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Université de Montréal

Expression de cytokines par les neutrophiles équins stimulés in vitro

Par
Philippe Joubert

Département de Sciences cliniques

Faculté de médecine vétérinaire

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures

En vue de l'obtention du grade de Maître es sciences (M.Sc.)
en sciences cliniques vétérinaires

Août 2001

©Philippe Joubert, 2001

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:~) Université de Montréal

Faculté des études supérieures

Ce mémoire intitulé :

Expression de cytokines par les neutrophiles équins stimulés m vitro

Présenté par :
Philippe Joubert

a été évalué par un jury composé des personnes suivantes :

Jean-Martin Lapointe : président-rapporteur

Jean-Pierre Lavoie : directeur de recherche

Amer Silim : co-directeur de recherche

John Fairbrother : membre du jury

 Ill

SOMMAIRE

Les neutrophiles sont les premières cellules inflammatoires recrutées lors de

l'activation du système immunitaire en réponse à un antigène étranger.
Traditionnellement considérées comme des cellules terminales dépourvues d'activité
transcriptionnelle et de synthèse protéique, leur rôle se limitait à celui de cellules
effectrices, principalement par la phagocytose et la relâche de médiateurs toxiques.
Récemment, plusieurs études sur les neutrophiles humains ont remis en question la
conception de cette population cellulaire en démontrant leur capacité à synthétiser
des protéines dont des cytokines. Le but de cette étude consistait à démontrer la
capacité des neutrophiles équins à produire de l'ARNm pour certaines cytokines.
Pour ce faire, les neutrophiles ont été purifiés à partir du sang périphérique équin
avec la méthode d'isolement cellulaire par sélection avec anticorps magnétiques
(MACS) et stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS) et du N-formyle-L-
méthionyle-L-leucycle-L-phénylalanine (fMLP). Des transcriptions inversées (RT)
et des réactions en chaînes de polymérase (PCR) ont été réalisées sur l'acide
ribonucléique (ARN) total isolé avant stimulation et après 5 et 20 heures de
stimulation. L'expression d'ARNm pour le facteur nécrosant des tumeurs-alpha
(TNF-a), les interleukines (IL) l-beta, 6 et 8 de même que pour les protéines
inflammatoires des macrophages-deux (MIP-2) a été démontrée alors qu'il a été
impossible de mettre en évidence la présence d'ARNm pour l'IL-4, l'IL-5 et
l'interféron-gamma (IFN-y). Ces résultats démontrent la capacité de synthèse de
cytokines par les neutrophiles équins et ouvrent des nouvelles perspectives quant à
leur l'implication dans certaines pathologies équines.

Mots clés: Equin - neutrophile - cytokine - chemokine - ARNm - RT-PCR

J
 iv

TABLE DES MATIÈRES

(
l

LISTE DES TABLEAUX. , VI

LISTE DES FIGURES ..vu

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES .vm

REMERCIEMENTS x

INTRODUCTION l
REVUE DE LITTÉRATURE .2
I- LE SYSTÈME IMMUNITAIRE. .2

II- LES NEUTROPHILES .4

A- Introduction. .4

B- Morphologie. .5

C- Maturation et migration des neutrophiles...................................... 6

D- Mécanismes d'action des neutrophiles ........................................... 9
E- Les neutrophiïes et les cytokines................................................... 11
l - La production de cytokines par les neutrophiles ...................... 11
2-Facteur nécrosant des tumeurs-a............................................. 13

3-Interieukine-lp........................................................................ 14
4- Interleukine-6.......................................................................... 15

5- Interleukine-8.......................................................................... 15

6- Protéine inflammatoire des macrophages-2 ............................. 16

7- Interleukines-4 et 5.................................................................. 17

8-Interféron-Y............................................................................. 20
9- Production de cytokines par les neutrophiles d'individus affectés
par diverses pathologies .............................................................. 21
F- Isolation des neutrophiïes.............................................................. 23
l-La centrifugation..................................................................... 24
a- Formes et composition des gradients ................................ 25
b- Sucrose............................................................................. 25

J e- Fîcoll................................................................................ 26
 v

d- Milieux iodés .................................................................... 26

e- Percoll.............................................................................. 27

2- Selection magnétique des cellules ........................................... 27

3- Activation des neutrophiles par les méthodes d'isolement....... 28

Ill- LA RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE.

A- Introduction................................................................................... 29

B-La PCR
l- Instriiments et réactifs .............................................................33

2- Inhibiteurs de PCR.................................................................. 34

IV- LA TRANSCMPTION INVERSÉE ....................................................... 35

ARTICLE SOUMIS À L'EQUINE VETERINARY JOURNAL

Summary.
Introduction

Materials et methods

Neutrophil isolation.
In vitro cell stimulation

Reverse transcriptase polymerase chain reaction..

Sequencing ofRT-PCR products
Results

Discussion.

Acknowledgements
Manufacturer's adresses

References

DISCUSSION ET CONCLUSION

BIBLIOGRAPHIE.
J
 vi

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I ( page 5 )
Principaux constituants des granules primaires et secondaires des neutrophiles.

Tableau II ( page 12)

Principales cytokines dont la production a été démontrée chez les neutrophiles
humains.

J
 vit

LISTE DES FIGURES

n
Illustration 1 ( page 9 )
Schématisation de la migration des neutrophiles du compartiment sanguin vers les
tissus périphériques en réponse à un stress antigénique.

Illustration 2 ( page 32 )
Représentation de l'amplification d'un fragment d'ADN complémentaire lors de
deux cycles de réaction en chaînes de la polymérase.

Illustration 3 ( page 36 )
Représentation de la formation d'ADN complémentaire à partir d'ARN total.

Figure 1 ( page 47 )
Cytokine mRNA expression by equine blood neutrophils prior to (TO) and after 5
(T5) and 20 hours (T20) of in vitro stimulation with N-formyl-L-methionyl-L-
leucyl-L-phenylalanine (10 nM/ml) and lipopolysaccharide (100 ng/ml). Stimulated
peripheral blood leucocytes were used as a positive control (+) and cDNA-free
solution served as a negative control (-). PCR products were visualised by ethidium
bromide staining after 1.5% agarose gel electrophoresis.

J
 viii

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

n
ADN: Acide désoxyribonucléique
ADNc: Acide désoxyribonucléique complémentaire à l'ARN
AMV-RT : Enzyme de transcription inversée du virus de la
myéloblastose aviaire; avian myelobastose vims reverse
transcriptase
ARN: Acide ribonucléique
ARNm: Acide ribonucléique messager
CD: Clé de différenciation; cluster of differentiation
CR3: Récepteur 3 du complément; complement receptor 3
dNTP: desoxynucléoside triphosphates
FcYR2: Récepteiir Fc 2 des immunoglobulines de type G
G-CSF : Facteur stimulant des granulocytes; granulocytes colony
stimulating factor
GM-CSF : Facteur stimulant des granulocytes et des macrophages;
granulocytes-macrophages colony stimulating factor
GRO-a : Oncogène relié à la croissance; growth related hormone-a
IFN: Interféron

IL: Interleukine

IL-1RA : Antagoniste du récepteur à l'IL-1; IL-1 receptor antagonist

LPS: Lipopolysaccharide
LT: Leucotriène

M-CSF : Facteur stimulant des macrophages; macrophages colony

stimulating factor
MACS: Selection cellulaire avec anticorps magnétiques; magnetic
antibody cell selection
MHC: Complexe majeur d'histocompatibilité; major
histocompatibility complex

J
 ix

MIP Protéine inflammatoire des macrophages; macrophage

n inflammatory protein
MMLV-RT : Enzyme de transcription inversée du virus Moloney de la
leucémie murine; murine Moloney leukemia vims reverse
transcnptase
PAF: Facteur activateur des plaquettes; platelet activating factor
PCR: Reaction en chaîne de polymérase; polymerase chain
reaction
PMN: Polymorphonucléaire
PVP: Polyvinylpurrolidine
RT: Transcription inversée; reverse transcription
RT-PCR : Reaction en chaîne de polymérase précédée d'une
transcription inversée; polymerase chain reaction
following reverse transcription
Th: Lymphocyte T accessoire; lymphocyte T helper
TNF: Facteur nécrosant des tumeurs; tumor necrosis factor
TGF: Facteur transformant de croissance; transforming growth
factor

J
 x

REMERCIEMENTS
n
J'aimerais consacrer quelques lignes aux personnes qui, par leur aide, ont permis la
realisation de ce projet et des autres travaux effectués au cours des dernières années :

Mon directeur, le Dr Jean-Pierre Lavoie pour la supervision exemplaire de mes

projets de maîtrise. Sa grande disponibilité, sa rigueur intellectuelle, sa confiance et
ses grandes qualités humaines ont chaque jour contribuées à créer une ambiance de
travail agréable et stimulante.
Mon co-directeur, le Dr Amer Silim pour m'avoir initié à la recherche et m'avoir
voué une confiance sans bornes lors de mes premiers pas dans ce domaine en 1997.
Son sens critique et ses conseils judicieux ont été et sont toujours d'une aide
inestimable dans mon cheminement professionnel.
Ma famille : mes parents, mes frères et Sophie à qui je voue une grande admiration.
Ils sont les principaux artisans de ma réussite en médecine vétérinaire et ont su
m'insuffler la passion de la recherche et le désir d'apprendre. Leur support ne s'est
jamais démenti.
Mes ami(e)s : Vincent W. (alias le Belge), Vincent L., Marie-Eve C., David F. et
Mathieu B. Ce sont eux qui nous rappelle que dans la vie...il y autre chose que la
recherche!

Le Dr Silverside avec qui nous avons contribué pour ce projet. Son expertise et les
ressources qu'il a mis à notre disposition se sont avérées cmciales dans la réussite de
nos travaux de recherche.

Un merci particulier à Francine B., Isabelle D., Alexandre B., Véronique P., Renaud
L., les animaliers de la fenne Frontenac et tous les autres qui m'ont épaulés lors des
experiences au laboratoire et avec les chevaux.

J
 INTRODUCTION
^
Les neutrophiles sont les cellules du système immunitaire les plus nombreuses chez
les chevaux et la plupart des autres espèces animales. En réponse à une stimulation
antigénique, ils ont la capacité de migrer très rapidement et en grand nombre vers un
site inflammatoires. La capacité des neutrophiles à produire des médiateurs
inflammatoires toxiques est très bien documentée ainsi que leur apport important à la
réponse immunitaire innée. Toutefois, certaines données récentes chez les humains
ont démontré leur importance dans la modulation de la réponse immunitaire acquise
par la production de cytokines. En effet, la synthèse et la relâche de cytokines telles
que le TNF-a, l'IL-12 et l'IL-4 peut influencer le système immunitaire vers une
réponse de type Th l ou Th2 selon la nature de la cytokine impliquée.
Les données sur la production de cytokines par les neutrophiles équins sont
inexistantes puisque cette capacité de production n'a pas encore été investiguée chez
les chevaux. L'objectif principal de ce projet de maîtrise consiste à démontrer le
potentiel de synthèse de cytokines par les cellules polymorphonucléaires équins.
Les résultats obtenus permettront d'examiner leur importance dans certaines
conditions équines dont la pathogénie est mal connue et dans lesquelles le
neutrophile pourrait jouer un rôle qui n'avait pas encore été considéré.
Parmi ces maladies équines, le « souffle » est une condition étudiée par beaucoup de
laboratoires de recherche equine à travers le monde. Typiquement, cette maladie
affecte les petites voies respiratoires des chevaux. Une caractéristique particulière
de cette condition est la présence d'une neutrophilie pulmonaire importante chez les
individus atteints (Robinson et al. 1996). En démontrant la production de cytokines
par les neutrophiles équins, nous serons ensuite en mesure d'étudier des conditions
chez lesquelles les neutrophiles semblent intervenir et jouer un rôle prépondérant.

J
 2

REVUE DE LA LITTÉRATURE
n
I- Le système immunitaire

Par définition, le système immunitaire est le système de défense contre les maladies
induites par des antigènes externes, particulièrement contre l'invasion par les
microorganismes infectieux (Abbas et al. 2000). Différentes populations cellulaires
et médiateurs composent ce système et génèrent collectivement une réponse
immunitaire lors de l'apparition d'un antigène. Celui-ci peut être de nature
microbienne ou propre à l'hôte même. La réponse immunitaire se divise en réponse
innée (non-spécifique) et réponse acquise (spécifique). La première se déclenche
très rapidement suivant l'apparition d'un antigène étranger et s'y s'attaque sans
aucune spécificité. La réponse acquise, quant à elle, s'active généralement quelques
jours suivant l'apparition de l'antigène et elle le reconnaît de façon spécifique
(Janeway et al. 1999). Elle mène à l'apparition de cellules mémoires qui
reconnaîtront l'antigène lors d'une éventuelle rencontre subséquente et l'élimineront
0 beaucoup plus rapidement et efficacement.

Tel que mentionné précédemment, le système immunitaire est composé de cellules

et de médiateurs. Les populations cellulaires, appelées leucocytes ou globules
blancs, sont divisées en deux lignées : la lignée lymphoïde et la lignée myéloïde. La
première est constituée de lymphocytes, cellules immunitaires très importantes dans
l'immunité acquise, alors que la deuxième contient essentiellement des cellules
phagocytaires qui jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire innée
(Tizard 2000). Quoique leurs rôles soient intimement liés, les leucocytes possèdent
des caractéristiques et des mécanismes d'action qui leur sont propres.

