Biologie cellulaire

POINTS CLÉS
► « Le monde vivant, aussi bien animal que végétal, est constitué par des unités, les
cellules. » Pressentie par Dutrochet, cette théorie cellulaire prend réellement naissance avec
les travaux de Schwann et de Schleiden.
► Il existe deux types de cellules : les procaryotes dont l'ADN n'est jamais séparé par
une enveloppe et les eucaryotes dont l'ADN est séparé du cytoplasme par une enveloppe
constituée par une double membrane.
► Les cellules eucaryotes sont caractérisées avant tout par une compartimentation
morphologique qui souligne la compartimentation d'activités spécialisées. Cette
compartimentation a magnifié les possibilités métaboliques, fonctionnelles de la cellule et lui
permet d'acquérir des potentialités et des spécialisations hors de la portée des procaryotes.
► Les divers compartiments cellulaires, tous limités par une membrane, sont des
organites : chacun d'entre eux étant spécialisé et fonctionnant de manière interactive grâce à
des échanges et des systèmes complexes d'intercommunication. Cette compartimentation
renforce les potentialités physiologiques de la cellule et lui permet, en s'associant au tissu, de
constituer des organes hyperspécialises.

□
 Les techniques d'étude
de la cellule

I. Les microscopes
II. Les techniques de préparations
conventionnelles
III. L'histochimie
IV. Les sondes moléculaires
V. La quantification du fonctionnement cellulaire
VI. Les cultures cellulaires
VII. Les techniques de microdissection
VIII. Les techniques d'ultracentrifugation
IX. Les techniques de diffraction des rayons X

Le biologiste dispose actuellement d'un grand nombre de techniques et d'instruments particulièrement adaptés à l'étude de la
cellule. Il n'est pas possible de faire, ici, un inventaire complet.

I. Les microscopes

A. Microscope optique ou photonique en lumière transmise

Le microscope optique en lumière transmise permet d'étudier les cellules fixées (tuées sans modifications essentielles de leur
structure, en vue d'un examen au microscope) et colorées. Un objet éclairé en lumière trans mise est examiné à travers un
système optique comprenant un objectif, qui donne une image grossie de l'objet, et un oculaire qui permet l'examen de l'image.
Les grossissements atteints sont de l'ordre de 1 500 à 2 000 diamètres, avec un pouvoir séparateur de Î/IO* de micromètre. Il est
possible aussi de l'employer :
■ en lumière réfléchie : l'éclairage est alors vertical, éclairant l'objet de haut en bas ; la lumière réfléchie par l'objet est
transmise à l'œil de l'observateur par le système optique du microscope ;

■ en fond noir : l'éclairage est latéral ; le fond de la préparation est donc obscur ; seules les particules qui diffractent
les rayons lumineux en direction de l'oculaire s'illuminent. Les rayons lumineux n'atteignent pas l'objectif lorsque la préparation
microscopique est dépourvue de structure. Lorsque la préparation contient des particules, la lumière est dif-fractée et certains
rayons traversent le système optique du microscope.

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B. Microscope polarisant

Le microscope polarisant est un microscope photonique ordinaire pourvu de

deux polaroïds (ou niçois) : l'un est placé entre la lumière et l'objet, l'autre dans
l'oculaire. Les niçois étant croisés, on obtient normalement l'extinction (la
lumière ne parvient pas à l'œil de l'observateur) : mais lorsque des particules ou
des structures sont anisotropes, elles apparaissent brillantes et se détachent sur
le tond sombre. Ce microscope est surtout utilisé en cristallographie : dans
l'étude des cellules, il donne des images de toutes structures dont les molécules
sont orientées, par exemple les fibres musculaires, le fuseau mitotique constitué
par de nombreux microtubules tous orientés de la même manière, les filaments
de myosine du muscle strié, les chloroplastes, les parois cellulaires végétales, la
paroi des cellules végétales. Sa résolution est inférieure à celle de la
microscopie photonique.

C. Microscope à contraste de phase

Le microscope à contraste de phase est surtout utilisé pour étudier des cellules
vivantes, en culture.
Les objets d'amplitude et les objets de phase agissent sur la lumière transmise
de deux manières différentes :
• les objets d'amplitude diminuent l'amplitude de la vibration électromagnétique :
ils sont visibles en microscopie photonique classique ;
* les objets de phase transparents et réfringents ne sont donc pas visibles en
microscopie optique conventionnelle, car ils n'absorbent pas les radiations
lumineuses : la vibration réfractée est retardée de 1/4 de longueur d'onde. L'œil
ne décèle pas ce retard de phase. Au cours de l'examen d'une cellule en
microscopie photonique ordinaire, l'œil perçoit la somme des ondes incidentes
et d'ondes diffractées par l'objet examiné. Le miao-scope à contraste de phase
augmente cette différence de phase de 1/4 de longueur d'onde et produit ainsi
un phénomène dit « phénomène d'interférence » qui provoque une baisse
d'amplitude de la lumière transmise : l'objet semble se comporter comme un
objet d'amplitude.

