5991-5411FR Agilent LC Theory French

Chromatographie liquide
haute performance
Principes de base :
Thorie
DVELOPPER
UNE SCIENCE TOUJOURS
MEILLEURE
AGILENT ET VOUS
des fins pdagogiques uniquement

8 janvier 2015
Agilent Technologies, Inc. 2016
1
Agilent Technologies sengage vis--vis
de la communaut ducative et souhaite
donner accs certaines informations
propritaires telles que fournies dans
cette prsentation.
La prsentation est fournie par Agilent Technologies. Son

utilisation est limite des fins pdagogiques uniquement. Les
prsents documents et informations sont accepts tels quels
sans aucune dclaration ni garantie que ce soit de la part
dAgilent Technologies qui dcline toute responsabilit drivant
de leur usage ou reproduction. Agilent Technologies ne sera pas
tenu responsable des dommages ventuels rsultant de ou en
rapport avec lutilisation, la reproduction ou la divulgation desdits
documents et informations. Vous consentez defendre et
indemniser Agilent Technologies en raison de votre utilisation ou
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8 janvier 2015
2
Introduction
La chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC (en

anglais), appele auparavant chromatographie en phase liquide haute
pression) est une technique de chimie analytique servant sparer,
identifier et quantifier les composants d'un mlange.
La HPLC s'appuie sur l'utilisation de pompes qui font circuler sous pression
un solvant liquide contenant l'chantillon travers une colonne remplie
d'un matriau solide adsorbant (galement appel phase stationnaire).
Chaque composant de l'chantillon interagit de manire lgrement
diffrente avec l'adsorbant. De ce fait le dbit varie selon les composants,
ce qui permet de les sparer leur sortie de la colonne.

8 janvier 2015
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Table des matires
Introduction quation de Van Deemter

Que se passe-t-il dans la colonne ? Diffusion turbulente
Paramtres cls Diffusion axiale
Temps de rtention et largeur de pic Rsistance au transfert de masse
Rsolution : sparation la ligne de base Plus d'infos sur l'quation Van Deemter
Rsolution : l'quation fondamentale Capacit de pics
Efficacit ou nombre de plateaux thoriques Analyse en gradient
Facteur de rtention Dfinition
Slectivit ou facteur de sparation Calcul de la capacit de pics
Largeur de pic
Comment jouer sur la slectivit ?
Exemple
Slectivit : exemple 1
Nombre de plateaux

8 janvier 2015
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Introduction
Que se passe-t-il dans la colonne ?
Temps t
Sparation tr2-tr1
Largeur de pic Wb1,2
Table des matires

8 janvier 2015
5
Introduction
tr2-tr1 tr2-tr1
Sparation correcte vs. Sparation moyenne
Wb1 Wb2 Wb1 Wb2
Sparation correcte vs. Sparation moyenne

Table des matires
8 janvier 2015
6
Introduction
t r 2 t r1
Rs
1 / 2 (Wb 2 Wb1 ) Temps t
La rsolution dcrit la capacit de la

colonne sparer les pics d'intrt.
Sparation tr2-tr1
La rsolution indique s'il y a eu Largeur de pic Wb1,2
sparation la ligne de base ou non.
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Temps de rtention et largeur de pic
h
tr2
tri Temps de rtention
du compos i
tr1 W1/2 Largeur de pic
mi-hauteur
Wbi Largeur du pic
la ligne de base
W 1/2
W b1 W b2
t
Table des matires

8 janvier 2015
8
Paramtres cls
Rsolution : sparation la ligne de base
h
La rsolution dcrit la capacit de la colonne
sparer les pics d'intrt. Rs = 1,5
La rsolution intgre l'efficacit (N), la
slectivit (a) et la rtention (k).
Une valeur minimum de 1 est ncessaire pour
permettre une sparation mesurable et une
quantification adquate.
Une valeur de 0,6 est ncessaire pour
distinguer une valle entre deux pics de hauteur
gale. t
Des valeurs gales ou suprieures 1,7 sont

souhaitables pour des mthodes robustes.
Une valeur de 1,6 est considre comme
permettant la sparation de la ligne de base et
garantit les rsultats quantitatifs les plus prcis.
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Rsolution : l'quation fondamentale de l'(U)HPLC
1 k
Rs 1 N
4 1 k
Efficacit Slectivit Rtention
La rsolution peut tre amliore en optimisant l'un de ces paramtres :