Parmi les cellules phagocytaires de la réponse immunitaire innée, les neutrophiles

sont des acteurs principaux. En effet, leurs multiples fonctions témoignent de leur
importance cruciale dès les premiers instants de la réponse immunitaire. Plus
encore, on leur découvre aujourd'hui de nouveaux potentiels qui portent à croire que
J leur contribution au système immunitaire pourrait s'étendre au-delà de ce qui a été
 3

constaté jusqu'à ce jour. Dans les prochains paragraphes, nous verrons quels sont
n les principaux rôles des neutrophiles et les nouvelles caractéristiques qui leur sont
attribuées et qui ont poussés les chercheurs à s'interroger davantage quant à leur
contribution dans le système immunitaire.

u
 4

II- LES NEUTROPHILES

^
A- Introduction

Les neutrophiles sont aussi appelés polymorphonucléaires (PMN) en raison du

polymorphisme et de l'aspect multilobé de leur noyau. Ils sont considérés comme la
première ligne de défense du système immunitaire en réponse à un antigène étranger
(Smith 2000). Ils constituent la plus grande population de leucocytes dans le sang
(Roitt et al. 1998; Tizard 2000) et leur demi-vie est de quelques jours seulement
(Tizard 2000). Suite à leur relâche par la moelle osseuse dans la circulation
sanguine, ils migrent rapidement vers les tissus périphériques (Tizard 2000).
Suivant un stress antigénique, cette migration vers les tissus sera augmentée par
l'exposition à des facteurs chimiotactiques (Bertram 1985). Traditionnellement, on
considérait que le rôle des neutrophiles se résumait à l'ingestion des bactéries et à
leur destruction. Aujourd'hui, leur potentiel de destmction des microorganismes ou
des cellules transformées par l'immunité cytotoxique à dépendance d'anticorps est

D bien reconnu (Grewal et al. 1980; Smith et Lumsden 1983). Toutefois, au cours des
deux dernières décennies, les chercheurs ont réalisé que les neutrophiles n'étaient
pas que des cellules effectrices dont le comportement était strictement dicté par les
médiateurs inflammatoires sécrétés par les autres populations cellulaires (Cassatella
1999). En effet, malgré une machinerie de synthèse protéique réduite, il est
clairement démontré que les neutrophiles humains possèdent la capacité de
synthétiser de nombreux médiateurs inflammatoires tels que les cytokines et que
leurs rôles pourraient excéder celui d'une simple cellule efférente (Lloyd et
Oppenheim 1992; Cassatella e/a/. 1995a; Cassatella e? aZ. 1997). La plupart des
études sur l'expression de cytokines par les neutrophiles sont réalisées sur des
cellules humaines. Chez les autres espèces, la production de cytokines a été très peu
étudiée. Deux études sur l'expression du gène codant pour l'IL-1 par les
neutrophiles bovins sont, à notre connaissance, les travaux réalisés chez les animaux
domestiques (Canning et Neill 1989; Beckman et al. 2000).

J
 5

B- Morpholosie
D
Les neutrophiles sanguins possèdent un diamèù-e d'environ 12 à 15 p-m (Calamai et
Spitznagel 1982). Leur noyau est segmenté en trois à cinq lobules interconnectés
(Abbas et al. 2000) et, dépendemment de l'espèce animale, cette lobulation sera
marquée ou non. Ainsi, chez les chevaux, l'indentation du noyau des neutrophiles
matures est beaucoup plus évidente que chez les chiens et les chats (Bertram 1985).
Comme les autres cellules de la lignée myéloïde, le cytoplasme des neutrophiles
contient des granules facilement distinguables au microscope électronique (Tizard
2000). En se basant sur leur activité peroxydase, il est possible de classifier ces
granules en deux groupes : les granules primaires (peroxydase positif) et les granules
secondaires (peroxydase négatif) (Graham et Karnovsky 1966). Ces granules
contiennent des facteurs et enzymes antimicrobiens qui interagissent avec des
enzymes cytoplasmiques et membranaires pour détruire les microorganismes
phagocytés (Bertram 1985; Gullberg étal. 1997; Smith 2000).

0 Tableau I - Résumé des principaux constituants des granules primaires et

secondaires des neutrophiles (traduit et adapté de Smith (Smith 2000))
Granules primaires Granules secondaires

Eléments antimicrobiens Eléments antimicrobiens

-Myéloperoxydase -Lactoferrine

-Lysozyme -Lysozyme
-Défensines -Cathélicidines

-Protéine bactéricide inductrice de

perméabilité
Enzymes Enzymes
-Hydrolases acides -Phosphatase alcaline
-Protéases neutres -Collagénase
-Elastase -Apolactoferrine
-Enzyme de dégradation du C5a

J
 6

C- Maturation et misration des neutrophiles

n
Les neutrophiles équins sont produits par la moelle osseuse à un rythme de plusieurs
millions de cellules par minute (Tizard 2000) et ils constituent environ 50% des
leucocytes totaux du sang (Tizard 2000). Leur maturation est sous l'influence d'un
grand nombre de cytokines et de plusieurs populations cellulaires dont les
monocytes et les lymphocytes T (Smith 2000). Durant le processus de
differentiation, les neutrophiles passent par plusieurs stages de maturité. Le jeune
neutrophile se distingue par son noyau non-segmenté et un cytoplasme pâle (Jain
1993). La durée du processus de maturation complet est très variable d'une espèce à
l'autre : il est de 6 jours chez les chiens et les chats (Latimer et Rakich 1989;
J.R.Duncan et al. 1994), de 7 jours chez les bovins (Valli et al. 1971) et de 14 jours
chez les humains (Kim et Demetri 1996).

Tel que mentionné précédemment, les neutrophiles ne demeurent pas longtemps en

circulation. Chez les chevaux, ils migrent vers les tissus après une dizaine d'heures
0 dans le sang (Carakostas et al. 1981) comparativement à 6 à 7 heures chez le chien
(Deubeleiss et al. 1975). Dans le compartiment vasculaire, les neutrophiles sont
distribués en deux groupes : le groupe de neutrophiles circulants et le groupe de
neutrophiles marginalisés. Ces derniers représentent les neutrophiles qui sont
séquestrés dans la microvascularisation de la moelle osseuse et des poumons
principalement (Witko-Sarsat et al. 2000). Ces neutrophiles sont très rapidement
mobilisables lors d'un phénomène inflammatoire. Chez les chevaux, les deux
groupes sont équivalents en nombre (Carakostas et al. 1981) alors que chez d'autres
espèces, par exemple le chat, le nombre de cellules marginées est trois fois plus
important que celui des cellules circulantes (Prasse et al. 1973). Cette rétention
physiologique des cellules polymorphonucléaires apparaît être un processus
mécanique attribuable à leur rigidité - en comparaison à la grande déformabilité des
globules rouges (Downey et al. 1990) - et ne semble pas faire intervenir les
molécules d'adhésion (Mizgerd et al. 1996; Doyle et al. 1997).

u
 7

La double fonction du neutrophile à savoir son rôle de surveillance immunitaire et

^ d'elimination de microorganismes ou de débris cellulaires in situ nécessite une
transition rapide entre un état de cellule vasculaire non-adhérente et celui de cellule
adhérente (Witko-Sarsat et al. 2000). Ce changement dans la capacité du neutrophile
à se marginaliser lui permet ensuite de migrer vers les tissus inflammés. La
première étape de sa migration vers les tissus est l'apparition, sur les cellules
endothéliales adjacentes au site inflammatoire, de molécules d'adhésion (Springer
1994). La relâche de médiateurs inflammatoires par les tissus endommagés est
responsable de l'activation de l'endothélium (Witko-Sarsat et al. 2000). Au niveau
des capillaires pulmonaires et des veinules post-capillaires, le courant sanguin déjà
lent est davantage ralenti par une vasodilatation locale permettant ainsi un
attachement transitoire du neutrophile à l'endothélium (Abbas et al. 2000). Ce
phénomène est communément appelé « roulement » et fait intervenir les L-sélectines
présentes à la surface des neutrophiles et leurs ligands, les E et P-sélectines
nouvellement exprimées à la surface des cellules endothéliales (Cronstein et
Weissmann 1993). Contrairement aux E et P-sélectines, les L-sélectines présentes à
la surface des polymorphonucléaires y sont présentes de façon constitutive (Witko-
Sarsat et al. 2000) et leur expression est augmentée suivant l'activation cellulaire.
Durant cette phase de roulement, l'endothélium produit des substances
chimio attractive s (Facteur activateur des plaquettes (PAF), leukotriènes B4
(LTB4),...) et des chemokines, dont l'interleukine-8 (IL-8), à sa surface (Witko-
Sarsat et al. 2000). L'IL-1 et le LPS bactérien sont deux stimuli importants qui
induisent la production et la relâche d'IL-8 par les les cellules endothéliales (Utgaard
et al. 1998). L'interaction entre les substances produites à la surface des cellules
endothéliales et les neutrophiles déclenche l'activation de ces derniers (Witko-Sarsat
et al. 2000) et leur adhésion ferme à la paroi vasculaire.

L'adhésion ferme des neutrophiles à l'endothélium est la deuxième étape du

processus de migration vers les tissus et fait suite à leur activation par différentes
molécules lors du roulement sur la paroi vasculaire. Elle implique l'interaction entre
les intégrines |3-2 (CDlla, CDllb, CDllc/CDlS) des leucocytes et les molécules
J
 8

ICAM-1 des cellules endothéliales (Fischer et al. 1983; Anderson et al. 1984; Sligh
n et al. 1993). Fait intéressant, les intégrines-beta2 sont incapables de se lier à leurs
ligands chez des neutrophiles inactivés. Ce mécanisme contrôlerait le flux de
neutrophiles dans les inflammations aiguës (Witko-Sarsat et al. 2000). Lors de cette
étape, le mouvement des cellules qui roulent sur la paroi se ralentit et ce, jusqu'à
leur arrêt complet.

Le processus de diapédèse est la migration du neutrophile entre les cellules

endothéliales dans le but d'atteindre les tissus. C'est la troisième étape du processus
complet de migration. Elle implique l'arrêt des polymorphonucléaires à la jonction
des cellules endothéliales. Pour ce faire, celles-ci expriment une grande quantité de
P-sélectines qui permet l'arrêt des leukocytes à l'endroit désiré (Witko-Sarsat et al.
2000). De plus, le processus de transmigration requiert la modification des jonctions
entre les cellules endothéliales afin de permettre le passage des neutrophiles. Cette
désorganisation des jonctions qui unissent deux cellules endothéliales a été observée
par Del Maschio et al. (Del Maschio et al. 1996).
0
Fait intéressant, la migration des neutrophiles à travers l'endothélium pulmonaire
peut se faire sans l'apport des intégrines CD11/CD18. En effet, en réponse à des
stimuli particuliers tels les bactéries Streptococcus pneumoniae, Sîaphylococcus
aureus et les streptocoques du groupe B, le C5a, l'hyperoxie et l'acide
hydrochlorique, il a été clairement démontré qu'une neutrophilie pulmonaire était
attribuable à une migration indépendante de CD11/CD18 (Doerschuk et al. 2000).

Le mouvement des neutrophiles à travers le tissu interstitiel est la dernière phase de

la migration tissulaire. L'hapotactisme est le terme qui désigne cette migration en
fonction d'un gradient d'agents chimioattractants non-solubles (Witko-Sarsat et al.
2000). Ceux-ci, principalement issus des bactéries, des cellules mortes et d'autres
populations cellulaires des tissus inflammés, adhèrent à la matrice interstitielle en
raison de leiu- charge négative (Witko-Sarsat et al. 2000). La migration est médiée
par les intégrines-p2 en association avec les intégrines-pl et p3.
^
 9

Tissu endommagé
n »•» Cellules mortes
t Bactéries
^
Médiateurs
inflammatoires

/
Cellules
stromales
y
4.
Leucotriènes (LTB4)
Chemokines
Facteur activant des
plaquettes sx
Endothéliuii
a

v^
Diapédèse

D Neutrophiles
sanguins
Adhésion

Illustration 1 - Schématisation de la migration des neutrophiles sanguins vers

les tissus suite à la relâche de médiateurs chimiotactiques en réponse à des
antigènes étrangers

D- Mécanismes d'action des neutrophiles

Lorsque les neutrophiles ont atteint un site inflammatoire, ils s'appliquent à éliminer
le ou les agents envahissants. La phagocytose est un moyen efficace utilisé par les
polymorphonucléaires pour éliminer les larges particules (0.5 um) comme les
microorganismes, les cellules sénescentes et les débris cellulaires (Smith 2000).
L'efficacité du processus d'ingestion et d'élimination est augmentée de façon
importante par la présence d'opsonines. Celles-ci sont majoritairement les
immunoglobulines et le complément qui vont recouvrir les particules étrangères et
u
 10

pour lesquelles les neutrophiles possèdent 2 principaux récepteurs (Roitt et al.

n 1998) : le FcYR2 (CD32) et le CR3 (intégrine CD1 lb/CD18). Lorsque les particules
sont ingérées, elles sont ensuite détruites. La destruction des microorganismes se
fait selon deux procédés : l) la libération de médiateurs toxiques et d'enzymes à
partir des granules présentes dans le cytoplasme de la cellule et 2) la génération de
métabolites oxydants très puissants (Abbas et al. 2000). Le premier moyen de
destruction fait appel à des lysosomes qui contiennent une grande quantité
d'enzymes (Weiss 1989). Lors de la phagocytose, les microorganismes étrangers
sont séquestrés dans des phagosomes. Ceux-ci iront ensuite fusionner avec les
lysosomes pour former des phagolysozomes et permettre ainsi aux nombreuses
enzymes toxiques d'attaquer les agents infectieux. Le deuxième des procédés
utilises par les neutrophiles pour détruire les microorganismes fait appel à la
formation de radicaux libres et autres agents oxydants à partir d'une enzyme
présente dans la paroi cellulaire (NADPH) et d'une autre appelée l'oxyde nitrique
synthétase (Weiss 1989; Abbas et al. 2000). Ces enzymes permettent la formation
d'anion superoxyde (02'), de peroxyde d'hydrogène (IÎ202'), d'ion hydroxyl (OH'),
3 d'oxyde nitreux CNO') et d'acide hypochlorite (HOCl')(Henderson et Chappel 1996)
qui diffuseront dans le phagosome afin d'y exercer leurs effets toxiques (Abbas et al.
2000).

Lorsque les neutrophiles sont incapables de phagocyter un agent infectieux, ils

relâchent le contenu de leurs lysozomes dans le compartiment extra-cellulaire et ils
sont alors susceptibles de causer des dommages tissulaires importants, voir
irréversibles (Weiss 1989) pouvant mener à des dommages tissulaires importants,
voire irréversibles (Smith 2000). Ainsi, la destruction tissulaire imputable aux
neutrophiles a été observé dans plusieurs maladies humaines tels le syndrome de
détresse respiratoire aiguë et le syndrome de dysfunction multiple des organes
(Fujishima et Aikawa 1995), les vasculites systémiques (Nowack et al. 1998), le
syndrome d'ischémie-reperfusion (Thiagarajan et al. 1997) et plusieurs autres
(Smith 2000).

J
 11

^ E- Les neutrophiles et les cytokines

Les neutrophiles sont les premières cellules à migrer vers les tissus en réponse à une
réponse inflammatoire aiguë (Cassatella 1999). Traditionnellement, ils ont
longtemps été considérés comme des cellules hautement différenciées et incapables
de synthèse protéique (Lloyd et Oppenheim 1992). Leur rôle se limitait à la
destruction des microorganismes par la phagocytose et la relâche de médiateurs
toxiques tel que décrit précédemment. Toutefois, au cours des dernières années,
certains résultats de recherches ont remis en question cette conception du
neutrophile dans les interactions cellulaires de la réponse immunitaire. En effet, les
études démontrant clairement le potentiel de synthèse de cytokines et autres
médiateurs cellulaires s'accumulent. Considérant leur relâche précoce lors de la
réponse immunitaire, ces cytokines pourraient influencer ou même déterminer le
type de réponse élaborée par le système immunitaire.

