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WT hhySL
Hydrogen uptake by S. avermitilis WT and K.O.
for hhySL (in attomol.CFUth
-1
.h
-1
)
Variation in the abundance and expression of high-affinity hydrogenases in a forest soil after different NPK amendments.

Quentin LIOT, Frederic RAYMOND, Jacques CORBEIL, Patrick HALLENBECK, Philippe CONSTANT
1. Abstract
Dans le monde des hydrognases, un nouveau et cinquime groupe a t dcrit en 2008
et confirm en 2013. Mais l'existence d'enzymes oxydant lH
2
atmosphrique reste
tablir, car elles sont potentiellement le chainon manquant dans le cycle biogochimique
de lhydrogne atmosphrique. Ces hydrognases hypothtiques peuvent tre trouves
chez certaines actinobactries, principalement des Streptomyces, incluant Streptomyces
avermitilis, et est principalement exprim dans les spores bactriennes. Avec un protocole
de PCR-targeting adapt cette souche, nous avons cr un mutant de S. avermitilis KO
pour hhySL, les gnes des sous-units structurales des hydrognases haute affinit
hypothtiques, Grce cela, nous avons confirmons l'existence de ces hydrognases avec
un Km suffisamment bas pour permettre l'absorption de l' H
2
de l'atmosphre. Il s'agit de
la premire tape de la dcouverte d'une toute nouvelle protines dont le rle reste
largement incertain en dpit de quelques diffrences phnotypiques indiquant un rle
dans la maturation des spores et la survie bactrienne.

2. Introduction
Les microorganismes du sol jouent un rle important dans le recyclage des gaz
atmosphriques tat de traces. Paradoxalement, l'importance et l'impact de ces gaz sur
l'cologie et la biologie terrestre sont encore inconnus. Un de ces gaz, l'hydrogne
molculaire (H2), prsent 0,55 ppmv dans l'atmosphre, est indirectement responsable
de l'effet de serre en rduisant l'oxydation du mthane, un puissant gaz effet de serre.
Environ 80% des missions mondiales sont attnus par l'absorption biologique du sol de
lH
2
atmosphrique, une activit omniprsente dans pratiquement tous les types de sol.
3. Objectifs
4. Matriels et mthodes
6. Conclusions & perspectives
1) PCR targeting des gnes hhySL dans S. avermitilis

La dltion des gnes hhySL chez S. avermitilis a t faite en utilisant un protocole de PCR-
targeting dvelopp par Gust et al. En bref, les gnes hhySL, prsents sur un cosmide
comprenant 40kb du chromosome de S. avermitilis ont t remplacs par une cassette de
rsistance l'apramycine, pralablement amplifi par PCR et flanqu de 39 nuclotides
correspondant aux rgions en amont et en aval de hhyS et hhyL, respectivement. Ce
cosmide modifi a t transfr dans S. avermitilis par conjugaison avec une souche de
E.coli conjugative et ne mthylant pas lADN, et les colonies recombinantes ont t
slectionnes sur un milieu avec apramycine. La double-recombinaison a t confirme
dune part par une perte de la rsistance la kanamycine (confre par le cosmide) et
dautre part, par labsence damplifia lors dune PCR ciblant hhySL. Loxydation dH2 a t
mesure pour les souches WT et mutante via un test de chromatographie en phase
gazeuse (voir ci-dessous).

2) Impact de la dltion

a) Phnotype du mutant :

Le phnotype du mutant et de la souche sauvage sont compars en tant mis en
croissance durant 7 jours sur une mme glose partir dune biomasse quivalente. En
parallle, de la biomasse issue de gloses confluence incubes 7 jours a t rcolte, et
les quantits respectives de spores et dhyphes immatures ont t quantifes au
microscope optique via un hmacimtre. Ltalement sur ptri a permis de calculer et
comparer les taux de viabilit de la biomasse des deux souches.

b) Calcul du taux doxydation de lhydrogne :

Des biomasses quivalentes sont mises en bouteille dans une solution tampon permettant
lactivit hydrognase (Tris-HCL pH 7,2), et 3ppmV dhydrogne sont injcts dans ces
bouteilles, sclles avec septum. Les mesures du taux dH
2
sont faites sur plusieurs jours
pour calculer le taux doxydation dH
2
selon la biomasse. Un essai avec une biomasse de la
souche sauvage 10 fois suprieure celle utilise est aussi fait pour savoir si
laugmentation de la biomasse limite la diffusion, rduisant ainsi le taux doxydation.
5. Rsultats et Discussion
1. hhySL encode pour une hydrognase NiFe haute affinit responsable de loxydation
de lH2 par le sol.

