European Journal of Pharmacology (4772003) 1- 7

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Inhibition des +canaux Na neuronaux sensibles à la tétrodotoxine

par deux toxines d'araignée : hainantoxine-III et
hainantoxine-IV
Yucheng Xiao, Songping Liang*.
Collège des sciences de la vie, Université normale du Hunan, Changsha, Hunan République
populaire410081, de Chine

Reçu en mai13 2003 ; reçu sous forme révisée en juillet25 2003 ; accepté en juillet. 292003

Résumé

L'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV, isolées du venin de l'araignée oiseau chinoise Seleconosmia hainana, sont des peptides
neurotoxiques composés de 33 à 35 résidus avec trois liaisons disulfure. En utilisant la technique du patch-clamp à cellules entières, nous avons
étudié leur action sur les canaux ioniques des neurones des ganglions de la racine dorsale de rats adultes. Nous avons constaté que les deux
toxines n'affectaient pas les canaux Ca2+ (à la fois les types activés par un voltage élevé et ceux activés par un voltage faible) ni les canaux
Na+ dépendant du voltage (VGSC) résistants à la tétrodotoxine. Cependant, l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ont fortement déprimé
l'amplitude des +courants Na sensibles à la tétrodotoxine avec des valeurs de CI50 de 1,1 et 44,6 nM, respectivement. L'hainantoxine-III (1
nM) et l'hainantoxine-IV (50 nM) ont toutes deux provoqué un décalage hyperpolarisant d'environ 10 mV du point médian de tension de
l'inactivation du canal Na+ à l'état d'équilibre, - mais elles ont montré une différence dans la cinétique de réamorçage des VGSCs :
l'hainantoxine-III a significativement diminué le taux de récupération de l'inactivation à un potentiel de préimpulsion de mV80 alors que
l'hainantoxine-IV ne l'a pas fait. Il est intéressant de noter que, comme pour l'hainantoxine-IV, les deux hainantoxines n'ont pas affecté la
cinétique d'activation et d'inactivation des +courants Na et, à une concentration de AM1, elles ont complètement
a inhibé le ralentissement des courants d'inactivation induits par BMK-I (toxine I du scorpion Buthus martensi Karsch), une toxine semblable à
celle du scorpion.
Les résultats indiquent que l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV sont de nouvelles toxines d'araignée et qu'elles affectent les canaux Na+
neuraux des mammifères par un mécanisme très différent de celui des autres toxines d'araignée ciblant le site récepteur neuronal, comme3,
les y-aractoxines et les A-agatoxines.
D Elsevier2003 B.V. Tous droits réservés.

Mots-clés : Toxine arachnéenne ; neurone ganglionnaire dorsal ; +courant Na ; Patch-clamp, cellule entière.

1. Introduction ce jour, au moins six sites (1 - 6)

sur les +canaux Na neuronaux ont été révélés en utilisant ces
Les canaux Na+ dépendant du voltage (VGSCs) sont des toxines (Cestele et al., 1995), et lorsque ces toxines se fixent à
protéines transmembranaires présentes dans la plupart des
neurones et des cellules musculaires. Leur ouverture
constitue la phase de dépolarisation du potentiel d'action. * Auteur correspondant. Tél : +86-731-8872556 ; fax : +86-731-
Ils jouent donc un rôle majeur dans la génération et la 8861304.
Adresse électronique : liangsp@public.cs.hu.cn (S. Liang).
propagation des signaux électriques dans les neurones et la
contraction des muscles. L'activité des VGSCs peut être
modulée selon différents mécanismes par de nombreuses
toxines purifiées à partir des venins de différents animaux
tels que les serpents, les scorpions, les escargots marins et
les araignées. Ces toxines natives
Les toxines, en particulier la tétrodotoxine et les a, h-
toxines de scorpion, sont des outils importants et utiles
pour étudier la relation structure-fonction des canaux Na+. A
les six sites sélectivement, les caractérisations des
canaux montrent quelques changements principaux
correspondants : bloquer la conductance du canal
(toxines du site 1), provoquer une activation persistante
(toxines du site 2), ralentir l'inactivation du canal
(toxines du site 3), induire à la fois un décalage de la
dépendance en tension de l'inactivation et une réduction
des courants de pointe (toxines du site 4), déplacer
l'inactivation vers un potentiel membranaire plus négatif
et bloquer l'inactivation (toxines5 du site 6) et inhiber
l'inactivation des courants indépendamment du voltage
(toxines du site 6). Bien que plusieurs toxines puissent
cibler le même site, elles ne se lient pas aux mêmes
0014-2999/$ - see front matter D Elsevier2003 B.V. Tous droits
réservés. doi:10.1016/S0014-2999(03)02190-3
résidus actifs dans les protéines du canal Na+. Par exemple,
la mutation d'un seul site démontre que la tétrodotoxine a
une interaction plus forte avec Tyr401 que la saxitoxine,
une autre toxine de site 1, dans les canaux Na+ des muscles
squelettiques adultes (Penzotti et al., 1998). De plus, les
toxines natives fournissent une clé pour une meilleure
discrimination pharmacologique entre les différents sous-
types de +canaux Na. Les VGSCs peuvent être classés en
types sensibles à la tétrodotoxine et résistants à la
tétrodotoxine (Ogata et Tatebayashi, 1993). Les canaux Na+
sensibles à la tétrodotoxine peuvent être divisés en trois
sous-types par les A-conotoxines (Shon et al.,
2 Y. Xiao, S. Liang / European Journal of Pharmacology (4772003) 1-7

