2A BIOMOLCULES Pr.

Sylvie DUCKI

ENSCCF

1. Les cellules vivantes 2. Acides nucliques 3. Protines 4. Enzymes et Coenzymes 5. Biosynthse

2

1. Cellules vivantes
Procaryotes
ADN libre dans la cellule

Eucaryotes
ADN dans un noyau

Bacteria Bactries vertes, flavobactries, cyanobactries

Archaea Sulfolobus, thermoproteus, thermofilum, methanobacterium, halobacterium

Eukarya Animaux, plantes, champignons, moisissures.

1.1. Structure des Eucaryotes

Membrane nuclaire Lysosome Centrosome Nuclole Noyau Ribosome

Mitochondrie

Cytoplasme

Rticulum endoplasmique rugueux (REr) Appareil de Golgi

Microtubule
Rticulum endoplasmique lisse (REl) Membrane plasmique
4

1.2. Le noyau
Noyau : contient le matriel gntique, sous la forme d'un complexe ADNprotines appel chromatine et compos de plusieurs units discontinues appeles chromosomes. Nuclole : zone du noyau o sont situs les gnes contrlant la synthse dARN ribosomal (ARNr) Pores Nuclole Chromatine Membrane nuclaire : bicouche qui comporte nuclaires Membrane un espace prinuclaire. nuclaire La membrane externe est en continuit
avec le REr L'espace entre les deux membranes est en continuit avec le lumen du REr. La membrane interne est recouverte par un rseau de protines qui joue un rle de soutien et participe l'organisation des mouvements de la chromatine pendant les diffrentes phases du cycle cellulaire.

REr

Pores nuclaires : permettent le transfert entre cytoplasme et noyau (sortie de lARN, entre des protines)

Chromosomes

Caryotype humain
23 paires de chromosomes, soit 46 au total. 23me paire : XX chez les femelles, XY chez les mles

1.3. La membrane plasmique

Bicouche lipidique qui dlimite la cellule Spare le cytoplasme du milieu extrieur Permet change entre milieux intro- et extracellulaire (recepteurs, transporteurs, canaux ioniques)
MEMBRANE PLASMIQUE NOYAU
O O O

O O P O O O

POLAIRE

NON-POLAIRE
n n

phospholipide

1.4. La mitochondrie
La membrane externe est pauvre en protines et contient une protine transmembranaire, la porine, qui permet le passage des ions et des mtabolites hydrosolubles de masse molaire < 10 kDa. La membrane interne est trs riche en protines mais elle est impermable aux ions et aux mtabolites hydrosolubles. La matrice contient les enzymes du cycle de Krebs et la plupart de celles qui catalysent l'oxydation des acides gras. Membrane Membrane interne externe La mitochondrie joue un rle important dans le mtabolisme de la cellule : Source principale de lnergie produite sous forme dATP Cycle de lacide citrique (Krebs) Catabolisme (b-oxydation) des acides gras Rgulation du calcium Matrice Crte 10 intracytoplasmique

1.5. Lappareil de Golgi

L'appareil de Golgi joue un rle important dans l'laboration et la maturation des protines. Il trie les milliers de protines synthtises dans la cellule et les achemine vers d'autres compartiments cellulaires, ou vers l'extrieur de la cellule. L'volution des composs contenus dans les diffrents compartiments de l'appareil de Golgi s'effectue de la face cis la face trans. Une fonction essentielle de l'appareil de Golgi est la maturation des glycoprotines (protines pourvues de chanes glucidiques) et la modification des protines qui lui parviennent par addition de divers groupements (phosphates, sulfates, ...) ou par coupure de certains fragments de protines.
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1.6. Lysosomes
Les lysosomes sont forms dans l'appareil de Golgi. Grce l'action des enzymes (lipases, protases, osidases) qu'ils contiennent, les lysosomes interviennent dans la vie cellulaire en assurant la digestion des substances nutritives ingres par la cellule, la dgradation ou le stockage des dchets du mtabolisme cellulaire dont la dure de vie est limite. Exocytose Endocytose Exocytose

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Endocytose / exocytose
Endocytose : (grec endon (dedans) et kutos (cellule)) Capture des molcules et particules (virus, bactries) par la cellule travers sa membrane.
Ex : Le cholestrol, prsent sous deux formes dans les vaisseaux sanguins : LDL (Low Density Liposoid) et HDL (High Density Liposoid). Le cholestrol ncessaire la matrice extracellulaire est pris dans le milieu extra-cellulaire par endocytose du LDL.

Exocytose : (du grec -exo "hors de" et de -kutos "cavit, cellule") processus inverse (scrtion).
Ex : expulsion des neuromdiateurs des vsicules synaptiques vers le milieu extracellulaire.

Endocytose

1 2

2 1
Exocytose

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1.7. Rticulum endoplasmique

Constitue un rseau de membranes au sein de la matrice cytoplasmique. Du fait de leur disposition parallle, cre par des canaux (citernes), de grandes surfaces membranaires sont cres.

