TP Sérologie Médicale 2023-2024UR2IM - 231212 - 133111

UE : Travaux Pratiques de Sérologie
Médicale
Code : MED 313
Chargés du TP : Dr Gnatoulma KATAWA,

Mlle Marthe AMESSOUDJI.
Année académique : 2023 - 2024

Laboratoire de Microbiologie et de Contrôle de qualité des Denrées
Alimentaires MED 313 : TP
Unité de Recherche en Immunologie et Immuno-Modulation Sérologie Médicale
Table des matières

Chapitre I : Les techniques immunologiques ...................................................................................3
A- Techniques immunologiques sans traceur ........................................................................3
I- Immunoprécipitation .........................................................................................................3
II- Immunodiffusion ...........................................................................................................5
III- Immunochromatographie..............................................................................................8
IV- Réaction d’agglutination ............................................................................................. 12
B- Techniques immunologiques avec traceurs .................................................................... 15
I- Les enzymes comme traceurs .......................................................................................... 15
II- Dosage Immuno-enzymatique (ELISA) ...................................................................... 17
III- Immuno-fluorescence (FLISA).................................................................................... 19
IV- Dosage radio-immunologique (RIA) ........................................................................... 23
Chapitre II : Réaction Antigène et anticorps dans les immunodosages ........................................ 24
I- Les antigènes comme réactifs .............................................................................................. 24
A- Caractéristiques d’un antigène.................................................................................... 24
B- Nature chimique, origine et localisation des antigènes ............................................... 24
C- Thermodynamique de la réaction Ag-Ac .................................................................... 25
D- Qualité de l’antigène et interaction Ag-Ac .................................................................. 25
E- Impact des propriétés des antigènes en immuno-dosage ............................................ 26
F- Propriétés des antigènes et choix des méthodes immunologiques .................................. 26
G- Conditions réactionnelles de la mise en œuvre d’un immunodosage ......................... 27
H- Fixation d’un antigène à un support ........................................................................... 27
I- Préparation d’un antigène............................................................................................... 27
II- Les anticorps comme réactifs .......................................................................................... 27
A- Les anticorps monoclonaux et polyclonaux ................................................................ 27
B- Conservation des anticorps.......................................................................................... 28
C- Intérêt des anticorps polyclonaux et monoclonaux ..................................................... 28
Chapitre III : Méthodes Automatisées Du Diagnostic Immunologique Des Maladies Infectieuses
......................................................................................................................................................... 30
I – Méthodes immuno-enzymatiques .......................................................................................... 30
A- Principe ........................................................................................................................ 30
B- Exemples d’équipements ............................................................................................. 30
II – CHIMILUMINESCENCE ................................................................................................... 31
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A- Principe ........................................................................................................................ 31
III – IMMUNOFLUORESCENCE ............................................................................................ 33
A- Principe ........................................................................................................................ 33
IV – IMMUNOTURBIDIMETRIE ............................................................................................ 35
A- Principe ........................................................................................................................ 35
B- Exemple d’équipement ................................................................................................ 35
V – Applications dans le diagnostic de certaines maladies ........................................................ 36
❖ MALADIES PARASITAIRES ........................................................................................ 36
❖ MALADIES BACTERIENNES ...................................................................................... 36
❖ MALADIES VIRALES ................................................................................................... 36
Chapitre IV : Performances des tests immuno-sérologiques ......................................................... 37
I - Les facteurs qui affectent la performance d’un test sérologique .......................................... 37
A- Les facteurs intrinsèques ............................................................................................. 37
B - Les facteurs extrinsèques .................................................................................................. 38
II – Les critères de validation des tests sérologiques .................................................................. 39
A- Tests qualitatifs ............................................................................................................ 39
B- Tests quantitatifs.......................................................................................................... 39
TRAVAUX PRATIQUES............................................................................................................... 41
PLANCHE N°1 : Courbe de précipitation ................................................................................. 42
PLANCHE N°2 : Test d’immunochromatographie (ICT) _ Bandelette réactive de test de
grossesse ...................................................................................................................................... 43
PLANCHE N°3 : Test immunochromatographique (ICT) _ Determine HIV........................... 45
PLANCHE N°4 : Test immunochromatographique (ICT) _ SARS-CoV-2 Ag (BIOSYNEX
COVID-19 Ag BSS) ..................................................................................................................... 49
PLANCHE N°5 : Test immunochromatographique (ICT) _ SARS-CoV-2 IgG/IgM ............... 51
PLANCHE N°6 : Test d’agglutination active............................................................................. 54
PLANCHE N°7 : Test d’agglutination passive........................................................................... 56
PLANCHE N°8 : Dosage des cytokines par méthode ELISA Sandwich ................................... 58
PLANCHE N°9 : Préparation d’un antigène ............................................................................. 60
PLANCHE N°10 : Programmation d’un lecteur de plaque ELISA .......................................... 61
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Chapitre I : Les techniques immunologiques

A- Techniques immunologiques sans traceur
I- Immunoprécipitation
On parle d’Immunoprécipitation lorsqu’en milieu liquide, on note l’apparition progressive d’un

précipité suite à l’ajout des quantités croissantes d'antigènes à une solution d'anticorps de
concentrations fixe dont l'importance varie avec le rapport antigène–anticorps.
Fig 1 : Courbe de précipitation de Heidelberger.
Deux principes optiques d'appareillages automatisables, basés sur la déviation d'un faisceau
monochromatique laser au contact des particules de précipité, ont été développés :
La turbidimétrie évalue ainsi la diminution de la lumière transmise dans une solution

contenant des complexes immuns insolubles.
La néphélémétrie, par contre, mesure à côté du faisceau laser, avec un angle précis, la lumière
dispersée par les complexes immuns insolubles, qui se comportent comme des particules
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Fig 2: Principes de la turbidimétrie et de la néphélémétrie
❖ Avantages/inconvénients
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❖ Exemples d'applications
• En recherche : l'immunoprécipitation en milieu liquide est couramment utilisée pour l'étude

de protéines. Les extraits protéiques à analyser (e.g. milieu de culture, lysat cellulaire) sont
incubés avec les anticorps. Cette étape permet la formation des complexes antigène–anticorps.
Les complexes sont séparés par simple centrifugation, ou grâce à un anticorps anti-
immunoglobulines ou une protéine liant le Fc des immunoglobulines, couplés à des billes.
• En clinique : la néphélémétrie est utilisée en pratique courante pour le dosage des protéines
sériques, dont les isotypes majeurs des immunoglobulines (IgG, IgA, IgM et accessoirement
IgD) et certains composants du complément (C3, C4, C1-inhibiteur et facteur B). Les
techniques avec particules de latex permettent le dosage des facteurs rhumatoïdes, de certaines
sous-classes d'IgG et des chaînes légères libres.
Travaux pratiques : Planche N°1
II- Immunodiffusion
L'immunodiffusion double d'Ouchterlony est une analyse qualitative qui consiste à déposer des
solutions d'antigène et d'anticorps dans des puits creusés en regard dans un gel d'agarose. Les
molécules diffusent uniquement en fonction de leur masse moléculaire et il se forme des lignes
de précipitation pour chaque système antigène–anticorps aux zones d'équivalence respectives.
Elle permet d'analyser les identités entre les différents constituants.

- Lorsque deux antigènes identiques sont déposés dans des puits adjacents, ils sont
reconnus par les mêmes anticorps de l'antisérum, et les arcs de précipitation sont
continus, car il s'agit du même système antigène–anticorps : on parle d'identité.
- Lorsque les deux antigènes sont différents, ils sont reconnus par deux groupes
d'anticorps différents, et les deux arcs de précipitation se croisent. On parle de non-
identité, liée à l'existence de deux systèmes antigène–anticorps totalement distincts.
- Enfin, si certains des épitopes sont partagés entre les deux antigènes, il y a formation
d'un éperon entre les deux arcs de précipitation, traduisant une identité partielle.
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Fig 3 : Technique d'Ouchterlony, immunodiffusion double.

