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Les spectres de

fluorescence frontale

Une

Science et technique
La thorie et la mthodologie de la spectroscopie de fluo-
rescence sont largement utilises dans les domaines de la
chimie et de la biochimie pour caractriser les proprits
structurales et catalytiques de molcules telles les pro-
empreinte
tines et les enzymes. Toutefois, jusqu rcemment, la
spectroscopie de fluorescence ntait pas ou peu mise en
uvre dans les domaines de ltude non invasive et non
destructive de la qualit et des proprits des produits ali-
digitale de
mentaires.
Suite lexcitation par la lumire, certaines molcules pr-
sentant des doubles liaisons conjugues absorbent des
la viande
photons de longueur donde donne. La molcule excite
revient son tat de repos en mettant des photons de lon-
gueur donde suprieure la longueur donde dexcita-
tion : cest le phnomne de fluorescence. La spectrosco-
pie de fluorescence est beaucoup plus sensible que les
autres techniques spectroscopiques telle la spectroscopie
infrarouge, (100 10 000 fois). De plus, les proprits de La spectroscopie de
fluorescence des fluorophores sont trs sensibles aux fluorescence frontale
modifications de leur environnement. Par exemple, la vita-
mine A incluse dans la matire grasse laitire prsente des
permet dobtenir un
spectres de fluorescence diffrents lorsque les triglyc- spectre trs
rides sont sous forme cristalline ou liquide (Dufour et al, caractristique pour
1998).
Depuis les travaux de Parker sur lhmoglobine en 1968 chaque type de
ceux de Dufour et collaborateurs sur le suivi de laffinage viande. Les
du fromage (Dufour et al, 2000), en passant par les tudes
de Swatland sur la viande dans les annes quatre-vingt
volutions
(Swatland 1987a, b, c), il a t montr que la spectrosco- techniques rendront
pie de fluorescence frontale ou de surface, autorisant des bientt la mthode
mesures en ligne, tait une technique de choix pour va-
luer la qualit des aliments. La spectroscopie de fluores- exploitable sur les
cence, de part sa rapidit et sa sensibilit, apparat comme lignes industrielles
une technique danalyse bien adapte au contrle qualit.
Lutilisation de micro-ordinateurs et doutils chimiom-
pour caractriser la
triques pour lanalyse des spectres permettra la spectro- qualit des viandes,
scopie de fluorescence de devenir un outil pour les dter- en particulier leur
minations qualitatives et quantitatives en industries agroa-
limentaires. tendret.
Aprs une revue bibliographique sur la spectroscopie de
fluorescence et ses applications, les premiers rsultats
obtenus par spectroscopie de fluorescence frontale sur dif-
frents muscles plusieurs temps de maturation sont rap-
ports dans cet article.

