UNIVERSITÉ D’AIX-MARSEILLE

FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ-ED 62
THÈSE DE DOCTORAT
Présentée et soutenue publiquement par
Zélika HAROUNA HAMIDOU
Le 26 novembre 2021

En vue de l’obtention du grade de DOCTEUR de l’Université

d’Aix Marseille

Mention : Biologie-Santé- Spécialité : Maladies infectieuses.

Thème : Diversité des Mycobactéries du groupe tuberculeux

en Afrique Sub-Saharienne.

Devant un jury composé de :

Mme le Pr Florence FENOLLAR (Aix-Marseille Université) Présidente
Mme le Pr Marie KEMPF (CHU Angers) Rapporteurse
Mr le Pr Sylvain GODREUIL (CHU de Montpellier) Rapporteur
Mr le Pr Saidou MAMADOU (Université Abdou Moumouni,Niamey) Co-Directeur de
Thèse.
Mr le Pr Michel DRANCOURT (Aix-Marseille Université) Directeur de Thèse

Laboratoire d’accueil
Microbes Evolution Phylogeny and Infections MEPHI- Aix Marseille
Université, Institut de Recherche pour le Développement IRD, IHU
Méditerranée Infection, Marseille, France
2020/2021
Affidavit

Je soussigné, Mme Zélika HAROUNA HAMIDOU, déclare par la présente que

le travail présenté dans ce manuscrit est mon propre travail, réalisé sous la direction

scientifique du Professeur Michel DRANCOURT et du Professeur Saidou MAMADOU,

dans le respect des principes d’honnêteté, d'intégrité et de responsabilité inhérents à

la mission de recherche. Les travaux de recherche et la rédaction de ce manuscrit ont

été réalisés dans le respect à la fois de la charte nationale de déontologie des métiers

de la recherche et de la charte d’Aix-Marseille Université relative à la lutte contre le

plagiat.

Ce travail n'a pas été précédemment soumis en France ou à l'étranger dans

une version identique ou similaire à un organisme examinateur.

Fait à Marseille, le 17 septembre 2021.

2
Liste de publications et participations aux conférences.

1) Liste des publications réalisées dans le cadre du projet de Thèse:

1.Harouna Hamidou, Z., Padane, A., Zgheib, R., Mamadou, S., Drancourt, M., Saad,

J. Two-decade distribution of Mycobacterium tuberculosis lineages in sub-Saharan

Africa: a genome-based review. (Soumis à European Journal of Clinical Microbiology

and Infectious Diseases).

2. Simon Robinne, Jamal Saad, Madjid Morsli, Zelika Harouna Hamidou, Fatah

Tazerart , Michel Drancourt, Sophie Alexandra Baron. Rapid screening method for

identification in the Mycobacterium tuberculosis complex using mass spectrometry: a

proof-of-concept. (Frontiers in Microbiology, en révision).

3. Harouna Hamidou, Z., Morsli, M., Mamadou, S., Drancourt, M., Saad, J.

Emergence of multi-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Niger: a snapshot

based on whole-genome sequencing. (Soumis à PLOS Neglected Tropical Diseases).

4. Harouna Hamidou, Z., Mamadou, S., Saad, J. Detection of Mycobacterium

tuberculosis sensu stricto isolated from soil, Niger. New Microbes & New Infections

(publié dans New Microbes & New Infections).

2) Participation aux Conférences et Écoles d’Eté au cours de la période de Thèse :

1. Participation en ligne (Poster) au 28ème Colloque Annuel de l'Ecole Doctorale

des Sciences de la Vie et de la Santé-ED 62 (2020-2021).

3
Avant-propos

Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la

spécialité Maladies Infectieuses et Microbiologie, à l’intérieur du Master des Sciences

de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie de

Marseille. Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui

comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un

meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie introduction et

bibliographie est remplacée par une revue envoyée dans un journal afin de permettre

une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de permettre à l’étudiant de

commencer le plus tôt possible une bibliographie exhaustive sur le domaine de cette

thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur article publié, accepté ou soumis associé

d’un bref commentaire donnant le sens général du travail. Cette forme de présentation

a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition internationale et

permet de se concentrer sur des travaux qui bénéficieront d’une diffusion

internationale.

Professeur Didier RAOULT

4
 Remerciements

Ma profonde gratitude va au Professeur Didier RAOULT d’avoir accepté de

financer ma thèse, permettez-moi de vous exprimer mes remerciements les plus

sincères.

Mes remerciements les plus sincères à mon directeur de thèse, le Professeur

Michel Drancourt. C’est un immense honneur que vous nous avez fait en nous confiant

ce travail. Votre expérience, l’étendue de votre savoir, votre rigueur scientifique font

de vous un maître admirable et respecté de tous. C’est avec patience et disponibilité

que vous avez dirigé ce travail. Nous espérons ne pas vous avoir déçus.

Mes vifs remerciements à mon co-directeur de thèse, le Professeur Saidou

MAMADOU. Vous êtes pour nous un exemple de rigueur et d’amour du travail bien

fait. Nous connaissons l'intérêt que vous portez à notre formation.

