SYSTME BIOLOG IDENTIFICATION DES BACTRIES AROBIES GRAM NGATIF

Lise Vzina, technicienne de laboratoire Michel Lacroix, agronome-phytopathologiste

Direction de linnovation scientifique et technologique Les systmes dvelopps par la compagnie Biolog visent lidentification de bactries, levures et champignons. Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection du MAPAQ, nous utilisons le systme permettant lidentification des bactries arobies Gram ngatif. Il nous est particulirement utile pour identifier les Pseudomonas et Xanthomonas responsables de taches et brlures chez plusieurs espces vgtales. Les images suivantes permettent de visualiser des taches et des brlures dorigine bactrienne sur diverses plantes cultives.

Pseudomonas syringae sur le cornouiller

Pseudomonas syringae pv. apii sur le cleri

Pseudomonas syringae
sur le soya

Xanthomonas campestris pv. hederae sur

le lierre commun

Xanthomonas campestris pv. vitians sur

la laitue

Xanthomonas campestris pv. campestris sur le chou

ISOLEMENT SUR MILIEU DE CULTURE GLOS

Pour le diagnostic des maladies bactriennes responsables de taches ou brlures foliaires, la premire tape consiste isoler la bactrie des tissus vgtaux. Les isolements sont raliss sur des milieux de culture gloss soit B de King pour les Pseudomonas (King, E.O., M.K. Ward et D.E. Raney. 1954) et LPGA (Levure Peptone Glucose Agar) pour les Xanthomonas. la suite du trempage des tissus vgtaux dans une solution saline (NaCl 0,85%) pendant 30 minutes, la suspension est tale par puisement sur les milieux de culture. Lincubation se fait 26oC et elle est gnralement de 48 72 heures afin dobtenir des colonies de 1 2 mm de diamtre.

IDENTIFICATION PAR LE SYSTME BIOLOG

Lidentification des bactries arobies Gram ngatif par le systme Biolog est possible grce lutilisation de plaques GN2. Elles permettent de vrifier simultanment la raction mtabolique des bactries en regard de 95 sources de carbone (figure 1). la suite de linoculation dune plaque GN2 avec une bactrie inconnue, un profil mtabolique est obtenu. Ce dernier est compar ceux de la base de donnes du systme Biolog pour les bactries arobies Gram ngatif. Lidentification est donc ralise en jumelant le profil de la bactrie identifier celui de lespce bactrienne prsentant le plus de similarit dans la base de donnes du systme Biolog (figure 2).

INOCULATION DES PLAQUES

Les colonies bactriennes isoles des tissus vgtaux et prsentant les caractristiques dun Xanthomonas ou dun Pseudomonas sont mises en culture pure sur le milieu TSA (Tryptic Soy Agar). La premire exigence du systme Biolog pour lidentification dune bactrie arobie Gram ngatif est de dterminer si la bactrie identifier est une entrobactrie ou une non-entrobactrie. partir dune culture pure de 18 24 heures, un test oxydase (bioMrieux) est ralis, lequel permet la dtection de lenzyme cytochrome oxydase dans la bactrie identifier. Cet enzyme oxyde le ractif phnylnediamine en un compos color violet, lindophnol. Le test oxydase se fait comme suit : Les colonies de Pseudomonas sur le milieu B de King ont une coloration blanchtre crme avec ou sans la prsence dune fluorescence lorsque les colonies sont soumises une lumire ultraviolet. Sur un papier filtre strile, dposer une goutte du ractif phnylnediamine. laide dun cure dent, prlever sur le milieu de culture la bactrie identifier et la dposer sur le papier filtre, l o le ractif est prsent. Lapparition dune coloration violace aprs 30 secondes indique un test oxydase positif.

Les colonies de Xanthomonas sur le milieu LPGA ont une coloration jaune ple jaune citron. Elles sont lgrement convexes, luisantes, avec une marge bien dfinie.

Laboratoire de diagnostic en phytoprotection MAPAQ

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Oxydase positif : entrobactrie Oxydase ngatif : entrobactrie ou non-entrobactrie

- +

52% 3% si une non-entrobactrie 63% 3% si une entrobactrie La turbidit de la suspension bactrienne est mesure par un lectrophotomtre ou un turbidimtre. Linoculation de la plaque GN2 se fait en dposant 150 l de la suspension bactrienne dans chacun des puits. Lincubation se fait dans une chambre humide 30oC pour une dure de 24 48 heures.