Certaines études se sont attardées sur la quantité de cytokines produites par les
neutrophiles stimulés in vitro et ont été revues par Cassatella (Cassatella 1995). Il
n'est pas étonnant de constater que, pour la plupart des cytokines, la quantité
exprimée est largement inférieure à celle d'un monocyte ou d'un lymphocyte
(Cassatella 1995). En effet, dépendemment de la cytokine impliquée et sur une base
individuelle, un neutrophile synthétise 10 à 300 fois moins de protéine que le
monocyte (Cassatella 1999). Toutefois, il est important de mentionner que dans la
plupart des phénomènes inflammatoires, les cellules polymorphonucléaires
représentent la population cellulaire la plus nombreuse et donc, la somme des
cytokines produites est non-négligeable (Cassatella 1999).

l- La production de cytokines par les neutrophiles

Les premières évidences de la production de cytokines par les neutrophiles sont

apparues à la fin des années 1980. En effet, Lindemann et al. (1988). ont alors
J
 12

démontré qu'en réponse au facteur stimulant des granulocytes et des macrophages

^ (GM-CSF), les neutrophiles exprimaient de l'IL-1. Actuellement, de nombreuses
études sur le sujet ont été publiées et le nombre de cytokines produites par les
polymorphonucléaires s'élève à plus de 30 (Cassatella 1999). Le tableau II résume
l'état des connaissances sur les principales cytokines produites par les neutrophiles.

Tableau II - Principales cytokines produites in vitro par les neutrophiles

humains (traduit et modifié d'après CassateIIa (Cassateiïa 1999))
Cytokines pro-inflammatoires Chemokines C-X-C

- Facteur nécrosant des tumeurs-alpha - Interleukine-8 (IL-8)

(TT^F-a) Facteurs de croissance

- Interleukine-1 alpha (IL-1 a) - Facteur stimulant des granulocytes (G-

- Interleukine-1 beta (IL-1)3) CSF)
- Interleukine-6 (IL-6) - Facteur stimulant des macrophages (M-

- Interleukine-12 (IL-12) CSF)

- Interféron alpha (IFN-a) - Facteur stimulant des granulocytes et
D des macrophages (GM-CSF)
- Interféron gamma (IFN-y)
Cytokines anti-inflammatoires - Interieukine-3 (IL-3)

- Antagoniste du récepteur à l'IL-1 (IL-

IRA)
- Facteur transformant de croissance beta

(TGF-1:

Dans le cadre de cette revue de littérature, nous nous attarderons sur les principales
cytokines pro-inflammatoires et chemokines afin de comprendre leur importance
dans les phénomènes inflammatoires impliquant les neutrophiles. Il est à noter que
plusieurs études sur la production de cytokines in vivo suivant un stimulus
experimental ont été réalisées. Ces études sont revues en détails par Cassatella et les
résultats sont similaires à ceux obtenus in vitro (Cassatella 1999).

J
 13

2- Facteur nécrosant des tumeurs-alpha (TNF- a)

^
Le TNF-a est une cytokine ayant de multiples effets proinflammatoires et
immunorégulatoires (Cassatella 1999). Elle joue un rôle de premier plan dans la
defense de l'hôte et dans l'immunité non-spécifique (Tracey et Cerami 1994). Cette
cytokine porte aussi le nom de cachexine puisque sa production chronique mène à
une perte de poids, de l'anorexie, de la déshydratation et à la depletion des protéines
et des lipides de l'hôte (Tracey et Cerami 1994). Parmi ses effets systémiques,
mentionnons son effet sur l'hypothalamus qui provoque de l'anorexie, de la fièvre et
la libération du facteur relâchant de la corticotropine (Tracey et Cerami 1994). Par
ailleurs, son action sur les leucocytes est aussi très importante. Le TNF-a active les
leucocytes, amplifie l'adhérence des neutrophiles et des monocytes à l'endothélium
vasculaire, déclenche la migration des cellules inflammatoires dans la matrice
intercellulaire, stimule la prolifération des fibroblastes et induit la production locale
d'autres cytokines proinflammatoires (Tracey et Cerami 1994; Janeway et al. 1999).

:) Cette cytokine est aussi impliquée dans l'apparition d'effets secondaires imputables
à certaines pathologies dont le cancer, le choc septique, le diabète, et plusieurs autres
(TraceyetCeramil994).

Puisque le TNF-a est un activateur efficace de la fonction des polymorphonucléaires

(Djeu 1992), la capacité des neutrophiles de le sécréter suggère l'existence d'un
mécanisme d'autoactivation par un effet autocrine. En effet, une étude de Sweeney
et al. a démontré que le surnageant de neutrophiles incubés avec C.albicans pendant
18 heures diminue de façon significative l'apoptose de neutrophiles fraîchement
recueillis (Sweeney et al. 1998). De plus, en bloquant l'action du TNF-a contenu
dans le surnageant avec des anticorps monoclonaux, une partie de cet effet est
annulée (Sweeney et al. 1998).

J
 14

3- Interleukine-lp
^
L'IL-lp est un important médiateur de la réponse immunitaire de l'hôte contre les
infections de par ses effets protecteurs et proinflammatoires (Dinarello 1997). Les
effets biologiques de l'IL-lp sont multiples et cette cytokine est sécrétée par une
grande quantité de cellules (Dinarello 1997). Parmi ces effets, mentionnons son
influence sur le développement des cellules des lignées myéloide et lymphoïde et
son induction de la production de cytokines par les monocytes (Dinarello 1997). Au
même titre que le TNF-a, l'IL-1 active les neutrophiles, augmente leur survie in
vitro et stimule in vivo la relâche corticostéroïde dans la circulation par son action
sur la relâche d'ACTH médiée par l'hypothalamus (Dinarello 1997). De plus, cette
cytokine joue un rôle important dans la réponse inflammatoire aiguë. Elle est le
principale pyrogène endogène avec le TNF-a et l'IL-6 (Dinarello 1996). In vivo,
elle cause de la fièvre, de l'hypotension, une perte de poids et une neutrophilie
(Dinarello 1996).

3 A l'image du TNF-a, l'IL-1 induit aussi des effets toxiques. Elle possède ainsi une
activité toxique importante sur les cellules-beta des ilôts des Langerhans de même
que sur les articulations et les os (Dinarello 1996). Elle a de plus été impliquée dans
la pathogénèse de plusieurs autres maladies (Dinarello 1996).

Quoique la réelle capacité de synthèse d'IL-1 par les neutrophiles a fait l'objet de
discussions au début des années 1990 (Cassatella 1999), il est maintenant évident
que cette cytokine est sécrétée par les neutrophiles de plusieurs espèces animales
(Goto et al. 1984; Kitamura et al. 1986; Canning et Neill 1989; Kusaka et
Donaldson 1990).

4- Interleukine-6

L'IL-6 est une cytokine qui exerce de multiples effets sur des cellules-cibles variées
(Hirano 1998). Elle est un facteur de differentiation important pour plusieurs
; populations cellulaires dont les lymphocytes B (Hirano 1998). Elle est aussi une
 15

cytokine proinflammatoire qui partage plusieurs ressemblances avec le TNF-a et

0 l'IL-1. En effet, tout comme ces dernières, elle possède une activité pyrogène
importante et elle induit la synthèse de protéines de la phase aiguë par le foie
(Hirano 1998). Elle est sécrétée par plusieurs populations cellulaires dont les
lymphocytes B et T, les macrophages, les cellules endothéliales et les fibroblastes
(Hirano 1998).

Aujourd'hui encore, la discussion portant sur la sécrétion d'IL-6 par les neutrophiles
ne fait pas l'unanimité. En effet, Cicco et al. (1990) ont rapporté qu'après
stimulation avec du facteur stimulant des granulocytes et des monocytes (GM-CSF),
les cellules polymorphonucléaires exprimaient rapidement de l'ARNm d'IL-6 et la
protéine correspondante (Cicco et al. 1990). Toutefois, des études subséquentes ont
remis en question ces résultats et démontré qu'avec une contamination par les
monocytes de moins de 0.8%, la présence d'IL-6 était indétectable, que ce soit par la
technique de Northern Blot ou de RT-PCR (Bazzoni et al. 1991 a; Cassatella et al.
1995b; ^/[cDonald et al. 1998). Toutefois, il faut mentionner que les techniques de
0 détection et les stimulants utilisés étaient différents dans les deux études et que des
résultats supplémentaires seront nécessaires avant de pouvoir conclure quant à la
capacité des cellules polymorphonucléaires à produire de l'IL-6.

5- L'interleukine-8

L'IL-8 est une chemokine de la classe des C-X-C en regard de la position relative
des résidus de cystéine. En effet, les chemokines possèdent 4 cystéines
caractéristiques et, dépendemment de la disposition des deux premières dans la
sequence protéique, sont classées en chemokine C-X-C, C-C, C et C-X-X-X-C. Les
chemokines C-X-C ont pour principale caractéristique d'exercer un effet de
chimiotactisme sur les neutrophiles. L'IL-8 est le représentant le plus connu et le
plus étudié de cette classe qui contient aussi le MIP-2 (Rollins 1997). L'IL-8 est
produite par plusieiirs types de cellules, incluant les lymphocytes T, les monocytes,
les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les fibroblastes et plusieurs autres.
J
 16

L'IL-8 exerce son effet chimiotactique sur les neutrophiles en induisant l'expression
n de molécules d'adhésion et leur migration transendothéliale (Huber et al. 1991).
Elle exerce aussi des effets sur les basophiles et les lymphocytes T (Huber et al.
1991). Parmi ses effets sur les polymorphonucléaires, mentionnons aussi sa capacité
d'augmenter la relâche d'enzymes des granules, la formation de radicaux toxiques et
l'expression de récepteiu-s au complément (CRI) (Oppenheim et al. 1991).

Plusieurs recherches ont établi sans l'ombre d'un doute que les neutrophiles humains
expriment de l'IL-8, que ce soit en démontrant l'expression d'ARNm ou la présence
de la protéine (Cassatella 1999). Il aussi été prouvé que les neutrophiles non-
stimulés exprimaient de l'ARNm d'IL-8 de façon constitutive (Cassatella et al.
1992; Stricter et al. 1992; Arnold et al. 1994). Cette présence d'ARNm pourrait
s'expliquer par un stress et une activation des neutrophiles lors du processus
d'isolation ou par une présence constante d'une réserve d'ARNm qui permet la
relâche rapide de la protéine lors d'un processus inflammatoire (Cassatella 1999).

0 6- Protéine inflammatoire des macrophages-2 (MIP-2)

La protéine inflammatoire des macrophages-2 fait aussi partie des chemokines C-X-
C (Wolpe et al. 1989; Sherry et al. 1992; Baggiolini et al. 1994). Comme l'IL-8,
certaines évidences laissent croire que MIP-2 joue un rôle dans le réseau de
cytokines qui influencent la réponse inflammatoire et immunitaire et qu'elle pourrait
contribuer à la pathogénèse de plusieurs maladies inflammatoires (Fahey et al. 1990;
Huang et al. 1992). Comme l'IL-8, MIP-2 possède un pouvoir d'attraction important
sur les neutrophiles et elle induit leur dégranulation avec relâche de lysozyme
(Wolpe et al. 1989). Toutefois, contrairement à l'IL-8, elle ne déclenche pas la
formation de radicaux libres chez les mêmes cellules (Wolpe et al. 1989). La source
principale de MIP-2 est le macrophage mais sa production a aussi été démontrée
chez les neutrophiles, les fibroblastes et les cellules épithéliales (Driscoll 1994).

}
 17

La production de MIP-2 par les neutrophiles est très peu détaillée. Chez l'humain,
on a démontré la production par les neutrophiles du facteur oncogène relié à la
croissance-alpha (GRO-a) et du GRO-P qui seraient les analogues du MIP-2 murin
(Gasperini et al. 1995) (Schramm et al. 2000).

7- Interleukines-4 et 5

Avant de discuter des caractéristiques immunologiques des interleukines 4 et 5, il

convient d'introduirc certaines notions qui permettront de comprendre davantage les
rôles que jouent ces cytokines dans le système immunitaire. Les lymphocytes sont
principalement divisés en deux populations distinctes : les lymphocytes CD4+ et
CD8+ en regard de la présence ou de l'absence de molécules de surface impliquées
dans les interactions cellulaires avec les cellules présentatrices d'antigènes. Les
lymphocytes CD4+ sont aussi appelés les lymphocytes T auxiliaires (Th) alors que
les lymphocytes CD8+ sont appelés lymphocytes T cytotoxiques. Les premiers sont
impliqués dans la modulation de la réponse inflammatoire et la destruction des
D
<. pathogènes extra-cellulaires alors que les deuxièmes visent la destruction des
pathogènes intra-cellulaires et/ou des cellules tumorales. Les lymphocytes CD4+
sont subdivisés en ThO, Thl, Th2 et, récemment, Th3 selon les types de cytokines
produites par chacune des sous-populations lymphocytaires. Les cellules Thl et Th2
sont particulièrement étudiées en raison de la dichotomie qui existe dans les effets
qu'elles induisent. Les cellules ThO représentent un stade intermédiaire précédant
l'induction en Thl, Th2 ou Th3 alors que les lymphocytes Th3 jouent un rôle dans
l'inhibition de la réponse immunitaire en sécrétant, entre autres, du facteur
transformant de croissance beta (TGF-P), une cytokine inhibitrice puissante.
L'aiguillage d'un lymphocyte CD4+ vers une sous-population plutôt qu'une autre
demeure un phénomène partiellement élucidé. Parmi les facteurs responsables, le
rôle de l'environnement de cytokines dans lequel baignent les lymphocytes en
développement est le plus étudié (Constant et Bottomly 1997). Les études ont ainsi
démontré que l'IFN-y et l'IL-12 sont les cytokines les plus importantes dans
l'induction de la différenciation en Thl alors que l'IL-4 induit la différenciation en
J
 18

Th2 (Swain et al. 1990; Seder et al. 1993; Seder et Paul 1994). Lorsque les
n lymphocytes T maturent en Thl, ils produisent de l'IFN-y, de l'IL-2 et du TNF-b.
Les cellules Th l sont plutôt associés à la stimulation de l'immunité à médiation
cellulaire et l'amplification de la phagocytose par les macrophages et autres cellules
phagocytaires (Romagnani 2000). A l'opposé, lorsque les lymphocytes maturent en
Th2, ils produisent plutôt de l'IL-4, de l'IL-5, de l'IL-6, de l'IL-10 et de l'IL-13
(Paul et Seder 1994). Ce profil de cytokine est associé à la stimulation des
lymphocytes B et à la production d'anticorps (Paul et Seder 1994). IL-4 et IL-13
sont particulièrement intéressantes puisqu'elles induisent la production
d'immunoglobulines detypeE (de Vries e?a/. 1993; Punnonen e^a/. 1993). L'IL-5
joue un rôle important dans la maturation des lymphocytes B stimulés en
plasmocytes qui sécrètent alors une grande quantité d'immunoglobulines (Hamaoka
et Ono 1986) alors que l'IL-6 augmente la production d'immunoglobulines par ces
même plasmocytes (Kishimoto 1989). Les lymphocytes de type Th2 sont impliqués
dans les processus allergiques dont l'asthme chez l'humain (Colavita et al. 2000;
Magnan et Vervloet 2000; Mazzarella et al. 2000; Yssel et Groux 2000). En effet,
0 plusieurs études ont démontré que les lymphocytes Th2 et les cytokines produites
par ces cellules étaient responsables de plusieurs caractéristiques de l'asthme humain
dont la présence d'un grand nombre d'éosinophiles et la production d'IgE (Yssel et
al. 1998; Haas et al. 1999; Rojas Ramos et Martinez Jimenez 1999).

