Immobilisation MO

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MlNISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DE JIJEL
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
MEMOIRE
de fin d'études pour l'obtention du Diplôme des Etudes Supérieures
En Biologie
OPTION
Microbiologie
1 Application Biotechnologique des

1 Cellules Microbiennes Immobilisées
Examiné par :
Mme Ben Hamada Wahiba
Boudjerda Mounira
1 ·Encadré par :
l1 Boumlit Rabiha
· Dr. Ouled Haddar Houria
1
2007/2008
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Sommaire
Introduction 1
Chapitre 1
Immobilisation des cellules microbiennes
I-1-Définition des cellules immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

I-2- La technologie des cellules immobilisées . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . 2
I-3- Les avantages et inconvénients d'immobilisation des cellules microbiennes.... .. 3
I-4- Les techniques d'immobilisation des-cellules microbiennes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4
I-4-1- L'attachement ou l'adsorption sur un support préformé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
· - Les avantages et les inconvénients de cette méthode..... ... .. ............. ..... . 6
I-4-2-L'inclusion: immobilisation dans des matrices poreuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6
I-4-2-1-Les avantages et les inconvénients de l'inclusion.... ....... .. .... ... .. .. .. ..... .. 7
I-4-3-La rétention derrière des membranes ou bioréacteur à membrane............ .... 8
I~4,.4e La floculation... .... ..... .. ...... .......... .. ... .... ...... .... .. ... ...... .. .... .. ........ . 9
I-5-Choix du support....... .... ..... .. ............ ... .... .. ..... .. .. ... .... ..... ..... ..... .. ... 9
I-6-Analyse des cellules immobilisées.......... ...... .......... .... .... ... .... ... ......... ... 10
I-7-Modification physiologiques induites par l'immobilisation. .... .. ..... ...... ....... . 11
Chapitre II
Les applications des cellules immobilisées
Il-1-Les biosenseurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
II-1-lDéfinition....... .. . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . .. . . . . . .. . . .. . . . . .. .. 12
II-1-2-La structure des biosenseurs. ....... ... ... ...... ..... ... .... .... ........ ... ...... .... .. 12
II-1-1-Les biorécepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 13
a- Les enzymes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 13
b- les microorganismes ou cellules entières... .... ..... ......... ..... ....... ......... .. . 14
II-1-2-Le transducteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 14
II-1-3-Les procèdes d'immobilisation des biorécepteurs...... ..... ......... ............ ... 14
II-1-3-1-L'immobilisation physique...... .. .... .. .... .... .... ...... ....... ... ..... ..... .... . 15
a- L'adsorption....... .... ....... ........ ........... .... .. ..... ..... ....... .................. 15
be La microencapsulation.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
II-1-3-2-L'immobilisation chimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
. ou co- retlc
, . 1at1.on
a- Ret1.cu , . ulat1.on. . .... .. ...... ... ........ ... ..... ...................... . 15
b- Le couplage covalent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15
II-1-4-Domaines d'application des biosenseurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 16
II-1-4-1-Médecine et pharmaceutcie......... ...... ....... ... .... ......... .... .... .... .. .. 16
II-1-4-2-Pour la détection des bactéries . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
II-1-4-3-Agro-alimentaire............. .......... ...... ...... .... ... .... ...... .... .. ...... .... .. . 17
II-1-4-4-Au contrôle environnemental........ . ......... .. ...... .... ... .. .. ..... ...... ...... .. 17
a- Les pest1.c1des . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
b- Les métaux lourds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 19
c- Les stations d'épurations (STEP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 19
d- Contrôle de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 19
. II-1-5-Autres applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
11-2-les bioremediations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20
II-2-1- Définition de la bioremediation.... ............. . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

II-2-2- Types de bioremediation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . .... 20
II-2-b-1-.:.Biostimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
II-2-2-2-Bioaugmentation........................ .. ......... . ........................... .. .... .. 21
.
II -2-2-3-B1oreme d.iat10n
. 1ntnnseque
. . , ............................ . .......... ... ................ . 21
II-2-3- Utilisation des microorganismes immobilisés dans la bioremediation . ....... .. 21
II-2-4- Les avantages de la bioremediation.......... ........ .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . ... 23
11-3-La stabilité plasmidique . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
II-3-1-La stabilité plasmidique chez Echerichia coli ... ... ... . .. ... .... . ... ... .. .. . ... . .... 23
II-3-2-La stabilité plasmidique chez Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 24
II-3-3-La stabilité plasmidique chez les levures . . . . .. . .. . . . . . ... . . .. . . . . .. . . .. . .. . . ... . ..... 25
11-4-La technologie des aliments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 25
II-4-1-Application de l'immobilisation des cellules dans l'industrie laitière......... .... 26

II-4-1-1-Production de biomasse...... . .................. ............ ............. .... ...... . 26
a- Les ferments des bactéries lactiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
b- Cultures probiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
II-4-2-Production de métabolites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 28
a- Production de l'acide lactique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
b- Production de l'exopolysaccharide . .. . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 29
c- Production de bactériocine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 30
II-4-3-La fabrication des produits laitiers fermente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
a- Exemple de yaourt.... . .................................................. .. .. . ........ ... 30
b- Exemple de fromage frais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 31
II-4-2-Réalisation de la fermentation alcoolique et élaboration de boissons
effervescentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 32
Chapitre III
Métabolites des cellules microbiennes immobilisées

III-1-Production des antibiotiques .... .. .................................. .. ... . ............... 33
III-2-Production des acides organiques par les cellules immobilisées . . . . . . . . . .. . . . . . . .. 34
III-3-Production des enzymes par les cellules immobilisées . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
III-4-Production d'alcool par les cellules immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .... 36
III-5-Biotransformation par les cellules microbiennes immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 37
Conclusion .. . .. . .. .. . . .. . . ... . . ... . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . ... . .. . . . . . .. . .. . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . ... 38
Liste des tableaux
Tab.1 : Avantages et inconvénients de la technologie des cellules immobilisées ........... 3

Tab,2; Quantité de support immobilisé sur divers supports,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,_._._._._._._._._.,, ,5
Tab.3: immobilisation par inclusion dans des supports solides poreux .. ............ .. .... .. 10
Tab.4: Méthodes d'immobilisation de l'élément biologique : avantages
et inconvénients ................. ... .. .... .......... ... .... ... .......... ..... ........... ..... 13
Tab.5: Méthodes d'immobilisation de l'élément biologique: avantages
et inconvénients ........................................................................... 15
Tab.6 : quelques biosenseurs utilisés pour la détermination des polluants ... . ............ . 18
Tab.7: certains plasmides des bactéries et leurs produits .... ........... ...... ......... ....... .25
Tab.8: les bactéries lactiques immobilisées par la technique d'inclusion ................ ... 27
Tab.9: Production des antibiotiques par les cellules immobilisées .... ..... .............. .... 34
Tab.10~ production des acides organiques par les cellules immobilisées .................... 35
Tab.11: production des enzymes par les cellules immobilisée .............................. .36
Tab.12: production d'alcool par les cellules immobilisées .................................. .. 37

Liste de figures
Fig.1 : classification des systèmes d'immobilisation selon quatre classes ... ...... .. ... .. ....4
Fig.2: l'immobilisation des cellules par l'adsorption .. .. ... .. . ..... .... ... .. ....... .. ..... ... .. 5
Fig.3 : L'immobilisation des cellules par le piège dans une matrice poreux .. .... ....... .... 7
Fig.4 : l'immobilisation des cellules par confinement mécanique derrière une barrière .. ..8
Fig~5; l'immobilisation des cellules par la floculation, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, . ,,, . ,9
Fig.6 : la structure des biosenseurs ... .. ........ .. .......... . ........... ......... ..... .. ......... .. 12
Fig.7: l'immobilisation des microorganismes ou de boue dans une matrice polymère ... 22
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Introduction
Introduction :
Dans la plupart des milieux naturels, les populations microbiennes réellement libres
ne représentent qu'une pait infime des populations totales, la majeure paitie étant
immobile.
Ainsi, dans les écosystèmes de l'eau et du sol, la population microbienne libre est
évaluée à 0,02 à 0,04%. Il est possible d'immobiliser les cellules microbiennes tout en
maintenant leur viabilité sur de longues périodes et en conséquence, réaliser des
transformations multienzymatiques. Le phénomène est même utilisé industriellement
depuis de nombreuses années dans quelques cas paiticuliers : lits bactériens dans
l'épuration des eaux, fabrication de vinaigre ou lixiviation des métaux [ 1].
L'immobilisation des cellules microbiennes dans les processus biologiques peut se
produire soit comme un phénomène naturel ou artificiel, dans les conditions naturelles les
cellules présentent nne croissance impmtante, les bactéries effectuent leur croissance
essentiellement sous forme de communautés immobilisées (les biofilms, les colonies ou
les agrégats), et aitificiellement les cellules immobilisées ont une croissance limitée [2].
Il y a nn grand nombre de méthodes physiques et chimiques (l'adsorption,
l'inclusion, la floculation .. .) développées pour l'immobilisation cellulaire qui
conespond à un état dans le quel les cellules ne peuvent pas se déplacer librement et se
sont fixes sur un support [3].
Depuis 1960, la technique des enzymes fixées s'est développée et nombreuses
applications ont été proposées et utilisées dans le domaine analytique (électrodes à
enzymes) et dans de la production industrielle de biomolécules et par conséquence le
développement de la technologie des cellules immobilisées [ 1].
L'avantage majeur qui a motivé les recherches réside dans le fait que l'on diminue le prix
de revient du produit traité puisqu'on peut utiliser la préparation catalytique de façon
continue et qu'il est possible, grâce à l'utilisation du catalyseur concentrée, d' augmenter
la productivité des bioréacteurs. Ce nouveau procédé élimine la plupart des faces
contraintes aux systèmes libres.
La technologie des cellules immobilisées avec ses origines dans l'immobilisation
des enzymes, a atti.Té l'attention de plusieurs groupes de recherches depuis la première
fois de réussite d'application des cellules immobilisées dans les applications industrielles
comme nne alternative fiable aux fermentations microbiennes conventionnelles [3].
Les applications de la technologie des cellules immobilisées comprennent différents
domaines comme la conception de biosenseurs, dans l' envii-onnement (bioremédiation
des sols), le secteuI" agro-alimentaire (lait, yaomt, fromage ...).
Dans ce mémoire on a étudié l'immobilisation des microorganismes, à partir de la
connaissance des méthodes d'immobilisation et leurs applications dans différents
domaines sanitaire, enviTonnemental ou agro-alimentaire .. ., en plus on a étudie
l'impmtance de l'utilisation des cellules immobilisées a partir de leur caractères
spécifiques qui leur différencient des bactéries libres.
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Chapitre I Immobilisation des cellules microbiennes
1-lmmobilisation des cellules microbiennes
1-1- Définition des cellules immobilisées

L'immobilisation ou la fixation des cellules microbiennes peut être définie comme la
localisation des cellules dans l'espace en réaction avec la conservation de leur propriétés
catalytiques, si bien qu'il est possible de les utilises de façon répétitive et continue [1],
cette localisation correspond à un état dans lequel les cellules ne peuvent pas se déplacer
librement sous l'effet d'un mouvement Brownien ou par sédimentation. Cette définition
générale englobe la formation naturelle de biofilm et d'agrégats par certains
microorganismes et les procédés qui consistent à retenir ou à inclure volontairement dans
une matrice des cellules [4]. Cette technique a plusieurs avantages parmi les: réutilisation
possible du support et des cellules immobilisées, stabilité plasmidique [5].
1-2-La technologie des cellules immobilisées (TCI)

La technologie des cellules immobilisées (TCI) n'est pas récente .C'est un procédé
traditionnel utilisé, par exemple, dans la production du vinaigre par des bactéries
acétiques immobilisées sur des copeaux de bois ou dans la production du kéfir avec des
levures Co-immobilisées avec des bactéries lactiques [6].
L'immobilisation permet de retenir les cellules microbiennes dans un système de
fermentation et d'obtenir de hautes densités de biomasse [7]. Cette technique comporte
de nombreux avantages, mais aussi des inconvénients, comparée à des procédés utilisant
des cellules libres (Tableau 1), les avantages majeurs sont, sans doute, une productivité
augmentée de la fermentation et une rétention des cellules, même à de hauts taux de
dilution.
D'autres avantages sont une réutilisation possible des cellules, une protection contre
des forces de cisaillement et une stabilité biologique élevée, lors de fermentation en
continu.
De plus, il est possible que les systèmes avec des cellules immobilisées soient moins
susceptibles aux attaques des bactériophages [6], et à la contamination microbienne [7] la
haute densité cellulaire et un microenvironnement différent des conditions dans le milieu
de culture résultent souvent en un changement morphologique et physiologique de la
culture .Ce ci peut représenter un avantage, par exemple en augmentant la tolérance de la
souche envers des substances inhibitrices[6] ou en découplant la croissance bactérienne
de la production de métabolites [4], ou un inconvénient car le métabolisme pourrait être
modifié de façon non voulue[6].
2
1-3-Les avantages et les inconvénients de l'immobilisation des cellules microbiennes

Le tableau (1) ci-dessous représente les avantages et les inconvénients de la
technologie des cellules immobilisées les plus représentatifs :
Tableau 1 : Avantages et inconvénients de la technologie des cellules immobilisées [6].
AVANTAGES INCONVENIENTS
-Production augmentée à cause d'une 1-Cellules peuvent se séparer du support et

densité de biomasse plus élevée. ainsi contaminer le produit.
-Lavage de la biomasse du réacteur -Stabilité mécanique et chimique de

empêchée pendant la fermentation certains supports peut être insuffisante
continue, même avec un taux de (cisaillement, dissolution, décomposition
dilution élevé. par le produit).
-Stabilité biologique et physique des -Prolifération cellulaire peut détruire la

cellules plus élevée en raison de la matrice du support et les cellules se
protection par le support. libèrent par la suite.
-Découplage de la croissance et de la 1-Limitation de diffusion peut restreindre

production de métabolites. la bioconversion.
-Coût réduit pour le traitement en aval 1-Technique des cellules immobilisées

du milieu. (TCI) peuvent être trop chère pour une
utilisation à grande échelle.
-Rendement plus élevés pour la
production de métabolites secondaires. -Métabolisme peut être modifié par
l'immobilisation.
-Rétention élevée des plasmides chez
les cellules qui en possèdent. -Nécessite d'ajouter une étape de
production des cultures immobilisées au
-Protection contre certains effets 1 procédé.
inhibiteurs dans le milieu.
-Nécessite d'entreposer les cellules ou de
-Susceptibilité diminuée contre 1 prévenir leur mortalité lors des périodes
l'attaque des phages et des d'arrêt de production.
contaminants.
-Complexité de l'assainissement du bio-
-Métabolisme peut être modifié par 1 réacteur si des contaminations se
l'immobilisation. produisent.
3
... ,
1-4-Les techniques d'immobilisation des cellules microbiennes