Correspondance : Pr . DUFOUR, UPRES TPA, ENITA-CF, site de Marmilhat, . DUFOURa, J.-P. FRENCIAb
63370 LEMPDES. Tl : 04 73 98 13 78. Fax : 04 73 98 13 90
Ml : dufour@gentiane.enitac.fr a
UPRES Typicit des Produits Alimentaires,
ENITA Clermont Ferrand, site de Marmilhat,
63370 Lempdes
b
ADIV, 2 rue Chappe,
63039 Clermont Ferrand cdex 2
Viandes Prod. Carns Vol 22 (1) 9
Janvier - Fvrier 2001
PROPRITS DES
MATRIEL ET MTHODES FLUOROPHORES
Le faux filet et le paleron, deux muscles prsentant des teneurs en collagne diffrentes,
INTRINSQUES DES
Science et ont t prlevs sur des carcasses de bovin 48 heures aprs abattage. La maturation a ALIMENTS
Technique t ralise sous vide 2 C, durant 16 jours. Les spectres de fluorescence ont t enre-
gistrs J + 2 (ressuage) et J + 16. Les prouvettes (L = 1 cm, l = 1 cm, e = 0,5 cm) sont La spectroscopie de fluorescence
dcoupes (perpendiculaire aux fibres) dans les chantillons de muscle et montes entre
deux lames de quartz. donne des informations sur la
prsence de fluorophores et sur
Spectroscopie de leur environnement dans les
fluorescence frontale chantillons (Marangoni, 1992).
Lprouvette est place sur le porte Ainsi les proprits de fluores-
chantillon pour les mesures en FIGURE 1 :
fluorescence frontale dun spectro- DES RSULTATS cence des acides amins aroma-
fluorimtre Fluoromax (Spex ENCOURAGEANTS SUR UN tiques des protines ou de sondes
Jobin Yvon ; Longjumeau)
MATRIEL DE LABORATOIRE extrinsques ajoutes au milieu
(Figure 1). ont t utilises pour caractriser
Les spectres dmission de fluores-
cence des tryptophanes des pro- la structure des protines et les
tines sont enregistrs, aprs exci- interactions protine/petites
tation 290 nm, entre 305 et 400 molcules hydrophobes. La trs
nm (pas = 0,5 nm). Pour le tissu
conjonctif, les spectres dmission grande majorit de ces exp-
ont t acquis, aprs excitation riences est ralise sur des solu-
317 nm, entre 425 et 580 nm (pas tions dilues dont labsorbance
de 1 nm). Les acquisitions ont t
ralises temprature ambiante.
est infrieure 0,1 : cest la fluo-
Pour lacquisition des spectres de rescence angle droit (Lakowicz,
chaque chantillon, 8 prouvettes 1983).
diffrentes ont t utilises. Au La spectroscopie de fluorescence
total, 32 spectres de fluorescence
des protines et 32 spectres de fluo- frontale a t dveloppe pour
Spectrofluorimtre Fluoromax
rescence du collagne ont t enre- permettre ltude des poudres et
gistrs. (Spex Jobin Yvon)
des milieux concentrs et tur-
Le codage des spectres des chan-
tillons tait comme suit : 1re lettre : C (spectre du collagne) ou P (spectre des pro-
bides (Figure 2) (Parker, 1968).
tines), 2e lettre : F (faux filet) ou P (paleron), 3e lettre : A (J + 2), B (J + 16), 4e lettre : Dans ce cas, la surface de lchan-
rptition (A F). tillon est illumine et donc exa-
mine. En dpit de lintrt que
Description des donnes par lAnalyse en Composantes Principales