Rticulum endoplasmique rugueux, REr : impliqu dans la synthse des protines (ribosomes)
Rticulum endoplasmique lisse, REl : impliqu dans la synthse des lipides complexes (sans ribosome) Ribosomes Volutes

REr

Citernes REl
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1.8. Le cytosquelette
Le cytosquelette est constitu de polymres polariss de protines :
Microfilaments, polymres dactine

Filaments intermdiaires

Microtubules, polymres de la tubuline

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Microfilaments
Appels galement filaments homopolymres d'actine. d'actine, les microfilaments sont des
Ces microfilaments adoptent une structure hlicodale par enroulement de deux brins d'actine F (F pour filamenteuse). Les protines d'actine s'associent tout d'abord entre elles pour former des trimres: il s'agit de la phase de nuclation. Les trimres se polymrisent sous forme de filaments.

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Filaments intermdiaires
Les filaments intermdiaires sont les lments les moins dynamiques du cytosquelette. Cependant ils ont un rle trs importants au niveau de la structure du noyau .
Cette structure est forme de protines fibrillaires assembles, l encore, de manire hlicodale. Les filaments intermdiaires participent au maintien de la forme cellulaire et l'ancrage des organites cellulaires (ex : mitochondries)

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Microtubules
Les microtubules sont les constituants les plus rigides du cytosquelette. a- et btubuline sassocient pour former un dimre, qui polymrise en protofilament. Lassociation de 13 protofilament conduit la microtubule.
Ces structures jouent un rle important notamment dans la division cellulaire (mitose), et dans les courants cytoplasmiques (guidage des vsicules). Cependant la coopration des microfilaments d'actine est ncessaire au droulement de ces processus. Les microtubules interviennent galement dans le maintient de la structure tridimensionnelle cellulaire.

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Fonction
Le cytosquelette contribue : la rgulation de la forme de la cellule lancrage aux membranes des cellules voisines (contact entre cellules) la formation de pores membranaires (important pour endo- et exocytose) le maintien de la structure interne de la cellule le transport des protines lintrieur de la cellule Bleu = noyau Vert = microtubules Rouge = actine

la sgrgation des chromosomes lors de la mitose

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1.9. Fonction mtabolique des organites

Maturation des protines Mtabolisme de l'oxygne Synthse d'ATP et NAD(P)H Oxydation des acides gras Cycle de lacide citrique (Krebs)

Synthse des acides nucliques ADN & ARN

rugueux : synthse des protines (ribosomes) lisse : synthse des lipides, mtabolisme des mdicaments

Dgradation des protines, lipides et polysaccharides

Forme cellulaire, contraction, mouvement, division cellulaire

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1.10. Fractionnement subcellulaire

Centrifugation diffrentielle
Centrifugation basse vitesse (1 000g, 10 min) Centrifugation moyenne vitesse (20 000g, 20 min)

Centrifugation grande vitesse (80 000g, 1 h)

Centrifugation trs grande vitesse (150 000g, 3 h)

Homognat tissulaire

Culot : cellules entires, noyaux, membrane plasmique

Culot : mitochondries, lysosomes

Culot : microsomes, petites vsicules

Culot : ribosomes, grosses macromolcules 21

1.11. Le cycle cellulaire

Mtaphase Alignement des chromosomes Anaphase Migration des chromosomes spars

Prophase Rupture de lenveloppe nuclaire, formation des microtubules, condensation des chromosomes G2 (Gap 2) La cellule se prpare a la division S Mitose Interphase

Tlophase Division du noyau

G1 (Gap 1)

G0

Synthse Croissance de la cellule de lADN

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Le cycle cellulaire est contrl par des complexes Cycline / Cdk (kinase cycline-dpendante) diffrents qui interviennent des moments prcis du cycle cellulaire.

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/cyclecellBM/images/CDK-cycle1.swf

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 Les Cdk forment des complexes htrodimriques avec les cyclines

Les complexes cycline-Cdk catalysent la phosphorylation de protines cibles ( = substrats) jouant un rle dans les vnements du cycle cellulaire

De cette phosphorylation, il rsulte un changement de conformation des protines cibles, ce qui entrane des proprits nouvelles pour ces dernires (activation, inhibition...).
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2. Acides nucliques
Rplication ADN ADN Transcription

Rplication
ARN

ARN
Traduction

Protines
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2.1. Structure des acides nucliques

Les acides nucliques sont des polymres dont lunit monomrique est le nuclotide.
Un nuclotide comporte 3 constituants : Phosphate-5-ose-1-N-base Les nuclotides sont associs en polynuclotides par formation de liaisons phosphodiester : base base base Phosphate-ose-phosphate-ose-phosphate-ose Par convention, lordre des nuclotides est lu en partant de lextrmit 5 vers lextrmit 3
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Phosphate Ose Base

2 types dacides nucliques

lacide dsoxyribosenuclique (ADN) Lose est le 2-doxyribose lacide ribonuclique (ARN) Lose est le ribose

Les bases sont : Adnine, Guanine, Cytosine Thymine (ADN) Uracil (ARN)

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Polynuclotide
Nucleotide
NH2 OH O P OH 5' O H H N N O H H O N N

La squence du polynuclotide est AGCT

O 3' H N NH O P OH O N O N N H NH2 H H H H NH2 O H N O P OH O O O N H H H H O H O NH O P OH O O O N H H H H OH H

DNA Strand Polynuclotide

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Appariement des bases

Deux brins dADN sont associs par des liaisons hydrogne entre les paire de bases puriques et pyrimidiques. Ladnine sassocie la thymine (A=T) et la guanine la cytosine (G=C).