En raison des avantages importants de la technique des cellules immobilisées (TCI),
plusieurs techniques d'immobilisation ont été développées (figure 1).Toutes ces
techniques imitent ce qui se passe dans la nature, où les cellules des microorganismes
croissent presque toujours dans un biofilm, associées entre elles et avec des surfaces [6],
ces techniques sont : l'attachement ou l'adsorption sur un support préformé, la rétention
derrière des barrières (membranes), l'inclusion dans une matrice de polymères et la
microencapsulation [7].
Les trois premières techniques sont les plus utilisées pour la production de biomasse
et/ou de métabolites, la microencapsulation est généralement destinée à préserver la
viabilité de microorganismes, tels que les cultures probiotiques, dans les aliments, et le
tractus gastro-intestinal [4].
Cellules immobilisées vivantes
1 1 1 1
Attachées à la Inclusion dans des Immobilisation Floculation

surface matrices poreuses de derrière une
barrière
1
1 1
Adsorption Adsorption Inclusion Support

naturelle induite Dans un gel préformé
artificiellement
Figure 1 : Classification des systèmes d'immobilisation selon quatre classes [6].
1-4-1-L'attachement ou l'adsorption sur un support préformé

L'immobilisation cellulaire par adsorption à une matrice préformée ou support
solide est basée sur l'affinité des cellules pour certaines surfaces, cette technique imite
l'environnement naturel des bactéries presque toujours associées à des surfaces et qui se ·
développent en biofilm [7].
L'adsorption est obtenue par la mise en contact du support qui à son tour peut être de
nature diverse : brique, vert, bois, PVC, ... (Tableau 2) [1], et des cellules actives pendant
une période définie dans le bioréacteur. Un choix judicieux de support permet une
immobilisation dans des conditions physico-chimique déterminé résultant en une viabilité
élevée des cellules immobilisées [7]. Par exemple : dans la technique d'étude
d'immobilisation par adsorption, ce procédé à été choisi en raison du caractère mucoide
de la souche de travail , Lactobacil/us rhamnosus RW-9598M , la production par les
cellules de polysaccharides capsulaires et d'exopolysaccharides (EPS) libres contribue à
l'adsorption au support de caoutchouc de silicone poreux et à sa colonisation subséquente
[6],les forces participant à l'adhésion d'une cellule au support sont la force de Van der
Waals, les ponts hydrogènes [8], les liaisons ioniques, et les interactions covalentes
4
Waals , les ponts hydrogènes [8] , les liaisons ioniques , et les interactions covalentes
(figure 2). Pour comprendre les mécanismes de l'adsorption microbienne, la structure de
la paroi cellulaire doit être connue. La distribution des groupes carboxyliques et aminés
dans les composantes de la paroi déterminent la charge de la cellule (figure 2).
En générale, la plupart des microorganismes sont chargés négativement .Egalement,
un grand nombre d'exopolysaccharides (EPS) et ainsi de capsules portent une charge
légèrement négative, pour cette raison, il est préférable d'utiliser des supports chargés
positivement [5].
Tableau 2 : Quantité de biomasse immobilisée sur divers supports [1]
Support Quantité immobilisées mg matière

sèche/g de support.
-Bois -248
-PVC (copeaux) -80
-Rafles des mais -20
-Pouzzolane -4
-Brique expansée -15
-Dow ex 1+8 -21
-Duo lite AlOl (forme acétate) -17
-Duo lite Al 62 (forme acétate -9
-Duo lase SP3 -105
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Adsorption en surface attachement électrostatique liaison covalent sur

En surface une surface
Support insoluble
±±t±±±±±t Forces électrostatique
Figure 2 :l'immobilisation des cellules par l'adsorption [7].
5
-Les avantages et les inconvénients de l'adsorption

-Avantages de l'adsorption
-Ces supports se montrent également résistants aux forces de cisaillement et de
compression rencontrées dans un bioréacteur [4].
-En général les difficultés de diffusion de substrats et de produits d'inhibition sont
moindres dans des systèmes à cellules adsorbées par rapport aux techniques plus
répandues d'immobilisation dans des billes de gel [7].
-Inconvénients de l'adsorption
-L'adhésion des cellules repose principalement sur leur capacité à former un biofilm,
cette technique n'est alors pas applicable à tous les microorganismes [4].
-Le coût élevé des supports limite leur utilisation pour des produits à haute valeur
ajoutée [4].
-L'inconvénients principal réside dans la vulnérabilité du biofilm faiblement attaché
au support et au détachement qui peut s'en suivre [7].
I-4-2-L'inclusion : Immobilisation dans des matrices poreuses

Le procédé d'immobilisation cellulaire le plus répandu consiste à inclure une culture
bactérienne dans une matrice poreuse par la gélification d'une solution de polymère (K-
carraghénane, gomme de gallan, agarose, gélatine, alginate, chitosane), ces polymères
sont facilement disponibles et largement acceptés comme additifs alimentaires dans
l'industrie [7]. La matrice poreuse peut être soit un gel, soit un support préformé [6]
figure 3).
-Les billes de gel sont en général préférées aux films grâce à leur géométrie sphérique
Augmentant la surface [7]. Avec cette technique, les cellules sont incluses dans un
polymère, ensemble, ils forment le biocatalyseur avec lequel la fermentation est exécutée.
Ce biocatalyseur est souvent obtenu par dispersion d'une solution de polysaccharides
et/ou de protéines contenant les cellules et en suit par solidification de cette solution. La
dispersion peut être réalisée par extrusion ou par émulsification [6], suivie d'une étape de
durcissement par abaissement de température ou l'ajout d'un agent gélifiant [7].
-Dans le cas de la méthode par extrusion, la solution liquide de polymère/ culture
bactérienne est extrudée par une seringue engendrant des gouttes sphériques qui tombent
dans une solution de durcissement.
-La technique par émulsion fait par contre intervenir la dispersion de cette phase
aqueuse de cellules / polymère dans une phase organique, résultant en une émulsion eau
dans l'huile, les gouttes aqueuses dispersées sont par la suite durcies par abaissement de
température ou par l'ajout d'un agent gélifiant.
La technique d'émulsion permet d'obtenir des billes de diamètre plus petit que par
extrusion et est plus adaptée à la production industrielle à grande échelle [7].
Dans le cas d'un support poreux préformé, on ajoute la matrice d'immobilisation au
début d'une fermentation. On laisse diffuser les cellules dans les espaces libres du
support où elles commencent à proliférer. Puisque la croissance des colonies est
rapidement limitée par le support et les colonies voisines, elles sont alors retenues dans le
biocatalyseur.
Afin d'obtenir des biomasses immobilisées élevées, les surfaces intérieures ainsi
qu' extérieures doivent être accessibles pom· les cellules, et les supports avec une porosité
élevée sont les plus appropriés.
6
Afin d'obtenir des biomasses immobilisées élevées, les surfaces intérieures ainsi
qu'extérieures doivent être accessibles pour les cellules, et les supports avec une porosité
élevée sont les plus appropriés.
Au début, les forces d'adhésion décrites précédemment, déterminent la vitesse de la
colonisation du support. Quand les premières cellules sont adhérées et les colonies se
sont formées, le diamètre des pores du support devient important. Il existe une grandeur
idéale de pores qui est déterminée par un équilibre entre deux effets : les pores doivent
être assez grands pour permettre la pénétration et la croissance des cellules à l' intérieur
de la matrice, mais ils doivent être assez pour empêcher la perte des cellules en
croissance la grandeur optimale des pores déterminée pour plusieurs microorganismes. Ils
ont trouvé un rapport optimal pour les bactéries de 4 à 5 entre la taille du pore et celle de
la cellule, l'utilisation des supports avec des pores plus grands que 1OOum représente une
forme d'immobilisation se situant entre la floculation et l'inclusion [6].
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Inclusion dans une matrice poreuse
Figure 3 : L'immobilisation des cellule~ par l'inclusion dans une matrice poreuse [7].
1-5-2-1-Les avantages et les inconvénients de l'inclusion:

-Les avantages :
Les polymères de la technique d'inclusion ont souvent l' avantage de permettre la
polymérisation dans ces condition très douces , la non-toxicité de ces gels ( autorisés
comme additifs dans l' industrie alimentaire), leur production rapide, leur porosité élevée
, leur thermostabilite ,leur capacité à former des matrices d' inclusion de formes et de
tailles différentes (billes ,microbilles ,fibres , membranes , cubes ) et à conserver une
bonne viabilité des microorganismes lors de l'inclusion , en font des matériaux de choix
pour la fabrication de produits alimentaires fermentés.
Cette technologie permet de limiter la libération cellulaire de manière totale ou
partielle. Elle à été utilisée dans le cas des levures pour la production de champagne, ou
du vin pétillant, ainsi que dans le cas des bactéries lactiques pour la fabrication de la
crème [1].
La matrice préformée protège les cellules contre les forces de cisaillement à
l'extérieur du biocatalyseur tout en permettant une bonne diffusion des nutriments et des
produits métaboliques.
7
Ce procédé (la matrice préformée) d' immobilisation n'est pas nuisible pour la
prolifération des cellules, comme ça peut être le cas pour certaines techniques d'inclusion
dans des billes de polymères formée in situ.
En raison de la forte résistance du support à la compression, cette méthode
d'immobilisation est adéquate pour l' utilisation dans des réacteurs comme le réacteur
agité ou le réacteur de type lit fixe.
-Les supports solides sont en général physiquement et chimiquement résistants en vers
l'usure par la croissance des microorganismes, ils sont souvent stérilisables par la vapeur
et réutilisables [6].
1-5-3-La rétention derrière des membranes ou bio réacteur à membrane :

La technologie des réacteurs à membrane consiste à coupler un fermenteur à une
unité d'ultrafiltration ou de microfiltration. Les cellules ne sont alors pas immobilisées
dans une matrice mais retenues dans le système de fermentation permettant la diffusion
de composés solubles de petite taille, selon la porosité de la membrane choisie (figure 4).
Le renouvellement continu du milieu de culture fermenté par addition de milieu frais
dans le système, permet de diminuer l'inhibition par les produits du métabolisme
bactérien. Des densités cellulaires 10 fois plus élevées qu'en fermentation batch classique
peuvent alors être obtenues. Ce ci permet par conséquent d' éliminer les étapes de
concentration de biomasse habituellement effectuées après la production, cependant, au
delà d'une certaine concentration cellulaire, l' activité métabolique est inhibée. Exemple:
l'activité des ferments lactiques produits dans un tel réacteur est faible, ce ci serait dû au
stress relié au pompage du milieu fermenté à travers la membrane de filtration.
Enfin, la stabilité à long terme du procédé est limitée par l' encrassement des membranes
[7].
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Microencapsulation Microencapsulation confinement entre membrane
Intrefaciale
............. 1 Membrane microporeuse
Figure 4 : l'immobilisation des cellules par confinement mécanique derrière une barrière
[7]
8
1-5-4-La floculation :
La floculation des microorganismes est un phénomène qui se rencontre naturellement
chez de nombreuses souches et qu'on peut aussi provoquer artificiellement [1], la
floculation a été définie comme une agrégation des cellules pour former une unité plus
grande, elles ont également la propriété d'adhérer en massifs aux sédiments rapidement
[9]. Il s'agit la d'une méthode de rétention séduisante car elle fait appel à la méthode de
séparation liquide solide la plus élémentaire, «La décantation» (figure 5). Il est possible
de maintenir en activité de 60 à 110 g/l de levures sans contraintes physiques au niveau
du microorganisme. Cette propriété est souvent prise en compte et maintenant bien
maîtrisée dans le cas des levures.
La souche de Lactobacillus hilgardi présentant la capacité de synthétiser des
polysaccharides pour former des grains dans un milieu riche en saccharose. Le mutanL ,,.
correspondant, immobilisé dans des billes de gel d'alginate se différenciait par un taux de
croissance plus élevé, mais la densité finale obtenue était la même dans les deux systèmes
[1].
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Floculation naturel floculation artificielle réactif hi fonctionnelle

(Agrégation) (Réticulation) (Réticulant)
Figure 5 : l'immobilisation des cellules par la floculation [7].
1-6-Choix du support :
Dans l'utilisation de la technique des cellules immobilisées (TCI) dans l'industrie
agroalimentaire, il existe des exigences concernant la nature du support. Premièrement, il
ne doit pas être toxique, ni pour l'homme ni pour les bactéries, et son utilisation dans le
domaine alimentaire doit être permise. En outre, il doit montrer des propriétés physiques
et chimiques favorisant l'immobilisation.
Un support préformé est caractérisé par sa densité, sa taille et sa forme ; sa résistance
à la friction, sa capacité de rétention des cellules (diamètre des pores et porosité) et sa
charge de surface. De plus, il doit être stérilisables.
Tableau 3 : donne une vue d'ensemble sur les matériaux de supports poreux, solides
rapportés en littérature comme des billes de verre (foam-glass -particles, pora-bacta) pour
immobiliser Lactobacilluse casei , il y a aussi peu de travaux dans la littérature sur la
production d'exopolysaccharide (EPS) avec des cellules immobilisées, la plupart portant
9
sur la production des homopolysaccharides (impliquant des enzymes extracellulaire ) par

exemple , le pullulane a été produit par la moisissure Aureobasidium pullulans
immobilisées par inclusion dans des cubes d'agar ou d'alginate de calcium dans des
billes de gel d'agarose et de carraghénane et dans des cubes d'éponge , lors de deux
fermentation en batch successives [6].
Tableau 3 : Immobilisation par inclusion dans des supports solides poreux [6].
Matériel du support Microorganisme

