Capdeville Marion-Justine 2011

N° d’ordre : 4303
THÈSE
PRESENTÉE A
L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
Par Marion-Justine CAPDEVILLE
POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : Chimie analytique et environnement
ÉTUDES DES CYCLES BIOGÉOCHIMIQUES DES

CONTAMINANTS ORGANIQUES DITS « ÉMERGENTS »
DANS LES SYSTÈMES AQUATIQUES
Thèse dirigée par Dr Hélène BUDZINSKI

EPOC-LPTC, UMR 5805 CNRS
Soutenue le 15 septembre 2011
Après avis de :
Mme GOMEZ, Éléna Maître de conférence, université Montpellier I Rapporteur
Mr LEVI, Yves Professeur, Université Paris-Sud 11, Rapporteur
Devant la commission d’examen formée de :

Mme GOMEZ, Éléna Maître de conférence, université Montpellier I Rapporteur
Mr LEVI, Yves Professeur, Université Paris-Sud 11, Rapporteur
Mr SCHMITTER, Jean-Marie Professeur, Université de Bordeaux 1, Examinateur
Mme HERNANDEZ-RAQUET, Guillermina Chargée de recherche INRA, Examinateur
Mme BUDZINSKI, Hélène Directeur de recherche CNRS, Directeur de thèse
UMR EPOC – LPTC Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux – Laboratoire de

Physico- et Toxico-Chimie de l’environnement
Remerciements
REMERCIEMENTS
Bien que sur la couverture apparaisse le nom d’une seule personne, une thèse est en réalité le
résultat de l’investissement de plusieurs personnes que je voudrais ici remercier.
MERCI aux membres du jury, Mme Elena Gomez et Mr Yves Lévi, Mme Guillermina Hernandez-Raquet
et Mr Jean-Marie Schmitter, pour avoir accepté de juger ce travail. Merci pour votre patience
vis-à-vis de la date de soutenance qui a été reportée à plusieurs reprises. Merci pour avoir lu et
corrigé le « pavé ». Et enfin, merci pour vos remarques et commentaires et pour l’échange
constructif que nous avons eu lors de ma soutenance.
MERCI Hélène, point de départ de cette aventure. Ce n’était pas gagné au début, pas tellement plus à la
fin, mais j’ai énormément appris entre les 2, tant sur le plan professionnel que relationnel. Merci
de m’avoir accepté dans votre équipe et de m’avoir fait confiance (et souvent plus confiance que
ce que je me faisais à moi-même). Merci de m’avoir fait découvrir le monde de la chimie
analytique depuis « le comptage de tout ce qu’il y a par 5 dans la pièce 205 pour tenter
d’identifier les 5 GC/MS » jusqu’à « être la première utilisatrice du RRLC/MS/MS en tandem
avec Patrick ». Merci pour tous les moyens que vous avez mis à ma disposition pour réaliser ce
travail (je me souviens encore des 1380 € HT pour les 100 mg d’amox-13C et de la crise de l’ACN).
D’une certaine façon, merci pour l’expérience AERES. Comme vous dites « la communication est
un art difficile ». Puisque les voyages forment la jeunesse, Merci pour toutes les opportunités de
formation que vous m’avez offertes en France (Pau, Narbonne, Paris, Rennes, Toulouse,
Montpellier, Metz, Cannes) et à l’étranger (Varsovie, Göteborg, Paphos). Merci pour les « soirs
discussion-champagne » et pour les moments de convivialité à base d’huitres et de petits-fours.
Mais surtout, un grand MERCI pour nos longues conversations dans le hall du Palais de la Culture
et de la Science à Varsovie, dans l’aéroport d’Amsterdam, dans la salle de conférence de l’hôtel à
Paphos, dans la gare de Toulouse ou plus simplement dans votre bureau jusqu’à pas d’heure.
MERCI aux membres du LPTC, et plus particulièrement à ceux de l’équipe C.ORG (nouvellement nommée
AQUA), pour leur contribution active et quotidienne à la réussite de ces travaux.
Merci Patrick P. pour notre duo LC/MS/MS. Depuis nos débuts sur l’UPLC et la fameuse croix qu’il
fallait cocher pour prendre en compte les paramètres du spectro jusqu’à notre tandem de choc
sur le RRLC, en passant par tes cours de théorie sur la chromato liquide, l’attente du téléphone
en E215 et les expériences en LC/UV, c’était des bons moments. Je garderai aussi en mémoire le
souvenir de notre toute première injection sur le RRLC ; le premier soir de sa mise en service,
quand on est resté jusqu’à plus de 22h pour arriver à lancer la séquence et finalement n’obtenir
qu’une seule analyse de blanc qui a durée toute la nuit.
Merci Karyn de m’avoir formé à la GC/MS et à l’ASE. Merci pour la transmission de ton sens de
l’organisation et du travail bien fait. Et je n’oublierai pas que tu as fait demi-tour un soir, une fois
partie du labo, et que tu es revenue exprès pour moi à 21h30 pour m’aider sur l’ASE « parce qu’il
ne veut pas marcher si t’es pas à coté de lui ».
Merci Sylvie A. de m’avoir formé à la LC/MS et pour veiller à la santé de mes yeux en allumant la
lumière dans le bureau à la tombée de la nuit.
Merci Laurent P. pour mes premiers pas en HPLC à l’époque de mon stage de M2 et les réparations de
fuites le soir au moment où tu t’apprêtais à partir.
Merci Marie-Hélène pour notre tentative Speedvac et tes petits signes de tête le jour de la
soutenance.
Merci Marie-Ange, Jérôme et Patrick M. pour votre sympathie et votre bienveillance.
Remerciements
Merci Nathalie T. pour ton aide sur les capteurs passifs, pour les « codes secrets » de l’ASE et pour
avoir fait le chauffeur soit en m’amenant au labo quand j’avais mon torticolis soit en me ramenant
chez moi le soir quand il était trop tard et que je n’avais plus de bus. Merci pour nos discussions
sur mon avenir et mon orientation professionnelle que ce soit à la fin de mon M2 ou au cours de la
thèse.
Merci aux nombreux thésards que j’ai côtoyé pendant ces 5 ans et demi pour leur coup de pouce pour
décrypter la science ou les comportements humains : Anne T., Kévin C., Marie (t’avais raison,
j’avais pas besoin d’elle), Sophie (ma première SPE et mon premier dépouillement de chromato, je
n’oublierai pas que c’est toi qui me les a montrés), Killian, Caroline R., Anne-Laure (j’aurai mis un
an et demi de plus, mais ça y est, j’ai fini. Et au passage, merci pour ma soirée d’anniv à Varsovie),
Ludovic, Ninette (merci pour les corrections de mes textes en anglais, je garderai en mémoire
notre virée à Ax-les-Thermes et notre aprèm photos à la plage), Angel (heureusement que t’étais
là pour les manip capteurs passifs parce que les calculs de débit, de flux et la gestion au
quotidien c’était pas mon point fort), Iris (et cette histoire de décapsuleur australien), Caroline
GP (très agréable comme colloque de bureau), Nicolas Cr. (toujours présent pour les pots, merci
d’avoir fait le déplacement pour ma soutenance), Yann, Hoï, Perrine et Matthieu.
Merci Thomas G. pour avoir fait, ou refait, toutes les manips DIPERPHA et surtout pour les Petits
Ecoliers au chocolat noir.
Merci à tous les collègues de passages (techniciens ou ingénieurs contractuels, thésards étrangers
ou en collaboration, post-doc et stagiaires) qui par leur gestes de sympathie ou leur bonne
humeur ont permis d’alléger certaines journées : Sylvain F. (1er coloc de bureau), Sylvain C., Sylvie
R., Damien (merci de m’avoir tenue compagnie pendant les pesées de filtres), Jonathan (merci de
m’avoir prêté ton ordi et ton bureau quand j’étais SBF à la fin), Céciline (merci pour les conseils
sur les compléments alimentaires), Imilia, Pierre VD (merci pour ton mail d’encouragement à
quelques jours de la soutenance), Nicholas (merci pour tes bons plans sortie et notamment les
infos sur les portes ouvertes des châteaux viticoles), Vincent (et l’épisode du mur des
lamentations), Justyna, Janos, Elisa, Luminita, Hugues (mille mercis pour ton délicieux fondant au
chocolat), Anaïk, Guillaume Bol., Magalie (merci pour la plaquette de Merveille du monde), Raphaël
(et le cours de Pottok, encore désolée pour ton pouce), Anne P. (merci pour ton aide sur FLASH),
Nathalie B. et Nicolas Ch. (ou le chrono de l’introduction pour l’oral de soutenance).
Merci à Kévin F., Guillaume Bou., Emmanuelle et Simon qui m’ont apporté autant en compréhension
des relations humaines et des problèmes de communication qu’en résultats. Merci Emmanuelle
pour les coups de fil, promis maintenant j’ai plus peur de téléphoner aux inconnus.
Merci Nora et Maylis S. pour vos petites aides logistiques au quotidien depuis le bordereau DHL et
les impressions couleurs jusqu’à la traduction d’une publi.
Merci Virginie et Hélène J. pour la gestion des missions et des remboursements.
Merci Nadia pour veiller à la propreté de notre univers de travail.
Enfin, une pensée pour toutes les autres personnes que j’ai pu côtoyer au cours de ces années et qui
d’une façon ou d’une autre ont apporté une petite pierre à cet édifice: Nathalie G., Edith, Cédric,
Eric, Pierre-Marie, Blandine et Christelle.
MERCI aux collaborateurs extérieures au LPTC pour leur contribution : Guillermina Hernandez-Raquet,
Fabienne Petit, Fabrice Béline, Marie-Laure Pype, Jean-Charles Motte, R. Rajagopal, Patrick
Balaguère, Christian Mougin et les membres du projet AMPERES.
Merci Patrick Dabert pour avoir fait le sale (dans tous les sens du terme) boulot de DIPERPHA : les
prélèvements et surtout les longues heures de filtration.
Merci Kenny Oberlé pour la gestion et la réalisation des prélèvements pour FLASH.
Merci Lodovico Di Gioia, Liza Viglino et Jean-Luc Guinamant pour vos relectures.
Merci à l’IMS Health pour m’avoir gracieusement fourni des données de ventes de médicaments.
Merci au Dr Viel-Mazurier pour m’avoir donné son dictionnaire VIDAL.
Remerciements
MERCI à tout ceux qui, un jour ou l’autre, ont eu une attention ou un mot sympa à mon égard et qui
m’ont particulièrement touché ce jour-là :
Merci Fabrice pour les sauvetages informatiques, de la récupération de données à celle de l’ordi.
Merci Thierry pour les petits « oooo » et le petit signe de main qui va avec, parce que certains jours
ça m’a vraiment fait du bien au moral.
Merci Laurent Servant pour votre soutien administratif et moral au cours des derniers mois.
Merci aux dames qui font le service au Haut-Carré pour m’avoir mis de coté des assiettes de
carottes ou d’haricot verts … sans ail.
Et parce que la thèse c’est aussi l’occasion de rencontrer des personnes géniales et de créer des
amitiés fortes : mille MERCIS à Alexia, Frédéric, Mathieu, Coralie, Amélie, Chloé et Sarah.
MERCI Alex d’avoir été une coloc de bureau exceptionnelle en dépit de nos moultes déménagements,
j’aurai pas rêvé mieux. Du partage des madeleines, biscuits et chocolats au partage des
problèmes en tout genre et solutions, rien à redire. Merci pour ton écoute, ton réconfort et ta
zenatitude. Merci pour le chimiste-sitting dans mes grands jours de manip. Et enfin, merci aussi
pour les déjeuners indiens et les séances de badminton-défoulement du jeudi.
MERCI Fred pour ta bienveillance et tes attentions à mon égard, depuis le rangement-nettoyage
d’une paillasse un jour où les solvants m’étaient montés à la tête jusqu’à la livraison de sushis,
makis et brochettes pour « ma nuit de l’évaporation ». Merci pour nos débats et en particulier
celui sur « l’obligation de vote ». Merci de m’avoir laissé gagner notre p’tite compétition mais
saches que tu avais pourtant toutes tes chances.
MERCI Mathieu pour tes conseils prévenants au début et tes encouragements à la fin. Tu m’avais bien
dit comment se passait la 1ère, la 2ème et la 3ème année de thèse mais tu avais oublié de m’expliquer
comment se passait une 4ème et une 5ème année et j’avoue que j’ai été un peu perdue.
MERCI Coralie pour ton écoute, tes conseils et ton soutien depuis notre période de stage jusqu’à
notre fin de thèse. Merci aussi pour ta disponibilité et tes sourires. Et tu verras, finalement
c’est faisable, faut juste être patiente et persévérante.
MERCI Amélie pour ton écoute, ton soutien et ta disponibilité à toi aussi. Merci aussi pour ton
optimisme et ton boostage pour les candidatures. Bon, on n’aura toujours pas eu notre canapé car
les paliers entre 2 étages ne sont pas super confortables, mais maintenant on n’en a plus
tellement besoin, et c’est ça qui compte.
MERCI Chloé pour tes conseils avisés, en particulier depuis l’autre coté de l’Atlantique pour la gestion
de la soutenance. Bien qu’on ait commencé en même temps et avec les mêmes problèmes,
notamment une certaine histoire de carbamazépine, ça tombait bien que tu aies fini avant moi
comme ça, tu as pu m’expliquer les (dé)marches à suivre.
MERCI Sarah pour le partage, le soutien et les encouragements vis-à-vis de nos expériences
professionnelles et personnelles. Je n’aurais jamais cru en débutant DIPERPHA qu’on aurait eu
autant de points communs.
Enfin un IMMENSE MERCI à ma famille et mes amis qui m’ont supporté (dans tous les sens du terme).
Si j’avais un mot plus fort que merci je l’utiliserai ici.
MERCI papa, maman, Clément et LH, si je devais détailler ici tout ce que vous avez fait pour moi, je
pense que cette thèse serait en 2 tomes.
MERCI Véro (et les bourriches du dimanche soir), grand-mère, bonne-maman, Delphine et tout le
reste de la famille.
MERCI morena (pour tes mails quotidiens), cocotte (pour tes textos d’encouragement et de soutien),
bichette (pour nos coups de fil ou de skype de minimum 64 minutes et 18 secondes), Julie (d’être
venue me chercher aux quinconces la veille de ton concours parce que je n’avais plus de bus),
Thomas H. (et nos p’tits verres à la Victoire), Ulrika, Maud, Laetitia, Marine, Maylis W.,
Angélique et toutes les copines du cheval (heureusement qu’il y avait nos repas du mardi soir pour
Remerciements
décompresser), Gaëlle (merci de me confier Hamac), Célia (promis je ne ferai pas caissière à
Leclerc), Camille (et les textos du mercredi), ma jumelle et Christophe (t’as bien fait de me
dire de l’accepter cette thèse).
En conclusion, je souhaite rapporter ici une petite fable que j’ai trouvée sur internet. Je trouve
que cette fable correspond bien à certaines périodes de « mon expérience thèse » et c’est
pourquoi j’ai choisi de l’ajouter à cette partie Remerciements.
One day a farmer's donkey fell down into a well. The animal cried piteously for hours as the farmer tried to
figure out what to do. Finally, he decided the animal was old, and the well needed to be covered up anyway;
it just wasn't worth it to retrieve the donkey. He invited all his neighbors to come over and help him. They
all grabbed a shovel and began to shovel dirt into the well. At first, the donkey realized what was happening
and cried horribly. Then, to everyone's amazement he quieted down. A few shovel loads later, the farmer
finally looked down the well. He was astonished at what he saw. With each shovel of dirt that hit his back,
the donkey was doing something amazing. He would shake it off and take a step up. As the farmer's
neighbors continued to shovel dirt on top of the animal, he would shake it off and take a step up. Pretty
soon, everyone was amazed as the donkey stepped up over the edge of the well and happily trotted off!
MORAL:
Life is going to shovel dirt on you, all kinds of dirt. The trick to getting out of the well is to shake it off
and take a step up. Each of our troubles is a steppingstone. You can get out of the deepest wells just by
not stopping, never giving up!
C’est pourquoi je tiens très sincèrement à dire MERCI à tous ceux qui ont contribué à
l’aboutissement de ces travaux que ce soit par un soutien moral, technique, scientifique,
financier, amical ou familial ; mais que finalement, je remercie aussi tous ceux qui ont semé des
obstacles sur ce parcours car de les avoir franchis, m’a permis de grandir et de réellement
savourer la journée du 15 septembre 2011.
Publications et communications
 Liste des publications :
§ Capdeville M.J., Budzinski H., 2011, Trace-level analysis of organic contaminants in

drinking waters and groundwaters. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 30, 4, 586-606.
§ Combalbert S., Capdeville M.J., Pourcher A.M., Budzinski H., Dabert P., Bernet N.,
Hernandez-Raquet G., 2010, Impact des systèmes de traitement du lisier dans le transfert
des perturbateurs endocriniens et des antibiotiques vers l’environnement naturel. 42èmes
Journées de la Recherche Porcine, Paris, France, 2-3 février 2010 (proceedings).
§ Capdeville M.J., Pardon P., Coquery M., Martin S., Choubert J.M., Budzinski H.,
Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers,
antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid
chromatography tandem mass spectrometry analysis – application to sewage treatment
plant effluents (à soumettre dans Journal of Chromatography A).
§ Capdeville M.J., Oberle K., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H., Multi-residue
simultaneous analysis of 78 pharmaceutical compounds in aqueous samples:
development and application (à soumettre dans Analytical Bioanalytical Chemistry).
§ Capdeville M.J., Buytaert S., Belles A., Budzinski H., Calibration and application of
passive sampler for determination of 22 pharmaceuticals in river (à soumettre dans
Analytica Chimica Acta)
§ Oberlé K., Capdeville M.J., Berthe T., Budzinski H., Petit F., Evidence for a complex
relationship between antibiotics and antibiotic-resistant Escherichia coli along a “hospital
complex – Waste Water Treatment Plant – river” continuum (à soumettre dans
Environmental Science & Technology)
 Liste des communications orales :
§ Capdeville M.J., Oberle K., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H.
Analysis of Pharmaceuticals: analytical development and study of hospital sewages,
wastewater treatment plants and impacted surface waters,
2nd seminar of PhD students Water & Health, Cannes, France, 29 juin - 1er juillet 2010.
§ Hernandez-Raquet G., Beline F., Combalbert S., Capdeville M.J., Rajinikanth R., Bellet
V., Pourcher A.M., Budzinski H., Bernet N., Dabert P., Balaguer P.
Développement d’un procédé intégré pour la valorisation du lisier porcin et la réduction
des risques des pollutions associées : production du biogaz, traitement de l’azote et
élimination des polluants émergents, antibiotiques et hormones stéroïdes,
Salon des équipements, des technologies et des services de l’environnement Pollutec,
Lyon, France, 30 novembre -3 décembre 2010.
§ Combalbert S., Capdeville M.J., Pourcher A.M., Budzinski H., Dabert P., Bernet N.,
Hernandez-Raquet G.
Impact des systèmes de traitement du lisier dans le transfert des perturbateurs
endocriniens et des antibiotiques vers l’environnement naturel,
42èmes Journées de la Recherche Porcine, Paris, France, 2-3 février 2010.
§ Capdeville M.J., Budzinski H., Pardon P., Hernandez-Raquet G.

Développement d’une méthode d’analyse multi-classe pour le dosage de composés
pharmaceutiques dans l’eau,
Séminaire Agilent LC/MS, Paris Massy, France, 28 mai 2009.
§ Budzinski H., Soulier C., Lardy S., Capdeville M.J., Tapie N., Vrana B., Miege C., Ait
Aissa S.
Passive samplers for chemical substance monitoring and associated toxicity
asssessement in water,
XENOWAC, Paphos, Cyprus, 11-13 mars 2009.
§ Capdeville M.J., Budzinski H., Pardon P., Hernandez-Raquet G.

Development of a method for a multi-class analysis of pharmaceuticals in water,
XENOWAC, Paphos, Cyprus, 11-13 mars 2009.
 Liste des communications par affiche (posters) :
§ Capdeville M.J., Oberle K., Piram A., Pardon P., Soulier C., Petit F., Budzinski H.
Développement et application d’une méthode d’extraction sur phase solide (SPE) et
d’analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem (RRLC/MS/MS) pour le dosage de 78 substances pharmaceutiques mutli-
classes dans l’eau,
Journées Information Eaux, Poitiers, France, 28-30 septembre 2010.
§ Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H.

Methodology development (ASE,SPE, LC/MS/MS) and application for the analysis of
antibiotics in liquid and solid pig manure,
20th SETAC Europe, Seville, Spain, 23-27 may 2010.
§ Capdeville M.J., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H.

Solid Phase Extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
development and application for the screening of 78 pharmaceuticals in water,
10th EMEC, Limoges, France, 2-5 décembre 2009.

Développement et application d’une méthode couplant une étape d’extraction en phase
solide (SPE) et d’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse en tandem pour le dosage de 52 antibiotiques dans des lisiers porcins,
SMAP, 26ème Journée Française de Spectrométrie de Masse, Dijon, France, 14-17
septembre 2009.

Solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
development for the analysis of pharmaceuticals,
ISTA 14, Metz, France, 30 aout – 4 septembre 2009.

Solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
development for the analysis of antibiotics in manure,
ISTA 14, Metz, France, 30 aout – 4 septembre 2009.

development for the analysis of pharmaceuticals,
19th SETAC Europe, Göteborg, Sweden, 31 mai – 4 juin 2009.

Solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
development for the analysis of antibiotics in manure,
19th SETAC Europe, Göteborg, Sweden, 31 mai – 4 juin 2009.

Développement d’une méthode d’extraction en phase solide (SPE) et d’analyse par
chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem
(RRLC/MS/MS) pour le dosage de substances pharmaceutiques multi-classes dans

diverses matrices environnementales,
25ème Journées Françaises se Spectrométrie de Masse, Grenoble, France, 8-11
septembre 2008.

development for the analysis of multi-classes pharmaceuticals,
18th SETAC Europe, Warsaw, Poland, 25-29 mai 2008.

Développement d’une méthode d’extraction par SPE et d’analyse par chromatographie
en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (RRLC/MS/MS) pour
le dosage de substances pharmaceutiques dans des matrices environnementales
complexes,
Journée de l’École Doctorale Sciences Chimiques, bordeaux, France, 3 avril 2008.
§ Capdeville M.J., Pardon P., Augagneur S., Budzinski H.

Développement d’une méthode couplant UPLC et spectrométrie de masse en tandem
pour le dosage d’antibiotiques présents à l’état de traces dans les systèmes aquatiques,
SMAP, 24ème Journée Française de Spectrométrie de Masse, Pau, France, septembre
2007.
 Distinctions :
§ Prix des techniques innovantes pour l’environnement (catégorie déchets). Pollutec

ADEME 2010 pour les travaux concernant le : « Développement d’un procédé intégré
pour la valorisation du lisier porcin et la réduction des risques des pollutions associées :
production du biogaz, traitement de l’azote et élimination des polluants émergents,
antibiotiques et hormones stéroïdes ».
Les Prix des Techniques Innovantes pour l'Environnement récompensent les
laboratoires de recherche publique ayant proposé de présenter au salon Pollutec
2010 des travaux de recherche pouvant faire l'objet d'application ou de
développement industriel à court ou moyen terme. Ces prix sont organisés par Pollutec
et l'ADEME en partenariat avec InfoChimie Magazine, Hydroplus, Environnement
Magazine Hebdo, Environnement et Technique, Green News Techno, Mesures et avec le
soutien du Ministère de l’Ecologie, de l’Energie, du Développement durable et de la Mer
et du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche.
§ Prix du meilleur poster pour « Développement et application d’une méthode d’extraction

sur phase solide (SPE) et d’analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tandem (RRLC/MS/MS) pour le dosage de 78 substances
pharmaceutiques mutli-classes dans l’eau ». Élu par l’ensemble des participants du
congrès des Journées Information Eaux à Poitiers en septembre 2010.
Résumés et mots clés
Résumé
Les molécules pharmaceutiques font partie du groupe des contaminants émergents du fait de
leur intérêt récent dans les études environnementales comparativement à des polluants étudiés
depuis plus longtemps tels que les pesticides. Elles correspondent aux principes actifs des
médicaments et, à ce titre, sont responsables des propriétés pharmacologiques des
médicaments. Ce sont donc des molécules biologiquement actives qui peuvent agir sur les
organismes vivants présents dans les écosystèmes impactés. L’origine des molécules
pharmaceutiques dans l’environnement est variable mais les principales sources sont liées à
leur utilisation en médecine humaine ou vétérinaire. Une fois consommées, les molécules
pharmaceutiques sont excrétées dans les urines ou les fèces et se retrouvent dans les eaux
usées (consommation humaine) ou dans les déchets d’élevage (consommation vétérinaire).
Dans le premier cas, elles peuvent être rejetées directement dans le milieu, ou indirectement,
avec les eaux usées traitées ou les boues résiduaires, après traitement dans les stations
d’épuration (STEP). Dans le deuxième cas, elles atteignent directement le milieu lorsque les
animaux sont élevés en prairie ou indirectement lorsque les déchets d’élevage sont épandus
sur les sols agricoles pour les fertiliser. Ces travaux de thèse se sont attachés à étudier
l’origine et le devenir de ces molécules dans ces 2 cas de figure. Ainsi en se basant sur des
critères de consommation, de présence dans l’environnement par rapport à des études
antérieures, de toxicité et d’écotoxicité, d’originalité et de disponibilité des composés
standards de référence, 32 puis 78 molécules appartenant aux classes thérapeutiques des
antibiotiques, des anticancéreux, des -bloquants, des anti-VIH et des inhibiteurs de
phosphodiestérase de type 5 (PDE 5) ont été étudiées dans 2 continuums : i) effluents
hospitaliers - eaux usées brutes et traitées – eaux de surface, et ii) eaux usées brutes et traitées
- eaux de surface - eaux de captage souterraines. En s’appuyant sur les mêmes critères de
sélection, le devenir de 7 antibiotiques a été étudié dans des lisiers porcins dans des filières
simples de traitement du lisier (fosse de stockage), dans des filières complexes de traitement
du lisier (système de traitement ressemblant à des mini STEP) et dans des mésocosmes en
conditions contrôlées. Pour pouvoir réaliser l’ensemble de ces études, des protocoles
analytiques mettant en œuvre une étape d’extraction par SPE (Solide Phase Extraction) ou
d’extraction ASE (Extraction Accélérée par Solvant) puis de purification par SPE et d’analyse
par LC/MS/MS (Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem) ont été développés. Ces protocoles, en remplissant des critères de qualité tels que des
limites de détection et de quantification compatibles avec des analyses environnementales (de
l’ordre du ng/L à la dizaine de ng/L), une bonne linéarité, précision, justesse et performance,
ont permis d’analyser la phase dissoute des échantillons d’eaux et la phase dissoute et solide
des échantillons de lisiers. Il ressort des analyses des échantillons aqueux que : i) les -
bloquants, les anti-VIH et les antibiotiques appartenant aux familles des macrolides, des
fluoroquinolones et des sulfonamides, sont les molécules les plus representatifs de la
contamination du milieu naturel parmi les classes étudiées ; ii) les rejets de STEP sont une
source majeure de la contamination des systèmes aquatiques ; iii) les eaux usées sont
davantage contaminées en hiver qu’en été ; et iv) les eaux de surface sont davantage
contaminées en été qu’en hiver. Il ressort des analyses des échantillons de lisiers que : i) les
niveaux de contamination du lisier par les antibiotiques sont élevés, de l’ordre de la dizaine de
µg/L au mg/L ; ii) le niveau de contamination des lisiers n’est pas lié au stade physiologique
des cochons ; iii) l’intérêt de stocker le lisier pour en réduire la contamination en antibiotique
préalablement à l’épandage n’est pas mis en évidence ; iv) l’oxytétracycline, la tétracycline, la
tylosine et la marbofloxacine sont majoritairement présentes dans la phase solide alors que la
sulfadiazine, la lincomycine et la monensine sont essentiellement présentes dans la phase
liquide des lisiers ; v) la séparation des phases solides et liquides permet de réduire la
11
contamination des lisiers dans les filières de traitement ; et vi) la dégradation des antibiotiques
se fait principalement en condition aérobie.
Mots clés : molécules pharmaceutiques, antibiotiques, anticancéreux, -bloquants, anti-VIH,

inhibiteurs de PDE 5, SPE, ASE, LC/MS/MS, eaux, lisiers, continuums
12
Abstract
Pharmaceutical substances belong to the group of emerging contaminants due to their recent
interest in environmental studies in comparison with pollutants who have been studied for a
longer time like pesticides. They correspond to the active ingredient of drugs and by this
mean are responsible for their pharmacological properties. Consequently they are biologically
active molecules that can act on living organisms present in impacted ecosystems. The origin
of pharmaceuticals in the environment is variable but the main sources are related to their use
in human and veterinary medicine. Once consumed, pharmaceutical substances are excreted
in urine or feces and are found in wastewater (human consumption) or animal manure
(veterinary consumption). In the first case, they can be discharged directly in the environment,
or indirectly, with treated wastewater or sludge from sewage treatment plants (SWTP). In the
second case, they directly reach the environment when animals are bred on grassland or
indirectly when livestock wastes are spread on agricultural soils as fertilizer. This PhD work
has been focused on the study of the origin and fate of pharmaceutical substances in these 2
cases. Thus according to consumption data, occurrence in the environment reported in
previous studies, toxicity and ecotoxicity data, originality and availability of reference
standard compounds, 32 then 78 molecules belonging to 5 different therapeutic classes
(antibiotics, antineoplastics, -blockers, anti-HIV, phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE 5
inhibitor)) were studied in 2 continuums : i) hospital wastewater effluents – raw and treated
wastewater – surface water, and ii) raw and treated wastewater – surface water – ground
water. Based on the same selection criteria, the fate of 7 antibiotics was studied in pig manure
in simple manure storage facilities (storage tank), in aerobic manure treatment facilities
(treatment system like in small SWTP) and in mesocosms under controlled conditions. In
order to achieve all these studies, analytical protocols implementing an extraction step by SPE
(Solid Phase Extraction) or an ASE extraction (accelerated solvent extraction) followed by a
SPE purification and an analytical step by LC / MS / MS (liquid chromatography tandem
mass spectrometry) have been developed. These protocols, by filling out quality criteria such
as limits of detection and quantification compatible with environmental analysis (ng/L to
dozen of ng/L), good linearity, precision, accuracy and performance, were used to analyze the
dissolved phase of water samples and dissolved and solid phases of pig manure samples. The
water samples analysis shows : i) -blockers, anti-HIV and antibiotic belonging to the
families of macrolides, fluoroquinolones and sulfonamides are the most representative
molecules of the environmental contamination from the classes studied; ii) SWTP releases are
a major source of aquatic systems’ contamination; iii) wastewaters are more contaminated in
winter than in summer; and iv) surface water are more contaminated in summer than in
winter. The pig manure samples analysis shows : i) the levels of contamination of manure by
antibiotics are high, from a few µg/L to mg/L; ii) the manure level of contamination is not
related to the physiological stage of pigs; iii) the interest to store manure before spreading in
order to reduce the antibiotics contamination is not highlighted; iv) oxytetracycline,
tetracycline, tylosin and marbofloxacin are mainly present in the solid phase whereas
sulfadiazine, lincomycin and monensin are mainly present in the liquid phase of manure; v)
the separation of solid and liquid phases reduce manure contamination in aerobic treatment
facilities; and vi) antibiotics degradation is mainly aerobic.
Key words: pharmaceuticals, antibiotics, antineoplastics, -blockers, anti-HIV, PDE 5

inhibitor, SPE, ASE, LC/MS/MS, water, pig manure, continuums
13
14
Sommaire
Sommaire Général
REMERCIEMENTS ...................................................................................................................................... 3
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ................................................................................................ 7
RESUME....................................................................................................................................................... 11
ABSTRACT .................................................................................................................................................. 13
SOMMAIRE GENERAL ............................................................................................................................. 15
LISTE DES FIGURES ................................................................................................................................. 19
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................................. 23
ACRONYMES ET ABREVIATIONS.......................................................................................................... 25
INTRODUCTION GENERALE .................................................................................................................. 29
CHAPITRE 1 : GENERALITES ................................................................................................................. 35

I. GENERALITES SUR LES MOLECULES PHARMACEUTIQUES ................................................................. 36
I.1. Définition ................................................................................................................................ 36
I.2. Importance de la problématique ................................................................................................ 36
II. LES DIFFERENTES CLASSES DE MOLECULES PHARMACEUTIQUES ..................................................... 38
II.1. Douleurs et fièvres ................................................................................................................... 40
II.2. Troubles respiratoires ............................................................................................................... 40
II.3. Troubles gastriques .................................................................................................................. 41
II.4. Troubles / contrôles hormonaux................................................................................................ 42
II.5. Les médicaments de l’impuissance ........................................................................................... 42
II.6. Troubles du comportement et de l’humeur ................................................................................ 42
II.7. Troubles cardiaques ................................................................................................................. 43
II.8. Infections bactériennes ............................................................................................................. 45
II.9. Cancers .................................................................................................................................... 46
II.10. Infections virales ...................................................................................................................... 48
II.11. Traitements vétérinaires ........................................................................................................... 48
III. ORIGINE DANS L’ENVIRONNEMENT .............................................................................................. 51
IV. DEVENIR ...................................................................................................................................... 54
IV.1. Devenir dans les stations d’épuration ........................................................................................ 55
IV.2. Devenir dans l’environnement .................................................................................................. 60
V. PRESENCE DANS L’ENVIRONNEMENT ................................................................................................ 60
V.1. Les effluents hospitaliers .......................................................................................................... 65
V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP)................................................................................... 67
V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP).................................................................. 70
V.4. Les eaux de surface .................................................................................................................. 73
V.5. Les eaux souterraines ............................................................................................................... 76
V.6. Les eaux de boisson ................................................................................................................. 77
V.7. Les boues des STEP ................................................................................................................. 79
V.8. Les effluents d’élevage et les sols amendés avec les effluents d’élevage .................................... 81
V.9. Les sédiments .......................................................................................................................... 83
VI. TOXICITE ET ECOTOXICITE .......................................................................................................... 84
VI.1. Toxicité ................................................................................................................................... 84
VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments ............................................................................. 84
VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés .......................................................................................... 85
VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC50, LOEC, NOEC, etc.) .......................................................................... 86
VI.2. Antibiorésistance ..................................................................................................................... 91
VI.3. Evaluation du risque environnemental ...................................................................................... 92
VI.3.1. La démarche de l’évaluation du risque environnemental ................................................................... 92
VI.3.2. Application de l’évaluation du risque environnemental...................................................................... 95
VII. LEGISLATION ............................................................................................................................... 97
VIII. PROJETS DE RECHERCHE ............................................................................................................. 99
VIII.1. Européens ................................................................................................................................ 99
15
Sommaire
VIII.2. Français ................................................................................................................................. 100
OBJECTIFS DE CES TRAVAUX DE THESE ......................................................................................... 105
CHAPITRE 2 : LES COMPOSES ETUDIES ............................................................................................ 109

I. SELECTION DES CLASSES THERAPEUTIQUES ................................................................................... 110
I.1. Consommation ....................................................................................................................... 110
I.2. Toxicité ................................................................................................................................. 114
I.3. Présence dans l’environnement............................................................................................... 115
I.4. Persistance ............................................................................................................................. 116
I.5. Manque de données ................................................................................................................ 116
I.6. Classes sélectionnées.............................................................................................................. 117
II. SELECTION DES MOLECULES .......................................................................................................... 118
II.1. Les antibiotiques .................................................................................................................... 119
II.1.1. Consommation des antibiotiques...................................................................................................... 119
II.1.1.1 Consommation des antibiotiques en médecine humaine ........................................................... 119
II.1.1.2 Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire ........................................................ 125
II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance .......................................................................................... 127
II.1.3. Présence dans le milieu ................................................................................................................... 128
II.1.4. Persistance ...................................................................................................................................... 130
II.1.5. Manque de données ......................................................................................................................... 130
II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux, anti-VIH et inhibiteurs de la PDE
5. 130
II.2.1. Consommation................................................................................................................................. 130
II.2.2. Ecotoxicité ....................................................................................................................................... 135
II.2.4. Persistance ...................................................................................................................................... 137
II.3. Listes des molécules sélectionnées.......................................................................................... 138
III. COMPARAISON AVEC LES MOLECULES RETENUES DANS D' AUTRES ETUDES................................ 141
CHAPITRE 3 : MATERIEL ET METHODE ........................................................................................... 147

I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TECHNIQUES ANALYTIQUES .................................................... 148
I.1. Echantillons et techniques d’échantillonnage .......................................................................... 148
I.1.1. Type de prélèvement ........................................................................................................................ 148
I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements ............................................................................................. 149
I.1.3. Conservation des prélèvements ........................................................................................................ 149
I.2. Conditionnement des échantillons .......................................................................................... 150
I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d’intérêt .............................................. 151
I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE .......................................................................................... 152
I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE....................................................................... 155
I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs.................................................... 156
I.4. Techniques analytiques .......................................................................................................... 156
II. PROJETS ET SITES D’ECHANTILLONNAGE ....................................................................................... 161
II.1. Eaux usées et autres échantillons d’eau ................................................................................... 161
II.2. FLASH .................................................................................................................................. 164
II.2.1. Continuum hospitalier ..................................................................................................................... 164
II.2.2. Continuum agricole ......................................................................................................................... 166
II.3. DIPERPHA ........................................................................................................................... 167
II.4. Capteurs passifs ..................................................................................................................... 173
II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire.......................................................................................... 173
II.4.2. Application dans la Garonne ........................................................................................................... 175
II.5. Récapitulatif des projets ......................................................................................................... 175
III. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS.............................................................................................. 176
III.1. Échantillons « eau » ............................................................................................................... 176
III.2. Échantillons « lisiers » ........................................................................................................... 178
III.3. Échantillons « POCIS ».......................................................................................................... 180
16
Sommaire
CHAPITRE 4 : DEVELOPPEMENTS ANALYTIQUES ......................................................................... 185

I. DEVELOPPEMENT DES METHODES D’ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE COUPLEE
A LA SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM (LC/MS/MS) .................................................................... 186
I.1. Développement de la méthode d’analyse pour 32 molécules pharmaceutiques ......................... 187
I.2. Extension de la méthode d’analyse à 78 molécules pharmaceutiques ....................................... 191
I.3. Méthode spécifique à l’amoxicilline et à l’ampicilline............................................................. 193
I.4. Bilan méthodes analytiques .................................................................................................... 194
I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+) ...................................................................................................... 194
I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-)...................................................................................................... 197
I.5. Validation des protocoles ....................................................................................................... 198
II. DEVELOPPEMENT DU PROTOCOLE D’EXTRACTION DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE
LIQUIDE DES ECHANTILLONS PAR SPE..................................................................................................... 202
II.1. Les échantillons d’eau ............................................................................................................ 202
II.2. Le cas particulier de l’amoxicilline et de l’ampicilline............................................................. 206
II.3. Les échantillons de lisiers ....................................................................................................... 209
II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute................................................................................ 209
III. DEVELOPPEMENT DU PROTOCOLE D’EXTRACTION DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE
SOLIDE DES ECHANTILLONS PAR ASE ...................................................................................................... 212
III.1. Développement du protocole .................................................................................................. 212
III.2. Bilan protocole extraction phase solide ................................................................................... 214
IV. CONTROLE QUALITE ET QUANTIFICATION ................................................................................. 215
IV.1. Contrôle qualité ..................................................................................................................... 215
IV.2. Méthodes de quantification..................................................................................................... 216
IV.2.1. Etalonnage externe .......................................................................................................................... 217
IV.2.2. Etalonnage interne .......................................................................................................................... 217
CHAPITRE 5 : APPLICATIONS ENVIRONNEMENTALES ................................................................. 223

I. APPLICATION AUX MATRICES « EAUX » .......................................................................................... 224
I.1. Tests d’applicabilité des protocoles ........................................................................................ 224
I.2. Continuum Hérault : STEP – surface - captage ....................................................................... 227
I.2.1. Résultats de la campagne estivale .................................................................................................... 227
I.2.2. Résultats de la campagne hivernale ................................................................................................. 230
I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats............................................................................................. 232
I.3. Projet FLASH ........................................................................................................................ 238
I.3.1. Continuum hospitalier ..................................................................................................................... 239
I.3.1.1 Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux ............................................................ 239
I.3.1.2 Etudes des autres classes thérapeutiques ....................................................................................... 242
I.3.1.3 Bilan toutes classes thérapeutiques confondues ............................................................................. 245
I.3.2. Continuum agricole ......................................................................................................................... 247
I.3.2.2 Etude des autres classes thérapeutiques ........................................................................................ 248
I.4. Conclusion sur la contamination des eaux ............................................................................... 250
II. APPLICATION AUX MATRICES « LISIERS »....................................................................................... 253
II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier .................................................................. 253
II.2. Conditionnement des échantillons .......................................................................................... 254
II.3. Origine de la contamination du lisier stocké ............................................................................ 256
II.3.1. Origine du lisier brut et niveau de contamination ............................................................................ 257
II.3.2. Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers bruts ............................................. 257
II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et de l’élevage considéré ............. 259
II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier ............................................. 259
II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier..................................................................................... 260
II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier ..................................................................................... 264
II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées.................................................................. 266
II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique ................................................ 266
II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique .................................................................... 267
II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie ............................................................................ 268
II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques............................................................................................... 269
II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers ............................................................................. 270
17
Sommaire
CHAPITRE 6 : DEVELOPPEMENT ET APPLICATION DES POCIS .................................................. 273

I. DEVELOPPEMENT DE L’OUTIL : EXPERIENCES DE CALIBRATION .................................................... 274
II. APPLICATION DES POCIS .............................................................................................................. 276
PUBLICATION : CALIBRATION ET APPLICATION D'ECHANTILLONNEURS PASSIFS POUR LA
DETERMINATION DE 22 MOLECULES PHARMACEUTIQUES DANS L'EAU ............................... 277
RESUME ................................................................................................................................................... 277
INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 278
I. EXPERIMENTALE ............................................................................................................................ 282
I.1. Produits chimiques et matériel ................................................................................................ 282
I.2. Traitement de l'échantillon ..................................................................................................... 283
I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration ................................................................. 283
I.2.2. Extraction des POCIS...................................................................................................................... 283
I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem .................. 284
I.4. Calibration en laboratoire ....................................................................................................... 284
I.4.1. Conditions expérimentales ............................................................................................................... 284
I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des taux d'échantillonnage............... 285
I.5. Application environnementale ................................................................................................ 287
I.6. Paramètres de validation et assurance qualité .......................................................................... 287
II. RESULTATS..................................................................................................................................... 288
II.1. Développement de l'extraction des POCIS .............................................................................. 288
II.2. Calibration en laboratoire ....................................................................................................... 289
II.3. 4. Application environnementale, comparaison entre échantillonnage ponctuel et passif .......... 294
CONCLUSION ........................................................................................................................................... 297
REMERCIEMENTS .................................................................................................................................... 297
REFERENCES ........................................................................................................................................... 298
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................................................................... 301
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................... 309

ANNEXES................................................................................................................................................... 323
Annexe 1 : Elimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP. .................................................. 323
Annexe 2 : Présences et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques dans différentes matrices
environnementales ................................................................................................................................. 329
Annexe 3 : Ecotoxicité des antibiotiques ................................................................................................ 355
Annexe 4 : Structures des 78 molécules pharmaceutiques ....................................................................... 359
Annexe 5 : Propriétés physico-chimiques et pharmacocinétique des 78 molécules pharmaceutiques étudiées
............................................................................................................................................................. 365
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons environnementaux contenant des molécules
pharmaceutiques.................................................................................................................................... 371
Annexe 7 : Résultats bruts des différentes séries d’analyse, eau et lisier. .................................................. 379
PUBLICATION 1 : PROBLEMS AND SOLUTIONS OF TRACE LEVEL ANALYSIS OF ORGANIC

CONTAMINANTS IN DRINKING AND GROUND WATERS, REVIEW AND EXPERIENCE
FEEDBACK ................................................................................................................................................ 393
PUBLICATION 2 : DEVELOPMENT OF A METHOD FOR THE SIMULTANEOUS EXTRACTION
OF ANTIBIOTICS, -BLOCKERS, ANTINEOPLASTICS AND ANTIVIRALS BY SOLID-PHASE
EXTRACTION FOLLOWED BY LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS
SPECTROMETRY ANALYSIS – APPLICATION TO SEWAGE TREATMENT PLANT EFFLUENTS
..................................................................................................................................................................... 419
PUBLICATION 3 : MULTI-RESIDUE SIMULTANEOUS ANALYSIS OF 78 PHARMACEUTICAL
COMPOUNDS IN AQUEOUS SAMPLES: DEVELOPMENT AND APPLICATION ............................ 447
18
Liste des figures
Liste des Figures

Figure 1 : Répartition par année, sur les 20 dernières années, du nombre d'articles scientifiques publiés dans des revues à c omité de lecture
sur la problématique de la contamination de l’environnement par les molécules pharmaceutiques. ...................................................... 37
Figure 2 : Importance relative du nombre d'articles scientifiques, à comité de lecture, publiés en 1990, 2000 et 2010 sur les thématiques de la
contamination de l'environnement pas les molécules pharmaceutiques (pharma.), les hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAP) et les polychlorobiphényles (PCB). ................................................................................................................................................. 37
Figure 3 : Répartition des articles scientifiques publiés sur les molécules pharmaceutiques entre les différents thèmes de recherche entre 1998
et 2008 (graphique extrait et traduit du projet KNAPPE). ......................................................................................................................... 38
Figure 4 : Niveau 1 et 2 du classement ATC humain (OMS, 2009). ....................................................................................................................... 39
Figure 5 : Origine et distribution des molécules pharmaceutiques dans le milieu. ................................................................................................. 53
Figure 6 : Quantités moyennes de molécules pharmaceutiques et produits de soin corporels en entrée (influent) et sortie (effluent) de deux
stations d’épuration utilisant des filtres bactériens (Cilfynydd) ou des boues activées (Coslech) comme type de traitement (extrait de
Kasprzyk-Hordern et al.,, 2009). ................................................................................................................................................................. 55
Figure 7 : Rendement d'élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP (n = nombre de données) (la croix correspond à la
moyenne) (la famille des macrolides intègre aussi les lincosamides). ...................................................................................................... 57
Figure 8 : Elimination des molécules pharmaceutiques en fonction du traitement biologique appliqué (extrait de Kasprzyk Hordern et al.,
2009) .............................................................................................................................................................................................................. 58
Figure 9 : Pourcentage d'élimination et temps de demi-vie de différentes molécules pharmaceutiques en fonction du temps de résidence
hydraulique (extrait de Gros et al., 2010). ................................................................................................................................................... 59
Figure 10 : Répartition du nombre d’échantillons d’eau analysés par type de matrice d’après des données bibliographiques (graphique traduit
du délivrable D1.1 « List of relevant PPs » du projet KNAPPE, Schlüsener et al., 2007). ..................................................................... 62
Figure 11 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les diverses classes thérapeutiques pour les différentes matrices aqueuses
(nombre de classes thérapeutiques prises en compte, nombre de données prises en compte). ................................................................ 62
Figure 12 : Gammes de concentrations auxquelles les 8 composés représentés peuvent être retrouvés dans différentes matrices aqueuses
(gamme représentées par la valeur minimale et maximale trouvées dans les n données récupérées dans la littérature, 0 = 0,1 ng/L). 64
Figure 13 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les rejets hospitaliers
(nombre de données relevées dans chaque classe)...................................................................................................................................... 66
Figure 14 : Concentrations relevées dans la littérature pour 46 molécules pharmaceutiques mesurées dans des rejets hospitaliers. ................. 66
Figure 15 : Evolution du niveau de concentration en ciprofloxacine (b) et métronidazole (e) dans un effluent hospitalier en fonction de
l’heure de prélèvement et du débit (extrait de Lindberg et al., 2004). ...................................................................................................... 67
Figure 16 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux usées en entrée
de station d'épuration (nombre de données relevées dans chaque classe). ................................................................................................ 68
Figure 17 : Concentrations relevées dans la littérature pour 85 molécules pharmaceutiques mesurées dans des eaux usées brutes (entrée de
STEP). ............................................................................................................................................................................................................ 69
Figure 18 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux traitées en sortie
de station d’épuration (les données de Larsson et al.,, 2007 n’ont pas été intégrées ici car elles reflètent un cas particulier d’eaux
usées issues d’industries pharmaceutiques) (nombre de données relevées dans chaque classe). ............................................................ 70
Figure 19 : Concentrations relevées dans la littérature pour 94 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux usées traitées en sortie de
station d’épuration (par souci de lisibilité, les composés n’ayant qu’une seule valeur n’apparaissent pas et les croix représentent les
données relevées dans Larsson et al., 2007). .............................................................................................................................................. 72
Figure 20 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux de surface
Figure 21 : Concentrations relevées dans la littérature pour 100 médicaments mesurées dans les eaux de surface (par souci de lisibilité, les
composés n’ayant qu’une seule valeur n’apparaissent pas sur cette figure). ............................................................................................ 75
Figure 22 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux souterraines
Figure 23 : Concentrations relevées dans la littérature pour 42 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux souterraines. .................. 77
Figure 24 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux potables (eaux en
sortie de station de potabilisation ou eaux de boisson) (nombre de données relevées dans chaque classe). .......................................... 78
Figure 25 : Concentrations relevées dans la littérature pour 41 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux potables (AMDOPH : 1-
acetyl-1-methyl-2-dimethyl-oxamoyl-2-phenylhydrazid). ......................................................................................................................... 79
Figure 26 : Répartition des composés pharmaceutiques entre les boues (plein) et les eaux traitées (rayé) dans les STEP. En blanc apparaît la
fraction perdue par dégradation (graphique adapté de Heidler et Halden, 2008). .................................................................................... 80
Figure 27 : Concentrations relevées dans la littérature pour 54 molécules pharmaceutiques mesurées dans les boues des stations d’épuration.
........................................................................................................................................................................................................................ 80
19
Liste des figures
Figure 28 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant des effets toxiques aigus sur les algues, les cyanophytes
(cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (EC50) (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009
(http://www.onema.fr/IMG/pdf/J.Garric_CEMAGREF_Atelier_3.pdf, 15/12/10)). ............................................................................... 87
Figure 29 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant (EC 50) ou ne provoquant pas (NOEC) des effets toxiques chroniques
sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (graphique extrait d'une présentation de J. Garric,
mai 2009 (http://www.onema.fr/IMG/pdf/J.Garric_CEMAGREF_Atelier_3.pdf, 15/12/10)). ............................................................... 88
Figure 30: Répartition des classes de molécules pharmaceutiques en fonction de leur fréquence d’analyse dans des échantillons
environnementaux (traduit du projet KNAPPE). ...................................................................................................................................... 115
Figure 31 : Evolution de la consommation des antibiotiques en France en médecine ambulatoire entre 1998 et 2008 (a) et à l’hôpital entre
2006 et 2008 (b), exprimée en DDD pour 1000 habitants et par jour (à partir des données ESAC). .................................................... 120
Figure 32 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antibiotiques en médecine humaine (d’après le site internet
http://www.whocc.no/atc_ddd_index/)...................................................................................................................................................... 121
Figure 33 : Répartitions entre usage humain et vétérinaire des ventes des différentes familles d’antibiotiques (Source
http://www.afssa.fr/ftp/afssa/34471-34472.ppt# 350,19 ANMV-AFSSAPS 2002)............................................................................... 125
Figure 34 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 (d’après les données de Chevance et al,.
2009). ........................................................................................................................................................................................................... 126
Figure 35 : Répartition de la consommation des antibiotiques vétérinaires en France en 2008 (graphique d'après les données du rapport de
l'AFSSA-ANMV, Chevance et al., 2009). ................................................................................................................................................ 126
Figure 36 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 a) pour les porcs et b) pour les bovins
d'après les données de consommation exprimées en tonnes de poids vif traité (graphiques extrait du rapport de l’AFSSA, Chevance
et al., 2009). ................................................................................................................................................................................................. 127
Figure 37 : Présence et niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les matrices aqueuses d’après des données
relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). ............................................................................................. 129
Figure 38: Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des -bloquants en médecine humaine (d’après le site internet
Figure 39 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antinéoplasiques en médecine humaine (d’après le site internet
Figure 40 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antiviraux en médecine humaine (d’après le site internet
Figure 41 : Présence et niveau de contamination des -bloquants, des anticancéreux, des anti-VIH et des inhibiteurs de PDE 5 dans les
matrices aqueuses d’après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). ........................... 136
Figure 42 : Les différentes étapes dans le traitement d’un échantillon depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse. .............................................. 160
Figure 43: Cartographie des points de prélèvement (STEP, eau de surface, eau de captage). ............................................................................. 164
Figure 44 : Représentation schématique du continuum hospitalier et des points de prélèvement. ...................................................................... 165
Figure 45 : Représentation du continuum agricole et des sites de prélèvement (le point 5 correspond à l’eau de surface échant illonnée dans le
continuum hospitalier). ............................................................................................................................................................................... 167
Figure 46 : Filière simple de traitement du lisier dans un élevage de type naisseur-engraisseur. ........................................................................ 168
Figure 47 : Filière complexe de traitement du lisier avec séparation par centrifugation du solide et du liquide en sortie de la fosse de stockage
(élevage 4). .................................................................................................................................................................................................. 169
Figure 48 : Filière complexe de traitement du lisier sans séparation des phases solide et liquide (site 2). ......................................................... 170
Figure 49 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la première expérience en réacteur mésophile. ................................................... 172
Figure 50 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la seconde expérience en réacteur mésophile. .................................................... 172
Figure 51 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la troisième expérience en réacteurs thermophile. ............................................. 173
Figure 52: Photos du montage ayant servi aux expériences de calibration des POCIS. ....................................................................................... 174
Figure 53: Prélèvement des POCIS au cours de l’expérience de calibration réalisée en laboratoire. .................................................................. 175
Figure 54: Localisation des points de prélèvement. ................................................................................................................................................ 175
Figure 55 : Schéma récapitulatif de l'ensemble des études réalisées au cours de ces travaux de thèse. .............................................................. 176
Figure 56 : Comparaison de la composition et des teneurs en antibiotiques de la phase particulaire et de la phase solide de mêmes
échantillons de lisier (LS1 : lisier stocké site simple 1, LS2 : lisier stocké site simple 2, LS3 : lisier stocké site simple 3, Ls5 : lisier
stocké site complexe 5, BA5 : bassin d’aération site complexe 5, BE5 : bassin de décantation site complexe 5, Lag5 : lagune site
complexe 5). ................................................................................................................................................................................................ 180
Figure 57 : Schéma explicant le principe de l’analyse par chromatographie en phase liquide couplé à un spectromètre de masse en tandem
comportant 2 quadrupôles et fonctionnant en mode MRM (Multi-Reaction Monitoring). ................................................................... 187
Figure 58 : Localisation des différentes parties du LC/MS/MS correspondant aux paramètres à optimiser....................................................... 187
20
Liste des figures
Figure 59 : Chromatogrammes obtenus pour les 27 molécules ionisées en ESI+ en fonction de la constitution des phases mobiles, (a)
eau/ACN + 0,1 % CH3COOH dans chaque solvant, (b) eau/ACN + 0,3 % HCOOH dans chaque solvant, (c) eau/ACN + 2,5 %
CH3COOH dans chaque solvant. Exemple de l’acide oxolinique en rouge et de l’oxytétracycline (oxyTC) en bleu. ........................ 189
Figure 60 : Chromatogrammes obtenus pour les 5 molécules ionisées en ESI- en fonction de la constitution des phases mobiles (abondance
normalisée par la quantité injectée), (a) eau/ACN sans acide, (b) eau/ACN + 0,1 % CH 3COOH dans chaque solvant, (c) eau/ACN +
0,3 % HCOOH dans chaque solvant, (d) eau/ACN + 2,5 % CH 3COOH dans chaque solvant. ............................................................ 189
Figure 61 : Chromatogrammes d’analyses successives de pénicilline G sans acide dans la phase mobile (a) et avec 0,1 % d’acide acétique
dans chaque solvant de la phase mobile (b). ............................................................................................................................................. 190
Figure 62: Chromatogramme des 66 composés pharmaceutiques analysés en ESI +. .......................................................................................... 192
Figure 63: Chromatogramme d’une solution standard analysée en ESI -. ............................................................................................................. 192
Figure 64 : Chromatogramme de l'amoxicilline et de l'ampicilline ainsi que des 3 autres -lactames analysés en ESI+. ................................. 193
Figure 66 : Suivi de la carte de contrôle de la méthode d'analyse de 21 antibiotiques en ESI + pour DIPERPHA. .......................................... 202
Figure 67 : Rendement d'extraction moyen pour 15 antibiotiques en fonction du type de cartouche et du solvant employé. ........................... 203
Figure 68 : Rendement d'extraction moyen pour les 32 molécules pharmaceutiques en fonction du pH de l'échantillon et de l'ajout ou non
d'EDTA. ....................................................................................................................................................................................................... 203
Figure 69 : Rendements d’évaporation moyens en fonction du niveau d’évaporation pour les 32 molécules pharmaceutiques (a) et pour
quelques molécules spécifiques (b) (FQ : fluoroquinolones, Q : quinolones, S : sulfonamides, b-B : -bloquants). .......................... 204
Figure 70 : Rendements d'extraction moyens (n=16) pour chacun des 32 composés de la première liste de molécules sélectionnées. ........... 205
Figure 71 : Rendements d'extraction obtenus au cours du premier test d'optimisation d'un protocole SPE spécifique à l'amoxicilline et à
l'ampicilline. ................................................................................................................................................................................................ 207
Figure 72 : Rendements d'extraction obtenus au cours du second test d'optimisation du protocole SPE de l’amoxicilline et de l’ampicilline.
...................................................................................................................................................................................................................... 208
Figure 73 : Validation du nouveau protocole d'extraction de l'amoxicilline et de l'ampicilline ........................................................................... 208
Figure 74 : Protocoles d’extractions multi-résidus (32 et 78 composés) et spécifiques (amoxicilline et ampicilline) de la phase dissoute
d’échantillons aqueux (eau et lisiers)......................................................................................................................................................... 210
Figure 75 : Rendements de quantification (n=3) et d’extraction (SPE et ASE+SPE noté ASE, n=3) pour 5 des 7 molécules majorita ires
(lincomycine, marbofloxacine et sulfadiazine quantifiées par étalonnage interne avec les étalons dans le flacon de récupération,
oxytétracycline et monensine quantifiées par étalonnage externe). ......................................................................................................... 213
Figure 76: Comparaison des rendements d'extraction en fonction du moment où les étalons internes (ei) sont ajoutés, dans le flacon collecteur
des extraits ou dans la cellule ASE. ........................................................................................................................................................... 213
Figure 77 : Protocoles d’extractions de la phase solide d’échantillons de lisiers porcins. ................................................................................... 215
Figure 78 : Niveau de contamination et concentrations individuelles en antibiotiques, -bloquants et anti-VIH dans 10 effluents de STEP. 224
Figure 79 : Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP et débits, en m 3/j (courbe), des STEP... 226
Figure 80 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et
en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en été. .......................................................... 228
Figure 81 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continu um Hérault en
été. ................................................................................................................................................................................................................ 230
Figure 82 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et
en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en hiver (concentration et présence de
l’amoxicilline non présenté). ...................................................................................................................................................................... 231
Figure 83 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continu um Hérault en
hiver. ............................................................................................................................................................................................................ 232
Figure 84 : Comparaison saisonnière de la contamination totale des eaux usées en entrée et sortie de STEP, des eaux de surface en amont et
en aval de ces rejets et des eaux de captage. ............................................................................................................................................. 232
Figure 85 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux usées en entrée et sortie de STEP pour chacune des 14 molécu les
détectées dans ces eaux. .............................................................................................................................................................................. 234
Figure 86 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux de surface en amont et en aval des rejets de STEP et des eau x de captage
pour chacune des 7 molécules détectées dans ces eaux. ........................................................................................................................... 237
Figure 87 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (A-b : antibiotiques,
b-b : -bloquants, A-c : anticancéreux, A-VIH : anti-VIH). .................................................................................................................... 239
Figure 88 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-VIH et sildénafil, en été et en hiver le
long d'un continuum hospitalier. ................................................................................................................................................................ 241
Figure 89 : Abattements estivaux et hivernaux des différentes molécules au sein des différentes classes thérapeutiques et famille
d’antibiotiques (les abattements inférieurs à - 100 % apparaissent sur le graphique au niveau de la ligne -100 %) (macro. & linco :
macrolides et lincosamides, FQ & Q : fluoroquinolones et quinolones, autres Ab : autres antibiotiques). .......................................... 242
Figure 90 : Concentration totale (∑78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver. ................. 242
21
Liste des figures
Figure 91 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (AINS : analgésiques
et AINS, A-épi. & A-dép. : antiépileptiques et antidépresseurs, broncho. : bronchodilatateurs, hypolip. : hypolipémiants). ............ 243
Figure 92 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.),
des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum
hospitalier (retraite : maison de retraite).................................................................................................................................................... 245
Figure 95 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum hospitalier. ........ 246
Figure 96 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-VIH et sildénafil le long d'un continuum
agricole, en été et en hiver. ......................................................................................................................................................................... 247
Figure 97 : Concentration totale (∑78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver. ..................... 248
Figure 98 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.),
des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum
agricole. ....................................................................................................................................................................................................... 248
Figure 99 : Concentration totale (∑99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver. ..................... 249
Figure 100 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum agricole. .......... 249
Figure 101 : Contribution des familles d’antibiotiques et des classes thérapeutiques à la contamination des différents échantillons d’eau
analysés au cours de ces travaux de thèse. ................................................................................................................................................ 251
Figure 102 : A) Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP étudiées au cours des différents
projets et débits, en m3/j (courbe) (remarque : flux du continuum Hérault calculé à partir des débits moyens annuels des STEP), B)
concentrations totales, en ng/L, en molécules pharmaceutiques émises par les STEP. ......................................................................... 252
Figure 103 : Fréquence de détection des 18 antibiotiques retrouvés au moins une fois à l’issus des premières analyses de la p hase dissoute
d’échantillons de lisier provenant à la fois des filières simples et complexes. ....................................................................................... 254
Figure 104 : Concentration moyenne en antibiotiques d'un même lisier de porc en fonction des différentes conditions de conser vation (F + F :
frais + formaldéhyde; C + F : congelé + formaldéhyde). ......................................................................................................................... 255
Figure 105 : Concentration moyenne (n=3) en antibiotiques d'un même échantillon de lisier porcin en fonction des différentes conditions de
traitement (C : congelé; CF : centrifugé/filtré).......................................................................................................................................... 256
Figure 106 : Répartition de la contamination des lisiers bruts en fonction de leur bâtiment d'origine (phase solide et phase liquide prise en
compte) (ENG : engraissement, MATER : maternité, PS : post-sevrage). ............................................................................................. 257
Figure 107: Niveau de contamination du lisier stocké et brut en fonction de son origine (LB ENG : lisier brut engraissement, LB MATER :
lisier brut maternité, LB PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké). Pour l’élevage 2, les données de LB ENG et LS
proviennent d’analyses qui ont été réalisées sur du lisier prélevé à la même époque mais un an auparavant par rapport à LB MATER
et LB PS. ...................................................................................................................................................................................................... 258
Figure 108: Part relative de chaque antibiotique à la contamination globale du lisier en fonction de son origine (ENG : lisier brut
engraissement, MATER : lisier brut maternité, PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké). ......................................................... 259
Figure 109 : Evolution de la contamination totale du lisier stocké en fosse durant 5 mois dans 3 élevages porcins différents. ....................... 260
Figure 110 : Evolution de la contamination de la phase dissoute (a) et de la phase solide (b) du lisier stocké en fosse penda nt les 5 mois de
suivi dans les 3 élevages. ............................................................................................................................................................................ 261
Figure 111 : Evolution détaillée par molécule de la contamination du lisier de la fosse de stockage sur 5 mois de suivi dans 3 élevages
différents, en tenant compte (haut) ou non (bas) de l’oxytétracycline. ................................................................................................... 261
Figure 112 : Evolution et importance relative de chaque antibiotique à la contamination du lisier stocké, dans la phase dissoute (haut) et dans
la phase solide (bas). ................................................................................................................................................................................... 263
Figure 113 : Répartition des antibiotiques entre la phase dissoute (clair) et la phase solide (foncé) des lisiers stockés pour les 3 élevages
étudiés. ......................................................................................................................................................................................................... 263
Figure 114 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute (gauche) et dans la phase solide (droite,
ng/g de poids sec) de l'élevage 4. ............................................................................................................................................................... 264
Figure 115 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute (gauche) et dans la phase solide (droite,
ng/g de poids sec) de l'élevage 5. ............................................................................................................................................................... 265
Figure 116 : Comparaison des évolutions de la contamination du lisier le long des différentes filières de traitement. ..................................... 265
Figure 117 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage
aérobie-anoxique (RLsort) mésophile. ...................................................................................................................................................... 267
Figure 118 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier à l’entrée du réacteur (alimentation) et en sort ie du réacteur
(sortie) aérobie-anoxique mésophile. ......................................................................................................................................................... 268
Figure 119 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques à l’entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier
réacteur (R1) et du second réacteur (R2). .................................................................................................................................................. 269
Figure 120 : Les différents régimes d'adsorption des échantillonneurs passifs. .................................................................................................... 275
22
Liste des tableaux
Liste des Tableaux

Tableau 1 : Mode d’action des principaux antalgiques. ............................................................................................................................................ 40
Tableau 2 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles gastriques et leurs modes d’action............................................... 41
Tableau 3 : Exemples de médicaments impliqués dans les contrôles hormonaux. ................................................................................................. 42
Tableau 4 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles du comportement et de l’humeur et leurs modes d’action. ........ 43
Tableau 5 : Exemples d'hypolipémiants et leurs modes d'action. ............................................................................................................................. 44
Tableau 6 : Exemples d'anticoagulants et leurs modes d'action. .............................................................................................................................. 44
Tableau 7 : Modes d’action des différentes familles d'antibiotiques........................................................................................................................ 46
Tableau 8 : Modes d’action des différentes classes anticancéreux........................................................................................................................... 47
Tableau 9 : Exemple d'antiparasitaires vétérinaires et leurs modes d'actions. ......................................................................................................... 49
Tableau 10 : Exemple d’anti-inflammatoires vétérinaires et leurs modes d’action. ............................................................................................... 50
Tableau 11 : Modes d’action des antibiotiques administrés en médecine vétérinaire............................................................................................. 51
Tableau 12 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les eaux usées brutes (entrée de STEP) et traitées (sortie de STEP) ainsi
que les boues de STEP pour deux classes thérapeutiques majeures (concentrations indiquées en ng/L dans les eaux et en ng/g da ns
les boues). ...................................................................................................................................................................................................... 65
Tableau 13 : Nombre d'informations recueillies dans les différentes matrices aqueuses. ...................................................................................... 73
Tableau 14 : Concentrations des antibiotiques analysés dans les effluents d'élevage et les sols enrichis avec ces déchets (ng/g). .................... 82
Tableau 15 : Concentrations en antibiotiques trouvées dans les sédiments (ng/g).................................................................................................. 83
Tableau 16 : Concentrations effectives en µg/L (EC 50) pour 24 antibiotiques relevées dans la littérature. .......................................................... 89
Tableau 17: Différences de sensibilité d'une cyanobactéries et de 2 algues à différents antibiotiques (d’après Holten Lützhøft et al., 1999),
(0,015) : en dehors de la gamme de mesure du test pratiqué. .................................................................................................................... 90
Tableau 18: Les étapes de l'évaluation du risque environnemental (traduit du tableau 1, EMEA, 2006) ............................................................. 93
Tableau 19 : Evaluation de la toxicité de différentes molécules pharmaceutiques selon le rapport PEC / PNEC................................................ 96
Tableau 20 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché officinal en quantité en 2004, 2006, 2007 et
2008 (millions d’unités vendues (part du marché %)).............................................................................................................................. 111
Tableau 21 : Répartition des ventes de médicaments en quantité et en valeur sur le marché officinal en 2008 (part du marché %). Sont
indiquées en gras les classes communes aux 2 classements. ................................................................................................................... 112
Tableau 22 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché hospitalier en valeurs en 2004, 2 006, 2007 et
2008 (part du marché %). ........................................................................................................................................................................... 113
Tableau 23 : Classes thérapeutiques et molécules pharmaceutiques les plus recherchées dans les stations d'épuration (traduit de Miège et al.,
2009). ........................................................................................................................................................................................................... 116
Tableau 24 : Synthèse des classes de médicaments retenues suivant les différents critères de choix. ................................................................ 118
Tableau 25 : Nombre d’unités vendues sur les 100 premières molécules du marché ambulatoire français en 2007 et 2008 (données IMS
Health). ........................................................................................................................................................................................................ 122
Tableau 26 : Nombre d'unités d'antibiotiques (classe ATC J01) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). .... 124
Tableau 27 : Nombre d'unités de -bloquants (classe ATC C07) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). ... 133
Tableau 28 : Nombre d'unités d'anticancéreux (classe ATC L01 et L02) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS
Health). ........................................................................................................................................................................................................ 133
Tableau 29 : Nombre d'unités vendues d'anti-VIH (classe ATC J05) en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). .......... 134
Tableau 30 : Liste des composés sélectionnés avec les informations relatives à leur structure, leur consommation, leur pharmacocinétique,
leurs propriétés physico-chimiques, et les critères de sélection. .............................................................................................................. 139
Tableau 31 : Comparaison de la liste de molécules étudiées au cours de la thèse avec celles établies par d’autres études française ou
européenne. .................................................................................................................................................................................................. 143
Tableau 32 : Répartition des 28 références bibliographique précisant dans quel type de contenant les échantillons sont recuei llis (détails dans
l’Annexe - tableau 11). ............................................................................................................................................................................... 149
Tableau 33 : Répartition des références bibliographique précisant le mode de conservation des échantillons (détails dans l’Annexe - tableau
11). ............................................................................................................................................................................................................... 150
Tableau 34 : Répartition des références bibliographique en fonction de la porosité des filtres employés (détails dans l’Annexe - tableau 11).
...................................................................................................................................................................................................................... 151
Tableau 35 : Répartition des références bibliographique en fonction de la technique extractive employée (détails dans l’Annexe - tableau 12).
...................................................................................................................................................................................................................... 151
23
Liste des tableaux
Tableau 36 : Principe des différentes techniques extractives (T° : température, P° : pression). .......................................................................... 153
Tableau 37 : Répartition des références bibliographiques utilisant l’extraction par SPE entre les différentes sortes de cartouches (détails dans
l’Annexe - tableau 12). ............................................................................................................................................................................... 155
Tableau 38 : Répartition des références bibliographiques entre les différentes systèmes d’analyse ( détails dans l’Annexe - tableau 13)...... 157
Tableau 39: Caractéristiques des stations d'épuration où les échantillons ont été prélevés. ................................................................................. 162
Tableau 40 : Informations relatives au prélèvement et au traitement des échantillons. ........................................................................................ 163
Tableau 41 : Caractéristiques des quatre stations d'épuration étudiées. ................................................................................................................. 163
Tableau 42 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum hospitalier au cours des 2 campagnes................................................... 166
Tableau 43 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum agricole au cours des 2 campagnes. ...................................................... 166
Tableau 44 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système de traitement simple du lisier. ......................................................... 168
Tableau 45 : Dates de prélèvement du lisier stocké et des lisiers bruts en fonction du bâtiment d’élevage d’origine ....................................... 169
Tableau 46 : Dates de prélèvement dans la fosse de stockage du lisier sur les élevages possédant un système simple de traitement. ............. 169
Tableau 47 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système complexe de traitement du lisier. .................................................... 170
Tableau 48 : Volumes (mL) des prises d'essai pour les différents projets traités. ................................................................................................. 177
Tableau 49 : Conditions d'extraction de la phase solide des lisiers porcins par ASE. .......................................................................................... 179
Tableau 50 : Valeurs des paramètres de validation du protocole analytique spécifique au dosage de l'amoxicilline et de l'ampi cilline.......... 194
Tableau 51 : Paramètres communs à l'ensemble des composés analysés en ESI+................................................................................................ 195
Tableau 52 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de
collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation positif. ................................................ 195
Tableau 53 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de
collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation négatif. ............................................... 198
Tableau 54 : Paramètres analytiques de validation de la méthode multi-résidus pour 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de
l'ampicilline qui ont leur propre protocole. ............................................................................................................................................... 200
Tableau 55 : Volume de fuite déterminés pour l’ensemble des 32 composés (n.d : non determiné car rendements d’extraction trop faibles ou
nuls).............................................................................................................................................................................................................. 205
Tableau 56 : Paramètres expérimentaux de validation de la méthode de dosage des 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de
l'ampicilline qui ont leur propre protocole. Rendements calculés par étalonnage interne ou externe................................................... 211
Tableau 57 : Protocoles ASE testés pour l'extraction des antibiotiques dans la phase solide des lisiers. ............................................................ 212
Tableau 58 : Rendements de quantification (justesse analytique) et d'extraction obtenus lors des différentes séries d’analyses des échantillons
de lisier provenant des élevages. ................................................................................................................................................................ 214
Tableau 59 : Mode de quantification de chacun des composés étudiés. ................................................................................................................ 219
Tableau 60 : Exemple de rendements de manipulation (extraction + analyse) obtenus pour 3 molécules différentes au cours d’une même
expérience en fonction du mode d’étalonnage utilisé. .............................................................................................................................. 219
Tableau 61 : Liste des 32 molécules pharmaceutiques recherchées au cours de cette première étude et leurs résultats d'analyse (concentration
ng/L) en comparaison avec d'autres études françaises ayant recherchées et retrouvées, ou non, ces mêmes molécules dans dans d es
rejets de STEP (cases blanches : composés non recherchés, n.d : composés recherchés mais non détectés, valeurs : concentrations
mesurées en ng/L pour les composés détectés). ........................................................................................................................................ 225
Tableau 62 : Flux de molécules pharmaceutiques en sorties de STEP exprimés en mg/j. ................................................................................... 227
Tableau 63: Flux des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de STEP en été, calculés à partir des débits moyens annuels de
chacune des STEP, exprimés en mg/j. ....................................................................................................................................................... 238
Tableau 64 : Abattement (%) des molécules pharmaceutiques dans les 4 STEP étudiées (calculé quand les molécules ont été quant ifiées en
entrée et en sortie de STEP). ...................................................................................................................................................................... 238
Tableau 65 : Comparaison des abattements dans les STEP pour 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et l’ofloxacine, entre cett e étude et celle
de Castiglioni et al., 2006. .......................................................................................................................................................................... 238
Tableau 66 : Fréquences (F) de détection des 32 molécules communes recherchées dans l’ensemble de tous les effluents de STEP analysés au
cours de ces travaux de thèse. .................................................................................................................................................................... 250
Tableau 67 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide des lisiers avant (RLB) et après
traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile................................................................................. 267
Tableau 68 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et solide des lisiers à l’entrée du réacteur (alimentation) et en
sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile. ........................................................................................................................... 268
Tableau 69 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide à l’entrée des réacteurs anaérobies
thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2). ......................................................................... 269
Tableau 70: Régime d'adsorption sur 15 jours d’exposition et valeurs des paramètres calculés pour les 22 molécules pharmaceutiques....... 275
24
Acronymes et abréviations
Ab : antibiotique
Ac : anticancéreux
ACN : acétonitrile
AFSSA : Association Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
ANSES : Agence Nationale de Sécurité Sanitaire, de l’alimentation, de l’environnement et du
travail
APCI : Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (ionisation chimique à pression
atmosphérique)
ASE : Accelerated Solvant Extraction (extraction accélérée par solvent)
AVIH : anti-VIH
CH3COOH : acide acétique
DCE : Directive Cadre sur l'Eau
DCM : dichlorométhane
EC50 : Effect Concentration 50 (concentration provoquant des effets sur 50 % des organismes
étudiés)
EI : Electron Impact (impact électronique)
EI : étalon interne
ESI : ElectroSpray Ionisation (ionisation en mode éléctrospray)
GC : Gas Chromatography (chromatographie en phase gazeuse)
GC/MS : Gas Chromatography / Masse Spectrometry (chromatographie en phase gazeuse
couplée à un spectromètre de masse)
GC/MS/MS : Gas Chromatography tandem Masse Spectrometry (chromatographie en phase
gazeuse couplée à un spectromètre de masse en tandem)
HAP : Hydrocarbure Aromatique polycyclique
HCL : acide chlorhydrique
HCOOH : acide formique
HDPE : High Density PolyEthylen (polyéthylène haute densité)
HPLC : High Performance Liquid Chromatography (chromatographie en phase liquide haute
performance)
IDL : Instrumental Detection limit (limite de détection instrumentale)
INNTI : Inhibiteur Non Nucléosidique de la Transcriptase Inverse
INTI : Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse
IQL : Instrumental Quantification limit (limite de quantification instrumentale)
IT : Ion Trap (trappe à ion)
LC/MS : Liquid Chromatography / Masse Spectrometry (chromatographie en phase liquide
haute performance couplée à un spectromètre de masse)
LC/MS/MS : Liquid Chromatography tandem Masse Spectrometry (chromatographie en
phase liquide haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem)
LC50 : Lethal Concentration 50 (concentration léthale pour 50 % des organismes étudiés)
LOD : Limit Of Detection (limite de détection)
LOEC : Lowest Observed Effect Concentration (plus petite concentration provoquant les
effets observés)
LOQ : Limit Of quantification (limite de quantification)
MAE : Microwave-Assisted Extraction (extraction assistée par micro-ondes)
MDL: Method Detection limit (limite de détection méthodologique)
MEC : Mesured Environmental Concentration (concentration mesurée dans l'environnement)
MeOH : méthanol
25
MM : masse molaire
MQL : Method Quantification limit (limite de quantification méthodologique)
MRM : Multiple Reaction Monitoring (suivi de réaction multiple)
MS : Mass Spectrometry (spectromètre de masse)
Na2-EDTA : Ethylen-Diamine-Tetra-Acetic acid dissodium salt
NaOH : hydroxyde de sodium (soude)
NMW : Natural Mineral Water (eau minérale naturelle)
NOEC : No Observed Effect Concentration (concentrations sans effet observé)
OCDE : Organisation de Coopération et de Développement Économiques
OMS : Organisation Mondial pour la Santé
PDE 5 : Phospho-Di-Estérase de type 5
PEC : Predicted Environmental Concentration (concentration prédite dans l'environnement)
PES : PolyEtherSulfone
PNEC : Predicted Non Effect Concentration (concentration prédite sans effet observé)
POCIS : Polar Organic Chemical Integrative Sampler
PTFE : PolyTétraFluoroEthylène (Teflon®)
Q : Quadrupole (quadrupôle)
QQQ : triple quadrupôle
QTOF : quadrupôle – temps de vol en tandem
RRLC : Rapid Resolution Liquid Chromatography
SIM : Single Ion Monitoring (suivi d'un ion)
SIR : Single Ion Recording (suivi d'un ion)
SPE : Solid Phase Extraction (extraction en phase solide)
SPME : Solid Phase Micro-Extraction (micro-extraction en phase solide)
TOF : Time Of Flight (temps de vol)
UE : Union Européene
UPLC : Ultra Performance Liquid Chromatography
US : Ultra-Sons
VIH : Virus Immunodéficience Humaine
-b : -bloquant
26
Introduction
27
28
Introduction générale
Introduction Générale
Les molécules pharmaceutiques font partie des contaminants dits émergents du fait de leur
récent intérêt dans les études environnementales comparativement à des composés reconnus
comme polluants de façon plus ancienne tels que les hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP), les polychlorobiphényles (PCB) ou les pesticides. Malgré tout, les
premières études remontent au milieu des années 70 avec par exemple, la parution en 1977
d’un article de Hignite et Azarnoff « Drugs and drug metabolites as environmental
contaminants: chlorophenoxyisobutyrate and salicylic acid in sewage water effluent ». Du fait
de leur faible niveau de concentration dans les différents compartiments environnementaux et
de leur hydrophilie, il a fallu attendre le développement d’outils analytiques adaptés capables
de descendre en terme de limites de détection et d’analyser des composés polaires dans des
matrices aqueuses pour pouvoir les mettre en évidence dans les milieux naturels.
Généralement les analyses chimiques de ces molécules sont réalisées avec des couplages
chromatographie-spectrométrie de masse. Les premières applications de la spectrométrie de
masse datent de 1968 et c’est en 1975 que la chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse a été développée, améliorant ainsi l’analyse des composés hydrophiles
et faiblement volatils (Laprévote, 2007).
Parallèlement à ces avancées techniques, la découverte des effets perturbateurs endocriniens,

comme par exemple la présence de vitellogénine chez des poissons mâles exposés à des rejets
de stations d’épuration (Purdom et al., 1994), a amené les scientifiques à s’interroger sur les
causes de ces désordres et à en rechercher les composés responsables. Il est donc devenu
important d’identifier les composés présents dans les effluents des stations d’épuration. Les
premiers effets mis en évidence remonteraient au milieu des années 1980 (Routledge et al.,
1998).
Parmi l’ensemble des contaminants organiques, les molécules pharmaceutiques représentent

une catégorie particulière. En effet, à la différence des plastifiants comme le bisphénol A ou
des détergents comme les alkylphénols polyéthoxylés, les molécules pharmaceutiques sont
produites pour être biologiquement actives. De plus, à la différence des pesticides, leurs rejets
sont principalement diffus et chroniques car liés à la présence humaine, continus car non liés à
des pratiques agricoles saisonnières et non règlementés. La présence de ces molécules dans
les milieux aquatiques et édaphiques représente donc un risque potentiel pour les
écosystèmes. La féminisation des poissons mâles et les problèmes de maintien de population
que cela engendre (Kidd et al., 2007) ou la disparition d’une espèce de vautour au Pakistan lié
à l’absorption de diclofénac (Oaks et al., 2004) en sont des illustrations. Par ailleurs, les
résidus d’antibiotiques dans la viande ou le lait destinés à la consommation humaine et les
résidus de médicaments dans l’eau du robinet (Stackelberg et al., 2007; Garcia-Ac et al.,
2009; Vulliet et al., 2009), phénomènes de plus en plus vulgarisés et médiatisés, étendent
jusqu’à l’Homme les risques représentés par les molécules pharmaceutiques.
Il y a donc un intérêt fort à étudier les molécules pharmaceutiques pour :

- identifier leurs sources dans le milieu et ainsi tenter de réduire leurs apports
(diminution de leur utilisation avec par exemple l’interdiction depuis 2006 d’utiliser
les antibiotiques comme promoteurs de croissance chez les animaux d’élevage),
- comprendre leur devenir depuis leur excrétion de l’organisme, humain ou animal,
jusqu’au milieu naturel (dégradation abiotique et biotique, persistance) et ainsi tenter
de les éliminer à des endroits stratégiques comme les stations d’épuration par
exemple,
29
- connaître leur répartition entre les différents compartiments (eau, boue, sédiment, etc.)
et ainsi identifier les zones de stockage et les sources secondaires potentielles,
- préciser les dangers qu’ils représentent d’après leurs effets secondaires, leurs sites
d’action en médecine humaine ou vétérinaire (exemple : récepteurs -adrénergiques)
et la présence de ces mêmes sites d’action dans les organismes pour lesquels ils ne
sont pas destinés. Les dangers peuvent également être évalués au travers d’études de
modélisation ou de tests écotoxicologiques pratiqués sur des cellules ou des
organismes entiers de différents niveaux trophiques (bactérie, phytoplancton,
zooplancton, poisson).
L’ensemble des informations ainsi recueillies par les scientifiques doivent permettre aux
pouvoirs publics de prendre des décisions. A l’heure actuelle, il n’existe pas de
réglementation spécifique à la présence des molécules pharmaceutiques dans
l’environnement. Elles sont englobées dans des directives plus larges relatives à la qualité
chimique et biologique de l’eau (exemple : directive cadre sur l’eau). Néanmoins,
l’engagement 103 du Grenelle Environnement prévoit la « maitrise des risques liés aux
résidus médicamenteux » ; et « l’amélioration de la connaissance et la réduction des risques
liés aux rejets de médicaments dans l’environnement » constitue la cinquième mesure phare
du deuxième plan national santé-environnement (PNSE 2, 2009-2013). Ainsi pour atteindre
ces objectifs, il a été mis en place, par les ministères en charge de la santé et de
l’environnement, un Plan National sur les Résidus de Médicaments dans l’Eau (PNRM) dont
les deux axes sont (i) l’évaluation et (ii) la gestion des risques sanitaires et environnementaux.
A terme, ces mesures devraient permettre de passer d’une surveillance exploratoire à une
surveillance réglementaire.
En conséquence, la présence, le devenir et l’impact dans les systèmes naturels des molécules
pharmaceutiques suscitent un vif intérêt et sont des enjeux majeurs de connaissances. Le
développement d’outils et de méthodes permettant leurs analyses dans diverses matrices
environnementales devient alors un enjeu scientifique important. De par leur mode de
consommation, humaine ou vétérinaire, les molécules pharmaceutiques peuvent atteindre tous
les milieux aquatiques et terrestres. Par conséquent, il faut que les méthodologies soient
applicables à une large gamme de matrices environnementales, des matrices les moins
concentrées et les moins chargées en matière organique comme les eaux de boisson aux
matrices les plus chargées telles que les lisiers porcins. C’est dans ce contexte que ces travaux
de thèse s’inscrivent.
Ce manuscrit s’articule en 6 chapitres. Une synthèse bibliographique sur l’état des

connaissances constitue le chapitre 1. Ce chapitre présente des généralités relatives aux
molécules pharmaceutiques comme leurs sources d’introduction dans l’environnement, leur
devenir dans les stations d’épuration et dans le milieu naturel ou encore l’étendue et le niveau
de la contamination des systèmes aquatiques. Cette première partie comporte également un
paragraphe détaillé sur les dangers toxicologiques et écotoxicologiques que représentent les
médicaments. Elle présente aussi les différents programmes de recherche européens et
français s’intéressant à la pollution de l’environnement par les molécules pharmaceutiques.
Le deuxième chapitre de ce manuscrit justifie le choix des composés étudiés notamment au

travers des données de consommation. La présentation des 78 molécules sélectionnées y est
réalisée. La sélection des molécules est ensuite comparée à celle d’autres études françaises ou
à celle d’organisme de référence comme l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Aliments (AFSSA).
30
En s’appuyant sur une synthèse bibliographique, la première partie du chapitre 3 a pour

objectif de présenter les différentes techniques qui existent pour analyser les molécules
pharmaceutiques dans diverses matrices environnementales, depuis le prélèvement des
échantillons jusqu’à leur analyse à proprement parler en passant par leur traitement pour
maximiser les performances analytiques. Les méthodes d’analyse mises en œuvre au cours de
ces travaux sont décrites dans la suite de ce chapitre. Les sites d’études et les stratégies
d’échantillonnage y sont détaillés. Le traitement des échantillons depuis le prélèvement
jusqu’à l’étape d’évaporation/reconcentration, ultime étape avant l’analyse, y figure de façon
succincte.
Les développements méthodologiques, portant sur les étapes d’extraction, d’évaporation/

reconcentration et d’analyse, réalisés au cours de ces travaux de thèse sont présentés dans le
chapitre 4. Les protocoles finaux aux quels ils ont permis d’aboutir, en particulier les
méthodes d’analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de
masse en tandem, sont récapitulés dans ce chapitre. Ces développements ont fait l’objet de 2
publications qui sont visibles à la fin de ce manuscrit. Une attention particulière a été portée à
la qualité des résultats qui pouvaient être fournis lors d’analyse de composés organiques
présents à l’état de traces. Ce travail a fait l’objet d’une troisième publication qui apparaît
également à la fin de ce manuscrit.
La contamination de l’environnement par les molécules pharmaceutiques peut provenir de

leur utilisation en médecine humaine ou en médecine vétérinaire. Selon la source de
contamination, rejets humains ou vétérinaires, le type de composés et le type de matrice à
analyser ne seront pas les mêmes. Ces deux volets ont été étudiés au cours de ces travaux de
thèse et constituent respectivement la première et la deuxième partie du chapitre 5. La
première partie traite donc essentiellement de l’origine humaine de la contamination de
l’environnement (eaux usées et rejets de stations d’épuration). Elle concerne la contamination
des eaux (eaux usées, eaux de surface et eaux souterraines) par l’ensemble des molécules
pharmaceutiques étudiées. Les résultats des analyses conduites dans le cadre des projets
« continuum Hérault » et FLASH (Devenir des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries
Antibiorésistantes dans les Systèmes Hydriques de surface) y sont rapportés. La deuxième
partie traite de l’origine vétérinaire de la contamination de l’environnement en se focalisant
sur la présence et le devenir des antibiotiques dans les déchets d’élevage tels que les lisiers
porcins. Elle est dédiée aux résultats obtenus dans le cadre du projet DIPERPHA (Dynamique
et Impact des Perturbateurs endocriniens et des composés Pharmaceutiques issus des élevages
agricoles). Les résultats du suivi sur 5 mois du devenir des antibiotiques dans une fosse à
lisier sur des exploitations possédant un système simple de traitement des déchets ainsi que
les résultats des suivis le long des filières de traitement dans des exploitations possédant des
systèmes complexes de traitement des déchets y sont présentés. L’influence du stade
physiologique des animaux sur le niveau de la contamination des lisiers a été étudiée et les
résultats sont exposés dans cette partie. Enfin, l’étude de la dégradation des antibiotiques
dans des réacteurs en conditions contrôlées est rapportée avec les principaux résultats.
Le chapitre 6 est dédié à l’échantillonnage passif, au développement des POCIS (Polar

Organic Chemical Integrative Sampler) comme outil de prélèvement et de pré-concentration
et à leur application dans le milieu naturel.
Enfin, la dernière partie du manuscrit est consacrée aux conclusions et aux perspectives
découlant de ces différents travaux.
31
32
CHAPITRE 1
Généralités
33
34
Chapitre 1 : Généralités
I. GENERALITES SUR LES MOLECULES PHARMACEUTIQUES ................................................................. 36

I.1. Définition ................................................................................................................................ 36
I.2. Importance de la problématique ................................................................................................ 36
II. LES DIFFERENTES CLASSES DE MOLECULES PHARMACEUTIQUES ..................................................... 38
II.1. Douleurs et fièvres ................................................................................................................... 40
II.2. Troubles respiratoires ............................................................................................................... 40
II.3. Troubles gastriques .................................................................................................................. 41
II.4. Troubles / contrôles hormonaux................................................................................................ 42
II.5. Les médicaments de l’impuissance ........................................................................................... 42
II.6. Troubles du comportement et de l’humeur ................................................................................ 42
II.7. Troubles cardiaques ................................................................................................................. 43
II.8. Infections bactériennes ............................................................................................................. 45
II.9. Cancers .................................................................................................................................... 46
II.10. Infections virales ...................................................................................................................... 48
II.11. Traitements vétérinaires ........................................................................................................... 48
III. ORIGINE DANS L’ENVIRONNEMENT .............................................................................................. 51
IV. DEVENIR ...................................................................................................................................... 54
IV.1. Devenir dans les stations d’épuration ........................................................................................ 55
IV.2. Devenir dans l’environnement .................................................................................................. 60
V. PRESENCE DANS L’ENVIRONNEMENT ................................................................................................ 60
V.1. Les effluents hospitaliers .......................................................................................................... 65
V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP)................................................................................... 67
V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP).................................................................. 70
V.4. Les eaux de surface .................................................................................................................. 73
V.5. Les eaux souterraines ............................................................................................................... 76
V.6. Les eaux de boisson ................................................................................................................. 77
V.7. Les boues des STEP ................................................................................................................. 79
V.8. Les effluents d’élevage et les sols amendés avec les effluents d’élevage .................................... 81
V.9. Les sédiments .......................................................................................................................... 83
VI. TOXICITE ET ECOTOXICITE .......................................................................................................... 84
VI.1. Toxicité ................................................................................................................................... 84
VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments ............................................................................. 84
VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés .......................................................................................... 85
VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC50, LOEC, NOEC, etc.) .......................................................................... 86
VI.2. Antibiorésistance ..................................................................................................................... 91
VI.3. Evaluation du risque environnemental ...................................................................................... 92
VI.3.1. La démarche de l’évaluation du risque environnemental ................................................................... 92
VI.3.2. Application de l’évaluation du risque environnemental...................................................................... 95
VII. LEGISLATION ............................................................................................................................... 97
VIII. PROJETS DE RECHERCHE ............................................................................................................. 99
VIII.1. Européens ................................................................................................................................ 99
VIII.2. Français ................................................................................................................................. 100
Ce chapitre commence par définir le terme « molécules pharmaceutiques » et par présenter les
différentes molécules pharmaceutiques. Il développe ensuite leurs sources d’introduction dans
l’environnement, leur devenir dans les stations d’épuration et dans le milieu naturel et
l’étendue et le niveau de la contamination des systèmes aquatiques. Puis il comporte un
paragraphe détaillé sur les dangers toxicologiques et écotoxicologiques que représentent les
médicaments. Enfin, il expose la législation et les différents programmes de recherche
européens et français s’intéressant à la pollution de l’environnement par les molécules
pharmaceutiques.
35
I. Généralités sur les molécules pharmaceutiques

I.1. Définition
Dans le langage courant, pour parler de quelque chose qui soigne, le terme de « médicament »
est employé. Un médicament est « une substance active utilisée pour traiter une affection, une
manifestation morbide » (Grand Robert de la langue française). Dans la directive 2001/83/CE
du parlement européen et du conseil du 6 novembre 2001, un médicament est défini comme
« toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou
préventives à l'égard des maladies humaines » ; ou encore comme « toute substance ou
composition pouvant être administrée à l'homme en vue d'établir un diagnostic médical ou de
restaurer, corriger ou modifier des fonctions physiologiques chez l'homme » (European
Commission, 2001a). Ces définitions sont également applicables aux médicaments
vétérinaires qui sont administrés aux animaux (European Commission, 2001b). Le point
commun entre ces définitions est le terme substance.
Dans la pratique, les médicaments peuvent être fabriqués par différents laboratoires. Ils
portent alors un nom différent bien qu’ils contiennent la même substance dite « matière
active » ou « principe actif ». C’est cette dernière qui est responsable des propriétés
pharmacologiques du médicament, et c’est cette molécule chimique qui est étudiée lorsque
sont mises en œuvre des analyses chimiques pour observer la contamination de
l’environnement. On emploie alors le terme de « molécules pharmaceutiques » plutôt que
celui de médicaments.
I.2. Importance de la problématique
Suite à l’émergence d’outils analytiques capables de détecter des molécules présentes à l’état
de traces et suite à la mise en évidence d’effets biologiques liés à la présence de ces mêmes
molécules, un nouveau groupe de polluants, appelé les contaminants émergents, a été
reconnu. Les molécules pharmaceutiques font partie de ce groupe. Elles sont considérées
comme des contaminants de l’environnement depuis une trentaine d’années environ.
Cependant, cette problématique n’a réellement pris de l’ampleur qu’au cours de la dernière
décennie si on en juge par le nombre croissant d’articles scientifiques publiés sur ce sujet
(Figure 1).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les polychlorobiphényles (PCB) sont

reconnus depuis plus longtemps comme polluants chimiques de l’environnement. Une rapide
étude bibliométrique sur le nombre d’articles scientifiques parus en 1990, 2000 et 2010 sur le
sujet de la contamination de l’environnement par les molécules pharmaceutiques, les HAP et
les PCB met en avant la croissance de la part prise par les molécules pharmaceutiques dans
les études environnementales (Figure 2).
Les études environnementales sur les molécules pharmaceutiques se répartissent en différents

thèmes de recherche :
- développement de techniques et de protocoles analytiques,
- analyse de leur présence dans le milieu,
- étude de leur devenir,
- impact des procédés de traitement sur elles,
- observation de leur toxicité,
36
- évaluation du risquenombre
environnemental et sanitaire
d'articles scientifiques relatifs auxqu’elles
substancesreprésentent.
pharmaceutiques publiées ces 20 dernières années
225
200
nombre d'articles
175
150
125
100
75
50
25
0
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
Figure 1 : Répartition par année, sur les 20 dernières années, du nombre d'articles scientifiques publiés
dans des revues à comité de lecture sur la problématique de la contamination de l’environnement par les
molécules pharmaceutiques.
(résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes « pharmaceutical
» or « emerging contaminant » et « environment » à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en
importance relative
sélectionnant les thèmes suivant : « pharmacology, du nombre
toxicology d'articles
and pharmaceutics », « environmental science », «
chemistry », « biochemistry, geneticscientifiques publiésbiology
and molecular sur le thème
», «deagricultural
la and biological sciences » et «
contamination de l'environnement par les
multidisciplinary » ; et en éliminant les revues médicales, pharmacologiques ou de synthèse chimique)
substances pharmaceutiques, les HAP et les
PCB en 2000
pharma. PCB HAP
1990 2000 2010
21% 27%
28% 30%
38% 45%
51% 35% 25%
Figure 2 : Importance relative du nombre d'articles scientifiques, à comité de lecture, publiés en 1990,
2000 et 2010 sur les thématiques de la contamination de l'environnement pas les molécules
pharmaceutiques (pharma.), les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les
polychlorobiphényles (PCB).
(pharma. : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «
pharmaceutical » or « emerging contaminant » et « environment » à rechercher dans le titre, le résumé ou les
mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : « pharmacology, toxicology and pharmaceutics », «
environmental science », « chemistry », « biochemistry, genetic and molecular biology », « agricultural and
biological sciences » et « multidisciplinary » ; et en éliminant les revues médicales, pharmacologiques ou de
synthèse chimique.
HAP : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes « PAH » et
« environment » à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «
environmental science », « pharmacology, toxicology and pharmaceutics », « engineering », « agricultural and
biological sciences », « earth and planetary sciences », « chemistry », « biochemistry, genetic and molecular
biology », « energy », « chemical engineering », « immunology and microbiology » et « multidisciplinary ».
PCB : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes « PCB » et
« environment » à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «
environmental science », « pharmacology, toxicology and pharmaceutics », « engineering », « agricultural and
biological sciences », « earth and planetary sciences », « chemistry », « biochemistry, genetic and molecular
biology », « materials science », « chemical engineering », « immunology and microbiology » et «
multidisciplinary ».)
37
La Figure 3, provenant des résultats d’une étude bibliographique réalisée au cours du projet
KNAPPE (www.knappe-eu.org, 16/11/2010), présente la répartition des articles publiés entre
ces différents thèmes de recherche. Il apparaît qu’à la fin des années 90, les études portaient
majoritairement sur la présence des molécules pharmaceutiques alors qu’à la fin des années
2000, elles semblent davantage porter sur la toxicité et les risques représentés par ces produits
ainsi que sur les moyens de les éliminer.
100%
proportion de la littérature (%)
80%
Evaluation du risque
60% Toxicité
Général
40% Analyses
Devenir
20%
Processus traitement
Présence
0%
1998
1999
2000
2002
2003
2004
2005
2007
2008
2001
2006
< 1998
Figure 3 : Répartition des articles scientifiques publiés sur les molécules pharmaceutiques entre les
différents thèmes de recherche entre 1998 et 2008 (graphique extrait et traduit du projet KNAPPE).
II. Les différentes classes de molécules pharmaceutiques

Le dictionnaire Vidal 2010 répertorie 5000 médicaments. L’AFSSA recense 3000 molécules
pharmaceutiques à usage humain et 300 à usage vétérinaire. Il existe donc un très grand
nombre de molécules pharmaceutiques. Elles peuvent être classées selon différents critères :
leur mode d’action, leur indication thérapeutique ou leur structure chimique. Depuis 1976,
l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) les classe selon la classification ATC
(Anatomique, Thérapeutique, Chimique) qui s’est inspirée de la classification anatomique
développée par l’ « European Pharmaceutical Market Research Association » (EphMRA) et le
« Pharmaceutical Business Intelligence and Research Group » (PBIRG) (OMS, 2003). Dans
le système ATC, les molécules pharmaceutiques sont réparties selon l’organe sur lequel elles
agissent et/ou leurs caractéristiques thérapeutiques et chimiques. Cette classification
comprend 5 niveaux : le premier niveau est le niveau « anatomique » ; le deuxième, le niveau
« thérapeutique » ; le troisième, le niveau « thérapeutique/pharmacologique » ; le quatrième,
le niveau « chimique/thérapeutique/ pharmacologique » ; le cinquième niveau est celui de la
« substance chimique » (AFSSAPS, 2010). Les deux premiers niveaux de ce classement sont
présentés Figure 4 (OMS, 2009). De la même façon, il existe un classement ATC pour les
molécules pharmaceutiques à usage vétérinaire. Le classement ATCvet est basé sur le
classement ATC de la médecine humaine mais toute la nomenclature est précédée de la lettre
Q. Ainsi, par exemple, dans le classement ATC humain l’amoxicilline possède le code
J01CA04 et dans le classement ATCvet, le code QJ01CA04.
Ces classements sont exhaustifs mais présentent l’inconvénient de répertorier plusieurs fois
une même molécule selon l’organe sur lequel elle agit. Par exemple, la molécule
d’érythromycine se retrouve en D10AF02 quand elle est administrée sous forme de crème
38
pour le traitement de l’acné, en J01FA01 quand elle est administrée comme antibiotique pour
traiter des infections pulmonaires et en S01AA17 quand elle est administrée en
ophtalmologie. Il serait donc beaucoup trop lourd de passer en revue tout ce classement pour
faire l’état de l’art sur les molécules pharmaceutiques. Dans un souci de simplification, les
principales molécules seront donc présentées en fonction des maux ou maladies courantes
auxquelles elles se rapportent.
A- Voies Digestives et Métabolisme B- Sang et organes hématopoïétiques

A01 préparations stomatologiques B01 antithrombotiques
A02 médicaments pour les troubles de l’acidité B02 antihémorragiques
A03 médicaments pour les troubles fonctionnels gastro-intestinaux B03 préparations antianémiques
A04 antiémétiques and antinauséeux B05 substituts du sang et solution de perfusion
A05 thérapie hépatique (bile et foie) B06 autres agents hématologiques
A06 laxatives
A07 antidiarrhéique, antiinflammatoire intestinal/ agent antiinfectieux C- Système cardio-vasculaire
A08 préparations antiobésité, à l’exclusion des produits diététiques C01 médicaments en cardiologie
A09 médicaments de la digestion C02 antihypertenseurs
A10 médicaments du diabète C03 diurétiques
A11 vitamines C04 vasodilatateurs périphériques
A12 suppléments minéraux C05 vasculoprotecteurs
A13 toniques C07 bétabloquants
A14 anabolisants à usages systémique C08 inhibiteurs calciques
A15 stimulants de l’appétit C09 médicaments du système rénine-angiotensine
A16 autres médicaments du système digestif et du métabolisme C10 hypolipidémiants
D- Médicaments dermatologiques G- Médicaments du système génito-urinaire et hormones sexuelles

D01 antifongiques pour usage dermatologique G01 antiinfectieux et antiseptiques gynécologiques
D02 émollients et protecteurs G02 autres médicaments gynécologiques
D03 préparations pour traitement des plaies et ulcères G03 hormones sexuelles et modulateurs de système génital
D04 antiprurigineux incluant les anesthésiques G04 médicaments urologiques
D05 médicaments contre le psoriasis
D06 antibiotiques et anticancéreux pour usage dermatologique H- Hormones systémiques, hors hormones sexuelles et insulines
D07 préparations dermatologiques corticoïdes H01 hormones hypophysaires et analogues
D08 antiseptiques et désinfectants H02 corticoïdes à usage systémiques
D09 pansements médicamenteux H03 médicaments de la thyroïde
D10 préparations antiacnéiques H04 hormones pancréatiques
D11 autres préparations dermatologiques H05 médicaments de l’équilibre calcique
J- Antiinfectieux M- Muscles et squelette

J01 antibactériens à usage systémique M01 antiinflammatoires et antirhumatismal
J02 antimycosiques à usage systémique M02 produits topiques pour douleurs articulaire et musculaire
J04 antimycobactériens M03 myorelaxants
J05 antiviraux à usage systémique M04 antigoutteux
J06 immunsérums et immunoglobulines M05 médicaments des désordres osseux
J07 vaccins M09 autres médicaments des désordres musculaires et osseux
L- Antinéoplasiques et immunomodulateurs N- Système nerveux

L01 antinéoplasiques N01 anesthésiques
L02 thérapeutique endocrine N02 analgésiques
L03 immunostimulants N03 antiépileptiques
L04 immunosuppresseurs N04 antiparkinsoniens
N05 psycholeptiques
P- Produits antiparasitaires, insecticides et répellants N06 psychoanaleptiques
P01 antiprotozoaires N07 autres médicaments du système nerveux
P02 anthelminthiques
P03 antiparasitaires externes, incluant scabicides, insecticides et R- Système respiratoire
répellants R01 préparations nasales
V- Divers R02 préparations pour la gorge
V01 allergènes R03 médicaments des syndromes obstructifs des voies aériennes
V03 tous autres médicaments R05 médicaments rhume et toux
V04 médicaments pour le diagnostic R06 antihistaminiques à usage systémique
V06 nutriments R07 autres médicaments du système respiratoire
V07 tous autres produits non-thérapeutiques
V08 produits de contrastes S- Organes sensoriels
V09 diagnostic radiopharmaceutique S01 médicaments ophtalmologiques
V10 thérapeutique radiopharmaceutique S02 médicaments otologiques
S03 préparations ophtalmologiques et otologiques
Figure 4 : Niveau 1 et 2 du classement ATC humain (OMS, 2009).
39
II.1. Douleurs et fièvres
Généralement ces deux symptômes sont soignés par les mêmes médicaments. La sensation de
douleur est traitée par les antalgiques (ou analgésiques). Ils agissent soit directement sur les
centres de la douleur situés dans le cerveau, soit en bloquant la transmission de la douleur au
cerveau. Cependant, ils ne soignent pas les causes de la douleur. La fièvre est soignée par les
antipyrétiques. Ces médicaments sont utilisés pour abaisser la température du corps. Les anti-
inflammatoires sont des molécules qui ont à la fois des propriétés antalgiques et
antipyrétiques mais qui luttent en plus contre l'inflammation c'est-à-dire la réaction naturelle
de défense de l’organisme. Ils peuvent être dérivés de la cortisone (anti-inflammatoires
stéroïdiens) ou non (anti-inflammatoires non stéroïdiens, AINS). Enfin, les morphiniques sont
des molécules apparentées à la morphine. La morphine est une molécule extraite du pavot qui
possède des propriétés sédatives et antalgiques puissantes. Le Tableau 1 donne des exemples
de molécules pharmaceutiques entrant dans la composition de ces médicaments et résume
leurs modes d’action.
Tableau 1 : Mode d’action des principaux antalgiques.
mode d’action
classe exemple de exemple de (http://www.biam2.org, 07/10/10 ; dictionnaire Vidal, 2006 ;
thérapeutique molécules médicament http://www.adrenaline112.org/urgences/DPharmaco/AntalGen.html,
07/10/10)
analgésique paracétamol Doliprane baisse le taux des prostaglandines dans l’hypothalamus

anti-inflammatoire aspirine (acide Aspégic inhibe les enzymes cyclooxygénases (COX) impliquées dans la
non stéroïdien acétylsalicylique) Aspro synthèse des prostaglandines
(AINS) ibuprofène Advil
anti-inflammatoire prednisolone Solupred inhibe le recrutement des globules blancs vers le site de l'inflammation
stéroïdien  inhibe l’expression du complexe majeur d'histocompatibilité de
(corticoïde) type II et l’expression des cyclooxygénases de type 2 prévenant ainsi
la production de prostaglandines, inhibe l'activité de la phospholipase
A2, inhibe la sécrétion des cytokines par les lymphocytes T, inhibe la
prolifération des lymphocytes B et des cytokines impliquées dans la
synthèse des immunoglobulines
morphinique codéine Codenfan agoniste des récepteurs morphiniques μ
mineur
morphinique morphine Actiskenan bloque les synapses dans le cheminement central de la douleur,
majeur agoniste des récepteurs morphiniques μ, δ et κ
II.2. Troubles respiratoires
Les quintes de toux et l’essoufflement sont les deux symptômes majeurs des troubles
respiratoires. Ils proviennent de l’inflammation (ex. : asthme, bronchite, pneumonie,
bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO)), l’encombrement ou la destruction des
bronches (ex. : mucoviscidose) ou du rétrécissement des voies aériennes (ex. : asthme,
BPCO).
Suivant le type de toux, sèche ou grasse, les médicaments utilisés ne sont pas les mêmes.
Ainsi, en cas de toux sèche ou irritative, des antitussifs seront recommandés. Ils agissent
directement sur le centre de commande cérébrale provoquant le réflexe de toux. On distingue
les antitussifs opiacés qui peuvent contenir de la codéine par exemple, des antitussifs
antihistaminiques comme l’oxomémazine contenu dans Toplexil par exemple. Les toux
40
grasses sont dues à une accumulation, dans les poumons, de mucus qu’il faut éliminer. Dans
ces cas là, des fluidifiants bronchiques sont administrés. Les molécules les plus connues de
cette classe sont l’acétylcystéine (Exomuc ) et la carbocistéine (Bronchokod). Elles agissent
sur la structure des sécrétions en rompant les ponts disulfures des glycoprotéines (dictionnaire
Vidal, 2006).
L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches. Elle est la conséquence de
l’action d’un agent irritant sur les bronchioles : elles se contractent tout en secrétant du mucus
de manière importante. Les antiasthmatiques visent à réduire cette réaction, en limitant la
réaction inflammatoire (corticoïdes) ou en provoquant la dilatation des bronches pour faciliter
le passage de l’air (anticholinergiques, agonistes sélectifs -2 adrénergique…). Le
bronchodilatateur le plus connu est la Ventoline  dont le principe actif est le salbutamol.
Après inhalation, le salbutamol exerce une action stimulante sur les récepteurs -2 du muscle
lisse bronchique, entraînant ainsi une bronchodilatation rapide (dictionnaire Vidal, 2006).
II.3. Troubles gastriques
Les troubles gastriques sont de nature très diverse ; par conséquent les médicaments de ce
groupe ont des propriétés et des modes d’actions également très différents.
Tableau 2 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles gastriques et leurs modes
d’action.
classe exemple de exemple de mode d’action

thérapeutique molécules médicament (http://www.biam2.org, 07/10/10 ; dictionnaire VIDAL, 2006)
antispasmodique phloroglucinol Spasfon agit directement sur la fibre lisse et se comporte comme un antagoniste du
musculotrope alvérine Meteospasmyl calcium au niveau de la membrane cellulaire, élève le 3'5'AMP par
inhibition de la phosphodiestérase
pansement gastrique diméticone Pepsane forme une pellicule protégeant la muqueuse gastrique (produit neutre, actif
par ses propriétés physiques)
antiacide pantoprazole Eupantol pro drogue qui, après activation en milieu acide dans les cellules pariétales
de la muqueuse gastrique, inhibe sélectivement et de manière irréversible la
pompe ATPasique proton/potassium et s'oppose au transport du proton vers
la lumière gastrique
anti-ulcéreux famotidine Pepdine antagoniste compétitif de l'histamine sur les récepteurs H2, réduit le volume
de la sécrétion gastrique ainsi que la production d'acide et de pepsine
antiémétiques métopimazine Vogalene agit spécifiquement au niveau des récepteurs de la Trigger Zone (centre du
vomissement), activité antidopaminergique élective
laxatif osmotique macrogol Forlax entraîne un accroissement du volume des liquides intestinaux

laxatif lubrifiant paraffine Lansoyl agit par action mécanique en lubrifiant le contenu colique

antidiarrhéique lopéramide Imodium stimule l'absorption d'eau et d'électrolytes, diminue la sécrétion des fluides
et des électrolytes vers la lumière intestinale, ralentit le transit (fixation sur
les récepteurs morphiniques cérébraux et sur les entérocytes intestinaux)
Les médicaments des troubles gastriques sont :

- les antispasmodiques qui luttent contre les spasmes en empêchant la contraction de
fibres musculaires présentes dans la paroi de l'intestin ou des voies urinaires ;
- les antiacides qui neutralisent l'acidité des sécrétions gastriques ou qui bloquent les
glandes responsables de la sécrétion d'acide ;
41
- les antiulcéreux qui peuvent être des antihistaminiques de type H2. Ces
antihistaminiques s’opposent aux effets de l’histamine qui est, entre autre, impliquée dans la
sécrétion du suc gastrique ;
- les antiémétiques qui luttent contre les vomissements ;
- les laxatifs qui facilitent le transit et l'élimination des selles ;
- les antidiarrhéiques qui regroupent les anti-sécrétoires et les ralentisseurs du transit.
Le Tableau 2 donne des exemples de molécules pharmaceutiques entrant dans la composition

de ces médicaments et résume leurs modes d’action.
II.4. Troubles / contrôles hormonaux
Ce groupe comprend les hormones administrées pour compenser les déficits naturels, lors du
traitement de la ménopause ou de l’hypothyroïdie par exemple, et les hormones synthétiques
administrées pour leurs effets contraceptifs. Quelques exemples sont donnés dans le Tableau
3.
Tableau 3 : Exemples de médicaments impliqués dans les contrôles hormonaux.

exemple de exemple de mode d’action
classe thérapeutique
molécules médicament (dictionnaire Vidal, 2006)
hormone sexuelle éthinylestradiol Jasminelle inhibe l'ovulation et modifie l'endomètre
contraceptive de synthèse
hormone thyroïdienne lévothyroxine Levothyrox  augmente essentiellement la consommation tissulaire d'oxygène, le
métabolisme de base, le rythme cardiaque
hormone sexuelle 17  estradiol Oromone remplace l'arrêt de production des estrogènes chez les femmes
naturelle ménopausées, soulage les symptômes de la ménopause et prévient
l’ostéoporose
II.5. Les médicaments de l’impuissance
Ce sont les inhibiteurs de la phosphodiestérase de type 5 (inhibiteurs PDE 5) comme le

sildénafil citrate, le vardénafil et le tadalafil contenu respectivement dans le Viagra, le
Levitra et le Cialis (Nieto et al., 2010a). En inhibant sélectivement la phosphodiestérase de
type 5 responsable de la dégradation de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) au
niveau des corps caverneux, le sildénafil entraîne une augmentation des concentrations de
GMPc ce qui induit un relâchement des muscles lisses du corps caverneux et favorise l’afflux
sanguin (dictionnaire Vidal, 2006). Le sildénafil peut également être prescrit pour des
problèmes d’hypertension artérielle pulmonaire (Revatio).
II.6. Troubles du comportement et de l’humeur
Ce groupe comprend les antidépresseurs, les anxiolytiques, les antipsychotiques, les

anticonvulsivants et les antiparkinsoniens.
Les antidépresseurs agissent contre la dépression mais aussi contre les troubles obsessionnels
compulsifs. Ils sont divisés en 3 familles en fonction de leurs modes d'action et de leurs effets
indésirables : les antidépresseurs tricycliques dérivés de l’imipramine, les inhibiteurs de la
recapture de la sérotonine (IRS) et de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline
42
(IRSNA) et les inhibiteurs de la monoamine-oxydase (IMAO, sélectifs ou non sélectifs). Les

anxiolytiques luttent contre le stress et les angoisses. Les antipsychotiques traitent les délires
et les hallucinations. Les anticonvulsivants sont utilisés pour traiter les différentes formes
d'épilepsie. Ils sont classés en barbituriques (phénobarbital) et non barbituriques (http://
www.eurekasante.fr/Lexique-medical/A.html, 07/10/10). Enfin, les antiparkinsoniens sont
destinés à lutter contre les symptômes de la maladie de Parkinson. Les plus utilisés des
antiparkinsoniens stimulent ou remplacent l'action de la dopamine sur les centres
dopaminergiques du cerveau et d’autres empêchent sa dégradation par la catéchol-o-
méthyltransférase (COMT) et la monoamine oxydase (MAO), ce sont les inhibiteurs de la
COMT (ICOMT) ou de la MAO (http://www.eurekasante.fr/maladies/systeme-nerveux
/maladie-parkinson.html?pb=traitement, 22/11/10). Le Tableau 4 donne des exemples de
médicaments agissant sur les troubles du comportement et de l’humeur. Il résume aussi leurs
modes d’action.
Tableau 4 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles du comportement et de
l’humeur et leurs modes d’action.

thérapeutique molécules médicament (http://www.biam2.org, 07/10/10)
antidépresseur imipramine Tofranil s'oppose au recaptage de la noradrénaline au niveau de la
tricyclique amitriptyline Laroxil membrane axonale, inhibe le recaptage de la sérotonine dans le
cerveau surtout au niveau de l'hypothalamus et empêche l'action
des hydroxylases des microsomes hépatiques sur les barbituriques
(éphédrine et amphétamine)
antidépresseur IRS fluoxétine Prozac facilite la transmission sérotoninergique en inhibant la recapture
de la sérotonine
antidépresseur IRSNA venlafaxine Effexor inhibe de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline

antidépresseur IMAO moclobémide Moclamine inhibe préférentiellement et de façon réversible la monoamine
sélectif oxydase de type A
antidépresseur IMAO iproniazide Marsilid inhibe la dégradation des monoamines cérébrales : indolamines
non sélectif (tryptamine et sérotonine) et catécholamines (dopamine,
noradrénaline, adrénaline)
anxiolytique bromazépam Lexomil agoniste du récepteur aux benzodiazépines ce qui favorise l'action
du récepteur GABA et augmente la fréquence d'ouverture du canal
chlore
antipsychotique ripéridone Risperdal antagoniste dopaminergique D2 et puissante activité antagoniste
5-HT2
anticonvulsivant carbamazépine Tégrétol antagoniste des récepteurs centraux à l'adénosine, s'oppose à
l'augmentation des taux d'AMP cyclique, bloque les canaux
sodiques voltage-dépendants
antiparkinsonien lévodopa Sinemet précurseur de la dopamine qui franchit la barrière hémato-
encéphalique et provoque une élévation de la dopamine cérébrale
antiparkinsonien apomorphine Apokinon agoniste dopaminergique stimulant les récepteurs D1 et D2
antiparkinsonien tolcapone Tasmar inhibe la catéchol-O-méthyltransférase responsable de la
dégradation de la dopamine
II.7. Troubles cardiaques
Les troubles cardiaques peuvent être liés à des problèmes de fonctionnement du cœur lui-
même ou peuvent résulter de problèmes circulatoires. Les hypolipémiants (ou
43
hypolipidémiants), les antiarythmiques, les anticoagulants et les -bloquants sont regroupés

dans cette catégorie.
Les hypolipémiants aident à lutter contre le cholestérol. L'excès de cholestérol est un facteur
de risque pour certaines maladies du cœur et des vaisseaux. Il provoque une perte d’élasticité
des artères et réduit leur diamètre (http://www.eurekasante.fr/maladies/coeur-circulation-
veines/ cholesterol.html, 07/10/10). Il existe plusieurs familles d’hypolipémiants qui sont
illustrées dans le Tableau 5.
Tableau 5 : Exemples d'hypolipémiants et leurs modes d'action.

thérapeutique molécules médicament (dictionnaire Vidal, 2006)
les statines atorvastatine Tahor inhibe de façon sélective et compétitive l'HMG-CoA réductase,
l'enzyme responsable du contrôle du taux de biotransformation de la 3-
hydroxy-3-méthyl-glutaryl-coenzyme A en mévalonate, précurseur des
stérols et en particulier du cholestérol
les fibrates fénofibrate Fegenor réduction de la cholestérolémie due à l'abaissement des fractions
athérogènes de faible densité (VLDL et LDL). Elle améliore la
répartition du cholestérol plasmatique en réduisant le rapport cholestérol
total/cholestérol HDL, accru au cours des hyperlipidémies athérogènes
colestyramine colestyramine Questran résine basique synthétique échangeuse d’ions qui fixe les acides biliaires
sous forme d’un complexe insoluble, inhibant ainsi leur cycle
entérohépatique et augmentant leur élimination fécale
ézétimibe ézétimibe Ezetrol inhibe de façon sélective l'absorption intestinale du cholestérol et des
phytostérols apparentés
acide acide Niaspan LP inhibe la libération des acides gras libres à partir des tissus adipeux ce
nicotinique nicotinique qui entraîne une diminution de l’apport d’acides gras libres au niveau du
foie. L’acide nicotinique diminue le taux de synthèse hépatique du
VLDL cholestérol et donc du LDL cholestérol.
oméga 3 triglycérides Ysomega baisse le taux de triglycérides dans le sang
d'acide oméga 3
Les anticoagulants empêchent le sang de coaguler et préviennent ainsi la formation de caillots

dans les vaisseaux sanguins. Ils sont utilisés pour traiter ou prévenir les phlébites, les
embolies pulmonaires et certains infarctus. Ils permettent également d'empêcher la formation
de caillots dans le cœur lors de troubles du rythme comme la fibrillation auriculaire. Il existe
deux grands types d'anticoagulants (Tableau 6) : les anticoagulants oraux qui bloquent l'action
de la vitamine K et les anticoagulants injectables qui sont dérivés de l'héparine
(http://www.eurekasante.fr/Lexique-medical/A.html, 07/10/10).
Tableau 6 : Exemples d'anticoagulants et leurs modes d'action.

thérapeutique molécules médicament (http://www.eurekasante.fr/recherche.html?q=anticoagulant&x=0&y=0)
anti-vitamine K acénocoumarol Sintrom inhibe la synthèse par le foie des facteurs de la coagulation en se
substituant à la vitamine K
anticoagulant oraux rivaroxaban Xarelto inhibe de façon sélective le facteur Xa, une enzyme spécifique de la
coagulation
anticoagulant injectable daltéparine Fragmine héparine de bas poids moléculaire caractérisée par une activité anti-Xa
44
Les antiarythmiques sont indiqués dans les troubles du rythme cardiaque. Le Rythmodan® par
exemple, qui contient du disopyramide, est un inhibiteur des canaux sodiques à effet
stabilisant de membrane. Il modifie la vitesse de transmission de l'influx nerveux au sein du
muscle cardiaque (dictionnaire Vidal, 2006).
Enfin, les -bloquants sont des molécules qui bloquent l’action stimulante de molécules
naturellement présentes dans le corps comme les catécholamines (ex. : l’adrénaline ou la
noradrénaline). Ces molécules stimulent l’appareil cardiovasculaire, la respiration et le
métabolisme. En bloquant leur action, les -bloquants peuvent traiter l’hypertension, la
tachycardie, l’insuffisance cardiaque chronique ainsi que la migraine et le glaucome (sous
forme de collyre) (http://www.cite-sciences.fr/Lexique/definition1.php?definition=2&idmot
=395&iddef=876&idmedia=&page=&rech_lettre=b&num_page=4&recho=&radiob=&resulta
t=&habillage=standard&lang=fr&id_expo=25&id_habillage=42, 24/11/2006). Les -
bloquants agissent par inhibition compétitive. Ils entrent en compétition avec des molécules
naturellement présentes dans le corps pour occuper à leur place leur site d’action à savoir les
récepteurs «  » du système adrénergique mais la fixation des -bloquants n’entraîne pas de
réponse de la part du récepteur (Huggett et al., 2003). Ces molécules se distinguent selon le
type de récepteurs  sur lesquels elles se fixent: les récepteurs 1 qui prédominent dans les
tissus cardiaques et le rein ou les récepteurs 2 situés dans les vaisseaux et les bronches. Les
principaux -bloquants sont l’acébutolol, l’aténolol, le bétaxolol, le bisoprolol, le métoprolol
le nadolol, l’oxprénolol, le pindolol, le propranolol et le timolol. Parmi eux, certains sont
spécifiques des récepteurs 1 (acébutolol, aténolol, bisoprolol, métoprolol) alors que d’autres
sont non sélectifs (nadolol, oxprénolol, pindolol, propranolol, timolol) (Huggett et al., 2003 ;
dictionnaire Vidal, 2006).
II.8. Infections bactériennes
Ce sont les antibiotiques qui permettent de traiter les infections bactériennes. Découverte en
1928 par Alexander Fleming, la pénicilline a été le premier antibiotique introduit en
thérapeutique en 1941 (InVS, 2004) ; depuis, de nombreuses autres molécules ont été
découvertes et sont utilisées comme médicaments. Les antibiotiques sont des molécules
chimiques produites soit de façon naturelle par des micro-organismes (bactéries ou
champignons), soit de façon synthétique (obtenues soit à partir de dérivés artificiels, soit en
recréant des molécules primitivement extraites de micro-organismes), soit de façon semi-
synthétique (obtenues en modifiant en laboratoire une substance produite par un micro-
organisme) (http://crdp.ac-clermont.fr/etabliss/bpambert/eleves/medicaments/antibiotiques
.htm, 19/10/06). Ces molécules agissent à très petites doses en empêchant la croissance
d'autres micro-organismes (bactériostatiques) ou en les détruisant (bactéricides). Leur action
est spécifique car elles dérèglent le métabolisme de certains micro-organismes sans affecter
les cellules humaines ou animales (http://agora.qc.ca/mot.nsf/ Dossiers/Antibiotique,
19/10/06).
Les modes d’action de ces molécules sont variés (Tableau 7) ; certaines inhibent la synthèse
de la paroi bactérienne (ex. : les -lactames) ; d’autres agissent au niveau de la membrane
plasmique (ex. : les polymyxines) ; d’autres encore inhibent la synthèse protéique (ex. : les
macrolides, les phénicolés, les aminosides ou les tétracyclines) ; certaines empêchent le
métabolisme des acides nucléiques (ex. : les quinolones et fluoroquinolones ou les
sulfonamides et les diaminopyridines) ; et d’autres enfin agissent par inhibition compétitive
45
comme antimétabolites (ex. : sulfonamides) (http://www.123bio.net/cours/antibio/modedac

tion.html, 05/10/06).
Tableau 7 : Modes d’action des différentes familles d'antibiotiques.

mode d’action
famille exemple de exemple de (http://www.123bionet/cours/antibio/index.html, 05/10/06 ;
d’antibiotique molécules médicament http://www.omafra.gov.on.ca/french/Livestock/swine/facts/92-101.htm,
05/10/06 ; Beutin et al., 1981)
tétracyclines doxycycline toléxine inhibent la synthèse protéique en empêchant la liaison de l'aminoacyl-
ARNt à la sous unité 30S du ribosome bactérien
phénicolés chloramphénicol inhibent la synthèse protéique en empêchant l'élongation de la chaîne
(ou amphénicols) thiamphénicol peptidique suite à leur fixation sur la sous unité 50S du ribosome
bactérien
pénicillines amoxicilline Augmentin inhibent la synthèse de la paroi bactérienne suite à leur liaison avec les
Clamoxyl  protéines penicillin-binding et surtout à l'inhibition de l'activité des
trans-peptidases impliquées dans la synthèse de la paroi
céphalosporines cefpodoxime Orelox inhibent la synthèse de la paroi bactérienne

sulfonamides sulfaméthoxazole Bactrim anti-métabolite, inhibent la synthèse de l'acide tétrahydrofolique,
(ou sulfamides) triméthoprime cofacteur de la synthèse des bases puriques et pyrimidiques
et triméthoprime
macrolides et roxithromycine Rulid inhibent la synthèse protéique en empêchant l'élongation de la chaîne
lincosamides peptidique suite à leur fixation sur la sous unité 50S du ribosome
bactérien
aminosides (ou streptomycine inhibent la synthèse protéique suite à leur fixation sur la sous unité 30S
aminoglycosides) du ribosome bactérien
quinolones et ofloxacine Oflocet empêchent le métabolisme des acides nucléiques agissent sur la
fluoroquinolones norfloxacine Noroxine topoisomérase IV et sur l'ADN-gyrase bactérienne
glycopeptides vancomycine inhibent la synthèse de la paroi bactérienne

imidazoles métronidazole Birodogyl fonctionnent que chez les bactéries anaérobies en piégeant les électrons
au dépendent de d'autres composants de la chaîne de transfert d'électron
(NAD, NADP)
nitrofuranes furazolidone inhibent des enzymes impliquées dans la dégradation du glucose et du
nitrofurazone pyruvate, agissent au niveau du rein (antagonistes des fluoroquinolones)
polyéthers monensine influencent le transport des ions au travers des membranes cellulaires,
(ou ionophores) salinomycine inhibent le développement des bactéries gram + et stimule la croissance
quinolaxines olaquindox inhibent la synthèse de l'ADN
II.9. Cancers
Egalement appelés antinéoplasiques ou anti-tumoraux, les anticancéreux sont des molécules

cytotoxiques qui ont pour objectif de détruire de façon sélective les cellules malignes issues
de la tumeur d’origine. Deux problèmes se posent en raison de leur sélectivité et de leur
cytotoxicité. Les anticancéreux agissent sur la reproduction et la division cellulaire mais ils
peuvent interagir avec toutes les cellules de l’organisme (http://www.caducee.net/Dossier
Specialises/cancérologie/agentsanticancereux.asp#definition, 24/11/06). Si le point commun
entre tous les anticancéreux est leur cytotoxicité, en revanche, leurs mécanismes d’action sont
très variés (Tableau 8). Certains modifient la structure de l’ADN comme les agents
intercalants (ex. : les anthracyclines telles que l’épirubicine ou la daunorubicine), les agents
alkylants (ex. : le busulfan ou les moutardes azotées comme l’ifosfamide, le
cyclophosphamide ou le chlorambucil) ou la bléomycine qui casse les brins d’ADN. D’autres
46
inhibent la synthèse de l’ADN en empêchant la synthèse des bases puriques et pyrimidiques

(ex. : les antagonistes des folates comme le méthotréxate ou les antimétabolites tels que le 5-
fluorouracile ou la 6-mercaptopurine). D’autres empêchent la re-ligature des brins d’ADN
provoquant ainsi leur coupure définitive, ce qui amène à l’apoptose de la cellule comme les
anti-topoisomérases (ex. : le topotécan ou l’étoposide). Les sels de platines, comme le
cisplatine ou la carboplatine, inhibent la réplication de l’ADN. D’autres encore ont une action
sur la formation du fuseau mitotique comme la vincristine, la vinblastine ou le paclitaxel.
Enfin, l’asparaginase prive les cellules leucémiques d’asparagine, nutriment indispensable et
le tamoxifen est un anti-œstrogène, prescrit pour lutter contre le cancer du sein notamment, et
qui agit par inhibition compétitive sur les récepteurs à œstrogènes (http://www.baclesse.fr
/cours/fondamentale/c15-chimiothérapie/chimio-8.htm, 09/10/06; http://www.med.univ-
rennes1.fr/resped/s/pharmaco/antican/antican.ppt, 24/11/06).
Tableau 8 : Modes d’action des différentes classes anticancéreux.
classes exemple de mode d’action

d’anticancéreux molécules (dictionnaire Vidal, 2006)
antagonistes des méthotréxate inhibe la synthèse de l’ADN en inhibant de façon compétitive l'enzyme
folates dihydrofolate réductase
anti-métabolites 5-fluorouracile bloque la méthylation de l’uracile en thymine en se liant à la thymidilate
synthétase ce qui empêche la synthèse de l'ADN, entraîne des erreurs de
traduction lors de la synthèse des protéines en étant incorporé à la place de
l’uracile dans les ARNs
cytarabine inhibent la synthèse de l'ADN
6-mercaptopurine analogue des purines, bloque la formation d'adénosine et de guanine
agents alkylants mitomycine C, agissent au niveau de l'ADN, empêchent la séparation et la réplication de
agents alkylants, busulfan, l’ADN grâce à leurs groupements alkylés qui permettent d’établir des liaisons
moutardes azotées ifosfamide, covalentes stables entre les groupements nucléophiles des 2 brins de l’ADN
melphalan,
chlorambucil
sels de platine cisplatine, inhibent la séparation et la réplication de l'ADN en se fixant dessus et en
carboplatine produisant des liaisons alkyles responsables de la formation de ponts entre les 2
brins d’ADN
anthracyclines doxorubicine (ou agent intercalant, s'insèrent entre les 2 brins de l'ADN, provoquant des
(antibiotiques) adriamycine), changements de structure de l’ADN et empêchant la progression des ADN et
daunorubicine ARN polymérases ce qui bloque la synthèse d’ADN et d’ARN
anti-topoisomérases irinotécan, anti-topoisomérase I, inhibent l’ADN topo-isomérase I ce qui induit des lésions
topotécan simple brin de l’ADN qui bloquent la fourche de réplication
anti-topoisomérase II, inhibent l’entrée en mitose des cellules tumorales en
ténoposide, inhibant l’ADN topo-isomérase II chargée de ressouder les brins d’ADN après
étoposide leur cassure
anti-hormones tamoxifen antiœstrogène, inhibition compétitive des récepteurs de l’estradiol
autres anticancéreux paclitaxel, agissent au niveau des microtubules, désorganisent le réseau intracellulaire de
docétaxel, microtubules qui est essentiel aux fonctions vitales de l’interphase et de la
vincristine, mitose
vinblastine,
bléomycine casse un des 2 brins de l'ADN
asparaginase enzyme hydrolysant l’asparagine, constituant de base de la substance protéique
cellulaire. Les cellules leucémiques ne peuvent produire elles-mêmes cet acide
aminé, elles doivent utiliser l’asparagine extracellulaire or celle-ci est détruite
par l’asparaginase. La carence en asparagine provoque la destruction des
cellules incapables d’en faire une synthèse endogène
47
II.10. Infections virales
La grippe hivernale et la gastro-entérite sont deux des infections virales les plus courantes.
Dans ces deux cas ce sont essentiellement les symptômes qui sont soignés. La grippe, l’herpès
ou le VIH (Virus Immunodéficience Humaine) sont dus aux rétrovirus. Les rétrovirus sont des
virus dont le génome est formé d’ARN (Acide RiboNucléique) et qui possèdent une enzyme,
la transcriptase inverse, permettant la transcription de cet ARN viral en ADN (Acide
DésoxyriboNucléique) proviral alors capable de s’intégrer au génome de la cellule hôte grâce
à l’action d’une autre enzyme, l’intégrase (http://www.chups.jussieu.fr/polys/pharmaco
/poly/antiretroviraux.html, 27/03 /08). Ces virus ont donc besoin d’infecter une cellule afin de
se servir de la machinerie cellulaire pour se multiplier.
Les antirétroviraux agissent à différents niveaux du cycle de réplication du virus. Dans le cas
de la grippe A (H1N1) par exemple, l’oseltamivir (Tamiflu ) ou le zanamivir (Relenza )
inhibent de façon sélective les neuraminidases du virus. Les neuraminidases sont impliquées
dans la pénétration du virus dans les cellules et dans la libération des particules virales
nouvellement formées. Dans le cas d’herpes, l'acyclovir (Activir  ou Zovirax) après avoir
été phosphorylé en acyclovir triphosphate inhibe la synthèse de l'ADN viral par inhibition
compétitive sélective avec l'ADN polymérase virale (dictionnaire Vidal, 2006).
Les antirétroviraux impliqués dans le traitement du VIH sont répartis en 3 groupes principaux
en fonction de leur mode d’action. Ainsi on distingue les inhibiteurs de fusion, les inhibiteurs
de protéases et les inhibiteurs de la transcriptase inverse (TI) catégorisés en 3 sous-groupes :
les inhibiteurs nucléosidiques, les inhibiteurs non nucléosidiques et les inhibiteurs
nucléotidiques. Les molécules du premier groupe empêchent la particule virale de se lier à sa
future cellule hôte (ex. : l’enfuvirtide, http://www.fda.gov/oashi/aids/virals.html, 27/03/08).
Celles du second agissent sur les protéases qui sont les enzymes responsables du clivage
d’une macro-protéine primaire inactive, fabriquée par la cellule suite à l’intégration du
génome viral au sien, en protéines virales actives plus petites. Ces dernières interviennent
dans la formation de nouvelles particules virales (http://www.aidsmap.com/fr/docs/4
6CBB628-1F92-4882-B5EC-C13096FB620A.asp#522dee 27-7317-4de3-a244-b6afde43e8c3,
26/02/08). L’indinavir, le ritonavir, le nelfinavir ou encore le saquinavir appartiennent à ce
groupe des inhibiteurs de protéase. Enfin, les inhibiteurs de la TI agissent au niveau de
l’enzyme transcriptase inverse, qui intervient dans la transformation de l’ARN viral en ADN.
Sans cette étape, la multiplication virale n’est plus possible. L’efavirenz et la névirapine sont
des inhibiteurs non nucléosidiques de la TI alors que l’abacavir, la lamivudine ou la
zidovudine sont des inhibiteurs nucléosidiques de la TI (http://www.fda.gov/oashi/aids/
virals.html, 27/03/08). Dans le traitement du VIH ces médicaments sont souvent associés par
2 ou 3 (trithérapie).
II.11. Traitements vétérinaires
Il existe 6 classes majeures de médicaments vétérinaires auxquels se rajoutent les vaccins. Il

s’agit des antiparasitaires, des anti-inflammatoires, des antibiotiques, des hormones, des
vitamines et des anesthésiques (http://www.simv.org/Publications/Guide-Medicament/Som-
maire .htm, 28/04/2011).
Les antiparasitaires se partagent entre les antiparasitaires externes et les antiparasitaires

internes. Certains antiparasitaires, les endectocides, agissent à la fois sur les parasites internes
48
et sur les parasites externes. Les antiparasitaires externes sont utilisés dans les traitements
préventifs et curatifs des infestations par les puces, les tiques, la gale et les poux. Bien
qu’administré comme médicaments, la majorité des molécules de cette sous-classe
appartiennent au groupe chimique des pesticides tels que les organophosphorés ou les
phénylpyrazoles. Les antiparasitaires internes agissent sur les vers comme les strongles
pulmonaires et digestifs ou les douves et les coccidies. Les strongylicides se divisent en 3
groupes : i) les benzimidazoles tels que le fenbendazole ou l’oxibendazole ; ii) le lévimazole ;
et iii) les macrolides antiparasitaires comme l’ivermectine ou la doramectine qui peuvent
également agir sur les parasites externes. Certains antibiotiques de la famille des sulfonamides
sont administrés comme anticoccidiens. Des exemples de molécules et leurs modes d’actions
sont répertoriés dans le Tableau 9.
Tableau 9 : Exemple d'antiparasitaires vétérinaires et leurs modes d'actions.

sous-classe
exemple de exemple de animaux mode d’action
d’antiparasitaires
molécules médicament traités (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11)
(famille)
externes fipronil Frontline chiens, inhibe le complexe GABA en se fixant dans le canal chlore,
phénylpyrazole chats bloquant ainsi le transfert des ions chlore ce qui provoque
une activité incontrôlée du système nerveux central et la mort
des insectes et des acariens
endectocides ivermectine Cevamec porcins se lie de manière sélective au récepteur du glutamate des
avermectines canaux à chlorures de la membrane des cellules nerveuses et
musculaires des invertébrés parasites provoquant un blocage
des canaux à chlorures en position ouverte et donc un flux
entrant d'ions chlorures au sein de ces cellules.
L'augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire
aux ions chlorure et l'hyperpolarisation de la cellule
musculaire ou nerveuse qui en résultent conduisent à la
paralysie et à la mort des parasites ciblés.
internes oxibendazole Pig Helm porcins inhibe la polymérisation de la tubuline en microtubules. La
strongylcides destruction du réseau microtubulaire conduit souvent à la
benzimidazole désagrégation et à la mort cellulaire. Il possède une action
ovicide, larvicide et adulticide.
internes levamisole Anthelminticide porcins, agit au niveau des ganglions nerveux du nématode en se
strongylcides 15 % bovins, fixant sur les récepteurs de l'acétylcholine entrainant alors
imidazothiazoles ovins, une paralysie à l'origine de la mort du parasite
volailles
internes oxyclozanide Zanil bovins, perturbe le métabolisme énergétique du parasite en
douvicides suspension ovins découplant la phosphorylation oxydative mitochondriale +
salicylanilides permet le passage de protons à travers les membranes, en
particulier de la membrane mitochondriale interne.
internes décoquinate Rumicox veaux et perturbe le transport des électrons dans le système
anticoccidiens agneaux mitochondrial
sevrés
Comme en médecine humaine, les anti-inflammatoires se répartissent entre les anti-

inflammatoires stéroïdiens (AIS) et non-stéroïdiens (AINS) selon qu’ils sont dérivés de la
cortisone ou non. Les AIS sont utilisés pour traiter les inflammations aiguës de l’appareil
locomoteur (ex. : arthrites), les états inflammatoires ostéoarticulaires, allergiques ou
consécutifs à un choc. Les AINS sont employés pour traiter les inflammations et les douleurs
musculaires ou squelettiques et réduire la fièvre. Des exemples d’anti-inflammatoires et leurs
modes d’action ainsi que les animaux auxquels ils sont administrés sont présentés dans le
Tableau 10.
49
Tableau 10 : Exemple d’anti-inflammatoires vétérinaires et leurs modes d’action.
exemple de exemple de mode d’action

animaux traités
molécules médicament (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11)
déxaméthasone Dexasone équins, bovins, chiens, diminue la réponse immunitaire en inhibant la dilatation des capillaires,
chats, caprins, porcins, la migration des leucocytes et la phagocytose
prédnisolone Megasolone chiens, chats inhibe la phospholipase A2, provoquant une diminution de la synthèse
5 d'acide arachidonique, précurseur de nombreux métabolites pro-
inflammatoires ; induit la synthèse de lipocortines qui possèdent une
activité anti-phospholipase et empêchent la libération d'enzymes hors du
sac lysosomial ; diminue la production d'anticorps et inhibe plusieurs
facteurs du complément ; inhibe la libération d'histamine par les
mastocytes
acide Aspirine 50 veaux, agneaux, inhibe de façon irréversible les enzymes cyclooxygénases impliquées
acétylsalicylique Coophavet chevreaux, porcins, dans la synthèse des prostaglandines ; inhibe l'agrégation plaquettaire en
chevaux, volailles bloquant la synthèse plaquettaire du thromboxane A2
flunixine Meflosyl équins, bovins, porcins inhibe de façon réversible et non sélective les cyclooxygénases
impliquée dans la synthèse des prostaglandines, prostacyclines et
tromboxanes
Les antibiotiques se répartissent en différentes familles telles que les pénicillines et

céphalosporines, les macrolides et lincosamides, les quinolones et fluoroquinolones, les
tétracyclines, les sulfonamides, les aminosides, les polypeptides, les polyéthers et les
phénicolés. Ils sont administrés pour traiter les infections bactériennes de l’appareil
respiratoire, digestif et uro-génital, les panaris interdigités, les mammites, les métrites, les
plaies infectées et les infections post-opératoires. Ils peuvent être utilisés en curatif et/ou en
préventif en milieux infectés dans les élevages. Un exemple de molécule antibiotique par
famille et son mode d’action est récapitulé dans le Tableau 11.
Les hormones comme l’alfaprostol (Alfabédyl) ou le cloprosténol (Planate) sont des

analogues de synthèse de la prostaglandine F2. Elles sont administrés pour contrôler la
reproduction soient en permettant la synchronisation de l’œstrus soit en permettant l’induction
et la synchronisation de la parturition.
Dans les autres classes, les vitamines sont administrées pour prévenir les carences et les
anesthésiques, en agissant sur le système nerveux central, induisent et entretiennent
l’anesthésie générale.
Au sein de ces 6 classes, certaines molécules sont spécifiquement administrées aux animaux
alors que d’autres sont communes avec celles administrées aux humains. Par exemple,
l’amoxicilline, un antibiotique de la famille des pénicillines, est utilisé aussi bien en médecine
humaine que vétérinaire alors que la marbofloxacine, un antibiotique de la famille des
fluoroquinolones, n’est administrée qu’en médecine vétérinaire. D’autres molécules encore
sont utilisées en médecine humaine et vétérinaire mais sous formes différentes. Par exemple,
l’oxytétracycline est utilisée sous forme de pommade chez les humains alors qu’elle est
utilisée sous forme injectable ou de poudre pour suspension buvable chez les animaux.
50
Tableau 11 : Modes d’action des antibiotiques administrés en médecine vétérinaire.
famille exemple de exemple de animaux mode d’action

d'antibiotiques molécules médicament traités (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11)
pénicillines amoxicilline Clamoxyl la bovins, empêche la formation de la paroi bactérienne en inhibant
porcins, l'activité des transpeptidases qui catalysent la
ovins, polymérisation des unités glycopeptides, constituants de
caprins, la paroi bactérienne
chiens, chats
céphalosporines ceftiofur Cevaxel bovins, inhibe la synthèse de la paroi des cellules bactériennes
porcins
macrolides tylosine Tylan 200 bovins inhibe la synthèse des protéines par fixation à la
adultes, fraction 50S des ribosomes
veaux,
caprins,
ovins,
porcins
lincosamides lincomycine lincocine vaches inhibe la synthèse des protéines par fixation à la sous-
intramammaire laitières unité 50 S du ribosome bactérien
fluoroquinolones enrofloxacine Chanenro bovins, inhibe l'ADNgyrase bactérienne empêchant ainsi la
porcins, soudure de la double hélice d’ADN ce qui provoque une
chiens, chats dégradation irréversible de l'ADN chromosomique ;
altère la perméabilité de la membrane externe
phospholipidique de la paroi cellulaire
quinolones acide oxolinique Inoxyl  salmonidés inhibe l'ADNgyrase bactérienne

tétracyclines oxytétracycline Acti-tetra B veaux, inhibe la synthèse protéique en se liant de façon
porcins, réversible aux récepteurs de la fraction ribosomale 30S,
agneaux, ceci conduisant à un blocage de la liaison de
chevreaux, l'aminoacyl-ARNt au site correspondant du complexe
lapins, ribosome-ARN messager
volailles
sulfonamides sulfadiméthoxine Methox 23,2 veaux, inhibe la multiplication cellulaire par inhibition
agneaux, compétitive de la synthèse de l'acide dihydrofolique à
chevreaux, partir de l'acide p-aminobenzoïque bloquant ainsi les
volailles, réactions nécessaires à la synthèse des purines, de la
lapins thymine et l'initiation de la synthèse protéique au
niveau des ribosomes
polypeptides colistine Cofalac veaux désorganise la membrane cytoplasmique des bactéries,
conduisant à une altération de la perméabilité cellulaire
et à une perte de matériel intracellulaire
phénicolés florphénicol Fenflor porcins inhibe la synthèse protéinique au niveau ribosomique
aminosides dihydro- Dipropen bovins, perturbe la biosynthèse des protéines bactériennes et la
streptomycine ovins, perméabilité de la membrane bactérienne
caprins,
porcins
III. Origine dans l’environnement

