyse (synthèse 0)

'. ;-
-- ---- ... -' .

Ù
figure 28 : spectres IR de r Adénine-CH 2- CH 2-0 -P-OH
OH
o
l'
CIe PS-( CH 2 )2-0-F-O-CH2-CH2-Adénine
l' OH
o
et "
de PS-(CH2)2-0-P-O-CH2-CH2-Adéntne
OH 1
 79

E - RESINES DU TYPE PS-CH -B où B est une base

2

Les condensations des bases puriques et pyrimidiques avec

PS-CH Cl conduisent à une profonde modification des spectres IR
2
que nous n'avons pas tenté d'interpréter en détail étant donné
la multiplicité des bandes observées.
En revanche, la microanalyse a permis de calculer les
taux de substitution à partir du pourcentage d'azote (Tableau
XVII). La substitution obtenue (13 à 66 ,) dépend de la base
condensée.

,
OH

F - RESINES DU TYPE PS-(CH2)2-0-P-O-(CH2)2-B où B est une

base Il
o

La microanalyse des produits de condensation des bases

puriques et pyrimidiques avec des groupements alkyle hydroxyle
ou alkyle phosphate que nous avons synthétisés, présente une
composition élémentaire très proche de la valeur théorique
(Tableau XVIII) les points de fusion qui sont également indi-
qués, sont en accord avec ceux publiés (192,193).
Les compositions des résines comportant à la fois un
groupement phosphate <phosphodiester) et une base, sont repor-
tées dans le tableau XVIII. Ces résultats font apparaître que
malgré l'encombrement stérique, les taux de substitutions sont
importants qu'il s'agisse de la condensation des dérivés hydro-
xylés sur des polystyrènes phosphorylés (synthèse E2) ou de
celle des dérivés phosphorylés sur les polystyrènes hydroxylés
(synthèse E3).
La spectroscopie IR permet de suivre qualitativement les
différentes transformations chimiques réalisées; il ressort de
l'examen des déformations des spectres des différents produits,
dans le cas de dérivés du polystyrène comportant la fonction
phosphoéthyladénine, qu'il est possible d'analyser étape par
étape les synt.hèses réalisées (Fig. 28).
 _________ % C %H % O~;~-%CI l "p i m:q/ g l ,":"'.."~.,"
._ . _~!r'n'nC-O-liC':pH 46,9 5,1 9,4 35,7 i l, ;,),9 105
1 f:2<'.j() -~ 1

CytClsinE'-CH1"C~OH 46,5 5,9 20,4 26,':11 6.4 99

T (22[\" c
1
TI~yrnine-CH2-CHpH 48,8 5,7 28,5 17_,21' 5,9 100
["-IRn"e
r- --, - 0'1
AClénine-c~ -C~ -O-f-OH 25,5 3,9123,2 20,8 - 10,8 3,5 90
OH
------------------~--~--~---+---+---+--~~--_4-----4----4_~
Q
PS-CH -CH -Q-P-O-
2 2 OH
-CH~-CH~-Adénine 56,7 7,3 19,5 7,8 0,2 5,8 44 19
/. " 17 POJ-k
-CH -CH -Thymine 63 7 16,6 1,9 - 7,05 0,68 19 12
2 2
36 P04-i2
59,3 6,9 19,6 3,9 1 0,4 6,8 0,93 34 20
(29 POi~

PS-CHz-CH 2-O-
63,4 6,4 14,S 7,2 0,1 1,03 40 20
-S-O-CH -CH -Adénine
OH 2 2
~:_--------------+---4---~--~--~--~---*----~-----~
Q
____+-~
Il
i PS-( CH ) -Q-P-O- 1 1
i 2 2 O'H
1 -

-Adénosine
A 56,7 7 20,f 2,5 1',21 7,91 0,34 16
50 POJi2;
8
B 76,1 7,5 12 Il,8 1 0,4 0,5 0,17 8 4
F
-Guanosine

'S11
63,5 7,7 13,.d 5,9 0,3 5,1
0,84 (18~bH 19
li ~
- Thymidine 61 7
1 '4 15/;!4,6 ; 0,2 5,21' 1,63 74 48 1

! (i-:;' 1 7,5 1
17,~'; 5,:) Il' '0,2 5 il 1,25 57 32 1

-------
1
-1--1-
l --,!-î PG1'~'I'_
li --+--(8_":"';"1-_ 1
i
_ 1-__ _

? i )i\717,'17,sl,,4
t 1,8 7,'-lil i 1,01 i 32! -1
-Cno IlnP i " Iii i1 1 i : ~
1) 156,6 7,8120,1 2,5! 1,9 5,45 1 1,8 ,56 48
~--~--~----~----~----+--4

1 -Sérine 167 ,7 7 15,2 2,2410,2 5 1,6 51

1- ---.-------_ _- - - L _ - - - L _ - - - L _ - - - L _ - - - L _ - - - L _ - L L_ _- ' -_ _--'-_ _ _.L..--J
T-ABLE/:.U :'<V' ~! - rèS'_i~t:~t::: !je n-,icroanaiyse ( syntnèses E -' F .' G )
 80

G - RESINES FONCTIONNALISEES PAR DES NUCLEOTIDES

La condensation de nucléotides (phosphate-ribose-base

hétérocyclique azotée) avec les résines de polystyrène hydroxylé
(PS-(CH2)2-0H) est mise en évidence par spectroscopie Infra
Rouge en particulier avec l'apparition des bandes caractéristi-
ques P=O.
L'analyse élémentaire permet le calcul du taux de substi-
tution (tableau XVIII) tant pour la fixation de nucléotides sur
les polystyrènes hydroxylés (synthèse Fa) que pour la condensa-
tion de nucléosides sur les résines phosphorylées (synthèse Fb).
Il est à noter que les deux méthodes de synthèse condui-
sent comme précédemment, à introduire un même groupement
fonctionnel dans un environnement différent; dans un cas en ef-
fet, le polymère est un polyélectrolyte porteur d'un excès de
fonctions phosphate non substituées, dans l'autre les nucléoti-
des sont entourés de fonctions hydroxyle.

H - RESINES CONSTITUEES D'ANALOGUES DE PHOSPHOLIPIDES

La microanalyse confirme, comme dans le cas de toutes les

synthèses précédentes, l'analyse spectroscopique IR (bandes ami-
nes et phosphates). La phosphosérine (synthèse Gl) et la phos-
phocholine (synthèse G2) fixées sur le polyChydroxyéthyl styrè-
ne) représentent ainsi plus de la moitié de la masse de la
résine (Tableau XVIII).
La fixation de phosphocholine à l'aide de bromoéthyl
dichlororophosphate CG2b) permet d'atteindre un taux de substi-
tution plus important qu'avec le premier agent de condensation
(G2a) la substitution totale (Br<0,2 1) du dérivé bromé inter-
médiaire (Br:14 1), conduit à l'obtention d'un polymère où tous
les sites phosphate sont sous la forme de phosphodiesters
associés à une molécule de choline.
 81

11-3 - DISCUSSION GENERALE

Les différentes méthodes d'analyse appliquées à tous les

polymères nous ont permis de les caractériser du point de vue de
leur composition chimique moyenne et ce quels que soient les
dérivés fonctionnels considérés. Il apparaît ainsi que nous
avons pu synthétiser par des réactions effectuées en phase hété-
rogène, une gamme de résines porteuses de groupements fonction-
nels différents et avec des taux de substitution variables. Il
est à souligner que la plupart des synthèses sont originales,
les produits correspondants n'ayant jamais été décrits.

La discussion que nous avons effectuée, cas par cas, pour

la caractérisation de ces résines laisse entière une question
générale. En effet, la détermination des valeurs moyennes des
compositions ne nous renseigne en aucune manière quant à l'hété-
rogénéité de la distribution des groupements fonctionnels dans
les phases solides; celle-ci provient du fait que les cinéti-
ques réactionnelles globales sont la résultante d'une part de la
vitesse locale des réactions au sein du polymère réticulé et
d'autre part, de la diffusion des réactifs depuis la surface
jusqu'au coeur des résines.

Deux cas limites sont de ce point de vue à considérer:

- Si la diffusion est rapide et la cinétique chimique est l'éta-
pe lente, la distribution des groupes chimiques dans la masse
des grains est homogène
- Si au contraire, la réaction est contrôlée par la diffusion
des réactifs, la distribution est essentiellement hétérogène;
la surface des résines est alors constituée de chaînes macro-
moléculaires totalement substituées et le coeur des grains
vierge de toute fonctionnalisation. Dans cette hypothèse, les
deux domaines sont séparés par une zone correspondant à un
front d'avancement de la réaction chimique dans laquelle le
taux de substitution varie rapidement.
 82

Seule la mise en oeuvre de méthodes d'analyse de la den-

sité superficielle des substituants chimiques, telles que l'ESCA
par exemple, permettrait de conclure directement quant à cette
importante question. Nous n'avons pas tenté d'utiliser ces
méthodes, car un examen attentif des données publiées nous a
convaincus de leur inefficacité lorsqu'elles sont appliquées à
la caractérisation de la surface de poudres constituées de
grains de 100 pm environ de diamètre.

Cependant, selon que les cinétiques de réaction hétérogè-

ne obéissent à l'un ou l'autre de ces deux modèles, les résines
obtenues ont des propriétés tcès différentes.
Dans le dernier cas, en effet, la composition de la sur-
face est la même quel que Süit le taux de substitution, et les
propriétés de ces polymères rapportées à l'unité de surface sont
indépendantes de ce taux. En revanche, les propriétés rapportées
à l'unité de surface des résines sont dépendantes de la composi-
tion dans le premier cas; cette dernière remarque permet de
conclure indirectement quant aux étapes contrôlant la cinétique
hétérogène, lorsque les méthodes de caractérisation physico-
chimique des surfaces ne donnent que des résultats décevants.
Nous verrons dans la suite, par l'étude des propriétés
biologiques des polymères fonctionnels synthétisés, que la
présente discussion va nous permettre de conclure quant à la
cinétique de certaines des réactions en phase hétérogène.
 83

INTERACTIONS DES ANTICORPS LUPIQUES

( ANTI-ADN ~ ANTICOAGULANTS CIRCULANTS )
AVEC LES POL YMERES FONCTIONNELS

I INTRODUCTION

Nous avons vu précédemment que le sérum des patients

atteints de Lupus Erythémateux Disséminé (L.E.D.) contient géné-
ralement des anticorps anti-ADN et/ou des anticoagulants
circulants (ACe). En vue de mettre en évidence une éventuelle
interaction biospécifique entre les polymères fonctionnels syn-
thétisés et ces immunoglobulines, ainsi que les variations de
ces interactions avec la structure des polymères, nous avons
déterminé les isothermes d'adsorption des anticorps provenant
des sérums des malades lupiques sur les différentes résines.

Pour ce faire, nous avons incubé des résines placées en

suspension dans des sérums lupiques et dosé les anticorps dans
les surnageants obtenus après centrifugation. Dans quelques cas,
les sérums lupiques ont été remplacés par des solutions de
protéines (lgG) purifiées.
Dans tous les cas, des contrôles ont été effectués en
employant des solutions aqueuses tamponnées ou des sérums
humai os normaux.
Il est à noter enfin, que dans le but de mettre au point de
nouvelles méthodes de dosages des anticorps lupiques, nous avons
effectué des déterminations directes des quantités d'anticorps
adsorbées par la mise en oeuvre d'un radioimmunoessai.
Après avojr décrit les différentes méthodes utilisées, nous
) Ji) de Sérum lupique au 1/10 ( l p. Borate) .. 50 Ji} d' ADN ( 1 1 1 n9 )*

__ J_-"
~gitatj()3)
---_..-
1 3 (1 rn rl a 37 0c -1- 18 fl à 4 "c
i
+ 1 ml
+
de S.A.5. à 55 '"

_ _ .~.t. ____
(ag tat:o~
...... _---- .....
30 rnn a 4 0 c

.. 1 ml de S.A.5. à SO "

,.-
_.1-~-...
( aoi tat lOn)
-'
'~
----_ .... ~,..
.~

1
~ 30 rnn à 1500 G ( 4°C \

(·--~ec·~
\ ........ _--..... _.- -.r----... --.~
1

t
+ 1 ml de Tampon Borate
_i_._
\I/~(
.......: i. t....at i. o~')
./'~
-- .-,-- ...•-

Tranvaser dans 5 ml <fA.C.S "

Comptage ft
 84

rapporterons les résultats obtenus ceux-ci, réalisés avec la

collaboration de V. MIGONNEY et la participation de C. LERET
(166), seront exprimés en terme de constante d'affinité des
anticorps pour les résines.

II METHODES

A - LES ANTICORPS ANTI-ADN

Nous sommes redevables des sérums lupiques contenant des

anticorps anti-ADN que nous avons utilisés, au Dr L. JACOB
(U25, Hôpital Necker, Paris).

A-l - PRINCIPE

Etant donné la sensibilité du test de FARR et le fait qu'il

permet de réaliser des déterminations précises, nous l'avons
retenu en tant que méthode de dosage des anticorps anti-ADN
lupiques. Les quantités d'anticorps anti-ADN, présents dans le
sérum ainsi que dans les surnageants résultant des équilibres
hétérogènes pOlymères-sérum, ont été déterminées.
Pour établir les isothermes d'adsorption, nous avons incubé
des quantités variables (16 à 64 mg) de résines dérivées du
polystyrène pendant 30 minutes à 4°C sous agitation permanente
avec différentes dilutions de sérum lupique. Les résultats
publiés (3) concernant l'adsorption de protéines sur les
polymères indiquent en effet qu'un temps de 15 minutes est géné-
ralement suffisant. Après centrifugation, le surnageant est
dilué et incubé avec une quantité fixe d'ADN double brin marqué
au :1.4C ; en parallèle, différentes dilutions du sérum initial
 1
40 ~
,
• •

-
-+
Z
Q
lICE

o 5 10 15 20 25

figure 29: cinétique d'incubotion è 4 0 C

 85

sont également incubées avec l'ADN. Le taux d'anticorps anti-ADN

adsorbé sur les résines est mesuré par différence des propor-
tions d'ADN précipité à partir du sérum lupique avant et après
incubation avec les polymères.
On réalise également ce test avec de l'ADN simple brin
obtenu par dénaturation thermique et ultrasonique de l'ADN natif
(161) .
Une description détaillée de la technique utilisée pour
réaliser le test de FARR est reportée dans le Tableau XIX.
Toutefois, comme nous l'avons vu précédemment, la spécificité,
la sensibilité et la reproductibilité du test de FARR sont liées
aux conditions opératoires, ce qui nous a conduits à étudier
l'influence sur le test de paramètres comme la durée de
l'incubation à 4°C, la dilution du sérum, la décomplémentation,
la congélation-décongélation du sérum ainsi que sa conservation
à 4°C.

A-2 - INFLUENCE DES CONDITIONS OPERATOIRES SUR LE TEST

DE FARR

a) Cinétique à 4°C

En fonction des données publiées analysées précédem-

ment, nous avons étudié l'influence de la durée de l'incubation
à 4°C sur la formation des complexes ADN-anti-ADN.
Nous avons ainsi ajouté à l'incubation à 37°C classi-
quement utilisée (24,150,151,153,159) une incubation à 4°C d'une
durée variable comprise entre 90 minutes et 24 heures. On obser-
ve (Fig. 29) qu'une période d'au moins 4 heures à 4°C avant
l'addition de sulfate d'ammonium, est indispensable pour la mise
en évidence des anticorps anti-ADN présents dans le sérum de
patient lupique ("546"). Ce résultat est en accord avec ceux de
T. PINCUS (151) et R. MANTHORPE et coll. (150) qui préconisent
respectivement 24 heures ou 15 heures d'incubation à 4°C. En
revanche, nos conclusions diffèrent donc de celles de L. AARDEN
et coll. (24,158).
 1

80 J ,
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1
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60.-11 /"
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110 ng d'ADN
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1- uolume ( ,11 )
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0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

flgure 30 : influence du volume de sérum lupiQue

50 i ,
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40 ~
""" /4"
.."
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Z
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1

10 -1

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1 /""',
i
SERUM ( • )
,..,
o ./ '-
,
0 20 40 60 eo 100

figure 31 . influence de la "déco((lplémentatlon" du sérum luplQue

 86

b) Dilution du sérum

La quantité d'ADN précipité dépend bien évidemment du

rapport des concentrations de l'antigène et de l'anticorps (24).
Nous avons donc en conséquence étudié la relation entre la
proportion d'ADN précipité (à l'état de complexe ADN/anti-ADN)
et la concentration des anticorps présents dans les sérums
lupiques dilués dans une solution aqueuse tamponnée (tampon
borate pH = 8,4).
La courbe de la figure 30 est une représentation typi-
que de la variation de la proportion d'ADN précipité en fonction
de la dilution; cette courbe met en évidence que la précipita-
tion de l'ADN ne varie de façon sensible que dans un domaine
limité de dilution. Nous avons en conséquence, défini un mode
opératoire qui nous permet de travailler dans le domaine utile
de dilution des sérums lupiques (de 0 à 50 ~l au 1/10 cf. Fig.
37) •

c) Décomplémentation

La "décomplémentation" par chauffage du sérum pendant

1/2 heure à 56°C peut avoir pour effet de détruire le complé-
ment, en particulier le C 1 q, qui se fixe de façon non spécifique
à l'ADN; cette procédure ayant donné lieu à des résultats di-
vergents (24,151,158,159,160), nous avons mesuré le taux d'ADN
par un sérum 1upique préalablement, ou non, "décomplémenté".
Comme le montre la figure 31, le chauffage de 30 minu-
tes à 56°C du sérum lupique n'induit aucune modification des
courbes de référence. La précipitation d'ADN non spécifique,
observée dans la méthode de FARR, par du plasma ou sérum humain
normal diminue légèrement (de 10 à 5 , d'ADN précipité après dé-
complémentation).
Nous n'avons donc pas procédé à la décomplémentation
des sérums dans nos protocoles.
 60~----------·----~
; S.L-0970 1- •
'(
J.O] S.L -93199- •

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SERUH (S)
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c) ,
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J+39
J+52
J+73
10 ~ ~ ~
j
i
• SERUM ( Z )
o+-- ~---
o w ~ 60 80 100
figure 33 : lnfluence de la conservation du
sérum luplQue à 40 C
 87

d) Conservation du sérum lupique

Nous avons étudié l'influence des conditions de con-

servation du sérum lupique, sur les résultats obtenus lors de la
mise en oeuvre du dosage des anticorps anti-ADN.
Après un nombre variable de cycles congélation-décon-
gélation (de -sooe à +37°e), trois sérums lupiques et le pool à
volumes égaux de ces trois sérums ont été analysés dans un test
de FARR (Fig. 32). La comparaison des résultats avec ceux
obtenus pour les mêmes sérums congelés une seule fois montre que
les cycles de congélation et décongélation des sérums lupiques
entraînent une augmentation significative des taux d'ADN
précipité.
En outre, la conservation à 4°C du sérum lupique
durant plusieurs mois conduit à une diminution, faible mais
progressive, du taux d'ADN précipité (Fig. 33).
En conséquence, les sérums lupiques que nous avons
utilisés, ont été distribués, congelés à -SooC puis décongelés
une seule fois avant leur utilisation.