Cellulose Saccharomyces cerevisiae
Cubes d'éponge Aureobasidium pullulans
Plastique composite (50% Lactobacillus casei
polypropyléne)
Leuconostoc mesenteroides
Ce lite Xanthomonas campestis
Aureobasidium pullulan
Chitosane
Lactobacillus casei
Calcium pectate
« type-Z »
Celite R635 Pseudomonas aeruginosa
Flexirings
Fibre de verre et polyester
Aureobasidium pullulan
Céramique
Mousse de polyuréthane
Alumimium Bactéries lactiques
Lactobacillus casei
Verre
Lctobacillus rhamnosus
Céramique Lactobacillus rhamnosus
Leuconostoc mesenteroides
Acier inoxydable
Trichoderma viride
Caoutchouc Saccharomyces cerevisiae
1-6-Analyse des cellules immobilisées

Afin d'élucider les effets de l'immobilisation sur les cellules, des techniques
d' analyse du système à cellules immobilisées, idéalement non-destructives, sont
nécessaires. Il y a maintenant plusieurs techniques biophysiques disponibles et
l'instrumentation pour diverses techniques spectroscopiques s'améliore constamment.
Les mesures d'intérêt dans l'examen des systèmes avec cellules immobilisées sont, par
exemple, la concentration des cellules immobilisées et les cinétiques de croissance, de
consommation de substrat et de formation de produit. Une caractérisation morphologique
et physiologique des cellules immobilisées, de même que de leur environnement direct,
est aussi d'un grand intérêt.
·' Les méthodes comme la microscopie optique et électronique, le marquage avec des
radio-isotopes et l'autoradiographie, la microfluorimetrie, la spectroscopie infrarouge et
10
la résonance magnétique nucléaire (RMN) peuvent être utilisées pour étudier des cellules
immobilisées [8].
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est un outil très puissant pour suivre les
processus métaboliques des cellules immobilisées. Avec la résonance magnétique
nucléaire (RMN) il est aussi possible de mesurer la quantité des cellules immobilisées,
mais l' application de cette méthode est très limitée à cause de son coût élevé [6] .
1-7-Modiflcation physiologiques induites par l'immobilisation

L'immobilisation cellulaire résulte pour les bactéries immobilisées en des conditions
environnantes différentes de celles des cellules libres [6] .
Une limitation des transferts de masse dans les matrices d'immobilisation crée un
environnement adverse pour le développement des cellules. Ces conditions peuvent
s' apparenter à des stress environnementaux tels qu'un pH acide, un manque de
nutriments et l'absence d'oxygène pour certains microorganismes aérobies stricts.
La physiologie et la morphologie des cellules peuvent ainsi présenter des
comportements très différentes selon qu'elles sont immobilisées ou sous une forme libre,
les chercheures ont observé le passage d'un métabolisme homofermentaire à
hétéroférmentaire chez des cellules de Lactobacillus plantarum immobilisées durant une
fermentation continue , plus généralement , les auteurs montrent une augmentation de la
résistance des cellules immobilisées à différent agents : produits d'inhibition, alcools,
phénols, antibiotiques, peroxyde d'hydrogène et nizine Z et produits de nettoyages à base
d'ammonium quaternaire [4] .
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Chapitre II Les applications des cellules immobilisées
II-Les applications des cellules immobilisées

11-1-les biosenseurs
11-1-1-Définition
Les biosenseurs sont des outils analytiques exploitant la concentration d'une seule
espèce moléculaire dans un mélange complexe [10], [11]. Un biosenseur est défini
comme un type spécifique de senseur chimique comprenant un élément de
reconnaissance biologique et un transducteur physico-chimique [11], [12].
Le biosenseur permet de transformer un phénomène biochimique en un signal électrique.
Il associe un composé biologique, le « biorécepteur » à un système physique, le
«transducteur», qui convertit en signal électrique la modification biochimique survenue
au niveau du biorécepteur [13], [14].
On peut résumer le développement de biosenseur à partir de l'année suivante :
-1950: HELAND CLARKE crée le premier biosenseur dont le but était de mesurer la
concentration en oxygène dissout dans le sang.
-1962 : ce biocaptem: (biosenseur) est adapté à la mesure de la concentration en glucose
dans le sang [15].
-1967: terme d'électrode enzymatique à glucose oxydase par UPDIKE et HUCKS pour
le dosage du glucose [13].
-1969: GERGE GUILBAULT crée un dispositif pour doser l'urée dans le sang et l'urine.
-Depuis les années 70 : une centaine d'enzymes sont utilisées pour les biocapteurs
enzymatiques et encore aujourd'hui ce sont les plus fiables et utilisés [15].
11-1-2-La structure des biosenseurs

Les biosenseur trouvent des applications croissantes en médecine, en microbiologie
industrielle et dans la surveillance de l'environnement.
Dans un biosenseur, une biomolécule ou un micro-organisme entier effectue une
réaction biologique (biorécepteur) et les produits de la réaction sont utilisés pour produire
un signal électrique (par transducteur) [16] (figure 6).
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Figure 6: la structure des biosenseurs [13], [17], [18]
-Le tableau (4): présente des exemples d'association biorécepteur-transducteur et leur

utilisation. Cette liste est non exhaustive mais souligne la très grande diversité qui existe
dans le domaine des biosenseurs [13]
12
Tableau 4 : Possibilités d'utilisation des biocapteurs selon le transducteur et le

biorécepteur choisis [13].
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Tissu
Cellules
ADN
Animal/
Immuno-
T Enzyme Microorganismes végétal
agents
Conductimétrique Acétylcholin- Chlore/la vulgaris Anticorps Thylakoides

Electro- estérase
chimique Ampérométrique Tyrosinase Cellules Hela thylakoides
Anticorps
Potentiométrique Glucose oxidase Cyanobactérie ADN
Anticorps
Chlore/la vulgaris Chloroplastes
Optique (fibre) Nitrate réductase De souris
isolés
11-1-2-1-Les biorécepteurs
Le fonctionnement des biocapteurs nécessite l'utilisation d'un composant
biologique, le biorécepteur, dont dépond le signal biologique émis [13].
Le biorécepteur est le premier maillon du biocapteur .Il permet l'identification de
l'espèce à détecter grâce à son site particulièrement sélectif en assurant la reconnaissance
moléculaire [15], [19] , associée ou non à la transformation de l'espèce [15] , il est
capable de reconnaître la présence ou la concentration d'un analyte spécifique même de
petite quantité en solution [11], [12], [17].
De l'interaction de l'élément de reconnaissance avec l'analyte cible, il résulte le
changement mesurable d'une propriété de la solution, comme la formation d'un produit
par exemple [ 11] le choix du biorécepteur est également lié à celui du transducteur selon
la nature du signal biologique émis (modification physico-chimique, fluorescence, ... ).De
plus, le biorécepteur doit répondre à un certain nombre d'exigences telles que la stabilité
de son signal ou sa facilité d'immobilisation [13], [18].
Les facteurs à prendre en compte dans le choix du biorécepteur sont [13] :
-La spécifité de sa réponse.
-Sa durée de vie.
-Sa stabilité opérationnelle et environnementale.
(Sa stabilité et la nature des substances chimiques ou biologique à analyser).
-Il existe différents types de biorécepteurs : parmi eux on cité [12], [15].
a- Les enzymes
Les enzymes purifiées sont des biorécepteurs couramment utilisées et beaucoup
sont commercialisées. De très nombreux travaux portent, en effet, sur la mise au point de
biosenseurs permettant le suivi d'une activité enzymatique [13], [14].
D'un point de vue structural, ce sont des protéines qui ne sont pas modifiées au
cours de la réaction, Le site actif de l'enzyme est, quant à lui, une zone particulièrement
importante de la protéine puisqu'il assure deux fonctions, La fixation du support (site de
fixation) et sa transfo1mation (site catalytique) [13].
13
L'utilisation de ces enzymes commercialisées présente de nombreux avantages

comme la reproductibilité des lots, des caractéristiques et des durés de vie connues, une
disponibilité rapide.
Cependant, ces enzymes purifiées ne sont pas toutes très stables et demandent parfois
l'utilisation d'un co-facteur [14], elles sont relativement couteuses [13].
b- Les microorganismes ou cellules entières

On peut travailler sur les cellules entières qui possèdent elles-aussi de nombreux
avantages. Il est en effet possible de suivre certains signaux représentatifs de leur
métabolisme global ainsi que leurs perturbations après une exposition à un toxique. La
respiration cellulaire peut, par exemple, être suivie grâce à la consommation en 0 2 ou la
production de C02, à la différence des enzymes, le dysfonctionnement du métabolisme
global ne permet cependant pas d'identifier une famille de toxiques, par contre, en
s'intéressant à des fonctions plus spécifiques du métabolisme comme la photosynthèse
pour les producteurs primaires, il est alors possible de mettre en évidence la présence de
certaines molécules perturbatrices [13]. Elles possèdent toutes les enzymes et co-facteur
dans leur environnement naturel, ils donnent la réponse de l'organisme vivant et ont donc
un grand intérêt écologique [13], [18].
Grâce au génie génétique, il est également possible d'utiliser des cellules
génétiquement modifiées [13], [20].
Les tissus et les organites : sont une source de matériels enzymatique cela peut être
des lysosomes, chloroplastes, mitochondries, microsomes [ 13]
Il existe aussi des biocapteurs à immunrécepteurs et chémorécepteurs [18] Les
anticorps-antigènes et ADN (acide nucléique) récepteurs cellulaires, tissus [12], [13],
[14], [18], [19].
11-1-2-2- Le transducteur
Le transducteur est un dispositif permettant la mise en évidence de la réaction assurée
par le biorécepteur [15], [18].TI permet aussi de convertir les réactions biologiques en
courants électriques [16] quantifiable (électrochimique, optique ou une mesure de masse
ou de chaleur) [11].
Ce transducteur peut être électrochimiques, optiques (fibre), piézo-électrique [12], [13]
[19], thermométriques ou magnétiques, il transforme le signal résultant de l'interaction de
l'analyte avec l'élément biologique dans un autre signal (c'est-à-dire capteurs), Puis peut
être plus facilement mesuré et quantifié; l'électronique associé ou processeurs de signal
est principalement responsable de l'affichage des résultats à un utilisateur de manière
plus conviviale [12].
11-1-3-Les procédés d'immobilisation des biorécepteurs

L'immobilisation du biorécepteur constitue un point critique de la réalisation des
biocapteurs .Elle peut influencer aussi bien la stabilité opérationnelle, la durée de
conservation, le temps de récupération, la sensibilité, la gamme linéaire que
l'accessibilité au biorécepteur et sa réactivité [ 13].
Certaines techniques, notamment chimiques, peuvent en effet, dénaturer 1' élément
biologique (enzyme) ou le rendre non viable (cellule) [13].Le matériel biologique peut
être immobilisé directement sur le transducteur ou à proximité [13], [15].0n peut
immobiliser les différents biorécepteurs sur le transducteur par différentes manières (15],
par l'immobilisation physique et l'immobilisation chimique [13].
14
11-1-3-1-L'immobilisation physique
a- L'adsorption: est une des techniques les plus simples basées sur les forces de Van
Der Waals qui peuvent exister entre un composé biologique et une surface [13].
b-La microencapsulation : d'un biorécepteur libre en solution derrière une membrane
sélective (membrane à dialyse, collagène ... ), permet de limiter la biodégradation ou les
contaminations mais reste un procédé complexe à mettre en œuvre qui peut également
poser des problèmes quant à l'accessibilité des polluants [ 13].
11-1-3-2-L'immobilisation chimique
a-Réticulation ou Co-réticulation : nécessite une protéine de charge (comme
l'albumine) et un agent bifonctionnel, le plus souvent le glutaraldéhyde sous sa forme
liquide ou vapeur.
Quelques travaux ont montré qu'il est possible d'utiliser cette technique de fixation
covalente pour des cellules entières comme des algues ou des levures [13], [18].
b- Le couplage covalent: lie le biorécepteur à un support préalablement activé, et ce de
manière irréversible. En activant le support du capteur grâce à un groupement carboxyle
réagissant avec un carbodiimide, celui-ci peut ensuite s'associer à un groupement antine
du biorécepteur et former un lien antine entre le support et le biomatériel [13].
Dans le tableau (5) si dessous, sont cités les avantages et les inconvénients de ces
techniques.
Tableau 5: Méthodes d'immobilisation de l'élément biologique: avantages et

inconvénients [18].
Méthode Avantages 1 Inconvénients
Immobilisation 1 Adsorption Réutilisation possible de Fixation très fragile, la

physique la matrice. Traitement moindre variation de pH, de
peu dénaturant, pas de la force ionique, de la
modification de température, peut provoquer
l'élément biologique la désorption.
Couplage Faible contraint Matrice non réutilisable,

Immobilisation 1 covalent diffusion elle, liaisons Toxicité des molécules
chimique. fortes entre l'élément utilisées.
biologique et la matrice, Contraintes diffusionelles.
résistance aux potentiellement importantes,
changements de pH et de Relargage possible de
force ionique. l'élément biologique.
Réticulation, Utilisation conjointe à la Contraintes diffusion elles

Co- rétention physique pour potentiellement importantes,
réticulation Eviter les relargages de Relargage possible de
L'élément biologique. l'élément biologique.
15
11-1-4-Domaines d'application des biosenseurs