D. Microscope à fluorescence
Ce type de microscope permet de voir les molécules qui émettent des photons
de longueur d'onde déterminée après excitation par une source lumineuse. Ces
molécules portent le nom de fluoro chromes. Un microscope optique à
fluorescence possède une source de lumière blanche très intense (lampe à
mercure). Cette lumière traverse un filtre dit d'excitation, ne laissant passer
qu'une fenêtre de longueurs d'onde qui est réfléchie, en direction de l'échantillon
biologique, par un miroir dichroïque. Les molécules fluorescentes alors excitées
émettent une lumière visible de longueurs d'ondes spécifiques, qui est
concentrée par une lentille objectif et sélectionnée sur un filtre d'émission.
L'image observée avec le microscope à fluorescence est la somme des images
situées en avant et en arrière du plan sur lequel la mise au point a été faite. Le
fluorochrome est fixé par covalence à une protéine dont on souhaite connaître
la localisation dans la cellule (comme l'actine, la tubuline). La protéine marquée
est injectée dans des cellules vivantes, par exemple en culture. Attention, ce
marquage peut empêcher ces protéines marquées

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 Les techniques d'étude de la cellule wi

d'intervenir dans les activités cellulaires normales de la cellule. Leur localisation en microscopie à
fluorescence est facile, il est possible de suivre leur parcours intracellulaire et ainsi d'étudier les activités
dynamiques auxquelles elles participent.

E. Microscope con focal à balayage

Le microscope confocal (fig. 2.1) est un microscope dont la source lumineuse est un laser et qui permet,
grâce à un montage optique particulier, d'obtenir uniquement l'image du plan sur lequel la mise au point a
été faite.

Fig. 2.1 Ordinateur

Principe de la microwopie confocale.
les rayons d'un faisceau laser sont réfléchis, par un miroir ddiroïque. en

Miroir dict.ro iq-je

I — Source
laser

Plan d'obsevaton

direction du spécimen. Ce laîsceau balaie point par point un plan du

spécimen. Les photons drfiactés traversent un diaphragme situé dans le Détecteur de photons
plan local du système optique (d'où l'adjectif confocal pour qualifier ce o
microscope) : les photons parasites sont donc élimines tandis que ceux
qui traversent le diaphragme gagnent un détecteur de photons relié à un
ordinateur Un moniteur perniet oV voir l'image numérisée du plan balayé
par le faisceau laser, tl est possible de balayer, plan par plan, l'objet à
étudier et d'en obtenir des reconstitutions ttKftmersionnelles

Lert!k>

Un rayon laser balaie très rapidement tous les points du plan focal. L'image de chacun de ces points est
Specimen

captée par un détecteur de photons, numérisée et transmise à un ordinateur (associé au microscope). Il est
ainsi possible d'observer une cellule ou une structure cellulaire plan par plan et d'obtenir par reconstitution
une image tridimensionnelle : cette technique porte le nom de tomographie photonique. L'apport à la
connaissance de la cellule, depuis 1987, date de sa commercialisation, est considérable : il permet de
suivre, dans une cellule vivante, une seule ou plusieurs molécules couplées à des fluorochromes. La
découverte de la protéine fluorescente verte (GFP : Creen Fluorescent Proteih) permet de marquer les
protéines au moment de leur synthèse. LADN codant pour la GFP est inséré dans la séquence codante du
gène de la protéine « X » que l'on souhaite étudier. LARNm contient la séquence codante de la protéine « X
» et de la GFP : sa traduction aboutit à la formation d'une protéine de fusion qui contient la protéine « X »
sur laquelle est fixée GFP. Si cette protéine est active, il est alors possible de la suivre facilement dans la
cellule.

F. Microscope électronique à transmission (MET)

Le microscope électronique à transmission (fig. 2.2) utilise, à la place de la lumière (rayonnement
photonique), un rayonnement électronique. La majorité des MET fonctionne avec une différence de potentiel
de 100 kV. En raison de la longueur d'onde du rayonnement électromagnétique qui est de 0,005 nm, le
pouvoir séparateur du ME peut être théoriquement 40 000 fois supérieur à celui du microscope optique et
deux millions de fois supérieur a celui de notre œil.