Représentation schématique des arcs de précipitation obtenus en comparant deux dépôts
d'antigènes identiques, différents ou partiellement identiques.
A : antigène A ; A′ : antigène A′ partiellement identique à A mais plus complexe ; Anti-A :
anticorps anti-A ; Anti-A′ :
Anticorps anti-A′ ; B : antigène B ; Anti-B : anticorps anti-B.
L'immunodiffusion radiale selon Mancini est une immunodiffusion simple bidimensionnelle

quantitative. Un antigène soluble, déposé dans un puits, diffuse radialement au sein d'un gel
contenant l'anticorps correspondant, qui doit donc être précipitant et le plus souvent de nature
polyclonale. La réaction antigène–anticorps aboutit à la formation de complexes insolubles
visualisés sous forme d'un cercle autour du puits où a été déposé l'antigène.
La surface de l'anneau de précipitation au point final de diffusion, donc le carré de son diamètre,
est proportionnelle à la concentration en antigène. La réaction se fait dans des plaques dans
lesquelles est incorporé un étalonnage en trois points. Après diffusion totale (24 à 72 heures),
les diamètres des anneaux de diffusion sont mesurés et une droite d'étalonnage est établie avec
les valeurs de la gamme d'étalonnage.
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Fig 4 : Technique de Mancini, immunodiffusion radiale
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• En recherche :
Ces techniques font partie historiquement des premières ayant permis d'explorer les systèmes
antigène–anticorps. Elles sont moins utilisées actuellement mais peuvent être utiles pour
vérifier la qualité des préparations antigéniques au cours des étapes de purification.
• En clinique :
– L'immunodiffusion simple d'Ouchterlony et l'électrosynérèse ont été très utilisées pour
analyser les spécificités de certains anticorps antinucléaires pour le diagnostic du lupus
érythémateux, antiADN naïf anti sm etc ;
– L'immuno-électrophorèse permet de séparer les fractions antigéniques et de rechercher des
anticorps dans les sérums de patients (identification d'anticorps anti-aspergillus ou anti-
candida).
Elle est également très utilisée pour l'étude des protéines sériques humaines ;
– L'immunofixation est principalement utilisée pour caractériser les immunoglobulines
monoclonales ou oligoclonales, dans le sérum, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) ;
– L'immunodiffusion radiale et l'électro-immunodiffusion sont utilisées pour le dosage de
protéines.
III- Immunochromatographie
Dans les applications visant à la détection d'antigènes, le principe général consiste à mettre en
contact une solution biologique et des billes portant à leur surface des anticorps spécifiques de
la molécule recherchée. Ce mélange migre sur un support possédant à sa surface des anticorps
spécifiques de la même molécule d'intérêt. Si la molécule cible est présente dans l'échantillon
biologique de départ, elle est prise en sandwich au cours de la migration entre les deux anticorps
et les billes s'immobilisent sur le support. Lorsque suffisamment de billes sont immobilisées,
une coloration est détectable et indique la présence de la molécule d'intérêt. Deux types
d'anticorps de capture sont déposés en deux points pour former une ligne de capture (fixation
des complexes immuns sur les billes) et une ligne de contrôle (fixation des billes seules
reconnues par un anticorps anti-immunoglobulines). Dans ce cas, un test positif se traduit par
la formation de deux bandes de billes d'or
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Fig 5A : Immunochromatographie sur membrane.selon un principe sandwich.
Une alternative à cette technique sandwich, pour la détection d'antigènes, est la méthode par
compétition. Dans ce cas, les billes recouvertes d'anticorps ayant fixé l'antigène recherché ne
peuvent être arrêtées par de l'antigène préalablement fixé sur la membrane et sont seulement
reconnues par des anticorps anti-immunoglobulines.
Les billes n'ayant pas fixé l'antigène sont arrêtées par l'antigène de la membrane et par les
anticorps anti-immunoglobulines. Dans ce cas, un test positif se traduit par la formation d'une
seule bande de billes d'or
Fig 5B : Immunochromatographie sur membrane par compétition
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ESTBA/UL Dr KATAWA
Exemple : Recherche de streptocoques A par immunochromatographie
Etape 1 : Présentation de la bandelette comportant la membrane de migration
Strep A
S T C
Etape 2 : Liaison entre le polyoside C et l’anticorps anti-streptocoque A

chromophore
Etape 3 : Prise en sandwich des complexes immuns dans la zone test et liaisons
entre l’anticorps anti-streptocoque A chromophore et l’anti-globuline dans la
zone témoin
Zone Témoin de
test migration
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Etape 4 : Résultat : apparition d’un trait coloré dans la zone témoin (signant un
test valide) et dans la zone test (signant un test positif)
Zone Témoin de
test migration
• En recherche :
Dans le domaine agro-alimentaire, les tests d'immunochromatographie sont utilisés
couramment pour la recherche et la détection de Listeria monocytogenes dans les aliments ou
de Plasmopara halstedii sur le tournesol.
• En clinique :
– en pratique clinique, l'exemple le plus connu est le test de grossesse qui révèle la présence
d'hormone chorionique gonadotrope (HCG) dans les urines ;
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– ces tests sont également utilisés pour l'orientation diagnostique de maladies infectieuses
comme la peste, la dengue, le paludisme, les infections à streptocoques ou la grippe
(écouvillonnage nasal).
Travaux pratiques : Planche N°2, Planche N°3, Planche N°4 et Planche N°5
IV- Réaction d’agglutination
Les réactions d'agglutination mettent en jeu le plus souvent un antigène présent à la surface
d'une particule d'une taille comprise entre 0,1 et 10 microns (hématies, leucocytes, plaquettes,
spermatozoïdes, micro-organismes, billes de latex ou de sépharose) et des anticorps qui en sont
spécifiques. La suspension de particules, d'abord homogène, devient le siège d'agrégats visibles
à l'oeil nu ou au faible grossissement d'un microscope ordinaire (objectif × 10). C'est un
phénomène d'association antigène–anticorps regroupant les particules en amas.
Les différentes modalités consistent à développer une agglutination directe ou indirecte, active
lorsque l'antigène est propre à la particule (e.g. groupe sanguin, bactérie) ou passive lorsque
sont utilisées des particules inertes sur lesquelles l'antigène d'intérêt a été préalablement fixé.
Fig 6 : Exemple d'agglutination directe avec des anticorps agglutinants d'isotype IgG (en haut)
ou IgM (en bas) reconnaissant un antigène (en bleu) présent à la surface des particules
agglutinées.
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1. Agglutination ACTIVE
Agglutination résultant d’une union spécifique entre un anticorps et un antigène particulaire

appartenant naturellement à la particule.
2. Agglutination PASSIVE
Agglutination réalisée entre un anticorps et un antigène normalement soluble, mais rendu

particulaire par fixation sur un support.
3. Agglutination DIRECTE
Agglutination réalisée entre un anticorps agglutinant et un antigène généralement

particulaire.
4. Agglutination INDIRECTE ou ARTIFICIELLE
Agglutination réalisée entre un anticorps non agglutinant et un antigène (généralement

particulaire) avec utilisation d’un artifice.
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Exemple d’agglutination directe et indirecte : Test de Coombs
• En recherche : cette technique peut être appliquée à de nombreuses combinaisons antigène
anticorps.
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• En clinique :
– les groupes sanguins sont déterminés par agglutination active ou directe. Ce type de réactions
est également appliqué aux sérogroupages bactériens (e.g. Salmonella, Shigella, E. coli
entéropathogènes) ;
– la recherche d'anticorps anti-hématies est réalisée dans le cadre des anémies hémolytiques par
les tests de Coombs directs ou indirects ;
– l'agglutination passive est utilisée par exemple pour la recherche d'anticorps antitoxoplasme
dans un sérum après fixation d'un antigène soluble de toxoplasme sur des billes de latex ;
– la néphélémétrie microparticulaire est utilisée pour le dosage des facteurs rhumatoïdes.
Travaux pratiques : Planche N°6, Planche N°7
B- Techniques immunologiques avec traceurs

I- Les enzymes comme traceurs
L'utilisation d'enzymes comme traceurs a été introduite dans la seconde moitié du xxe siècle
pour offrir une alternative aux radio-isotopes. Pour être efficaces en tant que traceurs, les
enzymes candidates doivent privilégier des contraintes michaeliennes avec un faible KM pour
leur substrat, catalyser des réactions irréversibles, être stables, résistantes aux interférences et
faciles à conjuguer sans perte d'activité.
L'activité enzymatique en présence d'un substrat adapté et d'un chromogène1 génère un produit
coloré proportionnellement à la quantité d'enzymes et donc de la molécule à laquelle elle est
conjuguée.
La mesure est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre et le résultat est exprimé en unités
arbitraires de densité optique (DO).
Dans les techniques immuno-enzymatiques en phase liquide, le produit coloré doit demeurer
soluble et rester détectable par spectrophotométrie ou chimioluminescence. Dans les techniques
en phase solide (e.g. membranes synthétiques, cellules, tissus), le produit coloré précipite au
site précis de la réaction antigène– anticorps et est détecté macroscopiquement ou
microscopiquement. L'anticorps (ou l'antigène) est couplé à une enzyme soit de façon
covalente, soit par des liaisons non covalentes biospécifiques. Le système biospécifique de
conjugaison non covalente est basé sur l'interaction entre la biotine et la streptavidine (purifiée
à partir de Streptomyces avidinii) ou l'avidine (isolée des blancs d'oeufs). Cette interaction à
une affinité extrêmement forte de l'ordre de 10−14 M. Deux systèmes peuvent être utilisés.
Dans le plus simple, la biotine est conjuguée à l'anticorps et la streptavidine à l'enzyme, toutes
deux de façon covalente. C'est le système streptavidine–biotine ou avidine–biotine (Avidin–
Biotin Complex ou ABC). Les enzymes les plus utilisées sont la peroxydase et la phosphatase
alcaline en raison de leur simplicité d'utilisation et de leur sensibilité.
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Fig 7 : Représentation schématique du système d'amplification du complexe avidine–biotine