Les biosenseurs allient plusieurs technologies comme par exemple la biologie
moléculaire, la microélectronique, l'optique, l'informatique.
De nos jours les biocapteurs se miniaturisent : du centimètre à quelques centièmes de
millimètre de diamètre. Ils permettent des analyses à faibles coûts, d'éviter des
contaminations potentielles grâce à des électrodes jetables, de contrôler la qualité des
aliments (agro-alimentaire) de détecter des polluants de l'environnement [13], [15], [18],
[20].
L'ensemble des cellules, biocapteur offrent la possibilité d'obtenir de telles
informations, pour des applications telles que la pharmacologie, la biologie cellulaire, la
toxicologie [21], les mesures environnementales (une application particulièrement
importante) et la découverte de médicaments [22].
11-1-4-1-Médecine et pharmacie
Un nouvel instrument d' analyse rapide a été développé et utilisé dans des
hôpitaux depuis quelques années ; un exemple très connu la mesure du glucose dans le
sang [14]. L'analyse délocalisée peut être pratiquée au lit du malade, au cabinet médical
, dans une pharmacie , un centre de soins , un centre commercial ou par le patient lui-
même .Son application doit se définir selon des critères de rationalité et de rapport cout
/efficacité , et non sur des raisons de politique , de pouvoir ou de profit .En théorie ,
l'analyse délocalisée présente des avantages : temps de réponse plus court, prise de
décisions médicales plus rapide, élimination des problèmes d'identification et de
transport, utilisation de volumes de spécimens plus faible ainsi qu'une motivation plus
forte du personnel concerné [23].
Un biosenseur ultra-rapide lors d'un diagnostique médical, les symptômes en
présences ne sont parfois pas suffisants pour établir une conclusion sur une
contamination par un agent pathogène tel qu'une bactérie. Dans le doute, un traitement
antibiotique général est alors prescrit pour prévenir une éventuelle infection [24].
Des chercheurs du Rochester Médical centre ont inventé une puce électronique qui
pourra permettre d'émettre un diagnostique avec certitude. Ce nouveau procédé utilisé
une protéine de la bactérie suspectée responsable de l'infection comme système de
détection ainsi qu'une puce en silicium et une caméra numérique. Intégrable à tous les
types de bactéries, le système à d' abord été testé sur Escherichia coli [24].
Dans l'industrie pharmaceutique et le domaine médical, les biosenseurs ont
principalement été développés pour la recherche de stéroïdes tels que le cholestérol, la
testostérone, des antibiotiques tels que la nystatine et d'autres composés, les hormones,
l'urée, l'acide urique, la créatinine et le fer (II et III). Les biosenseurs les plus utilisés sur
le marché sont les biocapteurs à glucose, constitués de glucose oxydase comme
biorécepteur et d'un transducteur électrochimique, pour leur l'utilisation dans le
diagnostique de diabète [18].
16
11-1-4-2-Pour la détection des bactéries

Le rôle des biocapteure dans la détection de bactéries infectieuses, aussi bien que les
non infectieuses. Récemment, un intérêt accu à été manifesté pour la conception des
méthodes de détection rapides et fiable en utilisant des biocapteurs de la détection de
bactérie infectieuse. Ce ci fut particulièrement le cas pour des organismes impliqués
dans le bioterrorisme, les empoisonnements alimentaires et les problèmes chimiques tel
que la résistance aux antibiotiques [25], [26].
11-1-4-3-Agro-alimentaire
Ces dernières années la demande pour des outils analytiques spécifiques et donnants
des réponses rapides s'est accrue dans le domaine de l'industrie agro-alimentaire [18], et
notamment dans la détection des concentrations des substances résiduelles durant les
processus de fermentation industrielle qui sont critiques et exigent un contrôle
(monitoring) rapide [14]. La plupart des industries et des agences gouvernementales de
santé utilisent une variété de méthodes analytiques pour le contrôle qualitatif des
aliments, et des additifs alimentaires, et elle développe des procédés d'analyse en
continu, mais aussi pour le contrôle des contaminations biologiques ou non [18], [27] ;
ainsi que le contrôle de caractéristiques telle que les odeurs et les saveurs. Les mesures en
continu des procèdes industriels permettant un contrôle rigoureux de ceux-ci notamment
pour le contrôle de la biomasse dans le cas des procédés de fermentation [18].
Les biocapteurs sont utilisés pour le suivi en ligne des différentes étapes de
production et pour le contrôle de la qualité des produits finis. Leur application est
multiple : évaluation de la fraicheur, le contrôle de la qualité sur les matières premières,
les produits semi-finis et finis. Divers aliments sont concernés.
Il est indispensable de pouvoir détecter toute sorte de produits dans des milieux
souvent complexes. Les biocapteurs sont capables de détecter avec précision, rapidité, et
à faible coût de nombreuses substances. Cette cascade de contrôle augmente les chances
de produit un produit sûr et réduit les couts des contrôles finaux [ 15].
Exemple : D'un biocapteur ampérique et spécifique pour dégrader la caféine et la
détermination de la caféine dans les solutions. L'ensemble des cellules de Pseudomonas
alcaligenes MTCC5264 ayant la capacité de dégrader la caféine, ont été immobilisée sur
une membrane de cellophane par réticulation covalente. [28].
Il existe des biosenseurs d'acides nucléiques, leurs applications pour l'industrie des
produits laitiers pour détecter l'agent pathogènes produisant des toxines tels que
Salmonella, Listeria, Escherichia coli, Staphylococcus aureus [29], [30].
Un biocapteur utilise la pénicillinase immobilisée pour détection la pénicilline dans le
secteur du lait [29].
Une équipe de chercheurs (au Dipertomento dichimica, universsite à degli studi di
Firenze, fiortorton, l'Italie), à développé une gamme de genosenseurs électrochimiques
pour la détection rapide et simultanée de différents contaminants pathogènes des aliments
[30].
11-1-4-4-Au control environnemental

La présence de polluants d'origine industrielle ou agricole dans l'environnement, et
dans les eaux en particulier, est liée à l'utilisation massive de composés tels que les
herbicides et pesticides, les solvants chlorés ainsi que les composés des essences qui
peuvent être déversés lors du transport et du stockage des carburants. Les composés
chiriliques concernés sont généralement toxiques pour l'homme et les animaux. Cette
17
Chapitre Il Les applications des cellules immobilisées
toxicité nécessite dans les cas de pollution de suivre l'évolution de ces composés. Les
outils classiques de mesure sont très efficaces du point de vue de la sensibilité et la
reproductibilité mais leur utilisation nécessite d'effectuer des prélèvements sur site, de
transporter les échantillons puis de les analyser au laboratoire.
Les délais induits peuvent être rédhibitoires et les coûts ne sont pas négligeables
quand des nombreux échantillons sont à analyser sur des périodes de temps longues.
C'est pour ces raisons que de nouveaux appareils de mesure, biosenseurs ou biocapteurs,
qui profitent de l'avancée de connaissances dans plusieurs domaines scientifiques et dans
celui de la biologie en particulier ont été conçus. Ils permettent la création d'outils
analytiques plus sélectifs et peu encombrants, qui fournissent des mesures en temps réel
sur le site étudié [ 14].
De nombreux biocapteurs destinés au contrôle environnemental ont été développés,
et dans certains cas commercialisés, pour détecter les grandes familles de substances
susceptibles de polluer les écosystèmes aquatiques et la détection rapide de toxiques et
donc l'intervention plus rapidement en cas de pollution [13], [16].
Le tableau (6) résume quelques biosenseur utilisés pour déterminer la pollution.
Tableau 6 : Quelques biosenseur utilisés pour la détermination des polluants [17].
Soluté ou environnement Elément biologique transducteur

échantillons
Pesticides et estrone Eau de rivières Anticorps optique
phénols Eau usée Enzyme optique
alkyl benzene Eau de rivières Bactèries Electrochimique
sulphonale lineaire
(LAS)
Toxicité Usine de traitement Bactéries Electrochimique
des eaux usées
AlCanes Les eaux sou Bactéries optique
terrainent
Estrogenas Lacs et usines de Récepteur optique
traitement des eaux estrogène
usées
Demande Eau de rivière bactéries optique
biologique en
oxygène (DBO)
Mercure et arsénite Sol Bactéries optique
Zinc di chromate Sol Bactéries optique
chromate
Chlamydia Eaux de ravière ADN Electrochimique
trachomatis (DNA)
a- Les pesticides
Des capteurs à cellules entières reposent généralement sur la mesure de l'activité
photosynthétique de cellules algales perturbée en présence d'herbicides des chercheurs
ont mise en évidence la présence d'atrasine. D'autres auteurs se sont intéressés aux
"
18
variations de la consommation d'0 2 ou de la production de co2 lors de la photosynthèse

(comme les Cyanobactéries) pour détecter la présence d'herbicides [13].
b- Les métaux lourds

Biocapteurs à Chlore/la vulgaris (biorécepteurs) permettent de suivre l'activité des
phosphatases alcalines membranaires ainsi que leur perturbation en présence de divers
métaux lourds [ 13].
Des biocapteurs à enzymes purifiées détectent les métaux lourds notamment l 'uréase
et la phosphatase alcaline.
L'immunocapteurs, bien que souvent utilisés dans l'industrie agroalimentaire et le
domaine de la santé, peuvent aussi permettre la détection de toxiques dans
l'environnement [18].
Des études sur un capteur à base algues immobilisées pouvant également servir à la
détection du mercure et du cuivre [ 13].
c- Les stations d'épurations (STEP)

Les biocapteurs permettent différentes mesures au niveau de la station d'épuration.
La mesure de la pollution organique : peut être réalisée grâce à des biorécepteurs basées
sur la mesure de la DBO [demande biologique (biochimique) en oxygène] de bactéries
immobilisées. La dégradation de molécules organiques par les microorganismes
s'accompagne en effet d'une augmentation de leur consommation en oxygène modifiant
de signal mesuré par le capteur [13], [14], [15], [17].
De multiples critères établissent la base pour le développement d'un biocapteur
DBO utile, rapide pour l'estimation de la DBO des déchets industriels [17], [31], la
mesure de la toxicité [17], la mesure des pesticides et des métaux lourds [15].
Les avantages dans les STEP est que les biocapteurs sont d'une grande utilité dans
le dosage des divers polluants de l'eau: les analyses sont plus précises, plus rapides, plus
sensibles [15].
Un biocapteur est proposé qui contient des bactéries qui répondent naturellement
par efflux des ions potassium lorsque menacées par les espèces électrophiles.
Pseudomonas aeruginosa a été isolée d'une boue activée, elle possède la caractéristique
de réponse par efflux de potassium. Elle à été immobilisées dans des billes d'alginate de
calcium et liée à un système fonctionnel comme biocapteur, l'efflux de potassium et la
viabilité des cellules ont été mesurées dans les matrices d'immobilisation [17], [32], [33].
d- Control de sécurité
Des immunosenseurs ont été développés récemment pour la détection rapide du
trinitrotoluène (TNT).
Des puces à ADN sont également en développement peu détecter des
microorganismes hautement dangereux comme Bacillus anthracis.
La présence des toxines ricinées, toxine botulinique ou de drogues peut être suivie par
l'usage de biosenseurs [14].
11-1-5- Autres applications

-Détection de phénol dans leau [ 13].
-Détection et détermination des organophosphorés, d'analyse de routine de mesure de
l'acide folique, biotine, vitamine B 12 et l'acide pantothéniques comme une alternative aux
tdts microbiologiques [12].
19
-Détermination des résidus de médicaments dans des aliments, comme les antibiotiques
et les stimulateurs de croissance, en particulier la viande et le miel.
-Détection de métabolites toxiques tels que les mycotoxines [12].
-Analyse agricole ; horticole et vétérinaire ; mesure de gaz toxiques dans les industries
minières; mesure biologique directe d'aromes, d'essences et de phéromones, diagnostic
chimique et surveillance biomédicale ; surveillance de gaz et de liquides industriels [11].
\... 11-2- La bioremediation ~ "' \ V'o ~~ / ~=J'-.
Les procédés biotechnologiques ont déjà été utilisés dans la protection de

l'environnement depuis presque un siècle, bien avant l'invention du terme biotechnologie
[34]. Depuis quelques années, les biotechnologies jouent un rôle important dans de
nombreux secteurs dont l'environnement. La biotechnologie environnementale s'est
développée et elle propose des outils intéressants pour la détection de substances
potentiellement toxiques, et des applications dans le domaine de l'assainissement ou la
dépollution de matériaux (sols, déchets) ou l'eau (bioremediation) [35]. La
bioremediation n'est pas une technologie nouvelle, en effet l'utilisation d'engrais en
agriculture et le traitement des eaux usées sont basés sur les microorganismes et leur
capacité d'action. La technique la plus moderne de bioremediation remonte à 1981 avec
l'utilisation d'une plante pour le traitement des eaux usées. En fait seul le terme
« bioremediation » est récent puisqu'il n'est apparu dans la littérature scientifique qu'en
1981. Il faudra cependant attendre les années 90. Pour que les techniques de
bioremediation deviennent une alternative aux méthodes classiques et coûteuses de
dépollution [35].
11-2-1 Définition de la bioremediation

La bioremediation est. littéralement « l'action de corriger un défaut, par exemple une
pollution, à l'aide d'organisme vivants». La bioremediation est donc un ensemble de
techniques qui utilisent les systèmes biologiques pour dépolluer l'air, l'eau et le sol [35].
'i:::Elle est basée sur les principes généraux de traitement microbi~ns de dépollution des
eaux usées domestique et industrielle, mais elle est appliqué au contaminant de
manipulation particulièrement dangereuse ; produits radioactifs, métaux lourdes,
composés toxiques, explosifs [36].La bioremediation isole, identifie et caractérise les
microorganismes capables de réaliser ces réactions. En effet, de par leur diversité, les
microorganismes peuvent dégrader, modifier la structure et délocaliser différents types de
polluants (hydrocarbures, mercure, plombdioxines ... ) [35].
L'immobilisation de cellules viables est un outil versatile utilisé pour accroître la
stabilisation d'un système microbien, permettant son application dans des conditions
environnementales extrêmes. Cette technologie fournit une méthode novatrice pour
l'immobilisation des bactéries qui peut être employer en vue d'améliorer la performance
et la stabilité de traitements biologiques conçus pour la bioremediation des eaux
contaminées par des solvants chloré, des hydrocarbures, des nitrates et d'autres composés
biologiquement dégradables [37].
20
11-2-2- Types de bioremediation

La bioremediation est un ensemble de techniques consistant a augmenter la
bioremediation ou la biotransformation, en inoculant des microorganismes spécifiques
(bioaugmentation) ou en stimulant l'activité de population microbiennes indigènes (bio
stimulation) par apport de nutriments et par ajustement des conditions de milieu [38].
11-2-2-1-Biostimulation : Ajout de substances nutritives et l'oxygène sous forme liquide

ou gazeuse aux eaux usées ou au sol contaminé pour favoriser la croissance et le
développement de bactéries déjà présentes dans le milieu. La disparition des
contaminants est contrôlée afm de garantir l'efficacité des mesures correctives [39].
11-2-2-2-Bioaugmentation: Ajout de microorganismes aptes à nettoyer un polluant

particulier aux eaux ou aux sols contaminés. La bioaugmentation est généralement
utilisée avec succès sur des polluants retirés de leur site d'origine, comme par exemple
dans des installations municipales de traitement des eaux usées. Jusqu'à présent, cette
méthode n'a pas eu beaucoup de succès dans les sites pollués, en raison de la difficulté de
contrôler les conditions du site pour optimiser la croissance des microorganismes
introduites. Comme les scientifiques n' on pas encore compris touts les mécanismes que
comporte la bioremediation, les organismes introduites dans un environnement étranger
ont parfois de la difficulté à suivre [39].
11-2-2-3 Bioremediation intrinsèque: aussi connus sous le nom d'atténuation naturelle.