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5. Surface du tissu. 6. Ombrage au carbone de la surface libérée. 7. Réplique de la surface isolée par digestion en
L'histochimte regroupe de très nombreuses techniques qui peuvent caractériser les constituants de la cellule
(métaux, enzymes, acides nucléiques, glucides, lipides, protéines, etc.).

B. Techniques utilisées en histochimie

Les techniques histochimiques permettent de reconnaître spécifiquement des groupes chimiques ou des
substances et de les localiser d'une manière précise. Elles offrent la possibilité d'étudier et de connaître la
répartition des acides nucléiques, des lipides, des glucides, des protéines dans la cellule, de localiser un
très grand nombre d'enzymes. La précision est parfois remarquable, puisqu'un histologiste peut sur une
coupe, localiser une granulation de bleu de Prusse de 1 nm de diamètre ce qui correspond à 1 x lO^y
(gamma = 1/1 000 000* de gramme). D'une manière générale, les techniques histochimiques peuvent être :
* non spécifiques : elles détectent et localisent les molécules ayant des
propriétés chimiques communes (recherche des acides nucléiques dans
la cellule).
■ spécifiques : elles détectent et localisent une molécule particulière dans la cellule (ex. : détection de la
tubuline). Les techniques histochimiques permettent de colorer des groupes chimiques, de localiser des
enzymes, d'étudier les fonctions cellulaires, de localiser de manière précise des molécules spécifiques.

1. Détection des groupes chimiques spécifiques

L'utilisation de colorants liposolubles permet de localiser les lipides dans les cellules. Mais, les lipides sont
solubles dans les alcools et dans le toluène utilisés au cours de l'inclusion à la paraffine (une technique de
préparation des tissus à examiner pour la MO). Il est donc nécessaire de congeler le tissu afin de pouvoir le
couper en fines tranches de 10 à 15 um d'épaisseur : de telles coupes sont obtenues à l'aide d'une micro-
tome à congélation. Les coupes obtenues sont plongées dans des colorants liposolubles (noir Soudan B ou
rouge Soudan).

2. Localisation des enzymes actives

L'étude de la distribution d'une enzyme (par exemple les phosphatases acides et alcalines, les
déshydrogénases, les ATPases) se fait sur des coupes de tissus frais préparées au microtome à
congélation. Ces coupes sont placées dans un milieu contenant le substrat de l'enzyme. L'enzyme réagit
avec le substrat : il se forme un produit de réaction primaire insoluble qui peut être mis en évidence par
coloration.

3. Marquage des molécules

a. Définition

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 Les techniques d'étude de la cellule wi

Le marquage des molécules est la fixation, sur une molécule, d'un signe de reconnaissance facilement
identifiable qui autorise le suivi d'un composé dans un organisme, un organe, un tissu ou dans la cellule. Le
marquage utilise soit les isotopes radioactifs (autohistoradiographie), soit des composés fluorescents.

b. Marquage par des isotopes radioactifs

Une molécule marquée est suivie beaucoup plus facilement dans l'organisme ou dans un tissu. Ainsi, le
marquage de la cystéine par du soufre 35 permet de connaître le chemin qu'elle parcourt dans le cartilage.
La cystéine marquée est injectée à plusieurs rats : ils sont sacrifiés à des intervalles réguliers après
l'injection. Le cartilage prélevé est préparé pour un examen en microscopie optique ou en MET. Une
émulsion photographique liquide est versée (en chambre noire) sur la préparation : en séchant, elle forme
une pellicule sur les cellules. Les régions occupées par l'isotope réduisent l'argent à leur contact. La coupe
est traitée, après plusieurs jours d'exposition, comme une pellicule photographique (révélateur puis fixateur),
de telle sorte que les grains d'argent réduit apparaissent. Les techniques d'autohistoradiographie sont très
efficaces pour étudier la répartition de nombreuses molécules, leur déplacement ainsi que les fonctions
cellulaires.