A-3 - EXPRESSION DES RESULTATS EN GRANDEURS MOLAIRES

Les résultats obtenus par la méthode de FARR ne sont

que très rarement exprimés en grandeurs molaires. Ceci entraîne
une difficulté pour l'analyse des propriétés des biomatériaux
polymères en contact avec des sérums lupiques. Pour lever ces
difficultés, nous avons mis en oeuvre deux méthodes de calcul
des concentrations molaires des anticorps anti-ADN dans les
sérums lupiques.

a) 1ère méthode

La première méthode est basée sur l'hypothèse, retenue

par ailleurs par L. AARDEN et coll. (149) selon laquelle, la
 ;?
l ' ..
Ai)N 'ypfjnj
< 1-' '.. "-
\.
i- ,:,
t-"'~ ~

wwn (pl) obArvé )(=1 )(=2

1 1,00 9,9 14,9 1,3

2 1,~ l,g,4_ - _20,L 1 2,7
3 1,75 r 21,9 22,8 3,5
4 2,00 1 22 .. 1 24,9 1 4,~
5 2,25 1 27 ..5 26,7 1 5,4
6 2,~ 31,~ 28,~ 6,4
•'- .iP_ J•
7
8
2,75
3,0
..13.1..
37,3
- 31,3
7,4
8,4

.......--. l
4,~ ~,~
.
~O
S.L-1SS- / ...... : Ln ( Fo ) =f ( Y)
40 /

• l "- ·
c~ 4,31 ~. -8
C anti-.+d>N = 1,9 .10 M
C c·O,l78
..., 1
&:

... '" ,

3,9 +-~-..--",,--"'--,---r----.---r--"-:----11 •
o 2 3 4 ~

VOLUtE (,1)
figure 34: calcul de la concentration en anti-ADN
 88

fonction de distribution du nombre de molécules d'anticorps par

molécule d'ADN dans le complexe Antigène-Anticorps, suit une loi
de Poisson :

-r x
e .r
F (x) = avec F (x) fraction de molécules d'ADN
x!
qui fixent x molécules d'anti-
corps
et r rapport molaire des quantités
initiales d'anticorps et d'ADN

-r
Sans anticorps, cette relation devient F(o) = e et donc la
proportion d'ADN libre (F(o» est telle que Ln(F(o» = -r = -C.V
avec V le volume de sérum pur et c une constante.

Appliquée à l'interprétation des résultats du test de

FARR, cette méthode consiste à considérer que F(x) représente la
proportion d'ADN précipité dans des domaines où x est constant
et, r (avec une quantité initiale d'ADN constante) est propor-
tionnel à la dilution du sérum (résolution numérique en annexe).
Le calcul de r pour chaque dilution du sérum est
effectué en reportant, comme indiqué sur la figure 34, le loga -
rithme de la fraction d'ADN libre en fonction du volume de
sérum on obtient alors une droite de pente c. La comparaison
(Fig. 34) des abaques représentatives de la variation de F(x) en
fonction du volume (V) et des résultats expérimentaux, permet de
déterminer les domaines dans lesquels x est constant.
Dans le cas du sérum lupique étudié ("155"), dans le
domaine de dilution de 4 à 6 " x est égal à 1; en utilisant
des concentrations de sérum lupique plus importantes, nous cons -
tatons une augmentation du nombre de molécules d'anticorps fixés
par molécule d'ADN. Ces résultats sont en accord avec ceux de
L. AARDEN et coll. (149) qui indiquent en outre qu'une molécule
d'ADN (M = 6 x 10 6 ) peut fixer jusqu'à 200 molécules d'anticorps

La connaissance de x et de r nous a permis de calculer

la concentration molaire Qe~ antlcorp~ antl-ADN àan~ le8 8érums
 89

lupiques dont nous avons disposé: pour 5 pl de sérum "155" non

dilué, le calcul effectué à l'aide de 7 courbes d'étalonnage
conduit à une valeur de r=0,78 (a=0,09) r étant le rapport
molaire du nombre de molécules d'anticorps au nombre de molécu-
les d'ADN (initialement introduits dans le test) on obtient avec
-1
M ~ 150 000 g,mole -
IgG 6 -1
M - 10 g.mole (estimé)
ADN -7
ffi
ADN
= 1,11.10 g
-3
une valeur de la concentration de 2,6(±0,3).10 gll c'est-à-
dire 1,7(± 0,2).10- 8 M.

Cette valeur est en accord avec les estimations qui

résultent des comparaisons entre sérum lupique et solutions
d'anticorps monoclonaux effectuées par D.W. BALLARD et coll.
(162) elle est également comparable à celle que l'on peut
calculer à part ir des résultats de L. AARDEN et coll. (149).

b) Méthode thermodynamique

Le calcul de la concentration en anticorps anti-ADN

dans le sérum lupique peut également être effectué par une
deuxième méthode utilisant une analyse thermodynamique de la
précipitation d'un antigène (Ag) par x anticorps (Ac) :
Ag + xAc ~ Ag - Ac x ~

Le produit de solubilité (5) est une constante thermo-

dynamique définie par la relation

S = [Ag] . [AC]x avec [Ac] et [Ag] les concentrations

des espèces libres.

Dans le cas où x=l, le pourcentage d'ADN précipité (F)

peut s'écrire
[Ag-Ac P
F :::
 90

et la concentration initiale en antigène C

Ag
= [Ag] + [Ag-Ac ~]

la concentration initiale en anticorps C

Ac
= [Ac] + [Ag-Ac ~]

Ainsi, pour deux couples de points obtenus sur la

courbe d'étalonnage, on obtient la relation:

étant donné que C

AC
= a,c Ac ' ~vec a facteur de dilution entre
1 2
les deux concentrations de sérum, on a l'expression

F 2 - F - F 2 + Fi
221
=

Par récurrence, pour n points de la courbe d'étalonna-

ge, on obtient n . (n-l)/2 relations du type:

CA C l.
=
1 - F(i) - œ + a.F(i+j)

avec iE[1,n-1J et j€[l,n-i]

La résolution de ces systèmes d'équations peut être

effectuée de façon numérique.
Dans le cas des résultats reportés sur la figure 34,
dans le domaine de dilution compris entre 4 et 6 'de sérum
lupique "155" (x=l), la valeur calculée de la concentration
-8
d'anti-AON est: 1,9(±0,2).10 M.

Les deux méthodes de calcul nous conduisent ainsi à

des résultats identiques ; nous avons donc pu, par la mise en
oeuvre de ces méthodes, déterminer avec une bonne précision la
valeur de la concentration en anticorps anti-ADN dans les sérums
-8
lupiques dont nous disposions: elle est de l'ordre de 10 M.
 91

A-4 - ISOTHERMES D'ADSORPTION DES ANTI-ADN

L'établissement des isothermes d'adsorption est effec-

tué, en dosant les anticorps anti-ADN au moyen du test de FARR,
sur les surnageants des résines incubées avec les sérums lupi-
ques et normaux (contrôle) à différentes dilutions. L'incubation
avec les polymères biospécifiques a pour effet de diminuer le
taux d'ADN précipité dans les surnageants de la suspension de
résines dans le sérum lupique (Fig. 37). Les taux de précipita-
tion obtenus, correspondent à des concentrations d'anti-ADN dans
les sérums dont les valeurs sont déterminées à partir de la
courbe d'étalonnage précédemment décrite; la différence
d'abscisses relevée en reportant sur cette courbe de dilution,
le taux d'ADN précipité dans le surnageant, permet de calculer
la quantité d'anticorps anti-ADN adsorbée sur la résine; celle-
ci est exprimée en taux de dilution du sérum lupique initial et
peut être convertie en grandeurs molaires à partir de la déter-
mination des concentrations molaires en anticorps anti-ADN
présents dans le sérum.

B - LES ANTICOAGULANTS CIRCULANTS

La détermination des isothermes d'adsorption des ACC a été

effectuée par comparaison des temps de coagulation, dits de
Céphaline Kaolin (TeK) mesurés sur les sérums lupiques et les
surnageants obtenus à partir des suspensions de polymère dans
les sérums lupiques.
Comme précédemment, nou~ avons étudié l'influence de divers
paramètres tels que la concentration des ions calcium ou
l'influence d'une décomplémentation préalable des sérums.
 92

B-1 - PRINCIPE

Les plasmas lupiques contenant des A.C.C. ont été mis à no-
tre disposition par le Pro M.J. LARRIEU (Centre Hospitalier de
Bicêtre, Kremlin-Bicêtre) et par le Pro G. TOBELEM (Hôpital
Lariboisière, Paris).

a) Préparation des sérums

Tous les sérums lupiques ou normaux utilisés au cours

de cette étude sont préparés de façon identique : ils sont issus
de plasmas citratés (complexation des ions Ca 2 +) dans des condi-
tions standards, coagulés par une solution de thrombine; après
une incubation de 4 heures à 37°C destinée à permettre la
rétraction du caillot, le sérum est recueilli par centrifugation

b) Mesure des TCK

Le protocole détaillé de la mesure des Temps de

Céphaline Kaolin (TCK) est reporté dans la partie expérimentale
(11-B) ; il implique une incubation d'une heure à 37°C des sé-
rums lupiques ou normaux, avec des volumes identiques de plasma
humain normal citraté ; cette première incubation permet la neu-
tralisation par les inhibiteurs présents dans le plasma, des
facteurs activés de la coagulation subsistant dans le sérum.
L'incubation de ce mélange sérum-plasma avec une solution de
céphaline (extrait phospholipidique de cerveau) et de kaolin
pendant 3 minutes est suffisante pour que les ACC complexent les
phospholipides. En effet, les ACC sont des inhibiteurs rapides
de la coagulation. Cette deuxième incubation est complétée par
une addition de chlorure de calcium qui déclenche la voie
intrinsèque de la coagulation. Dans ces conditions, la présence
des ACC se manifeste par un allongement des TCK.
 1
110 -.
•
1
--
U)

~
100

90 l
~

...
(.)

80 -t
di 1ut i on du sérum
• l00~
:
1; A SOW;
1 o 23~
70 ~ • 0 W;

60 ~
i -2
;
;
CaC1 (10 M)
1 2
50 -:--

figure 35 : variations de-s TeK en fonction de la

dilution du sérum et de la concentration de CaC1
2

-
75

~--.. _._---_._----
65 "' ....... .' ------- If il( -",.-. S.H.N. ( 1/2 h 56° + 1h 37°)

- . . _-fi. . .
55.,
i
!
""-. "'----""-
--- . - - - - -_ _ _.--Ü....-._

45'+--~ ~----~---~--~--~----~----

o 20 40 60 80 100
SERUM ( 1 )
figure 36 : effet de la "décornplémentation" du sérum lupique
 93

c) Influence des conditions opératoires sur la valeur

du TCK

c-1) Concentration de Ca 2 '"

Les TCK sont sensibles à la concentration des ions
Ca 2 '" (Fig. 35). La courbe représentant les temps de coagulation
en fonction de la concentration de Ca 2 '" ajoutée présente un
minimum. C'est à la valeur correspondant à ce minimum, et pour
chaque dilution du sérum dans le tampon, qu'il faut se placer
afin d'obtenir des valeurs précises et reproductibles (Partie
Expérimentale II--B).
Il est à noter que l'utilisation de sérums citratés
évite tout risque d'erreurs liées à la déplétion en ions Ca 2 '" du
sérum lors de l'incubation de ceux-ci avec les résines phospho-
rylées.

c-2) Décomplémentation
Les protocoles concernant la détection des ACC pré-
voient une "décomplémentation" par chauffage à 56°C pendant 30
minutes des sérums testés. Nous avons vérifié l'utilité d'une
telle pratique en comparant les résultats des mesures de TCK
d'un sérum lupique ayant ou non subi cette "décomplémentation".
Ceux-ci montrent qu'il est, en effet, nécessaire (Fig. 36) de
"décomplémenter" le sérum lupique pour que la présence des ACC
se traduise par un allongement des TCK.
Il est à noter que nous n'avons pas observé, dans
nos conditions opératoires, les allongements des TCK anormaux
décrits antérieurement (54,169,170,171) dont l'interprétation
repose sur la présence dans certains plasmas normaux d'un
"cofacteur du lupus".

B-2 - ISOTHERMES D'ADSORPTION DES ACC

Afin d'établir les isothermes d'adsorption des ACC sur les

résine:s, de~ q~antités variables de polymère (12 à 40 mg) sont
 94

incubées à 4°C pendant 30 minutes sous agitation c.onstante avec

)es sérums lupiques et normaux (a titre de contrôle) à différen-
1 es di !l1t ions. Les temps de Cépha1ine Kaolin sont reportés en
fon~lion de la dilution dans le tampon, du sérum 1upique, du
sérum humain normal ~t du surnageant de la suspension de résine
dans le sérllm. Un résultat typique de ces mesures de TCK est
représenté ~Ul" la figure 36. Les TCK obtenus avant et après
l'ilicubdLiou A.vec.~ 1.", t-ésine correspondent à des quantités diffé-
rentE'S d'anticorps dnticoagtl1ants dans le sérum; la différence
d~s abscisses relevées en reportant lE's valeurs du TCK du
surnageant et du sérum lupique initial mesure le taux d'ACC
~dRorhé (exprimé en taux de dilution du sérum 1upique initial
utilisé).

C - LEB IMMUNCX:;LOBULINES G NORMALES

L' ét<::tbl i s sem"'nl des isothermes d'adsorption des immunoglobu-

lines ~ nnrmale~ pour les ré~ines permet de comparer les valeurs
ries const,3ntt=>S d'affinité obtenues avec des IgG normales, à
re11 es mesurées P('Ut" les anti-ADN et les ACC.
La quantité d'IgG adsorbée sur les polymères est mesurée à
l'aide d~ trois méthodes: - immunodiffusion radiale
- dosage protéique
- lê1dioimmunoessai.

C-1 - H1MflNODIFFUSTON RA;1TAf.E

LM. cr.n,-".ntratJOn en imlo\'1J1('globuUnes de type G est mesurée

pal" immunodiffusion radiale (l27), sur les sérums lupiques et
normaux et les surnayeants de ç~ux-ci incubés pendant 30 minutes
A 4°C Hvec les résines.
 • Résine phosphorylée il 32 %

40~ Cl
0

- roj
/~~

Cl~

Cl
S.l. "546"

..
Cl
M
..... • S.l.+R Cl
1
x S.H.N.
•
Z Cl
Q
~
1
20
1 Cl
•
10 Cl
•
x_x-x--- K

0 /
1 /
~ --- ~
Cl

X ~-~:
)(~ __ x---- x - ~

o ~ ~ ~ ~ 100
ANTI-ADN ( Z )
figure 37 : courbe de précipitation d'ADN
 9S

C-2 - DOSAGE PROTEIQUE

Le dosage de protéines, suivant la technique de Folin (Par-

tie Expérimentale IV-l), est réalisé sur les solutions purifiées
d'IgG et sur le surnageant des suspensions de polymère dans ces
mêmes solutions. Les isothermes d'adsorption sont établies en
incubant pendant 30 minutes à 4°C, des quantités variables d'IgG
avec les résines phosphorylées. La quantité d'IgG adsorbée est
mesurée par différence des concentrations d'IgG avant et après
l'incubation.

C-3 - RADIOIMMUNOESSAI

Des quantités variables d'IgG radiomarquées à l'Iode 125,

sont incubées pendant 4 heures à 4°C avec les polystyrènes phos-
phorylés (Part.ie Expérimentale IV-2). La radioactivité mesurée
sur la résine correspond alors directement à la quantité d'IgG
adsorbée. Les isothermes d'adsorption sont établies et les cons-
tantes d'affinité calculées par les techniques précédemment
décrites.

III AFFINITE DES ANTICORPS

ANTI-ADN POUR LES RESINES

Nous avons étudié la variation de l'affinité des anticorps

anti-ADN pour les résines phosphorylées en fonction du taux de
substitution en groupements phosphate. Nous avons de même carac-
térisé l'adsorption de ces anticorps sur les polymères porteurs
de groupea fonctlonnel~ constitués de bases puriques et pyrimi-
 -
1--- sérum lupique ADN simple br in ~
1

ADN doublE' brin ~

i
1
1 "155" 28 % 55 %
!
j
1-- 1
1
i "546" 69 % 50 %
i
L- 1

TABLEAU XX : caractéristiques de pn~cipitation d'ADN (50 Il 1 au 1/10 )

~--------------------------------r~
S.L.-155-
50
'"

..
M
....
.a
40 ". ADNdb
-0- ~sb
20
-
"0 30
Z
Q 10
oC 20

10

0 ~~---r--~-.--~--.-~---r------+O
0 20 40 60 80 100
ANTI-ADN ( S )

70 70
S.L.-S46-
60 60
.....
-
--
M

oC
50

40
.. ADftd>
-0- ADN sb
/ /
50

40
!!le
......
...
oC
CI)

"Qz m 30 z

oC 20

10
/
/
1. .,-
20

10
0
..c(

0
~ 0
20 40 60 go 100
0
ANTI-ADN ( S )

riqure "6 cour[JPs (je ;)!-ec pltation d'ADN natif ( db )

c·t aenature ( sb ) .
 96

diques associées ou non à des groupements phospho mono et

diester.