Des recherches sont présentement en cours afin de déterminer si, à l'image de

l'asthme humain, les lymphocytes pulmonaires des chevaux affectés par le souffle
expriment un profil de cytokines de type allergique. Les résultats récents
démontrent qu'effectivement, les cellules pulmonaires des chevaux affectés par le
souffle sécrètent davantage d'IL-4 et d'IL-5 et moins d'IFN-y que celles des
chevaux normaux (Lavoie et al. Sous presse). Par ailleurs, des résultats silimaires
ont été obtenus dans une étude chez des chevaux atteints de souffle et des chevaux

normaux (Cordeau et al. Manuscrit en préparation). Comme le souffle est une

condition se caractérisant par une neutrophilie pulmonaire importante, notre groupe

J de recherche s'intéresse à l'interaction entre les cytokines de type Th2 et la

 19

production de ces cytokines par les neutrophiles (Joubert et al. Manuscrit en

0 preparation).

L'IL-4 est une cytokine produite principalement par les lymphocytes CD4+ de type
Th2 et aussi par les basophiles et les mastocytes (Seder et Paul 1994). Elle joue un
rôle central dans la régulation de la differentiation des cellules T naïves stimulées
par un antigène. En effet, l'IL-4 provoque la transformation de ces cellules en
lymphocytes Th2 capables de produire de l'IL-4, de l'IL-5, de l'IL-10 et de l'IL-13
(Hsieh et al. 1992; Seder et al. 1992). De plus, une autre caractéristique importante
de l'IL-4 est sa capacité à contrôler la production d'immunoglobulines de type E par
les lymphocytes B (Gauchat et al. 1991). L'IL-5 est pour sa part associée au
recrutement des éosinophiles et à leur activation (Sanderson et Urwin 2000;
Weltman et Karim 2000). Elle est la principale cytokine impliquée dans
l'inflammation éosinophilique (Weltman et Karim 2000). L'IL-5 est
majoritairement produite par les lymphocytes Th2. Ses effets sur les éosinophiles
sont nombreux : augmentation du recrutement, de la maturation, de la dégranulation
0 et du temps de survie, ainsi qu'une induction de l'expression de molécules
d'adhésion (Jung et al. 1995; Weltman et Karim 2000).

Tel que vu précédemment, l'IL-4 et l'IL-5 sont deux cytokines dont la production est
étroitement liée aux lymphocytes T auxiliaires (Jung et al. 1995). Pour cette raison,
la production de ces cytokines par les neutrophiles n'a pas été étudiée de façon
extensive. Une étude publiée récemment démontre toutefois que les cellules
polymorphonucléaires expriment une très faible quantité d'IL-4 dans leur
cytoplasme et qu'en présence d'un agent stimulateur tel que la brefedine A ou un
ionophore, la production d'IL-4 est augmentée de façon significative (Brandt et al.
2000). Ces résultats poussent à croire que les neutrophiles ont une capacité de
synthèse d'IL-4 qui peut être modulée par des signaux stimulants ou inhibiteurs.
Des études complémentaires demeurent néanmoins nécessaires afin de compléter la
littérature sur le sujet.

J
 20

8- Interféron-Y (IFN-y)
0
L'interféron-Y est aussi connu sous le nom d'interféron type II ou interféron
immunitaire en référence à son rôle central dans la défense de l'hôte contre les

pathogènes et les antigènes étrangers (Boehm et al. 1997). Il est sécrété

principalement par les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles (NK) (Farrar
et Schreiber 1993). Les effets de l'IFN-y sont nombreux et visent principalement la
promotion de la réponse immunitaire à médiation cellulaire principalement par
l'activation des macrophages et des mécanismes immunologiques non-spécifiques
de ce type d'immunité (Farrar et Schreiber 1993). L'IFN-y amène l'expression de
plusieurs molécules importantes telles que les molécules du complexe majeur
d'histocompatibilité I et II (MHCI et MHCII), les molécules d'adhésion et certaines
chemokines (Farrar et Schreiber 1993). En plus d'activer les macrophages, 1'IFN-y
active aussi les neutrophiles de plusieurs façons. En effet, il induit l'expression des
récepteurs pour les immunoglobulines de type G, il amplifie la cytotoxicité
dépendante des anticorps (ADCC), potentialise la production de radicaux libres et la
0 relâche de granzymes et module l'activité microbicide chez ces cellules (Berton et
Cassatella 1992). Enfin, l'IFN-Y est une cytokine bien connue pour le rôle important
qu'elle joue dans l'aiguillage des lymphocytes T auxiliaires (Th) vers un profil Thl
plutôt que vers un profil Th2.

Les premières évidences de la capacité des polymorphonucléaires à synthétiser de

l'interféron-Y ont été démontrées récemment par Yeaman et al. (Yeaman et al.
1998). Fait intéressant à noter, seulement un neutrophile sur trois semblait exprimer
cette protéine (Yeaman et al. 1998) ce qui pousse à croire que l'interféron-Y n'est
pas systématiquement produit par tous les neutrophiles. De plus, dans une autre
étude, les chercheurs n'ont pas été en mesure de constater la présence de la cytokine
dans le surnageant de neutrophiles stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS)
pendant 24 heures (Keel et al. 1997). Par conséquent, des études additionnelles
seront nécessaires afin de confirmer les résultats obtenus jusqu'à ce jour et d'établir
l'importance des neutrophiles dans les processus invoqués précédemment.
J
 21

n 9- Production de cytokines par les neutrophiles d'individus affectés par

diverses pathologies

La prochaine partie de cette revue de littérature vise à démontrer que les

neutrophiles, de par la sécrétion de cytokines, sont des acteurs non-négligeables de
la réponse immunitaire dans certaines conditions pathologiques précises. Ces
recherches ont pour la plupart été réalisées chez les humains ou chez quelques
espèces d'animaux de laboratoire puisque la production de cytokines par les
neutrophiles chez les animaux domestiques est très peu documentée jusqu'à ce jour.

L'IL-8 est une cytokine qui a été étudiée de façon extensive dans le cadre de
plusieurs maladies humaines. Chez les patients atteints de fîbrose kystique, on a
observé une augmentation de l'expression d'IL-8 et d'oxyde nitreux dans les
sécrétions respiratoires (Francoeur et Denis 1995). Il a été proposé que ces deux
médiateurs inflammatoires pourraient représenter des cibles thérapeutiques afin de

D diminuer les dommages pulmonaires qui leur sont associés (Oishi et al. 1994). De
même, le rôle de l'IL-8 dans l'accumulation des neutrophiles chez les gens atteints
de sinusite chronique a été étudié (Suzuki et al. 1996). Cette maladie est
caractérisée par la présence d'un grand nombre de neutrophiles dans les effusions
nasales et paranasales (Suzuki e/aZ. 1996). Les décharges nasales des patients
atteints de la condition contenait davantage d'IL-8 que les patients atteints de rhinite
allergique (Suzuki et al. 1996). Enfin, Franchini et al. (1998) ont démontré
l'importance de l'IL-8 chez les chevaux atteints de souffle.

Les neutrophiles représentent des médiateurs cellulaires importants des maladies

intestinales inflammatoires telles que la colite ulcérative et la maladie de Crohn
(Cassatella 1999). Mazzucchelli et al. (1994) ont étudié l'expression du gène de
l'IL-8 chez des segments intestinaux de patients affectés par l'une ou l'autre des
conditions. Les résultats de ces travaux ont révélés que les muqueuses des intestins
affectés révélaient un fort signal spécifique d'IL-8 corrélé avec la sévérité des

J lésions inflammatoires à l'histopathologie (Mazzucchelli et al. 1994). Les

 22

neutrophiles représentaient la principale population cellulaire exprimant l'IL-8 aux

n sites d'inflammation active (Mazzucchelli et al. 1994). L'IL-lp et le TNF-a sont
aussi impliqués dans la condition (Derkx et al. 1993). Des études ultérieures ont
démontrées que l'expression de TNF-a et l'IL-1 P par les polymorphonucléaires
n'était pas spécifique de la condition puisque des patients atteints de colite
infectieuse démontraient aussi une augmentation de la relâche de cytokines
proinflammatoires (Nikolaus et al. 1998). Ces résultats ont confirmé que les
neutrophiles étaient une source importante de cytokines proinflammatoires chez les
individus affectés par des conditions inflammatoires de l'intestin et qu'une attention
particulière devra par conséquent leur être portée pour la compréhension de la
pathogénie de ces maladies (Nikolaus et al. 1998).

L'arthrite rhumatoïde est une maladie auto-immunitaire dont l'étiologie demeure

obscure. La condition est caractérisée par une inflammation chronique de la
membrane synoviale qui mène généralement à la destruction du cartilage articulaire
(Arend et Dayer 1990). Plusieurs évidences suggèrent une implication importante
0 des cytokines dans revolution de la maladie (Arend et Day er 1990). Une
caractéristique intéressante de la condition vient du fait que la membrane synoviale
des individus atteints est infiltrée par un grand nombre de neutrophiles (85-95% du
nombre total de cellules) (Cassatella 1999). Des études ont ainsi démontré que l'IL-
8 et le GRO-a étaient des chemokines impliquées dans le recruitement des
neutrophiles au niveau de l'articulation et qu'ils contribuaient à la pathogénie de
l'arthrite rhumatoïde (Beaulieu et McColl 1994).

Plusieurs autres études ont été publiées sur l'implication des neutrophiles dans
certaines conditions pathologiques. La production d'IL-6 par les neutrophiles a
aussi été étudiée chez des patients ayant subi une chirurgie des gencives (Euler et al.
1998) et chez d'autres atteints du cancer du sein (Ericson et al. 1998). De même, les
effets d'immunomodulation par l'interféron-Y ont été étudiés dans divers
circonstances dont celles du choc endotoxique (Galanos et Freudenberg 1993).

J
 23

Une revue complète de l'implication des cytokines produites par les neutrophiles
0 dans les pathologies humaines a été publiée par Cassatella (1999). Les conclusions
tirées par l'auteur sont les suivantes: les neutrophiles ne doivent plus seulement être
considérés comme des cellules efférentes de la réponse immunitaire mais aussi
comme des cellules qui, par la sécrétion de cytokines, peuvent influencer et
aiguillonner cette réponse immunitaire selon la pathologie et l'antigène impliqué.

F- Isolation des neutrophiles

Les caractéristiques de chacune des méthodes d'isolation des polymorphonucléaires

dépendent des types d'experimentation qui seront pratiqués sur les cellules isolées.
Par exemple, la recherche de l'expression de cytokines par RT-PCR nécessite de très
hauts taux de pureté des cellules isolées. Ceci est particulièrement vrai pour les
neutrophiles puisqu'il est connu que ces derniers expriment beaucoup moins
d'ARNm que les monocytes ou les lymphocytes (Cassatella 1995). Avec
l'utilisation de techniques aussi sensibles que la PCR, la moindre contamination par
0 d'autres populations cellulaires est suffisante pour fausser les résultats et ainsi
remettre en question leur pertinence. Ainsi, pour éviter ce problème, il est
souhaitable d'utiliser des neutrophiles ayant une pureté supérieure à 99.5% tel que
suggéré par Cassatella (Cassatella 1999).

Par ailleurs, un autre aspect important de la méthode d'isolation des neutrophiles

utilisée est sa capacité à stimuler les cellules isolées. Dans l'optique où un
chercheur désire comparer le niveau d'expression d'une cytokine chez une cellule
activée versus une cellule non-activée, la méthode choisie peut une fois de plus
changer les résultats obtenus. Dans les prochains paragraphes, nous résumerons les
différentes techniques d'isolation des neutrophiles disponibles et utilisées
couramment en recherche equine en portant une attention particulière au degré de
pureté cellulaire qu'elles permettent d'obtenir et à leur potentiel à modifier certaines
caractéristiques des cellules isolées.

J
 24

l- La centrifugation
n
Plusieurs techniques d'isolement font appel au principe de centrifugation. En fait,
les méthodes de séparation par centrifugation sont les plus utilisés pour séparer des
cellules de densité ou de taille différentes. La méthode isopycnique abordée plus bas
est particulièrement efficace pour séparer les cellules de densités différentes.
Toutefois, la plupart des cellules ne présentent pas de grande différence de densité
mais varient considérablement en taille (Pretlow et Pretlow 1982). En effet, la
densité de la majorité des cellules de mammifères se situent entre 1.01 et 1.005 g/ml
alors que la taille de ces mêmes cellules varie de 2.5 à 15 |^m de diamètre (Sharpe
1988). Reprenons sommairement l'ensemble de ces techniques.

Le principe de la centrifugation est fort simple et intuitif. Il s'agit en effet de faire

rotationner les cellules autour d'un axe iïxe afin d'exercer sur elles une force

(calculée en g) qui les poussera vers la périphérie à travers un milieu liquide de

densité variable (Pretlow et al. 1975; Sharpe 1988). La vitesse et le taux de descente
f^
D ou de sédimentation varieront en fonction de la densité cellulaire et de la dimension

des cellules (Pretlow et Pretlow 1982).