c Marquage par des substances fluorescentes

Un analogue fluorescent résulte du couplage de la molécule à étudier avec un colorant fluorescent. Cet
analogue est introduit dans la cellule par micro-injection avec une micropipette de verre dont l'extrémité a un
diamètre de l'ordre du micron. Il est ainsi facile de suivre, grâce à la microscopie à épifluorescence ou
confocale, la dynamique des microtu-bules en injectant un analogue fluorescent de la tubuline (il est
constitué par le dimère afl de tubuline couplé à une molécule de rhodamine). Les analogues se polymérisent
en MT qu'il est alors possible de voir individuellement bien que leur diamètre est à peine supérieur au
pouvoir de résolution de la microscopie optique.
4. Techniques immunocytochimiques

L'immunocytochimie est l'application à la cellule de techniques fondées sur

l'antigénicité des protéines afin de les localiser et de suivre leur évolution.
Elle permet de révéler spécifiquement des molécules qui ne pourraient l'être avec les
plus puissants microscopes électroniques. Il est possible actuellement de produire
des anticorps contre n'importe quel constituant cellulaire. Il devient donc relativement
facile de les localiser en microscopie confocale ou en microscopie électronique en
utilisant les techniques immunocytologiques.

a. Préparation des anticorps

Un anticorps (fig. 2.6), spécifique de l'antigène (protéine) à étudier, est préparé par
injection de cet antigène purifié à un animal appartenant à une autre espèce que
celle dont on a extrait l'antigène injecté. L'animal traité développe une réaction
immunologique : des macrophages phagocytent la protéine, la fragmentent en
peptides et les exposent à leur surface grâce au CMH II (complexe majeur
d'histocompatibilité de type II). Les peptides sont présentés aux lymphocytes T.
Chacun des peptides présentés déclenche la multiplication de lymphocytes T diffé-
rents. Les lymphocytes T activent ensuite les lymphocytes B qui se transforment en
cellules productrices d'anticorps, les plasmocytes.

Fig. 2.6
Représentation schématique d'un anticorps (d"après Poirier et coll.).
A. l. Sites de liaison des antigènes. 2. Site de liaison du complément J. Chaîne lourde. A. Chaîne légère. B. 1 la
papaine divise la molécule en un fragment Fab (fragment antigen binding ; fragment de liaison aux antigènes) et un
fragment complément Fc. l. Zone de clivage induit par la papaine. 1 Fragment Fab. 3. Fragment Fc.

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L'anticorps ainsi obtenu se fixe sur la protéine qui est à l'origine de sa

fabrication.

b. Marquage de l'anticorps
Afin de visualiser le complexe antigène-anticorps, on associe à l'anticorps un
système marqueur (ou révélateur) composé d'une molécule détectable en
microscopie :
* une substance fluorescente (par exemple l'isothiocyanate de fiuorescéine) :
technique d'immunofluorescence utilisable uniquement pour la microscopie
photonique ;
• une enzyme (peroxydase du raifort, phosphatase alcaline). La visualisation du marqueur se fait par la
production de précipité coloré par l'enzyme : technique immunoenzymologique utilisable en microscopie
photonique et électronique ;
• marqueurs métalliques (ferritine, or colloïdal) utilisés essentiellement en microscopie électronique car ils
sont spontanément opaques aux électrons.

c Technique de détection

► Immunocytochimie directe
Les anticorps repérables par leur marqueur se fixent sur leur antigène (fig. 2.7A). Le complexe antigène-
anticorps-marqueur est alors détectable en microscopie.

► Immunocytochimie indirecte
Elle permet d'augmenter la sensibilité de la réaction, en combinant deux types d'anticorps : les anticorps
anti-protéine (anticorps primaires) qui ne sont pas porteurs de marqueurs et des anticorps anti-anticorps
primaires (anticorps secondaires) porteur de marqueurs. La préparation est d'abord traitée par des anticorps
primaires : ils se combinent avec la protéine X puis les anticorps secondaires se fixent alors sur les anticorps
primaires (fig. 2.7B).

Fig. 2.7 4 5
L« techniques d'immunofluorcscence
(d'après Poirier et rofl.).
A. Mise en évidence directe. I. Membrane
piasmique. 2. Antigène a localiser.
3. Anticorps antJ-A. 4. Molécule
fluorescente.
B. Mise en évidence indirecte. 1. Membrane
plasmique. 2. Antigène A à localiser.
y Anticorps primaire anti-A 4. Anticorps
secondare (ans anticorps anti-A).
5. Molécule secondaire marquant
l'anticorps
secondaire.

IV. Les sondes moléculaires

A. Définition
Une sonde moléculaire est une molécule qui permet de localiser une molécule dans la cellule, d'explorer les
structures d'une cellule, de localiser une séquence recherchée sur un acide nucléique. Les molécules utili-
sées comme sondes sont soit des anticorps, soit des antigènes pour les protéines, soit des acides
nucléiques pour étudier les complémentarités séquentielles d'acides nucléiques.