L'adsorption des anti-ADN sur les résines dépend à priori de

quatre paramètres qui sont
- la concentration des anticorps anti-ADN dans le sérum
lupique
- la variabilité des sérums lupiques selon les patients
- la concentration de polymère utilisé
- le taux de substitution de la résine.

En ce qui concerne l'influence de la nature des sérums lupi-

ques, il faut remarquer que les anticorps auto-immuns sont dif-
férents selon les patients et que les sérums contiennent des
anticorps anti-ADN simple et double brin. Ils peuvent en outre
présenter des anticorps anticoagulants de natures diverses.
Nous rapporterons ici les résultats obtenus avec les sérums
lupiques "155" et "546" qui contiennent des anticorps anti-ADN
natif et dénaturé en proportions variables (Tableau XX et Fig.
38>'
Les résultats relatifs aux sérums contenant à la fois des
anticorps anti-ADN et des Ace seront considérés à part.

111-1 - INTERACTIONS DES RESINES PHOSPHORYLEES AVEC LES ANTI-ADN

Nous avons étudié l'influence des quatre paramètres gou-

vernant l'adsorption des anticorps anti-ADN sur les résines
phosphorylées.

La variation de l'adsorption en fonction de la concen-

tration en anticorps est représentée par le tracé de l'isotherme
d'adsorption, établie à partir du sérum "155" dont il est à
noter que les anticorps lupiques reconnaissent de façon identi-
 o,~ S.L-155-

,..
• 322911
+ 215 911
t x 114911
+ +
CIl
..,
0,4
~...-///'~
• ..----" --
...
+
--~- -.
~
t ----------------- +

1
0,3 /'

~ + x
QI
C
0,2
x
•"c
....!.
•
C
~
AllTI-ADR .IRODUIT (10 H)
O,O+---------~----~--~----~----~i----~i----~i----~i

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6

figure 39: isothermes d'adsorption sur polystyrène phosphorylé (30")

~o
S.L.-S46-
,..,
-
0
40
" rJ motifs phosphelte
a)
0

1
~
30 o
•
x
A
32~
43~
~~
~~
0

•x
;
.!.
20
•x
... x
•
~ 10 A
t.
X
~ MlTI-ADII (S)
0
0 20 40 60 80 100

f 19u r e 40 : lsotijer~nes<j'adsorpt ion d'ant icorps

Jnti-,ADN pc'ur 200rng/rnl de différents
pc\lystyrènes phosprlorylés
 97

que l'ADN simple et double brin (Fig. 38). La figure 39 repré-

sente trois isothermes obtenues, pour une résine hydroxyéthyle
phosphorylée à 30 " préparée par le procédé de synthèse décrit
précédemment (synthèse C 2 ), avec trois concentrations de polymè-
re en suspension dans le sérum (320 ; 215 ; 115 g/l).
Ces isothermes obéissent à une loi de Langmuir; l'or-
donnée du plateau de saturation est proportionnelle à la concen-
tration du polymère dans la suspension. A partir de ces isother-
mes, nous avons calculé la constante d'affinité des anticorps
anti-ADN pour cette résine phosphorylée. Nous avons trouvé une
valeur de 4.10 8 litres/mole (M-1). Cette valeur est élevée si on
la compare aux valeurs usuelles des constantes d'affinité des
protéines plasmatiques pour des dérivés du polystyrène (138,
139). Cependant, cette constante apparente est faible devant
celle des anticorps anti-ADN pour leur antigène naturel, l'ADN:
10 11 à 10 12 M-1 (168).

L'adsorption des anticorps anti-ADN double brin sur des

polymères, porteurs par l'intermédiaire d'un bras éthyle de
groupements phosphoester à des taux compris entre 8 et 64 , en
poids, a fait l'objet d'une étude systématique à partir du sérum
lupique "546"*. Ces polymères ont été synthétisés selon la mé-
thode de phosphorylation décrite antérieurement (synthèse C 3 ).

Les isothermes d'adsorption, établies pour une concen-

tration identiqu.: (200 mg/ml) des différents polymères phospho-
rylés, sont représentées sur la figure 40. L'examen de ces iso-
thermes fait apparaître que l'adsorption des anticorps anti-ADN
varie de façon significative d'un polymère à l'autre. Cette
variation ne peut être attribuée ni à des différences de concen-
tration de polymère, ni à des concentrations différentes du
sérum lupique qui sont les mêmes dans chaque cas, ni à des
différences de la surface spécifique des grains de polymère.

*Ce sérum lupique contient une population hétérogène d'anticorps

anti-ADN le taux de précipjtation de l'ADN simple et double
brin par ce sérum est en effet différent.
 40
•
'"
w
D
•
•x
U.,.8EIDI
8O.8EIU1
6O.8EIDI
10 4OW8EIU1

1 20
1
.L
i 10

*"' ~ ./
0
0 10 20 10 40 50 60 10
......HATEOO

flj!fE' 4: : l du tj!J~' ce su~~stitution sur iadsorption

n f<H?nCe
d'anticorps afiti-,ADN ( .?OO mg/ml de polystyrènes
ol;ospnor,/ès ,~ differer'ts taux de substitution) .
 98

dont la forme et~ les taux de gonflement sont voisins. Cette

variation d'adsorption ne peut donc être rapportée qu'à un effet
de la composition des polymères. En vue de le mettre en éviden -
ce, nous avons reporté sur la figure 41, la variation de la
quantité d'anti-ADN adsorbée en fonction de la composition des
résines, pour quai:re dilutions du sérum lupique.
Cette représentation fait apparaître une variation non
monotone de l'adsorption en fonction du taux de substitution des
polymères en groupes phosphate. Une adsorption maximale est
observée pour des résines dont le taux de groupements phosphoes -
ter est voisin de 30', tandis que l'adsorption est faible pour
des taux voisins de 60 ,.
A des fins de comparaison, nous avons déterminé l'ad-
sorption des IgG normales sur ces résines par la méthode d'immu-
nodiffusion radiale les résultats obtenus montrent que cette
adsorption est très faible et inférieure à la limite de sensibi-
lité de la méthode, alors que les concentrations d'IgG dans les
suspensions de polymères sont de l'ordre de 12 g.1-1, valeur à
comparer avec la concentration des anti-ADN qui est voisine de
10- 3 g.1- 1 •

Ces considérations permettent de conclure que les anti-

corps anti-ADN double brin possèdent une affinité élevée pour
des résines qui présentent en surface une densité de sites
phosphoester déterminée, affinité très supérieure à l'affinité
non spécifique des IgG normales.
Il est probable que lE-:s anticorps anti-ADN simple brin
présentent un comportement analogue.

111-2 - LES RESINES SUBSTITUEES PAR LES BASES

Nous avons également étudié l'adsorption des anticorps

anti-ADN sur les résines substituées par les bases puriques et
pyrimidique::; de l'ADN; des publications récentes (163,164,165)
 ..... 30
et S.L.-S46-
....,
Ul • P+MéniM 175 9 /1
L&.I o Méntnt 320 911
ID o GuiniM 2~ 9/1
~
0 20 l( Cy tosine 1~ 9 Il
(1) • ThymiM 150 9/1
Ci
oC /'
-'il

/
'C
Z
Ci 10
4
1
...z /' /'
oC /
0
0 20 40 60 9') 100

ANTI-ADN INTRODUIT ( • )

......
te 40
....,
(1)
w S.L. -546-
ID ~
~
Q o GuiniM 2~ 911
(1)
Ci • Thymine 1:50 911
oC 20
.0
CI)

zQ
4

Z
oC
1
...
10

0
F'
0 20 40 60 eo 100
ANTI-ADN INTRODUIT ( • )

t 11:1'.!r,?..12. 1'3()tr,=,rtï'~'? d':1d5:Jrptior! de';. anticorp~, antj-ADN double brin ~db!

et sirnple orin (st' ) sur :es OJlystyrènes substitues par les ba:=.es
pur'Ques et pyrn,(.,'diques de i'ADN.
 99

indiquent, en effet, que la guanine et/ou la cytosine seraient

les déterminants antigéniques d'anticorps monoclonaux et poly-
clonaux dirigés contre l'ADN natif ou dénaturé.
Les caractéristiques des résines utilisées au cours de
cette étude sont reportées dans le tableau XVII (Synthèse D).

Nous avons pu disposer pour effectuer cette étude d'une

quantité suffisante du sérum lupique "546" qui, comme cela a
déjà été signalé, est constitué d'une population d'anticorps
anti-ADN composite. En effet les courbes d'étalonnage du test de
FARR établies avec de l'ADN double et simple brin (Fig. 38), ne
peuvent s'interpréter que par la prise en considération d'une
hétérogénéité de la population d'anti-ADN. Les techniques emplo-
yées, ne permettent pas d'analyser précisément la composition de
cette population; il est cependant possible d'évaluer qualita-
tivement les proportions d'anticorps anti-ADN natif et dénaturé,
en se basant sur les hypothèses qu'il n'existe pas d'anticorps
susceptibles de reconnaître à la fois l'ADN simple et double
brin, que l'affinité des anticorps vis-à-vis de chaque type
d'ADN est la mê~e et que la stochiométrie des réactions antigè-
ne-anticorps est identique pour les anticorps anti-ADN natif et
dénaturé. Dans ce cas, l'analyse des courbes d'étalonnage de la
figure 38 conduit à la conclusion que la concentration en anti-
corps anti-ADN simple brin dans ce sérum est légèrement supé-
rieure à celle des anticorps anti-ADN double brin.
Compte tenu des caractéristiques du sérum "546" et du
fait que les paramètres qui gouvernent l'adsorption des anti -
corps anti-ADN sur les résines phosphory1ées sont à priori les
m~mes pour les résines constituées des bases puriques et pyri-
midiques, nous nous sommes limités à l'étude de l'influence sur
l'adsorption de l'hétérogénéité et de la concentration des
anticorps anti-ADN.

La figure 42 représente les isothermes d'adsorption des

anticorps anti-ADN simple et double brin qui ont été établies
pour les polymèl~es substitués par les bases puriques (cytosine,
thymine) et py~1midiques <guanine, adénine). L'examen de ces
 100

isothermes met en évidence que l'adsorption des anticorps anti-

ADN simple et double brin sont du même ordre et que ces isother-
mes semblent obéir à une loi de type Tempkin (cf. Fig. 14). Le
mécanisme d'adsorption des anti-ADN sur ces résines est donc
différent de celui observé dans le cas des polymères phosphory-
lés. En effet, lorsque les isothermes sont de type Tempkin,
l'interprétation classique implique une adsorption non indépen-
dante des protéines. Un tel processus peut correspondre soit à
une hétérogénéité des sites d'adsorption présents à la surface
du polymère, soit à une hétérogénéité de la population d'anti-
corps, soit enfin à une combinaison des deux situations. Si l'on
suppose que, pour le même sérum lupique ("546"), la population
des anticorps adsorbés est la même pour les résines phosphory-
lées et les résines substituées par les bases, le comportement
d'adsorption observé peut alors être attribué à une hétérogénéi-
té de la nature des sites d'adsorption sur les polymères consti-
tués des bases puriques et pyrimidiques en revanche, et sous
réserve des mêmes hypothèses, les sites d'interactions présents
sur la surface des polymères phosphorylés seraient tous
semblables.

Nous avons en outre étudié l'adsorption des anticorps

anti-ADN natif sur une résine constituée d'un groupement
phosphate lié à l'adénine (Tableau XVIII: synthèse E 2 ). Sur la
figure 42 est représentée l'isotherme d'adsorption des anti-ADN
du sérum "546" sur ce polymère (P + Adénine), L'adsorption des
anticorps est plus importante sur cette résine que sur celle
uniquement constituée d'adénine. Par ailleurs, l'isotherme
d'adsorption des anti-ADN sur la résine phosphoéthyl adénine
obéit à une loi de type Langmuir' ce fait indique que le méca-
nisme d'adsorption ou la nature des protéines adsorbées sont
différents selon la nature du substituant fixé sur les résines.
Sous réserve que ces résultats soient confirmés par
l'examen des propriétés d'adsorption des anticorps anti-ADN sur
des résines où les taux de substitution seraient variables, ils
permettent de conclure que les adsorptions sur les résines subs-
tituée~ uniquement par des bases puriques ou pyrimidiques se
 TCI<SL.- TCKtémoin
sérum lupique TCK sérum pur TeK témoin 4

"LM" 94 s 25 %

"BC" 119 s 54%

TABLEAU XXI: caractéristiques des sérums lupiques contenant des ACe

ADN doub le brin ~ TC~; L -

TeK témoin
TCK sérum pur,
1

(50 IJ l eu 1/10 ) TeK temoin

22 % 95 s 24%

TABLEAU XXII: caractérstiques du sérum '~SF" ( anti-ADN et ACe)

sérum lupique TCK sérum pur TCKE,L- TeK témoin

TCK temoin

"GE" 137 s 98 %
TABLEAU XXIII: caractéristiques du sérum "GE" ( fig. 46 )
 101

produisent selon des mécanismes différents de ceux observés pour

les résines constituées soit de phosphate soit de phosphate et
d'adénine. Ces résultats confirment également l'importance de la
présence du groupement phosphoester dans le déterminant antigé-
nique reconnu ~pécifiquement par les anticorps anti-ADN.

IV AFFINITE DES ANTICOAGULANTS

CIRCUI~ANTS LUPIQUES POUR. LES
RESINES

Nous avons étudié l'adsorption des AntiCoagulants Circu-

lants (ACC) pr~sents dans le sérum des patients lupiques, sur
les résines dérivées du polystyrène constituées de groupements
phosphoester à différents taux de substitution ainsi que sur des
polystyrènes porteurs de phoRphocholine ou de phosphosérine
(synthèse G).
Les ACC sont détectés par la mesure des Temps de Céphaline
Ka()lln (TCK) dans les conditions décrites précédemment.
L'adsorption des ACC sur les résines dépend à priori des
mêmes paramètres que ceux gouvernant l'adsorption des anti-ADN.
En ce qui concerne l'influence de la nature des sérums lupiques,
ces derniers peuvent différer entre eux par la spécificité et la
concentration des anticorps. Nous distinguerons différentes
cdt~gorles de sér.'ums lupiq\lt~s

.- les sérllms ne contendnt. qlle des ACC qui reconnaissent spéci fi-
quement les phospholipide3; Ils diffèrent entre eux par la
concentration des anticorps. Relèvent de cette catégorie, les
sérums deti patients ~LM~ ~t "BC" dont les caractéristiques
sont reportées dans le tableau XXI.
 100 ..,

, 100 911 ct. po1ysty,."'" phosphorylé ( 71 Si )

i
90~ ClSol. "LM"
t • Sol.+ résine
1
i o S.H.N.
1
i
,
~ 80 ~
U
~

,
70~

SERUM ( S )
,
~+I----~--~----~--~----~--~--------~----~--~
o 20 40 60 80 100

figure 43 : adsorption d'ant1corps anticoagulants ( MLM w

)
 102

- les sérums contenant à la fois des ACC du type précédent et

des anti-ADN ; c'est le cas du sérum "SF" dont les caractéris-
tiques sont reportées dans le tableau XXII.
- les sérums contenant des anticorps anticoagulants dirigés con-
tre les phospholipides et les facteurs de coagulation. A cette
catégorie, appartient le sérum du patient "GE" (Tableau XXIII)

Nous présenterons ici tout d'abord les résultats relatifs

aux sérums de la première catégorie. Nous examinerons ensuite,
les résultats obtenus dans le cas des sérums "SF" et "GE".

IV-1 - INTERACTIONS DES RESINES PHOSPHORYLEES AVEC LES ACC

L'étude de l'adsorption des ACC sur les résines phospho-

rylées a été effectuée par incubation du sérum lupique "LM"
(Fig. 43> avec un polystyrène substitué à 71' en poids (3,1
meq/g). La courbe représentant la variation du TCK en fonction
de la dilution des surnageants résultant de cette incubation,
est superposable à celle du sérum humain normal. Il en découle
que l'adsorption des anticoagulants circulants, présents dans ce
sérum 1upique, est totale.

L'influence de la composition de la résine sur l'adsorp-

tion des ACC du sérum "BC" a été étudiée sur des résines de
polystyrène phosphory1ées dont les taux de substitution varient
entre 32 et 71 % en poids ces résines sont identiques à celles
utilisées pour l'étude de l'adsorption des anti-ADN. Après
incubation avec les résines phosphorylées à taux de substitution
élevés (64 et 71 1), les TCK des surnageants des suspensions de
polymères dans le sérum lupiqu~ sont inférieurs à ceux du sérum
initial (Fig. 44). De plus, l'analyse de l'isotherme d'adsorp-
tion établie à partir des incubations de 60 mg par ml de résine
 SERUM ( 1 )
ro+I----~--~----~--~----~--~----~--~----~--~
o 20 40 60 80 100

figure 44: adsorption d'anticorps anticoagulants ( NBC· )

 103

à 64 ~ de phosphate, indique que l'adsorption obéit à une loi de

type Langmuir.
En revanche, le surnageant résultant de l'incubation de
ce sérum avec un polystyrène phosphorylé à 32 ~, à la concentra-
tion de 100 mg/ml de sérum, présente un TCK identique à celui du
sérum lupique initial; il en découle que les ACC ne s'adsorbent
pas sur cette dernière résine.
Cette étude permet de conclure qu'une densité particuliè-
re de sites phosphoester à la surface des résines est nécessaire
pour que l'adsorption des anticoagulants circulants présents
dans le sérum des patients lupiques puisse se produire sur les
résines. En outre, ces densités sont différentes pour les anti-
ADN ; il apparaît en effet, que lorsque la composition en grou-
pements phosphate est voisine de 70 " l'adsorption des ACC est
maximale et même totale, alors qu'une adsorption minimale des
anti-ADN est obtenue pour ces mêmes résines. En revanche, pour
des résines à taux de substitution voisins de 30 " l'adsorption
des Ace est très faible ou nulle alors que celle des anti-ADN
est maximale.

