RECUEIL DEXERCICES DE

BIOCHIMIE

5. Les enzymes
5.2. Dosage de lactivit enzymatique 5.3. Km et Vmax

6 5 4 1/V0 3 2 1 0 -1
-1/Km

1 1/[S]

Universit du Qubec Montral

5.2. Dosage de lactivit enzymatique 5-8 : Dosage de lactivit de la glutathione rductase.

nonc : La glutathione rductase catalyse la raction suivante : GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP La formation de GSH peut tre dtecte indirectement grce lajout de 5,5-dithiobis(2acide nitrobenzoque) (DTNB) : GSTNB + TNB GSH + DTNB -1 Le TNB absorbe 412 nm ( = 13,6 mM cm-1) et permet de quantifier lactivit de la glutathione rductase. Ainsi, pour chaque molcule de GSH forme, il y aura formation dune molcule de TNB. Vous voulez dterminer lactivit de la glutathione rductase dans un extrait vgtal. Vous prparez le milieu de dosage de la faon suivante : 1,0 mL de tampon KPO4 pH 7,5 (0,2 M) 0,5 mL de DTNB (3 mM) 0,1 mL de NADPH2 (2 mM) 0,1 mL dextrait vgtal 0,2 ml de H20 0,1 mL de GSSG (2 mM)

La raction dbute avec lajout de GSSG et vous prenez labsorbance toutes les minutes pendant 5 minutes 412 nm. Vous obtenez les rsultats suivants : Temps (min) 1 2 3 4 5 Question : Dterminez lactivit de la glutathione rductase en nmol de GSH produit/min/mg protine. Un dosage des protines vous indique quil y a 1,8 mg de protine par mL dextrait vgtal. Rponse Absorbance 412 nm 0,184 0,394 0,606 0,816 1,024

5.3. Km et Vmax 5-9 : Estimation de Vmax et de Km par inspection.

nonc : Voir Lehninger, A. L., Nelson, D. L. and Cox, M. M. Principes de biochimie. Deuxime dition. Traduction franaise de : Biochemistry. Second Edition. Worth Publishers. New York. 1993. p. 238 #6. ou Charles Bilodeau. Recueil dexercices de biochimie. Dpartement des Sciences biologiques. UQAM. 1999. p. 43. (COOP) Rponse 5-10 : Raction de transamination. nonc : Voir Lehninger, A. L. Biochimie. Deuxime dition. Traduction franaise de : Biochemistry, the molecular basis of cell structure and function. 6th Edition. Worth Publishers. New York. 1970. p. 166 #5. ou Charles Bilodeau. Recueil dexercices de biochimie. Dpartement des Sciences biologiques. UQAM. 1999. p. 43. (COOP) Rponse

5-8 : 1: Dterminer la concentration en GSH chacun des temps, partir de . 1 min : A = cl 0,184 = 13,6 mM-1cm-1 X c X 1 cm c = 0,184/13,6 mM-1 c = 0,0135 mM ou 13,5 M Temps (min) 1 2 3 4 5 [GSH] (M) 13,5 29,0 44,6 60,0 75,3

2 : Dterminer la formation moyenne de GSH par minute. Intervalle de temps (min) 1-2 2-3 3-4 4-5 Moyenne = 15,5 M Donc nous avons 15,5 M de GSH de produit/min 3 : Exprimer en nmol de GSH produit/min/mg de protine 15,5 M/min = 15,5 mol/L/min Le volume final de dosage est de 2 mL (0,002 L) Donc, 15,5 mol/L/min X 0,002 L/mL = 0,031 mol/mL/min ou 31 nmol/mL/min [GSH] (M) 15,5 15,6 15,4 15,3

Nous avions un extrait de 0,1 mL Donc pour 1 mL dextrait, 31 nmol/mL/min X 10 = 310 nmol/min/mL dextrait vgtal 1 ml dextrait contient 1,8 mg de protine Donc, 310 nmol/min/1,8 mg de protine = 172 nmol de GSH produit/min/mg de protine 5-9 : En examinant les deux dernires concentrations de substrats utilises, on voit que V0 naugmente presque plus. On peut donc estimer Vmax prs de 140 M/min. Km = Vmax 140 M/min = = 70 M/min 2 2

Donc 70 M/min, [S] = 10-5 M = Km 5-10 : Il faut calculer 1/V0 et 1/[S] et tracer le graphique de Lineweaver-Burk.
6 5 4 1/V0 3 2 1 0 -1
-1/Km

1 1/[S]

Par rgression linaire, on peut trouver lintercept pour x = 0 (1/[S] = 0), on obtient 0,631. -0,631 = -1/Km. Donc Km = 1,58 M