(ABC).
Tableau 1 : Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique développée en

immuno-analyse
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Tableau 1 Suite : Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique

développée en immuno-analyse
II- Dosage Immuno-enzymatique (ELISA)
Tableau 2 : Différents types d'ELISA utilisables selon l'analyte recherché : antigène ou

anticorps
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Fig 8 : Représentation schématique des différents types d'ELISA ou de FLISA.
Fig 9 : Différentes étapes d'un ELISA de type sandwich.
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III- Immuno-fluorescence (FLISA)

➢ Fluorescence Linked Immunosorbent Assay
Immuno Fluorescence indirecte Immuno Fluorescence directe
Fig 10 : Immunofluorescence directe et indirecte.
Exemple d’application : Recherche de Treponema pallidum dans un sérum
1 -Fixation du 2 -Ac anti – 3 -Anticorps

prélèvement Treponema pallidum conjugué FITC
-
Négatif
+
Positif
4 -Résultats
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➢ Immunodosage par les billes

o le CBA
La technologie d'immunodosages multiplex utilise des microbilles de polystyrène de 5 à
8 μm (selon les fournisseurs), recouvertes de molécules (e.g. peptides, anticorps, acides
nucléiques) fixées de manière covalente par une liaison entre le groupement amine de la
molécule et les fonctions carboxyliques des microbilles. L'originalité de cette technique repose
sur la détection simultanée de plusieurs analytes (jusqu'à 100) à partir d'un faible volume
d'échantillon, d'où le terme de multiplexage.
Le principe est de capturer l'analyte avec les billes et de révéler cette capture avec un traceur
fluorescent, selon une technique de type sandwich.
Fig 11 : Principe du multiplexage sur billes.

Exemple d'un système à laser rouge (635 nm) et à laser vert (532 nm).
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Les domaines d'application de la technologie d'immuno-analyse par multiplexage sur billes sont
très étendus.
• En recherche : le dosage des cytokines dans des fluides biologiques ou dans des surnageants
ou lysats cellulaires utilise cette méthodologie. Il est par ailleurs désormais possible d'effectuer
des analyses transcriptomiques (mRNA, miRNA) grâce aux plates-formes de multiplexage sur
billes.
• En clinique : le multiplexage est utilisé pour la détection et la quantification d'auto-anticorps
(diagnostic et suivi de maladies auto-immunes), d'allo-anticorps (anti-HLA en transplantation
d'organes) ou d'anticorps post infectieux. Le couplage de sondes oligonucléotidiques sur les
billes permet le typage d'allèles (très utilisé pour les typages HLA, en transplantation
notamment), l'analyse de polymorphismes ou de mutations, ou encore la détection d'acides
nucléiques viraux ou bactériens.
o Le luminex
La technologie Luminex repose sur des particules de polystyrènes microscopiques appelées
microsphères ou microbilles, qui servent de phase solide pour la détection des réactions
biochimiques. Actuellement, 100 différents types de microbilles qui diffèrent dans leur couleur
de fluorescence sont disponibles. Chaque type de microbille peut être chargé avec différents
réactifs de détection. Cette combinaison de différentes microbilles permet lors, lors d’un test,
d’avoir jusqu’à 100 réactions de détection différentes effectuées simultanément dans un très
petit volume d’échantillon. Grâce à la grande flexibilité de multiplexage des différentes
microbilles, tous les paramètres imaginables sont mesurables par une interaction spécifique
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définie de deux composés biochimiques. La détection spécifique de l’analyte lié aux microbilles
se fait via une molécule de détection (conjugué), qui a une forte affinité pour l’analyte. Le
conjugué est couplé avec un colorant fluorescent dont la longueur d’onde diffère de celle émise
par les microbilles. De cette façon, la classification des microbilles et la quantification de
l’analyte sont effectués en parallèle.
Fig 12 : Système complet du Luminex
Fig 13 : Principe complet du Luminex
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IV- Dosage radio-immunologique (RIA)

❖ Méthode par compétition (ou par défaut d'anticorps)
Le principe repose sur la compétition entre des molécules d'antigène marquées (Ag*) et non
marquées
(Ag) d'une même espèce vis-à-vis d'un nombre donné et limité de sites de liaison anticorps.
L'anticorps (Ac) est fixé sur une phase solide, paroi de tube ou billes de polystyrène. L'excès
de traceur est éliminé après incubation par une étape de lavage. La quantité des formes liées
(Ag*-Ac) est inversement proportionnelle à la quantité de l'analyte non marqué (Ag) présent
dans l'échantillon. Les trousses de dosage fournissent le support solide (tubes, billes), l'analyte
marqué et une gamme étalon couvrant le domaine de mesure.
❖ Méthode sandwich
Le principe du dosage s'appuie sur la reconnaissance de l'antigène dosé par deux anticorps
spécifiques de deux sites antigéniques distincts et accessibles. Un premier anticorps est adsorbé
sur un support sol ide (tube ou bille). Le second anticorps est marqué à l'iode-125 et utilisé
comme traceur. L'antigène de l'étalonnage ou de l'échantillon est pris en sandwich entre les
deux anticorps. L'excès de traceur est éliminé par une étape de lavage. La radioactivité mesurée
est proportionnelle à la quantité d'antigène présente dans l'échantillon.
Les techniques RIA ont été supplantées par les techniques ELISA. Il subsiste quelques
domaines d'application en hormonologie, cancérologie (marqueurs tumoraux), auto-immunité
(anticorps anti-ADN natif) ou pharmacologie (dosage de médicaments et de toxiques).
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Chapitre II : Réaction Antigène et anticorps dans les immunodosages
I- Les antigènes comme réactifs

A- Caractéristiques d’un antigène
Leur définition sous-entend une interaction spécifique avec le système immunitaire adaptatif et
plusieurs critères permettent de caractériser les antigènes.
Les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes B (BCR) peuvent reconnaître des molécules
natives, en solution ou particulaires.
Les antigènes thymo-dépendants les antigènes induisant une réponse lymphocytaire B faisant
appel aux lymphocytes T auxiliaires.
Les antigènes thymo-indépendants sont certaines structures répétitives pouvant induire des
réponses lymphocytaires B sans l'intervention des lymphocytes T.
Les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) reconnaissent des fragments
d'antigènes, le plus souvent des antigènes peptidiques, associés aux molécules du complexe
majeur d'histocompatibilité (CMH) ou human leucocyte antigens (HLA) chez l'homme.
Un épitope correspond à la structure minimale d'un antigène reconnue par une partie limitée
pour le récepteur de l'antigène, appelée paratope. Un antigène peut être constitué d'une
mosaïque d'épitopes. La structure d'un épitope dans l'espace (ou structure stéréochimique) peut
être séquentielle (ou linéaire) ou conformationnelle (structures secondaire, tertiaire ou
quaternaire).
B- Nature chimique, origine et localisation des antigènes
Les antigènes peuvent être des protéines, des polysaccharides, des lipides, des acides
nucléiques, des métaux, des molécules de synthèse ou des molécules complexes (e.g.
glycolipides, glycoprotéines).
Selon leur origine, on distingue :