IV-2 - INTERACTIONS DES DERIVES DU POLYSTYREHE AVEC LE SERUM

"SF"

La présence à la fois d'anticorps anti-ADN et d'ACC a été

mise en évidence dans le sérum "SF" (Tableau XX!!). Nous avons
étudié les interactions de ces deux types d'anticorps pour les
polystyrènes phosphorylés mais également pour les dérivés du
polystyrène porteurs de phosphocholine et phosphosérine.

a) Les résines phosphorylées

L'incubation d'un polystyrène substitué à 71' en

poids, à la concentration de 100 ~/l, avec le sérum lupique "SF"
 100 9/1 ft polyst\lrtne phospborlJ1é (71~)

c S.L."SF"
i
• S.L. + résint
90~i
-
r: S.H.N.

o
~---. ••.--<>-
1
70 -1

SERUM (S)
~+!----~--~--~--~-----~--~--~--~--------~
o 20 40 60 80 100

figure 45 : adsorption d'anticorps anticoagulants ( "SF" )

 104

a été effectuée. Comme dans le cas du sérum "LM" avec cette même
résine, on observe (Fig. 45) une adsorption totale sur ce poly-
mère des ACC présents dans le sérum "SF"; en effet, la varia-
tion du TCK des surnageants des suspensions avec la concentra-
tion du sérum dans le tampon, est identique à celle d'un sérum
humain normal. Par contre, les taux d'ADN précipité par ces
mêmes surnageants dans le test de FARR sont identiques à ceux du
sérum "SF" avant incubation. Il n'a donc été observé aucune
adsorption d'anticorps anti-ADN sur cette résine alors que dans
un même temps tous les ACC présents dans ce sérum sont adsorbés
sur ce polymère.
Ces résultats permettent de conclure que non seulement
le sérum "SF" possède deux populations d'anticorps lupiques,
mais que ces populations ne présentent pas de réactions croisées
vis-à-vis des résines phosphorylées.
Il résulte de ce qui précède que l'adsorption sur les
résines phosphorylées, des anticorps anti-ACC et des ACC est
très spécifique. Dans le cas du sérum du patient lupique "SF",
les deux populations d'anticorps ne diffèrent entre elles que
par leur site de reconnaissance de l'antigène. L'adsorption des
anticorps lupiques sur les résines phosphorylées implique donc
en tant que site d'adsorption, le site de reconnaissance de
l'antigène c'est-à-dire le fragment Fab. Il existe ainsi à la
surface des polymères phosphorylés, une topologie particulière
des sites phosphoester, pel~mettant la constitution de sites
d'adsorption mimant un épitope reconnu spécifiquement soit par
les anticorps anti-ADN soit par les anticorps anticoagulants
circulants lupiques; ces anticorps interagissent donc lors de
l'adsorption sur les résines par leurs déterminants idiotypi-
ques.

b) Dérivés du polystyrène porteurs de phosphocholine

et de phosphosérine.

Nous avons étudié également les interactions des ACC

présents dans le sérum "SF" avec deux résines portant à leur
 105

surface soit la phosphocholine (1 meq/g : 32 ,) soit la phospho-

sérine (1,6 meq/g: 51 ,). Pour ce faire, nous avons incubé ces
deux polymères respectivement aux concentrations de 175 g/l et
190 g/l avec le sérum lupique "SF".
Les résultats obtenus indiquent que les TCK des surna-
geants résultant de l'incubation de ces résines avec le sérum
"SF" sont absolument inchangés par rapport aux TCK du sérum ini-
tial. Les ACC présents dans le sérum "SF" ne s'adsorbent donc
sur aucune de ces deux résines alors qu'une concentration de 100
mg de résine phosphorylée à 71 , par ml de sérum "SF" suffisait
à une épuration totale en ACC (Fig. 45).
Il en résulte que les résines substituées par la phos-
phocholine ou la phosphosérine dans les compositions indiquées
ne permettent pas de développer des interactions d'affinité
suffisantes avec les anticorps anticoagulants de ce sérum. Les
groupements chimiques fixés sur ces deux résines ne correspon-
dent donc pas à une structure antigénique reconnue par les ACC
du sérum lupique "SF".

IV-3 - INTERACTIONS DES DERIVES DU POLYSTYRENE AVEC LE SERUM

"GE"

Le sérum "GE" nous avait été fourni par le service du Pro

M.J. LARRIEU, à des fins de diagnostic de la spécificité des
anticorps anticoagulants présents. Les déterminations effectuées
sur ce sérum à l'Hôpital Kremlin-Bicêtre, indiquaient en effet
la présence d'anticorps dirigés contre les facteurs de coagula-
tion VIII, IX (taux> 1/500), XI et XII, mais ne permettaient
pas de trancher en ce qui concerne la présence dans ce sérum
d'anticorps lupiques antiphospholipides. Nous avons étudié les
interactions des résines phosphorylées ainsi que des résines
constituées de phosphocholin~ et de phosphosérine avec ce sérum.
 140..,
100 E't 190 9i1 dE' polystyrÈ-nE' phosphorylé (71~)
i

- 120 -1 0 SL"GE"
S1. + rési~ (100 ( /1 )

-
j •

1• S.L. + résin€' ( 180 g/1)

o
100 ~ 0 S.H.N.
i
i
80 -11 C'~.

601
ei
v-- "
i
8

.-- -
O.J

.
...

.~
__-0------ --
SERUM ( • )
40~'-­
o 20 40 60 80 100

f1gure 46a : adsorption d'ant1corps anticoagulants ( "GE" )

25l

.-
~.-
1

,
,... -1
a

/
20
...,
Ct)
LW

1 15 ~
!
/ ..
t
CD 1
CI t
oC i
la .1 • ruine (100 9/1)
f
Il
1 & résinf (180 9/D

-
C
U
l-
I:
oC
AIITICORPS ( ,. )
0
o 20 40 60 80 100
figure 46b : isotherme d'adsorption d'anticorps
antlcoagulents ( "GE" ) sur polystyrène phosphorylé à 71:g
 106

a) Les résines phosphorylées

Nous avons incubé avec ce sérum la résine phosphorylée à

71 , déjà étudiée précédemment, à la concentration de 100 g/l.
Contrairement aux cas des sérums lupiques "LM" et "SF", on n'ob-
serve dans ce cas (Fig. 46a) qu'une adsorption partielle des
anticorps anticoagulants. Les TCK des surnageants des suspen-
sions de polymère dans le sérum "GE" pur, au 1/2 ou au 1/4, ne
sont diminués que d'environ 15 secondes par rapport aux TCK des
dilutions correspondantes du sérum "GE". Cette diminution est
faible comparée aux allongements très importants des TCK du
sérum "GE" (TCK = 137 s pour 100 'sérum) par rapport au sérum
humain normal (TCK = 67 s pour 100 'sérum). L'incubation du
sérum "GE" avec cette résine à la concentration de 180 g/l ne
permet pas d'augmenter l'adsorption le faible taux d'anticorps
adsorbés ne s'explique donc pas, par une saturation des sites
d'interactions présents sur le polymère, car un accroissement de
la surface spécifique mise en contact avec le sérum n'entraîne
aucune augmentat.ion de la quantité d'anticorps adsorbée.
L'adsorption observée sur cette résine des anticorps anticoagu-
lants, qui repr~sentent environ 25 , de l'activité anticoagulan-
te détectée par TCK dans ce sérum, correspond donc à l'adsorp-
tion de la totalité des ACC présents dans ce sérum.
Il apparaît en conséquence, que sous réserve de vérifier
que les résines phosphorylées à 71 , ne développent pas d'inter-
actions spécifiques avec les anticorps dirigés contre les
facteurs de coagulation (ce qui est en fait très improbable),
l'utilisation de ces résines permet de détecter la présence
d'anticorps antiphospholipides et de suivre l'évolution du taux
de ces anticorps chez les patients lupiques présentant d'autres
anomalies du système de la coagulation.

Il est à noter que l'isotherme d'adsorption (Fig. 46b)

établie pour ces anticorps et cette résine phosphorylée obéit à
une loi de typ,e Langmui r. Comme dans le cas de l'adsorption des
anti-ADN ou des ACC précédents sur les polymères phosphorylés,
ce ~êsultat indique que les sites d'adsorption pré~ent~ à la
 107

surface des résines constituées d'une combinaison de groupements

phosphoester sont tous identiques et de ce point de vue, la sur-
face est homogène.

b) DérIvés de polystyrène porteurs de phosphocholine et

de phosphosérine

De la même façon que dans le cas du sérum "SF", nous

avons étudié les interacti0ns des anticorps anticoagulants du
sérum "GE" avec les deux r?sines constituées de phosphocholine
et de phosphosérine aux concentrations respectives de 175 g/l et
190 g/1.

Les résultats obtenus avec la résine substituée par la

phosphosérine indiquent une adsorption des anticorps anticoagu-
lants relativement faible mAis comparable à celle observée dans
le cas de la résine phosphorylée à 71 ~ (Fig. 46a). En revanche,
l'abaissement des TCK après l'incubation de la résine constituée
de phosphocholine avec ce sérum est très faible et non signifi-
ca tif.

La pho::iphocholine fix,~e f,ur cette résine ne présente donc

aucune affInij-é spécifique pour les ACC de ce sérum, ni comme
nous l'avions précédemment obhervé, avec ceux du sérum "SF".
L'adsorption constatée avec la résine substituée par la phospho-
sérine peut être attribuée à la fixation des ACe de ce sérum,
bien que l'on ne puisse exclure la possibilité d'interactions de
cette résine avec d'autres anticorps, en particulier ceux diri-
gés contre les facteurs de coagulation.
 108

METHODE DE DOSAGE DES

ANTICORPS LUPIQUES

La détection des anticorps anti-ADN et anticoagulants cir-

culants présente dans la pratique hospitalière des difficultés
liées en particulier à la sellsibilité et à la durée de la réali-
sation de ces dosages. Dans ces conditions, il est intéressant
de tenter de mettre au point une technique fiable, de mise en
oeuvre facile et rapide, permettant de détecter et de quantifier
les anticorps lupiques présents dans le plasma de ces patients.
Dans ce contexte, nous proposons ici, une approche nouvelle
du dosage des anticorps lupiques utilisant les résines de poly-
styrène phosphorylé (167). Nous montrerons que cette technique
permet d'exprimer les résultats obtenus en grandeurs molaires.

V-l - PRINCIPE

Nous avons vu précédemm~nt que les anticorps lupiques se

fixent spécifiquement sur les résines phosphorylées. Cette
adsorption est médiée par le fragment Fab des immunoglobulines.
Il est donc en principe concevable de caractériser les anticorps
adsorbés de type IgG sur les résines à l'aide d'un anticorps
anti-Fc humai~.

C'est ce principe que nous avons utilisé en réalisant

l'adsorption d'anticorps radiomarqués (125I) dirigés contre le
fragment Fc des IgG humaines, sur des résines phosphorylées
préalablement incubées avec des plasmas lupiques et normaux. Les
résines employées dans cette étude sont les polymères phospho-
rylés à 58 " 64' et 71' déjà utilisés pour l'étude de
l'adsorption des anticorps anti-ADN et anticoagulants circu-
 "LM"
"GE" ,,....
,
,
....
,",,
~ RES. 71 9S P '\ ,
,, ,,
, , ,,,"
o RES. 58. P
'\ '\
,, ,,
'\ '\
'\
'\

rJ RES. 64. P ,", , ,"

,", , ,
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'\ '\ '\
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"SF" '\ '\ '\ '\

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,',', ,
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,~,~ ,~,~ "S,A,~'; "BC" "546" "155"
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" "
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,
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,
,',',
'\ '\
o ~~~~__~~LA,-__~~~~~'~'~~'~'~~__~~~r-__~L-~~~~~
ppp normal A.C.C. Anti·-A.D.N.

flgU r e 47 : antico:ps anti-Fc adsorbés sur des polystyrènes ph05pho r yJés

( 71 % ; 58 % ; 64% ) préa 1ab 1ement incubés avec des pJasm as
normaux ( ppp normal) et luplQues ( AC.e. et anti-ADN ).
 109

lants. Le protocole détaillé est reporté dans l'annexe expéri-

mentale (IV-3).

V-2 - RESULTATS ET DISCUSSION

Les résultats obtenus dans cette étude préliminaire, con-

firment que les anticorps lupiques sont adsorbés sur les rési-
nes phosphorylées, par l'intermédiaire de leur fragment Fab ; en
effet, les taux reportés sur la figure 47 d'anticorps anti-Fc
fixés sur les IgG lupiques adsorbées, sont. plus élevés lors de
l'incubation préalable des résines avec les plasmas lupiques
qu'avec les PI,ismas Pauvres en Plaquettes humains normaux (PPP
normal). Cet effet existe pour les trois types de résines phos-
phorylées et pour tous les sérums lupiques (ACC et anti-ADN)
étudiés précédemment. La fixation des anticorps anti-Fc marqués
est toutefois considérablement plus importante dans le cas de la
résine phosphorylée à 71 % préalablement incubée avec les plas-
mas contenant des ACC.
Ces résultats sont donc en accord avec ceux des études
effectuées par mesure des TCK, concernant l'interaction spécifi-
que des ACC avec la résine substituée à 71 % en groupements
phosphoester.
Sur cette base, et sous réserve d'une recherche tendant à
définir des conditions optimales, l'utilisation de cette résine
constitue une méthode de dosage des anticorps lupiques.

Cette méthode est également utilisable pour la détermina-

tion de la concentration en anticorps lupiques dans le sérum des
patients. Par exemple, en effet, dans le cas du sérum "LM", les
dosages par mesure des TCK ont montré que la totalité des ACC
présents dans ce sérum est adsorbée sur la résine phosphorylée à
71 % (Fig. 43). Dans ces conditions, la quantité d'anticorps
ant_i-Fc fixés, 'correspond à la quanti té totale des Ace présents
 - RES. 58 GA 0--
[J RES.100GIL ~

~ 0 _________ - -

/- ----
o ____ - -

lt6 IITRODUITES (10 . .les)

-9

0,0 < : F - - - - - . . . - - - - - - . . , r - - - - - - - , . - - - - - - ,
o 2

o 1009/1
- sa g/l

~ -1
Kiff =4,4.10 M

Protéine libre ( JlH )

l ' 1 ----,
o 1 2 3 4 5 6
figure 48 : isothermes d'adsorption d'lgG norm8les
sur polystyrène phoSPhorylé
 110

dans le sérum, déduction faite de l'adsorption non spécifique

déterminée sur le ppp normal. La valeur calculée de la concen-
tration en ACC dans le sérum du patient "LM" est d'environ
10- 9 M, de l'ordre de grandeur des valeurs attendues. La déter-
mination de cette concentration nous a permis de calculer la
constante apparente d'affinité des ACC pour cette résine à par-
tir de l'isothe~me d'adsorption de
type Langmuir. Nous avons
trouvé qu'elle est de l'ordre de 10 10 M-1. Cette valeur très
élevée indique effectivement une affinité remarquable des ACC
pour ce polymère fonctionnel.

VI A.FFINITE DES IgG NORMALES

POUR LES RESINES

[.'établissement des isothermes d'adsorption des IgG norma-

les sur les résines phosphorylées a été réalisé. La quantité
adsorbée d'immunoglobulines normales a ét.é mesurée par les deux
méthodes précéde~ment décrites :
- dosage protéique suivant la technique de Folin
- radioimmunoessai.

Les résultats obtenus indiquent que les isothermes

d'adsorption des IgG sur les résines obéissent à une loi de type
Lanqmuir (Fig. 48). L'ordonnée du plateau de saturation de
1 'isotllerme est proportionnelle à la quantité de polymère (Fig.
48). Le calcul de la constan~e d'affinité apparente des IgG nor-
males pour ces polymères, dans le cas où la concentration des
IgG a été mesur~e par la technique de Folin, est de 4 x 10 5 M-1.
Un0 valpur comparable de 8 x 10. M-. a été obtenue pour cette
 111

constante, lorsque la deuxième méthode de dosage a été mise en

oeuvre.
Ces valeurs sont donc très faibles
si on les compare à
celles déterminées pour les anticorps lupiques (10 e à 10 10 M-1).
Elles confirment que l'adsorption des immunoglobulines G norma-
les sur les résines phosphorylées est non spécifique, et que par
contre l'adsorption des anticorps lupiques sur ces résines est
très spécifique.

