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ÉLECTROPHORÈSE

Article écrit par Jean GUASTALLA, Jean MORETTI, Jean SALVINIEN

Prise de vue

En solution ou en suspension dans l'eau, une solution aqueuse ou certains autres liquides, des macromolécules, des particules, des grains d'émulsion, des bactéries même tendent en général à se déplacer sous l'effet d'un champ électrique : c'est l'électrophorèse, découverte en 1892 par S. E. Linder et H. Picton.

L'importance du phénomène d'électrophorèse, outre son intérêt théorique propre, réside dans l'utilisation qu'on en fait, très largement, à des fins analytiques ou préparatives. On doit à cette méthode la découverte et l'identification de nombreux constituants des tissus animaux et végétaux. La principale application pratique est l'étude des sérums pathologiques.

I-Principe de l'électrophorèse

L'électrophorèse suppose tout d'abord que la macromolécule ou la particule en cause possède une charge électrique. Dans le cas des macromolécules ionisables, l'origine de la charge électrique est évidente, mais, d'une façon plus générale, la surface d'un solide acquiert le plus souvent une charge électrique au contact de certains liquides qui favorisent l'ionisation. Ainsi, la surface de la silice ou du verre, au contact de l'eau, se charge négativement, en perdant des ions H + s'il s'agit de silice, des ions Na + s'il s'agit de verre. Même des corps qui ne sont pas capables de perdre des ions peuvent néanmoins acquérir au contact de ces liquides une charge superficielle, qu'on attribue à l'adsorption préférentielle d'ions d'une nature donnée ou d'un signe donné présents dans le liquide.

On suppose donc que la particule possède une charge électrique localisée à sa zone superficielle. Le principe d'électroneutralité impose la présence, autour de la particule, d'une couche d'ions de signe opposé dont la charge électrique compense exactement celle de la particule. Il faudrait en effet fournir un travail considérable pour accumuler dans un volume donné ou sur une surface donnée des charges électriques de même signe, non compensées par des charges de signe opposé très voisines ; la charge électrique totale d'un petit élément de surface électriquement chargé et d'une fine tranche de solution contiguë, contenant un excès d'ions de signe opposé, doit être pratiquement nulle.

Les théories classiques de l'électrophorèse reposent sur la structure de la couche double électrique et dérivent des théories de l'électro-osmose. L'électro-osmose est le déplacement d'un liquide le long d'une paroi solide, sous l'effet d'un champ électrique parallèle à celle-ci.

Suivant l'ancienne conception présentée par H. L. F. Helmholtz, les ions compensateurs s'aligneraient en une nappe parallèle à la paroi solide, à une petite distance bien définie de celle-ci. Cette représentation s'est révélée insuffisante : l'agitation thermique des ions compensateurs entre en compétition avec leur attraction électrostatique par la surface chargée et leur interdit une distribution en nappe parallèle à cette surface. D'après L. G. Gouy, les ions compensateurs se distribueraient en couche diffuse, de faible épaisseur, avec une répartition de type « atmosphérique » à partir de la surface solide. Selon Stern, une partie des ions compensateurs se fixeraient énergiquement à la paroi, le reste de ces ions constituant une couche diffuse de type Gouy.

Couche double ionique Schéma d'une couche ionique : selon Helmholtz (a), selon Gouy (b), selon

Couche double ionique

Schéma d'une couche ionique : selon Helmholtz (a), selon Gouy (b), selon Stern (c)(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Dans un champ électrique parallèle à la surface du solide supposé immobile, les ions compensateurs mobiles de la couche diffuse tendent à se déplacer en entraînant le liquide et provoquent l'électro-osmose.