La consommation de médicaments est la principale origine des molécules pharmaceutiques
dans l’environnement. En effet, une fois administrés, les médicaments sont excrétés via les
urines et les fèces. Dans le cas d’une consommation humaine, ils se retrouvent alors dans les
eaux usées. Ces dernières peuvent être déversées directement dans le milieu naturel, ou
dirigées vers des stations d’épuration (STEP) où elles seront traitées avant d’être rejetées.
Lorsque les molécules pharmaceutiques ne sont pas éliminées au cours du traitement, elles
aboutissent dans les milieux aquatiques où sont rejetées les eaux traitées, tels que les cours
51
d’eau, les lacs ou le milieu marin. Le traitement des eaux usées dans les STEP génère des
boues résiduaires dans lesquelles les polluants peuvent être piégés. Ces boues sont ensuite
épandues sur les sols cultivés afin de les fertiliser. Les molécules pharmaceutiques qui y
étaient retenues se retrouvent alors dans le milieu édaphique. Cette voie d’introduction
présente le double inconvénient d’atteindre à la fois le milieu terrestre et le milieu aquatique à
cause des ruissellements d’eau de pluie sur les sols amendés (atteinte des nappes phréatiques
sous-jacentes et des eaux de surface à proximité). Dans le cas d’une consommation
vétérinaire, les résidus de médicament contenus dans les excréments atteignent directement le
sol des pâturages lorsque les animaux sont élevés en plein champ, ou se retrouvent dans les
déchets d’élevage (lisier, fumier, etc.). Comme les boues de STEP, les déchets d’élevage sont
appliqués sur les sols agricoles pour les enrichir. De la même façon, les produits
pharmaceutiques qu’ils contenaient sont alors dispersés dans le milieu naturel.
Lorsque les médicaments ne sont pas consommés et qu’ils sont jetés dans les éviers ou les
toilettes, ils se retrouvent alors dans les eaux usées et suivent le même circuit que s’ils avaient
été utilisés. Dans d’autres cas, ils sont jetés avec les déchets ménagers et finissent dans les
décharges. Les lixiviats de ces décharges contenant des polluants de toute sorte, dont les
molécules pharmaceutiques, contaminent les sols et les eaux de surface avoisinantes.
Une autre source de pollution est la production des molécules pharmaceutiques (Velagaleti
1997 ; Larsson et al., 2007 ; Phillips et al., 2010). La fabrication et le conditionnement des
médicaments ne sont pas de façon générale les sources de contamination les plus
importantes ; néanmoins, aux endroits où les rejets de ces usines ont lieu, les concentrations
peuvent être extrêmement importantes et contribuer de façon majoritaire à la pollution
(Larsson et al., 2007 ; Phillips et al., 2010). Par ailleurs, même si ce n’est pas une généralité
(Langford et Thomas, 2009 ; Mullot, 2009), les centres de soins et en particulier les hôpitaux
sont connus pour être des « hot spot » de la contamination des eaux usées par les molécules
pharmaceutiques. Ceci est d’autant plus vrai pour les molécules entrant dans les traitements
administrés exclusivement à l’hôpital.
La production naturelle de ces molécules par les végétaux ou les bactéries, comme pour les
antibiotiques de la famille des -lactames ou la streptomycine par exemple, est minoritaire
dans les sols et n’a jamais été mise en évidence dans les systèmes aquatiques (Kümmerer,
2009a).
Enfin, le déversement direct dans les fermes aquacoles constitue une autre voie d’entrée de
ces molécules dans le milieu naturel.
En résumé, il existe de nombreuses voies d’entrée des molécules pharmaceutiques dans

l’environnement :
- les rejets directs d’eaux usées,
- les rejets d’eaux traitées dans les stations d’épuration,
- les épandages de boues résiduaires provenant du traitement des eaux dans les STEP,
- les épandages des déchets d’élevage,
- les déjections animales émises directement dans le milieu,
- les déversements dans les fermes aquacoles,
- les lixiviats de décharges,
- les usines de fabrication et de conditionnement,
- la production naturelle.
52
La Figure 5 schématise ces différentes voies d’entrée.
PRODUCTION
Production naturelle
Production hémisynthétique Synthèse chimique
(animal, végétal, minéral)
Rejets usines de fabrication

et conditionnement
CONSOMMATION
Consommation humaine Consommation vétérinaire
Officines Hôpitaux Animaux d’élevage Animaux de compagnie
Médicaments non utilisés
EXCRETION
Natifs Métabolites Conjugués
DISPERSION / CONTAMINATION
Origine humaine Origine animale
Eaux usées Décharge Aquaculture Déchets d’élevage
boues
Station d’épuration SOLS stockage / traitement
eaux traitées
EAUX DE SURFACE
EAUX SOUTERRAINES
Station de potabilisation
EAUX POTABLES
Figure 5 : Origine et distribution des molécules pharmaceutiques dans le milieu.
Les formes, sous lesquelles ces molécules sont retrouvées dans le milieu, sont très variables.
En effet quand il y a épandage direct dans les fermes aquacoles, quand ils proviennent des
usines de production ou quand ils sont excrétés sans avoir subi de transformation
métabolique, les composés se retrouvent sous leurs formes natives. De plus, quand ils
proviennent des usines de production, leurs précurseurs, issus des déchets intermédiaires de la
chaine de production, peuvent également être observés dans les rejets et donc dans
l’environnement (Velagaleti, 1997). Quant au contraire ils ont été métabolisés dans le corps
ou biotransformés par les bactéries dans les STEP, ce sont leurs métabolites qui sont
53
rencontrés dans l’environnement. Ces derniers peuvent alors être des molécules bien
différentes des composés parents et ont leur propre comportement et influence sur le milieu et
les organismes. Dans d’autres cas, ils sont sous formes conjuguées et peuvent revenir à leur
forme native lors des processus de biodégradation/biotransformation. C’est par exemple le cas
de la carbamazépine qui peut être issue de la déconjugaison de la carbamazépine-N-
glucuronide dont la moitié glucuronide est clivée par les activités glucuronidases des bactéries
présentes dans les boues de STEP (Vieno et al., 2007 ; AFSSA, 2010).
IV. Devenir
Quel que soit le milieu considéré (eaux usées, de surface ou souterraines, sols, etc.), le devenir
des composés est lié à leur comportement qui est dicté par les propriétés physico-chimiques
des molécules. Le pKa par exemple, conditionne, en fonction du pH du milieu, la forme acide
ou basique des molécules. En fonction de leur forme, ces dernières pourront interagir
différemment avec les éléments qui les entourent. Mais le pKa n’est pas le seul facteur qui
peut influencer la répartition et le devenir des composés. Le coefficient de partage octanol-eau
(Kow) ou la constante organique des sols (Koc) sont aussi à prendre en compte. Les
propriétés physico-chimiques les plus utiles sont définies ci-après :
 Le coefficient de partage octanol-eau, Kow, correspond au rapport des concentrations

d’une substance, S, dans l’octanol et dans l’eau: Kow = [S]octanol / [S]eau. Il permet de définir si
une substance est liposoluble ou hydrosoluble. Il est exprimé généralement sous sa forme
logarithmique (log Kow) et si : log Kow(S) > 3 alors S est dite liposoluble (Tissier et al.,
2005).
 La constante organique des sols, Koc, est le coefficient de partage entre la fraction de
carbone organique et l’eau dans le sol, les boues ou les sédiments. Il est exprimé sans
dimension ou en l.kg-1 et permet de prévoir la distribution d’un composé entre la phase liquide
et la phase solide des sols, boues et sédiments. Il indique approximativement le degré
d’adsorption d’une substance, S, et si Koc(S) > 3 alors S est dite adsorbable (Tissier et al.,
2005).
 La solubilité d’une substance dans l’eau est sa concentration de saturation dans l’eau à
une température donnée ; elle est exprimée en kg.m-3 ou mg.l-1. Une substance est considérée
non soluble si sa solubilité est inférieure à 1 mg.l-1 (Tissier et al., 2005).
 La constante de Henry caractérise la capacité d’une substance à se partager entre l’air et

l’eau ; elle est exprimée en Pa.m3.mol-1. Une substance est considérée comme volatile si sa
constante de Henry est supérieure à 1 Pa.m3.mol-1 (Tissier et al., 2005).
Ainsi, à partir de l’ensemble de ces caractéristiques, on peut prévoir le devenir des molécules :
des composés à la fois lipophiles (log Kow(S) > 3), adsorbables sur le carbone (Koc(S) > 3) et
non solubles dans l’eau (solubilité < 1 mg.l-1) se retrouveront principalement dans les boues
de STEP, dans la phase particulaire des eaux naturelles ou dans les sédiments ; à l’inverse, des
composés non adsorbables et solubles comme les pénicillines se retrouveront très
probablement dans la phase aqueuse des eaux naturelles et des effluents de STEP, s’ils n’ont
pas été dégradés au moment du traitement. Par ailleurs, une substance lipophile sera
probablement davantage bioaccumulée ou bioconcentrée dans les organismes qu’une
substance hydrophile.
54
IV.1. Devenir dans les stations d’épuration
Les stations d’épuration ont été installées pour traiter les eaux usées avant qu’elles ne soient
rejetées dans le milieu naturel. Leur objectif était d’éliminer les matières solides, la matière
organique dissoute et les nutriments comme l’azote ou le phosphore. Pour cela, la plupart des
STEP françaises comportent une étape de prétraitement puis un traitement primaire et un
traitement secondaire. Le prétraitement consiste généralement en un dégrillage, dessablage et
dégraissage qui permet d’éliminer les éléments solides, le sable et les graisses. Le traitement
primaire porte sur les matières particulaires décantables. Dans certain cas, un traitement
physico-chimique est appliqué à ce niveau. Il consiste à ajouter des floculants aux eaux
sortant du prétraitement pour finir d’en éliminer les matières en suspension. Les traitements
secondaires sont des traitements biologiques réalisés par des bactéries dans le but d’éliminer
la matière organique dissoute (carbone principalement mais aussi azote et phosphore). Il en
existe de différentes sortes : le lagunage, les cultures libres (boues activées et bioréacteur à
membranes) et les cultures fixées (biofiltres, lits bactériens, disques biologiques, filtres
plantés) où les bactéries se développent sur un support. A l’issue du traitement secondaire, les
boues issues de la dégradation des matières organiques sont récupérées par curage (lagune) ou
par clarification (décantation) (ADEME fiche technique assainissement ; Gabet-Giraud,
2009).
Figure 6 : Quantités moyennes de molécules pharmaceutiques et produits de soin corporels en entrée

(influent) et sortie (effluent) de deux stations d’épuration utilisant des filtres bactériens (Cilfynydd) ou des
boues activées (Coslech) comme type de traitement (extrait de Kasprzyk-Hordern et al.,, 2009).
55
Initialement les stations d’épuration n’ont donc pas été conçues pour éliminer les
micropolluants organiques comme les molécules pharmaceutiques. Néanmoins, les
concentrations totales mesurées dans la phase dissoute des eaux rejetées en sortie de station
sont souvent plus faibles que celles mesurées dans les eaux usées en entrée de station ce qui
signifie que les traitements appliqués permettent d’éliminer certains micropolluants (Figure
6). En revanche, l’abattement n’est pas le même pour tous les composés. Par exemple, d’après
les données de Kasprzyk-Hordern et al. (2009), les concentrations en paracétamol diminuent
fortement entre l’entrée (211 380 ng/L) et la sortie (11 733 ng/L) de la STEP « Cilfynydd »
utilisant un traitement par filtres bactériens alors que celles de la carbamazépine augmentent
passant de 1 694 ng/L en entrée à 2 499 ng/L en sortie.
Toutes les molécules pharmaceutiques ne sont donc pas éliminées de la même façon dans les
stations de traitement mais une même molécule n’est pas non plus éliminée de la même façon
en fonction de la saison (Castiglioni et al., 2006), du traitement appliqué dans la station
(Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk Hordern et al., 2009) et de l’étude considérée. Par exemple,
l’ofloxacine semble ne pas être éliminée en hiver alors qu’elle est au moins éliminée à 33 %
en été d’après Castiglioni et al. (2006). Pour Vieno et al. (2007), elle peut être éliminée à 75
% dans une STEP possédant un système de boues activées avec canal d’oxydation et à 88 %
dans une STEP possédant un système de boues activées avec dénitrification. Enfin, suivant la
STEP étudiée, son abattement peut varier entre 20 et 99 % pour Gros et al. (2010). Au final,
en considérant tous les articles, l’élimination de l’ofloxacine dans les stations d’épuration
varie entre 0 et 99 % et aucune valeur globale ne peut être dégagée. De la même façon,
suivant l’étude considérée, les taux d’abattement des -bloquants, et en particulier du
propranolol, sont très différents. Par exemple, d’après Ternes (1998) le propranolol est
éliminé à 96% dans les STEP alors que pour Bendz et al. (2005), Gabet-Giraud et al. (2010)
ou Roberts et Thomas (2005 dans Fent et al., 2006) il est éliminé respectivement à 32 %, 22
% ou même, pas éliminé du tout. Gabet-Giraud et al. (2010) constatent également de fortes
variations dans les abattements des -bloquants d’une station de traitement à une autre. En
revanche, pour les antibiotiques appartenant à la famille des macrolides, les diverses études
seraient davantage en accord pour conclure à une présence plus forte de ces composés en
sortie qu’en entrée de station se traduisant par des abattements nuls ou même négatifs
(Richardson et Bowron, 1985 dans Halling-Sørensen et al., 1998 ; Castiglioni et al., 2006 ;
Gros et al., 2010,). Néanmoins, ils peuvent atteindre les 50 % dans certains cas (Kasprzyk
Hordern et al., 2009 ; Miège et al., 2009). Göbel et al. (2007) justifient ce comportement par
le fait que ces composés sont principalement rejetés de l’organisme par la bile et les fèces et
sont par conséquent emprisonnés dans des particules fécales en entrée de STEP. Les apports
sont donc sous-estimés quand les phases dissoutes et particulaires sont analysées mais pas la
phase solide. Au cours du traitement dans les STEP, les macrolides sont libérés et sont donc
détectables dans les eaux traitées en sortie de station.
La Figure 7 est issue d’une synthèse bibliographique de 18 articles scientifiques à comité de

lecture dont 2 reviews (Fent et al., 2006 ; Miège et al., 2009). Les données brutes relevées
dans la littérature et utilisées pour générer ce graphique sont présentées en annexe (Annexe -
tableau 1). Les composés pour lesquels moins de 3 valeurs ont été relevées ne sont pas
représentés sur le graphique (en particulier anticancéreux et anti-viraux). Quand des plages de
taux d’élimination ont été relevés (ex. : 30 - 100), les deux valeurs extrêmes ont été
considérées séparément comme deux données différentes (ex. : 30 et 100). Dans le but de
maximiser la lisibilité du graphique, les valeurs négatives ont été ramenées à zéro. Par
ailleurs, il est important de noter que les taux d’élimination rapportés dans la littérature sont
généralement calculés à partir de la différence entre les concentrations mesurées dans la phase
56
dissoute en entrée et en sortie des stations de traitement. L’élimination des composés ne

signifie donc pas toujours qu’ils ont été dégradés au cours du traitement mais qu’ils ont
disparu de la phase dissoute, ils peuvent être adsorbés sur les particules ou les boues.
100
100
80
(%) (%)
80
Rendement
60
60
Rendement
40
40
20
20
00
pénicillines (n=4)
bézafibrate(n=18)
cimétidine(n=4)
propranolol(n=9)
gemfibrozil(n=10)
ranitidine(n=6)
imidazoles(n=3)
sulfonamides (n=21)
sotalol(n=6)
aspirine(n=5)
fluoroquinolones (n=30)
kétoprofène(n=15)
carbamazépine(n=17)
diclofénac(n=18)
enalapril (n=6)
tétracycline (n=5)
paracétamol(n=6)
ibuprofène(n=27)
salbutamol (n=7)
métoprolol(n=15)
et lincosamides(n=17)
aténolol (n=19)
fénofibrique(n=4)
furosémide (n=8)
acide salicylique (n=6)
méfénamique(n=6)
clofibrique(n=12)
naproxène(n=20)
(n=10)
(n=5)
(n=6)
(n=18)
(n=3)
(n=17)
(n=5)
(n=27)
(n=15)
(n=20)
(n=8)
(n=30)
(n=9)
(n=6)
(n=18)
(n=6)
(n=7)
(n=6)
(n=21)
(n=19)
(n=15)
(n=6)
(n=12)
(n=4)
(n=4)
(n=4)
(n=6)
(n=17)
tétracycline
salicylique
pénicillines
furosémide
salbutamol
enalapril
cimétidine
ranitidine
imidazoles
aspirine
propranolol
sotalol
fénofibrique
méfénamique
paracétamol
fluoroquinolones
sulfonamides
aténolol
bézafibrate
diclofénac
kétoprofène
gemfibrozil
carbamazépine
macrolides macrolides
ibuprofène
métoprolol
clofibrique
naproxène
acide
acideacide
acideacide
acideacide
Figure 7 : Rendement d'élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP (n = nombre de
données) (la croix correspond à la moyenne) (la famille des macrolides intègre aussi les lincosamides).
Cette figure met clairement en évidence l’étendue des taux d’élimination dans les STEP pour
28 molécules ou familles de molécules (antibiotiques). Les plages les plus larges, entre le
premier et le troisième quartile, sont celles du propranolol, du bézafibrate et du salbutamol.
Néanmoins, malgré la diversité des données, il ressort que le paracétamol, l’aspirine et l’acide
salicylique, son métabolite, sont bien éliminés avec des pourcentages d’élimination supérieurs
à 80 %. A l’opposé, il ressort que la carbamazépine, les macrolides et lincosamides et les
imidazoles sont difficilement éliminés avec des taux d’abattement inférieurs à 30 % si on tient
compte des données comprises entre le premier et le troisième quartile. Entre ces deux
extrêmes, certains composés comme les 3 anti-inflammatoires non stéroïdien (AINS)
ibuprofène, kétoprofène et naproxène semblent relativement être bien éliminés alors que
l’acide méfénamique ou le métoprolol paraissent difficilement être abattus.
Les variations observées peuvent être expliquées par les propriétés physico-chimiques de la
molécule étudiée et le procédé de traitement appliqué. La Figure 8, extraite de Kasprzyk-
Hordern et al. (2009), montre l’impact du traitement appliqué sur les taux d’élimination des
molécules pharmaceutiques. Bien que les deux systèmes comparés soient tous deux des
traitements biologiques, il ressort que les composés sont généralement mieux éliminés par les
boues activées que par les filtres bactériens. Ceci est particulièrement mis en évidence pour le
sulfaméthoxazole, l’érythromycine, la sulfapyridine ou encore l’acide 5-aminosalicylique.
57
Figure 8 : Elimination des molécules pharmaceutiques en fonction du traitement biologique appliqué

(extrait de Kasprzyk Hordern et al., 2009)
(filtres bactériens : trickling filters, ou boues activées : activated sludges).
La différence de procédé mis en œuvre dans la station de traitement n’est pas le seul facteur
qui puisse justifier de telles différences dans l’épuration des eaux usées. En effet, pour six
STEP appliquant un même procédé de traitement par boues actives, Gabet-Giraud et al.
(2010) ont remarqué des variations de 233 %, 79 % et 93 % respectivement pour le
propranolol, le métoprolol et le sotalol. En réalité, les propriétés physico-chimiques de la
molécule étudiée et le procédé de traitement appliqué mais aussi les conditions climatiques
(dilution des eaux brutes suites à des épisodes pluvieux ou à la fonte des neiges, température,
ensoleillement) peuvent influencer l’élimination des molécules pharmaceutiques dans les
STEP. En conséquence, les abattements des composés peuvent être différents d’une station à
une autre mais aussi au sein d’une même station (Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk Hordern et al.,
2009). Par exemple, la température du compartiment des boues activées influence
l’élimination de l’aténolol (Gabet-Giraud et al., 2010). Par ailleurs, Vieno et al. (2007) ont
observé qu’en période de pluie, l’élimination des -bloquants, en particulier de l’acébutolol,
l’aténolol et le métoprolol était diminuée. De même une moins bonne efficacité dans les
processus d’élimination a été observée en période de pluie pour le métronidazole,
l’ibuprofène, le diclofénac, la codéine, la carbamazepine, les -bloquants, la cimétidine et le
furosémide par Kasprzyk Hordern et al. (2009). Lorsque le système de collecte des eaux
pluviales n’est pas différencié de celui des eaux usées, alors en période pluvieuse, les eaux
usées se retrouvent diluées par les eaux de pluie. Si la dilution des eaux contaminées est un
avantage dans les systèmes naturels, en revanche dans les STEP c’est un inconvénient car
pour arriver à traiter les plus gros débits, les temps de résidence sont réduits, diminuant
d’autant l’efficacité du traitement. Il semble qu’un paramètre important dans l’efficacité du
traitement soit le temps de résidence hydraulique (TRH) et le temps de résidence des boues
(Vieno et al., 2007 ; Gros et al., 2010). Gros et al. (2010) ont calculé les temps de demi-vies
de certaines molécules pharmaceutiques en se basant sur les concentrations moyennes
mesurées en entrée et en sortie de stations d’épuration. A partir de ces temps de demi-vie, ils
ont pu estimer les taux d’élimination des composés en fonction du TRH. Il ressort de leurs
58
résultats que des composés ayant des temps de demi-vie assez long seront faiblement éliminés
dans des STEP possédant des TRH courts (7-10 heures) alors qu’ils seront mieux éliminés
dans des STEP possédant des TRH longs (32 heures) (Figure 9).
Figure 9 : Pourcentage d'élimination et temps de demi-vie de différentes molécules pharmaceutiques en

fonction du temps de résidence hydraulique (extrait de Gros et al., 2010).
De nos jours, de plus en plus de stations s’équipent d’un traitement tertiaire comme la
filtration sur sable, la décantation rapide, le lagunage de finition, l’ozonation, l’osmose
inverse ou la filtration sur charbon actif. Ces traitements tertiaires sont prometteurs pour
éliminer les micropolluants organiques. L’ozonation semble efficace pour éliminer certaines
molécules pharmaceutiques (Castiglioni et al., 2006). Gabet-Giraud et al. (2010) ont ainsi
observé des rendements d’élimination supérieurs à 80 % pour les -bloquants quand des
traitements par ozonation, osmose inverse ou filtration sur charbon actif étaient appliqués. Le
sulfaméthoxazole semble également être efficacement dégradé par l’ozonation (Dantas et al.,
2007 dans Kümmerer, 2009a).
Les principaux mécanismes impliqués dans l’élimination des molécules pharmaceutiques

dans les STEP sont la biodégradation par hydrolyse, par oxydation ou par déméthylation,
l’adsorption sur les particules ou les boues, la filtration et l’oxydation chimique. L’élimination
par volatilisation de ces composés est très peu probable (Miège et al., 2009). Par exemple,
l’adsorption sur les boues est la voix principale d’élimination des fluoroquinolones (Golet et
al., 2003).
En conclusion, pour comprendre le devenir des molécules pharmaceutiques dans les stations
d’épuration il faut tenir compte :
 du composé étudié (classe thérapeutique et propriétés physico-chimiques),
 du procédé de traitement appliqué dans la station considérée (le type de traitement et la
présence d’un traitement tertiaire),
 des conditions climatiques (température, précipitations, ensoleillement).
59
IV.2. Devenir dans l’environnement
Le devenir des molécules pharmaceutiques dans les milieux naturels est lié à deux
phénomènes : l’adsorption, sur les particules, les sédiments ou le sol, et la dégradation. La
disparition des composés natifs dans la phase aqueuse ne signifie pas obligatoirement qu’ils
ont été éliminés. Les tétracyclines par exemple sont connues pour se fixer sur les particules du
sol ou pour former des complexes avec les ions présents (ex. : Na2+, Ca2+) (Thiele-Bruhn,
2003 ; Kümmerer, 2009b). La sulfadiazine et d’autres sulfonamides s’adsorbent aussi sur les
particules du sol (Kümmerer, 2009a). L’adsorption des tétracyclines présente l’avantage de
réduire les risques de dispersion via la phase aqueuse mais l’inconvénient de les mettre en
contact avec les bactéries du sol. De plus, la fixation des tétracyclines sur les cations divalents
comme le calcium ou le magnésium des eaux marines oblige les fermes aquacoles à utiliser de
plus grosses quantités d’antibiotiques, augmentant ainsi les problèmes de pollution
(Kümmerer, 2009b). La présence de substances humiques peut modifier l’adsorption des
composés en supprimant ou en améliorant leurs interactions avec les surfaces minérales
(Kümmerer, 2009a). L’adsorption des contaminants, comme les HAP ou les PCB, sur la
matière organique peut être estimée au travers de la valeur du log Kow. Cependant, pour les
antibiotiques d’autres paramètres rentrent en ligne de compte. Ainsi, en fonction du pH du
milieu, des interactions ioniques peuvent se produire par le fait que ces composés possèdent
des fonctions acides et basiques. Par exemple, les fluoroquinolones qui sont des composés
zwitterioniques (pKaCOOH = 5,9-6,4, pKaNH2 = 7,7-10,2) s’adsorbent sur la matière organique
des boues de STEP grâce à des interactions électrostatiques (Golet et al., 2003). Ainsi
l’adsorption des composés pharmaceutiques dépend du log Kow mais aussi du pH, du
potentiel redox, de la stéréochimie de la structure et de la nature chimique de l’adsorbant et
des composés (Kümmerer, 2009b).
La dégradation peut être de différente nature : chimique comme les réactions de

photodégradation, hydrolyse et thermolyse ou biologique par action des micro-organismes
(bactéries et champignons). La photodégradation dépend de l’intensité du rayonnement, de la
profondeur de l’eau, de la saison et de la latitude, de la présence et de la composition de la
matière organique (Mompelat et al., 2009). Par exemple les sulfonamides sont mieux
photodégradés dans une eau naturelle que dans une eau pure grâce à la présence de matière
organique dissoute (Boreen et al., 2005). Certains composés sont connus pour être sensibles à
la lumière. Les fluoroquinolones et la tylosine par exemple sont dégradés par le rayonnement
UV (Kümmerer, 2009a). En revanche, les fluoroquinolones et les sulfonamides sont
insensibles à l’hydrolyse. Lors d’études en laboratoire, les pénicillines ont été rapidement
hydrolysées (Kümmerer, 2009a). De plus, la pénicilline G est décomposée par la chaleur. Les
-lactames peuvent être dégradées par les -lactamases qui sont des enzymes présentes dans
les bactéries. Cependant, des tests de biodégradation pratiqués sur des antibiotiques selon les
normes OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Économiques) ont montré
une lente biodégradation de ces derniers à l’exception de la pénicilline G (Alexy et al.,
2004 dans Mompelat et al., 2009 ; Gartiser et al., 2007 dans Mompelat et al., 2009). Maki et
al. (2007 dans Kümmerer, 2009a) ont trouvé que l’ampicilline, l’oxytétracyline, la
doxycycline et le thiamphénicol sont biodégradés alors que la josamycine reste intacte.
V. Présence dans l’environnement

Les molécules pharmaceutiques sont ubiquistes. On les retrouve dans :
60
 les rejets industriels (industrie pharmaceutique) : Larsson et al., 2007 ; Li et al., 2008 ;
Phillips et al., 2010
 les eaux usées des centres de soin (hôpitaux, maison de retraite, hôpitaux psychiatriques) :
Steger-Hartmann et al., 1996 ; Kümmerer et al., 1997 ; Steger-Hartmann et al., 1997 ;
Hartmann et al., 1998 ; Lindberg et al., 2004; Gomez et al., 2006 ; Mahnik et al., 2007 ;
Catastini et al., 2009; Mullot, 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010
 les eaux usées brutes et traitées (entrée et/ou sortie de STEP) : Steger-Hartmann et al., 1996 ;
Kümmerer et al., 1997 ; Ternes, 1998 ; Hirsch et al., 1999 ; Golet et al., 2001 ; Sedlak et
Pinkston, 2001 ; Golet et al., 2002a ; Andreozzi et al., 2003 ; Huggett, 2003 ; Ferrari et
al., 2004; Huschek et al., 2004 ; Bendz et al., 2005 ; Cha et al., 2006 ; Gagne et al., 2006 ;
Gros et al., 2006 ; Pomati et al., 2006 ; Segura et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Piram et
al., 2008 ; Coetsier et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010 ; Gabet-
Giraud et al., 2010 ; Nieto et al., 2010a ; Prasse et al., 2010
 les boues de STEP : Golet et al., 2002b ; Lindberg et al., 2005 ; Thomas et al., 2007 ; Díaz-
Cruz et al., 2009 ; Jelić et al., 2009 ; Nieto et al., 2010b
 les effluents d’élevages (lisiers, fumiers, etc.) : Hamscher et al., 2002 ; Pierini et al., 2004 ;
Martínez-Carballo et al., 2007
 le sol après épandage des boues de STEP ou des déchets d’élevage : Golet et al., 2002b ;
Hamscher et al., 2002 ; Jacobsen et al., 2004 ; Martínez-Carballo et al., 2007 ; Kemper et
al., 2008 ; Weiss et al., 2008
 les sédiments :Yang et al., 2010 ; Zuccato et al., 2000
 les eaux de lessivage des sols enrichis avec les boues de STEP ou les déchets d’élevage
(lixiviat) : Kemper, 2008 ; Weiss et al., 2008
 les eaux de surface (ruisseau, rivière, fleuve, lac, estuaire, mer, océan) : Ternes, 1998 ;
Hirsch et al., 1999 ; Zuccato et al., 2000 ; Lindsey et al., 2001 ; Golet et al., 2002a ;
Kolpin et al., 2002 ; Stackelberg et al., 2004 ; Bendz et al., 2005 ; Cha et al., 2006 ; Gros
et al., 2006 ; Hao et al., 2006 ; Pomati et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Kasprzyk-
Hordern et al., 2007 ; Focazio et al., 2008 ; Nageswararao et al., 2008 ; Tamtam et al.,
2008 ; Vulliet et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010 ; Prasse et al.,
2010
 les eaux souterraines: Sacher et al., 2001 ; Barnes et al., 2008 ; Focazio et al., 2008 ; Avisar
et al., 2009
 les eaux potables (en sortie de station de potabilisation, eau du robinet, eau embouteillée) :
Zuccato et al., 2000 ; Heberer, 2002 ; Reddersen et al., 2002 ; Wenzel et al., 2003 ;
Stackelberg et al., 2004 ; Chen et al., 2006 ; Stackelberg et al., 2007 ; Ye et al., 2007 ;
Zuehlke et al., 2007 ; Togola et Budzinski, 2008 ; Garcia-Ac et al., 2009 ; Vulliet et al.,
2009 ; Watkinson et al., 2009
 les animaux (traités ou non) : poissons (Dasenaki et Thomaidis, 2010), crevettes (Furusawa,
2008), vautours (Oaks et al., 2004)
 les plantes : Hu et al., 2010
 la nourriture suite aux traitements des animaux (antibiotiques) : lait bovin (Keever et al.,
1998) ; muscles et lait bovins (Becker et al., 2004), miel (Hammel et al., 2008).
Au niveau environnemental, les eaux, et la phase dissoute en particulier, sont les matrices les
plus analysées. Par exemple, sur les 117 publications étudiées par Miège et al. (2009) sur les
molécules pharmaceutiques et les produits de soin corporels dans les stations d’épuration,
seulement 15 traitent des boues et une seule de la phase particulaire. De plus, d’après les 2
61
500 articles étudiés au cours du premier volet du projet KNAPPE, sur l’ensemble des matrices
aqueuses, les eaux usées traitées (sortie de STEP) et les eaux de surface sont les matrices les
plus étudiées. Environ, 75 % des échantillons analysés, et dont les résultats sont présentés
dans la littérature entre 1998 et 2007, se rapportent à ces matrices (Figure 10).
nombre d'échantillons 25000

19 168
20000
14 156
15000
10000
5 581
5000 2 877
1 134 660 544
0
Figure 10 : Répartition du nombre d’échantillons d’eau analysés par type de matrice d’après des données
bibliographiques (graphique traduit du délivrable D1.1 « List of relevant PPs » du projet KNAPPE,
Schlüsener et al., 2007).
En ce qui concerne la synthèse bibliographique sur les matrices aqueuses présentée dans ce
chapitre, 55 articles et 2 rapports scientifiques ont été pris en compte. Les données relevées
sont rapportées dans les tableaux présentés en annexe (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau
8). Seules les valeurs chiffrées positives, supérieures aux limites de quantification, ont été
reportées. Les informations relatives aux composés recherchés mais non trouvés ou dont les
concentrations étaient inférieures aux limites de détection et de quantification n’ont pas été
rapportées. La totalité des valeurs collectées ont été utilisées pour générer les différents
graphiques présentés dans les paragraphes suivants (Figure 12 à Figure 25).
concentration (µg/l)
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000
rejets hopitaux (8, 275)
entrée STEP (14, 206)
sortie de STEP (16, 386)
eau de surface (17, 407)
eau souterraine (11, 47)
eau potable (10, 90)

Figure 11 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les diverses classes thérapeutiques pour
les différentes matrices aqueuses (nombre de classes thérapeutiques prises en compte, nombre de données
prises en compte).
62
Dans l’ensemble des matrices aqueuses (Figure 11), les composés sont majoritairement
présents à des concentrations comprises entre quelques ng/L et quelques µg/L. Cette gamme
là correspond aux plus faibles valeurs de concentration relevées dans les rejets hospitaliers et
les eaux usées alors qu’elle correspond aux plus fortes valeurs relevées dans les eaux
souterraines et les eaux potables. Des concentrations en paracétamol ou agents de contraste
iodés atteignant le mg/L dans les rejets d’hôpitaux ont été relevées. A l’inverse, des
concentrations de l’ordre du dixième de ng/L ont été relevées pour diverses classes
thérapeutiques dans les eaux potables et les eaux souterraines. Ainsi, les concentrations sont
généralement comprises entre la dizaine de ng/L et la centaine de µg/L dans les rejets
hospitaliers et dans les eaux usées en entrée de STEP, entre le ng/L et la dizaine de µg/L dans
les eaux traitées en sortie de STEP, entre le dixième de ng/L et la dizaine de µg/L dans les
eaux de surface et les eaux souterraines et entre le dixième de ng/L et la centaine de ng/L dans
les eaux potables.
Préalablement à l’étude détaillée de chacune des matrices liquides, afin de comparer de façon
plus précise les niveaux de contamination entre les rejets hospitaliers, les eaux usées en entrée
et en sortie de STEP, les eaux de surface, souterraines et potables, 8 molécules détectées dans
ces 6 compartiments aqueux, à l’exception du cyclophosphamide, ont été sélectionnées. Il
s’agit du diclofénac, du paracétamol, de la carbamazépine, du bézafibrate, de la
roxithromycine, du sulfaméthoxazole, de l’aténolol et du cyclophosphamide. Elles
représentent les principales classes thérapeutiques analysées (analgésiques et anti-
inflammatoires, antiépileptiques et antidépresseurs, hypolipémiants, antibiotiques, -
bloquants et anticancéreux). Les plages de contamination de ces 8 molécules sont représentées
Figure 12 en utilisant les valeurs les plus faibles et les plus fortes relevées dans la littérature
dans chacune des 6 matrices. D’une façon générale, en se basant sur les valeurs maximales de
chaque molécule, le gradient de contamination suivant peut être observé : rejets hospitaliers
(70 ng/L - 1,3 mg/L, 77 données prises en compte) > entrée de STEP (400 ng/L - 43 µg/L, 72
données prises en compte) > sortie de STEP (300 ng/L - 11 µg/L, 160 données prises en
compte) > eau de surface (54 ng/L - 10 µg/L, 189 données prises en compte) > eau
souterraine (3 ng/L - 1,1 µg/L, 32 données prises en compte) > eau potable (3 - 258 ng/L, 44
données prises en compte). Cependant, la carbamazépine, le bézafibrate et la roxithromycine
présentent des concentrations maximales plus élevées dans les eaux traitées (sortie de STEP)
que dans les eaux usées brutes (entrée de STEP). Par ailleurs, à l’exception des eaux potables
et des rejets hospitaliers, les plages de concentration se superposent entre les différentes
matrices pour une même molécule. En conséquence, des eaux souterraines peuvent être autant
contaminées en diclofénac, paracétamol, carbamazépine, sulfaméthoxazole et aténolol que des
rejets de STEP ; ou des eaux de surface peuvent être autant contaminées que des eaux usées
brutes (entrée de STEP ou rejets hospitaliers) pour l’ensemble de ces 8 composés. De plus,
dans les eaux potables, même si les niveaux de contamination sont principalement inférieurs à
la dizaine de ng/L, des valeurs de l’ordre de la centaine de ng/L ont été relevées pour le
paracétamol et la carbamazépine.
En ce qui concerne la synthèse bibliographique effectuée dans le cadre de ce travail sur les
matrices solides (boues de STEP, déchets d’élevage, sols, sédiments), 16 articles et 1 rapport
scientifique ont été pris en compte. Du fait de la complexité de ces matrices et des difficultés
analytiques qu’elles engendrent, elles sont moins étudiées que les eaux et la phase dissoute.
Les données relevées sont rapportées dans l’Annexe - tableau 8 et dans le Tableau 14 et le
Tableau 15 présentés dans les paragraphes V.7 à V.9. Comme pour la phase liquide dissoute,
seules les valeurs chiffrées positives, supérieures aux limites de quantification, ont été
reportées dans les tableaux et les graphiques. Les informations relatives aux composés
63
Figure 12 : Gammes de concentrations auxquelles les 8 composés représentés peuvent être retrouvés dans différentes matrices aqueuses (gamme
représentées par la valeur minimale et maximale trouvées dans les n données récupérées dans la littérature, 0 = 0,1 ng/L).
(carba. : carbamazépine, roxithro. : roxithromycine, sulfamétho. : sulfaméthoxazole, cyclophos. : cyclophosphamide)
(hôpital : rejets hospitaliers, entrée STEP : eaux usées, sortie STEP : eaux traitées, surface : eaux de surface, souterraine : eaux souterraines, potable : eaux potables)
concentration (ng/l)
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000 10 000 000
hôpital (n=11)
entrée STEP (n=13)
sortie STEP (n=34)
surface (n=30)
diclofénac
souterraine (n=6)
potable (n=5)
hôpital (n=11)
entrée STEP (n=10)
sortie STEP (n=11)
surface (n=22)
souterraine (n=4)
paracétamol
potable (n=6)
hôpital (n=3)
entrée STEP (n=10)
sortie STEP (n=37)
surface (n=38)
carba.
64
souterraine (n=7)
potable (n=14)
hôpital (n=0)
entrée STEP (n=5)
détection et de quantification n’ont pas été rapportées.
sortie STEP (n=18)

surface (n=21)
souterraine (n=2)
bézafibrate
potable (n=6)
hôpital (n=4)
entrée STEP (n=2)
sortie STEP (n=8)
surface (n=9)
roxithro.
souterraine (n=2)
potable (n=4)
hôpital (n=20)
entrée STEP (n=14)
sortie STEP (n=31)
surface (n=44)
souterraine (n=9)
sulfamétho.
potable (n=5)
hôpital (n=12)
entrée STEP (n=15)
sortie STEP (n=14)
surface (n=22)
aténolol
souterraine (n=2)
potable (n=4)
hôpital (n=16)
entrée STEP (n=3)
sortie STEP (n=7)
surface (n=3)
recherchés mais non trouvés ou dont les concentrations étaient inférieures aux limites de
souterraine (n=0)
cyclophos.
potable (n=0)
Suivant la classe thérapeutique considérée, les concentrations relevées dans les boues de
STEP peuvent être plus importantes que celles mesurées dans les eaux usées, brutes ou
traitées, comme pour les antibiotiques ou au contraire beaucoup plus petites comme pour les
analgésiques et anti-inflammatoire (Tableau 12). En revanche, il n’y a pas de différence de
niveau de contamination entre les eaux de surface et les sédiments. Dans les deux matrices les
concentrations en antibiotiques varient entre le dixième de ng/L ou de ng/g et le µg/L ou le
µg/g avec des extrêmes pouvant atteindre la dizaine voire la centaine de µg/L ou µg/g.
Tableau 12 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les eaux usées brutes (entrée de STEP)
et traitées (sortie de STEP) ainsi que les boues de STEP pour deux classes thérapeutiques majeures
(concentrations indiquées en ng/L dans les eaux et en ng/g dans les boues).
analgésiques et anti-inflammatoires antibiotiques
matrice
minimum maximum n données minimum maximum n données
entrée de STEP 5 43 223 63 5 64 000 95
boues de STEP 2,5 425 27 0,2 97 500 102
sortie de STEP 2 12 070 122 2 6 000 193
La contamination de chacune des différentes matrices (rejets hospitaliers, eaux usées brutes et
traitées, eau de surface, souterraines et de boisson, sédiments, boues de STEP, déchets
d’élevage et sols enrichis avec les boues de STEP ou les déchets d’élevage) par les molécules
pharmaceutiques est passée en revue dans les paragraphes suivants.
V.1. Les effluents hospitaliers
Dans les eaux usées provenant d’hôpitaux, les plus fortes concentrations rapportées
concernent les agents de contraste utilisés pour les diagnostics médicaux. Ils sont retrouvés à
des valeurs supérieures au mg/L (Figure 13). Les analgésiques et anti-inflammatoires sont
également dosés à des niveaux élevés de concentration (mg/L) mais leur gamme de
concentrations est très étendue puisque certains composés ont été quantifiés à des
concentrations de l’ordre de la dizaine de ng/L seulement. Les antibiotiques et les
anticancéreux sont des classes thérapeutiques possédant aussi des plages de contamination
étendues, de la dizaine de ng/L à la centaine de ng/L alors que les -bloquants sont retrouvés
sur une gamme de concentrations un peu plus réduite allant de la centaine de ng/L à la
centaine de µg/L. Les autres classes thérapeutiques ont été moins étudiées et leur niveau de
contamination est plus variable.
Le détail des plages de concentrations de chaque composé à l’intérieur des différentes classes
thérapeutiques est présenté Figure 14. Dans la classe des analgésiques et des anti-
inflammatoires, le paracétamol et l’ibuprofène sont les 2 molécules retrouvées aux plus fortes
concentrations, respectivement 1,4 mg/L (Suède, Thomas et al., 2007) et 151 µg/L (Espagne,
Gomez et al., 2006), mais l’ensemble des composés est dosé à des concentrations
importantes. Contrairement aux autres matrices aqueuses, la carbamazépine a été peu analysée
dans les effluents hospitaliers et ses concentrations sont relativement faibles. L’iobitridol et
l’ioméprol, les deux agents de contrastes, sont tous deux présents à de très fortes
concentrations avec une concentration maximale en iobitridol de 9,9 mg/L (France, Mullot,
2009). Au sein des antibiotiques, les niveaux de concentrations sont plus variés et les valeurs
maximales sont relevées pour la ciprofloxacine (101 µg/L ; Suède, Lindberg et al., 2004), le
65
métronidazole (90,2 µg/L ; Suède, Lindberg et al., 2004), le triméthoprime (15 µg/L ; Suède,
rejets hospitaliers
Thomas et al., 2007) et le sulfaméthoxazole (12,8 µg/L ; Suède, Lindberg et al., 2004).
anticancéreux (56)
b-bloquants (23)
antibiotiques (128)
histamine antagonistes récepteurs H2 (3)
agents de contraste iodés (4)
antiépiléptiques et antidépresseurs (3)
anesthésiques (7)
analgésiques et anti-inflammatoires (51)
0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000

Figure 13 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être
retrouvées dans les rejets hospitaliers (nombre de données relevées dans chaque classe).
1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000 10 000 000
codéine
diclofénac
ibuprofène
kétoprofène
kétorolac
méthylprednisolone
paracétamol
propofol
carbamazépine
iobitridol
ioméprol
ranitidine
amoxicilline
pénicilline V
céfalexine
érythromycine
érythromycine-H2O
oléandomycine
roxithromycine
clindamycine
lincomycine
ciprofloxacine
enrofloxacine
loméfloxacine
norfloxacine
ofloxacine
acide nalidixic
sulfadiazine
sulfaméthoxazole
triméthoprime
chlortétracycline
déméclocycline
doxycycline
oxytétracycline
tétracycline
iso-chlortétracycline
métronidazole
aténolol
métoprolol
propranolol
cyclophosphamide
ifosfamide
doxorubicine
fluorouracil
étoposide
méthotréxate
Figure 14 : Concentrations relevées dans la littérature pour 46 molécules pharmaceutiques mesurées dans
des rejets hospitaliers.
66
Cependant, il faut savoir que les concentrations varient fortement suivant le moment de la
journée où le prélèvement a été effectué (Lindberg et al., 2004). Des échantillons prélevés à
un même endroit en milieu d’après-midi, en fin de matinée ou dans la nuit ne seront pas
contaminés de la même façon (Figure 15). L’aténolol est le -bloquant dosé à la plus forte
concentration (122 µg/L ; Espagne, Gomez et al., 2006). Enfin, au sein des anticancéreux, le
fluorouracil est le composé détecté à la plus forte concentration de 123,5 µg/L (Autriche,
Manik et al., 2007) alors que les autres molécules sont plutôt dosées à des concentrations
maximales variant entre la centaine de ng/L et quelques µg/L.
Figure 15 : Evolution du niveau de concentration en ciprofloxacine (b) et métronidazole (e) dans un

effluent hospitalier en fonction de l’heure de prélèvement et du débit (extrait de Lindberg et al., 2004).
V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP)
Dans les eaux usées, 3 classes thérapeutiques dominent en terme de nombre de données
disponibles dans la littérature et d’étendue des gammes de concentrations (Figure 16). Il s’agit
des antibiotiques, des -bloquants et des analgésiques et anti-inflammatoires. Elles sont
dosées à des concentrations allant de quelques ng/L à plusieurs dizaines de µg/L. Cependant,
les plus fortes concentrations ont été relevées pour la classe des stimulants dont le principal
représentant est la caféine. La caféine a été dosée à une concentration maximale de 640 µg/L
(Heberer, 2002). Les hypolipémiants, antiviraux et les antiépileptiques et antidépresseurs sont
les 3 autres classes fréquemment analysées et dont plus d’une quinzaine de données ont été
relevées pour chacune dans la littérature. Leurs gammes de concentration vont de quelques
ng/L à quelques µg/L. Peu de données ont été relevées pour les autres classes thérapeutiques,
soit parce qu’un moins grand nombre de molécules appartiennent à ces classes, soit parce
qu’elles sont moins étudiées et donc les informations qui leur sont relatives sont plus rares
(ex. : les inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5).
Les gammes de concentration individuelle de chaque composé appartenant à ces 14 classes

thérapeutiques sont présentées Figure 17. A l’exception de la codéine et de l’indométhacine,
les différents analgésiques et anti-inflammatoires sont retrouvés dans des gammes de
concentration similaires, entre la centaine de ng/L et la dizaine de µg/L. Comme dans les
effluents hospitaliers, les valeurs les plus fortes ont été relevées pour le paracétamol (43,2
µg/L ; Suède, Thomas et al., 2007) et l’ibuprofène (18,4 µg/L ; Espagne, Gros et al., 2009).
Comparativement aux autres antiépileptiques et antidépresseurs, de nombreuses données ont
été saisies pour la carbamazépine. Les concentrations auxquelles elle a été retrouvée varient
d’un facteur 100 (37 - 3 800 ng/L). L’acide clofibrique, le bézafibrate et le gemfibrozil sont
67
les hypolipémiants les plus analysés. Bien que rarement détectés, les antibiotiques de la
famille des -lactames sont quantifiés à des concentrations importantes dans les eaux usées
brutes (valeurs maximales de plusieurs µg/L à plusieurs dizaines de µg/L). D’après le nombre
de données recueillies, la ciprofloxacine, l’enrofloxacine, la norfloxacine et l’ofloxacine pour
les fluoroquinolones et le sulfaméthoxazole et le triméthoprime pour les sulfonamides, sont
les antibiotiques les plus recherchés et les plus retrouvées dans les eaux usées brutes. Les plus
importantes concentrations sont celles de la ciprofloxacine (6,3 µg/L ; France, Mullot, 2009).
Parmi les -bloquants, 4 molécules sont particulièrement bien documentées : l’aténolol, le
métoprolol, le propranolol et le sotalol. Elles sont généralement dosées à de fortes
concentrations, entre la centaine de ng/L et la dizaine de µg/L. Les données recueillies pour
les antiviraux sont variables et peu de données ont été saisies pour les anticancéreux,
probablement car c’est une classe moins fréquemment analysée que les autres.
eaux usées entrée de STEP
antiviraux (16)
anticancéreux (5)
b-bloquants (72)
antibiotiques (95)
inhibiteurs PDE 5 (7)
antidiabétiques (2)
diurétiques (6)
antihypertenseurs (3)
histamine antagonistes des récepteurs H2 (9)
hypolipémiants (21)
antiépileptiques et antidépresseurs (15)
anesthésiques (2)
stimulants (3)
1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000

retrouvées dans les eaux usées en entrée de station d'épuration (nombre de données relevées dans chaque
classe).
68
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000
acide méfénamic
acide salicylique
codéine
diclofénac
ibuprofène
hydroxy-ibuprofène
carboxy-ibuprofène
indométhacine
kétoprofène
naproxène
pa ra cétamol
propyphena zone
caféine
propofol
carbamazépine
fluoxétine
lorazépam
acide clofibrique
atorvastatine
meva sta tin
bézafibrate
gemfibrozil
cimétidine
fa motidine
ranitidine
ena la pril
hydrochlorothiazide
furosémide
glibendamide
sildénafil
Vardenafil
Ta da la fil
amoxicilline
pénicilline G
pénicilline V
cloxacilline
céfa lexine
céfochlor
a zithromycine
clarithromycine
oléa ndomycine
roxithromycine
tylosine
clindamycine
lincomycine
ciprofloxa cine
enrofloxacine
norfloxacine
ofloxacine
a cide na lidixic
sulfa dia zine
sulfaméthazine
sulfa méthoxazole
sulfathiazole
sulfasalazine
triméthoprime
chlortétracycline
doxycycline
oxytétra cycline
tétracycline
métronida zole
salinomycine
acébutolol
aténolol
bêtaxolol
bisoprolol
métoprolol
na dolol
oxprénolol
pindolol
propranolol
sotalol
timolol
cyclophosphamide
ifosfamide
tamoxifen
acyclovir
penciclovir
oseltamivir
oselta mivir ca rboxyla te
abacavir
lamivudine
névirapine
stavudine
zidovudine
des eaux usées brutes (entrée de STEP).
69
V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP)
Les classes pour lesquelles le plus de données ont été recueillies dans les eaux traitées sont les
antibiotiques (193), les analgésiques et anti-inflammatoires (172), les -bloquants (138), les
hypolipémiants (79) et les antiépileptiques et antidépresseurs (58) (Figure 18). A l’exception
des -bloquants qui sont retrouvés à des concentrations inférieures au ng/L, l’ensemble des
classes est retrouvé à des concentrations comprises entre quelques ng/L et la dizaine de µg/L.
Par ailleurs, aucune classe ne se détache des autres en terme de niveau de concentration.
L’étendue des gammes de concentrations semble proportionnelle au nombre d’informations
recueillies.
sortie de STEP
anti-viraux (10)
anticancéreux (19)
b-bloquants (138)
antibiotiques (193)
inhibiteurs PDE 5 (13)
diurétiques (9)
vasodilatateurs (2)
b-agonistes (7)
antagonistes des récepteurs H2 (8)
anesthésiques (2)
stimulants (12)
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000

retrouvées dans les eaux traitées en sortie de station d’épuration (les données de Larsson et al.,, 2007 n’ont
pas été intégrées ici car elles reflètent un cas particulier d’eaux usées issues d’industries pharmaceutiques)
(nombre de données relevées dans chaque classe).
A l’exception de 5 molécules (4 antiviraux : penciclovir, abacavir, lamivudine, stavudine et 1

antibiotique : salinomycine), les 85 molécules détectées dans les eaux usées brutes (Figure 17)
sont retrouvées dans les eaux traitées (Figure 19). Ainsi, en dépit des traitements appliqués
dans les STEP, les composés identifiés en entrée le sont aussi généralement en sortie. Au sein
des analgésiques et anti-inflammatoires, les composés les plus recherchés et pour lesquels le
plus grand nombre de données ont été saisies sont l’ibuprofène (35), le diclofénac (34), le
naproxène (24), le kétoprofène (19) et le paracétamol (11). Le plus petit nombre de données
recueillies pour le paracétamol, par rapport au diclofénac ou à l’ibuprofène alors que dans les
eaux en entrée de STEP le nombre de données était équivalent (diclo. 13, ibu. 11, para. 11),
montre bien que ce dernier est moins retrouvé que les autres dans eaux traitées. Ce constat
suggère que le paracétamol est mieux éliminé dans les STEP que les autres molécules de sa
catégorie, ce qui est en accord avec les taux d’abattement relevés dans la littérature (Figure 7).
Cependant, le paracétamol et l’ibuprofène restent les 2 composés possédant les plus fortes
concentrations, respectivement 11,3 (France, Togola et Budzinski, 2008) et 12 µg/L (Espagne,
Gros et al., 2009). Avec la caféine, ce sont les 3 seuls composés possédant des concentrations
supérieures à 10 µg/L si on exclut les données relevées dans Larsson et al. (2007). Au sein
des antiépileptiques et antidépresseurs, la carbamazépine demeure le composé plus recherché
70
et le plus retrouvé. Ses concentrations varient entre 31 ng/L (France, Togola et Budzinski,
2008) et 6,3 µg/L (Allemagne, Ternes, 1998). Au sein des hypolipémiants, le gemfibrozil, le
bézafibrate, l’acide clofibrique et le fénofibrate sont les composés les plus retrouvés avec
respectivement 24, 18, 13 et 11 données recueillies pour chacun. A l’exception du fénofibrate,
les concentrations auxquelles ils sont retrouvés varient entre quelques ng/L et quelques µg/L.
Chez les antibiotiques, proportionnellement à leur niveau de consommation, les -lactames ne
sont que très peu détectés dans l’eau (Kümmerer, 2009a). Seul l’amoxicilline est représenté
Figure 19 pour avoir plus d’une valeur relevée dans la littérature. Si les données de Larsson et
al. (2007) sont exclues, les macrolides sont les antibiotiques les plus abondants avec des
concentrations comprises entre la dizaine de ng/L et le µg/L. L’érythromycine, la
roxithromycine, l’azithromycine et la clarithromycine sont les 4 molécules de cette famille les
plus souvent recherchées et détectées. Les fluoroquinolones (ciprofloxacine, norfloxacine,
ofloxacine, etc.) sont fréquemment recensés dans les effluents de STEP à des concentrations
allant de la dizaine à la centaine de ng/L. A titre exceptionnel et à titre de comparaison avec
l’ensemble des données collectées ici, les données de Larsson et al. (2007) sont rapportées. Ils
ont dosé certains fluoroquinolones comme l’enrofloxacine ou la norfloxacine à des
concentrations qui atteignent la centaine de µg/L et voir la dizaine de mg/L pour la
ciprofloxacine dans un effluent de STEP en Inde en raison d’un apport important d’eaux usées
provenant des industries pharmaceutiques en entrée de la station de traitement étudiée. Le
sulfaméthoxazole et le triméthoprime sont les sulfonamides les plus détectés dans les effluents
de STEP avec des concentrations généralement aux alentours de la centaine de ng/L et des
valeurs maximales, respectivement, de 2 µg/L (Allemagne, Hirsch et al., 1999) et de 1,26
µg/L (Suède, Thomas et al., 2007). Quelques tétracyclines comme la chlortétracycline,
l’oxytétracycline ou la doxycycline sont détectées dans les eaux de STEP. Les antibiotiques
appartenant aux autres classes sont moins recherchés et/ou retrouvés en concentrations plus
faibles. Les -bloquants sont très régulièrement détectés dans les effluents de STEP à des
concentrations variant du ng/L (ex. : l’acébutolol à 0,4 ng/L en France, Piram et al., 2008) au
µg/L (ex. : acébutolol à 3,6 µg/L, aténolol à 2,3 µg/L et sotalol à 3,3 µg/L en France Gabet-
Giraud et al., 2010 ; métoprolol à 2,2 µg/L en Allemagne, Ternes, 1998 ; ou le propranolol à
1,9 µg/L aux U.S.A, Huggett et al., 2003). Comme pour les fluoroquinolones, les fortes
concentrations dosées en métoprolol par Larsson et al. (2007) s’expliquent par la présence
d’effluents industriels en amont de la STEP étudiée. Les anticancéreux, quand ils sont
détectés dans les effluents de STEP, sont principalement à des concentrations de l’ordre de
quelques dizaines de ng/L (cyclophosphamide à 20 ng/L en Allemagne, Ternes, 1998 ;
tamoxifen compris entre 53 et 102 ng/L en France, Coetsier et al., 2009) mais peuvent parfois
atteindre le µg/L (ifosfamide à 2,9 µg/L en Allemagne, Ternes, 1998). Des antiviraux et en
particulier des anti-VIH à des concentrations variables (7,2 ng/L névirapine, 564 ng/L
zidovudine ; Prasse et al., 2010) sont aussi détectés dans les eaux en sortie de stations de
traitement.
71
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000 10 000 000 100 000 000
acide méfénamic
acide salicylique
aspirine
codéine
diclofénac
fénoprofène
flurbiprofène
ibuprofène
1-hydroxy-ibuprofène
indométhacine
kétoprofène
naproxène
O-desméthylnaproxène
paracétamol
phenazone
propyphenazone
caféine
propofol
carbamazépine
fluoxétine
zolpidem
alprazolam
diazépam
oxazépam
lorazépam
acide clofibrique
acide fénofibrique
acide-4-chlorobenzoïque
atorvastatine
mevastatine
bézafibrate
fénofibrate
gemfibrozil
cimétidine
ranitidine
salbutamol
clenbutérol
terbutaline
pentoxifylline
enalapril
hydrochlorothiazide
furosémide
glibendamide
sildénafil
Vardenafil
Tadalafil
amoxicilline
azithromycine
clarithromycine
érythromycine
novobiocine
roxithromycine
tylosine
clindamycine
lincomycine
ciprofloxacine
danofloxacine
enoxacine
enrofloxacine
loméfloxacine
marbofloxacine
norfloxacine
ofloxacine
sulfadiazine
sulfaméthazine
sulfaméthoxazole
sulfapyridine
sulfasalazine
triméthoprime
chlortétracycline
doxycycline
oxytétracycline
métronidazole
acébutolol
aténolol
bêtaxolol
bisoprolol
métoprolol
nadolol
oxprénolol
propranolol
sotalol
timolol
cyclophosphamide
ifosfamide
méthotréxate
tamoxifen
bléomycine
acyclovir
oseltamivir
oseltamivir carboxylate
névirapine
zidovudine
les eaux usées traitées en sortie de station d’épuration (par souci de lisibilité, les composés n’ayant qu’une
seule valeur n’apparaissent pas et les croix représentent les données relevées dans Larsson et al., 2007).
72
V.4. Les eaux de surface
Avec respectivement, 732 et 779 données collectées, 122 et 124 composés différents étudiés
et 16 et 17 classes thérapeutiques différentes rescensées, les eaux de surface et les eaux de
rejets de STEP sont les matrices les plus analysées et pour lesquelles on dispose de plus grand
nombre d’information (Tableau 13). Ce constat est en accord avec celui du projet KNAPPE.
Tableau 13 : Nombre d'informations recueillies dans les différentes matrices aqueuses.

nombre de nombre de nombre de classes
matrice
données collectées composés étudiés thérapeutiques recensées
rejets hôpitaux 275 46 8
entrée STEP 319 85 14
sortie de STEP 732 122 16
eau de surface 779 124 17
eau souterraine 97 42 11
eau potable 133 42 10
Comme pour les autres matrices aqueuses, en se basant sur le nombre de données recueillies,
les principales classes thérapeutiques étudiées sont les antibiotiques, les analgésiques et anti-
inflammatoires, les antiépileptiques et antidépresseurs, les -bloquants et les hypolipémiants
(Figure 20). La majorité des gammes de concentrations se situe entre le ng/L et quelques µg/L
mais les antibiotiques et les analgésiques et anti-inflammatoires atteignent la dizaine de µg/L.
Des classes thérapeutiques peu représentées et/ou peu étudiées comme les antihypertenseurs,
les antagonistes des récepteurs calciques ou les vasodilatateurs sont présents à des
concentrations relativement élevées de l’ordre de la centaine de ng/L. Contrairement aux
effluents hospitaliers, les agents de contraste ne sont plus les composés les plus abondants
dans les eaux de surface.
eau de surface
antiviraux (22)
anticancéreux (10)
b-bloquants (76)
antibiotiques (278)
diurétiques (9)
antagonistes des récepteurs calciques (2)
vasodilatateurs (2)
b-agonistes (9)
antagonistes des récepteurs angiotensine II (4)
histamine antagonistes des récepteurs H2 (13)
stimulants (22)
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000
retrouvées dans les eaux de surface (nombre de données relevées dans chaque classe).
73
Certaines études montrent l’impact qu’un rejet de STEP peut avoir sur la contamination des
rivières par exemple (Bendz et al., 2005; Kasprzyk Hordern et al., 2009). La contamination
des eaux de surface par les molécules pharmaceutiques est visible dans de nombreux endroits
du monde : France (Togola et Budzinski, 2008 ; Coetsier et al., 2009), Espagne (López-
Roldán et al., 2010), Allemagne (Prasse et al., 2010), Royaume Unis (Kasprzyk-Hordern et
al., 2007), Italie (Zuccato et al., 2000), Pologne (Kasprzyk-Hordern et al., 2007), Suède
(Bendz et al., 2005), Finlande (Vieno et al., 2006), U.S.A (Huggett et al., 2002 ; Kolpin et al.,
2002 ; Focazio et al., 2008), Canada (Chen et al., 2006 ; Garcia-Ac et al., 2009) Australie
(Watkinson et al., 2009), Chine (Chang et al., 2010), Inde (Nageswararao et al., 2008), Japon
(Nakada et al., 2006), Brésil (Stumpf et al., 1999).
La majorité des concentrations relevées pour les analgésiques et anti-inflammatoires ainsi que
celles relevées pour la carbamazépine et le sulfaméthoxazole se situent entre quelques ng/L et
le µg/L alors que pour les autres classes thérapeutiques et les autres composés, la majorité des
concentrations se situent entre quelques ng/L et la centaine de ng/L dans les eaux de surface.
Au sein des analgésiques et anti-inflammatoires, les concentrations maximales recueillies sont
celles du paracétamol (10 µg/L, U.S.A, Kolpin et al.,, 2002), de l’acide salicylique (4,1 µg/L,
Allemagne, Ternes, 1998) et de l’ibuprofène (2,7 µg/L, Espagne, Fernandez et al., 2009). La
caféine est fréquemment dosée dans les eaux de surface (17 données relevées) à des
concentrations variant entre 4 et 6 000 ng/L. La carbamazépine est le composé de la classe des
antiépileptiques et antidépresseurs le plus recherché et par conséquent le plus retrouvé. Ses
concentrations dans les eaux de surface varient entre 0,1 ng/L (France, AFSSA, 2009) et
1 100 ng/L (Allemagne, Ternes, 1998). Dans la même classe thérapeutique, le lorazépam est
fréquemment retrouvé en France (AFSSA, 2009 ; Coetsier et al., 2009 ; Vulliet et al., 2009) à
des concentrations variant entre 0,7 et 39 ng/L. Au sein des hypolipémiants, le bézafibrate et
le gemfibrozil sont les 2 molécules les plus détectées avec des concentrations variant
respectivement entre 0,2 et 3 100 ng/L et entre 0,3 et 790 ng/L. Les antibiotiques les plus
dosés sont le sulfaméthoxazole (44 données relevées) et le triméthoprime (42 données
relevées) pour la famille des sulfonamides et la norfloxacine (23 données relevées) pour les
fluoroquinolones. Toutes familles confondues, la concentration la plus forte, 15 µg/L, a été
obtenue pour la sulfadiméthoxine par Lindsey et al. (2001) aux U.S.A. Au sein des
macrolides, l’érythromycine et la déhydroérythromycine sont les 2 composés quantifiés aux
plus fortes concentrations de 1,7 µg/L (Hirsch et al., 1999 ; Kolpin et al., 2002). La
ciprofloxacine (1,3 µg/L) et la norfloxacine (1,15 µg/L) sont les deux fluoroquinolones dosées
à plus d’un µg/L dans les eaux de surface (Australie, Watkinson et al., 2009). En dehors de la
sulfadiméthoxine, en plus d’être le composé le plus recherché, le sulfaméthoxazole est aussi
le plus abondant de la famille des sulfonamide avec des concentrations maximales de 2 µg/L
(Australie, Watkinson et al., 2009) et 1,9 µg/L (U.S.A, Kolpin et al., 2002). L’oxytétracycline
est l’antibiotique de la famille des tétracyclines dosé à la plus forte concentration de 1,34 µg/L
(U.S.A, Lindsey et al., 2001). Les 3 -bloquants les plus recherchés et les plus mesurés sont
l’aténolol, le métoprolol et le propranolol. Ils sont présents à des concentrations variant
respectivement entre 0,2 et 334 ng/L, entre 1 et 2 200 ng/L et entre 0,1 et 590 ng/L. Les
anticancéreux sont peu recherchés et peu retrouvés dans les eaux de surface. Dans cette
classe, les 3 molécules identifiées sont le cyclophosphamide, le tamoxifène et la bléomycine.
Les antiviraux, et en particulier les anti-VIH, sont peu recherchés mais ont été retrouvés dans
les eaux de surface. Les plus fortes concentrations relevées sont celles de l’acyclovir (190
ng/L), utilisée dans les traitements de l’herpès, et de la zidovudine (170 ng/L), utilisée dans le
traitement du VIH (Prasse et al., 2010).
74
concentration (ng/l) 0 1 10 100 1 000 10 000 100 000
acide méfénamic
acide salicylique
aspirine
codéine
diclofénac
ibuprofène
hydroxy-ibuprofène
carboxy-ibuprofène
indométhacine
kétoprofène
naproxène
paracétamol
phenazone
propyphenazone
tramadol
caféine
diméthylxanthine
carbamazépine
diphénylhydantoin
gabapentin
chlorpromazine
fluoxétine
fluphénazine
diazépam
lorazépam
oxazépam
acide clofibrique
acide fénofibrique
atorvastatine
parvastatine
bézafibrate
fénofibrate
gemfibrozil
iopromide
cimétidine
loratidine
ranitidine
valsartan
salbutamol
clenbutérol
pentoxifylline
déhydronifédipine
enalaprilat
diltiazèm
hydrochlorothiazide
furosémide
glibendamide
metformine
amoxicilline
azithromycine
clarithromycine
érythromycine
érythromycine-H2O
oléandomycine
roxithromycine
spiramycine
tylosine
clindamycine
lincomycine
ciprofloxacine
danofloxacine
enoxacine
enrofloxacine
norfloxacine
ofloxacine
sarafloxacine
acide nalidixic
acide oxolinique
fluméquine
sulfadiazine
sulfadiméthoxine
sulfaméthazine
sulfaméthizole
sulfaméthoxazole
sulfapyridine
sulfathiazole
triméthoprime
chlortétracycline
oxytétracycline
tétracycline
métronidazole
ornidazole
chloramphénicol
monensine
acébutolol
aténolol
métoprolol
nadolol
propranolol
sotalol
timolol
cyclophosphamide
tamoxifen
acyclovir
oseltamivir
oseltamivir carboxylate
névirapine
stavudine
zidovudine
Figure 21 : Concentrations relevées dans la littérature pour 100 médicaments mesurées dans les eaux de surface
(par souci de lisibilité, les composés n’ayant qu’une seule valeur n’apparaissent pas sur cette figure).
75
V.5. Les eaux souterraines
Dans les eaux souterraines, les analgésiques et anti-inflammatoires, les antibiotiques et les
antiépileptiques et antidépresseurs demeurent les classes thérapeutiques les plus recherchées
et par conséquent les plus retrouvées (Figure 22). Alors que dans les autres matrices aqueuses,
les -bloquants sont fréquemment détectés, peu de données ont été relevées sur leur présence
dans les eaux souterraines. Néanmoins, la gamme de concentrations auxquelles ils peuvent
être quantifiés reste étendue, de quelques dixièmes de ng/L à plusieurs centaines de ng/L.
Bien que les concentrations soient plus faibles que dans les effluents hospitaliers, les agents
de contraste, lorsqu’ils sont recherchés et détectés, sont présents à des niveaux de
concentration importants, de la centaine de ng/L au µg/L. Lorsqu’ils sont recherchés et
détectés, les composés de certaines classes peu étudiées comme les antagonistes des
récepteurs calciques (déhydronifédipine) ou les antihypertenseurs (diltiazème) sont présents à
des concentrations non négligeables d’une vingtaine de ng/L.
eau souterraine
b-bloquants (6)
antibiotiques (22)
diurétiques (2)
antagonistes des recéptueurs calciques (1)
stimulants (2)
0 1 10 100 1 000 10 000
retrouvées dans les eaux souterraines (nombre de données relevées dans chaque classe).
Les concentrations auxquelles les molécules pharmaceutiques peuvent être dosées dans les
eaux souterraines sont variables. En effet, deux composés de la même classe peuvent être
dosés à des valeurs très différentes comme par exemple le naproxène qui est dosé à des
concentrations inférieures à la dizaine de ng/L (0,4 - 2 ng/L) alors que l’ibuprofène est dosé à
des concentrations supérieures à la centaine de ng/L (200 - 3 110 ng/L) ; mais un même
composé peut également être dosé à des valeurs très différentes (ex. : acide salicylique 1,1 -
1 225 ng/L). L’acide clofibrique, un hypolipémiant, est le composé qui a été relevé à la plus
forte concentration (7,3 µg/L ; Allemagne, Heberer, 2002) parmi les 42 molécules
pharmaceutiques répertoriées Figure 23. Le sulfaméthoxazole (9 données saisies), la
carbamazépine (7 données saisies) et le diclofénac (6 données saisies) sont les composés les
plus souvent recherchés dans les eaux souterraines et pour lesquels le plus d’informations ont
pu être recueillies. Ils sont présents à des concentrations variant respectivement entre 0,2 et
1 110 ng/L, entre 0,1 et 900 ng/L et entre 0,2 et 590 ng/L.
76
0 1 10 100 1 000 10 000
acide salicylique
diclofénac
ibuprofène
kétoprofène
naproxène
paracétamol
phenazone
propyphenazone
caféine
diméthylxanthine
carbamazépine
fluoxétine
bromazépam
diazépam
lorazépam
oxazépam
zolpidem
acide clofibrique
acide fénofibrique
bézafibrate
fénofibrate
gemfibrozil
acide amidotrizoïque
iopamidol
déhydronifédipine
diltiazèm
furosémide
metformine
érythromycine-H2O
roxitromycine
lincomycine
danofloxacine
enrofloxacine
marbofloxacine
sulfaméthazine
sulfaméthoxazole
clotrimazole
aténolol
métoprolol
propranolol
sotalol
les eaux souterraines.
V.6. Les eaux de boisson
Bien que les concentrations soient faibles, 41 molécules pharmaceutiques différentes

appartenant à 10 classes thérapeutiques différentes ont été rapportées dans des eaux destinées
à la consommation humaine (Figure 24 et Figure 25). Comme pour les autres matrices
aqueuses, les analgésiques et anti-inflammatoires, les antiépileptiques et antidépresseurs, les
antibiotiques, les hypolipémiants et les -bloquants sont toujours les principales classes
thérapeutiques étudiées et pour lesquelles le plus d’information sont disponibles. A
l’exception des analgésiques et anti-inflammatoires, les concentrations, auxquelles les
composés sont dosés, sont généralement inférieures à quelques centaines de ng/L.
77
eau potable
anticancéreux (3)
b-bloquants (10)
antibiotiques (23)
antagoniste des recépteurs calciques (1)
stimulants (5)
0 1 10 100 1 000
retrouvées dans les eaux potables (eaux en sortie de station de potabilisation ou eaux de boisson) (nombre
de données relevées dans chaque classe).
L’AMDOPH (1-acétyl-1-méthyl-2-diméthyl-oxamoyl-2-phénylhydrazide), un analgésique

dérivé du diméthylaminophénazone, est le composé quantifié à la plus forte concentration
dans les eaux potables (900 ng/L, Allemagne, Reddersen et al., 2002). Les deux autres
analgésiques de la même famille, le phénazone et le propyphénazone, sont également dosés à
de fortes concentrations, 400 ng/L et 120 ng/L respectivement (Reddersen et al., 2002).
Contrairement aux autres matrices aqueuses passées en revue jusqu’ici, le diclofénac ou
l’ibuprofène ne font plus partie des analgésiques et anti-inflammatoires les plus fortement
concentrés dans les eaux potables. La concentration maximale relevée pour le diclofénac est
de 3 ng/L et celle pour l’ibuprofène de 1 ng/L. En revanche, le paracétamol fait toujours partie
des composés les plus abondants. Sa concentration maximale est de 210 ng/L (France, Togola
et Budzinski, 2008). La caféine est fréquemment détectée dans les eaux potables à des
concentrations variant entre 7 ng/L (Canada, Chen et al., 2006) et 119 ng/L (U.S.A,
Stackelberg et al., 2004). D’après le nombre de données collectées (14), la carbamazépine est
la molécule la plus détectée dans les eaux de boisson (Figure 25). Ses concentrations varient
entre 0,8 ng/L (Canada, Chen et al., 2006) et 258 ng/L (U.S.A, Stackelberg et al., 2004). Des
antidépresseurs comme l’oxazépam et des hypolipémiants comme l’acide fénofibrique ou le
bézafibrate sont régulièrement retrouvés dans les eaux de boisson à des concentrations variant
du dixième de ng/L (acide fénofibrique 0,2 ng/L ; France, Vulliet et al., 2009) à plusieurs
dizaines de ng/L (oxazépam 56 ng/L ; France, AFSSA, 2009). Alors que les agents de
contraste sont présents dans les eaux potables à des concentrations toujours supérieures à la
diazine de ng/L, les concentrations relevées pour les antibiotiques sont toujours inférieures à
cette valeur, à l’exception de la roxithromycine quantifiée une fois à 18 ng/L (France,
AFSSA, 2009). L’aténolol et le métoprolol sont les deux -bloquants identifiés dans les eaux
potables. Leurs concentrations sont inférieures ou égales à la dizaine de ng/L. Deux
anticancéreux ont été retrouvés dans les eaux de boisson, il s’agit du méthotréxate et de la
bléomycine. Les anti-VIH ou les inhibiteurs PDE 5 n’ont jamais été recherchés dans les eaux
potables.
78
0 1 10 100 1 000
acide salicylique
codéine
diclofénac
ibuprofène
kétoprofène
naproxène
paracétamol
AMDOPH
phenazone
propyphenazone
caféine
carbamazépine
amitriptyline
fluoxétine
diazépam
lorazépam
oxazépam
acide clofibrique
acide fénofibrique
parvastatine
bézafibrate
diatrizoate
iomeprol
iopamidol
iopromide
déhydronifédipine
metformine
érythromycine
roxithromycine
tylosine
ofloxacine
acide oxolinique
fluméquine
sulfaméthoxazole
sulfathiazole
triméthoprime
aténolol
métoprolol
méthotréxate
bléomycine
les eaux potables (AMDOPH : 1-acetyl-1-methyl-2-dimethyl-oxamoyl-2-phenylhydrazid).
V.7. Les boues des STEP
D'après le bilan massique réalisé par (Heidler et Halden, 2008), basé sur un ensemble de
données publiées dans des articles scientifiques à comité de lecture, la répartition des
composés entre les boues et les eaux traitées ne peut pas être généralisée à l'ensemble des
molécules d'une même classe thérapeutique. En effet, au sein des antibiotiques par exemple,
des molécules comme le triméthoprime ou le sulfaméthoxazole, de la famille des
sulfonamides, se retrouvent majoritairement dans les eaux alors que des composés de la
famille des fluoroquinolones, comme la norfloxacine ou la ciprofloxacine par exemple, se
retrouvent à plus de 70 % dans les boues (Figure 26). D'après Heidler et Halden (2008), la
répartition des composés entre les différentes matrices (eau/boue) dans les STEP est liée à
leur propriété physico-chimique et peut être estimée à partir des coefficients de partage
octanol-eau (Kow) ou de la constante organique des sols (Koc).
79
carbamazépine 116
triméthoprime 104
triméthoprime 36
sulfaméthoxazole 38
clarithromycine 79
norfloxacine 72
norfloxacine 75
ciprofloxacine 77
ciprofloxacine 83
0 50 100
bilan massique (%)
Figure 26 : Répartition des composés pharmaceutiques entre les boues (plein) et les eaux traitées (rayé)
dans les STEP. En blanc apparaît la fraction perdue par dégradation (graphique adapté de Heidler et
Halden, 2008).
concentration (ng/g)
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000
acide méfénamic
diclofénac
ibuprofène
indométhacine
kétoprofène
naproxène
paracétamol
phenazone
caféine
carbamazépine
fluoxéthine
diazépam
acide clofibrique
atorvastatine
bézafibrate
fénofibrate
gemfibrozil
cimétidine
famotidine
ranitidine
clenbutérol
salbutamol
oméprazole
hydrochlorothiazide
furosémide
glibendamide
sildénafil
Vardenafil
Tadalafil
azithromycine
clarithromycine
érythromycine
josamycine
roxithromycine
tylosine
ciprofloxacine
norfloxacine
ofloxacine
sulfaméthazine
sulfaméthoxazole
sulfapyridine
sulfathiazole
triméthoprime
doxycycline
4-épitétracycline
tétracycline
métronidazole
chloramphénicol
miconazole
aténolol
nadolol
pindolol
propranolol
sotalol
les boues des stations d’épuration.
80
Les données, relevées dans la littérature, sur le niveau de concentration des molécules
pharmaceutiques dans les boues de STEP sont présentées Figure 27. Les antibiotiques sont les
composés les plus abondants dans les boues de STEP avec des concentrations dépassant
fréquemment le µg/g en particulier pour les familles des macrolides (ex. : azithromycine 5,2
µg/g (US EPA, 2009) ; tylosine 4 µg/g (Nieto et al., 2007)) ; des fluoroquinolones (ex.
ciprofloxacine 97,5 µg/g (Thomas et al., 2007) ; ofloxacine 58,1 µg/g (US EPA, 2009)) ou
des tétracyclines (ex. : tétracycline 5,27 µg/L (US EPA, 2009) ; doxycycline 5,09 (US EPA,
2009)). Les fortes concentrations en fluoroquinolones relevées concordent avec les résultats
du bilan massique réalisé par Heidler et Halden (2008). En revanche, certains antibiotiques
comme le sulfaméthoxazole qui faisait partie des composés les plus abondants dans les eaux
traitées (Figure 21) sont parmi les antibiotiques les moins concentrés dans les boues de STEP.
En plus des antibiotiques, 3 composés, la carbamazépine (max. 6,03 µg/g), la fluoxétine (max.
3,13 µg/g) et la cimétidine (max. 8,33 µg/g), sont dosés à des concentrations supérieures au
µg/g dans les boues de STEP (US EPA, 2009). Contrairement aux eaux traitées, les composés
appartenant aux classes des hypolipémiants et des analgésiques et anti-inflammatoires ne sont
pas les plus présents dans les boues de STEP. Leurs concentrations sont inférieures à la
centaine de ng/g. Bien que présents en faible quantité, des inhibiteurs de PDE 5 ont été
détectés dans les boues de STEP à des concentrations variant entre 3 et 17 ng/g de boue
(Allemagne, Nieto et al., 2010a).
V.8. Les effluents d’élevage et les sols amendés avec les effluents
d’élevage
En médecine vétérinaire, deux classes de molécules pharmaceutiques sont majoritairement

administrées aux animaux d'élevage : les antibiotiques et les antiparasitaires. Les
antiparasitaires n'ont pas été étudiés au cours de cette synthèse bibliographique car ils ne
constituent qu'un quart des ventes de médicaments vétérinaires. De plus, certains principes
actifs antiparasitaires peuvent également être utilisés dans des produits phytosanitaires
(AFSSA, 2010). Ainsi la présence dans l'environnement de ces composés n'est pas
exclusivement liée à leur usage médical.
En raison de leur forte utilisation dans le traitement des animaux, la tétracycline,

l'oxytétracycline et la chlortétracycline pour la famille des tétracyclines, la sulfadiazine, la
sulfaméthazine et le triméthoprime pour la famille des sulfonamides et la tylosine pour la
famille des macrolides sont les antibiotiques les plus souvent recherchés dans les effluents
d’élevage (Tableau 14). Thiele-Bruhn (2003) rapporte des concentrations de 3,5 mg/kg pour
les sulfonamides et de 4 mg/kg pour les tétracyclines dans les lisiers et fumiers. En France,
d’après le rapport de l’ADEME de Algros et Jourdain (2007), l’oxytétracycline, la
doxycycline, la tétracycline, la sulfaméthazine et la fluméquine ont été dosées respectivement
à 20,4 µg/L, 0,53 µg/L, 0,19 µg/L, 4,59 µg/L et 1,51 µg/L dans des lisiers mais de la tylosine,
de la clindamycine, de l’acide oxolinique et de l’enrofloxacine ont aussi été détectés. D’après
ce même rapport, dans des fumiers, de l’oxytétracycline (1,61 mg/kg), de la tylosine (0,65
mg/kg), et de la sulfaméthazine (0,18 - 0,73 mg/kg) ont été trouvées. L’ordre de grandeur de
la contamination des lisiers et fumiers est le µg/g ou µg/L.
81
Tableau 14 : Concentrations des antibiotiques analysés dans les effluents d'élevage et les sols enrichis avec
ces déchets (ng/g).
composés matrices quantités trouvées références bibliographiques
tylosine sol 9 jours après épandage 8 - 57,4 Jacobsen et al., 2004
sol 155 jours après épandage 2,9 - 18 Jacobsen et al., 2004
lincomycine lisier hiver 120 - 3 800 Hu et al., 2010
sol hiver 1,1 - 11,7 Hu et al., 2010
ciprofloxacine sol 450 Martinez-Carballo et al., 2007
lisier hiver 100 - 4 300 Hu et al., 2010
sol hiver 10,3 - 30,1 Hu et al., 2010
sol été 0,8 Hu et al., 2010
enrofloxacine lisier porcin (fosse) 270 - 510 µg/L Pierini et al., 2004
lisier porcin (lagune) < 0,6 µg/L Pierini et al., 2004
lisier porcin 130 - 750 Martinez-Carballo et al., 2007
lisier de poulet 2 800 Martinez-Carballo et al., 2007
lisier de dinde 8 300 Martinez-Carballo et al., 2007
sol 370 Martinez-Carballo et al., 2007
ofloxacine lisier hiver 1 200 - 15 700 Hu et al., 2010
lisier été 230 - 7 800 Hu et al., 2010
sol été 0,6 - 1,6 Hu et al., 2010
péfloxacine lisier hiver 3 300 - 24 700 Hu et al., 2010
sulfachloropyridazine lisier hiver 300 - 2 400 Hu et al., 2010
sol hiver 1,3 - 2,5 Hu et al., 2010
sulfadiazine lisier de poulet 51 000 Martinez-Carballo et al., 2007
sulfadoxine lisier hiver 100 - 32 700 Hu et al., 2010
sulfaméthazine lisier porcin 20 000 Martinez-Carballo et al., 2007
lisier hiver 2 000 - 5 700 Hu et al., 2010
triméthoprime lisier de poulet 1 700 Martinez-Carballo et al., 2007
chloramphénicol lisier hiver 3 400 - 15 300 Hu et al., 2010
chlortétracycline lisier porcin 100 Hamscher et al., 2002
sol 4,6 - 7,1 Hamscher et al., 2002
lisier porcin 100 - 4 600 Martinez-Carballo et al., 2007
sol 9 jours après épandage 8,9 - 15,5 Jacobsen et al., 2004
sol 155 jours après épandage 0,7 - 0,8 Jacobsen et al., 2004
lisier hiver 400 - 26 800 Hu et al., 2010
sol hiver 33, 1 - 1 079 Hu et al., 2010
oxytétracycline lisier porcin 210 - 29 000 Martinez-Carballo et al., 2007
sol hiver 124 - 2 683 Hu et al., 2010
tétracycline lisier porcin 4 000 Hamscher et al., 2002
sol 43 - 199 Hamscher et al., 2002
lisier porcin 360 - 23 000 Martinez-Carballo et al., 2007
sol hiver 20,9 - 105 Hu et al., 2010
82
Thiele-Bruhn (2003) rapporte des concentrations de 450 - 900 µg/kg pour les tétracyclines, de
13 - 67 µg/kg pour les macrolides et de 6 - 52 µg/kg pour les fluoroquinolones dans des sols
amendés par des déchets d’élevage. Dans ce même type de matrice, Kemper (2008) rapporte
des concentrations de 305 µg/kg pour l’oxytétracycline, de 200 à 900 µg/kg pour la
tétracycline, de 39 µg/kg pour la chlortétracycline, de 6 à 52 µg/kg pour la ciprofloxacine, de
11 µg/kg pour la sulfaméthazine, de 8,5 µg/kg pour la lincomycine, de 1 µg/kg pour la
sulfadiazine et de 0,5 µg/kg pour le triméthoprime. L’ordre de grandeur de la
contamination du sol après enrichissement par des déchets d’élevage est de la dizaine à la
centaine de µg/kg soit la perte d’un facteur dix à cent par rapport aux effluents d’élevage.
V.9. Les sédiments
Peu d’études portent sur l’analyse des molécules pharmaceutiques dans les sédiments. En
effet, alors que 425 références d’articles sont parus en 2009 (213) et en 2010 (212) sur l’étude
des molécules pharmaceutiques dans l’environnement (Figure 1), seulement une cinquantaine,
28 en 2010 et 26 en 2009, traitent des sédiments (résultats obtenus après une recherche dans
la base de données Scopus en indiquant les termes « pharmaceutical » et « sediment » à
rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés et en éliminant les articles traitant des tests
de toxicité en laboratoire). Par ailleurs, lorsque les molécules pharmaceutiques sont
recherchées dans les sédiments, elles ne sont pas toujours détectés (Jelić et al., 2009 ; Pérez-
Carrera et al., 2010).
Tableau 15 : Concentrations en antibiotiques trouvées dans les sédiments (ng/g).

valeur valeur référence
composés pays
minimale maximale bibliographique
érythromycine Italie 0,01 0,63 Zuccato et al., 2000
érythromycine-H2O Chine 1,26 385 Yang et al., 2010
roxithromycine Chine 0,99 133 Yang et al., 2010
spiramycine Italie 0,38 2,9 Zuccato et al., 2000
tylosine Italie 0,13 2,64 Zuccato et al., 2000
lincomycine Italie 0,13 Zuccato et al., 2000
ciprofloxacine Chine 9,02 197 Yang et al., 2010
norfloxacine Chine 19,2 1 120 Yang et al., 2010
ofloxacine Chine 11,4 1 560 Yang et al., 2010
sulfadiazine Chine 3,08 83,9 Yang et al., 2010
sulfaméthazine Chine 1,91 248 Yang et al., 2010
tétracycline Chine 2,96 72 Yang et al., 2010
oxytétracycline Chine 0,93 196 Yang et al., 2010
100 11 000 Halling-Sorensen et al., 1998
(d'après Björklund et al., 1990 et 1991 ;
Coyne et al., 1994 ; Poliquen et al., 1993;
Weston et al., 1994 ; Kerry et al., 1995)
285 000 Halling-Sorensen et al., 1998
(d'après Samuelsen et al., 1992)
100 4 900 Halling-Sorensen et al., 1998
(d'après Jacobsen et Berglind, 1988)
500 4 000 Thiele-Bruhn, 2003
83
Quelques données, relevées dans la littérature, sur la contamination des sédiments par les
antibiotiques sont présentées dans le Tableau 15. Les fluoroquinolones comme la norfloxacine
et l’ofloxacine sont dosées à des concentrations importantes de l’ordre du mg/kg par Yang et
al. (2010) mais les valeurs les plus fortes sont rapportées par Halling-Sorensen et al. (1998)
pour l’oxytétracycline avec une concentration maximale de 285 mg/kg.
VI. Toxicité et écotoxicité

Les molécules pharmaceutiques sont produites pour être biologiquement actives et agir sur les
récepteurs humains et animaux ou être toxiques envers les organismes infectieux (Jelić et al.,
2009). Cependant, elles peuvent être la cause de réactions indésirables dans les organismes
(toxicité), ou être responsable d'effets néfastes dans les écosystèmes (écotoxicité). Lorsque le
médicament a volontairement été consommé et que des réactions indésirables se produisent,
on parle d'effet secondaire. Ce sujet est abordé dans le premier paragraphe de la partie sur la
toxicité des molécules pharmaceutiques. Des interactions entre les molécules
pharmaceutiques et des organismes non ciblés peuvent également avoir lieu, et être néfastes
pour ces organismes, s’ils possèdent les sites d’actions de ces molécules (ex. : enzymes,
récepteurs, etc.). Ce volet est étudié dans le deuxième paragraphe de la première partie. Pour
estimer la toxicité d’une molécule et définir les concentrations auxquelles des effets toxiques
sont observés, des tests de toxicité sont réalisés. Ce sujet est traité dans le troisième
paragraphe de la première partie. La deuxième partie est consacrée à la problématique de
l'antibiorésistance. Enfin, la troisième partie est dédiée à l'écotoxicité des molécules
pharmaceutiques au travers de la démarche de l'évaluation du risque environnemental (ERA,
Environmental Risk Assessment).
VI.1. Toxicité
VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments
La toxicité d'un médicament peut s'évaluer d'après les effets indésirables qu'il génère. Selon
les directives 2001/83/CE et 2001/82/CE, un effet indésirable est « une réaction nocive et non
voulue à un médicament, se produisant aux posologies normalement utilisées chez
l'homme/L’animal pour la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement d'une maladie ou pour la
restauration, la correction ou la modification d'une fonction physiologique ». Par conséquent,
un médicament peut être nocif et représenter un danger pour l'homme ou l'animal à qui il a été
administré.
Les effets indésirables ou effets secondaires de certains médicaments, comme les

antibiotiques qui provoquent des troubles digestifs, sont parfois courants et ne représentent
pas un grave danger. En revanche, les réactions allergiques à la pénicilline par exemple
peuvent être plus graves jusqu’à provoquer des chocs anaphylactiques. De même,
l’hépatotoxicité du paracétamol ne représente pas un risque aux posologies habituelles mais
un surdosage important entraîne la mort. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens comme
l'ibuprofène, de par leur mode d'action, détruisent les globules blancs du système immunitaire.
De plus, ils sont responsables de troubles gastro-intestinaux et de la formation d’ulcères
(dictionnaire Vidal, 2006). L’ibuprofène est également un néphro-toxique. Certains
antidépresseurs sont également responsables de troubles digestifs (nausée, constipation, etc.)
et de tachycardie. Les -bloquants peuvent provoquer des troubles cardiaques, une
constriction des bronches ou des hypoglycémies (http://www.cite-sciences.fr/Lexique/
84
definition1.php?definition=2&idmot=395&iddef=876&idmedia=&page=&rech_lettre=b&nu
m_page=4&recho=&radiob=&resultat=&habillage=standard&lang=fr&id_expo=25&id_habil
lage=42, 24/11/2006). Les anticancéreux agissent sur la reproduction et la division des
cellules cancéreuses mais ils peuvent aussi interagir avec toutes les cellules de l’organisme et
provoquer de nombreux effets secondaires comme des problèmes de toxicité gastro-
intestinale, rénale, vésicale, dermatologique, cardiaque, hépatique, pulmonaire, … (http://
www.caducee.net/DossierSpecialises/cancerologie/agents-anticancereux.asp#definition, http:
//www.med.univ-rennes1.fr/resped/s/pharma co/antican/an tican.ppt, 24/11/2006). Les
antiviraux utilisés pour le traitement du VIH sont lourds à supporter à cause de leurs effets
secondaires tels que les diarrhées, les nausées, les neuropathies (affection des cellules
nerveuses), la lipodystrophie (modification de la répartition des graisses dans le corps :
creusement des joues, amas de graisses au niveau du cou, du ventre…) ou encore les effets
neuropsychiques (vertiges, troubles d’humeur, dépression) (http://www.solidarite-
sida.org/index.php3?dossier=sidamst&partie=sidamst_traitements, 26/02/2008). L'organisa-
tion mondiale pour la santé (OMS) écrit même à propos des anti-VIH qu'il sont "responsables
d’un large éventail de toxicités allant de la simple intolérance de grade 1 ou 2 (gêne légère,
limitation des activités) et de résolution spontanée, aux effets secondaires pouvant mettre en
jeu le pronostic vital" (OMS, 2008). En conséquence, même volontairement consommés les
médicaments ne sont pas sans risque pour la santé humaine.
VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés
Une fois que les molécules pharmaceutiques ont atteint les écosystèmes naturels, si les
récepteurs avec lesquels elles interagissent sont présents dans les organismes non ciblés, elles
pourront avoir un effet sur ces organismes. Par exemple, des -bloquants comme le
métoprolol peuvent agir sur les récepteurs 1 des érythrocytes de truites ou le nadolol et le
propranolol peuvent agir à la fois sur les récepteurs 1 des érythrocytes et sur les récepteurs
2 des cellules cardiaques de truites arc-en-ciel (Huggett et al., 2003). De la même façon, des
anti-inflammatoires non-stéroïdiens activent les cytochromes P 450 de différents organismes
et la fluoxétine inhibe l’activité de l’acétylcholine-estérase. Le sulfaméthizole inhibe l’activité
basale de l’EROD (éthoxyresorufin-O-deéthylase) (Laville et al., 2004 dans Boxall, 2004).
Dans leur synthèse bibliographique sur la toxicité et l’écotoxicité des molécules
pharmaceutiques, Fent et al. (2006) passent en revue différentes classes thérapeutiques, le
mode d’action des molécules qui les composent et l’existence ou non des récepteurs et
biomolécules dans les organismes vertébrés ou invertébrés. Les AINS par exemple inhibent
les enzymes cyclo-oxygénases (COX) ; or des homologues de ces enzymes COX ont été
trouvés chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Les AINS pourraient donc avoir un
effet sur la truite arc-en-ciel. De la même façon, les fibrates (hypolipémiants) se fixent sur les
récepteurs PPAR (Peroxysome Proliferator-Activated Receptors) pour stimuler l’expression
de la lipoprotéine lipase or des gènes PPAR ont été trouvés chez divers poissons comme le
carrelet, le saumon d’Atlantique ou le poisson zèbre (Fent et al., 2006).
Par ailleurs, des effets toxiques ont été mis en évidence sans pour autant que des homologies
de récepteurs aient été recherchées. Selon Gagné et al. (2006), la pénicilline G, à 100µM,
provoque le déclanchement du métabolisme oxydatif par l’oxydation du NADPH dans des
hépatocytes de truites (tests in vitro) et il en est de même pour le sulfaméthoxazole, la
sulfapyridine, l’oxytétracycline et la novobiocine. Une étude réalisée in vitro par Miller et al.
(1999) met en évidence une inhibition de la synthèse de la vitellogénine par le paracétamol
dans des cellules de foie de truites. Pour Pomati et al. (2006), 13 molécules pharmaceutiques
85
en mélange (aténolol, bézafibrate, carbamazepine, cyclophosphamide, ciprofloxacine,

furosémide, hydrochlorothiazide, ibuprofène, lincomycine, ofloxacine, ranitidine, salbutamol
et sulfaméthoxazole) inhibent la croissance des cellules embryonnaires HEK293 de 10 à 30 %
et cette inhibition est associée à une réponse au stress cellulaire et au blocage du cycle
cellulaire. Pour Caminada et son équipe (2006), d’après des tests in vitro de toxicité cellulaire,
la doxorubicine est cytotoxique à partir de 1,14 mg/L.
D’autres études se sont focalisées sur la mise en évidence d'effets toxiques comme la
génotoxicité, la mutagénicité ou la cytotoxicité. Ainsi Hartmann et ses co-auteurs (1998) ont
montré au travers de tests umuC que les composés responsables de la génotoxicité des eaux
usées d’hôpitaux n’étaient pas des anticancéreux comme la doxorubicine, la bléomycine, le
cisplatine, la dacarbazine, l’étoposide, le fluorouracil ou la mitomycine C mais la
ciprofloxacine, un antibiotique de la famille des fluoroquinolones. Toujours d’après ces
auteurs, les antibiotiques tels que l’amoxicilline, la norfloxacine, le métronidazole et
l’ornidazole ne sont pas des composés génotoxiques. En revanche pour Giuliana et ses
collaborateurs (1996 dans Halling-Sørensen et al., 1998), le cisplatine et la mitomycine C sont
responsables de la génotoxicité des rejets hospitaliers. Par ailleurs, les anticancéreux tels que
l’ifosfamide et le cyclophosphamide (Steger-Hartmann et al., 1996 et 1997) ou les
antibiotiques de la classe des quinolaxines tels que le carbadox et l’olaquindox (Beutin et al.,
1981) sont présentés comme mutagènes et cancérigènes.
Enfin, dans un autre domaine, Huggett et al. (2002) ont étudié la reprotoxicité du propranolol.
Ce -bloquant affecte la reproduction (diminution du nombre de nouveaux-nés par femelle)
de l’amphipode Hyalella azteca après 27 jours d’exposition à 100 µg/L. Il peut également
affecter la reproduction du cladocère Ceriodaphnia dubia en provoquant une diminution du
nombre de nouveaux-nés par individu après 7 jours d’exposition à 250 µg/L. De plus, après 2
semaines d’exposition au propranolol à des concentrations inférieures ou égales à 500 µg/L, le
nombre d’œufs pondus et le pourcentage d’œuf viables éclos ne change pas mais, le niveau de
testostérone chez les médakas mâles est diminué et celui d’oestradiol chez les médakas
femelles augmenté. En revanche, le propranolol réduit le nombre d’œufs pondus par Oryzias
latipes (médaka) et le pourcentage d’œuf viables éclos après 4 semaines d’exposition à 0,5
µg/L.
VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC50, LOEC, NOEC, etc.)
Pour estimer l'impact des molécules pharmaceutiques sur les communautés ou sur les
organismes, des tests de toxicité sont réalisés. Classiquement, ils sont pratiqués sur des
vertébrés comme les médakas ou les poissons zèbres, des invertébrés comme les daphnies ou
des cyanobactéries (recommandées pour les antibiotiques). Ils permettent de définir les
concentrations effectives (EC50, concentrations pour lesquelles la molécule aura un impact sur
la croissance ou la reproduction de 50 % des organismes étudiés), les concentrations léthales
(LC50, concentrations pour lesquelles la molécule provoquera la mort de 50 % des individus)
ou encore les LOEC (Lowest Observed Effects Concentration) et les NOEC (No Observed
Effects Concentration) c'est-à-dire les plus petites concentrations provocant des effets
observables et les concentrations n'entraînant pas d'effets observables.
86
Figure 28 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant des effets toxiques aigus sur les
algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (EC50) (graphique extrait d'une
présentation de J. Garric, mai 2009
(http://www.onema.fr/IMG/pdf/J.Garric_CEMAGREF_Atelier_3.pdf, 15/12/10)).
Des niveaux de concentrations provoquant des effets toxiques aigus (EC 50) sont présentés
Figure 28. La majorité des valeurs de toxicité aiguë chez les invertébrés sont comprises entre
le mg/L et la centaine de mg/L. Cependant, des antidépresseurs comme la sertraline, la
paroxétine ou la fluoxétine présentent des EC50 plus faibles de l'ordre de la centaine de µg/L.
De même, le propranolol présente des EC50 plus faibles que les autres composés ou que les
autres -bloquants comme le nadolol ou l'acébutolol. Néanmoins, à l’exception des eaux
usées (rejets hospitaliers et entrée de STEP), les molécules pharmaceutiques sont rarement
dosées à des concentrations supérieures à la dizaine de µg/L. Il y a donc peu de risque que les
molécules pharmaceutiques soient toxiques (toxicité aiguë) pour les invertébrés aux
concentrations environnementales auxquelles elles sont mesurées. La toxicité aiguë des
molécules pharmaceutiques envers les algues et les cyanobactéries (cyanophytes) a
majoritairement été testée pour les antibiotiques et quelques autres composés. Les
concentrations effectives relevées sont comprises entre la centaine de µg/L et la dizaine de
mg/L pour les algues, à l'exception de celles de la clarithromycine et de l'érythromycine, deux
antibiotiques de la famille des macrolides, et de la fluoxétine, un antidépresseur, qui sont
comprises entre le µg/L et la centaine de µg/L. Les concentrations effectives relevées sont
comprises entre le µg/L et la centaine de µg/L pour les cyanobactéries. Avec les plus faibles
87
EC50 (< 10 µg/L), l'amoxicilline, la pénicilline G (benzylpénicilline), la spiramycine, la

streptomycine et la ciprofloxacine sont les antibiotiques les plus toxiques pour les
cyanobactéries. Dans l’environnement, des concentrations de l’ordre de quelques µg/L ont été
relevées pour les antibiotiques. Aussi, le risque que les antibiotiques soient toxiques (toxicité
aiguë) pour les cyanobactéries aux concentrations environnementales auxquelles ils sont
mesurés existe.
Figure 29 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant (EC50) ou ne provoquant pas

(NOEC) des effets toxiques chroniques sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et
les poissons (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009
(http://www.onema.fr/IMG/pdf/J.Garric_CEMAGREF_Atelier_3.pdf, 15/12/10)).
Des niveaux de concentrations provocant ou non des effets toxiques chroniques (EC 50 ou
NOEC) sont présentés Figure 29. Les concentrations sans effets observables sur les
invertébrés sont généralement supérieures à la centaine de µg/L mais des NOEC de l'ordre du
µg/L ont été relevées pour la sertraline, le propranolol et le clofibrate. Ces informations sur la
sertraline et le propranolol viennent confirmer les données de toxicité aiguë (Figure 28). Par
rapport aux concentrations environnementales auxquelles les molécules pharmaceutiques sont
mesurées, le risque qu’elles soient toxiques (toxicité chronique) pour les invertébrés est limité
mais pourrait s’exprimer pour quelques molécules comme la sertraline ou le propra-
88
Tableau 16 : Concentrations effectives en µg/L (EC50) pour 24 antibiotiques relevées dans la littérature (Halling-Sorensen et al., 1998 ; Holten Lützhoft et al.,
1999 ; Halling-Sorensen et al., 2000 ; Golet et al., 2002a ; Thiele-Bruhn, 2003 ; Ferrari et al., 2004 ; Huschek et al., 2004).
bactéries cyanobactéries algues zooplancton poisson
Vibrio Pseudomonas Microcystis Synechococcus Selenastrum Pseudokirchneriella Chlorella Cyclotella Rhodomonas Daphnia
bactérie
sp putida aeruginosa leopolensis capricornutum subcapitata sp meneghiniana salina magna
amoxicilline 3,7 250 000 3 108 000
mécillinam 62 100 60
pénicilline G 84 600
clarithromycine 151 280 000
érythromycine 210 600
roxithromycine 100 000
tylosine 54 700
ciprofloxacine 9,3 80 5 3 000
fluméquine 159 5 000 18 000
ofloxacine 90 000 10 16 4 740 90,6
89
sarafloxacine 15 16 000 24 000
acide oxolinique 100 180 16 000 10 000
sulfadiazine 135 7 800 403 000
sulfaméthoxazole 84 000 26,8 146 2 400
triméthoprime 17 800 112 000 110 000 16 000 123 000

chlortétracycline 400
oxytétracycline 1 200 207 4 500 1 600
tétracycline 2 200
métronidazole 39 100 12 500
streptomycine 470
chloramphénicol 160
bacitracine 30 000
lincomycine 379 400
olaquindox 95 700
nolol. Comme dans le cas de l'évaluation des effets toxiques aigus, la toxicité chronique des
molécules pharmaceutiques envers les algues et les cyanobactéries (cyanophytes) a
principalement été évaluée pour les antibiotiques et quelques autres composés. A l'exception
de la fluoxétine, les NOEC sont comprises entre la dizaine de µg/L et la centaine de mg/L
pour les algues. Les NOEC pour les cyanobactéries sont inférieures à la dizaine de µg/L pour
les antibiotiques alors qu'elles sont supérieures à la centaine de mg/L pour les autres
molécules pharmaceutiques. Ce constat met en évidence le caractère plus toxique des
antibiotiques par rapport aux autres médicaments vis-à-vis des cyanobactéries. Ce point est
confirmé par les EC50 des antibiotiques pour les cyanobactéries (cyanophytes). Les EC 50 sont
majoritairement comprises entre le µg/L et la centaine de µg/L ce qui est proche ou du même
ordre de grandeur que certaines concentrations mesurées dans les eaux de surface (ex. :
ciprofloxacine 1,3 µg/L Watkinson et al., 2009).
En conclusion, que se soit du point de vue de la toxicité aiguë ou de la toxicité chronique, les
antibiotiques sont davantage toxiques envers les cyanobactéries qu'envers les autres taxons et
semblent être pour ces espèces les molécules pharmaceutiques les plus toxiques.
En raison du caractère plus toxique des antibiotiques par rapport aux autres molécules
pharmaceutiques, les informations à suivre dans ce paragraphe ne concerneront que cette
classe de médicaments.
Des valeurs de EC50, LC50, NOEC et LOEC relevées dans la littérature ont été rassemblées
dans l’Annexe - tableau 9. Le Tableau 16 récapitule ici l'ensemble des EC50 qui ont été
collectées. Selon l'antibiotique concerné et l'organisme testé, les valeurs des concentrations
effectives peuvent être très variables. Par exemple, l'amoxicilline est le composé qui possède
à la fois la plus forte (3,7 µg/L vis-à-vis de Microcystis aeruginosa) et la plus faible toxicité
(3 108 mg/L vis-à-vis de Rhodomonas salina). De même, Holten Lützhøft et ses
collaborateurs (1999) ont montré que la sensibilité à un même antibiotique ou à une même
classe d’antibiotiques était très variable entre une cyanobactérie d’eau douce (Microcystis
aeruginosa), une algue verte d’eau douce (Selenastrum capricornutum) et une cryptophycée
marine (Rhodomonas salina) (Tableau 17).
Tableau 17: Différences de sensibilité d'une cyanobactéries et de 2 algues à différents antibiotiques

(d’après Holten Lützhøft et al., 1999), (0,015) : en dehors de la gamme de mesure du test pratiqué.
Microcystis aeruginosa Rhodomonas salina Selenastrum capricornutum
antibiotique (EC50, mg/L) antibiotique (EC50, mg/L) antibiotique (EC50, mg/L)
Amoxicilline (0,0037) Oxytétracycline (1,6) Oxytétracycline (4,5)
Sarafloxacine (0,015) Acide Oxolinique (10) Fulméquine (5)
Sulfadiazine (0,135) Triméthoprime (16) Sulfadiazine (7,6)
Fulméquine (0,159) Fulméquine (18) Acide Oxolinique (16)
Acide Oxolinique (0,180) Sarafloxacine (24) Sarafloxacine (16)
Oxytétracycline (0,207) Sulfadiazine (403) Triméthoprime (130)
Triméthoprime (112) Amoxicilline (3,108) Amoxicilline (250)
Néanmoins, les données de EC50 (Tableau 16) viennent confirmer l'effet toxique possible des
antibiotiques sur les bactéries et cyanobactéries puisque certaines EC 50 sont comparables à
des concentrations environnementales. Par exemple, la ciprofloxacine a été quantifiée par
Watkinson et al. (2009) à 1,3 µg/L dans des eaux de surface alors que Halling-Sorensen et al.
(2000) ont noté une EC50 de ce même composé à 5 µg/L vis à vis des cyanobactéries
90
Microcystis aeruginosa et que Golet et al. (2002a) ont noté une LOEC de la ciprofloxacine
sur les bactéries Salmonella thyphimurium à 5 µg/L. Concernant les autres taxons, les valeurs
des EC50 sont supérieures aux concentrations mesurées dans l'environnement (Figure 21,
Figure 23, Figure 25) et le risque que les antibiotiques soient toxiques pour eux est faible.
Dans un autre domaine, au niveau du sol, Hamscher et al. (2002) ont mis en évidence un
risque de toxicité aiguë pour les bactéries en contact avec des blocs de lisiers ou fumiers qui
ne se seraient pas mélangés au sol lors de leur épandage. En effet, des concentrations en
tétracycline et chlortétracycline de l’ordre de 0,35 mg/kg et 1,44 mg/kg ont été relevées dans
ces blocs or la concentration minimale inhibitrice (MIC), c'est-à-dire la plus petite
concentration pour laquelle la croissance des bactéries est affectée, est comprise entre 0,5 et 2
mg/L pour ces antibiotiques.
En dehors des tests de toxicité, il existe une autre façon pour définir les effets toxiques des
molécules pharmaceutiques sur les organismes. Elle consiste à utiliser la modélisation.
L’approche QSAR (Quantitative Structure–Activity Relationship) par exemple est cette mise
en avant par la directive REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of
Chemicals) (Kar et Roy, 2010). Cette technique ne sera pas détaillée ici mais il est intéressant
de noter que par sa mise en œuvre, Escher et al. (2010) et Kar et Roy (2010) ont pointé un
risque de toxicité pour les anti-VIH comme le ritonavir dans les rejets hospitaliers (Escher et
al., 2010) ou la stavudine vis-à-vis des poissons (Kar et Roy, 2010).
VI.2. Antibiorésistance
Que ce soit en santé humaine ou du point de vue environnemental, un danger spécifique aux
antibiotiques est à noter. Il s’agit des phénomènes de résistances bactériennes aux
antibiotiques. Ces phénomènes ont pour conséquence la difficulté à traiter et guérir certaines
maladies jusqu’ici facilement soignables. Sur la page de présentation du site internet de
l’InVS (Institut de Veille Sanitaire) dédié au suivi de la résistance aux anti-infectieux, on peut
lire : « La France connaît, depuis la fin des années 1970, une diffusion épidémique des
staphylocoques dorés résistants à la méticilline (SARM) dans les établissements de santé. En
médecine de ville, un tiers des pneumocoques est aujourd’hui résistant à la pénicilline alors
qu’ils étaient largement sensibles à cet antibiotique il y a 15 ans. Ils nécessitent une
antibiothérapie de plus en plus lourde, notamment pour la prise en charge des infections de
l’oreille moyenne chez l’enfant. A l’échelon mondial, le traitement des cas de tuberculose
multirésistante aux antibiotiques représente un surcoût important et le paludisme chimio-
résistant une cause notable de décès (1,5 à 2,7 millions de personnes dans le monde). »
(http://www.invs.sante.fr/surveillance/resistance/, 14/12/2010)
Certaines bactéries sont résistantes à des antibiotiques de manière innée. On parle de

résistance naturelle. D’autres sont initialement sensibles à certains antibiotiques mais y
deviennent résistantes suite à des modifications génétiques, on parle de résistance acquise.
Les modifications génétiques proviennent de mutations sur les chromosomes bactériens ou
d’échanges de plasmides ou de transposons entre bactéries. Lorsque les modifications
touchent le chromosome bactérien, la résistance qui en résulte ne concerne généralement
qu’un antibiotique ou une famille d’antibiotiques. Elle est héréditaire mais ne peut être
transmise aux autres bactéries en dehors de la descendance. En revanche, lorsque les
modifications proviennent d’un transfert de plasmide par exemple, les bactéries peuvent
devenir polyrésistantes en étant insensibles à plusieurs antibiotiques ou familles
91
d’antibiotiques. En effet, les bactéries peuvent déjà être résistantes, de façon innée ou acquise,
à certains antibiotiques et acquièrent par ces transferts de nouvelles résistances. Les transferts
peuvent avoir lieu d’une souche ou d’une espèce de bactéries à une autre. La résistance
plasmidique est donc transmissible à la descendance comme aux autres bactéries. Plusieurs
mécanismes sont responsables de la résistance : la production d’enzymes inhibant
l’antibiotique (ex. : les -lactamases), l’imperméabilisation de la membrane de la bactérie ou
la modification de la cible de l’antibiotique (ex. : protéine de liaison de la pénicilline, cible
ribosomiale, etc.). (http://www.invs.sante.fr/surveillance/resistance/, 14/12/2010)
L’utilisation importante des antibiotiques en médecines humaines et animales est considérée

comme la raison majeure de l’accroissement de la résistance bactérienne aux antibiotiques, et
de la contamination de l’environnement (eau et sol) par les antibiotiques. Dans le corps
humain ou animal, les bactéries résistantes sont sélectionnées en cas d’antibiothérapie de
durée insuffisante ou inadaptée ou si les quantités d’antibiotiques utilisés sont trop faibles.
Dans ces différents scénarii, les bactéries les plus sensibles disparaissent et seules les
bactéries qui ont résisté au traitement survivent et se multiplient. Dans l’environnement, 2
hypothèses expliqueraient l’existence de bactéries résistantes : i) la présence constante
d’antibiotiques, consécutive aux rejets humains (effluents de STEP) ou animaux (épandage
lisier/fumier sur les sols agricoles), à des concentrations inférieures aux seuils thérapeutiques
(Goñi-Urriza et al., 2000); ii) le rejet dans le milieu de bactéries résistantes présélectionnées
dans les organismes humains ou animaux (Séveno et al., 2002 ; Reinthaler et al., 2003 ;
Salyers et al., 2004). Dans la première hypothèse, la sélection de bactéries résistantes se ferait
dans l’environnement alors que dans la deuxième hypothèse, il y aurait un transfert de gène
porteur de résistance entre des bactéries d’origine fécale (humaine ou animale) et des
bactéries uniquement présentes dans le milieu naturel.
La présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans l’environnement, et en particulier

dans les eaux, représente un danger sanitaire et un danger écologique. En effet, du point de
vue sanitaire, l’homme est exposé à ces bactéries résistantes soit de façon directe lorsqu’elles
survivent aux traitements de potabilisation et qu’elles sont consommées avec les eaux de
boisson ou lorsqu’elles ont remonté la chaîne alimentaire jusqu’aux coquillages filtreurs
consommés par les hommes , comme les moules par exemple ; soit de façon indirecte
lorsqu’elles sont dans les eaux récréatives comme les eaux de baignades. Du point de vue
environnemental, un premier risque est lié à la dissémination de gène de résistance au sein des
communautés microbiennes. Le deuxième risque écologique est lié aux possibles
perturbations des communautés microbiennes autochtones impliquées dans les cycles
biogéochimiques.
VI.3. Evaluation du risque environnemental
VI.3.1. La démarche de l’évaluation du risque environnemental
Du point de vue environnemental, on ne parle plus de toxicité mais d’écotoxicité. Dans le cas
d’évaluation du risque environnemental il est toujours utile de confronter l’ensemble des
données que l’on possède sur une molécule. En effet, un composé très facilement dégradé,
même si ses concentrations effectives (EC50) ou sa concentration la plus basse pour avoir un
effet observé (LOEC) sont faibles (dizaine de µg/L ou moins), sera moins dangereux qu’un
autre composé ayant une concentration effective (EC50) plus forte (centaine de µg/L par
exemple) mais très persistant dans le milieu. De plus, un composé même cytotoxique ou
92
génotoxique, s’il n’est jamais détecté dans l’environnement ne représente pas un danger avéré
important à condition que les techniques d'analyse aient des limites de détection suffisamment
faibles et que les concentrations provoquant les effets ne soient pas inférieures aux limites de
détection. Par ailleurs, concernant les composés étudiés, il faut également tenir compte de
leurs origines dans le milieu. En effet, du fait de leur apport constant dans le milieu, les
composés provenant de rejets de STEP s’apparentent à une pollution de type chronique,
même s’ils peuvent être facilement dégradés. Ainsi pour évaluer le risque que représente une
molécule pour l’environnement, il faut prendre en compte de multiples paramètres tels que la
source de contamination, la toxicité (EC50, LC50, cytotoxicité, …), les quantités auxquelles
elle est présente dans le milieu, la persistance, les produits de dégradation (les métabolites
étant parfois plus toxiques que le composé parent), etc.
L’évaluation du risque environnemental pour les molécules pharmaceutiques au niveau

européen est régi par le « guide sur l’évaluation du risque environnemental pour les produits
médicaux à usage humain » (Guideline on The Environmental Risk Assessment of Medicinal
Products for Human Use) rédigé par l’EMEA (European Medicines Agency) et approuvé par
le CHMP (Committee for Medicinal Products for Human use). La première version date de
2000 et la version définitive de 2006, elle a pris effet le 1er décembre 2006 (EMEA, 2006).
L’évaluation du risque environnemental suit une démarche par étape. Le principe général de
la démarche est présenté dans le Tableau 18.
Tableau 18: Les étapes de l'évaluation du risque environnemental (traduit du tableau 1, EMEA, 2006)
Etape dans la Etapes dans
normalisation l’évaluation du Objectifs Méthode Test / données requises
de l’évaluation risque
Phase I Pre-screening Estimation de l’exposition Limites/champ Données de consommation,
d’action log Kow
Phase II Screening Prédiction initiale du risque Evaluation du Données de base sur la
partie A risque toxicologie aquatique et le
devenir
Phase II Etendu Affinement avec les données Evaluation du Données étendues sur
partie B sur la molécule et sur son risque l’émission, le devenir et les
compartiment spécifique et effets
évaluation du risque
Dans ce guide, l’ERA (Environmental Risk Assessment) passe dans un premier temps par
l’estimation de l’exposition grâce au calcul de la PEC (Predicted Environmental
Concentration). La PEC correspond à la concentration environnementale prédite pour une
molécule. Pour l’eau de surface, elle est calculée à partir de la dose journalière maximum
consommée par habitant, à partir du facteur de pénétration c’est à dire de la proportion de
personnes traitées par jour avec cette molécule, à partir du volume d’eau utilisée par jour et
par habitant et à partir du facteur de dilution (dilution entre l’effluent de STEP et l’eau de
surface). On ne tient pas compte dans ce premier calcul de la transformation métabolique que
le composé peut subir dans l’organisme ni de sa dégradation dans l’environnement (STEP et
milieu aquatique). Si la PECSURFACE est inférieure à 0,01 µg/L, et qu’il n’y a pas de données
sur la toxicité de la molécule à plus faibles doses (comme les perturbateurs endocriniens qui
agissent à des concentrations inférieures au ng/L), alors la molécule est considérée comme ne
représentant pas de risque pour l’environnement. Si la PEC SURFACE est supérieure ou égale à
0,01 µg/L alors on passe à l’étape suivante de l’ERA.
93
Dans la partie A de la 2ème phase, on tente de prédire, à partir des propriétés physico-
chimiques (notamment log Kow et Koc), le devenir, comme l’adsorption sur les particules par
exemple, des composés identifiés comme représentant un risque pour l’environnement dans la
phase I (PECSURFACE ≥ 0,01 µg/L). A partir de résultats de tests de toxicité (EC50, LOEC,
NOEC), on essaie également de prédire la PNEC (Predicted Non Effect Concentration) c’est-
à-dire la concentration pour laquelle les composés n’auront pas d’effet sur les organismes.
Cette concentration est calculée en appliquant un facteur de "précaution", AF (Assessment
Factor), à la plus basse NOEC (No Observed Effect Concentration) connue pour la molécule.
L’AF permet de prendre en compte la variabilité inter- et intra-spécifique ainsi que
l’extrapolation de résultats obtenus en laboratoire à des études de terrain. Une valeur de 10 est
généralement appliquée comme AF. Au final, on établit le rapport PEC / PNEC pour les
molécules qui demeurent intéressantes pour le milieu aquatique, celles qui restent dans l’eau
et qui ne sont pas adsorbées sur les particules des boues de STEP par exemple. Pour les
composés qui s'adsorbent sur les boues de STEP une ERA spécifique au milieu terrestre est
nécessaire en complément en utilisant des PECTERRESTRE. Si le ratio PEC / PNEC est inférieur
à 1 alors la PEC est inférieure à la PNEC et la molécule ne représente pas de risque pour
l’environnement. Dans le cas contraire, PEC / PNEC ≥ 1, une évaluation plus poussée est
nécessaire dans la partie B de la 2 ème phase de l’ERA. Le ratio PEC / PNEC est établi à la fois
pour l’eau de surface (PECSURFACE / PNECEAU), l’eau souterraine (PECEAU SOUTERRAINE /
PNECEAU SOUTERRAINE, PECEAU SOUTERRAINE = 0,25 x PECSURFACE) et pour les micro-
organismes (PECSURFACE / PNECMICRO-ORGANISMES) notamment dans le cas des antibiotiques.
De plus, si la molécule a le potentiel à se bioaccumuler (Kow > 1000 soit log Kow > 3) alors
le facteur de bioconcentration (BCF) doit être pris en compte dans la partie B de la 2 ème phase.
En plus d’une ERA complémentaire pour le milieu terrestre dans le cas où le composé a la
capacité de s’adsorber sur le carbone et donc sur les boues de STEP (Koc > 10 000 l.kg-1) qui
seront ultérieurement répandues sur le sol, une ERA pour les sédiments doit également être
mise en œuvre dans le cas où la molécule n’est pas facilement biodégradable et se retrouve
dans les sédiments (plus de 10 % du composé retrouvé 14 jours après le premier prélèvement
dans les sédiments).
Dans cette partie B de la 2 ème étape de l’ERA, une PEC affinée (PECSURFACEreffine) est calculée
en intégrant au calcul de la PEC SURFACE le pourcentage de molécule excrétée sous forme
inchangée, la capacité de la STEP locale considérée, la fraction non éliminée et émise par la
STEP dans l’eau de surface et un facteur prenant en compte l’adsorption des composés sur les
MES (Matières En Suspension). Une PECSEDIMENT et une PECBAC D’AERATION (à mettre en
relation avec la PNECMICRO-ORGANISMES) sont également calculées. Les ratio PEC / PNEC sont
établis et si les résultats sont supérieurs à 1 alors une analyse au cas par cas est nécessaire en
tenant compte des données sur les voies d’excrétion, sur la quantité et la qualité de composés
excrétés, sur la toxicité à long terme, sur la biodégradation et sur l’inhibition bactérienne. Les
molécules qui s’avèreraient représenter un risque pour l’environnement devront comporter
une indication sur leur emballage pour prévenir l’usager et pour l’informer sur le
comportement à tenir lorsque le médicament ne sera plus utilisé ou que la date de péremption
aura expirée.
Dans certaines études, les ratios PEC / PNEC sont remplacés par les ratios MEC / PNEC de
façon à mieux correspondre à la réalité environnementale. La MEC correspond à la
concentration mesurée dans l’environnement (MEC : Mesured Environmental Concentration).
94
VI.3.2. Application de l’évaluation du risque environnemental
Des valeurs de PEC et de PNEC ainsi que le ratio PEC / PNEC ou MEC / PNEC ont été
calculés pour diverses molécules pharmaceutiques : antibiotiques (clarithromycine,
érythromycine, ciprofloxacine, ofloxacine, sulfaméthoxazole, triméthoprime etc.),
analgésiques (paracétamol, diclofénac, indométhacine, etc.), antiépileptique (carbamazépine,
etc.), antidépresseurs (diazépam, etc.), hypolipémiants (gemfibrozil, acide clofibrique, etc.),
-bloquants (métoprolol, propranolol, etc.) et anticancéreux (ifosfamide, etc.). D’après Ferrari
et ses co-auteurs (2004), le sulfaméthoxazole représente un risque toxique aigu pour
l’environnement aussi bien en France qu’en Allemagne (PEC / PNECaiguë = 11,4 en France et
59,3 en Allemagne). En Allemagne, il pourrait également poser un problème de toxicité
chronique (PEC / PNECchronique = 2,72) mais pas en France (PEC / PNECchronique = 0,52). Dans
le cas d'une contamination chronique, toujours d’après Ferrari et son équipe, le propranolol
représente un risque toxique aussi bien en Allemagne qu’en France (PEC / PNECchronique =
104 en France et 11,9 en Allemagne). Dans le cas d'une contamination aiguë, le propranolol
n'est pas toxique en Allemagne. En revanche, en France, il possède une toxicité aiguë mais
celle-ci est relativement faible comparé à la toxicité chronique (PEC / PNECaiguë = 4,25 et
PEC / PNECchronique = 104). Pour Huschek et al. (2004), le propranolol n’est pas toxique pour
Daphnia magna. Ainsi à partir d’une même stratégie d’évaluation, il n’y a pas une seule
vérité (toxique / non toxique) pour une même molécule car les rapports PEC / PNEC
dépendent de divers facteurs. Ils dépendent de la molécule considérée, de la consommation
qui en est faite dans le pays considéré, de son élimination dans les STEP et de son taux
d’excrétion sous forme non métabolisée (variation PEC) ; ils dépendent aussi du test de
toxicité pratiqué (contamination aiguë ou chronique) et de l’organisme considéré (bactérie,
phytoplancton, zooplancton, poisson) (variation PNEC).
Différentes valeurs du rapport PEC ou MEC / PNEC ont été relevées dans la littérature et sont
présentées dans le Tableau 19. Bien que les analgésiques et anti-inflammatoires soient les
composés qui contribuent le plus à la contamination de l’environnement, ils ne semblent pas
poser de risque toxique d’après les rapports établis par Ferrari et al. (2004), Huschek et al.
(2004) et Gros et al. (2010), à l’exception de l’acide salicylique pour les bactéries et du
paracétamol pour Daphnia magna dont les valeurs sont légèrement supérieures à 1 (Huschek
et al., 2004). En revanche, les antibiotiques poseraient davantage de risque puisque les
rapports établis sont fréquemment supérieurs à 1. Ainsi, la clarithromycine représenterait un
danger pour les bactéries, l’érythromycine pour les daphnies, la ciprofloxacine pour les
cyanobactéries et les bactéries, l’ofloxacine pour les cyanobactéries, le sulfaméthoxazole pour
les cyanobactéries et les algues et enfin le triméthoprime pour les algues. De plus, les valeurs
de ces rapports peuvent être très élevées (ex. : PEC / PNEC ciprofloxacine = 97 Huschek et
al., 2004). Le propranolol de la classe des -bloquants semble également représenter un
danger avec des valeurs du rapport PEC / PNEC parfois très supérieures à 1 (ex. : PEC /
PNEC propranolol = 104 Ferrari et al., 2004). D’autres composés comme la carbamazépine,
l’acide clofibrique, la fluoxétine ou encore l’atorvastatine ont des rapports supérieurs à 1. Ils
présenteraient donc des risques vis-à-vis du zooplancton comme les daphnies ou vis-à-vis des
poissons. Néanmoins, dans la plupart des cas, les rapports PEC / PNEC restent inférieurs à 1
et les risques que les molécules pharmaceutiques soient dangereuses sont faibles.
95
Tableau 19 : Evaluation de la toxicité de différentes molécules pharmaceutiques selon le rapport PEC /

PNEC.
rapport
toxicité
PEC
classe molécule pays matrice aiguë / organisme testé références
(MEC) /
chronique
PNEC
AINS ibuprofène Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
ibuprofène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
kétoprofène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
naproxène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
analgésiques acide acétylsalicylique Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
acide acétylsalicylique Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (1,74) Huschek et al., 2004
acide salicylique Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
codéine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
diclofénac France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis <1 Ferrari et al., 2004
diclofénac Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis <1 Ferrari et al., 2004
diclofénac France eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia <1 Ferrari et al., 2004
diclofénac Allemagne eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia <1 Ferrari et al., 2004
diclofénac Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
diclofénac Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
indométhacine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie <1 Gros et al., 2010
paracétamol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
paracétamol Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna > 1 (1,1) Huschek et al., 2004
phénazone Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
propyphénazone Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
Ab pénicillines mécilliname Europe eau aiguë Microcystis aeruginosa <1 Halling-Sorensen et al., 2000
Ab macrolides clarithromycine Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (1,19) Huschek et al., 2004
clarithromycine Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
clarithromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie <1 Gros et al., 2010
érythromycine Espagne effluent STEP aiguë daphnie > 1 (9,5) Gros et al., 2010
érythromycine Espagne eau de surface aiguë daphnie > 1 (2) Gros et al., 2010
érythromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, algue <1 Gros et al., 2010
roxithromycine Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
roxithromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
Ab fluoroquinolones ciprofloxacine Europe eau aiguë Microcystis aeruginosa > 1 (13,3) Halling-Sorensen et al., 2000
ciprofloxacine Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (97) Huschek et al., 2004
ciprofloxacine Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
ciprofloxacine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
ofloxacine France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (8,75) Ferrari et al., 2004
ofloxacine France eau de surface chronique Synechococcus leopolensis <1 Ferrari et al., 2004
ofloxacine Espagne eau de surface aiguë daphnie <1 Gros et al., 2010
Ab sulfonamides sulfaméthoxazole France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (11,4) Ferrari et al., 2004
sulfaméthoxazole Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (59,3) Ferrari et al., 2004
sulfaméthoxazole France eau de surface chronique Synechococcus leopolensis <1 Ferrari et al., 2004
sulfaméthoxazole Allemagne eau de surface chronique Synechococcus leopolensis > 1 (2,72) Ferrari et al., 2004
sulfaméthoxazole Espagne effluent STEP aiguë algue > 1 (22,96) Gros et al., 2010
sulfaméthoxazole Espagne eau de surface aiguë algue > 1 (1,28) Gros et al., 2010
sulfaméthoxazole Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie <1 Gros et al., 2010
sulfaméthazine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
triméthoprime Europe eau aiguë bactérie <1 Halling-Sorensen et al., 2000
triméthoprime Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
Ab tétracyclines tétracycline Espagne effluent STEP aiguë algue > 1 (3,77) Gros et al., 2010
tétracycline Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie <1 Gros et al., 2010
anticancéreux ifosfamide Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
antidépresseurs diazépam Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
fluoxétine Espagne eau de surface aiguë poisson, algue <1 Gros et al., 2010
fluoxétine Espagne eau de surface aiguë daphnie >1 Gros et al., 2010
antidiabétiques metformine Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
antiépileptiques carbamazépine France eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana <1 Ferrari et al., 2004
carbamazépine Allemagne eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana <1 Ferrari et al., 2004
carbamazépine France eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia > 1 (2,4) Ferrari et al., 2004
carbamazépine Allemagne eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia > 1 (3,85) Ferrari et al., 2004
carbamazépine Allemagne eau de surface aiguë algue <1 Huschek et al., 2004
carbamazépine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
antigoutteux allopurinol Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
antihypertenseurs captopril Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
histamine agoniste
ranitidine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
des récepteurs H2
bronchodilatateurs théophylline Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
-agonistes salbutamol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
hypolipémiants acide clofibrique Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis <1 Ferrari et al., 2004
acide clofibrique Allemagne eau de surface chronique Brachionus calyciflorus <1 Ferrari et al., 2004
acide clofibrique Espagne eau de surface aiguë daphnie >1 Gros et al., 2010
acide clofibrique Espagne eau de surface aiguë poisson, algue <1 Gros et al., 2010
96
rapport
toxicité
PEC
classe molécule pays matrice aiguë / organisme testé références
(MEC) /
chronique
PNEC
hypolipémiants atorvastatine Espagne effluent STEP aiguë poisson > 1 (1,18) Gros et al., 2010
atorvastatine Espagne eau de surface aiguë poisson <1 Gros et al., 2010
bézafibrate Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
bézafibrate Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
fénofibrate Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
gemfibrozil Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
pravastatine Espagne eau de surface aiguë poisson <1 Gros et al., 2010
-bloquants aténolol Espagne eau de surface aiguë daphnie <1 Gros et al., 2010
métoprolol Allemagne eau de surface aiguë poisson <1 Huschek et al., 2004
métoprolol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue <1 Gros et al., 2010
propranolol France eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana > 1 (4,25) Ferrari et al., 2004
propranolol Allemagne eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana <1 Ferrari et al., 2004
propranolol France eau de surface chronique Oryzias latipes > 1 (104) Ferrari et al., 2004
propranolol Allemagne eau de surface chronique Oryzias latipes > 1 (11,9) Ferrari et al., 2004
propranolol Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna <1 Huschek et al., 2004
AINS : anti-inflammatoires non stéroïdiens, Ab : antibiotiques
Cyanobactérie : Microcystis aeruginosa, Synechococcus leopolensis ; algue : Cyclotella meneghiniana ; zooplancton : Brachionus
calyciflorus, Ceriodaphnia dubia, Daphnia magna ; poisson : Oryzias latipes
Bien que ces rapports PEC / PNEC permettent d’évaluer le risque toxique, ils ne permettent
pas complètement d’évaluer le danger représenté par une molécule. Par exemple,
l’ifosfamide, d’après Huschek et al. (2004), ne serait absolument pas toxique (PEC / PNEC =
0,00003 pour les daphnies) alors que pour Steger-Hartmann et al. (1996) et pour Kümmerer et
al. (1997) il serait mutagène, cancérigène et tératogène. Ces effets à long terme ne sont en
effet pas pris en compte dans les tests de toxicité qui permettent d’évaluer les PNEC. Dans un
rapport datant d’octobre 2009, l’INERIS (Institut National de l’Environnement et des
RISques) en collaboration avec l’ONEMA (Office National de l’Eau et des Milieux
Aquatiques) et AQUAREF (laboratoire national de référence pour la surveillance des milieux
aquatiques) évoque les limites des tests écotoxicologiques traditionnels utilisés pour définir
les PNEC. En effet, les tests de toxicité qui permettent de déterminer les EC 50, LOEC, NOEC,
et par extension de définir les PNEC, sont essentiellement basés sur des critères tels que la
mortalité ou l’inhibition de la croissance bactérienne ou algale (toxicité aiguë) et la
reproduction ou la croissance (toxicité chronique). Ils ne mettent donc pas en évidence les
problèmes à long terme comme les effets mutagènes et cancérigènes ni les troubles
physiologiques (ex. : rythme cardiaque, production d’œufs) ou du comportement (ex. :
prédation, nidification, alimentation). Dans ce rapport l’INERIS souligne que des différences
significatives ont été observées entre les résultats des tests de toxicité traditionnels et ceux des
nouveaux tests évaluant la capacité à maintenir un nid, la production d'œufs, le rythme
cardiaque ou l'activité de nourrissage par exemple. En comparant les concentrations
correspondant aux plus faibles réponses toxiques obtenues pour ces tests de toxicité, ou pour
des tests traditionnels, avec des concentrations mesurées dans l’environnement, il ressort que
le 17 -éthinylestradiol, le paracétamol, le 17 /-œstradiol et l’acide salicylique peuvent
poser un risque pour les écosystèmes avec des concentrations mesurées supérieures de
plusieurs ordres de grandeur à celles donnant les plus faibles réponses toxiques.
VII. Législation
La convention OSPAR (Oslo / Paris) d’une part et la DCE (Directive Cadre sur l’Eau
européenne) d’autre part, permettent, en complément de nombreuses autres directives comme
celle du 15 février 2006 relative aux rejets de substances dangereuses, de protéger et de
préserver le milieu aquatique et sa qualité. La convention OSPAR (98/249/CE) du 7 octobre
97
1997, entrée en vigueur le 25 mars 1998, relative à la protection du milieu marin de

l’Atlantique Nord-Est, a pour objectif de prévenir et d’éliminer la pollution ainsi que de
protéger la zone maritime contre les effets néfastes des activités humaines
(http://www.europa.eu/scadplus/printversion/fr/Lvb/128061.htm, décembre 2006).
Initialement, le clotrimazole, un antibiotique de la famille des imidazoles, était la seule
molécule pharmaceutique à faire partie de la liste OSPAR des produits chimiques prioritaires
(http://www.ospar.org/content/content.asp?menu=30940304440000_000000_000000, 15/12/
10). Depuis la liste a été étendue à des "substances potentiellement préoccupantes". Dans cette
nouvelle liste, 19 molécules appartiennent à la classe des médicaments comme par exemple le
midazolam (un anesthésique) ou l'acide niflumique (un AINS). La DCE (directive
2000/60/CE) du 23 octobre 2000 a deux objectifs. D’une part elle prévoit pour les Etats-
membres l’atteinte du bon état écologique et chimique des eaux de surface et souterraines et
d’autre part elle vise à réduire la pollution due aux substances prioritaires et à éliminer les
rejets des substances dangereuses prioritaires (http://europa.eu/scadplus/Leg/fr/Lvb/
l28002b.htm, décembre 2006). Les molécules pharmaceutiques ne font pas partie de la liste
des 33 puis des 41 ni des 132 molécules prioritaires établie dans le cadre de la DCE en
s’appuyant sur les listes I et II de la directive 76/464/CEE (directive 2008/105/CE et arrêté 21
mars 2007). Cependant, 4 d’entre elles, le diclofénac, l’ibuprofène, le 17 -éthinylestradiol et
le 17 -œstradiol ont été proposées par AQUAREF et sont actuellement en cours
d’évaluation pour intégrer la liste des substances européennes prioritaires. De plus, la DCE
oblige également les Etats Membres à identifier et inclure dans les programmes de
surveillance une liste de polluants pertinents spécifiques au niveau national par bassin versant.
Dans ce cadre là, l’INERIS a proposé au Ministère de l’écologie, du développement durable,
du transport et du logement d’ajouter la carbamazépine à la liste des molécules pertinentes au
niveau français et pour lesquelles une définition de la Norme de Qualité Environnemental
(NQE) est à établir. Par ailleurs, bien que non encore officiellement intégrées à la liste des
substances prioritaires de la DCE, les molécules pharmaceutiques n’en restent pas moins
préoccupantes, en particulier les antibiotiques, et sont donc à ce titre intéressantes à étudier
afin de remplir le deuxième objectif de la DCE à savoir l’atteinte du bon état écologique et
chimique des eaux de surface et souterraines.
Les molécules pharmaceutiques n’ont pas de réglementation spécifique quant à leurs rejets
dans le milieu et en particulier le milieu aquatique contrairement à certaines molécules issues
de l’industrie dont les rejets sont règlementés et les quantités que l’on peut retrouver dans
l’eau fixées. Cependant, il existe des valeurs seuils quant aux résidus de médicament, et
d’antibiotiques en particulier, qui peuvent être détectés dans les denrées alimentaires comme
la viande, les œufs, le lait et le miel. La première directive (CEE n° 2377/90) date du 26 juin
1990. Elle consistait à établir une procédure communautaire pour la fixation des limites
maximales de résidus de médicaments vétérinaires dans les aliments d'origine animale.
Depuis plusieurs textes ont abrogé cette directive. La dernière version date du 22 décembre
2009 (UE n° 37/2010). Elle est relative aux molécules pharmacologiquement actives et à leur
classification en ce qui concerne les limites maximales de résidus dans les aliments d’origine
animale. En annexe de cette directive, on trouve un tableau répertoriant les molécules
pharmacologiquement actives, l'espèce animale considérée, les denrées ciblées et les limites
maximales de résidus (LMR). Par exemple, pour l'amoxicilline, toutes les espèces
productrices d'aliments sont concernées et les LMR sont de 50 µg/kg dans les muscles, les
graisses, le foie et les reins de 4 µg/kg dans le lait.
98
VIII. Projets de recherche

Bien qu’il n’y ait pas de réglementation spécifique aux molécules pharmaceutiques dans
l’environnement, leur présence, leur devenir et l’impact qu’elles peuvent avoir n’en restent
pas moins des sujets de préoccupation comme en attestent les nombreux programmes de
recherche européens et français listés ci-après.
VIII.1. Européens
 ERAVMIS (1999 - 2003, Environmental Risk Assessment of Veterinary Medicines In