Mes plus respectueux remerciements s’adressent au Professeur Marie KEMPF

et au professeur Sylvain GODREUIL, qui ont accepté d’être les rapporteurs de cette

thèse et au Professeur Florence Fenollar pour avoir accepté de présider ce jury.

Je remercie Docteur Gérard Aboudharam pour son soutien continu et pour ses

encouragements tout au long de ma recherche.

Je remercie Jamal SAAD pour son aide précieuse, ses conseils et ses

encouragements. Il a toujours fait tout son possible pour m’aider.

Tout au long de mon cursus au sein de l’Institut Hospitalier Universitaire de

Marseille, bon nombre du personnel m’a aidée. Une mention spéciale pour Gilles

LIOTAUD Muriel MILITELLO, Alice CHANTELOUP. Un grand merci.

Je remercie particulièrement Hamadou OUMAROU HAMA, Abdourahamane

YACOUBA, Kenza DJEMAI, Yasmine HASSANI, Mustapha FELLAG, Madjid MORSLI

pour leur aide, leur amitié et leurs conseils.

Je remercie la Drancourt team pour leur appui, leur amitié et leurs conseils.

5
 J’exprime ma profonde gratitude à Maryam TIDJANI ALOU pour son affection

et ses encouragements. Merci à Maryam pour son inestimable soutien.

Je remercie toute l’équipe du laboratoire national des IST/VIH et de la

tuberculose de Niamey-Niger dont la contribution à mon travail est non négligeable et

la direction de l’hôpital national Amirou Boubacar Diallo, Niamey pour avoir donné

l’autorisation de réaliser cette Thèse.

Je remercie mes parents pour leur amour, leur soutien moral, leurs conseils,

leurs encouragements et leurs prières continues. Grâce à vous j’ai appris à surmonter

les difficultés de la vie. Puissiez-vous à travers ce travail être fiers de moi et lire dans

ces lignes tout l'amour de votre fille.

Je remercie mon très cher et tendre époux Issa BAKA, ton attention et ton

soutien ne m’ont jamais fait défaut pendant la réalisation de ce travail. Que dieu nous

accorde une vie paisible et pleine de bonheur. En signe d’affection, trouve à travers ce

modeste travail l’expression de tout mon amour.

6
 Sommaire

Affidavit………………………………………………………………………………………2

Liste de publications et participations aux conférences………….………………..3

Avant-propos………………………………………………………………………………..4

Remerciements……………………………………………………………………………..5

Résumé……………………………………………………...……………………………….9

Abstract…………………………………………………………...………………...….…..10

Introduction……………………………………………………………………….…….....11

Chapitre I : Diversité génomique des isolats du complexe Mycobacterium tuberculosis

en Afrique Sub-Saharienne, 2000-2020………………………………………………...13

Article 1 : Two-decade distribution of Mycobacterium tuberculosis lineages in sub-

Saharan Africa: a genome-based review. Harouna Hamidou, Z., Padane, A., Zgheib,

R., Mamadou, S., Drancourt, M., Saad, J. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. (soumis)….19

Chapitre II : Identification des souches cliniques du complexe Mycobacterium

tuberculosis par spectrométrie de masse………………………………………………...47

Article 2 : Speciation of the Mycobacterium tuberculosis complex by mass

spectrometry: a proof-of-concept. Robinne Simon, Saad Jamal, Morsli Madjid,

Harouna Hamidou Zelika., Tazrart Fatah., Drancourt Michel, Baron Sophie

Alexandra. Frontiers in Microbiology, en révision……………………………………….50

Chapitre III: Epidémiologie moléculaire des souches cliniques du complexe

Mycobacterium tuberculosis au Niger…………………………………………………….69

Article 3 : Emergence of multi-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Niger: a

snapshot based on whole-genome sequencing. Harouna Hamidou, Z., Morsli, M.,

Mamadou, S., Drancourt, M., Saad, J. PLOS Neglected Tropical Diseases (en cours

de review)………………………………………………………………………………….73

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Chapitre IV : Investigation des sources telluriques du complexe Mycobacterium

tuberculosis au Niger…………………………………………………………………….103

Article 4 : Detection of Mycobacterium tuberculosis sensu stricto isolated from soil,

Niger. Harouna Hamidou, Z., Mamadou, S., Saad, J., New Microbes & New Infections

(publié)…………………………………………………………………………………….107

Conclusions et perspectives………………………………………………………….113

Références……………………………………………………………………………….116

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Résumé

Notre recherche bibliographique portant sur 8,139 séquences génomiques du

complexe Mycobacterium tuberculosis dans 34 des 49 pays qui forment l’Afrique

Subsaharienne ayant montré l’absence de données pour le Niger dont nous sommes

originaire, nous avons investigué des souches cliniques provenant de quatre régions

différentes du Niger par une nouvelle approche expérimentale et d’analyse spectrale

de spectrométrie de masse et identifié ces souches comme M. tuberculosis, lignée 3

et lignée 4, montrant la possibilité de typage des mycobactéries du complexe M.