Ce type de bioremediation peut apparaître spontanément. Très souvent ·cependant, les
conditions naturelles ne sont pas suffisamment favorables par manque d'éléments
nutritifs, d'oxygène ou de bactéries appropriées. On peut améliorer ce genre de situation
en complétant l'un ou l'autre des facteurs nécessaires, ou même plusieurs, par exemple
en 1989, lors de la marée noire due au pétrolier géant Exxon Valdez, on a dispersé des
éléments nutritifs supplémentaires pour hâter la dégradation des hydrocarbures qui
avaient été répandus sur 1000 milles de long de la cote de l'Alaska [38].
11-2-3 Utilisation des microorganismes immobilisés dans la bioremediation

Une variété de systèmes d'immobilisation a été bien développée sur quelques
approches impliquant l'encapsulation, dans des polymères notamment l'inclusion et
l'adsorption pour l'utilisation dans le domaine de bioremediation [40].
Une nouvelle méthode a été mise au point pour l'immobilisation de microorganismes ou
de boue dans une matrice polymérique.. L'immobilisation est réalisée par couplage d'un
polymère de chitosane à haut poids moléculaire avec du lignosulfonate dans des
conditions douces pour former des billes encapsulant des cellules bactériennes ou des
boue (Figure 7). L'immobilisation protège les cellules contre les conditions extérieures
défavorables comme le pH et les solvants organiques. On peut également avoir recours
à une technique de pulvérisation pour réduire la taille des particules en besoin [37]
21
Figure 7: l'immobilisation des microorganismes ou de boue dans une matrice

Polymèréque [37].
En outre. Les chercheurs, ont réalisés des expériences sur les bactéries autotrophes
dénitrifiant Paracoccus denitrificans. Ces bactéries ont été immobilisées dans des
microcapsules de core\ Shell polymethylmethacrylate (PMMA) et utilisés pour la
dénitrification des eaux souterraines contaminées par azote nitrique [41].
Dans l'étude suivante. Une nouvelle technologie de la bioremediation a été étudiée en
utilisant les bactéries du genre micrococcus roseus, qui ont été immobilisées dans des
billes sphériques poreuse d'alginate de sodium (SA) et d'alcool de polyvinylique (PVA).
Les résultats expérimentaux ont indiqués que les cellules immobilisées ont une excellente
tolérance au pH et les changements de température ; et sont aussi plus résistantes aux
stress des métaux lourds par rapport aux cellules libres [42].
Aussi différentes méthodes de bio- réhabilitation de l'arsenic ont été mise au point. La
plupart de ces méthodes utilisent deux étapes : une oxydation chimique de l'arsénite
AS(III) en arséniate AS(7). Suivie de l'immobilisation de L'AS (7). L'utilisation
puissante est l'origine de pollution secondaire. L'oxydation par voie microbiologique de
L 'AS(III) permet de proposer une méthode alternative intéressante puisque non
polluante. Une B -protéobactérie, récemment nommée cenibacterium arsenoxidans a été
explorée car capable d'oxyder efficacement L'AS (III) en AS (7). L'étude constitue des
étapes préliminaires pour le développement de méthodologies destinées au traitement
d'eaux contaminées par l'arsenic .les chercheurs ont établi les conditions d'obtention de la
biomasse intérêt en testant de nouveaux supports de culture basés sur la valorisation de
déchets d'industries agroalimentaires. L'oxydation d' AS (III) par Cenibacterium
arsenoxidans a été testée avec des cellules en suspension ainsi qu'avec des cellules
immobilisées dans des billes d'alginate [9].
Une autre étude sur l'utilisation des cellules immobilisées dans la dégradation de
cyanure a été réalisée. Les contaminations au cyanure ou les métaux de cyanure sont
devenues des problèmes graves à l'environnement et à la santé humaine. Un mutant de
champignon Trichoderma koningii a été analysé pour avoir une haute capacité de
dégrader le cyanure. Dans cette étude, les cellules mutantes ont été piégées dans des
billes d'alginate de sodium (Na- alginate) pour dégrader le cyanure et le ferrocyanure
dans un milieu liquide minérale. En comparaison, l'immobilisation cellulaire a pris au
moins 3 et 8 jours plutôt respectivement pour une dégradation complète de cyanure et de
ferrocya..TJ.ure. Les résultats de cette étude fournissent une méthode alternative
prometteuse à grande échelle pour l'assainissement des sols ou des systèmes d'eau de la
contamination au cyanure [43].
22
11-2-5 Les avantages de la bioremediation

-La bioremediation peut être employée dans le but de s'attaquer aux contaminants
spécifiques tels que les pesticides chlorés, qui sont dégradés par des bactéries ; ou d'une
approche plus générale, telles que les marées noires qui sont ventilées en utilisant
plusieurs techniques, y compris l'ajout d'engrais pour faciliter la décomposition de pétrole
brut par les bactéries [44].
La bactérie Pseudomonas halodenitrificans fait son régal des nitrates. Ces derniers
apprécies en agriculture sous forme d'engrais, deviennent une menace pour la qualité de
l'eau lorsque ils sont répandus dans l'environnement. La bactérie est capable de respirer
en utilisant les nitrates quelle transforme par oxydoréduction en azote moléculaire,
élément gazeux inerte qui retourne dans l'atmosphère et ne présente plus de danger de
pollution [38].
La bioremediation utilise les ressources disponibles dans la nature pour nettoyer la
contamination, l'emploi de procédés biologiques comme dans le cas de bioremediation
comporte habituellement des coûts relativement faible par rapport au coût de processus
chimiques de dépollution employés dans divers sites. En outre ce processus perturbe
moins l'environnement [44].
Mais .Ce ne sont pas tous les contaminants qui sont facilement traitées grâce à
l'utilisation de la bioremediation, par exemple des métaux lourds comme le cadmium et
le plomb ne sont pas facilement absorbés par les organismes ou capturés. L'intégration de
métaux comme le mercure dans la châme alimentaire peut faire empirer les choses et ces
organismes bioaccumulent les métaux [44]. Cependant comme c'est un processus naturel
il prend beaucoup du temps [3 8].
ill-3- La stabilité plasmidique

Pour la production de protéines d'intérêt, pour des finalités thérapeutiques ou
technologiques, on a souvent recours à des microorganismes recombinants.
Généralement ces systèmes requièrent l'utilisation de plasmides bactériens comme
vecteurs portant le gène à exprimer. L'instabilité plasmidique est une préoccupation
importante lors des processus de production de protéines recombinantes, il en résulte des
diminutions significatives des rendements de production par un enrichissement progressif
de souches ayant perdu leur plasmide. Pour éviter cette situation, il est indispensable de
bénéficier de systèmes de sélection permettant de ne garder que les souches porteuses de
plasmides. Les systèmes classiques de sélection plasmidique sont basés sur une
résistance à un antibiotique ou une complémentation a une autotrophie [45].
Les techniques de génie génétique aussi permettent d'obtenir des cellules
recombinées qui sont programmées pour la production de substances naturelles de grand
intérêt. Cependant l'exploitation a l'échelle industrielle de ces microorganismes
recombinées soulève des problèmes lies a l'instabilité des plasmides. L'immobilisation
des cellules constitue un outil permettant de pallier cette instabilité [46].
111-3-1-la stabilité plasmidique chez Escherichia coli

L'effet de l'immobilisation sur la physiologie cellulaire et comment cette
cellules détermine le rendement métabolique est une préoccupation importante pour le
développement des bioprocessus, cela est particulièrement vrai pour les microorganismes
génétiquement modifies et leur stabilité génétique [47].
La stabilité du plasmide pTG201 a été examinée par la culture continue dans trois
23
souches d'Escherichia coli hôtes génétiquement différents, deux types d'expériences ont
été effectuées, l'une avec des cellules libres et l'autre avec des cellules immobilisées.
Lorsque les cellules ont été cultivées en culture libre continue en l'absence
d'antibiotique de sélection le plasmide a été maintenu avec des degrés divers de stabilité
dans les trois organismes hôtes. En revanche dans la culture en continue avec les cellules
immobilisées, le plasmide pTG201 été maintenu dans les trois souches, l'augmentation de
la stabilité de pTG201 dans les cellules immobilisées est du ni à un plasmide de transfert
entre les cellules immobilisées ni a une augmentation du nombre de copies du plasmide
dans ces cellules mais au fait d'être immobilisées [48].
Une autre étude sur la stabilité du plasmide pTG201 a été réalisé dans le gel de
carraghenane, le plasmide qui code pour la catéchol 2.3 dioxygenase a été maintenu au
cours de 80 générations dans le cas des les cellules immobilisées [49].
La stabilité et le nombre de copies de pBR322, pBR325 et pBR328 ont été étudiés au
cours de cultures continues de des cellules libres et immobilisées d 'Escherichia coli
w3101 dans les cellules immobilisées, les plasmides ségrégant librement n'ont pas été
détectés dans tous les cas, même après 250 générations. Les chercheurs ont également
montré que le nombre de copies du plasmide est resté constant et que les phénomènes tels
que les fluctuations ou les modifications génétiques qui ont eu lieu après la croissance a
long terme de bactérie dans une culture libre continue pourraient être évités dans les
cellules immobilisées [50].
La stabilité du plasmide pKK.223-.200 dans Escherichia coli JM105 a été étudiée
pour les cellules libres et immobilisées au cours d'une culture continue. La relation entre
le nombre de copies du plasmide, l'activité -de xylanase codée par le plasmide, le taux de
croissance et les conditions de culture a cause des interactions complexes qui déterminent
la stabilité du plasmide. En règle générale, la stabilité du plasmide a été renforcée dans
les cellules en cultures immobilisées par rapport aux cultures des cellules libres. Cette
stabilité est associée avec la modification du nombre de copie du plasmide [51].
111-3-2 la stabilité plasmidique chez Bacillus subtilis

La stabilité plasmidique des cellules recombinées de_Bacillus subtilis_a été étudiée
en culture continue de cellules libres et immobilisées. Bacillus subtilis phv1431 a été
immobilises dans des billes de carraghenane afin d'améliorer la stabilité du plasmide
pHV1431 aux deux températures de culture 30°C et 37°C. [52] La stabilité a été
augmentée par rapport aux cultures libres cependant l'instabilité reste néanmoins
présente. Des observations microscopiques et l'étude de la densité de l'inoculum au sein
des billes confortent l'hypothèse de l'amélioration de la stabilité par la
compartimentation des cellules et le relargage cellulaire [53], de plus une augmentation
sensible du nombre de copies a été observée en culture immobilisées. Cette augmentation
pourrait être due aux différences de croissance de cellule au sein de la bille. La souche
AP551 possède un plasmide amplifiable intégré dans le chromosome, cette souche a été
étudiée en culture continue et montre assez rapidement une perte de l'amplification
plasmidique. Lors des cultures immobilisées dans des billes de carraghenane,
l'amplification plasmidique a été maintenue plus longtemps que lors des cultures libres
mais cette amplification reste également instable lors de l'immobilisation [54], et le
tableau (7) ci-dessous présente quelques produits de fermentation codés par des
plasmides dans les espèces étudiées précédemment.
24
Tableau 7: Certains plasmides des bactéries et leurs produits.
Bactéries Plasmide Produit de fermentation Référence
Escherichia coli pTG201 Catéchol 2.3 di oxygénase [4'3J

Escherichia coli pKK.223.200 Xylanase [51]
JMJ05
Escherichia coli pUC8 B-lactamase [57]

JMJOJ
Bacillus subtilis pHv143, pIL252, [54]
pIL252kpn
Bacillus subtilis aprE Protéase alcaline [5~]
111-3-3-Stabilité plasmidique chez les levures

En raison des nombreux avantages, la levure Saccharomyces cerevisiae est de plus
en plus utilisée pour l'expression de protéines recombinantes. Habituellement, les
plasmides hybrides [vecteurs navette] sont employés comme des transporteurs à
introduire l' ADN étranges dans la levure hôte [58] ; malheureusement, la transformation
de l'hôte souffre souvent d'une sorte d'instabilité, qui tend a perdre ou à modifier le
plasmide étranger. La construction de plasmides stables, et le maintien de leur stabilité au
cours de la culture, sont quelques uns des principaux défis auxquels la production
commerciale de protéines recombinantes fait face. Plusieurs chercheurs ont montré que
par rapport à la suspension de culture libre, l'immobilisation des cellules est
particulièrement efficace dans l'amélioration de la rétention plasmidique [59].
11-4-La technologie des aliments