transmission neuromusculaire dans les préparations isolées

Fig. Comparaison1. des structures primaires de trois toxines d'araignée :
huwentoxine-IV, hainantoxine-III et hainantoxine-IV. Notez les
terminaisons C- amidées. L'huwentoxine-IV a été isolée du venin de
l'araignée oiseau chinoise Selenocosmia huwena et l'hainantoxine-III et
l'hainantoxine-IV ont été isolées d'une autre araignée oiseau chinoise
Selenocosmia hainana. L'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV
partageaient 30 % et 80 % d'identité de séquence avec l'huwentoxine-IV,
respectivement. Les résidus identiques sont ombragés en noir.
1998) : (1) sensible à A-PIIIA et à A-conotoxine GIIIA, (2)
sensible à A-PIIIA mais pas à A-GIIIA, et (3) résistant à A-PIIIA
et à A-GIIIA.
L'hainantoxine-III (P83464, http://www.pubmed.com) et
l'hainantoxine-IV sont isolées du venin de l'araignée oiseau
chinoise Seleconosmia hainana (Liang et al., 1999). Leurs
séquences ont été déterminées comme étant de 33 - 35 résidus
avec trois liaisons disulfure et leurs extrémités C-
terminales sont amidées (Fig. 1). La DL50 intrapéritonéale
de l'hainantoxine-IV pour les souris est de mg/kg0.2. Elle
peut bloquer
de synapse du nerf phrénique-diaphragme de souris (Liu et
al., 2002). Cependant, les mécanismes du bloc
neuromusculaire sont encore inconnus. Dans ce rapport,
nous décrivons l'effet des deux toxines d'araignée sur les
canaux ioniques dans les cellules ganglionnaires de la
racine dorsale de rat adulte.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Purification de la toxine
L'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ont été purifiées
à l'aide d'une chromatographie en phase liquide haute
performance (HPLC) en phase inverse suivie d'une
chromatographie par échange d'ions, comme décrit
précédemment dans notre laboratoire (Liang et al., 1999).
2.2. Procédures d'isolement des cellules
Des neurones de ganglion de la racine dorsale de rat ont
été dissociés de façon aiguë et maintenus dans une culture
primaire à court terme en utilisant la méthode décrite par
Wang et al. (1998). En bref, des neurones de 30 jours

Fig. 2. Effets de l'hainantoxine-III et de l'hainantoxine-IV sur les courants Na+ résistants à la tétrodotoxine (A, B) et sensibles à la tétrodotoxine (C- G) sur les
neurones du ganglion de la racine dorsale du rat. Les deux types de courants ont été induits par un potentiel dépolarisant de 50 ms de - 10 mV à partir d'un potentiel
de maintien de - 80 mV. (C, D) Effets des courants sensibles à la tétrodotoxine : (C) 1 nM d'hainantoxine-III et (D) 50 nM d'hainantoxine-IV. Les résultats ci-
dessus suggèrent que les deux toxines n'ont aucun effet sur les courants Na+ résistants à la tétrodotoxine alors qu'elles inhibent les courants Na+ sensibles à la
tétrodotoxine de 49,1 F 5,5% (hainantoxine-III) et 57,2 F 5,4% (hainantoxine-IV). Le ralentissement des courants sensibles à la tétrodotoxine induit par
l'AM 1BMK-I a été inhibé par l'AM 1hainantoxine-III (E) et l'AM hainantoxine-IV (F). (G) Le temps
évolution de l'inhibition des courants sensibles à la tétrodotoxine en présence d'AM 1hainantoxin-III (. ) ou d'AM 1hainantoxin-IV (o).
 Y. Xiao, S. Liang / European Journal of Pharmacology (4772003) 1-7 3