L'hypothèse primitive de Helmholtz permet des calculs simples. Soit l la distance (très petite) entre la couche mobile d'ions compensateurs et la surface du solide, η la viscosité du liquide dans l'intervalle, σ la densité de charge par unité de surface du solide. Dans un champ unité, chaque centimètre carré de la nappe mobile d'ions compensateurs est soumis à une force tangentielle f égale à σ ; la vitesse μ eo de déplacement de l'eau qu'ils entraînent a pour valeur, d'après les lois de l'hydrodynamique :

pour valeur, d'après les lois de l'hydrodynamique : Soit ζ la différence de potentiel de passage

Soit ζ la différence de potentiel de passage à travers la couche double électrique constituée par les charges superficielles du solide et la nappe d'ions compensateurs, ε la constante diélectrique du liquide intercalaire. De la relation classique :

du liquide intercalaire. De la relation classique : (dans le système C.G.S.), on tire : La

(dans le système C.G.S.), on tire :

la relation classique : (dans le système C.G.S.), on tire : La valeur de la mobilité

La valeur de la mobilité électro-osmotique sera :

tire : La valeur de la mobilité électro-osmotique sera : On peut démontrer que la relation

On peut démontrer que la relation qui exprime la mobilité électro-osmotique est la même que ci-dessus dans le cas d'une couche diffuse de type Gouy, ζ représentant alors la variation de potentiel électrique de passage à travers toute l'épaisseur de la couche diffuse (dans le cas d'une couche de type Stern, le potentiel ζ sera compté à partir du plan où les ions commencent à être mobiles jusqu'à l'infini).

Dans l'électrophorèse, une particule, solide ou liquide, au contact d'une solution aqueuse par exemple, acquiert une charge superficielle, tout comme la paroi solide dans l'électro-osmose et pour des raisons analogues ; elle s'entoure d'un nuage diffus d'ions compensateurs. Mais, contrairement au cas d'une paroi solide, la particule n'est pas immobilisée : dans un champ électrique, elle sera entraînée vers l'électrode de signe opposé à celui de sa charge superficielle ; elle est toutefois ralentie dans ses déplacements par les ions compensateurs mobiles qui viennent s'accumuler devant la particule en mouvement et se déplacent en entraînant le liquide, le long de la surface de la particule et en sens inverse du déplacement de celle-ci, avant de se disperser derrière elle.

de celle-ci, avant de se disperser derrière elle. Particule chargée Schéma d'une particule chargée

Particule chargée

Schéma d'une particule chargée entourée de ses ions compensateurs(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Des calculs classiques conduisent à exprimer la mobilité électrophorétique μ eph , en valeur absolue, par une relation de la forme :

p h , en valeur absolue, par une relation de la forme : où α pourrait

où α pourrait prendre suivant les cas des valeurs comprises entre 4 π et 6 π ; cette relation est assez analogue à celle qui exprime la mobilité électro-osmotique. En fait, si l'on mesure simultanément les mobilités électrophorétique et électro-osmotique sur une suspension faite de la matière même de la paroi de la cellule (voir ci-dessous), on constate bien que les deux mobilités, qui sont de signe opposé, sont à peu près du même ordre de grandeur en valeur absolue. D'autre part, dans les relations classiques, le rayon de la particule s'introduit seulement dans un terme correctif : en fait, toutes choses étant égales par ailleurs, les valeurs expérimentales des mobilités électrophorétiques sont à peu près indépendantes des dimensions des particules.

Néanmoins, les théories actuelles laissent subsister des difficultés d'interprétation de certains faits expérimentaux. Le potentiel introduit dans les relations est une grandeur qui paraît difficile à mesurer directement, de sorte que les relations théoriques ne peuvent pas être contrôlées par l'expérience.

II-L'électrophorèse libre

Mesure de la mobilité électrophorétique

La mesure de la mobilité électrophorétique (vitesse de déplacement d'une particule ou d'une macromolécule, dans un liquide donné à une température donnée, sous l'effet d'un champ électrique unité) peut s'effectuer par observation des particules sous microscope si les particules sont visibles à l'aide de cet appareil, au moins sous éclairage ultramicroscopique ; si les particules sont invisibles au microscope (macromolécules en solution par exemple), on observe par des moyens optiques appropriés le déplacement dans le champ d'une frontière initialement créée entre la solution colloïdale et le solvant pur : la vitesse de

déplacement de cette frontière est celle des macromolécules.