tuberculosis par spectrométrie de masse. Ensuite, le séquençage génomique de 42

souches provenant de cinq régions du Niger a confirmé l’identification exclusive de

l’espèce M. tuberculosis, lignées 1-4 (lignée 4 prédominante, (90,5%) réparties en dix

sous-lignées (sous-lignée L4.1.3 prédominante (47,3%). Toutes les souches de cette

sous-lignée L4.1.3 étaient résistantes aux antituberculeux et comportaient 72,2% de

souches multidrug-resistant, 16,6% de souches pré-MDR et 5,5% de souches

extensivement drug-resistant. Certains génotypes ont ensuite été détectés dans 5/99

échantillons de sol collectés autour des résidences des patients tuberculeux, par un

système PCR CRISPR-Csm4 que nous avons contribué à développer dans notre

laboratoire et confirmés et détectés sensibles à la rifampicine par le test Xpert MTB/RIF

Ultra. Les données acquises par nos travaux de Thèse, confirment les disparités

microbiologiques du complexe M. tuberculosis entre les différentes régions d’Afrique

Subsaharienne et plaident pour la mise en place d’un observatoire tuberculose au

Niger, auquel nous pensons contribuer dans les prochaines années.

Mots clés: Mycobacterium tuberculosis, Niger, séquençage du génome entier,

diversité génétique, tuberculose multirésistante, sol, spectrométrie de masse MALDI-

TOF-MS.
9
Abstract

Literature survey of 8,139 genomic sequences of the Mycobacterium tuberculosis (M.

tuberculosis) complex reported in 34 of the 49 countries forming Sub-Saharan Africa

showed the absence of data for Niger, where we are from. We investigated clinical M.

tuberculosis strains collected in four regions of Niger by a new experimental approach

and spectral analysis of mass spectrometry, identified them as M. tuberculosis, lineage

3 and lineage 4, unprecedentedly showing mass spectrometry capability to type M.

tuberculosis complex isolates. Further whole genome sequencing of 42 strains

collected in five regions of Niger confirmed the exclusive identification of M.

tuberculosis sensu stricto lineages 1-4 (predominant lineage 4, (90.5%) divided into

ten sublineages (predominant L4.1.3 sublineage (47.3%). All the L4.1.3 sublineage

strains were resistant to antituberculous, comprising 72.2% multidrug-resistant strains,

16.6% pre-MDR and 5.5% extensively drug-resistant. Some M. tuberculosis genotypes

were also detected in 5/99 soil samples collected around the residences of tuberculosis

patients, by a CRISPR-Csm4 PCR system that we contributed to develop in our

laboratory; and were confirmed and detected as rifampicin-susceptible by the Xpert

MTB / RIF Ultra test. These data acquired in the course of our Thesis concerning Niger

confirmed microbiological disparities of the M. tuberculosis complex between the

different regions of Sub-Saharan Africa and pleaded for the establishment of a

tuberculosis observatory in Niger, to which we expect to contribute in the coming years.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, Niger, whole genome sequencing, genetic

diversity, multidrug-resistant tuberculosis, soil, mass spectrometry, MALDI-TOF-MS.

10
Introduction générale à la Thèse: Microbiologie de la Tuberculose en Afrique

Sub-Saharienne.

La tuberculose est l’une des maladies transmissibles les plus mortelles au monde,

causée par les mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis (M.

tuberculosis). Après la découverte du bacille tuberculeux en 1882 [1] et de

médicaments antituberculeux depuis 1944, la tuberculose reste un problème majeur

de santé publique à l’échelle mondiale [2]. En 2019, environ dix millions de nouveaux

cas de tuberculose ont été enregistrés dans le monde, ainsi que 1,2 million de décès

dus à la tuberculose [3]. Les patients étaient déclarés à l’Organisation Mondiale de la

Santé par les pays d'Asie du Sud-Est (44% des patients déclarés), d'Afrique (25% des

patients) et des régions du Pacifique Occidental (18% des patients déclarés) [2].

Également, l’impact de la tuberculose sur la santé publique des pays à forte endémie

est compliqué par l’émergence des souches de M. tuberculosis multi-résistantes aux

antituberculeux (MDR) définies par leur résistance simultanée à la rifampicine et à

l’isoniazide [4]. La tuberculose due aux souches résistantes aux antibiotiques

antituberculeux, menace la lutte contre la tuberculose, d’autant qu’il a été rapporté que

seulement 206.030/500.000 (41%) patients atteints de tuberculose résistante/multi

résistante à la rifampicine (TB-RR/MDR) ont été diagnostiqués dans le Monde, en

2019 [2]. Concernant les pays d’Afrique Sub-Saharienne, malgré les limites liées à la

sous-déclaration des cas, un travail de revue a rapporté une incidence de 2,1% de

tuberculose MDR [5].

M. tuberculosis se transmet d’une personne à l’autre par voie aérienne: Quand

un patient atteint de tuberculose pulmonaire tousse, éternue ou crache, il projette des

bacilles tuberculeux qui peuvent être inhalés par un autre individu et on considère que

la voie respiratoire est la principale voie de transmission de M. tuberculosis; n'excluant

pas des voies minoritaires de transmission [6].