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B. Sondes d'acides nucléiques

Les sondes d'acides nucléiques permettent de localiser dans la cellule des
séquences d'acides nucléiques complémentaires de celles de la sonde
utilisée. Les sondes sont des molécules d'acides nucléiques marquées (soit
par des isotopes radioactifs, soit par des composés fluorescents ou non
fluorescents) ou non marquées. Les sondes peuvent être :
• de l'ADN monobrin ;
• de l'ADN double brin ;
• un ARNm (ribosonde) ;
• des oligonucléotides synthétiques.
1. Sondes d'ADN marquées utilisées in vivo (fig. 2.8)
Afin de pouvoir les suivre dans la cellule, les sondes sont marquées :
• par des isotopes radioactifs (tritium ou phosphore radioactif : 12P ou 33P)
pour les sondes chaudes ;
• par des composés fluorescents ou non fluorescents (biotine ou enzymes
□ comme la phosphatase alcaline) pour les sondes froides.

N marquée (d'après Poirier el coll.)

marquée. 2. AON monobrin.
marquée se lite sur la séquence doni les bases complémentaires sont complémentaires de la cellule qu'elle porte
rquée permet de localiser une séquence déterminée de nudéoboes.
Les sondes (fig. 2.8) qui se sont combinées à des brins complémentaires sont
mises en évidence :
• par autoradiographie pour les sondes chaudes ; un film de gélatine pho-
tographique est déposé (en chambre noire) sur les préparations. L'émission
de radiations réduit les sels d'argent en grains d'argent. Le comptage des
grains d'argent permet une analyse semi-quantitative (technique utilisée
également en MET) ;
• par la microscopie en fluorescence pour les sondes froides marquées par des
composés fluorescents ;
• par des anticorps pour les enzymes.
2. Sondes d'ADN monobrin marquées utilisées in vitro
Pour obtenir une sonde d'ADN monobrin, il convient de séparer les deux brins
d'ADN par dénaturation par une température supérieure à 80'C ou par un pH
supérieur à 11,3. Les ultraviolets permettent de suivre la dénaturation de
l'ADN. L'absorption des UV (ultraviolet) d'une longueur d'onde

de picture élément ; élément d'une image). Divers logiciels adaptés a

l'analyse d'image (analyse de forme, calcul de surface, reconstruction
tridimensionnelle à partir d'une série de coupes) donnent des résultats
quantifiés.

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E. nte. Cette solution cellulaire est mélangée avec une solution tampon qui
Cytomét servira de milieu d'entraînement Les cellules sont dirigées dans une canule
rie à flux qui ne laisse passer qu'une cellule à la fois. Un rayonnement laser illumine
continu chaque cellule au moment de son passage. La lumière diffusée par la cellule
qui reçoit le rayonnement est analysée. Puis, la suspension cellulaire circule
Le trieur dans une canule vibrante qui la divise en gouttelettes contenant une seule
de cellule. Au moment de leur formation, les gouttelettes reçoivent une charge
cellules électrique en fonction de la fluorescence cellulaire. Puis les gouttelettes
par traversent un champ électrique : les gouttelettes sans charge ou de charge
fluoresce moindre sont déviées tandis que celles qui contiennent la charge optimum
nce sont recueillies.
(FACS :
Fluoresce
nce
Activated
Cell
Sorter)
sépare
les
cellules
en
fonction
de leur
fluoresce
nce (fig.
2.10).
Supposo
ns que
nous
souhaitio
ns isoler
les
cellules
porteuses
d'une
protéine
membran
aire X de
celles qui
n'en sont
pas
porteuses
. La
suspen-
sion
cellulaire
contenant
ces deux Fig. 2.10 Cytocnétrie de flux.
I. VfbratHV à utlrasom. 2 Suspension cellulaire S Manchon liquide. 4. Analyseur. S. User. 6.
types Gouttelettes chargées positivement j Gouttelettes chargées négativement 8. Clump électrique. 9.
cellulaires Détecteurs. 10. Signal de chaiges. 11. Collecteur
est traitée
par un
anticorps
anti-X Les techniques d'analyse de la cellule donnent des indications précises sur la
associé à concentration intracellulaire en ions (par microélectrodes), permettent
une d'analyser le fonctionnement des canaux ioniques (patch-clamp), de compter
molécule les cellules et de les séparer les unes des autres selon des critères
fluoresce préalablement fixés.