Mesures sous microscope

Ces mesures, effectuées dans des canaux très fins, se compliquent du fait de la superposition de deux phénomènes : l'électrophorèse (déplacement des particules par rapport au liquide) et l'électro-osmose (déplacement du liquide le long des parois du canal).

On opère souvent selon la méthode d'Ellis : deux petits récipients communiquent par un « canal capillaire » long de quelques centimètres, généralement de section rectangulaire et de très faible épaisseur. La cellule est complètement remplie de la suspension à étudier ; on introduit dans les petits récipients des électrodes montées sur des bouchons qui assurent la fermeture étanche de la cellule.

bouchons qui assurent la fermeture étanche de la cellule. Cellule d'électrophorèse Schéma d'une cellule

Cellule d'électrophorèse

Schéma d'une cellule d'électrophorèse sous microscope(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Une différence de potentiel électrique connue est établie entre les électrodes : la valeur du champ électrique qui règne dans le canal peut être déduite de cette différence de potentiel ou, parfois, contrôlée grâce à une paire d'électrodes-sondes placées aux extrémités du canal. Dans ce champ électrique, le liquide de suspension est entraîné par électro-osmose le long des parois, mais, comme la cellule est close, ce liquide reflue en sens inverse dans la portion axiale du canal. Dans le cas d'un canal de section rectangulaire et de très faible épaisseur, les lois de l'hydrodynamique montrent que les vitesses du liquide par rapport aux grandes parois sont représentées, en fonction de la distance à l'une de ces parois, par un arc de parabole et qu'il existe deux plans parallèles aux grandes parois (plans stationnaires) au niveau desquels le liquide reste immobile ; les distances de ces plans à l'une des grandes parois du canal sont approximativement égales à 21 p. 100 et à 79 p. 100 de l'épaisseur du canal. Si l'on met un microscope exactement au point sur l'un des deux plans stationnaires, la vitesse directement mesurée sur les particules visibles avec netteté est leur vitesse d'électrophorèse.

avec netteté est leur vitesse d'électrophorèse. Canal capillaire d'une cellule d'électrophorèse

Canal capillaire d'une cellule d'électrophorèse

Coupe du canal capillaire d'une cellule d'électrophorèse sous microscope : les flèches représentent, à différentes profondeurs du canal, les vitesses du liquide entraîné le long des parois avec une vitesse Veo(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

La mobilité électrophorétique s'obtient en divisant la vitesse d'électrophorèse par la valeur du champ électrique dans le canal.

Mesures de la mobilité de macromolécules en solution

On utilise fréquemment un appareil de type Tiselius, où l'épaisseur des canaux des cellules est de l'ordre de plusieurs millimètres.

La cellule, soigneusement thermostatée, constitue, en position de mesure, un tube en U dans lequel sont superposés la solution macromoléculaire à étudier et son solvant (par exemple une solution de protéine dans un tampon et le tampon pur) ; la solution de plus forte densité (en général la solution macromoléculaire) doit être placée au-dessous de la solution de plus faible densité. À leur partie supérieure, les deux branches du tube en U communiquent avec des récipients contenant les électrodes. Dans une portion verticale de chacune des branches du tube en U, on crée, immédiatement avant de faire passer le courant électrique, une frontière aussi nette que possible entre la solution et son solvant. Il existe plusieurs techniques pour créer ces frontières précises. Dans l'appareil de Tiselius, le tube en U est sectionné en cinq tronçons, dont deux tronçons verticaux solidaires l'un de l'autre, formant un bloc qui peut glisser comme un tiroir aux joints parfaitement étanches entre la portion inférieure du tube en U et le bloc constitué par les deux portions supérieures ; la portion inférieure, indépendamment, peut aussi glisser le long de la base du « tiroir » médian. Grâce à un jeu convenable des parties mobiles, on emplit d'abord la portion inférieure du tube de solution, puis l'un des tronçons médians de tampon pur et l'autre de solution, enfin les branches supérieures de tampon pur ; on pousse alors les tiroirs de façon à reconstituer le tube en U ; puis, en déplaçant le liquide dans le tube, on amène les deux frontières à un niveau où leur examen optique est possible, c'est-à-dire dans les tronçons médians. S'il n'existe en solution qu'une seule espèce macromoléculaire, ou si les mobilités de toutes les espèces présentes sont de même signe dans les conditions de l'expérience, un champ électrique donné déplacera l'une des frontières vers le haut (branche ascendante), l'autre vers le bas (branche descendante) ; en même temps, les frontières perdent de leur netteté initiale en raison de la diffusion. Dans d'autres types d'appareils, on crée la frontière par aspiration latérale.