Des rats Sprague-Dawley adultes des deux sexes ont été tués les données sont présentées sous forme de moyenne F erreur
par décapitation sans anesthésie, les ganglions de la racine standard et n est le nombre d'expériences indépendantes.
dorsale ont été retirés rapidement de la moelle épinière, Les courbes ajustées de l'inhibition dépendante de la
puis ils ont été transférés dans du milieu d'aigle modifié de concentration (Inhibition%) et de l'inactivation du +canal Na à
Dulbecco (DMEM) contenant de la trypsine (0,5 g/l, type l'état d'équilibre (Inactivation%) ont été calculées à l'aide
III), de la collagénase (1,0 g/l, type IA) et de la DNase (0,1 d'une méthode de mesure de la concentration.
g/l, type III) pour être incubés à 34 jC pendant 30 min.
L'inhibiteur de trypsine (1,5 g/l, type II-S) a été utilisé pour
terminer le traitement enzymatique. Après transfert dans
des boîtes de culture de 35 mm (Corning, Sigma) contenant
95 % de DMEM, 5 % de sérum de veau nouveau-né, un
supplément d'hypoxanthine aminoptérine-thymidine et de la
pénicilline-streptomycine, les cellules ganglionnaires de la
racine dorsale ont été incubées dans un incubateur à CO2 (5
% de CO2, 95 % d'air, jC37) pendant 1- 4h avant le patch-
clamp.

2.3. Enregistrements électrophysiologiques

Les courants macroscopiques (filtrés à 10 kHz,

numérisés à 3 kHz avec un amplificateur de patch-clamp
EPC-9, HEKA Electron- ics, Allemagne) ont été enregistrés
à température ambiante (20 - 25jC). Des micropipettes (2 - 3
Am de diamètre) ont été tirées d'un tube capillaire en verre
borosilicate en utilisant un extracteur vertical à deux étapes
(PC-10, Narishige, Olypmus) et polies à chaud avec une
microforge (MF-900, Narishige). Les résistan- ces des
micropipettes ont été 1-2MV après avoir été remplies de
solution interne. Les 2+courants Ca ont été enregistrés en
utilisant un
solution interne contenant (en mM) : CsCHSO33 MgCl
108,2EGTA4, Hepes9, MgATP9, créatine3.6, phosphate
(sel de Tris) 14, GTP (sel de Tris) 1, créatine kinase à 50
unités/ ml à pH et7.4, la solution de bain externe contenait
(en mM) : BaCl2 5, chlorure de tétraéthylammonium 160,
EGTA 0,1, HEPES 10 à pH 7,4 (Mintz et al., 1991). Les
+
courants Na ont été enregistrés en utilisant une solution
interne contenant (mM) : CsF 135, NaCl 10, Hepes 5 à pH
7,0 et la solution de bain externe contenant (mM) : NaCl
CsCl30, D-5, glucose 25, MgCl 21, CaCl2 1,8, HEPES 5,
chlorure de tétraéthylam- monium 20, chlorure de
tétraméthylammonium 70 à pH (7.4Zeto et al., 2000). Un
pont de gélose Ag- AgCl/150 mM NaCl- a été introduit entre
l'électrode de bain et la solution de bain pour éviter de
perturber la composition de la solution externe. Après avoir
établi la configuration d'enregistrement de la cellule
entière, on a laissé la cellule se stabiliser pendant une
période de plus de 3 - 4 min pour permettre un équilibrage
adéquat entre la solution de la micropipette et l'intérieur de
la cellule. Les concentrations nécessaires d'hainantoxines
ont été dissoutes dans la solution 2+externe de Na+ ou Ca et
ensuite environ
10 Le volume d'Al a été appliqué aux cellules
expérimentales par injection sous pression avec un micro-
injecteur (IM-5B, Narishige).