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V vées se multiplient rapidement : en quelques jours la

totalité du milieu est recouverte, les mitoses s'arrêtent,
Le les cellules meurent. Ce mécanisme d'arrêt est un
s mécanisme décrit sous les noms d'inhibition de
cul contact qui dépend de la transmission de signaux
tur entre les cellules cultivées. Afin de maintenir les
cellules en vie, il est nécessaire de prélever quelques
es cellules (avant qu'elles ne meurent) et de les mettre
cel en culture dans une autre boîte (repiquage). De
lul repiquage en repiquage, il est possible de conserver
air des cellules longtemps : mais elles ne sont pas
immortelles. Il est possible de réaliser des cultures à
es partir d'une seule cellule. Toutes les cellules issues de
Les la multiplication d'une seule cellule constituent un
cultu clone : elles possèdent toutes le même patrimoine
res génétique. Les cellules cancéreuses ont perdu
cellu l'inhibition de contact. L'arrêt des divisions et leur mort
laire
sont conditionnés uniquement par l'appauvrissement
s se
prati du milieu de culture. Des repiquages successifs les
quen maintiennent en vie : elles sont devenues immortelles.
t: L'examen en contraste de phase des cellules en
- soit culture a apporté une contribution considérable à la
sur connaissance du fonctionnement de la cellule. Ces
des techniques permettent en effet :
cellu • d'étudier les cellules vivantes (humaines, par
les exemple) soumises à des conditions variées, de les
en cinématographier et d'observer leur réaction à des
susp
agents chimiques ;
ensi
on • de suivre le déroulement de la mitose, dans les
(cult conditions normales ou après application de
ures substances antimitotiques ;
de • de réaliser des caryotypes, étude des chromosomes
cellu à partir de la culture des leucocytes ;
les
diss • d'observer les cellules cancéreuses et leur
ocié comportement ;
es) ;
• soit
• de maintenir des virus et de fabriquer des vaccins,
etc.
sur
des Les cultures cellulaires offrent la possibilité de
milie comprendre le fonctionnement cellulaire et de
ux poursuivre des expérimentations sur du matériel vivant
de en dehors de l'organisme dont elles sont issues.
cultu
re
disp VII.Les techniques de
osés microdissection
dans
La microdissection (ou microchirurgie) est une
des
micromanipulation qui consiste à disséquer des
boîte
organismes microscopiques, des cellules vivantes :
s de
Pétri c'est la chirurgie de la cellule. Cette microdissection se
. fait grâce à des micro-outils (micropipettes,
microbistouris) fabriqués à l'aide de microforges. La
Les
main, pour des raisons de précision, ne peut guider
cellu ces micro-outils. Il est nécessaire d'employer un

□ les
nor
male
micromanipulateur. La microdissection permet
d'enlever un noyau d'une cellule, de l'introduire dans
une autre, de couper des cellules en plusieurs
s fragments, d'injecter des produits dans le cytoplasme,
culti de couper le fuseau mitotique, etc. Les techniques de

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solution de saccharose de façon à donner un homogénat (suspension

VIII. homogène).
Les
techn A. Centrifugation zonale

iques Les divers organites cellulaires diffèrent les uns des autres aussi bien par leur
d'ultr taille que par leur densité. Les éléments les plus gros et les plus denses
sédimentent plus rapidement que les autres structures.
acentr
ifugati
on
La
centrifuga
tion de
broyats
cellulaires
(fig. 2.11)
à des
vitesses
supé-
rieures à
100 000
tours/min
offre la
possibilité
d'isoler
des
particules
de
densité
infime
puisque
la force
centrifuge
est
comprise
entre 100
000 et
500 000
g. Un
tissu est
broyé
mécaniqu
ement
dans une

Fig. 2.11
Ultracentrirugation différentielle.
Le prélèvement (2) d'un organe ( I ) est broyé pins homogénéisé, l/homogénal (5) qui contient
tous les organites des cellules du prélèvement (J) est placé dans une ultracentnfugeuse W. Il
est soumis a une centrifugation de 600 g pendant IO minutes. Le culot de centnfugaoon contient