2. Lhydrognase est hauement implique dans la maturation des spores et la survie
bactrienne chez S. avermitilis.

3. Le mcanisme liant hydrognase, maturation des spores et survie est encore
dcouvrir : un transcriptome diffrentiel entre deux deux souches, lune avec
500ppmv d.H
2
(saturant lenzyme) et une autre avec de lair ambiant, est envisag
pour la suite.
Cette activit est principalement lie une nouvelle
classe d' hydrognases NiFe (Fig. 2), qui dmontre une
affinit inhabituellement lev envers lH
2
ainsi quune
capacit doxyder l'H
2
atmosphrique. Cette forte
activit doxydation haute affinit de lH
2
a t
dcouverte dans certains Streptomyces possdant les
gnes codant pour HhyS et HhyL, les units structurales
de cette enzyme. Des donnes gnomiques issues
dtudes minires et environnementales ont montr
que les gnes codant pour l'hydrognase hypothtique
sont ingalement rpartis chez les Actinobacteria, ainsi
que les Proteobacteria, Chloroflexi et Acidobacteria
(Fig. 1).
Fig. 1: Arbre de type Neighbor-joining, cr
partir des squences traduites dacides amins des
gnes hhyL retrouvs dans les bases de donnes
publiques, les isolats de sols et dans les librairies
de clones issus du sol. Les microorganismes dans
lesquels l'activit d'oxydation de l'H2 haute
affinit a t dmontre sont signales par un
astrisque.
Fig. 4 : (A) Taux de viabilit de la biomasse rcolte sur
glose aprs 7 jours, tale sur MS-Agar. Dilution faite
pour obtenir en moyenne 1000, 100, et 10 colonies sur
glose. (B) Rapport spores / hyphes, visant dterminer
la biomasse mature de celle immature. (C) Quantit de
biomasse moyenne rcolte par glose produsant des
spores, exprime en logarithme dcimal.
7. Rfrences
8. Remerciements
Ce projet de recherche est support par une subvention CRSNG-Dcouverte
1Inactiver les gnes hhySL chez S. avermitilis pour prouver la fonctionnalit de
lhydrognase NiFe haute affinit
2. Identifier les impacts de la dltions sur le phnotype, loxydation de lhydrogne, et la
survie, de S. avermitilis.
Fig. 3: (A) Souche sauvage et mutant K.O. pour hhySL incubs 7 jours sur une mme glose de MS-Agar, La coloration grise
du sauvage vient des spores, matures et en grand nombre. (B) Les taux d'absorption dH2 mesurs par chromatographie en
phase gazeuse ont t utiliss pour calculer l'activit d'oxydation dH2 par UFCthoriques des deux souches sauvage et
mutante.
Le premier impact visible de la mutation est la rduction drastique de sporulation chez la
souche mutante. Au bout de 7 jours, tandis que la souche sauvage produit de grandes
quantits de spores matures, la souche sauvage fabrique ponctuellement des chaines de
spores non-pimentes, la pigmentation progessant durant la maturation des spores,
passant de blanches noires (fig. 3A). Etonnament, dautres espces de Streptomyces
sporulent normalement sans pourtant encoder pour cette protine.
Aprs avoir mis la mme biomasse des deux souches en prsence dhydrogne 3ppmV,
on remarque comme prvu une perte doxydation de lH
2
par la souche dlte pour
hhySL.

5. Rsultats et Discussion
Fig. 2: Arbre consensel de squences partielles d'acides amins
traduits partir de squences de gnes semblables hhyL
issues disolats de Streptomyces et de bases de donnes gnomiques
publiques. Les groupes L1 L4 ont t largement dcrits par Vignais
et Billoud (2007), le nouveau cluster haute affinit n'a pas encore
t document.
Cette absence de maturation et de sporulation fait drastiquement chter le taux de
survie, tant donn que seulement 15% (10%) des units formatrices de colonies
attendues poussent rellement sur glose., tandis que lon retrouve un taux de 121%
(23%) avec la souche sauvage, donc plus quattendu (fig, 4A). On peut donc penser que
lhydrognase est implique dans la survie de la bactrie, le mcanisme impliqu restant
dcouvrir. Cest dans ce but que nous prvoyons de faire une tude transcriptomique
visant dcouvrir quels gnes voient leur expression relie lhydrognase Dans la
biomasse, on remarque que la souche mutante produit beaucoup moins de biomasse (fig.
Cc) et que, lorsquelle sporule, elle produit plus dhyphes immatures par rapport aux
spores, que la souche sauvage (fig. 4B). Ceci permet de penser que lhydrognase est
implique dans la maturation des spores , ce qui pourrait expliquer la baisse de viabilit.
Constant, P., S.P. Chowdhury, L. Hesse, J. Pratscher, and R. Conrad., 2011. Appl. Environ.
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Mohanty, S.R., Bodelier, P.L.E., Floris, V., Conrad, R., 2006, Appl. Environ. Microbiol., 72(2):
1346-1354
B. A.
Sauvage Mutant
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
WT hhySL
Taux de survie de la biomasse rcolte de S.
avermitilis WT et K.O. pour hhySL (en %
dUFCrelles / UFC thoriques)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
WT hhySL
Rapport spores/hyphes dans la biomasse de s.
avermitilis WT et K.O. pour hhysl (en %)
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+02
1.0E+03
1.0E+04
1.0E+05
1.0E+06
1.0E+07
1.0E+08
1.0E+09
WT hhySL
Moyenne de biomasse rcolte par glose de
S. avermitilis WT et K.O. pour hhySL ( en UFC
thoriques )
A.
C.
B.