Les donnes obtenues par spectroscopie de fluorescence frontale se prsentent sous
prsente cette technique pour la
forme de spectres constitus de plusieurs centaines de points de mesure. Lorsque lon caractrisation des produits ali-
enregistre une collection de spectres pour n chantillons, on peut organiser laide de mentaires en ltat, peu de tra-
ces donnes, un tableau n lignes et p colonnes, reprsentant respectivement les chan- vaux ont t publis dans ce
tillons et les variables. Avant toute analyse, les spectres sont norms, en rduisant les-
pace sous chaque spectre une valeur de 1 (Bertrand et Scotter, 1992). domaine comme la montr une
Les mthodes danalyses multidimensionnelles sont des mthodes statistiques dex- recherche bibliographique : nous
ploitation des donnes. Elles facilitent linterprtation et lutilisation des grands pouvons signaler ltude des pro-
tableaux de donnes qui contiennent un grand nombre de variables mesures pour un
grand nombre dindividus. Ces mthodes peuvent tre descriptives, mettant en vi-
tines du gluten de bl par Genot
dence les relations existant entre les variables et les chantillons comme lanalyse en et al (1992a, b). Ce manque din-
composantes principales (ACP), ou prdictives, permettant destimer une ou plusieurs trt pour lutilisation de cette
caractristiques dun chantillon partir dautres mesures effectues sur le mme
technique peut sexpliquer par la
chantillon, comme la rgression en composantes principales.
Lobjectif de lACP est de dcrire, sans aucune hypothse pralable sur les donnes, composition complexe des pro-
une collection de donnes par un nombre rduit de variables, en respectant aux mieux duits alimentaires ou par les
les distances observes pour lensemble des individus. Ces nouvelles variables, appeles faibles diffrences spectrales
composantes principales, sont des combinaisons linaires des variables dorigine.
Il est ensuite possible de reprsenter les individus sur des graphes, en slectionnant observes aprs un traitement
deux composantes principales et en affectant aux individus les coordonnes factorielles technologique qui rendent diffi-
correspondantes. ciles lanalyse et linterprtation
des donnes de fluorescence.
FIGURE 2 : De plus, il est gnralement
LA FLUORESCENCE ANGLE DROIT POUR OBSERVER admis que de nombreux facteurs
DIRECTEMENT LE PRODUIT perturbent les rsultats de fluo-
rescence. Lintensit de fluores-
cence enregistre sur un chan-
tillon varie fortement avec la tem-
prature : gnralement laug-
mentation de la temprature
conduit une diminution de lin-
tensit de fluorescence (Wold,
2000). La couleur de lchantillon
modifie aussi de faon importan-
te lintensit de f luorescence
mesure. Lmission des chan-
Schmas des principes de la fluorescence angle droit
tillons clairs est plus importante
et de la fluorescence frontale
que celle des chantillons foncs
qui rabsorbent fortement les