Les haptènes les antigènes non immunogènes,
Xéno-antigènes les antigènes propres à une espèce différente,
Allo-antigènes les antigènes propres à des individus différents dans la même espèce,
Auto-antigènes les antigènes propres à un individu donné,
Les néo-antigènes, les antigènes formés de novo par transformation de l'antigène originel ou
issus de la combinaison de plusieurs molécules.
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C- Thermodynamique de la réaction Ag-Ac
Les caractéristiques physiques des réactions antigène– anticorps sont très importantes à
connaître pour le développement de techniques qui les utilisent car elles conditionnent de
nombreux paramètres de l'expérimentation souhaitée. Épitopes et paratopes engagent des
interactions non covalentes, instables et réversibles, de type liaisons de van der Waals, liaisons
hydrophiles/hydrophobes, liaisons électrostatiques et liaisons hydrogène. La somme de ces
liaisons définit la force d'interaction entre l'antigène et son récepteur. L'affinité de l'anticorps
est évaluée par une constante d'affinité (Ka) qui s'exprime en L/mol (L.mol−1). Ainsi, un
anticorps de faible affinité possède une constante proche de 10−4 L.mol−1 et un anticorps de
haute affinité, une Ka proche de 10−12 L.mol−1. Une autre façon ^^d'exprimer l'affinité d'un
complexe épitope/paratope est de définir la concentration molaire permettant de saturer 50 %
des récepteurs présents. On considère qu'une faible affinité est de l'ordre de 10−4 mM et une
forte affinité de l'ordre de 10−9 mM. Cette affinité dépend de la complémentarité entre l'épitope
et le paratope.
Les immunoglobulines portent au minimum deux paratopes semblables, capables de

reconnaître les mêmes épitopes, si ceux-ci sont répétés au sein du même antigène ou présents
sur deux antigènes proches. La valence antigénique correspond au nombre de molécules d'un
épitope donné pouvant être reconnues simultanément par des anticorps qui lui sont spécifiques.
L'accès des paratopes aux épitopes est par ailleurs contraint par la notion d'encombrement
stérique. La valence antigénique est ainsi toujours inférieure ou égale au nombre d'épitopes.
L'avidité représente la résultante des différentes forces d'interaction engagées entre les anticorps
et les épitopes. La force d'interaction globale d'un anticorps avec sa cible dépend alors du
nombre de paratopes qu'il peut engager. Ainsi, une IgM, pentamérique, qui peut engager ses
dix paratopes lors de l'interaction avec un antigène, a une force d'interaction (avidité) plus
importante que celle d'une IgG qui ne peut engager que deux paratopes identiques.
D- Qualité de l’antigène et interaction Ag-Ac

Une modification infime de l'épitope peut avoir des conséquences majeures sur la qualité des
récepteurs engagés, avec des retentissements parfois importants sur la qualité de la réponse
immunitaire qui en découle. Dans le cas des épitopes peptidiques, on peut ainsi définir des
motifs :
• Agonistes, qui présentent une structure proche ou dans lesquels le remplacement d'acides
aminés n'affecte en rien la qualité de la reconnaissance par le récepteur et la réponse
immunitaire qui en découle ;
• Agonistes partiels, au sein desquels le remplacement d'acides aminés affecte la

reconnaissance et surtout la quantité de signaux transduits par le récepteur. La réponse
immunitaire peut être moins intense et/ou aboutir à un autre profil cytokinique (e.g. Th1 versus
Th2) ;
• Super-agonistes, si le remplacement d'acides aminés conduit à une réponse amplifiée

comparativement à celle obtenue avec la molécule initiale ;
25
ESTBA/UL Dr KATAWA
• Antagonistes, lorsque le remplacement d'acides aminés affecte la reconnaissance et conduit

à la réponse inverse de celle obtenue avec la molécule initiale.
E- Impact des propriétés des antigènes en immuno-dosage
Tableau 3 : Impacts des propriétés de l'antigène dans les réponses immunitaires et en

immuno-analyse
F- Propriétés des antigènes et choix des méthodes immunologiques
Tableau 4 : Impact de la propriété des antigènes sur le choix des méthodes immunologiques
26
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G- Conditions réactionnelles de la mise en œuvre d’un immunodosage
Tableau 5 : Influence des conditions réactionnelles sur la mise en œuvre d'un immunodosage
H- Fixation d’un antigène à un support
Cf Travaux pratiques : Planche N°8
I- Préparation d’un antigène
Cf Travaux pratiques : Planche N°9
II- Les anticorps comme réactifs

A- Les anticorps monoclonaux et polyclonaux
Anticorps polyclonaux : mélange d’anticorps produits par différents clones de plasmocytes

étant des lymphocytes B différenciés.
Anticorps monoclonaux : Des anticorps produits par un même clone de plasmocytes et qui ont
les mêmes caractéristiques physico-chimiques et biologiques.
27
ESTBA/UL Dr KATAWA
Fig 14 : Schéma récapitulatif de la production des anticorps monoclonaux
B- Conservation des anticorps
L'exposition à des pH extrêmes et à des solutions de force ionique forte ou faible durant les
étapes de purification tend à réduire leurs capacités d'interaction avec l'antigène et à favoriser
leur agrégation et leur précipitation au cours du temps.
Pour un archivage de longue durée, les solutions d'anticorps peuvent être congelées à −80 °C,
préférentiellement en présence de 10 à 25 % de glycérol, sous forme d'aliquotes afin d'éviter de
répéter des cycles de congélation– décongélation. Après décongélation, l'activité des anticorps
doit être contrôlée de nouveau. Les solutions diluées doivent être conservées dans des récipients
présentant de faibles capacités d'adsorption des protéines.
C- Intérêt des anticorps polyclonaux et monoclonaux
Les anticorps polyclonaux sont constitués d'un mélange de plusieurs espèces d'anticorps
différents dirigés contre plusieurs épitopes d'un même antigène. Une même molécule d'antigène
peut fixer en même temps plusieurs anticorps différents, chacun sur son épitope respectif. Cette
28
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propriété confère aux anticorps polyclonaux une avidité beaucoup plus forte vis-à-vis de leur
antigène et une meilleure capacité de détection des protéines d'intérêt
Tableau 6 : Intérêts respectifs des anticorps polyclonaux et monoclonaux
29
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Chapitre III : Méthodes Automatisées Du Diagnostic Immunologique Des

Maladies Infectieuses
I – Méthodes immuno-enzymatiques
A- Principe
B- Exemples d’équipements
❖ VIDAS
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❖ VITROS
II – CHIMILUMINESCENCE
A- Principe
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❖ MAGLUMI
❖ VIRCLIA
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❖ ARCHITECT
III – IMMUNOFLUORESCENCE
A- Principe
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❖ THERALIS
❖ HELIOS IFA
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IV – IMMUNOTURBIDIMETRIE
A- Principe
B- Exemple d’équipement
❖ ABX MICROS CRP
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V – Applications dans le diagnostic de certaines maladies

❖ MALADIES PARASITAIRES
MALADIE Analyses AUTOMATE
LEISHMANIOSE Leishmania IgM / IgG VIRCLIA
CHAGAS Chagas IgM / IgG VIRCLIA
TOXOPLASMOSE Toxo IgM / IgG VIDAS
❖ MALADIES BACTERIENNES
CHLAMYDIOSE Chlamydia IgA / IgG VIRCLIA
BRUCELLOSE Brucella Ig M / IgG VIRCLIA
SYPHILIS Syphilis IgM / IgG VIDAS
❖ MALADIES VIRALES
Hépatite B Ag HBs / Ac anti-HBc VITROS 3600
VIH Ag P24 /Ac anti VIH1-2 ARCHITEC
RUBEOLE IgG anti Rubéole VIDAS
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Chapitre IV : Performances des tests immuno-sérologiques

I - Les facteurs qui affectent la performance d’un test sérologique
La performance d’un test peut être influencée par deux grands facteurs qui sont :
• Les facteurs intrinsèques à savoir la sensibilité et la spécificité,
• Les facteurs extrinsèques à savoir les valeurs prédictives positives et négatives.
A- Les facteurs intrinsèques

1- La sensibilité
La sensibilité d’un test est sa capacité à identifier correctement les patients présentant la maladie
Formule de calcul : Sensibilité (Se) = VP / (VP + FN) *100
Avec VP=Vrais positifs, FN=Faux négatifs
Exercice d’application : Calculer la sensibilité du test sérologique A qui permet de

diagnostiquer la Brucellose. Le test a été réalisé sur 58 patients connus.
Test A Effectif Effectif Total Sensibilité
Positif 54 58
Négatif 4
1- La spécificité
La spécificité d’un test est sa capacité à identifier correctement un sujet non infecté
Formule de calcul Specificité (Sp) = VN / (VN + FP) *100 :
Avec VN = Vrais négatifs, FP = Faux positifs
37
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Exercice d’application : Calculer la spécificité du test sérologique B de

dosage des IgG totaux pour la toxoplasmose congénitale chez 125 personnes
non infectés
Test A Effectif Effectif Total Spécificité
Positif 11 125
Négatif 114
2- Variation de la sensibilité et de la spécificité en fonction du seuil de

positivité
B - Les facteurs extrinsèques

1- Les valeurs prédictives positives
La valeur prédictive positive est la probabilité d’être malade dans un contexte de test positif
VPP = VP/(VP+FP)
2- Les valeurs prédictives négatives