Grossièrement, il existe deux types de centrifugation pour la séparation cellulaire :

l) différentiel de taille et 2) gradient de densité. Dans la première méthode, un
milieu homogène de densité similaire à la population cellulaire recherchée est utilisé.
Puisque la densité des cellules et du milieu est semblable, les cellules se séparent en
fonction de leur taille. Dans la deuxième méthode, comme le nom le suggère, un
milieu hétérogène est utilisé et la densité augmente vers le bas du tube. Cette
méthode est également subdivisée en deux principes différents : l) "rate zonal" et 2)
isopycnique. La technique "rate zonal" utilise une faible densité de milieu et les
cellules se séparent selon leiir différence de taille alors que la technique isopycnique
utilise une milieu de haute densité de sorte que les cellules se séparent selon leur
différence de densité (Sharpe 1988). Dans les prochains paragraphes, nous

J
 25

accorderons une attention particulière au gradient de centrifugation puisque c'est la

^ méthode la plus utilisée pour la séparation de leucocytes.

a- Formes et composition des gradients

Il existe deux formes de gradient de densité : les gradients continus et discontinus.

Comme leur nom le suggère, dans un gradient continu la densité du milieu augmente
graduellement vers le bas du tube alors qu'un gradient discontinu consiste en une
série de solutions de différentes densité disposées en couches successives dans le
tube (Pretlow et al. l 975). La centrifugation isopycnique peut utiliser les deux
formes de gradient alors que la centrifugation "rate zonal" utilise généralement un
gradient continu puisque des bandes artéfactuelles peuvent se former à l'interface de
chacune des couches.

La composition des gradients est très variable et il existe différentes formes

disponibles commercialement. Plusieurs caractéristiques sont recherchées lors de la
synthèse des gradients de densité. Parmi celles-ci, mentionnons : l) le médium doit
être inerte et non-toxique pour les cellules; 2) le milieu doit être soluble dans
plusieurs types de tampons afin de produire un large éventail de densités pour cibler
plusieurs types de population cellulaires; 3) le milieu doit facilement être lavable des
cellules afin de permettre le bon fonctionnement des tests qui seront effectués
ultérieurement sur les cellules isolées.

b- Sucrose

Le sucrose est un gradient de densité très efficace pour la centrifugation rate-zonale.

Toutefois, il est très peu utile pour la séparation des cellules puisque son osmolarité
est très grande. En effet, à des densités inférieures à 1.15g/ml (environ 35%
poids/volume), son osmolarité est dangereusement hypertonique (supérieure à 290
mOsm).

J
 26

e- Ficoll
0
Le Ficoll (Ficoll 400) est une molécule synthétique de haut poids moléculaire qui a
été conçue en vue d'une utilisation pour la séparation cellulaire. Des mélanges de
Ficoll et de métrizoate de sodium (Hypaque) ont été utilisés pour la séparartion des
lymphocytes et des monocytes à partir d'échantillons sanguins (Pretlow et al. 1975).
Les solutions de Ficoll peuvent seulement être produites pour fournir une densité
entre 1.00 et 1.17 g/ml. Les solutions de moins de moins de 20% (poids/volume) ou
1.07 g/ml sont osmotiquement inertes. Toutefois, à des concentrations supérieures,
la force osmolaire augmente rapidement de même que le risque de lyse cellulaire;
c'est ce qui explique cette limitation dans les densités disponibles. De plus, il a été
proposé que cette méthode d'isolation cellulaire pouvait sélectionner
préférentiellement certaines sous-populations de lymphocytes et de monocytes au
detriment des autres populations cellulaires présentes (Aiuti et al. 1974).

d- Milieux iodés

0
L'utilisation de solutions aqueuses iodées de faible poids moléculaire est l'une des
plus récentes innovation dans le domaine de l'isolement cellulaire par centrifugation.
Le Métrizamide (2-(3-acétamido-5-N-méthylacétamido-2,4,6-tri-iodobenzmido)-2-
deozy-D-glucose) et le Nycodenz (N,N-bis (2,3-dihydroxypropyl)-5-(N-(2,3-
dihydroxypropyl)acetamido)-2,4,6,-triiodo-isophthalamide) sont les deux
représentants les plus connus de cette classe de gradient de densité. Le Métrizoate
de sodium est particulièrement utilisé pour la séparation des lymphocytes du sang
entier et peut aussi être utilisé pour la séparation des polymorphonucléaires. Les
solutions de Nycodenz sont particulièrement populaires puisqu'elles peuvent être
autoclavées. Les milieux iodés présentent l'avantage d'offrir une osmolarité
compatible avec une excellente viabilité cellulaire.

J
 27

e- Percoll
0
Le Percoll est une suspension de particules colloïdales qui est spécifiquement
préparée pour l'isolation cellulaire. Ces particules sont recouvertes de polyvinyl-
pyrrolidine (PVP) afin de les stabiliser et de diminuer leurs interactions avec le
matériel biologique. Depuis son introduction sur le marché, le Percoll a été
largement utilisé pour la séparation cellulaire par centrifugation isopycnique. Il
permet d'obtenir une excellente viabilité cellulaire et est facilement lavable de la
surface des cellules. Son principal désavantage est attribuable à sa nature
particulaire. En effet, les particules de Percoll sont facilement phagocytables par les
cellules phagocytaire et cela a pour effet d'augmenter la densité de ces derniers et
produire des bandes artéfactuelles.

2- Selection magnétique des cellules

Le principe général de cette catégorie d'isolement cellulaire consiste à fixer des

molécules magnétiques à la surface des cellules et de faire passer ces dernières dans
un puissant champ magnétique afin de les sélectionner. Cet ensemble de techniques
est généralement utilisé dans le but d'obtenir de hauts taux de pureté cellulaire, à un
coût raisonnable et de façon rapide (Owen et Sykes 1984).
Une grande variété de particules magnétiques (microsphères) ont été produites pour
ce genre de technique. Idéalement, ces billes magnétiques doivent être très petites,
se lier de façon spécifique à la population recherchée et, par surcroît, ne doivent pas
entraîner l'agglutination cellulaire. Il existe deux principaux types de particules: l)
les particules avec des champs magnétiques permanents et 2) les particules dont le
magnétisme doit être induit en appliquant un fort champ magnétique. Le
désavantage majeur de l'utilisation de la majorité de ces particules est leur capacité à
activer les cellules sur lesquelles elles se fixent. Dans certaines circonstances de
recherches, cela ne représente pas un problème majeur alors que dans d'autres (ex.
évaluation du potentiel de phagocytose des neutrophiles ou des macrophages), cela
modifie certaines caractéristiques cellulaires importantes pouvant influencer la

^ nature des résultats et les conclusions tirées.

 28

n Une variation de cette technique existe et consiste à fixer des billes magnétiques à
des anticorps dirigés spécifiquement contre des épitopes des cellules recherchées
(Papadimitriou et al. 1995). Toutefois, les billes utilisées demeurent relativement
grosses en rapport avec la taille des cellules et peuvent entraîner des problèmes
d'activation et d'agglutination lors du processus de séparation.

En 1988, une nouvelle technologie basée sur la sélection magnétique a été

développée sous le nom de sélection cellulaire avec anticorps magnétique (MACS)
(Miltenyi et al. 1990) et améliorée afin de répondre aux critères de sélection
cellulaire mentionnés précédemment. Le principe est le même que celui des autres
techniques de sélection magnétique mais les dimensions des billes magnétiques
utilisées sont comparativement très inférieures à celles des technologiques
antérieures. Les MicroBeads® para-magnétiques possèdent un diamètre d'environ
50 nm (Miltenyi et al. 1990), ce qui est comparable aux dimensions d'un virus et
environ un million de fois plus petit qu'une cellule eucaryote standard
3 (renseignements fournies par la compagnie Miltenyi Biotec et disponible à l'adresse
électronique http://www.miltenyibiotec.com/). Ces billes sont fixées à des anticorps
dirigés contre des antigènes spécifiques d'une population cellulaire ou d'un
anticorps primaire. Puis les cellules sont passées dans une coloime insérée dans un
champ magnétique très puissant. En raison de la faible taille des billes et de leur
capacité à se dégrader, il n'est pas nécessaire de les enlever de la surface des cellules
après une sélection positive (Miltenyi et al. 1990). Il existe une variante de cette
technique qui consiste à diriger l'anticorps couplé aux billes magnétiques à un
anticorps primaire dirigé vers l'épitope cellulaire visé. Cette alternative permet de
bénéficier d'une plus grande variété d'anticorps.

3- Activation des neutrophiles induite par les méthodes d'isolement

Il existe un nombre relativement modeste de publications scientifiques traitant de

l'activation des neutrophiles suite à une ou des méthodes d'isolement cellulaire.
J
 29

Parmi les travaux portant sur le sujet, mentionnons une étude de Zahler et al. (1997)
n qui est particulièrement intéressante. En effet, on y démontre que l'isolement de
neutrophiles sanguins humains à l'aide d'une centrifugation avec gradient de densité
altère l'état d'activation des neutrophiles alors que l'isolement avec MACS ne
semble pas l'altérer. Par ailleurs, une autre étude abonde dans le même sens et
démontre aussi l'alteration des certaines molécules de surface des neutrophiles de
ruminants suivant une centrifugation avec gradient de densité (Vachiery et al. 1999).
Bien que ces études aient été réalisées chez d'autres espèces que chez le cheval, elles
suggèrent fortement que l'utilisation des méthodes d'isolement basées sur la
selection magnétique est souhaitable lorsque la purification des neutrophiles est
recherchée.

Ill- LA REACTION EN CHAÎNES DE LA POLYMÉRASE fPCR)

A- Introduction

0 Depuis son introduction en recherche dans les années 1980, la réaction en chaînes de
la polymérase est rapidement devenue une technique de base essentielle et largement
utilisée dans les laboratoires de recherche et de diagnostic. Depuis 1985, le nombre
de citations sur le sujet dans la littérature s'est accru de manière exceptionnelle. En
effet, il existait en 1986, 61 citations de PCR dans la littérature alors qu'en 1995, il
en existait plus de 60000 (Newton et Graham 1997). Les applications de cette
technique se sont également multipliées à un rythme accéléré. Ainsi, la PCR est
aujourd'hui utilisée pour la caractérisation d'acide ribonucléique messager (ARNm)
et de gènes, le clonage, le diagnostic de pathogènes, la détection de mutations,...
Dans les prochains paragraphes, nous décrirons brièvement les principes généraux
de la technique de réaction en chaînes de la polymérase et ses applications pour la
détection d'ARNm.

^)
 30

B-La PCR
n
La PCR a été décrite pour la première fois en 1986 (Mullis et al. 1986). Elle permet
d'augmenter de manière considérable la quantité d'acide désoxyribonucléique
(ADN) dont on dispose initialement (J.Etienne 1999). Par définition, la réaction en
chaînes de la polymérase est une technique in vitro qui permet l'amplification
enzymatique d'une région précise d'un segment d'ADN comprise entre deux courtes
régions dont les séquences sont connues (amorces) (Saiki et al. 1988). Lors d'une
reaction d'amplifîcation, l'ADN double-brins est initialement chauffé et se dénature
pour former une molécule simple-brin. Cette première étape s'appelle la
dénaturation. La température est ensuite abaissée pour permettre rattachement des
amorces (étape de rattachement). L'élongation est l'étape diu-ant laquelle l'enzyme
ADN polymérase allonge les segments adjacents aux amorces vers l'extrémité 5' du
segment d'ADN à une température précise. L'ensemble de ces étapes représente un
cycle d'amplification et chaque nouveau brin d'ADN formé mène en la synthèse de
nouveaux brins lors des cycles subséquents (voir figure 2).
D
L'amplification d'ADN par la PCR est un processus exponentiel qui se traduit par
l'équation suivante : P=T(1+E)N où N est le nombre de cycles, E l'efficacité de la
reaction de PCR (entre 0 et l) et T le nombre de copies d'ADN présentes dans
l'échantillon de départ (Newton et Graham 1997; Freeman et al. 1999). Cette
formule mathématique met en valeur la nécessité de maximiser l'efficacité des
protocoles d'extraction d'ARN, de synthèse d'ADN complémentaire et de PCR afin
d'obtenir des résultats qui se rapprochent le plus de la réalité (Freeman et al. 1999).
Une différence d'effîcacité d'amplification d'aussi peu que 5% entre deux
échantillons identiques peut faire varier la quantité du simple au double après
seulement 26 cycles d'amplification (Freeman et al. 1999)! Pour une réaction de
PCR normale, on estime l'amplification après 20 cycles à 10 fois avec une réaction
dont l'efficacité est de 70% (Newton et Graham 1997). Plusieurs facteurs
interviennent afin de diminuer l'efficacité d'une réaction. De façon générale, ces
facteurs se manifestent après 25 à 30 cycles (Newton et Graham 1997) puisque la
J
 31

quantité d'enzyme disponible devient limitée en raison de l'augmentation importante

n des produits amplifiés. De plus, l'activité enzymatique diminue de façon non-
négligeable dû à la dénaturation thermique de l'enzyme durant le processus
d'amplification (Newton et Graham 1997). D'ailleurs, les compagnies fournissent
des taq polymérases de plus en plus résistantes à la chaleur, ce qui contribue à
conserver leur efficacité au fur et à mesure que le nombre de cycles augmente.

)
 32

n 1'
A
3' -e 5'

t
5' 3'
^—1^X1
B
CYCLE 1 k 3' 5'

M.
5' 3'
L r<\vi
e

^ 3' 5'

M.
r 5> -e 3'

mrm —>
L ^sxs]
D ^—F^XI
D

CYCLE 2 < 5'

ï
5' 3'
5'
3'
^ G ^N?a

^s^s^

Illustration 2 - Représentation de deux cycles de PCR. La lettre A indique l'étape

de dénaturation, la lettre B indique l'appariement des amorces et l'élongation des
fragments vises et la lettre C indique le résultat final après l'elongation.

J
 33

l- Instruments et réactifs

Dans revolution de la PCR, deux innovations ont particulièrement contribués à

l'avancement de la technique : l'utilisation d'ADN polymérase thermostables (Saiki
et al. 1988) et le développement de thermocycleurs automatiques (Newton et
Graham 1997). La première à simplifié la procédure de façon importante et permis
l'utilisation de hautes températures pour augmenter la spécificité et la sensibilité de
la technique ainsi que la pureté et la longueur des produits à amplifier (Saiki et al.
1988). Le développement des thermo cycleurs à permis l'automatisation de la
procédure et un gain de temps considérable. Aujourd'hui, il existe plusieurs
procédés utilisés pour le refroidissement et le réchauffement des échantillons
(Newton et Graham 1997). Plus récemment, le développement de capillaires de
plastique ou de verre dans un système thermo-cycleur conventionnel (utilisant un
bloc de métal ou système d'air pour le réchauffement et le refroidissement des
échantillons) permet de réaliser une réaction en chaînes de polymérisation de 30
cycles en moins de 30 minutes (Wittwer et al. 1990).