Hydrophobic interactions (H-bonds)

O H N N H N N H H N N O N N H N H N H O N

H N N H N H H O NH

Adenine-Thymine

Guanine-Cytosine
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Watson-Crick Base Pairing

30

Double hlice dADN

LADN se dispose en double hlice dont les deux brins progressent en direction oppose (antiparallle). LADN humain contient: 2,9 x 109 paires de bases et mesure 990 000 mm Grand sillon

Petit sillon

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Polymorphismes de lADN

Les chaines tournent vers la droite (de bas en haut)

Hlice gauche

Triple hlice
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Structure de lARN
Contrairement a lADN, lARN est habituellement monocatnaire et possde typiquement de nombreuses liaisons hydrognes intra-chaine

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2.2. Dnaturation et rappariement

Exprimentalement, la dnaturation est obtenue par chauffage Tm ou en augmentant le pH a 12. La temprature laquelle 50% des deux brins dADN sont spars est la temprature de fusion (Tm).

Dnaturation

Rappariement

Chauffage Tm

Refroidissment

ADN

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Ltude cintique de la dnaturation seffectue par mesure de labsorbance de la solution dADN la longueur donde dabsorption maximale des bases (~260 nm) Coube Cot

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2.3. Rplication de lADN

La rplication de lADN est semi-conservative Fourche de rplication

Brin parental

Brin fille

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1) Initiation Ouverture de lADN par laction des hlicases (rupture des liaisons H entre 2 brins) et interaction avec SSB pour viter reformation du double brin. Droulement de lADN par laction de topoisomrase. 2) Elongation progresse dans le sens 5 vers 3 pour le brin direct laide des polymrases d qui ajoutent les nuclotides. Pour le brin indirect, lADN polymrase a a besoin dune amorce dARN, cre par la primase. 3) Terminaison Arrt de la rplication lorsque deux fourches de rplication de rencontrent.

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2.4. Raction de polymrisation en chaine (PCR)

La PCR permet lamplification de 10100,000 fois dun fragment dADN.

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1) lADN est dnatur par la chaleur (1 min 94C)

2) LADN est appari aux amorces (45 sec 54C)

3) A partir des amorces, la polymrase thermostable Taq procde lextension de chaque chaine (1 min 72C)
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40

2.5. Squenage de lADN

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1) Rplication

Une ADN polymrase synthtise le brin complmentaire de l'ADN squencer.

Dans le milieu de raction se trouvent des nuclotides dNTP en grand nombre, et une faible proportion d'un nuclotide terminal ddNTP (Adnine, ou Guanine, ou Thymine, ou Cytosine). A un moment totalement alatoire, un nuclotide ddNTP sera ajout la chane en cours de synthse par l'ADN polymrase. Cette synthse s'arrtera donc cet endroit.

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2) Sparation des brins de longueurs diffrentes par lectrophorse

3) Sequencage La lecture du gel se fait horizontalement de haut en bas en notant chacune des bandes: GGA CGA CCG GTA AAC T

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Automatisation du sequenage

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45

2.6. Transcription et traduction

5' A T G T T C A C T T A G 3'

brin d'ADN non-transcrit

ADN
T 3' T A C A A G T G A A T C A C A A G T G A A T C 5'

brin d'ADN transcrit

TRANSCRIPTION codons
A 5' A U U G G U U U U C C

le code gntique de l'ADN est transcrit par l'ARN

A A C C U U U U A A G 3' G

mARN

Methionine Phenylalanine Threonine TRADUCTION N-formyl methinonine (START)

H
SMe O N H H N O Ph Me O N H OH OH O

STOP

L'information stocke sur l'ARN est traduite en acide amins. STOP

Protine

46

Le code gntique

47

48

3. Protines
Protine vient du grec protos, qui veut dire premier, ce terme fut introduit par un hollandais en 1836 avec l'ide que ces molcules avaient un rle de premier ordre et taient trs importantes. Elles rsultent de l'assemblage des acides amins en une chane linaire non ramifie. Structure gnrale des acides amins

Chaine latrale

R
Fonction amine

H3 N

O O

Fonction acide carboxylique

49

3.1. Structure des acides amins

Il existe 20 acides amins naturels Les acides amins sont chiraux, sauf la glycine R = H Les acides amins sont de configuration S, sauf la cystine R = CH2-SH

R H 3N O O

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Acides amins aliphatiques

Ces acides amins sont hydrophobes et apolaires.

H2N
Pas de C* R=H GLYCINE GLY G

O OH
H2N

CH3 O OH
R = CH3 ALANINE ALA A

H2N

O OH

H2N

O OH

H2N

O OH

R = CH(CH3)2 VALINE VAL V

R = CH2CH(CH3)2 LEUCINE LEU L

R = CH(CH3)CH2CH3 ISOLEUCINE ILE I 51

Acides amins imino-acide

La proline ne rpond pas la formule gnrale des acides amins. La fonction imino rend cet acide amin peu flexible.

fonction imino

N H
PROLINE PRO P

O OH

Chaine latrale lie a la fois au C et a N

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Acides amins aromatiques

Ces trois molcules sont responsables dinteractions hydrophobes (Van der Walls). A lintrieur des protines elles contribuent a stabiliser la structure spatiale. Les noyaux aromatiques contiennent les electrons p dlocaliss qui absorbent fortement dans lUV = permet le dosage des protines en solution

phnol
O OH
PHENYLALANINE PHE F

OH
indole NH O OH
TRYPTOPHANE TRP W
53

H 2N

H2N

O OH
TYROSINE TYR Y

H 2N

Acides amins hydroxyls

Ces deux molcules participent a llaboration de liaison hydrogne. Elles peuvent aussi (avec Tyr) fixer un groupement phosphate (phosphorylation).