VII DISCUSSION GENERALE

De ce qui précède, il résulte que les constantes apparentes

d'affinjté des anticorps lupiques pour les résines phosphorylées
sont très élevées, t_ant da.ns le cas des anticorps anti-ADN
(4 x 10 e M-1) que dans celui des antiphospholipides (10 10 M-1).
En outxe, les constantes apparentes d'affinité des immunoglobu-
lines G normales pour ces mêmes résines, sont de l'ordre de
10 5 M-1. Il existe donc une affinité spécifique de ces résines
vis-à-vis des Anticorps présents dans le sérum des malades lupi-
ques.
Nous avons montré que cette adsorption spécifique est
dépendante de la compositJon chimique des polymères phosphory-
lés. En effet, l'adsorption totale des ACC antiphospholipides
est réalisée avec des résines à fort taux de substitution (70'
ellviron) en groupements phosphoester; elle est en revanche
minimale pour des taux de substitution faibles. Dans le même
temps, les interactions entre les anticorps anti-ADN et les
résines phosphorylées sont maximales pour des taux voisins de
 112

30 , en motifs phosphoester et minimales pour des résines subs-

tituées à 70 % par des groupements phosphoester.
Les deux types d'anticorps lupiques étudiés reconnaissent
donc une densJté particulière de sites phosphate à la surface
des résines jl en découle que la reconnaissance spécifique par
l'anticorps de cette topologie de motifs chimiques est médiée
par le fragment Fab des immunoglobulines lupiques. Ces résultats
indiquent que l,on seulement les sites de fixation sur les rési-
nes constituéer de phosphoester sont différents dans le cas des
anticorps anti ·'ADN et de ceux des anticorps anticoagulants mais
qu'en plus les déterminants idiotypiques le sont également.
Les proce~sus d'adsorption des anticorps lupiques avec des
constantes d'a:finité très élevées, ne sont donc pas de simples
phénomènes d'échange d'ions mais ils correspondent à une affi-
nité spécifiquE" résultant de liaIsons électrostatiques fortes
entre les sitE's de quelques groupes "convenablement" distribués
sur la surface et le déterminant idiotypique soit des anticorps
anti-ADN soit c.es anticoagulants circulants lupiques. Il devrait
être possible, par une analyse statistique, de déterminer à
partir de nos résultats expérimentaux, la structure du site
d'adsorption dE ces anticorps, c'est-à-dire la distribution
précise des gl'oupes phosphoester reproduisant à la surface de
ces polymères un épi tope spécifiquement reconnu par les
anticorps lupit'ues. Par extension, il serait alors possible de
connaître la néture des épitopes dans les antigènes naturels, et
les déterminants idiotypiques de leurs anticorps respectifs.

La variation des propriétés d'adsorption des anticorps

anti-ADN et anticoagulants circulants pour les résines phospho-
rylées, permet de répondre également à une question générale
évoquée précédemment concernant l'hétérogénéité de la distribu-
tion des grouIes fonctionnels dans les polymères réticulés. En
effet, nous a~'ions indiqué que les méthodes d'analyse de la
composition de ces résines ne permettaient d'atteindre que des
valeurs moyennts de celles-ci et que suivant la nature des ciné-
tiques réactiornelles, la distribution des groupes chimiques
dans la masse de la résine devrait être homogène ou non. Cette
 113

discussion nou:; avait conduit à remarquer que la variation des

propriétés des résines en fonction de leur composition, corres-
pondrait à unt~ distribution homogène des substituants sur les
chaînes macromoléculaires; nous avions noté enfin que dans ce
cas, la diffu:sion des réactifs dans les grains de polymère ne
serait pas l'é~ape lente de la cinétique réactionnelle.
Compte tenu du fait que nous avons bien observé une varia-
tion de l'adso~ption des anticorps lupiques sur les polystyrènes
phosphorylés en fonction de leur composition, nous pouvons con-
clure que la distribution des fonctions phosphoester dans la
structure macrl)moléculaire est homogène et que par conséquence,
lors de la pho,;phorylation des résines hydroxylées, la diffusion
des réactifs '~st rapide devant la réaction chimique proprement
dite.

Nous avon,; par ailleurs étudié l'influence de la nature des

substituants présents sur les dérivés du polystyrène synthétisés
en utilisant des résines fonctionnalisées par les quatre bases
puriques et pyrimidiques majeures ou par les fonctions phospho-
choline et phosphosérine. Les résultats obtenus indiquent que
les anticorps anti-ADN présents dans le sérum des patients lupi-
ques ont une affinité pour les polymères fonctionnalisés par les
bases des acides nucléiques. En revanche, les ACC ne semblent
pas développer d'interaction avec les résines constituées de
phosphosérine ~u de phosphocholine. Ces dernières observations
devront être =ependant confirmées par l'analyse de l'adsorption
des anticorps anti-ADN et anticoagulants circulants sur ces
types de résin~s à des taux de substitution variables.

En conclusion, il apparaît que les résines phosphorylées

présentent des analogies de comportement en tant qu'antigènes
avec l'ADN et les phospholipides. En tant que telles, ces rési-
nes pourraient être utilisées pour l'épuration spécifique du
plasma des patients lupiques. Nous avons en effet montré qu'il
est possible d'enlever totalement les ACC présents dans le plas-
ma de ces patients à l'aide des résines fortement substituées en
 114

groupements phosphoester. La réalisation d'immunoadsorbants spé-

cifiques utilisant ces résines est donc envisageable.
Ces polymères fonctionnalisés sont également susceptibles
d'être utilisés dans le dosage des anticorps lupiques présents
dans le plasma des malades ; pour ce faire il resterait à opti-
miser la méthode dont nous avons établi le principe en utilisant
dans un radioimrrtunoessai les résines phosphorylées. Pour satis-
faire aux exigences des laboratoires d'analyse, il suffirait de
réaliser un immunoenzymoessai utilisant dans des conditions
optimales qui restent à établir, des polymères phosphorylés et
un anticorps anti-Fc humain marqué par une enzyme telle que la
péroxydase.
 115

POL YSTYRENES PHOSPHORYLES EN

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE
PERFORMANCE

l PRINCIPE

Le polystyrène réticulé à 2 , de divinylbenzène possède une

excellente résistance mécanique en compression et une très gran-
de stabilité chimique et thermique; cependant son caractère hy-
drophobe a, jusqu'à présent, fortement limité son usage en chro-
matographie liquide des protéines.
La fonctionnalisation du polystyrène par des groupements
phosphoester confère en revanche au polymère, un caractère
hydrophile et une capacité d'échange d'ions importante les mo-
tifs phosphorylés sont fixés chimiquement à des taux de substi-
tution élevés par l'intermédiaire de bras espaceurs de longueur
et de nature variables sur les noyaux aromatiques du polystyrène

Les propriétés acido-basiques et donc d'échange d'ions de ce

nouveau type de phase stationnaire sont assez nettement diffé-
rentes de celles des supports habituels comportant des fonctions
amines, carboxyliques ou sulfonates. En effet, ils possèdent des
fonctions acides ionisables de façon variable entre pH - 2 et 11
comme l'indique la courbe de titration acidimétrique d'un poly-
styrène phosphorylé (cf. Fig. 26). Les supports phosphorylés
sont donc susceptibles d'être utilisés comme phases stationnai-
res en chromatographie d'échange d'ions, en particulier
lorsqu'il est nécessaire d'adsorber des polycations à un pH
relativement bas (de pH =2 à 7).
Par ailleurs, comme nous l'avons montré précédemment, les
polystyrènes ~hosphorylés sont susceptibles de présenter une
affinité spécifiqu@ pour certaines protéines, ce qui permet
 116

d'envisager leur utilisation en chromatographie d'affinité pour

le fractionnement de mélanges protéiques.

Nous avons donc étudié le comportement de ces polystyrènes

phosphorylés en tant que phases stationnaires en chromatographie
liquide à haute performance (HPLC) d'échange d'ions et d'affini-
té. La description des conditions expérimentales utilisées est
reportée dans la partie expérimentale (V).

II RESULTATS ET DISCUSSION

11-1 - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE D'ECHANGE D'IONS A HAUTE

PERFORMANCE

Les possibilités des supports phosphorylés en tant que

phases stationnaires en chromatographie liquide d'échange d'ions
à haute performance ont été testées à différents pH et à tempé-
rature ambiante avec la colonne nOl (25 x 0,4 cm; polystyrène
phosphorylé à 2,6 meq/g de groupements phosphoester). Trois
solutions de protéines à la concentration de 2 mg/ml ont été
utilisées
- Albumine M = 66000 g/mole pl = 4,8
- Myoglobine M = 17000 g/mole pl = 7,3
- Cytochrome C M = 12400 g/mole pl = 10

Nous avons tout d'abord contrôlé que les propriétés des

résines phosphorylées permettaient leur utilisation en tant que
phases stationnaires; nous avons ainsi trouvé que ces résines
résistent sans modification de leurs propriété~ àe pha~e ~ta-
 ~I
(,
,1
-1
l,
1\
1\ 1
l,
1
l,
Il 2
- 1
1 1
1 1 1 \
1 1\
,
1
-1
l ,
1 1
1
1
o 1
,
co
N
1
i \ 1\
« 1 " - 1 \
1 \

- 1\
j_---.L-\~----------
1 \"\
..... 1
____ _
>
_-_.-.~_._~-_.--------._._-

---,··--·-r--r---"J-L.·--r - - - ,
~.~ 3.-1 ~.S :18.< n.b 17.~ ~(t...
,
~3.8
1----.
~.6
, --,- --r,--r-,---'-,---~,-
3.8 :18.8 27.8 36.~ 45.6 51.0 &3.6

figure 49 : élution isocratiQue de l'ALBUMINE

,. débit 0.2 ml/mn
• solution tampon Tris 0.05 M, NaCl 0.01 M, pH =7
2. débit 0.1 ml/mn
• solution tampon phosphate 0.05 M, NaCl 0.1 M, pH =7.4