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Janvier - Fvrier 2001
Spectroscopies de fluorescence

Fluorescence angle droit Fluorescence frontale


ou de surface
Cuvette chantillon
(solution dilue) (moreau de viande)
Excitation Excitation

Emission Emission

Figure 1, Dufour et al
photons mis (Wold, 2000). essentiellement port sur les pro- fluorescence et de rflectance
Lauteur suggre aussi que linfor- prits de fluorescence du tissu ont permis de prdire avec une
mation contenue dans les conjonctif mesures directement certaine confiance le got et la
spectres de f luorescence est
essentiellement relie lintensi-
sur la viande et sur les relations
entre les spectres de fluorescen-
tendret de steaks (Swatland et
al., 1998). Enfin, Brondum et al
Science et
t du signal et peu lallure du ce et la qualit de la viande. En se (2000) ont prdit le pouvoir de
Technique
spectre, contrairement linfra- basant sur les proprits de fluo- rtention deau et la composition
rouge. Toutefois des travaux rescence des groupements pyridi- de la viande porcine, aux moyens
conduits sur le lait, les mulsions noline, une des principales mol- de donnes de fluorescence et de
et les fromages ont montr claire- cules assurant le pontage des spectroscopies dans le visible et
ment que lallure du spectre fibres de collagne et dlastine, le proche infrarouge.
contenait une information qui il a dvelopp une sonde com-
permettait de caractriser et prenant une fibre optique coaxia- Comme lindiquent les lignes ci-
didentifier ces produits (Dufour le en Y permettant de caractri- dessus, seule ou presque la fluo-
et al, 1998, 2000). Ainsi, lallure ser et de doser le tissu conjonctif. rescence du collagne et de
du spectre de fluorescence de la Swatland (1987a) a mis en vi- llastine a t tudie. Toutefois,
vitamine A contenue dans la dence que les spectres dmis- dautres f luorophores tels les
matire grasse laitire varie forte- sion des collagnes I et III sont tryptophanes des protines, les
ment lorsque les triglycrides diffrents, alors que collagne I co-facteurs NADH et FADH et les
passent de ltat solide ltat et lastine prsentent des nuclotides sont prsents dans la
liquide : la reprsentation des spectres similaires. Le collagne I viande. notre connaissance,
valeurs de F322nm/F295nm en prsente des maxima dexcitation aucun article ne rapporte les pro-
fonction de la temprature per- et dmission respectivement prits de fluorescence de ces
met de dterminer le point de 370 nm et 440 nm ainsi quun fluorophores intrinsques de la
fusion de la matire grasse paulement 510 nm. Les colla- viande. Alors que ces f luoro-
(Dufour et al, 1998). Dufour pr- gnes I et III sont discrimins phores ont t utiliss depuis
conise de normaliser les spectres essentiellement sur la base de longtemps pour ltude des tissus
avant tout traitement des don- leur intensit de f luorescence animaux (Udenfriend, 1969).
nes, afin de saffranchir des respective. Du fait des proprits
variations dintensit artfac- de f luorescence similaires de UN BON OUTIL POUR
tuelles. llastine et du collagne I qui DTERMINER LA TEXTURE
sont prsents dans les tendons et
Par ailleurs, lanalyse des collec- les aponvroses, il a t possible Dans le cadre dun programme
tions spectrales prsentant de de dvelopper une mthode de financ par Interbev et lOfival,
faibles diffrences ncessite lem- dosage du cartilage dans les lAdiv et lEnita-CF ont valu les
ploi des mthodes danalyse sta- viandes haches (Swatland, potentialits de la spectroscopie
tistique multidimensionnelle 1987b). Cet auteur rapporte un de f luorescence frontale pour
pour valuer les donnes ; coefficient de corrlation de 0,85 dterminer la tendret de la vian-
dmarche pratique avec succs pour le collagne, dtermin par de. Cette approche sur la viande
dans le domaine de la spectrosco- la mthode de rfrence et par la sest base sur des travaux ant-
pie infrarouge (Bertrand et fluorescence intrinsque de la rieurs raliss sur les fromages.
Scotter, 1992). Le fait dappliquer viande bovine. Lquipe de lEnita-CF a mis en
ces outils statistiques sur des col- vidence que les spectres de fluo-
lections de donnes renfermant Le gras intramusculaire peut aussi rescence des tryptophanes des
un grand nombre de variables tre quantifi par fluorescence protines et de la vitamine A de la
mesures pour un grand nombre (Wold, 2000). Dans ce cas, la matire grasse taient fortement
dchantillons permet de conclu- viande doit tre broye avant lac- corrls la texture des fromages
re sur la significativit des faibles quisition des donnes, afin de dis- (Herbert, 1999 ; Dufour et al,
diffrences spectrales observes. poser dchantillons homognes. 2001 ; Lebecque et al, 2001).
Le potentiel de la spectroscopie Selon Swatland, le principal fluo- Pour ce qui concerne ltude de
de fluorescence couple lana- rophore du tissu adipeux serait Lebecque et al (2001), les carac-
lyse en composantes principales constitu par les fibres de tristiques de texture des fro-
des spectres pour discriminer des conjonctif, formes essentielle- mages ont t values par analy-
chantillons de lait cru, chauff ment de collagne III, qui entou- se sensorielle, mesures rholo-
ou homognis a t montr par rent les cellules adipeuses. Il est giques et spectroscopie de fluo-
Dufour et Riaublanc (1997). aussi probable que les vitamines rescence. Lanalyse en compo-
liposolubles et des pigments fluo- santes principales et lanalyse
UNE MTHODE ADAPTE rescents contenus dans le tissu canonique des corrlations ont
LA VIANDE adipeux contribuent la fluores- t utilises pour analyser les
cence mesure aprs excitation donnes et valuer les relations
Dans le domaine des recherches 332 nm. entre les diffrents jeux de don-
sur la fluorescence de la viande, nes enregistrs sur les mmes
Howard Swatland est indniable- Certaines proprits technolo- chantillons de fromage. Toutes
ment le principal contributeur giques et sensorielles de la viande les mthodes danalyse utilises
(Swatland, 1987a, b, c, 1993, et des produits carns peuvent dans cette tude permettaient de
1997, 2000 ; Swatland et al, 1991, tre prdites partir des spectres discriminer les fromages : les
1996). Ses investigations ont de fluorescence. Des mesures de donnes enregistres consti-