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les noyaux contient la fraction dite soluble du cytosol (la dernière étape de l'ultracentnfugation n'est pas
cellulaires représentée).
(ils sont
recueillis
par remise
en
B. Centrifugation isopycnique
suspension)
: le
Les fractions obtenues par la centrifugation zonale ne
surnageant
sont pas parfaitement pures. Pour améliorer les
renferme
tous les résultats, il convient de soumettre ces fractions à une
autres centrifugation isopycnique, c'est-à-dire une
organites de centrifugation à l'équilibre en gradient de densité. Une
la cellule. solution de saccharose ou de glycérol est préparée de
Ce telle sorte que la concentration la plus élevée se
surnageant
(6) est isolé,
Eléments sous
puis
droits d'auteur
centrifugé
& 15 000 g
pendant S
minutes : le
culot de
centrifugati
on contient
les
mrtochondri
es. les
fysosomes,
les
peroxysome
s. Le

□
surnageant
obtenu (7)
est
centrifugé à
100 000 g
pendant 60
minutes : le
cutot
contient la
membrane
plasmique.
la fraction
microsomal
e (RE
fragmenté)
et des
pofyriboso
mes. Le
surnageant
(8) est
centrifugé a
100 ooo g
pendant 2
heures : le
culot
contient des
sous-unités
ribosomales
et de petits
polyribosom
es. le
surnageant

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situe au protéines
fond et la Cette
2 000 diamètres.
méthode Le microscope à contraste de phase est surtout
moins élevée
membranaires
en haut de
utilisé diffraction
pour observer les cellules vivantes en culture car il permet de
du tube contenues
à centrifuger. aux
voir rayons
nettement
X a les mitochondries, le noyau et diverses autres
La fractiondansà étudier ces notamment
structures cellulaires. Le microscope polarisant nous révèle les
est placée fractions.
dans Parce permis
structures anisotropes.
de Le microscope à fluorescence nous montre les
tube qui exemple,
est soumisdes à déterminer
substances spontanément
la fluorescentes ou colorées par des molé-
structure
cules fluorescentes.
en
une centrifugation
anticorps trèsanti-
élevée clathrine
(40 000
sont ► hélice
double de
Le microscope à fluorescence confocale isole l'image d'un
la
plan d'unmolécule
objet (tomographie photonique) sans superposition avec les
tours/min)fixés pendant
sur des
d'ADN.
autres plans.
plusieurs bactéries heures.
: ces
Chaque anticorps élément se ► Le MET permet théoriquement d'atteindre des résolutions
contenu combinent
dans le tube de l'ordre des distances interatomiques : la résolution est en pratique
flotte alors
sélectivement
à sa de 0,5 à 1 nm. Le MEB donne des images de la surface des objets. Le
microscope à effet tunnel précise la structure et l'organisation des
position auxd'équilibre.
molécules
molécules.
Cette de clathrine.
position
d'équilibreDanscorrespond une
à une zone fraction
du tube où ne P
la densité contenant
du liquideque OIN
est égaledes à celle de TS
l'élément membranes,
concerné. Le
CLÉ
contrôle deseulespureté se les
fait en membranes
microscopie S
électronique.
des vésicules Le r» La
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Éléments sous droits d'auteur

 S
Les techniques d'étude de la cellule

► La fixation conserve la structure des cellules. L'inclusion à la paraffine pour la MO, dans les
résines pour la MET, permet la réalisation de coupes fines. L'utilisation de sels de métaux lourds en MET
contraste les structures et les rend facilement visibles. En MET, la coloration négative facilite l'examen des
grosses molécules : les techniques de cryofracture et de cryodécapage permettent d'obser ver leur
disposition.
► Les techniques d'immunofluorescence utilisent des anticorps spécifiques liés à une substance
immunofluorescente pour localiser les protéines qui ont été utilisées pour fabriquer ces anticorps. Ces
techniques donnent des préparations temporaires et sont inexploitables en MET. L'immunoen-zymologie
utilise des complexes anticorps-enzymes dont la partie enzymatique peut être facilement mise en
évidence. L'application de ces techniques à une molécule d'ADN coupée en petits fragments permet, entre
autres, de déceler la répétitivité de certaines séquences, de localiser des séquences spécifiques, d'établir
les parentés géniques possibles entre divers organismes, de reconnoitre des espèces particulières d'ADN.
Ces techniques sont également appliquées à l'ARN sur cellules fixées : elles permettent, par exemple, de
détecter la présence d'un ARN messager spécifique dans tel ou tel type cellulaire.
► Les techniques d'hybridation utilisent des molécules d'acides nucléiques marquées afin de locali-
ser dans la cellule les séquences complémentaires (de type ADN ou ARN). Ces techniques permettent
également d'établir des parentés géniques possibles entre divers organismes.
► Les techniques d'analyse de la cellule donnent des indications précises sur la concentration
intracellulaire en ions (par microélectrodes), permettent d'analyser le fonctionnement des canaux ioniques
(patch-clamp), de compter les cellules et de les séparer les unes des autres selon des critères
préalablement fixés.
► Les cultures cellulaires offrent la possibilité de comprendre le fonctionnement cellulaire et de
poursuivre des expérimentations sur du matériel vivant en dehors de l'organisme dont elles sont issues.
► Les techniques de centrifugation zonale et isopycnique permettent d'isoler des culots purs
d'orga-nites en fonction de la vitesse de centrifugation. Elles offrent la possibilité de déterminer avec préci -
sion la composition biochimique des constituants cellulaires.