Le paramtre qui a la plus grande influence sur la rsolution est la
slectivit. De petites variations de la slectivit ont un gros impact
sur la rsolution.
L'influence de la rtention n'est significative qu' des valeurs k faibles.
L'efficacit dcrit le pouvoir de sparation de la colonne.
Table des matires
8 janvier 2015
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Paramtres cls
Rsolution : l'quation fondamentale de l'(U)HPLC
La slectivit a le plus fort impact sur la rsolution
changer de phase stationnaire
changer de phase mobile
Le plus facile est d'augmenter le nombre
de plateaux
Cette figure dmontre comme la rsolution est fonction de la

slectivit, de l'efficacit de la colonne ou de la rtention.
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Efficacit ou nombre de plateaux thoriques (N)
2 2
tr tr
N 16 N 5,54
Wb W1/ 2
L'efficacit de la colonne est utilise pour comparer la performance de
diffrentes colonnes. Elle s'exprime en nombre de plateaux thoriques, N.
Les colonnes ayant un nombre lev de plateaux sont plus efficaces.
Une colonne ayant un nombre N lev a un pic plus troit un temps
de rtention donn qu'une colonne ayant un nombre N infrieur.
Paramtres ayant un effet sur l'efficacit de la colonne :
Longueur de colonne (une colonne plus longue est plus efficace)
Granulomtrie (une baisse de la granulomtrie accrot l'efficacit)
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Facteur de rtention (k)
t r t0
k
t0
Le facteur de rtention mesure le temps qu'un composant de l'chantillon

passe dans la phase stationnaire par rapport au temps qu'il passe dans la
phase mobile. Il est calcul en divisant le temps de rtention par le temps
d'un pic non retenu (t0).
Paramtres ayant un effet sur le facteur de rtention :
Phase stationnaire
Phase mobile
Pente du gradient*
Volume rsident du systme*
Table des matires
*gradient d'lution uniquement

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Facteur de rtention (k) : gradients d'lution
tG F
k `
S Vm
L'quation montre l'influence du dbit (F), de la dure du gradient (tG),
de la plage de gradient () et du volume de la colonne (Vm) sur le facteur
de rtention.
Rappel : pour que le facteur de rtention reste constant, des modifications
apportes au dnominateur doivent tre compenses par des modifications
proportionnelles du numrateur, et inversement.
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Slectivit ou facteur de sparation ()
k2 Slectivit
k1 Facteur de rtention du 1er pic
k1 k2i Facteur de rtention du 2me pic
La slectivit correspond une mesure du temps ou de la distance entre

les maxima de deux pics. Si = 1, les deux pics ont le mme temps
de rtention et co-luent. Elle se dfinit comme le rapport entre facteurs
de capacit.
Paramtres ayant un effet sur le facteur de rtention :
Phase stationnaire
Phase mobile
Temprature
Table des matires

8 janvier 2015
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Paramtres cls
Effet de N, et k sur la rsolution
Table des matires

8 janvier 2015
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Comment jouer sur la sparation ?
Mme chantillon, dans des conditions de temprature, phase mobile
et gradient constantes, analys avec diffrentes phases stationnaires.
Table des matires

8 janvier 2015
17
Mme chantillon dans des conditions de temprature, phase stationnaire
et gradient constantes, analys diffrents pH.
Table des matires

8 janvier 2015
18
Mme chantillon analys avec la mme phase mobile, phase stationnaire
et le mme gradient, diffrentes tempratures.
acide salicylique
Table des matires