Les ADN polymérases thermostables du Thermus aquaticus (Saiki et al. 1988),

communément appelées Taq, sont les plus couramment utilisées dans les réactions
de PCR (Newton et Graham 1997). L'ADN polymérase Taq possède une vitesse
d'élongation de 35-100 nucléotides par seconde à 70-80 C. Plusieurs formes de Taq
recombinantes sont maintenant disponibles sur le marché et possèdent des
caractéristiques spécifiques dont l'ajout de nucléotides adénine au bout 3' du produit
amplifié pour le clonage et la capacité à s'activer complètement ou partiellement
avec une étape de chauffage additionnelle (hot start) (Newton et Graham 1997).

Les autres réactifs impliqués dans une réaction de PCR incluent les
déoxynucléosides triphosphates (dNTP) qui sont en fait les nucléotides qui
formeront les nouveaux amplicons lors de l'elongation. Le magnésium est un
constituant important d'une réaction de PCR. En effet, l'ADN polymérase Taq est
J
 34

très sensible à la présence d'ions magnésium (Erlich et al. 1989). Ainsi, à des
~) concentrations de 2.0 mM, le chlorure de magnésium maximise l'activité ADN
polymérase de la Taq alors que des concentrations supérieures exercent un effet
d'inhibition (Erlich et al. 1989). D'autres auteurs rapportent des concentrations
optimales de 0.5 à l mM pour des segments d'ADN génomique (Erlich et al. 1989).
Les amorces sont des constituants primordiaux d'une réaction de PCR. La
spécificité et la sensibilité d'une réaction sont étroitement reliées à la qualité des
amorces. Les concentrations optimales d'amorces varient largement selon leur
sequence, leur cible et le fragment d'ADN visé et se situent entre 0.1-1.0 ^lM (Erlich
et al. 1989). En général, leur longueur varie de 20 à 30 nucléotides et le nombre de
chacun des nucléotides doit idéalement être égal (Newton et Graham 1997).

2- Inhibiteurs de PCR

Ils existent plusieurs substances ayant un potentiel inhibiteurs sur une réaction de
PCR. Parmi celles-ci, certaines sont communément retrouvées dans l'ensemble des
3 protocoles qui mènent à l'élaboration de la réaction en chaînes de la polymérase.
L'ADN utilisé est généralement issu de spécimens biologiques obtenus de cellules
sanguines, d'urine, de selles, de biopsies et autres tissus ou liquides biologiques.
Plusieurs de ces préparations contiennent des substances inhibitrices qui n'ont pas
été identifiées encore mais qui requièrent l'utilisation de contrôles rigoureux
(Newton et Graham 1997). Parmi ces substances, notons l'héparine, un
anticoagulant fréquemment utilisé lors de la récolte de sang.

L'extraction d'ADN de différents spécimens fait couramment appel à des détergents

pour la lyse cellulaire et la dénaturation. En général, les détergents non-ioniques
sont utilisées et ne semblent pas interférer avec l'amplification de l'ADN à des
concentrations allant jusqu'à 5% (Newton et Graham 1997). Toutefois, les
détergents ioniques tels que le sulfate dodecyl de sodium (SDS) sont tolérés à des
concentrations minimes. Généralement, ces substances sont utilisées à des
concentrations de 1-2% (poids/volume) et elles inhibent la Taq polymérase à des
J
 35

concentrations supérieures à 0.01%. Lorsqu'utilisées, elles doivent être enlevées par

~) une extraction au phénol et une précipitation de l'ADN à l'éthanol (Newton et
Graham 1997). Par ailleurs, plusieurs procédures d'extraction à base de détergents
contiennent la protéinase K, une protéase qui digère les protéines dénaturées. La
Taq polymérase est susceptible à cette digestion et cette protéinase doit être enlevée
ou inactivée. La dénaturation thermique à 95°C est suffisante pour arriver à cette fin
et elle est normalement suivie par une extraction au phénol qui dénature la
protéinase (Newton et Graham 1997).

IV- LA TRANSCRIPTION INVERSÉE fRT)

L'évaluation de l'expression d'un gène était jadis possible grâce à l'utilisation de la

technique de buvardage de type northern (Alwine et al. 1977). Toutefois, cette
méthode requiert beaucoup d'ARN et de temps (Freeman et al. 1999).
L'avènement de la PCR et sa combinaison avec la transcription inversée ont permis
l'utilisation de la RT-PCR pour la qualification et la quantification de l'ARNm
(Becker-Andre et Hahlbrock 1989; Gilliland et al. 1990). L'amplification de l'ARN
par PCR est possible en liant une amorce au brin d'ARN visé et en synthétisant un
brin d'ADN complémentaire (ADNc) en utilisant une enzyme transcriptase inverse
(Belyavsky et al. 1989; Newton et Graham 1997). Deux principaux types
d'enzymes sont disponibles commercialement : le virus Moloney de la leucémie
murine (MMLV-RT) et le vims de la myéloblastose aviaire (AMV-RT) (Freeman et
al. 1999). Le choix de l'une ou l'autre est basé sur les préférences personnelles et le
coût. Une amorce d'oligonucléotides est requise pour initier la synthèse du cDNA.
Cette amorce se lie à l'ARN et l'ADN complémentaire est synthétisé vers le bout 5'
de l'ARNm. Les amorces peuvent être spécifiques du gène ou non-spécifiques
(Freeman et al. 1999). Les amorces non-spécifîques peuvent être composées de
résidus désoxythymidine (oligo(dT)) qui se lient à la queue polyadénylée (polyA) de
la majorité de l'ARNm des eucaryotes (Freeman et al. 1999). Alternativement, une
amorce spécifique peut être utilisée pour la réaction de RT. Pour les échantillons
pauvres en ARNm ciblé, l'utilisation d'amorces spécifiques augmente la spécificité
J
 36

et diminue le bruit de fond associés à l'utilisation d'amorces non-spécifîques

~) (Freeman et al. 1999). Il est ensuite possible de procéder à l'amplification de
l'ADNc par un protocole de PCR conventionnel (Mullis et Faloona 1987). La figure
3 schematise une réaction de RT réalisée avec une amorce non-spécifique oligo (dt).

ARN polyA+

5' J- A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A 3'

i
5' _|- A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A 3'
111111111111

Amorce polyT

t
5' ^ A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A 3'
^ l
ï-1
111111111111

ADN comolémentaire

Illustration 3 - Schématisation de la formation d'un brin d'ADN complémentaire à

partir d'un segment d'ARN total (transcription inversée) à l'aide d'une sonde non-
spécifique oligo-dT

J
 37

^ ARTICLE SOUMIS À L'EOUINE VETEmNARY JOURNAL

Equine neutrophils express mRNA for tumor necrosis factor-a, interleukin (IL)-
S, IL-6, IL-8 and macrophage-inflammatory-protein-2 but not for IL-4, IL-5 and
interferon-Y

Philippe Joubert, David W. Silversides* and Jean-Pierre Lavoie

Department of Clinical Sciences and *Biomedicine,

Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Montréal,
C.P. 5000, St-Hyacinthe, Québec, Canada, J2S-7C6

Keywords: neutrophil, cytokine; chemokine, equine, mRNA

Word count: 3317

J
 38

Summary
")
The aim of the present study was to investigate the capacity of equine neutrophils to
produce cytokine mRNA after in vitro stimulation. Neuu-ophils were purified using
magnetic antibody cell separation and stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and N-
formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine. RT-PCR was performed on mRNA
isolated before and after 5 hours and 20 hours of in vitro stimulation. TNF-a, IL-1(3, IL-
6 and IL-8 mRNA were expressed by unstimulated and stimulated neutrophils while
MIP-2 mRNA expression was only seen in neutrophils stimulated for 5 hours. IL-4, IL-
5 and IFN-y mRNA expression was not detected in neutrophils at any time period. These
findings open new fields of investigation for equine neutrophilic inflammatory diseases.

J
 39

Introduction
^
Neutrophils are the first inflammatory cell to be recruited in response to cell damage,
invading pathogens and allergens. Because neutrophils were regarded as terminally
differentiated cells, devoid oftranscriptional activity, their fiznction has long been
considered to be restricted to an effector role primarily through phagocytosis and the
generation of reactive oxygen species and the release ofproteolytic enzymes and lipid
mediators (Weiss 1989; Cassatella 1995). Recent findings showing that neutrophils are
capable of de novo protein synthesis, and express receptors that have been implicated in
diverse inflammatory reactions, have raised the possibility that they may play a more
active role in the immune response than previously believed, notably in the first step of
an inflammatory reaction (Lloyd and Oppenheim 1992; Gounni et al. 2001).
Furthermore, early recruitment ofneutrophils has been shown to be required for the
induction of a polarized TH 1-type cell response in a model of bacterial pneumonia,
suggesting that they may be a crucial cell population bridging innate response and the
cell mediated immunity (Tateda et al. 2001b). Cytokines produced by neutrophils are of
D particular interest, due to their broad spectmm of biological activities (Cassatella 1995).
Among the various cytokines that have been shown to be produced by human
neutrophils, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-1(3 and IL-6, which are potent
proinflainmatory cytokines, and the chemokines IL-8 and macrophage inflammatory
protein (MIP)-2, which have been implicated in the immunomodulation of the acute
phase response (Cassatella 1999), are likely to play an active role in the pathogenesis of
equine neutrophilic diseases.
Reported studies have primarily focused on human neutrophils, and to our knowledge,
only IL-1 mRNA expression by bovine neutrophils has been reported in domestic
animals (Canning and Neill 1989; Beckman et al. 2000). As part of a larger study
evaluating the role of cytokines in the immunoregulation of heaves, a condition of
horses characterized by pulmonary neutrophilia, the aim of the present study was to
investigate the capacity of equine neutrophils to express mRNA for TNF-a, IL-1(3, IL-6,
IL-8 and MIP-2. We also sought to determine whether equine neutrophils express
mRNAs for IL-4, IL-5 and DSTF-P, which are landmark Th2 and Thl-type cytokines, as
J
 40

our group has recently reported possible implication of these cytokines in heaves
-) (Lavoie et al. In press).

Materials and methods

Neutrophil isolation

Blood was drawn from the jugular vein of healthy adult horses in sterile heparinized
vacutainer tubes and allowed to sediment at room temperature for 30 to 40 minutes.
Neutrophils were isolated using magnetic antibody cell separation (MACS) and a
method modified from that described by Zahler et al. (1997). Briefly, the leukocyte rich
fraction was centrifùged at 500g for 5 minutes and the cell pellet was washed once with
degassed phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 0.5% low endotoxin fetal
bovine sérum1 (FBS) and 2 mM EDTA2 (PBS-buffer). The cells were incubated for 5
minutes on ice with a monoclonal antibody directed against CD90 of equine
neutrophils , centrifuged at 500g and the cell pellet was resuspended with degassed
D PBS-buffer. This was repeated two times to wash the cells. Cells were then incubated
with an anti-mouse IgM antibody conjugated with microbeads for 5 minutes on ice,
centrifuged, and resuspended in 3 ml of degassed PBS-buffer. A separation column5
was mounted on a magnetic support and washed at room temperature with 1 ml of
degassed PBS-Buffer. The magnetically labeled cells were then loaded onto the
column. The column was rinsed three times with 1 ml of degassed PBS-buffer, then
removed from the magnetic field and flushed with 3 ml ofPBS-buffer. Immediately
after isolation, neutrophils were suspended in culture medium6 at a concentration of
5x106 cells/ml and supplemented with 10% low endotoxin FBS, 2 mM ofL-glutamine,
lOOU/ml of penicillin and lOOug/ml of streptomycin7.
Total cell counts were determined using a hemacytometer and viability was assessed by
the Trypan blue dye exclusion test. The differential cell counts were determined on
cytospin slides stained with Wright-Giemsa. At least four hundred cells from each
specimen were counted.

J
 4l

In vitro cell stimulation

^
Freshly isolated neutrophils (l x 10 ) were incubated at 37°C for 5 or 20 hours with 10
nM ofN-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine (Cassatella et al. 1995b) and
100 ng/ml oflipopolysaccharide11 (LPS) (Zallen et al. 1999). After incubation, the cell
viability was assessed as previously described. Equine peripheral blood leukocytes
(PBL) stimulated with 100 ng/ml ofLPS and 16 nM (100 ng/ml) ofPhorbol 12-
Myristate 13-Acetate12 (PMA) (Arnold et al. 1994) for 20 hours were used as a positive
control. Neutrophils before and after in vitro stimulation were suspended in TRIzol13
and stored at -80 C until further analyses. All the reagents and solutions used
throughout the experiments were prepared with RNase and endotoxin-free material.

Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total cellular RNA was extracted from neutrophils with TRIzol according to the
manufacturers instructions. Briefly, RNA pellets were dissolved in RNase- and DNase-

D free water . The cDNA strand was generated in a 30 p.1 reaction, using 0.4 to 0.8 |^g of
total RNA as template, oligo(dT)12-18 primer and reverse-transcriptase enzyme , in the
presence ofribonuclease inhibitor . The PCR mixture consisted of 1.5 mM MgCl2, IX
PCR buffer, 0.25 mM dNTP mixture17 , 2.5 units Taq polymerase18, 20 pmol each of the
sense and antisense primers, as well as 1 to 2.5 |^1 of the synthesized cDNA strand. The
samples were amplified in a thermal cycler for 35 to 37 cycles (32 cycles for IFN-y)
consisting of 45 sec of denaturation at 95 C, l min annealing at the specific primer
annealing temperature (60°C or 61 C), and l min of extension at 72 C as reported by
Giguère et al. (1999). PCR primer sequences used for (3-actin, IFN-y, TNF-a, IL-1(3,
IL-4, IL-6 and IL-8 were those reported by Giguère et al (1999). MIP-2 primer
sequences were as reported by Franchini et al. (1998). The IL-5 primers (forward, 5'
ACGTCTGTGCCCTTGCTGTAGAAAGT; reverse, 5'-
GGTAGTCTAGGAATTGTTTCACTCTCC) were designed using Genbank sequence
ECU91947. With the exception ofMIP-2, all primers were selected to amplify across
exon-intron boundaries to allow discrimination of amplified genomic DNA and cDNA
J sequences. PCR products were visualized by ethidium bromide staining (5%) after 1.5
 42

% agarose gel electrophoresis, using a phosphoimager21. The correct band size was
n determined by comparison with a DNA molecular weight marker .

Sequencing ofRT-PCR products

Amplified products were purified using a gel extraction kit23, ligated into a plasmid24
vector and transformed into bacteria . Plasmids representing each cytokine were
amplified in bacteria and purified using a plasmid extraction kit method2 . DNA
sequencing of one strand of each plasmid was performed using an automated
sequencer2 .