Le vinaigre, était probablement le premier aliment fabriqué par la technique des
cellules immobilisées (TCI), et la technique des cellules immobilisées (TCI) est
maintenant proposée pour une variété d'applications dans la production des aliments.
La technique des cellules immobilisées (TCI) est plus utilisée dans le secteur des
boissons alcoolisées et notamment la bière, la production de vin, de la bioconversion
alimentaire et la production des ingrédients, les applications sont aussi potentiellement
nombreuses pour l'industrie laitière et les fermentations des produits carnés [60].
Dans plusieurs opérations, un caractère important de la technologie des cellules
immobilisées (TCI) est l'utilisation répétée des cellules. Ce ci augmente l'intérêt pour la
diminution de la contamination [61].
25
11-4-1-Application de l'immobilisation des cellules dans l'industrie laitière

La technologie des cellules immobilisées est développée et mise à profit pour la
production de biomasse, de ferment, et de métabolites [62].
11-4-1-1-Production de biomasse
Les levains sont traditionnellement produits en fermentation batch avec des cellules
libres. Cependant, l'accumulation rapide dans le . milieu de culture des déchets du
métabolisme limite considérablement la croissance cellulaire.
La fermentation par rapport continu de milieu frais peu pallier à cet inconvénient mais les
risques de contamination , la perte de plasmide et le déséquilibre des populations en
culture mixte des facteurs limitant son utilisation . Une alternative prometteuse consiste à
produire le levain par fermentation en continu avec des cellules immobilisées. La forte
biomasse immobilisée permet d'assurer une haute productivité tout en réduisant les
risques de contamination grâce aux importants taux de dilution et d'inoculation.
D'autres chercheurs ont montrés que l'immobilisation cellulaire permettait
d'améliorer la stabilité plasmidique [4].
La libération des cellules croittre au périphérique des billes de gels dans les couches très
colonisés peut être utilisé de façon efficace à produire la biomasse dans le milieu liquide
en batch. Cette activité de libération des cellules peut être utilisée pour la production des
cultures homogènes uniques, ou des cultures des souches mixtes, l'inoculation continue
des aliments liquides et pour le traitement des aliments fermentés comme les produits
laitiers fermentés [63].
a- Les ferments des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les simples et mixtes cultures
pour la production de fromage, lait fermenté, yaourt et culture de beurre [4], [63].
La production d'un levain, composé de trois souches de Lactococcus /actis sp, par
fermentation en continu de perméat de lactosérum avec cellules immobilisées dans des
billes de K-carraghénane/gomme de caroube a été réalisée. La productivité élevée du
système, 5,3 .10 12 UFC/L.h, est restée stable durant plus de 50 jours et la modification des
paramètres de fermentation (pH, taux de dilution et température) à permis de contrôle le
ratio des populations dans l'effluent sans entrainer une baisse de l'activité du levain.
Néanmoins, la souche de Lactococcus diacetylactis devient rapidement dominante sur
Lactococcus lacis et Lactococcus cremoris dans l'effluent et les billes de gel, quelques
soient les conditions testées de température, pH et taux de dilution, et le ratio de départ
entre les populations immobilisées.
En effet , les cellules de Lactococcus diacetylactis colonisaient très largement , par
contamination croisée , les billes contenant initialement une culture pure des deux autres
souches tandis que le phénomène et moins prononcé pour les cellules de Lactococcus
!astis et inexistant pour Lactococcus cremoris , dans les limites de la méthode de
quantification utilisée .La dominance de Lactococcus diacetylactis sur Lactococcus
cremoris et/ou Lactococcus lactis à également été observée avec des souches d'origine
différente et dans un système de pré fermentation en continu du lait .
La modification du ratio initial de deux population de Lactococcus cremoris,
protéinase positive et négative, immobilisées séparément dans · un gel de K-
cairaghénane/gomme de caroube a permis de contrôler la proportion des cellules
26
relargerées dans le milieu de culture après 1Oh de fermentation batch sous contrôle de pH
[4], [63].
La stabilité microbiologique et mécanique des billes de gel, qui sont des propriétés
critiques des processus des cellules immobilisées pour les applications industrielles ont
été montrées durant 7 semaines de fermentation prolongées [63].
Tableau (8): les bactéries lactiques immobilisées par la technique d'inclusion [63].
Concentration maximale
support espèces
des cellules
11
Ca-alginate Lactococcus lactis ssp 2,0.10 UTC/ml
Ca-ahri.nate Lactococcus lactis ssp 3,8.10 11 UFC/g
K-carraghenane/gomme Lactobacillus casei 5,1.10 11 UFC/ml
caroube
K-carraghenane /gomme Lactococcus lactis ssp (trois 1,3.1011 UFC/g
caroube souches)
Gomme gellan Bifidobacterium lonf(Um 6,8. lOrn UFC/g
b- Les cultures probiotiques

Maintenant, Les probiotiques sont utilisées pour préparer une grande variété des
produits pharmaceutiques, d'aliments de lait fermenté, tels que les fromages frais, lait
fermenté, yaourt, la mayonnaise la crème glacée [64]. Tout fois, des cultures
probiotiques, comme Bifidobacterium sont fastidieuses et non compétitives, ce sont des
bactéries très sensibles aux paramètres environnementaux [65], comme l'oxygène et
l'acidité, elles exigent des milieux complexes et couteux pour leur croissance avec
l'addition de facteurs de croissance [63].
Alors que les bactéries lactiques sont principalement sélectionnées pour leurs activités
acidifiantes et protéolytiques dans les ferments classiques, d'autres propriétés doivent
être étudiées dans le cas des probietiques. Pour exercer leur effet bénéfique sur la sant~,
les probiotiques doivent, comme pour les ferments classiques, survivre en grand nombre
au procédé de fabrication, à la lyophilisation éventuelle et à l'entreposage qui s'en suit. Il
est en effet généralement admis qu'un nombre minimal de 107 cellules viables /g du
produit est nécessaire pour exercer un effet probiotiques. [7]
Des techniques d'encapsulation et de cellules immobilisées dans un état de biofilm
sont développées pour protéger et stabiliter les cultures probiotiques et pour permette un
relargage ciblé de composés biologiques actifs [62], [64], [66].
Les données récentes sur la technologie des cellules immobilisées montrent
clairement que cette approche peut être utilisée pour une production continue et stable
contenant des souches mixtes. Comme les bifidobactéries, avec une haute productivité
volumétrique et une haute concentration en biomasse dans une fermentation continue,.
même à haut taux de dilution dépassant le taux spécifique de croissance.
La production de culture lactique mixte contenant Lactococcus lactis ssp. Lactis
biovar diacetylactis MD et Bifidobacterium longum ATCC15707 est étudiée au cours de
17 Jours [63].
L'immobilisation cellulaire dans des billes de gel de polysaccharide pourrait être une
solution pour l'incorporation de souches de bifidobactéries dans les ferments
traditionnels. Cette technique permet, par la forte croissance bactérienne dans les billes et
27
les tensions intrinsèques qu'elle provoque, les forces de cisaillement dans le réacteur
agité et les nombreuses collisions entre billes, la fuite des bactéries immobilisées à la
surface des billes dans le milieu liquide. Afin d'évaluer le potentiel d'un tel système pour
produire des cultures lactiques contenant des bifidobactéries, le suivi spécifique d'une
souche de bifidobactéries en culture mixte avec une souche de lactocoque utilisée
couramment dans les ferments traditionnels doit être effectué dans le cadre d'une
production avec cellules immobilisées, d'un ferment probiotiques modèle composé de
deux souches [4].
Plusieurs études ont démontré que des cellules en phase stationnaire de croissance,
plus tolérantes aux stress environnementaux que des cellules en phase exponentielles,
devraient être privilégiées pour la confection de produits contenant des probiotiques en
grand nombre. Les interactions possibles entre bactéries lactiques et probiotiques
devraient également être prises en compte pour sélectionner la meilleure combinaison de
souche afin d'optimiser le procédé et la survie cellulaire dans le produit entreposé [7]
Enfin, ces bactéries probiotiques devraient être capables de survivre en grand nombre
aux conditions acides de l'estomac et aux sels biliaires de l'intestin lors de la
consommation du produit, puis d'adhérer aux cellules épithéliales de l'intestin afin de
produire les effets bénéfiques désirés le plus longtemps possible [7].
Donc, les bactéries lactiques sont largement utilisées en culture pure ou en mélange
dans les fermentations alimentaires traditionneles et, plus récemment, dans la production
d'aliments probiotiques et de nutraceutique. Une nouvelle technologie avec cellules
immobilisées est présentée pour la production de cultures alimentaires, avec plusieurs
avantages importants comme une productivité volumétrique très élevé, une grande
stabilité biologique lors des cultures à long terme, une haute flexibilité, un meilleur
contrôle du procédé et des rendements plus élevé en comparaison avec les procédés
classiques de culture en batch. [65], [67]
11-4-1-2-Production de métabolites
L'acide lactique, exopolysaccharides (EPS), bactériocines et la nisine Z sont les
principaux métabolites d'intérêt dont la production est réalisée par des cultures
immobilisées de bactéries lactiques ou des bifidobactéries, les fermentations sont
réalisées avec du perméat de lactosérum, sous produit de l'industrie fromagére,
supplémenté en extrait de levure afin de répondre aux exigences nutritionnelles des
bactéries lactiques [4], [62], [63].
a- Production d'acide lactique

L'acide lactique est largement utilisé comme un acidulant et agent de conversion
dans les alimentes et comme un précurseur pour la production d'émulsifiants, comme
stéaroyl-2-lactylates, pour les industries de cuisson.
De nouvelles applications telles que son utilisation comme un monomère pour la
production de plastiques biodégradables et un environnement convivial et solvant
chimique augmentera la demande en acide lactique en avenir [63].
Il est possible d'atteindre avec Lactobacillus delbrukii ATCC 9649 inclus dans le
polyacrylamide et en réacteur agité une productivité de 21,5 g/1.h d'acide lactique, des
chercheurs réalise la fermentation dans un réacteur en colonne, dans ce cas, les
transformations restent plus modestes. Il est néanmoins possible de fermenteur 48 g/1 de
glucose avec un temps de séjour de 7,9 h. Les auteurs ont pu mesurer dans ces conditions
peu favorable une demi-vie des cellules incluses de 100 jours [1].
28
Pour la production d'acide lactique, l'utilisation de la technologie des cellules

immobilisées de Lactobacillus couplée à une fermentation en continu permet d'atteindre
des productivités élevées [4], [68].
Exemples:
Immobilisation de suspensions de Lactobacillus helveticus dans des billes d'alginate
de calcium. Les suspensions concentrées immobilisées permettent de réduire de 60% la
durée de fermentation du lactosérum comparativement à une fermentation par les
procédés classiques. Les cellules immobilisées entreposées deux semaines à 4 °c dans
l'eau peptone montrent une perte d'activité de l'ordre de 50%, la teneur en alginate des
billes n'influence pas l'activité fermentaire. L'agitation des billes stimule la production
d'acide lors d'une première fermentation mais cette action est néfaste lors d'une
réutilisation [69], [70], [71].
b-Production d'exopolysaccharides (EPS)

L'industrie laitière à commencé à utiliser des bactéries lactiques produisant des EPS
parce qu'elles améliorent les caractéristiques rhéologiques des lait fermentés, ce qui
permet d'éviter d'utilisation des additifs épaississants, de réduire la matière grasse dans
les produits et même la teneur en solides du lait pour une même fermenté ou viscosité du
produit [6].
L'immobilisation de la souche est un moyen efficace d'augmenter la productivité et
de stabiliser biologiquement des fermentations en continu, parce que les souches
productrices d'exopolysaccharide favoriseraient fortement l'immobilisation par adhésion
dans des supports poreux [6], [4]. Le nouveau bioingrèdient fonctionnel devra faire face à
la concurrence de polysaccharide d'autres organismes comme le xanthane et la gomme
de caroube.
Afin de rendre les exopolysaccharides des bactéries lactiques concurrentiels, il est
important de trouver des conditions optimales (température, pH, taux de dilution) des
fermentations en continu avec des cellules immobilisées pour la production
d' exopolysaccharides.
Cependant, les méthodes pour l'isolement et la purification des exopolysaccharides
sont de longue durée, et nécessitent un volume important d'échantillon. Ceci rend la
détermination de la quantité et de la qualité d'EPS laborieuse et difficile, le
développement d'une nouvelle méthode fiable, simple et nécessite un faible volume
d'échantillon pour le dosage des EPS est alors nécessaire [6], [63].
La souche Lactobacillus rhamnous RW69595M a été choisie à cause de ses
propriétés technologiques (viscosité, aromes), nutritionnelles (fibre alimentaire,
probiotiques) et éventuellement nutraceutique associées à une forte synthèse
d' exopolysaccharides.
Cette souche à démentré une forte production d'EPS de 277mg/l dans un milieu a base de
perméat de lactosérum [6]. La fermentation en batch répétée et le contrôle de pH de
perméat de lactosérum supplémenté par une culture de Lactobacillus rhamnous
RW.9595M immobilisée sur un support solide poreux permet d'obtenir des
concentrations élevées en polysaccharides atteignant 1808mg/l [4], [72].
29
c- Production de bactériocine
Les bactériocines sont des substances naturelles de nature protéique, produites par
des microorganismes et qui présentent une activité bactéricide ou bactériostatique.
L'emploi dans les industries alimentaires , de bactériocines produites par des bactéries
lactiques nécessite des méthodologies de production et de purification extrapolables afin
de réaliser des expérimentations pilotes .La production d'une bactériocine active contre
Listeria, la divercine V41, par des cellules entières de Carnobacterium divergens V41,a
été étudiée en culture discontinue ,et en culture continue avec des cellules libres et
immobilisées dans des billes d'alginates de calcium placées dans un réacteur piston, les
productivités et les concentrations atteintes en bactériocines ont été comparées .
Les cellules immobilisées présentent une bonne productivité que l'on peut
avantageusement comparer à celle du système discontinu.
Une méthode de purification simple, rapide et bon marché, fondée su l'emploi d'un
détergent, à été développée. La production pilote de bactériocine peut donc être
raisonnablement envisagée et des études d'impact, au sein des aliments réalisées [73].
L'immobilisation cellulaire à également été utilisée pour augmenter la densité
cellulaire dans un système destiné à la production en continu de nisine Z. Malgré, un
accroissement de la biomasse d'un facteur de 1Odans le bioréacteur avec CI par rapport
aux cultures réalisées avec des cellules libres, la production de nisine Z est similaire avec
les deux systèmes.
D'autres auteurs ont rapporté une diminution de 25% de la production de nisine par
des cellules de Lactobacillus lactis 10-1, adsorbées sur un support de résine
photosensibles en fermentation continue comparativement à un réacteur avec cellules
libres.
Des résultats similaires ont été observés pour la production de pédiocine par Pediococcus
acidilactici UL5. Pour expliquer la diminution de la production spécifique de
bactériocine, ces auteurs ont proposé que les conditions constantes de la fermentation
continue avec cellule immobilisée étaient un facteur limitant pour les étapes clés dans la
biosynthèse de la bactériocine [4], [63].
Il y a aussi la technique d'immobilisation des cellules mycéliennes dans une matrice
d'inclusion, produire des métabolites d'intérêt industriels [74].
11-4-1-3-La fabrication des produits laitiers fermente