11
 Dans les pays d’Afrique Sub-saharienne, le diagnostic de tuberculose

pulmonaire repose essentiellement sur l’observation microscopique de bacilles acido-

alcoolo-résistants à l’examen direct des expectorations: Ces bacilles colorés en rose

avec la coloration de Ziehl-Neelsen ont une disposition caractéristique en cordes qui

permet l’identification microscopique de M. tuberculosis notamment dans les pays à

ressources limitées dans lesquels les tests moléculaires de diagnostic automatisé tels

que Xpert® MTB/RIF ou Xpert® MTB/RIF Ultra (Cepheid, Sunnyvale, États-Unis) qui

permettent d'identifier simultanément le complexe M. tuberculosis et la résistance à la

rifampicine (RIF) en moins de deux heures, ne sont pas implémentés [7] (Figure 1).

12
Figure 1 : GeneXpert du Laboratoire National de Référence des IST/VIH et de la

tuberculose.

Également, peu de laboratoires réalisent en routine l’isolement et la culture des

souches. Enfin, les outils moléculaires d’analyse partielle ou totale du génome, sont

utiles pour mieux comprendre la dynamique de transmission dans une zone donnée,

comprenant essentiellement la recherche des sources d’infection. Néanmoins, les

études moléculaires sur la tuberculose sont rares dans les pays à forte incidence et à

faible revenu [8].

Le développement et l'application d'outils de génotypage pour M. tuberculosis

a grandement amélioré notre compréhension de l'épidémiologie de la tuberculose au

13
niveau local [9] et à l'échelle mondiale [10–13]. Trois méthodes de génotypage

normalisées au niveau international, IS6110 DNA empreintes digitales [14], nombre

variable d'unités répétitives intercalées mycobactériennes de tandem, le typage répété

(MIRU-VNTR) [15] et le spoligotypage [16] ont été largement utilisés pour quantifier la

transmission [14], décrire la diversité génétique, déterminer l'épidémiologie de la

résistance aux médicaments [17–19]. Cependant, toutes ces méthodes sont

maintenant supplantées par l’analyse de la séquence du génome entier (whole

genome sequencing, WGS), devenue le standard pour résoudre les limites des tests

basés sur les sondes. Le WGS peut identifier les génotypes et permet de comparer

les souches deux à deux ou plus, est relativement prédictif du phénotype de résistance

aux antituberculeux et a le potentiel de déterminer la parenté génétique et d'identifier

la dynamique de transmission nécessaire pour guider les décisions cliniques.

Cependant, nous avons recensé uniquement 25/49 pays d'Afrique subsaharienne

disposant d’une plateforme WGS (Figure 2).

14
Figure 2. Carte des ressources en séquenceurs disponibles en Afrique

Subsaharienne.

Les travaux de génomique ont confirmé que L’Afrique est le seul continent où

toutes les lignées de M. tuberculosis sont détectées. En effet, les six lignées de M.

tuberculosis sensu stricto (lignage 1 Indo-Océanique, lignage 2-Est-Asiatique, lignage

3-Est-Afro-Indien, lignage 4-Euro-Américaine, lignage 7 et lignage 8) [20–22] , les deux

lignées de Mycobacterium africanum (M. africanum), composé de lignage 5-Ouest

Africain ou M. africanum I et du lignage 6-Ouest-Africain ou M. africanum II), et le

lignage 9 ont été décrites en Afrique, en plus de Mycobacterium canettii en Afrique de

l’Est [23].

Notre travail de Thèse avait pour but de préciser les connaissances sur la

microbiologie de la tuberculose au Niger, et comportait les étapes suivantes:

(1) Revue bibliographique des espèces du complexe M. tuberculosis et des

lignées de l’espèce M. tuberculosis caractérisées à partir des souches cliniques

isolées depuis deux décennies en Afrique Sub-Saharienne (Travail de revue).

(2) Identifier une collection de souches du complexe M. tuberculosis collectées

au Niger, par une nouvelle approche de spectrométrie de masse Matrix-Assisted Laser

Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) (Travail

expérimental).

(3) Décrire la diversité génétique de souches du complexe M. tuberculosis

collectées au Niger par séquençage génomique (Travail expérimental).

(4) Rechercher la présence de ces génotypes dans une collection d’échantillons

de sol prélevés sur le site des patients tuberculeux au Niger (Travail expérimental).

15
Chapitre I: Diversité génomique des isolats du complexe Mycobacterium tuberculosis

en Afrique Subsaharienne, 2000-2020.

Préambule

La connaissance de la diversité génétique des souches du complexe M. tuberculosis

circulant en Afrique Sub-saharienne, permet une meilleure connaissance de la

pathogénicité et la transmissibilité des différentes souches, l'identification de gènes

candidats pour les cibles médicamenteuses et l'amélioration des techniques de

diagnostic moléculaire [24,25]. Notre travail de revue avait pour principal objectif de

présenter une bibliographie exhaustive sur la connaissance des structures génétiques

de la population du complexe M. tuberculosis en Afrique Subsaharienne, une telle

revue n’étant pas disponible dans la littérature. Pour réaliser cet objectif, nous avons

utilisé la base de données TB profiler (https://tbdr.lshtm.ac.uk/sra) pour compléter nos

recherches bibliographiques. Nous avons décrit le profil de sensibilité aux

médicaments et l'épidémiologie moléculaire des souches mycobactériennes isolées à

partir des prélèvements cliniques.