Eléments sous droits d'auteur

 3
Biologie cellulaire

plasmique.
mbrane plasmique après cryodécapage. J. Rèpkque de la la<e reslanle apiès cryodécapage. 4. Aspecl en microsc

Fig. 3.4
Structure de la membrane plasmique
l. Milieu extracellulaire. 2. Chaîne ohgosacchandique. 3.
Clycoproteine. 4. Clvcoltpide. 5. Cholestérol. 6. Protéine
intrinsèque 7. Filaments du cytosquetette. 8. Protéine
pénphénque intracellulaire, les protéines périphériques
extracellulaires ne sont pas représentées. 9. Acides gras.

études en MET et à l'analyse

biochimique, montre que la
membrane plasmique est un
assemblage de molécules
protéiques (souvent
glycosylées) et de molécules
lipidiques organisées en un
double feuillet de lipides ; les
molécules lipidiques se
disposent en une double
couche :
•des protéines membranaires
intrinsèques ou protéines
transmembra-naires ;
•des protéines membranaires
extrinsèques ou protéines
périphériques extra et
intracellulaires ;
•des glucides membranaires
qui constituent la fraction
glycosylée des gly-
coprotéines et des
glycolipides membranaires
 3
aire

f doplasmique, l'appareil de
o Golgi, les endosomes, les
r vacuoles d'endocytose, les
m lysosomes, les peroxysomes,
a les grains de sécrétion et la
n membrane externe de la mito-
t chondrie, bref toutes les
l membranes cellulaires, ont la
e même organisation
moléculaire à l'exception du
c cell coat.
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 Organisation de la membrane
plasmique

II. Composition biochimique de la membrane plasmique

A. Techniques d'étude

Afin de pouvoir étudier la composition des membranes plasmiques, il est nécessaire d'en recueillir, à
l'état pur, une quantité suffisante. Après broyage des cellules, les membranes plasmiques sont
isolées par ultracentrifugation. Cette technique permet d'obtenir des culots de membrane plasmique,
mais ils sont toujours plus ou moins contaminés si les cellules centrifugées contiennent d'autres
cytomembranes (appareil de Golgi, reticulum endoplasmique, etc.).
Les hématies (globules rouges ou erythrocytes) des vertébrés sont un matériel de choix puisqu'elles
ne contiennent pas d'organites ni de noyaux (contrairement aux hématies des batraciens). Les
hématies sont placées dans un milieu fortement hypotonique : elles se distendent, deviennent
sphériques : elles ont tendance à se rompre en un seul endroit. Elles se vident de leur contenu et
donnent naissance à des ghosts (fantômes) qui possèdent une seule perforation (fig. 3.5). Il se
forme également de petites vésicules : elles sont produites par la rupture mécanique du ghost qui
rapidement se réorganise en une structure fermée, une sorte de vésicule. La face externe est
tournée soit vers l'extérieur, soit vers l'intérieur : cela dépend des conditions ioniques au moment de
la rupture et de la constitution de la structure fermée. La suspension de ghosts, mélangée au
cytoplasme expulsé par hydrolyse, est soumise à une ultracentrifugation : le culot de centrifugation
ne contient pratiquement que des membranes plasmiques qu'il sera relativement facile d'analyser.

Chosts.
1 Membrane éfYthrocylaire.
2 Zone de rupture de la membrane plasmique

Les pores d'hémolyse

Dans un milieu faiblement hypotonique, les hématies tentent de
maintenir un équilibre entre la concentration ionique du milieu
extracellulaire et celle du milieu intracellulaire. L'eau pénètre
néanmoins dans l'hématie qui se distend, se gonfle, devient
sphérique, et subit l'hémolyse. L'hématie se vide en fabriquant des
pores membranaires, dénommés pores d'hémolyse (qui
apparaissent 20 ms après le dépôt des hématies).

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