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Chromatographie liquide

haute performance
Principes de base :
Thorie

DVELOPPER
UNE SCIENCE TOUJOURS
MEILLEURE
AGILENT ET VOUS

des fins pdagogiques uniquement


8 janvier 2015
Agilent Technologies, Inc. 2016
1
Agilent Technologies sengage vis--vis
de la communaut ducative et souhaite
donner accs certaines informations
propritaires telles que fournies dans
cette prsentation.

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utilisation est limite des fins pdagogiques uniquement. Les
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Introduction

La chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC (en


anglais), appele auparavant chromatographie en phase liquide haute
pression) est une technique de chimie analytique servant sparer,
identifier et quantifier les composants d'un mlange.
La HPLC s'appuie sur l'utilisation de pompes qui font circuler sous pression
un solvant liquide contenant l'chantillon travers une colonne remplie
d'un matriau solide adsorbant (galement appel phase stationnaire).
Chaque composant de l'chantillon interagit de manire lgrement
diffrente avec l'adsorbant. De ce fait le dbit varie selon les composants,
ce qui permet de les sparer leur sortie de la colonne.

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Table des matires

Introduction quation de Van Deemter


Que se passe-t-il dans la colonne ? Diffusion turbulente
Paramtres cls Diffusion axiale
Temps de rtention et largeur de pic Rsistance au transfert de masse
Rsolution : sparation la ligne de base Plus d'infos sur l'quation Van Deemter
Rsolution : l'quation fondamentale Capacit de pics
Efficacit ou nombre de plateaux thoriques Analyse en gradient
Facteur de rtention Dfinition
Slectivit ou facteur de sparation Calcul de la capacit de pics
Largeur de pic
Comment jouer sur la slectivit ?
Exemple
Slectivit : exemple 1
Slectivit : exemple 2
Slectivit : exemple 3
Nombre de plateaux

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Introduction
Que se passe-t-il dans la colonne ?

Temps t

Sparation tr2-tr1
Largeur de pic Wb1,2

Table des matires


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Introduction
Que se passe-t-il dans la colonne ?
tr2-tr1 tr2-tr1

Sparation correcte vs. Sparation moyenne

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Sparation correcte vs. Sparation moyenne


Table des matires
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Introduction
Que se passe-t-il dans la colonne ?
t r 2 t r1
Rs
1 / 2 (Wb 2 Wb1 ) Temps t

La rsolution dcrit la capacit de la


colonne sparer les pics d'intrt.
Sparation tr2-tr1
La rsolution indique s'il y a eu Largeur de pic Wb1,2
sparation la ligne de base ou non.

Table des matires


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Paramtres cls
Temps de rtention et largeur de pic
h

tr2
tri Temps de rtention
du compos i
tr1 W1/2 Largeur de pic
mi-hauteur
Wbi Largeur du pic
la ligne de base

W 1/2

W b1 W b2
t

Table des matires


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Paramtres cls
Rsolution : sparation la ligne de base

h
La rsolution dcrit la capacit de la colonne
sparer les pics d'intrt. Rs = 1,5
La rsolution intgre l'efficacit (N), la
slectivit (a) et la rtention (k).
Une valeur minimum de 1 est ncessaire pour
permettre une sparation mesurable et une
quantification adquate.
Une valeur de 0,6 est ncessaire pour
distinguer une valle entre deux pics de hauteur
gale. t

Des valeurs gales ou suprieures 1,7 sont


souhaitables pour des mthodes robustes.
Une valeur de 1,6 est considre comme
permettant la sparation de la ligne de base et
garantit les rsultats quantitatifs les plus prcis.

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Paramtres cls
Rsolution : l'quation fondamentale de l'(U)HPLC

1 k
Rs 1 N
4 1 k

Efficacit Slectivit Rtention

La rsolution peut tre amliore en optimisant l'un de ces paramtres :


Le paramtre qui a la plus grande influence sur la rsolution est la
slectivit. De petites variations de la slectivit ont un gros impact
sur la rsolution.
L'influence de la rtention n'est significative qu' des valeurs k faibles.
L'efficacit dcrit le pouvoir de sparation de la colonne.
Table des matires
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Paramtres cls
Rsolution : l'quation fondamentale de l'(U)HPLC
La slectivit a le plus fort impact sur la rsolution
changer de phase stationnaire
changer de phase mobile
Le plus facile est d'augmenter le nombre
de plateaux

Cette figure dmontre comme la rsolution est fonction de la


slectivit, de l'efficacit de la colonne ou de la rtention.