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enregistrs directement sur des
FIGURE 3 : chantillons de viande en ltat
NORMER LES SPECTRES AVANT ANALYSE sont prsents respectivement
Science et figures 3 et 4. La figure 3 prsen-
te les spectres norms dmission
Technique des tryptophanes du faux filet et
du paleron enregistrs J + 2 et
J + 16. Ils sont caractriss par un
maximum localis au voisinage
de 332 nm qui est caractristique
des protines en gnral. Par
ailleurs, lallure des spectres dif-
fre lgrement dun chantillon
lautre. Mme si ces diffrences
peuvent apparatre peu impor-
tantes et non significatives, elles
sont du mme ordre de grandeur
que celles observes sur les
spectres de f luorescence des
tryptophanes des protines
Spectres dmission (excitation : 290 nm) de fluorescence des acquis sur les fromages. Les
tryptophanes des protines enregistrs sur du faux filet (PF) spectres dmission enregistrs
et du paleron (PP) aprs excitation 317 nm sont
caractriss par un maximum aux
environs de 465 nm (figure 4).
Les spectres du faux filet et du
FIGURE 4 : paleron aux deux temps de matu-
UN MAXIMUM 465 NM POUR LES SPECTRES ration prsentent de grandes dif-
DEXCITATION 317 NM frences. Toutefois, comme le
montrent les spectres CFBA et
CFBF enregistrs sur des prou-
vettes diffrentes de lchantillon
de faux filet J + 16, il y a une
trs mauvaise rptabilit des
spectres du tissu conjonctif (figu-
re 4). Cette mauvaise rptabilit
obtenue sur des chantillons de
viande en ltat a probablement
deux origines, dpendantes lune
de lautre :
- les caractristiques du rseau
de conjonctif ;
- la faible surface chantillonne
(7 mm x 0,5 mm) par le faisceau
lumineux du spectrof luori-
mtre.

Les spectres dmission (excitation : 317 nm) de fluorescence du tissu La faible surface illumine par la
conjonctif enregistrs sur du faux filet (CF) et du paleron (CP) lumire dexcitation ne permet
pas denregistrer un signal refl-
tant les caractristiques moyen-
nes de la trame conjonctive de
tuaient des empreintes digitales quisition des spectres de fluores-
lchantillon. Cette mauvaise
des fromages. De plus, des corr- cence des tryptophanes des pro-
rptabilit des spectres du tissu
lations fortes ont t mises en tines et du collagne et dautre
conjonctif est clairement mise en
vidence entre le domaine des part de faire des mesures sur 2 vidence sur la carte factorielle 1-
descripteurs sensoriels et les types de muscles, variant par le 2 trace partir des rsultats de
domaines des mesures instrumen- taux de collagne, plusieurs lACP ralise sur les spectres du
tales, suggrant que les phno- temps de maturation. tissu conjonctif (figure 5) : aucu-
mnes observs aux niveaux ne discrimination des chan-
molculaire et macroscopique DES RSULTATS tillons nest observe.
taient relis la texture des fro- ENCOURAGEANTS
mages. SUR LA VIANDE Des rsultats diffrents sont obte-
nus avec les spectres dmission
Les objectifs du prsent travail Les spectres dmission de fluo- de fluorescence des protines. La
taient dune part de dfinir les rescence des tryptophanes des figure 6 prsente la carte facto-
conditions opratoires pour lac- protines et du tissu conjonctif rielle trace partir des rsultats

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Figure 3, Dufour et al

1,12E-01
PPAA
PPDD
PFAA
PFDD
9,20E-02
Intensit de fluorescence (u.a.)

7,20E-02

5,20E-02

3,20E-02

1,20E-02
305 315 325 335 345 355 365 375 385 395
Longueur d'onde (nm)
Figure 4, Dufour et al

0,142
Intensit de fluorescence (u.a.)