2.4. Analyse des données

L'analyse des données a été réalisée à l'aide de Pulsefit

(HEKA Electronics) et Sigmaplot (Sigma, USA). Toutes
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(I/Imax) ont été obtenues en utilisant la forme suivante de
l'équation de Boltzmann :

Inhibition% ¼100 =½1 þ expðC - ICÞ=k}50

ð
Þ1

I =Imax ¼1 =½1 þ expðV - VÞ=k}1=2

ð
Þ2

Dans l'équation (1), où IC50 est la concentration de

toxine à l'inhibition semi-maximale et k est le facteur de
pente, C est la concentration de toxine. Dans l'équation
(2), où V1/2 est la tension de demi-inactivation et k est le
facteur de pente, V est la tension d'essai.

3. Résultats

3.1. Effets des toxines sur les courants Na+ dépendant du

voltage

Les cellules du ganglion de la racine dorsale ayant un

diamètre de 20 à 40 Am ont été choisies pour étudier les
canaux Na+, car les cellules du ganglion de la racine
dorsale plus grandes provenant d'animaux plus âgés
ont tendance à exprimer des +courants Na rapides
sensibles à la tétrodotoxine, tandis que les plus petites (<
10 Am) ont tendance à exprimer des +courants Na lents
résistants à la tétrodotoxine (Su et al., 1997). La
tétrodotoxine (200 nM) a été ajoutée à la solution de
bain externe pour séparer les courants Na+ résistants à la
tétrodotoxine des courants Na+ sensibles à la -
tétrodotoxine. Dans des conditions de voltage-clamp, les -
deux types de courants Na+ sur les cellules
ganglionnaires de la racine dorsale ont été déclenchés
par une dépolarisation par paliers de 50 ms à mV10 à
partir d'un potentiel de maintien de 80 mV toutes les
secondes. L'hainantoxine-III (1 nM) et l'hainantoxine-
IV (50 nM) n'ont pas affecté de façon significative les
courants résistant à la tétrodotoxine (Fig. 2). Cependant,
l'autre type de courant Na+ était sensible aux deux
hainantoxines. À la même concentration,
l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ont réduit
l'amplitude de pointe des courants Na+ sensibles à la
tétrodotoxine de contrôle jusqu'à un effet maximal de
F49.1 5,5 % (n = 12)