Table des matires


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Paramtres cls
Efficacit ou nombre de plateaux thoriques (N)
2 2
tr tr
N 16 N 5,54
Wb W1/ 2
L'efficacit de la colonne est utilise pour comparer la performance de
diffrentes colonnes. Elle s'exprime en nombre de plateaux thoriques, N.
Les colonnes ayant un nombre lev de plateaux sont plus efficaces.
Une colonne ayant un nombre N lev a un pic plus troit un temps
de rtention donn qu'une colonne ayant un nombre N infrieur.
Paramtres ayant un effet sur l'efficacit de la colonne :
Longueur de colonne (une colonne plus longue est plus efficace)
Granulomtrie (une baisse de la granulomtrie accrot l'efficacit)

Table des matires


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Paramtres cls
Facteur de rtention (k)

t r t0
k
t0

Le facteur de rtention mesure le temps qu'un composant de l'chantillon


passe dans la phase stationnaire par rapport au temps qu'il passe dans la
phase mobile. Il est calcul en divisant le temps de rtention par le temps
d'un pic non retenu (t0).
Paramtres ayant un effet sur le facteur de rtention :
Phase stationnaire
Phase mobile
Pente du gradient*
Volume rsident du systme*
Table des matires
*gradient d'lution uniquement

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Paramtres cls
Facteur de rtention (k) : gradients d'lution

tG F
k `

S Vm
L'quation montre l'influence du dbit (F), de la dure du gradient (tG),
de la plage de gradient () et du volume de la colonne (Vm) sur le facteur
de rtention.
Rappel : pour que le facteur de rtention reste constant, des modifications
apportes au dnominateur doivent tre compenses par des modifications
proportionnelles du numrateur, et inversement.

Table des matires


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Paramtres cls
Slectivit ou facteur de sparation ()

k2 Slectivit
k1 Facteur de rtention du 1er pic
k1 k2i Facteur de rtention du 2me pic

La slectivit correspond une mesure du temps ou de la distance entre


les maxima de deux pics. Si = 1, les deux pics ont le mme temps
de rtention et co-luent. Elle se dfinit comme le rapport entre facteurs
de capacit.
Paramtres ayant un effet sur le facteur de rtention :
Phase stationnaire
Phase mobile
Temprature

Table des matires


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Paramtres cls
Effet de N, et k sur la rsolution

Table des matires


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Comment jouer sur la sparation ?
Mme chantillon, dans des conditions de temprature, phase mobile
et gradient constantes, analys avec diffrentes phases stationnaires.

Table des matires


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Comment jouer sur la sparation ?
Mme chantillon dans des conditions de temprature, phase stationnaire
et gradient constantes, analys diffrents pH.

Table des matires


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Comment jouer sur la sparation ?
Mme chantillon analys avec la mme phase mobile, phase stationnaire
et le mme gradient, diffrentes tempratures.

acide salicylique

Table des matires


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Comment jouer sur la sparation ?
Qu'est-ce qu'un plateau en HPLC ?

Lc 1 Lc
Rs ~ 1 N Rs ~ 1 ~
4 4 H 4 h d
p

LC Longueur de colonne
dp Granulomtrie
h Hauteur rduite d'un plateau thorique

Un plateau thorique est un stade hypothtique pendant lequel les deux


phases d'une substance (phases liquide et vapeur) sont en quilibre.

Table des matires


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Comment jouer sur la sparation ?

Un nombre de plateaux (N) lev offre :


Des pics troits et pointus
Une meilleure dtection
Une capacit de pics pour sparer des chantillons complexes
Toutefois, l'augmentation de la rsolution est proportionnelle seulement
la racine carre du nombre de plateaux.
RS ~ N
L'augmentation du nombre de plateaux est limite par les conditions
exprimentales
Temps d'analyse, pression

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Comment jouer sur la sparation ?
Rapprochement des paramtres : largeur de pic et hauteur rduite
d'un plateau thorique
tr1 tr 2 Lc
Rs Rs ~ 1
1 / 2 ( Wb 2 Wb1 ) 4 h d
p

h f (w )

h f ( w eddy w ax w C )

h : hauteur rduite d'un plateau thorique

Table des matires


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quation de Van Deemter
Diffusion turbulente

wturb ~ dp : Qualit du remplissage de colonne

Variation des trajectoires de diffusion due :

Trajectoires diffrentes Mauvais remplissage Distribution large de la


de la colonne taille des particules

Table des matires


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quation de Van Deemter
Diffusion axiale ou longitudinale
Augmentation de la largeur de pic due l'auto-diffusion de l'analyte
un dbit faible, la dure de sjour de l'analyte dans la phase mobile
est longue
Augmentation forte de la largeur de pic
Hauteur accrue d'un plateau thorique