Au total, nous avons recensé 8,139 isolats du complexe M. tuberculosis, rapportés

dans 34 des 49 pays de l’Afrique Subsaharienne. Ces 8,139 isolats comportaient 7,664

isolats (94,1 % du nombre total d'isolats analysés) de l’espèce M. tuberculosis sensu

stricto, 456 isolats (5,6 %) de l’espèce Mycobacterium africanum, 16 isolats (0,2 %) de

l’espèce Mycobacterium bovis et trois isolats identifiés comme Mycobacterium caprae.

L'analyse génomique de ces isolats a permis d’identifier neuf lignages (lignage 1-Indo-

Océanique, lignage 2-Est-Asiatique comprenant la famille Beijing, lignage 3-Indes et

Afrique de l'Est, lignage 4-Euro-Américain, lignage 5-Ouest Africain ou Mycobacterium

africanum I, lignage 6-Ouest-Africain ou M. africanum II, le lineage 7 de M.

tuberculosis, le lignage 8 de M. tuberculosis et le lignage 9 M. tuberculosis et 87

différents sous-lignages. Dans tous les pays d'Afrique subsaharienne, M. tuberculosis

lignage 4 était prédominant mais la distribution des différents lignages et sous-lignages

16
du complexe M. tuberculosis était hétérogène selon les pays. Nous avons reviewé des

isolats résistants aux antibiotiques dans 26/34 (76,5 %) pays, comportant 1,015/8,139

(12,4%) isolats multirésistants (MDR) et 167/8,139 (2%) isolats ultra-résistants (XDR)

essentiellement retrouvés parmi des souches de l’espèce M. tuberculosis sensu

stricto.

Cette revue de la littérature a montré la rareté des données de génotypage des

souches de mycobactéries du complexe M. tuberculosis au Niger, qui est notre pays

d’origine. En effet, seule une étude par spoligotyping était disponible à l’initiation de

notre travail de Thèse [26].

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Chapitre II : Identification des souches cliniques du complexe Mycobacterium

tuberculosis par spectrométrie de masse.

Préambule

Le genre Mycobacterium comporte actuellement 248 espèces reconnues (voir la liste

des noms mycobactériens avec classement dans la nomenclature

[http://www.bacterio.net/mycobacterium.html]). Ces micro-organismes provoquent

une morbidité et une mortalité importantes chez l'homme et sont responsables

essentiellement (mais non pas exclusivement) d’ infections pulmonaires, cutanées,

ganglionnaires, des infections des tissus mous et d’infections disséminées [27].

L'identification des mycobactéries a initialement reposé sur la combinatoire de

caractéristiques phénotypiques, méthode lente car laborieuse [28] et de résolution

limitée. Ensuite, les méthodes de biologie moléculaire ont été utilisées pour identifier

les espèces de mycobactéries, culminant dans le séquençage complet du génome

[29]. Cependant, le séquençage nécessite une expertise encore rare en particulier

dans les pays à plus faibles ressources dont le Niger, d’où nous sommes originaire La

spectrométrie de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une

matrice Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight mass spectrometry

(MALDI-TOF) s'est avérée être une technique rapide, rentable et précise pour

l'identification conventionnelle des bactéries et des levures [30,31]. La distinction entre

M. tuberculosis et les autres espèces du complexe est utile pour :

1) la recherche de la source d’infection

2) des schémas thérapeutiques appropriés pour éviter l’émergence d’une antibio-

résistance.

Dans cette partie expérimentale de notre Thèse, nous avons contribué à la mise en

place d’une nouvelle méthode d’identification des souches du complexe M.

tuberculosis par spectrométrie de masse de type Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF). Dans ce travail,

47
128 isolats cliniques de M. tuberculosis incluant 18 isolats provenant du Laboratoire

National de Référence des IST/VIH et de la Tuberculose, Niamey, Niger (LNR-

IST/VIH/TB) ont été utilisés pour l’identification des espèces du complexe M.

tuberculosis. L'identification des spectres d'isolats par comparaison avec la

bibliothèque MALDI Biotyper Compass IVD v9.0 et la méthode des billes de

mycobactéries Library v.3.0 (Bruker Daltonics) a donné 69% d'identifications correctes

des espèces de Mycobacterium avec un score de comparaison supérieur à 2,00 ; et

cette valeur est passée à 91% en utilisant un score de comparaison supérieur à 1,80.

Dans cette étude, nous avons montré que les spectres MALDI-TOF-MS des

mycobactéries peuvent être utilisés comme méthode de première ligne d’identification

des souches du complexe M. tuberculosis, et le typage de certaines lignées de

l’espèce M. tuberculosis sensu stricto.

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Chapitre III: Epidémiologie moléculaire des souches cliniques du complexe

Mycobacterium tuberculosis au Niger.

