COLIMTRIE

Bibliographie : Microbiologie alimentaire 5me dition de C. et J.N. Joffin Activits technologiques en microbiologie Terminale BGB de G. Leyral, C. et J.N. Joffin, E. Verne, J.L. Larpent Rglement (CE) N2073/2005 de la commission du 15/11/2005 concernant les critres microbiologiques applicables aux denres alimentaires

2.1.4. Lecture

La colimtrie correspond aux mthodes de dnombrement des coliformes. Les techniques de colimtrie ont pour objectif le dnombrement et, ventuellement, lidentification des coliformes totaux, des coliformes thermotolrants (ou coliformes fcaux) ou dEscherichia coli en particulier. Lintrt de ces manipulations est de dterminer pour le produit test une contamination fcale et den apprcier lampleur, car les coliformes sont des bactries vivant principalement dans les intestins. De plus, les coliformes thermotolrants et Escherichia coli survivant difficilement hors de lintestin traduiront donc une contamination fcale rcente.

a. Si un tube par dilution La prsence dun trouble (culture) et la production de gaz dans la cloche (au moins 1/10 du volume de la cloche) permet de conclure la prsence dau moins un coliforme dans le mL dinoculum de la dilution teste. b. Si 2 ou 3 tubes par dilution On utilise la table de Mac Grady afin de dterminer statistiquement la quantit de coliformes prsents dans un mL de produit pur. (voir cours sur les techniques de dnombrement ). 2.2. En milieu solide
2.2.1. Milieux utiliss : glose au dsoxycholate ou glose VRBL

1. Tmoins de contamination fcale

1.1. Dfinitions
1.1.1. Coliformes totaux

Ces deux milieux contiennent du dsoxycholate qui inhibe les bactries Gram + (mais pas les coliformes), du lactose utilis comme source de carbone et dnergie et du rouge neutre (indicateur de pH permettant la lecture du caractre lactose : colonies rouges lactose +). Le milieu VRBL est plus slectif du fait de la prsence de cristal violet en plus du dsoxycholate.
2.2.2. Ensemencement

Un coliforme est une entrobactrie fermentant le lactose 30 ou 37 C avec production de gaz.

1.1.2. Coliformes thermotolrants

Le dnombrement est ralis dans la masse des milieux pr-cits en double couche.
2.2.3. Incubation

Un coliforme thermotolrant est une entrobactrie fermentant le lactose 44 C avec production de gaz.
1.1.3. Escherichia coli

24 heures 30C.
2.2.4. Lecture

Escherichia coli est une entrobactrie fermentant le lactose 44 C avec production de gaz et produisant de lindole 44 C. 1.2. Principe de base des techniques de dnombrement Tous les milieux utiliss contiennent du lactose. Les milieux liquides possdent une cloche afin de mettre en vidence la production de gaz. Un certain nombre de milieux utilisent des agents slectifs, inhibiteurs des bactries Gram + : vert brillant, cristal violet, dsoxycholate, Des milieux rcents chromognes permettent le dnombrement direct dEscherichia coli par mise en vidence de lactivit -glucuronidase.

Toutes les colonies rouges (lactose +) dun diamtre minimum de 0,5 mm en 24 heures sont considrs comme tant des coliformes. Les milieux contiennent un agent de diffrenciation : les normes prconisent alors de prendre en compte les botes contenant entre 15 et 150 colonies.

3. Dnombrement des coliformes thermotolrants

Il se ralise sans dnombrement pralable des coliformes par la mme technique en milieu solide (DCL ou VRBL) mais avec une temprature dincubation de 44C.