Sludge) portait sur le devenir (adsorption et biodégradation) des médicaments à usage
vétérinaire (antibiotiques) dans le sol et la toxicité associée au travers d’analyses
environnementales, de tests pratiqués en laboratoire et de modélisation.
 REMPHARMAWATER (2000 - 2003, ecotoxicological assessment and REMoval

technologies for PHARMaceuticals in wasteWATERs) avait pour objectifs d'évaluer (i) la
présence des produits pharmaceutiques les plus utilisés dans les eaux usées et leur devenir
pendant les procédés de traitement, (ii) leur persistance (temps de demi-vie), (iii) leurs effets
toxiques sur les organismes vivants (algues, invertébrés, poissons), et (iv) d’étudier des
traitements complémentaires pour réduire leurs concentrations afin de prévenir la pollution
des eaux de surface et souterraines due aux molécules pharmaceutiques.
 POSEIDON (2001 - 2004, Assessment of technologies for the removal of

pharmaceuticals and personal care products in sewage and drinking water facilities to improve
the indirect potable water reuse) était focalisé sur l’élimination des molécules
pharmaceutiques et des produits de soins corporels dans les stations de traitement. Les
objectifs étaient d'améliorer et de protéger les réserves en eau, de minimiser les impacts
environnementaux et de prévenir d’éventuels risques pour la santé humaine. Ses objectifs
étaient en lien avec la directive cadre sur l'eau et la directive eaux urbaines résiduaires.
 ENVIPHARMA (2003, European conference on human and veterinary pharmaceutical

products in the aquatic environment: fate, effects and regulation : knowledge and future
needs) était une conférence organisé en 2003 en France pour présenter l’avancée des travaux
des trois projets de recherche listés ci-dessus (ERAVMIS, REMPHARMWATER,
POSEIDON).
 TRITON (2002 - 2004, Scheme to provide training and assistance for research players
for the assessment of the fate and removal of pharmaceuticals and estrogenic compounds
(PECS) released into the environment) venait à la suite de ERAVMIS,
REMPHARMWATER, POSEIDON et avait pour objectif de communiquer les connaissances
nouvelles sur la toxicité des produits et les technologies de dépollution aux jeunes
scientifiques pré- ou post-doctorants qui se forment dans ce domaine.
 SWIFT-WFD (2003 - 2007, Screening methods for Water data InFormaTion in support
of the implementation of the Water Framework Directive) avait 5 objectifs : i) améliorer la
qualité des données de surveillance du milieu aquatique; ii) obtenir des données comparables
entre les différents bassins d’étude européens en se basant sur des procédures d’assurance
qualité et de contrôle qualité communes ; iii) le développement, la validation et l’application
de techniques de screening, chimiques ou biologiques, à faible cout pour le suivi de la qualité
99
des masses d’eau dans le cadre de la DCE ; iv) le transfert des savoirs et des technologies
entre l’Europe et le tiers monde ; et v) évaluer l’impact socio-économique des nouveaux outils
de screening utilisés.
 ERAPHARM (2004 - 2007, Environmental Risk Assessment of PHARMaceuticals)

avait comme objectif de faire avancer les connaissances existantes et l'utilisation des
procédures dans l'évaluation du risque environnemental (ERA) de médicaments à usage
humain et vétérinaire.
 F & F (2004 - 2007, Pharmaceutical products in the environment: development and

employment of novel methods for assessing their origin, fate and effects on human fecundity)
cherchait à identifier les produits pharmaceutiques affectant la fécondité de l'homme et les
mécanismes impliqués. Il visait à évaluer l’environnement, l’alimentation et l’exposition des
populations aux produits pharmaceutiques présentant des risques importants.
 NORMAN (2005 - 2008, Network Of Reference laboratories for monitoring of

emerging environmental pollutants) avait pour objectif de créer un réseau de laboratoires de
référence afin d'améliorer l'échange d'informations et de données sur les contaminants
émergeants de l'environnement, et d'harmoniser les méthodes de mesure et les outils de suivi.
Depuis le réseau NORMAN continue d’exister sous la forme d’une association loi 1901 qui
s’occupe de gérer des groupes de rencontres d’experts, des banques de données et des
exercices de validation de méthodes par le biais d’exercice d’intercalibration.
 COST (european COoperation in the field of Scientic and Technical research) action
636 : Xenobiotics in the Urban Water Cycle (2005 - 2009) avait pour objectif principal
d’évaluer le rôle des xenobiotiques (composés métalliques ou organiques issus des activités
humaines : lessivage des sols, retombées atmosphériques, utilisation des produits d’entretien
ou de médicaments) dans le cycle urbain de l’eau et d’élaborer des stratégies pour minimiser
leur impact sur l’Homme et les écosystèmes. La création d’un réseau européen de
scientifiques et d’experts travaillant sur la problématique des xenobiotics dans le cycle urbain
de l’eau et la création d’un réseau de jeunes chercheurs travaillant sur cette même
problématique faisaient partie des objectifs secondaires du projet.
 KNAPPE (2007 - 2009, Knowledge and Need Assessment on Pharmaceutical Products

in Environmental Waters) avait pour objectif d’identifier, à partir des connaissances
actuellement disponibles et des avancées scientifiques en cours, les actions prioritaires à
mener dans les domaines scientifiques, réglementaires et sociaux pour limiter l’occurrence et
l’impact des molécules pharmaceutiques dans l’environnement.
VIII.2. Français
 Plan Micropolluant PNAR (2010 - 2013, Plan National d'Action pour lutter contre la
pollution des milieux aquatiques) se divise en 4 axes. Le premier axe vise à réduire les
émissions à la source par i) une action sur les molécules les plus préoccupantes en soutenant
le retrait ou la substitution des molécules les plus dangereuses par exemple, ii) une action sur
les secteurs d’activité les plus contributeurs en réduisant l’usage des pesticides ou en
réduisant les déversements de substances dans les réseaux de collecte des eaux usées par
exemple, et iii) une action sur les milieux les plus dégradés et les plus importants comme les
100
eaux de captage utilisées pour la production d’eau potable par exemple. Le deuxième axe vise
à améliorer la connaissance de l’état des masses d’eau en améliorant la comparabilité des
données de surveillance des milieux et des rejets, en réalisant l’inventaire des émissions et
rejets ponctuels et diffus des substances définissant l’état chimique des eaux ou encore en
définissant des règles claires d’interprétation des résultats de la surveillance utilisables par
l’ensemble des acteurs. Le troisième axe vise à améliorer les connaissances scientifiques et
techniques pour identifier les marges de progrès et hiérarchiser l’action des pouvoirs publics.
Pour cela, il est nécessaire d’identifier les voies de réduction des rejets dans l’environnement
pour les molécules les plus déclassantes de l’état des masses d’eau ou d’améliorer le
diagnostic de la contamination et la connaissance de l’impact des molécules sur les milieux
aquatiques. Enfin, le quatrième axe est relatif à la communication des progrès. La réduction
des pollutions des milieux aquatiques par les micropolluants répond à i) des enjeux
environnementaux en raison de l’impact toxique possible à faible dose de ces micropolluants,
ii) des enjeux sanitaires en protégeant les ressources en eau destinées à la production d’eau
potable, et iii) économique en réduisant les coût de traitement en protégeant les milieux
aquatiques.
 PNRM (Plan National sur les Résidus de Médicaments dans l’eau, dans le cadre du
PNSE 2, 2009 - 2013, Plan National Santé Environnement) a comme objectifs l’évaluation et
la gestion des risques sanitaires et environnementaux liés à la présence des molécules
pharmaceutiques dans l’environnement. L’évaluation des risques passe par un renforcement
des connaissances sur l’état des milieux et sur l’exposition aux résidus de médicaments et
leurs effets sur l’environnement et la santé. La gestion de ces risques potentiels passe par la
mise en place de stratégies visant à réduire les sources de pollution et à renforcer la
surveillance.
De plus, parallèlement au PNRM, le ministère en charge de la santé a demandé un bilan sur la
présence de ces molécules dans les eaux destinées à la consommation humaine. Une
campagne nationale d’analyse des eaux de surface et souterraine servant à la production d’eau
potable (eaux brutes) et des eaux traitées en sortie de station de potabilisation a alors été lancé
en septembre 2009. L’ANSES (Agence Nationale de Sécurité sanitaire de l'alimentation, de
l'environnement et du travail) a publié les résultats de cette étude en mars 2011. Il ressort que
plus de 50% des eaux de surfaces brutes et plus de 80 % des eaux souterraines brutes ou des
eaux de surface et souterraine traitées présentent une teneur cumulée en résidus
médicamenteux inférieure à 25 ng/L. Dans les eaux brutes, les molécules les plus
fréquemment détectées (hors caféine) ont été la carbamazépine, l’oxazépam, le paracétamol et
l’époxy-carbamazépine et dans les eaux traitées, l’époxycarbamazépine, la carbamazépine,
l’oxazépam et l’hydroxyibuprofène (ANSES, 2011).
101
102
Objectifs
103
104
Objectifs de ces travaux de thèse

L'ensemble des informations contenues dans le premier chapitre peut être résumé de la façon
suivante:
- il existe de nombreuses molécules pharmaceutiques aux propriétés thérapeutiques variées
(analgésique, antibiotiques, antidépresseurs, hypolipémiants, -bloquants, etc.) et à la
pharmacocinétique différente (métabolisation ou non, transformation, conjugaison, etc.) ;
- la présence des molécules pharmaceutiques dans l'environnement est majoritairement due
à une consommation humaine (rejets d'eaux usées traitées ou non, épandage des boues
résiduaires de STEP) ou animale (déjections émises directement dans le milieu, épandages
des déchets d’élevage, déversements dans les fermes aquacoles) des médicaments;
- le devenir des molécules pharmaceutiques dans le milieu naturel est lié à leurs propriétés
physico-chimiques (répartition entre la phase dissoute et la phase solide: eau/particules/boue
dans les STEP, eau/particules/sédiment dans les écosystèmes aquatiques, sol/eau d'infiltration
ou de ruissellement dans le milieu édaphique) ;
- les molécules pharmaceutiques ont des sensibilités différentes vis-à-vis des traitements
appliqués dans les stations d'épuration et certaines classes ou familles sont plus ou moins bien
éliminées de la phase dissoute lors de leur passage dans les STEP ;
- la présence des molécules pharmaceutiques a principalement été étudiée dans les rejets
des stations d'épuration ou dans les eaux de surfaces mais ces molécules ont été mise en
évidence dans l'ensemble des matrices étudiées : eaux usées, eaux traitées, eaux de surface,
eaux souterraines, eaux de boisson, déchets d'élevage, sol, sédiments, animaux et plantes ;
- les molécules pharmaceutiques sont des molécules biologiquement actives qui peuvent
être à l'origine d'effets indésirables (effets secondaires) lorsqu'elles sont consommées
volontairement, et qui peuvent aussi être responsables d'effets toxiques envers des organismes
non ciblés si des homologies de récepteurs ou de site d'action sont présents chez ces derniers;
- les antibiotiques se révèlent être parmi les composés les plus toxiques envers les
cyanobactéries et des applications de l'ERA ont mis en évidence un risque environnemental
de ces composés envers les algues et les cyanobactéries ;
- la résistance des bactéries aux antibiotiques est un enjeu sanitaire et environnemental
majeur ;
- bien que régulièrement étudiées au cours de nombreux programmes de recherche
européens, la présence des molécules pharmaceutiques dans l'environnement n'est pas encore
spécifiquement réglementée.
Dans ce contexte, il est donc apparu important de compléter ces informations en étudiant : i) à
la fois l’origine humaine et vétérinaire de la contamination de l'environnement, et plus
particulièrement celle des systèmes aquatiques, par les composés pharmaceutiques et
notamment par les antibiotiques ; ii) le devenir de ces composés au travers d’une approche
dite de "continuum" qui consiste à suivre la contamination depuis les rejets des centres de
soins jusqu'aux eaux de surface ou depuis les entrées de STEP jusqu'aux eaux de captage ou
encore le long des filières de traitement dans des élevages porcins ; et iii) le lien
présence/effets en couplant les analyses chimiques avec des tests d'antibiorésistance réalisés
par d'autres équipes lors de collaborations au cours des programmes de recherches support.
L’attention particulière portée aux antibiotiques se justifie par 2 raisons : i) les antibiotiques
sont des composés utilisés à la fois en médecine humaine et vétérinaire, ils contribuent donc
doublement à la contamination du milieu puisque les deux voies majeures d'introduction sont
possibles; et ii) ils représentent des risques environnementaux et sanitaires réels notamment
au travers de la problématique de l'antibiorésistance. L’étude de la contamination des
systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques constitue donc l’objectif principal de
105
ces travaux de thèse. Cependant, pour l’atteindre, il a été nécessaire de répondre à un autre
objectif. Ce deuxième objectif concerne le développement de méthodes d’analyse permettant
le dosage de composés pharmaceutiques appartenant à différentes classes thérapeutiques dans
diverses matrices environnementales
L'originalité de ces travaux réside donc dans le développement de méthodes multi-résidus

adaptées à un large panel de molécules pharmaceutiques aux propriétés physico-chimiques
variées, et dans les approches conjointes car peu d'études ont travaillé en même temps sur
l’origine humaine et vétérinaire de la contamination, sur la notion de continuum et enfin, sur
la présence d'antibiotiques et l'antibiorésistance potentiellement associée. Ce dernier point
n’est cependant pas détaillé dans ce manuscrit mais fera l’objet de publications écrites en
collaboration avec les équipes de recherche ayant réalisées les tests d’antibiorésistance.
Ces travaux de thèse ont été appuyés sur 2 programmes de recherche : le projet « Seine Aval »
FLASH (Devenir des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries Antibiorésistantes dans les
Systèmes Hydriques de surface) et l'ANR SEST DIPERPHA (Dynamique et Impact des
Perturbateurs endocriniens et des composés Pharmaceutiques issus des élevages agricoles).
Le projet FLASH vise à étudier le devenir des antibiotiques, le transfert des bactéries
antibiorésistantes et le flux de gène correspondant le long de 2 types de continuum : i) rejets
hospitaliers - STEP - eaux de Seine, et ii) exploitation animale (bovins) – eaux de rivière –
estuaire de Seine. Cette étude s’inscrit dans une démarche d’analyse du risque associé au rejet
dans le milieu, d’antibiotiques et de bactéries antibiorésistantes. Le risque environnemental
est défini comme la dissémination de gènes de résistances dans les communautés
microbiennes et le rejet de concentration en antibiotiques favorables à l’émergence ou au
maintien de bactéries résistantes dans l’environnement. Une collaboration avec le laboratoire
de microbiologie du froid (université de Rouen-CNRS) a permis de réaliser les études
relatives à l'antibiorésistance. Le projet FLASH a supporté les études liées à l'origine humaine
de la contamination des systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques. A l'occasion
de ces prélèvements, d'autres classes thérapeutiques ont été analysées. Il s'agit des -
bloquants, des anticancéreux, des anti-VIH et des inhibiteurs de PDE 5. Les -bloquants ont
été choisis comme traceurs pour servir de point de comparaison car ils sont fréquemment
recherchés dans les rejets de STEP. Miège et al. (2009) rapportent une fréquence de recherche
de 8,7 % et de 2,8 % respectivement pour les antibiotiques et les -bloquants dans les rejets
de STEP. Et les autres classes ont été choisies pour compléter les informations relatives à la
contamination des systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques car elles étaient
moins étudiées que d’autres classes et à ce titre méritaient des investigations supplémentaires.
Les objectifs de l'ANR DIPERPHA sont d’une part : (i) de connaître le devenir réel des
œstrogènes et des antibiotiques issus des élevages bovins et porcins, lors du stockage et du
traitement de ces effluents, (ii) de déterminer le transfert vers les sols et la plante lors de
l’épandage des déchets dans des terres agricoles, (iii) de déterminer les conditions de
dégradation (biologique et thermique) des œstrogènes et des antibiotiques présents dans ces
déchets et d’optimiser cette dégradation. D'autre part, cette étude vise à : (iv) déterminer
l’effet endocrinien et toxique des rejets d’élevage et des produits de son traitement à travers
des modèles cellulaires, (v) identifier l’impact des antibiotiques présents dans les rejets
d’élevage sur le développement des résistances microbiennes à ces composés et, finalement,
(vi) identifier et caractériser d’autres composés œstrogènes présents dans les rejets d’élevage.
Ces objectifs impliquent le suivi en conditions réelles des concentrations en œstrogènes et en
composés pharmaceutiques dans les systèmes de stockage et de traitement des déchets
d’élevage porcin avec un suivi dans le temps et au cours des différentes étapes de traitement
(fosse de stockage, bassin biologique, boues).
106
CHAPITRE 2
Les composés étudiés
107
108
Chapitre 2 : Les composés étudiés
I. SELECTION DES CLASSES THERAPEUTIQUES ................................................................................... 110

I.1. Consommation ....................................................................................................................... 110
I.2. Toxicité ................................................................................................................................. 114
I.3. Présence dans l’environnement............................................................................................... 115
I.4. Persistance ............................................................................................................................. 116
I.5. Manque de données ................................................................................................................ 116
I.6. Classes sélectionnées.............................................................................................................. 117
II. SELECTION DES MOLECULES .......................................................................................................... 118
II.1. Les antibiotiques .................................................................................................................... 119
II.1.1. Consommation des antibiotiques...................................................................................................... 119
II.1.1.1 Consommation des antibiotiques en médecine humaine ........................................................... 119
II.1.1.2 Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire ........................................................ 125
II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance .......................................................................................... 127
II.1.4. Persistance ...................................................................................................................................... 130
II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux, anti-VIH et inhibiteurs de la PDE
5. 130
II.2.1. Consommation................................................................................................................................. 130
II.2.2. Ecotoxicité ....................................................................................................................................... 135
II.2.4. Persistance ...................................................................................................................................... 137
II.3. Listes des molécules sélectionnées.......................................................................................... 138
III. COMPARAISON AVEC LES MOLECULES RETENUES DANS D' AUTRES ETUDES................................ 141
Ce deuxième chapitre expose les différents critères qui ont permis de sélectionner les
composés étudiés. Il détail en particulier le critère relatif à la consommation des molécules
pharmaceutiques. Il contient ensuite une présentation des 78 molécules sélectionnées. Une
comparaison de cette sélection avec celle d’autres études françaises ou à celle d’organisme de
référence comme l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) est réalisée
à la fin de ce chapitre.
109
I. Sélection des classes thérapeutiques

Au vu de la grande diversité des molécules pharmaceutiques et du nombre important de
molécules (plus de 3000 en médecine humaine et 300 en médecine vétérinaire), toutes ne
peuvent être étudiées. La première étape consiste donc à cibler les composés à analyser. Le
premier niveau de choix concerne les classes thérapeutiques. La consommation des
médicaments constitue l’un des critères de sélection. La pertinence de ce critère repose sur le
postulat suivant : plus une molécule est vendue, plus elle est consommée et plus elle est
susceptible de se retrouver dans l’environnement car rejetée en partie lors de sa
consommation. Les données de consommation sont issues des rapports annuels de
l’AFSSAPS sur "L’analyse des ventes de médicaments aux officines et aux hôpitaux en
France". Le choix a aussi été appuyé sur des données de toxicité présumée en se basant sur les
effets secondaires indésirables des médicaments, sur des données pharmacologiques comme
les mécanismes d’action et sur des résultats d’ERA. La représentativité des classes
sélectionnées a également été prise en compte en prenant en considération des résultats
d’études antérieures révélant la présence et la distribution de médicaments dans
l’environnement (Daughton et Ternes, 1999 ; Sacher et al., 2001 ; Kolpin et al., 2002 ; Gros
et al., 2006 ; Touraud, 2008 ; Miège et al., 2009). La persistance des molécules, notamment
au cours des traitements en station d’épuration, a été intégrée aux critères de sélection. Enfin
le manque d’informations relatives à certaines classes thérapeutiques a également été pris en
considération dans le but de combler ces lacunes. Les différents critères sont passés en revue
dans les paragraphes suivants.
I.1. Consommation
D’après les rapports de l’AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments (AFSSAPS,
2006 ; AFSSAPS, 2008 ; AFSSAPS, 2009 ; AFSSAPS, 2010), en France, depuis 2004 et
jusqu’en 2008, les antibactériens à usage systémique (J01, antibiotiques) arrivent en 3ème
position du classement des médicaments les plus vendus, en quantité, aux officines, derrière
les analgésiques (N02) et les psycholeptiques (N05) (Tableau 20). Après les médicaments du
système nerveux (classes ATC N), ce sont les médicaments des voies digestives et du
métabolisme (classe ATC A) qui sont les plus vendus en officine entre 2004 et 2008. Les
médicaments pour les troubles gastro-intestinaux (antispasmodiques et anticholinergiques,
classe A03) et pour les troubles de l’acidité (antiacides et antiulcéreux, classe A02) se
positionnent généralement autour de la 6 ème place de ce classement. Les médicaments les plus
vendus dans la classe ATC C (médicaments du système cardio-vasculaire) sont les
médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine (C09), les hypolipémiants (C10) et
les vasculoprotecteurs (C05). Les -bloquants (C07) n’apparaissent dans ce classement qu’en
2008, en 20ème position. Les médicaments du rhume et de la toux (R05) et les préparations
nasales (R01) figurent également dans ce listing des 20 classes ATC de niveau 2 les plus
vendues en officine. En revanche, les anticancéreux, les antiviraux ou les immunomodulateurs
ne font pas partie de ce classement.
Les données de l’AFSSAPS relatives aux ventes de médicaments sur le marché officinal sont
indiquées soit en millions d’euros (chiffre d’affaire) et soit en millions d’unité vendues. Les
données exprimées en millions d’unité vendues reflètent réellement la quantité de
médicaments vendus et donc supposés consommés (Tableau 20). Ces informations sont
directement exploitables dans le cas de la démarche de sélection appliquée ici. En revanche,
110
Tableau 20 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché officinal en quantité en 2004, 2006, 2007 et 2008 (millions
d’unités vendues (part du marché %)).
2004 2006 2007 2008

N02 - analgésiques 515 (16,2) N02 - analgésiques 583 (18,4) N02 - analgésiques 628 (19,5) N02 - analgésiques 607 (19,4)
N05 - psycholeptiques 162 (5,1) N05 - psycholeptiques 165 (5,2) N05 - psycholeptiques 164 (5,1) N05 - psycholeptiques 161 (5,1)
J01 - antibactériens 134 (4,2) J01 - antibactériens 131 (4,1) J01 - antibactériens 134 (4,2) J01 - antibactériens 131 (4,2)
R05 - rhume et toux 126 (4,0) V03 - tous autres médicaments (3,3) V03 - tous autres médicaments (3,7) V03 - tous autres médicaments (3,4)
C05 - vasculoprotecteurs 103 (3,2) S01 - médicaments ophtalmologiques 86 (2,7) S01 - médicaments ophtalmologiques 88 (2,7) S01 - médicaments ophtalmologiques 86 (2,7)
A02 - troubles de l'acidité 90 (2,8) N06 - psychoanaleptiques 84 (2,7) A02 - troubles de l'acidité 87 (2,7) A03 - troubles gastro-intestinaux 85 (2,7)
N06 - psychoanaleptiques 86 (2,7) A03 - troubles gastro-intestinaux 86 (2,6) A03 - troubles gastro-intestinaux 86 (2,6) A02 - troubles de l'acidité 85 (2,7)
S01 - médicaments ophtalmologiques 83 (2,6) C09 - système rénine-angiotensine 82 (2,6) N06 - psychoanaleptiques 83 (2,6) N06 - psychoanaleptiques 82 (2,6)
G03 - hormones sexuelles 78 (2,5) C05 - vasculoprotecteurs 81 (2,6) C09 - rénine-angiotensine 82 (2,6) C09 - rénine-angiotensine 80 (2,5)
C10 - hypolipidémiants 77 (2,4) A02 - troubles de l'acidité 77 (2,4) R01 - préparations nasales 78 (2,5) R01 - préparations nasales 77 (2,5)
A03 - troubles gastro-intestinaux 71 (2,2) C10 - hypolipidémiants 76 (2,4) C10 - hypolipidémiants 74 (2,3) R05 - rhume et toux 73 (2,3)
C09 - système rénine-angiotensine 70 (2,2) R01 - préparations nasales 73 (2,4) R05 - rhume et toux 74 (2,3) C10 - hypolipidémiants 71 (2,3)
R01 - préparations nasales 69 (2,2) A10 - médicaments du diabète 71 (2,3) A10 - médicaments du diabète 72 (2,2) M01 - AI et antirhumatismaux 69 (2,2)
A10 - médicaments du diabète 56 (2,1) R05 - rhume et toux 71 (2,2) C05 - vasculoprotecteurs 72 (2,2) A10 - médicaments du diabète 69 (2,2)
111
M01 - AI et antirhumatismaux 66 (2,1) G03 - hormones sexuelles 67 (2,1) M01 - AI et antirhumatismaux 71 (2,2) B01 - antithrombotiques 64 (2,1)
A06 - laxatifs 63 (2,0) M01 - AI et antirhumatismaux 68 (2,1) G03 - hormones sexuelles 66 (2,0) A01 - préparations stomatologiques 64 (2,1)
A12 - suppléments minéraux 61 (1,9) A06 - laxatifs 62 (2,0) A01 - préparations stomatologiques 64 (2,0) A06 - laxatifs 63 (2,0)
C01 - médicaments en cardiologie 56 (1,8) A01 - préparations stomatologiques 62 (1,9) R06 - antihistaminiques systémiques 63 (2,0) G03 - hormones sexuelles 62 (2,0)
A07 - antidiarrhéiques 51 (1,6) B01 - antithrombotiques 60 (1,9) A06 - laxatifs 63 (2,0) R06 - antihistaminiques systémiques 62 (2,0)
R06 - antihistaminiques systémiques 50 (1,6) R06 - antihistaminiques systémiques 59 (1,9) B01 - antithrombotiques 63 (2,0) C07 - -bloquants 52 (1,7)
A02 - médicaments pour les troubles de l'acidité ; A03 - médicaments troubles fonctionnels gastro-intestinaux
C09 - médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine
G03 - hormones sexuelles et modulateur de la fonction génitale
J01 - antibactériens à usage systémique
M01 - anti-inflammatoires et antirhumatismaux
R05 - médicaments du rhume et de la toux
les données relatives aux ventes de médicaments sur le marché hospitalier sont exprimées
uniquement en millions d’euros (chiffre d’affaire). Elles prennent alors en compte à la fois la
quantité de médicaments vendus mais aussi le prix du médicament. Dans ce classement, une
classe ATC composée de médicaments qui coutent chers mais qui sont peu vendus pourra se
retrouver au même niveau qu’une classe ATC composée de médicament peu couteux mais
beaucoup vendus. Cependant, en comparant le classement des ventes de médicaments sur la
marché officinal exprimées en valeur (chiffre d’affaire en million d’euros) avec celui basé sur
les données exprimées en quantité (millions d’unité vendues) (Tableau 21), il ressort que plus
de la moitié des classes ATC de niveau 2 sont communes aux deux classements. De plus, sur
les 10 classes les plus vendues en valeur, 8 font partie des classes les plus vendues en
quantité. En conséquence, en dépit de l’influence du prix du médicament, les données de
vente exprimées en valeur reflètent un certain niveau de consommation. Les données de
l’AFSSAPS sur les ventes de médicaments sur le marché hospitalier exprimées en valeur sont
donc exploitables à condition de ne pas tenir compte de l’ordre du classement.
Tableau 21 : Répartition des ventes de médicaments en quantité et en valeur sur le marché officinal en
2008 (part du marché %). Sont indiquées en gras les classes communes aux 2 classements.
classes ATC de niveau 2 les plus vendues en quantité classes ATC de niveau 2 les plus vendues en valeur
N02 - analgésiques (19,4) C09 - système rénine-angiotensine (7,0)
N05 - psycholeptiques (5,1) C10 - hypolipidémiants (5,7)
J01 - antibactériens (4,2) N02 - analgésiques (5,1)
V03 - tous autres médicaments (3,4) R03 - syndromes obstructifs des voies aériennes (4,9)
S01 - médicaments ophtalmologiques (2,7) B01 - antithrombotiques (4,3)
A03 - troubles gastro-intestinaux (2,7) A02 - troubles de l'acidité (4,3)
A02 - troubles de l'acidité (2,7 N06 - psychoanaleptiques (4,1)
N06 - psychoanaleptiques (2,6) J05 - antiviraux à usage systémique (3,4)
C09 - système rénine-angiotensine (2,5) A10 - médicaments du diabète (3,3)
R01 - préparations nasales (2,5) J01 - antibactériens (3,2)
R05 - médicaments du rhume et de la toux (2,3) N05 - psycholeptiques (2,9)
C10 - hypolipidémiants (2,3) J07 - vaccins (2,8)
M01 - AI et antirhumatismaux (2,2) L03 - immunostimulants (2,8)
A10 - médicaments du diabète (2,2) L04 - immunosuppresseurs (2,8)
B01 - antithrombotiques (2,1) S01 - médicaments ophtalmologiques (2,6)
A01 - préparations stomatologiques (2,1) G03 - hormones sexuelles (2,5)
A06 - laxatifs (2,0) L02 - thérapeutique endocrine (2,1)
G03 - hormones sexuelles (2,0) M01 - AI et antirhumatismaux (2,0)
R06 - antihistaminiques systémiques (2,0) B03 - préparations antianémiques (1,9)
C07 - -bloquants (1,7) L01 - antinéoplasiques (1,8)
A02 - médicaments pour les troubles de l'acidité ; A03 - médicaments troubles fonctionnels gastro-intestinaux
C09 - médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine
G03 - hormones sexuelles et modulateur de la fonction génitale
J01 - antibactériens à usage systémique
M01 - anti-inflammatoires et antirhumatismaux
R03 - médicaments syndromes obstructifs des voies aériennes
D’après les rapports de l’AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments (AFSSAPS,
2006 ; AFSSAPS, 2008 ; AFSSAPS, 2009 ; AFSSAPS , 2010), en France, depuis 2004 et
jusqu’en 2008, les anticancéreux (antinéoplasiques), les antihémorragiques, les antiviraux, les
substituts du plasma et solutions de perfusion ou encore les antibactériens, les
psycholeptiques et les analgésiques sont parmi les classes ATC de niveau 2 les plus vendues
112
Tableau 22 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché hospitalier en valeurs en 2004, 2006, 2007
et 2008 (part du marché %).
2004 2006 2007 2008

L01 - antinéoplasiques (20,2) L01 - antinéoplasiques (28,8) L01 - antinéoplasiques (28,9) L01 - antinéoplasiques (30,1)
J05 - antiviraux (10,6) B02 - antihémorragiques (9,0) B02 - antihémorragiques (9,3) B02 - antihémorragiques (9,3)
B03 - préparations antianémiques (10,0) J05 - antiviraux (6,9) J05 - antiviraux (7,1) J05 - antiviraux (7,2)
B02 - antihémorragiques (7,8) B05 - plasma et perfusion (6,2) B05 - plasma et perfusion (5,5) L04 - immunosuppresseurs (5,3)
B05 - plasma et perfusion (5,4) J01 - antibactériens (4,6) J06 - immunsérums et Ig (4,2) B05 - plasma et perfusion (5,2)
J01 - antibactériens (4,9) J06 - immunsérums et Ig (3,7) L04 - immunosuppresseurs (3,8) J06 - immunsérums et Ig (4,5)
L04 - immunosuppresseurs (3,5) B03 - préparations antianémiques (3,3) J01 - antibactériens (3,8) A16 - voies digestives (3,6)
V03 - tous autres médicaments (3,3) L04 - immunosuppresseurs (3,3) A16 - voies digestives (3,4) B01 - antithrombotiques (3,4)
N01 - anesthésiques (3,1) B01 - antithrombotiques (3,2) B01 - antithrombotiques (3,3) J01 - antibactériens (3,3)
J06 - immunsérums et Ig (3,0) N01 - anesthésiques (2,9) B03 - préparations antianémiques (3,2) B03 - préparations antianémiques (2,8)
113
J02 - antimycosiques (2,3) J02 - antimycosiques (2,8) J02 - antimycosiques (2,7) J02 - antimycosiques (2,6)
L03 - Immunostimulants (2,2) V03 - tous autres médicaments (2,7) V03 - tous autres médicaments (2,7) N01 - anesthésiques (2,5)
B01 - antithrombotiques (2,1) A16 - voies digestives (2,5) N01 - anesthésiques (2,6) V03 - tous autres médicaments (2,3)
C02 - antihypertenseurs (2,0) N05 - psycholeptiques (2,0) N05 - psycholeptiques (1,9) V09 - radiopharmaceutiques (1,8)
A16 - voies digestives (2,0) N02 - analgésiques (1,9) N02 - analgésiques (1,9) N02 - analgésiques (1,8)
N05 - psycholeptiques (1,9) V09 - radiopharmaceutiques (1,4) V09 - radiopharmaceutiques (1,7) N05 - psycholeptiques (1,7)
N02 - analgésiques (1,6) V08 - produits de contraste (1,3) C02 - antihypertenseurs (1,4) C02 - antihypertenseurs (1,5)
V08 - produits de contraste (1,3) C02 - antihypertenseurs (1,3) V08 - produits de contraste (1,2) V08 - produits de contraste (1,0)
V09 - radiopharmaceutiques (1,2) N06 - psychoanaleptiques (1,0) M03 - myorelaxants (1,1) M03 - myorelaxants (0,9)
M03 - myorelaxants (0,9) M03 - myorelaxants (1,0) N06 - psychoanaleptiques (1,0) D08 - antiseptiques et désinfectants (0,9)
A16 - autres médicaments des voies digestives

communes avec le marché officinal comme les antibiotiques ou les analgésiques.
B05 - substituts du plasma et solutions de perfusion

J01 - antibactériens à usage systémique ; J02 - antimycosiques à usage systémique ; antiviraux à usage systémique ; J06 - immunsérums et
immunoglobulines
V09 - produits radiopharmaceutiques
les antihémorragiques, les produits de contraste ou les anesthésiques alors que d’autres sont
sur la marché hospitalier (Tableau 22). Certaines classes sont spécifiques à ce marché comme
En conclusion, à partir des données de ventes affichées dans les rapports de l’AFSSAPS, il
ressort que les analgésiques (N02), les psycholeptiques (N05) et les antibiotiques (J01) sont
les médicaments les plus consommés aussi bien en officine qu’à l’hôpital ; que les
médicaments des voies digestives et du métabolisme (classes ATC A02, A03), du système
cardio-vasculaire (classes ATC C05, CO9, C10, C07) et du système respiratoire (classes ATC
R01, R05) sont aussi fortement consommés spécifiquement sur le marché officinal ; et que les
anticancéreux (L01), les antiviraux (J05) et les médicaments de la classe ATC B (sang et
organes hématopoïétiques, B01, B02, B05) sont les plus consommés sur le marché hospitalier.
Par ailleurs, pour certains médicaments qui sont vendus sans prescription, comme ceux
disponibles sur internet par exemple, il est très difficile d’avoir un chiffre exact sur leurs
ventes ou sur leurs consommations. C’est le cas par exemple des inhibiteurs de PDE 5 comme
le sildénafil contenu dans le viagra. Vu la facilité d’accès à de tels médicaments, leur
consommation est supposée être importante mais aucune donnée précise n’est vraiment
disponible.
I.2. Toxicité
Les éléments présentés dans ce paragraphe reprennent brièvement les données présentées dans
la partie VI. Toxicité et écotoxicité du chapitre 1.
D’après les informations disponibles sur les effets secondaires des médicaments dans le
dictionnaire Vidal (2006), dans le guide « Traitement antirétroviral de l’infection à VIH chez
l’adulte et l’adolescent en situation de ressources limitées » (OMS, 2008) ou sur le site
internet Drugs.com (http://www.drugs.com), il s’avère que les anticancéreux et les anti-VIH
comptent parmi les composés les plus cytotoxiques et pour lesquels le plus d’effets
secondaires indésirables ont été rapportés (ex. : nausée, perte des cheveux pour les
anticancéreux ou neuropathie et lipodystrophie pour les anti-VIH).
Du point de vue des mécanismes d’action, des récepteurs 1 et/ou 2 sur lesquels des -
bloquants peuvent agir sont présents sur les érythrocytes et sur les cellules cardiaques de la
truite arc-en-ciel (Huggett et al., 2003). Des homologues des enzymes COX, que les AINS
peuvent inhiber, ont été trouvés chez la truite arc-en-ciel. Des gènes codant pour des
récepteurs PPAR ont été identifiés chez plusieurs espèces de poisson comme le saumon
d’Atlantique ou le poisson zèbre. Les hypolipémiants du groupe des fibrates se fixent sur ces
récepteurs PPAR (Fent et al., 2006). La présence chez les poissons de récepteurs ou d’enzyme
similaire à celles présentes chez les humains laisse supposer que les effets biologiques ou les
réactions indésirables des médicaments pourraient se produire chez les non-mammifères.
D’un point de vue toxicologique, les antibiotiques envers les cyanobactéries, les -bloquants
et les antidépresseurs comme la fluoxétine ou encore les hypolipémiants comme les fibrates,
envers les invertébrés, sont les composés les plus toxiques avec des EC 50 ou des NOEC de
l’ordre du µg/L ou de la dizaine de µg/L (Figure 28 et Figure 29). D’après les tests
d’évaluation du risque environnemental conduite par Ferrari et al. (2004) ou Gros et al.
(2010), les antibiotiques constituent la classe thérapeutique qui représente le plus de risques
avec le plus de composés possédant des rapports PEC / PNEC > 1.
Par ailleurs les phénomènes d’antibiorésistance accentuent les risques sanitaires et

environnementaux représentés par les antibiotiques. Des bactéries résistantes aux
114
antibiotiques de la famille des -lactames (pénicillines et céphalosporines) ont été mises en

évidence dans des rejets de stations d’épuration et les eaux de surface (Reinthaler et al.,
2003).
Ainsi, de par leurs effets secondaires, leurs mécanismes d’action ou le niveau de leurs
concentrations effectives, les antibiotiques, les anticancéreux, les anti-VIH, les bloquants, les
hypolipémiants de la catégorie des fibrates et les AINS sont identifiés comme des classes
thérapeutiques pouvant avoir un effet toxique sur des organismes non ciblés. Les problèmes
d’antibiorésistance ajoutent un poids supplémentaire aux risques sanitaires et
environnementaux représentés par les antibiotiques.
I.3. Présence dans l’environnement
En se basant sur les résultats du projet KNAPPE (Figure 30, Schlüsener et al., 2007), les
antibiotiques, les anti-inflammatoires, les -bloquants et les analgésiques sont les classes de
médicaments les plus recherchés et les plus retrouvés dans les échantillons environnement.
Selon Miège et al. (2009) (Tableau 23), les analgésiques et anti-inflammatoires, les
antibiotiques, les hypolipémiants, les antiépileptiques et les -bloquants sont les classes
thérapeutiques les plus étudiées avec des fréquences de recherche respectivement de 20 ; 8,7 ;
4,4 ; 4 et 2,8 %.
D’après les données collectées dans la littérature et présentées dans les tableaux en annexe
(Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7), les analgésiques et anti-inflammatoires, les
antibiotiques, les antiépileptiques et antidépresseurs, les hypolipémiants et les -bloquants
sont les composés les plus recherchés et les plus retrouvés dans les différentes matrices
aqueuses. Les antibiotiques et certains antiépileptiques et antidépresseurs comme la
carbamazépine ou la fluoxétine sont également retrouvés dans les boues de STEP (Annexe -
tableau 8). Les antibiotiques sont en plus recherchés et retrouvés dans les déchets d’élevage.
Ainsi, 5 classes sont retenues comme étant les plus présentes dans le milieu naturel. Il s’agit
des analgésiques et anti-inflammatoires, des antibiotiques, des antiépileptiques et
antidépresseurs, des -bloquants et des hypolipémiants.
antiasthmatique
2%
hypolipémiant anticancéreux décongestionnant
6% 3% bronchodilatateur
1%
métabolite
7% antibiotique
anxiolytique
30%
anti-convulsant
8%
agent de contraste
9% anti-inflammatoire
analgésique b-bloquant 13%
10% 11%
Figure 30: Répartition des classes de molécules pharmaceutiques en fonction de leur fréquence d’analyse
dans des échantillons environnementaux (traduit du projet KNAPPE).
115
Tableau 23 : Classes thérapeutiques et molécules pharmaceutiques les plus recherchées dans les stations
d'épuration (traduit de Miège et al., 2009).
fréquence
classes thérapeutiques molécules
(%)*
hormones œstrone, 17 -œstradiol, 17 -œstradiol, 30
17 -éthinylœstradiol, testostérone, progestérone
analgésiques et anti- ibuprofène, diclofénac, kétoprofène, naproxène, 20
inflammatoires acide méfénamic
antibiotiques sulfaméthoxazole, triméthoprime, ciprofloxacine, 8,7
roxithromycine, norfloxacine, clarithromycine,
érythromycine
hypolipémiants bézafibrate, gemfibrozil 4,4
antiépileptique carbamazépine 4,0
métabolites acide clofibrique, acide salicylique 3,9
-bloquants métoprolol, propranolol, aténolol 2,8
produits de soin corporel galaxolide, tonalide 2,7
agents de contraste iopromide 1,1
désinfectant triclosan 0,8
vasodilatateurs pentoxifylline 0,7
antidépresseurs diazépam 0,6
total 80
* fréquence de citation dans la base de données de Miège et al., 2009 (117 articles, 6641 données, 184 molécules)
I.4. Persistance
D’après la Figure 7 présentée dans la partie IV du chapitre 1, à l’exception du diclofénac, les

analgésiques comme le paracétamol ou l’aspirine et les anti-inflammatoires comme
l’ibuprofène, le kétoprofène ou le naproxène sont relativement bien éliminés dans les STEP.
En revanche, les antiépileptiques comme la carbamazépine, les hypolipémiants comme l’acide
clofibrique ou les -bloquants comme le métoprolol sont difficilement éliminés (abattement <
50 %). La persistance des antibiotiques durant le traitement dans les stations d’épuration varie
en fonction de la famille considérée. Les fluoroquinolones sont bien éliminés de la phase
dissoute par exemple alors que les macrolides ou les imidazoles ne semblent pas être affectés
par les traitements appliqués. Les anticancéreux sont également difficilement éliminés dans
les STEP (Annexe - tableau 1).
Ainsi, 5 classes sont retenues comme persistantes en dépit des processus de traitement
appliqués dans les STEP, il s’agit : des antiépileptiques, des hypolipémiants, des -bloquants,
de certains antibiotiques et des anticancéreux.
I.5. Manque de données
A travers l’ensemble des données de présence et de concentration collectées et présentées

dans les figures 13 à 27 et les tableaux 14 et 15 ou encore de l’Annexe - tableau 2 à l’Annexe
- tableau 8, il ressort que certaines classes comme les anesthésiques, les antihypertenseurs, les
antidiabétiques, les vasodilatateurs, les antagonistes des récepteurs angiotensine II, les
antagonistes des récepteurs calciques, les inhibiteurs de PDE 5 ou encore les anti-VIH sont
peu étudiées. Deux raisons peuvent expliquer ce constat. La première est liée au nombre de
molécules qui constituent ces classes. Contrairement aux analgésiques ou aux antibiotiques
116
dont plus d’une douzaine et plus d’une quarantaine de molécules respectivement ont été
recherchées et retrouvées au moins une fois dans les eaux de surface ou les effluents de STEP,
certaines classes comme les antihypertenseurs ou les antidiabétiques ont peu de représentants,
2 molécules recherchées et retrouvées. La deuxième raison est liée au peu d’intérêt qui a été
porté jusqu’à présent à certaines classes comme les anti-VIH ou les anticancéreux (en dehors
des rejets hospitaliers). Ainsi, en dépit d’un nombre suffisamment conséquent de
représentants dans ces classes, peu d’informations sont disponibles. Par exemple uniquement
2 articles scientifiques traitent des anti-VIH dans l’environnement à notre connaissance (Al-
Rajab et al., 2010 ; Prasse et al., 2010). Enfin certaines classes comme les inhibiteurs de PDE
5 cumulent les 2 raisons. Elles sont constituées d’un petit nombre de molécules et sont peu
étudiées (un seul article scientifique traite des inhibiteurs de PDE 5 dans l’environnement à
notre connaissance Nieto et al., 2010a).
Ainsi, 6 classes et sous classes sont retenues comme ne possédant pas beaucoup
d’informations relatives à leur présence dans l’environnement. Il s’agit des anti-VIH, des
inhibiteurs de PDE 5, des anticancéreux, des antihypertenseurs, des antidiabétiques et des
anesthésiques. Par ailleurs aucune donnée n’a été relevée sur la présence de médicament
appartenant aux classes ATC A02 et A03 relatives aux médicaments des troubles gastro-
intestinaux ou de l’acidité alors que d’après les données de ventes de l’AFSSAPS, ce sont des
composés très consommés.
I.6. Classes sélectionnées
Le Tableau 24 reprend les classes de molécules retenues pour chacun des critères de sélection
pris en compte. Les classes thérapeutiques les plus récurrentes dans le tableau, c’est-à-dire
celles correspondant au plus grand nombre de critère de sélection ont été choisies. Cependant,
un autre critère relatif aux composés déjà étudiés au laboratoire a été pris en considération à
ce niveau là de la sélection. En effet, une méthode initiale développée par Togola et Budzinski
(2008) existait au laboratoire pour permettre le dosage de molécules pharmaceutiques
appartenant aux classes thérapeutiques des AINS, des hypolipémiants, des anti-épileptiques et
antidépresseurs, des bronchodilatateurs et des stimulants. Ainsi, bien que certaines de ces
classes répondent à un grand nombre de critères de sélection, de façon délibérée, elles n’ont
pas été retenues. Les classes sélectionnées ont été choisies de façon à constituer une liste
complémentaire à celle pré-existante.
Les antibiotiques ont été retenus car ils répondent à 4 critères de sélection (présents dans 4 des
5 colonnes du Tableau 24). Ils sont fortement consommés, fréquemment recherchés et
retrouvés dans l’environnement et peu éliminés de la phase dissoute lors du traitement dans
les STEP pour certaines familles. Ils représentent aussi un risque environnemental et sanitaire
majeur de par leur toxicité envers les cyanobactéries et les phénomènes d’antibiorésistance.
De plus, contrairement à d’autres classes thérapeutiques, ils sont également utilisés en
médecine vétérinaire.
Les anticancéreux correspondent également à 4 des 5 critères de sélections. Ils sont toxiques,
persistants et fortement consommés, surtout à l’hôpital. Par ailleurs, ils ont été peu recherchés
dans l’environnement à l’exception des rejets hospitaliers. En conséquence, peu de données
sont disponibles sur leur présence potentielle dans le milieu naturel. L’ajout de cette classe de
médicaments à la liste des composés à analyser permettra potentiellement de combler ces
lacunes.
117
Les -bloquants, les antiviraux, les antiépileptiques et les hypolipémiants répondent à 3

critères sur 5. Cependant, en considérant le critère relatif à la toxicité et à l’écotoxicité comme
prioritaire sur les autres, seuls les -bloquants et les anti-VIH ont été sélectionnés. De plus les
antiépileptiques et les hypolipémiants appartiennent à la liste pré-existante des composés
précédemment analysés au laboratoire. Les antiépileptiques ne remplissent pas ce critère selon
nos données et les hypolipémiants ne le remplissent que pour le sous-groupe des fibrates ce
qui est insuffisant pour considérer la classe entière. En revanche, les anti-VIH ont été choisis
car peu d’études ont été menées sur eux et ils apportent un coté innovant à ces travaux.
Enfin, la classe des inhibiteurs de PDE 5 a été retenue pour deux raisons : i) à notre
connaissance, une seule publication traite des inhibiteurs de PDE 5 à l’heure actuelle (Nieto et
al., 2010a) et la volonté d’intégrer cette classe apporte un côté original à cette étude ; ii)
aucune donnée précise de consommation n’est disponible sur ces composés, or s’ils sont
détectés à de fortes concentrations dans les eaux usées, cela permettra d’avoir une idée sur les
pratiques de consommation (stratégie similaire à celle appliquée à l’étude des drogues,
Postigo et al., 2010).
Tableau 24 : Synthèse des classes de médicaments retenues suivant les différents critères de choix.
classes sélectionnées classes sélectionnées classes sélectionnées classes sélectionnées classe sélectionnées selon
selon le critère selon le critère selon le critère selon le critère le critère manque de
consommation toxicité / écotoxicité présence persistance données
analgésiques antibiotiques analgésiques certains antibiotiques anticancéreux
antibiotiques anticancéreux antibiotiques certains anticancéreux antidiabétiques
anticancéreux anti-inflammatoires antidépresseurs antiépileptiques anesthésiques
antihémorragiques anti-VIH antiépileptiques -bloquants antihypertenseurs
antiviraux -bloquants anti-inflammatoires hypolipémiants antiviraux dont anti-VIH
troubles gastro- hypolipémiants
intestinaux (fibrates) -bloquants inhibiteurs PDE 5
troubles de l’acidité hypolipémiants troubles gastro-intestinaux
psychoanaleptiques
psycholeptiques
plasma et perfusion
II. Sélection des molécules

Pour cibler les composés à analyser, une fois les classes thérapeutiques sélectionnées, le
deuxième niveau de choix consistait à identifier les familles d’antibiotiques ou sous-classes
d’anticancéreux et d’anti-VIH à étudier. Enfin le troisième niveau de choix concernait les
molécules. Les critères et documents pris en compte pour effectuer ces choix sont détaillés
classe par classe dans les paragraphes suivants.
Dans un premier temps, 32 molécules ont été sélectionnées comme composés modèles
d’étude. Comme pour les classes thérapeutiques, le choix s’est basé sur des données de
consommation, de toxicité, de représentativité des classes et sous-classes de composés ainsi
que sur des résultats d’études antérieures révélant la présence de certaines molécules par
rapport à d’autres au sein d’une même classe/famille. Il a également été pris en compte la
disponibilité et le prix des composés étalons de référence. La liste a ensuite été étendue à 78
composés. Le choix s’est basé sur les mêmes critères que ceux évoqués précédemment
auxquels ont été ajoutées les informations obtenues suite à nos premiers résultats d’analyse
comme par exemple la présence plus importante de certaines classes ou familles. Le tableau
118
présenté à la fin de cette partie liste les 78 molécules retenues accompagnées de leur critère de
sélection.
II.1. Les antibiotiques
II.1.1. Consommation des antibiotiques
Les antibiotiques sont utilisés à la fois en médicine humaine et en médecine vétérinaire dans
le traitement d’infections dues à des bactéries, des champignons, des parasites. Ils ont aussi
pendant longtemps été employés dans les élevages (agricoles et aquacoles) comme additifs
alimentaires pour prévenir une infection et favoriser la croissance des animaux (InVS, 2004).
Mais les problèmes de résistances bactériennes aux antibiotiques ont amené les pouvoirs
publics au niveau européen à limiter leurs usages dans de tels buts depuis l’interdiction des
glycopeptides comme l’avoparcine en 1997 (http://www.admi.net/eur/Loi/Leg_euro/fr_397
L0006.html, 24/11/06) jusqu’à l’interdiction totale de tous les antibiotiques comme additifs
alimentaires depuis le 1 er janvier 2006 (http://europa.eu/rapid/pressReleasesAction.do
?reference=IP/05/1687&format=HTML&aged=0&language=FR&guiLanguage=fr, 24/11/06).
En fonction de leurs usages (médecine humaine ou vétérinaire), de leur spectre d’action et de

leur mode d’action, les différentes classes d’antibiotiques sont plus ou moins prescrites et
donc plus ou moins consommées.
II.1.1.1 Consommation des antibiotiques en médecine humaine
En raison des problèmes d’antibiorésistance, la consommation des antibiotiques en France et

en Europe est particulièrement suivie. Le projet ESAC, pour « European Surveillance of
Antimicrobial Consumption », en est un parfait exemple. L'objectif principal de ce projet est
de collecter les données de consommation des antibiotiques et de le mettre gratuitement à la
disposition de la communauté scientifique et du grand public (http://app.esac.ua.ac.be/public
/index.php/fr_fr /esac/what, 16/09/10). Il est donc aisé de trouver des données sur la
consommation des différentes familles d’antibiotiques. Celles-ci sont exprimées en DDD pour
« Define Daily Dose ». L’ESAC définit la DDD comme « la dose moyenne journalière d’un
médicament (ou plus exactement de la molécule active qu’il contient) dans son indication
principale, pour un adulte de 70 kilogrammes ». C’est une unité de mesure de la
consommation et un outil de comparaison qui a été mis au point par l’OMS. Afin de prendre
en compte les différences importantes de population d’un pays à l’autre et de rendre ainsi
possibles des comparaisons internationales, la consommation d'antibiotiques est
communément exprimée en nombre de doses définies journalières pour 1000 habitants et par
jour (defined daily doses per 1000 inhabitants per day, DID) (http://app.esac.ua
.ac.be/public/index.php/fr_fr/antibiotic/defined-daily-dose, 16/09/10).
La Figure 31 a été réalisée à partir des données disponibles sur le site de l’ESAC. Elle met en
évidence l’évolution de la consommation des différentes familles d’antibiotiques en France
entre 1998 et 2008 en médecine ambulatoire et entre 2006 et 2008 en médecine hospitalière.
La Figure 31a représente l’évolution de la consommation des différentes familles
d’antibiotiques en France entre 1998 et 2008 en médecine ambulatoire. Il ressort très
clairement que les pénicillines sont la famille d’antibiotique la plus consommée. Depuis 2005,
les familles d’antibiotiques les plus consommées en médecine ambulatoire sont par ordre
119
décroissant d’importance : 1) les -lactames (pénicillines), 2) les macrolides et lincosamides,

3) les tétracyclines, 4) les autres -lactames (céphalosporines), 5) les quinolones et
fluoroquinolones et enfin, 6) les sulfonamides et triméthoprime. En médecine hospitalière, les
consommations sont moins importantes qu’en médecine ambulatoire (Figure 31b) et les
tendances ne sont pas tout à fait les mêmes. La famille des quinolones et fluoroquinolones
arrive en deuxième position, derrière les pénicillines, des familles d’antibiotiques les plus
consommées. Les macrolides et lincosamides ainsi que les tétracyclines y sont peu
consommés.
consommation antibiotiques en France en médecine ambulatoire
b-lactames (pénicillines) macrolides, lincosamides et streptogramines

autres b-lactames tétracyclines
quinolones et fluoroquinolones sulfonamides et trimethoprime
autres antibiotiques
20
15
DDD/1000hab-j
10
5
consommation antibiotiques en France à l'hopital
b-lactames
0 (pénicillines) macrolides, lincosamides et streptogramines
autres b-lactames tétracyclines
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
quinolones et fluoroquinolones sulfonamides et trimethoprime
autres antibiotiques (a)
1,5
DDD/1000hab-j
1,0
0,5
0,0
2006 2007 2008 (b)
Figure 31 : Evolution de la consommation des antibiotiques en France en médecine ambulatoire entre
1998 et 2008 (a) et à l’hôpital entre 2006 et 2008 (b), exprimée en DDD pour 1000 habitants et par jour (à
partir des données ESAC).
La première sélection des familles d’antibiotiques a été faite à partir de ces informations.
Ainsi les pénicillines et céphalosporines, les macrolides et lincosamides, les tétracyclines, les
quinolones et fluoroquinolones, les sulfonamides et les phénicolés ont été retenus. En se
basant sur le classement ATC (Figure 32) et sur les données de consommation en médecine
vétérinaire (cf. II.1.1.2 Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire) et dans le
but de représenter tous les sous-groupes (ATC niveau 4), 23 molécules ont été choisies au
sein de ces familles (ATC niveau 3) de façon à alimenter une méthode de base.
120
J01 antibactériens à usage systémique

J01A tétracyclines
J01AA tétracyclines (12 molécules différentes)
J01B amphénicols
J01BA amphénicols (2 molécules différentes)
J01C beta-lactames, pénicillines

J01CA pénicillines à spectre large (18 molécules différentes)
J01CE pénicillines sensibles aux beta-lactamases (10 molécules différentes)
J01CF pénicillines résistantes aux beta-lactamases (5 molécules différentes)
J01CG inhibiteurs de beta-lactamase (2 molécules différentes)
J01CR combinaisons de pénicillines, incl. inhibiteurs de beta-lactamase (1 molécule)
J01D autres beta-lactames

J01DB céphalosporines première génération (12 molécules différentes)
J01DC céphalosporines seconde génération (11 molécules différentes)
J01DD céphalosporines troisième génération (17 molécules différentes)
J01DE céphalosporines quatrième génération (3 molécules différentes)
J01DF monobactames (1 molécule)
J01DH carbapenemes (6 molécules différentes)
J01DI autres céphalosporines (1 molécule)
J01E sulfonamides and triméthoprime

J01EA triméthoprime and dérivés (3 molécules différentes)
J01EB sulfonamides à courte vie (8 molécules différentes)
J01EC sulfonamides à vie intermédiaire (3 molécules différentes)
J01ED sulfonamides à longue vie (9 molécules différentes)
J01EE combinaison de sulfonamides and triméthoprime, incl. dérivés
J01F macrolides, lincosamides and streptogramines

J01FA macrolides (14 molécules différentes)
J01FF lincosamides (2 molécules différentes)
J01FG streptogramines (2 molécules différentes)
J01G aminoglycosides
J01GA streptomycines (2 molécules différentes)
J01GB autres aminoglycosides (11 molécules différentes)
J01M quinolones
J01MA fluoroquinolones (19 molécules différentes)
J01MB autres quinolones (7 molécules différentes)
J01R combinaison d’antibactériens

J01RA combinaison d’antibactériens
J01X autres antibactériens

J01XA glycopeptides (5 molécules différentes)
J01XB polymyxines (2 molécules différentes)
J01XC antibactériens stéroïdes (1 molécules différentes)
J01XD dérivés de l’imidazole (3 molécules différentes)
J01XE dérivés des nitrofuranes (2 molécules différentes)
J01XX autres antibactériens (10 molécules différentes)
Figure 32 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antibiotiques en médecine
humaine (d’après le site internet http://www.whocc.no/atc_ddd_index/).
Ultérieurement, dans le but d’agrandir et d’optimiser la liste des molécules à étudier, il est
apparu nécessaire de connaître le détail des consommations individuelles de chaque
antibiotique. L’ « IMS Health » est une entreprise qui collecte les données des ventes de
médicaments en officine. Elle possède donc les chiffres exacts des ventes de chaque spécialité
pharmaceutique. En compilant les données de vente des différents médicaments contenant le
même principe actif, elle est à même de fournir les données de ventes individuelles de chaque
molécule. L’IMS Health a alors été contacté dans le but d’obtenir les chiffres des ventes
individuelles de chaque antibiotique. Cette entreprise a ainsi pu nous donner le classement des
100 molécules les plus vendues en France en 2007 et en 2008 ainsi que les données des ventes
121
d’antibiotiques en officine, molécules par molécules (Tableau 25 et Tableau 26). En l’absence

de données plus précises sur les ventes d’antibiotiques à l’hôpital, ce sont les données sur les
ventes en officines qui ont guidé le choix des antibiotiques à étudier.
Les données de l'IMS Health (Tableau 26) ont permis de confirmer les choix précédents
comme par exemple celui de l’amoxicilline, qui avec plus de 48,9 millions d’unités vendues
en 2008 (31 879 072 seule et 17 090 265 en association avec l’acide clavulanique) est la
cinquième molécule pharmaceutique et le premier antibiotique le plus vendu, ou encore celui
du cefpodoxime proxétil qui est la trente-huitième molécule pharmaceutique et le troisième
antibiotique le plus vendu. Elles ont également permis d’étendre la sélection à des familles
d’antibiotiques qui n’avaient pas été retenues dans la liste initiale de base comme les
imidazoles par exemple. En effet, le métronidazole est le quatrième antibiotique le plus
consommé avec 5 945 182 unités vendues en 2008. Au total, en France, en 2008, plus de
127 millions d’unités d’antibiotiques à usage systémique ont été vendues en officines. Au
final en incluant ces nouvelles informations aux précédentes, 52 antibiotiques ont été choisis
pour être analysés.
Tableau 25 : Nombre d’unités vendues sur les 100 premières molécules du marché ambulatoire français
en 2007 et 2008 (données IMS Health).
Unités Unités
2007 2008
paracétamol 359 968 100 362 373 119
dextropropoxyphène / paracétamol 66 209 727 60 532 673
ibuprofène 44 642 062 45 536 094
acide acétylsalicylique 44 025 250 43 217 105
amoxicilline 31 037 694 31 879 072
lévothyroxine sodium 29 570 806 30 593 355
metformine 29 231 093 27 327 019
codéine / paracétamol 25 588 005 25 589 778
diclofénac 24 164 384 24 768 639
zolpidem 23 116 238 23 080 994
paracétamol / tramadol 19 921 436 22 117 926
caféine / dextropropoxyphène / paracétamol 21 180 905 18 997 761
kétoprofène 18 626 174 18 422 694
chlorhexidine / chlorobutanol 16 433 924 18 050 015
oméprazole 18 412 280 18 004 759
dompéridone 18 472 392 17 867 688
amoxicilline / acide clavulanique 17 026 802 17 090 265
macrogol(s) 16 914 324 16 937 459
phloroglucinol 17 135 929 16 559 289
furosémide 16 523 459 16 497 210
alprazolam 16 295 669 16 398 917
atorvastatine 17 097 819 16 002 958
bétaméthasone 16 375 769 15 910 199
zopiclone 16 142 460 15 824 670
méthadone 14 158 013 15 581 707
paroxétine 16 159 140 15 267 755
acide alginique / sodium 13 312 709 13 420 314
bromazépam 13 885 820 13 264 132
glycine max / persea gratissima 12 904 310 13 012 119
magnésium / pyridoxine 13 962 885 12 993 594
trimétazidine 13 748 059 12 918 562
lopéramide 12 664 852 12 865 565
esoméprazole 10 938 704 12 835 393
prednisolone 12 388 113 12 661 667
phloroglucinol / triméthoxybenzène 11 802 413 12 149 001
clopidogrel 12 112 600 12 146 795
hélicine 11 804 828 12 133 858
cefpodoxime proxétil 12 706 970 12 113 131
122
Unités Unités
2007 2008
pravastatine 13 966 779 11 990 827
fénofibrate 13 252 521 11 856 302
pantoprazole 11 628 363 11 851 027
carbocistéine 12 469 210 11 782 244
caféine / opium / paracétamol 11 823 230 11 756 291
sodium (sous forme de chlorure, etc.) 11 083 813 11 423 066
allopurinol 11 488 739 11 360 409
buprénorphine 11 133 187 11 314 099
bisoprolol 11 117 647 11 310 429
oxomémazine 11 122 057 11 230 909
trimébutine 11 835 322 11 204 291
acétylcystéine 11 055 109 11 145 154
lidocaïne / prilocaïne 10 600 395 11 102 376
potassium (sous forme de chlorure, d’iodure, 10 770 809 10 779 710
du gluconate, de citrate, etc.)
desloratadine 10 598 287 10 761 951
acétylcystéine / tuaminoheptane 11 129 956 10 710 939
éthinylestradiol / lévonorgestrel 11 161 375 10 678 339
lorazépam 11 264 324 10 677 965
glycérol / huile de paraffine 9 849 264 10 499 706
calcium / colécalciférol 10 818 960 10 280 048
simvastatine 11 254 563 10 272 928
vaccine, grippe 10 684 325 10 164 379
alvérine / siméthicone 10 117 753 10 103 130
tramadol 9 688 321 9 965 266
rosuvastatine 8 247 309 9 692 274
salbutamol 9 933 750 9 612 607
tétrazépam 9 208 836 9 152 369
ramipril 9 409 470 9 138 683
éconazole 9 192 536 9 073 919
fluindione 8 948 558 9 060 466
povidone-iodine 8 841 650 8 960 002
amlodipine 9 916 201 8 917 259
lansoprasole 9 024 591 8 668 248
gliclazide 8 895 086 8 652 737
acide borique 9 053 678 8 577 319
venlafaxine 8 641 088 8 559 826
ginkgo biloba (hétérosides de ginkgo + 8 854 691 8 545 655
ginkgolides bilobalide)
magnésium (sous forme de chlorure, de 9 237 303 8 544 603
sulfate, du gluconate, de citrate, etc)
tixocortol 8 807 202 8 490 898
cétirizine 8 643 970 8 325 795
fluoxétine 9 208 390 8 261 668
aténolol 8 955 784 8 253 301
prednisone 8 045 252 7 996 183
smectite 7 604 783 7 854 578
oxazépam 7 497 940 7 757 604
lactulose 8 237 432 7 726 952
acide chondroitinsulfurique 7 592 834 7 622 248
pholcodine 6 619 730 7 380 621
lercanidipine 7 007 819 7 313 471
perindopril 7 221 872 7 283 123
hydroxyzine 7 083 862 7 121 166
buflomédil 8 361 205 6 938 276
ibuprofène / pseudoéphédrine 7 423 135 6 891 289
trolamine 6 424 677 6 732 394
benfluorex 7 739 065 6 636 097
morphine 6 788 742 6 616 766
acide folique 6 481 089 6 553 216
alpha amylase 7 816 646 6 498 780
fluticasone / salmeterol 6 731 312 6 480 458
doxylamine 6 210 502 6 456 599
naphazoline / prednisolone 6 571 925 6 398 398
cétylpyridinium / chlorobutanol / eugen 6 004 358 6 382 201
123
Tableau 26 : Nombre d'unités d'antibiotiques (classe ATC J01) vendues en France en 2007 et 2008 en
officines (données IMS Health).
Unités Unités
2007 2008
J01 ANTIBACTERIENS 129 608 051 127 090 216
amoxicilline 31 037 694 31 879 072
amoxicilline / acide clavulanique 17 026 802 17 090 265
cefpodoxime proxétil 12 706 970 12 113 131
métronidazole / spiramycine 5 961 185 5 945 182
pristinamycine 5 333 534 5 654 278
ceftriaxone 4 802 023 4 785 213
clarithromycine 4 697 813 4 355 236
céfixime 3 581 500 3 714 468
céfuroxime axétil 3 673 588 3 447 879
doxycycline 3 175 753 3 048 806
norfloxacine 2 919 785 2 788 596
ofloxacine 2 061 208 2 114 997
azithromycine 2 189 961 2 064 272
sulfaméthoxazole / triméthoprime 2 100 170 2 055 592
ciprofloxacine 2 112 665 2 046 960
gentamicine 2 072 267 1 952 121
josamycine 1 966 960 1 885 606
nétilmicine 1 848 509 1 722 450
roxithromycine 1 701 537 1 625 050
cloxacilline 1 495 094 1 469 692
oxacilline 1 418 891 1 425 664
acide fusidique 1 531 581 1 402 644
levofloxacine 1 200 823 1 244 419
céfaclor 1 478 458 1 173 716
colistine 1 080 972 981 822
minocycline 1 150 712 921 355
lymécycline 967 723 885 995
pénicilline V 894 395 853 557
spiramycine 822 849 785 038
céfotiam hexétil 807 917 773 048
telithromycine 1 029 572 638 537
moxifloxacine 814 087 629 309
tobramycine 636 555 597 557
loméfloxacine 585 673 596 539
céfadroxil 520 983 444 768
ceftazidime 233 119 286 020
érythromycine 284 883 282 481
céfalexine 296 806 248 124
clindamycine 194 837 207 916
cilastatine / imipénème 108 639 113 511
métacycline 114 466 101 514
pénicilline G 85 308 83 646
lysozyme / métacycline 84 260 78 242
ampicilline 100 126 74 210
pipéracilline / tazobactam 54 755 74 157
péfloxacine 82 680 72 866
céfuroxime 46 849 42 414
ampicilline / sulbactam 51 322 41 551
céfradine 63 920 39 289
céfatrizine 96 152 38 256
aztréonam 32 267 35 416
dirithromycine 42 054 33 550
fluméquine 35 072 30 643
midécamycine 26 885 22 252
pivampicilline 73 089 12 058
céfépime 5 416 11 060
acide clavulanique / ticarcilline 2 500 10 343
thiamphénicol 11 097 9 109
ticarcilline 3 144 8 653
lincomycine 6 016 7 854
céfapirine 54 124 5 490
124
Unités Unités
2007 2008
pivmécillinam 6 658 4 850
spectinomycine 3 715 1 620
déméclocycline --- 217
céfazoline 686 54
céfotaxime 12 17
bacampicilline 986 ---
II.1.1.2 Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire
En France, en 2008, 1191 tonnes d'antibiotiques à usage vétérinaire ont été vendues
(Chevance et al., 2009). Si certaines familles sont utilisées autant en médecine humaine que
vétérinaire, d'autres en revanche sont majoritairement destinées à la consommation animale
telle que les phénicolés, les aminosides (ou aminoglycosides), les polymyxines, les
tétracyclines, les sulfonamides (ou sulfamides), les quinolones et dans une moindre mesure,
les macrolides et apparentés (Figure 33).
part
humain vétérinaire
100%
pourcentage des ventes
80%
60%
40%
20%
0%
quinolones
polymyxines
b-lactames
macrolides et
autres b-lactames
aminosides
sulfonamides et
fluoroquinolones
nitrofurannes
tétracyclines
phénicolés
triméthoprime
apparentés
Figure 33 : Répartitions entre usage humain et vétérinaire des ventes des différentes familles
d’antibiotiques (Source http://www.afssa.fr/ftp/afssa/34471-34472.ppt# 350,19 ANMV-AFSSAPS 2002).
Parmi les familles d’antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire, les tétracyclines arrivent
largement en tête des antibiotiques les plus vendus suivies par les sulfonamides puis viennent
les pénicillines, les macrolides, les aminosides et enfin les polypeptides (Figure 34). Les 4
premières familles citées représentent plus de 80% des ventes (Chevance et al., 2009).
Sur l’ensemble des ventes d’antibiotiques à usage vétérinaire, 93 % du tonnage total est
distribué aux animaux consommables, les porcs représentant à eux seuls plus de 50% de la
consommation totale (Figure 35) (Chevance et al., 2009).
125
Chapitre
répartitions 2 : Lesd'antibiotiques
des ventes composés étudiés
par familles
entre 1999 et 2006
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
800
ventes (tonnes) 700
600
500
400
300
200
100
0 s
fu s
es
pé ides
na s
ph nes
os es
s
pe s
eth de s
in s
s
ne
qu e rs
m line
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oq olé
e
e
ne
rim
su clin
n
po sid
lid
lo
ph olo
ri
v
i
ra
m
c
pt
cil
di
no
po
ro
ni
op
cy
in
ni
ac
ui
lfo
tra
am
ly
al
té
or
tri
flu
cé
Figure 34 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques
familles à usage vétérinaire entre 1999 et 2008
(d’après les données de Chevance et al,. 2009).
répartion des ventes d'antibiotiques à usage vétériniare
entre les différentes espèces
OVIN-CAPRIN; 1,48% POISSON; 0,43%

CHEVAL; 0,39%
CHIEN-CHAT; 1,69%
AUTRE; 0,01%
LAPIN; 4,46%
BOVIN; 15,22%
PORC; 56,70%
VOLAILLE; 19,62%
Figure 35 : Répartition de la consommation des antibiotiques vétérinaires en France en 2008 (graphique

d'après les données du rapport de l'AFSSA-ANMV, Chevance et al., 2009).
Au sein des diverses espèces animales, la répartition de la consommation des antibiotiques par
famille est différente (Figure 36). Ainsi chez les porcs, 2 familles sont majoritairement
administrées: les tétracyclines et les polypeptides alors que chez les bovins il y a une plus
grande diversité dans la consommation des différentes familles d'antibiotiques. Les
pénicillines sont les plus utilisées puis viennent les aminosides, les macrolides et les
tétracyclines et les polypeptides à part égale. Pour pouvoir comparer les données de
consommation entre les espèces, ces dernières sont rapportées en tonnes de poids vif traité.
Chez les poissons, seulement quatre familles d’antibiotiques sont administrées, les
quinolones, les tétracyclines, les sulfonamides et les triméthoprimes par ordre décroissant
d’importance (Chevance et al., 2007).
Enfin d'une façon plus détaillée, les molécules les plus utilisées pour traiter les porcins sont :
la chlortétracycline, l'oxytétracycline, la sulfadiazine, la sulfadiméthoxine, le triméthoprime,
l'amoxicilline, la tylosine, les lincosamides, la marbofloxacine et la colistine. Et celles pour
126
traiter les bovins sont par ordre décroissant d'utilisation: l'oxytétracycline, la

sulfadiméthoxine, la pénicilline G, la sulfadiazine, la doxycycline, la dihydrostreptomycine,
l'amoxicilline, la colistine, l'ampicilline, la néomycine, le triméthoprime, la tylosine, la
chlortétracycline, la tétracycline, l'acide oxolinique, la fluméquine, la cloxacilline et la
spiramycine (com. pers.).
40% 40%
35% 35%
30% 30%
25% 25%
20% 20%
15% 15%
2000 10% 2000 10%
2002 5% 2002 5%
2004 0% 2004 0%
2006 2006
2008 2008
a) b)
Figure 36 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 a)
pour les porcs et b) pour les bovins d'après les données de consommation exprimées en tonnes de poids
vif traité (graphiques extrait du rapport de l’AFSSA, Chevance et al., 2009).
De l’ensemble de ces informations, il faut retenir qu’en médecine vétérinaire, ce sont

majoritairement les mêmes familles d’antibiotiques qu’en médecine humaine qui sont
administrées, seule leur importance relative varie. Deux familles spécifiques viennent s’y
ajouter, les polypeptides et les aminosides. Par ailleurs, les molécules administrées peuvent
être les mêmes comme l’amoxicilline par exemple ou à l’inverse, très spécifique comme la
marbofloxacine. Sur la base de ces nouvelles informations la sélection d’antibiotique a pu être
élargie. Il a aussi été ajouté deux molécules appartenant à la famille des polyéther/ionophores,
la monensine et la salinomycine (groupe QP dans la classification ATCvet) qu’il est
normalement interdit d’utiliser comme facteur de croissance (IP/05/1687 du 22/12/05,
http://europa.eu/rapid/pressReleasesAction.do?reference=IP/05/1687&format=HTML&aged=
0&language=FR&guiLanguage=en). Au final, parmi les 52 antibiotiques choisis, 6 sont
exclusivement destinés à l’usage vétérinaire : le ceftiofur, la tylosine, la marbofloxacine,
l’enrofloxacine, la monensine et la salinomycine.
II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance
Comme pour la sélection des classes thérapeutiques, le choix des familles d'antibiotiques et
des molécules s'est appuyé sur les données de toxicité et d'écotoxicité présentées dans la
partie VI du chapitre 1.
En se basant sur les effets secondaires, la famille des pénicillines est retenue. Les pénicillines
(amoxicilline, ampicilline, pénicilline G, etc.) semblent être la seule famille responsable
d'effets secondaires pouvant engager le pronostic vital en provoquant des réactions allergiques
susceptibles d'évoluer jusqu'au choc anaphylactique.
127
Du point de vue des mécanismes d'action, le sulfaméthizole inhiberait l'activité basale de

l'EROD, enzyme reflétant l'induction du cytochrome P450 responsable de l'élimination des
xénobiotiques (Laville et al., 2004 dans Boxall, 2004). La pénicilline G, le sulfaméthoxazole,
la sulfapyridine, l'oxytétracycline et la novobiocine provoqueraient le déclanchement du
métabolisme oxydatif (Gagné et al., 2006). La ciprofloxacine serait génotoxique (Hartmann et
al., 1998).
Les tests de toxicité aigue pratiqués sur les cyanobactéries, les algues, les invertébrés et les
poissons (figure 27 et tableau 13 chapitre 1) ont fait ressortir le caractère toxique des
antibiotiques vis-à-vis des cyanobactéries et en particulier de l'amoxicilline (EC 50 = 3,7 µg/L,
figure 27 et tableau 13), de la pénicilline G (figure 27), de la spiramycine (figure 27), de la
streptomycine (figure 27), de la ciprofloxacine (EC50 = 5 µg/L, figure 27 et tableau 13), de
l'ofloxacine (EC50 = 16 µg/L, tableau 13), de la sarafloxacine (EC50 = 15 µg/L, tableau 13) et
du sulfaméthoxazole (EC50 = 26,8 µg/L, tableau 13). Les tests de toxicité chronique pratiqués
sur les cyanobactéries, les algues, les invertébrés et les poissons (figure 28) ont confirmé le
caractère toxique des antibiotiques vis-à-vis des cyanobactéries et en particulier de
l'amoxicilline, de la pénicilline G, de la spiramycine, de l'érythromycine, du
sulfaméthoxazole, de la streptomycine, de l'ofloxacine, de la levofloxacine et de la
ciprofloxacine (EC50 ou NOEC < 10 µg/L).
Lors des ERA, Huschek et al. (2004) ont montré que la clarithromycine et la ciprofloxacine
représentaient un risque pour les bactéries avec des rapports PEC / PNEC supérieurs à 1.
Halling-Sorensen et al. (2000) ont mis en évidence le risque représenté par la ciprofloxacine
pour les cyanobactéries. Ferrari et al. (2004) ont montré qu'une autre fluoroquinolone,
l'ofloxacine, représentait également un risque pour les cyanobactéries. Gros et al. (2010) ont
montré que l'érythromycine représentait un risque vis-à-vis des invertébrés (daphnies) et la
tétracycline vis-à-vis des algues. Enfin, avec plusieurs valeurs de rapport PEC / PNEC
supérieurs à 1, le sulfaméthoxazole représente un danger pour les cyanobactéries et les algues
(Ferrari et al., 2004 ; Gros et al., 2010).
Du point de vue de l'antibiorésistance, les résistances aux -lactames sembleraient être les
plus courantes (activité -lactamase de certaines bactéries) (InVS).
II.1.3. Présence dans le milieu
La présence et le niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les

diverses matrices aqueuses sont présentés Figure 37. En se basant sur le nombre de données
collectées (nombre de points sur le graphique), les familles d'antibiotiques les plus
recherchées et les plus retrouvées sont les sulfonamides, les quinolones et fluoroquinolones et
les macrolides et lincosamides. Les tétracyclines et quelques -lactames sont également
recherchés et retrouvés mais à des fréquences moindres. Le groupe des autres antibiotiques
(autre Ab) est essentiellement constitué par la famille des imidazoles. Quelques soit la famille
considérée, les niveaux de contamination se situent entre la dizaine de ng/L et le µg/L mais
peuvent être inférieurs dans les eaux souterraines ou les eaux de boisson, ou au contraire
supérieurs dans les entrées de STEP et les effluents hospitaliers.
128
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000
hopital
b-lactames entrée STEP
sortie STEP
présence et niveau de contamination des antibiotiques dans les différentes matrices aqueuses
surface
souterraine
potable
hopital
macrolides et lincosamides
entrée STEP
sortie STEP
surface
souterraine
potable
hopital
entrée STEP
fluoroquinolones
quinolones et
sortie STEP
surface
souterraine
potable
hopital
entrée STEP
sulfonamides
sortie STEP
surface
souterraine
potable
hopital
entrée STEP
tétracyclines
sortie STEP
surface
souterraine
potable
hopital
entrée STEP
autres Ab
sortie STEP
surface
souterraine
potable
Figure 37 : Présence et niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les matrices
aqueuses d’après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7).
129
Au sein de ces différentes familles, généralement 2 ou 3 composés sont davantage recherchés

et retrouvés que les autres (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). Dans la famille des
sulfonamides, il s'agit du sulfaméthoxazole et du triméthoprime. Dans la famille des
fluoroquinolones et quinolones, il s'agit de la ciprofloxacine, de la norfloxacine et de
l'ofloxacine. Dans la famille des macrolides et lincosamides, il s'agit de l'érythromycine et de
la roxithromycine. Miège et al. (2009) listent les mêmes molécules comme étant les
antibiotiques les plus fréquemment recherchés mais remplacent l'ofloxacine (une
fluoroquinolone) par la clarithromycine (un macrolide).
Dans les boues de STEP (Figure 27), se sont les mêmes molécules qui sont les plus
recherchées mais à la différence, ce sont surtout les fluoroquinolones (ciprofloxacine,
norfloxacine et ofloxacine) et les tétracyclines (doxycyclines et tétracyclines) qui sont les plus
retrouvées en raison de leur affinité la matière organique (Koc) ou des liaisons
éléctrostatiques qu’elles forment avec elle (pKa). Néanmoins, la clarithromycine, le
sulfaméthoxazole et le triméthoprime sont fréquemment détectés.
Dans les déchets d'élevage, les antibiotiques de la famille des tétracyclines (tétracycline,
oxytétracycline, chlortétracycline) sont les molécules les plus souvent analysées (recherchées
et détectées), en particulier la chlortétracycline. Les molécules les plus fréquemment dosées
sont les fluoroquinolones tels que la ciprofloxacine ou l'enrofloxacine, les macrolides et
lincosamides tels que la tylosine et la lincomycine et les sulfonamides tels que la
sulfaméthazine.
II.1.4. Persistance
Les différentes molécules d'une même famille d'antibiotiques ont des comportements
similaires. Les comportements observés pour une ou deux molécules peuvent donc être
étendus à l'ensemble de la famille. Les macrolides et lincosamides ainsi que les imidazoles
sont faiblement éliminés dans les stations d'épurations (Figure 7). Leurs pourcentages
d'élimination moyens sont inférieurs à 20 %. En revanche, les pénicillines et les
fluoroquinolones sont bien éliminés de la phase dissoute avec des pourcentages d'élimination
supérieurs à 60 %.
II.1.5. Manque de données
Relativement aux autres composés, les antibiotiques appartenant aux familles des polyéthers
ionophores ou des polypeptides sont peu recherchés dans les matrices environnementales. En
conséquence, peu de données sont disponibles pour les molécules comme la monensine ou la
bacitracine.
II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux,

anti-VIH et inhibiteurs de la PDE 5.
II.2.1. Consommation
Contrairement aux antibiotiques, il est difficile d’avoir accès à des données de consommation
pour les sous-classes ou pour chaque molécule individuelle de ces 4 classes thérapeutiques.
130
Dans les rapports de l’AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments aux officines et
aux hôpitaux, les informations majoritaires qui peuvent en être extraites concernent
l’évolution du nombre d’unités vendues ou de DDJ consommées pour la totalité de la classe.
Par ailleurs, pour les antinéoplasiques ou les anti-VIH par exemple, des informations
concernant les ventes de certains médicaments sont disponibles dans le rapport de
l’AFSSAPS (AFSSAPS, 2009) mais elles sont exprimées en valeurs et non en quantité or vu
le prix de tels traitements, cela ne reflète pas forcément la consommation de chaque molécule
mais uniquement l’importance générale de la classe. Par conséquent, initialement, les critères
de sélection au sein de ces classes ont été uniquement les données de présence dans
l’environnement et d’écotoxicité ainsi que la représentativité des sous-classes (cf. classement
ATC Figure 38 pour les -bloquants, Figure 39 pour les anticancéreux et Figure 40 pour les
anti-VIH). C’est ainsi que pour les -bloquants par exemple, un représentant des -bloquants
sélectifs (métoprolol) et un autre des -bloquants non-sélectifs (propranolol) ont été choisis.
De même, il a été décidé de choisir une molécule dans chacun des 3 groupes les plus
importants d’anti-VIH (IP, INTI, INNTI ou les classes ATC J05AE, J05AF, J05AG Figure
40) en se basant sur les recommandations de traitement de l’OMS. Ce choix a ensuite été
orienté en fonction de la disponibilité et du coût des composés étalons de référence.
Ultérieurement, la sélection a pu être optimisée grâce aux données fournies par l’IMS Health
sur les ventes de molécules pharmaceutiques aux officines en 2008 (Tableau 25, Tableau 27,
Tableau 28 et Tableau 29).
C’est ainsi qu’ont été intégrés les -bloquants les plus consommés tels que le bisoprolol
(quarante-septième molécule pharmaceutique et premier -bloquants le plus vendu avec
quasiment 15 millions d’unités vendues, seul ou en association) ou l’aténolol (quatre-
vingtième molécule pharmaceutiques et deuxième -bloquants le plus vendu avec plus de 8
millions d’unités vendues, seul ou en association) (Tableau 25 et Tableau 27).
Au sein des antinéoplasiques (L01), le méthotréxate est le composé le plus consommé avec
plus d’un million d’unités vendues. Le fluorouracile et le cyclophosphamide font partie des 15
antinéoplasiques les plus consommés en France en 2008 sur le marché ambulatoire. Avec 49
236 et 23 558 unités vendues, ils sont respectivement les huitièmes et quatorzièmes molécules
les plus vendues. La doxorubicine et la daunorubicine sont des antinéoplasiques qui sont aussi
vendus sur le marché ambulatoire. Le tamoxifène est le troisième cytostatique utilisé en
hormonothérapie le plus vendu avec 675 101 unités vendues en 2008 en France. Il
n'appartient pas à la classe des antinéoplasiques (L01) mais est utilisé comme anticancéreux
dans les traitements du cancer du sein.
Au sein des anti-VIH, la lamivudine (253 000 unités vendues, 87 973 en association avec
l’abacavir, 87 776 en association avec la zidovudine, 29 995 en association avec l’abacavir et
la zidovudine et 47 409 seul) et le ritonavir (227 000 unités vendues, 139 595 en association
avec le lopinavir et 88 251 seule) sont respectivement le premier et le second anti-VIH les
plus vendus. L'abacavir et la zidovudine comptent également parmi les anti-VIH les plus
administrés avec plus de 148 000 et 132 000 unités vendues sur le marché ambulatoire
(abacavir seul : 30 510 unités vendues, abacavir en association avec zidovudine : 87 973
unités vendues et abacavir en association avec lamivudine et zidovudine : 29 995 unités
vendues ; zidovudine seul : 14 608 unités vendues, zidovudine en association avec lamivudine
: 87 776 unités vendues et zidovudine en association avec lamivudine et abacavir : 29 995
unités vendues).
131
C07 bétabloquants
C07A bétabloquants
C07AA bétabloquants, non-sélectif (14 molécules différentes)
C07AB bétabloquants, sélectif (13 molécules différentes)
C07AG alpha et bétabloquants (2 molécules différentes)
C07B bétabloquants et thiazides

C07BA bétabloquants, non-sélectif, et thiazides
C07BB bétabloquants, sélectif, et thiazides
C07BG alpha et bétabloquants et thiazides
C07C bétabloquants et autres diurétiques

C07CA bétabloquants, non-sélectif, et autres diurétiques
C07CB bétabloquants, sélectif, et autres diurétiques
C07CG alpha et beta bétabloquants et autres diurétiques
C07D bétabloquants, thiazides et autres diurétiques

C07DA bétabloquants, non-sélectif, thiazides et autres diurétiques
C07DB bétabloquants, sélectif, thiazides et autres diurétiques
C07E bétabloquants et vasodilatateurs

C07EA bétabloquants, non-sélectif, et vasodilatateurs
C07EB bétabloquants, sélectif, et vasodilatateurs
C07F bétabloquants et autres antihypertenseur

C07FA bétabloquants, non-sélectif, et autres antihypertenseur
C07FB bétabloquants, sélectif, et autres antihypertenseur
Figure 38: Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des -bloquants en médecine
L01 antinéoplasiques
L01A agents alkylants
L01AA moutardes azotées (8 molécules différentes)
L01AB sulfonates alkylés (3 molécules différentes)
L01AC imines éthylene (3 molécules différentes)
L01AD nitrosourées (7 molécules différentes)
L01AG époxides (1 molécule)
L01AX autres agents alkylants (4 molécules différentes)
L01B antimétabolites
L01BA analogues de l’acide folique (4 molécules différentes)
L01BB analogues des purines (6 molécules différentes)
L01BC analogues des pyrimidines (8 molécules différentes)
L01C plantes alcaloïdes et autres produits naturels

L01CA vinca alcaloïdes et analogues (5 molécules différentes)
L01CB dérivés de la podophyllotoxine (2 molécules différentes)
L01CC dérivés de la colchicine (1 molécule)
L01CD taxanes (3 molécules différentes)
L01CX autres plantes alcaloïdes et produits naturels (1 molécule)
L01D antibiotiques cytotoxiques et autres substances apparentées

L01DA actinomycines (1 molécule)
L01DB anthracyclines et substances apparentées (9 molécules différentes)
L01DC autres antibiotiques cytotoxiques (4 molécules différentes)
L01X autres antinéoplasiques

L01XA composés du platinium (4 molécules différentes)
L01XB méthylhydrazines (1 molécule)
L01XC anticorps monoclonaux (10 molécules différentes)
L01XD sensibilisateurs utilisés en photodynamique et radiothérapie (5 molécules différentes)
L01XE inhibiteurs de protéines kinases (11 molécules différentes)
L01XX autres antinéoplasiques (27 molécules différentes)
L01XY combinaison d’antinéoplasiques
Figure 39 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antinéoplasiques en
médecine humaine (d’après le site internet http://www.whocc.no/atc_ddd_index/).
132
J05 antiviraux à usage systémique

J05A antiviraux agissant directement
J05AA thiosemicarbazones (1 molécule)
J05AB nucléosides et nucléotides, exclu. inhibiteurs de la transcriptase inverse (11 molécules différentes)
J05AC amines cycliques (2 molécules différentes)
J05AD dérivés de l’acide phosphonique (2 molécules différentes)
J05AE inhibiteur de la protéase (10 molécules différentes)
J05AF inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse (12 molécules différentes)
J05AG inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (4 molécules différentes)
J05AH inhibiteurs de la neuraminidase (2 molécules différentes)
J05AR antiviraux pour le traitement des infections au VIH, combinaison
J05AX autres antiviraux (8 molécules différentes)
Figure 40 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antiviraux en médecine
Tableau 27 : Nombre d'unités de -bloquants (classe ATC C07) vendues en France en 2007 et 2008 en
Unités Unités
2007 2008
C07 BETA BLOQUANTS 52 812 489 51 107 199
bisoprolol 11 117 647 11 310 429
aténolol 8 955 784 8 253 301
acébutolol 6 243 918 5 906 122
propranolol 4 711 918 4 583 310
sotalol 4 296 079 4 211 843
nébivolol 3 381 282 4 083 699
bisoprolol / hydrochlorothiazide 4 064 344 3 680 333
céliprolol 3 940 795 3 499 782
métoprolol 2 113 896 1 981 173
bétaxolol 1 092 363 985 858
labétalol 807 939 709 994
carvédilol 745 050 700 326
nadolol 352 628 354 885
aténolol / chlortalidone 358 577 315 211
pindolol 238 546 191 006
amiloride / hydrochlorothiazide / timolol 111 268 99 400
tertatolol 67 192 59 637
oxprénolol 54 892 43 085
clopamide / pindolol 50 608 41 574
chlortalidone / métoprolol 37 437 32 461
cartéolol 30 329 28 107
timolol 26 689 23 721
chlortalidone / oxprénolol 13 309 11 942
Tableau 28 : Nombre d'unités d'anticancéreux (classe ATC L01 et L02) vendues en France en 2007 et
2008 en officines (données IMS Health).
Unités Unités
2007 2008
L01 ANTINEOPLASIQUES 2 876 871 2 618 400
méthotréxate 1 387 544 1 124 362
hydroxycarbamide 619 991 634 024
vinorelbine 155 314 140 094
capécitabine 109 776 109 119
imatinib 86 265 87 465
chlorambucil 82 307 74 870
pipobroman 77 775 72 380
fluorouracile 44 706 49 236
mercaptopurine 53 496 48 447
cytarabine 45 940 40 333
erlotinib 35 378 38 919
133
Unités Unités
2007 2008
mitomycine 31 486 31 963
estramustine 33 621 30 484
cyclophosphamide 25 179 23 558
sunitinib 15 649 20 307
melphalan 17 636 15 943
sorafenib 8 116 13 751
fludarabine 13 419 13 173
étoposide 4 516 9 905
tegafur / uracile 9 157 9 821
dasatinib 473 7 084
vincristine 7 174 6 995
vinblastine 2 927 2 882
bléomycine 3 058 2 709
procarbazine 3 247 2 633
nilotinib --- 2 508
asparaginase 1 821 1 745
miltefosine --- 1 482
acide aminolévulinique --- 762
lapatinib --- 531
busulfan 387 333
cladribine 156 235
idarubicine 112 183
chlormethine 178 69
topotécan --- 42
fotémustine 47 37
doxorubicine 2 7
pirarubicine 17 4
daunorubicine 2 3
L02 HORMONOTHERAPIE
CYTOSTATIQUE 5 054 678 4 897 548
anastrozole 1 151 093 1 133 704
cyprotérone 1 153 900 1 063 037
tamoxifen 743 600 675 101
bicalutamide 531 440 516 354
letrozole 399 939 480 035
leuproréline 251 959 250 970
exemestane 248 267 243 347
triptoréline 231 207 219 166
goserelin 124 450 117 090
flutamide 78 245 62 755
diéthylstilbestrol 47 218 48 110
nilutamide 41 060 35 766
fulvestrant 25 403 27 398
megestrol 14 144 12 477
médroxyprogestérone 7 908 7 542
buséréline 4 086 4 108
toremifène 759 588
Tableau 29 : Nombre d'unités vendues d'anti-VIH (classe ATC J05) en France en 2007 et 2008 en
Unités Unités
2007 2008
J05A ANTIVIRAUX DU VIH 1 154 803 1 262 945
emtricitabine / ténofovir disoproxil 161 679 222 458
lopinavir / ritonavir 128 696 139 595
éfavirenz 108 195 119 716
atazanavir 94 550 114 055
ritonavir 45 734 88 251
abacavir / lamivudine 68 515 87 973
lamivudine / zidovudine 104 123 87 776
névirapine 77 666 80 385
ténofovir disoproxil 64 635 62 008
134
Unités Unités
2007 2008
lamivudine 58 210 47 409
didanosine 53 621 41 797
fosamprénavir 44 794 39 596
abacavir 32 723 30 510
abacavir / lamivudine / zidovudine 33 238 29 995
saquinavir 19 989 19 022
zidovudine 17 804 14 608
darunavir --- 12 141
stavudine 13 868 8 774
emtricitabine 8 598 7 789
indinavir 6 329 4 569
enfuvirtide 4 423 2 480
tipranavir 2 307 1 994
amprénavir 142 25
maraviroc --- 10
raltegravir --- 7
zalcitabine 44 3
nelfinavir 4 922 ---
Les données de vente des médicaments contenant du sildénafil n'ont pu être obtenues. Par
ailleurs, le sildénafil est le principe actif du viagra or le viagra est en vente libre sur internet, il
est donc très difficile d’avoir un chiffre de vente reflétant une consommation réelle.
Néanmoins, on peut supposer qu'il est fortement consommé puisque facilement accessible.
Pour clore cette partie sur les données de consommation, à titre indicatif, en France, en 2008,
plus de 51 millions d’unités de -bloquants, plus de 7,5 millions d’unités d’anticancéreux et
plus de 1,2 millions d’unité d’anti-VIH ont été vendues en officines (données IMS Health).
II.2.2. Ecotoxicité
Les -bloquants sont des composés qui possèdent à la fois des effets secondaires indésirables
(troubles cardiaques, constrictions des bronches), des mécanismes d'action susceptibles de les
rendre nocifs pour des organismes non ciblés (présence de récepteurs 1 et 2 chez la truite
arc-en-ciel), des effets reprotoxiques et aussi des données de toxicité (EC50 – NOEC) les
rendant potentiellement dangereux pour l'environnement (ERA, PEC / PNEC > 1). Selon
Huggett et al. (2003), le métoprolol pourrait agir sur les récepteurs 1 des érythrocytes de
truites. Selon ces travaux, le nadolol et le propranolol pourraient agir à la fois sur les
récepteurs 1 des érythrocytes et sur les récepteurs 2 des cellules cardiaques de truites arc-
en-ciel. De plus, le propranolol affecterait la reproduction des invertébrés (amphipodes et
cladocères) et des poissons comme le médaka (Huggett et al., 2002). Par ailleurs, les
concentrations effectives (EC50) provoquant des effets toxiques aigus sont relativement faibles
(centaine de µg/L) pour le propranolol (figure 27 chapitre 1). En revanche, les EC 50 des autres
-bloquants sont généralement autour du mg/L ce qui est éloigné des concentrations mesurées
dans l'environnement. Les données de toxicité chroniques (figure 28 chapitre 1) viennent
confirmer ces tendances avec des NOEC pour le propranolol vis à vis des invertébrés proches
du µg/L. Enfin, Ferrari et al. (2004) ont mis en évidence les risques écotoxicologiques que
représentait le propranolol avec des rapports PEC / PNEC supérieurs à 1 vis-à-vis des algues
(Cyclotella meneghiniana) et des poissons (Oryzias latipes).
Les anticancéreux sont responsables de nombreux effets secondaires. De plus, ce sont des
cytotoxiques comme par exemple la doxorubicine (Caminada et al., 2006). La mitomycine et
135
le cisplatine sont génotoxiques (Guiliana et al., 1996 dans Halling-Sorensen et al., 1997) alors
que l'ifosfamide et le cyclophosphamide sont mutagènes et cancérigènes (Steger-Hartmann et
al., 1996 et 1997). En revanche, d'après Huschek et al. (2004) l'ifosfamide ne représenterait
pas un danger pour les invertébrés (rapport PEC / PNEC < 1).
En ce qui concerne les anti-VIH, ce sont des composés qui provoquent de nombreux effets
secondaires, certains pouvant mettre en jeu le pronostic vital (OMS, 2008). D'après des études
de modélisation, le ritonavir représenterait un risque de toxicité pour les algues (Escher et al.,
2010) et la stavudine un pour les poissons (Kar et Roy, 2010).
II.2.3. Présence dans le milieu
0 1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000
hopital
présence et niveau de contamination des autres classes de médicaments étudiées

entrée STEP
b-bloquants
sortie STEP
surface
souterraine
potable
dans les différentes matrices aqueuses

hopital
entrée STEP
anticancéreux
sortie STEP
surface
souterraine
potable
hopital
entrée STEP
sortie STEP
anti-VIH
surface
souterraine
potable
hopital
inhibiteurs PDE 5
entrée STEP
sortie STEP
surface
souterraine
potable
Figure 41 : Présence et niveau de contamination des -bloquants, des anticancéreux, des anti-VIH et des
inhibiteurs de PDE 5 dans les matrices aqueuses d’après des données relevées dans la littérature (cf.
Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7).
136
La présence et le niveau de contamination des 4 classes thérapeutiques dans les diverses

matrices aqueuses sont présentés Figure 41. En se basant sur le nombre de données collectées
(nombre de points sur le graphique), parmi les 4 classes, les -bloquants sont les composés les
plus recherchés et les plus retrouvés. Leurs concentrations varient entre le ng/L et le µg/L. Les
anticancéreux ont principalement été recherchés dans les effluents hospitaliers et dans les
rejets des STEP. Leur niveau de contamination varie entre la dizaine de ng/L et la centaine de
µg/L dans les rejets hospitaliers et entre le ng/L et le µg/L dans les rejets de STEP. Les anti-
VIH et les inhibiteurs de PDE 5 n’ont été que très peu recherchés dans les échantillons
environnementaux. Seules les eaux usées brutes (entrée de STEP) et les eaux usées traitées
(sortie de STEP) ont été étudiées pour ces deux classes. Les eaux de surface ont aussi été
analysées pour les anti-VIH. Quand ils ont été recherchés, les composés de ces deux classes
ont été retrouvés. Les niveaux de concentration des anti-VIH varient entre le ng/L et le µg/L
alors que les niveaux de concentration des inhibiteurs de PDE 5 sont plus faibles et varient
entre le ng/L et quelques dizaines de ng/L.
Au sein de ces différentes classes, généralement 3 ou 4 composés sont davantage recherchés

et retrouvés que les autres (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). Pour les -bloquants, ce
sont l’aténolol, le propranolol et le métoprolol qui sont les plus recherchés et les plus
retrouvés. Dans la classe des anticancéreux, il s'agit du cyclophosphamide, du tamoxifène et
du méthotréxate. Dans les rejets hospitaliers, le fluorouracile est également régulièrement
détecté. A notre connaissance, uniquement 5 anti-VIH ont été recherchés dans les matrices
aqueuses (Prasse et al., 2010). Il s’agit de l’abacavir, de la lamivudine, de la névirapine, de la
stavudine et de la zidovudine. Sur ces 5 molécules recherchées, la névirapine et la zidovudine
sont celles les plus fréquemment retrouvées. A notre connaissance, une seule publication a
recherché et retrouvé des inhibiteurs de PDE 5 (Nieto et al., 2010a). Les trois molécules
étudiées au cours des travaux présentés dans cet article sont le sildénafil, le vardénafil et le
tadalafil. Le sildénafil est le composé de cette classe qui a été le plus détecté (Nieto et al.,
2010a).
Dans les boues de STEP (Figure 27), 5 -bloquants ont été recherchés et retrouvés. Parmi les
plus fréquemment détectés, il y a le propranolol et l’aténolol, comme dans les matrices
aqueuses. Les anticancéreux et les anti-VIH n’ont jamais été retrouvés dans les boues de
STEP car à priori, ils n’ont jamais été recherchés dans cette matrice. Le sildénafil a été
retrouvé dans des échantillons de boues de STEP (Nieto et al., 2010a).
II.2.4. Persistance
Les pourcentages d’élimination des -bloquants dans les STEP sont très variables en
particulier pour le propranolol (Figure 7). Néanmoins les valeurs moyennes et médianes des
taux d’élimination de l’aténolol, du métoprolol et du propranolol sont inférieures à 50 %. Le
sotalol semble un peu mieux être éliminé avec une valeur moyenne d’abattement autour de 60
%.
Les données sur les taux d’élimination des anticancéreux, des anti-VIH et des inhibiteurs de
PDE 5 sont disponibles dans l’Annexe - tableau 1.
Lorsqu’elle a été étudiée, l’élimination des anticancéreux dans les STEP a été qualifiée de
faible. L’ifosfamide par exemple n’est pas éliminé pour Kümmerer et al. (1997) et il est
éliminé à moins de 3 % pour Mahnik et al. (2007).
137
Selon la molécule considérée au sein de la classe des anti-VIH, son élimination dans les STEP
peut être nulle ou au contraire très importante. Ainsi, d’après Prasse et al. (2010), l’abacavir,
la lamivudine et la stavudine sont éliminés de la phase dissoute à plus de 65 % au cours des
traitements appliqués dans les STEP. En revanche, la névirapine et la zidovudine ne sont pas
toujours éliminés (taux d’élimination atteignant 0 %).
Avec des taux d’abattement de 68, 69 et 80 % dans les STEP, les 3 inhibiteurs de PDE 5 sont
bien éliminés de la phase dissoute dans les STEP (Nieto et al., 2010a).
II.2.5. Manque de données
Les manques de données de présence ou de toxicité sont relatives aux molécules appartenant
aux classes les moins étudiées comme les anticancéreux, les anti-VIH et les inhibiteurs de
PDE 5. Alors qu’il existe un grand nombre de molécules utilisées dans le traitement du cancer
ou du VIH, moins d’une dizaine ont été recherchées dans l’environnement pour chacune de
ces classes. Par ailleurs, à notre connaissance, la présence des anti-VIH dans les eaux
souterraines ou les eaux de boisson n’a jamais été étudiée. De plus, bien qu’ils soient
supposés fortement toxiques, des ERA portant sur les anticancéreux ou les anti-VIH sont rares
ou inexistantes. Concernant les inhibiteurs de PDE 5 comme le sildénafil, il n’existe pas de
donnée relative à leur présence dans les eaux de surface, les eaux souterraines ou les eaux de
boisson. Il n’existe pas non plus d’ERA pour le sildénafil.
II.3. Listes des molécules sélectionnées
A partir de l’ensemble des critères évoqués dans les paragraphes précédents, initialement, 32
molécules, marquées d’un astérisque dans le Tableau 30 (23 antibiotiques, 2 -bloquants, 5
anticancéreux et 2 anti-VIH), ont été choisies. La liste a ensuite été complétée avec la prise en
compte de nouvelles informations sur les données de consommation (données IMS Health) ou
d’écotoxicité (Fent et al., 2006 ; Jjemba, 2006), sur la disponibilité des composés étalons de
références ou encore la pertinence d’inclure certaines molécules par rapport à des projets de
recherche spécifiques comme DIPERPHA qui nécessitait de prendre en compte des
antibiotiques à usage vétérinaire exclusif tel que d’anciens promoteurs de croissance. Au final
78 molécules ont été choisies dans 5 classes thérapeutiques différentes. Elles sont présentées
dans le Tableau 30 accompagnées de leur code ATC, de leurs données de consommation et du
critère de sélection. Leur structure chimique (Annexe 4) et un tableau plus complet
comportant leurs données de pharmacocinétiques et leurs propriétés physico-chimique est
présenté en annexe (Annexe - tableau 10).
Il est rappelé que les molécules appartenant aux classes thérapeutiques des AINS,
antiépileptiques et anti-dépresseurs, hypolipémiants, bronchodilatateurs et stimulants, incluses
dans une méthode pré-existante au laboratoire à ces travaux de thèse, n’ont pas été
sélectionnées. Néanmoins, comme elles ont été analysées dans le cadre du projet Seine Aval
FLASH et que ces résultats sont présentés dans le chapitre 5, elles sont nommées ci-après :
- AINS : aspirine, paracétamol, ibuprofène, kétoprofène, naproxène, diclofénac
- antiépileptiques et anti-dépresseurs : carbamazépine, fluoxétine, amitryptilline,
imipramine, doxépine, alprazolam, bromazépam, diazépam, nordiazépam
- hypolipémiants : gemfibrozil
- bronchodilatateurs : salbutamol, terbutaline, clenbutérol
- stimulants : caféine, théophylline
138
Tableau 30 : Liste des composés sélectionnés avec les informations relatives à leur structure, leur
consommation, leur pharmacocinétique, leurs propriétés physico-chimiques, et les critères de sélection.
(1 : données de l’IMS Health, 2 : données de Besse et Garric, 2007)
Composé
Classe Famille Consommation Critère de sélection
(code ATC)
-lactames
1
antibiotiques amoxicilline* 48 969 337 unités (2008) consommation (1er antibiotique le plus vendu) +
pénicillines (J01CA04) 333 223 kg (2004)2 toxicité
antibiotiques -lactames ampicilline* 115 761 unités (2008)1 consommation + représentativité de la classe
pénicillines (J01CA01)
antibiotiques -lactames pénicilline G* 83 646 unités (2008)1 toxicité + représentativité de la classe
pénicillines (benzylpénicilline)
(J01CE01)
antibiotiques -lactames pénicilline V* 853 557 unités (2008)1 consommation + représentativité de la classe
pénicillines (phénoxyméthyl pénicilline)
(J01CE02)
antibiotiques -lactames oxacilline* 1 425 664 unités (2008)1 consommation (21ème antibiotique le plus vendu)
pénicillines (J01CF04) + représentativité de la classe
antibiotiques -lactames cloxacilline 1 469 692 unités (2008)1 consommation (20ème antibiotique le plus vendu)
pénicillines (J01CF02) + représentativité de la classe
antibiotiques -lactames dicloxacilline représentativité de la classe
pénicillines (J01CF01)
antibiotiques -lactames céfalexine 248 124 unités (2008)1 représentativité de la classe
céphalosporines (J01DB01)
antibiotiques -lactames céfotaxime 17 unités (2008)1 représentativité de la classe
céphalosporines (J01DD01)
antibiotiques -lactames cefpodoxime proxétil* 12 113 131 unités (2008)1 consommation (2ème antibiotique le plus vendu)
céphalosporines (J01DD13) 9 283 kg (2004)2
antibiotiques -lactames ceftiofur* représentativité de la classe + antibiotique
céphalosporines (QJ01DD90) vétérinaire exclusif
antibiotiques -lactames céfuroxime 42 414 unités (2008)1 représentativité de la classe
céphalosporines (J01DC02)
antibiotiques macrolides azithromycine 2 064 272 unités (2008)1 consommation (13ème antibiotique le plus vendu)
(J01FA10) 4 073 kg (2004)2 + persistance
antibiotiques macrolides clarithromycine* 4 355 236 unités (2008)1 consommation (7ème antibiotique le plus vendu) +
(J01FA09) 15 105 kg (2004)2 écotoxicité (ratio PEC / PNEC bactéries > 1) +
présence + persistance
antibiotiques macrolides érythromycine* 282 481 unités (2008)1 écotoxicité (ratio PEC / PNEC daphnies > 1) +
(J01FA01) présence + persistance
antibiotiques macrolides josamycine 1 885 606 unités (2008)1 consommation (17ème antibiotique le plus vendu)
(J01FA07) 12 802 kg (2004)2
antibiotiques macrolides roxithromycine* 1 625 050 unités (2008)1 consommation (19ème antibiotique le plus vendu)
(J01FA06) 3 404 kg (2004)2 + présence + persistance
antibiotiques macrolides spiramycine 6 730 220 unités (2008)1 consommation + toxicité + persistance
(J01FA02)
antibiotiques macrolides tylosine antibiotique vétérinaire exclusif + présence
(QJ01FA90) (déchets d’élevage)
antibiotiques lincosamides clindamycine 207 916 unités (2008)1 consommation + représentativité de la classe
(J01FF01)
antibiotiques lincosamides lincomycine* 7 854 unités (2008)1 consommation (médecine vétérinaire) + présence
(J01FF02) (déchets d’élevage) + persistance STEP
antibiotiques fluoroquinolones ciprofloxacine* 2 046 960 unités (2008)1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC
(J01MA02) 12 186 kg (2004)2 / PNECbactéries et cyanobactéries > 1) + présence
antibiotiques fluoroquinolones enrofloxacine représentativité de la classe + antibiotique
(QJ01MA90) vétérinaire exclusif
antibiotiques fluoroquinolones marbofloxacine consommation (médecine vétérinaire) +
(QJ01MA93) représentativité de la classe + antibiotique
vétérinaire exclusif
antibiotiques fluoroquinolones norfloxacine 2 788 596 unités (2008)1 consommation (11ème antibiotique le plus vendu)
(J01MA06) + présence
antibiotiques fluoroquinolones ofloxacine* 2 114 997 unités (2008)1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC
(J01MA01) 4 137 kg (2004)2 / PNECcyanobactéries > 1) + présence
antibiotiques quinolones acide oxolinique* représentativité des antibiotiques administrés aux
(J01MB05) poissons
antibiotiques quinolones acide pipémidique représentativité de la classe
(J01MB04)
139
Composé
(code ATC)
1
antibiotiques quinolones fluméquine* 30 643 unités (2008) représentativité de la classe
(J01MB07)
antibiotiques tétracyclines tétracycline* écotoxicité (ratio PEC / PNEC algues > 1) +
(J01AA07) présence (déchets d’élevage)
antibiotiques tétracyclines oxytétracycline* consommation (médecine vétérinaire) + présence
(J01AA06) (déchets d’élevage)
antibiotiques tétracyclines chlortétracycline* consommation (médecine vétérinaire) + présence
(J01AA03) (déchets d’élevage)
antibiotiques tétracyclines doxycycline* 3 048 806 unités (2008)1 consommation (10ème antibiotique le plus vendu)
(J01AA02) 6 243 kg (2004)2
antibiotiques sulfonamides sulfadiazine consommation (médecine vétérinaire)
(J01EC02)
antibiotiques sulfonamides sulfadiméthoxine représentativité de la classe + antibiotique utilisé
(J01ED01) en médecine vétérinaire
antibiotiques sulfonamides sulfamérazine représentativité de la classe
(J01ED07)
antibiotiques sulfonamides sulfaméthazine* présence (déchets d’élevage)
(J01EB03)
antibiotiques sulfonamides sulfaméthizole représentativité de la classe
(J01EB02)
antibiotiques sulfonamides sulfaméthoxazole* 2 055 592 unités (2008)1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC
(J01EC01) 16 730 kg (2004)2 / PNECcyanobactéries et algues > 1) + présence
antibiotiques sulfonamides sulfanilamide représentativité de la classe + antibiotique utilisé
(J01EB06) en médecine vétérinaire
antibiotiques sulfonamides sulfapyridine représentativité de la classe + antibiotique utilisé
(J01EB04) en médecine vétérinaire
antibiotiques sulfonamides sulfathiazole représentativité de la classe
(J01EB07)
antibiotiques sulfonamides triméthoprime* 2 055 592 unités (2008)1 consommation + présence
(J01EA01) 3 346 kg (2004)2
antibiotiques phénicolés chloramphénicol* représentativité de la classe
(J01BA01)
antibiotiques phénicolés thiamphénicol 9 109 unités (2008)1 représentativité de la classe
(J01BA02)
antibiotiques imidazole métronidazole 5 945 182 unités (2008)1 consommation (4ème antibiotique le plus vendu) +
(J01XD01) 36 545 kg (2004)2 persistance
antibiotiques polyéthers / monensine sodium salt représentativité de la classe + antibiotique
ionophores (QP51AH03) vétérinaire exclusif + promoteur de croissance
interdit
antibiotiques polyéthers / salinomycine sodium représentativité de la classe + antibiotique
ionophores (QP51AH01) vétérinaire exclusif + promoteur de croissance
interdit
antibiotiques polypeptides bacitracine représentativité de la classe + promoteur de
(J01XX10) croissance interdit
antibiotiques polypeptides virginiamycine M1 représentativité de la classe
(QJ01FG90 ou D06AX10)
autres antibiotiques rifampicine 2 383 kg (2004)2 représentativité de la classe
(J04AB02)
autres antibiotiques acide fusidique 1 402 644 unités (2008)1 consommation + représentativité de la classe
(J01XC01)
-bloquants aténolol 8 568 512 unités (2008)1 consommation (2ème -bloquant le plus vendu) +
(C07AB03) 18 337 kg (2004)2 présence + persistance
-bloquants bisoprolol 14 990 762 unités (2008)1 consommation (1er -bloquant le plus vendu)
(C07AB07) 2 112 kg (2004)2
-bloquants métoprolol* 2 013 633 unités (2008)1 toxicité (peut agir sur les récepteurs 1 des
(C07AB02) 8 786 kg (2004)2 érythrocytes de truite) + présence + persistance
-bloquants propranolol* 4 583 310 unités (2008)1 consommation + toxicité + reprotoxique +
(C07AA05) 12 487 kg (2004)2 écotoxicité (ratio PEC / PNEC algues et poissons > 1) +
présence + persistance
-bloquants sotalol 4 211 843 unités (2008)1 consommation + représentativité de la classe
(C07AA07)
-bloquants timolol 123 121 unités (2008)1 représentativité de la classe
(C07AA06)
anticancéreux anthracyclines daunorubicine* 3 unités (2008)1 anticancéreux antibiotique + consommation en
(L01DB01) 0.8 kg (2004)2 médecine ambulatoire
140
Composé
(code ATC)
1
anticancéreux anthracyclines doxorubicine* 7 unités (2008) anticancéreux antibiotique + consommation en
(L01DB02) 8 kg (2004)2 médecine ambulatoire
anticancéreux anthracyclines épirubicine* 19 kg (2004)2 anticancéreux antibiotique
(L01DB03)
anticancéreux moutardes cyclophosphamide* 23 558 unités (2008)1 consommation + toxicité (mutagène, cancérigène,
azotées (L01AA01) 282 kg (2004)2 tératogène) + présence
anticancéreux moutardes ifosfamide* 121 kg (2004)2 toxicité (mutagène, cancérigène, tératogène) +
azotées (L01AA06) persistance
anticancéreux anti-métabolites 5-fluorouracil 49 236 unités (2008)1 consommation + présence (effluents hospitaliers)
(L01BC02) 1 690 kg (2004)2
anticancéreux anti-métabolites gemcitabine 339 kg (2004)2 représentativité de la classe + manque de données
(L01BC05)
anticancéreux antagoniste des méthotréxate 1 124 362 unités (2008)1 consommation (1er anticancéreux le plus vendu) +
folates (L01BA01) 118 kg (2004)2 présence
anticancéreux antihormones tamoxifen 675 101 unités (2008)1 consommation + présence
(L02BA01)
autres anticancéreux docétaxel 16 kg (2004)2 représentativité de la classe + manque de données
(L01CD02)
anti-VIH INTI abacavir 148 478 unités (2008)1 consommation + manque de données
(J05AF06)
anti-VIH INTI lamivudine 253 153 unités (2008)1 consommation (1er anti-VIH le plus vendu) +
(J05AF05) manque de données
anti-VIH INTI stavudine 8 774 unités (2008)1 écotoxicité + manque de données
(J05AF04)
anti-VIH INTI zidovudine* 132 379 unités (2008)1 consommation + présence + persistance
(J05AF01)
anti-VIH INNTI névirapine 80 385 unités (2008)1 présence + persistance
(J05AG01)
anti-VIH inhibiteur de indinavir 4 569 unités (2008)1 manque de données
protéase (J05AE02)
anti-VIH inhibiteur de nelfinavir 4 922 unités (2007)1 manque de données
protéase (J05AE04)
anti-VIH inhibiteur de ritonavir* 227 846 unités (2008)1 consommation (2ème anti-VIH le plus vendu) +
protéase (J05AE03) écotoxicité
anti-VIH inhibiteur de saquinavir 19 022 unités (2008)1 manque de données
protéase (J05AE01)
inhibiteur de la PDE « viagra » sildénafil manque de données
5 (G04BE03)
INTI : inhibiteur nucléosidiques de la transcriptase inverse, INNTI : inhibiteur non nucléosidiques de la transcriptase inverse
III. Comparaison avec les molécules retenues dans d'autres

études
La liste des molécules sélectionnées a été comparée avec les listes de molécules
médicamenteuses prioritaires à rechercher dans l’environnement établies par d’autres auteurs.
Le Tableau 11 présente ces différentes listes uniquement pour les classes thérapeutiques
communes à celles étudiées au cours de ces travaux de thèse.
Les travaux de Capleton et al. (2006) ont été retenus car ils proposent une liste de molécules
pharmaceutiques à usage vétérinaire prioritaires, classées selon leur toxicité et le risque pour
les humains d’y être exposés via l’environnement. La liste établie par Schlüsener et al. (2007)
dans le cadre du projet KNAPPE, a été utilisée car elle résulte de l’analyse d’un grand nombre
de base de données et de 2 500 publications internationales. Elle totalise 135 molécules
pharmaceutiques d’intérêt environnemental. Les listes d’Algros et Jourdain (2007) ont été
retenues car elles résultent de leurs propres résultats d’analyse de 37 échantillons urbains (eau
et boue de STEP) et de 10 échantillons agricoles français. Ils proposent une liste de « 12
molécules antibiotiques à rechercher préférentiellement au niveau d’échantillons d’origine
141
urbaine » et une liste de « 13 molécules antibiotiques à rechercher préférentiellement au

niveau d’échantillons d’origine agricole ». La liste de molécules pharmaceutiques prioritaires
de Besse et Garric (2007) est basée sur des données de consommation, les premières à être
exprimées en masse de principe actif (kg) pour la France, de métabolisme et d’écotoxicité.
Ces mêmes auteurs proposent également une liste très similaire dans un article intitulé «
Human pharmaceuticals in surface waters: Implementation of a prioritization methodology
and application to the French situation » paru en 2008. Dans cette liste les composés natifs
mais aussi les métabolites sont pris en compte. La sélection des composés s’est basée sur des
données d’exposition (PEC calculées à partir de données de consommation et des données
d’excrétion sous forme inchangées des molécules parents), de toxicité et de pharmacologie
(mécanismes d’action, interaction avec des enzymes, effets secondaires) et sur les propriétés
physico-chimiques. Les listes proposées par Besse et Garric (2007 et 2008) ont été retenues
car ce sont les premières listes françaises. Enfin, la liste établie par l’agence française de
sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) a été retenue. Trois critères de hiérarchisation ont été
choisis pour la constituer : le tonnage, l’activité et l’affinité pour l’eau. Les données de
tonnage sont issues des travaux de Besse et Garric (2007). L’affinité pour l’eau est basée sur
les propriétés physico-chimiques des molécules comme la solubilité. Pour les médicaments à
usage humain, l’activité est liée aux posologies minimales et maximales des médicaments et
aux doses journalières admissibles (DJA). Pour les médicaments à usage vétérinaire, les DJA
et les AJMT (Apport Journalier Maximum Théorique) ont été pris en considération. En
intégrant ces données sous forme d’équation ((quantité consommée / posologie minimale) x
solubilité), un indice de criticité à pu être obtenu. Les molécules présentant les plus forts
indices de criticité ont été sélectionnées.
L’analyse du Tableau 11 montre qu’hormis pour la sous-classe des céphalosporines et des

polypeptides, notre sélection d’antibiotiques est cohérente avec celle des autres listes. Elle est
généralement plus exhaustive. Deux molécules semblent cependant y manquer, il s’agit de la
fosfomycine et de la dihydrostreptomycine. La fosfomycine et la streptomycine, tout comme
l’amikacine, la gentamicine et la colistine, avaient initialement été intégrées à la liste des
molécules à étudier au cours de ces travaux mais n’ont pas été retenues au final pour des
raisons analytiques. Les conditions chromatographiques nécessaires à leur analyse étant
différentes de celles des 78 autres molécules retenues, ces 5 molécules ne pouvaient s’intégrer
dans le cadre d’une démarche d’analyse multi-résidus de la contamination de
l’environnement. En ce qui concerne les -bloquants, elle est bien en accord et même avec un
nombre plus important de composés que les listes proposées par l’AFSSA et par Besse et
Garric. En revanche, certains -bloquants (bétaxolol, carazolol, nadolol, pindolol) y font
défaut par rapport à la sélection de Schlüsener et al. (2007). Le cyclophosphamide,
l’ifosfamide et le fluorouracile sont les anticancéreux, les plus partagés entre toutes les listes.
Ils sont également présents dans notre sélection. Le tamoxifen retenu par Besse et Garric est
également présent dans notre liste. En ce qui concerne les autres anticancéreux, hormis
l’hydroxycarbamide qui apparaît dans les listes de l’AFSSA et de Besse et Garric, leur
sélection semble auteur-dépendant. Les antiviraux, quelque soit leur spécificité (VIH, herpès
ou autre), ne font partie d’aucune autre liste. De même le sildénafil n’apparait dans aucune
autre sélection. L’intégration de ces 2 groupes à la liste de molécules à étudier dans le cadre
de ces travaux de thèse lui confère un caractère original et innovant. Leur analyse et leur
détection dans les échantillons environnementaux vont permettre de remonter aux pratiques
d’usages comme c’est le cas pour les drogues illicites par exemple.
142
Tableau 31 : Comparaison de la liste de molécules étudiées au cours de la thèse avec celles établies par
d’autres études française ou européenne.
Besse et
Algros et
Garric, 2007; Schlüsener et Capleton et
classe - famille familles ces travaux AFSSA, 2008 Jourdain,
Besse et al., 2007 al., 2006
2007
Garric, 2008
antibiotiques amoxicilline x x x x x
pénicillines ampicilline x x x
pénicilline G x x x x
pénicilline V x x
oxacilline x x
cloxacilline x x
dicloxacilline x x
flucloxacilline x
méthicilline x
mezlociline x
nafcilline x
pipéracilline x x
acide clavulanique x
procaïne x
antibiotiques céfalexine x
céphalosporines céfotaxime x
cefpodoxime x
ceftiofur x
céfuroxime x
cefquinome sulfate x
ceftriaxone x
antibiotiques azithromycine x x
macrolides clarithromycine x x x
14-hydroxy- x
clarithromycine x x x x
érythromycine x x x
josamycine x x x
roxithromycine x x x
spiramycine x x x x x
tylosine
antibiotiques clindamycine x x x
lincosamides lincomycine x x
antibiotiques ciprofloxacine x x x x
fluoroquinolones danofloxacine x
enrofloxacine x x
marbofloxacine x
norfloxacine x x x
ofloxacine x x x x x
sarafloxacine x
antibiotiques fluméquine x x x
quinolones acide oxolinique x x x
acide pipémidique x
antibiotiques chlortétracycline x x x x
tétracyclines doxycycline x x x x x
oxytétracycline x x x x x
tétracycline x x x x
antibiotiques sulfadiazine x x x
sulfonamides sulfadiméthoxine x
sulfamérazine x
sulfaméthazine x x x x
sulfaméthizole x
sulfaméthoxazole x x x x
acétyl- x
sulfamethoxazole x
sulfanilamide x
sulfapyridine x
sulfasalazine x
sulfathiazole x
baquiloprime x x x x x
triméthoprime
antibiotiques chloramphénicol x x
phénicolés florfénicol x x
thiamphénicol x x
antibiotiques bacitracine x
polypeptides colistine x
virginiamycine x
143
Besse et
Algros et
Garric, 2007; Schlüsener et Capleton et
classe - famille familles ces travaux AFSSA, 2008 Jourdain,
Besse et al., 2007 al., 2006
2007
Garric, 2008
antibiotiques métronidazole x x x
imidazoles hydroxy- x
métronidazole x
clotrimazole x
mébendazole x
oxfendazole x
parconazole
antibiotiques monensine x x
ionophores salinomycine x x
antibiotiques acide fusidique x x
autres rifampicine x x
fosfomycine x x
dihydrostreptomycine x x
pristinamycine x
dapsone x
furazolidone x
vancomycine x x
bronopol x
-bloquants atenolol x x x x
bisoprolol x x
métoprolol x x
propranolol x x x
sotalol x x x
timolol x
bétaxolol x
carazolol x
nadolol x
pindolol x
anticancéreux daunorubicine x
anthracyclines doxorubicine x
épirubicine x
anticancéreux cyclophosphamide x x x x
moutardes moutarde x
azotées phosphoramide
acroléine x x x x
ifosfamide x
moutarde
isophosphoramide
acroléine
autres 5-fluorouracil x x x
anticancéreux docétaxel x
gemcitabine x
méthotréxate x
tamoxifène x x
hydroxycarbamide x x
carboplatine x
cytarabine x
bléomycine x
etoposide x
imatinib x
antiviraux abacavir x
INTI lamivudine x
stavudine x
zidovudine x
antiviraux névirapine x
INNTI
antiviraux indinavir x
inhibiteurs de nelfinavir x
protéase ritonavir x
saquinavir x
inhibiteur PDE 5 sildénafil x
INTI : inhibiteur nucléosidiques de la transcriptase inverse, INNTI : inhibiteur non nucléosidiques de la transcriptase inverse
144
CHAPITRE 3
Matériel et Méthode
145
146
Chapitre 3 : Matériel et Méthode
I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TECHNIQUES ANALYTIQUES .................................................... 148

I.1. Echantillons et techniques d’échantillonnage .......................................................................... 148
I.1.1. Type de prélèvement ........................................................................................................................ 148
I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements ............................................................................................. 149
I.1.3. Conservation des prélèvements ........................................................................................................ 149
I.2. Conditionnement des échantillons .......................................................................................... 150
I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d’intérêt .............................................. 151
I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE .......................................................................................... 152
I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE....................................................................... 155
I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs.................................................... 156
I.4. Techniques analytiques .......................................................................................................... 156
II. PROJETS ET SITES D’ECHANTILLONNAGE ....................................................................................... 161
II.1. Eaux usées et autres échantillons d’eau ................................................................................... 161
II.2. FLASH .................................................................................................................................. 164
II.2.1. Continuum hospitalier ..................................................................................................................... 164
II.2.2. Continuum agricole ......................................................................................................................... 166
II.3. DIPERPHA ........................................................................................................................... 167
II.4. Capteurs passifs ..................................................................................................................... 173
II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire.......................................................................................... 173
II.4.2. Application dans la Garonne ........................................................................................................... 175
II.5. Récapitulatif des projets ......................................................................................................... 175
III. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS.............................................................................................. 176
III.1. Échantillons « eau » ............................................................................................................... 176
III.2. Échantillons « lisiers » ........................................................................................................... 178
III.3. Échantillons « POCIS ».......................................................................................................... 180
La première partie du chapitre 3 est une synthèse bibliographique sur les différentes
techniques existantes qui permettent d’analyser les molécules pharmaceutiques dans diverses
matrices environnementales. Elle traite des méthodes de prélèvement, du traitement des
échantillons pour en extraire les composés d’intérêt et des techniques d’analyses. La
deuxième partie du chapitre 3 s’attache à décrire les sites d’études et les stratégies
d’échantillonnage mis en œuvre au cours de ces travaux de thèse. Enfin, la troisième partie
présente le traitement des échantillons depuis le prélèvement jusqu’à l’étape
d’évaporation/reconcentration, ultime étape avant l’analyse à proprement parler.
147
I. Revue bibliographique sur les techniques analytiques

I.1. Echantillons et techniques d’échantillonnage
Il existe différentes sortes d’échantillons :

- liquide : eau (douce, saumâtre, salée, usée, traitée, potable, minérale), biologique
(sang, urine)
- solide : boue, sol, sédiment, fumier/Lisier, plante, biologique (muscles, organes,
animal entier)
Suivant le type d’échantillon, le but de l’analyse et le niveau supposé de contamination, le

prélèvement (ponctuel, moyen), les techniques de prélèvement (seringues, sceaux, bouteilles,
pelles, etc.), le volume prélevé (µL, l, kg), le contenant (verre, plastique, acier, aluminium), la
technique de conservation (congélation, addition d’un conservateur, lyophilisation) et la
méthode d’extraction (Extraction Assistée par Micro-ondes (MAE), Extraction Accélérée par
Solvent (ASE), Extraction en Phase Solide (SPE), Micro-Extraction en Phase Solide (SPME))
ne sont pas les mêmes. En revanche les outils analytiques finaux sont souvent identiques
(Chromatographie en phase Gazeuse (GC)/Chromatographie en phase Liquide (LC) –
Spectrométrie de Masse simple (MS) ou en tandem (MS/MS)).
I.1.1. Type de prélèvement
Il existe 3 façons différentes de procéder à l’échantillonnage : l’échantillonnage ponctuel,

l’échantillonnage moyenné et l’échantillonnage passif.
Dans le cas d’un échantillonnage ponctuel, 1 élément unique est prélevé à un seul moment et
un seul endroit (ex. : un certain volume d’eau, une certaine masse de sol, un seul organisme).
Ce type de prélèvement est le plus simple à mettre en œuvre et permet de réduire les coûts
d’échantillonnage. Néanmoins, les résultats issus de l’analyse de tels prélèvements ne
reflètent le niveau de contamination qu’à un instant ou en un lieu donné. Or dans le cas
d’analyse de molécules pharmaceutiques, il a été montré par Lindberg et al., en 2004 (Figure
15) que le niveau de contamination d’effluents hospitaliers par exemple était très variable
suivant le moment de la journée. Ainsi, selon la matrice considérée (eaux usées ou eaux
souterraines) et les informations que l’on souhaite obtenir, ce type de prélèvement n’est pas le
plus adéquate. Cependant, pour des raisons de coût ou d’accessibilité au site
d’échantillonnage, c’est le type de prélèvement qui est souvent mis en œuvre (Hirsch et al.,
1998 ; Vieno et al., 2006 ; Ye et al., 2007 ; Tamtam et al., 2008 ; Nieto et al., 2010a).
Pour s’affranchir des problèmes de représentativité de la mesure obtenue dans le cas d’un
échantillonnage ponctuel, un échantillonnage moyenné peut être réalisé. Dans ce cas là,
plusieurs prélèvements d’une même entité, ou un pool, sont prélevés et mélangés. Les
prélèvements peuvent se faire à un même endroit et à des moments différents (ex. :
prélèvement d’eau toutes les heures pendant 24h à la sortie d’une station de traitement) ou à
un même moment mais à des points différents (ex. : différentes profondeurs pour une même
masse d’eau ou en différentes zones d’un même champ agricole). Cet échantillonnage peut se
faire de façon manuelle ou à l’aide d’un préleveur automatique. Kolpin et al. (2002) ou
Watkinson et al. (2009) composent leur échantillon moyen en mélangeant plusieurs
prélèvements ponctuels réalisés manuellement alors que Coestier et al. (2009), Mullot (2009)
148
ou Gabet-Giraud et al. (2010) utilisent un préleveur automatique dont le prélèvement est

fonction du débit de l’eau à échantillonner.
Enfin le troisième type d’échantillonnage, l’échantillonnage passif, consiste à déposer un

échantillonneur spécifique au milieu étudié (eau, air) et aux contaminants recherchés. Ce
dernier va intégrer la contamination tout le long de son temps de pose qui peut atteindre
plusieurs semaines. Ces outils lissent les fluctuations liées à des évènements particuliers
comme par exemple un relargage massif en rivière d’eaux usées non traitées consécutif à une
saturation des capacités de traitement lors d’épisodes orageux lorsque les réseaux d’eau
pluviale et d’eaux usées ne sont pas différenciés.
I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements
Parmi les 42 références bibliographiques étudiées et rapportées dans l’Annexe - tableau 11

relatif aux conditions de prélèvement et de conservation des échantillons, 28 précisent dans
quel type de contenant les échantillons environnementaux sont recueillis. Quatre sortes de
matériaux sont évoqués : le verre, le plastique (polypropylène), l’acier et le
polytétrafluoroéthylène (PTFE ou Téflon®) (Tableau 32). La majorité des échantillons (78,6 %)
sont prélevés dans des contenants en verre et plus particulièrement dans des bouteilles en
verre ambré (57,1 %) pour éviter la dégradation des composés par les UV. Le verre présente
l’avantage d’être un matériau inerte, qui se nettoie bien (supporte la calcination) et qui peut
donc être réutilisé mais il présente également l’inconvénient d’être fragile et de se rayer. Bien
qu’employé que de façon ponctuelle, le plastique, l’acier et le téflon ® peuvent se révéler
indispensables pour certaines applications ou pour certaines molécules comme les
tétracyclines qui s’adsorbent sur les parois des contenants en verre (Ciarlone et al., 1990).
Tableau 32 : Répartition des 28 références bibliographique précisant dans quel type de contenant les
échantillons sont recueillis (détails dans l’Annexe - tableau 11).
Matériaux utilisés pour le verre polypropylène acier polytétrafluoroéthylène
prélèvement (dont verre ambré) (plastique) inoxydable (PTFE, Téflon®)
Nb de réf. bibliographiques 22 (16) 3 2 1
Fréquence (%) 78,6 (57,1) 10,7 7,1 3,6
I.1.3. Conservation des prélèvements
Pour assurer la stabilité de l’échantillon depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse, diverses

techniques de conservation sont employées : le refroidissement (4°C) ou la congélation (-
18°C ou -20°C), l’ajout d’acide ou d’un agent de conservation comme le formol, le noir, le
séchage ou la lyophilisation et enfin la combinaison de ces différents facteurs. La répartition
entre ces différentes techniques des références bibliographiques indiquant le mode de
conservation des échantillons est indiquée dans le Tableau 33.
Le refroidissement des échantillons à 4°C ou leur congélation permet de ralentir l’activité

bactérienne et donc la dégradation des composés d’intérêts. Le refroidissement à 4°C, seul ou
associé à d’autres techniques de conservation, est la méthode la plus fréquemment utilisée
(28,6 %). En enlevant l’eau tout en gardant l’échantillon congelé, la lyophilisation est la
technique qui permet le mieux de conserver les matrices solides comme les déchets d’élevage
149
ou les sédiments. Une fois lyophilisées ou séchées, elles peuvent ensuite être conservées à
température ambiante.
La combinaison de plusieurs modes de conservation peut s’avérer indispensable pour

certaines molécules. Par exemple, Catastini et al. (2008) ont montré que pour éviter la
dégradation du 5-fluorouracil, un anticancéreux, il était nécessaire d’acidifier les échantillons
en plus de les conserver à une température de 4°C. Kasprzyk-Horden et al. (2007) et Nieto et
al. (2010a) conservent également leur échantillons acidifiés et refroidis ou congelés,
respectivement à 4°C et -25°C. L’ajout d’acide (exemple : acide chlorhydrique, acide
sulfurique) dans les échantillons inhibe l’activité bactérienne et prévient ainsi toute
dégradation microbienne. D’autres auteurs combinent, la conservation à l’abri de la lumière et
à 4°C (Hamscher et al., 2002 ; Gagné et al., 2006 ; Martinez-Carballo et al., 2007 ; Garcia-Ac
et al., 2009). La conservation dans le noir ou dans des bouteilles en verre ambré ou en acier
permet de protéger les composés de la dégradation par les rayonnements UV. Enfin certains
auteurs ajoutent du formaldéhyde (Tong et al., 2009) ou du thiosulfate de sodium (EPA,
2007) pour préserver leurs échantillons durant le prélèvement, le transport et en attendant
l’analyse. Le formaldéhyde tout comme l’acide interrompt l’activité bactérienne. Le
thiosulfate de sodium permet de neutraliser le chlore empêchant alors certaines réactions
chimiques de ce dernier avec les molécules ciblées. Tong et al. (2009) ajoutent également de
l’EDTA dans leurs échantillons directement après le prélèvement afin d’éviter aux
antibiotiques de se fixer sur les ions métalliques. D’autres auteurs comme Cha et al. (2006) ou
Martinez-Carballo et al. (2007) se contentent de rincer leur matériel en verre avec de l’EDTA
afin d’éviter aux tétracyclines de se fixer sur les groupements silanol du verre ou aux ions
métalliques de catalyser la réaction d’hydrolyse du cycle -lactames des pénicillines.
Tableau 33 : Répartition des références bibliographique précisant le mode de conservation des

échantillons (détails dans l’Annexe - tableau 11).
Matériaux utilisés pour le T° congélation plusieurs
+ 4°C séchage lyophilisation
prélèvement ambiante (-18°C, -20°C, -25°C) critères
Nb de réf. bibliographiques 2 12 6 3 3 15
Fréquence (%) 4,7 28,6 14,3 7,1 7,1 35,7
I.2. Conditionnement des échantillons
Une fois que les échantillons ont été prélevés, le conditionnement correspond à la première
étape de leur traitement. Communément cette étape commence par la séparation des
différentes phases qui constituent l’échantillon (phase dissoute, phase particulaire et phase
solide). Le conditionnement peut se faire soit immédiatement après le prélèvement puis
l’échantillon est conservé selon les différents modes de conservation évoqués dans le
paragraphe précédent ; soit après conservation de l’échantillon et avant l’analyse.
Pour séparer la phase liquide de la phase solide, les échantillons solides mais encore
relativement liquides comme la vase, la boue ou les lisiers commencent par être centrifugés.
Puis, les phases solides issues de cette centrifugation ou certains échantillons solides tels que
des sédiments sont lyophilisés afin d’éliminer toutes traces résiduelles d’eau (Martinez-
Carballo et al., 2007 ; Jelic et al., 2009 ; Nieto et al., 2010a ; Yang et al., 2010). D’autres
auteurs comme Golet et al. (2002b), Hamscher et al. (2002) ou Jacobsen et al. (2004)
préfèrent faire sécher leurs échantillons à des températures variant entre 60°C et 100°C. Une
150
fois secs ou lyophilisés, les échantillons sont tamisés, ou broyés et tamisés, afin de les
homogénéiser. La maille des tamis peut varier de 0,125 mm (Nieto et al., 2010a) à 2 mm
(Jacobsen et al., 2004 ; Martinez-Carballo et al., 2007).
Pour séparer la phase particulaire de la phase dissoute, les échantillons aqueux ou la phase
liquide issue de la centrifugation d’échantillons semi-solides sont filtrés. Afin de faciliter leur
filtration, certaines eaux particulièrement chargées en particules, comme les eaux usées en
entrée de STEP, peuvent préalablement être centrifugées (Bendz et al., 2005 ; Cha et al.,
2006 ; Mahnik et al., 2007). La filtration est réalisée principalement sur des filtres en fibre de
verre mais des filtres en nylon sont également employés (Hernando et al., 2004 ; Gros et al.,
2006). Diverses porosités de filtres sont utilisées. La porosité varie entre 0,22 µm et 1,2 µm
mais la majorité des échantillons sont filtrés avec des filtres d’une porosité de 0,45 µm
permettant d’enlever à la fois les particules et les colloïdes (Tableau 34). De plus, la filtration
des échantillons préalablement à leur extraction permet d’éviter ou de limiter le colmatage des
cartouches SPE.
Tableau 34 : Répartition des références bibliographique en fonction de la porosité des filtres employés
(détails dans l’Annexe - tableau 11).
Porosité des filtres (µm) 0,22 0,4 0,45 0,7 1 1,2
Nb de réf. bibliographiques 2 1 14 7 3 2
Fréquence (%) 6,9 3,4 48,3 24,1 10,3 6,9
I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d’intérêt
Une fois les échantillons conditionnés, il faut ensuite en extraire les composés d’intérêt et les
reconcentrer. Dans le cas des échantillonneurs passifs, aucun conditionnement préalable n’est
nécessaire, les composés sont directement prélevés dans la phase dissoute et il ne reste plus
qu’à les extraire de l’outil.
Tableau 35 : Répartition des références bibliographique en fonction de la technique extractive employée

(détails dans l’Annexe - tableau 12).
Nb de références bibliographiques
Technique d’extraction Fréquence (%)
liquide solide
SPE 46 93,9
LLE 2 4
lyophilisation 1 2
USE 1 10
USE + LLE 1 4 10 40
USE + SPE 2 20
MAE + SPE 1 10
ASE 1 4 10 40
ASE + SPE 3 30
vortex + centrifugation 1 10
Pour les autres échantillons obtenus à partir de prélèvement ponctuels ou moyennés, diverses
techniques d’extraction sont possibles suivant si l’échantillon est liquide (phase dissoute) ou
solide (phase solide ou particulaire). Le Tableau 35 ci-dessus a été obtenu à partir des
151
informations détaillées présentées dans l’Annexe - tableau 12. Il présente la répartition des
références bibliographiques entre les différentes techniques extractives en fonction de la
matrice considérée.
Plus de 90 % des molécules contenues dans la phase dissoute sont extraites par extraction en
phase solide ou SPE (Tableau 35). Cette technique moderne présente l’avantage d’être rapide,
économique et automatisable. Elle est fiable et reproductible dans la mesure où le volume
maximal qui peut être reconcentré sans affecter les rendements d'extraction, c’est-à-dire le
volume de fuite, n’est pas dépassé. Richardson (2009) et Seifrtová et al. (2009a) soulignent
également dans leur review l’importance de cette technique et son usage massif. Néanmoins,
quelques protocoles utilisent des techniques alternatives comme l’extraction liquide-liquide
(LLE, Kolpin et al., 2002 ; Hou et al., 2003 ; Martinez-Carballo et al., 2007) ou la
lyophilisation (Hirsh et al., 1998). Ces procédés sont à la fois plus anciens, plus simples à
mettre en œuvre et robustes. Cependant, la LLE est une méthode lente et très consommatrice
de solvant. Les principes, les avantages et les inconvénients de ces 3 techniques sont
expliqués dans le Tableau 36. La micro-extraction en phase solide ou SPME est une autre
technique, entièrement automatique, qui permet d’extraire les composés des matrices
aqueuses (McClure et Wong 2007). Son principe, ses avantages et inconvénients sont
également présentés dans le Tableau 36.
Pour extraire les composés des phases particulaires et solides, plusieurs méthodes sont
possibles : l’extraction assistée par micro-ondes (MAE) pratiquée par Castiglioni et al. (2006)
par exemple ; l’extraction par ultrasons (USE) mis en œuvre par Hu et al. (2010) pour extraire
les antibiotiques du sol et des végétaux ; ou l’extraction par liquide pressurisé (PLE) encore
appelée extraction accélérée par solvant (ASE). Les 2 premières techniques présentent les
avantages d’être rapides et faciles à mettre en œuvre mais l’ASE présente en plus l’avantage
d’être automatisable et de consommer peu de solvant. Les principes, les avantages et les
inconvénients de ces différentes techniques sont expliqués dans le Tableau 36. L’ASE et
l’USE sont les 2 techniques les plus utilisées avec 40 % d’utilisation de chacune d’elles en
considérant tous les usages (simples ou combinés) (Tableau 35). La méthode privilégiée avec
une fréquence d’utilisation de 30% est la combinaison ASE + SPE. Elle utilise l’ASE pour
extraire les composés de la phase solide puis la SPE pour extraire et concentrer les composés
contenus dans l’extrait ASE. D’autres protocoles n’utilisant ni MAE, ni USE, ni ASE sont
aussi proposés. Par exemple, Furusawa (2008) met en pratique une technique d’extraction
pour extraire les antibiotiques des crevettes qui n’utilise aucun solvant organique seulement
une étape de broyage et de centrifugation.
Les conditions et les paramètres des 2 principales techniques d’extraction, SPE pour la phase
dissoute et ASE pour les phases solides, sont étudiés dans les 2 sous paragraphes suivants.
I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE
Les cartouches et le ou les solvants d’extraction sont les 2 principaux paramètres à définir
pour mettre en œuvre une SPE. Le type et le volume de phase contenue dans les cartouches
sont les 2 critères qui permettent de sélectionner la cartouche. L’affinité des composés
d’intérêt avec la phase stationnaire et les interactions qui seront mises en œuvre guident le
choix des cartouches. Ce choix dépend donc des propriétés physico-chimiques des molécules.
Différentes phases ont été relevées dans la littérature et sont présentées dans le Tableau 37. La
152
Tableau 36 : Principe des différentes techniques extractives (T° : température, P° : pression).