Fig. 3. Blocage concentration-dépendant des +courants Na sensibles à

la tétrodotoxine sur les neurones du ganglion de la racine dorsale du rat.
Chaque point de données (moyenne FS.E.) provenant de deux5 cellules
14montre le courant par rapport au contrôle. Les deux données
des points de l'hainantoxine-III (o) et de l'hainantoxine-IV (. ) ont été
ajustés en fonction des points de référence de l'hainantoxine-III.
à l'équation de Boltzmann (Eq. (1)) (voir Matériaux et méthodes).
L'équation ci-dessus
Les résultats indiquent que les valeurs de CI50 de l'hainantoxine-III et
de l'hainantoxine-IV sont respectivement de et 1.1nM44.6.
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et 57,2 F 5,4 % (n = 8) sur les neurones des ganglions de la
racine dorsale, respectivement. Les effets de l'inhibition
étaient rapides et l'hainantoxine 1 AM pouvait inhiber
complètement les courants Na+ sensibles à la tétrodotoxine
en moins de 1 min (n = 5, Fig. 2G). On a observé que,
contrairement à d'autres toxines d'araignée (par exemple les
y-aractoxines), après avoir été bloquée par les
hainantoxines, la forme des courants Na+
était similaire à celle du contrôle, ce qui indique que deux
toxines araignées n'ont pas modifié la cinétique d'activation
et d'inactivation des courants Na+ sensibles à la
tétrodotoxine. Afin de déterminer que les deux
hainantoxines n'agissaient pas sur le site 3, nous avons
observé plus avant l'interaction entre elles et les toxines du
site 3. BMK-I, agissant sur le site est3, une toxine typique
de type a
isolé du venin du scorpion asiatique, Buthus
martensi Karsch (Ji et al., 1996). Le BMK-I (1 AM) n'a pas
affecté l'amplitude du pic des courants Na+ sensibles à la
tétrodotoxine, mais il a ralenti l'inactivation des courants en
71.1 F 6,4 % (I/Iinacpeak). L'haïnantoxine-III (1 AM) et l'haï-
nantoxine-IV (1 AM) ont complètement inhibé les courants
d'inactivation induits par BMK-I (n = 6, Fig. 2E,F), ce qui
suggère que les deux toxines d'araignée ont modulé les
courants Na+
Fig. Effets4. de l'hainantoxine-III (1 nM) et de l'hainantoxine-IV (50 nM) sur les relations courant-tension de deux types de canaux Na+ sur les neurones des
ganglions de la racine dorsale de rat. Les groupes de courants sensibles à la tétrodotoxine (A, B) et résistants à la tétrodotoxine (C, D) ont été induits par des
5
par un mécanisme distinct de celui de BMK-I. Les
réductions de l'hainantoxine-III et de l'hainantoxine-IV
étaient con- centration-dépendantes avec la valeur IC50 de
1,1 et 44,6 nM, respectivement (Fig. 3). Lorsque les
courbes de dose ont été ajustées à l'équation de Boltzmann
(voir Matériels et méthodes), les
Le facteur de pente (k) de l'hainantoxine-III (- 1,51 F 0,31
nM) était plus grand que celui de l'hainantoxine-IV (-
F0.53 nM0.12).
3.2. Effets des toxines sur la cinétique d'activation et
d'inactivation du canal Na+ dépendant du voltage
La figure montre4 les courbes courant-tension (I - V) des
canaux Na+ sensibles à la tétrodotoxine et résistants à la
tétrodotoxine, qui donnent la tension initiale activée, le
potentiel d'inversion et la tension active des courants
entrants de pointe. Lorsque les cellules des ganglions de la
racine dorsale étaient maintenues au potentiel de repos de
la membrane
- 80 mV, dans des conditions de contrôle, les courants Na
+
sensibles à la tétrodotoxine ont été déclenchés initialement
-
à mV50, ont atteint leur amplitude maximale à environ
-
mV20 et se sont inversés à environ + mV35, tandis que les
courants résistants à la tétrodotoxine ont été à
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étapes de dépolarisation de 50 ms à divers potentiels à partir d'un potentiel de maintien de - mV80. Les potentiels d'essai allaient de - à80 + mV50. La courbe
courant-tension (I - V) (à droite) des courants Na+
montrent les relations entre les traces de courant avant (à gauche) et après (au milieu) l'ajout d'hainantoxine-III nM1 (A, C) ou d'hainantoxine-IV nM50 (B,
D).
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Fig. Effets5. de l'hainantoxine-III et de l'hainantoxine-IV sur l'inactivation à l'état d'équilibre des +canaux Na sur les neurones du ganglion de la racine
dorsale du rat. Des courants sensibles à la tétrodotoxine ont été induits par un potentiel dépolarisant de 50 ms de - mV10 à partir de divers potentiels de
préimpulsion pour s1 qui allaient de - à130 - mV20 avec un incrément de mV10. (A) Des traces de courant typiques ont été obtenues après une dépolarisation
de 50 ms à - 10 mV à partir de potentiels de préimpulsion de - 90, - 80, - 70,.- et60 - 50 mV. (B) Les points de 1 nM d'hainantoxine-III (o) et 50 nM
d'hainantoxine-IV ( ) ont été ajustés selon l'équation de Boltzmann (Eq. (2)) (voir Matériaux et méthodes). Dans les conditions de contrôle (n = 14),
hainantoxine-III nM1 (n = 7) et hainantoxine-IV nM50 (n = 5), les V1/2 étaient - F 55.8-0.56, F 67.40.62
et - F 65.9mV0.72, respectivement, et les k étaient - F 8.54-0.48, F10.0 et0.58 - F10.0 mV0.62, respectivement.

environ-- 1040, et + 25 mV, respectivement. Après un et tracé en fonction du potentiel de préimpulsion de