,...--+l-2M

E
•
o
III
N -..
\J

<C Z

~~~==~~~==~==~~o
2,018,0 3~,0 sqo 66,0 82,olMIHI

figure 50: élution d'un mélange de MYOGLOBINE (50 ~l ) et de

CYTOCHROME C ( 100 ~ 1 )
débit: 0,1 ml/mn
solution tampon Tris 0.05 M , pH • 7.6
 117

tionnaire, même à des pressions aussi élevées que 200 bars ; la

perte de charge dans les colonnes est en outre relativement fai-
ble puisque par exemple une pression de 20 bars suffit dans la
colonne n02 pour assurer un débit de 1 ml/mn. Leur durée de vie
est élevée puisque les résultats chromatographiques obtenus sont
reproduits sans modification ~près une centaine d'injections.

En élution isocratique, dans une solution aqueuse tampon-

née (citrate 0.16 M) à pH = 3.5, les trois protéines sont rete-
nues sur la phase stationnaire. A pH =7 (solution tampon Tris
0.05 M-NaCl 0.01 M), l'albumine est éluée juste après le volume
"mort" de la colonne, en 14 minutes pour un débit de 0,1 ml/mn
(7 min. à 0,2 ml/mn) (Fig. 49) des temps d'élutions identiques
sont obtenus pour l'albumine à pH = 7.4 dans une solution de
tampon Tris 0.05 M-NaCl 0.1 M ou dans une solution de tampon
phosphate 0.05 M-NaCl 0.1 M (Fig. 49). A pH = 7.6 (solution
tampon Tris 0.05 M), la myoglobine n'est pas retenue sur la
phase stationnaire (Fig. 50) alors que la cytochrome C n'est
désorbé qu'à force ionique élevée (chlorure de sodium 1.8 M).
L'effet de l'acidité des solutions sur l'élution des
trois protéines possédant des points isoélectriques différents
est résumé sur la figure 51 le processus d'échange d'ions sur
les polystyrènes phosphorylés est ainsi mis en évidence en
effet, lorsque le pH est inférieur au point isoélectrique de la
protéine (cf. Fig. 16), celle-ci présente une charge nette posi-
tive qui permei: son adsorption sur la surface anionique du
polystyrène phosphorylé.

La force ionique de la solution d'élution contrÔle, comme

cela était prévisible, l'adsorption et la désorption des protéi-
nes sur les supports phosphorylés. Ainsi par exemple, une solu-
tion de tampon acide citrique-phosphate de sodium à pH = 5, à la
concentration de 0.16 M, réduit les interactions ioniques entre
les protéines et la phase stationnaire: l'élution isocratique
dans cette solul:ion est réalisée sans rétention pour des protéi-
nes ayant des points isoélectriques supérieurs à 5, telles que
le cytochrome C (Fig. 52), la myoglobine, la ribonucléase
-E
Z
-
Q

t,O

4,8 7 7~ tO pH
,1 ALB. ,IHYO. ,1 CYl.

figure 51 : influence du pH sur l'élution des proteines

iN
•
ct

\~
if
1.5
J
12.5 2$.5 36.5
- .....s

figure 52 : élution isocratique de CYTOCHROME C

débit: 0.2 ml/mn
solution tampon acide citrique- phosphate de Na 0.16 M , pH • 5
 118

(pl = 9.45 M = 13700) et la transferrine (pl = 5-7 M = 80000).

En associant des gradients de pH et/ou de force ionique, il est
donc possible d'utiliser ce type de phase stationnaire pour la
séparation des mélanges protéiques.

Ces résultats démontrent qu'il est possible d'utiliser

des polystyrènes phosphory1és comme phase stationnaire en chro-
matographie liquide à haute performance pour le fractionnement
de mélanges de protéines. A titre d'exemple, la séparation d'un
mélange de myoglobine et de cytochrome C (Fig. 50) est réalisée
à pH = 7.6 à l'aide d'un gradient de chlorure de sodium.

11-2 - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE D·AFFINITE A HAUTE PERFORMANCE

Une étude préliminaire des possibilités d'emploi des

résines de polystyrène phosphorylées en tant que phase station-
naire pour la chromatographie liquide d'affinité à haute perfor-
mance a été effectuée sur l'exemple de la prothrombine; ce
travail a été réalisé avec la participation de N. PRADERE-NIQUET
en utilisant la colonne n 0 2 (20 x 0,7 cm ; polystyrène phospho-
rylé à 2 meq/g de groupements phosphoester).
Etant donné que la prothrombine (facteur II) se fixe
(cf. Fig. 7) par l'intermédiaire d'ions Ca 2 + et de ses résidus y
di carboxyliques sur des phospholipides acides lors de l'activa-
tion de la cascade de la coagulation, nous avons observé en
chromatographie liquide à haute performance, l'interaction de
la prothrombine avec un polystyrène phosphory1é en absence puis
en présence de calcium. Dans les fractions collectées, le dosage
de l'activité du facteur II a été effectué par la mesure du
temps de coagulation nommé temps de prothrombine (167) du plasma
humain normal pauvre en plaquettes.
 ·1
1 f'
,
1'= Il

ec
l 1
1
1[10-3U.]

0 1

ll \,--,r~
t~,o
CI)
N l'
1 \

<C
c.

,
\
l ' \
t 30

i .!
1 ,
' \ ~20
1
,
f
\~
~ 1 /
l
1
1 t. . .--_.
~,,-..I"-~-- ~.
t 11l

1"-----
r ...... - ..-...... -..-.. - ......-.. - ~
-T---- 4 .-L
ŒIU>
1 1 1
(1. ::: '\.3 8.3 12.3 16.3 26.3

figure 53 : élution de la Prothrombine ( 0,25 unités) sur

polystyrène phosphorylé
débit: 0.5 ml/mn
solution tampon Véronal, pH = 7_3
 119

En absence d'ions calcium, à un débit de 0.5 ml/mn, la

prothrombine humaine en solution à la concentration de 5 unités/
ml dans un tampon de Michaelis (Veronal 0.025 M - acétate de Na
0.025 M - NaCl 0.1 M pH = 7.33), est éluée sans être retenue
par la phase stationnaire en deux pics (3 mn 55 et 5 mn 35 non
entièrement résolus) (Fig. 53). Le rendement de l'élution expri-
mé en activité procoagulante de la prothrombine est de 67 , (76
, à 0.2 ml/mn), ce qui est acceptable si l'on tient compte du
fait que l'expérience a été effectuée à température ambiante et
de l'absence dans la solution des inhibiteurs des sérines proté-
ases de la coaqulation; ces derniers sont en effet classique-
ment utilisés lors des purifications de la prothrombine pour
éviter l'activation du facteur II. On constate également (Fig.
53) que la quasi totalité de la prothrombine dosée par coagula-
tion est contenue dans le deuxième pic.

En présence de calcium en revanche, la phase stationnaire

constituée de la même résine préalablement saturée en ions cal-
cium par lavage avec une solution de tampon de Michaelis calci-
que (tampon de Michaelis +0.2 M CaCIa), retient totalement la
prothrombine injectée dans la colonne; l'interaction est très
forte entre la prothrombine et le polymère puisqu'il n'a pas été
possible d'éluer le facteur II adsorbé par une solution de chlo-
rure de sodium 2 M.
Ces résultats préliminaires indiquent qu'en présence
d'ions calcium la prothrombine possède une forte affinité pour
les dérivés phosphorylés du polystyrène alors que cette affinité
est faible en l'absence d'ions calcium. Ils montrent en outre
qu'il devrait être possible d'utiliser des phases stationnaires
constituées de polymères phosphorylés en HPLC d'affinité pour
obtenir de la prothrombine purifiée à partir de fractions plas-
matiques ou de placentas humains (199).
 % taux de
RESINES synthèse
en masse substitution

PS-CH 2"Adénine 74% 3 meq/g D W1

0
'1
PS-( CH ) -0- P-OH
58 % 2,5 meq/g rB Z
2 2
OH
1 64% 2,8 meq/g œ1
C
0Il
PS-SC2NH-C~-ÇH-C~-O-I?-OH 30 % 0,8 meq/g œ

0
OH OH
"
PS-(CHi -O-P-O-(C~) -Adénine 44% 1,1 meq/ç E2 ID I
2 1 2
OH i
!
0
Il

PS-(CHi -O-P-O-Adénoslne
2 OH
16 % 0,35 meq/ç FA mel

TABLEAU XXIV: caractérfst1Ques des résjn~'s

 120

INTERACTIONS DE DERIVES DU POL YSTYRENE

AVEC LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION

I INTRODUCTION

L'information génétique nécessaire à la biosynthèse des

protéines et contenue dans l'ADN, est transcrite en ARN en pré-
sence de facteurs de transcription. La compréhension des méca-
nismes de régulation de la transcription nécessite la purifica-
tion de ces facteurs.

Dans ce contexte, nous avons utilisé, avec la participation

de N. PRADERE-NIQUET, différentes résines dérivées du poly(sty-
rène) réticulé comme phases stationnaires pour la purification
des facteurs de transcription issus d'extraits de cellules
humaines de la lignée HeLa. Ces extraits prépurifiés -nommés SP
0.35 et DE 0.25 (cf. Fig. 20)- nous ont été fournis par le Dr
J.M. EGLY (U184, L.G.M.E., Strasbourg). Ils contiennent des fac-
teurs (4) permettant l'initiation de la transcription du promo-
teur tardif majeur de l'Adénovirus-2 (cf. Fig. 18).

Les résines utilisées au cours de cette étude sont consti-

tuées de poly(styrène) substitué soit par l'adénine, soit par
les groupements phosphoester à différents taux de substitution
et fixés par l'intermédiaire de deux bras espaceurs, soit encore
par la phospt,oéthyladénine ou l' adénosine-5' -monophosphate. Les
caractéristiques de ces polymères sont indiquées dans le tableau
XXIV.
-
=
:::a.
"-' 30
40

CI R2
-40
=
::a.
"-'30
E3 R4
CI)

•c
CI)

•
-•
C

-.1
20 i
-.1
20
0
~
D.. 10
e
a. 10
o ~~I____~Ë3~I__~
FT O,OS 0,24 0,24 0,6 0,6 1 1 2 2 FT 0,0:5 0,24 0,24 0,6 0,6 1 122
Kt1 ( tt ) Kt1 ( tt )

-40 -40
=
:::L
=
::a. fi R6
• RS
"-'30
fi)

•c ••c
i 20 i 20
-.1 -.1
o o~
~
D.. 10 a. 10

o FT 0,0:5 0,24 0,24 O,S 0,6 1 122

FT O,OS 0,24 0,24 0,6 0,6 1 1 2 2 Kt) ( tt )
Kt1 ( tt )

figure 54: élution de 150 ~1 de DE 0.25

résines • 100 III
FT : effluent
3 X 150 III solution 50 mM KC1 ( 1 er cf. fig.)
4 x 150 III solutions 0.24; 0.6; 1 ; 2 M KCl ( 2 et 3 cf. fig. )
 121

L'extrait cellulaire contenant des facteurs de transcrip-

tion est dépo3é à 4°C sur les phases stationnaires (100 à 300
pl) ; après lavage par la solution initiale de tampon, les pro-
téines sont éluées à 4°C par des volumes déterminés de solutions
aqueuses tamponnées à concentrations salines croissantes (cf.
Partie Expérimentale VI).

Dans cette étude préliminaire, nous avons porté notre

attention sur la relation existant éventuellement entre la
nature et le taux des substituants fixés sur le poly(styrène) et
l'efficacité du fractionnement chromatographique des protéines
présentes dans les extraits cellulaires. Cette dernière a été
appréciée d'une part, par le dosage des protéines par complexa-
tion cuivrique des fractions recueillies et d'autre part, par
l'identificatJ.on électrophorétique des facteurs de transcription
dans les différentes fractions; les électrophorèses ont été
effectuées sur des gels de polyacrylamide en présence de sodium
dodécyle sulfate (S.O.S.) (cf. Partie Expérimentale VI), et la
révélation des protéines est obtenue par coloration au nitrate
d'argent. La masse moléculaire des facteurs de transcription a
été évaluée à l'aide d'un ensemble d'étalons protéiques de
masses moléculaires connues.

II RESULTATS

Le dosage des protéines dans les différentes fractions

recueillies par élution des extraits cellulaires SP 0.35 et DE
0.25 déposés sur des volumes identiques des différents polymères
a été effectué.
 ,.
...../
/

..... 15,0 o R1 ..... '5.0 ID R2

0)
:::1.
=
:a..
"""

r: I ~
"""œ10.0 ..-

-..,
CD ...~."
C /
./
CD .'
./
..,':
C 5,0 ./
L.
CL

FT 0,5 0,5 0,5 1 222 FT o,~ o,~ o~ 2 2 ~!

Ktl ( tt )
Kt) (" )

..... 15,0 § R4
..... 15,0 • R~
CD
~

""'œlO,O
" """
(#)10,0

-..,e
CD CD
c
CD
5,0
-..,e
C
CD

5,0
Q. CL

o,0 4-t=-=L,.Jt=:1..,J=~=L,...t;;;;;;;lL.,.J:=:::I.,--.--~_---j
0,0
FT 0,5 0,5 0,5 1 222 FT 0,5 0,5 0,5 222
Ktl ( t1 ) Ktl ( " )

figure 55 : élut ion de 280 ~l de SP 0.35

résines = 300 ~1
FT : effluent
2 x 500 ~ 1solution 50 mM KCI ( non dos ~ )
3 x 250 ~l solutions 0.5 ; 1 ; 2 M KCl
 122

Sur les figures 54 et 55 sont reporté les quantités de

protéines recueillies dans les fractions chromatographiques des
extraits de DE 0.25 et SP 0.35 respectivement, utilisant les
phases stationnaires étudiées. Le dosage des protéines dans
l'effluent ("FT" : première fraction avant l'addition de solu-
tions salines) permet une comparaison qualitative des capacités
d'adsorption des r.ésines; celles-ci présentent des différences
significatives. L'analyse des chromatogrammes des deux extraits
DE 0.25 et SP 0.35 indique que les capacités des résines sont
croissantes de Ri à R6. Les résines synthétisées, objets de
cette étude, possèdent donc des surfaces spécifiques différen-
tes.
L'élution des protéines adsorbées sur les phases station-
najres est réalisée par étapes successives avec des éluants
constitués de solutions aqueuses tamponnées à pH = 7,9 et dont
les concentrations en chlorure de potassium varient entre 0,05
et 2 M. Les protéines recueillies à chaque étape ne sont dosées
que dans l'une des fractions correspondantes.
Les diagrammes présentés sur les figures 54 et 55 font
apparaître que les profils d'élution varient avec la nature
chimique des phases stationnaires. Les résines Ri et R2 condui-
sent à des p~ofils comparables, l'élution se produisant princi-
palement à faible force ionique. En revanche pour les autres
résines, l'élution est continue dans tout le domaine des concen-
trations salines étudiées. Ces caractéristiques indiquent que
globalement les interactions ioniques entre les protéines éluées
et les rési~es R1 et R2 sont plus facilement dissociables et
donc plus f~ibles que celles établies avec les autres résines.
En l'absence d'une étude plus complète prenant en compte des
résines de tiUX de substitution variables, il n'est pas possible
d'analyser pLus précisément la variation observée, des
interactions des protéines avec les résines, en fonction de la
nature de lelr substituant.

L'identification par électrophorèse des protéines éluées

n'a été eff~ctuée que sur les fractions recueillies lors de la
chromatographie de l'extrait SP 0.35. La comparaison avec la
Ho FT a b c d • f SP Ho FT a abc d • f SP SP
1 i

,L.
1 1
1 U

1 II
,
u
,
, 1:-1
.e., 1 :
~

,, ..,
~."

. ,-
..
• ,!

~
1

• ,rio

..' j

Il-, ,
....

figure 56 : élution de SP 0.35 figure 57 : élution de SP 0.35

sur la résine R2 sur la résine R4

M: marqueur de masse moléculaire ( kD ) ; FT : effluent; SP : SP 0,35

KC 1 : a = 50. mM ; b = 150 mM ; c = 250 mM ; d = 500 mM ; e = 1 Mif = 2 M

figure 58 : gel de polyacrylamide

en présence de S,D.S.,coloré à
l'argent. Fraction en KCI 1 M de
SP 0.35 sur la résine R3 .
 123

composition de l'extrait cellulaire initial a été réalisée

systématiquement. Cet extrait contient les facteurs UEF et BTFa
(cf. Fig. 20). La masse moléculaire de BTFa n'est pas connue
alors que celle d'UEF supposée être de 55-57 kO (144) est en
fait de 45 kD (4). Cependant l'analyse électrophorétique met en
évidence l'existence d'une bande à 27 kO correspondant vraisem-
blablement au facteur BTF 3 (146) (cf. Fig. 20).
A l'aide des résultats chromatographiques reportés sur la
figure 56, on constate que le facteur BTF 3 (ou la protéine de 27
kO) ne se retrouve que dans les fractions à concentration de
chlorure de potassium 150 mM ; l'intensité de la bande observée
indique une purification chromatographique importante de cette
protéine. En ~evanche, la protéine de 57 kO présente dans l'ex-
trait initial n'est pas retenue sur la résine R2 constituée de
polystyrène phosphorylé (cf. Tableau XXIV) puisque l'élution se
produit à 50 ~M de KCl.
Lors de la résolution chromatographique de l'extrait SP
0.35 sur la r~sine R4 constituée de polystyrène phosphorylé (cf.
Tableau XXIV), le facteur BTF 3 n'est élué qu'en KCl 500 mM (Fig.
57), la protéine de masse 57 kD étant quant à elle présente dans
les solutions aqueuses salines de molarités égales à 50 mM et à
1 M.
Dans le ::85 de la résine phosphorylée R3, il a été possible
par la mise e1 oeuvre d'un gradient salin (0,05 à 2 M de KCl) ,
d'obtenir en une seule étape, à partir de l'extrait cellulaire,
une fraction i molarité saline 1 M ne contenant que 6 protéines
révélées par la coloration argentimétrique (Fig. 58). Les masses
moléculaires ;ont de 28, 37, 45, 57, 61 et 78 kD la bande de
masse 45 kD p,~ut être attribuée à UEF ; en revanche, dans cette
fraction, aUClne des bandes ne correspondant à BTF 3 , il en
résulte que l,i résolution chromatographique de l'extrait SP 0.35
sur la résine R3 a permis de séparer UEF et BTF 3 • En outre, UEF
est présent dans cette fraction à une concentration plus élevée
que dans l' ex':rai t i ni tial.
 124

III CONCLUSIONS

Les résultats qui précèdent montrent que l'emploi des rési-

nes phosphorylées, au cours du fractionnement chromatographique
des extraits cellulaires étudiés, peut permettre la séparation
et la purification des facteurs de transcription contenus dans
ces extraits i nous avons établi en outre que l'efficacité du
fractionnement chromatographique de ces facteurs de transcrip-
tion dépend de la nature des substituants fixés sur les chaînes
macromolécul~ires : en particulier, les capacités d'adsorption
et les interactions échangées entre les protéines et ces résines
varient en fonction de la composition de ces dernières.
Il reste cependant l confirmer ces résultats préliminaires
par des mesures de l'activité biologique (4, 172) telles que la
fixation l l'ADN ou la transcription in vitro des fractions
éluées des différents polymères.
L'analy~e de l'influence des substituants fixés sur le
polystyrène 6evra également être poursuivie en vue d'établir la
relation entle la composition des résines et l'efficacité du
fractionnement ce qui permettra par ailleurs de déterminer les
conditions optimales de la purification des facteurs de trans-
cription de l'ARN polymérase B. Ces études devraient permettre
de confirmer que la purification par chromatographie des
facteurs de transcription sur ces résines, est bien le résultat
d'une chromatographie d'affinité.
 125

CONCLUSIONS

L'objectif de ce travail consistait à mettre en oeuvre des

méthodes de synthèse permettant l'obtention de polymères origi-
naux biofonctionnels constitués de groupements analogues à ceux
de l'ADN et des phospholipides. Nous décrivons effectivement
dans ce mémoire la réalisation et la caractérisation de nouveaux
dérivés du poly{styrène) réticulé fonctionnalisés par des grou-
pements chimiques pris seuls ou associés tels que les bases
puriques et pyrimidiques des acides nucléiques, les pentoses,
les motifs phosphoester et les molécules de sérine et de choli-
ne. Ces fonctions sont fixées sur les unités du poly{styrène), à
des taux de substitution élevés par l'intermédiaire de bras
espaceurs de longueur et de nature variables; la substitution
des chaines macromoléculaires est statistique.
Les nucléotides ou leurs constituants apparaissent ainsi à
la surface de ces matériaux dans une distribution topologique
qui dépend du taux de substitution. En effet, la corrélation que
nous avons observée entre les propriétés biologiques des résines