OH H 2N O OH
SERINE SER S

OH H 2N O OH
THRONINE THR T

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Acides amins soufrs

Avec latome de soufre, ces molcules peuvent tablir des liaisons covalentes : pont disulfure entre 2 cystines.

SH H 2N O OH
CYSTEINE CYS C

H 2N
MTHIONINE MET M

O OH

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Acides amins dicarboxyliques

Ces acides amins sont a la fois donneurs et accepteurs de protons liaison hydrogne. Lorsquils sont chargs, ils peuvent former des liaisons ioniques.

O OH O OH

fonction acide carboxylique

OH

H2N

H2N

O OH

ACIDE ASPARTIQUE ASP D

ACIDE GLUTAMIQUE GLU E

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Acides amins dicarboxyliques amides

O NH2 O OH
ASPARAGINE ASN N

fonction amide

NH2

H2N

H2N

O OH

GLUTAMINE GLN Q

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Acides amins possdant deux groupements basiques

NH2 H2N O OH
LYSINE LYS K

N imidazole N H O OH
ARGININE ARG R

fonction geranidinium H N H2N O OH

ARGININE ARG R

H 2N

NH NH2

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3.2. Proprits des acides amins

En solution aqueuse, l'acide amin s'ionise, et a une forme dissocie appele zwitterion. Le zwitterion a la possibilit d'avoir des charges positives ou ngatives un pH donn. pH = 1
R H H3N O OH solution acide K1 R H H3N O O zwitterion H2O R H H2N O OH acide amin cristallin K2

pH = 14
R H H2N O O solution basique

59

60

Cas de lalanine

pKa1 2.34

pKa2 9.69 pH

H3N

O OH H3N O

H2N O

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Ionisation des chanes latrales

Histidine
+ H

Lysine
NH3 NH2 + H

HN

NH

HN

Cystine
Tyrosine
SH
OH O + H

+ H

Thronine / serine
OH O + H

Acide aspartique / Acide glutamique

Arginine
COOH COO + H
NH NH2 H2N H2N NH NH
62

+ H

Cas de lacide glutamique

pKa1 2.2

pKa2 4.3

pKa3 9.7 pH

COOH

COOH

COO

COO

H3N

O OH H3N O

H3N O

H2N O

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Point isolctrique (pI)

Le pH auquel la concentration de lion ammonium et lion carboxylate sont prsents en mme temps sappelle le point isolctrique (pI). La charge globale de la molcule est neutre. pKa1 2.4 pI 6.1 pKa2 9.9 pH

H3N

O OH H3N O

H2N O

pH = pI = 6.1 100% de la forme zwitterion

On utilise cette proprit des acides amins pour les sparer dun mlange en utilisant une technique qui sappelle lectrophorse.
64

pI des acides amins

ASP GLU CYS ASN THR TYR GLN SER MET TRP

2.98 3.08 5.10 5.40 5.60 5.63 5.65 5.68 5.74 5.88

PHE VAL LEU ILE GLY ALA PRO HIS LYS ARG

5.91 6.00 6.04 6.04 6.06 6.11 6.30 7.64 9.47 10.76
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3.3. Sparation des acides amins

Le mlange est appliqu sur un gel qui est tremp dans une solution tampon aqueuse et des lectrodes sont branches chaque extrmit du gel.
+ Glycine (pI = 6.0) Arginine (pI = 10.7) Gly ne migre pas Arg, charg +, migre vers -

Ac. glutamique (pI = 3.2) Glu, charg -, migre vers + Mlange Papier pH 6 Un potentiel lectrique appliqu et les acides amins chargs ngativement migrent vers llectrode positive. En mme temps, les acides amins chargs positivement migrent vers llectrode ngative.
66

lectrophorse

67

lectrophorse

68

3.4. Biosynthse des acides amins

69

3.5. Structure des protines

Liaison peptidique

R1 H3N COO + H3N

R2 COO

-H2O H3N

R1 O

H N R2

COO

liaison peptidique H d N

d O

70

71

Structure primaire des protines

La squence dacides amins constitue la structure primaire
OH NH2 HOOC H N O O N H H N O O N H H N O O N H OH OH O

N
Terminal N toujours a gauche

H2N

Asp Val Tyr

Ile Gly Ser Lys

Terminal C toujours a droite

DVYIGSK

72

Structure secondaire des protines

Repliement local de la chane peptidique Hlice - a

73

Structure secondaire des protines

Repliement local de la chane peptidique Feuillet - b

74

Structure secondaire des protines

Boucles et coudes

75

Structure tertiaire des protines

Repliement global de la chane (3D)

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Structure quaternaire des protines

Certaines protines existent sous la forme de polymre

Hmoglobine (ttramre)

Tubuline (dimre)

77

Structure de protines Insuline (51 aa)

Dimre

78

Structure de protines Ocytocine (9aa)

Pont disulfure

79

3.6. Purification des protines

Trois types de chromatographie utiliss pour purifier les protines

80

Electrophorse monodimensionnelle

81

Electrophorse bidimensionnelle

82

3.7. Squenage des protines

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3.8. Structure 3D des protines

84

Reprsentation des protines

Squence 3 lettres : Gly-Phe-Ala-Tyr-Val-Gly-Leu-Glu-Phe-Arg-Cys Squence 1 lettre : MRECISIHVGQAGVQIGNACWELYCLEHGIQPD Structure 3D Cartoon Surface

85

3.9. Synthse peptidique sur support solide

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Gly-Ala
Ala + Gly

Ala-Gly

Gly-Gly

Ala-Ala

Mlange de dipeptides
87

The Nobel Prize in Chemistry 1984 was awarded to Bruce Merrifield "for his development of methodology for chemical synthesis on a solid matrix".