traitement à l'hainantoxine-III 1 nM et à l'hainantoxine-IV
50 nM pendant 2 min, l'inhibition des courants a pu être
observée à toutes les impulsions de test, mais les deux
toxines araignées n'ont pas changé le seuil d'activation et la
tension d'activation des courants entrants. Il n'y a pas eu
non plus de déplacement du potentiel d'inversion de la
membrane, ce qui implique qu'elles n'ont pas modifié la
sélectivité ionique des canaux. Comme les autres toxines
d'araignée, l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV n'ont pas
affecté les courbes I - V des courants Na+ résistants à la
tétrodotoxine. Par conséquent, elles étaient toutes deux sans
effet sur les canaux Na+ résistants à la tétrodotoxine et
n'ont pas modifié les cinétiques d'activation et
d'inactivation à l'état d'équilibre des VGSCs résistants à la
tétrodotoxine.
Les enregistrements d'inactivation à l'état d'équilibre des
VGSCs sensibles à la tétrodotoxine ont été obtenus en
utilisant un protocole standard à deux impulsions décrit
dans la figure 5. Les courants Na+ de pointe enregistrés
pendant l'impulsion d'essai au potentiel de pré-impulsion de -
à130
- mV30 ont été normalisés par rapport à la valeur maximale de
la
conditionnement. La figure montre5 que l'hainantoxine-III
(1 nM) et l'hainantoxine-IV (50 nM) ont provoqué un
déplacement du potentiel d'inactivation semi-maximal des
canaux Na+ d'environ 10 mV dans la direction de
l'hyperpolarisation sans changer le facteur de pente (k) de
manière significative (figure 5B).
3.3. Effets des toxines sur la cinétique de réprimande des
canaux Na+ sensibles à la tétrodotoxine
La cinétique de récupération de l'inactivation a été
observée à l'aide d'un protocole à deux impulsions dans
lequel la deuxième impulsion d'essai a été déclenchée
- après
une interpulsion de repolarisation à 80 mV qui a duré de
0,5 ms à 1 s. Dans des conditions de contrôle, presque
aucun courant n'a été induit par la deuxième impulsion
d'essai à un temps d'interpulsion de 0,5 ms. À un temps
d'interpulsion de 50 à 100 ms, les courants induits par la
deuxième impulsion d'essai (Itest) étaient aussi importants
que ceux induits par la première préimpulsion (Iprep) (figure
6A). La récupération de
 8 6. Effets de deux hainantoxines sur la cinétique
Fig. Y. Xiao, S.
deLiang / European
réamorçage JournalNaof+ Pharmacology
des canaux (4772003) 1-7sur les neurones des ganglions de la racine
sensibles à la tétrodotoxine
dorsale du rat. Un protocole de clampage de tension à double impulsion a été détaillé dans l'encart, utilisant deux impulsions de 50 ms de - 80 à - 10 mV avec un
intervalle variable de 0,5 ms à 1 s. (A) Les traces de courant typiques représentent la récupération de l'inactivation en l'absence (en haut) et en présence (en bas)
de nM1 d'hainantoxine-III. (B) Points de données montrant le rapport de I/Iprepulsetest
en fonction du temps de récupération ont été ajustées à l'aide d'une équation exponentielle double. . Contrôle ; o, hainantoxine-III nM1 ; z, hainantoxine-IV
nM50.
 Y. Xiao, S. Liang / European Journal of Pharmacology (4772003) 1-7 9

On a vu que l'hainantoxine-III ralentissait significativement
la récupération des canaux après inactivation, et en
présence d'hainantoxine-III (1 nM), le nombre de canaux
Na+ inactivés est deux fois plus élevé que dans les
conditions de contrôle à un intervalle entre impulsions de 1 à
4 msprep. L'intervalle entre les impulsions auquel la moitié du
courant maximal a été récupéré a été augmenté par 1 nM
d'hainantoxine-III de 2,3 à 4,8 ms (Fig. 6B). En revanche,
l'hainantoxine-IV n'a eu aucun effet significatif sur la
cinétique de réprimande (Fig. 6B).
l'hainantoxine-IV sont spécifiques aux VGSCs sensibles à la
tétrodotoxine et il semble que leurs effets sur l'activité des
VGSCs soient plus importants.
sont encore plus élevées que celles de l'y-aractoxine-Ar1
ciblant les isoformes VGSC sensibles à la tétrodotoxine,
tant chez les vertébrés que chez les insectes (Nicholson et
al., 1998 ; Grolleau et

3.4. Effets des toxines sur les 2+courants Ca dépendant du

voltage

Deux catégories principales de canaux Ca 2+ dépendant

du voltage (VGCC) sont exprimées dans les neurones des
ganglions de la racine dorsale : les canaux activés par un
voltage élevé (HVA) et les canaux activés par un voltage
faible (LVA). Les canaux HVA et LVA peuvent bien sûr
être distingués par leur dépendance vis-à-vis du voltage et
leur cinétique. Ni l'hainantoxine-III ni l'hainantoxine-IV
n'ont affecté les VGCC.