La valeur prédictive négative est la probabilité d’être en bonne santé dans un contexte de test
négatif
VPN = VN/(VN+FN)
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NB : Pour évaluer les proportions des FP et des FN, la sensibilité et la spécificité seules ne
suffisent pas, on aura besoin de prendre en compte la prévalence de la maladie dans la
population dans laquelle le test est utilisé
II – Les critères de validation des tests sérologiques

A- Tests qualitatifs
Les critères de validation d’un test qualitatif sont

✓ La valeur du Cut-off pour les tests ELISA
✓ Les contrôles positifs et négatifs
✓ La densité optique du blanc
B- Tests quantitatifs
Les critères de validation d’un test quantitatif sont :

✓ La courbe du standard
✓ La plage rapportée du test pour ce type d'échantillon
✓ Le format ELISA
❖ ELISA sandwich - régression linéaire
❖ ELISA compétitifs - logistique à 4 paramètres
39
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✓ Le conjugué enzyme
✓ La plage dans laquelle votre lecteur fournit des lectures précises
Fig 15 : Courbe standard pour un dosage ELISA sandwich typique

montrant une relation linéaire entre le signal et la concentration en Ac par
exemple
y = mx + b y = signal, x = concentration, m = pente, b = ordonnée à l'origine
40
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TRAVAUX PRATIQUES
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PLANCHE N°1 : Courbe de précipitation
But de la manipulation : Mise en évidence de l’influence du rapport antigène–anticorps sur la

liaison Ag-Ac.
Principe
Lorsque des quantités suffisantes d’anticorps sont mélangées avec un antigène soluble on peut
observer une réaction de précipitation. La quantité de précipité dépend non seulement de la
quantité d’anticorps et d’antigène mais aussi du rapport entre les deux protagonistes. En effet,
si des quantités croissantes d’antigène sont ajoutées à une quantité connue de sérum contenant
l’anticorps à doser, on observe dans un premier temps une corrélation directe entre la quantité
d’antigène apportée et la quantité de précipité. La courbe de précipitation atteint alors un
maximum et si la quantité d’antigène augmente encore, on note que la quantité de précipité tend
cette fois à diminuer.
Matériels
- Disposer de 07 tubes à hémolyse ;
- Disposer des micropipettes et embouts adaptés ;
- Disposer d’un plasma O et d’une suspension d’hématies AB à 4% ;
- Disposer des lames porte-objet et des lamelles couvre-objet.
Mode opératoire
- Identifier les tubes (T1 à T7) et distribuer 100ul du plasma O dans chaque tube ;
- Ajouter respectivement dans les tubes 0ul, 25ul, 50ul, 75ul, 100ul, 200ul, 300ul et 500ul
de la suspension des hématies AB à 4% ; et homogénéiser les préparations pendant
05min ;
- Monter les préparations entre lame et lamelles pour une observation microscopique,
- En fonction des différentes concentrations de la suspension globulaire, tracer la courbe
de précipitation.
Résultats et interprétation
42
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PLANCHE N°2 : Test d’immunochromatographie (ICT) _ Bandelette

réactive de test de grossesse
But de la manipulation : Rechercher la Gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans les
urines
Principe
Il s’agit d’un test rapide basé sur l’immunochromatographique et destiné à la recherche

qualitative de la Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG) dans l’urine afin de faciliter la
détection précoce de la grossesse. Le test utilise la combinaison d’anticorps comprenant un
anticorps monoclonal anti-hCG. Le test est effectué en immergeant la bandelette réactive dans
un échantillon d’urine et en observant la formation de lignes stimulées. Le spécimen migre par
capillarité le long de la membrane pour réagir avec le conjugué coloré. Les échantillons positifs
réagissent avec le conjugué coloré spécifique anti-hCG coloré pour former une ligne colorée au
niveau de la ligne de test sur la membrane. L’absence de cette ligne colorée suggère un résultat
négatif. Pour servir de contrôle de procédure, une ligne colorée apparaitra toujours dans la
région de la ligne de contrôle si le test a été effectué correctement.
Matériels
- Bandelettes ce test
- Pot ou récipient de collecte d’urine
- Minuterie
Mode opératoire
- Laissez la bandelette réactive, l’échantillon d’urine et/ou les contrôles s’équilibrer à la

température ambiante (15-30°C) ;
- Retirez la bandelette réactive de la pochette scellée ;
- Les flèches pointant vers l’échantillon d’urine, immergez-la verticalement pendant au
moins 5 secondes ;
- Ne passez pas la ligne maximale de la bandelette réactive lors de son immersion ;
- Placez la bandelette-test sur une surface plane non absorbant, démarrez le chronomètre
et attendez que la ou les lignes rouges apparaissent ;
- Le résultat doit être lu à 3 minutes. Il est important que le fond soit clair avant la lecture
du résultat.
43
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- Une faible concentration de hCG peut entrainer l’apparition d’une ligne faible dans la
région de test (T) après une longue période ;
- Par conséquent, n’interprétez pas le résultat après 10 minutes.
- Positif : Deux lignes rouges apparaissent sur la membrane (une dans la région contrôle
C et une dans la région test T) ;
- Négatif : Une ligne rouge apparait dans la région contrôle C. Aucune ligne dans la
région test T ;
- Invalide : Pas de ligne dans la région contrôle C.
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PLANCHE N°3 : Test immunochromatographique (ICT) _ Determine HIV

(Alere) et TRI - DOT HIV
But de la manipulation : Rechercher les anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2
A- Determine HIV (Alere)

Principe
Il s’agit d’un test immunochromatographique pour la détection qualitative des anticorps anti-
VIH-1 et anti-VIH-2.
L’échantillon est déposé sur la zone de dépôt de l’échantillon. Comme l’échantillon migre
jusqu’à la zone de dépôt du conjugué, il se reconstitue et se mélange avec le conjugué colloïde
de sélénium-antigène. Ce mélange continue à migrer sur la phase solide jusqu’aux antigènes
recombinants immobilisés et aux peptides synthétiques au niveau de la fenêtre-patient.
Si les anticorps anti-VIH-1 et/ou anti-VIH-2 sont présents dans l’échantillon, ils se lient à
l’antigène du conjugué antigène colloïde de sélénium et à l’antigène de la fenêtre-patient en
formant une ligne rouge au niveau de la fenêtre-patient. Si les anticorps anti-VIH-1 et/ou anti-
VIH-2 sont absents, le conjugué antigène-colloïde de sélénium traverse la fenêtre patient sans
former de ligne rouge.
Une barre de contrôle de la procédure est incluse dans ce système de test afin d’assurer la
validité du test.
Matériels
- Kit Determine HIV-1/2
- Lancettes
Mode opératoire
- Enlever la protection plastique de chaque test
- Pour les échantillons de sérum ou de plasma :
a. Distribuer 50 μl d’échantillon (à l’aide d’une pipette de précision) sur la zone de dépôt de
l’échantillon (symbole : flèche).
b. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat
- Pour les échantillons de sang total (ponction veineuse)
a. Distribuer 50 μl d’échantillon (à l’aide d’une pipette de précision) sur la zone de dépôt de
l’échantillon (symbole : flèche).
b. Attendre une minute, puis distribuer une goutte de tampon de fixation sur la zone de dépôt
de l’échantillon.
c. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat.
- Pour les échantillons de sang total (bout du doigt) :
a. Distribuer 50 μl d’échantillon (avec un tube capillaire contenant de l’EDTA) sur la zone de
dépôt de l’échantillon (Symbole : flèche).
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b. Attendre que le sang soit absorbé par la zone de dépôt, puis distribuer une goutte de tampon
de fixation sur la zone de dépôt de l’échantillon.
c. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat
- POSITIF (deux barres)
Les barres rouges apparaissent dans la fenêtre-contrôle (annotée “Contrôle”) et la fenêtre-
patient (annotée “Patient”) sur la bandelette. Toute couleur rouge visible dans la fenêtre-
patient doit être interprétée comme un résultat positif.
Barre-contrôle
Barre-patient
Positif
- NEGATIF (une barre)
Une barre rouge apparaît dans la fenêtre-contrôle (annotée “Contrôle”), la barre rouge de la
fenêtre-patient (annotée “Patient”) n’apparaissant pas sur la bandelette.
Barre-contrôle
Barre-patient
- NON VALIDE (pas de barre) Négatif