Préambule

Notre travail de revue de la littérature concernant le génotypage des souches cliniques

de M. tuberculosis en Afrique subsaharienne, a indiqué l’absence complète de

données concernant le Niger. C’est pourquoi nous avons entrepris l'étude de la

diversité génétique et du profil de sensibilité et résistance des souches de M.

tuberculosis qui circulent au Niger, par séquençage génomique.

Le Niger est un pays d'Afrique de l'Ouest avec une population estimée de 23

millions de personnes [32] où la tuberculose demeure un réel problème de santé

publique, avec une incidence estimée à 84 cas pour 100.000 habitants [3]. Au Niger,

le diagnostic de la tuberculose pulmonaire repose essentiellement sur l’examen

microscopique direct des expectorations après coloration de Ziehl-Neelsen ou bien

coloration par l’auramine O [33]. Cependant, ces examens microscopiques ne sont

pas spécifiques du diagnostic de tuberculose pulmonaire car les mycobactéries

tuberculeuses et non-tuberculeuses présentent les mêmes affinités tinctoriales [34].

Les tests moléculaires d’identification du complexe M. tuberculosis et de détection de

la résistance à la rifampicine par PCR nichée (Xpert®MTB/Rif, Cepheid, Maurens-

Scopont, France) sont disponibles dans les hôpitaux de toutes les régions du Niger

(Agadez, Diffa, Dosso, Maradi, Niamey, Tahoua, Tillabéri et Zinder) tandis que les

tests moléculaires par sondes moléculaires (GenoType MTBDRplus et GenoType

MTBDRsl, Hain Lifescience GmbH, Nehren, Allemagne) sont disponibles au

Laboratoire National de Référence des IST/VIH et de la tuberculose, Niamey et sont

pratiqués dans les cas de rechute et d'échec thérapeutique qui sont diagnostiqués

résistant à la rifampicine pour la tuberculose et avant la mise sous traitement

antituberculeux de deuxième ligne pour les tests LPA. Les tests par sonde moléculaire

permettent d’identifier les mutations du gène katG et du gène promoteur inhA

69
associées à la résistance à l'isoniazide (INH) et les mutations du gène rpoB associées

à la résistance à la rifampicine (RMP); et du test GenoType MTBDRsl VER 2.0 (Hain

Lifescience GmbH) qui détecte des mutations dans les gènes gyrA et gyrB qui

confèrent une résistance aux fluoroquinolones (FQL); des mutations du gène rrs

conférant une résistance aux aminosides injectables de deuxième intention

(kanamycine, capréomycine, amikacine et viomycine); et des mutations dans le

promoteur eis qui confèrent une faible résistance à la kanamycine. Cependant, ces

tests moléculaires ne fournissent pas suffisamment d'informations pour discriminer

entre les différentes espèces du complexe M. tuberculosis qui causent la tuberculose

humaine et ne détectent pas toutes les mutations associées à la résistance aux

antibiotiques antituberculeux. Enfin, la culture des expectorations n’est pratiquée qu’

en cas d’échec thérapeutique ainsi que pour le suivi des patients pharmaco résistants.

Au total, une seule étude publiée a rapporté la diversité génétique des souches

cliniques du complexe M. tuberculosis au Niger [35]. Cette étude a inclus 222 isolats

cliniques (210 isolats résistant à la rifampicine et à l'isoniazide et 12 isolats mono-

résistant à la rifampicine) collectées entre 2008 et 2016 dans huit régions du Niger,

investiguées par le Laboratoire supranational de référence à l'IMT à Anvers, Belgique.

Deux espèces du complexe M. tuberculosis ont été rapportées, M. tuberculosis sensu

stricto (lignées 1-4) et Mycobacterium africanum (lignée 5 et lignée 6). Il ressort que la

lignée 4 (Euro américain) était prédominante avec la sous-lignée Ghana (47,7%,

106/222 isolats) suivie de la sous-lignée Cameroon (28.4%, 63/222 isolats).

Afin d’approfondir ces données, nous avons étudié la diversité génétique et le

profil de sensibilité et résistance de la tuberculose au Niger, par séquençage

génomique d’une collection rétrospective de souches cliniques isolées à partir des

prélèvements respiratoires. Ce travail diagnostique rétrospectif a obtenu l’autorisation

du Professeur Saidou MAMADOU, Chef du Laboratoire national de référence des

IST/VIH et de la tuberculose, Niamey, Niger) en date du 23 Avril 2018. Ce travail a

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montré une structure diversifiée de souches des sous-lignées de l’espèce M.

tuberculosis sensu stricto, seule espèce identifiée dans notre travail, avec une

prédominance L4.1.3 et L4.6.2.2 (Genotype Cameroon); qui comportent plus

particulièrement des souches extensively drug-resistant (XDR) (5,5%), multidrug-

resistant (MDR) (72,2%), pré-MDR (16,6%) pour la sous-lignée L4.1.3; et des souches

MDR (38,4%), pré-MDR (23 %) pour la sous-lignée L4.6.2.2.