Si le test oxydase est ngatif, un test oxydation/fermentation est ralis. Ce test permet de dterminer si la bactrie identifier possde un mtabolisme oxydatif ou fermentatif cest dire si elle utilise respectivement le glucose en prsence ou en absence doxygne. Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection le test oxydation/fermentation est effectu par lintermdiaire de lAPI OF Medium (bioMrieux). Le tube API OF Medium est dpos dans un bcher rempli deau puis chauff jusqu ce que le contenu du tube soit liqufi. Lextrmit du tube est alors casse pour permettre dinoculer le milieu avec la bactrie inconnue. Environ 1 cm dhuile minrale strile est ajoute pour crer des conditions anarobies. Lincubation dune dure de 24 heures se fait 26oC. Lutilisation du glucose par la bactrie engendre lacidification du milieu. Une telle acidification fait virer lindicateur color, le bleu de bromothymol, qui passe du vert au jaune. Ainsi, aprs lincubation la prsence dune coloration jaune indique que la + bactrie a un mtabolisme fermentatif et est donc considre comme une entrobactrie. En contrepartie, si le milieu demeure vert la bactrie possde un mtabolisme arobie strict. Il sagit alors dune nonentrobactrie. Ces caractristiques connues, il est possible de procder lidentification de la bactrie inconnue partir des plaques GN2 du systme Biolog. La premire tape est la prparation dune suspension bactrienne dans 20 ml de saline strile (NaCl 0,85%). La suspension bactrienne doit avoir une turbidit de :

LECTURE DE LA PLAQUE BIOLOG

Pour faciliter la lecture des ractions, la plaque GN 2 est dpose sur une source lumineuse. Les rsultats de chacun des puits sont alors saisis dans la base de donnes du systme Biolog. Le puits A1 doit tre incolore. Lutilisation des substrats par la bactrie se traduit par lapparition dans les puits dune couleur pourpre. Cette coloration pourpre est produite par la rduction de lindicateur, le ttrazolium, en un compos color le formazan. En labsence de lutilisation du substrat, le puits demeure incolore

Plaque GN2 la suite de linoculation avec une . bactrie inconnue et une priode dincubation de 24 heures 30oC

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A1
eau

A2 B2

-cyclodextrine

A3 B3

dextrine

A4 B4

glycogne

A5 B5

Tween 40

A6 B6

Tween 80

A7 B7

N-actyl-Dgalactosamine

A8 B8

N-actyl-Dglucosamine

A9 B9

adonitol

A10 B10

L-arabinose

A11 B11

D-arabitol

A12 B12

cellobiose

B1

i-rythritol

D-fructose

L-fucose

D-galactose

gentiobiose

-D-glucose

m-inositol

-lactose

-D-lactose lactulose

maltose

D-mannitol

D-mannose

C1

D-melibiose

C2

-mthyl D-glucoside

C3

psicose

C4

D-raffinose

C5

L-rhamnose

C6

D-sorbitol

C7

sucrose

C8

D-trhalose

C9

turanose

C10
xylitol

C11

mthyl pyruvate

C12

mono-mthyl succinate

D1

acide actique

D2

acide cisaconitique

D3

acide citrique

D4

acide formique

D5

acide Dgalactonique lactone

D6

acide Dgalacturonique

D7

acide Dgluconique

D8

acide Dglucosaminique

D9

acide Dglucuronique

D10
acide hydroxy butyrique

D11

acide hydroxy butyrique

D12

acide hydroxy butyrique

E1

acide p-hydroxy phnylactique

E2

acide itaconique

E3

acide -kto butyrique

E4

acide -kto glutarique

E5

acide -kto valrique

E6

acide D,Llactique

E7

acide malonique

E8

acide propionique

E9

acide quinique

E10

acide Dsaccharique

E11

acide sebacique

E12

acide succinique

F1

acide bromo succinique

F2

acide succinamique

F3

glucuronamide

F4

alaninamide

F5

D-alanine

F6

L-alanine

F7

L-alanylglycine

F8

L-asparagine

F9

acide Laspartique

F10

acide Lglutamique

F11

acide glycyl-Laspartique

F12

acide glycyl-Lglutamique

G1

L-histidine

G2

hydroxy Lproline

G3

L-leucine

G4

L-omithine

G5

L-phnyl alanine

G6

L-proline

G7

acide L-pyro glutamique

G8

D-serine

G9

L-serine

G10

L-thronine

G11

D,L-camitine

G12

acide -amino butyrique

H1

acide urocanique

H2

inosine

H3

uridine

H4

thymidine

H5

phnyl thylamine

H6

putrescine

H7

2-amino thanol

H8

2,3-butandiol

H9

glycrol

H10

D,L--glycrol phosphate

H11

glucose-1phosphate

H12

glucose-6phosphate

Figure 1. Reprsentation dune plaque GN2 du systme Biolog contenant 95 sources de carbone

INTERPRTATION DES RSULTATS

la suite de la saisie des rsultats de lutilisation des substrats par la bactrie inconnue, le systme didentification Biolog compare ce profil mtabolique ceux des bactries arobies Gram ngatif de sa base de donnes. Lidentification est donc ralise en jumelant le profil de la bactrie identifier celui de lespce bactrienne prsentant le plus de similarit. Lidentification sappuie principalement sur deux valeurs (figure 2): La similarit est un indice refltant le degr dappariement entre le profil mtabolique de la bactrie identifier et celui de la bactrie propose par le systme Biolog. Plus la valeur se rapproche de 1, meilleure est considre lidentification. La distance indique le nombre de puits dont les rsultats sont diffrents entre la bactrie inconnue et celle propose par le systme Biolog. Plus cette diffrence se rapproche de zro, meilleure est considre lidentification.

Figure 2 : exemple dune identification ralise par le systme Biolog Les photos de ce document ont t ralises par Chantal Malenfant, technicienne au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, MAPAQ.

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