matrice acronyme nom (anglais) principe avantage inconvénient
liquide SPE Solid Phase Les composés d’intérêts sont extraits de la  rapide (jusqu’à  volume de fuite,
Extraction matrice aqueuse par adsorption sur une 24 échantillons  étape de
phase solide, spécifiquement choisie pour traités en parallèle), reconcentration
eux, contenue dans une cartouche. Les  économique nécessaire
autres éléments ne sont pas retenus sur la (consommation
phase adsorbante ou alors en sont décrochés faible de solvant),
lors d’une étape de rinçage. Les composés  automatisable
d’intérêt sont ensuite élués et récupérés
dans un faible volume de solvant.
SPME Solid Phase Les composés d’intérêts sont extraits de la  automatique,  LOD plutôt élevées
Micro-Extraction matrice aqueuse par adsorption sur une fibre  économique,
recouverte d’une phase adsorbante  volume
spécifiquement choisie pour eux. La fibre d’échantillon
est directement plongée dans l’échantillon. nécessaire réduit,
Les composés sont désorbés dans l’injecteur  réduction des
d’un GC sous l’effet de la température ou effets matriciels,
d’un LC sous l’effet d’un solvant.  pas d’étape de
reconcentration
LLE Liquid-Liquid L’échantillon et un solvant organique sont  facile à mettre en  très consommatrice
Extraction mélangés dans une ampoule à décanter. Par œuvre, de solvant,
affinité pour le solvant organique, les  robuste  lente (un échantillon
composés d’intérêt vont migrer de l’eau traité à la fois),
vers le solvant. En laissant décanter, le  étape de
solvant organique contenant les analytes est reconcentration
ensuite récupéré indépendamment de l’eau. nécessaire
solide MAE Microwave L’échantillon est immergé dans un solvant  facile à mettre en  le solvant
Assisted qui absorbe les micro-ondes. La durée et la œuvre, d’extraction doit être
Extraction puissance des micro-ondes vont permettre  rapide (plusieurs compatible avec
aux composés d’intérêt de passer de échantillons l’usage des micro-
l’échantillon vers le solvant organique. peuvent être traités ondes,
L’extrait organique est récupéré puis purifié en parallèle),  étape de purification
sur des colonnes de silice ou par SPE.  automatisable et reconcentration
souvent nécessaire
USE UltraSonication L’échantillon est immergé dans un solvant.  facile à mettre en  consommatrice de
Extraction Les ultrasons vont faciliter la désorption des œuvre, solvant,
composés et leur permettre de passer de  plusieurs  étape de purification
l’échantillon vers le solvant. L’extrait échantillons et reconcentration
obtenu est récupéré, centrifugé puis le peuvent être traités souvent nécessaire
surnageant est purifié sur des colonnes de en parallèle
silice ou par SPE.
ASE Accelerated L’échantillon est emprisonné dans une  rapide,  étape de
Solvent cellule. Celle-ci se remplit ensuite de  automatique, reconcentration
Extraction solvant. Puis la pression et la température à  faible nécessaire,
l’intérieur de la cellule sont augmentées consommation de  co-extraction
pour permettre l’extraction des composés solvant, d’interférents
d’intérêt. Le solvant est chassé hors de la  intégration
cellule par un flux d’azote et est collecté possible de l’étape
dans un flacon. Le cycle d’extraction de purification
(solvant, T°, P°) peut être répété plusieurs
fois. Les extraits sont collectés dans un
même flacon. La purification de l’extrait
peut être réalisée en même temps que
l’extraction si un adsorbant est placé dans la
cellule avant d’introduire l’échantillon.
Sinon l’extrait est purifié par SPE.
153
phase la plus utilisée, avec une fréquence d’apparition dans la littérature étudiée de 42,3 %,
est la phase Oasis HLB. Seifrtova et al. (2009) met aussi en évidence une forte utilisation de
cette phase dans sa review sur les méthodologiques analytiques dédiées au dosage des
antibiotiques dans l’environnement. Cette phase « Hydrophile Lipophile Balance » est
constituée de groupements N-vinyl-pyrolidone qui interagissent avec les groupements
hydrophiles des molécules et de groupements divinyl-benzène qui interagissent avec les
groupements hydrophobes des molécules. Ainsi ce type de phase permet de retenir un large
spectre de molécules aux propriétés physico-chimiques variées. Elle est donc très utilisée, en
particulier pour les analyses multi-résidus où les propriétés physico-chimiques des composés
sont très différentes (Seifrtova et al., 2009). D’autres phases polymériques comme les phases
Isolute ENV+ ou Strata X permettent également de retenir des composés aux propriétés
physico-chimiques diverses. De plus, les phases polymériques supportent une large gamme de
pH ce qui les rend plus adaptées que d’autres types de phase pour les analyses
environnementales. Les phases Oasis MCX (« Mixed Cation eXchange ») sont aussi
fréquemment employées (7,7 % des cas seules et 5,8% des cas en association avec des Oasis
HLB). Ces phases, également polymériques, mettent en jeu des interactions ioniques et
retiennent les cations. A l’inverse les phases SAX (« Strong Anion eXchange ») retiennent les
anions.
Le choix de la taille des cartouches et donc du volume de phase qu’elles contiennent dépend
de l’échantillon à extraire. Plus l’échantillon sera potentiellement contaminé ou chargé en
matière organique et plus il faudra une masse de phase importante pour être en mesure de
retenir tous les composés d’intérêt. La matière organique peut interagir avec les sites
d’accrochage de la phase adsorbante et ainsi réduire le nombre de sites libres disponibles pour
retenir les composés ciblés. Par ailleurs, un des inconvénients de la SPE réside dans les
problèmes de colmatage des cartouches ; les cartouches se colmatent d’autant plus vite
qu’elles contiennent peu de phase ou que l’échantillon qui percole est très riche en matière
organique.
Une fois la phase adsorbante sélectionnée, le solvant d’élution est le deuxième paramètre à
définir lors d’une extraction par SPE. Le choix du solvant est basé sur l’affinité des molécules
Une fois la phase adsorbante sélectionnée, le solvant d’élution est le deuxième paramètre à
définir lors d’une extraction par SPE. Le choix du solvant est basé sur l’affinité des molécules
ciblées pour celui-ci. Dans l’idéal, le solvant doit permettre d’éluer les composés d’intérêt
sans pour autant décrocher les interférents contenus dans la matrice et qui ont été retenus sur
la cartouche. Pour les molécules pharmaceutiques, 5 solvants sont utilisés : le méthanol,
l’acétonitrile, l’acétone, le dichlorométhane et l’acétate d’éthyle. En raison de sa polarité et de
son groupement hydroxyle, le méthanol est celui qui est le plus couramment employé
(Annexe - tableau 12 et Seifrtova et al., 2009). Il peut être utilisé seul, en mélange avec
d’autres solvants ou supplémenté avec des acides (exemple : acide trifluoroacétique, acide
formique, acide phosphorique, acide oxalique), des bases (exemple : hydroxyde
d’ammonium) ou des sels (exemple : acétate d’ammonium). En ajoutant de l’acide ou une
base au solvant d’élution, la forme sous laquelle se trouvent les molécules retenues dans la
cartouche est modifiée (protonée ou non) au contact du solvant. La modification de la forme
des molécules permet de les décrocher de la phase et/ou de les éluer de façon plus spécifique
par rapport aux interférents. Les sels peuvent créer des interactions avec les molécules
retenues dans la phase et ainsi favoriser leur élution sans quoi, leur affinité pour la phase
serait plus grande que celle pour le solvant d’élution et elles ne seraient pas entrainées.
154
Tableau 37 : Répartition des références bibliographiques utilisant l’extraction par SPE entre les
différentes sortes de cartouches (détails dans l’Annexe - tableau 12).
phase des cartouches SPE Nb de références bibliographiques Fréquence (%)
Oasis HLB 22 42,3
Oasis MCX 4 7,7
Isolute ENV+ 4 7,7
Oasis HLB + MCX 3 5,8
Lichrolut EN 3 5,8
Isolute C2/ENV+ 3 5,8
Isolute C18 2 3,8
C18 2 3,8
MPC 2 3,8
Strata X 1 1,9
Baker SDB 1 1 1,9
SAX + Oasis HLB 1 1,9
Lichrolut EN + C18 1 1,9
Chromabond HR-P 1 1,9
PPL Bond-Elut 1 1,9
C8 1 1,9
I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE
L’ASE présente l’avantage d’être une technique rapide et automatique. Trois paramètres
majeurs conditionnent la réussite de ce type d’extraction : la température, la pression et
surtout le solvant d’extraction.
Dans une synthèse bibliographique récente, Nieto et al. (2010c) recensent les valeurs de ces
différents paramètres dans 11 publications. D’après leur étude, le méthanol, l’acétone et
l’acétonitrile, seul ou en mélange avec l’eau, sont les solvants les plus utilisés en raison de
leur polarité et de l’affinité des molécules pharmaceutiques pour ces solvants. Ce constat est
en accord avec nos propres relevés bibliographiques présentés dans l’Annexe - tableau 12.
L’utilisation d’eau comme solvant d’extraction nécessite de faire attention à la valeur du pH
en particulier, afin de s’assurer de la reproductibilité de l’extraction. La valeur à laquelle le
pH de l’eau est stabilisé pour rendre l’extraction optimum dépend des propriétés physico-
chimiques des molécules sélectionnées. D’après Nieto et al. (2010c), le mélange
eau/méthanol est le solvant d’extraction le plus souvent employé.
L’augmentation de la température permet de diminuer la viscosité des solvants et donc

d’augmenter leur pénétration dans la matrice mais une température trop élevée dégrade les
composés. Un compromis entre ces deux éléments permet de choisir la meilleure température
d’extraction. A l’exception de Jacobsen et al. (2004) qui pratiquent leur extraction à une
température de 20°C, la plupart des extractions sont réalisées entre 80° et 100°C (Schlüsener
et al., 2003 ; Göbel et al., 2005 ; Jelic et al., 2009 ; Wu et al., 2009 ; Nieto et al., 2010c).
Le choix de la pression est lié à la température et au solvant d’extraction utilisé puisqu’il ne

faut pas que le solvant passe à l’état de vapeur. Les produits pharmaceutiques sont
généralement extraits à une pression de 100 bars (Nieto et al., 2010c).
D’autres paramètres comme le temps de contact (« static »), c'est-à-dire la durée pendant
laquelle le solvant est au contact de l’échantillon, et le nombre de cycle, c'est-à-dire le nombre
fois où le solvant est ajouté puis purgé, peuvent influencer la réussite de l’extraction par ASE
mais ces paramètres sont matrice- et composé-dépendants. Leur détermination résulte d’un
155
compromis entre un temps de contact suffisamment long pour permettre au solvant de bien
pénétrer dans la matrice et un renouvellement régulier du solvant pour favoriser le passage
des composés de la matrice vers le solvant. Un temps de contact trop long provoquerait la
dégradation des composés et un nombre de cycle trop important conduirait à avoir des extraits
volumineux qui prendraient plus de temps à reconcentrer. Dans leur revue bibliographique,
Nieto et al. (2010c) conseillent de réduire la durée de contact mais de multiplier le nombre de
cycles.
Les extraits issus de l’extraction par ASE sont ensuite purifiés principalement par SPE. Pour
que les composés soient retenus sur la phase adsorbante, il faut qu’ils soient contenus dans
une phase aqueuse qui est percolée au travers des cartouches. Or les extraits ASE sont
majoritairement dans des solvants organiques. Les composés qu’ils contiennent seraient
entrainés par le solvant organique au fur et à mesure de leur dépôt sur la cartouche si les
extraits étaient percolés directement sur la cartouche. Une étape intermédiaire visant à
éliminer le solvant organique ou à en réduire sa proportion et à le diluer dans de l’eau est alors
nécessaire pour optimiser les rendements d’extraction (Nieto et al., 2010c). Pour cela, une
partie du solvant organique est évaporé soit sous flux d’azote (Díaz-Cruz et al., 2006) soit à
l’aide d’un évaporateur rotatif (Schlüsener et al., 2003). Le volume résiduel est ensuite dilué
dans de l’eau de façon à ce que sa proportion soit négligeable et que les composés ne soient
pas élués au fur et à mesure de leur dépôt. D’auteurs auteurs préfèrent diluer directement leurs
extraits ASE dans de l’eau sans évaporer une partie du solvant organique (Jacobsen et al.,
2004 ; Jelic et al., 2009).
I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs
Les échantillonneurs passifs présentent l’avantage d’extraire les composés ciblés directement
dans le milieu. Une fois retirés du milieu, il ne reste plus qu’à éluer les composés. Dans le cas
des molécules pharmaceutiques, l’échantillonneur passif le plus utilisé est le POCIS (Polar
Organic Chemical Integrative Sampler). La première étape de l’extraction consiste alors à
transférer la phase du POCIS vers un contenant comme par exemple des cartouches vides de
même sorte que celles utilisées pour la SPE. Puis un solvant est percolé sur la phase pour
éluer les composés d’intérêt. Togola et Budzinski (2007b) préconisent le méthanol comme
solvant d’élution de la phase Oasis HLB contenue dans les POCIS. De nombreux auteurs
utilisent aussi couramment ce solvant (MacLeod et al., 2007 ; Zhang et al., 2008 ; Bartelthunt
et al., 2009 ; Li et al., 2010). Le volume de solvant utilisé est le paramètre qui diffère le plus
d’une étude à l’autre. Togola et Budzinski (2007b) éluent leurs composés avec 10 mL de
solvant, MacLeod et al. (2007) avec 20 mL, Alvarez et al. (2004) avec 2 fois 20 mL et
Bartelthunt et al. (2009) ou Li et al. (2010) avec 50 mL. Les extraits obtenus sont ensuite
traités de la même façon que les extraits SPE.
I.4. Techniques analytiques

Vu le faible niveau de contamination des échantillons environnementaux, les techniques
analytiques utilisées doivent être particulièrement sensibles. Par ailleurs, les échantillons
environnementaux sont des matrices complexes, donc les outils doivent en plus être sélectifs.
Les techniques répondant à ces exigences, sont les couplages chromatographie-spectrométrie
de masse. En fonction des propriétés physico-chimiques des composés, la chromatographie
pourra être en phase gazeuse (GC), pour des composés volatils résistant à la chaleur par
156
exemple, ou en phase liquide (LC) pour des composés hydrophiles par exemple. La
chromatographie est une technique séparative c'est-à-dire qu’elle permet de séparer les
différents éléments d’un mélange. Les composés d’un mélange sont retenus sur la phase
stationnaire (colonne chromatographique) et sont entraînés au fur et mesure par la phase
mobile (gaz en GC, solvant en LC) en fonction de leur affinité pour cette dernière. Durant
l’étape de chromatographie, le mélange est décomposé et les différentes molécules qui le
constituent sont entraînées une à une vers le spectromètre de masse (MS). Les molécules sont
alors ionisées dans la source du spectromètre avant d’être triées en fonction de leur rapport
masse / charge dans l’analyseur et d’être détectées au niveau d’un détecteur. Ce dernier sert à
amplifier le signal, il peut être un multiplicateur d’éléctrons ou un photo-multiplicateur. Les
analyseurs des spectromètres de masse peuvent être montés en série pour optimiser davantage
la sélectivité. Selon le mode d’acquisition, balayage (scan) ou suivi d’un ion/transition (Single
Ion Monitoring (SIM) ou Single Reaction Monitoring (SRM) / Multiple Reaction Monitoring
(MRM)), un spectre de masse ou un signal sélectif sera obtenu. Le spectre de masse sert
généralement à identifier un composé alors que le signal sélectif permet de réaliser des
dosages quantitatifs.
Une quarantaine de références bibliographiques concernant l’analyse des molécules

pharmaceutiques dans diverses matrices environnementales ont été étudiées pour réaliser cette
revue bibliographique. Leur étude a amené à lister 62 protocoles analytiques employant 6
systèmes d’analyse différents : LC/UV (ultraviolet), LC/ FD (fluorescence), LC/MS,
LC/MS/MS (spectromètre de masse en tandem), GC/MS et GC/MS/MS (Annexe - tableau
13). La répartition de ces 62 protocoles entre les différentes techniques mises en œuvre est
présentée dans le Tableau 38. 55 protocoles soit 88,7 % des méthodes étudiées utilisent la
chromatographie en phase liquide et 58 protocoles soit 93,6 % des méthodes étudiées utilisent
la spectrométrie de masse comme moyen de détection. La LC/MS et plus spécialement la
LC/MS/MS en combinant ces 2 techniques sont les systèmes les plus employés. La
LC/MS/MS, technique plus sensible et plus spécifique que la LC/MS, représente 69,4 % des
techniques analytiques mises en œuvre dans les articles scientifiques étudiés. Hirsch et al., et
Ternes et al., en 1998 sont parmi les premiers à utiliser cette technologie. Depuis, les
constructeurs ont encore amélioré les techniques chromatographiques pour aboutir à de
nouvelles génération de chromatographie en phase liquide : UPLC (Ultra Performance Liquid
Chromatography), RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) ou l’UHPLC (Ultra
Haute Pression Liquid Chomatography). Ces techniques emploient des colonnes plus courtes
et de diamètre de particules plus petit de façon à réduire le temps d’analyse, augmenter la
résolution et diminuer les volumes morts ce qui permet aussi de diminuer la consommation de
solvant.
Tableau 38 : Répartition des références bibliographiques entre les différentes systèmes d’analyse ( détails
dans l’Annexe - tableau 13).
Technique analytique LC/UV LC/FD LC/MS LC/MS/MS GC/MS GC/MS/MS
Nb de références bibliographique 1 3 8 43 4 3
Fréquence (%) 1,6 4,8 12,9 69,4 6,5 4,8
Quel que soit le type de chaîne chromatographique liquide considérée, les colonnes
employées sont principalement des colonnes utilisant des phases gréffées C 18 (69 % des
colonnes LC répertoriées dans l’Annexe - tableau 13) souvent précédées d’une pré-colonne de
même type (Andreozzi et al., 2003 ; Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Hernando et al.,
2004). Dans leur revue bibliographique, Hao et al. (2007) et Seifrtová et al. (2009b) mettent
également en évidence l’utilisation de phase C8 ou de phase HILIC (« Hydrophilic Interaction
157
Chromatography »). Les phases C18 et C8 sont des phases inverses donc plutôt apolaires qui
nécessitent l’utilisation de phases mobiles polaires. Les colonnes HILIC sont des phases
normales donc polaires mais qui permettent également l’utilisation de phases mobiles polaires
traditionnellement utilisées avec les phases inverses (Peru et al., 2006).
L’eau, l’acétonitrile et le méthanol représentent les 3 solvants de base fréquemment employés

pour la constitution des phases mobiles (Annexe - tableau 13). Ils peuvent être utilisés seuls
ou en mélange mais des acides (formique, acétique) ou des sels (acétate d’ammonium) y sont
régulièrement ajoutés. L’ajout d’acide modifie le pH des phases mobiles qui influe sur la
forme des molécules selon le pKa de ces dernières (Dolan, 2006). Comme pour la SPE, en
stabilisant les molécules sous une de leur forme, l’ajout d’acide permet de rendre les analyses
plus reproductibles. En plus d’améliorer la séparation chromatographique, l’ajout d’acide, en
favorisant la forme protonée des molécules, permet d’améliorer l’ionisation des composés en
particulier lorsque celle-ci se fait en mode positif. L’acétate d’ammonium sert de tampon ce
qui permet de stabiliser le pH de la phase mobile (Dolan, 2006). Mais l’ajout d’acétate
d’ammonium permet également de détecter certaines molécules en formant des adduits sur
ces molécules. Certains composés forment naturellement des adduits avec des cations comme
le sodium. Ce sont ces adduits qui sont détectés en spectrométrie de masse. Or le quantité de
sodium peut varier d’une eau à une autre ou d’un jour sur l’autre rendant les analyses non
reproductibles. Afin de remédier à ce problème, des ions ammoniums sont ajoutés en quantité
fixe et connue à la phase mobile pour entrer en compétition avec les ions sodium pour se fixer
sur les composés d’intérêt.
Lorsque que la chromatographie en phase liquide est couplée à un spectromètre de masse,

l’ionisation des composés est réalisée à pression atmosphérique principalement par «
éléctrospray » (Annexe - tableau 13) mais elle peut aussi se faire par APCI (Ionisation
Chimique à Pression Atmosphérique) (Catastini et al., 2009).
Certaines analyses se font aussi par GC/MS (chromatographie en phase gazeuse couplée à un
spectromètre de masse) (Hao et al., 2007) bien que cette méthode nécessite souvent une étape
supplémentaire de dérivation (Huggett et al., 2003 ; Steger-Hartmann et al., 1996 ; Ternes et
al., 1998, Togola et Budzinski, 2007a).
Quelque soit la technique séparative choisie (LC ou GC), trois analyseurs sont couramment
employés pour les analyses environnementales : le quadrupôle (Q), le temps de vol (TOF) et
la trappe à ions (IT). Dans les couplages MS/MS, on retrouve souvent deux quadrupôles
montés en séries (QQQ) ou un quadrupôle suivi d’un temps de vol (QTOF). Le TOF est une
technique spectrométrique dite de haute résolution qui permet l’identification de composés.
Les critères retenus pour valider une méthode analytique sont les suivants : précision
(variation de la réponse entre plusieurs injections d’un même échantillon), justesse (accord de
la réponse mesurée avec la réponse théorique attendue), gamme de linéarité (proportionnalité
entre la quantité injectée et la réponse obtenue), limites de détection et de quantification
(quantité ou concentration la plus petite qui puisse être détectée ou quantifiée). Il existe
différentes sortes de limites de détection (LOD) : les limites instrumentales (IDL/IQL) qui
prennent en compte les limites techniques de l'appareil utilisé pour faire les analyses et les
limites méthodologiques (MDL/MQL) qui tiennent compte à la fois des limites instrumentales
mais aussi des limites apportées par le protocole de préparation des échantillons ou par la
matrice (Capdeville et Budzinski, 2011).
158
Les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL) sont définies à partir
de l'injection de solutions de référence. Elles sont exprimées en picogrammes ou
nanogrammes injectés. Elles sont directement liées à la sensibilité et aux performances des
instruments analytiques.
Les limites méthodologiques de détection tiennent compte à la fois de la sensibilité

instrumentale et des impacts du protocole de préparation des échantillons. Elles sont
exprimées en ng/L pour les matrice liquide et en ng/g pour les matrices solides. Une première
façon de les calculer, consiste à extrapoler les IDL en tenant compte du volume de la prise
d'essai et du facteur de reconcentration mais ce calcul suppose qu'il n'y ait pas de biais
méthodologique c'est-à-dire de pertes lors de la préparation des échantillons ni d’effet
matriciel au moment de l’analyse. Une autre possibilité pour les déterminer consiste à
appliquer l'ensemble du protocole (extraction, reconcentration et analyse) à une matrice de
référence assez simple, dépourvue des composés ciblés et contenant le moins de matière
organique possible, enrichie avec de très faibles quantités de composés. Ces MDL sont alors
mesurées en tenant compte de l'ensemble des impacts possibles du protocole tout en ayant
réduit au minimum les risques d’interférence causés par la matrice au moment de l'extraction
et de l’analyse.
Enfin, les MDL peuvent être mesurées à partir de l'analyse de différents types de matrices
enrichies avec les composés d’intérêt. Dans ce cas, en plus de tenir compte des problèmes
potentiels amenés par l’étape de préparation des échantillons, ceux liés à la nature de
l’échantillon sont pris en considération. Les effets que peut avoir la matrice sur les
rendements d’extraction ou sur la sensibilité analytique sont intégrés dans les calculs. Ce sont
les MDL les plus complètes.
Dans la plupart des cas, les limites de détection sont de l’ordre du ng/L ou de la dizaine de
ng/L (Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Huschek et al., 2004 ; Sacher et al., 2001) et
celles de quantification sont de l’ordre de la dizaine ou de la centaine de ng/L (Gómez et al.,
2006 ; Gros et al., 2006 ; Huschek et al., 2004 ; Sacher et al., 2001 ; Vieno et al., 2006). La
LC/MS/MS présente donc une bonne sensibilité. Cependant, cette approche, par
chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse, simple ou en tandem,
a deux problèmes majeurs : la présence d’interférents et l’extinction matricielle (Furlong et
al., 2008). Les interférents peuvent modifier la rétention des composés d’intérêts (décalage
des temps de rétention, empêcher les composés d’être retenus sur la colonne, empêcher la
séparation chromatographique de composés proches, déformation des pics
chromatographiques) (Furlong et al., 2008). Lors de l’étape de détection par spectrométrie de
masse, les interférents, qui n’ont pas été séparés des composés recherchés lors de l’étape de
chromatographie, peuvent être ionisés et donner un des ions du composé recherché et
modifier le ratio entre les ions utilisés pour l’identification (Furlong et al., 2008). Lors de
l’étape de détection par spectrométrie de masse, il peut aussi y avoir une compétition entre
l’interférent et les composés d’intérêt pour l’ionisation lorsque celle-ci se fait par électrospray
ce qui amène à de l’extinction ou de l’augmentation de signal. Les interférences matricielles
sont échantillons- et composés-dépendantes (Watkinson et al., 2009).
Les étapes d’extraction et de purification permettent de diminuer ces problèmes

d’interférence. L’analyse en LC/MS/MS réduit encore ce problème par rapport à la LC/MS
car elle est plus sélective. Par ailleurs, pour s’assurer de l’identité d’un composé, quatre
critères d’identification doivent être remplis au minimum : le temps de rétention
chromatographique, deux signaux ioniques (deux ions en MS et deux transitions en MS/MS),
159
et le rapport entre ces 2 signaux. On peut suivre au cours d’une même analyse plusieurs
transitions « ions précurseurs → ions produits » en utilisant le mode MRM (multiple réaction
monitoring). L’identification par au moins 4 points est recommandée par l’Union Européenne
dans la commission de 2002 (European Commission, 2002).
échantillon
centrifugation
liquide
filtration
solide particulaire dissout
lyophilisation
ultra-sons MAE ASE
capteur passif
SPE LLE SPME
élution
reconcentration
dérivation
injection
LC GC
UV fluorescence MS MS/MS
Figure 42 : Les différentes étapes dans le traitement d’un échantillon depuis le prélèvement jusqu’à
l’analyse.
Le deuxième problème de la LC concerne l’extinction matricielle c'est-à-dire le fait de

diminuer le signal de réponse du spectromètre de masse. La suppression du signal peut être
due à plusieurs phénomènes : i) les molécules pharmaceutiques s’adsorbent sur la matière
160
organique provoquant une diminution des composés libres qui sont dosés ; et ii) les
interférents contenus dans la matrice peuvent masquer les pics en augmentant le niveau de la
ligne de base du signal chromatographique (Gomez et al., 2006). Ce problème peut être en
partie résolu par l’ajout d’étalons internes qui se comportent exactement de la même façon
que les composés recherchés mais qui n’existent pas dans le milieu et qui sont rajoutés en
début de traitement de l’échantillon. Une autre façon de résoudre les problèmes d’effet
matriciel est de diluer l’échantillon avant injection. L’inconvénient de la dilution est de perdre
en sensibilité (Petrovic et al., 2005 ; Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Vieno et al.,
2006). Enfin la méthode des ajouts dosés qui consiste à ajouter une quantité connue de
composés dans un duplicat de l’échantillon avant l’analyse est une autre alternative pour
contourner les problèmes d’effets matriciels.
Pour conclure sur cette partie analytique, la Figure 42 reprend la chronologie de l’ensemble
des étapes du traitement d’un échantillon, depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse. Par
ailleurs, certains organismes de référence publient des guides avec les méthodes qu’ils ont mis
au point. Ainsi l’US EPA a publié en décembre 2007 une méthode pour l’analyse des
molécules pharmaceutiques et des produits de soin corporel dans l’eau, le sol et les sédiments.
Cette méthode décrit les protocoles d’extraction et d’analyse par HPLC/MS/MS (US EPA
2007). L’US GS a également publié une méthode qui décrit les protocoles d’extraction par
SPE et d’analyse par HPLC/MS des molécules pharmaceutiques dans les eaux filtrées
(Furlong et al., 2008).
II. Projets et sites d’échantillonnage

Dans cette partie, sont présentés les projets de recherche, les sites d’échantillonnage et les
modalités de prélèvement lié au travail de thèse. Quelques informations générales sur la prise
en charge des échantillons sont indiquées mais les détails relatifs au traitement des
échantillons (nettoyage du matériel, filtration, extraction, re-concentration) sont présentés
dans la partie suivante III. Traitement des échantillons.
II.1. Eaux usées et autres échantillons d’eau
Les premiers échantillons environnementaux analysés ont servi de tests pour vérifier
l’applicabilité d’une nouvelle méthode développée. La première étape dans cette démarche de
vérification consiste à choisir les échantillons tests. Cette sélection s’effectue selon divers
critères :
- les échantillons doivent très probablement contenir au moins quelques une des
molécules recherchées sinon, il ne sera pas possible de définir si l’absence de
détection de composés est liée à un problème méthodologique ou seulement au fait
qu’ils ne sont pas présents.
- les échantillons doivent pouvoir être facilement prélevés.
- la matrice ne doit pas être trop complexe de façon à limiter les problèmes
d’interférence et éviter ainsi, d’une part, de masquer les composés recherchés au
moment de l’analyse et d’autre part, d’empêcher l’extraction des composés (colmatage
des cartouches SPE, compétition pour les sites d’adsorption sur la phase).
Du fait de l’origine des molécules pharmaceutiques dans l’environnement aquatique et des
résultats d’études antérieures, les effluents de station d’épuration sont connus généralement
pour être contaminés par les molécules pharmaceutiques recherchées, notamment les
antibiotiques. Ils sont facilement prélevables car dans la plupart des STEP les rejets sont
161
régulièrement surveillés par les épurateurs ; on peut donc y accéder facilement. De plus, suite
aux traitements appliqués dans les stations, ils sont moins chargés en matière organique que
les eaux usées brutes. De cette façon, ils permettent d’éprouver la méthode sans pour autant
être confronté à la situation la plus complexe. Les effluents de station d’épuration semblaient
donc recommandés dans un premier temps comme échantillons tests pour essayer une
méthode nouvellement développée.
La première méthode testée concernait le dosage de 32 molécules pharmaceutiques (23

antibiotiques, 2 -bloquants, 2 anti-VIH et 5 anticancéreux) appartenant à la première liste de
molécules sélectionnées pour être étudiées. Dix effluents provenant de 9 stations d’épuration
différentes ont été analysés. Les stations d’épuration ont été choisies pour représenter les
différentes sortes de processus de traitement existant en France. Les prélèvements ont été
réalisés dans le cadre du projet AMPERES (Analyse des Micropolluants Prioritaires et
Emergents dans les Rejets et les Eaux de surface). Les caractéristiques des STEP sont
présentées dans le Tableau 39 et les informations relatives au prélèvement et au traitement des
échantillons dans le Tableau 40.
Les prélèvements ont été réalisés à l’aide de préleveurs automatiques équipés de tuyaux en
Teflon®, dans des bouteilles en verre pendant 24 heures de façon à obtenir un échantillon
journalier moyen (proportionnel au débit). Ils ont été transportés et conservés à 4°C avant
d’être filtrés au maximum dans les 48 heures après le prélèvement. Une fois la phase dissoute
et la phase particulaire séparées, ils ont été conservés à -20°C avant extraction par SPE (cf
III.1 Échantillons « eau »). Les analyses par LC/MS/MS ont été réalisées dans la semaine qui
a suivi l’extraction.
Tableau 39: Caractéristiques des stations d'épuration où les échantillons ont été prélevés.
code code capacité origine des débit
type de traitement
échantillon STEP (éq. hab) eaux usées (m3/j)
boue activée aération prolongée (C + N + DN) + filtre à sable + ozone
1 CA PA 1 97 000 urbain 4 200
(10 mg O2/L)
boue activée aération prolongée (C + N + DN) + décantation rapide
2 SE PA 1 300 000 urbain 28 600
(Al2(SO4)3) + filtre à sable
boue activée aération prolongée (C + N + DN) + filtre à sable +
3 SE PA 2 25 000 urbain 1 040
microfiltration + osmose inverse
décantation primaire physico-chimique + filtre biologique immergé
4 CA 5 88 000 urbain 7 150
aéré (C)
prétraitement + filtre planté de roseaux vertical + filtre horizontal
5 et 6 CA 6 100 rural 15
conventionnel (C + N + DN)
7 SE 4 110 000 urbain 14 500 prétraitement + boue activée aération prolongée(C + N + DN)
8 SE 5 24 000 urbain 1 500 prétraitement + bioréacteur à membranes (C + N + DN)
prétraitement + décantation primaire physico-chimique + filtre
9 SE 6 26 000 urbain 3 950
biologique immergé aéré (C + N)
10 SE 9 1 000 rural 135 lit bactérien + filtre planté de roseaux (C + N)
Éq. hab = équivalent habitant, C : élimination du carbone, N : élimination aérobie de l’azote (nitrification), DN :
élimination anoxique de l’azote (dénitrification)
162
Tableau 40 : Informations relatives au prélèvement et au traitement des échantillons.
code date de date de

lieu de prélèvement date SPE date analyse
échantillon prélèvement filtration
1 sortie de STEP 26/03/2008 27/03/2008
2 sortie de STEP 18/05/2008 20/05/2008
3 sortie de STEP 26/05/2008 27/05/2008
4 sortie de STEP 11-12/02/2008 13/02/2008
5 sortie filtre horizontal tertiaire 10-11/03/2008 12/03/2008 18/06/2008 (ESI+)
12/06/2008
6 sortie filtre horizontal conventionnel 10-11/03/2008 13/03/2008 20/06/2008 (ESI-)
7 sortie de STEP 11/09/2007 12/09/2007
8 sortie de STEP 09/10/2007 10/10/2007
9 sortie de STEP 17/10/2007 19/10/2007
10 sortie de STEP 08/04/2008 08/04/2008
Une fois l’applicabilité du protocole vérifiée au travers de l’analyse des effluents de STEP, ce
dernier a pu être appliqué à un spectre plus large d’échantillons. Ainsi des eaux usées
prélevées en entrée et sortie de 4 STEP différentes, mais aussi des eaux de surface, prélevées
en amont et en aval de ces rejets, et des eaux de captage ont été analysées. Les points de
prélèvements sont schématiquement représentés sur la Figure 43. Les prélèvements ponctuels
ont été réalisés en juin et en décembre 2008 (conditions été et hiver). Les échantillons,
contenus dans des flacons en plastique (HDPE), ont été transportés dans des glacières (4°C)
puis filtrés dans les 24 heures suivant le prélèvement (cf III.1 Échantillons « eau »). La phase
dissoute a été congelée à -20°C en attendant d’être analysée. Les caractéristiques des stations
d’épuration sont présentées dans le Tableau 41.
En raison des difficultés rencontrées pour analyser de façon satisfaisante l’amoxicilline et

l’ampicilline (rendement d’extraction très faible < 10 %), un protocole spécifique à leur
dosage a été développé au cours de ces travaux de thèse. Dans le but de vérifier son
applicabilité, il a été testé sur des échantillons prélevés en entrée et en sortie de la station
d’épuration bordelaise Louis Fargues. Cette station a une capacité de 370 000 équivalents
habitants et possède un prétraitement, un traitement primaire par décantation et un traitement
secondaire par boue activée à aération prolongée. Les échantillons ont été collectés le 4 et le 6
août 2010. Ils ont été reconstitués à partir de prélèvements automatiques d’eau asservis au
débit et collectés toutes les heures pendant 24 heures de façon à obtenir un échantillon
journalier moyen. Ils ont été filtrés puis congelés le jour du prélèvement (cf III.1 Échantillons
« eau »).
Tableau 41 : Caractéristiques des quatre stations d'épuration étudiées.

initiale capacité débit* (m3/j)
origine des eaux usées type de traitement
STEP (éq. hab) entrée - sortie
activité domestique, hospitalière et rurale
CL 22 2000 1903,6 - 1960,7 TP, BA, AP, DN / N
(cave coopérative de vinification)
L 13 300 2646,5 - 2638,5 activité domestique et hospitalière TP, BA, AP, DN / N
P 1 500 316,3 - 343,7 activité domestique TP, BA, AP
B 1 300 260 - 260 activité domestique filtres plantés roseaux, UV
débit* : débits moyens annuels
TP : traitement physique, BA : boues activées, AP : aération prolongée, DN / N: dénitrification / nitrification
163
France
Montpellier
Lergue L1
L
Hérault
H1
CL B1
STEP
B
eau de surface L2
eau captage P1
P
H2
Figure 43: Cartographie des points de prélèvement (STEP, eau de surface, eau de captage).
II.2. FLASH
Le projet FLASH (programme Seine Aval 4) vise à observer la relation entre la

consommation de médicaments (en particulier les antibiotiques), les quantités de principes
actifs dosés dans les échantillons d’eaux usées afférentes et la présence de bactéries
résistantes aux antibiotiques dans ces mêmes échantillons d’eau. Les analyses chimiques ont
été réalisées en appliquant le protocole développé pour permettre le dosage de la liste étendue
à 78 composés pharmaceutiques (32 molécules de la première liste + 46 nouvelles molécules
sélectionnées cf. chp 2 « Sélection des molécules »). Pour étudier à la fois les origines
humaines et vétérinaires de la contamination des eaux par les molécules pharmaceutiques,
deux continuums ont été suivis. Ils sont décrits dans les deux paragraphes suivants.
II.2.1. Continuum hospitalier
Le continuum hospitalier comprend un centre de soin situé en Haute Normandie (Eure) qui
regroupe un hôpital de 87 lits, ne possédant pas de service d’oncologie, et une maison de
retraite de 180 lits. Les eaux usées de ces 2 bâtiments viennent se déverser dans le réseau
collectif d’assainissement en amont d’une station d’épuration d’une capacité de 15 000
164
équivalents habitants. Les traitements appliqués dans la STEP sont les suivants : prétraitement
(dégrillage, dessablage), traitement biologique (bassin aération séquencée et boue activée),
traitement UV. Les débits dans la STEP sont de 2 100 m3/j en période sèche et de 4 500 m3/j
en période humide. Les eaux traitées sont ensuite rejetées dans un petit cours d’eau (noté
rivière). Le continuum hospitalier et les points de prélèvement sont représentés sur la Figure
44.
Estuaire
de la Seine
France
Effluent hospitalier
Effluent maison de retraite STEP
Effluent urbain : prélèvement
Figure 44 : Représentation schématique du continuum hospitalier et des points de prélèvement.
Une première campagne de prélèvement a eu lieu le 30 juin 2009 (condition été, période
épidémiologique de faible ampleur). Au cours de cette campagne, les effluents de l’hôpital et
de la maison de retraite ont été prélevés manuellement de façon ponctuelle dans des flacons
Nalgene en polyéthylène haute densité (HDPE). La station d’épuration est équipée d’un
échantillonneur automatique asservi au débit en entrée et en sortie. Un bidon de récupération
d’un volume de 25 litres est conservé dans un compartiment réfrigéré. Le jour de la mission
ce bidon était rempli à hauteur de 15 litres. Les échantillons ont été récupérés à partir du
contenu de ce bidon. L’eau du cours d’eau a été prélevée manuellement de façon ponctuelle
dans des flacons Nalgene en HDPE.
Une deuxième campagne a eu lieu le 8 décembre 2009 (condition hiver, période

épidémiologique de forte ampleur). Au cours de cette campagne, les effluents du centre de
soin ainsi que le cours d’eau ont été équipés d’un préleveur automatique. Tous les
échantillons sont donc des échantillons moyens, reconstitués à partir de prélèvements
réguliers (1 l par heure) pendant 24 heures ou 21 heures et 16 heures en cas de défaillance du
système de prélèvement. Les échantillons ont été reconstitués dans des bouteilles en verre à
partir de 250 mL de chacun des prélèvements. Les caractéristiques des prélèvements sont
résumées dans le Tableau 42.
165
Tableau 42 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum hospitalier au cours des 2

campagnes.
maison entrée sortie rivière
hôpital
de retraite STEP STEP (5)
rejet
influencé par : 87 lits 180 lits 15 000 éq. hab
STEP
moyenné moyenné
prélèvements juin 2009 (été) ponctuel ponctuel ponctuel
24h 24h
moyenné moyenné moyenné moyenné moyenné
prélèvements décembre 2009 (hiver)
24h 21h 24h 24h 16h
Quelle que soit la campagne, les échantillons ont été ramenés au laboratoire dans les 24
heures qui ont suivi le prélèvement et ont été filtrés dans les 24 heures suivantes. Les
échantillons de la campagne estivale ont été extraits et analysés les jours suivants (pas de
congélation). Pour les échantillons de la campagne hivernale, une fois la phase dissoute et
particulaire séparées, ils ont été conservés au congélateur à -20°C et ont été extraits et
analysés le mois suivant (7 janvier 2010).
II.2.2. Continuum agricole
Le continuum agricole, situé dans le département de l’Eure, comprend 4 sites

d’échantillonnage qui sont représentés sur la Figure 45. Le premier site (1) est situé en amont
et correspond, à priori, à un point de référence car il n’est pas impacté par des activités
urbaines ou agricoles (zone forestière, absence de pâturages et de cultures). Le deuxième site
(2) est impacté par les eaux de ruissellements d’une parcelle agricole servant de pâturage pour
450 bovins (usages d’antibiotiques et de vermifuges). Le troisième site (3) est impacté par le
bassin versant agricole situé en amont. Enfin, le quatrième site (4) est situé à la confluence de
deux ruisseaux pour quantifier les apports du premier au second.
Comme pour le continuum hospitalier, une campagne hivernale (24/11/09) et une autre
estivale (08/06/10) ont été menées. Dans les deux cas, des préleveurs automatiques ont été
posés sur chacun des sites de prélèvement de façon à obtenir des échantillons moyens sur 24
heures. En novembre, 1 litre a été prélevé toutes les heures et les échantillons moyens ont été
constitués en mélangeant 250 mL de chaque prélèvement (6 litres moyennés). En juin, 300
mL ont été prélevés par heure et les échantillons moyens ont été constitués en mélangeant 210
mL de chaque prélèvement (5 litres moyennés). Par malchance, les préleveurs ont
dysfonctionné au niveau des points 3 et 4 lors de la campagne du mois de novembre. Pour le
point numéro 3, 2 litres ont été prélevés automatiquement le 23/11/09 et 1 litre a été prélevé
manuellement le 24/11/09. Les 3 litres ont ensuite été mélangés de façon à créer un
échantillon moyen. Pour le point 4, 11 litres ont été prélevés automatiquement et ont été
mélangés pour créer un échantillon moyen. Les caractéristiques des prélèvements sont
résumées dans le Tableau 43.
Tableau 43 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum agricole au cours des 2 campagnes.
site 1 site 2 site 3 site 4
agricole cours d’eau
environnement forêt pâturage
divers 1, 2 et 3
moyenné moyenné moyenne moyenné
prélèvements novembre 2009
24h 24h sur 3 L 11h
moyenné moyenné moyenné moyenné
prélèvements juin 2010
24h 24h 24h 24h
166
Estuaire
de la Seine
France
Figure 45 : Représentation du continuum agricole et des sites de prélèvement (le point 5 correspond à
l’eau de surface échantillonnée dans le continuum hospitalier).
Les échantillons de la campagne hivernale sont arrivés au laboratoire le jour même de leur
collecte et ont été filtrés le lendemain. Les échantillons de la campagne estivale ont été
prélevés le 8 juin et sont arrivées au laboratoire le 11 juin (conservés réfrigérer à 4°C pendant
le transport). Ils ont été filtrés immédiatement. Les phases dissoutes, comme les phases
particulaires, ont ensuite été conservées au congélateur à -20°C. Dans les deux cas, les phases
dissoutes ont été extraites et analysées dans le mois suivant.
II.3. DIPERPHA
L’ANR DIPERPHA avait pour objectif principal l’étude du devenir des perturbateurs
endocriniens (hormones) et des molécules pharmaceutiques (antibiotiques) dans les déchets
d’élevage. Pour atteindre cet objectif et étudier l’origine vétérinaire quant à la présence des
antibiotiques dans le milieu naturel, des effluents d’élevage ont été analysés. Cinq élevages
porcins ont été choisis pour cette étude. La filière porcine a été préférée aux filières bovines
ou avicoles car : i) c’est la première source de viande, ii) la France est le troisième producteur
européen, iii) les lisiers représentent 30 % à 40 % des déchets d’élevage, iv) 28 millions de
tonnes de lisiers sont épandus sur les sols agricoles français chaque année, et surtout v) plus
167
de 50 % des antibiotiques à usage vétérinaire sont administrés aux cochons. Les élevages
sélectionnés sont de type naisseurs-engraisseurs c’est-à-dire que tous les stades
physiologiques sont présents sur chacun des sites. Les cochons sont répartis par bâtiment en
fonction de leur stade physiologique. Un bâtiment abrite les truies gestantes ou venant de
mettre bas (maternité, MATER), un autre les porcelets juste sevrés (post-sevrage, PS) et un
troisième les porcs ou truies à l’engraissement (engraissement, ENG). Les animaux sont
disposés sur caillebotis de façon à ne pas être en contact avec le sol et leurs déjections. Les
bâtiments sont nettoyés toutes les trois à quatre semaines.
truies porcelets porcs

gestantes post-sevrage engraissement
lisier brut lisier brut lisier brut

(LB MATER) (LB PS) (LB ENG)
lisier stocké (LS)
épandage
point de prélèvement
Figure 46 : Filière simple de traitement du lisier dans un élevage de type naisseur-engraisseur.
Trois des cinq élevages ont des systèmes simples de traitement du lisier c'est-à-dire que le
lisier est collecté dans une grande fosse avant d’être épandu comme engrais sur les sols
agricoles (Figure 46). La fosse est généralement vidée deux fois par an, à l’automne et au
printemps. Ces trois élevages ont été choisis car leurs fosses à lisier sont équipées d’un
système permanent de brassage qui permet, lorsqu’il est activé, d’agiter le lisier et donc
d’homogénéiser les futurs prélèvements. Les caractéristiques de ces trois élevages sont
répertoriées dans le Tableau 44.
Tableau 44 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système de traitement simple du lisier.
élevage 1 élevage 2 élevage 3

localisation (département) Plouguin (29) Plouguin (29) Plouzané (29)
nombre de truies 200 à 400 < 200 < 200
nombre animaux / an 6 000 3 200 5 000
volume fosse stockage (m3) 750 650 1 000
durée du stockage (mois) 4-6 4-6 4-6
Deux études ont été menées dans ces trois élevages (système simple). La première consistait à
savoir si le niveau de contamination du lisier était liée au stade physiologique de l’animal et
donc au bâtiment d’origine du lisier. Pour cela, du lisier brut (LB) a été prélevé directement à
la sortie de chacun des trois bâtiments d’élevage (maternité, post-sevrage et engraissement)
ainsi que du lisier stocké (LS), prélevé dans la fosse de stockage. Les dates de ces
168
prélèvements sont données dans le Tableau 45. Cependant, le site 2 n’a pas fait l’objet de
campagne d’échantillonnage spécifique à cette étude aussi le lisier brut n’a été prélevé qu’à la
sortie de 2 des 3 bâtiments (MATER et PS). Les lisiers bruts LB ENG et stockés LS ont été
prélevés à la même période mais un an auparavant. La deuxième étude avait pour objectif
d’observer le devenir des antibiotiques dans les fosses de stockage. Pour cela un suivi sur 5
mois consécutifs a été réalisé dans chacun des trois élevages. Les dates de collecte mensuelle
du lisier stocké sont indiquées dans le Tableau 46. Les points de prélèvement de ces 2 études
sont représentés Figure 46.
Tableau 45 : Dates de prélèvement du lisier stocké et des lisiers bruts en fonction du bâtiment d’élevage
d’origine
type de lisier LB ENG LB MATER LB PS LS
élevage 1 19/10/09 27/10/09 27/10/09 19/10/09
élevage 2 30/09/08 12/10/09 12/10/09 30/09/08
élevage 3 18/08/09 11/08/09 11/08/09 18/08/09
Tableau 46 : Dates de prélèvement dans la fosse de stockage du lisier sur les élevages possédant un
système simple de traitement.
date de prélèvement 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09
élevage 1 x x x x x
Les deux élevages restants possèdent des systèmes complexes de traitement du lisier. Ces
systèmes de traitement ressemblent à des mini-stations d’épuration. Initialement, ils ont été
installés pour favoriser l’élimination de l’azote. En effet, dans certaines zones, quand le lisier
contient trop d’azote, il ne peut être utilisé comme engrais pour enrichir les sols agricoles. Les
systèmes de traitement ne sont pas exactement les mêmes sur les deux sites.
lagune
(Lag)
arrosage (été)
lisier brut
liquid
centrifugation
bassin
bassin aération décantation
lisier stocké liquide
(BA) (BE)
(LS) reflux
solide de
séparation boue
compost
(RSS)
épandage
(printemps – automne)
Figure 47 : Filière complexe de traitement du lisier avec séparation par centrifugation du solide et du
liquide en sortie de la fosse de stockage (élevage 4).
169
Sur le premier site (élevage 4) (Figure 47), à la sortie de la fosse de stockage, le lisier est
centrifugé pour séparer le liquide du solide. Le reflux solide de séparation (RSS) est entassé
pour former du compost. Le liquide est dirigé vers un bassin d’aération (BA) où des périodes
d’aération, produites par agitation, sont alternées avec des périodes d’anoxie pour permettre
aux réactions de nitrification / dénitrification de se réaliser. Le lisier est ensuite guidé vers un
bassin de décantation où les boues sont stockées. Elles sont ensuite épandues (boues
épandues, BE). Le surnageant est déversé dans une lagune (Lag) et sert à arroser les cultures
en été.
Le deuxième site (élevage 5) ne possède pas de centrifugeuse (Figure 48), aussi le liquide et
le solide vont tous les deux dans le bassin d’aération en sortie de la fosse de stockage. La suite
du traitement est la même que sur le premier site. Les caractéristiques de ces deux élevages
sont listées dans le Tableau 47.
lagune
(Lag)
arrosage (été)
lisier brut
liquid
bassin
lisier stocké bassin aération décantation
(LS) (BA) (BE)
boue
épandage
(printemps – automne)
Figure 48 : Filière complexe de traitement du lisier sans séparation des phases solide et liquide (site 2).
Tableau 47 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système complexe de traitement du lisier.
élevage 4 élevage 5
localisation (département) Meslin (29) Plestan (22)
nombre de truies 350 230
nombre animaux / an 5 500
volume fosse « stockage » (m3) 300 300
centrifugeuse oui non
volume bassin d’aération (m3) 680 600
volume bassin de décantation (m3) 2 x 1 000 800
volume lagune (m3) 4 000 3 000
170
Un autre objectif du projet DIPERPHA était de savoir si les processus de traitement

permettent d’éliminer les antibiotiques. Pour répondre à cette interrogation, des prélèvements
ont été effectués le long des filières complexes sur chacun des deux élevages 4 et 5. Les
points de prélèvements sont visibles sur la Figure 47 et la Figure 48. Les campagnes
printanières ont eu lieu le 20 avril et le 4 mai 2009 pour les élevages 4 et 5 respectivement et
les campagnes automnales ont eu lieu les 16 novembre et 30 octobre 2009 respectivement
pour les élevages 4 et 5.
Sur l’ensemble des 5 sites étudiés, tous les lisiers sous forme liquide ont été prélevés à l’aide
d’un seau préalablement rincé avec l’échantillon lui-même. Un seul endroit permettait l’accès
au lisier brut à la sortie des bâtiments d’élevage et aux boues stockées dans le bassin de
décantation (BE), ces prélèvements ont donc été effectués plusieurs fois successivement au
même endroit dans le but d’avoir un échantillon le plus représentatif possible du bâtiment ou
du bassin. Les fosses de stockage et les bassins d’aération (BA) ne possédaient également
qu’un seul point d’accès mais la mise en route des systèmes d’agitation, 15 à 60 minutes
avant le prélèvement, permettait de rendre l’échantillon plus homogène et donc plus
représentatif. Des prélèvements ont été réalisés à différents points autour de la lagune. Ils ont
ensuite été mélangés pour tenter de produire un échantillon moyen. Le reflux solide de
séparation a été prélevé à la pelle et transporté dans des sacs en plastique. Plusieurs pelletées
ont été réalisées à divers endroits du tas de compost de façon à obtenir un échantillon moyen
représentatif du tas.
De retour au laboratoire, les échantillons de compost ont été transférés dans des barquettes
rectangulaires en aluminium et conservés au congélateur à -20°C. Les échantillons liquides
ont été centrifugés dans les 24-48h après le prélèvement et filtrés dans les 48-72h après le
prélèvement (cf. III.2 Échantillons « lisiers »). Une fois séparées, les différentes phases ont
été conservées au congélateur à -20°C. L’ensemble des prélèvements ainsi que le
conditionnement des lisiers ont été réalisés par le CEMAGREF de Rennes. Les échantillons
ont ensuite été expédiés dans de la carboglace jusqu’au laboratoire où ils ont été conservés à -
20°C en attendant d’être traités.
Pour compléter ces études « terrain », des expérimentations de dégradation en laboratoire en

conditions contrôlées « mésophiles » (bactéries supportant des températures comprises entre
15° et 45°C) et « thermophiles » (bactéries supportant des températures supérieures à 50°C)
ont été menées. Au cours d’une première expérience, du lisier provenant de la fosse de
stockage d’un des élevages précédemment décrit (Meslin, élevage complexe 1) est conservé
dans une cuve à 4°C de façon à alimenter en semi-continu (toutes le 12 heures) un digesteur.
Dans ce dernier, les conditions sont anaérobies et la température est de 38°C. Sa capacité est
de 120 litres et le temps de séjour moyen est de 26.7 jours. Une homogénéisation est pratiquée
pendant 10 minutes toutes les 3 heures. A la sortie du digesteur, le lisier rejoint un réacteur
dans lequel des réactions de nitrification et dénitrification sont provoquées par l’alternance de
conditions aérobies et anoxiques (aération de 4 à 6 heures par jour). La capacité du réacteur
est de 125 litres et le temps de séjour moyen est de 27.8 jours. L’homogénéisation y est
permanente. Du lisier a été prélevé à l’entrée du digesteur (réacteur lisier brut, RLB), à la
sortie du digesteur (réacteur lisier digéré, RLdig) et à la sortie du réacteur de
nitrification/dénitrification (réacteur lisier sortie, RLsort). L’ensemble des caractéristiques du
montage ainsi que les points de prélèvement sont représentés Figure 49.
Au cours d’une deuxième expérimentation, l’étape intermédiaire anaérobie (digesteur) a été

supprimée. Le réacteur est alimenté directement et en semi-continu (toujours toutes les 12
171
heures) par du lisier conservé à 4°C. Le temps de séjour est de 20,8 jours. La température est
comprise entre 25° et 30°C. Le temps d’aération est de 12h/j (6 heures toutes les 12 heures).
Du lisier a été prélevé en entrée (alimentation) et en sortie (sortie) du réacteur (Figure 50).
Enfin, au cours d’une troisième expérimentation, deux réacteurs fonctionnant en conditions

thermophiles (55°C) anaérobies sont alimentés manuellement et quotidiennement par du lisier
conservé à 4°C. Les 2 réacteurs ont une capacité de 4 L et les temps de séjour sont de 15
jours. Afin d’homogénéiser les contenus, ils sont placés sur des tables d’agitation. De plus,
pour éviter les pertes par évaporation, ils sont surmontés chacun d’un réfrigérant qui permet
de recondenser le biogaz sortant du système. Les 2 réacteurs se différencient par les inocula.
L’inoculum du premier réacteur (R1) provient de boues de STEP alors que celui du deuxième
réacteur (R2) provient de fumier équin. Dans les 2 cas, ils sont adaptés aux conditions
thermophiles. Le lisier a été prélevé en entrée (alim.) et en sortie de chacun des réacteurs (R1
sortie et R2 sortie). L’ensemble des caractéristiques du montage ainsi que les points de
prélèvement sont représentés Figure 51.
Comme pour les échantillons « terrain », les lisiers ont été centrifugés puis filtrés avant que
les différentes phases ne soient congelées séparément (cf. III.2 Échantillons « lisiers »).
réacteur
digesteur
N / DN
cuve de (38°C)
réacteur réacteur anaérobie réacteur
stockage anaérobie
lisier brut lisier digéré aéré 4-6 h/j lisier sortie
(4°C) 120 L
125 L
permet (RLB) temps de séjour : (RLdig) (RLsort)
temps de séjour :
l’alimentation 26,7 j
27,8 j
continue homogénéisation :
homogénéisation :
10 min/3 heures
continue
Figure 49 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la première expérience en réacteur
mésophile.
réacteur
réacteur N / DN
cuve de réacteur
lisier anaérobie
stockage lisier sortie
alimentation aéré 12h/j
(4°C)
125 L
permet (alimentation) (sortie)
temps de séjour :
l’alimentation
20,8 j
continue
homogénéisation :
continue
Figure 50 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la seconde expérience en réacteur mésophile.
172
Réacteur 1
(55°C)
anaérobie réacteur
4L lisier sortie
temps de séjour : (R1 sortie)

15 j
inoculum :
boues de STEP
réacteur
lisier
stockage
alimentation
(4°C)
alimentation (alim.)
manuelle
quotidienne
Réacteur 2
(55°C)
anaérobie réacteur
4L lisier sortie
temps de séjour : (R2 sortie)

15 j
inoculum :
fumier équin
Figure 51 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la troisième expérience en réacteurs

thermophile.
II.4. Capteurs passifs
Les POCIS (Polar Organic Chemical Integrative Sampler) utilisés pour la calibration en
laboratoire ou pour les expositions terrains sont faits au laboratoire. Les différents éléments
sont assemblés au laboratoire. Avant le montage, la phase adsorbante (Oasis HLB) et les
membranes en polyéther sulfone sont nettoyées par 3 lavages successifs avec du méthanol.
Les membranes sont ensuite mises à sécher dans une étuve pendant 2 heures à 50°C. Le
solvant est éliminé de la phase adsorbante lors d’une étape de filtration sous vide puis la phase
adsorbante est mise à sécher à température ambiante pendant une nuit. Les anneaux, vis et
écrous sont lavés manuellement avec du détergent (RBS) puis sont passés au lave-vaisselle.
Deux cent milligrammes de phase adsorbante sont ensuite pesés puis emprisonnés entre 2
membranes maintenues par deux anneaux en acier. Chaque POCIS est ensuite
individuellement identifié, emballé dans de l’aluminium et conservé au congélateur avant
d’être utilisé dans les jours suivants.
II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire
Préalablement à l’expérience de calibration des POCIS en aquarium, un essai sans POCIS a

été réalisé dans des conditions similaires afin de s’assurer que la concentration des composés
dans l’eau pouvait être maintenue constante. Cette manipulation permet de vérifier qu’il n’y a
pas de perte (adsorption sur les parois par exemple) ou de gains (pollution par le matériel
utilisé par exemple) des composés durant toute la durée de l’exposition. Elle a été réalisée sur
une sélection réduite de 12 molécules choisies d’après le coût des composés (prix des
cristaux), leur toxicité et la facilité d’analyse. Pour ces raisons, ce ne sont pas forcément les
mêmes molécules que celles utilisées dans l’expérience de calibration qui ont été retenues
mais des molécules ayant des comportements similaires car appartenant à la même famille
173
(exemple : lincomycine/clindamycine, roxithromycine/clarithromycine et acide oxolinique

/acide pipémidique). Cette expérience ainsi que celle de calibration des POCIS se sont
déroulées dans les mêmes conditions. Elles ont utilisé un aquarium de 27 L (dimensions : 30 x
30 x 30 cm) dont l’eau a été renouvelée en continu par un apport d’eau du robinet (débit 13,5
L/j) et de solution méthanolique de contamination (débit 200 mL/j) et un débordement
constant. Le système a été maintenu sous agitation par une pale métallique (80 rpm) (Figure
52). L’eau contaminée a été évacuée vers un autre aquarium où elle a été nettoyée par passage
sur charbon actif pendant au minimum une semaine avant d’être rejetée à l’évier. La bouteille
contenant la solution de contamination a été remplacée quotidiennement par une nouvelle.
Les solutions de contamination, conservées au congélateur, ont été issues de la dilution d’une
solution mère fortement concentrée (environ 135 µg/L) ayant servi au dopage initial de
l’aquarium. Le dopage initial a consisté à verser directement 95,2 mL de la solution mère
dans l’aquarium. Le volume a été défini d’après le débit mesuré des pompes péristaltiques
(eau et MeOH) et la valeur de la concentration finale désirée. La solution mère a été réalisée à
partir de la pesée de cristaux de composés purs dilués dans 1 litre de méthanol. Le niveau de
contamination visé était compris entre 500 et 1000 ng/L d’eau suivant les composés. Pour
suivre la contamination de l’eau de l’aquarium et vérifier la stabilité de sa concentration dans
l’expérience préliminaire, 200 mL d’eau ont été prélevés dans des flacons Nalgene (HDPE)
6h après le dopage initial, puis tous les jours les 4 premiers jours de l’expérience et enfin tous
les 2 jours jusqu’à la fin de l’expérimentation. Pour l’expérience de calibration des POCIS,
afin de s’assurer la stabilité du montage (débit stable des pompes péristaltiques, homogénéité
de la contamination), le dopage initial a été réalisé trois jours avant l’exposition des POCIS
puis le système de flux continu a été équilibré pendant 3 jours en renouvelant
quotidiennement l’eau et la solution de contamination. Comme pour la manipulation
préliminaire, le suivi de la concentration de l’eau de l’aquarium a été assuré par un
prélèvement de 200 mL d’eau, dans des bouteilles Nalgene (HDPE), tous les jours les 4
premiers jours où sont exposés les POCIS puis tous les 2 jours jusqu’à la fin de
l’expérimentation. Les 12 POCIS exposés ont été retirés progressivement de l’aquarium : 3
ont été retirés après 5 et 15 jours d’exposition, 2 après 10 et un après 7, 8, 12 et 13 jours
(Figure 53). A l’exception des trois derniers POCIS, prélevés à T15, qui ont été démontés
aussitôt après avoir été sortis de l’aquarium, les POCIS sont conservés à -20°C une fois retirés
de l’eau. Ils ont été ensuite tous démontés dans les 15 jours suivants.
Figure 52: Photos du montage ayant servi aux expériences de calibration des POCIS.
174
number
nombre of
de POCIS
POCIS collected 3 2 3
collectés
jours
days
Figure 53: Prélèvement des POCIS au cours de l’expérience de calibration réalisée en laboratoire.
II.4.2. Application dans la Garonne
Une fois les POCIS calibrés en laboratoire, ces outils ont été déployés pendant 15 jours dans
la Garonne en amont et en aval de l’agglomération Bordelaise (Figure 54).
Trois POCIS ont été posés au niveau de la ville de Cadaujac (amont) et trois autres au niveau
du port autonome de Bordeaux (aval) en juin 2010. Entre les deux points d’échantillonnage,
deux stations d’épuration, Clos de Hilde d’une capacité de 150 000 et Louis Fargues d’une
capacité de 370 000 équivalents habitants, rejettent leurs eaux traitées dans la Garonne. En
parallèle des échantillonneurs passifs, des prélèvements ponctuels d’eau ont été réalisés au
moment du dépôt et du retrait des POCIS dans le but de comparer les résultats obtenus par les
deux méthodes. Les POCIS sont montés sur des supports métalliques et sont enfermés dans
une cage en acier afin de les protéger et d’éviter que les membranes ne se percent. Les cages
sont attachées à un point fixe (pilier de ponton, échelle) et immergées à environ 1 m de la
surface. Les eaux des prélèvements ponctuels sont collectées aux mêmes endroits que là où
les cages ont été fixées et à la même profondeur. Les eaux sont filtrées le jour de leur
prélèvement puis sont conservées à -20°C en attendant d’être analysées. La phase des POCIS
est transférée dans les cartouches en verre le jour où les POCIS sont récupérés. Elle est séchée
sous vide puis conservée à -20°C en attendant d’en extraire les composés trois jours plus tard.
FRANCE
Bordeaux rejet de
STEP
points de
prélèvement
Figure 54: Localisation des points de prélèvement.
II.5. Récapitulatif des projets
La Figure 55 synthétise l’ensemble des programmes présentés précédemment. Elle permet de

visualiser l’ensemble des matrices étudiées dans le cadre de ce travail et le nombre de
molécules recherchées dans chaque cas.
175
matrices
lisier DIPERPHA
eau souterraine continuum Hérault
eau surface POCIS
sortie STEP a AMPERES

m
o
entrée STEP x
rejets
hospitaliers FLASH
2 7 22 32 78
nb molécules analysées
Figure 55 : Schéma récapitulatif de l'ensemble des études réalisées au cours de ces travaux de thèse.
Le projet FLASH est celui qui couvre le plus grand nombre de composés analysés. Lui et le
« continuum Hérault » ont permi d’étudier 5 sortes différentes de matrices aqueuses. Ainsi à
l’exception des eaux souterraines et des eaux de boisson, l’ensemble des matrices aqueuses
qu’il est possible d’étudier a été analysé pour un panel réduit mais représentatif de l’ensemble
des classes thérapeutiques suivies. Bien que le nombre de molécules recherchées soit
moindre, l’ANR DIPERPHA a permis d’étudier le volet vétérinaire de la contamination de
l’environnement. Même si cela n’est pas clairement mis en évidence sur la Figure 55, une
démarche de continuum (le long des filières de traitement complexe) a également été
appliquée dans ce cadre là.
III. Traitement des échantillons

III.1. Échantillons « eau »
Tous les échantillons d’eau traités au laboratoire subissent le même protocole général :
filtration sur filtres en fibre de verre préalablement calcinés à 450° C, extraction de la phase
dissoute par SPE, évaporation sous flux d’azote et analyse par LC/MS/MS. La filtration
permet d’enlever les matières en suspension et ainsi de séparer la phase particulaire de la
phase dissoute. La SPE permet d’extraire sélectivement les composés ciblés de l’échantillon.
L’évaporation permet de concentrer les extraits et ainsi de favoriser la détection des
composés. Les phases d’extraction et d’évaporation des échantillons ont fait l’objet de
développements spécifiques qui sont détaillés dans la publication :
Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers,
antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid chromatography
tandem mass spectrometry analysis – application to sewage treatment plant effluents.
Capdeville M.J., Pardon P., Coquery M., Martin S., Choubert J.M. and Budzinski H.
(publication 2).
176
L’ensemble de la verrerie utilisée pour les étapes de filtration, d’extraction et d’analyse a été
préalablement nettoyé au lave vaisselle avec des détergents adaptés (RBS) puis calciné à
450°C pendant 5 h.
¤ Filtration :
Pour les échantillons peu chargés en matière en suspension, comme les eaux de surface du
continuum agricole du projet FLASH ou les eaux de captage, les eaux sont filtrées
directement sur des filtres en fibre de verre d’une porosité de 0,7 µm (GF/F). Pour les autres
échantillons, les eaux subissent une double filtration. Elles sont filtrées une première fois sur
des filtres en fibre de verre d’une porosité de 1,6 µm (GF/A) puis le filtrat obtenu est filtré
une seconde fois sur des filtres en fibre de verre d’une porosité de 0,7 µm (GF/F). La
première filtration sur GF/A permet d’éviter le colmatage trop rapide des filtres GF/F et ainsi
de réduire leur fréquence de changement. La gestion en parallèle de plusieurs échantillons
devient alors plus facile et la consommation de filtres, et donc le coût de la filtration, sont
réduits.
¤ Extraction :
Le volume précis d’échantillon à extraire est mesuré soit à l’éprouvette soit par gravimétrie.
Les prises d’essais sont indiquées dans le Tableau 48. Dans le cas des méthodes multi-résidus
(32 et 78 composés), l’extraction par SPE est pratiquée sur des cartouches Oasis HLB (200
mg, 6 mL). Avant l’extraction, le pH des échantillons est ajusté à 7  0,1 à l’aide d’acide
chlorhydrique (0,33 M) ou de soude (1 M). Puis 4,16 ; 8,32 et 12,48 mL d’une solution de
Na2-EDTA (sel de disodium acide éthylènediaminetétraacétique) à 250 mM sont ajoutés
respectivement dans des échantillons de 100, 200 et 300 mL pour atteindre une concentration
finale à 10 mM/échantillon. La solution d’EDTA est préalablement préparée par dissolution
de cristaux d’EDTA dans de l’eau ultra-pure (eau milliQ). L’EDTA est un chélateur, il
empêche les tétracyclines de se fixer sur les groupements silanols des parois des contenants en
verre et de former des complexes avec les cations divalents comme le calcium ou le
magnésium. L’ajout d’EDTA provoque une baisse du pH. Ce dernier se retrouve alors
compris entre 4 et 5. Il est mesuré mais non remodifié. Les étalons internes sont ensuite
ajoutés à chacun des échantillons. Les cartouches sont conditionnées en laissant percoler par
gravité 5 mL d’acétonitrile (ACN) puis 5 mL d’eau minérale naturelle (EMN, Vittel) dont le
pH a été ajusté à 7  0,1 de la même façon que pour les échantillons. Les échantillons passent
ensuite à travers la phase adsorbante contenue dans la cartouche sous un léger vide. Une fois
la totalité de l’échantillon percolé, les bouteilles les contenant sont rincées avec 5 mL d’EMN
à pH 7 et ces 5 mL sont également passés sur les cartouches. Ils permettent de rincer aussi la
phase adsorbante. Cette dernière est ensuite laissée à sécher pendant 60 minutes sous vide.
Enfin, les composés sont élués avec 5 mL d’un mélange EMN pH 7 / ACN, 40/60 (v/v).
L’eau utilisée pour l’élution a été conditionnée en même temps et de la même façon que l’eau
utilisée pour le conditionnement des cartouches.
Tableau 48 : Volumes (mL) des prises d'essai pour les différents projets traités.
eaux usées brutes eaux usées traitées
projet eau de surface eau de captage
(entrée de STEP) (sortie de STEP)
"10 effluents STEP" 200
continuum "STEP-surface-captage" 200 200 200 200
"amoxicilline-ampicilline" 100 100
FLASH 100 200 300
177
Dans le cas de la méthode spécifique pour l’amoxicilline et l’ampicilline, l’extraction par SPE
est pratiquée sur des cartouches Oasis MCX (60 mg, 3 mL). Avant l’extraction, le pH des
échantillons est ajusté à 3  0,1 à l’aide d’acide chlorhydrique. Puis 4,16 mL d’une solution
de Na2-EDTA à 250 mM sont ajoutés aux 100 mL d’échantillon pour atteindre une
concentration finale à 10 mM/échantillon. L’EDTA empêche les ions métalliques de catalyser
la réaction de dégradation du cycle -lactame. L’ajout d’EDTA ne modifie pas le pH. La suite
de la méthode est identique à celle utilisée pour les analyses multi-résidus, seul le pH de l’eau
minérale naturelle change et est stabilisé à 3 au lieu de 7 par ajout d’acide chlorhydrique (0,33
M).
Le protocole permettant l’analyse des molécules pharmaceutiques appartenant aux classes

thérapeutiques des AINS, antiépileptiques et anti-dépresseurs, hypolipémiants, stimulants et
bronchodilatateurs, utilisé dans le cadre du projet FLASH, est décrit dans la publication de
Togola et Budzinski (2008). Brièvement, le pH des échantillons est ajusté à 2 puis l’extraction
par SPE est pratiquée à l’aide de cartouches Oasis MCX (60 mg, 3 mL) et les composés sont
élués avec 3 mL d’éthyl acétate puis 3 mL d’éthyl acétate/acétone (50/50; v/v) et enfin 3 mL
d’éthyl acétate/acétone/ hydroxide d’ammonium (48/48/2; v/v/v).
¤ Evaporation :
Quelque soit la méthodologie extractive appliquée, l’étape d’évaporation est pratiquée de la
même façon. Les extraits obtenus par SPE sont évaporés le jour même ou au plus tard 72h
après l’extraction en ayant été conservés au congélateur à -20°C. L’évaporation se fait sous
flux d’azote à une température de 40°C. Il est impératif de ne pas évaporer la totalité de
l’échantillon au moment de cette étape sous peine de perdre les fluoroquinolones et
quinolones. Les quelques microlitres restants sont ensuite transférés dans un insert en verre de
300 µL placé dans un flacon d’injection. Le flacon initial ayant contenu l’extrait est alors
rincé successivement 3 fois à l’acétonitrile et ces rinçages sont également transférés dans
l’insert avec l’échantillon. Les extraits reconcentrés peuvent ainsi rester quelques jours au
congélateur avant d’être analysés (maximum 15 jours). L’élution des cartouches SPE étant
pratiquée avec un mélange de solvant contenant de l’eau, l’EDTA retenu par la phase est
entrainé lors de l’élution et se retrouve dans l’extrait. Comme, au cours de l’étape
d’évaporation, la totalité de l’extrait n’est pas évaporé, il y a toujours de l’EDTA dans les
quelques microlitres restant. Par conséquent, ce dernier est également transféré dans l’insert
de 300 µL prévenant ainsi l’adsorption des tétracyclines sur les parois en verre de l’insert.
Une deuxième évaporation est pratiquée dans les mêmes conditions, juste avant l’analyse. Les
résidus sont ensuite dissous dans un mélange eau ultra-pure milliQ / acétonitrile 90/10 (v/v).
Le volume de ce mélange ajouté aux échantillons dépend de la nature des échantillons et du
facteur de concentration désiré, par exemple 50 µL sont ajoutés pour les dosages d’eau de
captage alors que 100 µL et 200 µL sont ajoutés respectivement pour les sorties et les entrées
de STEP.
III.2. Échantillons « lisiers »
Quelle que soit l’origine des échantillons (élevage ou réacteur), ils sont traités de la même
façon. Ils sont centrifugés une première fois pendant 20 minutes à 4°C et à 10 000 rotations
par minute. Le culot de centrifugation est récupéré. Le surnageant est centrifugé une
deuxième fois dans les mêmes conditions. Le nouveau culot de centrifugation obtenu est
ajouté au premier. Ils sont conservés dans une barquette en aluminium au congélateur à -20°C
en attendant d’être lyophilisés puis conservés à température ambiante. Le surnageant est
178
ensuite filtré une première fois sur des filtres en fibre de verre d’une porosité de 1,6 µm
(GF/A) puis le filtrat obtenu est filtré une seconde fois sur des filtres en fibre de verre d’une
porosité de 0,7 µm (GF/F). Les filtres recouverts des particules sont conservés dans des
barquettes en aluminium au congélateur à -20°C en attendant d’être lyophilisés. La phase
dissoute est conservée dans des flacons Nalgene  (HDPE) au congélateur à -20°C.
¤ Traitement de la phase dissoute :

Les extractions de la phase dissoute des lisiers sont réalisées par SPE de façon très similaire à
celle pratiquée pour les analyses multi-résidus des eaux. La prise d’essai est de 30 mL et est
mesurée par gravimétrie. Le pH des échantillons est ajusté à 7 à l'aide d'acide chlorhydrique et
de soude. Environ 2,1 mL d'une solution concentrée de Na2-EDTA sont ajoutés à chacun des
échantillons afin d'avoir une concentration finale de 10 mM. L’ajout d’EDTA n’entraîne pas
de modification du pH des lisiers en raison de leur forte teneur en ammoniaque. Plusieurs
dizaines de microlitres d'une solution mélange d'étalon interne sont ajoutés aux échantillons.
Préalablement au passage des échantillons sur les cartouches, ces dernières sont conditionnées
successivement avec 5 mL d'acétonitrile puis 5 mL d'eau minérale naturelle à pH 7. Une fois
les échantillons passés, 5 mL d'eau Vittel à pH 7 sont versés dans les bouteilles ayant contenu
les échantillons puis passés sur les cartouches dans le double but de rincer à la fois les
bouteilles et les cartouches. Celles-ci sont ensuite séchées 1 heure sous vide. Enfin l'élution
est pratiquée avec 5 mL d'un mélange eau Vittel pH 7 et acétonitrile à 40/60 en volume. Les
extraits sont ensuite évaporés une première fois au Rapidvap (40°C, 100 mbar) pendant 3
heures dans le but de les concentrer, puis une deuxième fois sous flux d'azote pour changer de
solvant. Les résidus finaux sont repris dans 300 µL d'un mélange 90/10 eau pure milliQ /
ACN (v/v).
¤ Traitement de la phase solide :

Une fois les culots de centrifugation lyophilisés, les antibiotiques en sont extraits par ASE
(Accelerated Solvant Extraction). Ainsi, 0,2 g de matrice sont disposés dans une cellule ASE
de 11 mL. Les étalons internes sont ajoutés dans la cellule. Dans la cellule, la matrice est
entourée de billes de verre recouvertes de Na2-EDTA. L’EDTA permet d’optimiser
l’extraction des tétracyclines. Les conditions d’extraction sont indiquées dans le Tableau 49.
Le solvant d’extraction est constitué d’un mélange d’eau ultra-pure (milliQ) et d’acétonitrile
(30/70, v/v). Les extraits obtenus sont ensuite évaporés au Rapidvap à 40°C et 300 mbar
pendant 30 minutes puis à 40°C et 220 mbar pendant 40 minutes et enfin à 40°C et 200 mbar
jusqu’à ce qu’il reste moins de 5 mL d’eau dans les flacons. Trente millilitres d’eau minérale
naturelle dont le pH a été fixé à 7 sont ensuite ajoutés à chaque extrait de façon à diluer
totalement les quelques gouttes d’acétonitrile qui resteraient. Ces extraits sont ensuite purifiés
par SPE puis reconcentrés en suivant le même protocole que celui décrit pour la phase
dissoute.
Tableau 49 : Conditions d'extraction de la phase solide des lisiers porcins par ASE.
paramètres ASE protocole
preheat (min) 5
heat (min) 5
static (min) 5
flush (%) 80
purge (sec) 60
nombre de cycles 3
pression (bar) 100
température (°C) 70
solvant 30/70 eau/ACN (v/v)
179
Un test d’extraction et d’analyse de la phase particulaire a montré qu’elle était qualitativement

et quantitativement contaminée de la même façon que la phase solide (culot de
centrifugation). Les mêmes antibiotiques sont retrouvés dans les mêmes proportions (Figure
56). Par conséquent, il a été choisi de ne pas analyser la phase particulaire et d’extrapoler les
dosages de la phase solide à la phase particulaire pour connaître la contamination totale d’un
échantillon de lisier. Cette extrapolation permet d’économiser le temps et le coût de traitement
d’un échantillon pour un même point de prélèvements.
100%
90%
80% monensine
70% sulfadiazine
teneur (%)
60% oxytétracycline
50% tétracycline
40% marbofloxacine
30% lincomycine
20% tylosine
10%
0%
solide
solide
solide
solide
solide
solide
solide
particule
particule
particule
particule
particule
particule
particule
LS1 LS2 LS3 Ls5 BA5 BE5 Lag5
30.09.08 30.09.08 30.09.08 30.10.09 30.10.09 30.10.09 30.10.09
Figure 56 : Comparaison de la composition et des teneurs en antibiotiques de la phase particulaire et de la
phase solide de mêmes échantillons de lisier (LS1 : lisier stocké site simple 1, LS2 : lisier stocké site simple
2, LS3 : lisier stocké site simple 3, Ls5 : lisier stocké site complexe 5, BA5 : bassin d’aération site complexe
5, BE5 : bassin de décantation site complexe 5, Lag5 : lagune site complexe 5).
III.3. Échantillons « POCIS »
Les POCIS ayant servi aux calibrations en laboratoire n’ont été en contact qu’avec de l’eau du
robinet et aucun nettoyage préliminaire n’est nécessaire. En revanche, sur les POCIS exposés
dans le milieu naturel, du biofouling a eu le temps de se former à la surface des membranes et
un nettoyage à l’eau osmosée est nécessaire. Une fois nettoyés, les POCIS exposés dans
l’environnement et les POCIS de calibration sont traités de la même façon. Les POCIS sont
démontés et les membranes sont rincées avec 5 mL d’eau minérale naturelle (pH non fixé,
proche de 7) de façon à décoller la phase adsorbante. Celle-ci est récupérée dans des
cartouches en verre dont le fond a été recouvert préalablement par un fritté en Téflon. Un
nouveau fritté en Téflon est déposé au-dessus de la phase. La phase est ensuite séchée sous
vide puis les cartouches, étiquetées et emballées individuellement dans une feuille
d’aluminium, sont conservées dans une bouteille contenant du desséchant (billes de silice) et
placées au congélateur. Avant d’éluer les composés adsorbés sur la phase, les cartouches sont
mises à décongeler pendant une nuit et la masse de phase exacte contenue dans chacune d’elle
est déterminée par pesée différentielle entre la cartouche pleine et la cartouche vide,
préalablement étiquetée et pesée avec les deux frittés. Les étalons internes sont ajoutés dans
les flacons de récupération des éluats. La phase adsorbante est éluée avec 20 mL de méthanol.
Les extraits sont ensuite reconcentrés au Rapidvap® à 60°C et 550 mbar pendant 30 min.
Quand il reste environ 1 mL dans chaque flacon, 1 mL d’eau milliQ contenant 5 mM de Na2-
EDTA est ajouté. L’évaporation est ensuite prolongée pendant 10 minutes à 60°C et 250 mbar
180
puis à 150 mbar jusqu’à ce qu’il ne reste que quelques microlitres. Comme pour les extraits
de SPE, les résidus sont transférés dans un insert en verre de 300 µL placé dans un flacon
d’injection. Le flacon initial ayant contenu l’extrait est alors rincé successivement 3 fois à
l’acétonitrile et ces rinçages sont également transférés dans l’insert avec l’échantillon. Une
deuxième évaporation est pratiquée sous flux d’azote à 40°C juste avant l’analyse et les
résidus sont dissouts dans 300 µL et 100 µL d’un mélange eau pure milliQ / acétonitrile 90/10
(v/v) respectivement pour les extraits des POCIS de calibration et pour les extraits de POCIS
exposés dans le milieu naturel.
181
182
CHAPITRE 4
Développements
analytiques
183
184
Chapitre 4 : Développements analytiques
I. DEVELOPPEMENT DES METHODES D’ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE COUPLEE

A LA SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM (LC/MS/MS) .................................................................... 186
I.1. Développement de la méthode d’analyse pour 32 molécules pharmaceutiques ......................... 187
I.2. Extension de la méthode d’analyse à 78 molécules pharmaceutiques ....................................... 191
I.3. Méthode spécifique à l’amoxicilline et à l’ampicilline............................................................. 193
I.4. Bilan méthodes analytiques .................................................................................................... 194
I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+) ...................................................................................................... 194
I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-)...................................................................................................... 197
I.5. Validation des protocoles ....................................................................................................... 198
II. DEVELOPPEMENT DU PROTOCOLE D’EXTRACTION DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE
LIQUIDE DES ECHANTILLONS PAR SPE..................................................................................................... 202
II.1. Les échantillons d’eau ............................................................................................................ 202
II.2. Le cas particulier de l’amoxicilline et de l’ampicilline............................................................. 206
II.3. Les échantillons de lisiers ....................................................................................................... 209
II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute................................................................................ 209
III. DEVELOPPEMENT DU PROTOCOLE D’EXTRACTION DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE
SOLIDE DES ECHANTILLONS PAR ASE ...................................................................................................... 212
III.1. Développement du protocole .................................................................................................. 212
III.2. Bilan protocole extraction phase solide ................................................................................... 214
IV. CONTROLE QUALITE ET QUANTIFICATION ................................................................................. 215
IV.1. Contrôle qualité ..................................................................................................................... 215
IV.2. Méthodes de quantification..................................................................................................... 216
IV.2.1. Etalonnage externe .......................................................................................................................... 217
IV.2.2. Etalonnage interne .......................................................................................................................... 217
Dans le cadre d’analyses chimiques quantitatives de micropolluants organiques dans des

échantillons environnementaux, la méthodologie classiquement appliquée est divisée en trois
phases majeures : le prélèvement de l’échantillon, l’extraction et la concentration des
composés d’intérêt et l’analyse finale. Les développements analytiques regroupent les
développements des phases d’extraction, de concentration et d’analyse. Ils se font par étapes.
La première étape consiste à sélectionner les outils qui seront utilisés en s’appuyant sur la
littérature scientifique. La deuxième étape consiste à les adapter aux exigences imposées par
les propriétés physico-chimiques des analytes (hydrophile/Lipophile, acide/basique/neutre), la
nature des échantillons (matrice plus ou moins complexe, riche en matière organique), la
quantité d’échantillons à traiter et la sensibilité souhaitée. La troisième étape consiste à
valider le protocole développé selon différents critères de qualité. Les différentes étapes du
développement de chacune des 3 phases (extraction, analyse, validation) sont présentées dans
les paragraphes suivants.
185
I. Développement des méthodes d’analyse par chromatographie

en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem (LC/MS/MS)
Un des objectifs de ces travaux de thèse a été de mettre au point des protocoles qui permettent
de doser des molécules pharmaceutiques, non encore analysées au laboratoire, dans différents
types d’échantillons aqueux.
Pour atteindre cet objectif le premier point a été de choisir les molécules pharmaceutiques
étudiées (cf. Chapitre 2). En se basant sur des données de consommation (rapport AFSSAPS
et AFSSA, données ESAC et IMS Health, rapport de Besse et Garric, 2007), de toxicité (effet
secondaire des médicaments), d’écotoxicité (Holten Lützhøft et al., 1999 ; Halling-Sørensen
et al., 2000 ; Huggett et al., 2002 ; Ferrari et al., 2004 ; Fent et al., 2006 ; Jjemba, 2006), de
présence dans l’environnement (Ternes, 1998 ; Daughton et Ternes, 1999 ; Hirsch et al., 1999
; Sacher et al., 2001 ; Kolpin et al., 2002 ; Boxall, 2004 ; Algros et Jourdain, 2007) et
d’innovation, 5 classes thérapeutiques ont été retenues : les antibiotiques, les -bloquants, les
anticancéreux, les anti-VIH et les inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5. La disponibilité
et le coût des composés standards de référence ont ensuite été pris en compte pour aboutir à
une première liste de 32 puis ultérieurement à une seconde liste de 78 molécules à étudier au
sein de ces classes.
Une fois les molécules sélectionnées, la technique analytique a pu être choisie. Le choix de la
chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem comme
instrument d’analyse s’est appuyé sur la littérature scientifique (Hirsch et al., 1998 ; Sacher et
al., 2001 ; Petrovic et al., 2005 ; Gomez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Hao et al., 2006 ;
Vieno et al., 2006 ; Kasprzyk-Hordern et al., 2007). La chaine chromatographique utilisée est
une chaîne Rapid Resolution 1200 de chez Agilent. Comme l'UPLC (Ultra Performance
Liquid Chromatography), cette chaîne fait partie de la nouvelle génération des chaînes
chromatographiques. Elle supporte des pressions plus élevées, jusqu'à 600 bars, ce qui permet
de travailler avec des colonnes plus petites (diamètre et longueur) remplies de phase
stationnaire très fine (1,8 µm). De par leurs caractéristiques, ces colonnes permettent de
réduire le temps d'analyse et la consommation de solvant et d'améliorer la résolution des pics
chromatographiques. La RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) est donc plus
avantageuse que l’HPLC classique. L’étape de chromatographie permet de séparer les
différentes molécules entre elles et de les séparer des éléments constitutifs de la matrice
(Figure 57a). En sortie de colonne chromatographique, une fois séparées, les molécules sont
dirigées vers la source d’ionisation. La source d'ionisation est une source électrospray (ESI)
qui permet l'ionisation à pression atmosphérique d'une large gamme de molécules. Les ions
formés dans la source sont entrainés vers le spectromètre de masse. Le spectromètre de masse
est le triple quadrupôle 6410A de chez Agilent. La spectrométrie de masse en tandem est plus
sélective que la spectrométrie simple masse c'est pourquoi elle a été choisie. Par ailleurs, la
combinaison triple quadrupôle (QqQ) est plus sensible et l'appareillage est moins coûteux que
des technologies hybrides comme le quadrupôle- temps de vol (Q – TOF) (López-Roldán et
al., 2010), c'est pourquoi elle a été préférée dans le cas d'analyse de contaminants organiques
présents à l'état de traces. Le premier quadrupôle ne laisse passer que les ions précurseurs
définis pour chaque molécule. Les ions arrivent ensuite dans la cellule de collision où ils sont
dissociés par suite de collision avec des molécules de gaz. Les fragments obtenus sont alors
dirigés vers le deuxième quadrupôle qui ne laisse passer sélectivement que les ions produits
définis pour chaque molécule (Figure 57b). Ainsi chaque composé est suivi par une ou
186
plusieurs transitions "ion précurseur → ion produit". En mode MRM (Multiple Reaction
Monitoring), les transitions sont balayées les unes après les autres de façon cyclique tout au
long de l’analyse.
séparation
séparation détection
détection
(http://www.chem.agilent.com)
(http://www.chem.agilent.com) (http://www.waters.com)
(http://www.waters.com)
(a) (b)
Figure 57 : Schéma explicant le principe de l’analyse par chromatographie en phase liquide couplé à un
spectromètre de masse en tandem comportant 2 quadrupôles et fonctionnant en mode MRM (Multi-
Reaction Monitoring).
Une fois l’outil et les analytes sélectionnés, plusieurs méthodes ont pu être développées.
I.1. Développement de la méthode d’analyse pour 32 molécules

pharmaceutiques
phases mobiles
source
électrospray
octopôle
(guide les ions) 1er quadrupôle 2ème quadrupôle
capillaire lentilles hexapôle détecteur

cellule de collision
phase stationnaire
Figure 58 : Localisation des différentes parties du LC/MS/MS correspondant aux paramètres à optimiser.
(1er quadrupôle  ion précurseur, 2ème quadrupôle  ions produits, capillaire  énergie du capillaire et du
fragmentor, héxapôle cellule de collision  énergie de collision, source électrospray  température et débit du
gaz séchant et pression du gaz de nébulisation).
Le développement de la méthode d’analyse a été la première étape dans l’élaboration d’un

protocole permettant l’étude de molécules pharmaceutiques dans l’environnement.
Initialement, le développement a été réalisé pour la sélection des 32 molécules réparties en 23
antibiotiques, 5 anticancéreux, 2 -bloquants et 2 anti-VIH. La partie analytique a été
optimisée à partir de solutions individuelles préparées avec les cristaux des composés de
référence. L’optimisation consistait d’une part à sélectionner les paramètres de masse de
187
chaque molécule afin de les détecter (ion précurseur, ions produits, énergie du capillaire et du
fragmentor, énergie de collision, température et débit du gaz séchant, pression du gaz de
nébulisation) et d’autre part à choisir les phases mobiles (solvants et additifs tels que des sels
ou des acides) et la phase stationnaire (dimension et type de greffage de la colonne) afin de les
séparer. Les différentes parties de l’appareil correspondant aux paramètres à optimiser sont
visibles sur la Figure 58.
La partie spectrométrique a été développée en premier. Les molécules ont été injectées
individuellement dans des mélanges de solvants (eau/ACN ou eau/MeOH, 50/50) de façon à
identifier le mode d’ionisation (positif : ESI+ ou négatif : ESI-), l’ion précurseur et les
meilleures conditions pour l’obtenir (mode d’ionisation, solvant, énergie du capillaire et du
fragmentor). Sur les 32 molécules, 27 sont analysées en mode positif et 5 en mode négatif.
L’ion précurseur s’est révélé être l’ion pseudo-moléculaire pour la totalité de ces 32 composés
([M + H]+ en ESI+ et [M – H]- en ESI-). Le méthanol permettait d’améliorer l’ionisation de
certaines molécules mais la méthanolyse non reproductible des pénicillines a orienté la
sélection du solvant organique vers l’acétonitrile. De plus, la viscosité du mélange eau/ACN
est inférieure à celle du mélange eau/MeOH ce qui permet de réduire les problèmes de
pression qui sont fréquents en chromatographie en phase liquide. Les ions produits ont ensuite
été sélectionnés pour chaque composé ainsi que les conditions pour les obtenir (énergie de
collision). Une fois les ions précurseurs et les ions produits identifiés, les 2 transitions MRM
les plus intenses ont été choisies comme transition de quantification et de confirmation. Ces
transitions MRM ont ensuite été comparées avec celles des autres méthodes publiées dans des
articles scientifiques. Au moins une des 2 transitions sélectionnées dans ces travaux est la
même que celles publiées dans ces articles (Castiglioni et al., 2005 ; Gomez et al., 2006 ;
Gros et al., 2006 ; Vieno et al., 2006). Cependant, dans la méthode développée ici comme
dans celle proposée par Gros et al. (2006), le sulfaméthoxazole est ionisé en mode positif
alors que pour Castiglioni et al. (2005) cette molécule est ionisée en mode négatif. De la
même façon, hormis l’amoxicilline et l’ampicilline, les molécules de la famille des
pénicillines sont ionisées en mode négatif dans ces travaux alors qu’elles sont ionisées en
mode positif pour Sacher et al. (2001).
Les méthodes chromatographiques ont ensuite été développées. La chaine chromatographique

employée est une chaine RRLC. La RRLC supporte des pressions plus élevées qu’une chaine
HPLC classique ce qui permet de réduire la taille de la colonne et le diamètre des particules
tout en diminuant le temps d’analyse et en augmentant la résolution. D’après la littérature, la
phase stationnaire classiquement employée pour analyser les molécules pharmaceutiques est
une phase C18. C’est ainsi qu’une colonne Zorbax-SB C18 avec des particules de 1,8 µm et une
longueur de 5 cm a été choisie. Une fois la colonne sélectionnée, des acides (acide formique
HCOOH et acide acétique CH3COOH), à différentes proportions, ont été ajoutés aux phases
mobiles dans le but d’améliorer l’ionisation de certains composés et surtout d’optimiser la
séparation, la résolution et la stabilité. En mode positif, il a été testé l’ajout de 0,1 % d’acide
acétique, 0,3 % d’acide formique et 2,5 % d’acide acétique. Les 2 dernières conditions
stabilisent le pH de la phase mobile aqueuse à une même valeur de 2 et permettent de
distinguer l’impact du pH de l’impact de l’acide testé sur la résolution et l’intensité des pics
chromatographiques. De façon à réduire la largeur des pics des tétracyclines, des quinolones
et des fluoroquinolones sans pour autant perdre en sensibilité, il s’avère nécessaire d’ajouter
0,3 % d’acide formique dans chacun des solvants constituant les phases (Figure 59). En mode
négatif, les 3 mêmes conditions plus une condition sans acide ont été testées. En l’absence
d’acide les intensités sont meilleures (Figure 60) mais les temps de rétention varient et les
pics chromatographiques se déforment au cours d’une séquence d’analyse (Figure 61). Aussi,
188
bien que l’intensité soit un peu plus faible, il a été choisi d’ajouter 0,1% d’acide acétique à
chacune des deux phases mobiles de façon à corriger ces problèmes. Finalement les gradients
et les débits des solvants ont été optimisés de façon à maximiser la séparation des composés et
à minimiser la durée de l’analyse. Enfin les paramètres de température et de débit du gaz
séchant ainsi que la pression du gaz de nébulisation ont été réglés.
chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,1% CH3COOH chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,3% HCOOH chromatogramme ESI+ phases mobiles + 2,5% CH3COOH
250 000
acide 250 000
acide 140 000
oxolinique oxolinique 120 000

200 000 200 000 oxyTC acide
oxyTC 100 000 oxyTC
150 000
oxolinique
abondance
abondance
150 000
abondance
80 000
60 000
100 000 100 000
40 000
50 000 50 000
20 000
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8
temps (minutes)
(a) temps (minutes) (b) temps (minutes) (c)
Figure 59 : Chromatogrammes obtenus pour les 27 molécules ionisées en ESI+ en fonction de la
constitution des phases mobiles, (a) eau/ACN + 0,1 % CH3COOH dans chaque solvant, (b) eau/ACN + 0,3
% HCOOH dans chaque solvant, (c) eau/ACN + 2,5 % CH 3COOH dans chaque solvant. Exemple de
l’acide oxolinique en rouge et de l’oxytétracycline (oxyTC) en bleu.
chromatogramme ESI- phases mobiles sans acide chromatogramme ESI- phases mobiles avec 0,1%
CH3COOH
9 5
8 4,5
7 4
3,5
abondance
6
abondance
3
5
2,5
4
2
3
1,5
2 1
1 0,5
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
chromatogramme ESI- phases
tempsmobiles avec 0,3% HCOOH chromatogramme ESI- phases mobiles avec 2,5%
(minutes) (a) CH3COOH
temps (minutes) (b)
2 0,45
1,8 0,4
1,6 0,35
abondance
1,4
abondance
0,3
1,2
0,25
1
0,2
0,8
0,15
0,6
0,4 0,1
0,2 0,05
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
temps (minutes) (c) temps (minutes) (d)
Figure 60 : Chromatogrammes obtenus pour les 5 molécules ionisées en ESI- en fonction de la constitution
des phases mobiles (abondance normalisée par la quantité injectée), (a) eau/ACN sans acide, (b) eau/ACN
+ 0,1 % CH3COOH dans chaque solvant, (c) eau/ACN + 0,3 % HCOOH dans chaque solvant, (d)
eau/ACN + 2,5 % CH3COOH dans chaque solvant.
189
(a) (b)
Figure 61 : Chromatogrammes d’analyses successives de pénicilline G sans acide dans la phase mobile (a)
et avec 0,1 % d’acide acétique dans chaque solvant de la phase mobile (b).
Le protocole a ensuite été validé à travers l’évaluation de paramètres tels que les limites
instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL), les limites méthodologiques de
détection (MDL), la linéarité, la précision et la justesse. La définition de ces paramètres ainsi
que leur mode de calcul sont décrits dans la partie I.5 Validation des protocoles. Les valeurs
de ces paramètres pour chacun des composés sont détaillées dans l’article « Development of a
method for the simultaneous extraction of antibiotics,  -blockers, antineoplastics and
antivirals by solid phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass
spectrometry analysis – application to sewage treatment plant effluents » (publication 2).
Brièvement, les IDLs varient entre 2 pg injectés pour la pénicilline G ou la pénicilline V et 28
pg injectés pour l’épirubicine. Les IQLs varient entre 3 pg injectés pour la lincomycine et 138
pg injectés pour l’épirubicine. Les MDLs ont été déterminées à partir de l’extraction et
l’analyse d’eau minérale enrichie à différentes concentrations (5, 10 20, 50 et 100 ng/L) avec
les composés d’intérêt. Elles varient entre moins de 5 ng/L pour les antibiotiques de la famille
des sulfonamides ou les -bloquants et 100 ng/L pour les antibiotiques de la famille des
céphalosporines ou des pénicillines analysées en mode positif (amoxicilline et ampicilline). A
l’exception de ces -lactames, d’après les MDLs, le protocole est donc adapté à des études de
traces au niveau environnemental. Entre 60 et 3000 pg injectés, la linéarité est bonne (R² >
0,998) pour 25 des 32 composés étudiés. Pour les 7 composés restant, des gammes plus
petites de concentration sont utilisées. La précision est évaluée au travers des variations intra-
et inter-jour. Les variations intra-jours moyennes sont inférieures à 15 % et les variations
inter-jours moyennes sont de 24 % en ESI+ et de 19 % ESI-. Ces variations sont
suffisamment faibles pour que le protocole soit considéré comme précis. Enfin, la justesse
moyenne de la méthode est de 97 %, elle varie entre 81 ± 14 % pour la ciprofloxacine et 144
± 27 % pour l’oxacilline. En plus d’être précise, la méthode est donc juste. En conséquent,
elle est valide pour permettre des analyses de molécules pharmaceutiques présentes à l’état de
traces dans des matrices environnementales.
En plus des paramètres de validation, les effets matriciels ont été évalués au cours de ces
phases de développement (cf. I.5 Validation des protocoles). De façon synthétique, 3
190
phénomènes résultant de la présence de matière organique et d’interférents ont été observés :

i) le décalage des temps de rétention des antibiotiques de la famille des macrolides
(érythromycine, clarithromycine et roxithromycine) dans les eaux usées brutes en entrée de
STEP ; ii) la diminution ou l’extinction du signal chromatographique d’anticancéreux
appartenant à la famille des anthracyclines et d’antibiotiques appartenant aux familles des
quinolones et fluoroquinolones ou des sulfonamides par exemple; et iii) l’augmentation du
signal chromatographique pour les macrolides et lincosamides par exemple. Les détails des
résultats obtenus sont présentés dans l’article « Development of a method for the
simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid
phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis –
application to sewage treatment plant effluents » (publication 2).
I.2. Extension de la méthode d’analyse à 78 molécules

pharmaceutiques
Dans le but d’augmenter le nombre de molécules pharmaceutiques analysées dans chacune

des classes thérapeutiques étudiées, la liste des molécules sélectionnées a été agrandie et
étendue à 78 composés. L’ajout de ces nouveaux composés a alors nécessité une modification
du protocole analytique.
Comme pour la précédente sélection, la partie spectrométrique a été optimisée en premier à

partir de solutions individuelles préparées avec les cristaux des composés de référence. Cette
optimisation a conduit à sélectionner les paramètres de masse individuels des nouvelles
molécules (ion précurseur, ions produits, énergie du fragmentor et énergie de collision) et à
vérifier que les conditions spectrométriques communes leur correspondaient (énergie du
capillaire, température et débit du gaz séchant, pression du gaz de nébulisation). Comme
précédemment, les molécules ont été injectées individuellement en ESI+ et en ESI- dans les
mélanges de solvants constituant les phases mobiles (eau/ACN + 0,3 % HCOOH dans chaque
solvant en ESI+ et eau/ACN + 0,1 % CH3COOH dans chacun des solvants en ESI-) pour
identifier l’ion précurseur et les meilleures conditions pour l’obtenir (mode d’ionisation,
énergies du capillaire et du fragmentor). Sur l’ensemble des 78 molécules, l’ion précurseur
s’est révélé être majoritairement l’ion pseudo-moléculaire portant une ou deux charges. Seul
le docétaxel et le stavudine font exception avec des ions précurseurs qui correspondent à des
ions issus de la fragmentaion de leurs ions pseudo-moléculaires (Corona et al., 2011 ; Huang
et al., 2004). Au final, 66 et 12 molécules sont analysées respectivement en mode positif et
négatif. Les ions produits puis les 2 transitions MRM donnant les signaux les plus intenses ont
ensuite été choisis. Au moins une des 2 transitions sélectionnées sont en adéquation avec
celles établies par Sacher et al. (2001), Castiglioni et al. (2005), Gomez et al. (2006), Gros et
al. (2006) et Vieno et al. (2006). Néanmoins, dans ces travaux se sont les ions doublement
chargés ([M + 2H]2+) qui ont été choisis comme ions précurseurs pour l’azithromycine et la
spiramycine par exemple alors que pour Gros et al. (2006) ou pour Sacher et al. (2001) et
Castiglioni et al. (2005), ce sont les ions moléculaires portant une seule charge qui ont été
retenus (([M + H]+). Par conséquent, les transitions MRM de ces composés ne sont pas les
mêmes entre ces travaux et les articles publiés.
Concernant le développement de la partie chromatographique, en ESI +, au vu du plus grand

nombre de composés à séparer (66), la dimension de la colonne a été changée. Une colonne
plus longue, de 10 cm, a alors été choisie mais la phase stationnaire est restée une phase C 18
avec des particules de 1,8 µm de diamètre. L’augmentation de la longueur de la colonne,
191
passant de 5 à 10 cm, a demandé des ajustements au niveau du débit de la phase mobile et au

niveau du gradient chromatographique mais la constitution des phases mobiles n’a pas été
modifiée. De même, les paramètres de température et de débit du gaz séchant ainsi que la
pression du gaz de nébulisation n’ont pas été modifiés. En ESI-, aucun changement n’a été
opéré sur les caractéristiques de la colonne. Les chromatogrammes obtenus sont présentés
Figure 62 et Figure 63.
Figure 62: Chromatogramme des 66 composés pharmaceutiques analysés en ESI +.
Figure 63: Chromatogramme d’une solution standard analysée en ESI -.
L’ensemble de ces développements sont repris dans l’article intitulé « Multi-residus

simultaneous analysis of 78 pharmaceutical compounds in aqueous samples: development
and application » (publication 3).
Comme pour l’analyse des 32 composés, le protocole a ensuite été validé à travers
l’évaluation de paramètres tels que les limites instrumentales de détection, les limites
192
méthodologiques de détection et de quantification, la précision (variation intra- et inter-jours)

et la justesse. La définition de ces paramètres, leur mode de calcul et leurs valeurs pour
chacun des 78 composés sont détaillées dans la partie I.5 Validation des protocoles.
I.3. Méthode spécifique à l’amoxicilline et à l’ampicilline
Le développement d’une méthode analytique spécifique pour l’amoxicilline et l’ampicilline a

été décidé en raison des difficultés à doser correctement ces 2 molécules avec les protocoles
multi-résidus et en raison de l’importance de l’amoxicilline d’après les données de
consommation et de toxicité. Ce nouveau protocole est basé sur le protocole de routine
d’analyse des 32 molécules pharmaceutiques. Les transitions MRM et les énergies appliquées,
le type de colonne et les phases mobiles sont restées les mêmes. Seuls le gradient et la
proportion initiale des solvants des phases mobiles ont été modifiés de façon à réduire le
temps total d’analyse et à retarder l’élution de l’amoxicilline qui sortait à la limite du volume
mort avec la méthode précédente. La nouvelle méthode d’analyse dure ainsi 10 minutes
contre 21 minutes avec le gradient précédent (Figure 64).
Pour parfaire la validation, les limites instrumentales et méthodologiques de détection et de

quantification, la linéarité, la répétabilité et la justesse ont été évaluées (Tableau 50).
Comparativement aux méthodes multi-résidus (32 et 78 molécules), les IDLs des 2
pénicillines sont équivalentes ou moins bonnes avec la nouvelle méthode d'analyse.
Néanmoins, elles sont suffisantes pour les futures analyses environnementales. En revanche,
les limites méthodologiques (MDL et MQL) sont nettement meilleures avec la nouvelle
méthodologie grâce à l'optimisation de l'étape de SPE (cf. II.2 Le cas particulier de
l’amoxicilline et de l’ampicilline). De la même façon qu’avec les autres méthodes multi-
résidus, les réponses de l'amoxicilline et de l'ampicilline sont parfaitement linéaires. Entre 15
et 1200 pg injectés, leurs coefficients de régression linéaire sont supérieurs à 0,999. De même,
la répétabilité et la justesse de quantification, évaluée par étalonnage externe ou interne, sont
bonnes avec des écart-type faibles. La répétabilité est supérieure à 90 % avec une variation
intra-jour inférieure à 10 % et la justesse est comprise entre 80 % et 130 %.
1 400
ampicilline
1 200
1 000
abondance
800
600
amoxicilline
400
200
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
temps (minutes)
Figure 64 : Chromatogramme de l'amoxicilline et de l'ampicilline ainsi que des 3 autres -lactames
analysés en ESI+.
193
Tableau 50 : Valeurs des paramètres de validation du protocole analytique spécifique au dosage de

l'amoxicilline et de l'ampicilline.
linéarité R2 répétabilité justesse (%) (n=3)
IDL / IQL MDL / MQL
(15 – 1200 pg (variation étalonnage étalonnage
(pg injectés) (ng/L)
injectés) intra-jour, %) externe interne
amoxicilline 10 / 30 40 / 120 0,9994 62 126  21 128  6
ampicilline 3/9 10 / 35 0,9992 55 91  5 83  6
I.4. Bilan méthodes analytiques
Les différentes méthodes d'analyses sont détaillées dans les paragraphes suivants, elles sont
regroupées en fonction du mode d'ionisation.
I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+)
Plusieurs méthodes d'analyse en ESI+ ont été développées et améliorées au cours de ces
travaux. La première méthode permet l'analyse de 27 molécules pharmaceutiques (issues de la
sélection des 32 premières molécules), plus les étalons internes qui leur sont associées, en 21
minutes. La deuxième méthode permet l'analyse de 85 composés dont 19 étalons internes, soit
66 composés natifs issus de la seconde sélection (78 composés), en 50 minutes. La troisième
méthode est spécifique au projet DIPERPHA. Elle permet l'analyse de 21 antibiotiques natifs
et de 13 étalons internes. Elle est basée sur la première méthode. Enfin la dernière méthode
est spécifique à l'amoxicilline et à l'ampicilline mais les autres -lactames ionisés en mode
positif peuvent aussi être analysés par cette méthode. Elle dure 10 minutes. Toutes ces
méthodes partagent certains points communs comme la constitution de la phase mobile, le
volume d’injection, le type de phase de la colonne (phase stationnaire) ou le voltage du
capillaire dans la source d'ionisation. En revanche d'autres paramètres comme les dimensions
de la colonne, le débit ou le gradient chromatographique sont différents. L'ensemble des
paramètres communs à tous les composés analysés dans chacune des méthodes est résumé
dans le Tableau 51.
Les composés sont analysés en mode MRM (Multi-Reaction Monitoring) c'est-à-dire que les
transitions définies sont balayées les unes après les autres de façon cyclique tout au long de
l’analyse. Pour correspondre aux critères de la directive européenne 96/23/CE, il faut que les
composés analysés en LC/MS/MS soient identifiés par 4 points d'identification. Ainsi pour
s'assurer de l'identification des composés, ceux-ci sont reconnus d'après leur temps de
rétention, deux transitions et le rapport d'intensité entre ces deux transitions. Par conséquent
quand de nombreux composés sont analysés simultanément, cela génère un grand nombre de
transitions à acquérir. Pour éviter que les « dwell time » et le temps de cycle ne soient trop
courts ou ne nuisent à la sensibilité de la méthode, le mode « MRM dynamic » a été adopté.
Dans cette configuration, les transitions ne sont pas suivies sur toute la durée d'une analyse
mais uniquement pendant quelques minutes autour du temps de rétention théorique du
composé correspondant. Le temps de cycle est fixé par l’utilisateur et le logiciel calcul et
applique alors les meilleurs « dwell time » possibles.
Bien que les méthodes d'analyses soient différentes, les transitions et les énergies du
fragmentor et de collision nécessaires à leur obtention sont identiques. Elles sont récapitulées
dans le Tableau 52. Comme les étalons internes sont des composés volontairement ajoutés en
194
début de manipulation, aucun doute n'est possible sur leur présence, aussi ils n’ont pas besoin
des 4 points d’identification et ils ne sont suivis que par une seule transition.
Tableau 51 : Paramètres communs à l'ensemble des composés analysés en ESI+.

Sélection (nb de composés) 32 78 2
nombre de composés analysés : 45 85 7
natifs (étalons internes) 27 (18) 66 (19) 5 (2)
phases mobiles (A / B) eau milliQ + 0,3 % HCOOH / acétonitrile + 0,3 % HCOOH
proportion solvant gradient départ (v/v) 90 / 10 95 / 5 95 / 5
débit de la phase mobile (mL/min) 0,6 0,4 0,6
gradient temps % B temps % B temps % B
(temps en minutes) 0 10 0 5 0 5
8 70 25 50 2 20
8,5 95 29,2 60 5 60
11,5 95 30 95 6 100
12 0 35 95 6,5 100
15 0 35,5 0 7 5
15,3 10 40,5 0 10 5
21 10 41 5
50 5
volume d’injection (µL) 5 5 5
temps de rinçage de l’aiguille d’injection (sec) 30 30 30
phase stationnaire (diamètre des particules) colonne Zorbax-SB C18 (1,8 µm)
dimension de la colonne (mm)
longueur x diamètre interne 50 x 2,1 100 x 2,1 50 x 2,1
énergie du capillaire d'ionisation (kV) 3 3 3
température du gaz séchant (°C) 300 300 300
débit du gaz séchant (L/min) 11 11 11
pression du gaz de nébulisation (psi) 30 30 30
mode d'acquisition MRM dynamic MRM dynamic MRM
temps de cycle (ms) 500 500 130
dwell time (ms) 10
durée de l'analyse (min) 21 50 10
HCOOH : acide formique Baker analyzed, pureté 98 %
Acétonitrile : Baker ultra gradient HPLC grade
Tableau 52 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies
du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en
mode d'ionisation positif.
fragmentor transition de E.C transition de E.C rapport
composés
(V) quantification (v) confirmation (v) TQ / TC
stavudine 90 127,0 → 54,0 24 127,0 → 84,0 18 1,9
métronidazole 80 172,0 → 128,0 12 172,0 → 82,0 26 1,8
sulfanilamide 110 173,0 → 93,0 24 173,0 → 76,0 46 5
lamivudine 70 230,0 → 112,0 8 230,0 → 95,0 46 5,6
sulfapyridine 110 250,0 → 155,9 14 250,0 → 92,0 32 1,4
sulfadiazine 110 251,1 → 156,0 12 251,1 → 108,0 22 1,6
sulfadiazine-13C6 93 257,1 → 162,0 8
sulfaméthoxazole 100 / 90 254,1 → 92,1 30 254,1 → 156,1 14 1
sulfaméthoxazole-13C6 90 260,1 → 98,1 30 14
sulfathiazole 110 256,0 → 156,0 12 256,0 → 108,0 24 2
propranolol 120 / 130 260,1 → 116,1 16 260,1 → 56,1 32 1,6
propranolol-d7 110 267,1 → 56,0 36 18
ifosfamide 130 261,1 → 92,1 28 261,1 → 63,1 52 1,4
195

composés
cyclophosphamide 140 / 130 261,1 → 140,1 22 261,1 → 106,1 18 1,9
acide oxolinique 90 262,1 → 244,1 18 262,1 → 216,1 32 7
fluméquine 90 262,1 → 244,1 18 262,1 → 202,1 36 1,7
gemcitabine 110 264,0 → 112,0 16 264,0 → 95,0 48 5
sulfamérazine 110 265,2 → 156,0 14 265,2 → 108,0 28 1,1
aténolol 130 267,1 → 145,0 28 267,1 → 74,1 22 1,6
aténolol-d7 130 274,2 → 145,0 30 20
névirapine 150 267,1 → 226,0 28 267,1 → 80,0 42 2,9
métoprolol 140 268,1 → 116,1 18 268,1 → 74,1 22 1
sulfaméthizole 100 271,0 → 156,0 12 271,0 → 108,0 26 2,2
sotalol 110 273,1 → 255,1 10 273,1 → 133,0 30 1,5
sulfaméthazine 130 / 120 279,1 → 186,1 16 279,1 → 92,1 34 2
sulfaméthazine-13C6 120 285,1 → 98,1 34 16
abacavir 150 287,1 → 191,0 18 287,1 → 150,0 32 6,4
triméthoprime 140 / 150 291,1 → 230,2 24 291,1 → 261,1 26 1,5
triméthoprime-13C3 155 294,0 → 233,1 22
acide pipémidique 60 304,2 → 217,3 20 304,2 → 286,3 18 4,3
indinavir 70 307,7 → 133,0 10 307,7 → 97,0 34 2,7
sulfadiméthoxine 100 311,1 → 156,0 18 311,1 → 108,0 26 3,1
sulfadiméthoxine-d6 150 317,1 → 162,2 22 30
timolol 130 317,1 → 261,0 14 317,1 → 74,0 22 1
norfloxacine 120 320,2 → 276,2 18 320,2 → 302,2 18 1,3
norfloxacine-d5 110 325,2 → 281,4 16 18
bisoprolol 150 326,2 → 116,0 16 326,2 → 74,0 24 3,3
ciprofloxacine 150 332,1 → 288,2 18 332,1 → 245,1 24 1,4
ciprofloxacine-13C2-15N 110 336,1 → 291,2 18 26
saquinavir 110 336,3 → 285,6 10 336,3 → 128,0 46 1,3
ampicilline 110 / 90 350,1 → 106,1 20 350,1 → 192,0 12 2,6
ampicilline-15N 105 351,1 → 107,0 21
enrofloxacine 130 360,3 → 316,4 20 360,3 → 245,0 28 1,5
ofloxacine 120 / 90 362,1 → 318,1 18 362,1 → 261,2 30 1,3
ofloxacine-d3 102 365,0 → 321,2 18
marbofloxacine 110 363,1 → 72,1 22 363,1 → 320,1 14 3,5
amoxicilline 70 / 100 366,1 → 349,1 4 366,1 → 114,0 20 1,3
amoxicilline-13C6 65 372,0 → 355,1 2
tamoxifen 150 372,2 → 72,1 26 372,2 → 129,0 26 25
tamoxifen-d5 170 377,2 → 72,0 24 30
azithromycine 70 375,4 → 158,3 22 375,4 → 116,3 24 1,2
lincomycine 120 / 110 407,2 → 126,1 30 407,2 → 359,2 18 11
lincomycine-d3 105 410,2 → 129,1 29
spiramycine 110 422,4 → 174,2 20 422,4 → 101,0 16 2
clindamycine 110 425,3 → 126,0 30 425,3 → 377,0 20 18,9
tétracycline 130 / 120 445,1 → 410,1 18 445,1 → 154,1 28 1,8
tétracycline-d6 95 451,2 → 416,1 17
doxycycline 130 / 120 445,1 → 428,1 18 445,1 → 410,1 26 17
méthotréxate 150 455,1 → 308,1 18 455,1 → 175,0 42 1,8
céfotaxime 120 456,2 → 324,0 10 456,2 → 396,2 8 1,1
oxytétracycline 110 / 130 461,1 → 426,1 20 461,1 → 444,1 16 8,7
sildénafil 210 / 110 475,1 → 58,1 46 238,1 → 58,1 20 1,3
sildénafil-d3 210 478,2 → 61,0 54 20
chlortétracycline 120 479,1 → 444,1 22 479,1 → 462,0 16 1
ceftiofur 140 / 130 524,0 → 241,0 16 524,0 → 125,9 46 3,6
virginiamycine 90 526,2 → 508,1 12 526,2 → 355,1 14 1,5
docétaxel 90 527,1 → 105,0 46 808,3 → 327,1 22 79
196

composés
daunorubicine 90 528,1 → 321,1 30 528,1 → 363,1 10 1,5
doxorubicine 100 / 90 544,1 → 396,9 9 544,1 → 361,0 28 3
épirubicine 100 / 90 544,1 → 396,9 9 544,1 → 130,1 14 1,1
cefpodoxime 120 / 150 558,1 → 410,1 14 558,1 → 241,1 20 2,5
nelfinavir 150 568,2 → 330,1 34 568,2 → 467,2 30 2,1
monensine 250 693,3 → 675,3 46 693,3 → 461,2 62 1,5
bacitracine 70 712,0 → 86,1 38 712,0 → 199,0 44 1,4
ritonavir 130 / 140 721,2 → 296,0 18 721,2 → 268,1 32 1,6
érythromycine 150 734,5 → 157,9 36 734,5 → 576,3 18 1,3
érythromycine-13C2 130 736,4 → 159,9 34 20
clarithromycine 150 748,5 → 157,9 30 748,5 → 590,3 18 4,2
clarithromycine-d3 105 751,5 → 161,1 29
salinomycine 270 773,4 → 431,1 60 773,4 → 531,3 54 2
rifampicine 160 823,4 → 791,3 18 823,4 → 399,0 20 4,9
josamycine 160 828,4 → 109,0 46 828,4 → 173,8 34 1,7
roxithromycine 130 / 140 837,5 → 157,9 38 837,5 → 679,3 22 1,2
tylosine 170 916,5 → 174,0 42 916,5 → 772,4 30 5,3
I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-)
Contrairement au mode positif, peu de composés, parmi ceux étudiés, sont ionisés en mode
négatif. Par conséquent une seule méthode a été développée dans ce mode-là et les nouveaux
composés ont été ajoutés au fur et à mesure.
La colonne chromatographique est une colonne Zorbax-SB C18 de 5 cm de long, de 2,1 mm

de diamètre interne et rempli avec une phase de 1,8 µm. Elle permet la séparation des 12
composés en moins de 8 minutes. La durée totale de la méthode en considérant le temps de
rinçage et de conditionnement est de 18 minutes. La phase mobile est constituée avec les
mêmes solvants (eau milliQ / ACN) qu'en mode positif mais le type et les proportions d'acide
ajoutées sont différents. En mode positif, en plus de favoriser l'ionisation des composés,
l'acide formique (HCOOH) permet d'améliorer la séparation chromatographique des
composés et de réduire la largeur des pics des tétracyclines et fluoroquinolones. En mode
négatif, l'ajout d'acide n'est pas nécessaire pour favoriser l'ionisation des composés mais
permet de stabiliser les temps de rétention en fixant le pH de la phase mobile et donc la
forme, acide ou basique, des molécules. C'est pour cette raison, que 0,1 % d'acide acétique est
ajouté dans chacun des deux solvants. Le gradient chromatographique est le suivant :
augmentation de 10 % à 48 % du solvant B entre 0 et 5 minutes, puis augmentation à 95 % en
30 secondes et stabilisation pendant 3 minutes, pendant les 3 minutes suivantes la colonne est
rincée avec 100 % de la voie A puis la colonne est remise à conditionner pendant 5 minutes
avec 10 % de la voie B. Contrairement aux phases mobiles, certains paramètres sont
communs entre les deux modes d'ionisation. L'énergie du capillaire, le débit et la température
du gaz séchant ainsi que la pression de nébulisation sont les mêmes dans les deux modes. Les
transitions et les paramètres nécessaires à leur obtention sont indiqués dans le Tableau 53.
Comme en mode positif, les étalons internes ne sont identifiés que par une seule transition.
Les acquisitions se font aussi en mode MRM mais le mode « MRM dynamic » n'est pas
nécessaire en raison du petit nombre de transitions à suivre. Le « dwell time » est ainsi fixé à
10 ms par transition induisant un temps de cycle de 270 ms.
197
Tableau 53 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies
du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en
mode d'ionisation négatif.
fragmentor transition de E.C transition de E.C ratio
composés
5-fluorouracil 90 129,0 → 42,0 20 129,0 → 58,8 30 13
5-fluorouracil-15N 90 131,0 → 43,0 16
zidovudine 90 / 100 266,0 → 223,0 2 266,0 → 193,0 6 11
chloramphénicol 170 321,0 → 152,0 12 321,0 → 257,0 6 1,4
chloramphénicol-d5 110 326,0 → 157,0 14
pénicilline G 80 / 70 333,0 → 192,0 4 333,0 → 74,0 24 2,8
pénicilline G-d7 85 340,0 → 199,1 2
céfalexine 70 346,2 → 233,0 8 346,2 → 268,1 10 1,7
pénicilline V 80 349,0 → 208,1 2 349,0 → 93,0 24 1,2
thiamphénicol 130 354,0 → 185,0 20 354,0 → 290,2 10 2,2
oxacilline 100 / 70 400,0 → 259,1 10 400,0 → 356,1 2 2,1
céfuroxime 70 423,0 → 207,0 8 423,0 → 318,0 4 1
cloxacilline 90 434,0 → 293,0 8 434,0 → 257,0 12 16
dicloxacilline 80 468,0 → 327,0 8 468,0 → 424,0 4 2,8
acide fusidique 150 515,4 → 393,3 24 515,4 → 455,5 18 1,1
I.5. Validation des protocoles
Pour valider une méthode analytique, il faut s’assurer que diverses conditions et paramètres
soient remplis. Ces éléments ainsi que leur définition et leur mode de calcul sont listés ci-
dessous.
 Les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification : il s’agit de la plus

petite quantité injecté qui peut être détectée par le système analytique utilisé. Elles sont
déterminées à partir de l’injection de solution étalon et sont exprimées en picogrammes
injectés. Dans notre méthodologie, les limites de détection et de quantification correspondent
à une hauteur de pic chromatographique égale respectivement à 10 et 30 sachant que le bruit
de fond est lissé. En effet tout signal inférieur à une hauteur absolue de 40 est non visible sur
un chromatogramme et donc un signal ayant une hauteur indiqué de 10 ou 30 vaut en réalité
une hauteur absolue de 50 ou 70.
 Les limites méthodologiques de détection (MDL) et de quantification : il s’agit des
plus petites quantités contenues dans un échantillon ayant subi l’ensemble du protocole
analytique qui puissent être détectées et quantifiées. Ces limites prennent en compte les
performances de la méthodologie dans sa totalité. Elles peuvent être déterminées de façon
théorique ou elles peuvent être mesurées. Dans le premier cas, elles sont extrapolées à partir
des IDL et IQL en tenant compte du facteur de reconcentration (volume de la prise d’essai et
volume de l’extrait reconcentré avant injection). Dans le deuxième cas, elles sont mesurées à
partir d’échantillons dopés à des concentrations environementalement pertinentes (quelques
ng/L) subissant l’ensemble du protocole (extraction, reconcentration et analyse). Comme les
limites instrumentales, elles correspondent à une hauteur de pic chromatographique égale
respectivement à 10 et 30. Les différences entre les IDL et MDL ainsi que les différentes
façons de calculer ces dernières sont détaillées dans la publication « Trace-level analysis of
organic contaminants in drinking waters and groundwaters » (Capdeville et Budzinski,
2011) (publication 1).
 La linéarité : elle correspond au fait que le signal varie dans les mêmes proportions
que la quantité injectée. Lorsque que la réponse est linéaire, une droite de la forme y = ax + b,
198
idéalement passant par zéro, est obtenue en traçant le graphique : "intensité de la réponse en
fonction de la quantité injectée". La linéarité est évaluée sur une gamme de concentration soit
par l'intermédiaire du coefficient de corrélation (R²) soit par l'intermédiaire du rapport
"intensité de la réponse / quantité injectée" qui doit toujours donner une même valeur pour
une même molécule. Le graphique : "intensité de la réponse / quantité injectée en fonction de
la quantité injectée" donne une droite horizontale sur la gamme de concentration où la réponse
est linéaire.
 La précision : elle correspond à la variation intra-jour et inter-jour de la réponse
analytique d’une même solution ou d’un même échantillon injectés dans les mêmes
conditions avec la même méthode. Elle est calculée à partir de l’écart-type relatif entre les
réponses et est exprimée en pourcentage de variation.
 La justesse : elle correspond au rendement de quantification c'est-à-dire l’adéquation
entre la quantité injectée calculée et la quantité injectée théorique d’une solution étalon. Elle
est exprimée en pourcentage. Elle peut être calculée par étalonnage interne ou externe (cf.
IV.2 Méthodes de quantification).
 La performance de la méthode : elle est évaluée au travers des rendements
d’extraction. Ceux-ci sont calculés à partir des échantillons dopés qui subissent l’ensemble du
protocole analytique (cf. II.4 Bilan protocole extraction phase dissoute et Bilan protocole
extraction phase solide). Elle est exprimée en pourcentage d’adéquation entre la quantité
calculée et la quantité théorique.
 Les effets matriciels : ce sont des phénomènes dus à la matrice de l’échantillon. Au
niveau chromatographique, ils peuvent jouer sur les temps de rétention des composés et les
décaler parce qu’ils empêchent soit leur élution par la phase mobile soit leur adsorption sur la
phase stationnaire. Au niveau spectrométrique, ils peuvent atténuer le signal, et plus rarement
l’augmenter. Ceci peut être dû soit à l’ionisation des composés de la matrice, ce qui provoque
une augmentation du niveau de la ligne de base et les composés ciblés sont masqués, soit à
une compétition entre les analytes et les interférents dans la source au moment de l’ionisation
ce qui réduit l’efficacité d’ionisation des analytes. Ils sont évalués en ajoutant les composés
ciblés en quantité connue dans une partie aliquote de l’échantillon et en comparant les
réponses entre la partie aliquote dopée et la partie aliquote non dopée. Ils sont exprimés en
pourcentage d’extinction et ils sont calculés selon l’équation suivante :
( Aem  ( AES  AENS )) où Aem est l’aire du composé dans de l’eau minérale
100  effet matriciel AES est l’aire du composé dans la partie aliquote dopée
Aem AENS est l’aire du composé dans la partie aliquote non dopée
A l’exception des effets matriciels et des rendements d’extraction, les valeurs de ces différents
paramètres sont reportées pour chacun des 78 composés dans le Tableau 54. Les valeurs
indiquées pour l’amoxicilline et l’ampicilline sont celles obtenues avec leur protocole
spécifique.
Les limites instrumentales de détection varient entre 0,1 et 450 pg injectés à l’exception de la
salinomycine pour qui 1400 pg injectés sont nécessaires. Les limites méthodologiques de
quantification varient entre 0,1 et 120 ng/L (sauf bacitracine 425 ng/L) ce qui est satisfaisant
pour permettre des analyses environnementales. Pour l’ensemble des composés, la précision
est bonne avec une variabilité intra-jour moyenne de 7 % en ESI+ et de 5 % en ESI- et une
variabilité inter-jour moyenne de 54 % en ESI+ et de 29 % en ESI-. La justesse est bonne
avec un rendement de quantification moyen de 109 %. La linéarité n’est pas représentée dans
le tableau mais, entre 30 et 1200 pg injectés, elle est bonne pour 50 composés (R² > 0,999).
Lorsque celle-ci est insuffisante sur l’ensemble de la gamme (R² < 0,999), des gammes plus
199
petites sont utilisées (technique des « brackets »). L’ensemble des paramètres étant respecté,
la méthode est considérée comme validée.
Tableau 54 : Paramètres analytiques de validation de la méthode multi-résidus pour 78 molécules à

l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole.
variabilité variabilité justesse3
IDL1 MDL2 MQL2
composés ESI intra-jour inter-jour (n=19)
(pg injectés) (ng/L) (ng/L)
(%) (%) (%)
pénicilline G - 0,5 0,4 2 3 31 110  24
pénicilline V - 0,5 0,7 2 3 37 107  9
oxacilline - 0,4 0,5 2 4 54 109  18
cloxacilline - 0,4 0,5 2 3 21 107  7
dicloxacilline - 0,7 2 5 2 14 108  11
céfalexine - 8 6 17 6 30 97  57
céfuroxime - 2 2,5 8 2 26 100  5
chloramphénicol - 5 2 5 4 18 106  11
thiamphénicol - 5 2 4 7 33 99  8
acide fusidique - 15 1 3 4 15 148  74
5-fluorouracil - 165 n.d n.d 12 61 96  23
zidovudine - 2 1 3 4 13 107  10
amoxicilline + 10 40 120 6 128  6
ampicilline + 3 10 35 5 83  6
céfotaxime + 3 2 7 4 41 104  39
cefpodoxime + 2 100 300 4 36 116  14
ceftiofur + 3 2 6 6 38 113  18
azithromycine + 11 0,6 2 12 78 105  11
clarithromycine + 0,4 0,1 0,2 4 38 100  7
érythromycine + 3 0,3 1 5 37 101  8
josamycine + 2 0,3 1 5 40 95  7
roxithromycine + 1 0,1 0,4 4 37 98  8
spiramycine + 13 0,3 1 10 48 132  28
tylosine + 3 0,5 2 5 52 103  19
lincomycine + 0,3 0,1 0,2 7 58 144  74
clindamycine + 0,2 0,1 0,2 3 70 100  9
ciprofloxacine + 3 0,5 2 10 42 100  8
enrofloxacine + 2 0,2 0,5 9 88 101  27
marbofloxacine + 1 0,1 0,3 5 60 97  3
norfloxacine + 2 0,4 2 9 46 114  15
ofloxacine + 0,8 0,1 0,3 5 29 97  4
acide oxolinique + 0,1 0,04 0,1 5 42 113  40
acide pipémidique + 2 0,4 2 4 39 95  21
fluméquine + 0,1 0,1 0,2 4 51 112  18
tétracycline + 0,7 0,3 1 13 37 99  8
oxytétracycline + 1 0,4 2 18 47 114  15
chlortétracycline + 2 6 18 11 45 126  27
doxycycline + 0,9 0,4 2 14 37 113  24
sulfadiazine + 0,4 0,1 0,3 8 48 101  16
sulfadiméthoxine + 0,1 0,04 0,1 4 65 94  15
sulfamérazine + 0,5 0,1 0,4 7 66 93  15
sulfaméthazine + 0,2 0,1 0,2 6 48 98  7
sulfaméthizole + 0,4 0,1 0,4 6 70 94  10
sulfaméthoxazole + 1 0,3 1 7 49 97  6
sulfanilamide + 37 24 70 8 79 101  10
sulfapyridine + 0,5 0,1 0,3 8 76 93  17
200
variabilité variabilité justesse3

IDL1 MDL2 MQL2
composés ESI intra-jour inter-jour (n=19)
(pg injectés) (ng/L) (ng/L)
(%) (%) (%)
sulfathiazole + 0,4 0,2 0,5 6 67 93  14
triméthoprime + 0,7 0,1 0,3 7 49 101  8
métronidazole + 0,4 0,1 0,2 6 50 95  22
monensine + 27 0,5 2 27 61 156  30
salinomycine + 1400 7 22 38 80 179  88
bacitracine + 407 142 425 11 64 140  35
virginiamycine + 4 9 28 7 46 110  32
rifampicine + 26 23 69 23 52 124  33
aténolol + 1 0,5 2 5 49 98  7
bisoprolol + 0,2 0,03 0,1 6 83 99  8
métoprolol + 0,9 0,1 0,4 3 55 99  5
propranolol + 0,5 0,1 0,3 3 50 99  6
sotalol + 0,3 0,1 0,3 4 59 95  6
timolol + 0,4 0,1 0,2 2 73 96  6
docétaxel + 50 22 65 5 46 121  33
daunorubicine + 2 0,8 3 3 34 99  13
doxorubicine + 6 20 60 3 50 104  48
épirubicine + 13 25 75 4 46 113  30
gemcitabine + 3 13 40 7 66 125  72
tamoxifen + 8 0,5 2 6 32 96  6
méthotréxate + 2 0,3 1 9 61 97  21
cyclophosphamide + 1 0,6 2 5 50 123  59
ifosfamide + 1 0,5 2 6 49 94  5
indinavir + 12 0,6 2 8 25 124  37
nelfinavir + 0,5 0,4 2 6 33 130  29
ritonavir + 7 0,8 3 5 28 141  41
saquinavir + 1 0,2 0,6 3 71 116  23
névirapine + 0,5 0,1 0,2 9 75 116  32
abacavir + 0,5 0,1 0,2 8 53 103  12
lamivudine + 0,6 0,3 1 7 76 99  44
stavudine + 22 9 26 7 67 123  33
sildénafil + 3 0,3 1 5 72 109  19
1 : limites instrumentales de détection obtenues par extrapolation suite à l’injection directe d’une solution standard de référ ence.
2 : limites méthodologiques de détection et de quantification obtenues suite à l’extrapolation des résultats obtenues pour l’extraction et
l’analyse de 200 mL d’eau minérale naturelle enrichie à 200 ng/L (facteur de concentration = 1000). n.d : non déterminées car rendements
d’extraction nuls.
3 : justesse quantifiée par étalonnage interne ou externe selon la disponibilité des étalons internes.
En plus de ces paramètres, pour valider et assurer la qualité de nos méthodes analytiques, il a
été choisi de réaliser des cartes de contrôle. Une carte de contrôle pour chaque méthode
analytique créée a été mise en place. Une carte de contrôle est une solution étalon préparée
toujours de la même façon et injectée trois fois successivement au début de chaque séquence
d’analyse. L’intensité de la réponse (hauteur du pic chromatographique) de chaque composé
est reportée dans un tableau de suivi afin de se rendre compte des évolutions. La carte de
contrôle permet d’évaluer la répétabilité des analyses entre les différentes séquences lancées à
des moments différents (jour, semaine, mois) et au sein d’une même séquence. Ainsi, il peut
être assuré qu’un même échantillon donnera toujours la même réponse quelque soit la date où
il a été analysé, s’il n’a pas subi de dégradation intrinsèque. Par ailleurs, en s’assurant que la
réponse est répétable au cours d’une même séquence d’analyse, cela permet de n’injecter
qu’une seule fois chaque échantillon de la séquence. A titre d’exemple, le graphique obtenu à
201
partir des valeurs enregistrées dans le tableau de suivi de la méthode d’analyse pour le projet
DIPERPHA est présenté ci-après (Figure 65). Le suivi de la carte de contrôle a permis de
mettre en évidence un problème d'encrassement du spectromètre de masse affectant la
sensibilité de l'appareil (début août 2010).
encrassement capillaire et octopole

600000
du spectromètre de masse tylosine
érythromycine
nettoyage du
monensine
500000 spectromètre de masse
intensité de la réponse (hauteur)
chlortétracycline
oxytétracycline
400000 doxycycline
tétracycline
spiramycine
300000
lincomycine
marbofloxacine
200000 enrofloxacine
ciprofloxacine
norfloxacine
100000
sulfadiméthoxine
triméthoprime
0 sulfaméthazine
sulfamérazine
3)
3)
)
)
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=3
=
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
(n
fluméquine
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6/
6/
6/
6/
6/
6/
7/
7/
8/
8/
8/
8/
8/
9/
0/
0/
0/
1/
1/
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/0
/1
/1
/1
acide oxolinique
/1
/1
13
14
15
16
17
21
16
29
02
03
04
25
26
29
11
20
21
02
03
sulfadiazine
date d'injection
sulfanilamide
Figure 65 : Suivi de la carte de contrôle de la méthode d'analyse de 21 antibiotiques en ESI + pour