Merrifield resin

88

couplage
R1 Fmoc N H
OH

Dprotection Fmoc
R1 Fmoc
R1

N H

O O

N H

O O

R2 Fmoc N H
OH

couplage
R1 N H O O

O
H N O R2

La synthse peptidique de fait du C vers le N

Fmoc

Dprotection Fmoc
H H N O R2 N H R1 O O

TFA
H H N O N R2 H R2 H N O O N R2 H R1 OH O
H H N O R2 N H R2 H N O O R2 N H R1 O O

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3.10. Fonction des protines

La myoglobine transporte loxygne

La myoglobine a une structure compacte et riche en hlice-a.

Loxygne est fix sur la myoglobine grce lhme (structure non-peptidique = prosthtique)
Le fer (Fe2+) joue un rle majeur dans cette fixation (6 liaisons de coordination)

91

La tubuline constitue le cytosquelette

Tubulin heterodimers alpha tubulin beta tubulin Microtubule Side view Top view

92

Les immunoglobulines (Ig) dans la reconnaissance

93

Les rcepteurs dans le transport

Protines immerges dans la bicouche lipidique qui contiennent des pores pour permettre le passage de molcules deau, dions (canal ionique) tels que Na+, Ca++, K+ Ces rcepteurs peuvent tre activs (ouverts) par des agonistes ou dsactivs (ferms) par des antagonistes.

94

4. Enzymes et coenzymes
Les transformations chimiques dans les cellules sont catalyss par des enzymes (catalyseur) en prsence de coenzymes (ractifs) pour transformer des substrats en produits.

Enzyme Substrat Coenzyme Produit

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4.1. Proprits des enzymes

Protines qui peuvent catalyser des ractions chimiques. Le repliement de ces protines est important pour crer la conformation spatiale du site actif, dans lequel les substrats subissent une transformation en sy liant pour former un complexe ternaire enzyme-coenzyme-substrat puis donner le produit.

Substrat Coenzyme

Produit

Enzyme

Complexe ternaire Enzyme-coenzyme-substrat

Enzyme 96

Le site actif
Le site actif est la rgion de lenzyme dans laquelle les chaines latrales des acides amins sont organises pour se lier au substrat.

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Interactions entre enzyme et substrat

Liaisons covalentes (200 kJ/mol) S S Liaisons ioniques (20-40 kJ/mol) COO+H N 3

Liaisons hydrognes (10-60 kJ/mol) X-H d- d+ HBD

Interactions Van der Waals (2-4 kJ/mol)

Y dHBA

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hydropobe
vdw
H C H H3C H2C H C CH3 CH2 C H CH3

SUBSTRAT LIGAND
NH3 O H O
+

H3C

Liaison H H O O H O ionique

Liaison H
O

RECEPTEUR ENZYME
PRINCIPAUX TYPES DE LIAIS ONS ENTRE UN LIGAND ET UN RECEPTEUR
99

4.2. Fonction des enzymes

Les enzymes sont classes selon leur activit. 1. Oxydorductase / dshydrognase Catalyse les ractions doxydation ou de rduction Oxydase : oxydation dalcool en ctone Rductase : rduction de double liaison 2. Transfrase Catalyse le transfert de groupement fonctionnel Kinase : transfert de phosphate Mthyltransfrase : transfert une carbone 3. Hydrolase Catalyse les ractions dhydrolyse Esterase : hydrolyse les esters Peptidase : hydrolyse les liaisons peptidiques Glucosidases : hydrolyse les polysaccharides Nuclase : hydrolyse lADN
100

4. Lyase Catalyse la rupture de liaisons chimiques spcifiques Decarboxylase : rupture C-COOH Aldolase : rupture C-C Dhydratase : rupture C-O 5. Isomerase Catalyse le rarrangement dune molcule en son isomre Racmase : racmisation Epimrase : pimrisation Cis-trans isomrase 6. Ligase Catalyse la condensation de deux molcules C-O synthtase C-S synthtase C-N synthtase

101

4.3. Coenzymes
Les coenzymes (CoE) sont des molcules organiques ncessaires la fonction enzymatique. Elles sont des co-substrats essentiels au fonctionnement de lenzyme.