on crée la frontière par aspiration latérale. Appareil de Tiselius Schéma de la cellule de l'appareil

Appareil de Tiselius

Schéma de la cellule de l'appareil de Tiselius(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Le déplacement de la frontière peut s'observer directement si la macromolécule est colorée (hémoglobine par exemple) mais, dans le cas général, on utilise divers procédés optiques (interférométrie, dispositif de Philpot-Svensson) reposant sur la variation d'indice de réfraction de la solution macromoléculaire avec sa concentration, qui permettent de suivre le déplacement du plan où le gradient est

maximal ; ces procédés sont analogues à ceux que l'on emploie pour suivre un déplacement de frontière provoqué par ultracentrifugation.

Si la solution contient plusieurs types de macromolécules, de mobilités différentes, la frontière initiale se résout en général en plusieurs frontières qui se déplacent avec des vitesses différentes.

Remarquons que l'électro-osmose le long des parois de la cellule ne déforme pratiquement pas l'horizontalité des zones frontières dans les canaux verticaux et de large section des appareils de ce type, à condition toutefois qu'il y ait entre la solution et son solvant une différence de densité suffisante pour que les effets hydrostatiques rétablissent à chaque instant cette horizontalité.

La figure représente un diagramme d'électrophorèse obtenu à l'aide du dispositif Philpot-Svensson, relatif au sérum sanguin humain.

Philpot-Svensson, relatif au sérum sanguin humain. Diagramme Philpot-Svenson Calque d'un diagramme

Diagramme Philpot-Svenson

Calque d'un diagramme Philpot-Svensson (sérum sanguin humain normal)(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Ordre de grandeur des mobilités électrophorétiques

Qu'il s'agisse de la mobilité des particules visibles au microscope, de particules submicroscopiques, de micelles d'agents de surface, de macromolécules en solution, ou même de bactéries, les valeurs des mobilités en solution aqueuse sont le plus souvent de l'ordre de quelques microns par seconde dans un champ d'un volt par centimètre ; cet ordre de grandeur est le même que celui des mobilités des « petits ions » des électrolytes minéraux comme l'ion Na + ou l'ion Cl - .

D'une façon générale, la mobilité électrophorétique diminue en valeur absolue quand la concentration saline de la solution augmente.

S'il s'agit de macromolécules amphotères (c'est-à-dire portant des groupes acides et des groupes amines), comme les protéines, la mobilité varie avec le pH de la solution : nulle à un pH caractéristique de l'espèce moléculaire considérée, appelé « point isoélectrique » (pH i ), elle est négative – c'est-à-dire que la molécule migre vers l'électrode positive – lorsque le pH est supérieur au pH i , positive lorsque le pH est inférieur au pH i .

Applications

Les mesures de mobilité électrophorétique des particules en suspension servent principalement à des recherches fondamentales concernant la charge électrique des particules ; elles peuvent s'appliquer à la prévision de la stabilité des suspensions colloïdales.

La mobilité de particules de silice couvertes d'une couche d'adsorption d'une protéine donnée est pratiquement égale à celle de la molécule elle-même, placée dans les mêmes conditions de pH (Abramson).

Signalons aussi certains usages de l'électrophorèse en bactériologie. Des espèces bactériennes différentes peuvent ainsi être séparées si leurs mobilités électrophorétiques sont assez différentes.