4. Dnombrement dEscherichia coli : test de Mackensie

Le test de Mackensie permet un dnombrement dEscherichia coli aprs avoir dnombr les coliformes totaux en milieu liquide (BLBVB 30 ou 37C). Il utilise la proprit dEscherichia coli de produire de lindole 44C et de fermenter le lactose 44C. 4.1. Milieux utiliss Un tube de BLBVB Un tube deau peptone 4.2. Ensemencement Pour chaque tube positif o lon souponne la prsence de coliformes en BLVB, on prlve une anse de culture que lon reporte dans un BLBVB et dans une eau peptone. 4.3. Incubation 24 48 h 44C 4.4. Lecture Le rsultat se rapportera au tube initial. Le tube BLBVB est positif sil prsente un trouble et que la cloche prsente du gaz (au moins un 1/10 du volume de la cloche). La lecture du caractre indole seffectue aprs ajout du ractif de Kovacs : la prsence dun anneau rouge permet de conclure indole + .
C. LARCHER

2. Dnombrement des coliformes

Le dnombrement des coliformes peut se faire, selon les produits, par des techniques en milieux liquides ou solides. La dmonstration de la nature coliforme nest jamais parfaite mais le principal est de suivre les normes permettant la standardisation des mthodes. 2.1. En milieu liquide
2.1.1. Milieu utilis : BLBVB + cloche (Bouillon Lactos Bili au Vert Brillant)

Ce milieu contient deux agents slectifs : la bile (ou dsoxycholate) et le vert brillant. Il contient des peptones et du lactose (caractre biochimique). Il ny a pas dindicateur de pH. La production de gaz se fait partir de lutilisation du lactose.
2.1.2. Ensemencement

1 mL de chaque dilution est introduit dans un tube de BLBVB + cloche. Homogniser linoculum afin quil se rpartisse dans tout le tube, cloche comprise.
2.1.3. Incubation

24 heures 30C.
C. LARCHER

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5.1.4. Lecture

Aspect des tubes aprs incubation 44C BLBVB Eau peptone

Interprtation

Conclusion E. coli

Genres bactriens probables

Lactose + avec gaz 44C Indole +

Prsence dau moins un E. coli dans le tube initial

Klebsiella Citrobacter

Lactose + avec gaz 44C Indole

Prsence dau moins un coliforme thermotolrant et de moins de un E. coli dans le tube initial

Autres bacilles Gram Bactries Gram +

Aspect obtenu Colonies de 2 3 mm de diamtre, plates, violet trs fonc, avec trs souvent un reflet mtallique Colonies grosses de 4 6 mm de diamtre, convexes, roses avec un centre violet, muqueuses Colonies violet ple avec un centre et un reflet mtallique peu marqu Petites colonies grises Trs petites colonies transparentes

Lactose (ou + sans gaz) 44C Indole +

Prsence de moins de un E. coli dans le tube initial

5.2. Identification Les principaux genres appartenant aux coliformes sont : Escherichia Citrobacter Klebsiella Enterobacter
5.2.1. Test IMViC (Indole rouge de Mthyle Voges Proskauer (inositol) Citrate)

Lactose (ou + sans gaz) 44C Indole

Prsence de moins de un coliforme thermotolrant dans le tube initial

Ce test classique de microbiologie alimentaire ne permet pas une identification trs prcise mais il est relativement peu coteux (ensemencement dune eau peptone, dun Clark et Lubs et dun Citrate de Simmons). Le tableau suivant permet de donner une conclusion approximative : Indole +
(parfois pour E. coli atypique)

RM + +

VP +

Citrate + +

Genre ou espce Escherichia coli Citrobacter Enterobacter ou Klebsiella

Remarque : le test de Mackensie peut tre remplac par le test de Schubert o le lactose est remplac par du mannitol.

(parfois + pour Citrobacter atypique)

5. Isolement et identification des coliformes

5.1. Isolement des coliformes
5.1.1. Milieu utilis : EMB (osine bleu de mthylne)

(parfois + pour Enterobacter atypique)

5.2.2. Galeries biochimiques

Ce milieu (de Lvine) ne contient pas dagents slectifs trs puissants (osine et bleu de mthylne ne font quinhiber partiellement la culture des Gram +) ni dindicateur de pH. On peut donc observer la culture de coques Gram + qui est en gnral faible.
5.1.2. Ensemencement

Galerie classique en macromthode ou galerie Api 20E.

6. Bilan de la recherche des coliformes

Isoler classiquement partir dun tube de BLBVB positif ou partir dun bouillon contenant des coliformes prsums.
5.1.3. Incubation

24 48 h 37C.

C. LARCHER

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