DIPERPHA.
II. Développement du protocole d’extraction des composés

contenus dans la phase liquide des échantillons par SPE
II.1. Les échantillons d’eau
Bien que la LC/MS/MS permette d’atteindre les niveaux de sensibilité et de sélectivité

nécessaire aux analyses d’échantillons environnementaux complexes, il faut cependant,
préalablement à l’analyse, extraire et concentrer les composés d’intérêt. D’après la littérature,
la méthodologie couramment employée pour cela est la SPE ou extraction en phase solide. Un
protocole permettant d’extraire les 32 puis les 78 molécules sélectionnées au cours de ces
travaux a alors été développé à partir d’eau minérale enrichie avec les composés ciblés.
Le premier test a consisté à choisir la phase adsorbante et le solvant d’élution. Il a été réalisé
avec une sélection réduite de 15 molécules. En s’appuyant sur les phases SPE et les solvants
les plus couramment employés d’après la littérature scientifique, 3 types de cartouches
contenant des phases adsorbantes polymériques (Oasis HLB, Strata X et Isolute ENV+) et 4
solvants et mélange de solvants (MeOH, ACN, MeOH/ACN 50/50, eau/ACN 30/70) ont été
testés. Les meilleurs rendements et les moins variables ont été obtenus avec les cartouches
Oasis HLB et les solvants MeOH ou mélange eau/ACN (Figure 66). Les rendements entre les
deux types de solvant étant similaires et le méthanol ne pouvant être utilisé à cause des
pénicillines, c’est le mélange eau/ACN qui a été adopté. Différentes proportions entre les 2
solvants ont ensuite été essayées pour conclure que le meilleur mélange était 40/60 eau/ACN
(v/v). Dans de nombreuses publications (Seifrtová et al., 2009) ce sont également les
202
cartouches Oasis HLB qui sont utilisées dans des méthodes multi-résidus pour le dosage de
Figure 66 : Rendement d'extraction moyen pour 15 antibiotiques en fonction du type de cartouche et du

solvant employé.
Le conditionnement des échantillons a ensuite été étudié pour l’ensemble des 32 composés
appartenant à la première liste de molécules sélectionnées. Un premier essai, testant différents
pH et une condition avec de l’EDTA, a permis d’établir l’EDTA comme un paramètre
important pour l’extraction des composés étudiés. Par ailleurs, l’EDTA, de par sa fonction
acide, s’est révélé modifier le pH des échantillons. Une deuxième expérience a alors été
réalisée pour tester l’influence du pH dans des échantillons où de l’EDTA avait préalablement
été ajouté. Les résultats combinés de ces deux tests sont présentés Figure 67. Les meilleurs
rendements d’extraction, et les moins variables, sont obtenus en présence d’EDTA quand le
pH des échantillons est stabilisé à 5, soit directement, soit après modification suite à l’ajout de
l’EDTA. Un dernier test a alors consisté à définir la concentration d’EDTA nécessaire en
essayant 4 concentrations différentes (2, 5, 10 et 20 mM d’EDTA). Les rendements obtenus
n’ont pas été suffisamment différents selon la condition testée pour permettre de définir quelle
concentration était la meilleure. Comme les premiers tests avaient été effectués à une
concentration de 10 mM et que les rendements obtenus au cours de ces essais étaient bons,
une concentration finale en EDTA à 10 mM a été retenue. Le protocole d’extraction optimisé
est donc le suivant : cartouches Oasis HLB (200 mg, 6 mL), mélange eau/ACN 40/60 (v/v)
comme solvant d’élution, ajout d’EDTA pour obtenir une concentration finale à 10 mM dans
les échantillons et pH final des échantillons stabilisé entre 4 et 5.
Figure 67 : Rendement d'extraction moyen pour les 32 molécules pharmaceutiques en fonction du pH de

l'échantillon et de l'ajout ou non d'EDTA.
203
Après le développement analytique et le développement de l’étape d’extraction, l’étape de

reconcentration a été optimisée. Trois conditions de solvant de reprise ont été évaluées (ACN,
eau/ACN 10/90, eau/ACN 30/70). Les résultats n’étant pas significativement différents, c’est
la méthode la plus facile à mettre en œuvre qui a été choisie. Les résidus sont donc repris avec
de l’acétonitrile. Finalement le niveau d’évaporation qui pouvait être atteint sans perte des
composés a été évalué. Les résultats de cet essai sont présentés Figure 68.
a) b)
Figure 68 : Rendements d’évaporation moyens en fonction du niveau d’évaporation pour les 32 molécules
pharmaceutiques (a) et pour quelques molécules spécifiques (b) (FQ : fluoroquinolones, Q : quinolones, S
: sulfonamides, b-B : -bloquants).
En moyenne (Figure 68a), plus les extraits sont évaporés, plus les rendements d’évaporation
sont faibles (< 50 %). Cette tendance est liée à certaines familles de molécules comme les
quinolones et fluoroquinolones. D’autres classes ou d’autres familles de molécules
pharmaceutiques telles que les sulfonamides ou les -bloquants ne semblent pas être
impactées par le niveau d’évaporation (Figure 68b). En conséquence, afin d’éviter la perte des
fluoroquinolones et des quinolones, il s’avère indispensable de ne pas évaporer totalement les
échantillons.
Pour valider le protocole, les rendements d’extraction obtenus sur 16 séries ont été moyennés.
Ils ont permis d’obtenir le graphique présenté Figure 69. Les résultats peuvent se répartir en 3
groupes : i) ceux qui ont de bons rendements d’extraction (≥ 70 %) avec une variabilité
modérée (25 %) ; ii) ceux qui ont des rendements moyens (≈ 50 %) avec une variabilité
importante (30 % ) ; et iii) ceux qui ont des rendements faibles (≈ 35 %) avec une variabilité
proportionnellement forte (25 %). Les antibiotiques de la famille des sulfonamides
(sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime), le chloramphénicol, les -bloquants
(métoprolol, propranolol), les anticancéreux de la famille des moutardes azotées
(cyclophosphamide, ifosfamide) et les anti-VIH (ritonavir, zidovudine) appartiennent au
premier groupe. Les antibiotiques de la famille des quinolones et fluoroquinolones (acide
oxolinique, fluméquine, ciprofloxacine, ofloxacine) et ceux de la famille des macrolides et
lincosamides (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine, lincomycine) appartiennent
au deuxième groupe. Enfin, les antibiotiques de la famille des -lactames (amoxicilline,
ampicilline, pénicilline G, pénicilline V, oxacilline, ceftiofur, cefpodoxime), ceux de la
famille des tétracyclines (tétracycline, oxytétracycline, chlortétracycline, doxycycline) et les
anticancéreux de la famille des anthracyclines (daunorubicine, doxorubicine, épirubicine)
appartiennent au troisième groupe.
204
Figure 69 : Rendements d'extraction moyens (n=16) pour chacun des 32 composés de la première liste de
molécules sélectionnées.
Avant de valider définitivement le protocole développé, une dernière expérience a été

effectuée pour évaluer les volumes de fuites. Le volume de fuite correspond au volume
maximum qui peut être percolé sur une cartouche SPE sans modifier les rendements
d’extraction. Au-delà de ce volume de fuite, les composés ne sont plus retenus sur la
cartouche SPE et sont élués au fur et à mesure que l’échantillon percole. C’est un paramètre
spécifique à chaque composé. Pour l’évaluer, différents volumes d’eau minérale (50, 100,
200, 500, 1000 et 2000 mL) contaminée à un même niveau (300 ng/L) ont été extraits. Les
résultats sont présentés dans le Tableau 55. La molécule possédant le plus petit volume de
fuite est le facteur limitant et impose ce volume à l’ensemble des autres composés dans le cas
d’une analyse multi-résidus. Parmi les 32 premières molécules étudiées, c’est la
roxithromycine qui possède le plus faible volume de fuite, 200 mL. Par conséquent le volume
de fuite de la méthode d’analyse des 32 composés pharmaceutiques est 200 mL.
Tableau 55 : Volume de fuite déterminés pour l’ensemble des 32 composés (n.d : non determiné car
rendements d’extraction trop faibles ou nuls).
volume de volume de volume de
composés composés composés
fuite (mL) fuite (mL) fuite (mL)
amoxicilline n.d ciprofloxacine 1 000 chloramphénicol 500
ampicilline n.d ofloxacine 1 000 métoprolol 2 000
pénicilline G 1 000 acide oxolinique 1 000 propranolol 2 000
pénicilline V 1 000 fluméquine 1 000 daunorubicine 2 000
oxacilline 1 000 tétracycline 2 000 doxorubicine 500
cefpodoxime 1 000 oxytétracycline 2 000 épirubicine 500
ceftiofur 1 000 chlortétracycline 2 000 ifosfamide 2 000
clarithromycine 2 000 doxycycline 1 000 cyclophosphamide 2 000
érythromycine 2 000 sulfaméthoxazole 2 000 ritonavir 1 000
roxithromycine 200 sulfaméthazine 1 000 zidovudine 1 000
lincomycine 1 000 triméthoprime 2 000
205
Ces tests qui ont permis la mise au point du protocole d’extraction des 32 premiers composés
choisis sont détaillés dans la publication « Development of a method for the simultaneous
extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction
followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis – application to
sewage treatment plant effluents » (publication 2).
Initialement, le protocole d’extraction et de concentration a été développé pour les 32

molécules pharmaceutiques de la première liste. Par la suite, il a été appliqué à la sélection
étendue sans modification particulière. A l’exception des -lactames et en particulier de
l’amoxicilline qui avaient déjà des taux de récupérations faibles, les rendements d’extraction
étant satisfaisants, le protocole n’a pas subi de changement et a été utilisé de la même façon
pour les 32 ou les 78 molécules. L’étude des volumes de fuite a cependant révélé le besoin
d’être attentif aux volumes percolés en particulier pour l’aténolol (volume de fuite < 50 mL).
L’ajout de l’étalon interne spécifique à ce composé (aténolo-d7) a permis d’éviter que son
volume de fuite ne soit le volume limitant pour l’ensemble des composés. Le volume de fuite
pour l’ensemble de la méthodologie multi-résidus est alors resté à 200 mL.
II.2. Le cas particulier de l’amoxicilline et de l’ampicilline
Si ce protocole d’extraction et d’évaporation est bon dans son ensemble (rendement moyen
pour les 78 composés de 74  39 %), il s’avère n’être pas adapté ni aux -lactames et en
particulier à l’amoxicilline ni au 5-fluorouracil. En raison de l’importance de l’amoxicilline
d’après les données de consommation et de toxicité, il a été décidé de développer une
méthode analytique spécifique pour elle et l’ampicilline.
Les -lactames en général et l’amoxicilline en particulier sont les antibiotiques les plus
consommés. Or, en dépit de leur fortes consommations, ils ne sont que très peu, voir pas,
retrouvés dans les systèmes aquatiques contrairement à d’autres antibiotiques moins
consommés mais très souvent détectés comme le sulfaméthoxazole. Selon les protocoles
développés et présentés précédemment, les -lactames (pénicillines et céphalosporines)
répondent parfaitement aux critères de validation analytique comme les limites instrumentales
de détection et de quantification, la justesse, la précision et la linéarité mais présentent de
grosses lacunes au niveau des rendements d’extraction. L’application de protocoles
d’extraction publiés dans la littérature scientifique (Christian et al., 2003 ; Cha et al., 2006)
n’ont pas permis d’améliorer ce point. La question de savoir si l’absence d’amoxicilline dans
les échantillons environnementaux était liée à des difficultés analytiques ou à sa dégradation
rapide par hydrolyse (Hirsch et al., 1999 ; Christian et al., 2003 ; Cha et al., 2006 ; Seifrtova
et al., 2009) comme cela est souvent suggéré, s’est alors posée. Kümmerer soulève aussi cette
interrogation dans sa synthèse bibliographique parue en 2009 et intitulée « Antibiotics in the
aquatic environment, a review, part I » (Kümmerer, 2009a). Pour y répondre, une
méthodologie spécifique à l’amoxicilline a été développée et à laquelle, une autre pénicilline
structurellement très proche, l’ampicilline, a été associée. Comme pour les méthodes
précédentes, les développements ont été réalisés à partir de solutions standards individuelles
et d’eau minérale dopée avec les composés d’intérêt. Ils sont basés sur le protocole de routine
d’analyse des 32 molécules pharmaceutiques.
Lors des tous premiers tests de développement de la SPE, ceux pour la sélection des 32
produits pharmaceutiques, le mélange eau/ACN (40/60, v/v) avait été choisi comme solvant
d’élution en alternative au méthanol parce que les pénicillines réagissaient de façon non
206
reproductible avec ce dernier. Au cours de ces développements, le choix du solvant n’a donc
pas été remis en question. Les premiers paramètres qui ont été testés concernés le pH des
échantillons et la phase adsorbante. L'amoxicilline et l'ampicilline possédant plusieurs pKA, il
était judicieux de tester la combinaison de ces 2 paramètres simultanément. Ainsi, 5 phases
adsorbantes (Oasis HLB, Oasis MCX, Oasis MAX, Strata X et Strata XC) ont été testées à 3
pH différents (3, 7 et 9) au cours d'une première expérience. L’EDTA était ajouté dans les
protocoles précédents pour prévenir une adsorption des tétracyclines sur les parois en verre
des contenants. En l’absence de tétracyclines, dans ce premier essai, il n’a donc pas été ajouté.
Un test a été mené en parallèle en utilisant le protocole extraction des 32 produits
pharmaceutiques pour lequel uniquement le pH des échantillons a été modifié, pH 2 au lieu de
5. Cette valeur de pH a été choisie car elle est inférieure à tous les pK A des 2 pénicillines et
permet ainsi de s’assurer de la forme protonée des molécules. Les résultats obtenus à pH 7 et
pH 9 sont mauvais et ne sont donc pas représentés ici. L'amoxicilline n'a pu être extraite avec
aucune des cartouches testées à aucun de ces deux pH. Les autres résultats sont présentés
Figure 70. Les meilleurs rendements d’extraction sont obtenus avec les cartouches Oasis HLB
et MCX avec un pH de 3.
Figure 70 : Rendements d'extraction obtenus au cours du premier test d'optimisation d'un protocole SPE
spécifique à l'amoxicilline et à l'ampicilline.
Ce constat a conduit à une deuxième expérience qui visait à conforter le résultat précédent en
comparant les rendements d’extraction obtenus dans différentes conditions pour une eau
minérale enrichie avec de fortes concentrations en -lactames (10 µg/L). Ces tests cherchaient
également à évaluer l’influence de l’EDTA sur l’extraction des pénicillines. Pour parfaire
cette expérience, un triplicat a été extrait avec l’ancien protocole. Ainsi 5 conditions ont été
testées : cartouches Oasis MCX avec des échantillons à pH 3 avec et sans EDTA, cartouches
Oasis HLB avec des échantillons à pH 3 avec et sans EDTA et cartouches Oasis HLB avec
des échantillons à pH 5 avec EDTA (ancien protocole). Il ressort de ce test qu’uniquement 2
conditions permettent d’extraire l’amoxicilline et l’ampicilline, les cartouches Oasis MCX à
pH 3 avec EDTA et les cartouches Oasis HLB à pH 5 avec EDTA c'est-à-dire l’ancien
protocole (Figure 71). Aucun des triplicats des autres conditions testées n’ont permis
d’extraire les 2 pénicillines. De plus, les rendements d’extraction obtenus avec les nouvelles
conditions (MCX, pH 3, EDTA) sont meilleurs, de l’ordre de 60%, que ceux obtenus avec
l’ancien protocole (9  2 % pour l’amoxicilline et 21  6 % pour l’ampicilline) ce qui
confirme les résultats du premier test (Figure 70).
207
Figure 71 : Rendements d'extraction obtenus au cours du second test d'optimisation du protocole SPE de
l’amoxicilline et de l’ampicilline.
Pour valider ce nouveau mode opératoire, une dernière expérience a été réalisée en triplicat
sur une eau minérale enrichie à des concentrations environnementalement pertinentes (100
ng/L). Les étalons internes des 2 molécules ont été ajoutés au cours de cet essai pour finaliser
la validation du protocole. Les résultats sont présentés Figure 72. Avec des rendements
d’extraction de l’ordre de 46  3 % pour l’amoxicilline et de 45  2 % pour l’ampicilline en
étalonnage externe et des rendements de l’ordre de 110  11 % pour l’amoxicilline et 107  3
% pour l’ampicilline en étalonnage interne, le protocole d'extraction est validé. Les
rendements d'extraction sont donc meilleurs avec le nouveau protocole par rapport à l'ancien
et ceci en étalonnage externe comme en étalonnage interne. De plus la variabilité est faible,
inférieure ou égale à 10%.
Figure 72 : Validation du nouveau protocole d'extraction de l'amoxicilline et de l'ampicilline
Par ailleurs, pour tester l’hypothèse d’une dégradation rapide de l’amoxicilline par hydrolyse,
une solution de ce composé a été préparée et a été analysée durant plusieurs jours. Pour cela,
des cristaux d’amoxicilline ont été dissouts dans de l’eau ultra-pure et la solution ainsi
obtenue a été analysée à plusieurs reprises par LC/MS/MS pendant 6 jours. Entre les
injections, le flacon contenant 1 mL de la solution a été laissé sur le portoir de la machine
sans précaution particulière. Du point de vu analytique, aucune différence n’est apparue entre
la première injection et la dernière injection réalisée 140 heures plus tard. En conséquence, il
ne semble pas que l’amoxicilline soit hydrolysée. La même expérience a été réalisée avec les
autres -lactames et il s’avère que seul le cefpodoxime est particulièrement affecté.
L’intensité de sa réponse diminue d’un facteur 2 en 9 h, d’un facteur 5 en 20 h et il n’est
quasiment plus détectable en 48 h. L’ajout de 2% de méthanol semble en revanche permettre
de préserver sa dégradation pendant au moins 90 h soit un peu plus de 3 jours. Ainsi dans
208
l’environnement, l’absence des -lactames est peut-être due à une dégradation bactérienne
mais pas à une hydrolyse.
II.3. Les échantillons de lisiers
A partir des protocoles analytiques multi-résidus développés pour étudier la contamination de

l’eau par les molécules pharmaceutiques, un protocole très similaire a été adapté pour
permettre l’analyse de la phase dissoute de lisiers porcins. Seuls 2 points diffèrent entre ces
protocoles : i) l’ajout d’EDTA n’entraine pas de baisse du pH, les extractions sont donc
pratiquées à pH 7 ; et ii) la première évaporation/reconcentration n’a pas lieu sous flux
d’azote mais sous vide et agitation au Rapidvap® (Labconco) afin d’accélérer le processus et
d’éviter la formation d’un film opaque à la surface de l’extrait.
II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute
Les protocoles finaux résultant de ces différents développements sont schématisés Figure 73.
Cette figure permet de visualiser clairement les diverses étapes des protocoles et de mettre en
évidence les points communs et les différences entre eux.
Les performances de ces méthodes sont évaluées au travers des rendements d’extraction. Les
valeurs des rendements sont récapitulées dans le Tableau 56. Elles correspondent aux
moyennes de valeur de rendement obtenues pour 12 séries d’extraction d’eau minérale
enrichie avec les composés d’intérêt et réalisées avec le protocole multi-résidus, excepté pour
l’amoxicilline et l’ampicilline. Les valeurs indiquées pour l’amoxicilline et l’ampicilline sont
celles obtenues avec leur protocole spécifique et correspondent au triplicat ayant servi à
valider la méthode (II.2 Le cas particulier de l’amoxicilline et de l’ampicilline).
Grâce à l’optimisation du protocole d’extraction pour l’amoxicilline et l’ampicilline, les

performances des méthodes sont bonnes avec un rendement moyen de 76  39 %. Cependant,
les composés peuvent être répartis en 3 groupes : i) ceux qui ont un bon rendement avec une
variabilité faible comme les sulfonamides ou les -bloquants par exemple, ii) ceux qui ont un
bon rendement mais une variabilité relativement forte comme certains macrolides, certaines
tétracyclines ou certains anti-VIH et iii) ceux qui ont des rendements faibles comme les
céphalosporines, certains antibiotiques (exemple : chlortétracycline, bacitracine,
salinomycine, virginiamycine et rifampicine) et certains anticancéreux (exemple : 5-
fluorouracil, doxorubicine, épirubicine, gemcitabine).
209
FILTRATION  PHASE DISSOUTE
SPE multi-résidus SPE spécifique amoxicilline SPE lisiers

Cartouches OASIS HLB 200 mg, 6 ml Cartouches OASIS MCX 60 mg, 3 ml Cartouches OASIS HLB 200 mg, 6 ml
Préparation échantillons Préparation échantillons Préparation échantillons

prise d'essai : 100 ml entrée STEP, prise d'essai : 100 ml entrée STEP, prise d'essai : 50 ml sortie de réacteur,
200 ml tout le reste 200 ml tout le reste 30 ml tout le reste
ajuster pH 7 ajuster pH 3 ajuster pH 7
ajout 4,16 ml d'une solution d'EDTA à ajout 4,16 ml d'une solution d'EDTA à ajout 4,16 ml d'une solution d'EDTA à
0,25 M / 100 ml d'échantillon  eau 0,25 M / 100 ml d'échantillon 0,25 M / 100 ml d'échantillon (pH
baisse du pH (entre 4 et 5) ajout étalons internes stable)
ajout étalons internes ajout étalons internes
Conditionnement cartouche Conditionnement cartouche Conditionnement cartouche

5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel pH 7 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel pH 3 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel pH 7
Dépôt échantillon Dépôt échantillon Dépôt échantillon

rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel pH 7 rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel pH 3 rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel pH 7
Séchage Séchage Séchage

1 h sous vide 1 h sous vide 1 h sous vide
Elution Elution Elution

5 ml eau/ACN 40/60 v/v 5 ml eau/ACN 40/60 v/v 5 ml eau/ACN 40/60 v/v
(eau Vittel pH 7) (eau Vittel pH 3) (eau Vittel pH 7)
1ère reconcentration RapidVap

80%, 40°C, 150 mbar, 30 min
1ère reconcentration sous flux d’azote 1ère reconcentration sous flux d’azote
80%, 40°C, 100 mbar, 30 min
reprise résidus : 3 rinçages ACN reprise résidus : 3 rinçages ACN
80%, 40°C, 70 mbar, 30 min et +
reprise résidus : 3 rinçages ACN
2ème reconcentration flux d'azote

ajout 50 µl eau/ACN 90/10 v/v (eau milliQ) pour eau de surface (volume final ≈ 100 µl)
ajout 100 µl eau/ACN 90/10 v/v (eau milliQ) pour sortie de STEP (volume final ≈ 150 µl)
ajout 200 µl eau/ACN 90/10 v/v (eau milliQ) pour entrée de STEP (volume final ≈ 250 µl)
ajout 250 µl eau/ACN 90/10 v/v (eau milliQ) pour lisier (volume final ≈ 300 µl)
Analyse
Injection RRLC/MS/MS
Figure 73 : Protocoles d’extractions multi-résidus (32 et 78 composés) et spécifiques (amoxicilline et
ampicilline) de la phase dissoute d’échantillons aqueux (eau et lisiers).
210
Tableau 56 : Paramètres expérimentaux de validation de la méthode de dosage des 78 molécules à

l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole. Rendements calculés par
étalonnage interne ou externe.
rendement rendement
composés étalons internes(n=12) composés étalons internes (n=12)
(%) (%)
pénicilline G pénicilline G-d7 101  6 sulfadiméthoxine sulfadiméthoxine-d6 104  12
pénicilline V pénicilline G-d7 80  18 sulfamérazine sulfaméthazine-13C6 105  8
oxacilline pénicilline G-d7 77  17 sulfaméthazine sulfaméthazine-13C6 102  10
cloxacilline pénicilline G-d7 80  22 sulfaméthizole sulfaméthoxazole-13C6 89  9
dicloxacilline pénicilline G-d7 61  27 sulfaméthoxazole sulfaméthoxazole-13C6 105  10
céfalexine 61  62 sulfanilamide sulfaméthazine-13C6 38  25
céfuroxime pénicilline G-d7 66  15 sulfapyridine sulfadiméthoxine-d6 105  9
chloramphénicol chloramphénicol-d5 156  28 sulfathiazole sulfaméthazine-13C6 100  15
thiamphénicol chloramphénicol-d5 111  14 triméthoprime triméthoprime-13C3 97  13
acide fusidique 74  66 métronidazole 65  21
5-fluorouracil 5-fluorouracil-15N 0 monensine 97  73
zidovudine 53  15 salinomycine 210  84
amoxicilline amoxicilline–13C6 110  11 bacitracine 23  20
ampicilline ampicilline–15N 107  3 virginiamycine 8  11
céfotaxime 22  24 rifampicine 33  23
cefpodoxime 34 aténolol aténolol-d7 99  18
ceftiofur 26  25 bisoprolol propranolol-d7 108 ± 14
azithromycine clarithromycine-d3 116  52 métoprolol propranolol-d7 111  16
clarithromycine clarithromycine-d3 102  8 propranolol propranolol-d7 100  12
érythromycine érythromycine-13C2 115  13 sotalol propranolol-d7 55  3
josamycine clarithromycine-d3 98  44 timolol propranolol-d7 62  27
roxithromycine clarithromycine-d3 101  11 docétaxel 31  15
spiramycine 68  25 daunorubicine 40  22
tylosine clarithromycine-d3 126  34 doxorubicine 79
lincomycine lincomycine-d3 104  14 épirubicine 99
clindamycine lincomycine-d3 97  24 gemcitabine 62
ciprofloxacine ciprofloxacine-13C2-15N 105  8 tamoxifen tamoxifen-d5 105  11
enrofloxacine 74  26 méthotréxate 74  19
marbofloxacine ofloxacine-d3 87  8 cyclophosphamide propranolol-d7 94  23
norfloxacine norfloxacine-d5 108  10 ifosfamide propranolol-d7 98  26
ofloxacine ofloxacine-d3 101  13 indinavir 61  26
acide oxolinique 83  26 nelfinavir 15  9
acide pipémidique 37  21 ritonavir 58  29
fluméquine 71  23 saquinavir 39  26
tétracycline tétracycline-d6 112  5 névirapine 86  34
oxytétracycline 67  25 abacavir 84  28
chlortétracycline 85 lamivudine 16  10
doxycycline 51  13 stavudine 58  22
sulfadiazine* sulfaméthazine-13C6 98  17 sildénafil sildénafil-d3 102  11
* sulfadiazine initialement quantifiée par rapport à la sulfaméthazine-13C6 en attendant de disposer de son propre étalon interne.
211
III. Développement du protocole d’extraction des composés

contenus dans la phase solide des échantillons par ASE
III.1. Développement du protocole
Les résultats des analyses préliminaires de la phase dissoute d'une grande partie des
échantillons ont conduit à réduire la liste des antibiotiques recherchés dans le cadre du projet
DIPERPHA à 7 molécules. Les développements concernant l'extraction de la phase solide ont
donc initialement été réalisés sur cette liste réduite. Parmi les différentes techniques
d’extraction possibles pour les matrices solides (micro-ondes, ultra-sons, vortex puis
centrifugation), c’est la méthode ASE (Accelerated Solvent Extraction) qui a été choisie car
cette technique permet d’extraire successivement et automatiquement 24 échantillons. Les
extraits obtenus sont ensuite purifiés par SPE en appliquant le protocole mis au point pour
l'extraction de la phase dissoute.
La première partie de l’optimisation a consisté à sélectionner les solvants d’extraction et les

proportions de ces solvants. La présélection des solvants à tester (eau, MeOH, ACN) s’est
faite à partir de données publiées. Les paramètres de température et de pression ont également
été choisis d’après des données publiées en se basant sur les valeurs les plus fréquemment
retrouvées (Schlüsener et al., 2003 ; Göbel et al., 2005 ; Carretero et al., 2008 ; Blasco et al.,
2009 ; Jelic et al., 2009 ; Wu et al., 2009). Au final, deux protocole ont été établis et testés sur
du sédiment dopé avec les composés ciblés. Ils sont présentés dans le Tableau 57 et se
différencient par les solvants et proportions de solvant utilisés. Afin d'évaluer l'impact de la
lyophilisation, ils ont été appliqués sur du sédiment lyophilisé ou non. Dans le but d’extraire
au mieux les tétracyclines, les billes de verre servant à homogénéiser la matrice ont été
enrobées d’EDTA.
Tableau 57 : Protocoles ASE testés pour l'extraction des antibiotiques dans la phase solide des lisiers.
paramètres ASE protocole 1 protocole 2
taille des cellules (mL) 11 11
preheat (min) 5 5
heat (min) 5 5
static (min) 5 5
flush (%) 80 80
purge (sec) 60 60
nombre de cycles 3 3
pression (bar) 100 100
température (°C) 70 70
solvant 50/50 eau/MeOH 30/70 eau/ACN
Les résultats de ce premier test ont conduit à choisir le protocole n°2 mais n'ont pas permis de
trancher sur la nécessité ou non de lyophiliser les échantillons avant extraction. Dans le cas de
l'analyse des hormones (dosages réalisés en parallèle des antibiotiques sur les mêmes
échantillons de lisiers dans le cadre du projet DIPERPHA), il s'avère nécessaire de lyophiliser
les échantillons avant extraction afin de réduire la variabilité de l'analyse. Par extrapolation, la
lyophilisation a été choisie pour le dosage des antibiotiques.
Un deuxième test, réalisé initialement dans le but de valider le protocole ASE, a été pratiqué
en triplicat sur du sédiment lyophilisé puis dopé avec 5 des 7 molécules majoritaires (une
212
molécule par famille d'antibiotiques). Les résultats sont satisfaisants à l'exception de ceux
obtenus pour la marbofloxacine pourtant dosée par étalonnage interne (Figure 74). La
comparaison des rendements d’extraction entre SPE et ASE+SPE pour l’oxytétracycline
montre que les pertes ont d'avantage lieu pendant l’étape de SPE et donc que le protocole
ASE est validé pour ce composé.
Figure 74 : Rendements de quantification (n=3) et d’extraction (SPE et ASE+SPE noté ASE, n=3) pour 5
des 7 molécules majoritaires (lincomycine, marbofloxacine et sulfadiazine quantifiées par étalonnage interne
avec les étalons dans le flacon de récupération, oxytétracycline et monensine quantifiées par étalonnage externe).
Ce protocole a été utilisé pour analyser la phase solide des échantillons de lisier provenant du
suivi des cinétiques de dégradations en condition mésophiles au cours du couplage anaérobie-
aérobie/anoxie. (cf. chapitre 5).
Ultérieurement, dans le but d'améliorer les rendements d'extraction, en particulier ceux de la

marbofloxacine et de l’oxytétracycline, un troisième test a été réalisé au cours duquel le
moment de l'ajout des étalons internes a été évalué. En effet lors des premiers essais, les
étalons étaient ajoutés dans les flacons collecteurs des extraits. Ce dernier test devait
permettre de comparer les rendements d'extraction obtenus quand les étalons internes sont
ajoutés dans les cellules ASE avant extraction avec ceux obtenus quand l'ajout se fait dans les
flacons collecteurs. Les résultats, présentés Figure 75, montrent l’avantage d’ajouter les
étalons internes dans la cellule avant extraction pour obtenir un meilleur dosage, bien que
dans certains cas cela conduise à un surdosage (exemple : marbofloxacine).
Figure 75: Comparaison des rendements d'extraction en fonction du moment où les étalons internes (ei)
sont ajoutés, dans le flacon collecteur des extraits ou dans la cellule ASE.
213
Ce protocole ainsi validé a été appliqué à l’analyse de la phase solide de tous les échantillons
prélevés dans les élevages. Les rendements d’extraction (SPE et ASE+SPE), évalués au
travers d’eau minérale et de sédiments dopés, obtenus au cours de ces différentes séries de
manipulation sont présentés dans le Tableau 58. Ces rendements sont bons, proches de 100%
avec une variabilité faible, à l’exception de la tylosine et de la marbofloxacine qui ont
respectivement des rendements élevés ou variables lors des extractions par ASE. Pour
compenser les rendements élevés de la tylosine, les quantités déterminées dans les
échantillons de lisiers sont divisées par 2. Néanmoins, au vu de ces résultats, les protocoles
d’extraction liquide (SPE) et solide (ASE) sont considérés comme valides et suffisament
robustes.
Tableau 58 : Rendements de quantification (justesse analytique) et d'extraction obtenus lors des

différentes séries d’analyses des échantillons de lisier provenant des élevages.
Quantification SPE ASE

composés
(n=12) (n=14) (n=7)
tylosine 94 ± 10 120 ± 31 213 ± 38
lincomycine 129 ± 5 102 ± 4 107 ± 6
marbofloxacine 95 ± 6 83 ± 9 142 ± 61
tétracycline 102 ± 8 98 ± 11 115 ± 17
oxytétracycline 104 ± 19 110 ± 20 103 ± 18
sulfadiazine 96 ± 3 106 ± 7 113 ± 10
monensine 103 ± 14 65 ± 26 61 ± 26
III.2. Bilan protocole extraction phase solide

Le protocole final résultant de ces différents développements est schématisé Figure 76. Cette
figure permet de visualiser clairement les diverses étapes du protocole.
214
Centrifugation
2 x (20 min, 10 00 rpm, 4°c)
(1ère fois tout l'échantillon, 2ème fois que le surnageant issu de la première centrifugation)
SOLIDE LIQUIDE
Lyophilisation Filtration
GF/A (1,6 µm) puis GF/F (0,7 µm)
0,2 gr de matrice
PARTICULAIRE DISSOUT
ASE Lyophilisation SPE
Cellules 11 ml contaminées
Cartouches OASIS HLB 200 mg, 6 ml
(complétées avec billes enrobées
d'EDTA)
Préparation échantillons
pre-heat : 5 min prise d'essai : 30 ml
heat : 5 min ajuster pH 7
static : 5 min ajout 2,08 ml d'une solution d'EDTA à 0,25 M
pression : 100 bar ajout étalons internes
flush : 80 %
purge : 60 sec Conditionnement cartouche
nombre de cycles : 3 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel pH 7
température : 70°C
solvant : eau milliQ/ACN , 30/70, v/v Dépôt échantillon
rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel pH 7
Séchage
Evaporation Rapidvap 1 h sous vide
60%, 40°C, 300 mbar, 30 min
65%, 40°C, 220 mbar, 40 min Elution
70%, 40°C, 205 mbar, 50 min 5 ml eau/ACN 40/60 v/v (eau Vittel pH 7)
Reconcentration Rapidvap
SPE 80%, 40°C, 150 mbar, 30 min
Cartouches OASIS HLB 200 mg, 6 ml 80%, 40°C, 100 mbar, 30 min
80%, 40°C, 70 mbar, 30 min et +
Préparation échantillons
ajout 30 ml eau Vittel pH 7 reprise résidus : 3 rinçages ACN
ajout 1,25 ml d'une solution d'EDTA à 0,25 M 
baisse du pH (entre 4 et 5)
Reconcentration sous flux d'azote
ajout 250 µL eau/ACN 90/10 v/v (eau milliQ)
Analyse
Injection RRLC/MS/MS
Figure 76 : Protocoles d’extractions de la phase solide d’échantillons de lisiers porcins.
IV. Contrôle qualité et quantification

IV.1. Contrôle qualité
Pour assurer la fiabilité d’un résultat, deux éléments importants sont à vérifier : i) que les
composés détectés proviennent bien de l’échantillon en lui-même et non d’une pollution
apportée au cours du traitement de l’échantillon, et ii) que les composés non détectés sont
bien absents de l’échantillon et non qu’ils aient été perdus au cours du traitement de
l’échantillon. Plus le niveau de contamination est faible et plus il est important de vérifier ces
215
deux paramètres. Ces contrôles qualité appliqués dans le cas d’analyse d’eau souterraine ou
d’eau de boisson ont fait l’objet d’une publication « Trace-level analysis of organic
contaminants in drinking waters and groundwaters » (Capdeville et Budzinski, 2011)
(publication 1).
Pour éviter le premier problème, c'est-à-dire le risque de faux positifs, des « blancs » sont
réalisés en parallèle du traitement de chaque échantillon. Suivant le point de la méthodologie
que l’on veut contrôler (prélèvement, extraction ou analyse), les blancs peuvent être
constitués d’eau, de sédiments ou de solvant organique. Les étalons internes peuvent ou non y
être ajoutés. Dans notre méthodologie, un blanc de manipulation est réalisé en parallèle de
chaque série d’extraction SPE et ASE. Ces blancs sont des cellules ASE ou des cartouches
SPE dans lesquels aucun échantillon n’est déposé mais qui subissent l’ensemble du protocole
d’extraction/reconcentration. Ils servent à évaluer la pollution potentiellement apportée par les
solvants, les réactifs, la verrerie, l’atmosphère de travail, le matériel utilisé, le manipulateur.
Ces blancs de manipulation contiennent les étalons internes sauf quand la pollution est
amenée par les impuretés de ces étalons internes. Les quantités de composés détectés dans les
blancs sont retranchées aux quantités mesurées dans les échantillons. De plus des blancs dits
« blancs d’injection » sont insérés régulièrement dans les séquences d’analyse afin de
contrôler que le système analytique n’est pas responsable d’une pollution de l’échantillon.
Cette pollution peut provenir des phases mobiles, du système d’injection ou de la colonne si
ces derniers ne sont pas correctement rincés entre 2 analyses successives.
Pour évaluer les pertes de composés, des « dopages » sont réalisés en parallèle de chaque
série d’analyse. Ces dopages sont des matrices de constitution proche de celle des échantillons
et dépourvues des composés recherchés. Elles sont enrichies avec les composés d’intérêt.
Pour cela, une quantité connue de composés est ajoutée au début du traitement. Dans nos
méthodologies, de l’eau minérale naturelle (Vittel) et du sédiment vaseux prélevé dans le
bassin d’Arcachon, lyophilisé, sont utilisés respectivement comme matrices en parallèle des
extractions SPE et ASE. Une fois enrichis, ces échantillons subissent l’ensemble des
protocoles d’extraction, reconcentration et analyse. Les taux de récupérations sont ensuite
évalués par comparaison entre les quantités calculées et les quantités théoriques. Ils doivent
être proches de 100 %. Pour compenser le problème des pertes lorsque la quantification est
réalisée par étalonnage externe, les rendements calculés pour le dopage sont appliqués pour
corriger les quantités déterminées dans les échantillons environnementaux. Ceci est vrai en
partant du principe que le dopage mime parfaitement l’échantillon, mais dans le cas où des
effets matriciels interviendraient, comme ils sont échantillon-dépendants, un biais demeure.
L’étalonnage interne prend ici l’avantage sur l’étalonnage externe car les étalons internes
ayant le même comportement que les composés qu’ils servent à doser, les pertes et les effets
matriciels seront identiques et les pertes des uns compenseront celles des autres au moment du
calcul de quantification.
IV.2. Méthodes de quantification
Il existe 2 façons de déterminer la quantité de composé présente dans un échantillon. Soit

l'intensité de la réponse analytique d'un composé de l'échantillon est comparée avec celle de
ce même composé dans une solution étalon, dont la concentration en ce composé est connue.
C'est l'étalonnage externe. Soit l'intensité de la réponse analytique d'un composé de
l'échantillon est comparée avec celle d'un autre composé, appelé étalon interne et ajouté
216
volontairement en quantité connue dans ce même échantillon. C'est l'étalonnage interne. Les
deux modes de quantification sont détaillés dans les paragraphes suivants.
IV.2.1. Etalonnage externe
La réalisation d'une gamme d'étalonnage est la technique communément employée pour

quantifier les échantillons par étalonnage externe. La gamme est effectuée à partir de la
dilution en série d'une solution de référence contenant en quantité connue l'ensemble des
composés recherchés. Les différents points de la gamme sont ensuite injectés et un graphique
: "intensité de la réponse en fonction de la quantité injectée" peut être tracé pour chaque
composé. Si la réponse est linéaire sur l'ensemble des points, une droite est ainsi obtenue. A
partir de la réponse analytique du composé et l'équation de cette droite, la quantité de
composé, dans l'échantillon que l'on cherche à doser, peut être déterminée. Au cours de ces
travaux de thèse, les gammes étaient constituées de 6 points correspondant à des quantités
injectées allant d'environ 30 à 1 200 picogrammes injectés. La linéarité pouvait être évaluée
soit par l'intermédiaire du coefficient de corrélation, avec R²  0,999, soit par l'intermédiaire
du ratio "intensité de la réponse / quantité injectée" qui doit toujours donner une même valeur
pour une même molécule. Dans le cas où la réponse n'était pas linéaire sur la totalité de la
gamme (6 points) des gammes plus petites de 3 points étaient utilisées. C'est ce qui est appelé
la technique des "brackets".
Afin de vérifier la justesse de la méthode d’étalonnage externe, une gamme plus petite de 3
points était préparée en parallèle. Cette deuxième gamme était effectuée à partir de la dilution
en série d'une autre solution de référence contenant en quantité connue l'ensemble des
composés recherchés. Les dosages de ces 3 échantillons étaient ensuite réalisés et les
quantités déterminées étaient alors comparées avec les quantités théoriques. Les rendements
de quantification ainsi obtenus devaient être proches de 100%. Dans certain cas, la justesse
était préférée à la linéarité. Dans ces cas-là, quand la linéarité sur l'ensemble des 6 points de la
gamme était bonne mais que les rendements de quantification étaient meilleurs en utilisant la
technique des "brackets", les échantillons environnementaux ont été quantifiés par la
technique des "brackets" et non avec la totalité de la gamme.
IV.2.2. Etalonnage interne
L’étalonnage interne repose sur la possibilité de quantifier un composé dans un échantillon à

partir d’un autre composé, l’étalon interne, ajouté en quantité connue au début du traitement
de l’échantillon. Pour que cette technique fonctionne correctement, il faut que le composé et
son étalon interne se comportent de la même façon aussi bien au moment de l'extraction (ex. :
adsorption, rétention et élution identique sur la phase des cartouches SPE) que de
l'évaporation (ex. : dégradation, volatilité, etc.) ou encore de l'analyse chromatographique
(ex. : même temps de rétention). Pour cela, il faut que leurs propriétés physico-chimiques
soient similaires. De plus, l’étalon interne ne doit pas être initialement présent dans
l’échantillon à doser de façon à ce que sa quantité corresponde uniquement à ce qui a été
ajouté et qu’elle soit ainsi parfaitement connue. Pour satisfaire ces conditions, dans l’idéal,
l’étalon interne est un analogue isotopique du composé étudié. Les hydrogènes, les 12C ou les
14
N du composé étudié sont remplacés respectivement par des deutériums, des 13C ou des 15N
sur l’étalon interne. Cependant,il n’existe pas d’analogues isotopiques pour tous les composés
étudiés et quand ils existent, ces composés sont très onéreux. Ainsi, pour des raisons pratiques
217
ou de coût, un même étalon interne peut être utilisé pour différents composés appartenant à
une même classe ou famille et possédant des propriétés physico-chimiques proches.
Une fois l’étalon interne adéquate sélectionné pour chaque composé, il faut déterminer la
valeur du facteur de réponse, K, de chaque composé par rapport à son propre étalon interne.
Cela est réalisé à partir de l'injection d'une solution étalon de concentration connue contenant
l'ensemble des composés et des étalons internes. La formule (1), basée sur le principe que la
réponse analytique d'un composé est proportionnelle à la quantité injectée à un facteur de
réponse près (k), est ensuite appliquée.
K facteur de réponse du composé C par rapport à l’étalon interne ei

Aei la réponse analytique de l'étalon interne ei en aire
kei Aei. Qc Qei la quantité injectée de l'étalon interne ei
K  (1) avec kei le facteur de réponse de l'étalon interne ei
kc Ac. Qei Ac la réponse analytique du composé C en aire
Qc la quantité de composé C injectée
kc le facteur de réponse du composé C
Si le composé et son étalon interne se comportent de la même façon, le facteur K est proche
de 1. Pour vérifier l'adéquation entre le composé et son étalon interne, les rendements de
quantification ou d'extraction des étalons internes peuvent être quantifiés par étalonnage
externe. Une fois K défini, dans un échantillon environnemental auquel on a ajouté l'étalon
interne ei, la quantité du composé C peut alors être déterminée d'après :
K facteur de réponse du composé C par rapport à l’étalon interne ei

Ac Aei la réponse analytique de l'étalon interne ei en aire
Qc  K . Qei . (2) avec Qei la quantité injectée de l'étalon interne ei
Aei Ac la réponse analytique du composé C en aire
Qc la quantité de composé C injectée
Pour vérifier la justesse de cette technique, une deuxième solution étalon de concentration
connue, indépendante de la première, et contenant également l'ensemble des composés et des
étalons internes doit être injectée. Elle est ensuite dosée comme un échantillon
environnemental. La quantité calculée est alors comparée avec la quantité théorique. Le
rendement de quantification doit être proche de 100 %.
Le mode de quantification adopté pour chacun des composés étudiés est présenté dans le
Tableau 59. Pour certains composés comme l’ofloxacine par exemple, la quantification par
étalonnage interne donne des résultats identiques à la quantification par étalonnage externe
lorsque le protocle est appliqué à des échantillons d’eau minérale dopés. En revanche, pour
certaines molécules comme l’érythromycine, un facteur qui n’a pu être identifié est
responsable, dans certaines séries d’extraction, de la chute des rendements lorsque la
quantification est faite par étalonnage externe. L’ajout de l’étalon interne (érythromycine-
13
C2) a permis de corriger ce problème et de rendre l’analyse fiable et reproductible. De
même, les faibles rendements de l’aténolol, lorsqu’elle est quantitifée par étalonnage externe,
en raison de son volume de fuite, sont corrigés lorsque le dosage est réalisé par étalonnage
interne (Tableau 60).
218
Tableau 59 : Mode de quantification de chacun des composés étudiés.

mode d'étalonnage mode d'étalonnage
composé composé
(étalon interne) (étalon interne)
amoxicilline interne (amoxicilline-13C6) sulfanilamide interne (sulfaméthazine-13C6)
ampicilline interne (ampicilline–15N) sulfapyridine interne (sulfadiméthoxine-d6)
pénicilline G interne (pénicilline G-d7) sulfathiazole interne (sulfaméthazine-13C6)
pénicilline V interne (pénicilline G-d7) triméthoprime interne (triméthoprime-13C3)
oxacilline interne (pénicilline G-d7) chloramphénicol interne (chloramphénicol -d5)
cloxacilline interne (pénicilline G-d7) thiamphénicol interne (chloramphénicol -d5)
dicloxacilline interne (pénicilline G-d7) métronidazole externe
céfalexine externe monensine externe
céfotaxime externe salinomycine externe
cefpodoxime externe bacitracine externe
ceftiofur externe virginiamycine externe
céfuroxime interne (pénicilline G-d7) rifampicine externe
azithromycine interne (clarithromycine -d3) acide fusidique externe
clarithromycine interne (clarithromycine -d3) aténolol interne (aténolol-d7)
érythromycine interne (érythromycine-13C2) bisoprolol interne (propranolol-d7)
josamycine interne (clarithromycine -d3) métoprolol interne (propranolol-d7)
roxithromycine interne (clarithromycine -d3) propranolol interne (propranolol-d7)
spiramycine externe sotalol interne (propranolol-d7)
tylosine interne (clarithromycine -d3) timolol interne (propranolol-d7)
lincomycine interne (lincomycine -d3) 5-fluorouracil interne (5-fluorouracil-15N)
clindamycine interne (lincomycine -d3) cyclophosphamide externe et interne
(propranolol-d7)
ciprofloxacine interne (ciprofloxacine-13C2-15N) daunorubicine externe
enrofloxacine externe docétaxel externe
marbofloxacine interne (ofloxacine-d3) doxorubicine externe
norfloxacine interne (norfloxacine-d5) épirubicine externe
ofloxacine interne (ofloxacine-d3) gemcitabine externe
acide oxolinique externe ifosfamide externe et interne
(propranolol-d7)
acide pipémidique externe méthotréxate externe
fluméquine externe tamoxifen interne (tamoxifen-d5)
tétracycline interne (tétracycline-d6) abacavir externe
oxytétracycline externe et interne indinavir externe
(tétracycline-d6)
chlortétracycline externe lamivudine externe
doxycycline externe et interne nelfinavir externe
(tétracycline-d6)
sulfadiazine interne (sulfadiazine -13C6) névirapine externe
sulfadiméthoxine interne (sulfadiméthoxine-d6) ritonavir externe
sulfamérazine interne (sulfaméthazine-13C6) saquinavir externe
sulfaméthazine interne (sulfaméthazine-13C6) stavudine externe
sulfaméthizole interne (sulfaméthoxazole-13C6) zidovudine externe
sulfaméthoxazole interne (sulfaméthoxazole-13C6) sildénafil interne (sildénafil-d3)
Tableau 60 : Exemple de rendements de manipulation (extraction + analyse) obtenus pour 3 molécules

différentes au cours d’une même expérience en fonction du mode d’étalonnage utilisé.
rendements (%) érythromycine ofloxacine aténolol
étalonnage interne 106 93 105
étalonnage externe 40 90 22
219
220
CHAPITRE 5
Applications
environnementales
221
222
Chapitre 5 : Applications environnementales
I. APPLICATION AUX MATRICES « EAUX » .......................................................................................... 224

I.1. Tests d’applicabilité des protocoles ........................................................................................ 224
I.2. Continuum Hérault : STEP – surface - captage ....................................................................... 227
I.2.1. Résultats de la campagne estivale .................................................................................................... 227
I.2.2. Résultats de la campagne hivernale ................................................................................................. 230
I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats............................................................................................. 232
I.3. Projet FLASH ........................................................................................................................ 238
I.3.1. Continuum hospitalier ..................................................................................................................... 239
I.3.1.2 Etudes des autres classes thérapeutiques ....................................................................................... 242
I.3.2. Continuum agricole ......................................................................................................................... 247
I.3.2.2 Etude des autres classes thérapeutiques ........................................................................................ 248
I.4. Conclusion sur la contamination des eaux ............................................................................... 250
II. APPLICATION AUX MATRICES « LISIERS »....................................................................................... 253
II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier .................................................................. 253
II.2. Conditionnement des échantillons .......................................................................................... 254
II.3. Origine de la contamination du lisier stocké ............................................................................ 256
II.3.1. Origine du lisier brut et niveau de contamination ............................................................................ 257
II.3.2. Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers bruts ............................................. 257
II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et de l’élevage considéré ............. 259
II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier ............................................. 259
II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier ..................................................................................... 260
II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier ..................................................................................... 264
II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées.................................................................. 266
II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique ................................................ 266
II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique .................................................................... 267
II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie ............................................................................ 268
II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques ............................................................................................... 269
II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers ............................................................................. 270
Le deuxième objectif de ces travaux de thèse était d’utiliser les méthodologies développées
pour des analyses environnementales. Dans un premier temps, il était nécessaire de vérifier
l’applicabilité des protocoles. Ainsi, le premier protocole multi-résidus, celui développé pour
l’analyse de 32 molécules pharmaceutiques (nommé « multi-résidus 32 »), a été testé sur une
dizaine d’effluents de station d’épuration. De la même façon, ultérieurement, le protocole
spécifique au dosage de l’amoxicilline et de l’ampicilline a été testé sur des eaux usées brutes
et traitées, respectivement en entrée et sortie de STEP. Une fois leur applicabilité confirmée,
les méthodologies, optimisées pour des analyses d’eau, ont été employées pour des suivis
environnementaux dans les cadres du projet « continuum Hérault » et dans le cadre du projet
FLASH. En parallèle, le protocole développé pour l’analyse des antibiotiques dans les lisiers
porcins a été utilisé dans un premier temps pour déterminer les meilleures modalités de
conditionnement des échantillons entre le prélèvement et l’analyse. Une fois le protocole
d’extraction de la phase solide développé et les conditions de stockage définies, 3 thèmes ont
été étudiés : l’origine de la contamination des lisiers en fonction du stade physiologique des
cochons, le devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier (stockage simple
ou filières complexes de traitement) et le devenir des antibiotiques en conditions contrôlées.
Les valeurs brutes des résultats présentés dans ce chapitre sont récapitulées dans l’annexe 7.
223
I. Application aux matrices « eaux »
I.1. Tests d’applicabilité des protocoles
Les effluents de STEP ont été choisis pour tester l’applicabilité des protocoles en raison de
leurs contaminations par les molécules pharmaceutiques, de la facilité d’accès à leurs sites de
prélèvement et de leurs faibles charges en matière organique (cf. Chapitre 3). Ainsi, 10
échantillons provenant d’effluents de 9 STEP mettant en œuvre des procédés de traitement
différents (cf. descriptif dans le chapitre 3, II.1. Eaux usées et autres échantillons d’eau),
prélevés dans le cadre du projet AMPERES, ont fait l’objet d’analyse en utilisant le protocole
« multi-résidus 32 ». En plus de vérifier l’applicabilité du protocole, ces tests devaient
permettre d’estimer les niveaux de contamination des composés sélectionnés, en particulier
des anti-VIH pour lesquels aucune donnée sur leur niveau de contamination en France n’a été
publiée à notre connaissance. Les résultats de ce screening sont présentés Figure 77. A titre
d’information, les dosages de cette première étude ont été quantifiés par étalonnage externe.
concentration (ng/L) en antibiotiques, b-bloquants et anti-rétroviraux dans diverses échantillons d'effluents de STEP
concentration (ng/L) en antibiotiques, b-bloquants et anti-rétroviraux dans diverses échantillons d'effluents de STEP
clarithromycine érythromycine roxithromycine lincomycine ciprofloxacine ofloxacine

clarithromycine érythromycine roxithromycine lincomycine ciprofloxacine ofloxacine
acide oxolinique fluméquine
acide oxolinique
tétracycline
fluméquine tétracycline
oxytétracycline
oxytétracycline
doxycycline
doxycycline
sulfaméthoxazole
sulfaméthoxazole
triméthoprime métoprolol
triméthoprime métoprololpropranolol
propranolol ritonavir
ritonavir zidovudine
zidovudine
2 500 2 500
2 000
2 000
concentrations (ng/l)
1 500
1 500
1 000
1 000 500
0
500 CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 - 1 CA 6 - 2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9
STEP
Figure 77 : Niveau de contamination et concentrations individuelles en antibiotiques, -bloquants et anti-
VIH dans 10 effluents de STEP.
(traitements appliqués dans les STEP (détails cf. chapitre 3 II.1. Eaux usées et autres échantillons d'eau) :
0 CAPA1 = boues activées + filtres à sable + ozone, SEPA1 = boues activées + décantation rapide + filtres à sable,
CA PASEPA2
1 SE PA 1 activées
= boues SE PA 2
+ filtres à CA 5 + microfiltration
sable CA 6 - 1 + CA 6 - 2 inverse,
osmose SECA5
4 = décantation
SE 5 SE 6+ filtre SE 9
primaire
biologique immergé aéré, CA6-1 = pré-traitement STEP + filtre planté de roseaux horizontal tertiaire, CA6-2 = pré-
traitement + filtre planté de roseaux horizontal conventionel, SE4 = pré-traitement + boues activées, SE5 = pré-
traitement + bioréacteur à membrane, SE6 = pré-traitement + décantation primaire + filtre biologique immergé
aéré, SE9 = lit bactérien + filtre planté de roseaux)
Au cours de l’étude de ces 10 effluents de STEP, les molécules les plus souvent retrouvées
ont été la clarithromycine et l’érythromycine, identifiées dans 100 % des échantillons, ainsi
224
que l’ofloxacine, le triméthoprime et le propranolol, identifiés dans 9 échantillons sur 10. La

roxithromycine, le sulfaméthoxazole, le métoprolol, le ritonavir, la ciprofloxacine et la
zidovudine ont également été fréquemment détectés. Ils ont été retrouvés dans plus de 50 %
des échantillons. Du point de vue quantitatif, les molécules les plus abondantes sont
l’ofloxacine, la clarithromycine, la ciprofloxacine et la roxithromycine avec respectivement
des concentrations maximales de 1077, 992, 542 et 402 ng/L. En conséquence, les
antibiotiques de la famille des macrolides et des fluoroquinolones sont à la fois les plus
fréquents et les plus abondants. Enfin, les deux anti-VIH ont été détectés dans 60 % et 80 %
des échantillons avec des concentrations maximales atteignant 142 et 134 ng/L pour la
zidovudine et le ritonavir respectivement.
Tableau 61 : Liste des 32 molécules pharmaceutiques recherchées au cours de cette première étude et
leurs résultats d'analyse (concentration ng/L) en comparaison avec d'autres études françaises ayant
recherchées et retrouvées, ou non, ces mêmes molécules dans dans des rejets de STEP (cases blanches :
composés non recherchés, n.d : composés recherchés mais non détectés, valeurs : concentrations mesurées
en ng/L pour les composés détectés).
AFSSA Andreozzi Coestier et Gabet-Giraud Piram et
composés cette étude Mullot, 2009
2009 et al., 2003 al., 2009 et al., 2010 al., 2008
amoxicilline n.d
ampicilline n.d
pénicilline G n.d
pénicilline V n.d
oxacilline n.d
cefpodoxime n.d
ceftiofur n.d
clarithromycine 21 - 992
érythromycine 17 - 182 109 - 562
roxithromycine 16 - 402
lincomycine 63 n.d
ciprofloxacine 122 - 542 60 600 < cip < 1700
ofloxacine 66 - 1077 330 - 510
acide oxolinique 1 n.d
fluméquine 1-8 n.d
tétracycline 21 - 96
chlortétracycline n.d
oxytétracycline 40
doxycycline 12 - 71
sulfaméthazine n.d n.d
sulfaméthoxazole 2 - 84 150 - 189 70 - 90 100 - 900
triméthoprime 1 - 73 43 - 99 20 - 40
chloramphénicol n.d
métoprolol 3 - 168 29 - 190 80 16 - 435 1
propranolol 5 - 80 186 - 450 10 - 40 160 - 560 3 - 398 2
cyclophosphamide n.d n.d 300
ifosfamide n.d n.d 4 n.d
daunorubicine n.d
doxorubicine n.d
épirubicine n.d
ritonavir 6 - 134
zidovudine 15 - 142
Il ressort donc de ce screening que 13 des 23 antibiotiques sélectionnés et que les 2 -

bloquants et les 2 anti-VIH ont été dosés dans les effluents de STEP. La capacité à identifier
et à quantifier des composés à des concentrations proches de celles rapportées dans d’autres
études françaises a prouvé que le protocole développé était applicable (Tableau 61). Par
exemple, dans cette étude l’érythromycine, un antibiotique, a été détectée dans tous les rejets
à des concentrations variant entre 17 et 182 ng/L. Dans son rapport sur les résidus de
225
médicaments dans les eaux de bassins versant français, l’AFSSA (2009) a également identifié
cette molécule dans des rejets de STEP à des concentrations légèrement plus fortes, variant
entre 109 et 562 ng/L. De même, le métoprolol, un -bloquant, a été détecté dans 8 des 10
effluents de STEP analysés au cours de cette étude à des concentrations variants entre 3 et 168
ng/L et l’AFSSA (2009) l’a dosé à des concentrations similaires variant entre 29 et 190 ng/L.
Gabet-Giraud et al. (2010) l’ont également retrouvé dans ces mêmes rejets de STEP et dans
d’autres rejets de STEP à des concentrations similaires variant entre 16 et 435 ng/L (moyenne
156 ng/L). De plus, le sulfaméthoxazole, un antibiotique, et le propranolol, un -bloquant, ont
été retrouvés à chaque fois dans les autres études de rejets de STEP françaises où ils ont été
recherchés et les concentrations aux quelles ils ont été mesurés sont du même ordre de
grandeur. En revanche, aucun des 5 anticancéreux recherchés (cyclophosphamide, ifosfamide,
daunorubicine, doxorubicine, épirubicine) n’a été détecté au cours de cette étude alors que
Mullot (2009) a dosé du cyclophosphamide dans un rejet de STEP français, recevant des
effluents hospitaliers, à une concentration de 300 ng/L et Coestier et al. (2009) ont détecté de
l’ifosfamide dans un rejet de STEP français, recevant aussi des effluents hospitaliers, à une
valeur médiane de 4 ng/L. Les résultats d’analyse d’autres rejets de STEP européens,
canadiens, nord-américains ou australiens sont présentés dans la partie V.3. Les eaux traitées
(effluent / sortie de STEP) du chapitre 1 et dans l’Annexe - tableau 4. Ainsi, par exemple, la
zidovudine, un anti-VIH, a été quantifiée dans 6 des 10 rejets de STEP analysés au cours de
cette étude à des concentrations variant entre 15 et 142 ng/L et Prasse et al. (2010) l’ont dosé
en Allemagne à des concentrations du même ordre de grandeur (98 - 564 ng/L).
Pour compléter cette étude, en utilisant la valeur des débits de chacune des STEP (cf. Tableau
39), les flux des 17 molécules détectées ont pu être calculés (Tableau 62). Les STEP qui ont
les plus gros débits sont celles qui émettent les plus gros flux de médicaments (Figure 78).
Les 3 STEP qui rejettent journalièrement le plus de médicaments sont par ordre décroissant
SE-PA 1, SE 4 et CA 5 avec des flux totaux de 59, 22 et 16 g/j respectivement. Les molécules
les plus rejetées avec des flux souvent supérieurs au g/j sont l’ofloxacine (max. : 30,8 g/j SE-
PA 1), la cicprofloxacine (max. : 15,5 g/j SE-PA 1) et la clarithromycine (max. : 5,6 g/j CA
5). En plus de ces 3 antibiotiques, l’érythromycine et le triméthoprime, 2 autres antibiotiques,
mais aussi le propranolol, un -bloquant, et le ritonavir, un anti-VIH, peuvent également être
rejetés à des fortes quantités pouvant atteindre un ou plusieurs g/j (Tableau 62).
70 000 35 000
60 000 30 000
50 000 25 000
flux (mg/j)
débits (m3 /j)
40 000 20 000
30 000 15 000
20 000 10 000
10 000 5 000
0 0
CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 - 1 CA 6 - 2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9
STEP
Figure 78 : Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP et
débits, en m3/j (courbe), des STEP.
226
Tableau 62 : Flux de molécules pharmaceutiques en sorties de STEP exprimés en mg/j.

composés CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 - 1 CA 6 - 2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9
clarithromycine 87 2 517 140 5 657 13 15 2 893 342 2 096 6
érythromycine 70 3 001 85 1 303 0,3 0,5 1 289 154 343 2
roxithromycine 66 895 4 6 759 94 411 5
ciprofloxacine 15 510 1 398 3 851 183 1 103 24
ofloxacine 30 795 202 3 813 1 1 7 335 336 722 31
lincomycine 916
acide oxolinique 0,01 0,01
fluméquine 56 37 6 8 0,2
tétracycline 687 302
oxytétracycline 586
doxycycline 417 167 10
sulfaméthoxazole 516 2 116 0,2 469 75 331 0,3
triméthoprime 1 403 1 183 0,02 0,01 1 057 5 109 1,5
métoprolol 14 392 21 756 1 053 28 189 23
propranolol 588 5 541 0,2 0,1 1 051 120 244 3
ritonavir 26 3 822 30 457 358 64 212 2
zidovudine 622 17 109 341 213 151
Ultérieurement, au cours d’une autre étude, afin de vérifier l’applicabilité du protocole

développé spécifiquement pour le dosage de l’amoxicilline et de l’ampicilline, des eaux usées
brutes et traitées prélevées respectivement en entrée et sortie de STEP ont été analysées.
L'amoxicilline n'a été identifiée dans aucun des échantillons (MDL = 40 ng/L). L'ampicilline
a été détectée dans tous les échantillons mais à des valeurs inférieures à la limite de
quantification (< 35 ng/L). Les échantillons qui ont servi de tests ont été prélevés en été donc
à une période où ces molécules pharmaceutiques ne sont pratiquement pas consommées. Afin
de conclure de manière définitive sur l’absence ou la dégradation de ces pénicillines, il sera
nécessaire de renouveler ces analyses sur des échantillons prélevés en hiver quand l'utilisation
des antibiotiques est maximale.
I.2. Continuum Hérault : STEP – surface - captage
Une fois validé et applicable, le protocole « multi-résidus 32 » a été utilisé pour l’étude de
quatre stations d’épuration, de deux rivières impactées par ces rejets de STEP et d’eaux de
captage. Les résultats des échantillons prélevés en été sont présentés dans la Figure 79 et ceux
des échantillons prélevés en hiver dans la Figure 81. A titre informatif, aux cours de ces 2
campagnes, des premiers tests de quantitifaction par étalonnage interne ont été réalisés avec
l’ajout de 4 étalons internes dans les échantillons. Cependant les résulats présentés ci-après
sont issus de calcul par étalonnage externe car l’étalonnage interne n’a pu être appliqué en
raison de différences trop fortes entre les concentrations des étalons internes et celles des
composés à dosés (problème de linérarité des réponses).
I.2.1. Résultats de la campagne estivale
En été, à l’exception de la STEP B, plusieurs molécules ont été retrouvées dans toutes les
stations : 3 macrolides (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine), 2 fluoroquinolones
(ciprofloxacine et ofloxacine), 1 tétracycline (doxycycline), 2 sulfonamides
(sulfaméthoxazole, triméthoprime) et 2 -bloquants. A l’exception de la doxycycline, ce sont
les mêmes molécules majoritaires que celles détectées dans l’étude des 10 effluents de STEP
présentée dans le paragraphe I.1. Dans leur review, Miège et al. (2009) listent les classes
227
thérapeutiques les plus étudiées mais aussi les molécules les plus souvent analysées (Tableau
23). Au sein des antibiotiques, parmi les 8 composés indiqués précédement, 6 sont communs
avec la liste de Miège et al. (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine, ciprofloxacine,
sulfaméthoxazole et triméthoprime). En revanche, l’ofloxacine et la doxycyline n’apparaissent
pas dans cette liste mais elles ont toutes les 2 été régulièrement dosées dans des eaux usées en
entrée ou en sortie de STEP (Andreozzi et al., 2003 ; Zuccato et al., 2005 ; Vieno et al.,
2006 ; Thomas et al., 2007 ; Gros et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009). Parmi les composés
majoritairement retrouvés,les 2 -bloquants, le métoprolol et le propranolol, apparaissent
aussi dans la liste de Miège et al. (2009). L’anti-VIH ritonavir a été dosé dans les 2 plus
grosses stations (STEP L 13 300 éq. hab. et STEP CL 22 200 éq. hab.) qui, de plus,
perçoivent des effluents hospitaliers. Les sulfonamides et les anti-VIH n’ont pas été identifiés
dans la STEP B mais comme dans les autres STEP, les -bloquants et les macrolides y ont été
détectés.
7000
zidovudine
6000
7 000 ritonavir
5000 propranolol
6 000
7000 metoprolol
4000 5 000 zidovudine
triméthoprime
6000
ritonavir
3000 4 000 sulfaméthoxazole
5000 propranolol
doxycycline
2000 3 000 metoprolol
4000 tétracycline
triméthoprime
2 000
1000 3000 ofloxacine
sulfaméthoxazole
1 000 doxycycline
ciprofloxacine
2000
0 900 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entréetétracycline
sortie
roxithromycine
entrée
entrée
entrée
entrée
sortie
sortie
sortie
sortie
1000
800 ofloxacine clarithromycine roxithromycine
L CL P Bérythromycine
ciprofloxacine ofloxacine fluméquine
700
0
600 clarithromycine
roxithromycine 80 sulfaméthoxazole daunorubicine
entrée
entrée
entrée
entrée
sortie
sortie
sortie
sortie
L 500 CL P B érythromycine ritonavir

400 clarithromycine 60
300 L CL P B
40
200
100 20
0
0
entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie
amont aval amont aval P1 B1
L CL P B
rivière L rivière H captage
Figure 79 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4
stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de
captage souterraines en été.
Dans certains cas, la contamination totale est apparue plus importante en sortie de STEP
qu’en entrée (STEP L et STEP B). De même, certaines molécules ont été dosées à des
concentrations plus fortes en sortie qu’en entrée (exemples : érythromycine STEP P ou
ofloxacine et propranolol STEP L). Gros et al. (2006) rapportent aussi des concentrations en
propranolol plus fortes en sortie de STEP (entre 100 et 470 ng/L) qu’en entrée (entre 80 et
290 ng/L). Ces mesures de concentrations plus élevées en sortie pourraient être dues aux
problèmes d’effet matriciel qui provoquent des diminutions de signal dans des matrices très
chargées comme les entrées de STEP. Le signal étant diminué en entrée, la contamination
semble plus forte en sortie. Cette hypothèse est corroborée par les rendements d’extraction et
d’analyse calculés sur les étalons internes. Ainsi par exemple, les rendements calculés pour
l’étalon interne de l’érythromycine, l’érythromycine-13C2, sont de 1 ± 0,8 % en entrée de
STEP et de 59 ± 37 % en sortie de STEP. Pour contourner ces problèmes d’effet matriciel,
228
Gomez et al. (2006) suggèrent par exemple de diluer les échantillons avant de les analyser (cf.
chapitre 3 partie I.4 Techniques analytiques). Une autre hypothèse, pour expliquer les
concentrations plus fortes en sortie qu’en entrée, concerne la déconjugaison des molécules.
Certaines molécules, comme le propranolol par exemple, sont excrétées sous forme conjuguée
(dictionnaire Vidal, 2006) et ne sont donc pas dosées dans les eaux en entrée de STEP. Les
traitements appliqués dans les STEP peuvent provoquer la déconjugaison des molécules qui
se retrouvent alors sous forme libre et donc analysable dans les effluents de sortie. Cela a été
proposé par Vieno et al. (2006) pour expliquer des concentrations en carbamazépine plus
forte en sortie qu’en entrée de STEP par exemple. Enfin, une dernière hypothèse provient des
mesures effectuées sur des prélèvements ponctuels combinés à une élimination faible ou nulle
des composés dans les STEP comme c’est par exemple le cas pour l’érythromycine ou le
propranolol. En effet, Castiglioni et al. (2006) et Kasprzyk-Hordern et al. (2009) ont montré
que l’érythromycine n’était pas ou que faiblement (50 %) dégradé dans les STEP et Bendez et
al. (2005), Kasprzyk-Hordern et al. (2009) et Gabet-Giraud et al. (2010) ont montré que le
propranolol n’était que faiblement dégradée (22 - 32 %) dans des STEP mettant en œuvre des
procédés de traitement par boues activées comme c’est le cas des STEP L et P.
L’analyse des eaux de surface a clairement mis en évidence l’impact des rejets de STEP sur la
contamination du milieu, d’une part car la concentration totale en aval est supérieure à celle
en amont, respectivement 5 et 60 ng/L dans la rivière L et 0 et 23 ng/L dans la rivière H ; et
d’autre part car ce sont les mêmes molécules qui ont été dosées dans les eaux de surface et
dans les rejets de STEP (exemple : ritonavir) (Figure 79). Bendz et al. (2005) en Suède,
Castiglioni et al. (2006) en Italie ou encore Gabet-Giraud en France dans sa thèse (2009)
mettent aussi en évidence l’impact des rejets de STEP sur la contamination des eaux de
surface avec des concentrations mesurées en aval des rejets nettement supérieures à celles
mesurées en amont. En se focalisant sur 5 molécules représentant chacune les familles
d’antibiotiques ou classes thérapeutiques majoritaires détectées (érythromycine pour les
marcolides, ofloxacine pour les fluoroquinolones, sulfaméthoxazole pour les sulfonamides,
propranolol pour les -bloquants et ritonavir pour les anti-VIH), la Figure 80 appuie et illustre
ces conclusions. Par ailleurs, elle permet de préciser : i) que ce sont les 2 plus grosses STEP
(STEP L et STEP CL) qui sont responsables de la contamination de la rivière L, et ii) que
c’est la rivière L qui contamine la rivière H. En effet, dans le premier cas, le sulfaméthoxazole
et le ritonavir ne sont pas présents ni en amont de la rivière L ni dans le rejet de la STEP B
mais uniquement dans les rejets des STEP L et CL or ils sont détectés dans la rivière L en
aval de ces rejets. Dans le deuxième cas, le ritonavir n’est pas présent ni en amont de la
rivière H ni dans le rejet de la STEP P mais il est détecté dans la rivière L et dans la rivière H
en aval de la confluence de ces 2 rivières. Et à l’inverse, l’érythromycine, détectée dans le
rejet de la STEP P, n’est pas retrouvée en aval dans la rivière H.
Le sulfaméthoxazole est la seule molécule qui a été dosée dans les eaux de captage (B1).
Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat, d’une part le sulfaméthoxazole est une
molécule particulièrement résistante (Avisar et al., 2009), elle peut donc provenir des eaux de
la rivière L qui alimente en partie la nappe souterraine (Figure 80), et d’autre part l’analyser
est une chose relativement aisée et fiable, d’autres molécules auraient donc pu potentiellement
être présentes mais n’ont pas été détectées. C’est certainement pour ces mêmes raisons que le
sulfaméthoxazole a également été identifié dans des eaux souterraines par Sacher et al. (2001)
en Allemagne, par Barnes et al. (2008) aux USA et par Avisar et al. (2009) en Israël ou dans
des eaux de boisson par Chen et al. (2006) au Canada, Ye et al. (2007) aux USA et Vulliet et
al. (2009) en France.
229
été été
ritonavir
450 été 2 200
propranolol
400
450
concnetration (ng/l)
350 sulfaméthoxazole 2 000
400
300 ofloxacine
250
350 été érythromycine
1 800 été
ritonavir ritonavir
200
450 450
300
150 propranolol 1 600 propranolol
400 400
100
250
350 sulfaméthoxazole sulfaméthoxazole
1350
400
30050
200 ofloxacine 300 ofloxacine
250 0
100 érythromycine 1250
200 érythromycine
150 amont sortie sortie sortie aval captage
200
90 20050
150 rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1
100
80 1150
000
100 10040
50
70
50 50
600 030
50
amont sortie sortie sortie aval captage amont sortie sortie sortie aval captage
40 rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1 20 rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1
30
20 10
10
0 0
amont sortie sortie sortie aval captage amont aval sortie aval captage
rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1 rivière H rivière L STEP P rivière H P1
Figure 80 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées
le long du continuum Hérault en été.
I.2.2. Résultats de la campagne hivernale
Au cours des analyses des échantillons prélevés en hiver, l’amoxicilline a été détectée dans
tous les échantillons d’eaux usées en entrée et en sortie des 4 STEP à l’exception des eaux
usées brutes en entrée de la STEP B. Cependant, considérant les difficultés analytiques liées à
ce composé lorsqu’il est analysé avec le protocole global et le manque de fiabilité sur les
valeurs de concentrations que cela engendre, les concentrations en amoxicilline n’ont pas été
retenues et ce composé n’apparait pas sur la Figure 81. Seule la présence d’amoxicilline dans
les eaux usées en hiver et son absence dans ces mêmes eaux en été pourra être retenue. Au
moment où ces analyses ont été pratiquées, le protocole spécifique à l’amoxicilline n’avait pas
encore été optimisé.
En hiver, comme en été, les mêmes molécules et les mêmes tendances ont été observées dans
les deux plus grosses STEP, L et CL. Les 3 macrolides, les 2 fluoroquinolones, les 2
sulfonamides, les 2 -bloquants et l’anti-VIH ritonavir ont été analysés à la fois dans les eaux
usées brutes et dans les eaux usées traitées. Les eaux usées traitées rejetées par la STEP L sont
globalement plus contaminées que les eaux brutes prélevées en entrée de la station. En
revanche, dans les 2 autres petites stations, les tendances et la composition des eaux ne sont
pas les mêmes entre les 2 saisons. En effet, dans ces 2 petites stations, les tendances se sont
inversées. En hiver, les eaux traitées de la STEP P sont plus contaminées en sortie qu’en
entrée de station alors qu’en été, une diminution de la contamination totale a été observée en
sortie de la STEP. Les eaux usées et traitées de la STEP B sont contaminées à un niveau
équivalent en hiver, proche de 930 ng/L, alors qu’en été, les eaux rejetées par la STEP sont
plus polluées que les eaux usées brutes. La composition des eaux a aussi changé entre les 2
saisons. En été, le sulfaméthoxazole est la molécule la plus abondante mesurée en entrée de la
STEP P alors qu’en hiver, la molécule majoritaire est la ciprofloxacine. De même, en été,
l’érythromycine était la molécule la plus abondante dosée dans les eaux usées traitées en
sortie de cette même station alors qu’en hiver, le métoprolol est majoritaire. De la même
façon, en été, le propranolol et la clarithromycine sont les molécules qui ont les plus fortes
concentrations respectivement en entrée et en sortie de STEP B alors qu’en hiver, il s’agit de
230
la ciprofloxacine et du métoprolol. Cependant, il faut rappeller que ces résultats sont issus
d’analyses pratiquées sur des échantillons prélevés de façon ponctuelle. Aussi ils renseignent
sur l’état de la contamination à un moment donné mais les conclusions sur l’abondance et le
niveau de concentration de certaines molécules par rapport à d’autres auraient pu être
différents si l’échantillonnage avait été réalisé quelques heures ou quelques jours plus tôt ou
plus tard. Il faut également tenir compte de la variabilté analytique dans l’interprétation de ces
informations (cf. le critère « précision » évalué au travers des variations intra- et inter-jours
Tableau 54).
clarithromycine
clarithromycine érythromycine
érythromycine roxithromycine
roxithromycine ciprofloxacine
ciprofloxacine
ofloxacine ofloxacine
fluméquine fluméquine
tétracycline tétracycline
doxycyclinedoxycycline
sulfaméthoxazole
sulfaméthoxazole triméthoprime
triméthoprime metoprolol metoprololpropranolol propranolol
ritonavir ritonavirzidovudine zidovudine
3 000 3 000
2 500 2 500
2 000 2 000 30
25
1 500 1 500
20
1 000 1 000 15
10
500 500
5
0 0 0
sortie
sortie
entrée
entrée
entrée
sortie
entrée
sortie
sortie
sortie
entrée
entrée
entrée
sortie
entrée
sortie
amont aval amont aval P1 B1
rivière L rivière H captage

L LCL CLP PB B
Figure 81 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4
stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de
captage souterraines en hiver (concentration et présence de l’amoxicilline non présenté).
En hiver, l’influence des rejets de STEP sur les niveaux de contamination des eaux de surface
est moins marquée qu’en été (Figure 82). Ainsi, les eaux de la rivière L sont plus contaminées
en amont qu’en aval des rejets de STEP et les eaux de la rivière H, qui n’étaient pas
contaminées en amont des rejets en été, le sont en hiver. De plus, contrairement à la saison
estivale, le ritonavir, qui est toujours détécté dans les rejets des STEP L et CL ne l’est plus
dans la rivière L.
En plus du sulfaméthoxazole, seule molécule détectée dans les eaux de captage en B1 en été,
de l’érythromycine a été retrouvée en hiver dans les 2 eaux de captages. La présence
d’érythromycine dans les eaux de la rivière H, à proximité du point de captage P1, et dans les
eaux de la rivière L, à proximité du point de captage B1, peut expliquer la présence de ce
composé dans les eaux de captage (Figure 82). En revanche, le sulfaméthoxazole n’a été
quantifié que dans les eaux de capatge en B1 alors qu’il a été détecté, mais n’a pu être
quantifié, dans les eaux des 2 rivières. La persistance de ce composé dans la nappe
souterraine, déjà détecté en B1 en été, pourrait expliquer cette observation. Avisar et al.
(2009) expliquent aussi la présence de ce composé dans les aquifères qu’ils ont analysés par
sa résistance à la dégradation.
231
hiver
850 été hiver
ritonavir
750 450 propranolol 550
400 500
650 350 sulfaméthoxazole
450
550 300 été ofloxacine 400
250 ritonavir
450 érythromycine 350
été
450 200 propranolol ritonavir
400 450
300
150 propranolol
350
350 sulfaméthoxazole 400
100 250
300
250 ofloxacine 350 sulfaméthoxazole
50 200
40
40
250 300 ofloxacine
150 0 érythromycine 150
200
35 250
35
amont sortie sortie sortie aval captage érythromycine
50
150 100
200
30 rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1 30
100 50
150
25
50 25
100
200 50
20
amont sortie sortie sortie aval captage 0
15 15
rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1 amont sortie sortie sortie aval captage
10 10 rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1
5 5
0 0
amont sortie sortie sortie aval captage amont aval sortie aval captage
rivière L STEP L STEP CL STEP B rivière L B1 rivière H rivière L STEP P rivière H P1
Figure 82 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées
le long du continuum Hérault en hiver.
I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats
Pour compléter cette étude, les concentrations, totales (Figure 83) et individuelles (Figure 84
et Figure 85) de chaque molécule, mesurées en été et en hiver ont été comparées.
été hiver - amox

6 123
3 000 été hiver
2 500 70
60
2 000
50
1 500 40
1 000 30
20
500 10
0 0
entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie amont aval amont aval P1 B1
L CL P B rivière L rivière H captage
Figure 83 : Comparaison saisonnière de la contamination totale des eaux usées en entrée et sortie de
STEP, des eaux de surface en amont et en aval de ces rejets et des eaux de captage.
Du point de vue global, il ressort qu’à l’exception de la station P, les eaux usées sont plus
contaminées en hiver qu’en été avec respectivement des concentrations moyennes proches de
1,6 µg/L et 0,5 µg/L. A l’inverse, en aval des rejets de STEP, les eaux de surfaces sont
contaminées de façon plus abondante en été qu’en hiver. Ces résultats peuvent s’expliquer
d’une part, par une plus forte consommation de médicaments, tels que les antibiotiques, en
hiver et donc une plus forte contamination des eaux usées à cette saison ; et d’autre part, par la
dilution plus faible des rejets de STEP dans les rivières en période estival en raison du
manque de précipitation et donc du débit et du volume plus faible des rivières. Dans leur
étude saisonnière de la STEP de Varese Olona, Casiglioni et al. (2006) mettent aussi en
évidence une contamination plus forte des eaux usées en hiver qu’en été pour des composés
232
comme les antibiotiques ou les anti-inflammatoires dont les modes de consommation sont
saisonniers. Aucune conclusion n’a pu être tirée sur l’impact de la saison sur les eaux de
captage puisqu’en P1 l’eau est plus contaminée en hiver qu’en été et que la tendance inverse a
été observée en B1.
Du point de vue individuel, le comportement de chacune des 14 molécules quantifiées dans

les eaux usées et des 7 molécules quantifiées dans les eaux de surface et de captage est
présenté respectivement dans les Figure 84 et Figure 85. Les flux des molécules, en entrée et
en sortie de STEP, calculés à partir des débits moyens annuels de chaque STEP sont présentés
dans le Tableau 63. Ils ont été utilisés pour calculer les abattements dans les STEP (Tableau
64) à partir de la formule suivante :
flux entrée  flux sortie
abattement   100
flux entrée
 Les 3 macrolides, la clarithromycine, l’érythromycine et la roxithromycine, présentent

des comportements similaires dans les STEP (Figure 84). A l’exception de la sortie de STEP
P, les concentrations sont systématiquement plus importantes, ou équivalentes dans le cas de
la STEP B, en hiver qu’en été. De plus, quelle que soit la saison, les concentrations sont
équivalentes, si on considère la variabilité analytique, ou plus fortes en sortie qu’en entrée de
STEP ce qui se traduit par des abattements négatifs ou faibles (< 40%) (Tableau 64). Ceci est
en accord avec les conclusions de Castiglioni et al. (2006), qui estiment les rendements
médians de la clarithromycine comme nuls par exemple, ou avec les conclusions de Gros et
al. (2009), de Miège et al. (2009) et les valeurs relevées dans la littérature et présentées
Figure 7 (élimination des macrolides variant entre 0 % et 50 % avec une moyenne < 20 %) ou
dans l’Annexe - tableau 1. Les valeurs des flux de ces 3 molécules sont notables mais ne sont
pas toujours les plus importants par rapport aux autres molécules. Parmi ces 3 antibiotiques,
les flux les plus importants sont ceux de la clarithromycine qui peuvent atteindre 2,2 g/j en
hiver en sortie de la STEP L. Enfin, la clarithromycine et l’érythromycine, mais pas la
roxithromycine, sont présents en hiver dans les 2 rivières, en amont et en aval des rejets, à des
concentrations proches ou inférieures à 10 ng/L (Figure 85). La clarithromycine et la
roxithromycine sont présentes en été en aval dans les 2 rivières. Gros et al. (2006) ont aussi
détecté de l’érythromycine dans le bassin de la rivière Ebre, en Espagne, à une concentration
moyenne de 17 ng/L.
 Les 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et l’ofloxacine, ont des concentrations

équivalentes ou plus fortes en hiver qu’en été (Figure 84). Leurs flux sont également plus
importants en hiver (plusieurs centaines de mg/j) qu’en été (une centaine de mg/j) (Tableau
63). Les flux les plus importants sont émis par la STEP CL en hiver (1,4 g/j pour la
ciprofloxacine et 2 g/j pour l’ofloxacine). Castiglioni et al. (2006) remarquent aussi une
charge plus importante de ces 2 composés en hiver qu’en été dans la STEP de Varese Olona
(ex. : 490 mg/j/1000 habitants en hiver et 259 mg/j/1000 habitants en été pour la
ciprofloxacine). Comme pour les macrolides, ces observations sont en lien avec les modes
d’usage de ces médicaments. A l’exception de la STEP L en été et de la STEP P en hiver pour
l’ofloxacine, quelle que soit la saison, leurs concentrations sont équivalentes ou plus faibles
en sortie de STEP qu’en entrée ce qui se traduit par des bons abattements variants entre 41 %
et 91 % pour la ciprofloxacine et entre 4 % et 95 % pour l’ofloxacine (Tableau 64). Gros et al.
(2009) notent aussi des rendements variants entre 37 % et 99 % pour la ciprofloxacine et entre
20 % et 99 % pour la l’ofloxacine. Comme pour Castiglioni et al. (2006), l’influence de la
233
clarithromycine érithromycine roxithromycine

1724
900 été hiver 400 200 été hiver
été hiver
800 350 180
700 160
300 140
600
250 120
500
200 100
400
150 80
300 60
200 100
40
100 50 20
0 0 0
entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie
STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B
ciprofloxacine ofloxacine
1 200 été hiver 1 200 été hiver
1 000 1 000
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie
STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B
tétracycline doxycyline
25 été hiver
concentration (ng/l) 14 été hiver
12
20
10
15 8
10 6
4
5
2
0 0
sulfaméthoxazole triméthoprime
5088
300 été hiver 700 été hiver
250 600
500
200
400
150
300
100
200
50 100
0 0
métoprolol propranolol
600
200
500
400 150
300 100
200
50
100
0 0
ritonavir zidovudine
120 40
35
100
30
80 25
60 20
15
40
10
20 5
0 0
Figure 84 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux usées en entrée et sortie de STEP pour
chacune des 14 molécules détectées dans ces eaux.
234
saison sur les abattements n’est pas significative (Tableau 65). Quelque soit la saison, la
ciprofloxacine n’a jamais été détectée dans les eaux de surface. En revanche, Tamtam et al.
(2008) ont détecté de la ciprofloxacine dans les eaux de la Seine mais n’ont pu mesurer sa
concentration qui était inférieure à leurs limites de quantitifcation (10 ng/L). Bien que non
identifiée en été dans les eaux en amont de la rivière H, l’ofloxacine a été quantifiée en été et
en hiver, dans les 2 rivières, à des concentrations équivalentes, comprises entre 5 et 7 ng/L
(Figure 85). Tamtam et al. (2008) ont dosé de l’ofloxacine dans la Seine à une concentration
moyenne de 30 ng/L au niveau du barrage de Pose.
 Les 2 tétracyclines, la tétracycline et la doxycycline, ont été mesurées à de faibles

concentrations dans les eaux usées, comparativement aux autres composés détectés dans ces
échantillons (Figure 84) et n’ont pas été quantifiées dans les eaux de surface. La plus forte
concentration relevée pour la tétracycline est de 21 ng/L en entrée de la STEP B et elle est de
13 ng/L en entrée de la STEP P pour la doxycycline. Du fait de leurs faibles concentrations,
elles contribuent peu aux flux de molécules pharmaceutiques dans les STEP. Leurs flux sont
de l’ordre de quelques mg/j (Tableau 63). Ces 2 antibiotiques ont des comportements
saisonniers différents dans les STEP (Figure 84). La tétracycline est majoritairement
retrouvée en hiver, avec une fréquence de détection de 75 % contre 37,5 % en été, alors que la
doxycycline est plus retrouvée en été avec une fréquence de détection de 87,5 % contre 62,5
% en hiver. En revanche, elles semblent avoir le même comportement vis-à-vis de leur
dégradation dans les STEP avec des concentrations mesurées en sortie équivalentes ou plus
faibles que celles mesurées en entrée. Les abattements calculés pour la tétracycline varient
entre - 29 % et 78 % et ceux pour la doxycycline entre - 15 % et 71 % (Tableau 64). Gros et
al. (2010) ont calculé des meilleurs abattements pour la tétracycline avec des taux
d’élimination variant entre 40 % et 89 %.
 Les 2 sulfonamides, le sulfaméthoxazole et le triméthoprime, ont des comportements

et des tendances très similaires (Figure 84). Ceci est cohérent avec les pratiques médicales qui
leurs sont associées puisqu’ils sont généralement administrés en même temps (ex. : Bactrim®,
dictionnaire Vidal, 2006). A l’exception de l’entrée de la STEP P, où des concentrations
particulièrement élévées ont été mesurées (5 088 ng/L pour le sulfaméthoxazole et 574 ng/L
pour le triméthoprime), leurs concentrations estivales sont légèrement plus faibles (12 - 84
ng/L pour le sulfaméthoxazole et 3 - 161 ng/L pour le triméthoprime) que leurs concentrations
hivernales (3 - 212 ng/L pour le sulfaméthoxazole et 25 - 245 ng/L pour le triméthoprime).
Avec des flux de l’ordre de la centaine de mg/j à quelques centaines de mg/j, en été comme en
hiver, ces 2 antibiotiques contribuent de façon importante aux flux totaux des molécules
pharmaceutiques dans les STEP (Tableau 63). En revanche, Castiglioni et al. (2006) ont
observés une différence importante entre les flux selon la saison. Pour eux, les flux en entrée
de STEP sont plus importants en hiver (209 mg/j/1000 habitants) qu’en été (0 mg/j/1000
habitants). La valeur de flux qu’ils ont relevés pour le sulfaméthoxazole en hiver dans les
eaux usées en entrée de la STEP de Varese Olona (209 mg/j/1000 habitants) est du même
ordre de grandeur que celles relevées dans cette étude (moyenne flux sulfaméthoxazole en
entrée de STEP en hiver : 152 mg/j). Les tendances de ces 2 molécules dans les STEP
semblent aléatoires. Les concentrations sont plus fortes dans les eaux usées brutes que dans
les eaux usées traitées pour la STEP CL en hiver et en été pour la STEP P. Ce qui se traduit
par des abattements variants entre 65 % et 98 % pour le sulfaméthoxazole et entre 15% et 69
% pour le triméthoprime (Tableau 64). Ce qui est en accord avec les rendements
d’élimination relevés par Gros et al. (2010) qui sont compris entre 30 % et 92 % pour le
sulfaméthoxazole et celui relevé par Bendz et al. (2005) de 49 % pour le triméthoprime. A
l’inverse, les concentrations sont plus fortes dans les eaux usées traitées que dans les eaux
235
usées brutes en été et en hiver dans la STEP L et en hiver dans la STEP P (Figure 84). Ce qui
se traduit par des abattements négatifs variants entre - 180 % et - 3178 % pour le
sulfaméthoxazole et entre -247 % et -1250 % pour le triméthoprime (Tableau 64). Comme
précédemment justifié (cf. 210), ces valeurs impressionnantes peuvent en partie s'expliquer
par le type d'échantillonnage pratiqué (échantillonnage ponctuel). Gobel et al. (2007) notent
également des rendement d’élimination très variable pour ces 2 molécules, entre -138 % et 60
% pour le sulfamthéxazole et entre - 40 % et 20 % pour le triméthoprime, dans des STEP
mettant en œuvre des procédés de traitement par boues activées comme c’est le cas des STEP
L et P. Le triméthorpime et le sulfaméthoxazole ont été détectés en hiver dans les eaux de
surface mais n’ont pu être quantitifés. Le sulfaméthoxazole a en revanche pu être quantifié en
été dans les eaux de la rivière L, en aval des rejets de STEP à une concentration de 12 ng/L
(Figure 85). Dans la littérature, Gros et al. (2006) l’ont détecté mais ne peuvent pas non plus
le quantifier dans des eaux de surface et Bendz et al. (2005) l’ont quantifié une fois, sur 3
analyses, à une concentration de 10 ng/L proche de celle mesurée dans cette étude. Le
sulfaméthoxazole est identifié en hiver et en été dans les eaux souterraine de captage en B1
(cf. paragraphe I.2.1 et I.2.2 précédents).
 Dans l’ensemble des 4 STEP, les concentrations en métoprolol sont plus élevées en
hiver qu’en été alors qu’elles sont relativement similaires entre les 2 saisons pour le
propranolol (Figure 84). En conséquence, les flux du métoprolol sont également plus
importants en hiver, en moyenne 284 mg/j conte 46 mg/j en été alors que ceux du propranolol
sont proches, en moyenne 117 mg/j en hiver et 92 mg/j en été (Tableau 63). Les
concentrations du métoprolol sont soit similaires soit plus fortes dans les eaux usées traitées
(hiver : 182 - 655 ng/L, été : 20 - 78 ng/L) que dans les eaux brutes (hiver : 15 - 325 ng/L,
été : 19 - 29 ng/L) (Figure 84). En conséquence, les abattements sont négatifs ou très faibles.
Ils varient entre - 2946 % pour la STEP B en hiver et 9 % pour la STEP CL en hiver (Tableau
64). Comme pour le sulfaméthoxazole ou le triméthoprime, la valeur de "- 2946 %" peut
s’expliquer par la variabilité de la mesure consécutif un échantillonnage de type ponctuel. Des
concentrations en entrée (4,6 - 473 ng/L) et en sortie (15,8 - 435 ng/L) de STEP, proches de
celles relevées en hiver dans cette étude, ont été rapportées par Gabet-Giraud et al. (2010). De
même, ces auteurs soulignent la variabilté de l’élimination de ce composé dans les STEP
(abattement variant entre - 40 % et environ 90 %). Bendz et al. (2005) trouvent également des
concentrations en sortie de STEP (190 ng/L) plus fortes qu’en entrée (160 ng/L). Bien que les
niveaux de concentrations soient différents, les mêmes tendances peuvent être observées pour
le propranolol. Aussi, à l’exception des STEP P et B en été, les concentrations du propranolol
sont plus fortes dans les eaux usées traitées (hiver : 113 - 179 ng/L, été : 47 - 135 ng/L) que
dans les eaux brutes (hiver : 48 - 103 ng/L, été : 36 - 222 ng/L) (Figure 84). Les abattements
sont donc également très variables, entre - 241 % et - 34 % ou de 34 % et 51 %
respectivement dans les STEP P et B en été. Gabet-Giraud et al. (2010) constatent aussi des
éliminations très variables du propranolol dans les 14 STEP qu’ils ont étudié, entre - 50 % et
presque 90 %, avec une moyenne d’élimination de 22%. Bendz et al. (2005) et Ternes (1998)
trouvent des meilleurs taux d’élimination pour le propranolol avec abattements de 32 % et 96
% respectivement. Par ailleurs, Gabet-Giraud et al. (2010) ont montré que quel que soit le
procédé de traitement mis en œuvre, l’abattement du propranolol est très variable. En été,
aucun des 2 -bloquants n’a été détecté dans les eaux de surface. En hiver, le métoprolol a été
détecté mais non quantifié dans les eaux de la rivière L et le propranolol a été détecté dans
toutes les eaux de surface mais il n’a pu être quantifié qu’en amont dans la rivière L à une
concentration de 1,2 ng/L (Figure 85). Gros et al. (2006) n’ont détecté aucun de ces 2 -
bloquants dans les 10 échantillons d’eaux du bassin de la rivière Ebre qu’ils ont analysé. A
236
l’inverse, Bendz et al. (2005) ont retrouvé du métoprolol dans la rivière Höje à des
concentrations variant entre 60 et 70 ng/L et du propranolol à des concentrations de 10 ng/L.
 L’ anti-VIH ritonavir n’a été détecté que dans les 2 plus grosses STEP L et CL, en été
comme en hiver. L’autre anti-VIH étudié, la zidovudine, n’a été détectée que dans la STEP
CL, en été comme en hiver (Figure 84). De façon, surprenante par rapport au mode de
consommation de ces 2 médicaments, les concentrations mesurées sont plus fortes en hiver
qu’en été. Par exemple, les concentrations du ritonavir en hiver varient entre 87 ng/L et 115
ng/L et en été, entre 21 ng/L et 39 ng/L. Par rapport aux concentrations mesurées par Prasse et
al. (2010) en entrée et en sortie de STEP (de la centaine à plusieurs centaines de ng/L), les
concentrations de zidovudine dosées dans cette étude sont faibles (< 45 ng/L). Les flux de
ritonavir sont relativement importants puisqu’ils sont en moyenne de 222 mg/j en hiver ce qui
est du même ordre de grandeur que les flux moyens de la roxithromycine (172 mg/j) ou du
sulfaméthoxazole (186 mg/j) dans les 2 mêmes STEP. Avec des abattements compris entre -
15 % et 38 %, le ritonavir ne semble pas être bien éliminé dans des STEP possédant un
traitement par boues activées (Tableau 64). A partir des valeurs mesurées dans la STEP CL,
la zidovudine ne semble pas être éliminée dans les STEP. Prasse et al. (2010) observent de
fortes variations dans les taux d’élimination de la zidovudine, 68 % dans une STEP et 0 %
dans une autre, bien qu’elles possèdent toutes les 2 un système de traitement par boues
activées. Le ritonavir est le seul anti-VIH à être détecté dans les eaux de surface des 2 rivières
L et H en été, en aval des rejets de STEP (Figure 85). Il permet de mettre en évidence l’impact
des rejets de STEP sur la contamination des eaux de surface (cf. paragraphe I.2.1 et I.2.2 de ce
chapitre).
clarithromycine érithromycine roxithromycine

14 été hiver 12 été hiver 6 été hiver
12 10 5
10
8 4
8
6 3
6
4 2
4
2 2 1
0 0 0
amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1
rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage
ofloxacine sulfaméthoxazole
7 16
6 14
5 12
10
4
8
3 6
2 4
1 2
0 0
amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1
rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage
propranolol ritonavir
1,4 été hiver 20 été hiver
18
1,2
16
1 14
0,8 12
10
0,6 8
0,4 6
4
0,2
2
0 0
amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1
rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage
Figure 85 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux de surface en amont et en aval des
rejets de STEP et des eaux de captage pour chacune des 7 molécules détectées dans ces eaux.
237
Tableau 63: Flux des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de STEP en été, calculés à partir
des débits moyens annuels de chacune des STEP, exprimés en mg/j.
été hiver
clarithromycine 274 179 31 56 4 2 1 53 1 577 2 216 407 942 5 43 3 53
érythromycine 98 102 593 5 265 540 53 3
roxithromycine 30 72 49 3 16 40 155 232 262 8 65 1 12
ciprofloxacine 371 163 868 97 23 10 888 525 1 420 122 317 44 142 13
ofloxacine 108 394 340 198 34 33 2 817 504 2 042 373 10 34 67 3
tétracycline 12 4 1 28 6 8 10 5 2
doxycycline 16 13 21 6 4 1 2 2 7 8 1 1
sulfaméthoxazole 33 111 86 55 1 609 29 52 145 404 142 1 27
triméthoprime 7 93 37 43 181 55 67 232 198 169 84
metoprolol 77 131 35 40 7 27 5 555 520 391 356 103 225 4 120
propranolol 95 323 69 93 70 46 26 13 158 298 91 243 33 61 18 37
ritonavir 89 103 65 40 254 229 218 185
zidovudine 11 15 82
Tableau 64 : Abattement (%) des molécules pharmaceutiques dans les 4 STEP étudiées (calculé quand les
molécules ont été quantifiées en entrée et en sortie de STEP).
STEP L STEP CL STEP P STEP B
été hiver été hiver été hiver été hiver
clarithromycine 35 -40 -82 -132 40 -775 -4225 -1747
roxithromycine -289 32 -13 -712 -1247
ciprofloxacine 56 41 89 91 58 86 91
ofloxacine -265 38 42 82 4 -239 95
tétracycline 78 69 -29 71
doxycycline 23 71 -15 71 5
sulfaméthoxazole -236 -180 35 65 98 -3178
triméthoprime -1250 -247 -15 15 69
metoprolol -70 6 -12 9 -269 -119 -2946
propranolol -241 -89 -34 -168 34 -88 51 -101
ritonavir -15 10 38 15
zidovudine -458
Tableau 65 : Comparaison des abattements dans les STEP pour 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et
l’ofloxacine, entre cette étude et celle de Castiglioni et al., 2006.
abattements (%) cette étude Castiglioni et al., 2006
ciprofloxacine hiver 41 - 91 45 - 78
ciprofloxacine été 56 - 89 53 - 69
ofloxacine hiver 38 - 95 0 - 62
ofloxacine été 4 - 42 33 - 66
I.3. Projet FLASH
Une fois validé, le protocole « multi-résidus 78 » a été utilisé dans le cadre du projet FLASH
pour réaliser le suivi d’un continuum hospitalier et d’un continuum agricole. Les
prélèvements ont été réalisés une fois en été et une fois en hiver de façon à voir l’influence de
la saison. L’étude de ces 2 continuums a permis d’enrichir les connaissances sur les sources
de contamination et le devenir des molécules pharmaceutiques.
238
I.3.1. Continuum hospitalier
I.3.1.1 Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux
L’analyse des échantillons provenant du continuum hospitalier fait ressortir une

contamination importante par les antibiotiques et les -bloquants. Les anti-VIH sont
également retrouvés mais essentiellement en entrée de station d’épuration (Figure 86 et Figure
87).
Dans un premier temps, la contamination par les 5 classes thérapeutiques de chacune des
matrices du continuum a été étudiée (Figure 86). Les échantillons provenant des effluents
hospitaliers sont majoritairement contaminés par les antibiotiques, été comme hiver. En effet,
la concentration totale en antibiotiques des effluents hospitaliers est de 48,7 µg/L en été et de
343,4 µg/L en hiver alors que celles des -bloquants sont respectivement de 0,7 µg/L et de 1,5
µg/L et celles des autres classes thérapeutiques sont inférieures à la centaine de ng/L. Les
échantillons provenant des effluents de la maison de retraite sont majoritairement contaminés
par les antibiotiques en hiver (81,3 µg/L) et par les -bloquants en été (8,8 µg/L). L’entrée de
STEP est fortement marquée par une contamination en -bloquants (11,7 µg/L en été et 7,1
µg/L en hiver) mais les antibiotiques (5,7 µg/L en été et 5,9 µg/L en hiver) et les anti-VIH
(2,1 µg/L en été et 0,3 µg/L en hiver) sont également très présents. La sortie de STEP et l’eau
de surface impactée par ce rejet sont contaminées principalement par les antibiotiques (ex. :
sortie de STEP ≈ 2,5 µg/L) et les -bloquants (ex. : sortie de STEP ≈ 3,8 µg/L) bien que les
anti-VIH (ex. : sortie de STEP ≈ 0,2 µg/L) soient également détectés dans ces matrices.
évolution évolution
de la concentration le long
de la concentration le longduducontinuum hospitalier
continuum hospitalier par classes
par classes
évolution de la concentration le long du
thérapeutiques et en fonction de la saison
thérapeutiques et en fonction de continuum
la saison hospitalier par classes
thérapeutiques et en fonction de la saison
été hiver
été hiver 300
été hiver 250
(ng/l)(ng/l)
362 000 200

362 000 312 000 évolution de la concentration le long du continuum hospitalier 150par classes
100
262 000
362 000
concentration
50
312 000 212 000 thérapeutiques et en fonction de la saison
312 000 0
262 000
A-c
A-VIH
sildénafil
A-b
162 000
b-b
262 000 été hiver

A-bconcentration
212 000 112 000

212 000
62 000
162 000
162 000
12 000 rivière
112 000 112 000
10 000
A-VIH
b-b A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-b
A-b
A-b
A-b
A-b
viagra
sildénafil A-c viagra
viagra
viagra
viagra
A-c
A-c
A-c
A-c
A-c
b-b
b-b
b-b
b-b
b-b
62 000 628 000

000
12 000 126 000
000
4 000
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-b
A-b
A-b
A-b
A-b
A-bviagra
b-bviagra
A-cviagra
A-VIHviagra
viagra
A-c
A-c
A-c
A-c
b-b
b-b
b-b
b-b
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-b
A-b
A-b
A-b
A-cviagra
viagra
viagra
viagra
viagra
A-c
A-c
A-c
A-c
A-c
b-b
b-b
b-b
b-b
b-b
2 000 hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière

0
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-VIH
A-b
A-b
A-b
A-b
A-c
A-c
A-c
b-b
b-b
b-b
b-b
sildénafil
sildénafil
sildénafil
sildénafil
hopital hopital maison retraite

maison retraite entrée STEP sortie STEP
entrée STEP sortie STEP rivière
rivière
hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière
Figure 86 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le
continuum hospitalier (A-b : antibiotiques, b-b : -bloquants, A-c : anticancéreux, A-VIH : anti-VIH).
Dans un second temps, l’évolution de la contamination le long du continuum au sein de

chacune des classes thérapeutiques a été étudiée (Figure 87). De plus, en comparant les
niveaux de contamination de l’effluent hospitalier, de l’effluent de la maison de retraite avec
celui de l’entrée de la station d’épuration, l’origine de la contamination peut être identifiée.
 Au sein des antibiotiques, l’effluent hospitalier est plus contaminé que celui de la
maison de retraite et est plus contaminé que les eaux usées en entrée de STEP, en été comme
en hiver (Figure 87). En conséquence, la contamination de l’eau par les antibiotiques provient
majoritairement des rejets hospitaliers. Les concentrations hivernales dans les effluents de
239
l’hopital (343,4 µg/L) et de la maison de retraite (81,3 µg/L) sont nettement plus importantes
que les concentrations estivales (hopital : 48,7 µg/L, maison de retraite : 2,7 µg/L). Comme
dans le cas de l’étude du continuum Hérault, cette observation semble logique au regard du
mode d’utilisation de ces médicaments. En revanche, la différence saisonnière est inversée
dans les eaux de la rivière (été : 180 ng/L, hiver : 24 ng/L) probablement à cause d’une
dilution moins importante en été en raison des précipitations plus faibles. Dans les eaux usées
en entrée et en sortie de STEP, la différence saisonnière n’est pas marquée. La concentration
moyenne en antibiotiques est de 5,8 µg/L en entrée et de 2,5 µg/L en sortie de STEP. Une
diminution de la contamination globale en antibiotiques des eaux usées suite à leurs passages
dans la STEP est donc observée. Cependant, tous les antibiotiques et par conséquent toutes les
familles d’antibiotiques ne sont pas éliminés de la même façon dans la STEP étudiée (Figure
88). Les -lactames, les tétracyclines et le métronidazole (autres Ab) sont bien éliminés
(abattements > 75 %). Contrairement aux résultats obtenus lors de l’étude du continuum
Hérault et à ceux obtenus par Castiglioni et al. (2006), les fluoroquinolones sont mieux
éliminés en hiver (abattement > 65 %) qu’en été (abattement < 35 %). Quelle que soit la
saison, l’élimination des macrolides et des sulfonamides dans la STEP est très variable avec
des abattements respectifs compris entre -74 % et 91% et entre -2341 % et 71%. La valeur de
"- 2341 %" correspond à l'abattement de la sulfapyridine en été. Deux hypothèses peuvent
expliquer ce chiffre : i) le type d'échantillonnage mis en œuvre puisqu'en été le bidon
collecteur n'était pas rempli en entier (15 litres pour une contenance de 25 litres); et ii) la
variabilité analytique de la mesure car d'un point de vue général, les concentrations mesurées
en entrée (0,4 ng/L) et en sortie (9 ng/L) sont du même ordre de grandeur. De fortes variations
avaient également été observées pour les sulfonamides lors de l’étude du continuum Hérault
et par Castiglioni et al. (2006) ou Gobel et al. (2007). Pour les macrolides, des abattements
proches de 90 % ont été calculés au cours de cette étude. Ces résultats sont différents de ceux
obtenus lors de l’étude du continuum Hérault ou de ceux obtenus dans d’autres études (Figure
7).
 Dans le cas des -bloquants, la contamination des effluents de la maison de retraite est
plus importante que celle des effluents hospitaliers (Figure 87). Néanmoins, les -bloquants
sont d’avantage présents en entrée de STEP que partout ailleurs ce qui signifie que la maison
de retraite est la principale source de contamination de l’eau mais que les eaux usées d’origine
urbaine y contribuent aussi. Comme pour les antibiotiques, les concentrations sont plus faibles
en sortie de STEP qu’en entrée. Les -bloquants sont donc en partie éliminés par les
traitements appliqués dans la STEP étudiée (Figure 88). Cependant, l’élimination est variable
avec des taux d’abattement compris entre -197 % et 88 %. Comme dans l’étude du continuum
Hérault ou dans les résultats de Gabet-Giraud et al. (2010), l’abatttement du propranolol est
faible, 13 % en été et 28 % en hiver et celui du métoprolol est variable (-197 % été, 58 %
hiver). Comme pour la sulfapyridine, la valeur de "-197 %" pour le métoprolol en été peut
s'expliquer par l'échantillonnnage pratiqué en cette saison. Les différences saisonnières de
concentrations sont moins marquées que pour les antibiotiques, ce qui semble cohérants avec
les modes d’usages de ces composés. Néanmoins, l’eau du point « rivière » est plus
contaminée en été (240 ng/L) qu’en hiver (37 ng/L), probablement pour la même raison que
pour les antibiotiques.
 Contrairement aux antibiotiques et aux -bloquants, les concentrations en
anticancéreux et anti-VIH sont plus fortes en entrée de STEP que dans les effluents des
établissements de soin (Figure 87). La contamination provient donc majoritairement des eaux
usées d’origine urbaine. De plus, l’hôpital ne dispose pas d’un service de cancérologie ce qui
explique les faibles concentrations en anticancéreux dans les effluents des établissements de
soin. Le méthotréxate et le tamoxifen sont les 2 anticancéreux qui ont été détectés en entrée de
STEP à des concentrations respectivement de 22 ng/L et 4 ng/L. Le tamoxifen a également été
240
détecté en sortie de STEP à une concentration de 2 ng/L. Ces 2 molécules semblent donc
éliminées par les traitements appliqués dans la STEP. Les anti-VIH ont été analysés à des
concentrations plus fortes en été (2138 ng/L) qu’en hiver (302 ng/L) en entrée de STEP mais
à des concentrations équivalentes en sortie (205 ng/L été, 188 ng/L hiver). Ils ont également
été détectés dans les eaux du cours d’eau mais les concentrations hivernales (30 ng/L) sont
plus fortes que celles estivales (15 ng/L). L’élimination des anti-VIH dans la STEP est bonne
avec des abattements compris entre 57 % et 100 % selon les composés (Figure 88). Par
exemple, l’abacavir et la lamivudine sont éliminées respectivement 97 % et 98 % en été. Ces
résultats sont en accord avec ceux de Prasse et al. (2010) qui trouvent des taux d’élimination
supérieurs à 99 % et à 76 % pour ces 2 mêmes molécules. Par ailleurs, Prasse et al. (2010) ont
mesurés des concentrations en névirapine plus fortes en sortie qu’en entrée de STEP et dans
cette étude, la névirapine n’a été dosée qu’en sortie de STEP. Ces 2 résultats vont dans le
même sens.
 Le sildénafil a majoritairement été dosé en été et à un niveau équivalent entre les
effluents des établissements de soin et les eaux usées en entrée de STEP (Figure 87). Il
semblerait donc que le sildénafil provienne des eaux usées d’origine urbaine mais aussi des
eaux usées des centres de soin. Il n’a été retrouvé qu’à de faibles concentrations (< 5 ng/L) en
sortie de STEP. Son élimination a été estimée à 83 % (Figure 88). Le sildénafil est donc bien
éliminé dans les STEP ce qui est en accord avec Nieto et al. (2010a) qui ont estimé son
élimination à 68 %.
Les résultats de cette étude sont également disponibles dans la publication « Multi-residus
simultaneous analysis of 78 pharmaceuticals compounds in aqueous samples : development
and application » (publication 3).
été hiver
362 000
312 000
concentration (ng/L)
350
262
350 000
300
212
300 000
250
162 000 200

250 150
112 000
100
200
62 000 50
150
12 000 0
hopital
hopital
hopital
retraite
retraite
retraite
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
sortie STEP
sortie STEP
rivière
rivière
sortie STEP
rivière
hopital
hopital
hopital
hopital
hopital
retraite
retraite
retraite
retraite
retraite
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
rivière
rivière
rivière
rivière
rivière
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
100
10 000
8 000
50 anticancéreux anti-VIH sildénafil
60 000
hopital
hopital
hopital
sortie STEP entrée STEP
sortie STEP entrée STEP
entrée STEP
retraite
retraite
retraite
hopital sortie STEP
hopital sortie STEP
sortie STEP
rivière
rivière
rivière
4 000 antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-VIH viagra
2 000
0
retraite
retraite
retraite
retraite
retraite
hopital
hopital
hopital
rivière
rivière
rivière
rivière
rivière
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
anticancéreux anti-VIH viagra
antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-VIH sildénafil
Figure 87 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-VIH

et sildénafil, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier.
Les résultats d’analyses globales du continuum hospitalier (Figure 89) montrent que la
contamination des effluents des centres de soins (hôpital et maison de retraite) est bien plus
241
importante en hiver qu’en été. Ce sont majoritairement les antibiotiques qui sont responsables
de cette tendance. A l’inverse, la contamination des eaux usées en entrée de STEP est plus
importante en été qu’en hiver. C’est la dilution des eaux usées en hiver par les eaux de pluies
qui explique ce constat. En été comme en hiver, bien que les tendances individuelles soient
variables, de façon globale, les eaux en entrée de STEP sont plus contaminées qu’en sortie. Il
y a donc une bonne efficacité du traitement. La contamination des eaux de surface est faible.
Cependant, elle est plus forte en été qu’en hiver en raison de la plus faible dilution du rejet de
STEP dans la rivière en été. En conclusion, une diminution globale de la contamination est
observée le long du continuum hospitalier.
été été été été été été hiver hiver hiver hiver hiver hiver hiver
100
80
60
abattement (%)
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
anti-VIH
sulfonamides
sildénafil
b-bloquants
tétracyclines
anticancéreux
b-lactames
autres Ab
FQ & Q
macro. & linco.
Figure 88 : Abattements estivaux et hivernaux des différentes molécules au sein des différentes classes
thérapeutiques et famille d’antibiotiques (les abattements inférieurs à - 100 % apparaissent sur le
graphique au niveau de la ligne -100 %) (macro. & linco : macrolides et lincosamides, FQ & Q :
fluoroquinolones et quinolones, autres Ab : autres antibiotiques).
été hiver
345
100
80
60
40
20
0
hopital retraite entrée sortie STEP rivière
STEP
Figure 89 : Concentration totale (∑78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier,
comparaison été/hiver.
I.3.1.2 Etudes des autres classes thérapeutiques
Au cours de ce projet « FLASH », 21 molécules appartenant à 5 autres classes thérapeutiques

(analgésiques et AINS, antiépileptiques et antidépresseurs, bronchodilatateurs,
hypolipémiants et stimulants) ont été analysées. Comme ces classes ne font pas l’objet
directement de ces travaux de thèse, les résultats de leurs analyses ne sont présentés que très
brièvement dans les 3 paragraphes suivants.
242
Dans les divers échantillons prélevés le long du continuum hospitalier, la classe des
analgésiques et AINS est la plus abondante avec des concentrations qui peuvent atteindrent
les 2,7 mg/L dans les rejets des établissements de soin en été (Figure 90). Hiver comme été,
les stimulants (caféine et théophylline) représentent la deuxième classe la plus abondante dans
les effluents hospitaliers, dans les eaux usées en entrée de STEP et dans les eaux de la rivière.
En hiver, c’est également la deuxième classe la plus abondante dans les effluents de la maison
de retraite alors qu’en été, ce sont les antiépileptiques et les antidépresseurs. Les
bronchodilatateurs apparaissent aussi comme des composés participant à la contamination des
eaux usées en sortie de maison de retraite, particulièrement en été. En sortie de STEP, les
antiépileptiques et les antidépresseurs participent presque autant à la contamination des eaux
que les analgésiques et AINS. Dans la rivière, les antiépileptiques et les antidépresseurs
constituent la troisième classe qui contribue à la contamination de l’eau.
3 000 000 été hiver

2 5003 000
000 000
2 0002 000
500 000 été hiver
2 000 000
31 500
000 000
000
1 500 000 2 885

été hiver
21 000
500 000
000 300
1 000 000 250

2 000 000
500 000
1 500 500
000 000
40 000
200
150
0
1 000 000 0
35 000 100
stimulantsbroncho
stimulantsbroncho
stimulantsbroncho
stimulantsbroncho
broncho
stimulants
stimulants
stimulants
stimulants
stimulants
broncho AINS
broncho AINS
broncho AINS
broncho AINS
AINS
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép

AINS hypolip
AINS hypolip
AINS hypolip
AINS hypolip
hypolip
50
30 000
500 000
0
25 0000 AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants
broncho rivière
stimulants
AINS
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép

hypolip
hypolip
hypolip
hypolip
hypolip
20 000
15 000
10 000
5 000 hopital maison entrée STEP sortie STEP rivière
0
retraite
broncho
broncho
broncho
broncho
broncho
stimulants
stimulants
stimulants
stimulants
stimulants
AINS
AINS
AINS
AINS
AINS
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép
A-épi & A-dép

hypolip
hypolip
hypolip
hypolip
hypolip
hopital maison entrée STEP sortie STEP rivière

retraite
hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière
Figure 90 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le
continuum hospitalier (AINS : analgésiques et AINS, A-épi. & A-dép. : antiépileptiques et
antidépresseurs, broncho. : bronchodilatateurs, hypolip. : hypolipémiants).
L’évolution de la contamination le long du continuum au sein de chacune des classes

thérapeutiques a ensuite été étudiée (Figure 91). Comme pour les premières classes
thérapeutiques étudiées, en comparant les niveaux de contamination de l’effluent hospitalier,
de l’effluent de la maison de retraite avec celui de l’entrée de la station d’épuration, l’origine
de la contamination peut être identifiée.
 Avec des niveaux de concentration plus élevés dans les effluents hospitaliers (été :
2710,6 µg/L, hiver : 353,5 µg/L) et dans les effluents de la maison de retraite (été : 2733,5
µg/L, hiver : 394,6 µg/L) que dans les eaux usées en entrée de STEP (été : 287,5 µg/L, 194,9
µg/L), la contamination des eaux par les analgésiques et les AINS provient majoritairement
des centres de soin. Les concentrations en sortie de STEP sont beaucoup plus faibles,
quelques µg/L, qu’en entrée de STEP, quelques centaines de µg/L, traduisant ainsi une bonne
élimination de ces composés dans les STEP. Ce qui est en accord avec les valeurs relevées
dans la littérature (Figure 7 et Annexe - tableau 1). Dans la rivière, les analgésiques et AINS
sont détectrés à une concentration plus forte en été (2,9 µg/L) qu’en hiver (0,2 µg/L).
243
 Avec des concentrations plus fortes dans les effluents de la maison de retraite que dans
les effluents hospitaliers ou dans les eaux usées en entrée de STEP, il peut être conclu que la
contamination des eaux usées par les antiépileptiques et les antidépresseurs provient de la
maison de retraite. En été la concentration en antiépileptiques et antidépresseurs est
sensiblement égale entre l’entrée (1,1 µg/L) et la sortie (1,2 µg/L) de STEP et en hiver, la
concentration mesurée en sortie (0,8 µg/L) est plus forte que celle mesurée en entrée (0,3
µg/L). Ceci traduit une mauvaise élimination de ces composés dans la STEP, en particulier de
la carbamazépine ce qui est en accord avec de nombreuses autres études (Ternes, 1998 ;
Bendz et al., 2005 ; Castiglioni et al., 2006 ; Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk-Hordern et al.,
2009 ; Miège et al., 2009). Ces composés ont été retrouvés eux aussi à une concentration plus
forte en été (97 ng/L) qu’en hiver (24 ng/L) dans les eaux de la rivière.
 Les bronchodilatateurs sont dosés à une concentration élevée (3 µg/L) dans les eaux
usées de la maison de retraite alors qu’ils sont dosés à moins de 50 ng/L dans les effluent
hospitaliers et en entrée de la STEP en été. En hiver, ils sont dosés à une concentrations plus
élevée dans les effluents hospitaliers (163 ng/L) que dans les effluents de la maison de retraite
ou dans les eaux usées en entrée de STEP. Ceci traduit une origine par les centres de soin
majoritaire et la différence été/hiver semble cohérente avec les modes d’usage de ces
médicaments. En effet, en été, avec la chaleur, les difficultés respiratoires sont plus
importantes, en particulier pour les personnes agées, ce qui explique un usage plus grand des
bronchodilatateurs en cette saison à la maison de retraite. En été, leurs concentrations sont
plus importantes en entrée (49 ng/L) qu’en sortie (22 ng/L) de STEP ce qui signifie que ces
composés sont bien éliminés. Ceci est en accord avec les résultats de Kasprzyk-Hordern et al.
(2009). En revanche, en hiver, les concentrations sont plus fortes en sortie (172 ng/L) qu’en
entrée de STEP (25 ng/L) ce qui signifie que les composés ne sont pas éliminés dans la STEP
ce qui est en accord avec les résultats de Castiglioni et al. (2006). En effet, ces auteurs
trouvent que le salbutamol n’est pas éliminé dans les STEP en hiver alors qu’il est un peu
éliminé en été (abattement : 12 %).
 Le gemfibrozil (hypolipémiant) n’a pas été dosé ni en été ni en hiver dans les eaux
usées provenant des centres de soin. Sa présence en entrée de STEP provient donc
uniquement des eaux usées urbaines. Ce composé est analysé à des concentrations similiaires
entre l’été et l’hiver et à des concentrations plus fortes en entrée (≈ 130 ng/L) qu’en sortie (≈
20 ng/L) de STEP. Il est donc relativement bien éliminé dans la STEP ce qui est en accord
avec les résultats de Ternes (1998), de Bendz et al. (2005), de Miège et al. (2009) et de Gros
et al. (2010) (cf. Annexe - tableau 1).
 Bien qu’ils soient dosés à des concentrations plus fortes dans les effluents hospitaliers
que dans les effluents de la maison de retraite ou dans les eaux usées en entrée de STEP en
été ; en hiver, les stimulants sont dosés à des concentrations équivalentes entre les 3 matrices.
Leur origine est donc variée et ces composés proviennent des 3 sources évoquées. Leurs
concentrations en sorties (0,1 - 0,5 µg/L) de STEP sont plus faibles qu’en entrée (7 - 13 µg/L)
ce qui traduit une bonne élimination dans les STEP. Néanmoins ils sont dosés à des
concentrations relativement importantes dans les eaux de surface (été : 151 ng/L, hiver : 198
ng/L).
Les résultats d’analyses globales du continuum hospitalier (Figure 89) montrent que la
contamination des effluents des centres de soins (hôpital et maison de retraite) est plus
importante en été qu’en hiver contrairement à ce qui avait été observé pour les premières
classes thérapeutiques étudiées (Figure 89). Ce sont majoritairement les analgésiques et les
AINS qui sont responsables de cette tendance. La différence de concentration entre l’été et
l’hiver n’est presque plus marquée dans les eaux usées en entrée de STEP et elle disparait en
sortie de STEP ou dans les eaux de la rivière. Comme pour les autres classes thérapeutiques
244
étudiées, en été comme en hiver, de façon globale, les eaux en entrée de STEP sont plus
contaminées qu’en sortie, il y a donc une bonne efficacité générale du traitement bien
qu’individuellement certaines molécules soient moins bien ou mal éliminées. La
contamination des eaux de surface est faible. En conclusion, une diminution globale de la
contamination est observée le long du continuum hospitalier.
35 000
30 000
25 000
20 000
été hiver 15 000

10 000
7 000
5 000
3 000 000 6 000
été hiver
5 000
2 500 000 3 000 000
4 000
3 000
2 000
2 000 000 2 500 000 1 000
0
1 500 000
hopital
hopital
hopital
hopital
retraite
retraite
retraite
retraite
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
sortie STEP
rivière
rivière
rivière
rivière
rivière
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
2 000 000
1 000 000 1 500 000
A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants
500 000 1 000 000
0 500 000
hopital
hopital
hopital
hopital
hopital
entrée STEP
entrée STEP
STEPSTEP
STEPSTEP
STEPSTEP
sortie STEP
retraite
sortie STEP
retraite
retraite
rivièreSTEP
retraite
rivièreSTEP
rivièreSTEP
retraite
rivière
hopitalrivière
hopitalrivière
hopitalrivière
hopitalrivière
hopital
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
entrée STEP
retraite
retraite
retraite
retraite
sortie STEP
retraite
sortie STEP
rivière
rivière
sortieentrée
sortieentrée
sortieentrée
sortie
sortie
sortie
AINS A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants
AINS A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants
Figure 91 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et
antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des
stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier (retraite : maison de retraite).
été hiver
2 745 2 755
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
sortie sortie entrée sortie rivière
hopital maison de STEP STEP
retraite

I.3.1.3 Bilan toutes classes thérapeutiques confondues
En additionnant les concentrations mesurées pour l’ensemble des 99 composés analysés, la

Figure 93 a été obtenue. Les concentrations estivales sont plus fortes que celles hivernales,
particulièrement dans le cas des effluents des centres de soin. Néanmoins, quelle que soit la
saison, les concentrations mesurées dans les effluents des centres de soin sont supérieures à
celles mesurées en entrée de STEP, elles-mêmes supérieures aux concentrations totales
mesurées en sortie de STEP. Les concentrations mesurées en sortie de STEP sont aussi plus
245
fortes que celles mesurées dans les eaux de surface. En conslusion, une diminution de la
contamination le long du continuum hospitalier a été observée.
été hiver
2 794 2 767
1 000 12
10
900
8
800 6
700 4
2
600 0
500 sortie rivière
400 STEP
300
200
100
0
sortie sortie entrée sortie rivière
hopital maison de STEP STEP
retraite

Par ailleurs, la contribution de chacune des 10 classes thérapeutiques à la contamination des

eaux a été étudiée (Figure 94).
été hiver
100%
100%
90% 90%
stimulants
80%
répartition (%)
stimulants
répartition (%)
80% hypolipémiants
70% 70%
hypolipémiants
60% 60% bronchodilatateurs
bronchodilatateurs
50% 50% antiép. et antidép.
antiép. et antidép.
40% 40% analgésiques et AINS
30% analgésiques et AINS
30%
sildénafil
20% 20%
viagra
10% 10% anti-VIH
anti-VIH
0% 0% anticancéreux
anticancéreux
sortie sortie entrée sortie rivière sortie sortie entrée sortie rivière b-bloquants
b-bloquants
hopital maison STEP STEP hopital maison STEP STEP antibiotics
de antibiotics de
retraite retraite
Figure 94 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long
du continuum hospitalier.
 En été, à l’exception des effluents de la station d’épuration, les analgésiques et AINS

sont responsables de la contamination des eaux à plus de 80 %. Les antibiotiques, les -
bloquants, les anti-VIH et les stimulants contribuent légèrement (≈ 10 %) à la contamination
des eaux usées en entrée de STEP. En sortie de STEP, la contamination des eaux se répartie
entre les -bloquants (37 %), les antibiotiques (23 %), les analgésiques et AINS (21 %) et les
antiépileptiques et antidépresseurs (12 %). Enfin, les antibiotiques et les -bloquants
participent respectivement à hauteur de 5 % et 7 % à la contamination des eaux de surface.
 En hiver, les analgésiques et AINS se partagent la contamination des eaux usées en
sortie des établissements de soin (hopital et maison de retraite) avec les antibiotiques. Ces
derniers representent alors respectivement 48 % et 17 % de la contamination des effluents
246
hospitaliers et de la maison de retraite. Le profil de contamination des eaux usées en entrée de

STEP est le même en hiver qu’en été. En sortie de STEP, la contamination des eaux se
répartie entre les -bloquants (43 %), les antibiotiques (29 %), les analgésiques et AINS (14
%) et les antiépileptiques et antidépresseurs (9 %). En dehors des anticancéreux, du sildénafil
et du gemfibrozil (hypolipémiant), la contamination des eaux de surface se répartie entre
toutes les classes thérapeutiques étudiées avec une majorité d’analgésiques et AINS et de
stimulants (36 % chacun).
I.3.2. Continuum agricole
I.3.2.1 Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux
Le long du continuum agricole, les antibiotiques et les -bloquants sont également les
composés les plus présents et les plus abondants (Figure 95). Le point numéro 5, qui
correspond au point « rivière » du continuum hospitalier, est le plus contaminé et révèle
l’impact du rejet de la STEP sur la contamination de la rivière, en particulier avec les anti-
VIH. Les points 1 et 2 sont contaminés majoritairement (> 80 %) par des antibiotiques (ex. :
érythromycine, lincomycine, enrofloxacine) ce qui met en avant une influence agricole de la
contamination, probablement lié à de l’élevage. En effet ces antibiotiques sont administrés
aux animaux et ils ont déjà été dosés par Hu et al. (2010) ou Martinez-Carballo et al. (2007)
dans des déchets d’élevage. De plus, l’enrofloxacine par exemple n’est utilisé qu’en médecine
vétérinaire (cf. chapitre 2).
été hiver 25
20
250
15
200 10
5
150 0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
100 anticancéreux anti-VIH sildénafil
50
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-VIH sildénafil
Figure 95 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-VIH

et sildénafil le long d'un continuum agricole, en été et en hiver.
La contamination des eaux de surface est faible (total < 100 ng/L sauf point 5 en été, 435
ng/L). Cependant, elle est plus forte en été qu’en hiver en particulier au niveau du point 5 en
raison de la plus faible dilution du rejet de STEP dans la rivière en été (Figure 96).
Contrairement au continuum hospitalier, une augmentation globale de la contamination est
observée le long du continuum agricole. Celle-ci est certainement due à l’influence croissante
de paramètres externes comme les zones agricoles et les rejets de STEP.
247
été hiver
500
400
300
200
100
0
1 2 3 4 5
Figure 96 : Concentration totale (∑78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole,
I.3.2.2 Etude des autres classes thérapeutiques
Comme pour le continuum hospitalier, au cours de ce projet « FLASH », 21 molécules

appartenant à 5 autres classes thérapeutiques (analgésiques et AINS, antiépileptiques et
antidépresseurs, bronchodilatateurs, hypolipémiants et stimulants) ont été analysées. Comme
ces classes ne font pas l’objet directement de ces travaux de thèse, les résultats de leurs
analyses ne sont présentés que très brièvement dans le paragraphe suivant.
été hiver
2885
40
500 30
20
400 10
0
300 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
A-épi & A- broncho. hypolip.