L'électrophorèse des macromolécules en solution est employée souvent à des fins analytiques et sert à déceler dans une solution protéique (ou dans une solution de polyélectrolytes en général) l'existence de plusieurs espèces de mobilités différentes, à identifier ces espèces grâce à la valeur de leur mobilité dans un tampon de pH donné, à doser approximativement chacune d'elles. Dans les appareils destinés à l'électrophorèse préparative, on peut séparer en quantité notable une espèce protéique de plusieurs autres, par exemple en se plaçant à un pH intermédiaire entre le point isoélectrique de l'espèce à séparer et ceux des autres espèces : les molécules de l'espèce à séparer migrent alors en sens inverse des autres.

Dans une solution où l'on a créé un gradient de densité vertical à l'aide d'un soluté non-électrolyte (saccharose par exemple), une espèce macromoléculaire donnée, sous l'action d'un champ électrique approprié, s'immobilisera à un niveau où l'effet électrique sera compensé par un effet hydrostatique. On réalise ainsi des séparations d'espèces macromoléculaires par zones.

Jean GUASTALLA

III-Électrophorèse de zone sur support

Si l'électrophorèse dite « libre », en veine liquide, permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques, elle présente par contre certains inconvénients : non seulement elle nécessite un appareillage coûteux, une mise en œuvre longue et délicate, mais encore elle ne permet pas de distinguer, d'isoler, ni de caractériser les fractions protéiques autrement que par leur mobilité.

C'est pourquoi, à partir de 1950, on a proposé différents supports qui permettent d'effectuer une électrophorèse de zone sur un support « stabilisateur » qui peut être le papier-filtre (E. Durrum, D. Cremer et A. Tiselius, W. Grassmann et K. Hannig, tous en 1950), l'acétate de cellulose (J. Kohn en 1957), ou encore le gel d'agar (C. A. Grabar et P. Williams en 1953, R. J. Wieme en 1959).

Ces supports ont connu un immense succès, car leur emploi est simple, rapide, peu onéreux. En outre, il ne nécessite que de très petites quantités de substances. Ainsi, dans le cas d'un sérum sanguin, quelques microlitres suffisent.

Quel que soit le support, on utilise une « cuve à électrophorèse » essentiellement constituée de deux bacs contenant le tampon et une électrode. Anode et cathode sont reliées à un générateur de courant continu. Les extrémités du support solide trempent dans le tampon ou lui sont reliées par des ponts en papier filtre.

Cuve à électrophorèse Cuve à électrophorèse. Les petits tubes de verre renferment de la laine

Cuve à électrophorèse

Cuve à électrophorèse. Les petits tubes de verre renferment de la laine de verre ou du coton dont le rôle est, en arrêtant les gros ions, de freiner le changement de concentration du tampon dû à l'électrolyse.(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Électrophorèse sur papier et sur acétate de cellulose

On dépose quelques microlitres de la solution à étudier (mélanges d'enzymes, de protéines sériques ou d'autres substances chargées) sous forme d'une ligne mince sur le support imbibé de tampon. On le soumet ensuite à une électrophorèse ; l'intensité du courant est voisine de 2 mA par centimètre de largeur du support.

Au bout de quelques heures, la feuille est séchée. Les différentes fractions sont révélées par des colorants spécifiques, qui permettent de caractériser, par exemple, les protéines, les glycoprotéines, les lipoprotéines. Quant aux enzymes, on peut les révéler en utilisant leur activité spécifique sur des substrats convenablement choisis.

Le pouvoir de résolution de cette technique n'est pas supérieur à celui de l'électrophorèse en veine liquide. Par exemple, à partir du sérum, on obtient six fractions : albumine, α 1 , α 2 , β 1 , β 2 et γ-globulines.

L'interaction entre le support et les protéines n'est pas totalement négligeable, c'est là un inconvénient. Si elle est faible avec l'acétate de cellulose, elle est plus marquée avec le papier filtre. C'est pourquoi, dans les conditions normales, on ne peut déceler, avec ce support, dans le cas d'un sérum, les préalbumines, qui devraient migrer plus vite que l'albumine, mais qui sont freinées par leur adsorption par le papier. On y parvient cependant, par exemple, en augmentant la quantité de protéines déposée.