Si la barre rouge n’apparaît pas dans la fenêtre-contrôle de la bandelette et même si une barre
rouge apparaît dans la fenêtre-patient de la bandelette, le résultat n’est pas valide et le test doit
être recommencé.
Barre-contrôle
Barre-patient
Non valide
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B- TRI – DOT HIV
Principe
Les antigènes du VIH sont immobilisés sur une membrane poreuse d'immunofiltration.
L'échantillon et les réactifs passent à travers la membrane et sont absorbés dans l'absorbant
sous-jacent. Lorsque l'échantillon du patient passe à travers la membrane, les anticorps anti-
VIH, s'ils sont présents, se lient aux antigènes immobilisés. Le conjugué se lie à la partie Fc des
anticorps VIH pour donner un (des) DOT(s) distinct(s) de couleur rose-violet sur fond blanc.
Matériels
Kit TRI-DOT HIV contenant : le dispositif, la solution tampon et le conjugué
Mode opératoire
- Ajouter 3 gouttes de solution tampon au centre du dispositif,

- Tenez le compte-gouttes verticalement et ajoutez 1 goutte d'échantillon de patient 50µl
(sérum ou plasma),
- Ajouter 5 gouttes de solution tampon,
- Ajouter 2 gouttes de conjugué de protéine A directement du flacon de conjugué,
- Ajouter 5 gouttes de solution tampon et lire immédiatement les résultats. Jeter la casette
en considérant qu'il est potentiellement infectieux.
IMPORTANT : IL EST IMPORTANT DE LAISSER CHAQUE SOLUTION S'IMPRÉGNER
DANS LE DISPOSITIF DE TEST AVANT D'AJOUTER LA SOLUTION SUIVANTE.
47
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Résultats Interprétation
Patient séronégatif au VIH1 et 2
Patient séropositif au VIH1
Patient séropositif au VIH2
Patient séropositif au VIH1 et 2
Test non valide
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PLANCHE N°4 : Test immunochromatographique (ICT) _ SARS-CoV-2 Ag

(BIOSYNEX COVID-19 Ag BSS)
But de la manipulation : Rechercher l’antigène nucleocapsidique spécifique du SARS-CoV-

2
Principe
Le test BIOSYNEX COVID-19 Ag BSS est un test immunochromatographique sur membrane

qui utilise des anticorps monoclonaux très sensibles pour détecter la protéine de nucléocapside
du SRAS-CoV-2 dans un écouvillon nasopharyngé (NP). La bandelette de test est composée
des éléments suivants : un tampon pour l'échantillon, un tampon pour les réactifs, une
membrane de réaction, le tampon de réactif, la membrane de réaction et le tampon absorbant.
Le tampon réactif contient de l'or colloïdal conjugué à des anticorps monoclonaux contre la
protéine nucléocapsidique du SRAS-CoV-2 ; la membrane de réaction contient les anticorps
secondaires pour la nucléocapside du SRAS-CoV-2. L'ensemble de la bande est fixé à l'intérieur
d'un dispositif en plastique. Lorsque l'échantillon est déposé, les conjugués séchés dans le
tampon réactif sont dissous et migrent avec l'échantillon. Si l'antigène du SRAS-CoV-2 est
présent dans l'échantillon, un complexe se forme entre le conjugué anti-SARS-CoV-2 et le virus
sera capturé par les anticorps monoclonaux spécifiques anti-SARS-CoV-2 appliqués sur la
région de la ligne de test (T). L'absence de la ligne T indique un résultat négatif. Pour servir de
contrôle procédural, une ligne rouge apparaît toujours dans la ligne de contrôle.
Matériels
- Le test BIOSYNEX COVID-19 Ag BSS,
- L’échantillon: écouvillon nasopharyngé
Mode opératoire
Laisser le dispositif d'essai, l'échantillon d'essai et le tampon s'équilibrer à la température

ambiante (15-30°C) avant l'essai.
- Retirer le dispositif de test de la pochette scellée juste avant le test et le poser à plat sur
le banc de travail,
- Prendre le tube contenant l'échantillon, et ajouter 4 gouttes (environ 100 µL)
d'échantillon dans la fenêtre d'échantillon,
- Attendez que la ou les bandes colorées apparaissent. Le résultat doit être lu après 15
minutes. N'interprétez pas le résultat après 20 minutes.
49
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Le résultat indique un test positif
Le résultat indique un test négatif
Le résultat indique un test invalide
NB : Test validé par l’Union Européenne
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PLANCHE N°5 : Test immunochromatographique (ICT) _ SARS-CoV-2

IgG/IgM
But de la manipulation : Rechercher les anticorps anti-IgM et/ou anti-IgG SARS-CoV-2
Principe
La cassette de test rapide COVID-19 IgG/IgM (sang total/sérum/plasma) est un test

immunochromatographique à flux latéral. Le test utilise un anticorps IgM anti-humain (ligne
de test IgM), des IgG anti-humains (ligne de test IgG) et des IgG de lapin (ligne de contrôle C)
immobilisés sur une bande de nitrocellulose. Le tampon conjugué de couleur bordeaux contient
de l'or colloïdal conjugué à des antigènes recombinants SARS-CoV-2 Spike S1. Lorsqu'un
spécimen suivi d'un tampon de test est ajouté au puits d'échantillon, les anticorps IgM et/ou
IgG, s'ils sont présents, se lieront à l’antigène SARS-CoV-2 Spike S1 pour former un complexe
Ag-Ac. Ce complexe migre à travers la membrane de nitrocellulose par action capillaire.
Lorsque le complexe rencontre la ligne de l'anticorps immobilisé correspondant (anti-humain
IgM et/ou anti-IgG humain), le complexe est piégé et forme une bande de couleur bordeaux qui
confirme un résultat de test positif.
Matériels
Le kit de réactif contenant les cassettes de test, des compte-gouttes et une solution tampon conjugué.
Mode opératoire
- Laissez la cassette de test, l'échantillon, le tampon et/ou les contrôles s'équilibrer à la

température ambiante (15-30°C) avant le test,
- Retirer la cassette de test de la pochette en aluminium scellée et l'utiliser dès que
possible. Les résultats doivent être obtenus dans l'heure qui suit,
- Placez le dispositif de test sur une surface propre et plane,
➢ Pour les échantillons de sérum ou de plasma :
À l'aide d'un mini compte-gouttes en plastique de 5 μL fourni, prélevez un échantillon de
sérum/plasma afin de dépasser la ligne d'échantillonnage comme indiqué dans l'image suivante,
puis transférez l'image suivante, puis transférez l'échantillon de sérum/plasma aspiré dans le
puits d'échantillon (S). Ajoutez ensuite 2 gouttes (environ 80 μL) de tampon d'échantillon dans
le puits de tampon (B) immédiatement. Évitez les bulles d'air.
Remarque : Entraînez-vous quelques fois avant le test si vous n'êtes pas familier avec la mini
compte-gouttes. Pour une meilleure précision, transférez l'échantillon avec une pipette capable
de délivrer un volume de 5 μL,
➢ Pour un échantillon de sang total veineux :

Tenez le mini compte-gouttes en plastique de 5 μL verticalement et transférez 1 goutte de sang
total. (environ 10 μL) dans le puits d'échantillon (S) du dispositif de test, puis ajoutez 2 gouttes
51
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(environ 80 μL) de tampon d'échantillon dans le puits de tampon (B) immédiatement. Évitez
les bulles d'air.
- Attendez que les lignes colorées apparaissent. Après 2 minutes, si la couleur rouge ne
n'a pas traversé la fenêtre de test ou si du sang est encore présent dans le puits de
l'échantillon (S), ajoutez 1 goutte supplémentaire de tampon d'échantillon dans le puits
de tampon (B),
- Le résultat doit être lu en 10 minutes. Les résultats positifs peuvent être visibles dès que
2 minutes. Ne pas interpréter le résultat après 15 minutes.
Virage de la ligne bleue (C) au rouge. Pas de Le résultat indique un test négatif
ligne dans les régions de test M ou G
Virage de la ligne bleue (C) au rouge, ligne Le résultat du test indique la présence d'anticorps
rouge dans la région de test M IgM anti-SARS-Cov-2.
Virage de la ligne bleue (C) au rouge, ligne Le résultat du test indique la présence d'anticorps
rouge dans la région de test G IgG anti-SARS-CoV-2.
Virage de la ligne bleue (C) au rouge, lignes Présence d'anticorps IgM et IgG anti-SARS-CoV-
rouges dans les régions de test M et G 2.
La ligne de contrôle (C) est partiellement rouge,
et ne passe pas complètement du bleu au rouge. Test invalide
52
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5ul de plasma/sérum 1 goutte de sang total 2 gouttes du tampon conjugué
Bleu Bleu Bleu
(+) (+) (+) (-)