La fermentation lactique des produits laitiers constitue un champ d'application idéal
pour l'utilisation avantageuse des bactéries lactiques sous forme incluse puisqu'il s'agit
dans l'ensemble des transformations de provoquer la fermentation lactique de lactose,
parfois aussi la fermentation du citrate et dans tous les cas un relargage contrôlé des
cellules [ 1].
Les ferments lactiques jouent un rôle technologique fondamental en transformation
laitière et 1' exploitation de cultures pro biotiques (bifidobactéries, lactobacilles) exigent
des activités biologiques particulières et en pleine croissance dans le secteur des aliments
fonctionnels [62].
a- Exemple de yaourt
Les études ont décrit un procédé de fabrication du yaourt entièrement continu qui
comporte deux étapes successives. Le pré fermentation est réalisé à pH 5, 7 dans une
première cuve. Le lait pré acidifié est ensuit envoyé dans une cuve de coagulation
spécialement étudiée (yaourt brassé) ou incubé en pots (yaourt ferme) [1].
30
Il est essentiel que le rapport Lactobacillus bulgaricus / Streptococcus thermophilus soit

constant.
Pour ce faire, il faut obligatoirement que la souche possédant le taux de croissance le
plus élevé dépende nutritionnellement de la souche associée. Des variantes peuvent être
obtenus, ce qui entrain un déséquilibre dans la Co-culture.
Dans ce type de procédé, le temps de séjour du lait est de 1 à 2 heures dans la cuve
de pré acidification, ce qui au total entrain une économie des cuveries de 20% [1].
Un schéma technologique identique mais utilisant des cellules incluses à été proposé
.L es productivité les plus élevée sont obtenues, lorsque les deux espaces de bactéries
sont incluses séparément .Et la très forte productivité obtenue est due à la densité
cellulaire très élevée maintenue dans le fermenteur (5.10 12 a 1.10 13 UFC/l).
Le procédé permet par ailleurs, du fait des taux de dilution élevés, une réduction des
risques de contamination et l'obtention d'un produît fini de qualité constant. [1].
La première application des cellules immobilisées pour l'inoculation et pré
acidification (pré fermentation) en continu du lait à été développé pour la préparation de
yaourt. Dans ce système, les cellules de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus
bulgaricus sont immobilisées dans des billes d'alginate de calcium et le pH est contrôlé
par apport de lait frais. De ce fait, le taux de dilution est directement relié à la capacité
acidifiante de la culture. Avec une consigne de pH fixée à 5,7, le temps de résidence du
lait dans le bio réacteur est très court (8-9 minutes) et la production d'acide lactique est
3,3 fois supérieur à celle d'un système avec cellules libres, la productivité de ce système
permet ainsi de réduire le temps de fermentation pour la préparation de yaourt de 50 à
20% comparativement à l'utilisation classique de levains sous forme lyophilisée ou
liquide.
De plus, le ratio entre les souches est resté stable durant les lüjours de
l'expérimentation et égale à 1 ce qui constitue une valeur optimale pour la production de
yaourt [1].
b- Exemple du fromage frais

Dans le but de mieux contrôler et d'accélérer la maturation fromagère, les chercheurs
s'intéressaient au rôle joué par les bactéries du genre Lactobacillus et les enzymes
impliquées dans l'affinage du fromage cheddar. Des efforts importants sont consentis en
vue d'identifier les peptides amers et astringents du fromage et de caractériser les
aminopeptidases qui jouent un rôle prépondérant dans la disparition de l'amertume .Les
chercheurs optimisent actuellement un procédé de maturation accéléré du fromage, mis
au point récemment et implanté en industrie [62].
Un système étudiait de pré fermentation en continu du lait par quatre souches de
bactéries lactiques mésophiles [5] (ensemencement mixte) Lactobacillus lactis var. lactis
, Lactobacillus lactis var cremoris et Lactobacillus lactis var lactis biovar .diacetylactis
[ 1] immobilisées séparément dans des billes de K-carraghénane / gomme de caroube pour
la préparation de fromage frais .Une productivité très élevée d'acide lactique et de
biomasse est observée, lorsque le système opérer à 30°c [4].
Le ferment mixte est généralement utile car dans ces conditions, la genèse de di
acétyle est meilleure. Le rapport citrate/ aromes (diacétyle-acétions) est de 1/0,06 pour la
souche aromatique seule et devient 1/0, 15 pour le levain mixte .Par contre, pour la souche
incluse, il atteint 1/0,3 ce qui est encore avantageux. L'obtention de fromage frais
uniquement avec Lactobacillus lactis var .lactis bio var .diacetylactis est possible et
obtient ainsi un fromage avec une caractéristique organoleptique prononcée [ 1].
31
Ce système permet de réduire de moitie le temps de fermentation pour la production du

fromage frais, obtenu après une étape additionnelle d'acidification du lait préfermenté
jusqu'à pH 4,8 par rapport à un procédé traditionnel. Cette performance s'explique par le
taux d'inoculations élevées et le pH plus faible du lait pré fermenté en sortie du
bioréacteur. De plus, les cellules relargurées dans le lait sont en phase exponentielle de
croissance, il n'y a donc pas de phase de latence comparativement à l'emploi de levains
sous forme lyophilisée ou d'un ferment frais.
Les taux de croissance élevés en périphérie des particules permettent un renouvellement
continu de cette zone, et donc un maintien de son activité sur des durées prolongées de
fermentation [1].
La vitesse d'agitation, le type de lait et sa composition, font l'objet d'autres études.
De ces travaux. il ressort que les très forts taux de production, la stabilité biologique des
cellules et la réduction des temps de fermentation comptent parmi les avantages majeurs
du procédé d'inoculation et pré acidification en continu du lait par les cellules
immobilisées .Il est également possible d'arrêter le système pour des opérations de
maintenance du bio réacteur , ou des aspects organisationnels et pratiques en usines, sans
que cela affecte l'activité biologique des cellules . De plus, les qualités organoleptiques
ne sont pas significativement différentes entre un produit obtenu par un ensemencement
traditionnel du lait et celui préparé à partir de lait pré fermenté [75].
11-4-2-Réalisation de la fermentation alcoolique et élaboration de boissons

effervescentes
Des réacteurs à lit fixe utilisant des levures immobilisées, sont employés
commercialement pour la maturation de la bière en continu ou pour la production de
bière sans alcool.
Le procédé s'applique également à la vinification et à la production du cidre [76].
32
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Chapitre III Métabolites des cellules microbiennes immobilisées
III-Métabolites des cellules microbiennes immobilisées

Certaines recherches explorent les récents progrès dans l'utilisation des cellules
immobilisées pour la production de métabolites utilisés dans l'industrie alimentaire et
d'autres applications telles que les enzymes, les acides aminés, les acides organiques, les
alcools, les composés d'arome, les polysaccharides et les pigments [77].
111-1- Production des antibiotiques par les cellules immobilisées

La production d'antibiotiques est l'un des domaines clés dans le domaine de la
microbiologie appliquée. Il est difficile de produire des antibiotiques dans les
fermentations en continue avec les cellules libres, mais c'est un cas approprié pour les
cellules immobilisées.
Par conséquent, plusieurs tentatives ont été faites pour immobiliser différentes
espèces microbiennes sur des supports différents pour la production des antibiotiques ; le
plus étudiée est le système de production de la pénicillineG, en utilisant des cellules
immobilisées de Penicillium chrysogenum. Un autre groupe de recherche a piégé les
conidies des champignons en carraghenane et les a utilisé pour une production continue
de la pénicilline et l'a comparé avec les champignons adsorbés sur celite. Il a été signalé
que l'adsorption sur célite a été cinq fois plus productive que les cellules immobilisées en
k-carraghenane. [78]
Ogazi et al. ont utilisé des cellules immobilisées de Streptomy ces rinosus pour la
production continue de l' oxytétracycline.
Parmi les différentes méthodes d'immobilisation, l'adsorption sur le polymère
d'uréthane a été jugée supérieure aux autres méthodes ; la littérature a également rapporté
des travaux sur la production de bacitracine, patuline, nikkomycine, néomycine,
candicidine, céphalosporine, érythromycine, actinomycine et cyclosporine [77].
Certains antibiotiques produits par les cellules microbiennes immobilisées sont
indiqués dans le tableau (9).
33
Tableau 9 : Production des antibiotiques par les cellules immobilisé [3], [79]
Microorganismes
Antibiotiques Supports
immobilisées
-Actinomycine D -Streptomyces parvullus -Ca-alginate
-Bacitracine -Bacillus sp -Polyacrylamide
-Candicine -S. griseus -K-carraghenane
-Céphalosporine -S. clavuligerus -Polyacrylamide
-Chlorotétracycline -S. aureofacino -Ca-alginate
-Cyclosporine A -Tolypocladium injlatam -K-carraghenane celite
-Daunorubicine -S. eucetius -Ca-alginate
-Erythromycine -S. erythreus -Alginate
-Antibiotique hybridé -S. lividans -Agrégat des bactéries
S.ilvidans
-6APA -Escherichia co/i -Ca-alginate
-Mithramycine -S. iverini -Agar
-Néomycine -S.fradiae -Gel de cellulose
-Nikkomycine -S. tendae -Ca-alginate
-Patuline -Penicillium artica -Polyacrylamide celite
-Pénicilline G -P. chrysogenum -K-carraghenane
-Rifamycine B -S. rinosus pfl 2er -K-carraghenane
-Thienomycine -S. cattleya -Celite
-Tylosine -Streptomyces sp -Ca-alginate
111-2-Production des acides organiques par les cellules immobilisées

Les acides organiques sont d'importants produits microbiens utilisés dans une variété
d'application comme l'alimentation et les médicaments. Parmi les divers acides
organiques, l'acide citrique; occupe une position prédominante à l' lchelle commerciale
biochimique. Aspergillus Niger est le microorganisme le plus utilisé dans la synthèse de
l' acide citrique. Les champignons de fermentation ont de sérieux inconvénients dans
l'augmentation de la viscosité du milieu en conduisant à un mauvais apport en oxygène
aux cellules, par conséquent, il devient nécessaire d'aérer les cultures avec de grands
volumes d'air stérile. En cas d'immobilisation des cellules, dans la mesure où la
croissance est limitée, il est possible de faire fonctionner les fermenteurs sans affecter la
viscosité, ce qui facilite bien des taux de transfert d'oxygène avec un minimum de cause;
il existe plusieurs enquêtes sur la production d' acide citrique en utilisant des cellules
immobilisées d'A. Niger. [77] Divers acides produits par les cellules immobilisées sont
énumérés dans le tableau (10).
34
Tableau 10: Production des acides organiques par les cellules immobilisées [3].
Acides Microorganismes Supports

immobilisées
-Acide citrique -Aspergillus niger -Na-alginate

- Acide citrique -Aspergillus niger -Agarose
-Acide citrique - Aspergillus niger -Polyacrylamide
- Acide citrique -Yarrowinia l ipolitica -Différents support
-Acide citrique -Y. lipolytica -Na cellulose sulfate
-Acide lactique -Lactobacillus delbruckii -Resin

-Acide lactique -L. casei -Resin
- Acide lactique -L. lactis -Ca-alginate
- Acide lactique -Streptococcus.feacalis -Polypropyline
- Acide lactique -L. helveticus -Polypropyline
- Acide lactique -Sporolactobacillus -Na-alginate
cellulosolvens
- Acide lactique -Rhizopus orizae -Polyethylene glycol
ditnethylacrylate
-Acide acétique -Acetobacter sp. K-1024 -K-carraghénane
-Acide gluconique -A. niger -Ca-alginate
-Acide kojique -A. orizae -Alginate
-Acide malique -Brevibacterium flavum
~acide fumarique wRhizopus arrhiez
-Acide succinique -Levure -Na-alginate
-Acide gibberellique -Gibberella fajkaroi -Ca-alginate
-Acide vanilique -Pseudomonas fluorescens -Na-alginate
-Acide italonique -Aspergillus terreus -Polyuréthane
111-3-La production des enzymes par les cellules immobilisées

Les microorganismes sont les meilleures sources pour la production des enzymes
utile.
La technologie des cellules immobilisées est parfaitement adaptée pour produire des
enzymes extracellulaires, parmi les enzymes microbiennes, les enzymes dégradant
l'amidon, a-amylase et glycoamylase ont été étudiés. Plusieurs chercheurs ont tenté la
production de l'amylase par les cellules immobilisées. Plusieurs polymères ont été
utilisés (alginate de calcium, agar, polyacrylamide . . . ). Rama Krishna et al. ont tenté
l'immobilisation de Bacillus cereus dans l'alginate, ils ont employé différents réacteurs
pour une synthèse continue de l'amylase [3]. De même, des souches d'Aspergillus niger
ont été immobilisées pour la production de glucoamylase. Abraham et al. ont démontré
une production continue de glycoamylase, par l'immobilisation de fragments mycéliens
d'A. niger.
La pénicilline acyclase est une des enzymes les plus importantes utilisées
commercialement pour la production de 6AP A phényle et l'acide acétique.
Le tableau (11) : représente la production des enzymes par les cellules
iinmobilisées.
35
Chapitre III Métabolites des. cellules microbiennes immobilisées
Tableau 11: Production des enzymes par les cellules immobilisées. [3]
Enzymes Microorganismes Supports