4. Discussion

Dans la présente étude, nous avons caractérisé les

actions de l'hainantoxine-III et de l'hainantoxine-IV, isolées
du venin de l'araignée oiseau chinoise S. hainana, sur les
canaux ioniques. Les deux toxines ne montrent aucun effet
sur les canaux Ca2+ et sur les VGSCs résistants à la
tétrodotoxine. L'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV sont
les principaux composants du venin brut et des expériences
antérieures ont démontré que le venin brut de l'araignée
n'affectait pas les canaux potassium retardés par le
redresseur (Xiao et al., 2001). Par conséquent, il est
raisonnable de déduire que l'hainantoxine-III et
l'hainantoxine-IV ne ciblent pas les canaux potassiques à
retardement du redresseur. Leurs actions sur les canaux
Na+ sensibles à la tétrodotoxine dans les neurones des
ganglions de la racine dorsale sont les suivantes : réduction
de l'amplitude maximale du courant ; aucun changement
dans l'activation initiale et le potentiel d'inversion mais un
changement significatif dans l'inactivation à l'état
d'équilibre d'environ 10 mV dans la direction de
l'hyperpolarisation ; seule l'hainantoxine-III diminue la
vitesse de récupération après l'inactivation.
Les venins d'araignées contiennent de nombreuses
toxines peptidiques et polyamides. En général, les
premières sont plus spécifiques pour cibler les canaux
voltage-dépendants que les secondes. Les toxines
peptidiques d'araignée peuvent affecter sélectivement les
VGSCs (y-aractoxines (Nicholson et al., 1998)), les canaux
Ca 2+ (huwentoxin-I
(Peng et al., 2001)) et N-agatoxine IIIA (Mintz et al., 1991))
ou des canaux potassiques (HaTx1-2 et PaTx1-2 (San-
guinetti et al., 1997)). Cependant, les toxines polyamides
(Argio- toxine-636 ; Scott et al.,1998 ) modulent les
activités de plusieurs types de canaux voltage-dépendants
ou/et de canaux récepteurs. L'hainantoxine-III et
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al., 2001), car ces deux peptides n'ont aucun effet sur les réduction de la disponibilité des canaux au potentiel de
blattes, les contractions du diaphragme de souris induites repos, car après les traitements aux toxines, l'amplitude des
par un stimulus électrique direct, ou la tension de twitch courants enregistrés à partir du potentiel de maintien de
du cœur de grenouille (données non montrées). Il est donc même mV130 n'a pas retrouvé complètement la taille de
très probable qu'ils ciblent sélectivement les isoformes de contrôle (voir Fig. 6). Cependant, le résultat inverse
VGSCs sur les membranes des neurones de mammifères. se produit en présence d'autres toxines d'araignée telles que
les y- aractoxines. Les deux hainantoxines affectent la
Il existe plus de six sites récepteurs neuronaux sur les
cinétique de réamorçage.
canaux Na+, qui peuvent être modulés par des toxines
natives. A ce jour, près de 20 toxines peptidiques
interagissant avec les VGSCs ont été fractionnées à partir
des venins d'araignées. À l'exception de l'huwentoxine-IV,
D'autres toxines d'araignée, telles que les y-aractoxines, les
A-agatoxines et les N- palutoxines, partagent toutes un mode
commun de ralentissement de la cinétique d'inactivation
des courants, similaire aux a- toxines de scorpion, ou aux
toxines d'anémone de mer ciblant le site des canaux
(3Escoubas et al., 2000). Huwentoxin-IV est une toxine
semblable au site 1 trouvée en premier parmi les toxines
d'araignée (Peng et al., 2002). La découverte la plus
intrigante de la présente étude est que, comme dans le cas
de la toxine de l'araignée, la toxine de l'araignée est une
toxine de type 1.
L'huwentoxine-IV, l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ne
montrent aucun effet sur la cinétique d'activation ou
d'inactivation des VGSCs. Les mêmes résultats sont
également obtenus sur les cellules NG108-15 (résultat non
publié). De plus, ce résultat est cohérent avec celui du
venin brut d'araignée, qui ne ralentit pas la cinétique
d'inactivation des +courants Na sur les cellules NG108-15
(Xiao et al., 2001). Les toxines3 de site induisent la