C C C C
G
Bleu G
M
G
M
G Test valide
M M
IgM IgG IgG et IgM Négatif

C C C C
G G G G Test non valide
M M M M
Résumé du mode opératoire et des résultats
NB : Test validé par l’Union Européenne
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PLANCHE N°6 : Test d’agglutination active
But de la manipulation : Mettre en évidence des antigènes du système ABO et de l’antigène

D
Principe
Ce test est basé sur le principe d'agglutination. Les érythrocytes humains normaux possédant
l'antigène correspondant s'agglutinent en présence de l'anticorps spécifique dirigé contre
l'antigène.
Matériels
Les réactifs listés contiennent les clones suivants :

- Anti-A monoclonal ;
- Anti-B monoclonal ;
- Anti-AB monoclonal ;
- Anti-D monoclonal (Rhésus) ;
- Lame de verre ;
- Pipette Pasteur ;
- Baguette de mélange ;
- Tubes à hémolyse ;
- Micropipettes ;
- Centrifugeuse ;
- Solution saline isotonique (eau physiologique).
Mode opératoire
• Méthode sur lame
- Utiliser uniquement le sédiment érythrocytaire ou le sang total ;
- Sur une lame de verre déposer 1 goutte de réactif approprié ;
- A l'aide d'une pipette Pasteur ajouter une goutte (environ 50 μl) de sédiment
érythrocytaire ou de sang total (environ 50 μl) a lame ;
- Mélanger bien les hématies avec le réactif à l'aide d'une baguette et étaler la préparation
sur un cercle de 2 cm de diamètre ;
- En faisant pivoter légèrement la lame, contrôler l'apparition d'une agglutination dans un

délai de 1 minute (la réaction démarre en quelques secondes). Noter le résultat. Des
réactions non spécifiques peuvent se produire en raison du séchage durant la réaction
ou si la lame est chauffée.
54
ESTBA/UL Dr KATAWA
• Méthode de centrifugation en tube

- Utiliser uniquement une solution à 2 à 5 % d'érythrocytes dans une solution saline
isotonique (hématies lavées une fois ou jusqu'à trois fois avec la solution saline
isotonique) ;
- Ajouter 100 μl (solution alternative : une goutte = environ 50 μl) de réactif approprie à
chaque tube ;
- Ajouter 100 μl (solution alternative : une goutte = environ 50 μl) de la suspension
d'érythrocytes appropriée à chaque tube ;
- Mélanger bien en secouant légèrement ;
- Mettre le tube à incuber à température ambiante (15 à 30°C) pendant 1 - 15 minutes ;
- Centrifuger le tube pendant 1 minute à 1 000 tours/min (environ 180 a 270g) ;
- Remettre les érythrocytes doucement en suspension et contrôler a l'œil nu l'apparition
d'une agglutination dans un délai de 3 minutes. Noter le résultat.
En faisant pivoter/en secouant légèrement dans la méthode sur Lame et la méthode en
Tube :
- Résultats positifs (+) : une agglutination visible des érythrocytes est un résultat positif,
qui indique la présence de l'antigène correspondant.
- Résultats négatifs (-) : l'absence d'agglutination visible des érythrocytes est un résultat
négatif, qui indique l'absence de l'antigène correspondant.
La lecture et l'interprétation des cartes gel doivent être effectuées selon les instructions figurant
dans la notice de la carte employée.
55
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PLANCHE N°7 : Test d’agglutination passive
But de la manipulation : Mettre en évidence et quantifier la Protéine C Réactive
Principe
Le réactif CRP est une suspension de particules de latex polystyrène recouvertes d’IgG de
chèvre anti-CRP humain. Le réactif CRP s’agglutine quand il est mélangé avec les échantillons
contenant de la CRP. La sensibilité du Latex est ajustée pour détecter une concentration
minimale de 6mg/l de CRP.
Matériels
- Kit CRP-latex
- Rotatrice mécanique à vitesse réglable entre 80-100 tours/min
- Pipettes 50μl
- Agitateurs en plastique
- Mélangeur vortex
Mode opératoire
• Méthode qualitative
- Amener le latex, les contrôles et les échantillons à température ambiante
- Placer une goutte de contrôle positif sur le puits 1 de la lame. Placer une goutte de
contrôle négatif sur le puits 2 de la lame. A l’aide d’une pipette, pipeter 50μl de chaque
sérum non dilué sur les puits suivants
- Secouer vigoureusement le réactif au latex manuellement ou sur un mélangeur vortex
et placez une goutte sur chaque puits, à côté des échantillons. A l’aide d’un agitateur
homogénéisez le mélange rationnel dans chaque puits et l’étalant sur toute la surface du
puits. Changez d’agitateur pour chaque échantillon afin d’éliminer les contaminations
de puits à puits
- Mélanger par rotation de la lame (80-100 tours/min) pendant 2 minutes et lire
immédiatement sous une lumière directe. Des résultats faussement positifs peuvent
apparaitre si le test est lu après 2 minutes.
• Méthode semi-quantitative
- Amener le latex, les contrôles et les échantillons à température ambiante
- Réaliser des dilutions sériées doubles des échantillons dans une solution saline à 9g/l
- Procéder pour chaque dilution comme dans la méthode qualitative
56
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Dilution 1/2 1/4 1/8 …

Sérum d’échantillon 100μl
Solution saline 100μl 100μl 100μl …
100μl
100μl …
Volume d’échantillon 50μl 50μl 50μl
Une réaction négative est indiquée par une suspension laiteuse uniforme, ne présentant aucune
agglutination, comme observée avec le contrôle négatif. La présence d’une agglutination
visible, différente de celui du contrôle négatif est synonyme de réaction positive.
La présence d’une agglutination indique une concentration en CRP égale ou supérieure à
6mg/ml.
Le titre dans la méthode semi-quantitative se définit comme l’inverse de la dilution la plus
élevée présentant un résultat positif.
La concentration est l’inverse de la dilution *6 :
6*1/dilution 6*2 6*4 6*8 …

mg/l 12 24 48 …
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ESTBA/UL Dr KATAWA
PLANCHE N°8 : Dosage des cytokines par méthode ELISA Sandwich

But de la manipulation : Détecter et quantifier une cytokine d’intérêt
Principe
Le principe de l’ELISA sandwich consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un
« anticorps de détection », les antigènes d’intérêt. Ces deux anticorps sont généralement
spécifiques de l’antigène d’intérêt. L’anticorps dans la plupart des cas est biotinylé. Cette
caractéristique lui permet de se fixer à un complexe enzymatique (une peroxydase telle que
l’Avidine-HRP). La détermination des concentrations en antigène se fait en ajoutant un
chromogène à ces complexes, par la lecture de densités optiques.
Matériels
- Kit ELISA
- Chaine ELISA
Mode opératoire
➢ Sensibilisation de la plaque ELISA
1- Préparer le « Tampon sensibilisation 1X » en diluant le « Tampon de sensibilisation
10X » au 1/10ème avec de l’eau distillée ;
2- Préparer la solution de sensibilisation en diluant l’ « Anticorps de capture ou anticorps
primaire 250X» avec le «Tampon sensibilisation 1X » au 1/250ème ;
3- Distribuer dans chaque puits de la plaque, 50μl de la solution de sensibilisation. Couvrir
la plaque avec un papier aluminium et l’incuber pendant toute une nuit à 4°C ;
➢ Saturation de la plaque ELISA
4- Préparer la solution de saturation « Diluant ELISA 1X » en diluant « Diluant ELISA 5X »
au 1/5ème avec de l’eau distillée ;
5- Jeter le contenu des puits de la plaque et la laver 5 fois. Sécher la plaque en la tapotant
sur un papier absorbant ;
6- Distribuer dans chaque puits 100μl de « Diluant ELISA 1X» et incuber pendant 1 heure
à la température ambiante ;
➢ Dépôt des échantillons