Results

Neutrophils accounted for 99.5% of the cells isolated by MACS with a viability of 98%
(T=0 and T=5h) and 90% (T=20h). Figure 1 reports the temporal cytokine mRNA
expression by neutrophils stimulated with LPS and fMLP and purified using MACS.

D TNF-a, IL-Ip, IL-6 and IL-8 mRNA were expressed by unstimulated and stimulated
neutrophils while MIP-2 mRNA expression was only seen in neutrophils stimulated for
5 hours. IL-4, IL-5 and IFN-y mRNA expression was not detected in neutrophils at any
time period.
Sequences of ampliiïed gene products were found to be homologous to reported equine
sequences for |3-actin, IFN-y, TNF-a, IL-lp, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-8 (Genbank #
AF035774, ECU04050, AB035735, ECU92481, AF305617, ECU91947, ECU64794
and AF062377, respectively). Amplified sequences for equine MIP-2 showed 83.3%
homology with the human sequence (Genbank # AF043340).

J
 43

Discussion

~)
The results of the present study indicate that equine neutrophils have the ability to
produce mRNA for TNF-a, IL-lp, IL-6, IL-8 and MIP-2, but not IFN-y, IL-4 and IL-5,
and that expression of individual cytokine mRNA varies according to the state and
duration of cell activation. These results support the concept that neutrophils should not
only be considered as active elements in the inflammatory response, but also as a cell
that may significantly influence the direction and evolution of immune processes
through cytokine secretion (Cassatella 1995).
Unstimulated equine neutrophils expressed mRNA for TNF-a, IL-1(3, IL-6 and IL-8 in
the present study. The iïndings that IL-8, TN"F-a and IL-113 mRNA are present in
unstimulated cells are in agreement with the observations made by Cassatella et al.
(1992, 1999). Furthermore, these cytokines were shown to be rapidly expressed by
neutrophils following LPS stimulation using an in vivo model of acute lung
inflammation (Xing et al. 1994). The presence ofcytokine mRNA in unstimulated cells
could have resulted from preactivation ofneutrophils induced by the isolation procedure
as reported in some human studies (Altstaedt et al. 1996; Cassatella 1999). However, it
has been shown that the immunomagnetic cell selection used in the present study, unlike
gradient separation, does not activate human neutrophils (Zahler et al. 1997).
TNF-a, IL-Ip, IL-6 and IL-8 are cytokines involved in the acute phases of inflammation
(Akira et al. 1990); their constitutive mRNA has been reported in neutrophils of other
species (Cassatella et al. 1992; Melani et al. 1993; Cassatella 1999) and could represent
a pool that allows the rapid appearance of cytokines following appropriate stimulus
which could contribute to continuous inflammatory cell recruitment and activation.
MIP-2 mRNA expression by equine neutrophils was detected only after 5 hours of in
vitro stimulation. To our knowledge, and in agreement with the results of the present
study, MIP-2 mRNA expression has not been reported in unstimulated neutrophils.
MIP-2, as IL-8, is a chemokine of the C-X-C family, which exerts strong chemotactic
activity on neutrophils (Wolpe et al. 1989). Both MIP-2 and IL-8 are rapidly expressed
by neutrophils during inflammatory conditions (Bazzoni et al. 1991 a; Xing et al. 1994).

J
 44

We also investigated whether equine neutrophils expressed IL-4, IL-5 and IFN-y, which
^ are cytokines associated with either the Thl or the Th2 type response. It has been
shown that lymphocytes are the predominant source of these cytokines, although other
cells including basophils (IL-4), eosinophils (IL-5), mast cells (IL-4 and IL-5), and
natural killer cells (IFN-y) may also secrete them (Abbas et al. 2000). While expression
ofIFN-Y mRNA by neutrophils is controversial, we were unable to find a study where
the production ofIL-4 and IL-5 was evaluated in neutrophils. The results of our study
suggest that the expression ofIL-4, IL-5 and FNF-y mRNAs in a mixed inflammatory
exudate, such as found in pulmonary secretion of horses with heaves, is not likely to
originate from neutrophils. The nature of the stimulating agent for the study ofcytokine
mRNA expression by neutrophils is likely to be an important factor, especially
considering that in horses, unlike many other animal species, fMLP alone is a weak
secretagogue agonist for equine neutrophils (Brazil et al. 1998). Although it could be
argued that these cytokines may be expressed under different stimulation conditions, IL-
4, IL-5 and IFN-y mRNA were not detected when equine neutrophils were stimulated

3 with ionomycine alone or with a combination ofPMA and LPS (data not shown).
A minute contamination of the neutrophil population by lymphocytes or monocytes
would be likely to affect the cytokine profile expressed by neutrophils using a sensitive
technique such as RT-PCR. It has been shown that on a single cell basis, human
neutrophils may produce 10 to 20 fold less of a particular cytokine than monocytes
(Cassatella 1995), indicating that study ofcytokine production by neutrophils requires
highly purified cell populations. In the present study, a purity ofneutrophils of 99.5%
was achieved, which is comparable to purity obtained in similar studies using human
neutrophils (Zahler et al. 1997). The absence ofmRNA for IL-4 and IL-5, which are
cytokines produced in large amounts by lymphocytes, but not by neutrophils, indicates
that significant lymphocyte contamination did not occur.
In the present study, we showed that equine neutrophils express mRNA for various
cytokines and chemokines and that the expression is time dependent. These findings
indicate that neutrophils may play an active role in modulating equine inflammatory
diseases. Even though the cytokine production on a per cell basis has been shown in

J other species to be less in neutrophils than in mononuclear cells, this may be

 45

compensated by the large predominance ofneutrophils in many equine inflammatory

-) diseases. Although an excellent agreement between cytokine inRNA expression and
protein production by neutrophils is usually observed (Arnold et al. 1994; Cassatella et
al. 1997; Knott et al. 2001), the cytokine protein synthesis by equine neutrophils should
be confirmed in follow-up studies. The findings of the present study open new fields of
investigation for equine neutrophilic inflammatory diseases.

Acknowledgements

Thanks to Isabelle Daneau and Alexandre Boyer for their valuable technical assistance.
This study was supported by the Fonds du Centenaire of the Université de Montréal and
the Groupe de Recherche en Médecine Equine du Québec (GREMEQ).

J
 46

Manufacturers adresses
n Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada
2
Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada
3 Anti-Thyl, VMRD , Pullman, WA, USA
Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA
LS+ column, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA
6
•RPMI 1640, Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada
8
Lympholyte®-poly, Cederlane, Hornby, ON, Canada
9 Cytospin model II, Shandon, Pittsburg, PA, USA
10 Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada
11
0111; B4, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada
12 PMA, Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
13 Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
14 Sigma, St-Louis MO, USA
15 SuperscriptTM II, Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
0 RNAguard, Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfé, QC, Canada
Ultrapure dNTP set, Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfé, QC, Canada
18 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
19 TwinBlock™System, MJ EasyCycler™ Séries, Ericomp, MA, USA
20 Agarose Ultra Pure, Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
21 Fotodyne inc., Hartland, WI, USA
22 1 Kb Plus DNA ladder, Gibco BRL, Burlington, ON, Canada
Qiagen, Mississauga, ON, Canada
24 pGEM®-T , Promega, Madison, WI, USA
25 XL 1-Blue competent cells, Stratagene, La Jolla, CA, USA
2 Plasmid MAXI kit, Quiagen, Mississauga, ON, Canada
27 ABI PRISM® 377 DNA Sequencer, Applied Biosy stems, Foster City, CA
28 Pavillon de synthèse et d'analyse d'acides nucléiques. Université Lavai, QC, Canada

)
s^
 47

Figure 1. Cytokine mRNA expression by equine blood neutrophils prior to (TO)

and after 5 (T5) and 20 hours (T20) of in vitro stimulation with N-formyl-L-
methionyI-L-leucyl-L-phenylalanine (10 nM/ml) and lipopolysaccharide (100
ng/ml). Stimulated peripheral blood leucocytes were used as a positive control (+)
and cDNA-free solution served as a negative control (-). PCR products were
visualised by ethidium bromide staining after 1.5% agarose gel electrophoresis.

TO T5 T20 +

-Actin

TNF- w^^ii

IFN-
——

IL-1

IL-4

IL-5

IL-6

IL-8

MIP-2

^
 48

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J
 52

DISCUSSION ET CONCLUSION
n
Les résultats de la présente étude démontrent pour la première fois que les neutrophiles
sanguins équins ont la capacité d'exprimer de l'ARNm pour le TNF-a, l' IL-1 P, l'IL-6
et l'IL-8 et le MIP-2 mais pas pour l'IL-4, l'IL-5 et l' IFN-y en réponse à une
stimulation avec du LPS et du fMLP. La production d'ARNm varie selon la présence
ou l'absence et la durée de la stimulation cellulaire. Ces résultats suggèrent que les
neutrophiles équins devraient être considérés comme des cellules ayant le potentiel
d'influencer le type et revolution de la réponse immunitaire par la synthèse de
cytokines (Cassatella 1995; Tsiteda et al. 2001b).

Par ailleurs, les résultats obtenus révèlent aussi que les neutrophiles équins non-stimulés
expriment de l'ARNm pour le TNF-a, l'IL-lp, l'IL-6 et l'IL-8, tout comme les
neutrophiles humains (Cassatella étal. 1992; Cassatella 1999).
Les études sur la production de cytokines par les neutrophiles humains sont nombreuses.
Toutefois, deux études portant sur l'expression du gène pour l'IL-1 chez les neutrophiles
0 bovins sont, à notre connaissance, les deux seuls exemples disponibles de la production
de cytokines par les neutrophiles chez les animaux domestiques (Canning et Neill 1989;
Beckman et al. 2000). Par conséquent, le présent ouvrage s'avère une source de
données substantielle pour étoffer la littérature sur le sujet en médecine vétérinaire.
Il a été proposé par certains auteurs que la présence d'ARNm chez les neutrophiles
humains non-stimulés pourrait être la conséquence d'une pré-activation induite par le
processus d'isolation cellulaire (Altstaedt et al. 1996; Cassatella 1999). Toutefois, une
étude de Zahler et al. (Zahler et al. 1997) a démontré que, contrairement à une méthode
d'isolement conventionnelle basée sur un gradient de séparation (Percoll®), l'isolation
par sélection magnétique des cellules n'altère pas le degré d'activation des neutrophiles,
évalué par la mesure de l'expression de l'intégrine CDllb , par les changements
morphologiques et par la réaction oxydative (Zahler et al. 1997). Il faut toutefois
mentionner que l'anticorps primaire utilisé dans cette étude était dirigé contre l'antigène
de surface CD 15 alors que celui utilisé dans le cadre de nos travaux était dirigé contre le
CD90. Même si la littérature sur le sujet est inexistante, il est permis de croire que les
J
 53

changements fonctionnels induits peuvent varier selon l'antigène de surface visé.

n L'utilisation d'un marqueur tel que le CD62L, qui est rapidement relâché lors d'une
stimulation cellulaire, peut être un bon indicateur de l'état d'activation cellulaire et
aurait pu être utilisé dans le cadre de cette étude (Stibenz et Buhrer 1994).

Le TNF-a, l'IL-l(3, l'IL-6 et l'IL-8 sont des cytokines impliquées dans les réactions
inflammatoires aiguës (Akira et al. 1990). L'expression constitutive d'ARNm pour ces
médiateurs immunologiques a aussi été rapportée chez les neutrophiles humains
(Cassatella et al. 1992; Melani et al. 1993; Cassatella 1999). Chez un modèle in vivo
d'inflammation pulmonaire aiguë, le TNF-a, l'IL-l|3 et l'IL-8 sont rapidement exprimés
par les neutrophiles en réponse à une stimulation avec du LPS (Xing et al. 1994),
laissant croire qu'il existe un « pool » d'ARNm exprimé de façon constitutive par les
neutrophiles et rapidement disponible pour la synthèse protéique (Cassatella 1999).
Ainsi, suivant un stimulus approprié, la libération rapide de ces cytokines pourrait
contribuer au recrutement et à l'activation des cellules inflammatoires et ce, très

rapidement après un stress antigénique. L'IL-8 augmente la diapédèse des neutrophiles

0 et leur chimiotactisme (Huber et al. 1991) et peut conséquemment amplifier l'appel de
neutrophiles vers un site inflammatoire d'une manière autocrine et paracrine. Pour sa
part, l'IL-lp est une cytokine pro-inflammatoire qui possède plusieurs fonctions,
incluant la synthèse des protéines de la phase aiguë et le chimiotactisme de cellules
inflammatoires en induisant leur expression de molécules d'adhésion et de chimiokines
(Dinarello 1984). Nos résultats démontrent que la production d'IL-l(3 et d'IL-8 est
continue dans le temps, laissant penser que leur synthèse est nécessaire à une réaction
inflammatoire soutenue. A l'image des observations faites chez les neutrophiles
humains (Bazzoni et al. 1991a), les neutrophiles équins expriment de l'ARNm pour le
TNF-a après 5 et 20 heures de stimulation. Le TNF-a est également une cytokine pro-
inflammatoire avec de nombreuses fonctions immunobiologiques dont l'activation des
macrophages et des neutrophiles (Tracey et Cerami 1994; Edwards et Hallett 1997).

L'IL-6 induit de multiple effets biologiques sur une grande variété de cellules

u inflammatoires. Dépendemment de l'environnement où il est produit, il peut posséder

 54

des propriétés pro-inflammatoires (Akira et al. 1990; Akira et al. 1993). Cicco et al. ont
n rapporté que, après une stimulation avec le GM-CSF, les neutrophiles humains
exprimaient l'ARNm d'IL-6 pour atteindre un pic de production après 6 heures et
ensuite atteindre des niveaux plus bas après 24 heures de stimulation (Cicco et al. 1990).
Arnold et al. (1994) ont aussi observé un phénomène similaire chez des neutrophiles
humains stimulés avec le complexe anticorps-virus syncytial respiratoire . Nos résultats
sont en accord avec ces observations. En effet, ceux-ci indiquent une production
d'ARNm supérieure après 5 heures de stimulation et des niveaux plus bas après 20
heures de stimulation. Bien que l'expression constitutive d'ARNm d'IL-6 par les
neutrophiles ne soit pas un résultat unanime parmi les études qui s'y sont intéressées, il
n'en demeure pas moins qu'il s'agit d'une cytokine qui partage beaucoup de similitudes
avec les autres cytokines mentionnées précédemment dont l'expression d'ARNm chez
les cellules non-stimulées est unanime (Akira et al. 1990). En effet, il est connu que la
synthèse d'IL-6, par les neutrophiles pourrait stimuler la prolifération de leur propre
cellules souches en induisant un rétro-contrôle positif (Cicco et al. 1990). L'IL-6 est
aussi rapportée comme étant une cytokine majeure dans l'induction de la synthèse de
0 protéines de la phase aiguë par le foie (Akira et al. 1993). Ces protéines sont très
importantes dans les premières étapes de la réponse immunitaire innée puisque que
certaines d'entre elles agissent comme des opsonines très puissantes et que d'autres sont
impliquées dans la cascade du complément (Cicco et al. 1990). Il y a donc lieu de croire
qu'une synthèse précoce de l'IL-6 est nécessaire à une mise en branle rapide et efficace
de la réponse immunitaire innée.