La comparaison de la structure génétique des souches de M. tuberculosis qui

circulent au Niger, avec celles qui circulent dans les autres pays d’Afrique

Subsaharienne indique que 21 isolats de la sous lignée L4.1.3 ont été retrouvés en

Côte d'Ivoire dont 18 souches MDR, trois en République du Congo et une souche au

Nigeria. La sous lignée L4.6.2.2 a été observée au Nigéria avec 29 isolats dont 10

MDR, 16 isolats en Côte d’Ivoire, 15 isolats au Ghana, cinq isolats en République

Démocratique du Congo et trois isolats dans chacun des pays suivants : Liberia,

Malawi, et République du Congo. La comparaison de ces prévalences indique que la

proportion de souches des sous-lignées L4.1.3 et de L4.6.2.2 est significativement

supérieure (pour L4.1.3) et inférieure (pour L4.6.2.2) au Niger que dans les autres pays

d'Afrique Subsaharienne (test chi2, p<0,05).

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Chapitre VI : Investigation des sources telluriques du complexe Mycobacterium

tuberculosis au Niger.

Préambule

Une étude expérimentale réalisée il y a quelques années dans notre laboratoire a

montré la persistance dans le sol de trois des espèces de mycobactéries du complexe

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), Mycobacterium bovis, Mycobacterium

canettii et Mycobacterium tuberculosis sensu stricto responsables de la tuberculose

pulmonaire chez l’homme. Dans ce travail expérimental, ces trois espèces de

mycobactéries avaient présenté une survie pendant 12 mois dans le sol; et restaient

pathogènes dans un modèle de souris dans lequel l’ingestion du sol infecté induisait

des lésions granulomateuses gastriques et pulmonaires [36]. Ce travail expérimental

avait été suscité par les données antérieures concernant l’épidémiologie de la

tuberculose bovine à M. bovis et le rôle possible du sol comme un relai intermédiaire

de transmission indirecte de M. bovis, depuis la faune sauvage vers les bovins[37,38].

L’intérêt de ce travail était triple: (1) confirmer expérimentalement la survie de M. bovis

dans le sol (2) étendre cette propriété à deux autres espèces du complexe M.

tuberculosis, comme une propriété du complexe lui-même (3) montrer la possibilité

expérimentale de tuberculose pulmonaire à point de départ digestif, travail que nous

avons confirmé depuis [39].

Cependant, peu d'études ont examiné la dissémination et la persistance des

mycobactéries du complexe M. tuberculosis dans l'environnement. Tanner et Michel

ont rapporté une survie allant jusqu'à six semaines pour les cellules de M. bovis

inoculées dans le sol et les matières fécales, détectées par des méthodes de culture

sélective en milieu de culture gélosé [40]. Cette observation expérimentale hors

laboratoire, a été relayée par des observations de terrain réalisées à Téhéran en Iran

où M. tuberculosis a été isolé dans des prélèvements de sol et des prélèvements d’eau

[41]. Un travail récent a fait l’inventaire de l’ensemble des données expérimentales et

103
d’observations de terrain, permettant de confirmer la possibilité de conservation

prolongée du complexe M. tuberculosis dans le sol [6].

Au cours de notre travail de Thèse, nous avons collecté 103 échantillons de sol

dans six régions différentes du Niger (régions de Agadez, Dosso, Diffa, Niamey,

Tillabéri et Zinder), dont 99/103 ont été collectés à proximité des lieux de résidence de

patients diagnostiqués avec une tuberculose pulmonaire et quatre ont été prélevés sur

les sites de construction des habitats, comme contrôles négatifs. Ces échantillons de

sols environnementaux ont été collectés au Niger et acheminé en France pour être

manipulés dans l’IHU Méditerranée Infection, avec l'autorisation du Secrétariat

Exécutif du Conseil National de l'Environnement pour un Développement Durable

N°0153/SE/CNEDD au Niger, en accord avec les clauses du Traité de Nagoya co-

signé par le Niger et la France. Pour dépister la présence de mycobactéries du

complexe M. tuberculosis dans ces échantillons, nous avons utilisé un système de

détection par PCR ciblant CRISPR-Csm4, mis au point dans notre laboratoire. Ce

système est basé sur quatre systèmes de PCR (temps réel et standard) qui ciblent le

gène CRISPR-csm4. Le gène CRISPR-csm4 est spécifiquement présent parmi les

mycobactéries du complexe M. tuberculosis et non pas parmi les autres complexes du

genre Mycobacterium. Pour M. tuberculosis sensu stricto, nous avons trouvé que tous

les isolats de M. tuberculosis lignées Beijing présentaient une délétion de 552-pb dans

la partie C-terminale du gène. Egalement, nous avons trouvé une mutation A-807

spécifique des isolats de M. tuberculosis des lignées L1 (Indo Oceanic), L3 (East

African Indien), L4 (Euro American) et de l’espèce M. canettii. Aussi, une autre

mutation G-739 a été détectée spécifiquement pour Mycobacterium pinnipedii. Enfin,

nous avons observé que M. canettii présentait une plus grande diversité de séquence

du gène CRISPR-Csm4, que les autres espèces du complexe M. tuberculosis.