Électrophorèse en gel d'agar (gélose)

Le support est constitué à l'aide d'une solution de gélose (agar-agar) à 1 p. 100 dans le tampon choisi. On la coule à chaud sur une lame de verre où elle se solidifie par refroidissement. Le pouvoir de résolution est identique à celui du papier. Mais le gel d'agarose purifiée présente l'avantage de ne pas produire d'interaction avec les protéines.

Pour augmenter le nombre de fractions protéiques séparées par l'électrophorèse, on a proposé d'autres supports qui se comportent comme des tamis moléculaires. Il s'agit de gels poreux qui, par un phénomène de friction, retardent d'autant plus la migration des protéines que les dimensions de leurs molécules sont plus grandes. Ainsi le groupe des α 2 -globulines peut être résolu en une dizaine de constituants. On signalera les deux principaux procédés dans les paragraphes ci-dessous.

Électrophorèse en gel d'amidon

Elle a été proposée par Smithies en 1955. Elle utilise un amidon partiellement hydrolysé avec lequel on fait un gel contenant de 13 à 15 g d'amidon pour 100 ml de tampon. Le mélange, fluide à l'ébullition, est coulé dans un bac où il se prend en gel par refroidissement. On insère les protéines à séparer dans une fente pratiquée dans le gel. Après électrophorèse, on coupe le gel dans son épaisseur et on révèle les protéines par un des colorants habituels.

Avec un sérum humain, on peut obtenir près d'une vingtaine de bandes. L'opération complète demande au minimum quinze heures.

L'opération complète demande au minimum quinze heures. Électrophorèse en gel d'acrylamide Électrophorèse

Électrophorèse en gel d'acrylamide

Électrophorèse d'un sérum humain

Électrophorèse d'un sérum humain(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Elle a été décrite par S. Raymond et Weintraub en 1959, par B. J. Davis et L. Ornstein la même année. C'est une méthode très fine de séparation par simple électrophorèse sur support.

Une solution d'acrylamide, coulée dans de petits tubes verticaux, forme un gel par polymérisation. Les pores ont un diamètre de 5 nm environ. Les protéines à séparer sont déposées à une extrémité du gel dans lequel elles se déplacent sous l'action du champ électrique.

Après coloration, les protéines sont visibles sous forme de disques parallèles, superposés, d'où le nom de Disc-electrophoresis utilisé par les Anglo-Saxons.

Cette technique est rapide, précise, reproductible, sensible. Un sérum humain est résolu en au moins une vingtaine de fractions.

Le polyacrylamide ne donne aucune réaction avec les colorants, ni les protéines, ni les polysaccharides, ni les lipides. Le gel est transparent. Il permet une évaluation densitométrique plus aisée que celle obtenue lorsqu'on utilise le papier comme support.

Électrophorèses préparatives sur support

On a décrit plusieurs procédés qui permettent de séparer des groupes de protéines (albumine, α 1 , α 2 , β 1 ,

β 2 , γ-globulines) en vue de préparer ces fractions à partir, par exemple, d'un sérum. À cet effet, on utilise des portoirs de grandes dimensions dans lesquels on met une pâte d'amidon, ou de tout autre support neutre comme le Pévikon (chlorure de polyvinyle), ou même des gels (gélose, amidon, etc.). L'opération terminée, on découpe le support en tranches d'où l'on élue les protéines. Cette technique est évidemment utilisable pour préparer toute substance isolée par l'électrophorèse sur ce genre de support.

Électrophorèse à haute tension

L'emploi de tensions élevées – de l'ordre de 3 000 à 5 000 volts – permet de séparer, par électrophorèse à une ou deux dimensions perpendiculaires, des substances telles que peptides et acides aminés. On utilise une feuille de papier de 30 × 40 cm, placée entre deux plaques isolantes, refroidies à + 2 0 C pour éviter que la feuille ne se dessèche et, finalement, ne se consume. L'appareillage nécessaire est assez onéreux. Un dispositif plus simple consiste à immerger la feuille à électrophorèse dans de l'éther de pétrole, lui-même refroidi par un serpentin.