Classification des Coenzymes :

CoE doxydorduction Nicotimamide adnine dinuclotide (NAD+/NADH) Nicotimamide adnine dinuclotide phosphate (NADP+/NADPH) Flavine adnine dinuclotide (FAD/FADH2) CoE de transfert de groupements Adnosine triphosphate (ATP/ADP/AMP) Coenzyme A (CoA-SH) Thiamine Acide lipoque Biotine Coenzymes foliques S-Adnosine mthionine (SAM)
102

Adnosine Triphosphate (ATP)

Adnine

Ribose AMP ADP ATP ATP est impliqu dans de nombreuses ractions de transfert de phosphate avec les kinases: Kinase Substrat Produit P

ATP

ADP
103

 Lhydrolyse de lATP en ADP est associe une forte variation dnergie ngative (raction exothermique qui fournit de lnergie la cellule)
H O H NH2 N N O HO OH N N H2O H+ OO O P O P O O O O HO OH Pi NH2 N N N N + H O O P OO-

OO O O P O P P O O-O O O

G = - 30.5 kJ.mol-1

Adenosine triphosphate (ATP) H2O G = - 45.6 kJ.mol-1 H+ OO P O O O NH2 N N N N + HO O OP P O O-O O

Adenosine diphosphate (ADP)

HO OH Adenosine monophosphate (AMP)

Inorganic Pyrophosphate (PPi)

104

 La forte variation ngative dnergie libre associe permet de nombreuses ractions de se drouler.

lhydrolyse de lATP

Ex: Phosphorylation du glucose

ATP + H2O Glucose + HPO4 2Glucose + ATP ADP + HPO4 2- + H+ Glucose 6-phosphate + H2O Glucose 6-phosphate + ADP + H+ G2 = - 30.5 kJ.mol-1 G1 = + 13.8 kJ.mol-1 GT = - 16.7 kJ.mol-1

Une raction apparemment endothermique (G = + 13.8 kJ.mol-1) devient exothermique (G = - 16.7 kJ.mol-1) en rendant le OH meilleur groupe partant. Le phosphate est plus ractif

105

Le systme redox NAD(P)H / NAD(P)+

D-Ribose Acide D-Ribose Nicotinamide pyrophosphorique Adnine

NAD+ R = H NADP R =
+

NH2 N N N N O O P P O OO O O O O N

O NH2

P O O O

HO OH HO OR Nicotinamide adenine dinucleotide [NAD(P)+] H H O N N N O O

-

NADH R = H NADPH R =
- P O O O -

NH2 N P P O OO O O O

NH2

HO OH HO OR Reduced Nicotinamide adenine dinucleotide [NAD(P)H]

106

 Le coenzyme NAD+ est impliqu dans les raction doxydation.

O NH2

H H

O R

Oxidation

H H O N NH2 NADH

O R

NAD+
"H-"

Le coenzyme NADPH est impliqu dans les ractions de rduction.

H H O N NH2 NADPH

O R

Reduction N

O NH2 NADP+ H

OH R

107

Flavine adnine dinuclotide (FAD)

Le couple rdox FAD/FADH2 est impliqu dans les ractions doxydorduction des systmes conjugus (b-oxydation).
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) R N N O O H H O H Reduced Flavin Adenine DinucleotideFADH2 Me Me O R N N H H N O NH O

H
N O NH

Me Me

Oxydation Rduction

:B

108

La thiamine (Vitamine B1)

NH2 N N N H S OPP pH~7 N NH2 N S OPP R1

S R2

N Thiamine pyrophosphate (TPP)

La thiamine est implique dans les ractions de dcarboxylation oxydative, au cours desquelles la perte de CO2 dun acide a-ctonique saccompagne de loxydation de l aldhyde obtenu en acide.
O 2 O Acide pyruvique OH -2 CO2 O Thiamine OH

109

Le Coenzyme A (CoASH)
Acide pantothnique Thiotha- b-alanine Acide pantoque nolamine ADP

NH2
Coenzyme A (CoASH)

O HS N H N H

O Me Me O OH
-

N P P O O-O O O O N O HO OH N

Addition dAcetate

NH2
Acetate de Coenzyme A (CoASAc)

O Me O S N H N H

O Me Me O OH O O P P O OO O HO O

N N OH N

110

 Ladditon de lactate sur CoA fait intervenir deux autres coenzymes : thiamine pyrophosphate (TPP) et acide lipoique.
O HS N H CoASH R

TPP, Lipoic acid Pyruvate

O Me O S N H R

CoASAc

NH2 N N N

H S OPP pH~7 N

NH2 N S OPP

R1

S R2

N Thiamine pyrophosphate (TPP)

CO2H Lipoic Acid

Binds to enzyme via acid

R3

111

Pyruvate
O Me R1 N CO2S R
2

Me + H+ R
1

OHO S O R2

decarboxylation -CO2

Me R1 N

OH
S

H S R3

SN

S R2

Lipoic acid
SN-like displacement of enamine on S of lipoic acid

TPP
O Me O R N H CoA-SH
Acyl transfer

b-hydroxy acid

Enamine

SH S R
3

O Me R
1

SH S R3

Me R1 N

H HS O S S R2

R3

acetyl on lipoic acid

SH

S R2

Me

Elimination of TPP Me (catalytic nucleophile)

O R N H

Me

O S

H S

R3 SH

O Me O S N H R SH SH R3

S FAD FADH2

R3

acetyl on coenzyme A

CoA-SAc

112

 Le CoA-SAc fonctionne comme un groupe activateur dans de nombreuses ractions de transfert du groupe acyle. Il intervient notamment dans la biosynthse des acides gras et des polyctides. La raction de Claisen est plus favorable si le CoA-SAc est converti en malonate-S-CoA par dcarboxylation en prsence dion bicarbonate (HCO3-), ATP et la coenzyme biotine (Vitamine H).
Phosphorylation
O H O O ATP ADP H O O OP

O HN S O Biotin-Enzyme NH Enzyme O

O N

O NH S R

Bicarbonate HCO3-

Mixed anhydride

O CoAS

O CoAS

-CoASH
CoAS

O O SCoA CH3

H3C

SCoA
O O O CoAS

HN +

NH

- CO2

n x malonyl-SCoA CO2 O CoAS n O O O

"Claisen-type" decarboxylation

S R H Malonyl-SCoA Biotin-enzyme

poly-b-keto ester

H acide pKa ~ 10

113

Coenzymes foliques
Le transfert dun carbone peut impliquer lacide folique (Vitamine B9), sous sa forme de ttrahydrofolate.