Dbit

Table des matires


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quation de Van Deemter
Rsistance au transfert de masse

wC ~ dp2
Trajectoires de diffusion diffrentes

Particule poreuse
Couche stationnaire de la phase mobile

Table des matires


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quation de Van Deemter

L'quation de Van Deemter tablit la relation entre les


variances par unit de longueur d'une colonne de sparation
et la vitesse linaire de la phase mobile en prenant en compte
les proprits physiques, cintiques et thermodynamiques
d'une sparation (Wikipdia).

h = f ( wturb + wax + wC ) Diffusion turbulente


Coefficient de diffusion
h = A + B/u + C u Rsistance au transfert de masse

Table des matires


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quation de Van Deemter

h = A + B/u + C u
Hauteur rduite d'un plateau thorique (h)

Courbe cumulative : Van Deemter

Rsistance au transfert de masse

Diffusion turbulente

Diffusion axiale
Dbit

Table des matires


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quation de Van Deemter
Mesure avec des granulomtries diffrentes
De petites particules
permettent des plateaux
thoriques de hauteur
infrieure et donc une
meilleure efficacit de
sparation
5,0 m
Avec de petites
particules, l'effet de
l'augmentation du dbit
3,5 m
sur l'efficacit
de sparation est
moindre 1,8 m

Dpend du compos
et de l'instrument
Dbit optimal dpend
du compos

Table des matires


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Capacit de pics
Analyses en gradient

La hauteur rduite d'un plateau thorique


h f (w 2 ) comme facteur de la largeur de pic

Analyse isocratique :
La largeur de pic dpend uniquement des processus de diffusion.
Analyse avec gradient :
La largeur de pic dpend des processus de diffusion et de la focalisation
du gradient la tte de la colonne.

Table des matires


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Capacit de pics
Dfinition
La capacit de pics correspond au nombre de pics (n) pouvant tre spars
dans un temps donn avec une rsolution donne.
La capacit de pics dpend de diffrents facteurs tels que la longueur
de colonne et la granulomtrie.

Capacit de pics : 32 pics en 2,5 min

Table des matires


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Capacit de pics
Calcul de la capacit de pics
wmoy Largeur de pic moyenne
tG tG
P 1 1 n Nombre de pics
1 n

w av tG Dure du gradient
w w Largeur de pic du pic slectionn
n 1
tG
Forme simplifie : P 1
w

Table des matires


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Capacit de pics
Largeur de pic

Largeur de pic mi-hauteur

temps
Largeur de pic 5 % de la hauteur
Largeur de pic 4,4 % de la hauteur (5)

Largeur de pic selon la mthode des tangentes


Table des matires
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Capacit de pics
Exemple
mAU
Colonne : 2,1 x 150 mm, 1,8 m
Contrepression : 402 bars
60
Capacit de pics : 313

40

20

10 20 30 40 50 min
mAU
Colonne : 2,1 x 300 mm*, 1,8 m
50 Contrepression : 598 bars
Capacit de pics : 406
40
30
20
10

20 40 60 80 100 min
Table des matires *colonne de 300 mm par assemblage de deux colonnes de 150 mm

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Informations complmentaires
Pour des informations complmentaires sur les produits Agilent, consulter
www.agilent.com ou www.agilent.com/chem/academia
Pour nous soumettre des questions ou remarques concernant cette prsentation :
contacter academia.team@agilent.com
Publication Titre N de Pub.
Brochure The LC Handbook 5990-7595EN
The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase
Note d'application 5990-8298EN
HPLC
Note d'application Increasing resolution using longer columns while maintaining analysis time 5991-0513EN
Study of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic
Poster
performance
Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using
Note d'application 5990-6933EN
gradient parameters
Note d'application Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC 5990-6932EN

Note d'application Increased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system 5990-6313EN

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personnel universitaire

Table des matires


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MERCI

Table des matires 5991-5411FR

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Abrviations

Abrviation Dfinition Abrviation Dfinition


Slectivit t Temps
dp Granulomtrie tr Temps de rtention
Plage de gradient t0 Temps mort de la colonne
F Dbit tG Dure du gradient
h Hauteur rduite d'un plateau thorique Vm Volume de la colonne
une mesure du pouvoir de rsolution w Largeur de pic
d'une colonne
W 1/2 Largeur de pic mi-hauteur
k Facteur de rtention (appel auparavant
k` - facteur de capacit) W bi Largeur du pic la ligne de base
wturb Diffusion turbulente
Lc Longueur de colonne
Qualit du remplissage de colonne wax Diffusion axiale ou longitudinale

N Efficacit ou nombre de plateaux wC Rsistance au transfert de masse


de la colonne wmoy Largeur de pic moyenne
P Capacit de pics
R Rsolution

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