La haute tension permet de séparer en une heure un mélange de substances comme les peptides obtenus par hydrolyse enzymatique d'une protéine. La « carte » obtenue par deux électrophorèses perpendiculaires avec deux tampons différents (ou une chromatographie dans une direction suivie d'une électrophorèse dans l'autre) constitue un diagramme caractéristique comme l'est une empreinte digitale, d'où le terme finger-print donné par les Anglo-Saxons à cette technique.

Jean MORETTI

IV-Analyse immuno-électrophorétique

Les méthodes précédentes, même les plus efficaces, ne permettent pas toujours de séparer et d'identifier des protéines différentes lorsqu'elles ont la même mobilité électrophorétique ; en outre, des composants très peu abondants peuvent passer inaperçus.

Grabar et Williams ont apporté un perfectionnement remarquable aux méthodes de séparation et d'analyse des protéines en combinant l'électrophorèse et l'analyse immuno-chimique par diffusion.

Une fraction du mélange protéique étudié, servant de mélange antigénique, est injectée à un animal

(cheval, lapin, chèvre

chaque composant du mélange protéique correspond un anticorps qui réagit sur lui d'une façon étroitement spécifique. Dans des conditions convenables, la réaction in vitro entraîne la formation d'un précipité bien visible, dû à la formation d'un complexe antigène-anticorps.

),

qui réagit en fabriquant des anticorps qu'il déverse dans son sérum sanguin. À

Le mélange antigénique subit d'abord, dans un gel de gélose, une électrophorèse qui entraîne une séparation plus ou moins complète des constituants le long d'un axe Ox. On laisse ensuite ces constituants diffuser normalement à Ox contre le mélange d'anticorps qui provient d'un réservoir rectangulaire très allongé et parallèle à Ox. Lorsqu'un constituant antigénique rencontre son anticorps spécifique, il forme avec lui une ligne fine de précipité qui affecte le plus souvent la forme d'un arc elliptique dont la concavité est tournée vers Ox. À chaque protéine du mélange étudié correspond une ligne et une seule.

du mélange étudié correspond une ligne et une seule. Immuno-électrophorèse Diagramme immuno-électrophorétique

Immuno-électrophorèse

Diagramme immuno-électrophorétique (en gélose) du sérum sanguin d'un homme normal(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

La méthode utilise donc successivement le pouvoir de résolution de l'électrophorèse et la grande spécificité des réactions immunochimiques. Elle permet ainsi des analyses qualitatives extrêmement fines qui révèlent parfois l'existence de traces de constituants.

Lorsque s'est dessinée la figure de diffusion, on peut ajouter des colorants qui facilitent la caractérisation des diverses protéines formant les arcs de précipité.

Il est possible de dessécher la lame de gélose de façon à obtenir une pellicule transparente qui conserve indéfiniment les résultats de l'analyse sous forme d'un diagramme naturel.

Cette élégante méthode a permis, entre autres, d'identifier tous les constituants protéiques de nombreux sérums sanguins correspondant ou non à des états pathologiques.

Dans sa partie supérieure, la figure reproduit le diagramme immuno-électrophorétique, obtenu dans la gélose, du sérum sanguin d'un homme normal.

dans la gélose, du sérum sanguin d'un homme normal. Diagramme immuno-électrophorétique Immuno-électrophorèse

Diagramme immuno-électrophorétique

Immuno-électrophorèse : schéma de principe(2005 Encyclopædia Universalis France S.A.)

Parallèlement à ce diagramme, est figurée la bande d'électrophorèse en gel d'amidon du même sérum. Dans cette bande, la position relative des constituants antigéniques du sérum est sensiblement la même que celle qu'ils avaient dans la lame de gélose après électrophorèse, mais avant diffusion. Les lignes discontinues indiquent les correspondances et conduisent aux symboles des constituants responsables des arcs de précipité. De gauche à droite, on reconnaît aisément l'arc de la sérum-albumine (symbole Alb), les arcs des globulines α et β, l'arc très allongé des globulines γ. La figure permet d'apprécier à sa juste valeur le pouvoir de résolution de l'analyse immuno-électrophorétique.

Jean SALVINIEN

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