Acide folique

114

methylenetetrahydrofolate
H2N N N OH NHR N H N Ring opening H B+

Ammonium salt H H2N N N

H2N
N N OH OS HN

N N

H N

Base covalently NHR bound to coenzyme

N HO O
B

NHR

O
2-

HN
N S

O3P O O

HN N O HO

H N dRP S

Enzyme

dRP Enolate

dUMP

H2N N

H N NHR N

acidic H a to C=O)
H N NHR

Thymidylate synthase Methylenetetrahydrofolate

O
2-

H2N N

HO O-

dihydrofolate
H H H

O3P O O

HN N O HO

CH3
O

HN N S

1,4-addition
HN O

HO O

N H

free coenzyme!
HB+

dTMP

dRP enolate = not stable

N dRP

115

S-Adenosyl methionine (SAM)

Biosynthse de SAM partir de lATP et la mthionine :
+

H3N

CO2+

OHO O O P O P P O O-O O O O

NH2 N N N N Me S Methionine

H3N

CO2N

NH2 N N
+ PPPi

Me

O S-Adenosylmethionine HO OH HO OH transferase, Mg2+ Adenosine triphosphate (ATP) S-Adenosyl methionine (SAM)

Le rle principal de SAM est le transfert dun groupement mthyle par substitution nuclohile de type SN2.
+

H3 N

CO2N

SN2
Me Nu HO S O

NH2 N N N OH
116

SAM may be regarded as 'biological methyl iodide'

H O
+

H3N

CO2N

H3N

CO2N

NH2 N N N O

NH2 N N N O

O Me -H+

Me -H O

HO H O

OH

HO Me

OH

H Me

Me

117

4.4. Examples

118

119

5. Biosynthse
Quest ce que la biosynthse? La biosynthse est la production de molcules par les cellules vivantes. Quest ce que le mtabolisme? Le mtabolisme est lensemble des transformations molculaires qui se produisent dans la cellule vivante. Dans une cellule, des molcules sont synthtises et dgrades par une srie de ractions (bio)chimiques, chacune tant catalyse par une enzyme. Catabolisme: Lensemble des ractions de dgradation de molcules / mtabolites complexes en composs moins complexes. Les ractions de catabolisme sont des oxydations (ou des dshydrognations) et elles sont thermodynamiquement favorables, c'est--dire qu'elles sont exonergtiques (cdant de l'nergie, produisant de l'nergie). Anabolisme: L'ensemble des ractions chimiques permettant la synthse de mtabolites essentiels partir des lments de base fournis par l'alimentation. Les ractions d'anabolisme sont des rductions et sont endonergtiques (qui consomment de l'nergie).
120

5.1. Principales voies de mtabolisme

121

Catabolisme (dgradation) / Anabolisme (biosynthse)

Le catabolisme est l'ensemble des ractions de dgradations molculaires de l'organisme considr. Les ractions de catabolisme sont des oxydations (ou des dshydrognations) et elles sont thermodynamiquement favorables, c'est--dire qu'elles sont exonergtiques (cdant de l'nergie, produisant de l'nergie).

L'anabolisme est l'ensemble des ractions chimiques des organismes vivants permettant la synthse de mtabolites essentiels partir des lments de base fournis par l'alimentation et aboutissant la construction ou au renouvellement des tissus. Les ractions d'anabolisme sont des rductions et sont endonergtiques (qui consomment de l'nergie).
122

Consommation alimentaire (protines, glucides, lipides)

Macromolcules

ATP

ADP
Catabolisme NADPH Anabolisme

NADP+

CO2 Petites molcules (glucose, pyruvate)

123

5.2. Catabolisme
Lessentiel de lATP et du NADPH forms dans la cellule pendant le catabolisme est produit au niveau des voies mtaboliques suivantes : La Glycolyse La b-oxydation des acides gras Le cycle de lacide citrique (cycle de Krebs) Glycolyse GLUCOSE NADPH, ATP NADPH b-oxydation ACIDE GRAS CoA-SAc FADH2, NADPH PYRUVATE CO2

Cycle de Krebs FADH2 NADPH ATP

124

5.2.1. La Glycolyse
Glycolyse GLUCOSE NADPH, ATP PYRUVATE

Loxydation du glucose mne au pyruvate.