8 janvier 2015
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Qu'est-ce qu'un plateau en HPLC ?
Lc 1 Lc
Rs ~ 1 N Rs ~ 1 ~
4 4 H 4 h d
p
LC Longueur de colonne
dp Granulomtrie
h Hauteur rduite d'un plateau thorique
Un plateau thorique est un stade hypothtique pendant lequel les deux

phases d'une substance (phases liquide et vapeur) sont en quilibre.
Table des matires

8 janvier 2015
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Un nombre de plateaux (N) lev offre :

Des pics troits et pointus
Une meilleure dtection
Une capacit de pics pour sparer des chantillons complexes
Toutefois, l'augmentation de la rsolution est proportionnelle seulement
la racine carre du nombre de plateaux.
RS ~ N
L'augmentation du nombre de plateaux est limite par les conditions
exprimentales
Temps d'analyse, pression
Table des matires

8 janvier 2015
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Rapprochement des paramtres : largeur de pic et hauteur rduite
d'un plateau thorique
tr1 tr 2 Lc
Rs Rs ~ 1
1 / 2 ( Wb 2 Wb1 ) 4 h d
p
h f (w )
h f ( w eddy w ax w C )
h : hauteur rduite d'un plateau thorique
Table des matires

8 janvier 2015
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quation de Van Deemter
Diffusion turbulente
wturb ~ dp : Qualit du remplissage de colonne
Variation des trajectoires de diffusion due :
Trajectoires diffrentes Mauvais remplissage Distribution large de la

de la colonne taille des particules
Table des matires

8 janvier 2015
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Diffusion axiale ou longitudinale
Augmentation de la largeur de pic due l'auto-diffusion de l'analyte
un dbit faible, la dure de sjour de l'analyte dans la phase mobile
est longue
Augmentation forte de la largeur de pic
Hauteur accrue d'un plateau thorique
Dbit
Table des matires

8 janvier 2015
24
Rsistance au transfert de masse
wC ~ dp2
Trajectoires de diffusion diffrentes
Particule poreuse
Couche stationnaire de la phase mobile
Table des matires

8 janvier 2015
25
L'quation de Van Deemter tablit la relation entre les

variances par unit de longueur d'une colonne de sparation
et la vitesse linaire de la phase mobile en prenant en compte
les proprits physiques, cintiques et thermodynamiques
d'une sparation (Wikipdia).
h = f ( wturb + wax + wC ) Diffusion turbulente

Coefficient de diffusion
h = A + B/u + C u Rsistance au transfert de masse
Table des matires

8 janvier 2015
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h = A + B/u + C u
Hauteur rduite d'un plateau thorique (h)
Courbe cumulative : Van Deemter
Rsistance au transfert de masse
Diffusion turbulente
Diffusion axiale
Dbit
Table des matires

8 janvier 2015
27
Mesure avec des granulomtries diffrentes
De petites particules
permettent des plateaux
thoriques de hauteur
infrieure et donc une
meilleure efficacit de
sparation
5,0 m
Avec de petites
particules, l'effet de
l'augmentation du dbit
3,5 m
sur l'efficacit
de sparation est
moindre 1,8 m
Dpend du compos
et de l'instrument
Dbit optimal dpend
du compos
Table des matires

8 janvier 2015
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Capacit de pics
Analyses en gradient
La hauteur rduite d'un plateau thorique

h f (w 2 ) comme facteur de la largeur de pic
Analyse isocratique :
La largeur de pic dpend uniquement des processus de diffusion.
Analyse avec gradient :
La largeur de pic dpend des processus de diffusion et de la focalisation
du gradient la tte de la colonne.
Table des matires

8 janvier 2015
29
Capacit de pics
Dfinition
La capacit de pics correspond au nombre de pics (n) pouvant tre spars
dans un temps donn avec une rsolution donne.
La capacit de pics dpend de diffrents facteurs tels que la longueur
de colonne et la granulomtrie.
Capacit de pics : 32 pics en 2,5 min
Table des matires

8 janvier 2015
30
Capacit de pics
Calcul de la capacit de pics
wmoy Largeur de pic moyenne
tG tG
P 1 1 n Nombre de pics
1 n

w av tG Dure du gradient
w w Largeur de pic du pic slectionn
n 1
tG
Forme simplifie : P 1
w
Table des matires