En utilisant ce système CRISPR-Csm4, aucun des quatre échantillons de sol

témoins négatifs, mais cinq échantillons de sol parmi les 99 échantillons testés ont été
104
détectés positifs, puis confirmés par le test Xpert MTB/RIF Ultra comme cinq souches

sensibles à la rifampicine, bien qu’un de ces échantillons ait été typé comme une

souche Beijing par le système CRISPR-Csm4.

Cette étude a montré pour la première fois au Niger, la détection de génotypes

circulants de M. tuberculosis dans le sol, dont la viabilité n’a pas pu être confirmée

dans ce travail préliminaire. Cependant, ce premier travail suggère de nouvelles

études sur une large collection de sol pour étudier davantage la présence du complexe

M. tuberculosis dans l'environnement et son rôle potentiel dans l'épidémiologie de la

tuberculose afin de mener une lutte contre cette maladie.

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Conclusions et perspectives

La tuberculose demeure une préoccupation majeure au Niger malgré les multiples

efforts réalisés ces dernières années. Les techniques de diagnostic mises à disposition

des cliniciens au laboratoire national de référence des IST/VIH et de la tuberculose

(LNR-IST/VIH/TB) sont en train de modifier radicalement l’approche diagnostique de

la tuberculose au Niger. Ces techniques sont à l’origine des progrès importants faits

dans l’identification des souches de mycobactéries et des résistances aux

antituberculeux de 1ère et 2ème ligne. Le diagnostic de la tuberculose multirésistante au

LNR-IST/VIH/TB repose actuellement sur la culture des mycobactéries sur milieu

solide (gold standard) associée à des tests phénotypiques de sensibilité aux

antituberculeux complétés par des tests de biologie moléculaire (Xpert MTB/RIF,

GenoType® MTBDRplus, GenoType MTBDRsl). Le dispositif actuel permet d’effectuer

la culture chez les cas de retraitement mais ne permet pas d’effectuer la culture des

mycobactéries en routine pour tous les patients. Également, ce dispositif ne permet

pas de réaliser le typage des souches au niveau des lignés et sous-lignées. Enfin, les

tests moléculaires actuels sont rapides et faciles à réaliser mais ne testent qu'un

nombre limité de mutations associées à la résistance aux antituberculeux. Le

laboratoire ne dispose pas d’une technologie permettant de faire l’identification des

espèces et des lignées et sous-lignées.

Nos travaux de Thèse répondent à ces préoccupations de santé publique au

Niger en étant contributifs à la connaissance de la Microbiologie du complexe M.

tuberculosis au Niger, un pays d’Afrique Subsaharienne dont nous sommes originaire

et où nous allons poursuivre nos travaux diagnostiques et prospectifs; et ces

contributions tiennent en partie à la mise au point et à l’application nouvelle aux

souches du complexe M. tuberculosis isolées au Niger, de méthodes d’investigations

microbiologiques connues par ailleurs telles que l’identification des souches de

mycobactéries par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF-MS, et le séquençage

113
génomique. Ainsi, nous avons confirmé la prédominance de l’espèce M. tuberculosis

stricto sensu dans la collection de souches cliniques que nous avons analysées,

minorant le rôle possible de la tuberculose zoonotique, indiquant que les efforts de

prévention dans notre pays doivent porter essentiellement sur la transmission

interhumaine. Également, la diversité génomique de M. tuberculosis stricto sensu, en

partie reflétée par les analyses par MALDI-TOF-MS ce qui est nouveau, est

significativement différente dans nos travaux au Niger par rapport aux pays limitrophes

d’Afrique Subsaharienne, plaidant pour la poursuite de travaux de cette nature à

l’échelle nationale.

Notre travail sur les échantillons environnementaux prélevés autour des

patients tuberculeux, bien que très spéculatifs étant donné la rareté de la littérature sur

ce sujet, méritent d’être poursuivis en collaboration avec les services vétérinaires, pour

confirmer ou non la viabilité des mycobactéries du complexe M. tuberculosis dans le

sol, et sa durée, comme cela a été démontré expérimentalement par un travail ancien

dans notre laboratoire [36]; dans ce cas, la survie intra-amibienne dans le sol, comme

cela a été montré expérimentalement [38,42] et enfin, dans ce cas, la possible

transmission aux animaux voire zoonotique.

En conclusion, peu d’études ont été réalisées au Niger concernant

l’identification et le typage au niveau des sous-lignées des souches de mycobactéries

du complexe M. tuberculosis, ainsi que le profil complet de sensibilité et résistance de

ces souches aux antituberculeux, incluant les antituberculeux en repositionnement tels

que la clofazimine. Les résultats obtenus rétrospectivement au cours de notre travail

de Thèse méritent tous d’être confortés par des études prospectives plus larges,

incluant tous les nouveaux cas de tuberculose; par exemple en collectant pour les

investiguer par les méthodes techniques et intellectuelles développées au cours de

notre Thèse, tous les six mois/douze mois les souches de mycobactéries isolées à

partir des prélèvements cliniques; se donnant ainsi la possibilité de mettre en place un

114
véritable Observatoire de la tuberculose et un Conservatoire des souches, au sein du

Laboratoire National de Référence des IST/VIH et de la tuberculose.

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