125

126

phosphorylation

isomerisation OP
O OH

phosphorylation

HO HO

OH OH

ATP

ADP PO

OH O

ATP

ADP OP O

OP OH OH
cleavage

OH Glucose

hexokinase HO

OH phosphoOH OH glucose HO OH isomerase Fructose

Oxidation NADH NAD+

Phosphofructose kinase

HO

OP O HO ketose

aldolase OP O HO

phosphate transfer ATP CO2H OP ADP

HO

HO

CO2P

3-phosphoglyceraldehyde OP dehydrogenase ADP ATP phosphorylation

O HO OP aldose

OH HO OP

isomerisation

phosphoglycerate mutase CO2H enolase HO2C OH dehydration

PO

ADP ATP OP HO2C pyruvate kinase

pyruvate

127

L'isomrisation implique une tautomrisation cto-nol

H+

PO HO

OH OH

PO HO

OH O H OH H OH

PO HO

OH OH OH OH

OH glucose 6-phosphate

phosphoglucose isomerase

OP O

OH
PO

OH H OH O OH

fructose 6-phosphate HO

OH OH

HO

128

OP O HO OH HO OP Aldolase HO

OP O dihydroacetone (ctose)

O HO OP
OP H

Glyceraldehyde (aldose)

OP O HO O H HO OP

RetroAldol Reaction

PO HO enolate

O H H + O

O HO B: H ketose tautomerism (keto - enol) H HO OP OH enol

129

:B HO

OP aldose

H H O N

"H "
Enzyme S
O HO OP

O NH2 NAD
+

N NADH

NH2 O O - P O O O HO OP
-

Enzyme S H O HO H OP

Enzyme S

[ox] thiol ester

hemithioacetal
3-phospho glyceraldehyde dehydrogenase

SN on C=O
Enzyme S
HO CO2P OP

Enzyme S OP O HO OP

130

Bilan de la Glycolyse

C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 HPO42- + 2 ADP Glucose

O 2 H3C COO pyruvate

+ 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+

131

5.2.2. Le pyruvate
Pour tre mtabolis, le pyruvate produit au cours de la glycolyse doit tre transform en CoA-SAc.

CH3 C O

Pyruvate dshydrognase

CH3 C S O

COOH

CoA

CoA NAD+ Pyruvate

NADH CO2 CoA-SAc

Cf. diapo 112

132

5.2.3. b-oxydation des acides gras

b-oxydation ACIDE GRAS CoA-SAc FADH2, NADPH

Les acides gras sont oxyds dans les mitochondries.

133

 Leur dgradation procde par tapes successives; une unit de 2C est limine chaque tape. ATP
R O O

OH R

AMP

CoA-SAc
R O

CoA

Acide gras

Acyl adnylate

Acyl CoA

Oxydation FAD
FADH2

Oxydation
S R O O CoA S R OH O CoA

Hydratation
S R O CoA

3-ketoacyl CoA

NADH NAD+

L-3-hydroxyacyl CoA

H2O

trans-2-Enoyl CoA

Thiolyse

CoA-SH

R O

S CoA + O

CoA

Acyl CoA (-2C)

CoA-Sac

134

 Dans le cas de lacide palmitique (C16) :

C16-CoA + 7 FAD + 7 NAD+ + H2O + CoA

b-oxydation

8 CoA-SAc + 7 FADH2 + 7 NADH + 7 H+

Cycle de Krebs

135

5.2.4. Le cycle de Krebs

Glycolyse GLUCOSE PYRUVATE

NADPH, ATP
NADPH

CO2

b-oxydation
ACIDE GRAS CoA-SAc FADH2, NADPH

Cycle de Krebs FADH2 NADPH ATP

136

Glycolysis Glucose

CoASAc
SCoA

Malic Acid

NAD+
CO2H

NADH
CO2H O SCoA

CoASH

OH CO2H CO2H HO2C

CO2H OH CO2H CO2H

Citric Acid

Fumaric Acid
FADH2 FAD
CO2H CO2H

Oxaloacetate

CO2H

Succinic Acid
CO2H

NADH NAD+
CO2H CO2H CO2H HO CO2H O CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H

CO2H

Aconitic Acid

CO2
O

a-Ketoglutaric Acid

Isocitric Acid
137

CO2

NADH NAD

138

O SCoA H

O SCoA HO2C CO2H

CoASAc :B-citrate synthase

Aldol
O H

OH CO2H CO2H Citric Acid

citrate synthase
Oxaloacetate CO2H CO2H HO2C CO2

aconitase-B:

E2 (-H2O)
CO2H

Succinic Acid
NADH decarboNAD CO2H
+

xylation
H H O N CO2H O O H NH2

H2O HO2C O

OH

Aconitic Acid

a-keto glutarate

CO2H

isocitrate dehydrogenase H

aconitase

conjugate 1,4-addition
CO2H

NADH

N O H2N

decarboxylation CO2

O HO2C

b-keto acid

Oxidation

H O CO2H H CO2H Isocitric Acid

139

NAD+

CO2H

NAD+

NADH O

1,4-addition fumarase
CO2H

CO2H

OH CO2H Malic Acid

oxidation HO2C malate dehydrogenase Oxaloacetate

as before

OH2
O OH Fumaric Acid

succinate dehydrogenase b-oxidation

FADH2 FAD CO2H Me Me FAD

R N N H

H+ N O NH O O O H Me Me FADH2

R N N H

H N

O NH

O O H

CO2H Succinic Acid

HO2C

HO2C

140

Bilan du cycle de Krebs

O SCoA CoASAc 3 NAD+ + FAD + ADP + HPO42- + 2 H2O

HSCoA + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + ATP + 2 CO2

141

5.3. Anabolisme
POLYCTIDES ALCALOIDES

GLUCOSE

Actyl de Coenzyme A

Acides amins

isoprne

PROTINES

TERPENES

STEROIDES

142