libération de transmetteurs sur la membrane présynaptique
de sorte qu'elles provoquent des contractions spontanées
du muscle lisse isolé du canal déférent de rat (Escoubas et
al., 2000) et augmentent même la tension de contraction
du muscle isolé du diaphragme (Araujo et al., 1993). En
revanche, l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ont
bloqué la transmission neuromusculaire dans les
préparations de synapses isolées du nerf déférent de rat et
du nerf phrénique-diaphragme de souris dans nos études
précédentes. De plus, comme la tétrodotoxine,
l'hainantoxine-III et l'hainantoxine-IV ont complètement
bloqué les courants de ralentissement induits par les
toxines du site 3. En revanche, aucune des deux toxines n'a
déplacé la dépendance en tension de l'inactivation des
VGSCs. Ainsi, il est hautement improbable que deux
hainantoxines ciblent l'un des sites 2 - 6 sur les canaux Na+.
Nous sommes convaincus que, comme la huwentoxine-IV,
deux hainantoxines appartiennent à la famille des toxines1
de site.
La plupart des toxines d'araignée affectant les VGSCs
peuvent décaler l'état d'équilibre d'inactivation des canaux
et accélérer le taux de récupération de la transition entre
les états inactivé et de repos du canal (Nicholson et al.,
1998). La huwentoxine-IV est la toxine d'araignée qui a
été la première à ne pas cibler le site 3 des canaux Na+.
Mais les effets de l'huwentoxine-IV sur la cinétique
d'inactivation et de réamorçage à l'état stable des VGSC ne
sont pas clairs. Les deux hainantoxines déplacent
également l'inactivation à l'état d'équilibre, et il semble
que les effets inhibiteurs du +courant Na sensible à la
tétrodotoxine ne soient pas principalement dus à la
 Y. Xiao, S. Liang / European Journal of Pharmacology (4772003) 1-7
différemment. Une diminution significative de la vitesse de
récupération après inactivation des canaux Na+ a été
observée. L'effet similaire de certains agents
antihyperalgésiques (antidépresseurs tricycliques, 4030w92
(2,4-diarmino-5-5-(2,3-dichlorophényl)-6-
fluorométhylpyrimidine)) est rapporté récemment sur les
isoformes de +canaux Na neuronaux dans les cellules
chromaffines surrénales bovines (Pancrzao et al., 1998). De
manière surprenante, l'hainantoxine-IV n'a pas modifié la
cinétique de réamorçage des VGSCs. Cela indique que
deux hainantoxines ont une action différente des segments
S4 (capteur de tension) sur les canaux.
Il n'est pas surprenant que la toxicité de l'hainantoxine-
IV soit la même que celle de l'huwentoxine-IV avec une
valeur de CI50 de 30 nM. L'huwentoxine-IV est un motif
typique de nœud cystine inhibiteur (ICK) et en analysant sa
structure tridimensionnelle, Peng et al. (2002) suggèrent
que le résidu Arg26 doit être crucial pour sa liaison aux
VGSCs neuronaux sensibles à la tétrodotoxine. Bien que
l'huwentoxine-IV et l'hainantoxine-IV soient isolées de venins
d'araignée différents, elles partagent 80 % d'identité de
séquence entre elles et l'Arg26 est également conservé dans
l'hainantoxine-IV. Il est intéressant de noter que
l'hainantoxine-III est 40 fois plus puissante que
l'hainantoxine-IV et l'huwentoxine-IV. Bien que des
travaux récents indiquent que la toxine hainan-III adopte
également un motif ICK (résultat non publié), elle partage
une identité de séquence limitée avec l'huwentoxine-IV et
l'hainantoxine-IV (Fig. 1). L'Arg26 dans l'huwentoxine-IV
n'apparaît pas dans l'hainantoxine-III à la position
correspondante. Comme l'hainantoxine-III partage une
identité de séquence limitée avec d'autres peptides, il est
difficile de déterminer les résidus clés de l'hainantoxine-III.
Cependant, nous sommes convaincus que, comme la
tétrodotoxine et la saxitoxine, les trois toxines d'araignée ne
peuvent pas cibler les mêmes résidus actifs sur les
protéines VGSC. Les deux hainantoxines seront un outil
utile pour discriminer les différents sous-types de canaux
Na+ et révéler la relation structure-fonction des +canaux Na.
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