-Peptidase -Levure -ENT-2000
-B-amylase -Bacil/us megaterium -acrylamide
-Glucoamylse -Aureobasidium pollulans -Ca-alginate
-Ribonuclease -Aspergillus clavatus -PVA
-Protease -Huonicola lutea
-Alkaline phosphatase -E. coli -K. carraghénane
-Glucose oxidase -A. niger
-Chitinase -Micromonospora chalcae -Ca-alginate
-Hydantinase -Pseudomonas sp -Polyacrylamide
-Pectinase -A. niger
-Invertase -Levure -Polymére
-a-amylase -E.coli -R. carraghénane
-Amyloglucosidase -A. niger -Ca-alginate
-Cellulase -Trichoderma reesi -Fibre de cellulose
-Penicilline acyclase -E. coli -Polyacrylamide
-B. circulans
-Chloroperoxidase -Caldariomyces funago -K. carraghénane
-Lipase -Sporotrichom thermophile -Alginate
-Lignine peroxidase -Phanerachaete -Polystyrene divinylbenzene
-Pullulanase chrysogenum -Ca-alginate
-Xylanase -Clostridium sp -Ca-alginate
-Asper~illus sydowii
111-4-Production d'alcool par les cellules immobilisées

La fermentation d'éthanol par l'utilisation des cellules immobilisées de levure, est
l'un des systèmes largement étudiés. En fait, presque toutes les méthodes
d'immobilisation ont été jugées pour la fermentation d'alcool. Il ya des revues
spécialisées sur la fermentation d'éthanol par les levures de Saccaromyces cerevisiae
immobilisées. Il ya aussi plusieurs rapports sur Zymomonas mobilis pour la production
d'alcool.
En dehors de l'éthanol, plusieurs autres alcools tels que le sorbitol, le glycérol, le
propane-diol, le 2,3 butanediol et les solvants (acétone, butanol, ... ) ont été expérimentés
avec les cellules immobilisées [80].
Le tableau (12) présente certains microorganismes qui produisent des alcools.
36
Chapitre ill Métabolites des cellules microbiennes immobilisées
Tableau 12 : Production d'alcool par les cellules immobilisées [3]
Alcool Microorganismes Supports

immobilisées
-Ethanol -Levure - gel de resin
-Ethanol -Zymomonas sp -Ca-alginate
-Ethanol -Levure -Polymére
-Ethanol - Zymomonas mobilis -Fibrous matrix
-Ethanol -Levure -Ca-alginate
-Ethanol -Levure -Alginate
-Ethanol -Kluyveromyces marxianus -Alginate
-Ethanol -Levure -PVA
-Ethanol -S. cerevisiae -Microcarries
-Ethanol -Levure -Carraghénane
-Acéton, butanol, éthnol -Clostridium acétobutylicum -Ca-alginate
-butanol -C. acétobutylicum -Chitosane
-2,3butanediol -Klebsiella pneumoniae -Ca-alginate
-2,3butanediol -Klebsiella oxylucum -Sintered glass
-2,3butanediol -Kluveromyces lactis -Polyméthan
-butanol -Clostridium sp -Carraghénane
-Glycérol -S. cervisiae
-Glycérol -Citrobacter faundii
-Acéton,butanol -C. acétobutylicum
-Sorbitol -Zymomonas mobilis -K-carraghénane
exylitol -Candida pelliculosa -Photocross linkable
-Méthanobactirium sp -Resin ENT 4000
-Méthanol -Z.mobilis -DEAE celluselose
111-5-Biotransformation par les cellules microbiennes immobilisées

Le domaine de la biotransformation utilisant les cellules immobilisées a été élargi au
cours de dernières années. L'intérêt commercial dans la transformation des stéroïdes pour
la production des composés pharmaceutiques a augmenté dans ce domaine certains
rapports récents indiquent le potentiel d'immobilisé Arthrobacter simplex pour le
déshydrogénation du cortisol. Plusieurs réactions telles que l 'hydroxylation, etc. ont été
réalisées avec succès en utilisant des cellules de Nocardia sp, Cornibacterium sp,
Mycobacterium sp, et de diverse souches de champignons Rhizopus immobilisées. [3]
37
CTA
Conclusion
Conclusion
L'immobilisation des cellules microbiennes est une technique qui a fait son
apparition, il n'y a pas longtemps, et malgré ça, elle s'est très rapidement développée
avec des résultats très probants surtout dans ces dernières années.
Son application en biotechnologie, a eu un impact très positif dans différents
domaines soit dans l' amélioration des résultats des anciennes techniques
d'immobilisation, soit dans l'industrie agro-alimentaire ou dans l'environnement, les
secteurs de la santé et en pharmaceutique. Cette efficacité est due à la protection des
cellules pendant une longue duré de temps avec une stabilité génétique élevée, ça
propriétés se caractérise par rapport aux cellules libres par plusieurs avantages, ce sont
des cellules qui peuvent être programmées pour la production, dont leur gène (plasmide)
est stimulé pour produire des métabolites définies et utiles durant une courte durée avec
une haute qualité, donc avec un rendement plus élevé. La réutilisation du support et des
cellules immobilisées est possible (coût faible).
D'autres avantages sont : une résistance à la contamination et une protection accrue
des cellules face à différents agents physiques et chimiques.
Donc l'immobilisation cellulaire est une technique utilisée comme une méthode
alternative fiable dans plusieurs applications qui utilisent les cellules libres, ce ci est dû
aux avantages cités précédemment. Mais l'utilisation de cette technique reste limitée à
cause du manque de travaux sur certains aspects du métabolisme des cellules dans l'état
immobilisé. Les recherches se poursuivent afin d'améliorer l'application de la
technologie des cellules immobilisées tout en évitant ses inconvénients comme le
relargage des cellules du support et ainsi la contamination du produit, et la technologie
des cellules immobilisées peut être trop chère pour une utilisation à grande échelle.
38
Résumé:
L'immobilisation cellulaire est l'agrégation des cellules microbiennes sur un

support solide.
L'immobilisation peut être naturelle ou artificielle réalisée par différentes
techniques : d'adsorption, l'inclusion, la rétention et la floculation, la technique est
utilisée dans plusieurs application de la biotechnologie comme : les biosensors pour la
détection des bactéries pathogène et la contamination dans un produit, la
bioremediation des sols et des eaux pollués, augmentation de la stabilité plasmidique
des microorganismes recombinants et dans la technologie des aliments et d'autres.
Cette méthode a prouvé son efficacité dans la plus part des ces domaines grâce aux
plusieurs avantages qui caractérisent les cellules immobilisées par apport aux cellules
libres, comme : la haute résistance aux agents physiques et chimiques, la facilite des
processus de purification des produits et la possibilité de réutiliser des biocatalyseurs.
Références
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J. P. Microbiologie alimentaire. Tome 2. Londres , Paris .
2-lbrahim M.; Briandet R.; Yves-Mistou M.; Chrétien A. ; Tremblay J. et Kulakauskas S. 2004.
Immobilisation des lactocoques. Lait 84:103-114.
3-Ramakrishna S. V. et Prakasham S.V.1999.Microbial fermentation with immobilized cells. Thése de

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Boudjerda Mounira Application biotechnologie Encadré par :
Boudjerda Chahira des cellules microbiennes Dr Ouled haddar.H
Boumlit Rabiha immobilisées
Résumé
L'immobilisation cellulaire est l'agrégation des cellules microbiennes sur un supp rt
solide.
L'immobilisation peut. être naturelle ou artificielle réalisée par différentes tedhniques .1

d'adsorption, l'inclusion. la rétention et la floculation. la technique est utÙisée dans p 1)lusieurs \
application de la biotechnologie comme : les biosensors pour la détection des bactéri · ·
pathogène et la contamination dans un produit, la bioremediation des sols et d es '? • uJ 1
pollués. augmentation de la stabilité plasmidique des microorganismes recombinants et d~rl~"
la technologie des aliments et d'autres.
Cette méthode a prouvé son efficacité dans la plus part des ces domaines grâce aux
plusieurs avantages qui caractérisent les cellules immobilisées par apport aux cellules llbres.
• comme : la haute résistance aux agents physiques et chim.iques. la facilite d es processus d e

purification des produits et la j30$sibilité de réutiliser des biocatalyseurs.
Abstract
Cell immobilisation meons ogregotion of microbiol cells on o solid support. C Il
immobilisation can occur naturally, or be induced artificially using different techniques:
adsorption. inclusion. retention and floculation.
.,
The technique has many applications in biotechnology: biosensors for the detection of
pathogenic bacteria or for identifying contamination and pollution; bioremediation of
contaminated soifs and waters. increasing plasmid stabili1y of recombinant bacteria. and ih
food and other technologies.
This technique showed a high efficiency in many of the cited fields due to advantages
that characterize immobilized cells from free ones, like the high resistance to physical and
chemical conditions. the easy downstream processing and the reutilisability of the
biocatalysts.
~
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Mots clés:
Immobilisation, Agrégation , Support, Application biotechnologie, Cellules
immobilisées, cellules libres.

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MlNISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

1 Application Biotechnologique des

Atoœ WwlM à ~ Wu6 ceuœ qui ~ ont aidi, de p~ ou de ~

fu pwdiculWt tWbte encadJteWi 9)11, l9uLed !JladdaJt !Jfuwtia qui ~ a

A'oœ ~ l'ea:aminaœwt ..Mme 91en :Hamada Walü8a d'CW<Wt

Immobilisation des cellules microbiennes

I-1-Définition des cellules immobilisées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Les applications des cellules immobilisées

II-2-1- Définition de la bioremediation.... ............. . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

11-3-La stabilité plasmidique . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

11-4-La technologie des aliments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 25

II-4-1-Application de l'immobilisation des cellules dans l'industrie laitière......... .... 26

Métabolites des cellules microbiennes immobilisées

Tab.1 : Avantages et inconvénients de la technologie des cellules immobilisées ........... 3

Tab.4: Méthodes d'immobilisation de l'élément biologique : avantages

Tab.5: Méthodes d'immobilisation de l'élément biologique: avantages

Tab.12: production d'alcool par les cellules immobilisées .................................. .. 37

1-lmmobilisation des cellules microbiennes

1-1- Définition des cellules immobilisées

1-2-La technologie des cellules immobilisées (TCI)

1-3-Les avantages et les inconvénients de l'immobilisation des cellules microbiennes

Tableau 1 : Avantages et inconvénients de la technologie des cellules immobilisées [6].

-Production augmentée à cause d'une 1-Cellules peuvent se séparer du support et

-Lavage de la biomasse du réacteur -Stabilité mécanique et chimique de

-Stabilité biologique et physique des -Prolifération cellulaire peut détruire la

-Découplage de la croissance et de la 1-Limitation de diffusion peut restreindre

-Coût réduit pour le traitement en aval 1-Technique des cellules immobilisées

Chapitre I Immobilisation des cellules microbiennes

1-4-Les techniques d'immobilisation des cellules microbiennes

Cellules immobilisées vivantes

Attachées à la Inclusion dans des Immobilisation Floculation

Adsorption Adsorption Inclusion Support

Figure 1 : Classification des systèmes d'immobilisation selon quatre classes [6].

1-4-1-L'attachement ou l'adsorption sur un support préformé

Tableau 2 : Quantité de biomasse immobilisée sur divers supports [1]

Support Quantité immobilisées mg matière

ri"-/"~~{~;t:;;'~l {1;·Y-~{ii'y;-,t -~ /'~'.~/~~.

Adsorption en surface attachement électrostatique liaison covalent sur

±±t±±±±±t Forces électrostatique

Figure 2 :l'immobilisation des cellules par l'adsorption [7].

-Les avantages et les inconvénients de l'adsorption

I-4-2-L'inclusion : Immobilisation dans des matrices poreuses

.. lJfil~ ·• 1t~~ ~~~~~~~~;$t~t~~~~~~~~~~~~~~~t~~~~~~~~~

Inclusion dans une matrice poreuse

1-5-2-1-Les avantages et les inconvénients de l'inclusion:

1-5-3-La rétention derrière des membranes ou bio réacteur à membrane :

.... .., '

r···- .... '-..._,,.:..._, •

............. 1 Membrane microporeuse

Floculation naturel floculation artificielle réactif hi fonctionnelle

Figure 5 : l'immobilisation des cellules par la floculation [7].

sur la production des homopolysaccharides (impliquant des enzymes extracellulaire ) par

Matériel du support Microorganisme

1-6-Analyse des cellules immobilisées

1-7-Modiflcation physiologiques induites par l'immobilisation

II-Les applications des cellules immobilisées

11-1-2-La structure des biosenseurs

!!tl:.1:?.1--i-!:"=..\...-:..-::lb11 ~~:':5ic: T:..;.:".!loh-1:'l"I C' ~~:-OriJ Jyfo.-J~..ll'OJ e-:

Figure 6: la structure des biosenseurs [13], [17], [18]

-Le tableau (4): présente des exemples d'association biorécepteur-transducteur et leur

Tableau 4 : Possibilités d'utilisation des biocapteurs selon le transducteur et le

Conductimétrique Acétylcholin- Chlore/la vulgaris Anticorps Thylakoides

Potentiométrique Glucose oxidase Cyanobactérie ADN

.. lJfil~ ·• 1t ~~~~~~;$t~t~~~~~~~t~

!!tl:.1:?.1--i-!:"=..\...-:..-::lb11 :':5ic: T:..;.:".!loh-1:'l"I C' :-OriJ Jyfo.-J~..ll'OJ e-: