Bases Pratiques Des Chromatographies

emc-consulte : Le clic vers la rfrence mdicale
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Imprim par M. Jean Roch ALLIEZ le dimanche 17 fvrier 2008
Bases pratiques des chromatographies Practical principles in chromatography

Biologie clinique [90-60-0027]
M. Beljean-Leymarie Centre hospitalier spcialis Bon Sauveur, 93, rue Caponire, 14000 Caen, France Auteur correspondant.
Rsum
La chromatographie est l'ensemble des procds qui permettent de sparer diffrentes substances constitutives d'un chantillon en utilisant leur diffrence de migration travers une phase fixe sous l'impulsion d'un fluide mobile. Cet article prsente trs brivement les diffrentes mthodes utilises en chromatographie. Il dveloppe plus spcifiquement le concept de la chromatographie d'lution sur colonne et fournit les bases thoriques et pratiques requises l'amlioration raisonne des procdures de chromatographie.
Abstract
Chromatography refers to the body of processes used to separate different constituting substances of a sample using their difference of migration on a stationary and a fluid mobile phase. This chapter presents briefly the various techniques available in chromatography. It presents more specifically the column elution theory, providing the theoretical and practical bases required for the chromatographic procedure improvement.
Mots cls : Chromatographie, Chromatogramme, Rtention, Efficacit, Rsolution Keywords : Chromatography, Chromatogram, Retention, Efficiency, Resolution
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Introduction
La chromatographie est l'ensemble des procds qui permettent de sparer diffrentes substances constitutives d'un chantillon en utilisant leur diffrence de migration travers une phase fixe (phase stationnaire) sous l'impulsion d'un fluide mobile (phase mobile) [1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7]. Les mthodes chromatographiques sont nombreuses, les dnominations sont variables selon le type de classification choisie.
Classification selon la nature des phases
file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique... 28/07/2011
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Phase stationnaire solide ou liquide ; phase mobile gazeuse, liquide ou supercritique ; on diffrencie trois grandes classes de chromatographie : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ; la chromatographie liquide (CL) ; la chromatographie en phase supercritique (CPS). Les termes de chromatographie gaz-solide, gaz-liquide, liquide-solide, voire liquide-liquide sont dlaisss aujourd'hui.
Classification selon la nature des phnomnes mis en jeu

On distingue diffrents types de chromatographie : chromatographie d'adsorption : lorsque la phase stationnaire est un solide adsorbant, la phase mobile tant soit un liquide, soit un gaz ; chromatographie de partage : lorsque la sparation est base sur les diffrences de solubilit (de partage) des molcules dans une phase stationnaire liquide et une phase mobile (gaz, liquide, FSC) ; chromatographie d'appariement d'ions : c'est une chromatographie liquide applique des molcules ionises qui, mises en prsence d'un contre-ion, donnent naissance des paires d'ions ; chromatographie d'change d'ions lorsque la phase stationnaire est un solide ayant des proprits particulires d'changeur d'ions (groupements fonctionnels ioniss ou ionisables fixes et des ions mobiles assurant l'lectroneutralit) ; chromatographie d'change de ligands lorsque la phase stationnaire contient une espce chimique (ions mtalliques) capable de former des complexes avec les molcules organiques ; chromatographie d'exclusion-diffusion (permation de gel - filtration sur gel) lorsque la phase stationnaire est forme de grains poreux travers lesquels les soluts sparer peuvent ou non cheminer ; chromatographie chirale (lorsque la sparation s'appuie sur la diffrence de conformation des nantiomres, elle peut tre dveloppe en phase gazeuse, liquide ou supercritique) ; chromatographie d'affinit : c'est une chromatographie d'un type trs particulier qui vise sparer un solut parmi tous les autres (contrairement aux autres chromatographies qui visent la sparation d'un maximum de soluts) en utilisant la complmentarit de structure de type cl-serrure.
Classification selon le matriel utilis (technologie)

Chromatographie en colonne : tube, rempli ou non de phase stationnaire. Chromatographie planaire (de surface) : couche mince d'un support plus ou moins adsorbant.
Classification selon le mode d'introduction de la phase mobile

On parle de chromatographie par dveloppement lorsque le mlange est dpos sous forme de microvolume de solution et les soluts spars sur la phase stationnaire sont mis en vidence (rvls) lorsqu'ils sont encore sur la phase stationnaire et de chromatographie par lution lorsque le mlange analyser est dpos sous forme de microvolume de solution, chaque solut tant entran hors de la phase stationnaire. L'identification des substances spares se fait dans l'luat (c'est--dire la phase mobile la sortie de la colonne).
Remarque concernant les chromatographies haute performance

Les chromatographies haute performance sont nes des progrs technologiques.
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Chromatographie en phase gazeuse haute performance (CPG capillaire). Chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC) correspondant la chromatographie liquide dsormais courante avec phase mobile liquide pulse et supports de la phase stationnaire homognes, de trs petite taille. La notation haute performance est devenue, aujourd'hui, inutile. La chromatographie couche mince haute performance (HPTL) utilise les supports dvelopps pour l'HPLC contribuant la performance. La suite de cet article porte exclusivement sur la chromatographie d'lution sur colonne. L'me de la chromatographie est la colonne, les soluts s'y sparent au fur et mesure de leur progression en fonction de leurs diffrences d'affinit pour les phases. Toutefois, la colonne est ncessairement intgre dans un ensemble allant de l'injecteur l'enregistreur. Le rsultat observ (le chromatogramme) (Figure 1) n'est que le rsultat global de l'ensemble de l'appareillage.
Figure 1
Figure 1. Chromatogramme. Pic d'allure gaussienne. H : hauteur du pic ; Tr : temps de rtention ; : largeur la base ; : largeur mi-hauteur. Zoom
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Notions lies au chromatogramme

Chromatogramme
La simple observation d'un chromatogramme montre qu' la sortie de la colonne, un solut se prsente sous forme d'un pic d'allure gaussienne et que la largeur des pics augmente avec leur ordre de sortie (Figure 2).
Figure 2
Figure 2. Chromatogramme. Zoom
Le but de cet article tant essentiellement pratique, sont dveloppes succinctement les notions
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fondamentales qui permettent de juger un chromatogramme.
Concepts
Les diffrentes thories de la chromatographie d'lution en colonne visent expliquer le chromatogramme. La premire thorie de la chromatographie a tabli que le pic chromatographique est gaussien et que, sur le mme chromatogramme, la largeur des pics augmente avec la rtention des soluts ; menant aux deux relations majeures toujours trs couramment utilises par les utilisateurs de la chromatographie : la notion d' efficacit d'une colonne ; la notion de facteur de rtention (caractristique d'un solut dans des conditions donnes). Le pic d'allure gaussienne (Figure 1) implique que le pic rponde l'quation mathmatique d'une courbe de Gauss c'est--dire : le pic est symtrique autour de sa mdiane (correspondant au maximum max du pic), son quation est telle que les deux points d'inflexion, situs 60,7 % de la hauteur H du pic sont distants de 2 (l'cart-type), sa largeur mi-hauteur = 2,354 , la largeur la base du triangle extrapol par les tangentes aux points d'inflexion est gal 4 ; que la surface du pic, proportionnelle la quantit de solut injecte sur la colonne, est telle que : 95 % de la masse du solut est comprise entre m ax 2 ; 99,7 % du solut entre m ax 3 .
Cette surface A = 2 H.
Grandeurs de rtention
Ces grandeurs sont dfinies au moment o le solut sort de la colonne son maximum de concentration. le temps de rtention tr est le temps que met un solut sortir de la colonne, son maximum de concentration. t = 0 au moment de l'injection ; tr = L/vitesse du solut sur la colonne.
Remarque : une substance n'ayant aucune affinit pour la phase stationnaire n'est prsente que dans la phase mobile. Son temps de rtention est gal tm . Si reprsente la vitesse linaire de la phase mobile, tm = L/. Le tr est caractristique d'un solut donn dans un systme chromatographique donn. La distance de rtention dr est la distance parcourue par le stylet de l'enregistreur depuis le moment de l'injection du solut jusqu' sa sortie au maximum de concentration. dr est fonction de la vitesse de droulement du papier : dr = v papier tr .
Le volume de rtention Vr est le volume de phase mobile qui a perfus la colonne entre le moment de l'injection et l'instant o le solut sort son maximum de concentration. Si D est le dbit de la phase mobile perfusant la colonne (suppos constant) Vr = D tr .
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Deux relations majeures Efficacit apparente d'une colonne

La colonne de chromatographie est assimile l'empilement de N plateaux identiques (plateaux thoriques) de hauteur H. La longueur L de la colonne est gale NH. H est appel hauteur quivalente un plateau thorique (HEPT), anciennement note h. (Actuellement, la notation h est rserve comme symbole pour la hauteur rduite [cf. infra].) N se dfinit comme le nombre de plateaux thoriques sur une colonne. Ce nombre est accessible partir du chromatogramme, par comparaison de la grandeur de rtention la largeur du pic gaussien : N = (tr /total )2. Les pics sont d'autant plus troits que N est grand. La colonne est d'autant plus performante que N est grand ; elle a d'autant plus d'aptitude sparer les diffrents soluts ; elle est d'autant plus efficace . N exprime l'efficacit apparente de la colonne. Comme le terme apparent l'indique, la valeur de N ainsi tablie ne permet pas de juger des performances de la colonne elle-mme uniquement, puisque la colonne est ncessairement intgre dans l'ensemble de la chane de chromatographie. De ce fait, la variance 2total accessible par le chromatogramme est le reflet du systme chromatographique, dans sa globalit : 2total = 2 colonne + 2extracolonne .
Cette relation implique : qu'il est ncessaire dans une chromatographie de matriser la variance extracolonne afin de ne pas nuire aux performances de la colonne ; que l'on est amen avoir une exigence d'efficacit de la colonne suprieure celle d'un calcul thorique partir du chromatogramme. Aussi utilise-t-on de prfrence le terme d'efficacit Napparent ou Neffectif .
Facteur de rtention k
La deuxime relation fondamentale relie le volume de rtention d'un solut Vr aux volumes des phases stationnaire Vs et mobile Vm de la colonne, via le coefficient de partage K (de l'quilibre suppos). Vr = Vm + K Vs . Le facteur de rtention k (anciennement dnomm k' facteur de capacit) peut tre dfini soit comme le rapport des masses de solut distribues entre les deux phases (k = mstat. /mmob ) ou comme le rapport des temps de sjour du solut dans ces deux phases (tstat. /tmob. ), ce rapport est constant pour un solut donn dans un systme chromatographique donn stable dans le temps. Ainsi la relation K Vs /Vm se rencontre le plus souvent sous la forme : Vr = Vm (1 + k). Elle est traduite en termes de temps sous la forme : tr = tm (1 + k). Il est caractristique de chaque solut, il est tel que k = (tr -tm )/tm ; en pratique il est difficile d'apprhender tm . En chromatographie liquide, par exemple, on utilise des soluts supposs n'avoir aucune affinit pour la phase stationnaire (inertes) et l'on dfinit alors le facteur de rtention par rapport l'inerte choisi, comme k = tr -t0 /t0 ; t0 tant le temps de rtention de l'inerte choisi sur la phase utilise.
Consquences pratiques Dterminer exprimentalement le facteur de rtention
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Pour dterminer exprimentalement le facteur de rtention d'un solut donn, dans un systme chromatographique donn, il est ncessaire de disposer d'un compos que l'on puisse considrer comme n'ayant aucune affinit pour la phase stationnaire. Diffrents composs ont t proposs dans la littrature (nitrate, uracile...) en chromatographie liquide ; en CPG, on peut utiliser le pic de l'air avec certains dtecteurs.... Ce compos a pour temps de rtention t0 , le solut donn, prsentant un temps de rtention tr tel que tr = to (1 + k). Le facteur de rtention k = (tr - t0 )/t0 .
Dterminer l'efficacit apparente d'une colonne

On envisage les deux cas exprimentaux possibles, lis la symtrie des pics.
Pic symtrique
On mesure sur le chromatogramme : tr et soit partir de la largeur mi-hauteur (2,354 ), soit partir de la largeur entre les deux points d'inflexion (2) ou partir de la largeur la base extrapole par les tangentes ( = 4). On calcule N = (tr /)2.
Pic dissymtrique
L'asymtrie des pics complique l'interprtation du chromatogramme. Il est impossible de mesurer correctement . Les calculs effectus la base du pic, 50 ou 60,7 % de la hauteur conduisent des valeurs diffrentes, d'autant plus grandes que la mesure est faite dans la partie la plus basse du pic. Dans ce cas, il est souhaitable de disposer d'un logiciel qui permette d'accder aux moments statistiques de chacun des pics. Un pic chromatographique correspond la variation de la concentration ou de la quantit du solut dans le dtecteur en fonction du temps. Le moment d'ordre 0 . Mo = C(t) dt, reprsente l'aire sous la courbe. Cette aire est assimilable la quantit de solut injecte. Le moment d'ordre 1 . M1 = 1 / Mo 0 C(t) . t. dt correspond la valeur de t du centre de gravit pour laquelle la surface de la courbe de t infrieur est gale la surface de la courbe de t suprieur et gale la moiti de la surface de la courbe totale, c'est--dire quantit de solut pour t infrieur = quantit de solut de t suprieur = q o /2. (Lorsque le pic est gaussien, il correspond la valeur de t au maximum de la concentration C par dfinition au tr ; lorsque le pic n'est pas gaussien M1 ne correspond pas la valeur de t pour le maximum de concentration. Il est donc diffrent de t). Le moment d'ordre 2. M2 = 1/ Mo 0 C (t) (t - M1 ) 2 dt mesure la variance de la courbe (du pic) 2 pour des pics non symtriques : l'efficacit apparente de la colonne N est calcule, l'aide des moments, elle correspond au rapport des moments M1 2/M2 . Le moment d'ordre 3. M3 = 1/ Mo 0 C (t) (t - M1 ) 3 dt mesure l'asymtrie du pic.
Accder l'efficacit intrinsque d'une colonne

Dtermination de la variance extracolonne
On utilise le chromatogramme obtenu partir de l'injection d'un mlange d'au moins trois
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composs et d'une substance considre comme prsentant une rtention nulle, de temps de rtention t0 . Pour chacun des trois pics, on dtermine : le facteur de rtention k et la variance 2 total ; l'efficacit apparente de la colonne N est calcule ou donne par l'intgrateur. On reprsente la courbe 2total = f (t0 2/N) (1+ k)2] o (1+ k)2 est port en abscisse. Il s'agit d'une droite pour laquelle, lorsque k = 0 c'est--dire pour (1+k)2 = 1, la variance 2 totale correspond uniquement la variance extracolonne 2extracol . Celle-ci doit imprativement tre infrieure 10 % de la variance des pics. Ainsi pour rpondre une valeur souhaite d'efficacit de l'ensemble, il faut avoir une exigence suprieure pour la colonne. En effet Ncol = [tr col ]2 ; N exige (pour une bonne sparation par exemple) est Nexig = [tr 2col 2 + extracol 2] ; Nexig. = Ncol. /[1 + (extracol 2/col 2)], (Nexig est bien > Ncol. ).
Comment diminuer la variance extracolonne ?

La matrise de la variance extracolonne appartient au chromatographiste. La variance extracolonne rsulte de la dispersion du solut au niveau de l'injecteur, du dtecteur, et des capillaires de jonction. 2total = 2 inj + 2 tubes + 2 dtect .
- Au niveau de l'injecteur : 2 = V2/a o V est le volume d'injection ; on veille limiter le inj volume inject, si les concentrations disponibles le permettent.
4 - Au niveau des capillaires de jonction : 2 tubes = constante . D . d L/Dm . o d est le diamtre des tubes de jonction, D est le dbit de la phase mobile et Dm est le
coefficient de diffusion du solut. Ce paramtre est majeur car d intervenant la puissance 4 (d4) on veille n'utiliser que des capillaires trs troits destins cet effet. - Au niveau du dtecteur, deux paramtres sont importants : d'une part le temps de rponse, on veille rgler correctement la constante de temps du dtecteur ; d'autre part le volume de la cellule (choix l'achat).
Existence d'une variance extracolonne importante

Elle a pour consquence : une perte d'efficacit apparente de la colonne comme on vient de la montrer Nobs (1 + 2
2 extracolonne / colonne
= Nintr /
);
une perte de rsolution comme on va de le voir dans ce qui suit.
Grandeurs de rtention relatives

Le but de la chromatographie tant de sparer les diffrents soluts, des critres d'estimation des sparations ont t dfinis. Ce sont les grandeurs de rtention relatives.
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Pour cerner de plus prs le temps que passent les soluts dans la phase stationnaire, il est ncessaire de s'affranchir du terme tm intervenant dans tr , puisque tm reprsente le temps mis par un solut n'ayant aucune affinit pour la phase stationnaire pour sortir de la colonne. Les grandeurs de rtention corriges, ne pas confondre avec les grandeurs rduites (cf. infra) : t' = t - t ; r r m d' r V' r = dr - dm ; = Vr - Vm .
Les grandeurs de rtention relatives permettant d'apprcier la sparation de deux soluts lus conscutivement.
Rtention relative ou slectivit

La slectivit est dfinie comme le rapport entre les facteurs de rtention de deux soluts conscutifs (la plus grande des deux valeurs tant toujours porte au numrateur) = k2 /k1 . > 1. = 1 si les deux composs ne sont pas spars ; plus est suprieur 1, plus les composs sont spars . Remarque : = k2 /k1 = K2 /K1 ; K1 et K2 les coefficients de partage.
La slectivit mesure la diffrence de distribution thermodynamique des deux composs. Il s'agit des diffrences d'interactions des soluts dans les phases stationnaire et mobile. C'est une caractristique de la colonne. Toute modification de la nature de l'une ou de l'autre phase modifie .
Rsolution de pics symtriques

La rsolution est la grandeur destine apprcier la sparation de deux pics conscutifs. La premire dfinition s'adresse des pics gaussiens. Elle consiste comparer la distance qui spare deux pics conscutifs la somme de leurs demi-largeurs.
est la largeur la base du triangle, extrapole par les tangentes ; tRB est le temps de rtention du compos le plus retenu ; tRA est le temps de rtention du compos le moins retenu (Figure 3).
Figure 3
Figure 3. Rsolution de pics symtriques.
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Zoom
Valeur limite de Rs
On lit couramment que pour que deux pics soient bien spars, il faut R de cette valeur ? Cette valeur repose sur deux hypothses : les deux pics sont gaussiens et de mme importance quantitative. , la courbe Les pics sont gaussiens : 99,7 % du solut est compris sous la courbe entre tR est symtrique, il reste de part et d'autre de ce domaine 0,15 % de solut. Ainsi, dans le schma ci-dessus : OA K = 3 A ; OB L = 3 B , si L et K sont confondus IF = OA K + OB L = 3 A + 3 B ; 99,85 % de A est gauche de K(L) et 99,85 % de B est droite de L(K). Il existe un chevauchement de 0,15 % de A avec 0,15 % de B, si les deux pics sont d'gale importance (ceci est ngligeable) et l'on peut considrer que les deux substances sont bien spares.
s
1,50. Que penser
Remarque : si un pic est nettement plus important que l'autre, le recouvrement du plus petit est bien suprieur (> > 0,15 %), on doit avoir une plus grande exigence Rs = 2 voire 3 et plus .
Relations entre rsolution et paramtres chromatographiques
On peut montrer qu'il existe une relation entre la rsolution d'une part et l'efficacit N et la slectivit de la colonne, ainsi que les facteurs de rtention k des deux soluts d'autre part. On trouve dans la littrature plusieurs relations voisines diffrant par les hypothses faites. Les deux hypothses les plus frquemment rencontres s'appuient sur le fait que les pics sont trs proches l'un de l'autre, voire trop proches. Le calcul de rsolution a toujours pour but de rflchir la meilleure faon d'amliorer une sparation un peu dlicate (d'optimiser). Ce sont :
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1re hypothse : les pics sont si proches que l'on peut considrer qu'ils sont de mme largeur A = B avec B = 4 trB /NB , B est le compos le plus retenu partir duquel on calcule NB ;
2e hypothse : N efficacit est la mme pour tous les composs conscutifs, cette hypothse prsente l'avantage de donner aux deux soluts la mme importance.
reprsente la demi-somme des deux k . Ces deux relations conduisent des rsultats analogues, suffisants pour rpondre au but poursuivi : rationaliser l'influence de facteurs lis la chromatographie - c'est dire rationaliser l'optimisation. Rs varie : avec N l'efficacit de la colonne ; avec la slectivit de la colonne ; avec k les facteurs de rtention. Pour augmenter une rsolution on peut donc envisager la modification d'au moins un de ces trois paramtres. Augmenter N. N = L/h. Pour augmenter R, on peut augmenter L ou diminuer h (HEPT). Si on augmente L, ceci implique un changement de colonne et de plus tr augmentant, le temps de l'analyse augmente. On prfre d'abord chercher diminuer la HEPT H. Il suffit pour cela de vrifier que la colonne est utilise dans les conditions optimales de dbit. Influence de la vitesse linaire de la phase mobile sur l'efficacit de la colonne. On montre que l'largissement des bandes de solut sur une colonne est le rsultat de trois phnomnes : varit des chemins parcourus, diffusion, rsistance au transfert de masse vers l'une et l'autre phase. Ainsi la variance de la bande de solut sur la colonne : 2 col = 2 anisotropie + 2
diffusion
+ 2 transfert de masse .
On peut s'appuyer, dans une premire approche simplifie, sur l'quation de Van Deemter, reliant la HEPT la vitesse de la phase mobile . H = A + B/ + C , chacun des trois termes correspond une cause d'largissement des pics chromatographiques. Il est ais de montrer que la courbe reprsentative d'une telle quation prsente un minimum. ce minimum de la valeur Hmini correspond le maximum de la valeur Nmax que l'on peut donner l'efficacit de la colonne. Aspect pratique : dtermination du dbit optimal . Il est ncessaire d'tre attentif au rglage du dbit de la phase mobile D ; dbit et vitesse sont troitement lis : D = r2 , tant la
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porosit de la colonne. Pour dterminer le dbit optimal, on mesure l'efficacit apparente de la colonne trois dbits de (opt.= Remarque : en chromatographie liquide, une approche plus prcise utilise la relation de Knox, plus complte et reliant la HEPT rduite h (H/dp ) la vitesse rduite de la phase mobile H = A 1/3 + B/ + C Modification de la slectivit . peut tre modifi : en changeant la nature et la composition de la phase mobile ; en changeant la nature de la phase stationnaire ; en modifiant la temprature. Il est noter que ce qui influence la rsolution, est plus exactement le rapport :
Les modifications sur des trs proches de 1 ont une grande influence ; en revanche, si est trs diffrent de 1, l'influence est minime. Par exemple :
Le premier essai effectuer en chromatographie liquide porte sur la modification de la composition de la phase mobile. Le premier essai effectuer en chromatographie gazeuse porte sur la modification de la temprature. Modifications de k. En chromatographie liquide, on cherche habituellement des k compris entre 2 et 5 pour l'analyse de mlanges peu complexes. Les modifications sur des k trs proches de 0 ont une grande influence ; en revanche, si k est trs diffrent de 1, l'influence est minime, on est alors confront d'autres inconvnients. Ainsi, lorsque k passe de 5 10 la rsolution n'augmente que de 9 %, mais la dure d'analyse double.
Rsolution de pics dissymtriques
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La dfinition de la rsolution repose sur l'observation de chromatogrammes o les pics sont symtriques. Les exigences sont diffrentes si les pics sont de hauteurs trs diffrentes et si les pics sont asymtriques car, dans ces cas, la mesure de la largeur du pic notamment 60,7 % de hauteur (2) n'est plus adapte, devient suprieur 4. La dtermination gomtrique n'a plus de sens. Rs doit tre calcul partir du facteur de discrimination do . Le facteur de discrimination est par dfinition le rapport (Figure 4) :
Figure 4
Figure 4. Rsolution de pics dissymtriques. Facteur de discrimination. Zoom
hp hv
= hauteur du plus petit. = hauteur de valle.
Il a t montr qu'il existait une relation simple approximative mais suffisante pour chiffrer la sparation de deux soluts conscutifs : d0 = 1 - 2 e[-2Rs 2] = rsolution
o Rs
Calcule initialement pour des pics gaussiens, cette relation s'est avre satisfaisante pour des pics dissymtriques. De plus, comme nous l'avons montr prcdemment, l'existence d'une variance extracolonne minore la rsolution intrinsque sur la colonne.
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Intrt analytique de la chromatographie

Comme pour toutes les mthodes analytiques, les applications sont qualitatives et quantitatives.
En analyse qualitative
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Les mthodes chromatographiques sont des mthodes de sparation. Aprs sparation, les constituants peuvent tre identifis. Le premier critre d'identification d'un solut est son temps de rtention tr . tr est constant dans des conditions chromatographiques donnes, c'est--dire sur une colonne donne dans des conditions donnes (temprature et P en CPG ; nature, composition et dbit de la phase mobile en CL temprature donne). Mais le tr n'est pas un critre absolu . En effet, si on peut incontestablement affirmer que deux soluts dont les tr sont diffrents, sont de natures diffrentes, l'inverse n'est pas vrai. En effet, la sparation chromatographique repose sur des diffrences entre les soluts : de polarit, de polarisabilit, de solubilit, de tension de vapeur saturante (en CPG), d'encombrement strique... Ainsi, deux soluts de structures totalement diffrentes peuvent prsenter le mme tr . De nos jours, ce problme est moins complexe du fait des nouveaux dtecteurs qui sont en mesure de mmoriser simultanment trois paramtres. Par exemple : en spectrophotomtrie UV-visible, avec barrette de diodes (en CL) ou en spectrophotomtrie IR avec transforme de Fourier (en CPG) : le systme de dtection acquiert simultanment les donnes : absorbance, longueur d'onde et le temps ; en dtection de masse, ce sont les donnes courant ionique, m/z et temps qui sont mmorises simultanment. De ce fait, il est possible d'analyser toute partie du pic chromatographique et de conclure la puret du pic et l'identification.
En analyse quantitative
L'analyse quantitative est lie la thorie qui permet d'tablir que l'aire du pic est proportionnelle la quantit injecte. Ai : aire du pic correspondant l'intgration du signal dlivr par le dtecteur ; f i : facteur de rponse ou coefficient de rponse du dtecteur ; m i : masse solut, donc Ai = fi mi .
En thorie, on peut faire un talonnage en injectant un volume constant de solutions de concentrations diffrentes et en traant la courbe A = f(C). Cette courbe devrait tre une droite (dans les cas les plus simples). En ralit, la matrise de l'exactitude du volume inject est beaucoup plus difficile que l'on peut a priori supposer, mme quasi impossible en CPG. Aussi prfre-t-on utiliser un talon interne.
Principe de la mthode
Un talon interne (EI) est une substance que l'on ajoute aux chantillons analyser, concentration constante. Il est choisi parmi les soluts se sparant parfaitement bien des composs analyser mais prsentant un temps de rtention proche. Il permet d'liminer les erreurs quantitatives lies une mauvaise matrise du volume inject. L'aire d'un pic chromatographique est proportionnelle la masse de solut inject. Pour un solut X : mX = K AX ; pour l'EI : mEI = KEI AEI X et EI sont dans la mme solution de volume inject v. Si le dtecteur est stable, K et KEI sont constants dans le temps :
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Remarque : Le rapport mX /mEI des masses injectes est le mme que celui des masses dans le tube d'chantillon trait dans le protocole (avec la quantit fixe d'EI).
Ainsi,
qEI sera imprativement constant et AX /AEI = z' qX Le volume final n'est pas ncessairement gal dans tous les tubes, mais la quantit d'talon interne doit tre rigoureusement la mme dans tous les tubes.
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Conclusion
Cette fiche a pour but de rsumer les notions de base, afin de situer les problmes pratiques rencontrs lorsqu'on aborde la chromatographie. La pratique de chaque type particulier de chromatographie, chromatographie en phase gazeuse, chromatographie liquide polarits de phase inverses, chromatographie d'exclusion, DHPLC, etc... ainsi que l'appareillage ou les dveloppements rcents dans le domaine de la microchromatographie, de la nanochromatographie ou des flash chromatographies ne font pas l'objet de ces bases pratiques.
Le lecteur peut se reporter aux ouvrages gnraux ou spcialiss ainsi qu'aux informations trs dtailles fournies par les socits d'appareillage.
Figure 1
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Figure 1 : Chromatogramme. Pic d'allure gaussienne. H : hauteur du pic ; Tr : temps de rtention ; : largeur la base ; : largeur mi-hauteur.
Figure 2
Figure 2 : Chromatogramme.
Figure 3
Figure 3 :
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Rsolution de pics symtriques.
Figure 4
Figure 4 : Rsolution de pics dissymtriques. Facteur de discrimination.
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Rfrences
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[2] Caude M. Jardy A editors. Chromatographie liquide (partie 2). Permation de gel Techniques de l'analyse. (vol TA2) Paris: Techniques de l'ingnieur; 2007. [3] Caude M., Bargmann-Leyder N. Sparations TA2) Paris: Techniques de l'ingnieur; 2007. chirales Techniques de l'analyse. (vol
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[7] Chromatographie : faire le bon choix (automates) Option Bio. 2006 ; 361 : 38-44
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2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.
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Bases Pratiques Des Chromatographies

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Imprim par M. Jean Roch ALLIEZ le dimanche 17 fvrier 2008