L'expression d'ARNm pour MIP-2 par les neutrophiles a été détectée après 5 heures de
stimulation. En accord avec les observations faites chez les neutrophiles humains,
l'ARNm de MIP-2 ne semble pas être exprimé de façon constitutive chez les
neutrophiles non-stimulés. MIP-2 est une chimiokine qui exerce une forte activité
attractive sur les neutrophiles (Wolpe et Cerami 1989). A l'image de l'IL-8, elle est
exprimée rapidement par les neutrophiles durant un processus inflammatoire (Bazzoni et
al. 1991b; Xing et al. 1994). L'apport du MIP-2 dans le chimiotactisme des
neutrophiles n'est pas un phénomène complètement élucidé bien qu'une étude réalisée
^
 55

par Tateda et al. chez un modèle d'inflammation pulmonaire murin démontre qu'il
n existe une bonne corrélation entre la relâche de la protéine et la migration des
neutrophiles dans les poumons (Tateda et al. 2001 b). Contrairement aux résultats
obtenus avec les neutrophiles équins stimulés in vitro, la présence d'ARNm est soutenue
pendant 48 heures dans cette étude, mettant en relief le fait que la nature du stimulus et
les conditions de culture pourraient être des éléments importants dans l'induction de la
synthèse d'ARMm. La production d'IL-4, d'IL-5 et d'IFN-y par les neutrophiles équins
a aussi été investiguée. L'IL-4 et l'IL-5 sont deux cytokines associées avec une réponse
de type Th2 alors que l' IFN-y est associée à une réponse de type Thl . Il est aujourd'hui
bien recoimu que les lymphocytes représentent la source principale d'IL-4 et d'IL-5 bien
que plusieurs autres populations cellulaires possèdent aussi ce pouvoir de synthèse
(Abbas et al. 2000). Jusqu'à tout récemment, la production de ces deux cytokines par
les neutrophiles n'avait jamais été rapportée. Toutefois, Brandt et al. ont récemment
démontré que les neutrophiles humains produisaient l'ARNm d'IL-4 et la protéine en
quantité significative en réponse à des stimulus particuliers (Brandt et al. 2000). Chez
les neutrophiles équins, il nous a été impossible de démontrer la présence d'ARNm chez
0 les cellules non-stimulées et stimulées et ce, même en utilisant un ionophore comme
agent stimulant (données non montrées). Considérant la faible quantité d'ARNm, il
convient de croire que la réaction de RT-PCR pour la détection de cette cytokine
nécessite des conditions optimales ainsi qu'un nombre plus élevé de cycles de PCR.

L' IFN-Y est une cytokine très importante dans l'activation et l'immunité cellulaire. Tel
que mentionné précédemment, elle est aussi associée avec une réponse cellulaire de type
Thl et est principalement produite par les lymphocytes T et les cellules NK (Farrar et
Schreiber 1993). Sa synthèse par les neutrophiles humains est maintenant un fait
accepté (Yeaman et al. 1998; Brandt et al. 2000). Yeaman et al. (1998) ont mis en
evidence la protéine de l'IFN-y à l'intérieur du cytoplasme des neutrophiles de même
que dans le surnageant lorsque les cellules en culture étaient stimulées avec du facteur
stimulant des colonies de granulocytes (G-CSF) et/ou avec de l'IL-12 . Fait intéressant
à noter, l'induction de la synthèse d'IFN-y par les neutrophiles semble nécessiter des

^ stimulus particuliers. En effet, dans son étude. Keel et al. (1997) ont été incapable de
 56

démontrer la synthèse d' IFN-y par les neutrophiles humains stimulés avec du LPS
n pendant 16 heures. De même, les études précédentes n'avaient pas été en mesure de
démontrer la présence de l'ARNm ou de la protéine (Lloyd et Oppenheim 1992;
Cassatella 1995) mettant en relief la nécessité d'utiliser le stimulus approprié pour cette
cytokine. Ainsi, cela pourrait expliquer l'absence d'ARNm chez les neutrophiles
stimulés avec le LPS et le fMLP, résultat obtenu dans notre étude. Malheureusement,
les agents stimulants tels que l'IL-12 et le G-CSF recombinants équins ne sont pas
encore disponibles commercialement. Des études futures seront nécessaires afin de
compléter les observations obtenues au cours du présent projet de recherche.

Un aspect important à considérer lors de l'étude de la production de cytokines par les

neutrophiles est la contamination des échantillons étudiés par d'autres populations
cellulaires. En effet, dépendemment de la cytokine, les neutrophiles possèdent 10 à 20
fois moins d'ARN par cellule et produisent de 10 à 300 moins de protéines qu'une
cellule mononucléaire (monocyte ou lymphocyte) (Cassatella 1999). Il est alors aisé de
comprendre que l'étude de l'expression des protéines par les neutrophiles exige alors
0 une pureté de 100%. Quoique les techniques courantes d'isolement cellulaire soient
aujourd'hui très efficaces, elles ne permettent pas encore d'obtenir une telle pureté.
Pour cette raison, les études qui s'attardent à la présence de la protéine dans le
cytoplasme des neutrophiles sont valables puisqu'elles ne prennent pas en compte
l'apport des cellules contaminantes de même que certaines techniques par cytométrie de
flux qui permettent l'exclusion des autres populations cellulaires. Par ailleurs, l'étude
de l'expression d'ARNm par les neutrophiles requiert aussi une pureté maximale de
neutrophiles en raison de l'extrême sensibilité de la technique de RT-PCR. Cassatela
(1999) indique qu'une pureté supérieure à 99.5% est requise afin d'éviter les faux-
positifs associés à de la contamination par d'autres populations cellulaires. Dans le
cadre de notre étude, nous avons obtenu une pureté de 99.5% avec l'utilisation de la
technique d'isolation cellulaire. De plus, lors d'une experience connexe (résultats non
montrés), nous avons combiné l'utilisation de la technique d'isolement par gradient de
concentration (Ficoll®) avec la sélection magnétique. La pureté obtenue ainsi était de
99.8% (2 cellules contaminantes par 1000 cellules). Il faut aussi noter que les cellules
J
 57

contaminantes étaient des éosinophiles et que leur capacité de synthèse de cytokines

n semble comparable à celle des neutrophiles (Brandt et al. 2000). Ces cellules hautement
purifiées ont permis de valider l'exactitude des résultats obtenus dans notre étude
concernant la capacité des neutrophiles à produire du TNF-a, de l'IL-lp, de l'IL-6, de
l'IL-8 et du MIP-2. Enfin, l'absence de signal pour l'IFN-y, l'IL-4 et l'IL-5 témoigne
aussi de l'absence de contamination par des lymphocytes (IFN-y, IL-4 et IL-5) et de
macrophages (IFN-y) puisque leur pouvoir de synthèse de ces cytokines est bien connu
(Abbas et al. 2000). En effet, dans une étude préliminaire (résultats non-montrés), nous
avons soumis les neutrophiles isolés aux mêmes conditions de stimulation que les
cellules du sang périphérique utilisées comme contrôles positifs et qui exprimaient
l'ARNm de l'IFN-y, de l'IL-4 et de l'IL-5. Certaines études suggèrent que la présence
d'ARNm d'IL-6, telle qu'observée dans notre étude, est indicatif d'une contamination
par les monocytes (Cassatella 1999). Toutefois, il a été démontré que la production
d'ARNm codant pour IL-6 est dépendante de la durée et de la nature de la stimulation et
qu'elle peut être induite par le LPS (Cassatella 1999). De plus, avec une contamination

0 par les monocytes de moins de 0.5%, la contamination par les cytokines des monocytes
telle que l'IL-6 n'influence pas la détection de l'ARNm des neutrophiles en utilisant la
RT-PCR comme technique de détection (Takeichi 1994).

La relation entre la production d'ARNm et la synthèse de la protéine correspondante a

été démontrée dans plusieurs études sur les cytokines humaines (Arnold et al. 1994;
Cassatella et al. 1997; Cassatella 1999; Knott et al. 2001). Il est toutefois important de
mentionner que le contrôle de la synthèse d'une cytokine peut se faire à différents
niveaux : transcriptionnel, post-transcriptionnel, translationnel et post-translationnel.
Cela a été mis en évidence par l'utilisation de substances chimiques bloquant
spécifiquement la synthèse à l'un des quatre niveaux énumérés précédemment
(Cassatella 1999). Les études sur les neutrophiles ont démontré que les contrôles
pouvaient s'exercer à plusieurs niveaux pour une cytokine donnée, dépendemment de
l'agent stimulant utilisé (Cassatella 1999). Les régulations translationnelles et post-
translationnelles sont particulièrement intéressantes pour nous puisqu'elles indiquent si

J la présence d'ARNm est indicative ou non de la synthèse et de la relâche protéique.

 58

Ainsi, parmi les cytokines étudiées, la production de TNF-a semble être modulée au
0 niveau translationnel. L'augmentation d'ARNm est en relation avec la synthèse
protéique mais l'ajout de certains facteurs tels que le N0 ou le GM-CSF peut augmenter
cette production (Cassatella 1999). La production d'IL-8 semble, quant à elle, régulée
au niveau de la sécrétion (post-translationnelle). Plusieurs évidences supportent ce fait
bien que l'accumulation d'ARNm soit quand même carrelée à la relâche d'IL-8 chez les
neutrophiles stimulés avec du LPS (Meda et al. 1994). Des études approfondies seront
nécessaires afin de comprendre les mécanismes de régulation de l'expression des gènes
des cytokines produites par les neutrophiles ainsi que les effets des différents stimuli
auxquels ils sont soumis expérimentalement. Les observations mettent toutefois en
evidence le fait que l'étude de l'expression de l'ARNm, bien que souvent représentative
de l'expression protéique, possède ses limites quant à l'interpretation que l'on peut faire
d'une augmentation ou d'une diminution légère de sa production. Dans cet ordre
d'idées, la détection de la protéine dans le surnageant d'une culture cellulaire ou
directement dans un tissu sera probablement beaucoup plus représentative de la réalité.
Toutefois, en raison du peu d'anticorps disponibles chez l'espèce equine, l'étude de
0 l'ARNm demeure une alternative respectable.

Cette capacité des neutrophiles équins à produire des cytokines est susceptible d'amener
les chercheurs à considérer ou reconsidérer les rôles de ces cellules dans plusieurs
conditions où ils sont impliqués. On réalise aujourd'hui que non seulement les
neutrophiles ont le pouvoir de produire des cytokines qui exercent un effet direct sur les
populations cellulaires et qui influencent les premières étapes de la réaction
inflammatoire mais qu'en plus, ils peuvent déterminer le type de réponse immunitaire
Thl/Th2 qui s'ensuit et jouer un rôle déterminant dans la mise en branle de l'immunité
acquise (Cassatella et al. 1995b; Tateda et al. 2001 a; Tateda et al. 2001 b). De plus, ces
découvertes rehaussent l'importance des neutrophiles dans l'immunité contre les
organismes intra-cellulaires de par leur capacité à induire une réponse immunitaire de
type Th 1 (Tateda et al. 2001 a). Il sera intéressant dans le futur de déterminer le pouvoir
de synthèse d'IL-12 par les neutrophiles équins puisque cette cytokine joue un rôle
important dans l'équilibre des cytokines qui gouvernent ce type de réponse immunitaire.
u
 59

Les rôles traditionnels attribués aux neutrophiles sont basés sur une conception erronée
de cette cellule en tant que cellule terminale à faible - voire nulle - activité
transcriptionnelle. Les nombreuses études réalisées chez les humains démontrent
néanmoins que cette fausse perception du neutrophile doit être corrigée dans le but de
comprendre davantage certaines conditions ou phénomènes impliquant cette population
cellulaire. Les résultats de notre étude viennent aussi mettre en relief ce potentiel chez
les neutrophiles équins et laissent croire que certaines conditions pathologiques, dont le
souffle, pourront être mieux comprises et mieux investiguées. Dans cet ordre d'idées,
les résultats de notre étude s'inscrivent dans un projet de recherche qui vise à mettre en
lumière l'apport des neutrophiles dans une maladie respiratoire equine très fréquente
appelée souffle (Joubert et al. Manuscrit en préparation). Cette pathologie est
caractérisée par une présence importante de neutrophiles dans la lumière des voies
respiratoires des chevaux affectés. Nous étudions l'expression d'ARNm de cytokines
pro-inflammatoires par les neutrophiles périphériques afin de comprendre la cascade
d'événements qui mène à leur migration pulmonaire. Les divergences dans les résultats
0 obtenus des études sur les neutrophiles humains rappellent toutefois que, selon les
stimuli utilises, les cytokines produites et l'espèce étudiée, les profils d'expression
peuvent varier d'une étude à l'autre. Par exemple, la stimulation des neutrophiles
humains avec de l'IL-12 ou du G-CSF plutôt que du LPS semble nécessaire afin de
stimuler leur production d' IFN-y. Cette caractéristique particulière pourrait expliquer
l'absence d'expression d'ARNm pour l'IFN-y chez les neutrophiles équins stimulés
avec du LPS et du fMLP. Par ailleurs, des études ultérieures seront intéressantes afin de
déterminer le pouvoir de synthèse par les neutrophiles équins de cytokines telles que
l'IL-10, l'IL-12 et le TGF-(3; ces cytokines possédant un large éventail d'effets
immunobiologiques (dark et Coker 1998; Constantinescu et al. 1998; Trinchieri 1998;
Romagnani 1999) en étant particulièrement impliquées dans la modulation de
I'inflammation (IL-10 et TGF-P), la réponse Thl/Th2 (IL-10 et IL-12) et certaines
conditions équines (TGF-(3). Enfin, il va de soit que des études au niveau protéique,
particulièrement par des techniques de détection in situ et intra-cellulaires seront

J
<
 60

nécessaires afin de confirmer les résultats obtenus dans la présente étude tout en prenant
^ des dispositions particulières afin de travailler avec des populations cellulaires pures.

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