200 dép
100
0
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
AINS A-épi & A- broncho. hypolip. stimulants

dép
Figure 97 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et
antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des
stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum agricole.
Comme pour le continuum hospitalier, les analgésiques et AINS ainsi que les stimulants sont
les plus abondants et les plus présents le long du continuum agricole (Figure 97). Comme
pour les autres classes thérapeutiques étudiées dans la partie précédente (cf. I.3.2.1), le point
numéro 5 est le plus contaminé et révèle l’impact du rejet de la STEP sur la contamination de
la rivière, en particulier avec les analgésiques et AINS. Les niveaux de contamination des
eaux de surface par ces classes thérapeutiques sont plus élevés qu’avec les 5 autres classes
étudiées (cf. I.3.2.1). En effet, les concentrations des analgésiques et AINS varient entre 23 et
2885 ng/L et celles des stimulants entre 2 et 285 ng/L alors que celles des antibiotiques et des
-bloquants varient respectivement entre 5 et 180 ng/L et 0 et 240 ng/L. L’évolution globale
de la contamination le long du continuum sera donc influencée par les tendances de ces
248
classes thérapeutiques. Pour cette raison, elle ne sera pas détaillée dans ce paragraphe et
l’évolution globale pour l’ensemble des 10 classes sera présentée dans la partie I.3.2.3.
I.3.2.3 Bilan toutes classes thérapeutiques confondues
En additionnant les concentrations mesurées pour l’ensemble des 99 composés analysés, la

Figure 98 a été obtenue. Au niveau des points 1 et 2, les moins impactés par les activités
anthropiques, les concentrations estivales et hivernales sont équivalentes et sont faibles (< 150
ng/L). Au niveau des points 3 et 4, les concentrations hivernales sont un peu plus élevées que
les concentrations estivales et sont comprises entre 266 ng/L et 874 ng/L. Ces concentrations
sont donc plus importantes que celles des points 1 et 2. Enfin, au niveau du point 5, les
concentrations mesurées sont plus fortes en été (3571 ng/L) qu’en hiver (548 ng/L). En été, la
concentration en molécules pharmaceutiques au niveau du point 5 (3571 ng/L) est supérieure
à celle du point 4 (319 ng/L). En hiver, la concentration au niveau du point 5 (548 ng/L) est
équivalente à celle du point 3 (562 ng/L) et est un peu plus faible qu’au niveau du point 4
(874 ng/L). En conclusion, une augmentation de la contamination a été observée le long du
continuum agricole.
été hiver
4 000
3 500
3 000
2 500
2 000
1 500
1 000
500
0
1 2 3 4 5
Figure 98 : Concentration totale (∑99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole,
été hiver
100% 100%
90% 90% stimulants
stimulants
80% 80% hypolipémiants
hypolipémiants
répartition (%)
répartition (%)
70% 70% bronchodilatateurs

bronchodilatateurs
60% 60%antiép. et antidép. antiép. et antidép.
50% 50%analgésiques et AINS analgésiques et AINS
40% 40%viagra sildénafil
30% 30%anti-VIH anti-VIH

anticancéreux
20% 20%anticancéreux
b-bloquants
10% 10%b-bloquants
antibiotics
0% 0%antibiotics
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Figure 99 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long
du continuum agricole.
249
Comme pour le continuum hospitalier, la contribution de chacune des 10 classes

thérapeutiques à la contamination des eaux a été étudiée (Figure 99). En été, ce sont
principalement les analgésiques et les AINS qui contribuent à la contamination des eaux mais
les stimulants, les antibiotiques et les -bloquants dans une moindre mesure sont également
présents. En hiver, au niveau des points 1 et 2, ce sont les stimulants qui contribuent le plus à
la contamination des eaux alors qu’au niveau des points 3 et 4, ce sont les analgésiques et les
AINS. Au niveau du point 5, 7 des 10 classes thérapeutiques participent à la contamination de
l’eau or les anti-VIH et les bronchodilatateurs par exemple n’apparraissent pas en amont de ce
point ce qui met en évidence l’impact du rejet de la STEP sur la contamination.
I.4. Conclusion sur la contamination des eaux
De l’ensemble de toutes ces analyses environnementales (tests d’applicabilité des protocoles,

continuum Hérault et FLASH), il ressort que les -bloquants, les anti-VIH et les antibiotiques
appartenant aux familles des macrolides, des fluoroquinolones et des sulfonamides, sont les
molécules responsables de la contamination des eaux parmi les 5 classes étudiées au cours de
cette thèse (Figure 100).
Tableau 66 : Fréquences (F) de détection des 32 molécules communes recherchées dans l’ensemble de tous
les effluents de STEP analysés au cours de ces travaux de thèse.
10 effluents AMPERES Hérault F
FLASH
CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 L CL P B (%)
amoxicilline x x x x 29
ampicilline 0
pénicilline G 0
pénicilline V x 7
oxacilline x x x 21
ceftiofur 0
cefpodoxime 0
clarithromycine x x x x x x x x x x x x x x 100
érythromycine x x x x x x x x x x x x x x 100
roxithromycine x x x x x x x x x x x x 86
lincomycine x x 14
chloramphénicole 0
ciprofloxacine x x x x x x x x x x x 79
ofloxacine x x x x x x x x x x x x x 93
acide oxolinique x 7
fluméquine x x x x x x x 50
tétracycline x x x x x x x 50
oxytétracycline x 7
chlortétracycline 0
doxycycline x x x x x 36
sulfaméthazine 0
sulfaméthoxazole x x x x x x x x x x x x x 93
triméthoprime x x x x x x x x x x x x 86
metoprolol x x x x x x x x x x x x x 93
propranolol x x x x x x x x x x x x x 93
daunorubicine 0
doxorubicine 0
épirubicine 0
ifosfamide 0
cyclophosphamide 0
ritonavir x x x x x x x x x x x 79
zidovudine x x x x x x x x 57
250
Figure 100 : Contribution des familles d’antibiotiques et des classes thérapeutiques à la contamination des
différents échantillons d’eau analysés au cours de ces travaux de thèse.
251
A partir des analyses des effluents de STEP (AMPERES, continuum Hérault et FLASH), il
ressort que parmi les 32 molécules communes à toutes les analyses, la clarithromycine et
l’érythromycine sont retrouvées dans tous les échantillons (Tableau 66). L’ofloxacine, le
sulfaméthoxazole et les 2 -bloquants (métoprolol, propranolol) sont également souvent dosés
avec une fréquence de détection de 93 % (Tableau 66). Au total, 10 composés sont détectés
dans plus de 75 % des échantillons. En plus de ceux évoqués précédement, il s’agit de la
roxithromycine (86 %), du triméthoprime (86 %), de la ciprofloxacine (79 %) et du ritonavir
(79 %). Avec une fréquence de détection de 57 %, le deuxième anti-VIH, la zidovudine, est
aussi mesurée dans plus de la moitié des échantillons. La fluméquine et la tétracycline sont
identifiées dans 50 % des rejets de STEP. Les autres composés comme l’acide oxolinique, la
lincomycine ou certaines pénicillines sont détectées dans moins de 30 % des échantillons.
Enfin, l’amoxicilline et la pénicilline G, les 2 céphalosporines, les 5 anticancéreux, la
sulfaméthazine, la chlortétracycline et le chloramphénicole n’ont jamais été identifiés.
D’après les résultats des études saisonnières du continuum Hérault et du projet FLASH, il a
été mis en évidence une contamination des eaux usées plus importante en hiver qu’en
été (Figure 83 et Figure 89) et inversement, une contamination des eaux de surface plus
importante en été qu’en hiver (Figure 83 et Figure 96). Il a également été mis en évidence que
les rejets de STEP contribuent à la contamination des systèmes aquatiques (Figure 80, Figure
82 et Figure 99). En conséquence, pour comparer l’impact des différentes STEP étudiées, les
flux de molécules pharmaceutiques qu’elles rejettent ont été calculés à partir de leurs débits et
des concentrations totales en molécules pharmaceutiques et sont présentés Figure 101A. Il en
résulte : i) que le flux de molécules pharmaceutiques rejetées n’est pas proportionnel au
nombre de composés qui ont été analysés et retrouvés dans les échantillons correspondant, et
ii) que plus le débit de la STEP est important et plus la quantité de molécules
pharmaceutiques émise est élevée. Ainsi, bien qu’un plus grand nombre de composés aient été
recherchés et aient été retrouvés dans les effluents de la STEP du projet FLASH, ce n’est pas
la station qui rejette la plus grande quantité de molécules (STEP FLASH été = 13,3 g/j, SE-
PA1 = 59,2 g/j, SE 4 = 22,5 g/j et CA 5= 16,4 g/j). Par ailleurs, ce n’est pas parce qu’une
STEP présente les plus fortes concentrations en composés pharmceutiques (Figure 101B) que
c’est elle qui émet les plus gros flux. Le débit de la STEP est en fait le paramètre qui explique
les tendances observées. Ainsi plus le débit de la station est important et plus la quantité de
médicaments rejetés est forte.
60 000 30 000
50 000 25 000
40 000 20 000
débit (m3/j)
flux (mg/j)
30 000 15 000 8 000

7 000
6 000
20 000 10 000 5 000
4 000
3 000
10 000 5 000
2 000
1 000
0 0 0
été
hiver
P été
B hiver
été
CA 5
CL hiver
L été
P hiver
CA PA 1
L hiver
CA 5
B été
CA PA 1
B été
L été
CL été
SE 4
SE 5
SE 6
SE 9
hiver
SE PA 1
SE PA 2
CL hiver
P hiver
CL été
P été
SE PA 1
SE PA 2
SE 4
SE 5
SE 6
SE 9
B hiver
L hiver
CA 6
CA 6
A B
10 effluents AMPERE Hérault FLASH 10 effluents AMPERE Hérault FLASH
Figure 101 : A) Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP
étudiées au cours des différents projets et débits, en m3/j (courbe) (remarque : flux du continuum Hérault
calculé à partir des débits moyens annuels des STEP), B) concentrations totales, en ng/L, en molécules
pharmaceutiques émises par les STEP.
252
II. Application aux matrices « lisiers »
Une fois les méthodologies adaptées et optimisées, elles ont pu être appliquées pour évaluer la
présence et le devenir des antibiotiques dans les lisiers porcins dans le cadre de l’ANR
DIPERPHA.
II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier
Dans le cadre de l’analyse de lisiers porcins, seuls les antibiotiques ont été recherchés. Parmi
les 32 molécules pharmaceutiques retenues dans la première liste des molécules à étudier, 23
sont des antibiotiques. Une fois le protocole « multi-résidus 32 » adapté pour l’analyse des
lisiers porcins, ces 23 antibiotiques ont pu être dosés dans cette matrice. Ce premier protocole
a été utilisé pour les tests sur le mode de conservation des échantillons (cf. II.2.
Conditionnnement des échantillons).
Dans un second temps, la liste des molécules sélectionnées a été étendue à 78 composés parmi
lesquels 52 antibiotiques. De la même façon qu’avec le protocole « multi-résidus 32 », une
fois que le protocole « multi-résidus 78 » a été adapté à l’étude des lisiers porcins, les 52
antibiotiques ont pu être analysés dans cette matrice. Ce deuxième protocole a été appliqué à
l’étude de la phase dissoute de 32 échantillons de lisier provenant des différents élevages
(filière simple et filière complexe) ou prélevés en différents points des filières de traitement.
Ces premières analyses ont été réalisées en triplicat et ont permis de mettre en évidence une
bonne répétabilité du protocole avec une variabilité moyenne de 35 % (médiane = 22 %). En
raison de cette bonne répétabilité, il a été décidé par la suite que les analyses ne seraient plus
faites en triplicat.
De plus, ces premières analyses ont permis d’identifier les antibiotiques les plus fréquemment
détectés dans la phase dissoute et d’estimer les niveaux de contamination. Parmi les 52
antibiotiques recherchés, 18 ont été trouvés au moins une fois (Figure 102). L’enrofloxacine,
régulièrement analysée dans la littérature (Pierini et al., 2004 ; Al Gros et Jourdain, 2007 ;
Martinez-Carballo et al., 2007) ou encore l’amoxicilline, connue pour être administrée dans
les élevages français, n’ont jamais été retrouvées. Ceci peut être du, soit au fait que ces
molécules ne sont pas administrées dans les élevages étudiés, soit à des faiblesses analytiques,
notamment dans le cas de l’amoxicilline. Suite à ces analyses, une liste réduite de 21
antibiotiques a été retenue pour le dosage en routine de lisiers porcins. Elle comprend les 18
antibiotiques retrouvés au moins une fois lors des premières analyses de la phase dissoute
(Figure 102) auxquels 3 fluoroquinolones (l’enrofloxacine, la norfloxacine et la
ciprofloxacine) ont été ajoutés car ils sont rapportés comme régulièrement détectés dans les
études publiées. Cependant, pour pouvoir comparer l’efficacité des filières de traitement du
lisier, stockage simple et traitement, il est nécessaire d’avoir les mêmes molécules dans les 2
types d’échantillons. De même pour étudier l’influence du stade physiologique des porcs sur
la concentration en antibiotiques du lisier ou l’efficacité du traitement tout au long de la
filière, il est intéressant d’avoir des molécules présentes dans la quasi-totalité des échantillons.
En conséquence, pour réduire les efforts et les coûts analytiques, tout en optimisant les études
d’impact du traitement du lisier ou du stade physiologique des porcs, une liste plus réduite a
été établie en se basant sur les fréquences de détection (Figure 102). Les 7 composés
retrouvés dans plus de 50% des échantillons ont ainsi été retenus et ont été analysés dans la
totalité des échantillons prélevés dans les élevages et lors des suivis en conditions contrôlées.
Il s’agit de la lincomycine, de la sulfadiazine, de l’oxytétracycline, de la tétracycline, de la
marbofloxacine, de la tylosine et de la monensine. Par ailleurs, cette sélection présente
253
l’avantage d’avoir un composé par famille d’antibiotique les plus importantes (tétracyclines,
lincosamides, sulfonamides, macrolides, polyéthers et fluoroquinolones).
fréquence de détection des antibiotiques

100 100
100 95
82 82 81
fréquence (%) 80 68
60
36
40 28 28
22 19 19
20 14 13
9 6 5
0
Figure 102 : Fréquence de détection des 18 antibiotiques retrouvés au moins une fois à l’issus des
premières analyses de la phase dissoute d’échantillons de lisier provenant à la fois des filières simples et
complexes.
II.2. Conditionnement des échantillons
Le mode de conservation des échantillons entre l’étape de prélèvement et celle de traitement a

été étudié de façon à éviter toute perte d’information consécutive à une détérioration des
échantillons. Deux paramètres ont été testés: la congélation et l'ajout d'un agent de
conservation tel que le formaldéhyde. La combinaison de ces 2 paramètres a également été
évaluée conduisant ainsi à comparer le dosage d'un même échantillon dans 4 conditions : frais
(conservé à 4°C), frais + formaldéhyde, congelé (conservé à -20°C), congelé + formaldéhyde.
Les résultats de ce test sont présentés dans la Figure 103. Il en résulte, qu’à l'exception de la
lincomycine, les concentrations quantifiées dans les échantillons contenant du formaldéhyde
sont plus faibles que celles trouvées dans ceux sans agent de conservation. Deux hypothèses
peuvent expliquer ce résultat : soit l'ajout de formaldéhyde ne permet pas une bonne
conservation soit le formaldéhyde provoque une élution des composés lors du passage des
échantillons sur les cartouches durant l'étape de SPE. En conséquence, le formaldéhyde a été
éliminé comme moyen de conservation.
Par ailleurs les concentrations trouvées dans les lisiers traités après congélation se sont
révélées être plus fortes que celles trouvées dans les lisiers conservés à 4°C et traités dans les
48h après le prélèvement. Deux hypothèses ont été émises pour expliquer cette remarque : i)
dans les échantillons frais, les antibiotiques ont été dégradés avant d’être analysés, ou ii) dans
les échantillons congelés, certains colloïdes ou micro-organismes renfermant les composés,
ont éclaté à la congélation libérant ainsi les molécules dans la phase dissoute. Lors du dosage
de la phase dissoute des échantillons frais, ces dernières étaient retenues dans la phase solide
ou particulaire et n'étaient pas prise en compte.
254
frais (n=4) F + F (n=4) congelé (n=3) C + F (n=3)

31 000 25 681
(ng/l) (ng/l)
frais
26 000(n=4) 22F560
+ F (n=4) congelé (n=3) C + F (n=3)
16 947
21600
31 000 17 128
concentration
25 681
16600
26 000 22 560 8 603
11 000 4 660 16 947
21 600 4 749
concentration
173128
936 4 238 2 988
6 000
161600
2 000 1 302
8 603
111600
800
1 600 4 660
61600
400 4 749
3 936
4 238 2 988
1 200
11600
000
800 517
493
600
400 180 156 198
200 87 7 70 70 24
0
Figure 103 : Concentration moyenne en antibiotiques d'un même lisier de porc en fonction des différentes
conditions de conservation (F + F : frais + formaldéhyde; C + F : congelé + formaldéhyde).
Pour trancher entre ces 2 possibilités, la meilleure solution aurait été de doser les molécules
dans les 3 phases ; de vérifier qu'au final la concentration totale pour une molécule est bien la
même pour un même échantillon traité frais ou congelé et, de s'assurer qu'après congélation,
si la concentration dans la phase dissoute augmente alors celle dans la phase solide et/ou
particulaire diminue. Comme les analyses des phases solides et particulaires n'ont pu être
effectuées par manque de protocole adéquat à l’époque de ces tests, une alternative a alors été
de séparer les phases avant la congélation pour éviter tout transfert des molécules d'une phase
vers l'autre. Par conséquent, une deuxième expérience a été réalisée. Au cours de celle-ci, 3
conditions ont été comparées : i) lisier frais c'est-à-dire prélevé puis préparé dans les 24h, ii)
lisier frais centrifugé puis filtré puis congelé, noté lisier CF C, où les 3 phases sont séparées
avant la congélation pour éviter tout transfert de l’une vers l’autre et enfin, iii) lisier congelé
puis traité, noté lisier C CF. Les résultats de cette seconde expérience sont présentés dans la
Figure 104.
Le premier résultat confirme celui de la première expérience : les concentrations dans la phase
dissoute sont toujours supérieures dans le lisier traité après congélation que dans celui
conservé à 4°C (frais) et traité 48h après le prélèvement. Si ce phénomène était du à une
dégradation des composés dans les échantillons frais, les concentrations entre le lisier CF C et
le lisier C CF devraient être les mêmes ce qui n'est pas le cas. Dans le cas d'un changement de
spéciation, le fait d'avoir séparé les phases avant la congélation doit éviter ce phénomène et
les concentrations trouvées dans le lisier CF C devraient être proches de celles du lisier frais.
Comme pour la plus part des composés, et en particulier pour les composés les plus abondants
tels que l'oxytétracycline et la doxycycline ou encore la lincomycine, la tendance suivante est
observée : frais < CF C < C CF. Il y a donc très certainement un phénomène de changement
de spéciation qui se produit lors de la congélation. En conséquence, pour éviter les
phénomènes de dégradation tout en limitant ceux liés au changement de spéciation, le mode
opératoire suivant a été choisi : prélèvement des échantillons, centrifugation dans les 12h puis
filtration dans les 24-48h et enfin congélation à -20°C jusqu’à extraction. Les différentes
phases sont donc séparées avant la congélation pour préserver l’intégrité de l’échantillon.
255
lisier frais lisier CF C lisiers C CF

16 100 11909
14 100
(ng/l)
lisier frais lisier CF C lisiers C CF
12 100
concentration
10 100
16 100 11909
8 100
14 100
(ng/l)
6512
6 100
12 100 4343
4 100 1923
concentration
10 100
2 100
1301
880
8100
100
100
concentration (ng/l) 6512
90
6 100
80 4343 70 71
70 62 59
4 100
60
1923
50
33 1301
50
2 100 880 24 37
40 27
22
25 28 25
30 22
100
20 11 15 18
10
0
Figure 104 : Concentration moyenne (n=3) en antibiotiques d'un même échantillon de lisier porcin en
fonction des différentes conditions de traitement (C : congelé; CF : centrifugé/filtré).
II.3. Origine de la contamination du lisier stocké
Dans les élevages étudiés, les porcs sont répartis par bâtiment en fonction de leur stade de
développement : porcelets juste sevrés (notés PS pour post-sevrage), truies gestantes ou
venant de mettre-bas (notés MATER pour maternité) et porcs/truies à l’engraissement (noté
ENG). Chacun des trois bâtiments est relié à la fosse de stockage du lisier. Lors des tous
premiers prélèvements, du lisier brut (LB) a été prélevé directement à la sortie d’un des
bâtiments d’élevage et du lisier stocké (LS) a été prélevé dans la fosse. Lors des analyses de la
phase dissoute de ces premiers échantillons, il est apparu que dans l’élevage 1, le lisier brut
était toujours plus contaminé par les antibiotiques que le lisier stocké alors qu’à l’inverse,
dans l’élevage 2, il l’était moins. La contamination du lisier stocké était quant à elle du même
ordre de grandeur entre les 2 élevages. Dans l’élevage 1, le lisier brut provenait
systématiquement du bâtiment post-sevrage et dans l’élevage 2, du bâtiment engraissement.
Aussi, une première étude a été conduite pour analyser la contamination du lisier brut
provenant des différents bâtiments d’élevage et celle du lisier stocké. Elle a été mise en œuvre
afin :
1. de déterminer si l’origine du lisier brut, et donc le stade physiologique des porcs,
pouvaient avoir une influence sur le niveau de contamination du lisier par les
antibiotiques.
2. de savoir si le niveau de contamination du lisier stocké représentait une moyenne ou une
somme de la contamination des lisiers bruts. Dans le premier cas, lors du mélange dans la
fosse de stockage, il pourrait y avoir une dilution des lisiers bruts fortement contaminés
(ex. : élevage 1) ou un enrichissement des lisiers peu pollués (ex. : élevage 2). La
deuxième hypothèse expliquerait pourquoi, dans l’élevage 2, le lisier stocké est plus
contaminé que le lisier brut. Dans ce cas-là, si le lisier stocké de l’élevage 1 est moins
contaminé que le lisier brut, c’est peut-être parce qu’il y a eu des phénomènes de
dégradation des composés dans la fosse ou de dilution suite à des précipitations.
256
3. de savoir si les antibiotiques administrés sont les mêmes pour un même stade
physiologique dans les différents élevages ou si ce sont les mêmes traitements
administrés à tous les stades mais spécifique à chaque élevage.
Pour répondre à ces questions, il a été décidé qu’une campagne de prélèvement spécifique
serait réalisée et qu’au cours de cette dernière, du lisier brut provenant de chacun des 3
bâtiments ainsi que du lisier stocké seraient prélevés. Les prélèvements ont été réalisés en
août 2009 pour l’élevage 3 et en octobre 2009 pour l’élevage 1. Pour l’élevage 2, seuls LB
MATER et PS ont été prélevés en octobre 2009, leurs concentrations sont comparées avec
celles des LB ENG et LS prélevés à la même époque mais un an plus tôt (fin septembre
2008).
II.3.1. Origine du lisier brut et niveau de contamination
ENG ENG
PS
PS MATER
ENG MATER
MATER PS
Figure 105 : Répartition de la contamination des lisiers bruts en fonction de leur bâtiment d'origine
(phase solide et phase liquide prise en compte) (ENG : engraissement, MATER : maternité, PS : post-
sevrage).
La répartition de la contamination entre les 3 lisiers bruts s’est révélée être différente d’un
élevage à un autre (Figure 105). Pour l’élevage 1, ce sont les porcs à l’engraissement qui
produisent les lisiers les plus contaminés en antibiotiques. Pour l’élevage 2, la contamination
du lisier provenant du bâtiment des porcelets sevrés est aussi importante que celle du lisier
provenant des truies gestantes. Enfin, pour l’élevage 3, le lisier le plus contaminé provient du
bâtiment des porcelets sevrés. Par conséquent, aucun lien ne peut être fait de façon générale
entre le stade physiologique des porcs et le niveau de contamination du lisier. Le lisier brut
provenant du stade post-sevrage n’est donc pas toujours le lisier brut le plus contaminé
contrairement à ce qu’il pouvait être attendu. En effet, au moment du sevrage, les porcelets
sont plus vulnérables et donc plus soignés. Néanmoins, dans les élevages 2 et 3, la
contamination des lisiers bruts provenant du bâtiment post-sevrage est plus importante que
celle des autres stades, ce qui laisse supposer que les porcelets en post-sevrage reçoivent
beaucoup d’antibiotiques. Cependant, ces interprétations ne sont valables que si les volumes
de lisier, et par conséquent les flux, sont considérés comme homogènes entre les batiments et
entre les élevages.
II.3.2. Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers

bruts
Le lisier stocké de l’élevage 1 est plus contaminé que n’importe quel lisier brut (Figure 106).
Son niveau de contamination ne reflète donc pas un niveau moyen de contamination qui
257
proviendrait du mélange des lisiers bruts. Dans cet élevage là, il semblerait donc intéressant,
d’un point de vue environnemental, d’épandre séparément chacun des lisiers bruts, en
particulier le lisier provenant du bâtiment maternité, dans le but de limiter la pollution des sols
par les antibiotiques.
Le lisier stocké de l’élevage 2 est légèrement plus contaminé que les lisiers bruts provenant
des bâtiments de maternité et de post-sevrage (Figure 106). Son niveau de contamination ne
reflète donc pas ni une moyenne ni une somme de la contamination des lisiers bruts. Dans cet
élevage, il serait intéressant d’épandre séparément le lisier provenant du bâtiment des porcs à
l’engraissement mais le stockage des lisiers ne semble pas augmenter les risques de pollution
des sols par les antibiotiques.
Enfin, le lisier stocké de l’élevage 3 contient beaucoup moins d’antibiotiques que les lisiers
bruts provenant des bâtiments de maternité et de post-sevrage (Figure 106). Son niveau de
contamination ne reflète donc pas la somme de la contamination des lisiers bruts. Dans cet
élevage, il semble utile de mélanger et de stocker les lisiers avant de l’épandre sur les terres
agricoles. Par ailleurs, le lisier de l’élevage 3 est plus contaminé que celui des deux autres
élevages ce qui reflète un caractère élevage-dépendant du niveau de contamination global du
lisier.
LB ENG LB MATER LB PS LS
1 000
9 000 800
8 000 600
7 000 400
6 000 200
5 000
0
4 000 1 2
3 000
2 000
1 000
0
1 2 3
élevage
Figure 106: Niveau de contamination du lisier stocké et brut en fonction de son origine (LB ENG : lisier
brut engraissement, LB MATER : lisier brut maternité, LB PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier
stocké). Pour l’élevage 2, les données de LB ENG et LS proviennent d’analyses qui ont été réalisées sur du
lisier prélevé à la même époque mais un an auparavant par rapport à LB MATER et LB PS.
En conclusion de cette étude, suivant les élevages, le lisier stocké est soit autant, soit plus, soit
moins contaminé que le lisier brut. Par conséquent, la contamination du lisier stocké ne
représente ni la moyenne ni la somme de la contamination des lisiers bruts, à moins que des
phénomènes de dégradation particulièrement efficaces (élevage 3) et différents d’un élevage à
l’autre n’interviennent. Le suivi sur 5 mois du niveau de contamination du lisier stocké a
permis d’étudier si des phénomènes de dégradation interviennent malgré l’apport régulier de
lisier brut provenant d’un bâtiment ou d’un autre (cf. partie II.5. de ce chapitre). Par ailleurs, il
faut prendre en considération que toutes ces remarques sont issues de l’analyse d’un
échantillon unique de chaque sorte de lisier dans chacun des élevages, la généralisation des
résutlats ne serait donc pas pertinente bien que du point de vue analytique les différences
soient avérées.
258
II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et

de l’élevage considéré
Une analyse détaillée, molécule par molécule, du niveau de contamination de chaque lisier
brut (Figure 107) semble indiquer que sur un même élevage, un antibiotique est plus
administré qu’un autre à certains stades physiologiques mais aucune généralité ne peut être
faite pour l’ensemble des élevages. Par exemple, la marbofloxacine est retrouvée dans les
lisiers du stade post-sevrage de l’élevage 2 alors qu’elle est analysée dans les lisiers du stade
maternité de l’élevage 3. Autre exemple, la lincomycine semble être administrée aux stades
post-sevrage et maternité d’après l’analyse des lisiers des élevages 1 et 3 alors qu’elle semble
être administrée au stade importance
engraissement dans
relative l’élevageantibiotiques
des différents 2. à la
contamination global du lisier en fonction de son
origine
100%
monensine
contamination (%)
80% sulfadiazine
tétracycline
40% marbofloxacine
20% lincomycine
tylosine
0%
ENG
ENG
ENG
MATER
MATER
MATER
PS
PS
PS
Figure 107: Part relative de chaque antibiotique à la contamination globale du lisier en fonction de son
origine (ENG : lisier brut engraissement, MATER : lisier brut maternité, PS : lisier brut post-sevrage,
LS : lisier stocké).
Les pratiques médicales vétérinaires ne semblent donc pas être les même d’un élevage à
l’autre que se soit en terme de molécules (Figure 107) ou de doses administrées (Figure 106).
Par ailleurs, aucun antibiotique ne semble être spécifique d’un élevage. Toutes les molécules
ont été analysées dans tous les élevages bien qu’elles ne soient pas administrées au même
stade.
II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier
En France, la plupart des élevages porcins disposent d’une fosse de stockage qui permet de
conserver le lisier avant qu’il ne soit épandu pour enrichir les sols agricoles. Cependant, dans
certaines zones, quand le lisier contient trop d’azote, il ne peut être utilisé pour de telles
pratiques (directive nitrates, (European Commission, 1991)). Pour résoudre ce problème,
certains élevages, ou groupement d’élevages, se sont équipés d’un système de traitement du
lisier, sorte de mini station d’épuration. Un des objectifs du projet DIPERPHA, dans le cadre
duquel ces analyses de lisiers ont été réalisées, est de connaître le devenir des antibiotiques
lors du stockage et du traitement des effluents issus des élevages porcins. C’est pourquoi il a
été réalisé l’étude sur 5 mois du lisier stocké dans 3 élevages traditionnels (filières simples) et
l’étude, à 2 dates (printemps et automne), le long de la filière de traitement dans 2 élevages
possédant un système différent de traitement du lisier (filières complexes).
259
II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier
Dans les 3 élevages étudiés, la fosse de stockage est régulièrement remplie par l’arrivée de
lisier brut provenant des différents bâtiments d’élevage nettoyés toutes les 3-4 semaines.
Celle-ci est ensuite vidée deux fois par an, à l’automne et au printemps généralement, et le
lisier est utilisé comme engrais pour les sols agricoles. Une étude a consisté à suivre sur 5
mois le niveau de contamination des fosses de stockage. L’intérêt de cette étude était de
savoir si le fait de stocker le lisier avant de l’épandre permet d’en faire varier la contamination
en antibiotiques. Trois situations sont envisageables : i) la contamination diminue au cours du
temps à cause des phénomènes de dégradation ou de dilution par les eaux pluviales, ii) la
contamination augmente au cours du temps consécutivement à l’accumulation de lisiers
contaminés par les antibiotiques, ou iii) la contamination reste stable au cours du temps avec
des phénomènes de dégradation/dilution qui compensent les apports. Au cours des 5 mois
d’analyse, aucune tendance n’a pu être dégagée sur l’évolution de la contamination totale
(phase liquide et phase solide) du lisier stocké (Figure 108). Il semblerait que dans l’élevage 1
la contamination augmente au cours du remplissage de la fosse, que dans l’élevage 2 elle
diminue et que dans l’élevage 3 elle reste plus ou moins constante. Ainsi les variations des
concentrations totales en antibiotiques sont aléatoires et tous les cas de figures évoqués sont
représentés. Si ces résultats sont mis en parallèle avec ceux concernant le niveau de
contamination du lisier stocké par rapport à celui des lisiers bruts, il n’est pas possible de
conclure sur l’intérêt de stocker le lisier avant épandage afin d’en réduire la pollution par les
antibiotiques. Au contraire, le stockage peut même contribuer à en augmenter le niveau
(élevage 1). De plus, bien que variables, les concentrations totales en antibiotiques du lisier
stocké sont très élevées et fluctuent entre 0,2 et 1,05 mg/L de lisier. D’un point de vue
écologique, ces concentrations représentent un risque écotoxicologique car elles sont de
l’ordre de grandeur de certaines EC50lapour
évolution de
des cyanobactéries d’eau douce par exemple (EC50
contamination total du lisier stocké sur 5
Microcystis aeruginosa = 0,207 mg/L (Holten Lützhøft
mois dans et al.,
3 élevages 1999)).
porcins différents
1 200
1 000
800
600
400
200
0
Figure 108 : Evolution de la contamination totale du lisier stocké en fosse durant 5 mois dans 3 élevages
porcins différents.
L’analyse séparée des phases dissoute et solide (Figure 109) montre que les tendances dans
chacune des deux phases ne sont pas les mêmes. Au cours des 5 mois de suivi, la
contamination de la phase dissoute du lisier stocké des élevages 1 et 2 semble diminuer. Celle
de l’élevage 3 varie de façon aléatoire. Contrairement à la contamination de la phase dissoute
qui décroit, la contamination de la phase solide augmente au cours des 5 mois de suivi
essentiellement dans les élevages 1 et 3. Celle de l’élevage 2 varie de façon aléatoire. Il
semblerait que les tendances globales (Figure 108) soient liées à celles de la phase solide
(Figure 109 b), en particulier dans les élevages 1 et 2.
260
phase dissoute
300
250
200
150
100
50
0
élevage 1 élevage 2 élevage 3 (a)
phase solide
60
concentration (µg/g)
50
40
30
20
10
0
(b)
Figure 109 : Evolution de la contamination de la phase dissoute (a) et de la phase solide (b) du lisier stocké
en fosse pendant les 5 mois de suivi dans les 3 élevages.
suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents
1 200
1 000
monensine
800
marbofloxacine
suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents tétracycline
600
tylosine
400 lincomycine
1 200 sulfadiazine
200 oxytétracycline
1 000
0
04/11/08
04/11/08
04/11/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
27/08/08
27/08/08
19/01/09
monensine
800 suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents marbofloxacine
élevage 1 élevage 2 élevage 3 tétracycline
600 250
tylosine
400 lincomycine
200
sulfadiazine
monensine
200 150 marbofloxacine
oxytétracycline
tétracycline
0 100 tylosine
04/11/08
04/11/08
04/11/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
27/08/08
27/08/08
19/01/09
lincomycine
50 sulfadiazine
0
04/11/08
04/11/08
04/11/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
08/07/08
28/07/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
27/08/08
27/08/08
19/01/09

Figure 110 : Evolution détaillée par molécule de la contamination du lisier de la fosse de stockage sur 5
mois de suivi dans 3 élevages différents, en tenant compte (haut) ou non (bas) de l’oxytétracycline.
261
L’évolution de la concentration de chaque molécule individuellement au cours de ces 5 mois

de suivi a ensuite été étudiée. Il en résulte (Figure 110 haut) que les tendances globales sont
essentiellement liées à celle de l’oxytétracycline, la molécule majoritaire (> 50%). Si
l’oxytétracycline n’est plus prise en compte (Figure 110 bas), des tendances différentes sont
observées. Néanmoins, aucune généralité ne peut être faite sur les 3 élevages. En
conséquence, que ce soit de façon globale ou individuelle pour chaque molécule, la
contamination du lisier stocké est aléatoirement variable au cours des 5 mois de suivi. La
prise en compte de paramètres tels que les précipitations, les volumes de lisier brut apportés,
le temps écoulé entre le dernier apport de lisier brut et la date de prélèvement ou l’origine du
dernier lisier brut auraient peut-être pu expliquer les tendances observées s’ils avaient été
suivis. En conclusion, le stockage du lisier dans la fosse ne permet pas d’en modifier
significativement la contamination par les antibiotiques. Ces derniers ne semblent pas être
dégradés par les traitements anaérobies mis en œuvre dans ce type de stockage.
Les résultats des analyses des phases dissoutes et solides ont ensuite été exploités de façon
séparée afin de savoir comment les molécules se répartissent entre les deux phases et si les
mêmes molécules sont présentent dans les 2 phases.
Les analyses séparées des phases dissoutes et solides du lisier ont mis en évidence une
répartition différente des antibiotiques. L’oxytétracycline est la molécule majoritaire. Elle
représente plus de 50% de la contamination de la phase dissoute et plus de 70% de la
contamination de la phase solide, à l’exception d’une analyse (Figure 111bas). La
lincomycine et le sulfadiazine sont les 2 autres molécules majoritaires de la phase dissoute.
Les autres antibiotiques y sont décelés mais en proportions négligeables. A l’inverse, la
tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont davantage présentes dans la phase solide.
Les profils de contamination des deux phases ne sont donc pas les mêmes.
La distribution de chaque antibiotique entre la phase dissoute et la phase solide a été étudiée
(Figure 112). En conclusion, au minimum 95% de la tylosine, de la marbofloxacine ou de la
tétracycline et 80 % de l’oxytétracycline se trouvent dans la phase solide. Suivant l’élevage
considéré, entre 32 et 56 % de la sulfadiazine et entre 33 et 67 % de la lincomycine se
retrouve dans la phase liquide. La monensine se retrouve à plus de 98 % dans la phase liquide.
Il est donc indispensable d’analyser les 2 phases des lisiers car le dosage de la phase dissoute
uniquement sous-doserait la tétracycline, la tylosine, la marbofloxacine et l’oxytétracycline
alors qu’un dosage de la phase solide uniquement sous-doserait très fortement la sulfadiazine,
la lincomycine et la monensine.
262
phase dissoute
100%
contribution à la contamination (%)

90%
80%
70% monensine
60% marbofloxacine
tétracycline
50%
tylosine
40%
lincomycine
30%
phase dissoute sulfadiazine
20%
10%
90% 0%
28/07/08
27/08/08
08/07/08
27/08/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
19/01/09
08/07/08
30/09/08
28/07/08
04/11/08
04/11/08
04/11/08
80%
70% monensine
60% marbofloxacine
tétracycline
50% phase solide
tylosine
40% 100%
lincomycine
30% 90%
80%
sulfadiazine
20%
monensine
10%
60% marbofloxacine
0% tétracycline
50%
28/07/08
27/08/08
08/07/08
27/08/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
19/01/09
08/07/08
30/09/08
28/07/08
04/11/08
04/11/08
04/11/08
tylosine
40%
lincomycine
30%
sulfadiazine
élevage
10%1 élevage 2 élevage 3
0%
04/11/08
04/11/08
04/11/08
28/07/08
27/08/08
08/07/08
27/08/08
30/09/08
27/08/08
30/09/08
08/12/08
19/01/09
08/07/08
30/09/08
28/07/08

Figure 111 : Evolution et importance relative de chaque antibiotique à la contamination du lisier stocké,
dans la phase dissoute (haut) et dans la phase solide (bas).
tylosine marbofloxacine tétracycline oxytétracycline sulfadiazine lincomycine monensine

7% 2% 2% 1%
20%
32% 35%
élevage 1
93% 80% 68% 65%
98% 98% 99%

3% 3% 3%
17%
33%
élevage 2 44%
56%
97% 97% 97% 83% 67% 100
%

4% 5% 5% 2%
21%
44% 33%
élevage 3 56%
95% 95% 79% 67%
96% 98%
Figure 112 : Répartition des antibiotiques entre la phase dissoute (clair) et la phase solide (foncé) des
lisiers stockés pour les 3 élevages étudiés.
263
II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier
Une troisième étude a concerné l’évolution de la teneur en antibiotiques des lisiers le long des
filières complexe de traitement. Deux élevages porcins possédant des systèmes de traitement
différents ont été étudiés. Dans le premier élevage, les phases solides et liquides sont séparées
dès le début du traitement. Le deuxième élevage ne sépare pas la phase solide de la phase
liquide et c’est l’ensemble du lisier qui subit les processus de traitement. Dans les 2 élévages,
les volumes de lisier transitant entre les différents compartiments n’ayant pu être mesurés
pour des raisons d’accéssibilité, les interprétations présentées dans la suite de cette étude ne
sont valables que si les débits sont considérés comme homogènes et constants.
Les résultats du suivi de la contamination le long de la filière de traitement de l’élevage 4 sont

présentés Figure 113. Quelle que soit la saison, la phase dissoute est principalement
contaminée par de la sulfadiazine et de l’oxytétracycline alors que la phase solide est
principalement contaminée par l’oxytétracycline, la marbofloxacine, la tylosine et la
sulfadiazine. La contamination de la phase dissoute diminue le long de la filière de traitement
avec une chute importante de la concentration en antibiotiques entre la fosse de stockage et le
bassin d’aération (Figure 113 gauche). A l’inverse, la contamination de la phase solide varie
peu. Une diminution générale est observée entre le lisier stocké et la lagune mais la
contamination du reflux de séparation est supérieure à celle du lisier stocké. La baisse
importante de la contamination entre le lisier stocké et le bassin d’aération de la phase
dissoute est à mettre en parallèle avec l’augmentation de la contamination entre le lisier
stocké et le reflux de séparation. La contamination semble être reportée du lisier stocké vers le
reflux de séparation. L’évolution de la contamination de la phase dissoute est donc
probablement liée à la séparation des phases solides et liquides plutôt qu’à des phénomènes de
dégradation. Les niveaux de contamination équivalents du bassin d’aération, du bassin de
décantation et de la lagune peuvent être expliqués par ces phénomènes de dégradation peu
importants.
phase dissoute phase solide

25 000 1 400
1 200
20 000 monensine
monensine
1 000 sulfadiazine
sulfadiazine
15 000 oxytétracycline
800 phase solide oxytétracycline
tétracycline
1 400 tétracycline
600
10 000 marbofloxacine marbofloxacine
1 200 lincomycine lincomycine
(ng/g)
400
5 000 tylosine
monensine
tylosine
1 000 200 sulfadiazine
concentration
800
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
tétracycline
600 marbofloxacine
lisier stocké bassin bassin de lagune 400 lisier stocké bassin bassin de lagune reflux de lincomycine
d'aération décantation d'aération décantation séparation tylosine
200
Figure 113 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute
(gauche) et dans la phase 0solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage 4.
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
20/04/09
16/11/09
lisier stocké bassin

Les résultats du suivi le long de la filière de traitement debassin de
l’élevage
d'aération décantation
lagune reflux de
5 sont séparation
présentés Figure
114. Quelle que soit la saison, la contamination de la phase dissoute est liée à la présence
d’oxytétracycline, de tétracycline, de sulfadiazine, de lincomycine et de marbofloxacine. La
monensine est également décelée dans le lisier stocké prélevé en automne. Dans la phase
264
solide (Figure 114 droite), les principales molécules responsables de la contamination sont la
tétracycline, l’oxytétracycline et la marbofloxacine. La contamination de la phase dissoute
diminue fortement entre le lisier stocké et le bassin d’aération mais elle ré-augmente entre le
bassin d’aération et le bassin de décantation. Le niveau de contamination de la lagune est plus
faible que celui du lisier stocké mais il n’y a pas de diminution progressive le long de la
filière. Dans la phase solide, les variations sont faibles et la lagune est même davantage
contaminée que le lisier stocké.
phase dissoute phase solide

18 000
8 000
16 000
7 000
14 000 monensine monensine

6 000
sulfadiazine
12 000 sulfadiazine
5 000
oxytétracycline phase solide oxytétracycline
10 000
8 000
8 000 tétracycline
4 000 tétracycline
marbofloxacine
6 000 7 000
(ng/g)
lincomycine lincomycine
4 000 2 000 monensine
6 000 tylosine tylosine
2 000 1 000 sulfadiazine
concentration
0 0
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
30/10/09
04/05/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
4 000 tétracycline
lisier stocké bassin d'aération bassin de lagune
2 000 lisier stocké bassin d'aération bassin de lagune lincomycine
décantation décantation tylosine
1 000
Figure 114 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute
(gauche) et dans la phase 0solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage 5.
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
lisier stocké bassin d'aération bassin de lagune
La Figure 115 met en parallèle l’évolution de la contamination décantation
totale (liquide et solide) dans
les deux élevages étudiés. Dans l’élevage 4, la contamination diminue le long de la filière de
traitement entre le lisier stocké et la lagune. En revanche, la contamination augmente dans le
reflux de séparation. Dans l’élevage 5 où la phase solide n’est pas séparée de la phase liquide,
la contamination ne varie que très peu mais elle est plus faible dans la lagune que dans le
lisier stocké. Elle est cependant plus importante dans le bassin d’aération en automne et plus
importante dans le bassin de décantation au printemps. D’une façon générale, la
contamination totale le long des filières de traitement complexe du lisier diminue mais cette
diminution est plus marquée dans le cas où la phase solide et la phase liquide sont séparées.
élevage 1 élevage
élevage2 5
450
élevage 4 417 600
400 481
500
350
300 400
250 208 300
200
150 200 182
137 153
100 117 99
44 43 100
50 16 58 40
9 6 9 2 5
0 0
16/11/09
16/11/09
16/11/09
16/11/09
16/11/09
20/04/09
20/04/09
20/04/09
20/04/09
20/04/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
04/05/09
30/10/09
lisier stocké bassin bassin de lagune reflux de lisier stocké bassin d'aération bassin de lagune
d'aération décantation séparation décantation
Figure 115 : Comparaison des évolutions de la contamination du lisier le long des différentes filières de
traitement.
265
En conclusion de cette étude, il s’avère que les filières complexes de traitement permettent de
faire baisser la contamination du lisier par les antibiotiques essentiellement à cause de la
séparation des phases solides et liquides. Les phénomènes de dégradation sont faibles
comparativement à l’impact que peut avoir la séparation des phases. Aussi, l’évolution de la
contamination le long de la filière de l’élevage 5, où les phases ne sont pas séparées, est peu
marquée.
II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées
Pour finaliser les études sur le devenir des antibiotiques dans les lisiers porcins, 3 expériences
de dégradation en laboratoire ont été conduites. Dans la première expérience, le devenir des
antibiotiques est étudié durant le passage du lisier dans un couplage mettant en œuvre un
digesteur anaérobie mésophile puis un réacteur dans lequel des réactions de nitrification et
dénitrification sont provoquées par l’alternance de conditions aérobies et anoxiques. En se
basant sur les résultats de la première expérience, dans la deuxième expérience, le lisier arrive
directement, depuis la cuve de stockage, dans le réacteur où les phases d’anoxie et d’aérobie
alternent. Le devenir des antibiotiques est donc étudié uniquement dans le réacteur. Enfin,
dans la troisième expérience, le devenir des antibiotiques est étudié dans 2 réacteurs différents
utilisant des conditions anaérobies thermophiles. Les réacteurs se différencient par l’origine
de leurs inocula. L’inoculum du réacteur 1 (R1) provient de boues de STEP alors que celui du
réacteur 2 (R2) provient de fumier équin.
II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique
Dans la première expérience, les prélèvements ont été effectués en entrée du système (RLB),
en sortie du digesteur (RLdig) et en sortie du réacteur (RLsort) à 3 dates différentes.
L’analyse des antibiotiques a été réalisée sur 5 des 7 composés majoritaires (un antibiotique
par famille : lincomycine, oxytétracycline, sulfadiazine, marbofloxacine et monensine). Les
résultats ont été moyennés sur les 3 dates et sont présentés dans le Tableau 67 et la Figure
116.
Les résultats de l’analyse de la phase dissoute montrent qu’il n’y a pas de dégradation lors du
traitement anaérobie du lisier (RLdig) alors que la concentration diminue fortement après
traitement aérobie/anoxie (RLsort). A l’exception de l’oxytétracycline, les résultats de
l’analyse de la phase solide présentent les mêmes tendances : pas de diminution des
concentrations lors du traitement anaérobie du lisier (RLdig) et forte diminution des
concentrations après le traitement aérobie/anoxie (RLsort). En revanche, en ce qui concerne
l’oxytétracycline, une diminution de sa concentration est observée dans le digesteur anaérobie
mais cette dernière re-augmente en sortie du réacteur. Enfin, en considérant la phase solide et
la phase dissoute (total, Figure 116), il apparait qu’à l’exception de l’oxytétracycline, il n’y a
pas de dégradation dans le digesteur anaérobie. Avec une forte diminution de la concentration
totale en antibiotique à la sortie du réacteur et un abattement global de 84 %, il semblerait en
revanche, que les antibiotiques soient dégradés après traitement aérobie/anoxie, sauf la
monensine probablement en raison de la variabilité des analyses.
266
Tableau 67 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide des
lisiers avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort)
mésophile.
dissout (ng/L) (n=4) solide (ng/g poids sec) (n=3)
composés RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort
oxytétracycline 1 351 ± 1 247 1 562 ± 2 204 92 ± 205 236 ± 376 39 ± 76 107 ± 211
sulfadiazine 10 766 ± 6 118 10 248 ± 6 054 740 ± 591 77 ± 66 60 ± 46 8±5
lincomycine 1 421 ± 807 1 403 ± 803 174 ± 182 32 ± 22 35 ± 24 13 ± 10
marbofloxacine 187 ± 115 151 ± 91 47 ± 29 28 ± 26 32 ± 27 13 ± 10
monensine 15 ± 14 38 ± 25 40 ± 25 2±2 6±7 19 ± 14
RLB RLdig RLsort

40 000
concentration totale (ng/l)
5 000
35 000
4 000
30 000 3 000
25 000 2 000
20 000 1 000
15 000 0
lincomycine marbofloxacine monensine
10 000
5 000
0
oxytétracycline sulfadiazine lincomycine marbofloxacine monensine
Figure 116 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier avant (RLB) et après
traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile.
II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique
Dans la deuxième expérience, les prélèvements ont été effectués en entrée (alimentation) et en
sortie (sortie) du réacteur aérobie/anoxie à 3 dates différentes. L’analyse des antibiotiques a
été réalisée sur les 7 composés majoritaires et les résultats ont été moyennés sur ces 3 dates.
Ils sont présentés dans le Tableau 68 et la Figure 117.
L’analyse de la phase dissoute montre une forte diminution de la concentration en

antibiotiques entre l’entrée et la sortie du réacteur et confirme les résultats obtenus au cours de
la première expérimentation. A l’exception de la sulfadiazine, aucune diminution de
concentration n’est observée dans la phase solide des lisiers entre l’entrée et la sortie des
réacteurs. Cette tendance est un peu différente de celle observée au cours de la première
expérimentation. Au total, la concentration en antibiotique diminue suite au traitement
aérobie/anoxique appliqué dans le réacteur. Mais des différences sont observées entre les
antibiotiques (oxytétracycline, sulfadiazine et lincomycine diminuent, marbofloxacine et
tylosine restent constantes, tétracycline et monensine ne varient pas si les écart-types sont pris
en compte). Ces différences génèrent un abattement total moindre dans cette deuxième
expérience (45 %) par rapport à la première expérience (84 %). Les performances de ce
système sont donc réduites par rapport à celles du couplage digesteur anaérobie - réacteur
aérobie/anoxie. Il est donc probable que l’étape de digestion anaérobie favorise la dégradation
des composés dans le réacteur aérobie/anoxique en modifiant les caractéristiques de la matrice
par exemple, bien qu’elle n’influence pas directement les concentrations en antibiotiques.
267
Tableau 68 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et solide des lisiers à
l’entrée du réacteur (alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile.
composés alimentation sortie alimentation sortie
oxytétracycline 3 062 ± 2594 675 ± 300 348 ± 70 330 ± 84
sulfadiazine 4 967 ± 3096 176 ± 140 112 ± 24 41 ± 16
lincomycine 613 ± 17 0±0 46 ± 4 52 ± 3
tylosine 0±0 28 ± 25 2±0 5±1
tétracycline 27 ± 0 40 ± 42 15 ± 4 15 ± 1
marbofloxacine 149 ± 94 139 ± 66 82 ± 16 124 ± 36
monensine 133 ± 86 35 ± 17 1±1 2±1
alimentation sortie
25 000
concentration total (ng/l)
800
20 000 600
400
15 000
200
10 000 0
tétracycline monensine tylosine
5 000
0
e
e
ne
e
e
e
in
in
in
sin
sin
in
ci
az
yc
cl
cl
lo
xa
en
cy
di
cy
m
ty
fl o
on
l fa
co
ra
tra
m
ét
bo
lin
su
té
yt
ar
ox
Figure 117 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier à l’entrée du réacteur
(alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile.
II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie
Dans la troisième expérience, les prélèvements ont été effectués à 4 dates différentes en entrée
(alim.) et en sortie de 2 réacteurs (R1 et R2) fonctionnant tous les 2 en conditions
thermophiles mais avec des inocula différents. L’analyse des antibiotiques a été réalisée sur
les 7 composés majoritaires et les résultats ont été moyennés sur les 4 dates. Ils sont présentés
dans le Tableau 69 et la Figure 118.
La phase dissoute et la phase solide présentent des tendances très similaires et par conséquent
identiques à celle du total. Aucune dégradation n’est observée dans le réacteur 1 dont
l’inoculum provient d’une boue de STEP. La concentration totale en antibiotiques augmente
et l’abattement est négatif (-36 %). Il semblerait que l’augmentation de la sulfadiazine et de la
lincomycine dans la phase dissoute et celle de l’oxytétracycline dans la phase solide soit
responsable de ce résultat. Aucune dégradation n’est également observée dans le réacteur 2
dont l’inoculum provient d’un fumier équin. La concentration en antibiotique entre l’entrée et
la sortie du réacteur reste stable. Bien que meilleur, l’abattement reste aussi négatif (-4 %).
Les antibiotiques ne sont donc pas dégradés en condition anaérobie. De plus, la température
ne semble pas influencer la dégradation des antibiotiques puisque qu’elle était plus élevée
dans cette expérience (55°C) que dans les 2 premières (38°C).
268
Tableau 69 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide à
l’entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second
réacteur (R2).
composés alim R1 (sortie1) R2 (sortie2) alim R1 (sortie1) R2 (sortie2)
oxytétracycline 5716 ± 5329 6058 ± 4180 6737 ± 1851 814 ± 342 946 ± 261 638 ± 229
sulfadiazine 3778 ± 1918 4693 ± 1339 3561 ± 1576 61 ± 16 48 ± 7 32 ± 20
lincomycine 1123 ± 525 2688 ± 1445 1990 ± 1309 47 ± 6 69 ± 10 52 ± 16
tylosine 0±0 0±0 0±0 1±1 0±0 1±1
tétracycline 0±0 0±0 0±0 60 ± 23 93 ± 22 64 ± 35
marbofloxacine 0±0 0±0 0±0 53 ± 15 71 ± 12 60 ± 25
monensine 518 ± 266 756 ± 231 453 ± 80 2±2 2±1 1±0
alimentation R1 (sortie1) R2 (sortie2)
60 000
concentration totale (ng/l)
50 000
9 000
40 000 8 000
7 000
30 000 6 000
5 000
20 000 4 000 60
3 000 40
10 000 2 000 20
1 000
0 0 0
oxytétracycline sulfadiazine lincomycine

e
e
ne
e
e
e
in
in
sin
in
in
ci
az
yc
s
cl
lo
xa
en
di
cy
m
ty
fl o
on
l fa
co
tra
m
bo
lin
su
té
ar
m
Figure 118 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques à l’entrée des réacteurs anaérobies
thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2).
II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques
Si les résultats du suivi de la contamination de la fosse de stockage sur 5 mois dans les filières
simples de traitement du lisier (cf. II.4.1 Filières traditionnelles de stockage du lisier) sont mis
en parallèle avec ceux obtenus lors des études de dégradations en conditions contrôlées, il
apparait clairement que les antibiotiques ne sont pas dégradés en condition anaérobie. Et si les
résultats du suivi de la contamination du lisier le long de la filière de traitement dans les
systèmes complexe de traitement du lisier (cf. II.4.2Filières complexes avec traitement du
lisier) sont mis en parallèle avec ceux obtenus lors des études de dégradations en conditions
contrôlées, il apparait que la dégradation des antibiotiques dans les lisiers est aérobie. De plus,
pour améliorer la dégradation des composés il est important de séparer la phase solide de la
phase liquide. C’est pourquoi, les filières complexes de traitement incluant une étape de
centrifugation entre la fosse de stockage et le bassin d’aération sont intéressantes pour réduire
la contamination du lisier par les antibiotiques car en plus de posséder des bassins d’aération
où la dégradation aérobie peut avoir lieu, elles séparent la phase liquide de la phase solide. Par
ailleurs, pour traiter efficacement la pollution des lisiers par les antibiotiques, il est important
de connaître à la fois les molécules antibiotiques présentes dans le lisier et leurs modes de
répartition entre la phase liquide et solide. En effet, il faudra par exemple porter une attention
particulière au traitement de la phase liquide d’un lisier contaminé en lincomycine alors qu’il
faudra plus s’attacher à traiter la phase solide d’un lisier contaminé en tétracycline. En
conséquence, pour traiter la contamination par les antibiotiques du lisier, il faut séparer la
269
phase solide de la phase liquide et adapter un mode de traitement à chacune des deux phases
en fonction des molécules que l’on cherche à y dégrader.
II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers
De l’ensemble de toutes ces analyses, il ressort :

1. que 7 antibiotiques sont majoritaires car identifiés et quantifiés dans tous les
échantillons de lisiers (oxytétracycline, sulfadiazine, lincomycine, tétracycline,
tylosine, marbofloxacine, monensine).
2. qu’il est nécessaire, pour préserver les échantillons entre le prélèvement et l’analyse,
de les congeler en ayant préalablement séparé les phases dissoutes, solide et
particulaire afin d’éviter les phénomènes de spéciation et le transfert des molécules
d’une phase vers l’autre.
3. que les niveaux de contamination du lisier par les antibiotiques sont élevés, de l’ordre
de la dizaine de µg/L au mg/L.
4. que le niveau de contamination des lisiers n’est pas clairement lié au stade
physiologique des cochons bien que le stade post-sevrage semble être celui qui
contribue le plus à la contamination.
5. que la contamination du lisier dans la fosse de stockage varie de façon aléatoire au
cours des 5 mois de suivi. L’intérêt de stocker le lisier pour en réduire la
contamination en antibiotique préalablement à l’épandage n’a pas été mis en évidence.
6. que les molécules se répartissent différemment entre la phase solide et la phase
liquide. L’oxytétracycline, la tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont
majoritairement présentes dans la phase solide alors que la sulfadiazine, la
lincomycine et la monensine sont essentiellement présentes dans la phase liquide.
7. que la séparation des phases solides et liquides permet de réduire la contamination des
lisiers dans les filières de traitement.
8. que la dégradation des antibiotiques se fait principalement en condition aérobie.
270
CHAPITRE 6
Développement et
application des POCIS
271
272
Chapitre 6 : Développement et application des POCIS
I. DEVELOPPEMENT DE L’OUTIL : EXPERIENCES DE CALIBRATION .................................................... 274

II. APPLICATION DES POCIS .............................................................................................................. 276
PUBLICATION : CALIBRATION ET APPLICATION D'ECHANTILLONNEURS PASSIFS POUR LA

DETERMINATION DE 22 MOLECULES PHARMACEUTIQUES DANS L'EAU ............................... 277
RESUME ................................................................................................................................................... 277
INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 278
I. EXPERIMENTALE ............................................................................................................................ 282
I.1. Produits chimiques et matériel ................................................................................................ 282
I.2. Traitement de l'échantillon ..................................................................................................... 283
I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration ................................................................. 283
I.2.2. Extraction des POCIS...................................................................................................................... 283
I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem .................. 284
I.4. Calibration en laboratoire ....................................................................................................... 284
I.4.1. Conditions expérimentales ............................................................................................................... 284
I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des taux d'échantillonnage............... 285
I.5. Application environnementale ................................................................................................ 287
I.6. Paramètres de validation et assurance qualité .......................................................................... 287
II. RESULTATS..................................................................................................................................... 288
II.1. Développement de l'extraction des POCIS .............................................................................. 288
II.2. Calibration en laboratoire ....................................................................................................... 289
II.3. 4. Application environnementale, comparaison entre échantillonnage ponctuel et passif .......... 294
CONCLUSION ........................................................................................................................................... 297
REMERCIEMENTS .................................................................................................................................... 297
REFERENCES ........................................................................................................................................... 298
Dans une première partie, les 3 phases nécessaires au développement des POCIS (Polar
Organic Chemical Integrative Sampler) sont présentées : i) optimisation de l’étape
d’extraction des composés piégés dans la phase adsorbante ; ii) vérification de la faisabilité de
l’expérience de calibration en laboratoire en s’assurant de la stabilité de la contamination de
l’eau en aquarium ; et iii) expérience de calibration des POCIS en laboratoire et détermination
des paramètres tels que le taux d’échantillonnage (Rs) ou les constantes d’adsorption (k 1) ou
de désorption (k2). Dans une deuxième partie, une comparaison des résultats obtenus suite à
des analyses d’eau prélevée ponctuellement et des analyses consécutives au déploiement des
POCIS est présentée.
273
La question de la représentativité des échantillons analysés et donc de leurs modes de

prélèvement peut être soulevée. Généralement, les échantillons aqueux environnementaux
sont prélevés en une fois, à un moment T, variable d’un point de prélèvement à un autre en
fonction de diverses contraintes comme l’accessibilité au site par exemple. Or ce moment T
peut avoir lieu durant un pic de pollution par exemple, générant alors des niveaux élevés de
contamination du site étudié. A l’inverse, il peut avoir lieu à un instant où les eaux sont
diluées par de fortes précipitations par exemple, générant alors des niveaux de contamination
faibles. Dans un cas comme dans l’autre, les concentrations déterminées ne reflètent pas le
niveau général de contamination. En conséquence, un seul prélèvement n’est pas suffisant
pour représenter la contamination d’un site. Ce phénomène est encore davantage marqué dans
le cas des molécules pharmaceutiques car leur présence, particulièrement dans les eaux usées,
est liée à leur consommation et à leur excrétion. Les médicaments étant souvent pris au cours
des repas, l’excrétion et donc la présence des molécules pharmaceutiques est souvent
maximales 3 – 4 heures après les repas. Ainsi, il est fort probable que des échantillons
prélevés en fin de matinée ou en fin d’après midi ne donnent pas les mêmes informations que
si ils avaient été prélevés tôt le matin ou en milieu d’après-midi. Pour pallier ce problème, une
technique consiste à réaliser un échantillon moyen soit à partir de prélèvements réguliers sur
une journée soit à l’aide d’un préleveur automatique. Mais ces techniques sont fastidieuses
et/ou coûteuses. De plus, dans le cadre d’analyse de traces, de grands volumes d’eau sont
généralement nécessaire ce qui rajoute une difficulté supplémentaire. Par ailleurs, une fois les
échantillons prélevés, il faut encore les filtrer, en extraire les composés d’intérêt et les
concentrer avant de pouvoir pratiquer l’analyse. Les échantillonneurs passifs sont des outils
qui ont été mis au point pour remédier à ces problèmes. Ils permettent d’extraire et de
concentrer les composés directement au cours du prélèvement et comme ils peuvent être
déployés plusieurs semaines, ils intègrent les différents pics ou chutes de pollution. Ils
présentent donc le double avantage d'intégrer la contamination sur toute la durée de leur
exposition et de pré-concentrer les molécules d'intérêt. Dans le cas des molécules
pharmaceutiques, les échantillonneurs passifs classiquement utilisés sont les POCIS (Vrana et
al., 2005). Au cours de ces travaux de thèse, cet outil a été calibré pour permettre l’analyse de
22 des 78 molécules pharmaceutiques sélectionnées. Ces 22 molécules ont été choisies selon
des critères économiques (représentativité des 5 classes thérapeutiques et coût des composés
standard de référence), analytiques (facilité d’analyse, fiabilité de l’analyse, étalonnage
interne possible) et littéraire (stabilité, propriétés physico-chimiques).
I. Développement de l’outil : expériences de calibration

Dans un premier temps le protocole permettant d’extraire les composés piégés dans la phase
des POCIS a été optimisé. Le choix du solvant et du volume d’élution a été effectué au cours
de tests réalisés en triplicat sur de la phase Oasis HLB dopée avec les composés d’intérêt. En
s’appuyant sur la littérature scientifique (Vrana et al., 2005 ; Bartelt-Hunt et al., 2009 ; li et
al., 2010) et en raison de l’absence d’antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines
dans les composés étudiés, le méthanol a été choisi comme solvant d’élution. Différents
volumes de solvant (10 mL MeOH + 10 mL MeOH/DCM 50/50 ; 20 mL MeOH ; 40 mL
MeOH) ont été testés pour éluer les composés. En raison du peu de différences observées
entre les résultats obtenus pour les diverses conditions, le protocole consommant le moins de
solvant a été retenu. Les composés sont donc élués de la phase adsorbante avec 20 mL de
méthanol. L’optimisation de la méthodologie d’évaporation/reconcentration et en particulier
de la température à laquelle cette étape peut être pratiquée a ensuite été réalisée. Les résultats
274
de ces tests ont conduit à choisir une température de 60°C pour réduire le temps d’évaporation
sans risque de perdre les composés.
Puis les POCIS ont été calibrés au cours d’expérimentations conduites en laboratoire dans des
aquariums dont la contamination, mesurée régulièrement, était apportée par un flux continu.
La première expérience a permis de vérifier la stabilité de la contamination de l’eau et la
faisabilité de l’expérimentation.
concentration dans
l'échantillonneur
régime à l'équilibre
régime cinétique C POCIS . k 2
Ceau 
C POCIS . m k1
C eau 
Rs . t
temps
Figure 119 : Les différents régimes d'adsorption des échantillonneurs passifs.
Tableau 70: Régime d'adsorption sur 15 jours d’exposition et valeurs des paramètres calculés pour les 22
taux constante constante de
composés type de régime d’échantillonnage d’adsorption désorption
Rs (L/j) k1 (L/g/j) k2 (j-1)
azithromycine cinétique 0,201 1,86
clarithromycine cinétique 0,178 1,65
érythromycine cinétique 0,140 1,29
clindamycine cinétique 0,199 1,84
ciprofloxacine cinétique 0,102 0,95
ofloxacine cinétique 0,204 1,88
acide pipémidique équilibre 1,49 0,27
tétracycline cinétique 0,060 0,56
oxytétracycline cinétique 0,027 0,25
sulfaméthoxazole équilibre 0,35 0,27
triméthoprime cinétique 0,221 2,04
métronidazole équilibre 0,30 0,34
aténolol équilibre 0,98 0,20
métoprolol cinétique 0,161 1,49
propranolol cinétique 0,193 1,79
daunorubicine équilibre 85,28 0,16
cyclophosphamide cinétique 0,102 0,94
méthotréxate équilibre 2,40 0,36
tamoxifen ?
abacavir cinétique 0,180 1,67
ritonavir ?
sildénafil cinétique 0,213 1,97
Une fois la stabilité de la contamination validée, la deuxième expérience a pu être réalisée.

Elle a permis de définir le régime d’adsorption des POCIS pour chacun des composés en se
basant sur la courbe « concentration dans l’échantillonneur en fonction du temps » (Figure
275
119). Elle a également permis de déterminer différents paramètres comme le taux

d’échantillonnage (Rs) ou les constantes d’adsorption (k1) et de désorption (k2) à partir des
concentrations mesurées dans l’eau des aquariums et dans les POCIS pour chaque composé.
Lors d’application dans le milieu naturel, ces paramètres servent à calculer la concentration
moyenne dans l’eau (Ceau) au cours de la période d’exposition à partir de la concentration en
analytes mesurée dans le POCIS (CPOCIS). Si, sur la durée de l’exposition, les composés ont
atteint le régime à l’équilibre, alors la concentration moyenne dans l’eau est calculée à partir
C .k
de l’équation suivante Ceau  POCIS 2 . Si, sur la durée de l’exposition, les composés sont
k1
dans le régime cinétique, alors la concentration moyenne dans l’eau est calculée à partir de
C .m
l’équation suivante Ceau  POCIS avec m la masse de phase adsorbante dans le POCIS et t
Rs . t
la durée de l’exposition.
Sur une durée d’exposition de 15 jours, 14 des 22 molécules pharmaceutiques étudiées

présentent des régimes d’accumulation de type cinétique et leur Rs ont pu être calculés ; 6
semblent avoir atteint leur équilibre et les constantes d’adsorption et de désorption ont été
calculées ; et 2 présentent des cinétiques d’accumulation très particulières qui n’ont pas
permis de déterminer aucun des 3 paramètres (Tableau 70).
II. Application des POCIS

Une fois l’outil calibré, il a été utilisé en milieu naturel pour évaluer la contamination d’une
rivière, la Garonne, en amont et en aval d’une zone urbaine, la ville de Bordeaux. Des
prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés en parallèle au moment du dépôt et du retrait des
capteurs. Les POCIS ont permis de détecter des composés qui ne l’étaient pas avec les
prélèvements ponctuels (exemple : abacavir et cyclophosphamide). De plus, l’impact de la
zone urbaine, et notamment des 2 rejets de STEP qu’elle englobe, sur la contamination de la
rivière a été mis en évidence avec des concentrations détectées en aval plus fortes que celles
détectées en amont. Les POCIS se sont donc révélés être de bons outils pour échantillonner
les molécules ciblées. L’ensemble des développements et applications sont détaillés dans la
publication « Calibration et application d'échantillonneurs passifs pour la détermination de 22
molécules pharmaceutiques dans l'eau ».
276
Publication : Calibration et application d'échantillonneurs passifs

pour la détermination de 22 molécules pharmaceutiques dans
l'eau
CAPDEVILLE M.J., BUYTAERT S., BELLES A. AND BUDZINSKI H. *
EPOC-LPTC, UMR 5805, CNRS - Université Bordeaux 1, 351 cours de la libération, 33 405 Talence cedex,
France
* Corresponding author.
Tel.: + 33 (0)5 40 00 69 98
Fax: + 33 (0)5 40 00 22 67
E-mail: h.budzinski@epoc.u-bordeaux1.fr
A soumettre dans Analytica Chimica Acta
Résumé
L’utilisation de POCIS (Polar Organic Chemical Integrative Sampler) pour l’échantillonnage,
dans des eaux de surface, de molécules pharmaceutiques appartenant à 5 classes
thérapeutiques différentes (antibiotiques, anticancéreux, anti-VIH, -bloquants et inhibiteurs
de phosphodiestérase de type 5 (PDE 5)), a été étudiée dans cet article. La première étape a
consisté à mettre au point un protocole d'extraction. Ce développement a conduit à l'utilisation
de 20 mL de méthanol pour éluer les composés retenus dans la phase adsorbante. Une fois la
méthode d'extraction optimisée, une expérience de calibration des capteurs a été conduite en
laboratoire. Cette expérimentation a mis en jeu un aquarium maintenu sous agitation et
alimenté en continu avec de l'eau du robinet et la solution méthanolique de contamination.
Des POCIS et de l'eau ont été prélevés et analysés régulièrement durant les 15 jours de
l'expérience. Le tracé des courbes d'accumulation des analytes dans les capteurs en fonction
du temps ont permis de définir les régimes d'accumulation des POCIS pour chacune des
molécules ciblées. 14 composés présentent des régimes cinétiques d'accumulation et leurs
taux d'échantillonnage (Rs) ont pu être déterminés par régression linéaire. 6 composés
semblent avoir déjà atteint leur équilibre sur la durée de la manipulation et les valeurs de leurs
constantes d’adsorption (k1) et de désorption (k2) ont pu être calculées. 2 composés
(tamoxifen, ritonavir), apparemment trop hydrophobes pour les outils employés ici, ont donné
des courbes particulières (type exponentiel, pas d’accumulation ou accumulation negligeable
les premiers jours puis forte accumulation) et aucun paramètre n'a pu être établi pour eux.
Enfin, les outils ont été déployés dans une rivière en amont et en aval d'une zone urbaine.
Parallèlement, des prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés au moment du dépôt et du
retrait des capteurs. Quelque soit le mode d'échantillonnage, les concentrations mesurées en
aval de la ville sont plus fortes que celles mesurées en amont mettant ainsi en évidence
l'impact de la zone urbaine sur la contamination du milieu. Les POCIS ont permis de détecter
des molécules qui n’ont pas été décelées dans les prélèvements d'eau. Les concentrations
déterminées par échantillonnage passif sont globalement du même ordre de grandeur que
celles déterminées par échantillonnage ponctuel. Les POCIS se sont donc révélés être de bons
outils pour échantillonner les molécules ciblées.
Keywords: pharmaceuticals, POCIS, passive sampling, RRLC/MS/MS, sampling rate Rs
277
Introduction
Une des origines principales des molécules pharmaceutiques dans les eaux de surface sont les
rejets de stations d'épuration (STEP). En effet, une fois ingérés les médicaments sont excrétés
via les urines ou les fèces et se retrouvent ainsi dans les eaux usées. Les STEP n'ont pas
initialement été conçues pour éliminer totalement ces composés et les résidus médicamenteux
sont rejetés avec les eaux traitées dans les cours d’eau et les eaux marines. De par leurs
origines et leurs modes de consommation, les médicaments étant souvent consommés aux
heures des repas, le niveau de contamination des eaux de surface est donc variable selon
l'heure à laquelle le prélèvement est effectué. Lindberg et al. (2004) mettent bien en évidence
ce phénomène à l'échelle de la journée pour des antibiotiques tels que la ciprofloxacine, le
sulfaméthoxazole ou le métronidazole. De plus des évènements météorologiques comme de
fortes pluies (dilution) ou une sècheresse (rejet de STEP qui peut constituer plus de 50% du
cours d'eau dans lequel il se déverse) peuvent entraîner des variations de concentration à
l'échelle de la semaine. Pour palier ce genre de problème, une solution consiste à fabriquer un
échantillon "moyen" en mélangeant plusieurs prélèvements effectués à intervalles de temps
courts et réguliers. Mais ce système nécessite soit la disponibilité d'un technicien sur le site de
prélèvement pendant une journée entière, voir plusieurs jours, ce qui est contraignant, soit de
disposer d'un appareillage coûteux qui réalise automatiquement les prélèvements avec le
risque qu'ils soient dégradés puisque laissés sur site. L’échantillonnage peut aussi être asservi
au débit. Une fois les échantillons collectés il faut encore les filtrer pour séparer la phase
dissoute de la phase particulaire puis en extraire les composés d'intérêt. Par ailleurs, pour
pouvoir analyser des composés présents à l'état de traces, comme c'est le cas des molécules
pharmaceutiques, il est nécessaire d'avoir un grand volume d'eau pour concentrer les
molécules ce qui rajoute une contrainte supplémentaire. Une alternative à ces problèmes est
l'utilisation d'échantillonneurs passifs qui sont déposés dans le milieu pour une durée de
quelques jours à plusieurs semaines. Ces échantillonneurs présentent le double avantage
d'intégrer la contamination sur toute la durée de leur exposition et de pré-concentrer les
molécules d'intérêt. Dans le cas des molécules pharmaceutiques, un dispositif couramment
utilisé est le POCIS ou Polar Organic Chemical Integrative Sampler (Togola et Budzinski,
2007). Il est constitué de phase adsorbante solide retenue entre deux membranes en
polyéthersulfone qui sont maintenues collées l'une à l'autre par deux anneaux métalliques
(Vrana et al., 2005). La technique de l'échantillonnage passif est basée sur les mécanismes de
diffusion des polluants du milieu aquatique vers la phase réceptrice du dispositif (AQUA-
REF, 2010). Ainsi, à partir des concentrations en polluants mesurées dans la phase des POCIS
et à partir des valeurs des constantes d’adsorption et de désorption ou de celles du taux
d’échantillonnage, les concentrations en polluants dans le milieu aquatique peuvent-être
calculées. Les valeurs des constantes d’adsorption et de désorption et celles du taux
d’échantillonage sont composé-dépendantes et sont définies lors d’expériences de calibration
réalisées en laboratoire lorsque les concentrations dans l’eau et dans les POCIS sont connues
(Vrana et al., 2005).
Les molécules pharmaceutiques appartiennent au groupe des contaminants émergents de

l'environnement car ce sont des composés qui sont étudiés depuis moins longtemps que des
polluants classiques tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) ou les
pesticides. Du fait de leur caractère récent, les outils nécessaire à leur dosage dans
l’environnement ne sont pas encore tous calibrés. Cet article traitera donc du développement
des POCIS pour une vingtaine de composés pharmaceutiques appartenant à des classes
thérapeutique diverses (antibiotiques, anticancereux, -bloquants, anti-VIH et inhibiteurs de
PDE 5). Les composés étudiés ont été sélectionnés en s’appuyant sur des critères à la fois
278
économique (coût des composés standards de référence), analytique (facilité d’analyse,

étalonnage interne possible) et bibliograhique (stabilité, propriétés physico-chimiques, usage
et consommation des médicaments, présence potentielle en raison de leur détection dans
d’autres études environnementales). Le but était de diversifier le plus possible la sélection
pour avoir à la fois des composés dont on dispose de valeurs de Rs afin de pouvoir comparer
nos résultats avec ceux déjà obtenus dans d’autres études et de composés, qui à notre
connaissance, n’ont jamais été étudiés afin d’améliorer la connaissance de l’outil. Le Tableau
1 présente les composés sélectionnés avec certaines de leurs propriétés physico-chimiques. La
première partie du développement a consisté à trouver un protocole d’extraction adéquat pour
l’ensemble des composés étudiés. La deuxième partie a consisté à calibrer les POCIS en
laboratoire c’est-à-dire à définir les valeurs des constantes d’adsorption et de désorption ou du
taux d’échantillonage des POCIS pour chaque composé. Enfin, une fois calibrés, les POCIS
ont été appliqués à l’étude de la contamination de la Garonne en amont et en aval de la ville
de Bordeaux (France), partie de la rivière où le milieu est dilué et variable. Les concentrations
en molécules pharmaceutiques mesurées par les échantillonneurs passifs ont ensuite été
comparées avec celles issues d’échantillonnages ponctuels d’eau réalisés au moment de la
pose et du retrait des POCIS.
Tableau 1: Utilisation au cours de cette étude, propriétés physico-chimiques et limites instrumentales de

detection et de quantification des composés étudiés (MM = masse molaire).
classe MM 2 Log Kow 2 Solubility 2(mg/L) IDL / IQL
composés utilisation1 structure des molecule
famille (g/mol) (25° C) (25°C, pH 7) (pg injectés)
H3C
antibiotique O
OH
macrolide CH3 CH3
O
CH3 O O
CH3
O O
O
azithromycine calibration H3C
HO
CH3 748,98 3,33 100000 11 / 33
H3C OH
CH3
N
OH OH H3C CH3
H3C
N CH3
CH3 Az i t hr omyc i n
H3 C
O OH
CH 3
CH3
O O O
CH 3
CH 3
O O
clarithromycine calibration H3 C O CH3 747,95 3,16 2200 0,4 / 1
HO
H3 C OH CH3
N
H 3C CH 3
OH O
CH 3
H 3C CH 3
Clarithromycin
O
H3 C
O OH
CH 3
CH3
O O O
CH 3
CH 3
stabilité / O O
érythromycine O CH3 733,93 2,83 2800 3/8
calibration H3 C
HO
H3 C OH CH3
N
H 3C CH 3
OH OH
H 3C CH 3 Erythromycin
O
H3 C
O OH
CH 3
CH3
O O O
CH 3
CH 3
O O
roxithromycine stabilité H3 C
HO
O CH3
837,1 3,73 n,a 1/3
H3 C OH CH3
N
H 3C CH 3
OH OH
H 3C CH 3 Roxithromycin
N O
O O CH3
279

Cl CH 3
antibiotique CH 3 O CH 3
lincosamide N O S
N
H
clindamycine calibration 424,98 1,83 6800 0,2 / 0,6
HO OH
H 3C OH
Clindamycin
HO CH 3
H3 C O CH3
N O S
N
H
lincomycine stabilité 406,54 0,91 24000 0,3 / 0,8
HO OH
OH
H3 C Lincomycin
O
antibiotique O
fluoroquinolone F
OH
ciprofloxacine calibration N N
331,34 1,31 700 3 / 10
HN
Ciprof loxacin
O O
F
OH
stabilité /
ofloxacine 361,37 1,61 230 0,8 / 2
calibration N N
N O
H 3C CH 3
Of loxacin
O
antibiotique O
quinolone
O
OH
acide oxolinique stabilité O

261,23 0,94 11000 0,1 / 0,2
N
Oxolinic acid CH 3
O O
N OH
acide pipemidique calibration N N N

303,32 0,99 140 1,8 / 6
HN
CH 3
Pipemidic acid
H 3C CH 3
antibiotic N
HO CH3
tétracycline
OH
stabilité /
tétracycline NH2 444,43 -1,47 4100 0,7 / 2
calibration
OH
OH O OH O O
Tetracyclin
H3 C CH3
CH 3 OH N
HO
OH
stabilité /
oxytétracycline 460,43 -1,50 5100 1/3
calibration NH 2
OH
OH O OH O O
Oxytetracyclin
O
antibiotique
sulfonamide HN S NH 2
N O
sulfaméthazine stabilité 278,33 0,80 450 0,2 / 0,7
H 3C N
Sulfamethazine
CH 3
O
HN S NH2
stabilité / N O
sulfaméthoxazole 253,28 0,89 6100 1/3
calibration O
Sulfamethoxazole
CH3
280

CH 3
O
H 2N N O
stabilité / CH3
triméthoprime 290,32 0,79 1100 0,7 / 2
calibration N CH3
O
NH2
Trimethoprim
N
antibiotique
-
imidazole O
N+ N
CH3
métronidazole calibration OH
171,15 -0,01 7000 0,4 / 1
O
metronidazole
-bloquant OH
H
H 3C N O
O
aténolol calibration 266,34 0,09 423000 1/4
CH 3
NH 2
Atenolol
OH
H
H 3C N O
stabilité /
métoprolol 267,36 1,79 120000 0,9 / 3
calibration CH 3 CH3
O
Metoprolol
OH
H
H 3C N O
stabilité /
propranolol 259,34 3,10 10000 0,5 / 2
calibration CH3
Propranolol
H
anticancereux N O
5-fluorouracil calibration NH 130,08 -0,78 88000 165 / 495

F
O 5-fluorouracil
O OH O
OH
CH 3
daunorubicine calibration NH2 527,52 3,17 5,8 2/7

O O OH O
H3 C
OH
O
Daunorubicin
Cl
N O
cyclophosphamide calibration P 261,09 0,23 86000 1/4

Cl O NH
Cyclophosphamide
H2N N N
CH3
N N
N O
H
méthotréxate calibration NH2 N
OH 454,44 -0,24 106 2/5
O
Methotrexate
O OH
H3C O
N
CH3
tamoxifen calibration CH3 371,51 7,88 2,5 8 / 25
Tamoxifen
anti-VIH
HN
N
N
abacavir calibration 286,33 0,72 120 0,5 / 2
HO N N NH2
Abacavir
CH3
H3 C
N H 3C CH3
O O
ritonavir calibration H
N S 720,94 5,28 3,7 7 / 20
N N N O
H H
CH 3 O OH N
Ritonavir
281

O
inhibiteur CH 3
PDE 5 O O HN
N
N
S
sildenafil calibration N N 747,58 2,28 7,1 3/8
N
H 3C O CH 3 CH3
sildenaf il
1
: calibration = expérience de calibration des POCIS
stabilité = expérience pour s’assurer de la stabilité des concentrations des composés dans l’eau.
2
: valeurs calculées par SciFinder ACD/Lab, n.d = non disponible.
I. Expérimentale
I.1. Produits chimiques et matériel
Les composés standards d'érythromycine, roxithromycine, lincomycine, tétracycline,

oxytétracycline, acide oxolinique, acide pipemidique, ciprofloxacine, ofloxacine,
sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, métronidazole, aténolol, métoprolol,
propranolol, tamoxifèn et cyclophosphamide ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint
Qunetin Fallavier, France). Les composés d'azithromycine, clarithromycine, clindamycine,
méthotréxate, daunorubicine, 5-fluorouracil, abacavir, ritonavir et sildénafil ont été achetés
LGC Standards (Molsheim, France). Des composés isotopiques ont été utilisés comme étalons
internes. L'érythromycine-13C2, sulfaméthoxazole-13C6, triméthoprime-13C3 et ciprofloxacine-
13
C2-15N ont aussi été achetés chez LGC Standards. L'ofloxacine-d3 a été acheté chez Sigma-
Aldrich. L'atenolol-d7, propranolol-d7, 5-fluorouracil-15N, tamoxifen-d5 and sildenafil-d3 ont
été achetés chez Cluzeau Info Labo (Sainte Foy la Grande, France). Les 3 derniers étalons
internes clarithromycin-d3, lincomycin-d3 et tetracycline-d6 ont été achetés chez Toronto
Research Chemicals (North York, Toronto, Canada).
Les solvents utilisés pour les expérimentations et les analyses sont le dichloromethane (DCM,
Acros organic, for residues and pesticides analysis (Fisher Bioblock Scientific, Illkirch
Graffens, France)), le méthanol (MeOH, Merck Lichrosolv, gradient grade for LC (VWR,
Strasbourg, France)), l'acétonitrile (ACN, Baker, ultra gradient HPLC grade (Atlantic labo,
Bruges, France)), l'eau ultrapure (milliQ, Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France) et
l'eau minérale naturelle (NMW, Vittel, Nestlé (France Boissons, Lormont, France)). Les
réactifs utilisés pour cette étude sont l'acide acétique glacial (CH3COOH, Sharlau, HPLC
grade (Atlantic labo)), acide formique (HCOOH, Baker analyzed, 98% purity (Atlantic labo)),
acide hydrochlorique (HCl, Baker analyzed reagent, 36.5-38% purity (Atlantic labo)),
hydroxyde de sodium (NaOH, VWR BDH Prolabo, normapur 97% purity (VWR)) et l'acide
dissodium dihydraté d'éthylène-diamine-tétra-acétique (Na2-EDTA.2H2O, Sigma, 99 % purity
(Sigma Aldrich)). Les cartouches en verre (6 mL) et les frittés en Teflon® (Supelco) ont été
achetés chez Sigma-Aldrich. Les POCIS sont montés au laboratoire avec 200 mg de phase
adsorbante Oasis HLB (Waters, Saint Quentin en Yvelines, France) et des membranes
microporeuses en polyéthersulfone (Pall Life Sciences (VWR)). La phase adorbante et les
membranes sont préalablement rincées avec du méthanol. Dans la constitution finale, la phase
adsorbante est piégée entre les 2 membranes qui sont maintenues colllées l'une à l'autres par
des anneaux en acier inoxydable. Les cartouches utilisées pour la SPE (Solid Phase
Extraction) sont des Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance, 200 mg, 6 cc) de chez
Waters. Les filtres utilisés sont des filtres en fibres de verre d'une porosité de 0.7 µm (GF/F,
Whatmann (Fisher Bioblock Scientific)) et 1.6 (GF/A, Whatmann (Fisher Bioblock
Scientific)). Toute la verrerie est lavée à l'eau osmosée puis calciniée à 450°C pendant une
nuit avant utilisation. Les filtres en fibres de verre sont aussi calcinés à 450°C pendant une
nuit avant utilisation.
282
I.2. Traitement de l'échantillon

I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration
Les molécules pharmaceutiques sont extraites de l'eau par Extraction en Phase Solide (SPE)
avec des cartouche Oasis HLB (200 mg, 6 mL). Le protocole a préalablement été optimisé et
les détails des expériences sont accessibles dans Capdeville et al. (Development of a method
for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by
solid-phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis
– application to sewage treatment plant effluents). Avant l'extraction, les étalons internes sont
ajoutés dans l'eau et le pH est ajusté à 7 avec de l'acide chlorhydrique ou de la soude. Puis
quelques millilitres d'une solution de Na2-EDTA à 250 mM sont ajoutés pour obtenir une
concentration finale à 10 mM dans chaque échantillon. L'addition de Na2-EDTA provoque la
diminution du pH entre 4 et 5. Les cartouches sont conditionnées avec 5 mL d'ACN puis 5
mL de NMW à pH 7. 100 mL pour les expériences de calibration et 300 mL pour les eaux de
surface sont passés sur les cartouches. Les cartouches sont ensuite rincées avec 5 mL de
NMW à pH 7 puis séchées sous vide pendant 1 heure. Après le séchage des cartouches, les
composés sont élués avec 5 mL d'un mélange NMW/ACN (40/60, v/v). Les extraits obtenus
sont évaporés à 40°C sous flux d'azote jusqu'à ce qu'il ne reste plus que quelques microlitres.
Les résidus sont ensuite transférés dans des inserts de 300 µL placés dans des flacons
d'injections de 2 mL. Les extraits sont évaporés une seconde fois, juste avant l'analyse, et les
résidus sont dissouts dans un volume compris entre 50 et 150 µL d'un mélange eau
ultrapure/acétonitrile (90/10, v/v), selon le niveau de contamination de l'échantillon.
I.2.2. Extraction des POCIS
Une fois retirés du milieu naturel, les POCIS sont rincés avec de l'eau ultrapure pour éliminer
le biofouling. Les POCIS utilisés pour la calibration en laboratoire ou ceux exposés dans
l'environnement suivent ensuite le même protocole. Ils sont démontés et les membranes sont
rincées avec 5 mL de NMW pour éliminer la phase adsorbante collée dessus. La phase est
collectée dans des cartouches en verre et est maitenue entre 2 frittés en Teflon®. La phase est
ensuite séchées sous vide et conservée à -20° C jusqu'à l'extraction. Avant l'extraction, les
carrtouches sont mises à décongeler pendant une nuit et la masse exacte de phase est
déterminée par différence entre le poids des cartouches vides et celui des cartouches pleines,
préalablement pesées avec les 2 frittés. Les étalons internes sont ajoutés dans les flacons
collecteurs des extraits organiques et la quantité exacte introduite est controlée par
gravimétrie. La phase adsorbante est éluée avec un solvant organique. Cette étape a été
optimisée au travers d'une série de tests utilisant différents solvants (DCM, MeOH) et
volumes de solvant (10, 20 et 40 mL). Dans le protocole optimisé, 20 mL de méthanol sont
utilisés pour éluer les composés. Les extraits sont ensuite concentrés sous vide à basses
pression et température en utilisant un Rapivap(Labconco). Cette étape peut être très longue
et la température a été optimisée dans le but de réduire le temps d'évaporation. Dans le
protocole final, les paramètres sont : 70% d'agitation, 60°C, 550 mbar, 30 minutes. Quand il
reste environ 1 mL, 1 mL d'eau contenant 5 mM de Na2-EDTA est ajouté. L'évaporation est
ensuite poursuivie avec les paramètres suivant : 80% d'agitation, 60°C, 250 mbar, 10 minutes
puis 80% d'agitation, 60°C, 150 mbar jusqu'à ce qu'il ne reste plus que quelques gouttes.
Comme pour les extraits SPE, les résidus sont transférés dans un insert en verre de 300 µL
placé dans un flacon d'injection de 2 mL. Ils sont évaporés une seconde fois à 40°C sous flux
d'azote juste avant l'analyse. Les résidus issus des POCIS utilisés pour la calibration en
laboratoire sont dissouts dans 300 µL d'un mélange eau ultrapure/acétonitrile (90/10, v/v) et
283
ceux issus des POCIS exposés dans l'environnement sont dissouts dans 100 µL du même
mélange.
I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de

masse en tandem
Les POCIS et les échantillons d'eau sont analysés par Chromatographie en phase Liquide
couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS) utilisant une colonne Zorbax-SB
C18. Les analyses sont pratiquées avec une chaîne chromatographique Agilent 1200 series
RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) et un spectromètre de masse Agilent QQQ
6410 triple quadrupôle équipé d'une source d'ionisation électrospray (Agilent, Massy, France).
La RRLC est équipée de tuyaux de fin diamètre pour réduire les volumes morts et par
conséquent réduire le temps d'analyse. De plus, cette technique chromatographique utilise des
colonnes courtes (5 and 10 cm) contenant une phase stationnaire avec des particules de petite
taille (1,8 μm), ce qui permet des pressions plus fortes, des pics chromatographiques moins
larges et un temps d'analyse plus court. Les phases mobiles sont de l'eau ultrapure et de
l'acétonitrile toutes 2 supplémentées avec 0,3 % d'acide formique en mode positif d'ionisation
(ESI+) ou 0,1 % d'acide acétique en mode négatif d'ionisation (ESI-). Tous les composés sont
analysés en ESI+ sauf le 5-fluorouracil analysé en ESI-. Les composés sont suivis en mode
MRM (Multi Reaction Monitor) avec 2 transitions, une pour la quantification et une pour la
confirmation. Ils sont identifiés par leurs temps de rétention, ces 2 transitions et le rapport
entre elles. Les conditions analytiques sont plus détaillées dans Capdeville et al. (Multi-
residue simultaneous analysis of 78 pharmaceuticals compounds in aqueous samples:
development and application).
I.4. Calibration en laboratoire

I.4.1. Conditions expérimentales
Préalablement à l’expérience de calibration des POCIS, un essai sans POCIS a été réalisé
dans des conditions similaires afin de s’assurer que l’on pouvait maintenir constante la
concentration des composés dans l’eau. Cette manipulation permet de vérifier qu’il n’y a pas
de perte (adsorption sur les parois par exemple) ou de gains (pollution par le matériel utilisé
par exemple) de composés durant toute la durée de l’exposition. Elle a été réalisée sur une
sélection réduite de 12 molécules choisies d’après le cout des composés, leur toxicité et la
facilité d’analyse. Pour ces raisons, ce ne sont pas forcément les mêmes molécules que celles
utilisées dans l’expérience de calibration qui ont été retenues mais des molécules ayant des
comportements supposés similaires car appartenant à la même famille (exemple :
lincomycine/clindamycine, roxithromycine/clarithromycine et acide oxolinique/acide
pipémidique). Cette expérience ainsi que celle de calibration des POCIS se sont déroulées
dans les mêmes conditions. Elles ont utilisées un aquarium de 27 l (dimensions : 30 x 30 x 30
cm) dont l’eau a été renouvelée en continu par un apport d’eau du robinet (débit 13,5 L/j) et
de solution méthanolique de contamination (débit 200 mL/j) et un débordement constant. Le
système était maintenu sous agitation par une pale métallique (80 rpm). L’eau contaminée a
été évacuée vers un autre aquarium où elle a été nettoyée par passage sur charbon actif
pendant au moins une semaine avant d’être rejetée à l’évier. La bouteille contenant la solution
de contamination a été remplacée quotidiennement par une nouvelle. Les solutions de
contamination, conservées au congélateur, ont été issues de la dilution d’une solution mère
fortement concentrée (environ 135 µg/L) ayant servi au dopage initial de l’aquarium. Le
dopage initial a consisté à verser directement 95,2 mL de la solution mère dans l’aquarium.
284
Ce volume a été défini d’après le débit mesuré des pompes peristaltiques (eau et MeOH) et la
valeur de la concentration finale désirée. La solution mère a été réalisée à partir de la pesée de
cristaux de composés purs dilués dans 1 litre de méthanol. Le niveau de contamination visé
était compris entre 500 et 1000 ng/L suivant les composés. Pour suivre la contamination de
l’eau de l’aquarium et vérifier la stabilité de sa concentration dans l’expérience préliminaire,
200 mL d’eau ont été prélevés dans des flacons Nalgen® (HDPE) 6h après le dopage initial,
puis tous les jours les 4 premiers jours de l’expérience et enfin tous les 2 jours jusqu’à la fin
de l’expérimentation. Pour l’expérience de calibration des POCIS, afin de s’assurer la stabilité
du montage (débit stable des pompes péristaltiques, homogénéité de la contamination), le
dopage initial a été réalisé 3 jours avant l’exposition des POCIS puis le système de flux
continu a été équilibré pendant 3 jours en renouvelant quotidiennement l’eau et la solution de
contamination. Comme pour la manipulation préliminaire, le suivi de la concentration de
l’eau de l’aquarium a été assuré par un prélèvement de 200 mL d’eau, dans des bouteilles
Nalgen® (HDPE), tous les jours les 4 premiers jours où sont exposés les POCIS puis tous les 2
jours jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les 12 POCIS exposées ont été retirés
progressivement de l’aquarium : 3 sont retirés après 5 et 15 jours d’exposition, 2 après 10 et
un après 7, 8, 12 et 13 jours (Figure 1).
number
nombre of
de POCIS
POCIS collected 3 2 3
collectés
jours
days
Figure 1: Prélèvement des POCIS au cours de l’expérience de calibration réalisée en laboratoire.
A l’exception des trois derniers POCIS, prélevés à T15, qui ont été démontés aussitôt après
avoir été sortis de l’aquarium, les POCIS sont conservés à -20°C une fois retirés de l’eau.
Elles sont ensuite toutes démontés dans les 15 jours qui suivent leur retrait et la phase est
récupérée comme décrit dans la partie I.2.2 POCIS extraction.
I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des

taux d'échantillonnage
L'adsorption des polluants suit le modèle présenté Figure 2.

concentration in the
equilibrium regime
sampler
kinetic regime
tim e
Figure 2: Passive sampling devices adsorption regimes.
285
Les échanges entre la phase réceptrice et l'eau peuvent être modélisés par l'équation suivante
(Vrana et al., 2005):
CPOCIS : analyte concentration in POCIS (µg/g)
k1 Cwater: analyte concentration in water (µg/L)
C POCIS (t )  C water . . (1  e k2t ) (1)
k2 k1: uptake rate constant (L/g/d)
k2: offload rate constant (d-1)
Si le capteur fonctionne en régime à l'équilibre, c'est-à-dire que les concentrations dans le

POCIS et dans l'eau sont à l'équilibre, cette équation (1) peut être réduite à (Vrana et al.,
2005):
k k C
C POCIS (t )  C water . 1  C water . K (2) with K  1  Cwater  POCIS (3)
k2 k2 K
K, appelait coefficient de partage échantillonneur-eau exprimé en mL/g (AQUA-REF, 2010),
peut être déterminé lors d'expériences de calibration en laboratoire quand les concentrations
C
en analytes dans l'eau et dans le POCIS sont connues ( K  POCIS  Cf equilibrium ) . Une fois K
C water
caractérisé pour chaque molécule, l'équation (3) peut être appliquée pour déterminer les
concentrations en analytes dans l'eau lors d'applications terrain.
Si le capteur fonctionne en régime cinétique, l'accumulation de l'analyte dans

l'échantillonneur est linéaire et l'équation (1) peut être réduite à (Vrana et al., 2005) :
M
CPOCIS (t )  Cwater. k1. t (4) avec CPOCIS (t )  POCIS MPOCIS : analyte mass in POCIS (µg)
m m: phase mass in POCIS (g)
Une nouvelle équation peut alors être définie à partir des deux précédentes :
M POCIS (t )  Cwater . k1 . m . t  Cwater . Rs . t (5) avec Rs le taux d’échantillonnage. Ce Rs
correspond au volume d’eau épuré pour un analyte par unité de temps d’exposition du
dispositif (Vrana et al., 2005). Il est composé-dépendant. Ainsi dans le cas où
l’échantillonneur fonctionne en régime cinétique, il est nécessaire de connaître ce Rs pour
chaque contaminant de façon à pouvoir remonter jusqu’à la concentration moyenne
temporelle (TWA, Time Weighted Average) dans l’eau. Tout comme le K du régime à
l’équilibre, les Rs sont déterminés lors d’expérience de calibration réalisées en laboratoire
avec des concentrations en analytes dans l'eau et dans le POCIS connues. A partir de
l’équation (5), on peut établir la formule suivante :
M C .m m C C POCIS . m
Rs  POCIS  POCIS  Cf . (6) with Cf  POCIS  C water  (7)
Cwater. t Cwater. t t Cwater Rs . t
Le facteur de concentration Cf permet de normaliser la concentration dans le POCIS avec la

concentration de l’eau au cours de l’expérience de calibration. Ainsi, lors de ces expériences,
en se basant sur le modèle de la Figure 2, un nouveau graphique peut être obtenu en traçant Cf
en fonction du temps. Comme on est en régime cinétique, l’accumulation dans
l’échantillonneur est linéaire et on obtient alors une droite passant par zéro dont l’équation est
de la forme : Cf = a.t avec a le coefficient directeur de la droite. D’après l’équation (4), on
Rs
obtient Cf = k1.t et d'après l'équation (6), on a : Cf  . t . En établissant un parallèle entre
m
286
Rs
ces trois formules, on peut en déduire que a  k1  et ainsi déterminer k1 et Rs
m
avec Rs  k1 . m . Une fois le Rs caractérisé, l'équation (7) peut être appliquée pour déterminer
les concentrations en analytes dans l'eau lors d'applications terrain.
I.5. Application environnementale
Une fois les valeurs de taux d’échantillonnage déterminées, des POCIS ont été déployés
durant 15 jours dans la Garonne en amont et en aval de l’agglomération Bordelaise (Figure 3).
FRANCE
Bordeaux SWTP
release
Sampling
points
Figure 3: Localisation of the sampling points.
Trois POCIS ont été posés au niveau de la ville de Cadaujac (amont) et trois autres au niveau
du port autonome de Bordeaux (aval) en juin 2010. Entre les deux points d’échantillonnage,
deux stations d’épuration, d’une capacité de 150 000 et de 300 000 équivalent habitants,
rejettent leurs eaux traitées dans la Garonne. En parallèle des échantillonneurs passifs, des
prélèvements ponctuels d’eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des POCIS
dans le but de comparer les résultats obtenus par les deux méthodes. Les POCIS sont montés
sur des supports métalliques et sont enfermés dans une cage en acier afin de les protéger et
d’éviter que les membranes ne se percent. Les cages sont attachées à un point fixe (pilier de
ponton, échelle) et immergées à environ 1 m de la surface. Les eaux des prélèvements
ponctuels sont collectées aux mêmes endroits que là où les cages ont été fixées et à la même
profondeur. Les eaux de surface sont filtrées le jour de leur prélèvement sur des filtres en fibre
de verre d’une porosité de 1,6 µm (GF/A) puis de 0,7 µm (GF/F) puis sont conservées dans
des bouteilles Nalgen® (HDPE) -20°C en attendant d’être analysées. La phase des POCIS est
transférée dans les cartouches en verre le jour où les POCIS ont été récupérés puis séchée
sous vide. Les cartouches sont ensuite individuellement emballées dans du papier
d’aluminium, placées dans un bouteille en verre contenant des billes de silices utilisées
comme desséchant pour absorber l’humidité et conservées à -20°C en attendant d’extraire les
composés contenus dans la phase 3 jours plus tard.
I.6. Paramètres de validation et assurance qualité
Pour assurer le contrôle qualité, des blancs et des dopages sont réalisés en parallèle du
traitement des échantillons. Les blancs de manipulation réalisés en même temps que
287
l’extraction des eaux ou des POCIS ne voient que les solvants servant aux élutions, l’eau
minérale naturelle servant au conditionnement des cartouches ou au rinçage des membranes,
les étalons internes et les réactifs comme l’EDTA. Ils permettent de contrôler que les étapes
de traitement des échantillons ne les contaminent pas. Le blanc « phase » est constitué de 200
mg de phase Oasis HLB pesés et déposés directement entre les 2 frittés en Teflon dans une
cartouche en verre. Il est réalisé en parallèle du transfert de la phase contenue dans les POCIS
vers les cartouches en verre et permet de controler que les échantillons ne se contaminent pas
au cours de cette étape de récupération de la phase. D’autres blancs sont insérés dans les
séquences d’analyse pour s’affranchir des problèmes de contamination croisée liés à l’aiguille
d’injection ou aux résidus d’un échantillon très contaminé. Par ailleurs, des eaux minérales
naturelles, dépourvues des analytes recherchés, sont dopées et subissent le même traitement
SPE que les eaux échantillonnées afin de vérifier les rendements d’extraction de chaque série.
De même, de la phase adsorbante HLB identique à celle utilisée pour les POCIS, mais n’ayant
jamais été exposée en milieu naturel, est dopée avec les composés ciblés afin de vérifier les
performances du protocole d’extraction.
Du point de vue analytique, la linéarité, la précision, la justesse et les limites de détection et
de quantification ont été étudiées. La linéarité a été étudiée au travers du coefficient de
détermination, R², sur une gamme de dilution allant environ de 30 à 1200 pg injectés. Quand
R² est inférieur à 0.999 des gammes plus petites sont utilisées (technique des bracket). La
précision correspond à la variation intra- et inter-jour. Elle est étudiée au travers de l’injection
successive sur un ou plusieurs jours d’une même solution standard. La variabilité intra-jour
moyenne est de 6  3.5 % et celle inter-jour de 47  13 % pour l’ensemble des composés
ciblés. La justesse correspond au rendement de quantification, soit par étalonnage interne soit
par étalonnage externe, d’une solution pseudo-inconnue. La justesse moyenne est de 104  13
%. Enfin les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL) ont été
extrapolées d’après l’injection d’une solution standard. Les valeurs des IDL et IQL sont
données pour chaque composé dans le Tableau 1.
II. Résultats
II.1. Développement de l'extraction des POCIS
Pour développer le protocole d’élution des POCIS, des dopages ont été réalisés en triplicat.
Pour cela, 200 mg de phase Oasis HLB identique à celle utilisée dans les POCIS,
préalablement lavée et dépourvue des composés recherchés, ont été déposés directement dans
les cartouches en verre entre les deux frittés en Teflon et une quantité connue de composés a
été ajoutée. Après dépôt des composés natifs sur le fritté supérieur, les cartouches ont été
rincées avec 5 mL d’eau Vittel afin de reproduire l’étape de transfert de la phase des POCIS.
De même, les cartouches sont ensuite mises à sécher sous vide durant 60 min. Les étalons
internes sont introduits dans les flacons collecteurs avant l’élution et la quantité de solution
introduite est controlée par gravimétrie. Trois protocoles différents d’élution ont été testés : i)
10 mL de méthanol puis 10 mL méthanol/dichlorométhane (50/50 v/v) ; ii) 20 mL méthanol ;
iii) 40 mL méthanol. Ils ont été adaptés de celui actuellement utilisé au laboratoire pour
l’extraction de composés pharmaceutiques appartenant à d’autres classes que celles étudiées
ici (Budzinski et Togola, 2007) ou de la littérature (Bartelthunt et al., 2009; Li et al., 2010;
MacLeod et al., 2007; Zhang et al., 2008). Les différences de rendement obtenues avec les 3
protocoles sont minimes. Le protocole ii consommant moins de solvant que les deux autres, a
été retenu. Une fois la méthode d’élution mise au point, le protocole a été amélioré en
optimisant le temps d’évaporation en se focalisant sur la température. Dans un premier temps,
288
celle-ci avait été fixée à 40°C afin de protéger les composés potentiellement thermosensibles.
Ce test a été pratiqué avec des triplicats de 20 mL de méthanol enrichis avec les composés
ciblés et trois conditions de température ont été essayées : 40°, 60° et 80°C. L’augmentation
de la température n’entraîne pas de dégradation particulière des composés. Cependant, à
80°C, l’évaporation est trop rapide et il y a un risque d'évaporer complètement le solvant ce
qui entraînerait la perte des composés. Pour cette raison, c’est la température de 60°C qui est
sélectionnée. Elle permet d’évaporer les 20 mL de méthanol en environ 30 min au lieu de 3h à
40°C. La méthode d’extraction des POCIS a été validée en déterminant les rendements
d’extraction de trois échantillons dopés avec une quantité connue de composés natifs. Les
résultats sont présentés dans le Tableau 2 et les rendements d’extraction des eaux par SPE
sont présentés en parallèle.
Tableau 2: rendements moyens d’extraction SPE et POCIS (%, SPE : n=4, POCIS : n=5).
composés SPE POCIS composés SPE POCIS composés SPE POCIS
azithromycine 125 ± 21 84 ± 8 tétracycline 100 ± 9 20 ± 5 5-fluorouracil 0±0 0±0
clarithromycine 103 ± 7 88 ± 9 oxytétracycline 131 ± 31 32 ± 4 daunorubicine 102 ± 7 66 ± 5
érythromycine 94 ± 7 86 ± 4 sulfaméthoxazole 102 ± 4 96 ± 3 cyclophosphamide 79 ± 12 79 ± 6
clindamycine 96 ± 2 88 ± 8 triméthoprime 96 ± 6 93 ± 6 méthotréxate 118 ± 6 24 ± 7
ciprofloxacine 99 ± 8 73 ± 7 métronidazole 92 ± 27 99 ± 26 tamoxifen 99 ± 6 81 ± 6
ofloxacine 104 ± 5 87 ± 1 aténolol 106 ± 11 84 ± 3 abacavir 137 ± 14 123 ± 23
acide métoprolol 109 ± 10 88 ± 10 ritonavir 104 ± 25 99 ± 14
100 ± 14 77 ± 9
pipemidique propranolol 98 ± 9 85 ± 5 sildénafil 81 ± 8 82 ± 13
Le 5-fluorouracil (5-FU) n’est jamais récupéré que se soit lors d’une SPE ou lors d’extraction
de POCIS. Un test dans lequel les 5 mL d’eau, servant au rinçage des cartouches pour mimer
l’étape de récupération de la phase, ont été analysés, montre qu’environ 75% du 5-FU se
retrouve dans ces eaux de rinçage. De plus ce composé est le seul à être analysé en ESI-. Pour
toutes ces raisons, le suivi de ce composé a été abandonné. Hormis pour les tétracyclines et le
méthotréxate dont les taux de récupération sont compris entre 20 et 30%, les rendements
d'extraction des POCIS sont bons (> 65%) et la variabilité faible (< 15 %, excepté
metronidazole et abacavir). Le protocole est donc applicable.
II.2. Calibration en laboratoire

Les résultats de l'expérience préliminaire sur la stabilité de la contamination de l'eau sont
présentés Tableau 3. Avec un écart-type relatif moyen de 23 % et des écart-types relatifs
individuels inférieurs à 34 %, il ressort que les concentrations de 8 des 12 composés étudiés
au cours de cette expérimentation sont stables dans l'aquarium (érythromycine,
roxithromycine, ofloxacine, sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, métoprolol et
propranolol). Pour les 4 autres composés, les variations sont plus importantes. Pour ces
molécules, la variabilité de la concentration mesurée est davantage liée au mode de
quantification (étalonnage externe) utilisé qu’à des pertes ou des gains dans l’aquarium. En
conclusion, après une période de stabilisation de 2 à 3 jours, les concentrations des
contaminants dans l'eau de l'aquarium sont stables sur une durée de 15 jours. La calibration
des POCIS pourra donc se faire avec le même dispositif en prenant soin de laisser une période
d'équilibrage de quelques jours.
289
Tableau 3 : Concentration moyenne (ng/L) mesurée (n = 10) pour chaque composé sur toute la durée de
l’expérimentation (15 jours).
composés [moy.]° ± ET composés [moy.]° ± ET
érythromycine 1090 ± 150 sulfaméthoxazole 634 ± 121
roxithromycine 1705 ± 584 triméthoprime 602 ± 186
lincomycine 3808 ± 3446 tétracycline 1484 ± 1029
ofloxacine 270 ± 66 oxytétraycline 1151 ± 927
acide oxolinique 4217 ± 2573 métoprolol 577 ± 98
sulfaméthazine 841 ± 246 propranolol 491 ± 73
Comme précedemment expliqué (cf. paragraphe I.4.2 dans la partie « expérimentale »), pour
pouvoir utiliser les POCIS comme outils quantitatifs dans l’étude de la contamination de
l’eau, il faut résoudre les équations (3) ou (7), selon le régime dans lequel les POCIS se
trouvent au moment où ils sont retirés du milieu. Des expériences de calibration permettent, à
partir des concentrations mesurées dans les POCIS et dans les eaux, d’identifier le régime
d’accumulation de chaque composé et de définir les paramètres manquants de ces équations
(K pour le régime à l’équilibre et Rs pour le régime cinétique). Une expérience de calibration
a donc été conduite au laboratoire sur une durée de 15 jours afin d’identifier le type de régime
des 22 composés étudiés. Les prélèvements réguliers et les analyses des eaux et des POCIS,
réalisés selon les modes opératoires décrits dans la partie « expérimentale », ont permis de
tracer les courbes d’accumulation des analytes en fonction du temps. Ces courbes utilisent le
facteur de concentration Cf qui correspond aux concentrations mesurées dans les POCIS
normalisées par rapport à la concentration moyenne de l'eau sur la durée d'exposition du
C POCIS (T10 )
POCIS (exemple: Cf (T10 )  ). Les régimes et les paramètres des équations
C water( averageT0 T10 )
obtenus sont présentés dans la Tableau 4.
Tableau 4: Régimes d’accumulation et équations associées permettant de déterminer les constantes

d’adsorption (k1) et de desorption (k2) et les taux d’échantillonage (Rs) pour les 22 composés (Rs = k1 . m et
K = k1/k2).
régime 
paramèters de
composés paramètres équation
calibration
nécessaires ?
Cf = 1.8607 . t (R² = 0.9648)
cinétique Rs = 0.201 L/j
azithromycine  k1 = 1.8607 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.86 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.6534 . t (R² = 0.9722)
clarithromycine  k1 = 1.6534 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.65 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.2926 . t (R² = 0.9522)
érythromycine  k1 = 1.2926 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.29 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.8445 . t (R² = 0.9810)
clindamycine  k1 = 1.8445 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.84 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 0.9478 . t (R² = 0.8038)
ciprofloxacine  k1 = 0.9478 L/g/j
 Rs ? k1 = 0.95 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.8845 . t (R² = 0.8847)
ofloxacine  k1 = 1.8845 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.88 L/g/j
m = 0.108 g
290
régime 
paramèters de
composés paramètres équation
calibration
nécessaires ?
Cf = 5.51 (1 – e -0.27 t)
équilibre
K? k1 K = 5.51 L/g
acide pipemidique  = 5.51 k1 = 1.49 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.27 j-1
 k2 ?
k2 = 0.27
Cf = 0.5561 . t (R2 = 0.9723)
tétracycline  k1 = 0.5561 L/g/j
 Rs ? k1 = 0.56 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 0.2538 . t (R2 = 0.8505)
oxytétracycline  k1 = 0.2538 L/g/j
 Rs ? k1 = 0.25 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.28 (1 – e -0.27 t)
équilibre
K? k1 K = 1.28 L/g
sulfaméthoxazole  = 1.28 k1 = 0.35 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.27 j-1
 k2 ?
k2 = 0.27
Cf = 2.0428 . t (R2 = 0.8310)
triméthoprime  k1 = 2.0428 L/g/j
 Rs ? k1 = 2.04 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 0.89 (1 – e -0.34 t)
équilibre
K? k1 K = 0.89 L/g
métronidazole  = 0.89 k1 = 0.30 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.34 j-1
 k2 ?
k2 = 0.34
Cf = 4.92 (1 – e -0.20 t)
équilibre
K? k1 K = 4.92 L/g
aténolol  = 4.92 k1 = 0.98 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.20 j-1
 k2 ?
k2 = 0.20
Cf = 1.4876 . t (R2 = 0.9775)
métoprolol  k1 = 1.4876 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.49 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 1.7902 . t (R2 = 0.9747)
propranolol  k1 = 1.7902 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.79 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 533 (1 – e -0.16 t)
équilibre
K? k1 K = 533 L/g
daunorubicine  = 533 k1 = 85.28 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.16 j-1
 k2 ?
k2 = 0.16
Cf = 0.9449 . t (R2 = 0.8911)
cyclophosphamide  k1 = 0.9449 L/g/j
 Rs ? k1 = 0.94 L/g/j
m = 0.108 g
Cf = 6.67 (1 – e -0.36 t)
équilibre
K? k1 K = 6.67 L/g
méthotréxate  = 6.67 k1 = 2.40 L/g/j
 k1 ? k2 k2 = 0.36 j-1
 k2 ?
k2 = 0.36
tamoxifen Cf = 0.0281e0,.296 t (R2 = 0.9749)
Cf = 1.6701 . t (R2 = 0.9106)
abacavir  k1 = 1.6701 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.67 L/g/j
m = 0.108 g
ritonavir Cf = 0.0737e0.3168 t (R2 = 0.9907)
Cf = 1.9737 . t (R2 = 0.9378)
sildénafil  k1 = 1.9737 L/g/j
 Rs ? k1 = 1.97 L/g/j
m = 0.108 g
291
Sur une durée d’exposition de 15 jours, 14 des 22 molécules pharmaceutiques étudiées

présentent des régimes d’accumulation de type cinétique. L’accumulation est donc linéaire et
proportionnelle à la durée d’exposition (ex. : azithromycine Figure 4). Par régression linéaire,
les équations des droites ont pu être déterminées et le Rs calculé. Ces taux d’échantillonnage
ont ensuite été comparés avec ceux disponibles dans la littérature (Tableau 5). Bien que les
conditions et les durées d’immersions soient différentes, les taux d’échantillonnages calculés
par Martinez Bueno et al. (2009) et Li et al. (2010) sont en bonne adéquation avec ceux
déterminés dans cette étude. Cette similitude dans les résultats permet d’affirmer que les Rs
calculés ici ne sont pas aberrants. A l’inverse les valeurs données par MacLeod et al. (2007)
sont très différentes de celles calculées ici et sont élevées par rapport aux valeurs de Rs
généralement trouvées (0,1 à 0,3 L/j).
azithromycine
30
25
20
Cf
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
temps (jours)
Figure 4 : Exemple de régime d’accumulation de type cinétique (cas de l’azithromycine).
Sur les 22 composés ciblés, 2 composés, le tamoxifen et le ritonavir, présentent des cinétiques
d’accumulation très particulières avec un temps de latence initial (« lag effect ») avant une
accumulation exponentielle des composés dans les POCIS (ex : ritonavir Figure 5). Leurs log
Kow sont les plus forts parmi les molécules sélectionnées ici (Tableau 5) avec des valeurs de
7,88 et 5,28 pour le tamoxifen et le ritonavir respectivement. Les POCIS sont au départ
pensés pour être utilisés avec des composés hydrophiles (Vrana et al., 2005) ayant des log
Kow ≤ 3. Pour les composés ayant des log Kow > 3, une phase de latence est généralement
observée (Lardy, 2008), elle correspond au temps que met le composé à traverser la
membrane en PES.
ritonavir
9
8
7
6
5
Cf
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
temps (jours)
Figure 5 : Exemple de régime d’accumulation avec « lag effect » (cas du ritonavir).
Enfin, 6 composés (acide pipemidique, sulfaméthoxazole, métronidazole, aténolol,

daunorubicine et méthotréxate) ne présentent pas des régimes d’accumulation de type
cinétique et semblent avoir déjà atteint leur équilibre (ex. : acide pipémidique Figure 6). Les
292
valeurs des constantes d’adsorption (k1) et de désorption (k2) ont pu être calculées (Tableau 4)
en se basant sur le raisonnement suivant :
Quand l’équilibre est atteint, donc à T15, on peut déduire de l’équation (2) présentée dans la
C POCIS (T15 ) k1
partie expérimentale : Cf (T15 )    K . Avant cela, donc à Tx (avec 0 < x < 15),
C water (T15 ) k2
C POCIS k1
on a d’après l’équation (1) : Cf (Tx )   . (1  e k2 . x )  Cf (T15 ) . (1  e k2 . x ) . Le
(Tx )
C water (Tx ) k2
 Cf (Tx ) 
ln 1  
 Cf (T ) 
 15 
réarrangement de cette nouvelle équation permet de calculé k2 avec k 2  .
x
Une fois K et k2 définis, k1 est facilement déduit. Ainsi pour ces 6 composés, la
concentration dans les eaux lors d’application terrain peut être calculée à partir de l’équation
C POCIS (T )
C water (T ) 
(8) suivante : K . (1  e k2 .T ) (8). Contrairement aux résultats de cette
expérimentation, des valeurs de Rs ont pu être calculées pour le sulfaméthoxazole par Zhang
et al. (2008), Bartelthunt et al. (2009) et Li et al. (2010) et pour l’aténolol par MacLeod et al.
(2007) et Li et al. (2010) (Tableau 5). Dans le but de pouvoir néanmoins comparer, nos
résultats avec ceux de ces auteurs, des Rs ont été calculés en associant les régimes
d’accumulation de ces 2 composés à des régimes de type cinétique. Ainsi, avec une équation
de droite égale à Cf = 0,1014 . t, le Rs du sulfaméthoxazole a été estimé à 0,011 L/j. Cette
valeur est très différente de celles trouvées dans la littérature (environ 0,2 L/j, Tableau 5) et
confirme que sur la durée de l’expérimentation, le régime d’accumulation du
sulfaméthoxazole dans les POCIS n’est pas de type cinétique. En revanche, le Rs de l’aténolol
a été déterminé à 0,043 L/j, avec une équation de droite égale à Cf = 0,3938 . t, ce qui est
proche des valeurs de Rs déterminées par MacLeod et al. (2007) (0.040  0.070 L/j) et Li et
al. (2010) (0,073 L/j). Le régime d’accumulation de l’aténolol peut alors être reconsidéré et
être associé à un régime cinétique bien que le coefficient de regression linéaire (R 2 = 0,2372)
soit faible et n’incite pas à considérer la courbe d’accumulation de l’aténolol dans les POCIS
comme une droite (Figure 7). Par ailleurs, comme pour MacLeod et al. (2007) et Li et al.
(2010), le Rs de l’aténolol est faible par rapport à ceux déterminés pour les 2 autres -
bloquants étudiés (métorpolol et propranolol). Ceci peut être expliqué par les valeurs de log
Kow de ces composés. En effet, avec un log Kow de 0,09, l’aténolol est plus hydrophile que
le métoprolol (log Kow 1,79) et que le propranolol (log Kow 3,10) et est donc potentiellement
moins bien retenu dans la phase des POCIS que les 2 autres -bloquants.
pipemidic acid
8
6
4
Cf
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
temps (jours)
Figrue 6 : Exemple de régime d’accumulation ayant atteint l’équilibre (cas de l’acide pipémidique).
293
atenolol
8
6
4
Cf
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415
temps (jours)
Figure 7 : Comparaison des 2 régimes d’accumulation envisagés pour l’aténolol (cinétique droite en points
tillés, équilibre droite trait plein).
Tableau 5: Comparaison des taux d’échantillonnage (Rs L/j) determines dans cette etude avec ceux
trouvés dans la bibliographie.
Martínez Bueno Alvarez et Zhang et al. MacLeod Li et al. Bartelthunt
log Kow this study
et al. (2009) al. (2004) (2008) et al. (2007) (2010) et al. (2009)
azithrmomycin 3.33 0.201 0.120 0.06
clarithromycin 3.16 0.178 0.668  0.233
erythromycin 2.83 0.140 0.163 0.911  0.403
clindamycin 1.83 0.199
ciprofloxacin 1.31 0.102
ofloxacin 1.61 0.204
pipemidic acid 0.99
tetracycline -1.47 0.060 0.071
oxytetracycline -1.50 0.027 0.023
sulfamethoxazole 0.89 0.2 – 0.4 0.202 0.21
trimethoprim 0.79 0.221 0.360  0.210 0.215
metronidazole -0.01
atenolol 0.09 0.040  0.070 0.073
metoprolol 1.79 0.161 0.599  0.270 0.156
propranolol 3.10 0.193 0.10 0.980  0.345 0.271
daunorubicin 3.17
cyclophophamide 0.23 0.102
methotrexate -0.24
tamoxifen 7.88
abacavir 0.72 0.180
ritonavir 5.28
sildenafil 2.28 0.213
II.3. 4. Application environnementale, comparaison entre

échantillonnage ponctuel et passif
Une fois que les paramètres de calibration des POCIS ont été définis, ces échantillonneurs ont
pu être utilisés pour étudier la contamination de l’eau de la Garonne aux alentours de la ville
de Bordeaux.
A Cadaujac (amont), 11 composés ont été détectés avec des concentrations moyennes allant
de 0,9  0,1 à 30,6  1,3 ng/g de phase. En aval de Bordeaux, ces 11 mêmes composés, plus le
cyclophosphamide, ont été retrouvés. Les concentrations moyennes y sont plus élevées et se
situent entre 2,7  0,6 à 96,6  3,0 ng/g de phase (Figure 8).
294
amont aval
concentration POCIS (ng/g)

100
80
60
40
20
0
Figure 8 : Concentrations en molécules pharmaceutiques mesurées dans les POCIS (ng/g de phase).
Des prélèvements ponctuels d’eau ont été réalisés en triplicats au moment de la pose (T 0) et
du retrait (T15) des POCIS. En amont de Bordeaux aucune des molécules ciblées n’a pu être
quantifiées à aucun moment. En aval, 10 médicaments ont été identifiés à T0 et ont également
été retrouvés à T15 (Figure 9). Leurs concentrations sont du même ordre de grandeur aux deux
dates à l’exception du sulfaméthoxazole qui est 2 fois plus présent à T15 qu’à T0. Elles sont
comprises entre 0,1  0,02 et 3,32  0,63 ng/L.
aval T0 aval T15

concentration EAU (ng/l)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Figure 9 : Concentrations en molécules pharmaceutiques mesurées dans l’eau à partir des prélèvements
ponctuels (ng/L).
Que ce soit dans les POCIS ou dans les eaux, les quantités sont toujours plus importantes en
aval qu'en amont, ce qui reflète l'impact de la zone urbaine sur la contamination du milieu
aquatique. Par ailleurs, les POCIS permettent de détecter et de quantifier des composés qui
n’ont pu être analysés dans les échantillons d’eau prélevés ponctuellement (Figure 10).
amont aval
500
500 15
400 400
300
10
300
200 200
5
100 100
0 0 0
total POCIS total POCIS total EAU (T15)
Figure 10 : Comparaison des concentrations totales en molécules pharmaceutiques mesurées en amont et
en aval de la zone urbaine dans les POCIS et dans l’eau suite à l’échantillonnage ponctuel à T15.
295
Pour pouvoir comparer les données obtenues par échantillonnage passif avec celles obtenues
par échantillonnage ponctuel, il faut déterminer les concentrations dans l'eau, exprimées en
ng/L, à partir de celles mesurées dans les POCIS et exprimées en ng/g de phase. Ceci a été
réalisé grâce aux équations (7) et (8). La Figure 11 présente les données obtenues avec les
deux techniques d'échantillonnage.
amont ponctuel amont POCIS

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
aval ponctuel aval POCIS

48
aval ponctuel aval POCIS
38
50
4528
40
3518
30
25
8
2010
15
10 8
5
06
4
2
0
Figure 11: Comparaison des concentrations individuelles mesurées pour chaque composes en fonction de
la technique d’échantillonnnage appliquée.
En amont, seul les POCIS ont permis de détecter et de quantifier des molécules grâce à leur
caractère intégratif et accumulatif (Figure 11 haut). En aval, d'un point de vue qualitatif, la
majorité des composés détectés avec une méthode le sont aussi avec l'autre. Cependant,
l'abacavir, un anti-VIH, et le cyclophosphamide, un anticancéreux, ne sont retrouvés que dans
les POCIS. D'un point de vue quantitatif, les concentrations mesurées en aval de la ville sont
globalement plus fortes quand elles sont issues des POCIS que des prélèvements d'eau (Figure
11 bas). Néanmoins cette différence n'est réellement marquée que pour le sulfamethoxazole et
l'atenolol pour qui les concentrations sont 18 et 7 fois plus fortes que quand elles proviennent
de l'échantillonnage ponctuel. Lors de l’expérience de calibration, ces 2 composés ont montré
des régimes d’accumulation qui avaient atteint leurs équilibres au bout des 15 jours
d’exposition. Aussi, les concentrations de ces 2 composés ont été calculés en utilisant les Rs
296
de Li et al. (2010). Une hypothèse pour expliquer ces différences provient des valeurs des
paramètres utilisés pour calculer les concentrations dans l'eau à partir de celles mesurées dans
les POCIS. En effet, les conditions rencontrées dans le milieu ne sont pas exactement les
mêmes que celles établies lors des expériences de calibration. Dans le milieu, à durée
d'exposition égale, les paramètres environnementaux comme le débit, la salinité, le biofouling
ou encore la turbidité ont pu modifier les cinétiques d'adsorption et ainsi les valeurs de ces
paramètres (Li et al., 2011). Les concentrations dans l'eau déduites de celles des POCIS sont
alors faussées.
Conclusion
Le développement d’un protocole d’extraction, la calibration et l’application de POCIS pour
22 molécules pharmaceutiques appartenant à 5 classes thérapeutiques différentes ont été
réalisés au cours de cette étude. L’optimisation de la méthode d’extraction a abouti à
l’utilisation de 20 mL de méthanol pour récupérer 19 des 23 composés initialement
sélectionnés avec des rendements supérieurs à 65 %. Sur les 4 composés restants, 3 ont des
rendements d’extraction compris entre 20 et 30 % mais avec une variabilité inférieure à 10%
ce qui rend quand même le protocole utilisable pour eux. En revanche, le 5-FU a du être
abandonné faute d’une méthodologie suffisamment adaptée. La calibration des POCIS a
ensuite été réalisée en laboratoire sur une durée de 15 jours. Quatorze composés présentent
des régimes d’adsorption linéaire pour cette durée d’exposition et leurs taux
d’échantillonnage (Rs) ont pu être calculés. Six molécules (acide pipemidique,
sulfaméthoxazole, métronidazole, aténolol, daunorubicine et méthotréxate) ont atteint l’état
d’équilibre sur cette période et leurs constantes d’adsorption (k1) et de désorption (k2) ont pu
être définies. Enfin, 2 molécules, avec des log Kow supérieurs à 4, ont présenté des profils
particuliers d’adsorption montrant une phase de latence correspondant à la traversée de la
membrane par le composé. Une durée d’exposition de 15 jours n’est probablement pas
suffisante pour ces molécules. Finalement, des POCIS ont été déployés dans la rivière
Garonne en amont et en aval d'une zone urbaine (Bordeaux). Parallèlement, des prélèvements
ponctuels d'eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des capteurs. Les POCIS ont
permis de détecter des molécules qui n'avaient pas été décelées dans les prélèvements
ponctuels d'eau. Par ailleurs les concentrations déterminées par échantillonnage passif pour le
sulfaméthoxazole et l’aténolol sont plus élevées que celles déterminées par échantillonnage
ponctuel alors que pour les autres composés les concentrations sont du même ordre de
grandeur. Ces deux résultats peuvent être expliqués d'une part, par le caractère intégratif des
POCIS, qui prennent en compte les pics de pollution qui échappent aux prélèvements
ponctuels, et d'autre part, par les différences de conditions d'exposition entre le milieu naturel
et l'aquarium de calibration. En effet, le débit, la turbidité, la salinité et le biofouling
modifient les valeurs des paramètres Rs, k1 et k2 déterminés en laboratoire. Une façon de
compenser ces perturbations réside dans l'utilisation de PRC ou Performance Reference
Compounds (Mazzella et al., 2010). En conclusion, lorsque les concentrations sont faibles, les
POCIS permettent une meilleure détection que l’échantillonnage ponctuel et lorsque les
concentrations sont plus importantes, les valeurs mesurées par les 2 méthodes sont du même
ordre de grandeur, les POCIS présentent donc un fort interêt pour palier aux problèmes
d’échantillonnage des molécules pharmaceutiques.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier la Région Aquitaine, le projet Mediceau, le projet Etiage, le
CPER A2E et le projet Interreg Portonouvo pour le financement de ces travaux. Ils souhaitent
297
également remercier le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherché, l'ANR

(projet SEST DIPERPHA) et l'Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie
(ADEME) pour le fiancement de la thèse de M.J. Capdeville.
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298
Conclusion
et
perspectives
299
300
Conclusion et perspectives
Ce travail de thèse avait comme premier objectif le développement de méthodes analytiques

permettant le dosage de composés pharmaceutiques appartenant à 5 classes thérapeutiques
différentes dans diverses matrices environnementales, des plus simples comme les eaux
souterraines aux plus complexes comme les effluents d’élevage. Le deuxième objectif
concernait l’application de ces protocoles dans le cadre de différents projets de recherche
appliqués aux eaux (projet FLASH) mais aussi aux déchets d’élevage (ANR SEST
DIPERPHA) dans le but d’étudier à la fois l’origine humaine et vétérinaire de la
contamination et le devenir des composés.
Un premier protocole a été développé pour permettre le dosage de 23 antibiotiques, 5

anticancéreux, 2 -bloquants et 2 anti-VIH. Les 32 molécules pharmaceutiques sont extraites
simultanément au cours d’une étape d’extraction sur phase solide (SPE) mettant en œuvre des
cartouches Oasis HLB. Elles sont éluées de la phase adsorbante avec un mélange d’eau
minérale naturelle et d’acétonitrile (EMN/ACN, 40/60, v/v). Les extraits sont ensuite
reconcentrés puis analysés par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie
de masse en tandem (RRLC/MS/MS). Les molécules sont séparées sur une phase stationnaire
C18 avec un mélange de phases mobiles constituées d’eau ultra-pure et d’acétonitrile. La
source d’ionisation est une source électrospray (ESI), ainsi 27 composés sont analysés en
mode positif et 5 en mode négatif. En ESI+, les phases mobiles sont enrichies chacune avec
0,3 % d’acide formique alors qu’en ESI-, elles sont enrichies chacune avec 0,1 % d’acide
acétique. Les analyses sont pratiquées en mode MRM et les composés sont identifiés par 2
transitions, le rapport d’intensité entre ces 2 transitions et leur temps de rétention.
Pour ce protocole, les limites méthodologiques de détection varient entre moins de 5 ng/L
pour le sulfaméthoxazole, le triméthoprime ou les -bloquants et 100 ng/L pour
l’amoxicilline, l’ampicilline et les antibiotiques de la famille des céphalosporines. Avec un
coefficient de détermination supérieur à 0,998 pour 25 des 32 composés étudiés, la linéarité
est bonne entre 60 et 3000 pg injectés. Pour les autres composés, des gammes plus petites de
concentration sont utilisées. Les variations intra-jours moyennes sont inférieures à 15 % et les
variations inter-jours moyennes sont de 24 % en ESI+ et de 19 % ESI-. La justesse moyenne
de la méthode est de 97 ± 10 %. Le rendement d’extraction moyen pour l’ensemble des 32
composés est de 53 ± 24 %. Il varie entre 26 ± 15 % pour les antibiotiques appartenant à la
famille des pénicillines et 70 ± 8 % pour les -bloquants par exemple. Ce protocole est donc
suffisamment sensible, précis, juste et performant pour permettre l’analyse des 32 molécules
pharmaceutiques sélectionnées dans des matrices environnementales.
Une fois validée, cette méthode a été appliquée à l’analyse de 10 effluents de stations
d’épuration (STEP) françaises mettant en œuvre des procédés de traitement différents et à
l’analyse d’un continuum « eaux usées brutes - eaux usées traitées - eau de surface - eau de
captage souterraine » dans l’Hérault. Les résultats obtenus sont venus confirmer ce qui avait
été observé dans d’autres études environnementales européennes ou françaises (Andreozzi et
al., 2003 ; Bendz et al., 2005 ; Castiglioni et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Thomas et al.,
2007 ; Tamtam et al., 2008 ; AFSSA, 2009 ; Gros et al., 2009 ; Kasprzyk-Hordern et al.,
2009 ; Gabet-Giraud et al., 2010) : les antibiotiques appartenant aux familles des macrolides
(ex. : clarithromycine, érythromycine), des fluoroquinolones (ex. : ciprofloxacine, ofloxacine)
et des sulfonamides (ex. : sulfaméthoxazole et triméthoprime) ainsi que les -bloquants (ex. :
métoprolol et propranolol) sont les composés qui sont les plus fréquemment détectés dans les
eaux usées et les eaux de surface. De plus, la contamination des effluents de STEP françaises
301
par des anti-VIH tel que le ritonavir a été mise en évidence pour la première fois à notre
connaissance. Dans l’étude du continuum « eaux usées brutes-traitées/eaux de surface/eaux
souterraines », il a été mis en évidence : i) l’impact des rejets de STEP sur la contamination
des eaux de surface et donc l’origine humaine de la pollution ; ii) des concentrations en
molécules pharmaceutiques plus fortes dans les eaux usées en hiver qu’en été ; et iii) des
concentrations en molécules pharmaceutiques plus fortes dans les eaux de surface, en aval des
rejets de STEP, en été qu’en hiver. Enfin, le sulfaméthoxazole, comme dans d’autres études
(Sacher et al., 2001 ; Barnes et al., 2008 ; Avisar et al., 2009), est le seul composé à avoir été
détecté dans les eaux de captage souterraines.
Ce protocole a ensuite été étendu à une sélection plus large de 78 composés comprenant 52
antibiotiques, 10 anticancéreux, 6 -bloquants, 9 anti-VIH et 1 inhibiteur de la
phosphodiestérase de type 5 (PDE 5). Il combinait également une seule étape d’extraction par
SPE et une double analyse par RRLC/MS/MS, une en mode positif pour 66 molécules (+ 19
étalons internes) et une autre en mode négatif pour 12 molécules (+ 3 étalons internes). A
l’exception du 5-fluorouracile et des -lactames, notamment de l’amoxicilline qui avait déjà
des taux de récupérations faibles, les rendements d’extraction étant satisfaisants, le protocole
d’extraction n’a pas subi de changement et a été utilisé de la même façon pour extraire les 32
ou les 78 molécules. Concernant la méthode d’analyse, en ESI +, en raison du plus grand
nombre de composés à séparer, la longueur de la colonne a été augmentée impliquant des
ajustements au niveau du débit de la phase mobile et au niveau du gradient
chromatographique. En revanche, la constitution des phases mobiles n’a pas été modifiée. En
ESI-, aucun changement n’a été opéré. Les 7 nouveaux composés ont été intégrés à la
méthode existante pour les 5 premières molécules.
Les limites méthodologiques de détection et de quantification de ce protocole multi-résidus
varient respectivement entre 0,03 (bisoprolol) et 142 (bacitracine) ng/L et entre 0,1 (acide
oxolinique, sulfadiméthoxine et bisoprolol) et 425 (bacitracine) ng/L. Avec un coefficient de
détermination supérieur à 0,999, la linéarité est bonne entre 30 et 1200 pg injectés pour 50
composés. Pour les autres composés, comme avec la méthode précédente, des gammes plus
petites de concentration sont utilisées. Les variations intra-jours moyennes sont de 7 % en
ESI+ et de 5% en ESI-. Les variations inter-jours moyennes sont de 54 % en ESI+ et de 29 %
ESI-. La justesse moyenne de la méthode est de 109 ± 16 %. Le rendement d’extraction
moyen pour l’ensemble des 78 composés est de 74 ± 39 %. Bien qu’il montre certaines
faiblesses notamment au niveau de la sensibilité pour des composés comme la bacitracine et
la salinomycine ou au niveau des rendements d’extraction pour le fluorouracile et les
pénicillines, ce protocole est suffisamment sensible, précis, juste et performant pour permettre
l’analyse des 78 molécules dans des échantillons environnementaux.
Une fois validée, cette méthode a été appliquée au dosage des 78 composés le long d’un
continuum hospitalier et d’un continuum agricole dans le cadre du projet FLASH (Devenir
des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries Antibiorésistantes dans les Systèmes
Hydriques de surface). Parmi les classes thérapeutiques étudiées, les analyses réalisées le long
du continuum hospitalier ont permis de mettre en évidence une contamination du rejet
hospitalier par les antibiotiques, une contamination du rejet de la maison de retraite par les
antibiotiques et les -bloquants et une contamination des eaux usées et des eaux de surface
impactées par ces rejets par les -bloquants, les anti-VIH et les antibiotiques, en particulier
ceux appartenant aux familles des macrolides, des fluoroquinolones et des sulfonamides. Ce
dernier résultat est ainsi venu confirmer ce qui avait déjà été observé dans les études évoquées
précédemment. De plus, de la même façon que lors du suivi de la contamination le long du
continuum dans l’Hérault, il a été mis en évidence : i) une contamination des eaux usées plus
forte en hiver qu’en été liée à la présence d’antibiotiques, ce qui semble cohérent au regard
302
des modes d’usages de ces médicaments ; et ii) une contamination des eaux de surface plus
forte en été qu’en hiver probablement liée à une dilution moindre en raison des débits des
cours d’eau plus faibles en été. Enfin, une diminution de la contamination le long du
continuum hospitalier a été observée. L’étude du continuum agricole a fait ressortir une
contamination des 2 cours d’eau situés les plus en amont (point 1 et 2) par des antibiotiques
utilisés exclusivement en médecine vétérinaire (ex. : tylosine et enrofloxacine) amenant à
conclure à une origine vétérinaire de la contamination de ces 2 cours d’eau. En revanche, les 2
autres cours d’eau (point 3 et 4) se sont révélés être contaminés par des antibiotiques utilisés à
la fois en médecine humaine et en médecine vétérinaire ainsi que par des -bloquants, des
anticancéreux et des anti-VIH amenant à conclure à une double origine, à la fois humaine et
vétérinaire, de la contamination de ces systèmes aquatiques. Enfin, une augmentation de la
contamination, aussi bien en nombre d’antibiotiques retrouvés qu’en concentrations mesurées,
le long du continuum agricole a été observée au fur et à mesure que la pression anthropique
augmente.
Les perspectives des travaux menés dans le cadre de ce programme FLASH sont de vérifier
l’impact de la saison sur la contamination des eaux de surface en évaluant les flux de
substances d’après les débits des cours d’eau (continuum agricole) ; et aussi de finaliser les
études parallèles entre la consommation d’antibiotiques, leur détection dans les eaux
(continuum hospitalier) et l’antibiorésistance, notamment au travers de la rédaction et de la
publication d’un article scientifique.
En raison de l’importance que revêt l’amoxicilline dans l’antibiothérapie, au point d’être le

premier antibiotique le plus consommé en France, un protocole spécifique à son dosage dans
les eaux a été développé pour pallier les faiblesses des analyses multi-résidus exposées
précédemment. Dans ce nouveau protocole, l’amoxicilline et l’ampicilline sont extraites sur
des cartouches Oasis MCX et éluées avec un mélange EMN/ACN (40/60, v/v). Ces molécules
sont ensuite analysées par RRLC/MS/MS en mode positif. La méthode analytique est la
même que celle utilisée en ESI+ pour analyser les 27 composés pharmaceutiques issus de la
première sélection. Cependant, le gradient et la proportion initiale des solvants des phases
mobiles ont été modifiés de façon à réduire le temps total d’analyse et à retarder l’élution de
l’amoxicilline qui sortait à la limite du volume mort avec la méthode précédente. La
répétabilité, la linéarité et la justesse de cette nouvelle méthode sont bonnes mais ce nouveau
protocole a surtout permis d’obtenir des rendements d’extraction pour l’amoxicilline de 46 ±
3 %. De plus, lorsqu’il est combiné avec l’ajout de l’étalon interne spécifique à l’amoxicilline,
l’amoxicilline-13C6, il permet d’obtenir des rendements d’extraction de 110 ± 11 %. Cette
nette amélioration des rendements d’extraction révèle l’importance des étalons internes pour
optimiser la quantification des analytes. De plus, cette augmentation des rendements
d’extraction a permis d’améliorer la limite méthodologique de quantification de
l’amoxicilline, la faisant ainsi passer de 300 ng/L avec le protocole multi-résidus à 120 ng/L
avec le protocole spécifique. En dépit de ces améliorations, l’application du nouveau
protocole à des échantillons, prélevés en été, n’a pas permis de mettre en évidence une
contamination des eaux usées par l’amoxicilline. Il sera alors judicieux de l’appliquer à des
échantillons collectés en hiver pour confirmer ou non l’importance de l’amoxicilline dans la
pollution des eaux par les molécules pharmaceutiques.
Pour intégrer la contamination sur plusieurs heures et même plusieurs jours, des
échantillonneurs passifs ont été développés pour permettre le dosage de 22 molécules
pharmaceutiques parmi les 78 étudiées au cours de cette thèse. Dans un premier temps, la
méthode d’extraction a été optimisée pour aboutir à des taux de récupération supérieurs à 65%
pour 19 composés. Puis les Polar Organic Chemical Integrative Sampler (POCIS) ont été
303
calibrés lors d’expérimentations réalisées en laboratoire de façon à identifier leurs régimes

d’adsorption sur une durée d’exposition de 15 jours et à déterminer leur taux
d’échantillonnage (Rs) ou leurs constantes d’accumulation (k 1) et de dissipation (k2). Pour
cette durée d’exposition, sur les 22 composés, 14 présentent des régimes d’adsorption linéaire
et leurs Rs ont pu être calculés et 6 ont atteint l’état d’équilibre et leurs constantes k1 et k2 ont
pu être définies. Les 2 dernières molécules ont présenté des profils particuliers d’adsorption
montrant une phase de latence (« lag effect ») et ni leurs Rs ni leurs k1 et k2 n’ont pu être
calculés. Les POCIS ont ensuite été déployés dans la rivière Garonne en amont et en aval de
la zone urbaine de Bordeaux et des prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés en parallèle
au moment du dépôt et du retrait des capteurs. En amont, seul les POCIS ont permis de
détecter et de quantifier des molécules grâce à leur caractère intégratif et accumulatif. Aucune
des molécules recherchées n’a été détectée dans les prélèvements d’eau. En aval, les POCIS
ont permis de mettre en évidence la présence de composés qui n’étaient pas détectés par
échantillonnage ponctuel comme l’abacavir, un anti-VIH, ou le cyclophosphamide, un
anticancéreux. Ainsi, que ce soit via les POCIS ou via les eaux, l'impact de la zone urbaine
sur la contamination du milieu aquatique a été confirmé avec des quantités mesurées en aval
plus importantes que celles mesurées en amont. Par ailleurs, à l’exception de 2 composés pour
lesquels les concentrations dans l’eau ne sont pas calculées avec certitude à partir de celles
mesurées dans les POCIS, les concentrations dosées en aval de la ville sont du même ordre de
grandeur d’un point de vue environnemental qu’elles soient issues des POCIS ou des
prélèvements d'eau. En conséquence, les POCIS sont des outils prometteurs dans l’étude de la
contamination de l’environnement car en cas de faibles concentrations, ils permettent de
détecter des composés qui ne le sont pas avec les méthodes d’échantillonnage ponctuelles ; et
en cas de fortes concentrations, les dosages réalisés avec les POCIS sont similaires à ceux
réalisés avec les autres méthodes. Néanmoins dans le but d’améliorer les quantifications
réalisées à partir des POCIS, une perspective de ces travaux concerne le développement de
PRC (Performance Reference Compound). Les PRC permettent de compenser les effets de
l’agitation par exemple et ainsi de réduire les biais liés à la différence entre les conditions
d’exposition sur le terrain et celles de calibration en laboratoire rendant ainsi les
quantifications plus justes.
Enfin, dans le cadre du projet DIPERPHA (Dynamique et Impact des Perturbateurs

endocriniens et des composés Pharmaceutiques issus des élevages agricoles), parmi les 52
antibiotiques analysés dans ces travaux de thèse, 7 ont été sélectionnés, sur la base de leur
fréquence de détection (> 50 %) dans des analyses préliminaires, pour être étudiés dans des
lisiers porcins. Comme pour les eaux, la méthode d’analyse de la phase dissoute des lisiers
met en œuvre une étape d’extraction par SPE sur cartouches Oasis HLB et une étape
d’analyse par RRLC/MS/MS en mode positif. Le protocole d’extraction des antibiotiques de
la phase solide des lisiers a été développé. Il met en œuvre une étape d’extraction par ASE
(Accelerated Solvent Extraction) suivi d’une étape de purification par SPE, avec le même
protocole que celui utilisé pour l’extraction de la phase dissoute, puis une étape d’analyse par
RRLC/MS/MS. L’extraction de la phase solide est pratiquée sur du lisier lyophilisé, avec un
mélange d’eau ultra-pure et d’acétonitrile (eau/ACN 30/70, v/v), à une température de 70°C et
à une pression de 100bar. Pour améliorer les rendements d’extractions, les étalons internes sont
ajoutés dans les cellules ASE avant extraction. Avec des rendements d’extraction proches de
100%, à l’exception de la tylosine, le protocole est considéré comme valide.
Dans un premier temps, en se basant uniquement sur l’analyse de la phase dissoute des lisiers,
par manque d’une méthode adéquate à l’analyse de la phase solide, le mode de conservation
des échantillons a été évalué. Les résultats ont montré la nécessité, pour préserver les
échantillons entre le prélèvement et l’analyse, de les congeler en ayant préalablement séparé
304
les phases dissoutes, solides et particulaires afin d’éviter les phénomènes de spéciation et le
transfert des molécules d’une phase vers l’autre.
Une fois la méthodologie analytique complétée et validée et les conditions de conservation
assurées, les 7 antibiotiques ont pu être dosés dans les phases solides et liquides de lisiers
porcins pour répondre à divers interrogations. Une première application du protocole global
(phase dissoute + phase solide) visait à comprendre si le niveau de contamination du lisier
brut était lié au stade physiologique des cochons. Une plus forte contamination des lisiers
provenant du stade post-sevrage n’a pas clairement été démontrée. Une deuxième application
visait à étudier le devenir des antibiotiques dans une fosse de stockage du lisier. Au cours des
5 mois de suivi, aucune variation significative de la concentration en antibiotiques dans la
fosse n’a pu être mise en évidence. L’intérêt de stocker le lisier pour en réduire la
contamination en antibiotique préalablement à l’épandage n’a pas été montré. En revanche
une répartition différente des antibiotiques étudiés entre la phase solide et la phase dissoute a
été révélée. L’oxytétracycline, la tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont
majoritairement présentes dans la phase solide alors que la sulfadiazine, la lincomycine et la
monensine sont essentiellement présentes dans la phase liquide. Une troisième application
visait à comprendre le devenir des antibiotiques le long de filières complexe de traitement du
lisier. Il a été démontré l’importance de la séparation de la phase solide et de la phase liquide
dans la performance du système de traitement. Enfin, une quatrième application lors d’études
de dégradation en conditions contrôlées en laboratoire a montré que la dégradation des
antibiotiques se fait principalement en condition aérobie. Enfin, de l’ensemble de toutes ces
analyses, il ressort que les 7 antibiotiques (oxytétracycline, sulfadiazine, lincomycine,
tétracycline, tylosine, marbofloxacine, monensine) choisis sont majoritaires car ils ont été
identifiés et quantifiés dans tous les échantillons de lisiers analysés et que les niveaux de
contamination du lisier par les antibiotiques sont élevés, de l’ordre de la dizaine de µg/L au
mg/L.
Les perspectives de ces travaux menés dans le cadre de l’ANR DIPERPHA sont i) de
développer un ou plusieurs protocoles permettant le dosage de la colistine (famille des
polypeptides) et des aminosides (ex. : amikacine, gentamicine, streptomycine) car ces
antibiotiques sont connus pour être administrés de façon importante dans les élevages français
(Chevance et al., 2009) mais les premiers développements n’ont pas permis de les intégrer à
la méthodologie globale ; ii) d’étudier le transfert vers le sol, les plantes et l’eau des 7
antibiotiques majoritaires analysés dans les lisiers ; et iii) de finaliser les études d’impact entre
la présence des antibiotiques dans les lisiers porcins et le développement des résistances
microbiennes à ces composés.
En termes de perspectives générales à ces travaux de thèse, il serait intéressant de travailler à

l’analyse de la phase particulaire des eaux et par extension aux sédiments. En effet, au cours
des études rapportées dans ce manuscrit, seule la phase dissoute des échantillons d’eau a été
analysée or les résultats de l’ANR DIPERPHA montrent une répartition différente des
composés entre la phase liquide et la phase solide des lisiers. Il est donc possible qu’une
répartition des molécules pharmaceutiques s’opère également entre la phase particulaire et la
phase dissoute notamment dans les eaux usées particulièrement chargées en matière en
suspension. Ainsi dans le cas d’études portant sur le devenir des résidus de médicaments dans
les systèmes aquatiques, il est pertinent de s’intéresser à la contamination de la phase
particulaire et des sédiments car les composés adsorbés n’auront pas le même devenir que
ceux retrouvés libres dans la phase dissoute. De plus, la biodisponibilité n’étant pas la même,
l’impact sur les organismes vivants ne sera pas le même. Par ailleurs, les analyses réalisées au
cours de ces travaux de thèse se sont focalisées sur les composés parents or certaines
molécules, comme l’abacavir par exemple, ne sont excrétées qu’à 2 % sous forme inchangée.
305
Pour ces composés, il est alors plus cohérent de s’intéresser aux métabolites issus de leur
transformation dans l’organisme qu’aux composés parents. Ces métabolites peuvent être
considérés comme des nouveaux composés avec leurs propres propriétés physico-chimiques
et leur propre toxicité parfois même plus forte que celle des composés parents. Cependant la
disponibilité des composés standards de référence pour ces molécules est souvent un point
bloquant pour pouvoir développer les protocoles analytiques adéquats.
306
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319
320
Annexes
321
322
Annexe 1 : Elimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP
Annexes
Annexe 1 : Elimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP.
Annexe - tableau 1 : Rendements d'élimination des molécules pharmaceutiques dans les stations
d’épuration.
(BA : boues activées, Ab : antibiotiques, Ac : anticancéreux, Av : antiviraux)
élimination
classe / famille molécule commentaire références
STEP %
analgésiques et acide méfénamic -35 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
anti-inflammatoires 10 - 45 BA Miège et al., 2009
0 Roberts et Thomas, 2005 dans Fent et al., 2006
2 - 50 Tauxe-Wuersch et al., 2005 dans Fent et al., 2006
acide salicylique 82 - 99 Gros et al., 2010
98 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
100 BA Kasprzyk Hordern et al., 2009
99 Metcalfe et al., 2003 dans Fent et al., 2006
100 BA Miège et al., 2009
acide aminosalicylique 5-42 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
aspirine 98 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
80 - 82 BA Miège et al., 2009
81 Ternes, 1998
codéine 38 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
dextropropoxyphène 0 Roberts et Thomas, 2005 dans Fent et al., 2006
diclofénac 10 - 75 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
22 Bendz et al., 2005
30 - 100 Gros et al., 2010
17 Heberer, 2002 dans Fent et al., 2006
-50 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
-30 BA Kasprzyk Hordern et al., 2009
9 - 60 Lindqvist et al., 2005 dans Fent et al., 2006
15 - 50 BA Miège et al., 2009
23 Quintana et al., 2005 dans Fent et al., 2006
53 - 74 Strenn et al., 2004 dans Fent et al., 2006
0 Tauxe-Wuersch et al., 2005 dans Fent et al., 2006
69 Ternes, 1998
ibuprofène 52 - 99 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
96 Buser et al., 1999 dans Fent et al., 2006
60 - 70 Carballa et al., 2004 dans Fent et al., 2006
25 - 72 hiver Castiglioni et al., 2006
0 - 100 été Castiglioni et al., 2006
65 - 100 Gros et al., 2010
> 90 Metcalfe et al., 2003 dans Fent et al., 2006
50 - 100 BA Miège et al., 2009
90 Ternes, 1998
99 Thomas et Foster, 2004 dans Fent et al., 2006
hydroxy-ibuprofène 95 Bendz et al., 2005
carboxy-ibuprofène 96 Bendz et al., 2005
indométhacine 18 - 75 BA Miège et al., 2009
75 Ternes, 1998
kétoprofène 65 Bendz et al., 2005
40 - 100 Gros et al., 2010
323
élimination
STEP %
analgésiques et kétoprofène 51 - 100 Lindqvist et al., 2005 dans Fent et al., 2006
anti-inflammatoires 15 - 75 BA Miège et al., 2009