phosphorylées et leur composition nous indique que la
distribution des motifs phosphoester sur les chaines macromolé-
culaires est homogène en conséquence, la variation du taux
moyen de substitution de ces polymères reflète une variation
correspondante de la densité des groupes fonctionnels à la sur-
face de ces résines.

Nous avons ainsi pu mettre en évidence que la présence de

groupements phosphoester à la surface des résines dérivées du
~vly{styrène), ~onduit à des interactions très spécifiques avec
des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de
Lupus Erythémateux Disséminé (LED). Bien que les caractéristi-
ques de ces anticorps soient ma] connues, nous avons pu démon-
 126

trer qu'il est possible d'adsorber sélectivement sur ces résines

les anticorp5 anti-ADN et AntiCoagulants Circulants (ACC) pré-
sents dans le sérum des patients lupiques. Les constantes
d'affinité apparentes des
polystyrènes phosphorylés calculées
pour les anticorps anti-ADN (4 x 10 e M-1) et les ACC (10 10 M-1)
sont très él~vée5. Comparativemenmt, l'adsorption des immunoglo-
bulines G normales sur ces résines est non spécifique et corres-
pond à des clmstantes d'affinité de 10 5 M-1.

La variation du taux de groupes phosphoester dans la compo-

sition des rcisines nous a permis de montrer que les déterminants
idiotypiques des anticorps anti-ADN et anticoagulants circulants
sont différents et que ces deux populations d'anticorps lupiques
reconnaissent des sites différents à la surface des résines; en
effet, l'adsorption totale des ACC présents dans les sérums lu-
piques a pu être réalisée avec des résines fortement substituées
en groupement.s phosphoester ; en revanche, l'affinité spécifique
des anticorps anti-ADN n'a été obtenue que pour les dérivés du
poly(styrènel substitués par des groupements phosphoester à des
taux de substitution plus faibles. Ainsi, en dépit des difficul-
tés liées à la nature des matières premières étudiées que sont
les sérums l~piques humains, il nous a été possible de démontrer
q\le l'adsorption spécifique sur les résines phosphorylées impli-
que le fragment Fab des anticorps lupiques.
Nos études ont donc permis de reproduire à la surface des
résines phosfhorylées une topologie déterminée de sites chimi-
ques qui imite le site antigénique spécifiquement reconnu par
les anticorps lupiques.

Les résultats obtenus dans l'étude des interactions des

r?sines substituées par les bases des acides nucléiques avec les
anticorps anti-ADN, ont indiqué qu'il existe une reconnaissance
de ces structures chimiques par ces anticorps ; en revanche, les
~ésines constituées de phosphosérine ou de phosphocholine ne
semblent pas présenter d'interactions spécifiques particulières
avec les anticorps anticoagulants. Ces observations devront être
prolongées pat:' l 'analyse d.~ l'influence, sur les phénomènes
 127

d'interactions, du taux de substitution de ces fonctions chimi-

ques ainsi que des nucléosides ou nucléotides fixés par l'inter-
médiaire de divers bras espaceurs.

Les dérivés du poly(styrène} réticulé comportant des motifs

phosphate ont également, en tant que phases stationnaires, de
remarquables propriétés en Chromatographie Liquide à Haute Per-
formance (CLHP). Nous avons, en effet, montré que ce type de
support permet le fractionnement en CLHP de mélanges protéiques
par des proc€~SSUS ioniques. Il est à noter par ailleurs, que la
présence d'ions calcium confère aux polymères phosphorylés des
possibilités d'interactions en CLHP d'affinité avec les facteurs
non activés de la coagulation sanguine vitamines-K dépendants.

Enfin, l'utilisation de ces nouveaux dérivés du polyCstyrè-

ne) en tant que phases stationnaires, permet la résolution chro-
matographique n'extraits cellulaires contenant les facteurs de
transcription de l'ARN polymérase B.

En concl~5ion, les résultats obtenus au cours de ce travail

avec les polymères biofonctionnels que nous avons synthétisés,
laissent entrevoir de nombreuses applications telles que:
- l'épuration spécifique du plasma des patients atteints de
Lupus Erythémateux Disséminé, et la purification des anticorps
Canti-ADN et ACC} mono et polyclonaux
- le dosage des anticorps anti-ADN et anti-phospholipides du LED
dans la pratique diagnostique courante
- l'utilisation de ces phases stationnaires pour le fractionne-
ment de mélanges protéiques par Chromatographie Liquide à Hau-
te Performance d'échange d'ions
- la résolution par chromatographie d'affinité de mélanges pro-
téiques contenant des enzymes, coenzymes, facteurs de coagula-
tion, facteurs de transcription ou anticorps, qui reconnais-
sent dans leur substrat ou leur antigène des groupements
phosphoester seuls ou associés à d'autres groupes chimiques.
 128

La préparation de ces polymères fonctionnels et l'ensemble

des applications que nous venons d'évoquer fait l'objet de pro-
tf·cUons de la propriét.é industrielle par dépôt de brevets (198,
199) •
 129

PARTIE EXPERIMENTALE

I SYNTHESE ET CARACTERISATION

1-1 - REACTIFS UTILISES

Le poly(styrène) de départ est un copolymère de styrène et

2 'de divinylbenzène (FLUKA). Il se présente sous la forme de
particules sphériques de diamètre compris entre 35 et 75 pm
(200-400 meshl ; le poly(styrène) commercial est lavé successi-
vement avec une solution de soude 1 M, de l'eau, une solution
d'acide chlorhydrique 1 M et de l'eau puis séché sous vide à
60°C.
Les Catalyseurs Transfert de Phase, sulfate acide et bro-
mure de tétrabutylarrunonium sont des produits disponibles chez
EGA CHIMIE, et le chlorure de tricaprylylméthylammonium (Aliquat
336) est commercialisé par FLUKA. Les bases puriques et pyrimi-
diques, les nucléosides et nucléotides sont obtenus chez JANSSEN
ainsi que les réactifs chimiques (pureté> 99 ,). Les solvants
utilisés sont disponibles chez CARLO ERBA (qualité RPE) et sont
employés sans purification préalable.
 130

1-2 - SYNTHESES

25 g de poly(styrène) sont mis en suspension dans 250 ml

de dichlorométhane (CHzCl z ) pendant 2 heures à température
ambiante ; cette opération est destinée à assurer un gonflement
du polymère ; après abaissement de la température à 4°C, 50 ml
(670 mmoles) de chlorométhyl méthyl éther puis 10 ml de chlorure
stannique sont lentement ajoutés ; la suspension est agitée pen-
dant 3 heures à température ambiante. La résine est filtrée (à
l'aide d'un fritté nO 3), lavée dans du dichlorométhane puis
après filtration lavée dans un mélange 3/1 : Dioxane/HC13N.
La résine est alors soumise à une suite standard d'opéra-
tions de lavage-filtration (notées S par la suite) qui seront
effectuées pour tous les polymères synthétisés, à l'aide de
mélanges eau/dioxanne de plus en plus riches en dioxane puis de
mélanges eau/méthanol progressivement enrichi en méthanol et
enfin avec du méthanol pur et du dichlorométhane. La résine est
alors séchée sous vide à 60°C. Toutes les résines résultant des
synthèses suivantes seront séchées à l'étape finale dans les
mêmes conditions.

10 g de PS-CHzCl (55 meq) sont mis à gonfler pendant une

heure dans 70 ml d' ortho-di chlorobenzène 3 ml de chlorure de
tricaprylylméthylammoniurn et 15 g (153 mmoles) d'acétate de
potassium sont ajoutés et le mélange est gardé à 850C sous agi-
tation pendant 36 heures. 15 g (267 mmoles) de potasse en solu-
tion dans 15 ml d'eau, 1 ml du même catalyseur sont alors versés
à la suspension précédente qui est maintenue à 85°C pendant 36
heures. Après plusieurs filtrations et lavages avec de l'eau, la
résine est soumise à la suite standard S de lavages puis séchée
sous vide à 60°C.
 131

10 g de PS-CHaCI (50 meq) sont mis à gonfler dans 150 ml

de N,N'-diméthylformamide (OMF) pendant 1 heure 5 g (102
mmoles) de cyanure de sodium, préalablement solubilisés dans 100
ml de OMF par chauffage à 80°C pendant une heure, et 2 g de sul-
fate acide de tétrabutylammonium sont ajoutés à la suspension;
le mélange est alors porté à 80°C pendant 24 heures. La résine
est filtrée et lavée abondamment à l'eau (la destruction du cya-
nure étant assuré par traitement avec une solution aqueuse d'hy-
pochlorite de sodium), puis traitée selon les séquences S de
lavages et séchée.

1-2-4 - PS-CHa-COOH

7,7 g de PS-CHaC=N (45 meq) placés à l'intérieur d'une am-

poule sont mis en suspension, dans un mélange constitué de 100
ml d'acide chlorhydrique 12 N et 30 ml d'éthanol; l'ampoule est
refroidie à la température de l'azote liquide et scellée; elle
est ensuite portée à 110°C sous agitation énergique pendant 36
heures, puis à nouveau plongée dans l'azote liquide avant ouver-
ture; la résine recueillie est lavée successivement par de la
soude 1 N, de l'eau, de l'acide chlorhydrique 1 N et de l'eau,
avant d'être soumise à la suite S des lavages avant séchage.

1-2-5 - PS-(CHa)a-OH
1-2-5' - PS-(CHa)3-0H

8 g de PS-CHa-COOH (41 meq) (ou PS-(CHa)a-COOH) sont mis à

gonfler dans 45 ml de 2-méthoxyéthyl éther (Oiglyme), sous agi-
tation pendant 2 heures. 75 ml d'une solution molaire de borohy-
dure de sodium (NaBH 4 ) dans ce même solvant sont ajoutés très
lentement à la suspension, puis 18 ml (120 mmoles) de trifluoru-
re de bore diéthyl éther CBF 3 .OCCaHs)a). Après 12 heures à tem-
pérature ambiante sous agitation, la résine est lavée avec une
 132

solution décinormale d'acide chlorhydrique puis avec la suite S

de lavages avant séchage.

1-2-6 -

4,4 g de PS-CH2Cl (26 meq) sont mis à gonfler dans 100 ml

de DMF sous agitation pendant 1 heure; 30 ml (200 mmoles) de
malonate d'éthyle, 1 g de sulfate acide de tétrabutylammonium et
8 g de carbonate de potassium dissous dans 100 ml de DMF sont
ajoutés à la suspension qui est alors chauffée à 85°C sous agi-
tation pendant 24 heures. Après filtration et lavage à l'eau,
la résine est soumise à la suite S de lavages avant séchage.

5,2 g du polymère précédent (15 meq) sont mis à gonfler

pendant deux heures dans 30 ml d'éthanol; 150 ml de soude 6 N
sont ajoutés et le mélange est mis sous agitation pendant 12
heures à température ambiante. Après filtration et lavage à
l'eau, la résine est mise en suspension dans 200 ml d'acide
chlorhydrique 6 N et portée à 110°C pendant 24 heures. Le poly-
mère obtenu est ensuite lavé à l'eau et soumis à la suite S de
lavages avant séchage.

4 g de poly(styrène> sont mis à gonfler dans 400 ml de di-

chlorométhane à température ambiante pendant 3 heures. 50 ml
d'acide chlc.rosulfonique (750 mmoles) sont ajoutés à la suspen-
sion; celle-ci est maintenue une heure sous agitation à tempé-
rature ambiante puis la résine est filtrée et lavée successive-
ment avec du dichlorométhane, de l'acétone et à nouveau du
 133

dichlorométhane. La résine PS-SOaCI, qui n'est qu'un intermé-

diaire de synthèse, est utilisée immédiatement sans séchage
préalable.

I-2-9 - PS-SOaNH-(CHa)a-OH
I-2-9' - PS-SOaNH-(CHa)3-0H
I-2-9" - PS-SOaNH-CHa-CHOH-CHaOH

La totalité de la résine PS-SOaCI obtenue à l'étape précé-

dente est remise en suspension dans 40 ml de dichlorométhane. 42
ml (750 mmoles> d'éthanolamine lou 55 ml (720 mmoles) de propa-
noline lou 18 ml (300 mmoles) de 3-amino 1,2-propanediol sont
ajoutés et la suspension est alors portée à 50 0 e pendant 18 heu-
res sous agitation. Après filtrations et lavages avec du di chlo-
rométhane, de l'eau, de l'acide chlorhydrique 0,5 N puis de
l'eau, les résines sont soumises à la suite S de lavages avant
séchage.

1-2-10 - RESINES PHOSPHORYLEES (SYNTHESE C1)

15 ml (188 mmoles) de N-méthyllmidazole, 4.1 g (15 mmoles)

de chlorure mercurique (HgCl a ) et 1.5 g (18 mmoles) d'acide
phosphoreux (H 3 P03) sont mis sous agitation à 80°C pendant 2
heures; 2 g de PS-CHaOH (12,6 meq) sont ajoutés à cette solu-
tion et la suspension est maintenue à 80°C pendant 18 heures.
Après filtration et lavage à l'eau, la résine est soumise à la
suite S des lavages, et séchée.

I-2-11 - RESINES PHOSPHORYLEES (SYNTHESE Ca)

Un protocole identique a été utilisé pour la phosphoryla-

tion par le dichlorophosphate de méthyle, des 4 types de résines
hydroxylées reportées dans le tableau XIV.
 134

5 ml (46 mmoles) de dichlorophosphate de méthyle sont

ajoutés à 60 ml de pyridine anhydre préalablement refroidis à
OOC la solution est maintenue une heure sous agitation à OOC
1.4 g de résine hydroxylée (PS-(CH a ) a-OH : 8,1 meq) sont addi-
tionnés à la solution et la suspension est mise sous agitation à
température ambiante pendant 24 heures. Après addition de 200 ml
d'eau, la suspension est maintenue à température ambiante sous
agitation pendant 12 heures ; la résine suit alors la suite S de
lavages avant séchage.

1-2-12 - RESINES PHOSPHORYLEES (SYNTHESE C3)

Toutes les résines hydroxylées ont été phosphorylées avec

l'oxychlorure de phosphore suivant le protocole suivant: 4.1 g
de PS-(CHa)a-OH (20,5 meq) sont mis en suspension dans 25 ml de
triméthyl phosphate (PO-(OCH3)3). Afin d'obtenir la phosphoryla-
tion de toutes les unités hydroxyméthyles, 2.75 ml (30 mmoles)
d'oxychlorure de phosphore sont ajoutés. Pour obtenir des taux
variables de substitution en groupements phosphoester, des quan-
tités différentes d'oxychlorure de phosphore sont ajoutées à la
suspension. Dans le tableau XVI et sur la figure 25 sont repor-
tés les taux de substitution en fonction du rapport du nombre de
moles d'oxychlorure de phosphore ajoutées par équivalent
hydroxyle.
La suspension est ensuite portée à 60°C pendant 12 heures.
Après avoir versé celle-ci dans 250 ml d'eau, le mélange est
maintenu sous agitation 2 heures à température ambiante; la
suspension est alors filtrée et lavée à l'eau, puis la résine
est soumise à la suite S de lavages avant séchage.

1-2-13 - PS-CHa-B où B est une base

Toutes les bases puriques (cytosine, thymine, uracile) et

pyrimidiques (adénine, guanine) ont été condensées sur le polys-
tyrène chlorométhylé par la méthode décrite ci-après :
 135

3 g de PS-CHzCI (17 meq) sont mis à gonfler dans 70 ml de

diméthylsulfoxide (DMSO) anhydre pendant 1 heure j 4 g (30 meq)
d'adenine et 4.5 g de carbonate de potassium sont ajoutés à la
suspension qui est maintenue sous agitation à 40°C pendant 12
heures. La suite S des opérations de lavage est ensuite effec-
tuée avant séchage des résines.

I-2-14 - BASES HYDROXYETHYLEES

60 ml de diméthylformamide, 7.3 g d'adenine (54 mmoles)/

ou cytosine fou thymjne, 8.8 g (100 mmoles) de carbonate d'éthy-
lène et 1 g de bromure de tétrabutylammonium sont portés sous
agitation au reflux pendant 2 heures les bases hydroxyéthylées
sont séparées par cristallisation à 4°C puis purifiées par
lavage à l'éthanol.

I-2-15 - 9-[(2-dihydrogène phosphate)-éthyIJ-Adénine

1,5 g (8,25 mmoles) de 9(2-hydroxyéthyl)-adenine sont mis

en solution dans 15 ml de triméthyl phosphate et maintenus pen-
dant une heure à 4°C sous agitation. 0,85 ml (9 mmoles) d'oxy-
chlorure de phosphore est ajouté à la solution et le mélange est
gardé à 4°C pendant 1 heure puis pendant 12 heures à températu-
re ambiante 25 ml d'eau sont alors versés dans la solution et
le mélange est maintenu 12 heures à température ambiante. Après
évaporation et redissolution dans 50 ml d'une solution éthanol/
éther (60/40 V/V), le produit final est précipité par addition
d'eau.

1-2-16 - CONDENSATION DES BASES HYDROXYETHYLEES

3 9 de polystyrène éthyl phosphate (10,2 meq) sont mis à

gonfler dans 35 ml de DMF pendant 1 heure à température ambian-
te. Pendant ce temps, 9 mmoles (1,5 g) d'hydroxyéthyl adénine/
 136

ou cytosine lou thymine sont dissoutes dans 10 ml d'eau; la

base hydroxyéthylée est ajoutée à la suspension qui est ensuite
maintenue à 130°C sous agitation pendant 3 heures; l'eau est
alors éliminée par distillation puis la résine est remise en
suspension dans 20 ml de DMF anhydre ; l'opération de distilla-
tion puis remise en suspension est effectuée trois fois. Enfin,
10 g de N,N'-DiCyclohexylCarbodilmide CDCCI) dans 30 ml de DMF
anhydre sont ajoutés, et la suspension est maintenue à 130°C
pendant 18 heures. Le polymère est ensuite filtré et lavé avec
de la DMF à ébullition puis de l'éthanol à ébullition. La suite
S d'opérations de lavage est appliquée aux résines avant séchage

1-2-17 - CONDENSATION DES BASES PHOSPHORYLEES

500 mg de PS-CCH a ) a-OH C2,5 meq) sont mis à gonfler pen-

dant 1 heure dans 20 ml de DMF ; 500 mg d'adénine éthyl phospha-
te Cl,75 mmoles) préalablement mis en suspension dans 15 ml
d'eau, sont alors ajoutés à la suspension de polymère. Après 3
heures à 105°C et distillation de l'eau, la résine est mise en
suspension dans 15 ml de DMF anhydre. Enfin, 10 g de DCCI dans
15 ml de DMF anhydre sont ajoutés et la suspension est maintenue
à 130°C pendant 18 heures. Après filtration, le polymère est
lavé, avec de la DMF et de l'éthanol à ébullition avant de subir
la suite S des opérations de lavage, puis séché.

1-2-18 - POLYSTYRENES SUBSTITUES PAR DES NUCLEOTIDES

800 mg de polymère hydroxylé (4,7 meq) ou phosphorylé C2,7

meq) sont mis en suspension dans 20 ml de DMF pendant 1 heure à
température ambiante; 5,2 mmoles de nucléotide Cl,8 g d'adéno-
sine-5'-monophosphate) ou de nucléoside Cadénosine, guanosine,
(~ytidine, thymidine) en solution dans 10 ml d'eau, sont ajoutées
à la suspension qui est maintenue à 105°C pendant 3 heures.
Après la distillatioll de l'eau et la remise en suspension de la
résine dans 20 ml de DMF anhydre, 7 g de DCCI dissous dans 20 ml
 137

de DMF anhydre sont ajoutés à la suspension celle-ci est por-

tée ensuite à 110°C pendant 18 heures sous agitation. Les poly-
mères sont filtrés et lavés avec de la DMF puis de l'éthanol à
ébullition les résines sont enfin soumises à la suite S des
lavages et séchées.

I-2-19 - CONDENSATION DE LA PHOSPHOSERINE

1 g de PS-(CH2)2-0H (5,8 meq) est mis à gonfler dans 30 ml

de DMF pendant 1 heure, sous agitation à température ambiante
1 9 (5,5 mInoles) de phosphosérine dans 10 ml d'eau est ajouté à
la suspension; après 2 heures à 105°C, l'eau est éliminée par
distillation; la résine est remise en suspension dans 20 ml de
DMF anhydre ; 10 g de DCCI sont alors ajoutés et la suspension
est maintenue à 110°C pendant 18 heures; après filtration, la
résine est lavée avec de la DMF puis de l'éthanol à ébullition