7- Jeter le contenu des puits, laver la plaque 5 fois et la sécher ;
8- Distribuer dans les puits A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1, F2, G1 et G2
50μl de « Diluant ELISA 1X» et dans les puits correspondant aux échantillons, 25μl de
« Diluant ELISA 1X» ;
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ESTBA/UL Dr KATAWA
9- Distribuer dans les puits H1 et H2, 100μl du standard correspondant à la cytokine à

doser. A partir de ces puits, faire une dilution en cascade de raison 2 avec 50μl standard
dans les puits G1, G2, F1, F2, E1, E2, D1, D2, C1, C2, B1 et B2. Garder les 50μl de
« Diluant ELISA 1X » dans les puits A1 et A2 sans rien ajouté (Ces deux puits sont
pour le blanc) ;
10- Distribuer dans les puits correspondant aux échantillons, 25μl de chaque échantillon
correspondant (on obtient une dilution au ½ des échantillons) ;
11- Incuber la+ plaque pendant 2 heures à la température du laboratoire ou pendant toute
une nuit à 4°C ;
➢ Détection
12- Préparer l’anticorps de détection en diluant « Anticorps de détection ou anticorps
secondaire 250X » au 1/250ème avec le « Diluant ELISA 1X » ;
13- Jeter le contenu des puits, laver 5 fois la plaque et la sécher ;
14- Distribuer dans chaque puits 50μl de l’anticorps de détection puis incuber la plaque
pendant 1 heure à la température ambiante ;
➢ Ajout de l’enzyme
15- Préparer l’enzyme en diluant l’ « Avidin-HRP 250X » au 1/250ème avec le
« Diluant ELISA 1X » ;
16- Jeter le contenu des puits, laver 5 fois la plaque et la sécher ;
17- Distribuer dans chaque puits, 50μl de l’enzyme et incuber la plaque pendant 30 minutes
à la température ambiante ;
➢ Révélation/développement
18- Jeter le contenu des puits, laver 7 fois la plaque et la sécher
19- A l’abri de la lumière, distribuer dans chaque puits 50μl du « Substrat TMB 1X » et
incuber la plaque pendant 5 minutes à la température ambiante, toujours à l’abri de la
lumière.
➢ Lecture
20- Stopper la réaction en ajoutant à chaque puits, 25μl de l’acide sulfurique H2SO4 2N
puis lire la plaque au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 450nm
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PLANCHE N°9 : Préparation d’un antigène
But de la manipulation : Extraire les antigènes à partir d’un pathogène
Matériel
- Disposer du ver Onchocerca volvulus ;
- Disposer d’un mortier et d’un pilon de laboratoire ;
- Disposer des tubes à hémolyse avec bouchon ;
- Disposer de l’eau physiologique ;
- Disposer d’une centrifugeuse ;
- Micropipette et embouts.
Procédure
- Laver bien le mortier et le pilon ;
- Pipeter 1ml d’eau physiologique dans le mortier et ajouter le ver dans le mortier ;
- A l’aide du pilon, écraser le ver de manière à avoir une préparation homogène ;
- Ajouter 1ml d’eau physiologique au mélange et renverser tout dans un tube à
hémolyse ;
- Centrifuger le tube à 1300 trs/min pendant 08 min ;
- Récupérer le surnageant et procéder à un dosage des protéines par la méthode du
Bradford (pour une analyse quantitative des antigènes préparés).
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PLANCHE N°10 : Programmation d’un lecteur de plaque ELISA
❖ Test quantitatif
- Entrer le nom abrégé du paramètre à programmer ;

- Entrer le nom complet du paramètre ;
- Entrer la référence du Kit utilisé pour la programmation ;
- Choisir les longueurs d’onde d’analyse ;
- Choisir le mode de calibration en fonction du type de test à effectuer
• Test quantitatif : Ecran 1a ;
• Test qualitatif : Ecran 1b ;
- Entrer la valeur de la densité optique du Blanc et choisir le nombre de réplication ;
Ecran 1a Ecran 1b
- En fonction du test à faire :

• Quantitatif : Choisir le nombre de standard, leur concentration et l’unité (Ecran
2a) ;
• Qualitatif : entrer la formule du Cut-off à l’aide du clavier, de la liste des
contrôles et des signes mis à disposition (Ecran 2b) ;
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ESTBA/UL Dr KATAWA
Ecran 2a Ecran 2a
- Ecrire les valeurs limites de référence pour l’appréciation qualitative (positif ou

négatif) des résultats (Ecran 3) ;
- Cliquer sur « Finished » pour enregistrer la programmation (Ecran 3).
Ecran 3
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TP Sérologie Médicale 2023-2024UR2IM - 231212 - 133111

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UE : Travaux Pratiques de Sérologie

Chargés du TP : Dr Gnatoulma KATAWA,

Année académique : 2023 - 2024

Table des matières

Chapitre I : Les techniques immunologiques

On parle d’Immunoprécipitation lorsqu’en milieu liquide, on note l’apparition progressive d’un

Fig 1 : Courbe de précipitation de Heidelberger.

La turbidimétrie évalue ainsi la diminution de la lumière transmise dans une solution

Fig 2: Principes de la turbidimétrie et de la néphélémétrie

• En recherche : l'immunoprécipitation en milieu liquide est couramment utilisée pour l'étude

Travaux pratiques : Planche N°1

Elle permet d'analyser les identités entre les différents constituants.

Fig 3 : Technique d'Ouchterlony, immunodiffusion double.

L'immunodiffusion radiale selon Mancini est une immunodiffusion simple bidimensionnelle

Fig 4 : Technique de Mancini, immunodiffusion radiale

Fig 5A : Immunochromatographie sur membrane.selon un principe sandwich.

Fig 5B : Immunochromatographie sur membrane par compétition

Exemple : Recherche de streptocoques A par immunochromatographie

Etape 1 : Présentation de la bandelette comportant la membrane de migration

Etape 2 : Liaison entre le polyoside C et l’anticorps anti-streptocoque A

IV- Réaction d’agglutination

Agglutination résultant d’une union spécifique entre un anticorps et un antigène particulaire

Agglutination réalisée entre un anticorps et un antigène normalement soluble, mais rendu

Agglutination réalisée entre un anticorps agglutinant et un antigène généralement

4. Agglutination INDIRECTE ou ARTIFICIELLE

Agglutination réalisée entre un anticorps non agglutinant et un antigène (généralement

Exemple d’agglutination directe et indirecte : Test de Coombs

Travaux pratiques : Planche N°6, Planche N°7

B- Techniques immunologiques avec traceurs

Fig 7 : Représentation schématique du système d'amplification du complexe avidine–biotine

Tableau 1 : Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique développée en

Tableau 1 Suite : Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique

II- Dosage Immuno-enzymatique (ELISA)

Tableau 2 : Différents types d'ELISA utilisables selon l'analyte recherché : antigène ou

Fig 8 : Représentation schématique des différents types d'ELISA ou de FLISA.

Fig 9 : Différentes étapes d'un ELISA de type sandwich.

III- Immuno-fluorescence (FLISA)

Immuno Fluorescence indirecte Immuno Fluorescence directe

Fig 10 : Immunofluorescence directe et indirecte.

Exemple d’application : Recherche de Treponema pallidum dans un sérum

1 -Fixation du 2 -Ac anti – 3 -Anticorps

Travaux pratiques : Planche N°8

➢ Immunodosage par les billes

Fig 11 : Principe du multiplexage sur billes.

Fig 12 : Système complet du Luminex

Fig 13 : Principe complet du Luminex

IV- Dosage radio-immunologique (RIA)

Chapitre II : Réaction Antigène et anticorps dans les immunodosages

I- Les antigènes comme réactifs

B- Nature chimique, origine et localisation des antigènes

Selon leur origine, on distingue :

C- Thermodynamique de la réaction Ag-Ac

Les immunoglobulines portent au minimum deux paratopes semblables, capables de

D- Qualité de l’antigène et interaction Ag-Ac

• Agonistes partiels, au sein desquels le remplacement d'acides aminés affecte la

• Super-agonistes, si le remplacement d'acides aminés conduit à une réponse amplifiée

• Antagonistes, lorsque le remplacement d'acides aminés affecte la reconnaissance et conduit

E- Impact des propriétés des antigènes en immuno-dosage

Tableau 3 : Impacts des propriétés de l'antigène dans les réponses immunitaires et en

F- Propriétés des antigènes et choix des méthodes immunologiques

G- Conditions réactionnelles de la mise en œuvre d’un immunodosage

H- Fixation d’un antigène à un support

Cf Travaux pratiques : Planche N°8