48 - 69 Stumpf et al., 1999 dans Fent et al., 2006
naproxène 42 - 93 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
40 - 55 Carballa et al., 2004 dans Fent et al., 2006
60 - 100 Gros et al., 2010
40 - 100 Metcalfe et al., 2003 dans Fent et al., 2006
60 - 95 BA Miège et al., 2009
66 Ternes, 1998
paracétamol 96 - 100 Gros et al., 2010
(acétaminophène) 90 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
4-aminoantioyryrine 55 BA Miège et al., 2009
diméthylamino- 40 BA Miège et al., 2009
phénazone 38 Ternes, 1998
phénazone 35 BA Miège et al., 2009
33 Ternes, 1998
propyphénazone 30 - 87 Gros et al., 2010
tramadol -20 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
antiépiléptiques et carbamazépine 0 - 53 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
antidépresseurs 30 Bendz et al., 2005
0 hiver Castiglioni et al., 2006
0 été Castiglioni et al., 2006
4 Clara et al., 2004 dans Fent et al., 2006
8 Heberer, 2002 dans Fent et al., 2006
-20 BA Kasprzyk Hordern et al., 2009
< 50 Metcalfe et al., 2003 dans Fent et al., 2006
0 - 18 BA Miège et al., 2009
7 Ternes, 1998
-121 moyenne Vieno et al., 2007
-44 BA conventionnelles Vieno et al., 2007
-193 BA dénitrification Vieno et al., 2007
-32 BA canal d’oxydation Vieno et al., 2007
gabapentin -10 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
amitriptyline 70 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
diazépam 93 Van Der Hoeven, 2004 dans Fent et al., 2006
hypolipémiants acide clofibrique 0 - 30 hiver Castiglioni et al., 2006
10 - 50 BA Miège et al., 2009
0 Tauxe-Wuersch et al., 2005 dans Fent et al., 2006
51 Ternes, 1998
acide fénofibrique 65 BA Miège et al., 2009
64 Ternes, 1998
atorvastatine 40 - 80 Gros et al., 2010
bézafibrate 0 - 66 hiver Castiglioni et al., 2006
23 - 99 Gros et al., 2010
324
élimination
STEP %
hypolipémiants bézafibrate 50 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
30 - 100 BA Miège et al., 2009
83 Ternes, 1998
gemfibrozil 10 - 75 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
30 - 99 Gros et al., 2010
40 - 65 BA Miège et al., 2009
69 Ternes, 1998
agents de acide iothalamique 0 BA Miège et al., 2009
contraste iodé acide ioxithalamique 0 BA Miège et al., 2009
diatrizoate 0 BA Miège et al., 2009
iomeprol 0 BA Miège et al., 2009
iopamidol 0 BA Miège et al., 2009
iopromide 0 BA Miège et al., 2009
histamine cimétidine 30 - 99 Gros et al., 2010
antagonistes 10 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
des récepteurs H2
ranitidine 0 - 76 hiver Castiglioni et al., 2006
-agonistes salbutamol 0 hiver Castiglioni et al., 2006
20 - 99 Gros et al., 2010
bloqueurs de diltiazem 38 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
canaux calcium 75 BA Kasprzyk Hordern et al., 2009
angiotensine II Valsartan 40 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
antagonistes 75 BA Kasprzyk Hordern et al., 2009
antihypertenseurs enalapril 4 - 31 hiver Castiglioni et al., 2006
83 - 99 Gros et al., 2010
diurétiques hydrochlorothiazide 0 - 77 hiver Castiglioni et al., 2006
furosémide 0 - 17 hiver Castiglioni et al., 2006
20 - 96 Gros et al., 2010
anti-diabétiques glibendamide 22 - 75 Gros et al., 2010
inhibiteurs de la sildénafil 68 Nieto et al., 2010a
phosphodiestérase 5 Nieto et al., 2010a
vardénafil 80
tadalafil 69 Nieto et al., 2010a
Ab pénicillines amoxicilline 49 - 100 hiver Castiglioni et al., 2006
ampicilline 48 Richardson et Bowron, 1985 dans Halling-Sørensen
et al., 1998
Ab macrolides azithromycine 50 BA Miège et al., 2009
clarithromycine 0 - 24 hiver Castiglioni et al., 2006
érythromycine 0 hiver Castiglioni et al., 2006
0 Richardson et Bowron, 1985 dans Halling-Sørensen
et al., 1998
roxithromycine 30 - 50 BA Miège et al., 2009
spiramycine 0 - 11 hiver Castiglioni et al., 2006
Ab lincosamides lincomycine 0 hiver Castiglioni et al., 2006
325
élimination
STEP %
Ab lincosamides lincomycine 0 été Castiglioni et al., 2006
Ab fluoroquinolones ciprofloxacine 45 - 78 hiver Castiglioni et al., 2006
79 - 86 Golet et al., 2002a
37 - 99 Gros et al., 2010
60 - 90 BA Miège et al., 2009
84 moyenne Vieno et al., 2007
86 BA conventionnelles Vieno et al., 2007
79 BA dénitrification Vieno et al., 2007
96 BA canal d’oxydation Vieno et al., 2007
lévofloxacine 45 BA Miège et al., 2009
norfloxacine 80 - 87 Golet et al., 2002a
30 - 98 Gros et al., 2010
~ 80 BA Miège et al., 2009
lévofloxacine 45 BA Miège et al., 2009
ofloxacine 0 - 62 hiver Castiglioni et al., 2006
20 - 99 Gros et al., 2010
Ab tétracyclines tétracycline 40 - 89 Gros et al., 2010
35 - 100 BA Miège et al., 2009
et al., 1998
Ab sulfonamides sulfadiazine 43 - 98 Gros et al., 2010
sulfaméthazine 20 - 50 BA Miège et al., 2009
sulfaméthoxazole 0 - 84 hiver Castiglioni et al., 2006
30 - 92 Gros et al., 2010
40 - 80 BA Miège et al., 2009
et al., 1998
sulfapyridine -140 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
triméthoprime 49 Bendz et al., 2005
0 - 40 BA Miège et al., 2009
Ab imidazoles métronidazole 25 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
0 Richardson et Bowron, 1985 dans Halldansg-
Sørensen et al., 1998
Ab phénicolés chloramphénicol 100 filtre bactérien Kasprzyk Hordern et al., 2009
-bloquants aténolol 0 - 10 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
0 - 21 hiver Castiglioni et al., 2006
41 10°C Gabet-Giraud et al., 2010
84 20°C Gabet-Giraud et al., 2010
20 - 97 Gros et al., 2010
5 - 20 BA Miège et al., 2009
76 Vieno et al., 2006
bisoprolol 55 Gabet-Giraud et al., 2010
métoprolol 0 - 10 Andreozzi et al., 2003 dans Fent et al., 2006
40 Gabet-Giraud et al., 2010
0 - 25 BA Miège et al., 2009
326
élimination
STEP %
-bloquants métoprolol faible après traitement Sedlak et Pdanskston, 2001
secondaire ou tertiaire
sans BA
bon après traitement tertiaire Sedlak et Pdanskston, 2001
avec BA et nitrification
0 microfiltration Sedlak et Pdanskston, 2001
~ 100 osmose-inverse Sedlak et Pdanskston, 2001
83 Ternes, 1998
propranolol 32 Bendz et al., 2005
22 Gabet-Giraud et al., 2010
~ 100 BA Miège et al., 2009
faible après traitement Sedlak et Pdanskston, 2001
secondaire ou tertiaire
sans BA
bon après traitement tertiaire Sedlak et Pdanskston, 2001
avec BA et nitrification
0 microfiltration Sedlak et Pdanskston, 2001
~ 100 osmose-inverse Sedlak et Pdanskston, 2001
96 Ternes, 1998
sotalol < 20 Gabet-Giraud et al., 2010
Ac moutardes cyclophosphamide faible Steger-Hartmann et al., 1997
azotées ifosfamide 0 Kümmerer et al., 1997
<3 Mahnik et al., 2007
Ac anthracyclines daunorubicine adsorbé sur les Mahnik et al., 2007
particules
doxorubicine adsorbé sur les Mahnik et al., 2007
particules
épirubicine adsorbé sur les Mahnik et al., 2007
particules
Ac anti-métabolites 5-fluorouracile métabolisé par les Mahnik et al., 2007
micro-organismes
Ac anti-hormones tamoxifen 0 Roberts et Thomas, 2005 dans Fent et al., 2006
Av herpes acyclovir 97 - 98 Prasse et al., 2010
penciclovir 87 - 94 Prasse et al., 2010
Av grippe A oseltamivir 0 Prasse et al., 2010
oseltamivir carboxylate 59 Prasse et al., 2010
Av VIH abacavir > 99 Prasse et al., 2010
lamivudine 76 - 93 Prasse et al., 2010
névirapine 0 Prasse et al., 2010
stavudine 78 - 89 Prasse et al., 2010
zidovudine 0 - 68 Prasse et al., 2010
327
328
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (rejets hospitaliers)
Annexe 2 : Présences et niveau de contamination des molécules

pharmaceutiques dans différentes matrices environnementales
Annexe - tableau 2 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les rejets hospitaliers
(données relevées dans la littérature, exprimées en ng/L).
(Ab : antibiotiques, Ac : anticancéreux, Av : antiviraux)
valeur valeur
classe composés pays moyenne médiane référence bibliographique
minimale maximale
analgésiques et codéine Espagne 900 10 5 700 Gomez et al., 2006
anti-inflammatoires diclofénac Espagne 1 400 60 1 900 Gomez et al., 2006
Suède 819 784 238 1 629 Thomas et al., 2007
Suède 2 737 1 550 365 14 934 Thomas et al., 2007
ibuprofène Espagne 19 770 1 500 151 000 Gomez et al., 2006
Suède 499 417 69 987 Thomas et al., 2007
kétoprofène France 1 700 1 100 3 400 Mullot, 2009
France 7 900 3 700 14 000 Mullot, 2009
France 14 500 2 200 30 200 Mullot, 2009
kétorolac Espagne 4 200 200 59 500 Gomez et al., 2006
méthylprednisolone France 1 600 600 2 100 Mullot, 2009
paracétamol Espagne 16 020 500 29 000 Gomez et al., 2006
(acétaminophène) Suède 58 372 46 928 13 874 177 674 Thomas et al., 2007
Suède 329 852 197 258 5 421 1 368 474 Thomas et al., 2007
anesthésique propofol France 2 800 1 000 7 600 Mullot, 2009
France 2 900 15 300 Mullot, 2009
France 600 1 500 Mullot, 2009
antiépiléptiques et carbamazépine Espagne 40 30 70 Gomez et al., 2006
antidépresseurs
agents de iobitridol France 2 942 000 9 900 000 Mullot, 2009
contraste iodé ioméprol France 1 294 000 2 900 000 Mullot, 2009
histamine ranitidine Espagne 980 400 1 700 Gomez et al., 2006
antagonistes
des récepteurs H2
Ab pénicillines amoxicilline Australie 90 900 Watkinson et al., 2009
pénicilline V Australie 10 Watkinson et al., 2009
Ab céphalosporines céfalexine Australie 4 100 10 000 Watkinson et al., 2009
Ab macrolides érythromycine Chine 13 261 Chang et al., 2010
Espagne 19 10 30 Gòmez et al., 2006
érythromycine-H2O Chine 448 827 Chang et al., 2010
oléandomycine Australie 5 40 Watkinson et al., 2009
roxithromycine Australie 50 400 Watkinson et al., 2009
Chine 1 180 2 189 Chang et al., 2010
Ab lincosamides clindamycine Australie 4 90 Watkinson et al., 2009
lincomycine Australie 6 1 700 Watkinson et al., 2009
Chine 63 174 Chang et al., 2010
Ab fluoroquinolones ciprofloxacine Australie 2 500 15 000 Watkinson et al., 2009
France 12 300 6 700 20 400 Mullot, 2009
France 34 900 13 500 95 600 Mullot, 2009
France 14 800 7 100 22 000 Mullot, 2009
Suède 3 600 101 000 Lindberg et al., 2004
Suède 23 336 24 030 54 049 Thomas et al., 2007
Suisse 3 000 87 000 Hartmann et al., 1998
enrofloxacine Australie 60 100 Watkinson et al., 2009
loméfloxacine Chine 190 1 162 Chang et al., 2010
norfloxacine Australie 90 200 Watkinson et al., 2009
Chine 136 1 620 Chang et al., 2010
ofloxacine Chine 1 600 4 240 Chang et al., 2010
Suède 200 7 600 Lindberg et al., 2004
acide nalidixic Australie 20 40 Watkinson et al., 2009
Ab sulfonamides sulfadiazine Chine 48 253 Chang et al., 2010
sulfaméthoxazole Australie 100 300 Watkinson et al., 2009
Chine 195 1 060 Chang et al., 2010
France 3 100 1 000 6 500 Mullot, 2009
France 4 000 1 700 6 100 Mullot, 2009
329
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (rejets hospitaliers)
valeur valeur
minimale maximale
Ab sulfonamides sulfaméthoxazole Suède 404 260 1 375 Thomas et al., 2007
triméthoprime Australie 300 300 Watkinson et al., 2009
Espagne 25 10 30 Gòmez et al., 2006
Ab tétracyclines chlortétracycline Suède 11 69 Thomas et al., 2007
déméclocycline Suède 52 Thomas et al., 2007
doxycycline Australie 130 200 Watkinson et al., 2009
Suède 124 403 Thomas et al., 2007
oxytétracycline Suède 750 3 743 Thomas et al., 2007
Suède 435 2 294 Thomas et al., 2007
tétracycline Australie 40 Watkinson et al., 2009
iso-chlortétracycline Chine 17 20 Chang et al., 2010
Ab imidazoles métronidazole Espagne 5 900 1 800 9 400 Gòmez et al., 2006
-bloquants aténolol Espagne 3 400 100 122 000 Gòmez et al., 2006
France 1 900 900 4 000 Mullot, 2009
France 4 100 800 14 500 Mullot, 2009
France 3 600 1 500 6 200 Mullot, 2009
métoprolol Suède 1 072 951 419 2 232 Thomas et al., 2007
propranolol Espagne 1 350 200 6 500 Gòmez et al., 2006
Ac moutardes cyclophosphamide Allemagne 146 Steger-Hartmann et al., 1996
azotées Allemagne 19 4 500 Steger-Hartmann et al., 1997
France 300 900 Catastini et al., 2009
France 1 500 3 600 Mullot, 2009
France 1 300 2 200 Mullot, 2009
Suède 21 Thomas et al., 2007
ifosfamide Allemagne 109 1 914 Kümmerer et al., 1997
Allemagne 24 Steger-Hartmann et al., 1996
France 200 900 Catastini et al., 2009
Ac anthracyclines doxorubicine Autriche 600 1 350 Mahnik et al., 2007
Autriche 300 500 Mahnik et al., 2007
AC anti-métabolites fluorouracil Autriche 55 600 11 500 122 000 Mahnik et al., 2007
Autriche 21 000 40 100 Mahnik et al., 2007
Autriche 91 000 18 000 123 500 Mahnik et al., 2007
Autriche 23 800 17 100 29 100 Mahnik et al., 2007
France 30 Catastini et al., 2009
France 100 800 Mullot, 2009
France 1 700 5 800 Mullot, 2009
Ac anti-topoisomérases étoposide France 110 600 Catastini et al., 2009
Ac antagonistes des méthotréxate France 120 Catastini et al., 2009
folates
330
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (entrées de STEP)
Annexe - tableau 3 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux usées en
entrée de station d'épuration (données relevées dans la littérature, exprimées en ng/L).
valeur valeur valeur référence
classe composés pays moyenne médiane
individuelle minimale maximale bibliographique
analgésiques et acide méfénamic Croatie 5 5 Gros et al., 2006
anti-inflammatoires Espagne 50 130 Gros et al., 2009
acide salicylique Espagne 2 566 3 810 Gros et al., 2009
codéine Espagne 322 140 610 Gros et al., 2009
diclofénac Allemagne 3 020 7 100 Heberber, 2002
Croatie 250 50 540 Gros et al., 2006
Espagne 726 270 1 250 Gros et al., 2009
Suède 160 Bendz et al., 2005
ibuprofène Espagne 516 900 Gros et al., 2006
Espagne 13 228 7 320 18 410 Gros et al., 2009
Suède 3 590 Bendz et al., 2005
hydroxy-ibuprofène Suède 990 Bendz et al., 2005
carboxy-ibuprofène Suède 10 750 Bendz et al., 2005
indométhacine Espagne 53 80 Gros et al., 2009
kétoprofène Croatie 451 160 970 Gros et al., 2006
Espagne 1 496 500 2 270 Gros et al., 2009
France 3 200 6 100 Mullot, 2009
naproxène Croatie 99 190 Gros et al., 2006
Espagne 3 249 1 850 4 580 Gros et al., 2009
paracétamol Croatie 10 194 130 26 090 Gros et al., 2006
(acétaminophène) Espagne 10 899 4 160 15 600 Gros et al., 2009
Suède 12 424 3 469 1 746 43 223 Thomas et al., 2007
propyphenazone Espagne 37 50 Gros et al., 2009
excitant caféine Allemagne 230 000 640 000 Heberber, 2002
anesthésique propofol France 500 1 400 Mullot, 2009
antiépileptiques et carbamazépine Allemagne 1 780 3 800 Heberber, 2002
antidépresseurs Croatie 420 950 Gros et al., 2006
Espagne 157 37 277 Gros et al., 2009
Finlande 290 400 Vieno et al., 2006
fluoxétine Espagne 25 26 Gros et al., 2009
lorazépam Espagne 76 28 160 Gros et al., 2009
hypolipémiants acide clofibrique Allemagne 460 950 Heberber, 2002
Croatie 72 110 Gros et al., 2006
Espagne 16 30 Gros et al., 2009
atorvastatine Espagne 86 25 180 Gros et al., 2009
mevastatin Croatie 1 170 Gros et al., 2006
bézafibrate Croatie 23 50 Gros et al., 2006
gemfibrozil Croatie 155 360 Gros et al., 2006
histamine cimétidine Espagne 100 49 226 Gros et al., 2009
antagonistes famotidine Espagne 21 47 Gros et al., 2009
des récepteurs H2
ranitidine Croatie 188 290 Gros et al., 2006
antihypertenseurs enalapril Espagne 697 293 1 268 Gros et al., 2009
diurétiques hydrochlorothiazide Espagne 1 534 911 2 443 Gros et al., 2009
furosémide Espagne 604 203 925 Gros et al., 2009
antidiabétiques glibendamide Espagne 105 200 Gros et al., 2009
inhibiteur PDE 5 sildénafil Allemagne 32 22 53 Nieto et al., 2010a
Vardenafil Allemagne 11 20 Nieto et al., 2010a
Tadalafil Allemagne 12 19 Nieto et al., 2010a
Ab pénicillines amoxicilline Australie 1 400 6 940 Watkinson et al., 2009
pénicilline G Australie 10 Watkinson et al., 2009
pénicilline V Australie 20 13 800 Watkinson et al., 2009
cloxacilline Australie 4 600 Watkinson et al., 2009
cloxacilline USA 15 Cha et al., 2006
331

Ab céphalosporines céfalexine Australie 2 800 64 000 Watkinson et al., 2009
céfochlor Australie 500 6 150 Watkinson et al., 2009
Ab macrolides azithromycine Croatie 152 300 Gros et al., 2006
clarithromycine Espagne 208 501 Gros et al., 2009
oléandomycine Australie 5 Watkinson et al., 2009
roxithromycine Australie 8 500 Watkinson et al., 2009
tylosine Australie 60 Watkinson et al., 2009
lincomycine Australie 20 500 Watkinson et al., 2009
Ab fluoroquinolones ciprofloxacine Australie 600 1 100 Watkinson et al., 2009
Espagne 1 030 195 4 813 Gros et al., 2009
France 5 500 3 100 6 300 Mullot, 2009
Suisse 434 Golet et al., 2002 a
enrofloxacine Australie 40 Watkinson et al., 2009
ofloxacine Espagne 219 37 1 095 Gros et al., 2009
acide nalidixic Australie 200 Watkinson et al., 2009
Ab sulfonamides sulfadiazine Espagne 73 206 Gros et al., 2009
sulfaméthazine Espagne 132 586 Gros et al., 2009
sulfaméthoxazole Australie 250 3 000 Watkinson et al., 2009
France 600 400 700 Mullot, 2009
sulfathiazole Australie 300 Watkinson et al., 2009
sulfasalazine Australie 100 Watkinson et al., 2009
triméthoprime Australie 430 4 300 Watkinson et al., 2009
Croatie 1 172 4 220 Gros et al., 2006
Ab tétracyclines chlortétracycline Australie 6 200 Watkinson et al., 2009
oxytétracycline Australie 350 Watkinson et al., 2009
Ab imidazoles métronidazole Espagne 167 392 Gros et al., 2009
Ab polyethers salinomycine Australie 300 Watkinson et al., 2009
-bloquants acébutolol Finlande 390 510 Vieno et al., 2006
France 2 693 910 9 867 Gabet-Giraud et al., 2010
France 66 Piram et al., 2008
aténolol Croatie 395 740 Gros et al., 2006
France 3 100 2 200 3 900 Mullot, 2009
bêtaxolol France 32 2 108 Gabet-Giraud et al., 2010
bisoprolol France 213 44 429 Gabet-Giraud et al., 2010
métoprolol Espagne 65 265 Gros et al., 2009
Finlande 980 1 350 Vieno et al., 2006
France 223 5 473 Gabet-Giraud et al., 2010
nadolol France 10 Piram et al., 2008
332

-bloquants oxprénolol France 10 1 21 Gabet-Giraud et al., 2010
pindolol France 2 Piram et al., 2008
propranolol Croatie 168 80 290 Gros et al., 2006
sotalol Croatie 167 120 200 Gros et al., 2006
timolol France 5 1 13 Gabet-Giraud et al., 2010
Ac moutardes azotées cyclophosphamide Allemagne 7 143 Steger-Hartmann et al.,
1997
Ac moutardes azotées cyclophosphamide France 400 Mullot, 2009
ifosfamide Allemagne 29 Kümmerer et al., 1997
Ac anti-hormones tamoxifen 150 Roberts et Thomas, 2005
(dans Fent et al., 2006 )
Av herpes acyclovir Allemagne 1 780 Prasse et al., 2010
penciclovir Allemagne 20 43 Prasse et al., 2010
Av grippe A oseltamivir Allemagne 12 Prasse et al., 2010
oseltamivir carboxylate Allemagne 29 43 Prasse et al., 2010
Av VIH abacavir Allemagne 82 225 Prasse et al., 2010
lamivudine Allemagne 210 720 Prasse et al., 2010
névirapine Allemagne 5 22 Prasse et al., 2010
stavudine Allemagne 12 23 Prasse et al., 2010
zidovudine Allemagne 310 380 Prasse et al., 2010
333
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (sorties de STEP)
Annexe - tableau 4 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les rejets des stations
d'épuration (données relevées dans la littérature, exprimées en ng/L).
valeur valeur valeur
individuelle minimale maximale
analgésiques et acide méfénamic Croatie 7 10 Gros et al., 2006
anti-inflammatoires Espagne 30 60 Gros et al., 2009
acide gentisique Allemagne 590 Ternes, 1998
acide salicylique Allemagne 140 Ternes, 1998
France 24 50 AFSSA, 2009
aspirine Allemagne 220 1 500 Ternes, 1998
france 4 212 Togola et Budzinski, 2007a
France 24 52 Togola et Budzinski, 2008
codéine Espagne 184 10 600 Gros et al., 2009
diclofénac Allemagne 2 510 4 700 Heberber, 2002
Allemagne 1 470 2 100 Huschek et al., 2004
Allemagne 810 2 100 Ternes, 1998
Canada 359 429 Chen et al., 2006
France 250 410 Andreozzi et al., 2003
France 267 148 409 Coestier et al., 2009
France 290 410 Ferrari et al., 2004
France 26 919 Togola et Budzinski, 2007a
Grèce 890 Andreozzi et al., 2003
Italie 470 5 450 Andreozzi et al., 2003
fénoprofène Canada 78 336 Chen et al., 2006
flurbiprofène France 210 Andreozzi et al., 2003
Italie 340 Andreozzi et al., 2003
ibuprofène Allemagne 54 350 Huschek et al., 2004
Canada 284 1 150 Chen et al., 2006
Canada 786 381 1 191 Gagné et al., 2006
France 20 1 820 Andreozzi et al., 2003
Italie 20 180 Andreozzi et al., 2003
Italie 121 Zuccato et al., 2005
Suède 7 110 Andreozzi et al., 2003
1-hydroxy-ibuprofène France 62 77 AFSSA, 2009
2-hydroxy-ibuprofène France 219 698 AFSSA, 2009
carboxy-ibuprofène Suède 430 Bendz et al., 2005
indométhacine Allemagne 140 Huschek et al., 2004
Allemagne 270 600 Ternes, 1998
kétoprofène Allemagne 200 380 Ternes, 1998
France 15 1 137 Togola et Budzinski, 2007a
France 22 1 081 Togola et Budzinski, 2008
334

analgésiques et kétoprofène Suède 330 Bendz et al., 2005
anti-inflammatoires naproxène Allemagne 100 Huschek et al., 2004
Canada 589 2 670 Chen et al., 2006
Canada 271 217 325 Gagné et al., 2006
O-desméthyl-naproxène France 195 426 AFSSA, 2009
paracétamol Allemagne 6 000 Ternes, 1998
(acétaminophène) Croatie 2 102 5 990 Gros et al., 2006
aminopyrine France 430 Andreozzi et al., 2003
diméthylamino-phénazone Allemagne 1 000 Ternes, 1998
phenazone Allemagne 90 Huschek et al., 2004
propyphenazone Allemagne 110 Huschek et al., 2004
excitant caféine Allemagne 180 3 000 Heberber, 2002
Canada 11 160 315 22 000 Gagné et al., 2006
anesthésique propofol France 300 400 Mullot, 2009
antiépileptiques et carbamazépine Allemagne 1 630 5 000 Heberber, 2002
antidépresseurs Allemagne 900 1 200 Huschek et al., 2004
Allemagne 2 100 6 300 Ternes, 1998
France 590 1 359 AFSSA, 2009
France 1 102 326 1 573 Coestier et al., 2009
France 980 1 200 Ferrari et al., 2004
Grèce 1 030 Andreozzi et al., 2003
Suède 870 Andreozzi et al., 2003
fluoxétine Canada 509 Chen et al., 2006
amitriptyline France 6 Togola et Budzinski, 2008
zolpidem France 3 14 AFSSA, 2009
alprazolam France 8 12 AFSSA, 2009
citalopram Inde 770 000 840 000 Larsson et al., 2007
diazépam Allemagne 40 Ternes, 1998
nordiazépam France 8 Togola et Budzinski, 2008
oxazépam France 209 1 290 AFSSA, 2009
lorazépam Espagne 102 208 Gros et al., 2009
335

hypolipémiants acide clofibrique Croatie 28 20 30 Gros et al., 2006
acide fénofibrique Allemagne 380 1 200 Ternes, 1998
France 385 4 729 AFSSA, 2009
acide-4-chlorobenzoïque France 6 16 AFSSA, 2009
atorvastatine Espagne 122 9 395 Gros et al., 2009
mevastatine Croatie 383 800 Gros et al., 2006
parvastatine France 8 Coestier et al., 2009
clofibrate Grèce 800 Andreozzi et al., 2003
bézafibrate Allemagne 100 1 750 Huschek et al., 2004
Allemagne 2 200 4 600 Ternes, 1998
Croatie 10 Gros et al., 2006
France 79 1 506 AFSSA, 2009
fénofibrate Allemagne 30 Ternes, 1998
gemfibrozil Allemagne 280 Huschek et al., 2004
histamine cimétidine Espagne 26 60 Gros et al., 2009
antagonistes famotidine Espagne 12 Gros et al., 2009
des récepteurs H2
ranitidine Croatie 135 200 Gros et al., 2006
Inde 90 000 160 000 Larsson et al., 2007
antagoniste des cetirizine Inde 1 300 000 1 400 000 Larsson et al., 2007
récepteurs H1
antagoniste des losartan Inde 2 400 000 2 500 000 Larsson et al., 2007
récepteurs
angiotensine II
-agonistes salbutamol Allemagne 170 Ternes, 1998
clenbutérol Allemagne 80 Ternes, 1998
France 6 Togola et Budzinski, 2008
fenotérol Allemagne 60 Ternes, 1998
terbutaline Allemagne 120 Ternes, 1998
vasodilatateurs pentoxifylline Canada 15 171 Chen et al., 2006
antihypertenseurs enalapril Espagne 457 1 041 Gros et al., 2009
diurétiques hydrochlorothiazide Espagne 901 1 949 Gros et al., 2009
furosémide Espagne 225 82 624 Gros et al., 2009
France 484 2 622 AFSSA, 2009
inhibiteur PDE 5 sildénafil Allemagne 2 6 18 Nieto et al., 2010a
Allemagne 8 5 12 Nieto et al., 2010a
336

Vardenafil Allemagne 1 3 Nieto et al., 2010a
Allemagne 1 6 Nieto et al., 2010a
Allemagne 2 Nieto et al., 2010a
Ab pénicillines amoxicilline Australie 50 Watkinson et al., 2009
pénicilline V Australie 2 000 Watkinson et al., 2009
cloxacilline Australie 700 Watkinson et al., 2009
Ab céphalosporines céfachlor Australie 1 800 Watkinson et al., 2009
céfalexine Australie 250 Watkinson et al., 2009
Ab macrolides azithromycine Croatie 96 50 210 Gros et al., 2006
clarithromycine Allemagne 240 Hirsch et al., 1999
Allemagne 71 Huschek et al., 2004
érythromycine Allemagne 2 500 6 000 Hirsch et al., 1999
Allemagne 150 430 Huschek et al., 2004
novobiocine Canada 165 330 Gagné et al., 2006
roxithromycine Allemagne 680 1 000 Hirsch et al., 1999
Australie 20 500 Watkinson et al., 2009
spiramycine Italie 75 Zuccato et al., 2005
tylosine Australie 3 3 400 Watkinson et al., 2009
Ab ciprofloxacine Espagne 332 1 223 Gros et al., 2009
fluoroquinolones Finlande 40 Vieno et al., 2006
France 60 Andreozzi et al., 2003
Inde 28 000 000 31 000 000 Larsson et al., 2007
Suisse 50 110 Andreozzi et al., 2003
Suisse 45 108 Golet et al., 2001
danofloxacine France 37 71 AFSSA, 2009
enoxacine France 10 30 Andreozzi et al., 2003
enrofloxacine Australie 2 50 Watkinson et al., 2009
France 24 AFSSA, 2009
loméfloxacine France 180 190 Andreozzi et al., 2003
marbofloxacine France 40 42 AFSSA, 2009
Suisse 50 102 Andreozzi et al., 2003
337

Ab norfloxacine Suisse 48 120 Golet et al., 2001
fluoroquinolones Suisse 57 Golet et al., 2002 a
ofloxacine Espagne 95 13 367 Gros et al., 2009
Finlande 10 Vieno et al., 2006
acide nalidixic Australie 450 Watkinson et al., 2009
Ab sulfonamides sulfadiazine Espagne 60 93 Gros et al., 2009
sulfaméthoxazole Allemagne 400 2 000 Hirsch et al., 1999
Canada 49 99 Gagné et al., 2006
France 300 200 600 Mullot, 2009
France 300 100 900 Mullot, 2009
sulfapyridine Canada 23 46 Gagné et al., 2006
sulfasalazine Australie 4 150 Watkinson et al., 2009
triméthoprime Allemagne 320 660 Hirsch et al., 1999
Canada 220 440 Gagné et al., 2006
Ab imidazoles métronidazole Espagne 164 295 Gros et al., 2009
Ab polyether monensine Australie 20 Watkinson et al., 2009
Ab phénicolés chloramphénicol Allemagne 560 Hirsch et al., 1999
France 475 32 3 648 Gabet-Giraud et al., 2010
France 0,4 Piram et al., 2008
aténolol Allemagne 190 270 Huschek et al., 2004
338

-bloquants aténolol France 413 868 AFSSA, 2009
France 1 700 700 3 600 Mullot, 2009
France 1 300 400 3 500 Mullot, 2009
France 725 36 2 257 Gabet-Giraud et al., 2010
bêtaxolol Allemagne 57 190 Ternes, 1998
bisoprolol Allemagne 57 370 Ternes, 1998
Allemagne 130 Huschek et al., 2004
carazolol Allemagne 120 Ternes, 1998
métoprolol Allemagne 99 1 180 Huschek et al., 2004
Finlande 910 1 070 Vieno et al., 2006
France 80 Andreozzi et al., 2003
U.S.A 74 18 1 200 Huggett et al., 2003
nadolol Allemagne 25 60 Ternes, 1998
France 0,1 Piram et al., 2008
U.S.A 52 0 51 360 Huggett et al., 2003
oxprénolol France 20 50 Andreozzi et al., 2003
pindolol France 0,4 Piram et al., 2008
propranolol Allemagne 56 90 Huschek et al., 2004
U.S.A 117 37 26 1 900 Huggett et al., 2003
sotalol Allemagne 570 680 Huschek et al., 2004
timolol France 6 1 10 Gabet-Giraud et al., 2010
Allemagne 700 Ternes, 1998
Ac moutardes cyclophosphamide Allemagne 6 17 Steger-Hartmann et al., 1997
azotées Allemagne 20 Ternes, 1998
France 300 Mullot, 2009
ifosfamide Allemagne 43 Kümmerer et al., 1997
339

Ac moutardes ifosfamide France 4 Coestier et al., 2009
azotées Suède 71 Thomas et al., 2007
Ac antagonistes des méthotréxate 1 000 Aherne et English, 1985 (dans
folates Halling-Sorensen et al., 1997)
Ac anti-hormones tamoxifen France 27 53 102 Coestier et al., 2009
146 369 Roberts et Thomas, 2005
(dans Fent et al., 2006)
autre Ac bléomycine 11 19 Aherne et al., 1990 (dans
Halling-Sorensen et al., 1997)
Av grippe A oseltamivir Allemagne 9 16 Prasse et al., 2010
oseltamivir carboxylate Allemagne 12 17 Prasse et al., 2010
Av VIH névirapine Allemagne 7 32 Prasse et al., 2010
340
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (eaux de surface)
Annexe - tableau 5 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux de surface
analgésiques et acide méfénamic Espagne 2 3 Gros et al., 2006
anti-inflammatoires acide gentistique Allemagne 1 200 Ternes, 1998
acide salicylique Allemagne 25 4 100 Ternes, 1998
Espagne 3 0,1 63 Fernandez et al., 2009
France 1 29 Vulliet et al., 2009
aspirine Allemagne 340 Ternes, 1998
codéine Espagne 19 43 Gros et al., 2009
U.K 25 34 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
U.S.A 12 19 Kolpin et al., 2002
U.S.A 200 1 000 Kolpin et al., 2002
U.S.A 10 Stackelberg et al., 2007
diclofénac Allemagne 70 140 Ternes, 1998
Brésil 20 60 Stumpf et al., 1999
Canada 21 Chen et al., 2006
France 0,2 49 AFSSA, 2009
France 0,2 35 Vulliet et al., 2009
ibuprofène Allemagne 20 Ternes, 1998
Espagne 294 6 2 784 Fernandez et al., 2009
Italie 1 92 Zuccato et al., 2000
U.S.A 200 1 000 Kolpin et al., 2002
carboxy-ibuprofène Suède 1 Bendz et al., 2005
indométhacine Allemagne 20 30 Ternes, 1998
Espagne 10 Gros et al., 2006
kétoprofène Allemagne 120 Ternes, 1998
naproxène Allemagne 70 390 Ternes, 1998
341

analgésiques et naproxène Canada 59 Chen et al., 2006
anti-inflammatoires Espagne 87 2 640 Fernandez et al., 2009

paracétamol Espagne 4 0,1 43 Fernandez et al., 2009
(acétaminophène) Espagne 42 250 Gros et al., 2006
Pologne 11 58 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
U.K 216 1 388 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
U.S.A 110 10 000 Kolpin et al., 2002
diméthylamino- Allemagne 340 Ternes, 1998
phénazone
phenazone Allemagne 24 950 Ternes, 1998
propyphenazone Espagne 4 13 Gros et al., 2009
tramadol Pologne 425 2 108 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
excitant caféine Canada 8 160 Chen et al., 2006
Espagne 60 12 416 Fernandez et al., 2009
U.S.A 81 6 000 Kolpin et al., 2002
U.S.A 100 5 700 Kolpin et al., 2002
1,7-diméthylxanthine Espagne 9 0,3 28 Fernandez et al., 2009
U.S.A 110 3 100 Kolpin et al., 2002
antiépileptiques et carbamazépine Allemagne 250 1 100 Ternes, 1998
antidépresseurs Canada 1,1 94 Chen et al., 2006
Canada 6 11 Garcia-Ac et al., 2009
diphénylhydantoin Espagne 14 0,2 107 Fernandez et al., 2009
gabapentin Pologne 42 75 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
chlorpromazine Espagne 2 0,9 3 Fernandez et al., 2009
fluoxétine Espagne 21 0,6 66 Fernandez et al., 2009
fluphénazine Espagne 4 4 5 Fernandez et al., 2009
diazépam Italie 0,5 1,2 Zuccato et al., 2000
lorazépam Espagne 11 26 Gros et al., 2009
342

antiépileptiques et lorazépam France 32 9 39 Coestier et al., 2009
antidépresseurs France 0,7 1,7 Vulliet et al., 2009
nordiazépam France 2 Togola et Budzinski, 2008
oxazépam France 3 73 AFSSA, 2009
zolpidem France 2 AFSSA, 2009
hypolipémiants acide clofibrique Allemagne 20 30 Ternes, 1998
Espagne 3 0,4 18 Gros et al., 2009
acide fénofibrique Allemagne 30 Ternes, 1998
France 0,2 0,5 Vulliet et al., 2009
acide-4- France 2 24 AFSSA, 2009
chlorobenzoïque
atorvastatine Espagne 2 5 Gros et al., 2009
parvastatine France 0,3 5 AFSSA, 2009
bézafibrate Allemagne 90 200 Ternes, 1998
fénofibrate Espagne 3 9 Gros et al., 2009
gemfibrozil Allemagne 20 30 Ternes, 1998
Canada 0,3 23 Chen et al., 2006
agents de iopromide France 9 14 AFSSA, 2009
contraste iodé
histamine cimétidine U.K 5 11 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
antagonistes U.S.A 74 580 Kolpin et al., 2002
des récepteurs H2
loratidine Espagne 2 3 Gros et al., 2009
ranitidine Espagne 10 Gros et al., 2006
antagoniste des valsartan Pologne 20 133 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
récepteurs U.K 1 14 Kasprzyk-Hordern et al., 2007
angiotensine II
-agonistes salbutamol Allemagne 35 Ternes, 1998
clenbutérol Allemagne 50 Ternes, 1998
fenotérol Allemagne 61 Ternes, 1998
vasodilatateur pentoxifylline Canada 15 38 Chen et al., 2006
antagoniste des déhydronifédipine U.S.A 12 30 Kolpin et al., 2002
récepteurs calciques
antihypertenseurs enalaprilat U.S.A 46 46 Kolpin et al., 2002
diltiazèm U.S.A 21 49 Kolpin et al., 2002
diurétiques hydrochlorothiazide Espagne 91 4 960 Fernandez et al., 2009
343

diurétiques hydrochlorothiazide Espagne 20 106 Gros et al., 2009
furosémide Espagne 24 168 Gros et al., 2009
metformine France 0,3 735 AFSSA, 2009
U.S.A 110 150 Kolpin et al., 2002
Ab pénicillines amoxicilline Australie 200 Watkinson et al., 2009
ampicilline U.S.A 11 Cha et al., 2006
pénicilline V Australie 10 Watkinson et al., 2009
oxacilline U.S.A 10 Cha et al., 2006
Ab céfachlor Australie 200 Watkinson et al., 2009
céphalosporines céfalexine Australie 100 Watkinson et al., 2009
cefapirin U.S.A 9 Cha et al., 2006
Ab macrolides azithromycine Espagne 8 20 Gros et al., 2006
clarithromycine Allemagne 260 Hirsch et al., 1999
érythromycine Allemagne 150 1 700 Hirsch et al., 1999
Italie 0,7 17 Zuccato et al., 2000
érythromycine-H2O U.S.A 100 1 700 Kolpin et al., 2002
roxithromycine Allemagne 560 Hirsch et al., 1999
spiramycine Espagne 8 38 Gros et al., 2009
tylosine Australie 1 60 Watkinson et al., 2009
Ab ciprofloxacine Australie 1 300 Watkinson et al., 2009
fluoroquinolones Canada 78 Chen et al., 2006
Finlande 25 Vieno et al., 2006
danofloxacine France 19 19 19 Tamtam et al., 2008
enoxacine Espagne 6 7 Gros et al., 2009
France 11 Tamtam et al., 2008
enrofloxacine Australie 300 Watkinson et al., 2009
norfloxacine Australie 30 1 150 Watkinson et al., 2009
France 31 23 60 Tamtam et al., 2008
France 10 155 Tamtam et al., 2008
U.S.A 120 120 Kolpin et al., 2002
ofloxacine Canada 5 57 Chen et al., 2006
344

Ab sarafloxacine France 10 Tamtam et al., 2008
fluoroquinolones U.S.A 20 Kolpin et al., 2002
acide nalidixic Australie 50 750 Watkinson et al., 2009
acide oxolinique France 13 13 19 Tamtam et al., 2008
fluméquine France 12 11 27 Tamtam et al., 2008
Ab sulfonamides sulfachloropyridazine U.S.A 50 Kolpin et al., 2002
sulfadiazine Espagne 6 9 Gros et al., 2009
sulfadiméthoxine Espagne 0,7 0,4 7 Fernandez et al., 2009
U.S.A 60 15 000 Lindsey et al., 2001
U.S.A 220 220 Kolpin et al., 2002
U.S.A 220 Lindsey et al., 2001
sulfaméthizole U.S.A 130 130 Kolpin et al., 2002
sulfaméthoxazole Allemagne 30 480 Hirsch et al., 1999
Australie 8 2 000 Watkinson et al., 2009
U.S.A 150 1 900 Kolpin et al., 2002
U.S.A 1 020 Lindsey et al., 2001
sulfapyridine Canada 15 Chen et al., 2006
sulfasalazine Australie 30 Watkinson et al., 2009
triméthoprime Allemagne 200 Hirsch et al., 1999
Canada 0,6 18 Chen et al., 2006
U.S.A 150 710 Kolpin et al., 2002
345

U.S.A 420 690 Kolpin et al., 2002
doxycycline Australie 400 Watkinson et al., 2009
U.S.A 340 340 Kolpin et al., 2002
U.S.A 70 1 340 Lindsey et al., 2001
U.S.A 110 110 Kolpin et al., 2002
Ab imidazoles métronidazole Espagne 21 6 45 Gros et al., 2009
France 0,1 0,4 AFSSA, 2009
France 0,1 Vulliet et al., 2009
ornidazole France 28 22 58 Tamtam et al., 2008
clotrimazole France 17 AFSSA, 2009
Ab phénicolés chloramphénicol Allemagne 60 Hirsch et al., 1999
Espagne 0,2 0,4 Gros et al., 2009
Ab polyéther salinomycine Australie 150 Watkinson et al., 2009
monensine Australie 2 150 Watkinson et al., 2009
Ab polypeptides virginiamycine U.S.A 100 Kolpin et al., 2002
aténolol Espagne 58 2 334 Fernandez et al., 2009
bêtaxolol Allemagne 28 Ternes, 1998
bisoprolol Allemagne 2 900 Ternes, 1998
carazolol Allemagne 110 Ternes, 1998
métoprolol Allemagne 45 2 200 Ternes, 1998
Espagne 7 2 26 Fernandez et al., 2009
nadolol Espagne 1 2 Gros et al., 2009
propranolol Allemagne 12 590 Ternes, 1998
sotalol Espagne 70 Gros et al., 2006
timolol Allemagne 10 Ternes, 1998
Ac moutardes cyclophosphamide Canada 54 Chen et al., 2006
azotées Italie 2 10 Zuccato et al., 2000
Ac anti-hormones tamoxifen 53 27 212 Roberts et Thomas, 2005 (dans
Fent et al., 2006)
346

autre Ac bléomycine 17 Aherne et al., 1990 (dans Halling-
Sorensen et al., 1997)
Allemagne 3 31 Prasse et al., 2010
penciclovir Allemagne 7 Prasse et al., 2010
Av grippe A oseltamivir Allemagne 0,6 15 Prasse et al., 2010
Allemagne 0,3 17 Prasse et al., 2010
oseltamivir carboxylate Allemagne 0,6 24 Prasse et al., 2010
Av VIH abacavir Allemagne 1,4 Prasse et al., 2010
névirapine Allemagne 5 17 Prasse et al., 2010
stavudine Allemagne 2 3 Prasse et al., 2010
347
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (eaux souterraines)
Annexe - tableau 6 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux souterraines
classe composés pays référence bibliographique
analgésiques et acide salicylique Allemagne 1 225 Heberber, 2002
anti-inflammatoires France 19 92 AFSSA, 2009
diclofénac Allemagne 380 Heberber, 2002
Allemagne 590 Sacher et al., 2001
ibuprofène Allemagne 200 Heberber, 2002
U.S.A 3 110 Barnes et al., 2008
1-hydroxy-ibuprofène France 7 AFSSA, 2009
kétoprofène Allemagne 30 Heberber, 2002
naproxène France 0,4 2 AFSSA, 2009
paracétamol France 103 AFSSA, 2009
(acétaminophène) France 0,4 12 AFSSA, 2009
U.S.A 380 Barnes et al., 2008
phenazone Allemagne 1 250 Heberber, 2002
propyphenazone Allemagne 1 465 Heberber, 2002
excitant caféine U.S.A 130 Barnes et al., 2008
1,7-diméthylxanthine U.S.A 57 Barnes et al., 2008
antiépileptiques et carbamazépine Allemagne 900 Sacher et al., 2001
antidépresseurs France 3 167 AFSSA, 2009
fluoxétine U.S.A 56 Barnes et al., 2008
bromazépam France 42 93 AFSSA, 2009
diazépam France 2 6 AFSSA, 2009
lorazépam France 0,7 2 AFSSA, 2009
zolpidem France 2 3 AFSSA, 2009
acide fénofibrique France 2 105 AFSSA, 2009
bézafibrate France 7 AFSSA, 2009
fénofibrate Allemagne 45 Heberber, 2002
gemfibrozil Allemagne 340 Heberber, 2002
agents de acide amidotrizoïque Allemagne 1 100 Sacher et al., 2001
contraste iodé iopamidol Allemagne 300 Sacher et al., 2001
antagoniste des récepteurs déhydronifédipine U.S.A 22 Barnes et al., 2008
calciques
antihypertenseurs diltiazèm U.S.A 28 Barnes et al., 2008
diurétiques furosémide France 4 14 AFSSA, 2009
antidiabétiques metformine France 0,5 18 AFSSA, 2009
Ab macrolides érythromycine-H2O Allemagne 49 Sacher et al., 2001
roxitromycine France 0,5 3 AFSSA, 2009
Ab lincosamides lincomycine U.S.A 320 Barnes et al., 2008
Ab fluoroquinolones danofloxacine France 36 54 AFSSA, 2009
enrofloxacine France 30 62 AFSSA, 2009
marbofloxacine France 57 AFSSA, 2009
Ab sulfonamides sulfaméthazine Allemagne 160 Hirsch et al., 1999
U.S.A 360 Barnes et al., 2008
sulfaméthoxazole Allemagne 470 Hirsch et al., 1999
Israël 20 Avisar et al., 2009
U.S.A 1 110 Barnes et al., 2008
Ab imidazole clotrimazole France 10 20 AFSSA, 2009
348
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (eaux souterraines)

-bloquants aténolol France 0,5 13 AFSSA, 2009
métoprolol France 4 AFSSA, 2009
France 0,3 AFSSA, 2009
propranolol France 2 AFSSA, 2009
sotalol Allemagne 560 Sacher et al., 2001
349
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (eaux potables)
Annexe - tableau 7 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux potables
(eaux en sortie de station de potabilisation ou eaux de boisson) (données relevées dans la littérature,
exprimées en ng/L).
analgésiques et acide salicylique France 45 53 AFSSA, 2009
anti-inflammatoires France 0,6 19 AFSSA, 2009
codéine U.S.A 30 Stackelberg et al., 2007
diclofénac France 0,2 1 AFSSA, 2009
France 2,5 Togola et Budzinski, 2008
ibuprofène France 1,3 AFSSA, 2009
kétoprofène France 10 13 AFSSA, 2009
naproxène France 0,5 2 AFSSA, 2009
paracétamol France 28 AFSSA, 2009
(acétaminophène) France 0,5 45 AFSSA, 2009
AMDOPH Allemagne 900 Reddersen et al., 2002
phenazone Allemagne 400 Reddersen et al., 2002
Allemagne 300 Zuehlke et al., 2007
propyphenazone Allemagne 80 Heberber, 2002
Allemagne 120 Reddersen et al., 2002
Allemagne 90 Zuehlke et al., 2007
excitant caféine Canada 6,8 108 Chen et al., 2006
antiépileptiques et carbamazépine Canada 0,8 135 Chen et al., 2006
antidépresseurs Canada 5,6 Garcia-Ac et al., 2009
amitriptyline France 1,4 Togola et Budzinski, 2008
fluoxétine France 4 AFSSA, 2009
diazépam Italie 0,2 24 Zuccato et al., 2000
lorazépam France 2 AFSSA, 2009
hypolipémiants acide clofibrique Allemagne 40 Heberber, 2002
Canada 0,9 1,1 Chen et al., 2006
Italie 3,2 5,3 Zuccato et al., 2000
acide fénofibrique France 5 54 AFSSA, 2009
acide fénofibrique France 0,2 1,1 AFSSA, 2009
acide-4- France 9 18 AFSSA, 2009
chlorobenzoïque
parvastatine France 0,2 AFSSA, 2009
bézafibrate France 13 16 AFSSA, 2009
agents de diatrizoate Europe 18 100 Wenzel et al., 2003
contraste iodé iomeprol Europe 12 Wenzel et al., 2003
iopamidol Europe 180 Wenzel et al., 2003
350
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (eaux potables)

agent de contraste iodé iopromide Europe 29 Wenzel et al., 2003
antagonistes des déhydronifédipine U.S.A 4 Stackelberg et al., 2004
recéptueurs calciques
antidiabétiques metformine France 0,6 238 AFSSA, 2009
Ab macrolides érythromycine U.S.A 4,9 Ye et al., 2007
roxithromycine France 3,1 18 AFSSA, 2009
France 18 Vulliet et al., 2009
U.S.A 1,4 Ye et al., 2007
tylosine U.S.A 4,2 Ye et al., 2007
Italie 0,6 1,7 Zuccato et al., 2000
ofloxacine Canada 0,7 1,6 Chen et al., 2006
Ab quinolones acide oxolinique U.S.A 2,9 4 Ye et al., 2007
fluméquine U.S.A 1,2 2,5 Ye et al., 2007
Ab sulfonamides sulfaméthoxazole Canada 0,3 0,5 Chen et al., 2006
U.S.A 3 3,4 Ye et al., 2007
sulfathiazole U.S.A 10 Stackelberg et al., 2007
triméthoprime France 1 AFSSA, 2009
France 1 Vulliet et al., 2009
-bloquants aténolol France 0,4 7 AFSSA, 2009
métoprolol France 5 10 AFSSA, 2009
Ac antagonistes des méthotréxate 6,3 Halling-Sorensen et al., 1997
folates
autre Ac bléomycine 5 13 Aherne et al., 1990 (dans Halling-
351
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (boues de STEP)
Annexe - tableau 8 : Concentrations des molécules pharmaceutiques mesurées dans les boues de STEP
(données relevées dans la littérature, exprimées en ng/g).
(Ab : antibiotiques)
valeur valeur
minimale maximale
analgésiques et acide méfénamic Espagne 14 26 Jelic et al., 2009
anti-inflammatoires diclofénac Espagne 28 75 Jelic et al., 2009
Espagne 12 83 Nieto et al., 2010b
Espagne 425 Radjenovic et al., 2009 (dans Díaz-
Cruz et al., 2009)
Japon 35 Kimura et al., 2007 (dans Díaz-
Cruz et al., 2009)
U.S.A 10 23 Chenxi et al., 2008 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
ibuprofène Espagne 43 117 Jelic et al., 2009
indométhacine Espagne 3 3 Jelic et al., 2009
kétoprofène Espagne 19 21 Jelic et al., 2009
naproxène Espagne 4 6 Jelic et al., 2009
Espagne 4 Nieto et al., 2010b
paracétamol Espagne 42 103 Jelic et al., 2009
(acétaminophène) Espagne 64 419 Nieto et al., 2010b
phenazone Espagne 3 16 Jelic et al., 2009
stimulants caféine Espagne 43 74 Nieto et al., 2010b
antiépiléptiques et carbamazépine Espagne 10 13 Jelic et al., 2009
antidépresseurs Espagne 12 42 Nieto et al., 2010b
Espagne 74 90 Radjenovic et al., 2005 (dans Díaz-
Cruz et al., 2009)
Irlande 120 Barron et al., 2008 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
U.S.A 5 13 Barron et al., 2008 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
U.S.A 35 Chenxi et al., 2008 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
U.S.A 135 55 9 6 030 US EPA, 2009
fluoxéthine U.S.A 245 147 10 3 130 US EPA, 2009
diazépam Espagne 3 9 Jelic et al., 2009
hypolipémiants acide clofibrique Espagne 7 10 Nieto et al., 2010b
atorvastatine Espagne 21 65 Jelic et al., 2009
bézafibrate Espagne 3 19 Jelic et al., 2009
Espagne 9 Nieto et al., 2010b
fénofibrate Espagne 3 17 Jelic et al., 2009
gemfibrozil Espagne 14 34 Jelic et al., 2009
histamine cimétidine Espagne 0,5 6 Jelic et al., 2009
antagonistes U.S.A 1 332 171 4 8 330 US EPA, 2009
des récepteurs H2
famotidine Espagne 2 15 Jelic et al., 2009
ranitidine Espagne 0,2 2 Jelic et al., 2009
-agonistes clenbutérol Espagne 40 Jelic et al., 2009
salbutamol Espagne 4 Jelic et al., 2009
antiacides oméprazole Espagne 1 Nieto et al., 2010b
diurétiques hydrochlorothiazide Espagne 29 126 Jelic et al., 2009
furosémide Espagne 10 17 Jelic et al., 2009
antidiabétiques glibendamide Espagne 8 42 Jelic et al., 2009
inhibiteurs PDE 5 sildénafil Allemagne 8 4 17 Nieto et al., 2010a
Vardenafil Allemagne 6 Nieto et al., 2010a
Ab macrolides azithromycine U.S.A 831 278 8 5 205 US EPA, 2009
clarithromycine Allemagne 16 41 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Espagne 27 47 Jelic et al., 2009
Suisse 25 63 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
et al., 2009)
et al., 2009)
érythromycine U.S.A 36 19 2 180 US EPA, 2009
josamycine Espagne 5 48 Jelic et al., 2009
roxithromycine Espagne 1 300 1 800 Nieto et al., 2007
tylosine Espagne 1 300 4 000 Nieto et al., 2007
352
Annexe 2 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques (boues de STEP)
valeur valeur
minimale maximale
Ab macrolides tylosine Espagne 1 074 1 453 Nieto et al., 2010b
Ab fluoroquinolones ciprofloxacine Autriche 0,2 Ferdig et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Suisse 0,9 5 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Suisse 1 400 2 030 Golet et al., 2002 b
et al., 2009)
et al., 2009)
U.S.A 10 501 5 367 75 40 800 US EPA, 2009
norfloxacine Suède 100 4 200 Lindberg et al., 2005
ofloxacine Autriche 510 Ferdig et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Espagne 45 87 Radjenovic et al., 2009 (dans Díaz-
Cruz et al., 2009)
U.S.A 8 573 3 113 25 58 100 US EPA, 2009
Ab sulfonamides sulfaméthazine Espagne 1,1 Jelic et al., 2009
sulfaméthoxazole Allemagne 18 113 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Suède 20 73 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
sulfapyridine Allemagne 51 197 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Suède 24 29 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
sulfathiazole Espagne 23 37 Nieto et al., 2010b
triméthoprime Allemagne 87 133 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Espagne 9 11 Jelic et al., 2009
Espagne 14 Radjenovic et al., 2009 (dans Díaz-
Cruz et al., 2009)
Suisse 13 30 Göbel et al., 2005 (dans Díaz-Cruz
et al., 2009)
Ab tétracyclines doxycycline Suède 1 300 1 500 Lindberg et al., 2005
U.S.A 877 424 34 5 090 US EPA, 2009
4-épitétracycline U.S.A 1 135 620 41 4 380 US EPA, 2009
tétracycline U.S.A 1 278 630 38 5 270 US EPA, 2009
Ab imidazoles métronidazole Espagne 11 Jelic et al., 2009
Ab phénicolés chloramphénicol Espagne 1,2 Jelic et al., 2009
antimycosiques miconazole U.S.A 1 239 207 7 9 210 US EPA, 2009
-bloquants aténolol Espagne 4 11 Jelic et al., 2009
nadolol Espagne 0,8 3 Jelic et al., 2009
pindolol Espagne 14 23 Jelic et al., 2009
propranolol Espagne 9 26 Nieto et al., 2010b
sotalol Espagne 1,7 Jelic et al., 2009
353
354
Annexe 3 : Ecotoxicité des antibiotiques

Annexe - tableau 9 : Evaluation de la toxicité des antibiotiques.
(cyanobactérie : Microcystis aeruginosa, Synechococcus leopolensis ; bactérie : Aeromonas salmonicida,
Pseudomonas putida, Salmonella thyphimurium, Vibrio harveyi, Vibrio fischeri ; algue : Chlamydomonas
reinhardtii, Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa, Cyclotella meneghiniana, Pseudokirchneriella
subcapitata, Rhodomonas salina, Scenedesmus obliquus, Selenastrum capricornutum ; zooplancton : Acartia
tonsa, Artemia salina, Brachionus calyciflorus, Ceriodaphnia dubia, Daphnia magna, Daphnia pulex, Hyalella
azteca, Streptocephalus proboscideus, Tetrahymena pyriformis ; poisson : Brachydanio rerio Leociliopsis
lucida,, Lepomis Macrochines, Oncorhynchus mykiss, Oryzias latipes, Salmo gairdneri)
organisme testé EC50 LC50 NOEC LOEC référence
molécules autre
(matrice) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) bibliographique
amoxicilline (eau usée d'hôpital) 20 (umuC test) non génotoxique Hartmann et al., 1998
Microcystis aeruginosa 0,0037 Holten Lützhoft et al., 1999
Selenastrum capricornutum 250 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 320 - 30 199 Holten Lützhoft et al., 1999
mécillinam bactéries (boues activées) 62,1 Halling-Sorensen et al., 2000
Microcystis aeruginosa 0,05 - 0,06 Halling-Sorensen et al., 2000
Selenastrum capricornutum 300 Halling-Sorensen et al., 2000
Daphnia magna 300 Halling-Sorensen et al., 2000
Brachydanio rerio 100 Halling-Sorensen et al., 2000
pénicilline G microsomes d'hépatocytes cytotoxique à 100 µM Gagné et al., 2006
d’Oncorhynchus mykiss  métabolisme oxydatif
bactéries (boues de STEP) 84,6 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
clarithromycine bactéries (eau de surface) 0,151 Huschek et al., 2004
poisson (eau de surface) 280 Huschek et al., 2004
érythromycine cyanobactéries inhibe la croissance Pomati et al., 2004 (dans
Boxall, 2004)
Daphnia magna 210,6 (48h) n'affecte pas le Dojmi Di Delupis et al., 1992
comportement (dans Holten Lützhoft et al.,
phototactique 1999)
plantes aquatiques inhibe la croissance Pomati et al., 2004 (dans
Boxall, 2004)
novobiocine microsomes d'hépatocytes cytotoxique à 100 µM Gagné et al., 2006
d’Oncorhynchus mykiss  métabolisme oxydatif
roxithromycine poisson (eau de surface) 100 Huschek et al., 2004
lincomycine Daphnia magna 379,4 (48h) affecte le comportement Dojmi Di Delupis et al., 1992
phototactique: 5 mg/L (dans Holten Lützhoft et al.,
1999)
tylosine bactéries (sol) affecte la structure des Westergaard et al., 2003 (dans
communautés Boxall, 2004)
Thiele-Bruhn, 2003)
bactéries (boues de STEP) 17,5 (0h) Halling-Sorensen, 2001 (dans
24,9 (10h) Thiele-Bruhn, 2003)
ciprofloxacine (eau usée d’hôpital) 0,005 (umuC test) génotoxique Hartmann et al., 1998
Pseudomonas putida (sortie 0,08 Golet et al., 2002 a
de STEP)
bactéries(sortie de STEP) 0,002 Golet et al., 2002 a
bactéries (eau de surface) 0,003 Golet et al., 2002 a
bactéries (eau de surface) 0,0093 Huschek et al., 2004
Selenastrum capricornutum 3 Golet et al., 2002 a
(eau de surface)
Daphnia magna (eau de 60 Huschek et al., 2004
surface)
bactéries (boues activées) 0,31 - 1,22 Halling-Sorensen et al., 2000
0,008 (10h) Thiele-Bruhn, 2003)
Salmonella thyphimurium 0,005 Golet et al., 2002 a
Microcystis aeruginosa 0,004 - 0,006 Halling-Sorensen et al., 2000
Selenastrum capricornutum 2,41 - 3,66 Halling-Sorensen et al., 2000
enrofloxacine 0,040 Kolpin et al., 2002
fluméquine Aeromonas salmonicida MIC = 4 µg/mL (24h) Pursell et al., 1995 (dans
(tryptone + soja) MIC = 16 µg/mL (72h) Halling-Sorensen et al., 1997)
Aeromonas salmonicida MIC = 128 µg/mL (24h) Pursell et al., 1995 (dans
(tryptone + ion d'eau de MIC = 256 µg/mL (72h) Halling-Sorensen et al., 1997)
mer)
Aeromonas salmonicida MBC = 16 µg/mL (24h) Pursell et al., 1995 (dans
(tryptone + soja) MBC = 32 µg/mL (72h) Halling-Sorensen et al., 1997)
Aeromonas salmonicida MBC = 2 mg/mL (24h) Pursell et al., 1995 (dans
(tryptone + ion d'eau de MBC = 0,2 mg/mL Halling-Sorensen et al., 1997)
mer) (72h)
Microcystis aeruginosa 0,066 - 0,0382 Holten Lützhoft et al., 1999
Selenastrum capricornutum 1,6 - 16 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 10 - 31 Holten Lützhoft et al., 1999
Artemia salina 477 (24h) Brambilla et al., 1994 (dans
Halling-Sorensen et al., 1997 )
355

molécules autre
fluméquine Artemia salina 308 (48h) Migliore et al., 1997 (dans
96 (72h) Halling-Sorensen et al., 1997)
Artemia nauplii mortalité 22 %: 6,3 Migliore et al., 1997 (dans
mg/L Holten Lützhoft et al., 1999)
plantes effet sur les tiges, sur le Brambilla et al., 1994 (dans
poids moyen des racines Halling-Sorensen et al., 1997)
et réduction du poids
des feuilles
norfloxacine (eau usée d'hôpital) 0,025 (umuC test) non génotoxique Hartmann et al., 1998
(umuC IP <1)
Salmonella thyphimurium 0,025 (umuC test) Golet et al., 2002 a
ofloxacine Pseudomonas putida aigue : 0,010 Kümmerer et al., 2000 (dans
Ferrari et al., 2004)
Vibrio fischeri aigue : > 90 (30 Ferrari et al., 2004
min)
Vibrio fischeri chronic : Backhaus et al., 2000 (dans
0,00113 (24h) Ferrari et al., 2004)
Synechococcus leopolensis aigue : 0,016 chronic : Ferrari et al., 2004
(96h) 0,005 (96h)
Pseudokirchneriella aigue : 4,74 chronic : 2,5 Ferrari et al., 2004
subcapitata (96h) (96h)
Cyclotella meneghiniana aigue : 0,0906 chronic : Ferrari et al., 2004
(96h) 0,0312 (96h)
Brachionus calyciflorus chronic : 12,5 Ferrari et al., 2004
(48h)
Daphnia magna aigue : Ferrari et al., 2004
76,58 (48h)
Ceriodaphnia dubia aigue : 26,7 chronic : 10 Ferrari et al., 2004
(48h) (7j)
Danio rerio (embryon) chronic : > 16 Ferrari et al., 2004
(10j)
sarafloxacine Microcystis aeruginosa 0,009 - 0,023 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 11 - 52 Holten Lützhoft et al., 1999
acide oxolinique bactéries (boues de STEP) 0,10 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Microcystis aeruginosa 0,180 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 5,5 - 19 Holten Lützhoft et al., 1999
sulfadiazine bactéries (boues de STEP) 60 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Rhodomonas salina 146 - 1 113 Holten Lützhoft et al., 1999
sulfadiméthoxine Artemia salina 1800 (24h) Brambilla et al., 1994 (dans
500 (72h)
19 (96h)
des feuilles
sulfamérazine Oncorhynchus mykiss 100 (96h) Kolpin et al., 2002
sulfaméthazine Oncorhynchus mykiss 100 (96h) Kolpin et al., 2002
sulfaméthizole Oncorhynchus mykiss inhibition de l'activité Laville et al., 2004 (dans
(hépatocytes) basale de EROD Boxall, 2004)
sulfaméthoxazole Vibrio fischeri aigue : > 84 (30 Ferrari et al., 2004
min)
Synechococcus loepolensis aigue : 0,0268 chronic : Ferrari et al., 2004
(96h) 0,0059 (96h)
Pseudokirchneriella aigue : 0,146 chronic : Ferrari et al., 2004
subcapitata (96h) 0,090 (96h)
Cyclotella meneghiniana aigue : 2,4 chronic : 1,25 Ferrari et al., 2004
(96h) (96h)
Brachionus calyciflorus chronic : 25 Ferrari et al., 2004
(48h)
Daphnia magna aigue : > Ferrari et al., 2004
100 (48h)
Ceriodaphnia dubia aigue : > chronic : Ferrari et al., 2004
100 (48h) 0,250 (7j)
Danio rerio embryon chronic : > 8 Ferrari et al., 2004
(10j)
microsomes d'hépatocytes cytotoxique à 100 µM Gagné et al., 2006
d’Oncorhynchus mykiss)  métabolisme oxydatif
sulfapyridine microsomes d'hépatocytes cytotoxique à 100 µM Gagné et al., 2006
triméthoprime bactéries (boues activées) 17,8 Halling-Sorensen et al., 2000
Microcystis aeruginosa 100 - 126 Halling-Sorensen et al., 2000
Microcystis aeruginosa 100 - 126 Holten Lützhoft et al., 1999
Selenastrum capricornutum 64 - 192 Halling-Sorensen et al., 2000
Selenastrum capricornutum 81 - 211 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 9,3 - 27 Holten Lützhoft et al., 1999
356

molécules autre
Oncorhynchus mykiss 3 (96h) Kolpin et al., 2002
microsomes d'hépatocytes non cytotoxique, pas de Gagné et al., 2006
d’Oncorhynchus mykiss) métabolisme oxydatif
chlortétracycline bactéries (boues de STEP) 0,4 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Daphnia magna 88 (48h) Kolpin et al., 2002
oxytétracycline bactéries (boues de STEP) 1,2 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Selenastrum capricornutum 2,3 - 8,6 Holten Lützhoft et al., 1999
Rhodomonas salina 0,400 - 6 ,1 Holten Lützhoft et al., 1999
Daphnia magna 10,2 (48h) Kolpin et al., 2002
microsomes d'hépatocytes cytotoxique à 100 µM Gagné et al., 2006
tétracycline bactéries (boues de STEP) 2,2 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
cyanobactéries inhibe la croissance Pomati et al., 2004 (dans
Boxall, 2004)
plantes aquatiques inhibe la croissance Pomati et al., 2004 (dans
Boxall, 2004)
métronidazole (eau usée d’hôpital) 50 (umuC test) non génotoxique Hartmann et al., 1998
(umuC IP <1)
bactéries (boues de STEP) 100 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Chlorella sp 12,5 EC10 = 2,03 mg/L (72h) Lanzky et Halling-Sorensen,
38,8 1997 (dans Halling-Sorensen
et al., 1997)
Selenastrum capricornutum 39,1 EC10 = 19 mg/L (72h) Lanzky et Halling-Sorensen,
1997 (dans Halling-Sorensen
et al., 1997)
Acartia tonsa 100 Lanzky et Halling-Sorensen,
et al., 1997)
Brachydanio rerio 500 Lanzky et Halling-Sorensen,
et al., 1997)
ornidazole (eau usée d'hôpital) 5 (umuC test) non génotoxique Hartmann et al., 1998
(umuC IP <1)
aminosidine Daphnia magna 502,8 (48h) affecte le comportement Dojmi Di Delupis et al., 1992
1999)
streptomycine bactéries (boues de STEP) 0,47 Halling-Sorensen, 2001 (dans
Thiele-Bruhn, 2003)
Vibrio harveyi 19 Thomulka et al., 1993 (dans
Microcystis aeruginosa 0,3 (inhibition) Harras et al., 1985 (dans
Holten Lützhoft et al., 1999)
Selenastrum capricornutum 2,1 (inhibition) Harras et al., 1985 (dans
Holten Lützhoft et al., 1999)
algue bleue verte empêche la croissance, Harras et al., 1985 (dans
0,09 - 0,86 mg/L Holten Lützhoft et al., 1999)
Chlorella vulgaris empêche la croissance à Harras et al., 1985 (dans
21 mg/L Holten Lützhoft et al., 1999)
Scenedesmus obliquus empêche la croissance à Harras et al., 1985 (dans
21 mg/L Holten Lützhoft et al., 1999)
Chlamydomonas reinhardtii empêche la croissance à Harras et al., 1985 (dans
0,66 mg/L Holten Lützhoft et al., 1999)
chloramphénicol Vibrio harveyi 0,16 Thomulka et al., 1993 (dans
bacitracine Artemia salina 34 (24h) Migliore et al., 1997 (dans
Artemia salina 21,8 (48h) Migliore et al., 1997 (dans
Artemia nauplii mortalité 100 %: 6,3 Migliore et al., 1997 (dans
Artemia œufs provoque l'éclosion: 25 Migliore et al., 1997 (dans
Daphnia magna 126 (24h) Brambilla et al., 1994 (dans
Daphnia magna 30 (48h) Migliore et al., 1997 (dans
bacitracine Daphnia magna 126 (24h) 5 Di Delupis et al., 1992 (dans
Daphnia magna affecte le comportement Dojmi Di Delupis et al., 1992
1999)
357

molécules autre
des feuilles
ivermectine Chlorella pyrenoidosa > 9,1 Halley et al., 1989 (dans
Salmo gairdneri 3 (96h) 0,9 (96h) Halley et al., 1989 (Halling-
Lepomis Macrochines 4,8 (96h) Halley et al., 1989 (dans
carbadox pas d'effet sur la Kreuzer, 1994 (dans Halling-
composition du fumier Sorensen et al., 1997)
mutagène/ cancérigène Beutin et al., 1981
olaquindox mutagène/ cancérigène Beutin et al., 1981
Thiele-Bruhn, 2003)
358
Annexe 4 : Structure des molécules
Annexe 4 : Structures des 78 molécules pharmaceutiques
Les pénicillines et céphalosporines

NH2 NH2
H H H
N N N
S CH 3 S CH 3 S CH3
O
O N O N O N
CH 3 CH 3 CH3
HO
O O O
pénicilline
Penicillin V V
amoxicilline
Amoxicillin O ampicilline
Ampicillin O O
HO HO HO
O
NH O
O Cl
O S CH 3
N
CH 3
NH
O NH
Cl
NH N
S S CH 3 S CH3
CH3 CH 3
N N O
CH3 CH 3
O O
N N N
CH3 CH 3 O CH 3
O
O HO pénicilline
Penicillin G
G O
Oxacillin
oxacilline
O cloxacilline
Cloxacillin
HO
O
O
HO HO
Cloxacillin
Cl
O
NH2 O CH3
NH
H N
N
S CH3 S H
Cl N
S
N
CH3 O
O N N O O
CH 3
N O NH2
O CH3
O O
O O
dicloxacilline HO Cephalexin
céfalaxine O OH Cefuroxim
céfuroxime O OH
Dicloxacillin
O CH3
S O
N
H S
N H 2N H2 N
N S O
S N
H2N N
H
N
S O N N O S
N HN
O CH 3
O
O N
CH 3 N S
O
O O O O O CH3
céfotaxime
Cefotaxim O OH ceftiofur
Cef tiof ur
O O
cefpodoxime
Cef podoxime proxetil CH 3
O
CH3 H3 C O O CH3 HO O
Les tétracyclines
H 3C CH 3 H3 C CH 3
H3 C CH3
N Cl N
HO CH3 CH 3 OH N HO CH3
HO
OH OH
OH
NH2 NH2
NH 2
OH OH
OH
OH O OH O O OH O OH O O
OH O OH O O
tétracycline
Tetracyclin Oxytetracyclin
oxytétracycline chlortétracycline
Chlortetracyclin
H3 C CH3
CH3 OH N
OH
NH 2
OH
OH O OH O O
doxycycline
Doxycyclin
359
Les macrolides et lincosamides

H3C H3 C H3 C
OH O OH O OH
O
CH3 CH3 CH 3 CH 3
CH3 CH3
O
O O O O O O O O
CH3 CH3 CH 3 CH 3
CH 3 CH 3
O O
H3C O O O O O
CH3 H3 C O CH3 O CH3
HO H3 C
HO HO
H3C OH
CH3 H3 C OH CH3 H3 C OH CH3
N
OH N N
OH H3C CH3
H 3C CH 3 H 3C CH 3
H3C OH O OH OH
CH3 CH 3
N
H 3C CH 3 H 3C CH 3 érythromycine
Erythromycin
CH3
azithromycine
Azithromycin
clarithromycine
Clarithromycin
O O
H3 C
O OH
CH 3
CH3
O O O
CH 3
CH 3
HO CH 3
OH
Josamycin O CH3
O O
O CH3
Ch3 O josamycine H3 C
H3 C
HO S
Ch3 Ch3 N O
H3 C OH CH3 Ch3
N N
N OH H
HO O
H 3C CH 3 O O
OH OH O Ch3
O
CH3 CH3
HO OH
O O
H 3C CH 3 roxithromycine
Roxithromycin
Ch3 O O Ch3
O CH3 OH
N O
O O CH3 O CH3 H3 C lincomycine
Lincomycin
Ch3
N
Ch3
O
Ch3 O
O
Spiramycin CH3 O
Ch3 O
spiramycine CH 3 O
Cl CH 3
CH 3
H3C H3C CH3
HO CH3 N
Ch3 Ch3 N O S
O HO
N O N
Ch3 H3C O OH H
O OH O O O O
HO
O
O CH3
O
O Ch3 CH3 CH3 HO OH
O CH3 O OH O
OH
CH3 OH CH3
O CH3 H 3C OH
OH
Ch3 O Ch3
tylosine
tylosine clindamycine
Clindamycin
Les quinolones et fluoroquinolones

O O
O O O O
F
OH
O N OH
OH
N
O N N N
N
HN CH3
CH 3
acide oxolinique
Oxolinic acid CH 3 acidePipemidic
pipémidique
acid fluméquine
Flumequin
O O
O O O
O
F
F
OH F
OH
OH
N N N
N
N N
HN N O
HN
H 3C CH 3
CH 3
Ciprof loxacin
ciprofloxacine ofloxacine
Of loxacin Norf loxacin
norfloxacine
O O O O
F F
OH OH
N N N N
H 3C N N O N
H 3C CH 3
enrofloxacine
Enrof loxacin marbofloxacine
Marbof loxacin
360
Les sulfonamides
O O
O HN S NH2 HN S NH 2
NH 2 N O
HN S O
N
N O
O N
sulfadiméthoxine
Sulfadimethoxine sulfamérazine
Sulfamerazine
H 3C N
N sulfadiazine
Sulfadiazine
O CH3 CH3
O O
HN S NH 2 HN S NH2 O
N O N O HN S NH 2
H 3C N O S
sulfaméthazine
Sulfamethazine sulfaméthoxazole
Sulfamethoxazole
O
N
H 3C sulfaméthizole
Sulfamethizole
CH 3 CH3 N
O O
O
H
N S NH2
H2N S NH2 HN S NH 2
O
N S
O O
sulfanilamide
Sulfanilamide sulfapyridine
Sulfapyridine N sulfathiazole
Sulfathiazole
CH 3
O
H 2N N O
CH3
N CH3
O
NH2
triméthoprime
Trimethoprim
Les polypeptides
H3C CH3
CH 3 O OH
O O
H 3C
S CH3
O O CH 3
H H N O
N N CH 3
H 2N N
HN N CH 3 O
O H NH 2
CH 3 H O O H O
N N
N O CH 3
H 3C N
H O
H H HN O
N N
N N NH 2
O O H O O H
NH
bacitracine
bacitracin
N
HO O O OH CH3 virginiamycine
virginiamycin M1
Les polyethers ionophores

H 3C CH 3
CH3
CH3 CH3 CH3 CH3 H 3C
O
OH OH
O
OH O H 3C
O O
H3C
O O O
O ONa
CH3 ONa H 3C CH 3
O
H3C O O O
OH CH 3
CH3
salinomycine
salinomycin sodium salt O
CH 3 CH 3
monensine
monensin
H3C
HO OH
361
Les phénicolés
OH Cl
OH Cl
H
H N
N
Cl
Cl
O
-
O O O
N+ OH S OH
H 3C
O
O
chloramphénicol
Chloramphenicol thiamphénicol
Thiamphenicol
Les autres antibiotiques

CH 3 CH 3
HO H 3C
O
O O OH
CH 3 O H3 C OH
CH3 OH OH CH3
HO N
CH 3 NH
O -
CH3 O O CH3
H 3C
H 3C
CH 3
N+ N
N CH3
N O
O CH3 O OH
OH N
O CH 3 HO
O
CH 3 rifampicine
rif ampicin CH3 acide fusidique
f usidic acid metronidazole
métronidazole
Les  -bloquants
OH
OH H
H 3C N O
OH
H
H 3C N O H
O H 3C N O
CH3 CH3
CH 3
NH 2 CH 3 O propranolol
Propranolol
O CH 3
aténolol
Atenolol bisoprolol
Bisoprolol
OH
OH OH N
H
H H3 C N H
H 3C N O
H3 C N O
O
CH 3
N
CH 3 CH3 CH 3 S
H3 C CH3 N
O N S
H
métoprolol
Metoprolol sotalol
Sotalol O timolol
Timolol
Les anticancéreux
OH
O OH O O
OH O OH O OH O
CH 3 OH
OH
OH
NH2
NH2 NH2
O O OH O O O OH O
H3 C O O OH O
H3 C H3 C
OH
OH
O doxorubicine
Doxorubicin O
OH O
daunorubicine
Daunorubicin CH3 épirubicine
Epirubicin
CH 3
Cl
NH2
gemcitabine
Gemcitabine
N Cl H
H3C O N O N O
N
O P Cl P
CH3 N
CH3 O O N O NH
HO Cl
F
Tamoxifen
tamoxifen HO
F Ifosf amide cyclophosphamide
Cyclophosphamide
ifosfamide
362
Les anticancéreux (suite)

O OH
HO
H2N N N O
CH3
CH3 CH3
CH3
H3C
H3C
N N O NH CH3
N O O
H H3C
H N O O
NH2 N O
OH O O
OH CH3
OH
O NH O O
méthotréxate
Methotrexate
F
O OH O 5-fluorouracil
5-fluorouracil docétaxel
Docetaxel
Les anti-VIH
NH2 stavudine
Stavudine O
lamivudine
Lamivudine
CH3
HN
N HN
N
N
HO O
HO
N O N
HO N N NH2 O O
abacavir
Abacavir S
CH3
O
H3 C
CH3
HN névirapine
Nevirapine S
N H 3C CH3
O O
O N N N
HO N H
N S
O N N N O
H H
CH 3 O OH N
N N
+
N
H CH3
-
N zidovudine
Zidovudine O ritonavir
Ritonavir
Nelfinavir
nelfinavir
indinavir
Indinavir
O
N O
HO N
O OH H
HN
H N S N
H N
N H
CH3
HO N O CH3
O O
CH3 N
H3C NH H3C CH3
OH
N O
NH2 O CH3
saquinavir
Saquinavir H3C NH
OH
H3C
N
CH3
L’inhibiteur de PDE 5
O CH 3
N
O HN
O
N
S
N N
N
H 3C O CH 3 CH3
sidénafil
sildenaf il
363
364
Annexe 5 : Propriétés physico-chimiques et pharmacocinétique
Annexe 5 : Propriétés physico-chimiques et pharmacocinétique des 78

molécules pharmaceutiques étudiées
Annexe - tableau 10 : Liste des composés sélectionnés avec les informations relatives à leur structure, leur
consommation, leur pharmacocinétique et leurs propriétés physico-chimiques calculées par SciFinder
ACD/Labs (M: masse molaire) .
Classe Composé Pharmacocinétique M solubilité1
pKa log Kow1 Koc1
Famille (code ATC) (dictionnaire VIDAL 2006) (g/mol) (mg/L)
absorption : 80%
antibiotiques biotransformation : 20% acide
amoxicilline* 2.44  0.50
-lactames pénicilloïque 365.4 0.61  0.33 1 620
(J01CA04) 6.90  0.31
pénicillines excrétion sous forme active :
64% urines, 10% bile
absorption : 40%  60%
antibiotiques inchangée dans les fèces
ampicilline* 2.44  0.50
-lactames biotransformation : quasi-nulle 349.4 1.35  0.32 1 630
(J01CA01) 6.76  0.89
pénicillines excrétion sous forme active :
antibiotiques pénicilline G*
biotransformation : 20% -1,32  0,60
-lactames (benzylpénicilline) 334.4 1.67  0.20 1 300 000
excrétion : urinaire 2,45  0,50
pénicillines (J01CE01)
pénicilline V* absorption : 60%
antibiotiques
(phenoxymethyl biotransformation : acide -1.68  0.60
-lactames 350.4 1.87  0.25 1 180 000
pénicilline) pénicilloïque 2.44  0.50
pénicillines
(J01CE02) excrétion : 50% urines
antibiotiques absorption : 41%
oxacilline* -2.90  0.50
-lactames biotransformation : 45% foie 401.4 2.05  0.32 1 88 000
(J01CF04) 2.44  0.50
pénicillines excrétion : 30% urines
absorption : 70%
antibiotiques
cloxacilline biotransformation : faible -3.53  0.60
-lactames 435.9 2.53  0.34 1 31 000
(J01CF02) excrétion sous forme active : 2.44  0.50
pénicillines
antibiotiques
dicloxacilline -3.73  0.60
-lactames 470.3 3.02  0.39 1 11 000
(J01CF01) 2.44  0.50
pénicillines
antibiotiques absorption : 80%
cefalexine 3,12  0,50
-lactames biotransformation : nulle 347.4 0.65  0.26 1 1 700
(J01DB01) 6,80  0,29
céphalosporines excrétion : urinaire
antibiotiques biotransformation : 20% dérivés
cefotaxime 2,66  0,50
-lactames désacétylés 455.5 1.20  0.89 1 46 000
(J01DD01) 2,90  0,50
céphalosporines excrétion : urinaire et biliaire
absorption : 50%
antibiotiques cefpodoxime
biotransformation : cefpodoxime
-lactames proxetil* 557.6 2.17  0.91
excrétion sous forme active :
céphalosporines (J01DD13)
80% urines cefpodoxime
antibiotiques
ceftiofur* 2.62  0.50
-lactames 523.6 2.04  1.02 1 5 000
(QJ01DD90) 2.90  0.50
céphalosporines
absorption : 40%
antibiotiques
cefuroxime biotransformation : nulle -1.41  0.70
-lactames 424.4 0.47  0.89 1 320 000
(J01DC02) excrétion sous forme active : 2.59  0.50
céphalosporines
85% urines
biotransformation : N-
déméthylation, O-déméthylation,
antibiotiques azithromycine hydroxylation 8.59  0.70
748.9 3.33  0.77 2.73 100 000
macrolides (J01FA10) excrétion : biliaire 13.28  0.70
excrétion sous forme inchangée :
urine, bile
biotransformation :
descladinosyl-clarithromycine,
N-déméthyl- clarithromycine,
antibiotiques clarithromycine* 14-hydroxy- clarithromycine 8.16  0.70
747.9 3.16  0.78 82 2 200
macrolides (J01FA09) excrétion : 40% urines (18% 13.08  0.70
inchangée, 14% 14-hydroxy-
clari), 40% fèces (4,4%
inchangé)
365

pKa log Kow1 Koc1
absorption :
biotransformation : N-
antibiotiques érythromycine* déméthylation 8.16  0.70
733.9 2.83  0.77 54.2 2 800
macrolides (J01FA01) excrétion : biliaire 13.09  0.70
urinaire, biliaire
biotransformation : 50% foie, 2
antibiotiques josamycine métabolites hydroxylés 7.40  0.70
827.9 3.96  0.75 979 160
macrolides (J01FA07) excrétion : 10% urines, 90% bile 13.06  0.70
+ fèces
biotransformation : faible, 3
métabolites descladinose-
roxithromycine, N-mono-
antibiotiques roxithromycine* roxithromycine, N-diméthyl-
837.1 3.73  0.87
macrolides (J01FA06) roxithromycine
50%
excrétion : fécale
biotransformation : oui,
antibiotiques spiramycine métabolites actifs
843.1 3.06
macrolides (J01FA02) excrétion : 10% urines, biliaire,
fécale
biotransformation : 60% foie
antibiotiques tylosine excrétion : fécale 7.39  0.70
916.1 3.41  0.84 490 920
macrolides (QJ01FA90) 13.06  0.70
(source ANMV-AFSSA)
absorption : 90%
antibiotiques clindamycine 8.74  0.60
excrétion sous forme active : 424.9 1.83  0.67 4.42 6 800
incosamides (J01FF01) 12.87  0.70
10% urines, 3,6% fèces
absorption :
antibiotiques lincomycine* 8.78  0.6
excrétion sous forme active : 4 - 406.5 0.91  0.66 1.28 24 000
incosamides (J01FF02) 12.91  0.70
17% urines, bile, 40% fèces
biotransformation : 14%
antibiotiques ciprofloxacine* 6.03  0.70
excrétion : urinaire > biliaire (2% 331.3 1.31  0.78 1 700
fluoroquinolones (J01MA02) 8.38  0.25
bile)
biotransformation :
antibiotiques enrofloxacine ciprofloxacine 6.03  0.70
359.4 2.54  0.77 31.8 190
fluoroquinolones (QJ01MA90) 6.92  0.70
(source ANMV-AFSSA)
antibiotiques marbofloxacine urines et fèces 6.12  0.20
362.4 0.22  0.95 1.34 760
fluoroquinolones (QJ01MA93) 7.35  0.42
(source ANMV-AFSSA)
absorption : 40%
biotransformation : 6 métabolites
antibiotiques norfloxacine excrétion sous forme inchangée : 0.18  0.20
319.3 1.48  0.78 1.05 540
fluoroquinolones (J01MA06) 70% 8.38  0.25
excrétion : 30% urines, 65%
fèces
biotransformation :
antibiotiques ofloxacine* < 5% 5.23  0.40
361.4 1.61  0.81 1.4 230
fluoroquinolones (J01MA01) excrétion sous forme inchangé : 7.39  0.42
80% urines
antibiotiques acide oxolinique* -2.04  0.40
261.2 0.94  0.75 6.17 11 000
quinolones (J01MB05) 5.93  0.20
absorption : 80%
biotransformation :
antibiotiques acide pipémidique 3.24  0.20
< 4% 303.3 0.99  0.78 1 140
urines
biotransformation :
hydroxylation puis
glycuroconjugaison
antibiotiques fluméquine* -1.95  0.60
excrétion sous forme active : 7% 261.2 2.42  0.75 24.9 3 100
urines
excrétion : 70% urines, 10%
fèces
antibiotiques tétracycline* 4.50  1.00
444.4 -1.47  0.80 1 4 100
tétracyclines (J01AA07) 11.02  0.70
366

pKa log Kow1 Koc1
médecine humaine : pommade
antibiotiques oxytétracycline* médecine vétérinaire : 4.50  1.00

460.4 -1.51  0.83 1 5 100
tétracyclines (J01AA06) excrétion sous forme active : 10.8  0.70
urines
(source ANMV-AFSSA)
antibiotiques chlortétracycline* 4.50  1.00
médecine humaine : pommade 478.9 -0.32  0.82 1 1 100
tétracyclines (J01AA03) 11.01  0.70
antibiotiques doxycycline* excrétion sous forme active : 40 4.50  1.00
444.4 -0.54  0.80 1 980
tétracyclines (J01AA02) % urines, 32 % fèces 10.84  0.70
antibiotiques sulfadiazine 1.64  0.10
250.3 -0.12  0.25 5.1 4 800
sulfonamides (J01EC02) 6.50  0.30
antibiotiques sulfadiméthoxine 1.30  0.10
310.3 1.48  0.49 22.8 590
sulfonamides (J01ED01) 6.21  0.50
antibiotiques sulfamérazine 1.64  0.10
264.3 0.34  0.26 18 1 300
sulfonamides (J01ED07) 6.98  0.30
antibiotiques sulfaméthazine* 1.95  0.50
278.3 0.80  0.26 48.3 450
sulfonamides (J01EB03) 7.45  0.50
antibiotiques sulfaméthizole 1.88  0.50
acétylation 270.3 0.51  0.28 1.85 9 700
excrétion : 98% urines
absorption : 90%
antibiotiques sulfaméthoxazole* 1.39  0.10
excrétion sous forme inchangé : 253.3 0.89  0.42 5.07 6 100
sulfonamides (J01EC01) 5.81  0.50
20%
antibiotiques sulfanilamide 1.85  0.10
172.2 -0.72  0.22 9.66 13 000
antibiotiques sulfapyridine 2.90  0.19
249.3 0.03  0.32 18.8 3 000
antibiotiques sulfathiazole 2.31  0.50
255.3 0.05  0.40 16.1 1 500
absorption : 90%
antibiotiques triméthoprime* excrétion sous forme inchangé :
290.3 7.20  0.12 0.79  0.39 24.8 1 100
sulfonamides (J01EA01) 50%
excrétion : 80% urinaire, 4%
fèces
antibiotiques chloramphénicol* -1.73  0.70
323.1 1.08  0.37 85.2 230
phénicolés (J01BA01) 11.03  0.46
absorption : 100%
biotransformation : nulle
Antibiotiques thiamphénicol -1.73  0.70
excrétion sous forme active, 356.2 -0.27  0.45 17 850
phénicolés (J01BA02) 11.05  0.46
inchangée : 70% urines, 20%
fèces, 6% bile
absorption : 80%
biotransformation : oxydation
antibiotiques métronidazole 2.58  0.34
1 métabolite alcool, 1 171.1 -0.01  0.30 23.4 7 000
imidazole (J01XD01) 14.44  0.10
métabolite acide
excrétion : 65% urinaire
antibiotiques monensine sodium
polyéthers / salt 692.8 4.26  0.27 3.72  0.74 4.95 21 000
ionophores (QP51AH03)
antibiotiques salinomycine
polyéthers / sodium 772.9 4.36  0.10 6.10  0.78 123 1 900
ionophores (QP51AH01)
antibiotiques bacitracine
1422.7 -2.22  1.45
polypeptides (J01XX10)
virginiamycine M1
antibiotiques
(QJ01FG90 ou 525.6 -0.66  1.02
polypeptides
D06AX10)
biotransformation : désacétyl-
rifampicine
autres rifampicine 4.81  0.70
excrétion sous forme métabolite : 822.9 2.05  1.74 1.14 38
antibiotiques (J04AB02) 7.30  0.42
80% biliaire
18% urines
biotransformation : 7 métabolites
autres acide fusidique
excrétion : biliaire (95% 516.7 6.41  0.45
antibiotiques (J01XC01)
métabolisé)
367

pKa log Kow1 Koc1
absorption : 50%
biotransformation : < 10%,
atenolol 9.16  0.38
-bloquants hydroxylation 266.3 0.10  0.28 1 423 000
(C07AB03) 13.88  0.20
90% urines
biotransformation : 50% foie
bisoprolol 9.15  0.38
-bloquants excrétion sous forme inchangée : 325.4 2.14  0.44 2.72 49 000
(C07AB07) 13.86  0.20
50% urines
biotransformation : 10% alpha-
métoprolol* hydroxy-métoprolol 9.17  0.38
-bloquants 267.4 1.79  0.40 1.69 120 000
(C07AB02) excrétion sous forme métabolite : 13.89  0.20
95% urines
biotransformation : 4-hydroxy-
propranolol puis
propranolol* glycuroconjugaison 9.14  0.38
-bloquants 259.3 3.10  0.25 9.23 10 000
(C07AA05) excrétion sous forme inchangée : 13.84  0.20
4%
excrétion sous forme conjugué :
20%
biotransformation : nulle
sotalol 9.18  0.38
-bloquants excrétion sous forme inchangée : 272.4 0.32  0.37 1 286 000
(C07AA07) 9.55  0.50
90% urines
timolol 8.85  0.48
-bloquants excrétion sous forme inchangée : 316.4 0.06  0.54 1 160 000
(C07AA06) 13.38  0.20
20%
biotransformation :
anticancéreux daunorubicine* daunorubicinol, 7-hydroxy- 7.39  0.60
527.5 3.17  0.92 16.7 5.8
anthracyclines (L01DB01) daunorubicine, 7-deoxy-aglycone 8.68  0.70
excrétion : 10% urines, 40% bile
biotransformation :
doxorubicinol, 7-hydroxy-
anticancéreux doxorubicine* doxorubicine, 7-deoxy-aglycone 7.35  0.60
543.5 3.07  0.93 14.3 6.5
anthracyclines (L01DB02) excrétion sous forme inchangée 8.68  0.70
et métabolites : 50% bile, 10%
urines
biotransformation : épirubicinol,
anticancéreux épirubicine* 7-hydroxy-épirucine, 7-deoxy- 7.35  0.60
543.5 3.07  0.93 14.3 6.5
anthracyclines (L01DB03) aglycone, glucuroconjugaison 8.68  0.70
excrétion : biliaire
biotransformation : 4-hydroxy-
cyclophosphamide,
anticancéreux cyclophosphamide* aldocyclophosphamide,
261.1 2.84  0.20 0.23  0.36 31.7 86 000
moutardes azotées (L01AA01) moutarde phosphoramide,
acroléine
excrétion: urinaire
biotransformation :
aldofosfamide, moutarde
anticancéreux ifosfamide*
isophosphoramide, acroléine, 261.1 1.45  0.20 0.23  0.36 31.7 86 000
moutardes azotées (L01AA06)
carboxy-ifosfamide
excrétion : urinaire
biotransformation : CO2, urée, -
anticancéreux 5-fluorouracil
fluoro--alanine 130.1 7.68  0.40 -0.78  0.31 7.44 88 000
anti-métabolites (L01BC02)
excrétion : 80% respiratoire
biotransformation : foie, mono-,
di-, tri-phosphate de gemcitabine,
anticancéreux gemcitabine 2.54  0.70
2’-déoxy-2’,2’difluorouridine 263.2 -0.47  0.63 13.2 1 600
anti-métabolites (L01BC05) 11.65  0.70
(dFdU)
excrétion dFdU : 99% urines
biotransformation : dérivés
polyglutaminés, 7-hydroxy-
méthotréxate, acide 2,4-diamino-
anticancéreux
méthotréxate 10-méthylptéroïque (DAMPA) 3.54  0.10
antagoniste des 454.4 -0.24  0.72 1 1000 000
(L01BA01) excrétion sous forme inchangée : 5.09  0.42
folates
80%
excrétion sous forme métabolite :
10%
biotransformation :
hydroxylation (4-hydroxy-
anticancéreux tamoxifen
tamoxifen), déméthylation, 371.5 8.69  0.28 7.88  0.75 9570 2.5
antihormones (L02BA01)
conjugaison
excrétion : fécale
368

pKa log Kow1 Koc1
autres biotransformation : métabolisme
docetaxel
anticancéreux oxydatif , 4 métabolites 807.8 6.55
(L01CD02)
excrétion : 75% fèces, 6% urines
anti-VIH biotransformation : hépatique,
inhibiteur 5’-carboxy-abacavir, 5’-glucuro-
abacavir 6.53  0.30
nucléosidique de abacavir 286.3 0.72  0.82 42 120
(J05AF06) 14.86  0.10
la transcriptase excrétion sous forme inchangée :
inverse 2% excrétion : 83% urines
anti-VIH
biotransformation : lamivudine-
inhibiteur
lamivudine 5’-triphosphate 3.31  0.70
nucléosidique de 229.3 -0.71  0.58 9.78 3 400
(J05AF05) excrétion sous forme inchangée : 13.83  0.10
la transcriptase
essentiellement, urine
inverse
anti-VIH
inhibiteur
stavudine excrétion sous forme inchangée :
nucléosidique de 224.2 9.10  0.41 -0.86  0.40 8.06 18 000
(J05AF04) 50% urines
la transcriptase
inverse
anti-VIH
inhibiteur biotransformation : 80% 5’-
zidovudine*
nucléosidique de glucuronoconjugué, 3’-amino-3’- 267.2 -0.53  0.41
(J05AF01)
la transcriptase déoxythimidine
inverse
absorption : > 90%
anti-VIH biotransformation : métabolites
inhibiteur non hydroxylés puis
névirapine 4.17  0.20
nucléosidique de glycuroconjugués 266.3 1.84  0.60 239 560
(J05AG01) 12.05  0.20
la transcriptase excrétion sous forme inchangée :
inverse 3%
biotransformation : 7
métabolites,
glucuronoconjugaison, N-
anti-VIH
indinavir oxydation, 3’-hydroxylation, p- 5.19  0.10
inhibiteur de 613.8 2.87  0.86 847 20
(J05AE02) hydroxylation, N- 14.40  0.40
protéase
dépyridométhylation
10% urines
biotransformation : tetr butyl
anti-VIH
nelfinavir hydroxy nelfinavir (M8) 7.53  0.40
inhibiteur de 567.8 6.98  0.69 33 900 0.44
(J05AE04) excrétion sous forme inchangée : 9.58  0.10
protéase
22% fèces, 2% urines
absorption : une partie non
anti-VIH
ritonavir* absorbée 3.48  0.50
inhibiteur de 720.9 5.28  0.89 17 700 3.7
(J05AE03) biotransformation : 4 métabolites 11.47  0.46
protéase
excrétion : 86% fèces
anti-VIH biotransformation : dérivés
saquinavir 7.61  0.40
inhibiteur de mono-, dihydroxylés 670.8 4.44  0.85 1 230 6.4
(J05AE01) 11.05  0.46
protéase excrétion : 88% fèces, 1% urines
biotransformation : N-déméthyl-
inhibiteur de la
sildénafil sildénafil 6.03  0.42
phosphodiestérase 474.6 2.28  0.74 375 7.1
(G04BE03) excrétion sous forme métabolite : 10.05  0.20
de type 5
80% fèces, 13% urines
1
: Log Kow à 25°C, Koc à 25°C et pH 7, solubilité à 25°C et pH 7
369
370
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons (prélèvement et conditionnement)
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons

environnementaux contenant des molécules pharmaceutiques
Annexe - tableau 11 : Différentes conditions de prélèvement et de conservation d’échantillons
environnementaux relevées dans la littérature scientifique.
prélèvement conditionnement
références classe / famille matrice type de
bibliographiques molécules quantité matériel conservation centrifugation filtration autre
prélèvement
Andreozzi et al., analgésiques,
ponctuel ou
2003 hypolipémiants, sortie
moyen non
AINS, STEP
24h/débit
antiépileptique
Andreozzi et al., -bloquants, sortie
ponctuel ou
2003 antibiotiques moyen non
STEP
24h/débit
Avisar et al., 2009 antibiotique eau bouteille verre
2,5 l ponctuel 4°C 0,45 µm
souterraine ambré
Barnes et al., antibiotiques bouteille verre
2008 (Meyer et (macrolides et eau ambré,
composé 4°C 0,7 µm
al., 2007 USGS) sulfonamides) souterraine préalablement
nettoyée
Barnes et al., antibiotiques bouteille verre
2008 (Meyer et (quinolones et eau ambré,
al., 2007 USGS) tétracyclines) souterraine préalablement
nettoyée
Barnes et al., AINS, histamine
2008 (Cahill et antagoniste des bouteille verre
al., 2004) récepteurs H2, eau ambré,
antidépresseurs, souterraine préalablement
analgésiques, nettoyée
hypolipémiants
Bendz et al., 2005 hypolipémiants, automatique, container
entrée
antibiotiques, AINS, 7l moyen plastique oui 1,2 µm
STEP
-bloquants 24h/débit (polypropylène)
Bendz et al., 2005 hypolipémiants,
eau
antibiotiques, AINS, ponctuel oui 1,2 µm
surface
-bloquants
Catastini et al., anticancéreux
hopital 4°C + acide 0,7 µm
2009 (5-fluorouracile)
2009 (cyclophosphamide et hopital 4°C 0,7 µm
ifosfamide)
1,2 puis
2009 (méthotréxate et hopital 4°C
0,45 µm
étoposide)
Cha et al., 2006 antibiotiques entrée moyen
4°C (12h) oui 0,4 µm
(-lactames) STEP 24h/débit
Cha et al., 2006 antibiotiques sortie moyen
4°C (12h) 0,4 µm
(-lactames) STEP 24h/débit
Cha et al., 2006 eau
ponctuel 4°C (12h) 0,4 µm
surface
Chang et al., 2010 antibiotiques
bouteille verre 4°C (12h),
(Meyer et al., hopital 4-6l
ambré Na2EDTA
2007 USGS)
Coestier et al., analgésiques, AINS,
2009 hypolipémiants,
antiépileptique, sortie moyen
4°C 0,7 µm
antibiotiques, STEP 24h/débit
-bloquants,
anticancéreux
EPA, 2007 antibiotiques,
analgésiques,
antidépresseurs,
thiosulfate de
antiépileptique, ponctuel ou bouteille verre oui si
eau 2l sodium, noir,
-bloquants, AINS, moyen ambré besoin
congélation
hypolipémiants,
histamine antagoniste
des récepteurs H2
Fernandez et al., antibiotiques,
2009 analgésiques,
eau moyenne 2 x bouteille verre
antidépresseurs, 2l oui
surface 1l ambré
antiépileptique,
-bloquants
Furlong et al., antibiotiques,
2008 (US GS) analgésique,
antihypertenseur, eau container acier 4°C 0,7 µm
antiépileptique,
bronchodilatateur
371
prélèvement
Gabet-Giraud et -bloquants entrée moyen
bouteille verre 4°C oui
al., 2010 STEP 24h/débit
Gagné et al., 2006 antibiotiques,
analgésiques, AINS,
sortie
antiépileptique, 60 l plastique 4°C, noir
STEP
anticancéreux,
hypolipémiants
Garcia-Ac et al., antibiotiques,
2009 antiépileptique, eau 0,7 µm
bouteille verre 4°C, noir
anticancéreux, potable 0,45 µm
antihypertenseur
Golet et al., 2001 antibiotiques sortie bouteille verre 4°C, noir,
moyen 24h 0,45 µm
(fluoroquinolones) STEP ambré acide
Golet et al., 2002 antibiotiques sécher
b (fluoroquinolones) boue 60°C,
pot ambré T° ambiante
STEP tamisé 0,5
mm
Golet et al., 2002 antibiotiques sécher
b (fluoroquinolones) T° ambiante, 40°C,
sol acier
noir tamisé 0,2
mm
Gomez et al., antibiotiques,
2006 analgésiques, AINS,
antiépileptique,
bouteille verre
antidépresseurs, hopital recomposé 4°C 0,7 µm
ambré
-bloquants,
des récepteurs H2
Gomez et al., antibiotiques,
2006 analgésiques, AINS,
antiépileptique,
bouteille verre
antidépresseurs, hopital recomposé 4°C 0,7 µm
ambré
-bloquants,
des récepteurs H2
Gros et al., 2006 antibiotiques,
analgésiques, AINS, entrée
antiépileptique, STEP
antidépresseurs, sortie bouteille verre 1 µm
-bloquants, STEP ambré 0,45 µm
histamine antagoniste eau
des récepteurs H2, souterraine
hypolipémiants
Hamscher et al., déchet sécher
4°C, noir
2002 élevage 100°C
Hamscher et al., eau
PTFE
2002 souterraine
Hirsch et al., 1998 antibiotiques sortie bouteille verre
ponctuel 4°C 0,45 µm
STEP ambré
Hu et al., 2010 antibiotiques déchet
élevage
Jacobsen et al., antibiotiques sécher,
2004 sol tamisé 2
mm
Jelic et al., 2009
antibiotiques,
analgésiques,
antiépileptique,
-bloquants,
hypolipémiants,
boue lyophilisé
-agoniste, histamine - 20 °C
STEP (-40°C)
antagoniste des
récepteurs H2,
antidépresseurs,
diurétiques,
antihypertenseurs
Kasprzyk-Hordern antibiotiques,
et al., 2007 analgésiques,
antiépileptique,
-bloquants,
eau bouteille verre acide (HCl),
hypolipémiants, 1l 0,7 µm
surface silanisée 4°C
-agoniste, histamine
antagoniste des
récepteurs H2,
antidépresseurs
372
prélèvement
Kolpin et al., antibiotiques,
2002 analgésiques,
antiacides,
antihypertenseurs, eau bouteille verre
recomposé 0,7 µm
bronchodilatateurs, surface ambré
antidiabétiques,
hypolipémiants,
antidépresseurs
Lindberg et al., antibiotiques
hopital 1l ponctuel bouteille verre - 18 °C 0,45 µm
2004
Lindberg et al., antibiotiques boue recomposé
0,5 kg - 18 °C, noir
2005 STEP ou ponctuel
Mahnik et al., anticancéreux
hopital - 20 °C oui 0,22 µm
2007 (anthracyclines)
Martinez-Carballo antibiotiques lyophilisé,
et al., 2007 sol 4°C, noir tamisé 2
mm
Mullot, 2009 anticancéreux (5- 0,35 - 8 moyen 24h /
hopital flacons verre 24h 1 µm
fluorouracile) l débit
Mullot, 2009 anticancéreux
0,35 - 8 moyen 24h /
(cyclophosphamide et hopital flacons verre 24h 1 µm
l débit
ifosfamide)
Mullot, 2009 antibiotique moyen 24h /
hopital 24h 1 µm
(ciprofloxacine) débit
Mullot, 2009 -bloquant (aténolol),
moyen 24h /
antibiotique hopital 24h 1 µm
débit
(sulfaméthoxazole) 
Mullot, 2009 agent de contraste moyen 24h /
hopital 24h 1 µm
(ioméprol, iobitridol) débit
Mullot, 2009 AINS (kétoprofène) moyen 24h /
hopital 24h 1 µm
débit
Nieto et al., 2010a inhibiteurs PDE 5 entrée ponctuel ou - 25 °C,
STEP moyen 24h acide
Nieto et al., 2010a inhibiteurs PDE 5 lyophilisé,
boue
ponctuel T° ambiante tamisé 125
STEP
µm
Pierini et al., 2004 déchet
10 l polypropylène
élevage
Piram et al., 2008 -bloquants entrée
moyen 24h 4°C 0,45 µm
STEP
Prasse et al., 2010 antiviraux entrée
STEP
sortie ponctuel ou bouteille verre 4°C, noir,
< 1 µm
STEP moyen 24h ambré acide
eau
surface
Tamtam et al., antibiotiques eau bouteille verre
ponctuel congelé 0,47 µm
2008 surface ambrée
Thomas et al., antibiotiques,
hopital 2,5 l moyen 24h 4°C 0,45 µm
2007 anticancreux
Thomas et al., antibiotiques, boue
500 mL ponctuel -20°C
2007 anticancreux STEP
Tong et al., 2009 antibiotiques déchet bouteille verre formaldéhyde, 1 mm
4l ponctuel
élevage ambré 4°C, EDTA 0,45 µm
Togola et analgésiques, AINS,
Budzinski, 2007a antiépileptique,
bouteille verre
antidépresseurs, 2l 0,7 µm
ambré
hypolipémiants,
bronchodilatateurs
Vieno et al., 2006 antibiotiques entrée
(fluoroquinolones), STEP
-bloquants, sortie
1l ponctuel -18°C 0,45 µm
antiépileptique STEP
eau
surface
Watkinson et al., antibiotiques 6 x 200 bouteille verre
hopital recomposé 0,22 µm
2009 mL ambré
Watkinson et al., antibiotiques entrée
2009 STEP
sortie 3 x 200 bouteille verre
recomposé 0,22 µm
STEP mL ambré
eau
surface
Yang et al., 2010 antibiotiques lyophilisé,
sédiment bouteille verre 4°C tamisé 0,5
mm
Ye et al., 2007 antibiotiques 4°C, noir,
eau bouteille verre
ponctuel acide 0,45 µm
potable ambré
ascorbique
373
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons (extraction)
Annexe - tableau 12 : Différentes conditions et techniques d’extraction appliquées à l’analyse des

molécules pharmaceutiques dans diverses sortes d’échantillons environnementaux.
références volume
classe / famille molécules matrice technique cartouche solvant
bibliographiques (mL)
Andreozzi et al., analgésiques, hypolipémiants,
sortie STEP SPE Isolute RP-C18 500 - 1000 MeOH/DCM + diéthylamine
2003 AINS, antiépileptique
Andreozzi et al., -bloquants, antibiotiques Isolute
sortie STEP SPE 800 - 1000 MeOH + diéthylamine
2003 C2/ENV+
Avisar et al., 2009 antibiotique Chromabond
eau souterraine SPE 500 DCM/MeOH
HR-P
Barnes et al., 2008 antibiotiques
Oasis HLB +
(Meyer et al., 2007 (macrolides et sulfonamides) eau souterraine SPE MeOH et MeOH + NH4OH
Oasis MCX
USGS)
Barnes et al., 2008 AINS, histamine antagoniste des
MeOH et MeOH + acide
(Cahill et al., 2004) récepteurs H2, antidépresseurs, eau souterraine SPE Oasis HLB
trifluoroacétique
analgésiques, hypolipémiants
Bendz et al., 2005 AINS, hypolipémiants SPE C18 500 - 1000 acétone
Bendz et al., 2005 antibiotiques, -bloquants Isolute MeOH + triéthylamine et
SPE 800 - 1000
C2/ENV+ MeOH + ac. formic
Cha et al., 2006 antibiotiques (-lactames) entrée STEP,
sortie STEP, SPE Oasis HLB 200 MeOH
eau surface
Oasis HLB +
(Meyer et al., 2007 hopital SPE 123 MeOH et MeOH + NH4OH
Oasis MCX
USGS)
Coestier et al., 2009 analgésiques, hypolipémiants,
éthyle acétate et éthyle
AINS, antiépileptique,
sortie STEP SPE StrataX 500 acétate/acétone et éthyle
antibiotiques, -bloquants,
acétate/acétone + NH4OH
anticancéreux
EPA, 2007 antibiotiques, analgésiques,
antidépresseurs, antiépileptique, eau SPE Oasis HLB 500 - 1000 MeOH
AINS, hypolipémiants
EPA, 2007 histamine antagoniste des
eau SPE Oasis HLB 500 - 1000 MeOH et MeOH + HCOOH
récepteurs H2
Fernandez et al., antibiotiques, analgésiques,
2009 antidépresseurs, antiépileptique, eau surface SPE Oasis HLB 500 MeOH
-bloquants
Furlong et al., 2008 antibiotiques, analgésique,
MeOH et MeOH + acide
(US GS) antihypertenseur, antiépileptique, eau SPE Oasis HLB 1000
trifluoroacétique
bronchodilatateur
Gabet-Giraud et al., -bloquants entrée STEP SPE Oasis MCX 100 MeOH + NH4OH
2010
Golet et al., 2001 antibiotiques (fluoroquinolones) MeOH/ammonium/ac.
sortie STEP SPE MPC 150
phosphoric
Golet et al., 2002 b antibiotiques (fluoroquinolones) ASE : eau/ac. phosphoric +
ACN
boue STEP ASE, SPE MPC 200 mg
SPE : MeOH/ammonium/ac.
phosphoric
Gomez et al., 2006 antibiotiques, analgésiques, AINS,
antiépileptique, antidépresseurs,
hopital SPE Oasis HLB 100 MeOH
-bloquants, histamine
antagoniste des récepteurs H2
Gros et al., 2006 antibiotiques, analgésiques, AINS,
antiépileptique, antidépresseurs, entrée STEP, 100,
-bloquants, histamine sortie STEP, SPE Oasis HLB 200, MeOH
antagoniste des récepteurs H2, eau souterraine 500
hypolipémiants
Hamscher et al., 2002 vortex et
déchet élevage 1g tampon citrate/acétate d'éthyle
centrifugation
Hamscher et al., 2002 eau souterraine SPE Baker SDB 1 25 - 50 MeOH + acide
Hirsch et al., 1998 antibiotiques (tétracyclines) sortie STEP lyophilisation 100 tampon phosphate (KH2PO4)
Hirsch et al., 1998 antibiotiques (pénicillines, Lichrolut EN +
sortie STEP SPE 1000 MeOH
macrolides et sulfonamides) Lichrolut C18
Hu et al., 2010 antibiotiques MAE : EDTA-McIlaine
déchet élevage MAE, SPE Oasis HLB 0,5 g
SPE : MeOH
Jacobsen et al., 2004 antibiotiques SAX + Oasis ASE : MeOH/ac. Citric
sol ASE, SPE 10 g
HLB SPE : MeOH
Jelic et al., 2009 antibiotiques, analgésiques,
antiépileptique, -bloquants,
hypolipémiants, -agoniste, ASE : eau/MeOH
boue STEP ASE, SPE Oasis HLB 1g
histamine antagoniste des SPE : MeOH
récepteurs H2, antidépresseurs,
diurétiques, antihypertenseurs
Kasprzyk-Hordern et antibiotiques, analgésiques,
al., 2007 antiépileptique, -bloquants,
hypolipémiants, -agoniste, eau surface SPE Oasis MCX 1000 MeOH et MeOH + NH4OH
histamine antagoniste des
récepteurs H2, antidépresseurs
Kolpin et al., 2002 antibiotiques Oasis HLB et
eau surface SPE 500 MeOH et MeOH + NH4OH
Oasis MCX
374
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons (extraction)
références volume
classe / famille molécules matrice technique cartouche solvant
bibliographiques (mL)
Kolpin et al., 2002 antibiotiques eau surface SPE Oasis HLB MeOH
Kolpin et al., 2002 analgésiques, antiacides,
antihypertenseurs,
ACN et ACN + ac.
bronchodilatateurs, eau surface SPE Oasis HLB 1000
trichloroacétic
antidiabétiques, hypolipémiants,
antidépresseurs
Kolpin et al., 2002 analgésiques eau surface LLE 1000 DCM
Lindberg et al., 2004 antibiotiques hopital SPE C2/ENV+ 500 MeOH/triéthylamine
Lindberg et al., 2005 antibiotiques tampon phosphate et
boue STEP ultra-sons 2g
eau/MeOH + triéthylamine
Mahnik et al., 2007 anticancéreux (anthracyclines) hopital SPE C8 MeOH/trichlorométhane
Martinez-Carballo et antibiotiques (fluoroquinolones, US : MeOH/EDTA-
ultra-sons,
al., 2007 tétracyclines et sulfonamides) sol Isolute C18 3g MacllvaineSPE : eau et MeOH
SPE
+ ac. Oxalic
Mullot, 2009 anticancéreux (5-fluorouracile) SPE
hopital Isolute ENV+ 100 MeOH
automatique
Mullot, 2009 anticancéreux SPE
hopital Lichrolut EN 100 MeOH et acétate d'éthyle
(cyclophosphamide et ifosfamide) automatique
Mullot, 2009 antibiotique (ciprofloxacine) SPE
hopital Lichrolut EN 100 MeOH/ACN/ac. formic
automatique
Mullot, 2009 -bloquant (aténolol), SPE
hopital Oasis HLB 50 MeOH
antibiotique (sulfaméthoxazole)  automatique
Mullot, 2009 agent de contraste SPE
hopital Oasis HLB 10 MeOH
(ioméprol, iobitridol) automatique
Mullot, 2009 AINS (kétoprofène) SPE
hopital Isolute ENV+ 100 MeOH et acétate d'éthyle
automatique
Nieto et al., 2010a inhibiteurs PDE 5 entrée STEP SPE Oasis HLB 100 acétone/acétate d'éthyl
Nieto et al., 2010a inhibiteurs PDE 5 boue STEP ASE 1g MeOH
Pierini et al., 2004 déchet élevage LLE 20 DCM
Piram et al., 2008 -bloquants entrée STEP SPE Oasis MCX 400 MeOH/ammonium
Prasse et al., 2010 antiviraux entrée STEP
sortie STEP SPE Isolute ENV+ 100 MeOH/acétone/ac. formic
eau surface
Sacher et al., 2001 analgésiques, hypolipémiants, SPE
eau souterraine C18 1000 acétone
AINS, antiépileptique automatique
Sacher et al., 2001 -bloquants, anticancéreux, SPE PPL Bond-
eau souterraine 1000 MeOH
-agoniste automatique Elut
Sacher et al., 2001 agent de contraste SPE
eau souterraine LiChrolut EN 1000 MeOH et ACN
automatique
Sacher et al., 2001 antibiotiques SPE ACN et ANC/eau +
eau souterraine Isolut ENV+ 500
automatique triéthylamine
Tamtam et al., 2008 antibiotiques eau surface SPE Oasis HLB 100 MeOH
Thomas et al., 2007 antibiotiques, anticancreux hopital SPE Oasis HLB MeOH/éthyle acétate
Thomas et al., 2007 antibiotiques, anticancreux ultra-sons,
boue STEP 5g MeOH
LLE
Tong et al., 2009 antibiotiques MeOH/methyl tertiary-butyl
déchet élevage SPE Oasis HLB 50
ether
Togola et Budzinski, analgésiques, antiépileptique, éthyle acétate et éthyle
sorties STEP
2007a antidépresseurs, hypolipémiants, SPE Oasis MCX 500 acétate/acétone et éthyle
eau surface
AINS, bronchodilatateurs acétate/acétone + NH4OH
Vieno et al., 2006 antibiotiques (fluoroquinolones), entrée STEP 100
-bloquants, antiépileptique sortie STEP SPE Oasis HLB 250 MeOH
eau surface 500
Watkinson et al., antibiotiques hopital 100
2009 entrée STEP 100
SPE Oasis HLB MeOH
sortie STEP 200
eau surface 500
Yang et al., 2010 antibiotiques ultra-sons, US : ACN/ac. Citric
sédiment Oasis HLB 2g
SPE SPE : MeOH
Ye et al., 2007 antibiotiques eau potable SPE Oasis HLB 500 MeOH + ac. formic
375
Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d’échantillons (analyse)
Annexe - tableau 13 : Conditions et techniques d'analyse des molécules pharmaceutiques.

références phase
classe / famille molécules matrice technique solvant /gaz ionisation détection
bibliographiques colonne
Andreozzi et al., analgésiques, hypolipémiants,
sortie STEP GC/MS HP-5 hélium SIM
2003 AINS, antiépileptique
Andreozzi et al., -bloquants, antibiotiques Genesis RP- A : eau/ACN/ ac. formic
sortie STEP LC/MS/MS ESI + SRM
2003 C18 B : ACN/ ac. formic
Avisar et al., 2009 antibiotique eau A : eau/ac. formic
LC/MS/MS ACE-RP C18 ESI +
souterraine B : ACN/ ac. formic
Barnes et al., 2008 antibiotiques A : eau/acétate
eau Luna phenyl
(Meyer et al., 2007 (macrolides et sulfonamides) LC/MS ammonium/ACN ESI + SIM
souterraine hexyl
USGS) B : ACN
Barnes et al., 2008 antibiotiques A : eau/formate
Luna C8 ou
(Meyer et al., 2007 (quinolones et tétracyclines) eau d'ammonium/ac. formic/MeOH
LC/MS Xterra MS ESI + SIM
USGS) souterraine B : MeOH/formate
C18
d'ammonium/ac. Formic
Barnes et al., 2008 AINS, histamine antagoniste
A : eau/formate
(Cahill et al., 2004) des récepteurs H2, eau Metasil Basic
LC/MS d'ammonium/ac. formic ESI+ SIM
antidépresseurs, analgésiques, souterraine C18
B : ACN
hypolipémiants
Bendz et al., 2005 AINS, hypolipémiants impact
GC/MS ZB-5 hélium full scan
électronique
Bendz et al., 2005 antibiotiques, -bloquants LC/MS/MS
Genesis RP- A : eau/ACN/ ac. formic
ESI + SRM
C18 B : ACN/ ac. formic
2009 (5-fluorouracil, ifosfamide et hopital GC/MS/MS MRM
cyclophosphamide)
Catastini et al., anticancéreux ESI +
hopital LC/MS/MS SRM
2009 (méthotréxate et étoposide) APCI+
Cha et al., 2006 antibiotiques (-lactames) A : eau/ac. formic
Xterra MS
entrée STEP LC/MS/MS B : MeOH ESI+
C18
C : ACN
(Meyer et al., 2007 hopital LC/MS/MS Luna C18 ESI+ MRM
USGS)
Coestier et al., 2009 analgésiques, hypolipémiants,
AINS, antiépileptique, Ascentis RP- A : eau/ac. formic
sortie STEP LC/MS/MS ESI MRM
antibiotiques, -bloquants, C18 B : ACN
anticancéreux
EPA, 2007 antibiotiques, analgésiques, A : eau/formate
antidépresseurs, antiépileptique eau LC/MS/MS Xterra C18 d'ammonium/ac. formic ESI+ MRM
B : ACN/MeOH
EPA, 2007 antibiotiques (tétracyclines) A : eau/ac. oxalic
eau LC/MS/MS Xterra C18 ESI+ MRM
B : ACN/MeOH/ac. oxalic
EPA, 2007 AINS, hypolipémiants A : eau/acétate
eau LC/MS/MS Xterra C18 d'ammonium/ac. acétic ESI- MRM
B : ACN/MeOH
EPA, 2007 histamine antagoniste des A : eau/acétate
récepteurs H2 eau LC/MS/MS Atlantis hilic d'ammonium/ac. acétic ESI+ MRM
B : ACN
Fernandez et al., antibiotiques, analgésiques, A : eau/ac. formic/hydroxyde
Zorbax
2009 antidépresseurs,-bloquants, eau surface LC/MS/MS ammonium ESI+ MRM
Eclipse XDB
antiépileptique B : ACN
Fernandez et al., antibiotiques, analgésiques,
Zorbax SB- A : eau/ac. Acétic
2009 antidépresseurs, -bloquant,s eau surface LC/MS/MS ESI- MRM
C18 B : ACN
antiépileptique
Furlong et al., 2008 antibiotiques, analgésique,
A : eau/formate
(US GS) antihypertenseur,
eau LC/MS RP-ODS-3 d'ammonium/ac. formic ESI SIM
antiépileptique,
B : ACN
bronchodilatateur
Garcia-Ac et al., antibiotiques, antiépileptique, A : eau/ac. formic
synergi
2009 anticancéreux, antihypertenseur eau potable LC/MS/MS B : MeOH/ac. formic ESI+ SRM
fusion RP
C : ACN/ac. formic
Golet et al., 2001 antibiotiques (fluoroquinolones) Nucleosil A : eau/ac. trifluoroacétic
sortie STEP LC/MS/MS ESI+
RP-C18 B : ACN
Golet et al., 2002 b antibiotiques (fluoroquinolones) Discovery
A : eau/ac. phosphoric
boue STEP LC/fluorescence RP-amide-
B : ACN
C16
Gomez et al., 2006 antibiotiques, analgésiques,
Purospher A : eau/ac. formic
antidépresseurs-bloquants, hopital LC/MS/MS ESI+ MRM
star RP-C18 B : ACN
récepteurs H2
Gomez et al., 2006 antibiotiques, analgésiques,
Purospher A : eau
antidépresseurs, -bloquants, hopital LC/MS/MS ESI- MRM
star RP-C18 B : ACN
récepteurs H2
Gros et al., 2006 antibiotiques, analgésiques,
Purospher A : eau
antidépresseurs, -bloquants, entrée STEP LC/MS/MS ESI- MRM
star RP-C18 B : MeOH
récepteurs H2, hypolipémiants
376
références phase
Gros et al., 2006 antibiotiques, analgésiques,
AINS, antiépileptique, A : eau/acétate ammonium/ac.
Purospher
antidépresseurs, -bloquants, sortie STEP LC/MS/MS formic ESI+ MRM
star RP-C18
histamine antagoniste des B : ACN/MeOH
récepteurs H2, hypolipémiants
Gros et al., 2006 antibiotiques, analgésiques, A : eau (ESI-)
AINS, antiépileptique, A : eau/acétate ammonium/ac.
eau Purospher
antidépresseurs, -bloquants, LC/MS/MS formic (ESI+) ESI MRM
souterraine star RP-C18
histamine antagoniste des B : MeOH (ESI-)
récepteurs H2, hypolipémiants B : ACN/MeOH (ESI+)
Hamscher et al., antibiotiques déchet
A : eau/acétate ammonium/ac.
2002 élevage
LC/MS/MS Puresil C18 Formic ESI
eau
B : ACN
souterraine
Hirsch et al., 1998 antibiotiques (tétracyclines) Lichrospher A : eau/ac. oxalic
sortie STEP LC/MS ESI+
100 RP-8 B : ACN/ac. oxalic
Hirsch et al., 1998 antibiotiques (pénicillines) A : eau/acétate ammonium
Lichrospher
sortie STEP LC/MS B : eau/acétate ESI+
100 RP-18
ammonium/ACN
Hirsch et al., 1998 antibiotiques A : eau/acétate ammonium
Lichrospher
(macrolides et sulfonamides) sortie STEP LC/MS B : eau/acétate ESI+
RP-18
ammonium/ACN
Hu et al., 2010 antibiotiques déchet A : eau/ac. Formic
LC/MS/MS Zorbax C18 ESI
élevage B : ACN
Jacobsen et al., antibiotiques Xterra MS A: eau/ac. formic/MeOH
sol LC/MS/MS ESI MRM
2004 C18 B: MeOH/ac. formic/eau
Jelic et al., 2009 antibiotiques, analgésiques,
A : eau (ESI-)
antiépileptique, -bloquants,
A : eau/acétate ammonium/ac.
hypolipémiants, -agoniste, Purospher
boue STEP LC/MS/MS formic (ESI+) ESI MRM
histamine antagoniste des Star RP-18
B : MeOH (ESI-)
récepteurs H2, antidépresseurs, B : ACN/MeOH (ESI+)
diurétiques, antihypertenseurs
Kasprzyk-Hordern antibiotiques, analgésiques,
et al., 2007 antiépileptique, -bloquants,
Acquity BEH A : eau/MeOH/ac. acétique
hypolipémiants, -agoniste, eau surface LC/MS/MS ESI+ MRM
C18 B : MeOH/ac. Acétique
récepteurs H2, antidépresseurs
Kolpin et al., 2002 antibiotiques A : eau/MeOH/formate
eau surface LC/MS ESI+ SIM
d'ammonium/ac. formic
Kolpin et al., 2002 analgésiques, antiacides,
antihypertenseurs, A : eau/formate
metasil basic
bronchodilatateurs, eau surface LC/MS/MS d'ammonium/ac. Formic ESI+ SIM
RP-C8
antidiabétiques, hypolipémiants, B : ACN
antidépresseurs
Lindberg et al., antibiotiques hopital Hydrosphere A : eau/ac. formic
LC/MS/MS ESI +
2004 boue STEP C18 B : ACN/ac. formic
Mahnik et al., 2007 anticancéreux (anthracyclines) A: eau/K-di-
hopital LC/fluorescence Hypersil C18 hydrogenphosphate
B : ACN
Martinez-Carballo antibiotiques (fluoroquinolones) A : eau/ac. formic
sol LC/MS/MS Luna C8 ESI+ SIM
et al., 2007 B : ACN/ac. formic
Martinez-Carballo antibiotiques A : eau
sol LC/MS/MS Luna C8 ESI+ MRM
et al., 2007 (tétracyclines et sulfonamides) B : ACN
Mullot, 2009 anticancéreux
impact
(5-fluorouracile, ifosfamide et hopital GC/MS/MS VF-5ms Hélium MRM
électronique
cyclophosphamide)
Mullot, 2009 antibiotique (ciprofloxacine) A : eau/ac. formic
hopital LC/fluorescence XDB-C18
B : ACN
Mullot, 2009 -bloquant (aténolol), Nucléodur A : eau/ac. formic
hopital LC/MS/MS ESI+ MRM
antibiotique (sulfaméthoxazole)  C18 B : ACN/ac. formic
Mullot, 2009 agent de contraste A : eau
hopital LC/MS/MS ESI+ MRM
(ioméprol, iobitridol) B : ACN
Mullot, 2009 AINS (kétoprofène) impact
hopital GC/MS/MS VF-5ms Hélium MRM
électronique
Nieto et al., 2010a inhibiteurs PDE 5 entrée STEP
LC/MS/MS Halo C18 ESI+ MRM
boue STEP
Pierini et al., 2004 A : eau/ac.
déchet Spheri 5
LC/UV orthophosphoric/triéthylamine
élevage ODS
B : ACN
Piram et al., 2008 -bloquants Hibar A : eau/formate
entrée STEP LC/MS/MS Purospher d'ammonium/ac. formic ESI+ MRM
star B : ACN
Prasse et al., 2010 antiviraux entrée STEP
Synergi A : eau/formate d'ammonium
sortie STEP LC/MS/MS ESI+ MRM
hydro RP B : ACN
eau surface
Sacher et al., 2001 analgésiques, hypolipémiants, eau
GC/MS silice DB-35 Hélium full-scan
AINS, antiépileptique souterraine
Sacher et al., 2001 -bloquants, anticancéreux,
A : eau/acétate d'ammonium
-agoniste, antibiotiques eau nucleosil
LC/MS/MS B : ACN/MeOH/acétate ESI+ MRM
(imidazoles, sulfonamides, souterraine 120-3-C18
d'ammonium
macrolides)
377
références phase
Sacher et al., 2001 agent de contraste, A : eau/formiate d'ammonium
eau nucleosil
antibiotiques (pénicillines) LC/MS/MS B : ACN/MeOH/formiate ESI+ MRM
souterraine 120-3-C18
d'ammonium
Tamtam et al., 2008 antibiotiques A : eau/ac. formic
eau surface LC/MS/MS BEH C18 ESI+ MRM
B : ACN/ac. formic
Thomas et al., 2007 antibiotiques, anticancreux hopital A : eau/ac. formic
LC/MS/MS Atlantis dC18 ESI+
boue STEP B : ACN/ac. Formic
Tong et al., 2009 antibiotiques A : eau/ac. formic (ESI+)
déchet
LC/MS/MS Acclaim C18 A : eau (ESI-) ESI MRM
élevage
B : ACN
Togola et analgésiques, AINS,
Budzinski, 2007a antiépileptique, antidépresseurs, impact
2l GC/MS HP-5/MS hélium SIM
hypolipémiants, électronique
bronchodilatateurs
Vieno et al., 2006 antibiotiques entrée STEP
Zorbax A : eau/ac. acétic
(fluoroquinolones), sortie STEP LC/MS/MS ESI+ MRM
XDB-C18 B : ACN
-bloquants, antiépileptique eau surface
Watkinson et al., antibiotiques hopital
2009 entrée STEP synergi hydro A : eau/ac. formic
LC/MS/MS ESI+ MRM
sortie STEP RP B : MeOH
eau surface
Yang et al., 2010 antibiotiques Zorbax A : eau/ac. Oxalic
sédiment LC/MS/MS ESI+ MRM
XDB-C18 B : ACN
Ye et al., 2007 antibiotiques A : eau/ac. formic
eau potable LC/MS/MS Pursuit C18 ESI+
B : ACN
378
Annexe 7 : Résultats bruts d’analyse
Annexe 7 : Résultats bruts des différentes séries d’analyse, eau et lisier.
Annexe - tableau 14 : Données brutes, exprimées en ng/L, issues de l'analyse de 10 effluents de STEP
prélevées dans le cadre du projet AMPERES (quantification par étalonnage externe uniquement).
composés CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 - 1 CA 6 - 2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9
clarithromycine 21 88 135 791 857 992 200 228 531 42
érythromycine 17 105 82 182 23 34 89 103 87 17
roxithromycine 16 125 238 402 52 63 104 38
ciprofloxacine 542 196 266 122 279 178
ofloxacine 1 077 194 533 68 66 506 224 183 230
lincomycine 63
acide oxolinique 1 1
fluméquine 8 3 4 2 1
tétracycline 96 21
oxytétracycline 40
doxycycline 58 12 71
sulfaméthoxazole 18 2 16 12 32 50 84 2
triméthoprime 49 1 26 1 1 73 4 28 11
métoprolol 3 14 20 106 73 19 48 168
propranolol 21 5 76 11 8 72 80 62 20
ritonavir 6 134 29 64 25 43 54 18
zidovudine 22 16 15 24 142 38
379
Annexe - tableau 15 : Données brutes, exprimées en ng/L, issues de l'analyse de la phase dissoute des eaux
prélevées le long du continuum Hérault en été (d : détecté mais non quantifiable, quantification par
étalonnage externe uniquement).
STEP L STEP CL STEP P STEP B rivière L rivière H captage
clarithromycine 103 68 16 28 12 6 5 205 3 d 0,9
érythromycine 37 52 1 724 20
roxithromycine 11 38 25 10 63 5 3
ciprofloxacine 140 62 456 50 73 28
ofloxacine 41 149 178 101 109 97 8 5 5 5,08
fluméquine 9
tétracycline 6 2 4
doxycycline 6 5 11 3 13 3 7
sulfaméthoxazole 12 42 45 28 5 088 84 12 16
triméthoprime 3 35 20 22 574 161
metoprolol 29 50 19 20 23 78 20
propranolol 36 122 36 47 222 135 100 49
ritonavir 34 39 34 21 17 14
zidovudine 6
daunorubicine 9
prélevées le long du continuum Hérault en hiver (d : détecté mais non quantifiable, quantification par
étalonnage externe uniquement).
STEP L STEP CL STEP P STEP B rivière L rivière H captage

amoxicilline d d d d d d d
pénicilline V d d
oxacilline d d d
clarithromycine 596 840 214 481 15 125 11 204 12 5 1,1 3 d d
érythromycine 100 d 276 153 d 12 7 1,3 1,6 10 6 3
roxithromycine 15 59 122 133 25 188 3 46 d d
ciprofloxacine 336 199 746 62 1 002 127 544 51
ofloxacine 309 191 1 072 190 32 99 256 12 6 7 5 7
fluméquine d d d d d
tétracycline 11 2 4 5 d d 21 6
doxycycline d d 4 4 3 3 d
sulfaméthoxazole 20 55 212 72 3 78 d d d d d 2
triméthoprime 25 88 104 86 d 245 d d d d
metoprolol 210 197 206 182 325 655 15 461 d d
propranolol 60 113 48 124 103 179 71 142 1,2 d d d
ritonavir 96 87 115 95
zidovudine 8 42
380
prélevées le long du continuum hospitalier dans le cadre du projet FLASH (d : détecté mais non
quantifiable, < blc : quantité dans l’échantillon plus faible que celle du blanc de manipulation,
amoxicilline et ampicilline analysées avec le protocole multi-résidus).
sortie maison
sortie hopital entrée STEP sortie STEP rivière
de retraite
composés été hiver été hiver été hiver été hiver été hiver
PENICILLINES amoxicilline 844 90
ampicilline 679 5
cloxacilline 15
CEPHALOSPORINES cefotaxime 159 740 399 41
cefuraoxime 225
MACROLIDES azithromycine 360 101 21 32 887 254 793 254 16
clarithromycine 691 4 789 670 74 100 6 3
érythromycine 338 338 152 54 21 2
josamycine 616 70 1
roxithromycine 44 660 2 856 88 31 1 921 1 342 546 1 098 24 2
spiramycine 1 202 3 868 27 21 864 982 219 173 65 12
tylosine 3 6
LINCOSAMIDES lincomycine 10 1 < blc 1 0,2
clindamycine 30 25 33 22 26 18 9
FULOROQUINOLONES ciprofloxacine 45 73 291 32 37
& QUINOLONES norfloxaine 111 543 42 85 57 42 13
ofloxacine 776 68 254 603 83 227 426 199 130 11 1
acide pipémidique 43 58 572 45 16 33
fluméquine 2 2 0,5
TETRACYCLINES tétracycline 111 80 14 10
doxycycline 1 014 68 d
SULFONAMIDES sulfadiazine 7 13 9 17 11
sulfadiméthoxine 0,4 d
sulfaméthizole 2 8
sulfaméthoxazole 14 5 353 614 159 500 18 4
sulfapyridine 6 0,4 45 9 62 1 1
triméthoprime 5 1 104 263 30 146 2 0,4
AUTRES Ab bacitracine 1 332 1 343
métronidazole 257 32 216 3 36 80 245 10 53 0,6 4
rifampicine 89 54 35
-BLOQUANTS atenolol 102 1 094 6 130 1 458 8 553 3 482 1 017 1 205 32 10
bisoprolol 49 91 1 328 669 265 315 82 89 14 2
metoprolol 12 131 26 304 78 129 8 0,8
propranolol 407 27 213 1 382 636 1 009 555 722 57 4
sotalol 135 285 1 149 1 757 2 222 2 002 1 987 1 747 127 20
timolol 18 27 15 7 4 17 11 2 d
ANTICANCEREUX méthotréxate 22
tamoxifen 9 4 4 2 d
ANTI-VIH abacavir 377 23 13
lamivudine 1 283 26
nelfinavir 42 14
nevirapine 3 1
ritonavir 55 125 83 38 32 d
saquinavir 353 150 128 15
stavudine 28
zidovudine 10 d 140
INHIBITEUR PDE 5 sildenafil 45 31 27 5 1 d
381
Annexe - tableau 17 suite : Données brutes (ng/L) continuum hospitalier projet FLASH.
sortie maison sortie
sortie hopital entrée STEP rivière
de retraite STEP
ANALGESIQUES ibuprofene 5271 1879 404 6116 3162 122 12
ET AINS paracetamol 2689110 230826 263970 384119 190859 145439 732 74 2731 166
ketoprofene 6651 64980 277 2698 338 355 21
naproxène 29047 3339 1182 81 28 6 8
aspirine 9461 25649 2469465 9751 86098 41778 33 55 40 9
diclofenac 94 1146 65 58 1090 671 825 737 76 13
ANTIEPILEPTIQUES ET carbamazepine 16 18 12616 1246 874 175 1037 563 83 19
ANTIDEPRESSEURS diazepam 1 1 38 38 5 2 3 28 3
nordiazepam 76 125 70 281 188 19 70 84 5 2
Amitriptyline 7 101 60 81 76 5
imipramine 11 1 2
Alprazolam 6 3 6 5 0,3
Bromazépam 38 6 56 11 11 1
Fluoxétine 69 67 351 185 9 26 15 18 1
BRONCHODILATATEURS clenbuterol 0,4
salbutamol 31 142 3062 69 28 17 12 124 1 26
terbutaline 1 21 26 16 20 8 10 48 1 12
HYPOLIPEMIANTS gemfibrozil 139 119 16 27 2,1 1
STIMULANTS cafeine 3487 3708 3175 4052 3096 3705 384 131 123 174
Théophylline 30261 8900 2385 4074 10091 3857 97 19 28 23
382
prélevées le long du continuum agricole dans le cadre du projet FLASH (d : détecté mais non quantifiable,
< blc : quantité dans l’échantillon plus faible que celle du blanc de manipulation, ampicilline analysées
avec le protocole multi-résidus).
site 1 site 2 site 3 site 4 site 5

PENICILLINES ampicilline 3 5
MACROLIDES azithromycine 4 16
clarithromycine 0,4 d 0,6 0,2 3 0,4 2 4 6 3
érythromycine 1 3 d 1 1,5 1 1,2 2 21 2
josamycine d d 1 d d d
roxithromycine 7 d 0,4 0,7 4 24 2
spiramycine 23 4 12
tylosine d
LINCOSAMIDES lincomycine 0,6 < blc 0,7 < blc 0,9 1 < blc 0,2
clindamycine < blc < blc 0,3 < blc d < blc 9
FULOROQUINOLONES enrofloxacine 3 3
& QUINOLONES norfloxaine 13
ofloxacine d 2 2 1 0,5 2 11 1
fluméquine d d 0,3 0,3 2 0,5
TETRACYCLINES tétracycline 1
oxytétracycline 20 17
chlortétracycline d
doxycycline d d
SULFONAMIDES sulfadiazine < blc 0,5 < blc 0,3 < blc 0,9 < blc 11
sulfadiméthoxine 0,1 0,1
sulfaméthoxazole 9 3 3 18 4
sulfapyridine 1,2 1 0,5 1 1 1
triméthoprime 1,5 3 4 0,3 2 0,4
AUTRES Ab métronidazole 0,8 1 0,7 0,6 4 0,6 3,9
rifampicine 35
-BLOQUANTS atenolol 5 6 5 12 32 10
bisoprolol 0,2 0,1 0,1 0,2 0,3 0,7 2 14 2
metoprolol 0,4 0,9 0,4 0,6 8 0,8
propranolol 4 2 2 5 57 4
sotalol 1,1 3 13 18 127 20
timolol d 2 d
ANTICANCEREUX daunorubicine 8
tamoxifen d
ANTI-VIH abacavir 1,6
ritonavir d d d d d
saquinavir d 15
stavudine 28
INHIBITEUR PDE 5 sildenafil 3 d d
383
Annexe - tableau 18 suite : Données brutes (ng/L) continuum agricole projet FLASH.
site 1 site 2 site 3 site 4 site 5
ANALGESIQUES ibuprofene 12
ET AINS paracetamol 3 16 39 95 79 452 2731 166
ketoprofene 21
naproxène 3 0,5 0,4 189 1 22 6 8
aspirine 108 27 97 23 71 27 14 40 9
diclofenac 6 0,4 6 3 13 76 13
ANTIEPILEPTIQUES ET carbamazepine 1 2 7 7 11 83 19
ANTIDEPRESSEURS diazepam 3
nordiazepam 5 2
Amitriptyline 5
imipramine
Alprazolam 0,3
Bromazépam 1
Fluoxétine 1
BRONCHODILATATEURS salbutamol 0,3 0,3 3 1 26
terbutaline 3 2 1 1 12
HYPOLIPEMIANTS gemfibrozil 0,2 1 2,1 1
STIMULANTS cafeine 77 22 85 78 199 117 231 123 174
Théophylline 2 8 5 16 8 35 53 28 23
384
Annexe - tableau 19 : Données brutes « Origine de la contamination du lisier », niveau de contamination

du lisier brut (LB) en fonction du stade physiologique des cochons (ENG : engraissement, MATER :
maternité, PS : post-sevrage) (LS : lisier stocké).
liquide (ng/L) élevage 1 élevage 2 élevage 3
LB LB LB LB LB LB
composés LB PS LS LB PS LS LB PS LS
ENG MATER ENG MATER ENG MATER
tylosine 107 7 15 232 78 0 302 30 18 363 2 462 58
lincomycine 185 2 226 2 923 1 125 1 646 115 368 448 206 161 158 627 604 163 006
marbofloxacine 0 44 0 0 98 567 915 300 0 93 567 0 131
tétracycline 152 2 336 266 340 39 5 742 480 1 033 962 1 035 633
oxytétracycline 76 902 2 858 3 317 37 406 24 650 8 362 221 682 92 909 35 222 319 589 248 460 124 964
sulfadiazine 6 286 674 11 469 2 030 23 094 333 17 852 7 388 372 488 38 725 3 632 128 7 703
monensine 240 26 8 17 280 496 2 593 341 655 190 205 1 782
somme 83 872 5 839 18 067 41 076 50 187 9 913 249 453 101 894 409 622 614 554 4 511 894 298 275
solide (ng/g) élevage 1 élevage 2 élevage 3