CFAA
CFBA
CPAA
0,122
CPBA
CFBF

0,102

0,082

0,062

0,042

0,022
420 440 460 480 500 520 540 560 580
Longueur d'onde (nm)
collagne) et la dure de la
FIGURE 5 maturation. Ces rsultats encou-
UNE MAUVAISE RPTABILIT rageants viennent dtre repro-
DES SPECTRES DU TISSU CONJONCTIF duits lors dune exprimentation
portant sur 8 muscles diffrents
Science et
et 3 animaux.
Technique
UN AVENIR POSSIBLE EN SITE
INDUSTRIEL

Ces premiers rsultats obtenus


sur un spectrof luorimtre de
laboratoire sont encourageants et
laissent entrevoir la possibilit de
dvelopper un appareil de spec-
troscopie de fluorescence utili-
sable en site industriel ; cest--
dire autorisant des mesures
rapides directement sur les car-
casses. En effet, bien que les
structures des fromages et de la
Carte factorielle 1-2 de lanalyse en composantes principales ralise viande soient trs diffrentes,
sur la collection de spectres dmission du collagne. CFA (u), CFB lmission de fluorescence des
(n), CPA (s) et CPB (X) tryptophanes apparat comme
une sonde sensible permettant de
discriminer des muscles prsen-
tant des types de fibres et des
FIGURE 6 :
teneurs en collagne diffrentes
MAIS UNE BONNE DISCRIMINATION
plusieurs temps de maturation. Il
SUR LES SPECTRES DES TRYPTOPHANES
semble donc tout fait envisa-
geable que nous pourrons corr-
ler les spectres de fluorescence
des tryptophanes avec la texture,
et plus particulirement la ten-
dret de la viande, comme cela a
t fait pour les fromages. Les
rsultats obtenus rcemment
confirment cette hypothse : de
fortes corrlations ont t mises
en vidence entre les donnes
spectrales et les donnes senso-
rielles obtenues sur les mmes
chantillons (Frencia et Dufour,
en prparation).

En ltat actuel, la principale limi-


te de cette mthode rside dans
Carte factorielle 1-2 de lanalyse en composantes principales ralise le matriel. Lacquisition du
sur la collection de spectres dmission des tryptophanes des protines. spectre prend 2 minutes et nces-
PFA (u), PFB (n), PPA (s) et PPB (X) site le prlvement dun chan-
tillon de viande. Toutefois les
solutions techniques pour saf-
de lACP ralise sur la collection produit rsultant des proprits franchir de ces 2 contraintes exis-
de donnes. Pour un chantillon de fluorescence de lensemble tent. Nous travaillons actuelle-
donn, les spectres dmission des protines de la viande (myofi- ment au dveloppement dun
des tryptophanes prsentent une brilles, protines, sarcoplas- spectrofluorimtre quip dune
bonne rptabilit et permettent miques, collagne,) et de leurs fibre optique qui permet de
de discriminer le faux filet du volutions au cours de la matura- dporter la mesure et dune
paleron aux deux temps de matu- tion. camra CCD autorisant lacquisi-
ration. Comme cela avait t tion dun spectre en 1 seconde.
montr sur les fromages, le Les spectres de fluorescence des
spectre de fluorescence des tryp- tryptophanes des protines enre-
tophanes dun produit constitue gistrs sur un chantillon de vian-
une empreinte digitale qui per- de en ltat prsentent une bonne
met de le caractriser et de rptabilit et contiennent une
lidentifier. Les spectres consti- information relative au type de
tuent une empreinte digitale du muscle (type de fibres, taux de

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Figure 5, Dufour et al

100000

CFA
CFB

CP 2 (7,3 %)
80000
CPA
CPB

60000

40000

20000
CP 1 (89,5 %)

0
-400000 -300000 -200000 -100000 0 100000 200000 300000

-20000

-40000

-60000
Figure 6; Dufour et al

2,50E-03

CP 2 (15,5 %)
2,00E-03 PFA
PFB
PPA
1,50E-03
PPB

1,00E-03

5,00E-04
CP 1 (67,9 %)

0,00E+00
-5,00E-03 -4,00E-03 -3,00E-03 -2,00E-03 -1,00E-03 0,00E+00 1,00E-03 2,00E-03 3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03 6,00E-03

-5,00E-04

-1,00E-03

-1,50E-03

-2,00E-03

-2,50E-03
Science et
Technique

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Janvier - Fvrier 2001