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31
Capacit de pics
Largeur de pic
Largeur de pic mi-hauteur
temps
Largeur de pic 5 % de la hauteur
Largeur de pic 4,4 % de la hauteur (5)
Largeur de pic selon la mthode des tangentes

Table des matires
8 janvier 2015
32
Capacit de pics
Exemple
mAU
Colonne : 2,1 x 150 mm, 1,8 m
Contrepression : 402 bars
60
Capacit de pics : 313
40
20
10 20 30 40 50 min
mAU
Colonne : 2,1 x 300 mm*, 1,8 m
50 Contrepression : 598 bars
Capacit de pics : 406
40
30
20
10
20 40 60 80 100 min
Table des matires *colonne de 300 mm par assemblage de deux colonnes de 150 mm

8 janvier 2015
33
Informations complmentaires
Pour des informations complmentaires sur les produits Agilent, consulter
www.agilent.com ou www.agilent.com/chem/academia
Pour nous soumettre des questions ou remarques concernant cette prsentation :
contacter academia.team@agilent.com
Publication Titre N de Pub.
Brochure The LC Handbook 5990-7595EN
The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase
Note d'application 5990-8298EN
HPLC
Note d'application Increasing resolution using longer columns while maintaining analysis time 5991-0513EN
Study of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic
Poster
performance
Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using
Note d'application 5990-6933EN
gradient parameters
Note d'application Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC 5990-6932EN
Note d'application Increased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system 5990-6313EN
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personnel universitaire
Table des matires

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MERCI
Table des matires 5991-5411FR

8 janvier 2015
35
Abrviations
Abrviation Dfinition Abrviation Dfinition

Slectivit t Temps
dp Granulomtrie tr Temps de rtention
Plage de gradient t0 Temps mort de la colonne
F Dbit tG Dure du gradient
h Hauteur rduite d'un plateau thorique Vm Volume de la colonne
une mesure du pouvoir de rsolution w Largeur de pic
d'une colonne
W 1/2 Largeur de pic mi-hauteur
k Facteur de rtention (appel auparavant
k` - facteur de capacit) W bi Largeur du pic la ligne de base
wturb Diffusion turbulente
Lc Longueur de colonne
Qualit du remplissage de colonne wax Diffusion axiale ou longitudinale
N Efficacit ou nombre de plateaux wC Rsistance au transfert de masse

de la colonne wmoy Largeur de pic moyenne
P Capacit de pics
R Rsolution
Table des matires

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36

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Sparation correcte vs. Sparation moyenne

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Sparation correcte vs. Sparation moyenne

La rsolution dcrit la capacit de la

Table des matires

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Des valeurs gales ou suprieures 1,7 sont

Table des matires

Efficacit Slectivit Rtention

La rsolution peut tre amliore en optimisant l'un de ces paramtres :

Cette figure dmontre comme la rsolution est fonction de la

Table des matires

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Le facteur de rtention mesure le temps qu'un composant de l'chantillon

des fins pdagogiques uniquement

Table des matires

La slectivit correspond une mesure du temps ou de la distance entre

Table des matires

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Un plateau thorique est un stade hypothtique pendant lequel les deux

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Un nombre de plateaux (N) lev offre :

Table des matires

h : hauteur rduite d'un plateau thorique

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wturb ~ dp : Qualit du remplissage de colonne

Variation des trajectoires de diffusion due :

Trajectoires diffrentes Mauvais remplissage Distribution large de la

Table des matires

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L'quation de Van Deemter tablit la relation entre les

h = f ( wturb + wax + wC ) Diffusion turbulente

Table des matires

Courbe cumulative : Van Deemter

Rsistance au transfert de masse

Table des matires

Table des matires

La hauteur rduite d'un plateau thorique

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Capacit de pics : 32 pics en 2,5 min

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Largeur de pic mi-hauteur

Largeur de pic selon la mthode des tangentes

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Abrviation Dfinition Abrviation Dfinition