avant de subir la suite S des lavages et le séchage.

1-2-20 - CONDENSATION DE LA PHOSPHOCHOLINE (SYNTHESE G2a)

1 g de PS-(CH 2 )2-0H (5 meq) est mis à gonfler, 1 heure à

température ambiante, dans 25 ml de dichlorométhane anhydre
0,7 ml de 2-chloro-l,3,2-diaxophospholane (Réf. 195,196) en so-
lution dans 5 ml de dichloroInéthane sont ajoutés à la suspension
qui est alors maintenue pendant 1 heure à -10°C puis 1 heure à
température ambiante; 5 ml d'acétonitrile anhydre, 20 ml de té-
trahydrofurane CTHF) anhydre et 15 ml (3 g) d'une solution à
20 ~ (P/V) de triméthylamine dans le THF sont additionnés à la
suspension. Après 7 heures à 40°C, la résine est filtrée, lavée
au THF puis avec des mélanges THF/méthanol de plus en plus con-
centrés en méthanol. Le polymère est ensuite lavé par la procé-
dure S habituelle et séché.
 138

1-2-21 - CONDENSATION DE LA PHOSPHOCHOLINE (SYNTHESE G2b)

Le bromoéthyl dichlorophosphate est préparé par action de

200 mmoles d'oxychlorure de phosphore (18,5 ml) sur 100 mmoles
de bromoéthanol (7,2 ml) à température ambiante pendant 12 heu-
res. Après évaporation, le résidu est dissout dans 14 ml de
toluène; 1.6 ml Cl1 mmoles) de cette solution est ajouté à 2 g
de PS-(CHz)z-OH (10 meq) préalablement mis en suspension dans
50 ml de dichlorométhane, pendant 1 heure à température ambian-
te. Après 18 heures à 45°C, la résine est filtrée, lavée dans
des mélanges THF/eau de plus en plus concentrés en eau puis par
la suite S des lavages. Enfin, 1 9 du polymère obtenu (1,75 meq)
est mis en suspension dans une solution constituée de 10 ml de
dichlorométhane, 10 ml d'acétonitrile et 10 ml d'isopropanol ;
5,6 g de triméthylamine en solution dans 25 ml d'eau sont alors
ajoutés à la suspension qui est maintenue à 50°C pendant 10 heu-
res. Après addition de 150 ml d'eau, la résine est filtrée,
lavée avec des mélanges THF/eau de plus en plus concentrés en
THF, puis avec de l'eau. Elle est enfin soumise avant séchage à
la suite S des lavages précédemment décrits.

1-] - CARACTERISATION

L'analyse élémentaire des différents échantillons synthé-

tisés est réalisée au Ser.vice Central de Microanalyse du
C.N.R.S. (69390 VERNAISON).
La détermination des taux de chlore par dosage argentimé-
trique est effectuée selon les procédures publiées (174,186).
La spectroscopie Infra Rouge est réalisée à l'aide d'un
spectrophotomètre IR Perkin Elmer 580 à double faisceau.
Le dosage potentiométrique des fonctions acides et basi-
ques des différentes résines (environ 20 mg) est effectué sur
des suspensions de celles-ci dans 5 ml d'une solution aqueuse de
 139

chlorure de sodium à concentrations variables (0 à 2 Ml, à l'ai-

de d'un banc de titration automatique TACUSSEL (électrode de
verre, électrode au calomel, burette automatique, TT100, TT300,
enregistreur). Les additions de 10- 3 ml de solution titrante
(0,1 N environ) ne sont déclenchées que lorsque la variation à
l'électrode de verre est inférieure, pendant une période de 100
secondes, à 0.05 unités de pH par minute.

1-4 - CONDITIONNEMENT

Toutes les résines utilisées dans cette étude sont à

l'état de particules non broyées. Les éventuels fragments résul-
tant de la synthèse et du conditionnement sont éliminés par des
centrifugations successives (175).
Avant toute étude des interactions des résines avec les
constituants de systèmes biologiques, les résines sont lavées
successivement avec une solution 1,5 M de chlorure de sodium,
une solution molaire de citrate de sodium, puis la solution tam-
pon utilisée dans l'étude.

II ADSORPTION DES
ANTICOAGULANTS CIRCULANTS

A - REACTIFS UTILISES
 TABLEAU XXV: CONDIT!ONS EXPERIMENTALES DE L.A fvîESURE DES Tev

SERUM ppp normal SL ou SHN Tampon Michaël1s Concentrat ion

}.Il ~l f.'l ~l CaC12 M

100 50 50 0 0.025
50 50 25 25 0.021
25 50 12.5 37.5 0.0181
12.5 50 6.25 43.75 0.0167
6.25 50 3.125 46.87 0.016
Témoin 50 0 50 0.0153
 140

Le tampon utilisé est le tampon de Michaëlis dont la compo-

sition est:
0,025 M de sel de sodium de la diéthyl malonylurée (Véronal)
0,1 M de chlorure de sodium
0,025 M d'acétate de sodium.

Après dissolution dans l'eau distillée, le pH est ajusté à

7,33 par addition d'HCI concentré.
Le plasma pauvre en plaquettes (PPP) est préparé à partir de
plasma humain citraté frais, par centrifugation (10000 G) pen-
dant 30 mn à 4°C; il est ensuite stocké à -80°C.
Les sérums -(sérum lupique SL, sérum humain normal SHN)-
sont préparés par coagulation des plasmas à la thrombine : 45 pl
de thrombine "Roche" à 100 U/ml sont ajoutés à 3 ml de PPP et
laissés 4 hellres à 37°C pour incubation. Après rétraction, le
caillot est exprimé à l'aide d'une pipette Pasteur et après une
centrifugation (1500 G) de 15 mn à 4°C, le surnageant est récu-
péré.

B - MODE OPERATOIRE

Les sérums humains normaux et lupiques sont décomplémentés

pax incubation à 56°C pendant 30 mn, puis dilués en tampon
Michaëlis. La présence d'anticoagulants circulants dans les
sérums lupiques est détectée par mesure des temps de céphaline-
kaolin (TeK) comme suit :
- 50 pl de PPP humain normal + 50 pl de sérum dilué (100 " 50 ,
25 " 12,5 , et 6,25 ,> sont incubés 1 heure à 37°C dans des
tubes à hémolyse.
- Après addition de 0,1 ml de réactif Stago (CKprest), contenant
la céphaline et le kaolin, il est procédé à une incubation de
'3 mn à 37°C.
- Après addition de 0,1 ml de solution de chlorure de calcium à
la concent~ation définie dans le tableau XXV pour chaque dilu-
 141

tion de sérum, le temps de coagulation (TCK) est déterminé par

chronométrie manuelle.

Pour l'incubation des SL avec les résines, 200 pl de suspen-

sion de polymère à une concentration donnée (60 à 200 g/l) sont
centrifugés afin d'éliminer le tampon de Michaëlis et d'obtenir
des quantités de résines dans l'essai allant de 12 à 40 mg. 200
pl de SL, pur ou dilué en tampon, sont incubés 30 mn à 4°C avec
le polymère. Après centrifugation (13000 t/m) 4 mn, à températu-
re ambiante, les surnageants récupérés -SL épuré- sont utilisés
pour mesure des TCK. La valeur de la dilution du surnageant est
corrigée par le calcul du volume interstitiel des résines
(= 0,4 x le volume des résines).

TII ADSORPTION DES ANTICORPS

ANTI-ADN

A - REACTIFS UTILISES

Le tampon utilisé est le tampon borate dont la composition

est
0,1 M en acide borique
0,025 M en tétraborate de sodium décahydrate
0,075 M en chlorure de sodium.

Les PPP de patients lupiques présentant des anti-ADN sont

c,-,nservés comme précédemment.
Les solutions de sulfate d'ammonium saturées à 50 , et 55 ,
sont préparées par addition à 1 litre d'eau de respectivement
313 g et 351 g de sulfate d'ammonium.
 142

B - MODE OPERATOIRE

200 pl de sérum lupique (anti-ADN) à différentes dilutions

(40 à 100 ~) sont incubés 30 mn à 4°C avec les résines. La quan-
ti t.é d' anti -ADN présents dans le sérum lupique avant. et après
incubation avec les polymères est mesurée comme suit (Tableau
XIX)
- 50 pl de sérum dilué au dixième et 111 ng d'ADN natif (50 pl
d'une solution constituée de 0,3 ml d'ADN + 1,05 ml de tampon
borate) marqué (activité spécifique: 1,44 MBq/mg) au 14C

(Amersham) sont incubés 30 mn à 37°C puis 18 heures à 4°C.

- 1 ml de sulfate d'ammonium saturé (SAS) à 55' est ajouté et
et la solution est agitée (vortex). Après 30 mn d'incubation à
4°C, puis 30 mn de centrifugation (1500 G) toujours à 4°C, le
surnageant est décanté et 1 ml de SAS à 50 ~ est à nouveau
ajouté.
Après 30 mn de centrifugation à 4°C suivie d'une décantation,
le culot est dissous dans 1 ml de tampon borate, puis intro-
duit dans 5 ml de liquide scintillant pour comptage de la
radioactivité béta.

IV ADSORPTION DPIMMUNO-
GLOBULINES NORMALES

IV-l - DOSAGE DES PROTEINES

Des s,)lutions d' IgG bovines (BioRad) de concentrations

connues (42 à 280 pg) sont incubées, 30 mn à 4°C, avec différen-
 143

tes quantités de polystyrène phosphorylé. Après centrifugation,

5 mn à température ambiante, le surnageant est récupéré et la
quantité de protéines restant après incubation est dosée par la
méthode de Folin (lesprotéines sontcomplexées à l'acide phospho-
molybdotungstique) (175).

IV-2 - UTILISATION D·IgG RADIOMARQUEES

0,15 à 4,5.10- 9 mole (5 à 150 pl) d'IgG de chèvre diri-

gées contre le fragment Fc des IgG humaines, gracieusement four-
nies par le Dr C. KAPLAN (CNTS CABANEL, PARIS), marquées à l'io-
de 125 (ORIS) sont incubées 4 heures à 4°C aVec une quantité
fixe (97 g/1) de polymère phosphorylé. Après 6 lavages en tampon
borat.e, la radioactivité portée par la résine est mesurée au
moyen d'un compteur gamma.

IC-] - UTILISATION D·IgG ANTI-Fc

Après incubation d'une demi-heure à 4°C de 200 pl de sé-

rum lupique ou normal avec 20 mg de résine phosphorylée à 71 l,
28 mg à 64' et 38 mg à 58', les polymères sont lavés trois
fois avec 1 ml de tampon borate-sérum albumine bovine (BSA)
0,2 " puis le surnageant est éliminé. 100 pl d'IgG antl-Fc (cf.
IV-2) (3 x 10- 9 moles) et 100 ~l de tampon borate-BSA 0,2 l
sont ajoutés aux résines et incubés 4 heures à 4°C sous agita-
tion continue. Après élimination du surnageant et 6 lavages avec
1 ml de tampon borate-BSA 0,2', la mesure de la radioactivité
portée par les polymères est effectuée à l'aide d'un compteur
gamma.
 144

V CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
A HAUTE PERFORMANCE

Dans cette partie expérimentale consacrée aux techniques

mises en oeuvre lors de l'utilisation des polystyrènes phospho-
rylés en Chromatographie Liquide à Haute Performance, nous
décrirons les conditions expéri.mentales de cette étude, c'est-à-
dire la nature des solutions d'élution, les protéines employées,
les phases stationnaires contenues dans les colonnes chromato-
graphiques, et l'appareillage utilisé.

A - SOLUTIONS TAMPONS

1/ Tampon Citrate pH = 3,5

- acide citrique 0,16 M
- phosphate disodique 0,16 M
Le pH est ajusté à pH = 3,5 par addition à la solution
d'acide citrique d'une solution de phosphate disodique.

2/ Tampon Citrate pH = 5
- acide citrique 0,16 M
- phosphate disodique 0,16 M
Le pH est ajusté à pH = 5 par ajout à la solution de phos-
phate disodique, d'une solution d'acide citrique.

3/ Tampon Tris pH = 7
Tris-(hydroxyméthyle) amino méthane 0,05 M
- chlorure de sodium 0,1 M
Le pH est ajusté à pH = 7 par ajout d'acide chlorhydrique
concentré.
 II

145

41 Tampon Phosphate pH = 7,4

- phosphate disodique 0,05 M
- chlorure de sodium 0,1 M
Le pH est ajusté à pH = 7,4 par ajout d'acide chlorhydrique
concentré.

51 Tampon Tris pH = 7,6

- Tris-(hydroxyméthyle> amino méthane 0,05 M
Le pH est ajusté à pH = 7,6 par ajout d'acide chlorhydrique
concentré.

61 Gradient salin
Le gradient salin réalisé est un gradient linéaire effectué
entre la solution tampon 11, 2/, 3/, 41 ou 51 et le même tampon
contenant 2 M de chlorure de sodium.

B - PROTEINES

Les protéines utilisées sont obtenues auprès de la Société

SIGMA. Elles sont mises en solution, au moment de leur utilisa-
tion dans l'éluant chromatographique initial, et conservées à
4°C.

C - PHASES STATIONNAIRES

Les phases stationnaires synthétisées pour cette étude sont

obtenues par phosphorylation à l'aide de l'oxychlorure de phos-
phore de "1" polystyrène hydroxypropyle
"2" polystyrène hydroxyéthyle
 146

Les taux de substitution réalisés sont de 2,6 meq/g (62 ,)

et 2 meq/g (45 ,) respectivement pour les résines "1" et "2".
Ces phases stationnaires sont contenues dans des colonnes
cylindriques en acier inoxydables de dimensions :
"1" 25 cm de longueur x 0,4 cm de diamètre intérieur
"2" 20 cm de longueur x 0,7 cm de diamètre intérieur

Les colonnes chromatographiques sont remplies au laboratoire

suivant le procédé suivant (175)
- la phase stationnaire mise en suspension dans une solution
tampon à force ionique élevée (NaCl 2M) est débarrassée par
sédimentation, des fines particules.
- la suspension de résine est ensuite percolée dans la colonne
en acier inoxydable, à l'aide d'une pré-COlonne et d'un réser-
voir ; une vibration mécanique est appliquée pour favoriser un
remplissage homogène et compact.
- la colonne est enfin débarrassée de sa pré-colonne puis équi-
librée dans la solution initiale de tampon.

D - APPAREILLAGB CHROMATOGRAPHIQOE

L'appareillage chromatographique utilisé (HPLC MERCK) est

constitué :
- d'une pompe ~ trois têtes (LC 219) permettant d'atteindre des
débits de 0,1 à 30 ml/min
 147

- d'un système, constitué de trois solutions, permettant de réa-

liser des gradients de concentration.
- d'une vanne d'injection pneumatique (Rhéodyne 7126) équipée
d'une boucle d'échantillon de 100 pl
- d'un détecteur UV-visible (MERCK LC 313) pour la lecture en
continu de l'absorption (à 280 nm dans notre étude)
- d'un microordinateur (Epson QX-l0) progammant le débit d'élu-
tion, le gradient de la phase mobile, l'injection de l'échan-
tillon et réalisant le stockage et l'intégration des données
- d'un collecteur de fractions (Gilson TOC 80).

VI FACTEURS DE TRANSCRIPTION

VI-l - CHROMATOGRAPHIE

- La colonne est. un tube en polypropylène de 73 mm de longueur

et de diamètre interne de 7,5 mm contenant de 100 à 300 pl de
résine. Les fractions sont adsorbées par gravité sur le poly-
mère puis éluées par les solutions tampons.
- Les solutions utilisées sont des solutions de tampon Tris
Tris 50 mM, Glycérol 10 l, EOTA 0,1 mM, pH = 7,9
à différentes molarités en KCl
50 mM, 150 mM, 250 mM, 500 mM, 1 M, 2 M
auxquelles est ajouté au moment de leur utilisation 0,5 1 de
dithiotreitol 0,1 M.
 148

VI-2 - ELECTROPHORESE

Un gel à 9 ' d'acrylamide est coulé entre deux plaques de

verre de dimensions 180 mm x 160 mm et d'épaisseur 1,5 mm. Après
une polymérisation d'une heure et trente minutes à température
ambiante, une préélectrophorèse est effectuée avec le tampon de
migration.

Les échantillons de protéines qui sont analysés par électro-

phorèse sont dénaturés par une solution dénaturante (solution E)
et par ébullition quelques minutes. Ils sont ensuite déposés
dans les puits. La migration s'effectue à température ambiante
pendant 3 heures pour une intensité de 35 mA. Le gel est ensuite
coloré au bleu de coomassie puis décoloré et enfin coloré au
nitrate d'argent (4).

SOLUTIONS UTILISEES

Solutions mères
. La solution A est composée de 30 'd'acrylamide, et 0,8 ,
de bisacrylamide dans 1 litre d'eau distillée.
La solution Bl est composée de 0,4 , dodecylsulfate de so-
dium (SOS), de Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane 1,5 M et
le pH est ajusté à 8,8 par addition d'acide chlorhydrique
concentré.
La solution B2 est composé de 0,4 'dodecylsulfate de so-
dium (SOS), de Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane 0,5 M et
le pH est ajusté à 8,8 par addition d'acide chlorhydrique
concentré.
. La solution C est une solution de glycérol à 50' dans
l'eau distillée.
La solution 0 est composée de persulfate d'ammonium à la ,
dans l'eau distillée.
 149

La solution de migration
Cette solution qui sera diluée dix fois avant son utilisa-
tion est préparée avec ~O 9 de Tris, 140 9 de Glycine, 10 9
de SDS pour 1 litre d'eau distillée. Le pH est ajusté à 8,8
par addition d'acide chlorhydrique concentré.

La solution dénaturante (solution E)

Elle est composée de 1,5 , de SDS, 5 ' de mercaptoéthanol,
10 , glycérol et des traces de bleu de bromophénol dans 1 ml
de la solution de migration.

Le gel
Il est composé de 10,8 ml de solution A, de 9 ml de solution
BI, de 2 ml de solution C, de 14,2 ml d'eau distillée, de
0,2 ml de solution D, de 20 pl de TEMED (tétraméthyléthylène
diamine).
Un gel à 3 , d'acrylamide lui est superposé; il est composé
de 1,6 ml de la solution A, de 2,8 ml de la solution B2, de
100 pl de la solution D, de 6,6 ml d'eau distillée et de Il
pl de TEMED.

La solution colorante
Elle est préparée par addition de 0,4 9 de bleu de coomassie
dans 250 ml de méthanol puis 50 ml d'acide acétique et 200
ml d'eau.

Le décolorant
Il est composé de 250 ml d~ méthanol, 150 ml d'acide acéti-
que et 1600 ml d'eau.

La solution colorante de nitrate d'argent (AgN0 3 )

Elle est préparée par addition de 0,8 9 d'AgN0 3 à 4 ml

d'eau; cette solution est ajoutée lentement à un mélange de
21 ml de soude (NaOH) à 0,38 , et 2,5 ml d'ammoniaque (NH 3 );

le volume est ajusté à 100 ml par de l'eau distillée.

 150

La solution révélatrice
Elle se compose de 1,25 ml d'acide citrique à l ' e t 0,15 ml
de formaldehyde à 38 , ; son volume est ajusté à 250 ml par
de l'eau distillée.

La solution "Stop"
Elle est composée de 40 , de méthanol, 10 , d'acide acétique
et 50 , d'eau distillée.

La solution de séchage
Elle est composée de 20 , de méthanol, 2 , de Glycérol son
volume est ajusté à 1 litre par de l'eau distillée.

MESURE DES MASSES DES PROTEINES ANALYSEES PAR ELECTROPHORESE

La droite d'étalonnage Log M = f (d) est tracée à l'aide d'un

mélange (Pharmacia) contenant des protéines de masse connue
phosphorylase B 94 000 g.mol- 1
albumine bovine 67 000 ..
ovalbumine 43 000 .
anhydrase carbonique 30 000 ••
inhibiteur trypsique 20 100 ••
ac: lactalbumine 14 400 .

VII PROGRAMMES DE CALCUL

Les deux programmes de calcul reportés dans cette annexe ont

été réali~é~ ~ l'al~e ~'un microordinateur TEKTRONIX 4051.
 151

VII-l - CALCUL DE LA CONCENTRATION A SATURATION (LANGMUIR)

c = rsat et B = Kaff

100 lUIT
101 REM tOI: 'SAT
10l REI1 C =C Selt. ET B ln CCoflstQnte calculee ovec C
lOS PRIHT -SORTIE SliR I/1PRII1AlnE ; (1/0)-;
107 llFUT Z
119 PRUIT - UCCJ.8!\:E DE POINTS :-; 250 Q=P-1
120 lUPUT P ~60 fOR 1=1 TO Q
116 DIH S(l00),A(l00) 270 R=P-I
140 FOR 1=1 TO P _. 200 FOR.J=l TO R
150 FRIIIT - C AB , 290 C=S( J).S< l+J)HA( 1)-A( 1+J) )/(S<J+J)*f\<J )-5(1 )*A(J+J»
160 IIIPUT RU) _. 300 B=5(1)/(A(I>*(C-S(I)))
170 PRINT - 5 , :mS IF Z=O THEN 338
180 WPUT S( 1> ~O f"RIIIT @51:-SAT =-;C
23e IIEXT 1 330 f"RUlT C
235 Q=O .340 IŒXT J
236 E=l 350 NEXT J
237 R=O 380 END
238 C=e
239 B=O
VII-2 - LOI DE POISSON
X( I) , sérum lupique Y( I ) , ADN précipité

2ûlOO Y'lOO-V
~0110 \'=LCG(I')
~('120 X=XI:O 20m fRUIT
~~)450 F'RHIT "111 •• 111111 III 11111 111111 III Il 1" 1 1. Il l' t
20130 rF.IIlT·
~)HO P~JIIT
FiE~ESSlùU LJrlEAI~E : 1'=f'~tB"
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