LB LB LB LB LB LB
composés LB PS LS LB PS LS LB PS LS
tylosine 40 2 29 77 0 67 2 56 10 0 544 112
lincomycine 11 643 491 3 893 63 9 14 83 3 3 957 15 829 5 494
marbofloxacine 20 73 0 135 27 323 5 383 1 026 62 16 764 19 162
tétracycline 483 100 1 434 404 85 6 319 33 1 138 382 738 4 549 1 322
oxytétracycline 9 788 2 337 2 199 14 108 838 22 746 1 316 40 370 2 833 29 178 51 083 43 062
sulfadiazine 142 123 1 942 2 015 325 300 27 770 2 251 1 103 50 591 1 231
monensine 0 1 0 0,5 0 21 1 0,0 12 0 1 20,3
somme 10 484 3 278 6 095 20 632 1 337 29 786 6 777 43 443 5 553 51 740 122 617 51 403

total (ng/L)
liquid + solide LB LB LB LB LB LB
LB PS LS LB PS LS LB PS LS
tylosine 1 366 18 947 2 092 74 1 742 439 984 763 346 17 748 1 980
lincomycine 513 5 843 18 427 95 193 4 723 336 1 445 1 855 383 344 492 1 056 447 254 388
marbofloxacine 640 456 0 3 260 1 434 8 926 420 259 17 729 4 781 898 767 542 2 900
tétracycline 15 276 565 45 842 10 017 4 566 163 964 7 893 19 820 30 436 36 559 129 338 23 276
oxytétracycline 381 346 16 020 73 027 377 496 65 478 598 187 306 982 777 617 251 009 1 713 439 1 682 497 860 977
sulfadiazine 10 543 1 362 72 752 50 681 38 226 8 114 18 544 20 349 517 379 90 141 4 956 842 28 669
monensine 237 32 9 29 266 1 035 2 501 335 1 524 181 214 2 100
somme 409 920 24 296 211 004 538 768 114 766 782 303 758 063 838 688 806 274 3 083 925 7 843 628 1 174 290
385
Annexe - tableau 20 : Données brutes, suvi sur 5 mois du niveau de contamination du lisier dans la fosse
de stockage (filière simple de traitement du lisier).
liquide (ng/L) élevage 1 élevage 2 élevage 3
composés 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09
oxytétracycline 151 866 123 000 92 894 70 334 66 365 155 010 113 725 152 792 92 909 68 925 186 520 68 018 35 969 53 936 83 439
sulfadiazine 16 840 4 421 1 588 12 809 23 474 6 762 21 442 9 496 7 388 8 463 21 378 36 412 6 113 13 300 12 428
lincomycine 1 582 6 643 4 482 7 237 10 136 986 732 875 448 454 67 514 60 771 44 433 66 039 105 939
tylosine 557 257 139 107 35 64 69 57 30 16 25 85 40 49 60
tétracycline 415 709 519 473 425 1 043 600 610 480 319 1 074 285 219 279 385
marbofloxacine 51 32 33 0 22 200 387 581 300 245 600 137 39 33 55
monensine 32 15 15 23 22 366 346 400 341 317 555 395 382 409 409
somme 171 344 135 077 99 669 90 984 100 479 164 431 137 302 164 810 101 894 78 739 277 666 166 102 87 194 134 044 202 717
solide (ng/g) élevage 1 élevage 2 élevage 3

composé 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09
sulfadiazine 1 475 973 387 637 1 691 209 631 211 770 571 651 2 709 1 101 2 100 95
lincomycine 195 558 426 340 758 69 63 122 83 82 870 2 839 1 600 4 462 68
tylosine 331 84 146 32 18 131 117 116 56 55 20 48 48 100 162
tétracycline 1 697 974 725 1 383 812 1 368 680 1 622 1 138 948 446 598 727 552 139
marbofloxacine 82 56 35 43 45 279 687 787 1 026 478 167 244 297 196 14
monensine 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
somme 7 718 17 674 18 627 31 024 21 508 38 297 22 881 49 267 43 443 25 654 17 902 24 211 34 055 29 659 4 308
total (ng/L) élevage 1 élevage 2 élevage 3

composé 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09
sulfadiazine 52 072 27 828 10 900 27 907 63 789 10 193 31 798 12 919 20 349 18 022 32 164 82 219 24 883 49 069 13 836
lincomycine 6 262 19 964 14 660 15 276 28 214 2 145 1 794 2 937 1 855 1 838 81 277 108 402 71 104 141 385 105 295
tylosine 8 546 2 272 3 676 889 465 2 296 2 053 2 036 984 947 370 910 863 1 755 2 840
tétracycline 41 423 24 235 18 022 33 897 20 033 24 281 12 151 28 178 19 820 16 434 8 695 10 524 12 676 9 744 2 759
marbofloxacine 2 043 1 374 872 1 040 1 099 4 935 12 062 13 942 17 729 8 375 3 447 4 319 5 121 3 389 294
monensine 33 15 15 22 22 359 340 393 335 311 554 395 385 416 409
somme 353 751 558 984 547 480 838 625 617 898 812 688 523 940 999 543 838 688 513 511 579 771 578 264 669 461 640 146 273 089
386
Annexe - tableau 21 : Données brutes, évolution de la contamination le long de la filière de traitement du

lisier élevage 4.
bassin de reflux de
lisier stocké bassin d'aération lagune
décantation séparation
liquide (ng/L) 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09
tylosine 31 28 26 20 5 10 2 0
lincomycine 894 306 84 34 13 38 0 126
marbofloxacine 125 569 40 114 15 73 24 31
tétracycline 0 0 47 23 0 32 0 45
oxytétracycline 2 910 1 534 3 379 1 585 784 882 244 1 625
sulfadiazine 17 777 11 165 1 069 1 131 1 225 2 594 211 1 397
monensine 97 114 22 51 56 36 10 33
somme 21 835 13 716 4 668 2 959 2 098 3 666 490 3 257 0 0
bassin de reflux de
solide (ng/g) 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09
tylosine 21 7 15 16 13 22 5 0 14 2
lincomycine 74 25 24 19 20 21 7 11 17 8
marbofloxacine 33 221 25 71 34 56 22 9 49 394
tétracycline 24 16 36 10 5 19 0 14 42 26
oxytétracycline 248 241 547 105 178 171 96 143 451 765
sulfadiazine 212 271 73 140 74 128 69 112 52 52
monensine 1 1 3 5 2 4 0 0 0 1
somme 613 783 724 366 326 421 199 289 625 1 249
bassin de reflux de
total (ng/L) 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09
tylosine 833 305 257 275 156 271 31 0 4 508 759
lincomycine 3 663 1 248 458 331 258 294 35 184 5 561 2 734
marbofloxacine 1 387 8 959 430 1 208 427 743 140 77 16 437 131 479
tétracycline 921 601 608 174 55 264 0 122 13 859 8 814
oxytétracycline 12 223 10 648 11 828 3 193 2 912 2 928 754 2 377 150 378 255 118
sulfadiazine 25 149 21 036 2 189 3 291 2 098 4 107 580 1 989 17 242 17 237
monensine 113 148 71 134 84 80 10 34 141 482
somme 44 289 42 944 15 842 8 606 5 990 8 688 1 550 4 782 208 125 416 623
387
Annexe - tableau 22 : Données brutes, évolution de la contamination le long de la filière de traitement du

lisier élevage 5.
lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation lagune
liquide (ng/L) 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09
tylosine 41 82 49 74 45 6 61 0
lincomycine 1 364 875 130 34 347 219 461 129
marbofloxacine 1 320 1 302 308 556 253 567 624 267
tétracycline 1 235 2 453 292 0 363 3 295 781 1 746
oxytétracycline 7 065 7 428 2 106 0 6 151 7 021 6 678 3 950
sulfadiazine 5 864 2 455 108 148 623 612 153 166
monensine 47 234 14 41 24 54 23 37
somme 16 935 14 829 3 006 853 7 806 11 773 8 781 6 294

solide (ng/g) 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09
tylosine 9 9 14 6 18 5 26 6
lincomycine 44 37 19 14 51 20 82 22
marbofloxacine 426 267 348 591 1 004 255 202 136
tétracycline 940 576 521 1 756 3 306 1 014 1 621 1 744
oxytétracycline 832 1 059 1 127 1 479 2 340 702 3 029 1 324
sulfadiazine 60 21 21 23 55 28 41 170
monensine 1 2 1 5 3 7 5 6
somme 2 312 1 972 2 052 3 875 6 778 2 031 5 006 3 409

total (ng/L) 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09
tylosine 491 546 718 372 1 268 322 321 55
lincomycine 3 604 2 779 1 000 709 3 917 1 626 1 271 349
marbofloxacine 23 545 15 204 16 615 28 237 70 430 18 319 2 626 1 619
tétracycline 50 326 32 469 24 687 82 267 231 415 73 977 16 888 19 062
oxytétracycline 50 231 62 412 54 838 69 322 169 303 55 624 36 721 17 070
sulfadiazine 8 706 3 449 1 085 1 221 4 408 2 519 556 1 855
monensine 73 331 77 276 245 508 70 97
somme 136 976 117 190 99 022 182 403 480 987 152 895 58 452 40 108
388
Annexe - tableau 23 : Données brutes « dégradation des antibiotiques en condition controlées mésophiles
anaérobie et aérobie/anoxique » (RLB : lisier brut en entrée du réacteur, RLdig : lisier en sortie du
digesteur et RLsort : lisier en sortie du réacteur).
liquide (ng/L) 13/10/2009 23/10/2009 05/11/2009 18/11/2009
composés RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort
lincomycine 1 650 1 934 476 2 021 1 922 193 1 705 1 577 113 1 728 1 580 90
marbofloxacine 180 183 46 207 207 76 309 135 49 241 227 64
oxytétracycline 2 549 3 150 458 2 073 4 660 0 0 0 0 2 135 0 0
sulfadiazine 11 756 13 266 1 625 14 786 14 529 877 13 402 9 510 547 13 885 13 937 648
monensine 28 53 52 31 68 56 11 36 32 5 35 61
solide (ng/g) 13/10/2009 23/10/2009 05/11/2009

composés RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort
lincomycine 50 43 25 44 40 13 33 56 16
marbofloxacine 20 37 15 31 26 15 61 65 23
oxytétracycline 28 4 0 121 0 5 795 154 424
sulfadiazine 158 110 11 91 54 11 58 75 10
monensine 0 11 31 2 1 17 4 14 27
total (ng/L) 13/10/2009 23/10/2009 05/11/2009

composés RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort
lincomycine 4 178 3 609 957 4 082 3 432 564 3 184 3 691 475
marbofloxacine 1 196 1 686 345 1 712 1 242 499 3 218 2 632 581
oxytétracycline 3 890 3 165 449 7 886 4 473 138 37 904 5 937 9 877
sulfadiazine 19 400 17 226 1 810 18 512 16 120 1 178 15 549 12 052 758
monensine 26 500 666 123 101 528 214 558 663
Annexe - tableau 24 : Données brutes « dégradation des antibiotiques en condition controlée mésophile
aérobie/anoxique » (d : détecté mais non quantifiable).
liquide (ng/L) 18/05/2010 25/05/2010 31/05/2010 03/06/2010
composés sortie alimentation sortie alimentation sortie alimentation
oxytétracycline 957 2 487 707 804 359 5 895
tylosine 36 0 47 0 0 0
lincomycine d 625 d d d 601
marbofloxacine 214 192 89 42 114 214
tétracycline 70 27 11 d d d
sulfadiazine 104 7 183 338 1 429 86 6 288
monensine 52 229 19 60 33 110
solide (ng/g) 18/05/2010 25/05/2010 31/05/2010 03/06/2010

oxytétracycline 307 302 260 313 423 428
tylosine 7 2 4 3 5 2
lincomycine 50 50 50 45 56 44
marbofloxacine 164 75 94 71 115 101
tétracycline 16 11 14 15 15 19
sulfadiazine 37 122 27 84 59 130
monensine 2 1 1 2 4 1
total (ng/L) 18/05/2010 25/05/2010 31/05/2010 03/06/2010

oxytétracycline 10 597 15 186 8 539 14 715 12 603 21 077
tylosine 254 97 176 112 147 72
lincomycine 1 581 2 727 1 494 1 985 1 616 2 148
marbofloxacine 5 364 3 374 2 920 3 216 3 428 3 832
tétracycline 557 512 431 667 437 681
sulfadiazine 1 263 12 039 1 129 5 128 1 784 10 747
monensine 123 253 58 144 134 155
389
Annexe - tableau 25 : Données brutes « Dégradation des antibiotiques en condition controlée thermophile
anaérobie » (alim : lisier brut en entrée du réacteur).
liquide (ng/L) 12/07/2010 19/07/2010 26/07/2010 02/08/2010
R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
composés alim alim alim alim
(sortie1) (sortie2) (sortie1) (sortie2) (sortie1) (sortie2) (sortie1) (sortie2)
tylosine 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
lincomycine 794 1 661 1 027 560 1 371 1 813 1 620 3 256 3 889 1 518 4 464 1 231
marbofloxacine 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
tétracycline 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
sulfadiazine 2 521 3 776 2 151 1 765 3 403 3 298 5 588 6 263 5 810 5 236 5 332 2 983
monensine 879 991 386 555 739 566 329 848 449 308 446 409
solide (ng/g) 12/07/2010 19/07/2010 26/07/2010 02/08/2010

R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
oxytétracycline 1 312 1 235 509 686 1 070 847 725 639 815 532 837 381
tylosine 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0
lincomycine 50 80 55 49 71 39 49 56 73 38 68 41
marbofloxacine 64 83 44 58 78 79 60 56 84 32 67 34
tétracycline 91 114 50 49 103 60 61 63 113 39 93 33
sulfadiazine 77 56 53 44 43 11 72 42 45 50 53 20
monensine 1 2 2 6 1 1 2 1 1 1 3 1
total (ng/L) 12/07/2010 19/07/2010 26/07/2010 02/08/2010

R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
tylosine 0 27 35 0 6 63 43 0 0 35 0 17
lincomycine 2 363 4 750 3 717 2 122 4 159 3 535 3 137 5 193 5 774 2 846 6 704 2 928
marbofloxacine 2 034 3 274 2 196 1 875 3 131 3 713 1 922 2 046 2 286 1 145 2 372 1 477
tétracycline 2 893 4 495 2 503 1 599 4 140 2 801 1 953 2 313 3 099 1 418 3 285 1 434
sulfadiazine 4 865 5 839 4 684 3 141 4 991 3 634 7 727 7 562 6 876 6 870 7 021 3 720
monensine 896 1 042 458 718 770 593 375 867 472 333 522 437
390
Publications
391
392
Publication 1
Publication 1 : Problems and solutions of trace level analysis of

organic contaminants in drinking and ground waters, review and
experience feedback
CAPDEVILLE M.J. AND BUDZINSKI H.*
ISM-LPTC, UMR 5255, CNRS - Université Bordeaux 1, 351 cours de la libération, 33 405 Talence cedex,
France
Tel.: + 33 (0)5 40 00 69 98
Fax: + 33 (0)5 40 00 22 67
E-mail: h.budzinski@ism.u-bordeaux1.fr
Abstract
Drinking water and groundwater samples are water samples expected to be poorly
contaminated. For this reason they enter into the field of trace level analysis. Due to the very
low levels of contamination, this sort of analysis requires not only powerful analytical
technologies able to reach detections limits around the nanograms par liter, but also quality
control parameters such as blank and spike samples, to monitor potential contamination or
losses during sample treatment. Based on literature review as well as laboratory experience
feedback, this article discusses the problems linked to the difficulties of calculating detection
limits, of distinguishing instrumental from methodological limits and of preventing false
positives results in case of sample contamination, or false negatives results in case of
compound losses. When possible, solutions are suggested to compensate or prevent these
problems.
Key words: Trace level analysis, drinking water, limits of detection, blank contamination,
compound losses
Introduction
Contamination of environmental waters, such as surface and groundwaters and of waters
intended for human consumption, by trace levels of organic substances is a subject of
increasing concern in western countries. European regulations such as Council Directive
98/83/EC of November the third of 1998 [1] on the quality of water intended for human
consumption have fixed quality limits of concentration for some substances, including
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) such as benzo[a]pyrene (0.01 µg/L), pesticides
such as aldrin (0.03 µg/L) or residues of food contact materials such as vinyl chloride (0.50
µg/L). Nevertheless, occurrence in ground and drinking waters of some other unregulated
substances have also been reported in the literature, including pharmaceuticals and personal
care products such as carbamazepine, caffeine and sulfamethoxazole, endocrine disruptors
such as nonylphenol and flame retardants such as TCEP (tris(2-chloroethyl) phosphate)
(Table 1). All these substances were detected in the low µg/L down to the ng/L range.
The evolution of the analytical devices allows to improve the instrumental sensitivity, pushing
the scientists to publish protocols referring to always lower detection and quantification
limits. Unfortunately, in the field of ultra-traces analysis of organic contaminants, other
factors apart from the instrumental performance have to be taken into account in the
determination of those limits. Indeed, the contamination of the water sample during its
manipulation by some substances present in the working environment (ex. naphthalene) or
393
Publication 1
carried by the analyst (ex. caffeine) can turn into false positive results. On the contrary, the
difficulties to extract little water volumes combined to the breakthrough volume problems
(ex. paracetamol) can result in false negatives. Then, it is necessary to take some precautions
when manipulating such samples and it is also important to distinguish the instrumental limits
of detection or quantification from the real limits by considering the whole protocol, from
sampling to pure analysis. This is even more the case for drinking and ground waters, that are
very clean matrices allowing to reach very low detection and quantification limits.
This paper will deal with the complexity of reaching a reliable measure to qualify the
contamination of a sample at the ultra-trace level, in the field of very pure matrices like
drinking and ground waters. The major analytical difficulties at ultra-trace level, like the
detection limits, the false-positive and the false-negative results are reviewed including
literature advices and feedbacks from experience of our Laboratory and the know-how
acquired in this field.
Table 1: Overview of organic compounds and their concentrations (ng/L) found in groundwater and
drinking water worldwide. Only positives quantitative data, upper than the limits of quantification, are reported
and not the negative data (compounds not found, less than the quantification and detection limits).
EDCs
sample flame
references PPCPs2 (hormones, AkPs, BPA, pesticides4 others
type1 retardants5
phthalates)3
USA
[2] drinking AHTN 490 BPA 420 DEET 66 TBEP 350 anthraquinone 72
water HHCB 82 prometon 96 TCEP 99 benzophenone 130
caffeine 119 TDIP 250 bromoform 21000
carbamazepine 258 TBP 100 tetrachloroethylene 100
cotinine 25
dehydronifedipine 4
triethyl citrate 62
[3] drinking erythromycin 4.9
water tylosin 4.2
roxithromycin 1.4
oxolinic acid 2.9 - 4
flumequine 1.2 - 2.5
sulfamethoxazole 3 - 3.4
[4] drinking AHTN ~ 80 - 100 BPA ~ 100 - 300 DEET ~ 70 - 150 TDIP ~ 100 tetrachloroethylene ~ 30
water camphor ~ 10 - 30 4-NP ~2 TBP ~ 200
triethyl citrate ~ 100 OP2EO ~ 100 TCEP ~ 80
carbamazepine ~ 3 - 200
cotinine ~ 1 - 20
caffeine ~ 90
paracetamol ~ 0.5 - 4
dehydronifedipine ~2-4
cimetidine ~ 10
codeine ~ 30
diltiazem ~5
diphenydramine ~4
sulfathiazole ~5
[5] groundwater 1,4-dichlorobenzene 1 170 BPA 2 550 DEET 13 500 TCEP 737 naphthalene 1 510
lincomycin 320 cholesterol 1 730 5-methyl-1H- 2 080
benzotriazole
sulfamethazine 360 coprostanol 1 290 acetophenone 2 670
sulfamethoxazole 1 110 ethanol,2- 1 340
butoxyphosphate
dehydronifedipine 22
diltiazem 28
fluoxetine 56
1,7-dimethylxanthine 57
paracetamol 380
caffeine 130
ibuprofen 3 110
CANADA
[6] drinking NP1EO 50 - 31 00
water NP2EO 10 - 1 400
NP1EC 10 - 20 000
NP2EC 10 - 15 000
[7] drinking clofibric acid NP 67 - 72
water carbamazepine NP1EO 24 - 30
394
Publication 1
EDCs
sample flame
type1 retardants5
phthalates)3
caffeine NP2EO 41 - 65
cotinine NP3EO 25 - 43
ofloxacin NP4EO 47 - 105
sulfamethoxazole NP5EO 83 - 122
NP6EO 156 - 261
NP7EO 223 - 414
NP8EO 269 - 490
NP9EO 297 - 551
BPA 0.45 - 0.76
di(2- 103 - 188
ethylhexyl)phthalate
di-n-butylphthalate 46 - 50
[8] tap water carbamazepine 5.6 atrazine 15 - 28
deethylatrazine 278 - 331
deisopropylatrazine 8 - 11
cyanazine 2 - 3.5
simazine 7 - 16
EUROPE
[9] tap water iopamidol 180 4-NP1EO 2.5 - 2.6
diatrizoate 100 4-NP1EC 11 - 12
diatrizoate 45 stigmasterol 38 - 63
diatrizoate 18 -sitosterol 99 - 179
iopromide 29
iomeprol 12
France
[10] drinking amitryptiline 1.4
water before caffeine 22.9
chlorination carbamazepine 43.2
process
diclofenac 2.5
ibuprofen 0.6
ketoprofen 3
naproxen 0.2
paracetamol 210
[11] drinking atenolol 0.4 - 2 androstenedione 0.1 - 2.8
water bezafibrate 0.3 - 2.2 androsterone 0.5 - 1
carbamazepine 2.1 - 32 oestrone 0.3
diclofenac 0.2 - 1 levonorgestrel 0.2 - 10
fenofibric acid 0.2 - 1 norethindrone 0.3 - 6.8
ibuprofen 1.3 progesterone 0.2 - 10.7
ketoprofen 0.6 - 7 testosterone 0.2 - 26.4
metoprolol 0.3 - 1
naproxen 0.5
oxazepam 1.2 - 2.5
paracetamol 0.7 - 45
pravastatine 0.2
roxithromycin 18.1
salicylic acid 0.8 - 19
sulfamethoxazole 0.8
trimethoprime 1
Germany
[12] groundwater sotalol 560
phenazone 25
diclofenac 590
iopamidol 300
amidotrizoic acid 1 100
carbamazepine 900
anhydro-erythromycin 49
sulfamethoxazole 410
[13] drinking phenazone 400
water propiphenazone 120
dimethylaminophenazone 900
[14] drinking clofibric acid 1 - 170
water N-(phenylsulfonyl)- 2 - 105
sarcosine
propiphenazone 80
[15] drinking phenazone 300
water propiphenazone 90
DP 1 000
PDP 150
AMDOPH 550
AMPH 120
395
Publication 1
EDCs
sample flame
type1 retardants5
phthalates)3
Spain
[16] drinking simazine 43
water atrazine 25 - 62
desisopropylatrazine 25 - 73
desethylatrazine 33
metolachlor 40
[17] tap water 4-NP 24
BPA 6 - 25
dimethylphthalate 3-4
diethylphthalate 33 - 90
di-n-butylphthalate 16 - 32
buthylbenzylphthalate 12 - 17
di(2- 331
ethylhexyl)phthalate
bottled BPA 7
water (PET) di-n-butylphthalate 59
bottled BPA 2
water (PE) diethylphthalate 81 - 139
bottled 4-NP 78
water
(glass)
[18] drinking NP 85
water NP1EC 12
NP2EC 10
[19] drinking BPA 5 simazine 5 - 32
water atrazine 1 - 18
ISRAEL
[20] groundwater sulfamethoxazole 20
1
: drinking water = water sampling at the end of the drinking water treatment before the distribution system; tap water = water collected from
residential tap water [8] or public fountain [17]
2
: PPCPs: Pharmaceuticals and Personal Care Products, AHTN: acetyl hexamethyl tetrahydro naphthalene, HHCB: hexahydrohexamethyl
cyclopentabenzopyran, DP: 1,5-dimethyl-1,2-dehydro-3-pyrazolone, PDP: 4-(2-methylethyl)-1,5-dimethyl-1,2-dehydro-3-pyrazolone,
AMPH: 1-acetyl-1-methyl-2-phenylhydrazide, AMDOPH: 1-acetyl-1-methyl-2-dimethyloxamoyl-2-phenylhydrazide
3
: EDCs: Endocrine Disrupting Compounds, AkPs: alkylphenols, NP: nonylphenol, NPEO: nonylphenol polyethoxylate, NPEC: nonylphenol
carboxylate, BPA: bisphenol A
4
: DEET: N,N-diethyltoluamide
5
: TBEP: tris(2-butoxyethyl) phosphate, TBP: tributyl phosphate, TCEP: tris(2-chloroethyl) phosphate, TDIP: tris(dichloroisopropyl)
phosphate
I. General analytical validation parameters

Before going in depth into the specific problems of the trace analysis, it is important to make
a short reminder of the criteria essential to the validation of a method whatever the level of
studied contamination can be:
- The use of high purity reference compounds (99%) [21]. If the purity is lower than
96%, the exact degree of purity of the product must be known to correct the concentrations
[22]. The stock and working solutions must be prepared in solvents that are not too volatile,
otherwise their evaporation can involve changes in concentrations [22].
- The identification of the compounds during the analysis by at least three
characteristic parameters, like the retention time or the transition of quantification, as
recommended by the Commission decision (2002/657/CE) of August the twelve of 2002
implementing the Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical
methods and the interpretation of results [23,24]. In mass spectrometry, it is better to have
four identification points to ensure the identity of the compound: retention time, at least two
ionic signals (one signal for quantification and one for confirmation, two ions in SIM (Single
Ion Monitoring) mode in MS (Mass Spectrometry) or two transitions in MRM (Multi
Reaction Monitor) mode in MS/MS (tandem Mass Spectrometry)) and the ratio between the
two ionic signals [21].
- The evaluation of the linearity, the precision (repeatability and reproductibility) and
the accuracy of the analytical answer [8,12,18,24,25,26,27]. For most authors, the precision of
396
Publication 1
a method was determined by repeated intra-day and inter-day analysis (successive injection of
a standard solution in 1 day and in several successive days, respectively) and was expressed
as the relative standard deviation of these replicate measurements [8,24,25]. The Commission
decision 2002/657/CE defines accuracy as the closeness of agreement between a test result
and the accepted reference value. According to this commission decision, accuracy is
calculated by determining trueness and precision. Trueness is assessed through recovery of
certified reference material or spiked samples [23].
- If possible the addition of internal standards to evaluate the method performances [28].
II. Limits of detection / quantification

As underlined by Glaser et al., [29], the limits of detection are the most important criteria to
evaluate the performance of a method. The limit of detection or LOD corresponds to a
minimal quantity or concentration, different from zero, which can be reliably detected with a
certain degree of confidence [29]. There are various ways of calculating the LOD [30]: (i) use
of the signal-to-noise ratio (S/N); (ii) the statistical calculations based on the variation of the
analytical response; (iii) via the calibration curve obtained by spiking either pure water or the
samples themselves to take into account the matrix effect. When the LOD is defined from the
signal-to-noise ratio, the response of the analytes is compared to that of the background noise.
Usually the LOD corresponds to the concentration which gives a S/N ratio equal to 3 and the
limit of quantification (LOQ) to a concentration which gives a S/N ratio equal to 10
[3,17,18,25,27,31,32]. In other cases, the LOD corresponds to the variation (standard
deviation) of the response of the successive injection of 7 to 10 replicates of a sample spiked
at a very low concentration, multiplied by a factor of statistical confidence. It is the method
used by the US EPA and USGS [5,21,28,33]. A third technique, which can be used both for
the LOD and LOQ, consists in using a calibration curve. Wenzel et al., [9] determine their
LOQ for iodinated contrast media, alkyphenol polyethoxylates (APEOs) and alkylphenol
carboxylic acids (APECs) according to the DIN 32645 method: in this method, the LOQ is
calculated according to the confidence interval at 99% of a calibration curve, obtained with a
groundwater spiked with the compounds of interest.
As a consequence of nonexisting universal standard method for the calculation of the LOD,
the values of LOD can differ depending on the method used. This issue is illustrated for benzo
[a] pyrene in meat [34]. So, for trace analyses, one sample may be considered as contaminated
or not depending on the way of calculation of the LOD. In order to ensure reliable results,
several authors modify their LODs with corrective factors. These modified LODs are more or
less equivalent to LOQs. Barnes et al., [5] and Focazio et al., [28] rather use the term
“reporting levels” which correspond to five times the methodological limits of detection.
These reported limits correspond to the value beyond which they can quantify the
contamination and give the values with confidence. In order to reduce the risks of false
positive, Furlong et al., [21], use Interim Reporting Levels or IRL which correspond to two
times the methodological limits of detection. Lastly, Garcia-ac et al [8] talk about Method
Detection Limits (MDLs) when the LOD are established on the transition of quantification
and Method Confirmation Limits (MCLs) when the LOD are established on the transition of
confirmation. However, the Decision 2002/657/CE [23] and the most recent guidelines on
analysis by chromatography and mass spectrometry recommend the use of both transitions
(quantitative and confirmatory) to establish the limits of detection and quantification.
In addition, once the way of calculating is defined for LOD and LOQ, it is necessary to make
the difference between the instrumental limits (IDL or IQL) and the methodological limits
(MDL or MQL). The instrumental limits of detection (IDL) and of quantification (IQL) are
397
Publication 1
defined from the injection of standard solutions and are directly related to the sensitivity and
to the performances of the analytical instruments. For example, IDL of ofloxacin were 4759,
214 and 2 picograms injected when it was analysed respectively by LC/UV (HPLC thermo
pump P1500 spectraSystem, injector AS100 spectraSeries, detector DAD thermo UV6000;
mobile phases: water + 0.03 % TFA / acetonitrile + 0.03 % TFA), LC/MS (HPLC Agilent
1100 series, MS Agilent 1100 series single quadrupôle; mobile phases: water + 0.3%
HCOOH / acetonitrile + 0.3 % HCOOH) and LC/MS/MS (Rapid Resolution Liquid phase
Chromatography Agilent 1200 series, MS/MS Agilent 6410 QQQ; mobile phases: water +
0.3% HCOOH / acetonitrile + 0.3 % HCOOH). Globally, for various pharmaceuticals
analysed with this three instruments a factor ten of sensitivity is obtained between LC/UV and
LC/MS and another one is got between LC/MS and LC/MS/MS. Petrovic et al., [18] also
highlight the instrumental dependence of the IDL by comparing values obtained by LC/MS
(liquid phase chromatography mass spectrometry) to those obtained in LC/MS/MS. The
LC/MS/MS LODs are roughly three times lower than the LC/MS LODs. Since these LODs
are instrument-dependent, it was necessary to reach technological improvements in order to
be able to perform trace analyses especially for polar and hydrophilic contaminants.
The methodological detection limits take into account both the instrumental sensitivity and
the impacts of the sample preparation protocols. A first way of calculating them, consists in
extrapolating the IDLs by taking into account the sample volume and the factor of
reconcentration (theoretical IDLs). But this calculation supposes the absence of
methodological error, i.e. neither loss nor amplification phenomena during the samples
preparation and no matrix effect during the analysis. Another possibility consists in applying
the whole protocol (extraction, reconcentration and analysis) to pure water, spiked with very
small quantities of compounds. These MDLs are then measured by taking into account all the
possible impacts of the protocol but do not take into account matrix interferences during the
extraction and the analysis. MDLs obtained by extrapolation of IDLs and considering a factor
of reconcentration of 20000 (extrapolated LODs) and MDLs obtained by the extraction of one
liter of drinking water spiked with targeted compounds (measured LODs) were compared for
some pharmaceuticals in the Laboratory. In drinking water, the matrix effects are low and the
two MDLs have an equal order of magnitude. For example, diclofenac extrapolated and
measured LODs were 0.5 ng/L and 0.9 ng/L respectively. However there are some differences
depending on the compounds: for carbamazepine, sample pre-treatment makes it possible to
improve the measured MDLs (0.8 ng/L) compared to those extrapolated from the IDLs (2.5
ng/L); on the contrary, when the handling of the sample causes compound losses, which is
typically the case for caffeine, the measured MDLs (1.5 ng/L) are more important than the
extrapolated ones (0.7 ng/L). Thus, although the extrapolated LODs are in most cases good
estimators of the MDLs, the last two examples justify the interest to measure them.
Finally, there is a third kind of MDL, corresponding to the LODs measured from the analysis
of various types of waters spiked with the targeted compounds. In this case, the potential
problems brought during the sample preparation step, and those related to the nature of the
samples themselves, are both taken into account. The effects that the matrix can cause on the
extraction recoveries or on the analytical sensitivity are integrated in those calculations. They
are the most accurate MDLs, but in the case of drinking water analyses, the disturbances
brought by the matrix are unlikely. Table 2 illustrates the matrix impact on the MDLs for four
types of water: raw tap water, surface water, marine water and wastewater treatment plant
effluent. All were analysed according to the same protocol: extraction of the compounds by
SPE (Solid Phase Extraction) on Oasis MCX cartridges with ethyl acetate, ethyl
acetate/acetone and ethyl acetate/acetone/ammonium hydroxide as elution solvents, and
analysis with GC/MS with a HP5/MS capillary column and ultrapure helium as carrier gas
398
Publication 1
[10]. It clearly highlights that the MDLs increase with increasing content of organic matter in
water.
Ternes [49] showed that the MQLs are instrument- but also methodology-dependent. The
LOQs are ten times lower for the antibiotic analysis when he uses SPE rather than freeze-
drying as extraction/reconcentration technique. He also highlights the matrix-dependent
character of this parameter, since from drinking water to groundwater the estrogen LOQ
increases by a factor 2.
Table 2: Influence of the sample composition on the MDL (1L extracted for raw tap, surface and marine
water and 500 mL for wastewater effluent) of pharmaceutical compounds analysed by GC/MS1 [10]
measured MDLs (ng/L)
wastewater
raw tap water surface water marine water
effluent
amitryptiline 0.7 2.2 2.6 6.8
carbamazepine 0.8 1.4 2.2 22.3
diazepam 0.4 1.4 1.9 13.8
doxepine 0.7 2.1 2.4 16.6
imipramine 0.7 1.2 1.6 12.7
nordiazepam 0.4 1.4 1.9 13.8
aspirin 0.2 2.1 2.1 15.0
diclofenac 0.9 0.7 2.6 9.0
ibuprofen 0.1 0.1 1.7 4.8
ketoprofen 0.3 0.7 1.8 11.6
naproxen 0.1 1.0 2.1 6.2
clenbuterol 0.6 0.3 1.2 4.0
caffeine 1.5 2.5 2.3 28.6
gemfibrozil 0.1 0.3 1.2 3.2
1
: GC Agilent HP6890, MS Agilent 5973 single quadrupôle; ionization by electronic impact at 70 eV; carrier gaz ultrapure
He; capillary column HP5/MS 5 % diphenyl / 95 % dimethylsiloxane, 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm film thickness
Although in drinking water analyses, the LODs are unlikely modified due to matrix effect or
to signal extinction problems, they can be modified if contamination occurs. Indeed if blanks
are contaminated and the problem cannot be solved, then the blank values must be taken into
account to define the LOQs. A contamination background noise for bisphenol A of about 4
ng/L was noticed in the laboratory, by compiling a great number of experimental data.
Consequently, any sample that potentially contains less than 4 ng/L BPA cannot be analysed
with confidence, because the potential contamination of the sample is masked by the
background noise, in spite of an IDL extrapolated for the BPA at 1 ng/L. In this case, the real
LOD of the BPA should be at least 8 ng/L, i.e. twice the value of the background noise, to be
able to surely get rid of experimental pollution. In other cases, an analytical interference can
mask the targeted compound. For example, the ketoprofen signal has been shown to be
interfered by a molecule which has the same retention time and the same quantification
transition. The quantification of the signal in the blank gives a concentration equivalent to 2.5
ng/L. Then, in spite of extrapolated LOD around 1 ng/L, any sample contamination lower
than 3 ng/L will be hidden by the interference. Consequently, the LODs of ketoprofen should
be raised to at least 5 ng/L.
The last important point to define the LODs, is the considered signal. Few authors mention on
which signal the LODs are established [3]. Generally to ensure a compound identification in
mass spectrometry, one must check its retention time, one ion, or one transition of
quantification and another one of confirmation, and the ratio between these two signals. The
reliable identification of a compound is achieved when all these criteria match
simultaneously. However, the signal of confirmation is often less intense than that of
quantification. In the absence of this second signal, the presence of a compound in a sample
cannot be certified. Thus, the limit of detection should be related to the response of the second
399
Publication 1
signal. However, the potential presence of a compound in a sample cannot be completely

ignored if the other criteria are fulfilled, especially when the ratio between the two signals is
important. In this case, LOD will be defined according to the quantification signal. Then, to
determine whether or not the sample is contaminated by the compound, it is necessary to take
into account other parameters, such as the context (conditions in which the sample was
obtained, preserved and analysed), the type of sample (surface water, bottled water, etc) and
other indications such as published results with similar samples or laboratory internal results
(frequency and certainty of detection of this compound in this type of sample). Finally, the
sample cannot be certified at 100% contaminated or not contaminated.
To sum up, although the LOD is the most important criterion for the traces analysis, it is the
most variable parameter from one methodology to another. It is a compound-, technology-,
and matrix-dependent parameter. The ideal way of working for traces analysis, is to define
MDL by taking into account the analytical instrument used, the whole protocol (extraction,
reconcentration and analysis), the matrix effects, and to specify the method of calculation
adopted. Consequently, an accurate estimation of the LOD requires a spiking at low level of
one or several replicates of samples (final concentration within the range of about ten
nanograms per liters) and making them undergo the whole protocol, whatever is the mode of
calculation chosen.
III. The false positives

Good sensitivity is an essential, but not exclusive criterion to meet during the development of
a methodology for trace-level analysis of organic compounds in water samples. Determining
whether the sample contamination by targeted compounds originates from the sample itself or
is related to its handling is another very important point. Indeed, although there is no natural
background for "human-made" organic molecules as for metals, they enter the composition of
materials like plastics or products for standard human consumption such as cosmetics and are
present in our every day environment. In consequence they can be transferred to the samples.
The most common sources of sample contamination by organic molecules are: the
atmosphere; equipments that are insufficiently cleaned or made up with inappropriate
materials for the targeted compounds; bad care of the samples during the sampling and the
transport (adapted USGS 2006) [35]. In practice, solvents, reagents, glassware, analytical
instruments, equipment and work environment are the sources of contamination [22]. They
make it possible to qualify a “clean” sample as contaminated.
In the next paragraphs, the definition and the necessity to perform blanks in parallel to real
samples as well as the various sources of pollution and the possible solutions will be reviewed
from literature data and/or from our laboratory experiences feedback. In addition to the
blanks, the extraction recoveries can also reflect a pollution of the samples, when the recovery
rates are much higher than 100%. For example, during one of their experiments, Furlong et
al., [21] report an extraction recovery up to 560% for caffeine, clearly proving the
contamination of sample. In consequence blanks and extraction recovery experiments must be
performed in parallel.
III.1. The « blanks »

To prevent false positives, many authors make “blanks” in parallel to their analysis. In general
they use water free from organic matter and free from the targeted analytes. Depending on the
authors, various kinds of water are employed: water used for LC (Liquid phase
Chromatography) mobile phases (e.g. HPLC grade [33]), ultra pure water (e.g. MilliQ® water
400
Publication 1
[17,32]), bottled spring water [37], bottled natural mineral water [38] or homemade water
(distilled water [7], laboratory grade [2,36], water filtered on activated carbon [37]).
Several blanks can be made during sample treatment. They are introduced at different
moments of the sample treatment, from the sampling to the injection on the analytical
instrument, in order to identify the origin of the contamination such as the environment at
sampling time, the equipment used for sampling, filtration or extraction, the needle of
injection or the chromatographic solvent and gases. Table 3 adapted from USGS [35] lists the
principal types of blanks that can be realized to validate only the sampling step.
Table 3: Common types of blank samples and the questions they address [35]
[QC, quality control; IBW, inorganic-grade blank water; PBW, pesticide-grade blank water; VPBW,
volatile-organic-compound and pesticide-grade blank water]
type Targeted Source(s) of Bias1
Field blank Sample collection, processing and transport process
Basic QC sample: Was my sample contaminated as a result of field activities and
exposure?
Equipment blank Sample collection and processing equipment system
Topical QC sample: Does an initial equipment assessment2 confirm the suitability
of the equipment to provide samples within my data-quality requirements?
Topical QC sample: Is my equipment-cleaning protocol adequate?
Sampler blank Sampling device (for example, the D-95 sampler, Fultz pump, or peristaltic-pump
tubing)
Topical QC sample: Is my sampling device the source of contamination?
Filter blank Filtration device (for example, the capsule filter, in-line filter holder, aluminum
plate filter)
Topical QC sample: Is my filtration device the source of contamination?
Ambient blank Exposure to atmospheric outfall or other conditions
Topical QC sample: Was sample exposure to the atmosphere a contaminant
source?
Source-solution blank The blank water used (for example, IBW, PBW, or VPBW)
Topical QC sample: Was my blank water tainted with respect to my analyte(s) of
interest?
1
The bias and variability measured include that from laboratory handling, processing, and analysis of the sample in addition
to the targeted source listed.
2
An equipment blank is required for USGS investigations to determine the equipment suitability to provide the analyte data
needed to meet study objectives.
In practice, the field blank is the most complete one, since it undergoes all the sampling stages
(collection, transport and filtration) and makes it possible to validate the whole sampling step
[28,32,36]. Berryman et al., [6] make these blanks by bringing on the field bottles containing
pure water and the same preservative agent that is added to each sample (formaldehyde).
These bottles are opened during the collection step in the water treatment plant, in order to
evaluate the potential contamination brought by the equipment, the ambient air or transport.
Nevertheless, the field blank is not precise enough to identify the exact source of
contamination.
The second type of blanks that must be integrated in a quality approach are the blanks known
as laboratory blanks which are performed in parallel to the treatment of the environmental
samples [5,7,17,28]. They make it possible to be sure that there is no pollution of the sample
in the laboratory. For Furlong et al [21] these manipulation blanks correspond to water
samples free from organic matter and only spiked with the internal standards. They are
extracted and analysed in parallel with a series of ten environmental samples. Those blanks
really reflect what the handling can bring to a sample during the processing, since they
correspond to the processing of material, solvents, gases used for the extraction / purification.
401
Publication 1
They also take into account the atmosphere of the laboratory where the sample treatment is
performed, because compounds present in the atmosphere can be transferred to the solvents,
can adsorb on glassware or in the phases that are used, for instance, in SPE methodologies.
The last type of blanks to be included in the quality approach, are the injection blanks
[17,21,32,33]. These injection blanks make it possible to supervise a possible injection-to-
injection carryover. This cross-contamination between the injections can result from an
incomplete injection of the previous sample or from an insufficient washing of the needle of
injection. These blanks only contain solvent or water free from organic matter, plus the
internal and surrogate standards. They are placed directly on the rack of injection. Cahill et
al., [33] insert their injection blanks every ten analyses, whereas Furlong et al., [21] analyse
them just after the calibration verification sample (sample containing all the selected
compounds). In the 1694 method, the US EPA [37] also recommends to place an injection
blank right after the analysis of samples containing the targeted analytes, in order to make
sure that there is no transfer of pollutants.
Even if many authors carry out blanks in parallel to their samples to ensure the validity of
their environmental results, all of them do not exploit in the same way the information
provided, when they appear to be contaminated. Some authors, like Casajuana and Lacorte
[17], Chen et al., [7] or Garcia-Ac et al., [8] subtract the values of their laboratory and
injection blanks from the values of their samples. On the contrary, Furlong et al., [21] do not.
Such is also the case in US EPA methods 525.2 and 527 [22,39]. One should not subtract the
values of the blank from those of the samples, because the concentrations in the blanks are
variable. Others, such as Barnes et al [5] or Focazio et al [28] rather use these values to raise
their LODs. Thus, Barnes et al [5] report that the concentration of compounds in the
environmental samples are lower than their MDLs if the values are lower than at least ten
times the contamination of the blanks. Lastly, at the National Water Quality Laboratory
(NWQL, USA) the presence of a compound in a sample is validated only if the concentration
in the sample is ten times that in the blank and the concentration in the sample is higher than
the limits of quantification [21]. Other authors decide on an individual basis, according to the
compounds and the samples. Stackelberg et al., [2] specify that the quantities of compounds
found in the blanks are either much lower than those found in the associated samples or on the
contrary, that the compounds identified in the blanks are not found in the associated samples.
For example, carbamazepine is dosed at 0.3 ng/L in the field blank whereas it is dosed with a
value more than a hundred times higher in the associated sample or on the contrary the
sulfamethoxazole and the trimethoprim, respectively quantified at 0,9 ng/L and 0,1 ng/L in
the field blank, are not found in the associated samples. In both cases, they deduce that
identification of these compounds in the field blanks or in the laboratory blanks does not
compromise qualitatively and quantitatively the results of their analysis.
In general, the compounds that are the most frequently detected in the blanks are caffeine,
phthalates and bisphenol A (BPA). Blanks of Focazio et al., [28] reveal a frequent detection
of caffeine, varying from 3 ng/L to 162 ng/L. They also underline an occasional detection of
the metabolite of caffeine (1,7-dimethylxanthine), of plasticizers like bisphenol A, or the
triphenyl phosphate, or of molecules entering the composition of cosmetics such as 1,4-
dichlorobenzene or methyl salicylate. Furlong et al., [21] found at least once in the blanks
eleven out of the fourteen pharmaceutical substances that they were looking for. Caffeine is
found five times out of ninety-nine blanks analysed, with an average concentration of 77.8
ng/L, and with a maximum concentration of 239 ng/L; Codeine is found three times out of
ninety-nine blanks analysed, with an average concentration of 15 ng/L and with a maximum
concentration of 33.4 ng/L. The authors conclude that the contamination of the blank by the
402
Publication 1
PPCPs (Pharmaceutical and Personal Care Products) is not frequent and that one laboratory
blank every ten environmental samples treated is enough, but yet essential, to evaluate it.
III.2. Contributions of the technician

One of the sources of pollution during samples analysis is the technician himself. Some
compounds such as caffeine or cotinine (a nicotine metabolite), both found in standard
products for human consumption like coffee or cigarettes, but also AHTN (acetyl hexamethyl
tetrahydro naphthalene) found in perfume or aspirin, an anti-inflammatory drug also found in
dermatological creams, can be transferred to the samples via the analyst.
Tests have been carried out to compare the impact a coffee drinker can have on the transfer of
caffeine to the samples. The same water analysed by a coffee drinker contains 250 ng/L of
caffeine, whereas it contains no more than 30 ng/L when it is analysed by a person who does
not drink coffee. This concentration even goes down to less than 5 ng/L if the analyst washes
carefully his hands and wears gloves.
Other compounds are also transferable. It has been noticed that the presence of phenanthrene
or pyrene in laboratory blanks was the characteristic feature of a smoking technician, as
illustrated in Table 4. Also, it can be observed that an experienced technician, working for
several years on this problematic, pollutes less his samples than a beginner, working for the
first times on such samples, which is patent with naphthalene and phenanthrene but also
pyrene and perylene (Table 4).
Table 4: Influence of the technician characteristics (experienced / inexperienced, smoker or not) on the
detection of PAHs in experimental blanks (experienced technician : technician used for several years to
work on traces level samples, inexperienced technician : technician working for the first times on such
samples).
experienced inexperienced experienced
quantity (ng) of
non smoker non smoker smoker
PAHs compounds
technician technician technician
naphtalene 6.47 9.53 5.30
acenaphthylene 0.13 0.06 0.19
acenaphtene 0.52 0.05 1.38
fluorene 0.54 1.16 1.97
phenanthrene 1.78 13.35 5.91
anthracene 0.09 nd 0.22
fluoranthene 0.39 0.53 0.83
pyrene 0.55 1.46 2.63
benzo[a]anthacene nd 0.01 0.09
chrysene + triphenylene 0.03 0.01 0.23
benzofluoranthene nd nd nd
benzo[e]pyrene nd nd nd
benzo[a] pyrene nd nd nd
perylene nd 4.27 nd
indone[c-d]pyrene nd nd nd
dibenzo[a,h + a,c]anthracene nd nd nd
benzo[ghi]perylene nd nd nd
sum 10 30 19
These two examples confirm that the technician can be at the origin of sample pollution. In
the USGS (2006) [35] handbook about quality data acquisition of water analysis, chapter 4,
the quality control part lists the substances which can be introduced by people into the sample
during the sampling itself. This is true for sampling and also for the analysis of the sample
itself. Caffeine, nicotine or DEET (N,N-diethyltoluamide, a mosquito repellent) can be
403
Publication 1
transferred via dirty hands or gloves, alcohol can be brought by breath and many other
substances can be transferred by clothes or hairs. To reduce the risks of technician sample
pollutions, Barnes et al., [5], Focazio et al., [28] and the USGS [35] recommend to avoid
using perfume or insect repellant (DEET) and not to consume products containing caffeine or
tobacco when their components are also the target molecules.
In conclusion, to limit the transfer of compounds from the technician to the sample it is
recommended to select the person depending on his own characteristics (smoker or not, coffee
drinker or not) and on the targeted analytes. Wearing gloves, a lab coat and a mask throughout
the process of sampling and analysis is recommended to reduce the transfers. In addition, the
experience of the analyst strongly contributes to reduce the risks of pollution during handling
(Table 4).
III.3. Contributions of the working environment

The environment of the laboratory is also a source of contamination. In our laboratory, a room
has been dedicated to experiments on samples that are supposed to be highly contaminated,
such as waters from sewage treatment plants (STPs), and another one to experiments on
samples that are not or only slightly contaminated, such as groundwater or drinking water.
Initially the two rooms were the same but due to the constant treatment of contaminated
samples in the first one, the work environment is more likely to convey contaminants and
could consequently pollute the future samples, which will be analysed. For this reason, this
room was named the “contaminated room”. On the contrary, the environment of the second
room is supposed to be cleaner, so this second room is dedicated to the analyses of traces and
was named the “clean room”. Their respective ambient atmosphere is daily verified. PAHs
were analysed in blank samples carried out in parallel with environmental samples in each of
the 2 rooms. The average quantity of PAHs found in blank samples were 17 ng (n=7) and 8
ng (n=11) in the contaminated and the clean room respectively. In the same way, PCBs (Poly
Chloro-Biphenyls) and PBDEs (Poly Bromo-Diphenyl Ethers) were analysed in blank
samples carried out in parallel with environmental samples in each of the 2 rooms (Figure 1).
Even if there is an overlap area between the quantities found in these two room blanks, it can
noticed that for the two classes of compounds and for a same parameter, as for PAHS, the
values are systematically higher in the room dedicated to the contaminated matrices. These
results perfectly reflect the pollution that the laboratory environment itself can generate.
effet de la pièce de manip sur les blanc de manip
average maximum minimum median
25
sum PCB+PBDE (ng)
20
15
10
0
contaminated room (n=3) clean room (n=9)
room type
Figure 1: Impact of the room where the experiments are done on the quantity of PCBs and PBDEs
detected in blank samples (Contaminated room means room where samples supposed to be highly
contaminated are treated and clean room means room where only samples supposed not to be or only slightly
contaminated are treated; in parallel the ambient contamination is checked to verify levels for targeted
contaminants to be analyzed)
404
Publication 1
As a result, it can be strongly recommended to dedicate rooms and hoods to specific

applications. Moreover, samples of different level of contamination should not be analysed
during the same extraction series nor at the same time, in the same room, even if they are in
different extraction series. This will avoid cross-contaminations between samples. Respecting
this system of specific rooms according to the level of contamination, implies to double all
necessary equipment to avoid changing rooms during the experiment. Consequently, it
implies a certain cost, organizational rules and strict working methods. These practices are
part of heavy quality procedures and methodologies to set up, like the GLP (Good Laboratory
Practices) or HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) for example.
Despite these precautions, if some compounds are identified in the laboratory blanks, it is
necessary to distinguish the compounds brought by the sample treatment from those initially
present. One strategy consists in increasing the volume of the tested sample without changing
significantly extraction time. If the contamination comes from the sample, then the extracted
quantities will proportionally increase with the increasing treated volume. On the other hand
if the contamination comes from the working atmosphere, then, whatever the treated volume
is, the quantity of extracted compounds will be the same. But increasing the sample volume is
not always possible because matrix problems can increase or sample size can be limited.
Caffeine was analysed in eight raw waters (RW) for production of drinking waters. With a
sample volume of 100 mL, the contamination level of the laboratory blank (11.5 ng) and of
the samples (11.2 – 22.7 ng) are roughly the same. In this particular case, it is impossible to
know whether the caffeine analysed in the samples comes from the samples themselves or is
the result from contamination during sample processing. Increasing the volume of the treated
sample from 100 to 500 mL enables to go over the background noise for RW n°4 as example.
Extraction of 100 mL and 500 mL of this water gives 18.8 ng and 54.8 ng of caffeine
respectively whereas extraction of 100 mL and 500 mL of blank samples gives 11.5 ng and
20.2 ng of caffeine respectively. It can be concluded that RW 4 probably contains an average
of 70 ng/L of caffeine, after subtraction of the blank. On the contrary, the other samples
always contain caffeine in the same proportions (4.2 – 27 ng for 500 mL extracted water) as
in the laboratory blanks or even below. It can be deduced that these waters initially did not
contain caffeine and that the analysed quantities result only from the pollution brought during
handling. The differences among samples are due to the ambient contamination variability.
Generally, the more one sample is handled, the more it could be contaminated by working
atmosphere. To reduce this risk, there are certain techniques that can be used, such as direct
injection [40,41], SPME (Solid Phase Micro-Extraction) [42] or on-line SPE [8]. These
solutions both reduce the handling costs and the risks of pollution.
III.4. Contribution of the used laboratory equipment

According to the class of targeted contaminants, the laboratory blank pollution is more likely
to be caused by the working environment (example: naphthalene, caffeine), or by the
technician (example: pyrene, caffeine) or by the equipment. Indeed when targeted compounds
enter on plastics compositions like the alkylphenols, bisphenol A or phthalates, the equipment
used for the analysis should be carefully chosen. To illustrate this point, three times, two
different volumes of a same drinking water were extracted once by SPE with plastics pipes
and once with glass Pasteur pipettes in order to analyse BPA and 4-NP.
The quantities of 4-NP and BPA were respectively three times and one hundred times lower
when the analysis is realized with glass Pasteur pipettes than with plastic pipes. The
contamination of the sample by the equipment is obvious. Moreover, whit the same
equipment employed, the quantities found were higher when greater volumes were extracted.
405
Publication 1
For example, quantities of BPA were respectively 45.5 ng and 179.2 ng for 0.5 L and 1.5 L of
drinking water extracted with plastic pipes and 0.3 ng and 0.7 ng for 0.01 L and 0.1 L of the
same drinking water extracted with glass Pasteur pipettes. The larger the volume of treated
sample, the longer is the contact time and the greater is the quantity of BPA. Indeed, the
equipment is not inert and the longer the sample is in contact with plastic, the more it absorbs
BPA (and 4-NP), explaining why the quantities increase according to the increasing treated
volume.
Casajuana et Lacorte [17] observe that the contamination of their laboratory blanks, made in
parallel with the analysis of phthalates and other EDC (Endocrine Disruptor Compounds),
could come from the use of polypropylene cartridges and polyethylene frits during SPE. The
equipment used for the SPE being a source of pollution, the SPE does not seem to be the
appropriate technique to analyse phthalates at low levels. Moreover, for the analysis of
phthalates, it can be noticed that the less a sample is handled the less it is polluted. SPME
technique should be preferred because it allows to minimise the handling of aqueous samples.
However, the average (n=3) of DEHP (Di(2-EthylHexyl)Phthalate) chromatographic peak
area in blank injection sample were 25 048  5 235 and 73 791  12 979 with PDMS 100 µm
and PDMS DVB fibers respectively showing that when DEHP was analysed, laboratory
blanks systematically contain the targeted analyte, whatever the type of fibres employed is.
This unavoidable background noise can be managed by making a "fiber blank" before the
analysis of each sample. If the DEHP area in the sample is not at least two times higher than
that in the previous blank, then it cannot be concluded that the sample is contaminated with
DEHP. In addition, the state of the analytical system employed (more or less recent system
services and maintenance) and the type of fibre chosen can affect the quantities of DEHP
detected in the blanks, and can vary from one day to another (Figure 2). The decrease in
DEHP fiber contamination observed on Figure 2 can be explained either by the decrease in
the fiber pollution release or by a decrease in analytical sensitivity.
90000
80000
70000
60000
50000
area
40000
30000
20000
10000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
same fibre after a break new fibre + same new fibre + new
new fibre + new elements
into the usage elements cleaned elements
Figure 2: blank fiber contamination evolution depending on the analytical system and fiber states
elements = glass insert SPME, gold plated inlet seal, column cutting
Impact of glassware on phthalates analysis was studied by SPME. The DEHP concentrations
found were 4.2  2.1, 3.7  1.2, 3.3  1.6 and 1.5  0.2 ng/L in a same water analysed using
glassware used only for drinking water analysis, new glassware, new glassware baked and
new glassware washed and baked respectively. New, washed and baked glassware can reduce
406
Publication 1
both the DEHP concentrations and concentration variations in the analysed water. But
whatever the taken precautions are, there is an unavoidable background noise of about 4 ng/L.
This residual contamination masks all DEHP levels below 5 ng/L and imposes a LOD of at
least 10 ng/L.
The influence of the glassware state on caffeine analysis was also highlighted in the
laboratory. When the whole equipment used for extraction, reconcentration and analysis of
caffeine is new, then the detected caffeine level in the laboratory blank is around 1 ng/L. But
if the equipment used is not new, even if it has been used only for drinking water analysis and
it has been cleaned with detergents and baked at 450°C, traces of caffeine are quantified in the
concentration range of 3 to 30 ng/L. This is called "the memory effect".
The memory effect can be stronger if the equipment used for trace analyses is not clean
enough or if it has already been used with contaminated samples. At the opposite, the
molecules can be lost if the equipment used is not adapted. For example, they can be adsorbed
on the inside surface of the containers like some pesticides on plastic [43] or the tetracyclines
on glass [44]. Consequently, it is fundamental to pay attention to the choice of the material
used and its cleaning at every moment of the analysis protocol. For example, for the sampling
step, almost all the authors recommend the use of amber or inactinic glass bottles, to prevent
the photodegradation of the contaminants [2,3,16,20]. Furlong et al., [21] use stainless steel
containers. For handling, many authors recommend the use of glass laboratory material to
limit the pollution of the samples by the material employed [21,22,37,39]. For example
Montiel [45] recommends the use of pyrex bottles and Quintana et al [16] of borosilicate
pyrex bottles. Moreover, it is necessary to avoid the pollution coming from caps by using
Teflon caps to close flasks and bottles [21,22]. In addition, it is very important to pay
attention to the products used for the cleaning, as some detergents contain compounds such as
alkylphenol polyethoxylates (APEOs). Looking the literature, each team seems to have its
own cleaning protocol. To minimize the contamination of their material by APEOs, Wenzel et
al., [9] clean their glassware with precaution, heating it at 250°C during at least 24 hours, then
rinsing it with organic solvents. They clean the caps of their injection vials during 24 hours at
70°C under reduced pressure (50mbar). Boyd et al., [46] wash their glassware with soap, then
soak it in a solution containing a specific detergent for industrial and medical use and then in
a hydrochloric acid solution. To finish, they bake it at 450°C. The Teflon material is washed
in the same way as the glassware except for the baking step. Ye et al., [3] wash their bottles
with acid. In the US EPA method 1694 [37], it is recommended to wash the glassware with
solvents and a solution of detergent, right after its use. The various elements have to be
disassembled before washing. To optimize the elimination of the substances, the glassware
containing the solution of detergent can be sonicated for a few seconds and once washed, it is
immediately rinsed with several solvents: methanol, hot water, methanol, acetone and finally
methylene chloride. Finally it is baked between 300 and 500°C. Montiel [45] proscribes the
use of detergents, but recommends washing with nitric acid and then rinsing the glassware
with water, baking it during 30 minutes at 450°C and then rinsing it again with the extraction
solvent of the compounds that are looked for. Nevertheless, the re-use of a bottle can lead to
pollution, because of the memory effect. As a result, a bottle which has contained highly
polluted samples should not be used again for the analysis of traces. Depending of the target
compounds, one possible alternative consists in using single-use polyethylene bottles.
Watkinson et al., [32] autoclave their glassware before successively washing it with acetone,
methanol and MilliQ® water. In addition to their glassware, Furlong et al., [21] also bake
“pasteur pipettes” and glass fiber filters at 450°C during 4 hours, in order to eliminate all
organic compound residues. Many authors recommend the calcination of the glassware
407
Publication 1
[2,9,21,45,46]. To sum up, except for certain particular pollutants, it is advised to work with
glass containers and use Teflon-caps. The glassware must be washed with the extraction
solvents of the compounds and/or adapted detergents and then baked at 450°C during several
hours. The caps must also be washed with adapted detergents.
In addition to glassware, the SPE vacuum manifold used for the SPE extraction is another
possible origin of contamination. The same experiment was performed with and without a
SPE manifold, for aspirin analysis. In both cases, SPE cartridges were conditioned with ethyl
acetate, then with pure water. Then they were immediately eluted. In that way, the detected
quantities exclusively reflect the contamination brought by the equipment and particularly by
the SPE manifold, since it is the only variable element between the two experiments. Blanks
contained an average basis of 13 ng of aspirin when the analysis was carried out with the SPE
manifold versus 5 ng when the experiment was carried out without the manifold. This clearly
shows that the SPE manifold has an impact on sample contamination.
The sample reconcentration step under nitrogen flow can also be the source of pollution.
Fluoranthene was detected in all the protocol blanks of various experimenters at concentration
ranging between 0.2 ng and 1.4 ng. To identify the source of contamination, the experiment
was divided into several steps and several blanks were analysed after each step. The
conclusion was that the problem came from the reconcentration stage under nitrogen flow and
from the purity of the gases that were used. It is important to remember that working with
analytical gases of high quality (purity superior to 99.999% for nitrogen or switch to argon)
and excluding gases of industrial quality is of primary importance. Furlong et al., [21] specify
that they use ultrapure quality nitrogen for the stage of reconcentration.
Another source of pollution identified in laboratories is linked to the purity of standard

compounds and more particularly of internal standards. Indeed, erythromycin was analysed
with concentrations varying between 0.6 and 6 ng/L in several drinking waters during various
series. In parallel, it was observed that during the same series, concentrations were almost
identical, at an average level of 6  0.6 ng/L (n=8) or 0.6  0.1 ng/L (n=3) and that there was
a link between the quantity of erythromycin-13C2 added to the samples and the concentration
of erythromycin that was quantified. Finally, the LC/MS/MS injection of a solution
containing only erythromycin-13C2 revealed the presence of erythromycin. Consequently, the
erythromycin detected in drinking waters was caused by a pollution coming from the internal
standard. Stackelberg et al., [2] also noticed that adding erythromycin-13C2 was at the origin
of their laboratory blank pollution by erythromycin. Moreover, a similar observation was
made for two molecules of the same class, the lincomycin and the clarithromycin, which are
detected at very low concentrations, 2 ng/L and 4 ng/L respectively, in drinking water
samples when their respective internal standards are added, whereas they are absent when
these internal standards are not added. In these cases, the limits of the internal calibration are
reached.
To conclude, once the origin of pollution is identified, the problem can be limited by taking
great care of the quality and purity of solvents, gases and analytical standards, by a
meticulous cleaning of the equipment, by adapting the equipment used to the targeted class of
compounds and even by using new glassware for each analysis, if needed.
408
Publication 1
III.5. Contributions of the analytical system

Finally, samples can be considered as false positives if they are contaminated during the
ultimate analytical step, or if the analytical answers are parasitized by interferences which
have exactly the same identification criteria as the targeted compounds.
To prevent or evaluate the crossed contamination between samples during an analysis
sequence, one or more injection blanks can be inserted between each sample [17,22,39].
When interferences are due to the material employed and they coelute with the targeted
compounds, one possible way, to try to separate one from the other, is to modify the
chromatographic gradient. As example, with a fast 18 minutes gradient, the interfering
compound present in the injection blank is eluted at the same time as ketoprofen, (7.59 min).
By modifying the chromatographic gradient and by extending the analysis time to 38 minutes,
the interfering compound (14.59 min) is eluted before ketoprofen (14.85 min) which allows to
differentiate the two analytes.
30.63 30.63
ion 193 193 > 165
TIC TIC
30.74
ion 193 193 > 165
TIC TIC
30.77
Figure 3: Chromatograms of the same standard solution of carbamazepine (top) and the same water for
drinking water production (bottom) analysed by GC/MS/MS1 used in SIR mode (left) and in MRM mode
(right)
1
: GC Agilent 6890, MS/MS Waters Quattro Micro GC, column HP5/MS 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm
409
Publication 1
In the case of chromatographic interferences, another way of determining whether the

compound observed is indeed the targeted compound, is to change the analytical system or
the analysis mode. A sample suspected of containing carbamazepine was analysed in
LC/MS/MS and GC/MS/MS (Gaz Chromatography tandem Mass Spectrometry). In both
cases, the four identification criteria (retention time, signals of the two transitions and good
ratio between the two transitions) were met and made it possible to show the presence of
carbamazepine in water. On the contrary, a sample suspected of not containing carbamazepine
was analysed on the same machine but used once as a simple GC/MS (mode SIM) and then as
GC/MS/MS (mode MRM). The results of this test are presented in Figure 3. A
chromatographic peak is systematically observed on the TIC (Total Ionic Chromatogram) at
the expected retention time. But the compound which answered at the carbamazepine ion 193
did not answer at the carbamazepine transition 193  165, which implied that water was free
from carbamazepine.
IV. The false negatives

Injection or manipulation blanks allow to study the contamination phenomena and then to
avoid the risks of false positive results. At the opposite, samples enriched with compounds of
interest make it possible to study the phenomena of compounds losses and avoid the false
negative results, via the evaluation of quantification and extraction recoveries. The losses can
be caused by photodegradation (anthracene, benzo [a] anthracene or benzo [a] pyrene, [22]),
by oxidation (PAHs, [22]), by the absorption on the inside surface of the containers
(tetracyclines, [44]; metolachlor and atrazine, [43]), by their conversion into epimers or
isomers (tetracyclines, [47]), by inappropriate protocol etc.
IV.1. The extraction and quantification recoveries

To quantify the losses and to a lesser extent the gains of compounds, a water sample initially
free from the targeted compounds and free from organic matter is spiked with the molecules
of interest. The sample is then extracted and analysed in parallel with a series of
environmental samples varying from ten to sixteen, in order to estimate the recovery for each
series. These recoveries make it possible to evaluate the method performance in absence of
matrix interferences, and to make sure that there are not large changes for a set of analysed
samples [5,21,28,32,33].
The recoveries can be evaluated at various steps of the method: the extraction, the analysis,
the extraction and the reconcentration or the overall procedure (extraction, reconcentration
and analysis) [3,21]. Furlong et al., [21] introduce in their analytical sequence a "continuing
calibration verification standard", which is an aliquot of one of the points of their calibration
curve that contains all the selected compounds, including surrogates and internal standard.
This control enables to make sure that the compounds are always correctly identified and that
the analytical response doesn't change during the sequence. Ye et al., [3] first evaluate the
recovery of the extraction step only, then the extraction and reconcentration steps recovery
and finally the overall recovery. This last one is the most important one because it takes into
account both the potential interferences related to handling and those related to the matrix
effects during the analysis. The important recoveries are those of the whole extraction
methods, which give a clear idea of their performance.
According to Wenzel et al., [9] there are various ways of estimating the extraction recoveries.
For steroid hormones, they spike groundwater free from the selected compounds, at different
environmentally relevant levels (0.5; 2 and 10 ng/L). Then, they realize the whole protocol
(extraction, purification, derivatisation and analysis). Subsequently they evaluate the
410
Publication 1
percentage of recovery, either directly or by comparing it to another compound, which only

goes through the derivatisation step and the analysis. In the first case the recoveries vary
between 62% and 88%, according to the spiking level, whereas in the second case the
recoveries are improved up to 75% - 103%. This highlights the importance of the way of
evaluating the recoveries.
Internal standards and native compounds should have the same behaviour else, internal
standards will not compensate the native compounds losses. That is why, the internal
standards extraction recoveries are also evaluated [21,46].
Usually, when the recoveries of some compounds are lower than 20%, then these compounds
are excluded from the analytical method [46] or their results are reported as "estimates".
IV.2. Losses during handling

Some compounds such as naphthalene (PAHs) or caffeine (PPCPs) are very volatile and can
be easily lost during the step of evaporation / reconcentration, if this step is too long or too
sharp. Other molecules can be degraded by the heat required during this step. It is for example
the case of penicillin G, which is degraded at 75°C and at low pH [50]. Furlong et al., [21]
recommend not to exceed the temperature or the pressure required during the reconcentration
step, as it can negatively affect the handling yields. For other compounds such as the
antibiotics fluoroquinolones or tetracyclines, the fact of reaching dryness can cause the loss of
these compounds. Indeed, the ciprofloxacin and its internal standard, ciprofloxacin-13C3-
15N, recoveries decrease proportionally from 56% and 47% to 9% and 8% respectively with
the increase of dryness level whereas the recoveries of sulfamethoxazole and
sulfamethoxazole-13C6 are not affected. Their recoveries vary only from 70% and 69% to
67% and 64% respectively. Again, Furlong et al., [21] recommend not to reduce the final
extract below 100 µL, otherwise this can negatively affect the handling recoveries. However,
the addition of an adapted internal standard, i.e. with an exactly similar behaviour, can
compensate these losses as illustrated by ciprofloxacin and ciprofloxacin-13C3-15N and
sulfamethoxazole and sulfamethoxazole-13C6.
The breakthrough volume, which defines the maximum volume that can be reconcentrated by
SPE without affecting the extraction recoveries, is also a source of loss of compounds. As
illustrated in Figure 4 (top), the extraction recoveries of atenol-d7 and of paracetamol-d4 are
highly decreased when the volume of water passed through the SPE increases, whereas those
of propranolol-d7 and diazepam-d5 are almost unchanged.
The effects of breakthrough volume can also be compensated by adding the internal standard
corresponding exactly to the compound of interest. For instance, the atenolol extraction
recoveries evaluated according to atenolol-d7 are always around 100% (Figure 4 bottom)
whatever the percolated volume of water is, whereas it decreases strongly when calculated by
external calibration. This is also true in case of a measurement made with an inappropriate
internal standard (for example paracetamol compared to diazepam-d5). However, in the
extreme situations, the internal standard can sometimes not exactly act as the stable isotope,
causing an over-evaluation of the recovery (,Figure 4 bottom, 1500 mL).
To conclude on these two cases (evaporation and breakthrough volume), the loss of
compounds can only be compensated by adding an internal standard behaving exactly like the
targeted molecule. The isotopic analogues of the studied compounds are the preferred choice
[21]. However, in case when labelled isotopes do not exist, it is important to study these
phenomena to understand their impact on the molecules of interest. Once the limits of the
411
Publication 1
protocol have been established, it is necessary to make sure not to exceed them, in order to
optimize the extraction recoveries, even for the compounds without an isotopic analogue.
effet du volum e de fuite sur les rendem ents d'extraction effet du volum e de fuite sur les rendem ents d'extraction
(rendem ents calculés par étalonnage externe) (rendem ents calculés par rapport à un étalon d'injection,
im ipram ine-d4)
atenolol-d7 propranolol-d7
paracetamol-d4 diazepam-d5
125
100
recovery (%)
100
recovery (%)
75 75
50 50
25 25
0 0
(quantification 5 ml 100 ml 200 ml 300 ml (quantification 100 ml 500 ml 1500 ml
method (n=1) (n=2) (n=2) (n=2) method accuracy (n=3) (n=3) (n=3)
accuracy n=2) n=3)
com paraison des rendem ents d'extraction du paracétam ol quantifié
com paraison des rendem ents d'extraction de l'atenolol quantifiés par
percolated w ater volum e (quality assurance) percolated
par rapport w
à 2ater volum
étalons e (quality
internes assurance)
différents
etalonnage interne ou externe
paracetamol / diazepam-d5 paracetamol / paracetamol-d4

external calibration internal calibration (atenolol/atenolol-d7)
175
100 150
recovery (%)
125
recovery (%)
75
100
50 75
50
25 25
0 0
(quantification 100 ml 200 ml 300 ml (quantification 100 ml 500 ml 1500 ml
method accuracy method accuracy (n=3) (n=3) (n=3)
n=2) n=3)
percolated w ater volum e (quality assurance) percolated w ater volum e (quality assurance)
Figure 4: Impact of the breakthrough volume on the recovery (top) and its compensation via the addition
of the appropriate internal standard versus external calibration for the atenolol (left), or versus the
calibration by an inappropriate internal standard for paracetamol (right) (bottom)
-blockers: SPE on Oasis HLB cartridges and analyse in esi+ with LC/MS/MS, RRLC Agilent 1200 series and MS/MS 6410 QQQ; others
medicaments: SPE on Oasis MCX cartridges and analyse in esi+ with LC/MS/MS, RRLC Agilent 1200 series and MS/MS 6410 QQQ
IV.3. Losses due to inappropriate protocol

Some parameters such as the pH, are well known to influence the extraction recoveries. In
order to get optimal extraction conditions, it is important to study its effect on water spiked
with the targeted molecules. But other elements can interfere with the recovery rate, such as
the presence of chlorine or of divalent cations, such as calcium or magnesium. The addition of
ethylene-diamino-tetra-acetic acid (EDTA), a chelator of these divalent ions, allows to
improve significantly the extraction recoveries of antibiotics, such as the tetracyclines or the
fluoroquinolones (Figure 5 top) by avoiding their irreversible binding to such ions or onto
glass surface. The addition of EDTA in a water with a pH stabilized at 7 makes it decrease
down to 5, but as shown in Figure 5, the optimization of the extraction yields of these
antibiotics is not linked to this change in pH, but to the addition of EDTA.
In presence of chlorinated water, it is recommended to neutralize this disinfecting agent,

because it can degrade the organic compounds. In the US EPA method 525.2 [22] for the
quantification of PAHs, PCBs, phtalates and some pesticides, addition of sodium sulfite is
recommended. So are doing Boyd et al., [46] for the quantification of PPCPs. On the other
hand, in method 527 [39] for the quantification of some pesticides and brominated flame
retardants, the US EPA recommends the addition of ascorbic acid, because the other reducing
agents degrade the targeted compounds. Ye et al., [3] also use ascorbic acid addition to
prevent degradation by chlorine of EDCs such as BPA and antibiotics. Finally, in method
412
Publication 1
1694 [37] for the quantification of PPCPs, the US EPA recommends the addition of sodium
thiosulfate, and same recommendation is made by Quintana et al., [16] for the quantification
of some pesticides.
The optimisation of extraction recoveries when sodium thiosulfate is added is highlighted in
Figure 5 (bottom). The extraction yields of diclofenac-d4, paracetamol-d4 and gemfibrozil-d6
are null in chlorinated waters, and are clearly improved by addition of sodium thiosulfate,
reaching almost equivalent values to those obtained in reference water. On the contrary,
extraction recoveries of diazeapm-d5 and of ibuprofene-d3 do not vary for the three
conditions, indicating that diazepam and ibuprofen are not impacted by the presence of
chlorine. Thiosulfate has nodeeffect
effet on the
l'ajout d'EDTA surimprovement of their de
les rendem ents d'extraction recoveries
certains in this case.
antibiotiques
tetracycline oxytetracycline ciprofloxacin ofloxacin
150
125
recovery (%)
100
75
50
25 effet du thiosulfate sur la neutralisation du chlore sur
0 les rendements d'extraction
(quantification pH 5 pH 7 + EDTA pH 7
method accuracy)
tested condition (quality assurance)
diclofenac-d4 ibuprofene-d3
100 paracetamol-d4 diazepam-d5
recovery (%)
gemfibrozil-d6
75
50
25
0
reference water (n=3) chlorinated water chlorinated water +
water type thiosulfate
Figure 5: Improvement of the recovery of tetracycline and fluoroquinolones antibiotics by adding EDTA
in spiked water samples (top) and improvement of the recovery of some others pharmaceutical
compounds by the addition of sodium thiosulfate in chlorinated water, in comparison to the reference
water spiked with the internal standards (bottom)
Top: SPE on Oasis HLB cartridges + analyse with LC/MS/MS, RRLC Agilent 1200 series and MS/MS Agilent 6410 QQQ
Bottom: SPE on Oasis MCX + analyse with LC/MS/MS, RRLC Agilent 1200 series and MS/MS Agilent 6410 QQQ
IV.4. Analytical losses

If the presence of chromatographic interferences can produce false positive results, they can
also mask compounds of interest. This can be highlighted if the peak of a compound is
distorted in a spiked water sample compared to the peak of the same compound in a standard
solution. In this case, the interfering compound prevents the correct integration of the
compounds and a correct quantification. As for false positives, the solution recommended in
this case is either to change the chromatographic gradient, in order to move the retention time
of both substances, or to switch to another analytical technique, such as GC/MS/MS or
LC/MS/MS, when possible.
413
Publication 1
V. Confidence in the published results

If contaminants are detected in samples without exactly fulfilling all the criteria of method
validity, either because their extraction recoveries are not good enough, or because the LODs
are too high, or because they are detected in the blanks, it is difficult to claim that they are
indeed present and to give a concentration level. But, they cannot be neglected. In order to
make decisions in these zones of uncertainty, criteria of validity of a method need to be
established. For example, the results presented by some authors like Focazio et al., [28] can
be trustworthy, since they specify that for each treated sample series, they have analysed in
parallel, blanks, spiked pure water and spiked samples, but they have also duplicated some
samples in order to evaluate the extraction recoveries, the problems of matrix effect, the
reproducibility and the laboratory contamination. Moreover, they have added internal
standards to their samples which allow to estimate the method performances. All these
precautions, when detailed, allow to have confidence in the published results. In their review,
Hao et al., [48] confirm the necessity to have at least three minimal quality control parameters
(method blank, method spike and reagent blank) to have confidence in results. They reviewed
the quality control parameters of forty-four publications and conclude that only three of them
specify these three criteria. Otherwise, analysing the same sample using various methods and
different analytical techniques is another way to be sure of the presence and concentration of a
compound [5,28].
Apart from the validation parameters of the analytical method and the respect of the quality
principles, such as the blanks and the spikes treated in parallel with the environmental
samples, another factor can also modify the results: the preservation of the samples
themselves. Although the authors are aware of the crucial importance of this factor towards
the results, they have chosen not to discuss this subject here, since it does not strictly concern
the analytical field. Nevertheless, they underline that storage and preservation conditions
should not be neglected to make sure of the validity of the results and avoid false negative
results (samples kept in darkness, at 4°C or -20°C, with or without the addition of a
preservative such as formaldehyde or methanol, time of conservation between the sampling
and the treatment and between the extraction and the analysis). Conversely, when compounds
resulting from a reaction of degradation are being studied, like the nonylphenol for example
(APEOs bacterial degradation by-product), the concentrations could be higher if the sample
has been badly preserved.
Conclusion
Seen from a distance, working with drinking and ground waters can appear an easy task,
because matrix effects at the analytical level are weak, and there are few risks, for example, of
plugging the SPE cartridges. However, many other constraints make it very difficult to
produce reliable measurements. Table 5 summarizes problems and solutions of such analysis
coming from the literature review and from our own experience feedback.
414
Publication 1
Table 5: Probems encountered during trace level analysis and their solutions.
problems solutions
Analytical performance Use new (recent) analytical systems
e.g: LC/MS(/MS), GC/MS(/MS), on line SPE LC/MS/MS
Identification Use several criteria (two transitions in MRM mode,...)
And for the future generalize the use high resolution mass
spectrometer
e.g: LC/TOF, GC/TOF, LC/MSn
Pollution
linked to technician Wear lab coat, gloves and mask, select technician in relation with
targeted compounds (e.g: smoker or not)
linked to equipment Dedicate glassware, use adapted detergents for cleaning, bake
glassware, chose materiel in relation with targeted compounds (e.g:
glass bottles for BPA analysis)
linked to reagent Use high purity and quality standards, gases and solvents (e.g: HPLC
grade, ultrapure water)
linked to working environment Dedicate rooms, hoods and laboratory equipment in relation with the
sample level of contamination (e.g: water from STP or drinking
water)
Losses
due to degradation Prevent photodegradation (e.g: glass amber bottles)
due to adsorption Use plastic or glass bottle depending on molecules looked for
due to chlorine Use sodium thisulfate, sodium sulfite or ascorbic acid
due to cations Use EDTA
due to breakthrough volume Use isotopic analogues as internal standards (e.g: 13C, 15
N or
deuterated)
due to evaporation Avoid dryness and use labelled isotopes
Interferences
Analytical Change chromatographic gradient, use different analytical system
(e.g: LC/MS/MS and GC/MS/MS), use different mode (e.g: SIM and
MRM)
Experimental Increase sample volume
The biggest constraint for ultra trace analysis consists in avoiding risks of external
contamination. One could notice that from sampling to analysis, many sources of pollution
exist such as glassware, solvents, ambient air, technicians, experimental equipment or
measurement device. In order to produce trustworthy results, it is of primary importance to
prepare several blanks all along the handling of the samples and to be ready to criticize the
obtained results. Moreover, due to the very low level of contamination looked for, it is very
important to make sure that there is no loss of the analytes during the treatment process. It is
of equal importance to prepare spiked waters not only during the methodological
development, but also in parallel with each series of analyses, in order to evaluate the
recovery rates. Besides, the sensitivity of the developed method is a key element to carry out
successfully such analyses. Instruments, such as mass spectrometers, simple or in tandem,
allow to reach detection limits in the nanogram per liter range, but such analytical
performances are uninteresting if the sample handling is not surrounded by safeguards. In
conclusion, it appears from the bibliographic synthesis and from our own observations that
particular precautions must be taken when analysing organic pollutants present at trace level
in ground and drinking waters. The following list summarizes these precautions:
 Four identification points (retention time, one ionic signal for quantification and
another one for confirmation, the ratio between them)
 Standards, reagents, gases, solvents and water of high quality and purity
415
Publication 1
 Appropriate internal standards

 Field, laboratory, reagent and injection blanks
 Spiked waters at relevant concentration (ng/L)
 Glassware, equipment, rooms and hoods dedicated to traces analysis
 Careful cleaning (appropriate detergent and calcination) and equipment maintenance
 Wear lab coat, gloves and mask
 Avoid smoking, drinking coffee, wearing perfumes, dermatological cream and
others everyday cosmetics when targeted compounds enter into their composition
 Keep a critical eye on the results (e.g: sample concentrations in parallel with blanks
one)
Finally, inspired by the precautions exposed by Barnes et al., [5] when reporting the results of
their study on groundwaters in United States (< RL, UC, nd), we propose on Table 6 a way of
reporting the data as a function of the quality criteria they meet.
Table 6: How to report a value depending of the analytical criteria fulfilment (RT: retention time, MQL:
method quantification limit, R: extraction recovery, TRUE: identification and quantification certified,
FALSE: no compound, ESTIMATED: identification sure but quantification uncertain, DETECTED:
identification sure but no quantification possible)
ratio isotope label
n° RT signal (1) signal (2) MQL R (%) blank action  values
1/2 compound
1     > > 30 0 yes TRUE
2     > > 30 0 no accuracy ok in spiked environmental sample  TRUE
3     > > 30 ≠0 yes / no [sample]° >> [blank]°  TRUE
4     > > 30 ≠0 yes / no [sample]° ~ [blank]°  increase sample volume, change
material, change analytical instrument, remove isotope
label compound, etc  cf n° 3 else  FALSE
5     > < 30 0 yes / no ESTIMATED
6     < > 30 0 yes / no DETECTED
7     > > 30 0 yes / no FALSE
8    ~1 > > 30 0 yes / no FALSE
9    >> 1 > > 30 0 yes / no doubt  depend of compound, context, … confirmation
thanks to new analytical technique like MS high
resolution (MSn, TOF)
10     > > 30 0 yes / no duplicate sample and spike one  one amplified signal
at RT  TRUE else, 2 signal at different RT  FALSE
Acknowledgements
This work was supported by the EFBW (European Federation of Bottled Waters).
“Aquitaine Région” is also acknowledged for financial support in relation with analytical
equipment.
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417
418
Publication 2
Publication 2 : Development of a method for the simultaneous

extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals
by solid-phase extraction followed by liquid chromatography
tandem mass spectrometry analysis – application to sewage
treatment plant effluents
CAPDEVILLE M.J.1, PARDON P.1, MIEGE C.2, COQUERY M.2 AND BUDZINSKI H.1*
1
France
2
CEMAGREF, UR MALY, 3 bis quai Chauveau – CP220, F-69336 Lyon Cedex 09, France
Tel.: + 33 (0)5 40 00 69 98
Fax: + 33 (0)5 40 00 22 67
A soumettre dans Journal of Chromatography A
Abstract
A protocol for the simultaneous quantification of 21 antibiotics belonging to 9 families, 5
antineoplastics, 2 -blockers and 2 antivirals in water has been developed. The first step was
dedicated to the definition of SPE extraction parameters: type of the sorbent phase in
cartridges, pH and sample conditioning, elution solvent, … The second step was dedicated to
the optimization of the analytical parameters, both chromatographic and mass spectrometry
ones. Finally the developed method combines one single extraction step on Oasis HLB
cartridges and a rapid resolution liquid chromatography tandem mass spectrometry
(RRLC/MS/MS) analytical method with electrospray ionisation and a 5 cm length C 18
column. Before extraction, samples are conditioned with Na 2-EDTA and final pH is around 5.
SPE elution solvent is a mineral water/acetonitrile mixture (40/60, v/v). Chromatographic
mobile phases are water and acetonitrile (ACN) with 0.3 % formic acid in each phase in
positive ionization mode (ESI+) and with 0.1 % acetic acid in each phase in negative
ionization mode (ESI-). Analytical run time is 21 minutes in ESI+ and 18 minutes in ESI-.
The intra-day variability of the analytical method presented here was less than 15% and the
inter-day variability in ESI+ mode and ESI- mode was respectively about 24% and 19%. The
mean accuracy of the method was 97%. The instrumental detection limits varied between 2
and 28 pg injected and the limits of detection for the entire protocol varied from less than 5
ng/L up to 100 ng/L. The matrix effect issues like the variation in the retention time or the
signal suppression were investigated. Once the entire protocol was validated, it was then
applied to real environmental samples to prove its applicability. Due to the origin of
pharmaceuticals in aquatic systems, analyses were done on 10 effluents from various sewage
treatment plants using different treatment processes. The most often found compounds were
clarithromycin, erythromycin, ofloxacin, trimethoprim and propranolol (more than 9 out of 10
times) and the most abundant ones were ofloxacin, clarithromycin, ciprofloxacin and
roxithromycin (maximum concentrations > 400 ng/L). The 2 anti-HIV were frequently
detected and maximum concentrations were respectively 142 ng/L and 134 ng/L for
zidovudine and ritonavir.
419
Publication 2
Introduction
Despite pharmaceuticals belong to the emerging contaminant class due to their recent
consideration in environmental research, they are now well known micro-pollutants of land
and aquatic ecosystems (Daughton and Ternes, 1999; Kümmerer, 2009). They are widespread
and found in every compartment: surface and drinking water (Togola et Budzinski, 2007;
Mompelat et al., 2009), groundwater (Avisar et al., 2009; Barnes et al., 2008), soil and
sediment (Thiele-Bruhn, 2003). These compounds mainly enter into the environment via
sewage treatment plant (SWTP) effluents (human origin) or via runoff of land fertilized by
sludges from SWTP or manures from live stock (veterinary origin) (Halling-Sørensen et al.,
1998; Mompelat et al., 2009). In nature, they can be found in different forms (parent
compounds, conjugated compounds, metabolites and less frequently precursors) depending on
3 major factors: origin (e.g. manufacturing process from pharmaceutical industries, manure,
…), metabolism (released unchanged or metabolized depending the compound and
physiology) and degradation (e.g. by-products compounds or conjugated compounds which
could be transformed back to the parent form due to the degradation). Human and veterinary
pharmaceuticals are, most of the time, excreted unchanged (Table 1). For example, 80% of
ofloxacin (Vidal dictionary, 2006) and 80% to 90% of amoxicillin (Hirsch et al., 1999; Vidal
dictionary, 2006) are excreted as parent compound. However, depending on the data sources,
some contradictions can be found. As example, for Hirsch and his colleagues (1999) up to
60% of the administered dose of erythromycin is not metabolized, whereas for Mompelat and
his colleagues (2009), only 5% to 10% of erythromycin is excreted as parent compounds, so it
remains some uncertainties about the forms of the release. Nevertheless, when they are
released as parent compounds they keep all their pharmacological properties. Moreover, in the
case of a human origin, their removal in SWTP is different from one molecule to another one.
For example (Table 1), erythromycin is not degraded (Castiglioni et al., 2006) whereas
propranolol is removed at 96 % for Ternes (1998) but only at 32 % for Bendz et al. (2005). In
consequence, pharmaceuticals either as unchanged form either as transformed one are still
biologically active when they are discharge into the environment. This issue motivates studies
to document and understand the sanitary and environmental risks they could represent. There
is still lack of knowledge regarding their discharge and presence.
Moreover, when considering the large number of compounds to deal with (more than 3000,
AFSSA) it is not possible to analyze all of them. Because of the large diversity of molecules
belonging to the pharmaceutical group, it is necessary to pick up some compounds as
reference or tracers for each of the therapeutic classes. As example, Sacher et al. (2001)
worked on 60 molecules belonging to 12 therapeutic classes but they analyzed them with 6
different methods which is very time consuming. Indeed, because of the large variability of
the physico-chemical properties of molecules belonging to the different classes, it is not
possible to monitor every therapeutic class at the same time. Numerous studies deal with 1
therapeutic class (eg.: Tamtam et al. (2008) have studied antibiotics, Catastini et al. (2008)
have studied antineoplastics or Prasse et al. (2010) have studied antivirals) or combine 2
therapeutic classes (eg.: Piram et al. (2008) have studies -blockers and corticosteroids and
have used one single extraction step but 2 different analytical methods). Recent studies,
named “multi-residues” studies, deal with various therapeutic classes and analyse all the
compounds selected in the different classes at the same time with only one methodology. For
example, Gomez et al. (2006) worked on 16 molecules belonging to 7 different classes,
Togola and Budzinski (2008) worked on 17 molecules belonging to 7 different classes and
Gros et al. (2009) worked on 73 molecules belonging to 12 different classes.
The study presented here is also a multi-residues study. We first selected 4 classes of
compounds: antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals. The antineoplastics, used to
420
Publication 2
cure cancer, and antivirals, used to fight HIV infection in the present selection, were chosen
because they comprise numerous potentially toxic compounds. The -blockers, employed in
the treatment of hypertension, tachycardia, heart trouble and migraine, were selected because
they could represent a threat for the aquatic wildlife. Indeed, within the context of AMPERES
project, the ratio PEC/PNEC (i.e., predicted environmental concentration / predicted non
effect concentration) for the propranolol, for example, was found in the range or above 1,
showing a possible environmental risk in 4 on 15 receiving rivers located just downstream
SWTP (Maurepas, Maldroit, Bouillide and Ardières rivers, France) (Gabet, 2009). The
antibiotics, prescribed to treat disease linked to bacteria infection, were chosen because of
their direct influence on the natural microbiota and the selection of resistant strains. For all
these classes, based on the consumption data (AFSSAPS, 2009a; AFSSAPS, 2009b; Besse
and Garric, 2007; IMS-health com. pers.), the toxicity and ecotoxicity data (Holten Lützhøft
et al., 1999; Halling-Sorensen et al., 2000; Jjemba, 2006; Fent et al., 2006) as well as the
literature ones (Table 1) for quantification of already detected compounds and the degradation
processes in environment, 21 antibiotics belonging to 9 families (-lactams penicillins, P; -
lactams cephalosporins, C; macrolides, M; lincosamides, L; fluoroquinolones, FQ;
quinolones, Q; tetracyclines, TC, sulfonamides, S and phenicols, Ph), 2 -blockers, 5
antineoplastics and 2 antivirals were chosen. Compare to others studies already published, the
originality of our study is : i) the integration of anti-HIV because to our knowledge it is the
first time that anti-HIV antivirals were included in a multi-class analysis, and ii) the great
number of antibiotic families selected (9). Usually, only 3 or 4 antibiotic families are chosen
and most of the time, it is macrolids, fluoroquinolones and sulfonamids. It is really scarce that
penicillins, cephalosporins and lincosamides are included in a multi-classes study.
The origin of the pharmaceuticals in the environment implies that they represent a chronic
contamination at trace levels that means that they are continually released in the aquatic
system but at low concentrations. Due to those low concentrations, the analytical
methodology should be specific and sensitive enough to be able to quantify them in the ng/L
range (Table 1). The liquid or gas chromatography-tandem mass spectrometry coupled to
extraction enrichisment methodologies are the appropriate systems to fulfil this requirement
as it is mentioned in several review articles (Ternes, 2001; Petrovic et al., 2005; Seifrtová et
al., 2009; Richardson, 2009). We report here the optimization of extraction procedure in
combination with LC/MS/MS final analytical step allowing the detection and quantification
of 30 pharmaceuticals belonging to various classes in waste waters. One of the aims of this
development was to extract all the 30 compounds in a single step. The methodology selected
for that purpose was SPE. The process was optimized through several preliminary
experiments involving the choice of the sorbent, the elution conditions, the addition of a
chelating agent (Na2-EDTA), the pH value of the sample, the break through volume, the
evaporation level during the concentration step and the solvent used to dissolve the residue
after the drying step. LC/MS/MS analytical conditions were also optimized. Chromatographic
parameters like mobile phases solvents, flow and gradient as well as spectrometric parameters
like ionization mode, MRM transitions, fragmentor and collision energies to get them were
developed for that purpose. The developed method was then applied to treated water from
various SWTP using different treatment processes.
421
Publication 2
Table 1: General information of the 30 studied pharmaceuticals (Ab: antibiotic, -b: -blocker, Ac:
anticancer, Av: antiviral).
elimination in dissolved
excretion phase of SWTP effluents
1 consumption28 consumption3 min - max
class compounds M pK A1 Log Kow 1
Koc 1 1
Solubility unchanged (%)
(kg, 2004) (unit, 2008)
(%) SWTP
winter summer surface water
effluent
Ab P amoxicillin 365.4 2.44 ± 0.5 0.61 ± 0.3 1 620 333,223.22 48,969,337 80 2 49 – 100 22 100 22 14
5 - 120 8
6.90 ± 0.3 90 28
Ab P ampicillin 349.4 2.44 ± 0.5 1.35 ± 0.3 1 630 115,761 mostly2 11 15
48 9
6.76 ± 0.8
Ab P oxacillin 401.44 -2.90 ± 0.5 2.05 ± 0.3 1 88000 1,425,664 40 4 10 15
2.44 ± 0.5
Ab P penicillin G 334.39 -1.32 ± 0.6 1.67 ± 0.2 1 300000 83,646 50 – 70 4 1680 16 350 16
2.45 ± 0.5
Ab P penicillin V 350.39 -1.68 ± 0.6 1.88 ± 0.3 1 180000 853,557 40 4
2.44 ± 0.5
Ab cefpodoxime 557.6 2.77 ± 0.5 2.17 ± 0.9 1 90000 9,283.12 12,113,131 80 2, 28
C proxetil 2.90 ± 0.5
Ab clarithromycin 747.95 8.16 ± 0.7 3.16 ± 0.8 82 2200 15,104.87 4,355,236 60 4 0 – 24 22 0 22 8 8 - 359 32 1 24 - 260 4
M 13.08 ± 0.7 30 28
Ab erythromycin 733.93 8.16 ± 0.7 2.83 ± 0.8 54.2 2800 282,481 60 4, 25 5 0 22 0 22 9 8 - 6000 4 4 24 - 1700 4
M 13.09 ± 0.7 100 28
Ab roxithromycin 837.1 3,404.15 1,625,050 50 2, 28 36 32 - 1000 4 4 24 - 560 4
M 60 4
Ab L lincomycin 406.54 8.78 ± 0.6 0.91 ± 0.7 1.28 24000 7,854 0 22 0 22 11 8 - 846 8 14 25 - 730 18
12.91 ± 0.7
Ab ciprofloxacin 331.34 6.03 ± 0.7 1.31 ± 0.8 1 700 12,185.99 2,046,960 33 6 45 - 78 22 53 - 69 22 27 8 - 514 8 9 24 - 72 26
FQ 8.38 ± 0.3 70 23, 50 28
Ab ofloxacin 361.37 5.23 ± 0.4 1.61 ± 0.8 1.4 230 4,137.22 2,114,997 80 2, 6, 70 7 0 - 62 22 33 - 66 22 10 6 - 1081 8 5 24 - 306 14
FQ 7.39 ± 0.4 65 – 98.5 28
Ab oxolinic acid 261.23 -2.04 ± 0.4 0.94 ± 0.8 6.17 11000 19 17
Q 5.93 ± 0.2
Ab flumequin 261.25 -1.95 ± 0.6 2.42 ± 0.8 24.9 3100 30,643 10 2, 28 32 17
Q 5.72 ± 0.4
Ab tetracycline 444.43 4.50 ± 1 -1.47 ± 0.8 1 4100 80 – 90 4 50 32 - 850 32 50 18 - 110 19
09
TC 11.02 ± 0.7
Ab oxytetracycline 460.43 4.50 ± 1 -1.50 ± 0.8 1 5100 mostly2 440 20 70 19 - 1340 19
TC 10.80 ± 0.7 80 4
Ab chlortetracycline 478.88 4.50 ± 1 -0.33 ± 0.8 1 1100 70 4 50 18 - 150 19
TC 11.01 ± 0.7
Ab doxycycline 444.43 4.50 ± 1 -0.54 ± 0.8 1 980 6,242.93 3,048,806 mostly2
TC 10.84 ± 0.7 70 4, 72 28
Ab S sulfamethoxazole 253.28 1.39 ± 0.1 0.89 ± 0.4 5.07 6100 16,729.85 2,055,592 15 2, 4, 7, 40 28 0 – 84 22 71 22 18 32 - 2000 4 4 24 - 1900 18
5.81 ± 0.5 15 – 20 5
Ab S trimethoprim 290.32 7.20 ± 0.1 0.79 ± 0.4 24.8 1100 3,345.97 2,055,592 60 4, 50 28 20 21 - 660 4 0.6 25 - 710 18
49 10
40 - 60 5
Ab chloramphenicol 323.13 -1.73 ± 0.7 1.08 ± 0.4 85.2 230 5 - 10 4 560 4 60 4 - 355 27
Ph 11.03 ± 0.5
-b metoprolol 267.36 9.17 ± 0.4 1.79 ± 0.4 1.69 120000 8,785.82 2,013,633 5 2, 28
83 11
10 32 - 2200 11
13.89 ± 0.2 5 - 10 5
11 6
3 - 10 6
-b propranolol 259.34 9.14 ± 0.4 3.10 ± 0.3 9.23 10000 12,486.55 4,583,310 3 - 4 2, 28 96 7, 11 10 21 - 1900 29 590 11
13.84 ± 0.2 1 7, 10 29 32 10
Ac daunorubicin 527.52 7.39 ± 0.6 3.17 ± 0.9 16.7 5.8 0.77 3 13- 15 13
8.68 -+ 0.7
Ac doxorubicin 543.52 7.35 ± 0.6 3.07 ± 0.9 14.3 6.5 7.94 7 mostly
8.68 ± 0.7 10 28
Ac epirubicin 543.52 7.35 ± 0.6 3.07 ± 0.9 14.3 6.5 18.80 11 13
8.68 ± 0.7
Ac cyclophosphamide 261.09 2.84 ± 0.2 0.23 ± 0.4 31.7 86000 281.84 23,558 20 12, 25 28 Low 12 0.6 14 - 20 11 10 30
Ac ifosfamide 261.09 1.45 ± 0.2 0.23 ± 0.36 31.7 86000 121.38 10 - 40 31 13 10 31 - 2900 11
0
12 – 68 28
Av zidovudine 267.2 132,379 < 20 2
Av ritonavir 720.94 3.48 ± 0.5 5.28 ± 0.9 17700 3.7 227,846 86 2
11.47 ± 0.5
1
: calculated by SciFinder ACD/Labs ( M: molecular weight g/mol; log Kow at 25°C ; Koc at pH 7 and 25°C ; solubility at at pH 7 and 25°C mg/L)
2 3 4 5
: http://vidalpro.net/monographie/fiches : IMS-Health : Hirsch et al., 1999 : Huschek et al., 2004
6 7 8 9
: Vieno et al., 2006 : Ferrari et al., 2004 : Castiglioni et al., 2005 : Halling-Sorensen et al., 1998
10 11 12 13
: Bendz et al., 2005 : Ternes, 1998 : Steger-Hartmann et al., 1997 : Manik et al., 2007
14 15 16 17
: Zuccato et al., 2005 : Cha et al., 2006 : Li et al., 2007 : Tamtam et al., 2008
18 19 20 21
: Kolpin et al., 2002 : Lindsey et al., 2001 : Gagné et al., 2006 : Andreozzi et la., 2003
22 23 24 25
: Castiglioni et al., 2006 : Jjemba, 2006 : Christian et al., 2003 : Hao et al., 2006
26 27 28 29
: Nageswara-Rao et al., 2008 : Boxall, 2004 : Besse et Garric, 2007 : Huggett et al., 2003
30 31 32
: Pomati et al., 2006 : Kümmer et al., 1997 : Miege et al., 2009
422
Publication 2
VI. Experimental
VI.1. Chemicals and materials
Amoxicillin, ampicillin, oxacillin, penicillin G, penicillin V, erythromycin, roxithromycin,
tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline, oxolinic acid, flumequin,
ciprofloxacin, ofloxacin, sulfamethoxazole, trimethoprim, lincomycine, chloramphenicol
metoprolol, propranolol and cyclophosphamide were purchased from Sigma-Aldrich (Saint
Quentin Fallavier, France). Cefpodoxime, clarithromycin, daunorubicin, doxorubicin,
epirubicin, ifosfamide, ritonavir and zidovudine were purchased from LGC Standards
(Molsheim, France). The internal standards erythromycin-13C2, ciprofloxacin-13C2-15N and
sulfamethoxazole-13C6 were also purchased from LGC Standards. Individual stock solutions
were prepared in acetonitrile (100 µg/mL) and stored in the dark at -20°C.
The solvents used for the experimentations and the analyses were methanol (MeOH, Merck
Lichrosolv, gradient grade for LC (VWR, Strasbourg, France)), acetonitrile (ACN, Baker,
ultra gradient HPLC grade (Atlantic labo, Bruges, France)), ultrapure water (milliQ,
Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France) and natural mineral water (NMW, Vittel,
Nestlé (France Boissons, Lormont, France)). The reagents used for this study were acetic acid
glacial (CH3COOH, Sharlau, HPLc grade (Atlantic labo)), formic acid (HCOOH, Baker
analyzed, 98% purity (Atlantic labo)), hydrochloric acid (HCl, Baker analyzed reagent, 36.5-
38% purity (Atlantic labo)), sodium hydroxide (NaOH, VWR BDH Prolabo, normapur 97%
purity (VWR)) and ethylene-diamine-tetra-acetic acid dihydrate-disodium salt (Na2-
EDTA.2H2O, Sigma Ultra, 99% purity (Sigma-Aldrich)). The cartridges used were Oasis
HLB (Waters, 200 mg, 6 cc (Waters, Saint Quentin en Yvelines, France)), Isolute ENV+
(Envichrom, Supelco, 500 mg, 6 cc (Sigma-Aldrich)) and StrataX (Phenomenex, 200 mg, 6 cc
(Phenomenex, Le Pecq, france)). The filters used were 0.7 µm glass fiber filter (GF/F,
Whatmann (Fisher Bioblock Scientific, Illkirch Graffens, France)) and 1.6 µm glass fiber
filter (GF/A, Whatmann (Fisher Bioblock Scientific)).
All the glassware was washed with osmosis water and then baked at 450°C overnight before
use. The glass fiber filters were also baked at 450°C overnight before use.
VI.2. Sample extraction

The tests were practiced on natural mineral water (NMW, Vittel), free from our selected
compounds, spiked with a mixture solution of all the 30 pharmaceuticals to quantify the
extraction efficiency. The final SPE protocol was as follows: 200 mL of water sample were
adjusted to pH 7 with solutions of chlorhydric acid (0.33 M) or sodium hydroxide (1 M), then
8.3 mL of a 250 mM Na2-EDTA solution were added which brought the pH of the sample
between 4 and 5. Then, Oasis HLB (200 mg, 6 mL) cartridges were conditioned with 5 mL of
ACN, followed by 5 mL of pH 7 NMW; the samples were loaded on the cartridges; the bottle
carrying the sample was washed with 5 mL of pH 7 NMW and these 5 mL were passed
trough the cartridges too. The cartridges were then dried for one hour under vacuum and the
contaminants were eluted with a 5 mL mixture of pH 7 NMW/ACN (40/60, v/v). Finally the
extracts were evaporated at 40°C to near dryness under a nitrogen stream to concentrate the
analytes and transferred into 1.5 mL vials with 300 µL inserts. The extracts were stored at -
20°C until the day of the analysis. Before the analysis, they were dried again in the same
conditions to evaporate the droplets of ACN and the residues were dissolved into more or less
100 µL of a 90/10 (v/v) ultrapure water/ACN mixture.
423
Publication 2
VI.3. Liquid chromatography tandem mass spectrometry

After the extraction step, the 30 selected compounds were analyzed by RRLC-ESI-MS/MS
with a Zorbax-SB C18 column (50 x 2.1 mm; 1.8 µm particles). The chromatographic
apparatus was an Agilent (Massy, France) 1200 system and the spectrometer was an Agilent
QQQ 6410 triple quadrupole. The first step of the analytical development was the
optimization of the mass spectrometry parameters: ionization mode (ESI+ or ESI-), capillary
voltage (3 kV), fragmentor and collision energy (individual parameters), drying gas (N 2)
temperature (300°C), flow (11 L/min) and nebulization pressure (30 psi). Once the mass
spectrometry parameters obtained, the chromatographic conditions were also optimised.
Mobile phase A was ultrapure water and the organic solvent chosen for mobile phase B was
acetonitrile. Different additives were tested, in the 2 modes of ionization, for an improvement
of compound separation and resolution in LC and an improvement in the ionization process.
In that way, the addition of formic acid or acetic acid in various proportions was tested. In the
optimized configuration, the mobile phases were 0.3 % formic acid (volume) in ACN and
0.3% formic acid (volume) in ultrapure water in the positive ionization mode and 0.1% acetic
acid (volume) in ACN and 0.1% acetic acid (volume) in ultrapure water in the negative mode.
The chromatographic gradients are given in details in Table 2 and in Table 3.
Table 2: Chromatographic gradient for Table 3: Chromatographic gradient for

compounds analyzed in ESI + (v: volume). compounds analyzed in ESI - (v: volume).
Time H2O + 0.3 % (v) ACN + 0.3 % (v) Time H2O + 0.1 % (v) ACN + 0.1 % (v)
(minutes) HCOOH (%) HCOOH (%) (minutes) CH3COOH (%) CH3COOH (%)
0 90 10 0 90 10
8 30 70 5 52 48
8.5 5 95 5.5 5 95
11.5 5 95 8.5 5 95
12 100 0 9 100 0
15 100 0 12 100 0
15.3 90 10 12.5 90 10
21 90 10 18 90 10
VI.4. Quantification, method validation and quality controls

The method developed and presented here was validated before the first use on real sample
and is still controlled during routine analyses.
After optimization, the instrumental validation parameters such as linearity and range,
accuracy, precision, instrumental detection and quantification limits were documented. The
linearity and range of the analytical procedure were studied and evaluated by series of
dilutions of a stock standard solution mixture of the 30 compounds. The linearity was studied
for all the calibration range and was estimated by 2 different parameters, the correlation
coefficient (R²) and the ratio between peak area and the injected quantity. Precision
corresponded to the intra- and inter-day variabilities. Intra-day repeatability was checked
under the same operating conditions with 3 successive injections of the same standard stock
solution and this was repeated 5 times. Inter-day reproducibility corresponded to the answers
of a sample prepared from the dilution of a same stock solution with ultra-pure water and
injected on different days (n=7). The method accuracy, expressed as a percentage, was
evaluated as the quantification adequacy between theoretical and measured concentration of
samples prepared from various dilutions of a same stock solution with ultra-pure water (30,
424
Publication 2
60 and 300 ng/mL). Only the analytical part was evaluated with this procedure, not the
preparation step. Instrumental detection and quantification limits were determined using a
peak-to-peak signal-to-noise ratio modifying approach. Indeed, as the baseline was adjusted
by the software to 0, those limits were determined only by the height of the chromatographic
peaks of compounds as if the height of the noise was 1. Consequently the detection limit was
estimated to a peak height around 10 and the quantification limit corresponded to a height of
30. The limits of detection and quantification for the entire method were estimated by
applying the whole protocol to mineral water spiked at different levels from 5 ng/L to 100
ng/L. Finally, the matrix effect was evaluated by comparing the answers of spiked SPE
extracts. Two samples of natural mineral water and two samples of the same SWTP water
were extracted using the described SPE protocol. One of the 2 extracts were then spiked with
the mix solution of the 30 molecules and all of the extracts were analyzed by RRLC/MS/MS.
The matrix effect, expressed in percentage, could be calculated by the following equation:
( Amw  ( ASS  Auss )) Amw = the peak area of the mineral water spiked extract
100  matrix effect with Ass = the peak area of the spiked sample extract
Amw Auss = the peak area of the un-spiked sample extract
If the result is positive then the matrix effect corresponds to signal suppression and if the
result is negative then the matrix effect corresponds to an enhancement of the signal.
In order to ensure the quality of sample preparation, in parallel to each real sample extraction
set, blank and spiked NMW samples are added. Both are processed using the same sample
preparation as the real samples. The manipulation blank is used to assess the potential
contamination of real samples during preparation step. The spiked NMW sample is used to
evaluate the extraction recovery. Moreover, to insure the quality of the analytical part, every
injection sequence started with a three times standard sample injection. This standard sample
was used as a control card to evaluate the analytical system response and intra- and inter-day
repeatabilities of the instrument. Blank analytical samples which only contained solvent were
included in each sequence. They were used to monitor for potential injection-to-injection
carryover (cross contamination), as well as instrumental contamination. Furthermore, to
insure identification, each compound was identified using the retention time, 2 transitions and
the ratio between them. Finally, to insure external quantification process, a 6 points
calibration curve was performed and 3 known concentration standard samples were injected at
the beginning of each analytical sequence. Those 3 samples do not have the same
concentration and are used to assess the accuracy. To insure internal quantification process, 2
different mixture solutions of the 30 reference compounds and the 3 internal standards were
injected at the beginning of analytical sequence. The first one is used to define the response
factor between a compound and its internal standard and the second one, to test the accuracy
of the quantification process. External quantification was used for all optimisation tests and
for the first environmental analysis (cf. II.4. Method application). Internal quantification was
used for validation experiments and only for the 3 compounds which have their own internal
standard (erythromycin / erythromycin13C2, ciprofloxacin / ciprofloxacine13C2-15N and
sulfamethoxazole / sulfamethoxazole13C6).
VI.5. Sample collection, preparation and storage before analysis

10 effluents from different SWTP were sampled with automatic samplers equipped with
Teflon pipes and cleaned glass containers. The design features of these SWTP are presented
in Table 4. The 24 h ﬂow proportional composite samples were kept cold and shipped in
425
Publication 2
icebox to the laboratory. They were filtered as soon as they arrived on a 1.6 µm and then on a
0.7 µm glass fiber filters. Once the dissolved and the particulate phases divided, the samples
were frozen and kept at -20°C before extraction. They were sampled for the AMPERES
project and sampling details are provided in Gabet-Giraud et al. (2010).
Table 4: Characteristics of the involved SWTPs.

Design
sample SWTP raw water flow rate
capacity treatment process
identification Code origin (m3/d)
(PE)
activated sludge (C + N + DN) + sand filter + ozonation (10 mg
1 CA PA 1 97,000 urban 4,200
O3/L)
activated sludge (C + N + DN) + high rate chemical settler +
2 SE PA 1 300,000 urban 28,600
sand filter
activated sludge (C + N + DN) + sand filter + microfiltration +
3 SE PA 2 25,000 urban 1,040
reverse osmosis
4 CA 5 88,000 urban 7,150 chemical settling tank + submerged biological aerated filter (C)
5 and 6 CA 6 100 rural 15 vertical reed-bed filter + horizontal reed-bed filter (C+N + DN)
7 SE 4 110,000 urban 14,500 activated sludge (C + N + DN)
8 SE 5 24,000 urban 1,500 membrane bioreactor (C + N + DN)
9 SE 6 26,000 urban 3,950 primary settling tank + submerged biological aerated (C + N)
10 SE 9 1,000 rural 135 trickling filter + reed-bed filter (C + N)
PE = population equivalent (on the basis of 60 g BOD5/PE), C: carbon removal, N : aerobic nitrogen removal
(nitrification), DN: anoxic nitrogen removal (denitrification)
VII. Results
VII.1. Liquid phase chromatography tandem mass spectrometry
(LC/MS/MS) development
The optimization first focused on evaluation of the influence of the mass spectrometry
parameters on the signals. The MRM (Multi Reaction Mode) mode was selected to monitor
the compounds. So every compound was individually injected in a stream of 50/50 ultrapure
water/ACN (V/V) mobile phase to research the precursor ion (ms-scan) and then the product
ions (daughter-scan). Because the ionization of the molecules was performed by electrospray,
the ionization mode was first chosen in order to obtain the precursor ions. Based on data
found in the literature (Sacher et al., 2001; Becker et al., 2004; Dousa et al., 2006; Gros et al.,
2006; Vieno et al., 2006), all the compounds were scanned in positive mode and half of them
were also scanned in the negative mode. The most abundant ion, here the pseudo-molecular
one, was selected as the precursor ion. The negative mode was found more suitable for only 5
compounds: zidovudine, chloramphenicol, penicillin G, penicillin V and oxacilline. In order
to enhance the signal related to the precursor ion, the capillary voltage and the fragmentor
energy were optimized. The collision energy was then adapted to maximize the product ions.
Finally the 2 best transitions in terms of intensity were chosen for quantification and
confirmation and the drying gas flow, the drying gas temperature and the nebuliser gas
pressure were improved in a compromise way for the molecule set to obtain the best signal in
terms of sensitivity and stability. Mass spectrometric parameters for each molecule are given
in Table 5.
Afterwards, developments were focused on chromatographic parameters. The mobile phases

are the most important parameters to be optimized in LC. Because Penicillins react in an non
426
Publication 2
reproducible way with methanol (Brion et al., 1992), acetonitrile was chosen as the organic
solvent (phase B). Moreover, the viscosity of the 50/50 H 2O/ACN mixture is much less
important than the 50/50 H2O/MeOH mixture that is a real advantage for the pressure issue in
liquid chromatography. Once the ultrapure water and the acetonitrile mobile phases selected,
different additives were tested in order to improve chromatographic separation and resolution
as well as ionization. Based on data found in the literature (Becker et al., 2004; Castiglioni et
al., 2005; Gomez et al., 2006; Kasprzyk-Hordern et al., 2007), 2 additives, formic acid and
acetic acid, at different proportions were added to those solvents. To get a better resolution,
especially for tetracyclines, quinolones and fluoroquinolones, the optimization has led to 0.3
% formic acid in acetonitrile phase B and 0.3 % formic acid in the ultrapure water phase A in
the positive ionization mode (Figure 1). In the negative ionization mode, the addition of acid
reduces the chromatographic peak intensity. But without any, the retention time of the
penicillin antibiotics strongly vary and the peaks of those compounds are distorted (Figure 2).
So in negative ionisation mode 0.1 % acetic acid in acetonitrile phase B and 0.1 % acetic acid
in ultrapure water phase A was chosen to give the best compromise between the stability of
the retention times and the chromatographic peak intensities and sharpness (Figure 3). The
gradient was then optimized in each ionization mode. A linear gradient from 10 % to 100 %
organic mobile phase B in 10 minutes was first tested and had allowed to determine the
percentage of mobile phase B necessary to elute all compounds in each ionization mode. Then
in a compromise way between a good compounds separation and a fast analytical
methodology, the final linear gradient was selected as describe in Table 2 and 3. After this
linear gradient, in each mode, 3 different phases were added : the first one with 95 % organic
mobile phase B was used for clean column from hydrophobic residues; the second one was
used for clean column from hydrophilic residues especially EDTA crystal residues; and the
third one was used to condition column before the next analytical run. The optimization of the
flow has led to a flow of 0.6 mL/min at a column temperature of 30°C. This column
temperature was chosen, in respect to compounds temperature tolerance, to reduce the
viscosity of the H2O/ACN mixture which allow to decrease the pressure and increase the flow
without overpressure troubles. This condition allowed a sufficient separation for the different
compounds regarding the MS/MS detection system with minimum time dedicated to the
elution. Indeed in negative mode the 5 compounds were eluted in 5 minutes (Figure 3b) and
in the positive mode, the 28 molecules (25 compounds + 3 internal standards) were eluted in 8
minutes (Figure 4). The retention time of each compounds are given in Table 5.
chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,1% CH3COOH chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,3% HCOOH chromatogramme ESI+ phases mobiles + 2,5% CH3COOH
250 000 140 000
250 000
oxolinic acid
120 000
200 000 oxolinic acid
200 000
doxycycline oxytetracycline 100 000

ofloxacin doxycycline
150 000 oxolinic acid
abondance
abundance
150 000 80 000

oxytetracycline
abundance
ofloxacin
oxytetracycline
60 000
100 000
100 000
ofloxacin
40 000
doxycycline
50 000
50 000
20 000
0 0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8
temps (minutes) (a) 0 1 2 3 4
time (minutes)
5 6 7 8
(b) time (minutes)
(c)
Figure 1: Obtained chromatograms for the 27 molecules analyzed in ESI+ depending on the mobile phases
constitution, (a) water/ACN + 0.1 % CH3COOH in each solvent, (b) water/ACN + 0.3 % HCOOH in each
solvent, (c) eau/ACN + 2.5 % CH3COOH in each solvent. Example for tetracyclines (oxytetracycline and
doxycycline), quinolones (oxolinic acid) and fluoroquinolones (ofloxacin) antibiotic families.
427
Publication 2
(a) (b)
Figure 2: Chromatograms of successive analysis of penicillin G without any acid in mobile phases (a) and
with 0.1 % acetic acid in water and in ACN (b).
chromatogramme ESI- phases mobiles sans acide

chromatogramme ESI- phases mobiles avec 0,1% CH3COOH
9 5
8 4,5
7 4
6 3,5
abundance
abundance
5 3
2,5
4 2
3 1,5
2 1
1 0,5
0 0
0chromatogramme
1 ESI- phases
2 mobiles 3avec 0,3% HCOOH
4 5 6 0 1 2 3 4
chromatogramme ESI- phases mobiles avec 2,5% CH3COOH
5 6
time (minutes) (a) time (minutes) (b)
2 0,5
1,5 0,4
abundance
abundance
0,3
1
0,2
0,5
0,1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
time (minutes)
(c) time (minutes) (d)
Figure 3 : Obtained Chromatograms for the 5 molecules analyzed in ESI- depending on the mobile phases
constitution (abundance normalized by the injected quantity), (a) water/ACN without acid, (b) water/ACN
+ 0.1 % CH3COOH in each solvent, (c) water/ACN + 0.3 % HCOOH in each solvent, (d) water/ACN + 2.5
% CH3COOH in each solvent.
250000
200000
abundance
150000
100000
50000
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
time (minutes)
Figure 4: Chromatogram of a mixture standard solution analyzed in ESI+ (28 molecules)
428
Publication 2
Table 5: Analytical conditions for the analysis of pharmaceuticals by RRLC/MS/MS (CE: collision energy,
RT: retention time).
fragmentor CE quantification fragmentor CE confirmation RT
compounds ESI
(V) (V) transition (V) (V) transition (min)
amoxicillin + 100 20 366.1 → 114.0 70 4 366.1 → 349.1 0.4
ampicillin + 110 20 350.1 → 106.1 90 12 350.1 → 192.0 1.5
oxacillin - 100 10 400.0 → 259.1 70 2 400.0 → 356.1 5.1
penicillin G - 80 4 333.0 → 192.0 70 24 333.0 → 74.0 4.3
penicillin V - 80 2 349.0 → 208.1 80 24 349.0 → 93.0 4.8
cefpodoxime + 150 20 558.1 → 241.1 120 14 558.1 → 410.1 5.7
clarithromycin + 150 30 748.5 → 157.9 150 18 748.5 → 590.3 5.7
erythromycin + 150 36 734.5 → 157.9 150 18 734.5 → 576.3 4.8
erythromycin-13C2 + 130 34 736.4 → 159.9 4.8
roxithromycin + 130 38 837.5 → 157.9 140 22 837.5 → 679.3 5.9
lincomycin + 120 30 407.2 → 126.1 110 18 407.2 → 359.2 0.9
ciprofloxacin + 150 18 332.1 → 288.2 150 24 332.1 → 245.1 2.3
ciprofloxacin-13C2-15N + 110 18 336.1 → 2912 2.3
ofloxacin + 120 18 362.1 → 318.1 90 30 362.1 → 261.2 2.0
oxolinic acid + 90 18 262.1 → 244.1 90 32 262.1 → 216.1 3.8
flumequin + 90 18 262.1 → 244.1 90 36 262.1 → 202.1 4.9
tetracycline + 130 18 445.1 → 410.1 120 28 445.1 → 154.1 2.2
oxytetracycline + 110 20 461.1 → 426.1 130 16 461.1 → 444.1 1.7
chlortetracycline + 120 22 479.1 → 444.1 120 16 479.1 → 462.0 3.5
doxycycline + 130 18 445.2 → 428.1 120 26 445.2 → 410.1 3.8
sulfamethoxazole + 100 30 254.1 → 92.1 90 14 254.1 → 156.1 2.9
sulfamethoxazole-13C6 + 90 30 2601 → 98.1 2.9
trimethoprim + 140 24 291.1 → 230.2 150 26 291.1 → 261.1 1.4
chloramphenicol - 170 12 321.0 → 152.0 170 6 321.0 → 257.0 3.6
metoprolol + 140 22 268.1 → 74.1 140 18 268.1 → 116.1 2.9
propranolol + 120 16 260.1 → 116.1 130 32 260.1 → 56.1 4.2
daunorubicin + 90 30 528.1 → 321.1 90 10 528.1 → 363.1 4.9
doxorubicin + 100 9 544.1 → 396.9 90 28 544.1 → 361.0 4.2
epirubicin + 100 9 544.1 → 396.9 90 14 544.1 → 130.1 4.4
cyclophosphamide + 140 22 261.1 → 140.1 130 18 261.1 → 106.1 3.6
ifosfamide + 130 28 261.1 → 92.1 130 52 261.1 → 63.1 3.4
zidovudine - 90 2 266.0 → 223.0 100 6 266.0 → 193.0 1.5
ritonavir + 140 32 721.2 → 268.1 130 18 721.2 → 296.0 7.8
VII.2. Sample preparation development

The sample preparation development aims to define best conditions of the SPE steps
(equilibration, loading sample, washing, drying and elution) as well as the concentration one.
In that purpose pure water was spiked with compounds of interest and the recoveries get with
the different tested conditions were compared.
VII.2.1. Phase type and elution solvent selection
As already mentioned in the introduction, SPE is the suitable technique to extract a lot of
compounds from numerous samples in a minimum time with reduce solvent consumption.
The first need was to determine which sorbent phase was the best to extract all the selected
pharmaceuticals. For that purpose, based on the most often found phases in literature, 3
cartridges were tested: Oasis HLB, Isolute ENV+ and StrataX. Oasis HLB, Isolute ENV+ and
StrataX sorbents are made with 2 monomers of N-vinylpyrrolidone and divinylbenzene, a
hydroxylated polystyrene-divinylbenzene copolymer and a modifying styrene divinylbenzene
polymer, respectively. All are recommended for the extraction of mixture of compounds
exhibiting large range of physico-chemical properties in water samples. The second need was
the selection of solvent or mixture of solvent which allowed the elution of the selected
429
Publication 2
compounds retained by the phase but ideally without eluting interfering compounds. Due to
the physico-chemical properties of the selected molecules the solvent should be polar, as well
as suitable for LC/MS/MS analyses. Thus, 4 solvents or mixture of solvents were tested:
methanol, acetonitrile, MeOH/ACN 50/50 (v/v) and H2O/ACN 30/70 (v/v). The proportions
of the last mixture were those which allowed the elution of the entire set of compounds by
LC. So the first tests combined 3 cartridges and 4 solvent conditions. 15 model compounds,
selected on the basis of their standard availability, were chosen for the optimization. The
results are presented Figure 5. The cartridges (Figure 5a) and the elution solvent (Figure 5b)
which gave the best extraction recoveries were Oasis HLB (57  21 %) and the mixture
H2O/ACN (30/70, v/v) (63  25 %). To optimize these preliminary results, another test was
undertaken to confirm the solvent choice. In that second step, methanol and the mixture
H2O/ACN at different proportions (70/30, 50/50 and 30/70, v/v) were tested on the entire set
of molecules using Oasis HLB cartridges. The 2 best extraction recoveries were obtained with
the mixture H2O/ACN 50/50 (v/v) (53 %) and H2 O/ACN 30/70 (v/v) (51 %). Methanol also
gave pretty good recovery (45 %) but it was not chosen as elution solvent because of the same
reason for it was not selected as mobile phase in LC/MS/MS analyses (methanolysis of
penicillin antibiotics). Because the extraction recoveries were quiet the same (53% and 51%)
and because the mixture H2O/ACN 50/50 (v/v) was more suitable for some compounds and
the mixture H2O/ACN 30/70 (v/v) was more suitable for others, the final proportion of water
and acetonitrile were chosen in a compromise way between those 2 proportions. As a
consequence of these tests, Oasis HLB (200 mg, 6 mL) and the solvent mixture H2O/ACN
(40/60, v/v) were chosen as the suitable sorbent phase and elution solvent respectively for the
extraction of the 30 selected pharmaceuticals.
extraction recovery extraction recovery
(15 compounds, 4 conditions) (15 compounds)
100 100
80 80
recovery (%)
recovery (%)
60 60
40 40
20 20
0 0
HLB Starta X ENV+ MeOH ACN MeOH/ACN water/ACN
cartridges tested
(50/50, v/v) (30/70, v/v)
a) b)
solvent tested
Figure 5: Average extraction recoveries of combined tests beteween cartridges and solvents. The 15
compounds were extracted with 3 different types of cartridges (a) or eluted from Oasis HLB cartridges
with 4 different solvents (b).
VII.2.2. Sample loading
After the sorbent phase and the elution solvent, the most important thing to optimize in a SPE
development is the sample loading conditions and in particular the pH of the sample. The pH
needs to be fixed first because extraction is better and more reproducible at a same optimum
pH value and second because the retention of the molecules on the sorbent phase depends on
which form they are present in the sample and the form of the molecules (basic or protonated)
are pH-dependent. Indeed, when the sample pH is higher than the molecules’ pKa, molecules
present in this sample are under their basic form, whereas when pH is lower than the
molecules’ pKa, molecules are in the protonated form. Consequently it was necessary to
determine which pH was the best compromise to extract all the 30 selected pharmaceuticals
430
Publication 2
with good and reproducible recoveries. In a first experiment, 4 different pH values (3, 5, 7 and
9) were tested. Moreover, because of the presence of tetracycline antibiotics in our selection
of compounds, a fifth condition was tested with EDTA. EDTA is recommended in a lot of
article (Lindsey et al., 2001; Sacher et al., 2001; Kolpin et al., 2002; Christian et al., 2003;
Castiglioni et al., 2005; Cha et al., 2006; Hao et al., 2006) to improve tetracycline recoveries
because it prevents their binding to silanol groups of glassware or to cations present in water
(Ca2+, Mg2+, etc). It is also recommended to prevent the metal ions to catalyze the
hydrolysis of the -lactam cycle of the -lactam antibiotics (penicillins, cephalosporins)
(AFECT 1992; Cha et al., 2006). The results of this test clearly showed that it was the
condition with EDTA (10 mM) which gave the best extraction recoveries (Figure 6). Hence
EDTA was shown essential to get good recoveries.
Because EDTA needs time to be entirely dissolved in water, 2 different ways to add it in
water samples were tested: addition of EDTA under crystal form or under a dissolved form. In
the first case, EDTA was weighed and added on each sample individually which consume a
lot of time. In the second case, a unique very concentrated solution of EDTA (250 mM) was
prepared and a small volume of it was added to each sample. As there is only one EDTA
solution preparation, this option save a lot of time especially when there are a lot of samples
to extract simultaneously. The results of this test did not show any differences between the 2
possible ways to add EDTA. Thus in the objective of routines analyses, the addition of small
volumes of a very concentrated solution was preferred.
180
160
140
recovery (%)
120
100
80
60
40
20
0
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 EDTA
conditions tested
Figure 6: Average extraction recoveries of 30 pharmaceuticals depending on 5 conditions tested : 4 pH
conditions and 1 EDTA condition.
120
100
recovery (%)
80
60
40
20
0
EDTA EDTA EDTA EDTA pH 7
+ pH 3 + pH 5 + pH 7 + pH 9 + EDTA
conditions tested
Figure 7: Average extraction recoveries of 30 pharmaceuticals depending on 5 conditions tested with
EDTA: addition of EDTA and then pH adjustment to 3, 5, 7 and 9, or pH adjustment to 7 and then
addition of EDTA which modifying the pH value to 5.
431
Publication 2
During the first experiment, it has been noticed that when EDTA was added to the water, the
pH decreased from 7 to around 5. Consequently a second test was performed to determine the
best couple EDTA/pH to obtain good recoveries. In this new experiment, 5 conditions were
tested: addition of EDTA and then pH adjustment to 3, 5, 7 and 9, or pH adjustment to 7 and
then addition of EDTA which decrease the pH to 5. The results are presented Figure 7. As it
can be observed on this figure, EDTA alone is not enough to get good recoveries. The best
results were obtained for addition of EDTA and pH 5, either deliberately fixed at 5 either as a
consequence of the EDTA addition.
Depending on literature data, different concentrations of EDTA are used. For Hao et al.
(2006) it was necessary to add 13 mM of EDTA in each sample whereas for Castiglioni et al.
(2005) 2 mM were enough. So 4 concentrations were tested. 2, 5, 10 and 20 mM of EDTA
were added to the spiked water. The recoveries obtained were not sufficiently different
between all the tested conditions to determine which one is the best. Because this developed
methodology was designed to be applied to various water samples (raw and treated sewage
waters, surface water, groundwater, etc) a final concentration of 10 mM was chosen in order
to always have an excess of EDTA. The 20 mM concentration was not retained because of the
risk to damage the ionization source during the analytical step.
VII.2.3. Breakthrough volume
The breakthrough volume is the maximum volume that can be percolated on SPE cartridge
without elution of analytes. That means that if a more important sample volume than the
breakthrough volume is passed through the SPE cartridges then the compounds of interest are
not retain anymore. The breakthrough volume is compound-dependent. To assess this
parameter, various volumes (50, 100, 200, 500, 1000 and 2000 mL) of water spiked at the
same concentration (almost 300 ng/L) were passed through the Oasis HLB cartridges. The
breakthrough volume was chosen as the maximum volume for which extraction recoveries did
not decrease. Figure 8 show results of this test for 7 models compounds. For a lot of the 30
selected compounds, the breakthrough volume was found to be 1 L but for the 2
fluoroquinolone antibiotics it was 500 mL and for roxithromycin, a macrolide antibiotic, it
was 200 mL. Consequently, the breakthrough volume of the entire method was limited by the
roxithromycin and was found to be 200 mL.
50 ml 100 ml 200 ml 500 ml 1l 2l

160
140
120
recovery (%)
100
80
60
40
20
0
Figure 8: Evaluation of the breakthrough volume through the extraction recoveries of 7 models
compounds for different loading sample volumes.
432
Publication 2
VII.2.4. Evaporation
After the SPE, another very important step in the sample preparation before analysis is the
evaporation step to concentrate the analytes. If it is well known that volatile compounds can
be lost during this step, there is almost no information in the literature about the consequences
of it on antibiotic molecules. So the impact of the evaporation step on the recovery of the
selected pharmaceuticals was investigated. Six flasks containing 5 mL of a NMW/ACN
(40/60, v/v) mixture were spiked with the compounds of interest and were evaporated under a
gentle stream of nitrogen up to different levels of dryness: dry, near dry (one or 2 visible
droplets) and not dry (few microliters). Results are shown on Figure 9. For the entire
molecule selection, the results were clear. The dryness of the extract at the end of the
evaporation step is responsible for a decrease in the recoveries (Figure 9a). This decrease
seems related to the level of dryness. But when looking at the results in more details, it
appeared that the effect of the dryness is antibiotic family or therapeutic class dependent. The
dryness has no impact on the recoveries of the -blockers or of the sulfonamide antibiotics but
the fluoroquinolones and the quinolones are almost totally lost with evaporation to full
dryness (Figure 9b). Consequently it appeared very important to be careful during this last
step of the sample preparation and to not completely dry the extract. For this, a good
alternative could be to use a solvent keeper.
extraction recovery evaporation recovery
(32 compounds)
FQ + Q S + b-B
100 100
recovery (%)
80 80
recovery (%)
60 60
40 40
20 20
0 0
dryness near dryness not dry dryness near dryness not dry
(n=2) (n=3) (n=2) (n=3)
conditions tested a) conditions tested b)
Figure 9: Average evaporation recoveries for the 30 selected pharmaceuticals under various levels of
dryness (a) and for the specific molecules (b) (FQ: fluoroquinolone antibiotics, Q: quinolone antibiotics, S:
sulfonamide antibiotics, b-B: -blockers).
extraction recovery
(30 compounds)
175
recovery (%)
150
125
100
75
50
25
0
100% ACN 10/90 30/70
water/ACN water/ACN
conditions tested
Figure 10: Average extraction recoveries for the 30 molecules in relation with the used solvent to dissolve
the residue after the drying step.
The last experiment done to optimise the sample preparation concern the solvent used to
dissolve the residue after the drying step. Three conditions were tested: 100% ACN,
H20/ACN 10/90 (v/v) and H20/ACN 30/70. As it can be seen on Figure 10, the difference
433
Publication 2
between the recoveries was poor. So in order to make easier the second evaporation step
before the solvent change prior to the analysis, the pure organic solvent condition was
selected. Hence, the SPE extracts, collected in flasks, were first dry to near dryness and
transfer to injection vials. The flasks were rinsed 3 times with ACN which was also transfer to
the injection vials. Then, ACN was removed thanks to a second evaporation step and all the
residues were dissolved in a 90/10 ultrapure water/ACN mixture of solvent prior to the
analysis (this proportion was that of the start gradient of the LC/MS/MS analysis).
VII.3. Method validation

VII.3.1. Analytical validation
Table 6: Analytical validation parameters.

linearity R²
IDL / IQL MDL intra / inter-day accuracy
compounds (range 60 – 3000
(injected pg) (ng/L) variability (%) (%)
injected pg)
amoxicillin 12 / 128 100 0.9997 5 / 25 95 ± 16
ampicillin 12 / 25 100 0.9999 5 / 26 93 ± 15
oxacillin 5 / 10 10 0.9997 3 / 15 144 ± 27
penicillin G 2 / 10 10 0.9992 3 / 14 96 ± 16
penicillin V 2 / 10 10 0.9995 3 / 10 90 ± 16
cefpodoxime 12 / 26 100 0.9995 7 / 11 95 ± 10
clarithromycin 3 / 13 5 0.9998 8/6 91 ± 10
erythromycin 3 / 13 5 0.9997 9/7 87 ± 17
roxithromycin 3 / 13 5 0.9998 10 / 11 92 ± 11
lincomycin 3/3 5 0.9997 3 / 18 98 ± 12
ciprofloxacin 6 / 13 5 0.9799 12 / 44 81 ± 14
ofloxacin 3 / 12 <5 0.9776 12 / 26 94 ± 9
oxolinic acid 3 / 13 5 0.9960 5 / 28 95 ± 9
flumequin 3 / 13 <5 0.9956 4 / 35 97 ± 9
tetracycline 3 / 12 5 0.9998 11 / 23 93 ± 9
oxytetracycline 3 / 12 <5 0.9994 10 / 14 93 ± 10
chlortetracycline 3 / 12 5 0.9998 14 / 23 93 ± 9
doxycycline 3 / 13 <5 0.9997 14 / 23 96 ± 9
sulfamethoxazole 12 / 25 <5 0.9986 6 / 27 95 ± 9
trimethoprim 3/4 <5 0.9991 7 / 16 96 ± 8
chloramphenicol 12 / 35 5 0.9911 4 / 38 93 ± 12
metoprolol 3 / 12 <5 0.9999 4 / 18 94 ± 10
propranolol 3 / 12 <5 0.9995 6 / 20 93 ± 10
daunorubicin 13 / 27 5 0.9983 9 / 20 94 ± 10
doxorubicin 12 / 26 5 0.9983 9 / 36 97 ± 9
epirubicin 28 / 138 10 0.9987 9 / 25 93 ± 17
cyclophosphamide 3 / 12 <5 0.9996 5 / 40 98 ± 12
ifosfamide 12 / 26 <5 0.9986 6 / 31 100 ± 9
zidovudine 7 / 20 5 0.9978 3 / 19 94 ± 12
ritonavir 13 / 26 5 0.9902 8 / 27 108 ± 19
All the analytical validation parameters are summarized in the Table 6. The way how all these
parameters were calculated was already described in the material and method part and was not
detail in this section. The instrumental detection limits (IDL) and the instrumental
quantification limits (IQL) varied between 2 and 28 injected pg for IDL and between 3 and
138 injected pg for IQL. The method detection limits (MDL) was comprised between less
than 5 ng/L for sulfamehtoxazole or metoprolol as exemple to 100 ng/L for ampicillin or
434
Publication 2
amoxicillin. The linearity was very good (R² > 0.998) between 60 and 3000 injected pg for 24
compounds. When the linearity over the entire range was not good enough, smaller ranges
were used in order to get good linearity and define working scale (bracket method). This was
the case for ciprofloxacin, ofloxacin, oxolinic acid, flumequin, chloramphenicol and ritonavir.
In the same way that it was applied for the linearity, if the accuracy was not good enough with
the entire range then smaller 3 points ranges, closer to the expected concentration, were used
for quantification purpose in order to get good accuracy. The mean accuracy of the method
was 97 %. The intra-day variation was less than 15. The mean inter-day variation was 24 %
and 19 % in positive and negative ionisation mode respectively.
VII.3.2. Global recovery
Another validation parameter deals with the global recovery evaluated through the adequacy
between theoretical and measured concentration of a NMW, free from our selected
compounds, spiked at environmentally relevant concentration with a mixture solution of all
the 30 pharmaceuticals. This parameter takes into account the sample preparation steps as
well as the analytical part. Average results of different experiments are presented in Table 7.
Values presented in Table 7 result from quantification by external calibration curve and
values presented in parentheses result from quantification by internal standards for the 3
compounds (erythromycin, ciprofloxacin and sulfamethoxazole) for which internal standards
are available.
The results can be divided into 3 groups. The first one with sulfonamide and phenicol
antibiotics, -blockers, nitrogen mustard antineoplastics (cyclophosphamide and ifosfamide)
and anti-HIV had very good recoveries ( 60%) with quite poor variability (≤ 28%, except
ritonavir 43%). The second one with macrolide, fluoroquinolone, quinolone and lincosamide
antibiotics had pretty good recoveries ( 45%) but the variability was more or less strong
(between 15 % for erythromycin with internal standard quantification to 36 % for flumequine
with external quantification). The third group is composed by -lactam and tetracycline
antibiotics as well as anthracycline antineoplastics (daunorubicine, doxorubicine and
epirubicine) which had poor recoveries. Even with this poor recovery (26 - 41 %) the protocol
could be considered as validated for the tetracyclines and anthracyclines because the
variability was in the same range than that for the 2 first groups (14 - 31 %). For the -lactam
antibiotics, the recovery was poor (3 - 40%) thus the protocol was not good enough to be
considered as quantitative. It can be used as semi-quantitative one and for qualitative
purposes. A specific protocol will be needed especially for amoxicillin.
Table 7: Mean global extraction recovery of the 30 pharmaceuticals, n = 16 quantification by external

calibration curve (n = 11, quantification by internal standards).
global extraction global extraction global extraction

compounds compounds compounds
recovery (%) recovery (%) recovery (%)
amoxicillin 3±4 ciprofloxacin 46 ± 28 (100 ± 25) chloramphenicol 109 ± 28
ampicillin 23 ± 20 ofloxacin 46 ± 26 metoprolol 75 ± 26
penicillin G 27 ± 21 oxolinic acid 64 ± 35 propranolol 64 ± 23
penicillin V 40 ± 24 flumequine 67 ± 36 daunorubicin 34 ± 15
oxacillin 39 ± 25 tetracycline 33 ± 24 doxorubicin 41 ± 23
cefpodoxime 56 ± 41 oxytetracycline 33 ± 26 epirubicin 26 ± 14
clarithromycin 75 ± 36 chlortetracycline 32 ± 27 ifosfamide 82 ± 23
erythromycin 28 ± 24 (107 ± 15) doxycycline 41 ± 31 cyclophosphamide 91 ± 28
roxithromycin 67 ± 33 sulfamethoxazole 53 ± 21 (102 ± 9) zidovudine 62 ± 22
lincomycin 63 ± 30 trimethoprim 79 ± 24 ritonavir 83 ± 43
435
Publication 2
VII.3.3. Matrix effects
Finally for a complete validation of the protocol developed and presented here, the matrix
effects were assessed. The first impact noticed when this methodology was applied to real
samples from SWTP was the distortion of fluoroquinolones chromatographic peaks
(ciprofloxacin and ofloxacine, Figure 11a) and the variation of the retention time of macrolide
antibiotics (clarithromycin, erythromycin and roxithromycine, Figure 11b) in the influent. In
the effluent no changes were observed. Usually, in LC/MS/MS, compounds are identified by
their retention time and their transitions in MRM mode. So when the retention time varies
more than 1 minute it is very difficult to be sure of the identity of the compounds even with
the 2 transitions and the good ratio between them. The compounds presence can be confirmed
thanks to the internal standard (e.g.: ciprofloxacin-13C2-15N in SWTP influent, Figure 11a)
which also moved in the same way than the native compounds. Another option to confirm the
presence of those compounds consists in the following method: the extract is first injected
unspiked and then is spiked with the standard solution of the 30 compounds and is injected a
second time. Only one biggest peak appears for each molecule in this second injection
chromatogram which confirm the presence of macrolide compounds. The last option to
confirm the identity of the compounds is the analysis of the influent SWTP sample with high
resolution mass spectrometry systems (LC/QTOF).
The second impact of the matrix effect which is more documented in the literature (Gomez et
al., 2006; Vieno et al., 2006; Kasprzyk-Hordern et al., 2007) was the influence on sensitivity.
Because electrospray ionisation phenomena can be affected by matrix components, the signal
can be reduced or improved due to the presence of dissolved organic matter. This can happen
in relation with various phenomena: ionisation of matrix components could rise the baseline
and analyte peaks could be masked; analytes and interfering compounds could compete for
the ionisation process which could reduce ionisation efficiency of analytes, etc (Gomez et al.,
2006; Vieno et al., 2006; Kasprzyk-Hordern et al., 2007). To measure matrix impact, mineral
water as well as SWTP samples (influent and effluent) extracts were divided into 2 parts; one
was injected without further treatment and the other one was spiked just before the injection.
The matrix effect was calculated according to the equation presented in the material and
method section. Because SWTP samples free from pharmaceuticals do not exist, a precise
evaluation was quite difficult and results were semi quantitative. Moreover, because of the
difficulty to accurately analyse -lactam antibiotics, the impact of the matrix effect on these
compounds was not investigated. So the molecules can be divided into 4 groups depending on
the action of the matrix effect: strong and low enhancement or strong and low suppression of
the signal. Results are presented in the Table 8. Signal suppression was more frequent than
signal enhancement. Solutions to compensate these impacts are: i) standard addition that is
mean to make a calibration curve in the matrix sample (one calibration curve with SWTP
influent to quantify SWTP influent samples and another one with SWTP effluent to quantify
SWTP effluent) but it is time-consuming; ii) addition of suitable internal standard
(isotopically labelled compounds) but these compounds are not always commercially
available; iii) dilution of the extract but it could lead to a decrease in sensitivity. In
consequence matrix effects are really a strong issue in ESI-LC/MS/MS analysis as already
showed by Gomez et al. (2006), Vieno et al. (2006) and Kasprzyk-Hordern et al. (2007) and
it is necessary to estimate their impact for quantitative analysis.
436
Publication 2
standard solution standard solution

40000 90000
35000 80000
30000 70000
ery. Q
60000
abundance
abundance
25000 cipro. Q ery. C

50000
20000 cipro. C ery. IS
40000
15000 cipro. IS clari. Q
30000
oflo. Q clari. C
10000 20000
oflo. C roxi. Q
5000 10000 roxi. C
0 0
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5,5 6,5 7,5
time (minutes) time (minutes)
spiked water spiked water

14000 25000
12000
20000
10000 ery. Q
abundance
abundance
cipro. Q 15000 ery. C

8000
cipro. C ery. IS
6000 10000 clari. Q
cipro. IS
4000 oflo. Q clari. C
oflo. C 5000 roxi. Q
2000
roxi. C
0 0
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5,5 6,5 7,5
SWTP influent SWTP influent

35000 7000
2500
30000 2000 6000

1500
25000 5000 ery. Q
abundance
abundance
1000
cipro. Q 4000 ery. C
20000
500
cipro. C ery. IS
15000 0 3000
2 2,5 3 3,5 4 cipro. IS clari. Q
10000 oflo. Q 2000 clari. C
oflo. C roxi. Q
5000 1000
roxi. C
0 0
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5,5 6,5 7,5
SWTP effluent SWTP effluent

8000 35000
7000 30000
6000 25000 ery. Q
abundance
abundance
5000 cipro. Q ery. C

20000
15000
3000 cipro. IS clari. Q
oflo. Q 10000 clari. C
2000
oflo. C roxi. Q
1000 5000
roxi. C
0 0
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5,5 6,5 7,5
surface water surface water

5000 2500
4500
4000 2000
3500 ery. Q
abundance
abundance
3000 cipro. Q 1500 ery. C

2000 cipro. IS 1000 clari. Q
1500 oflo. Q clari. C
1000 oflo. C 500 roxi. Q
500 roxi. C
0 0
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5,5 6,5 7,5
(a) (b)
Figure 11: Influence of the matrice on the retention time of fluoroquinolones (a) and macrolides (b)
(cipro.: ciprofloxacin, oflo.: ofloxacine, ery.: erythromycin, clari.: clarithromycine, roxi.: roxithromycine,
Q: quantification transition, C: confirmation transition, IS: internal standard).
437
Publication 2
Table 8: Matrix effect of SWTP samples (influent, i; effluent, e) on the molecules studied.
strong enhancement low enhancement strong suppression low suppression
(> 50%) (< 50%) (> 50%) (< 50%)
clarithromycin (i/e) erythromycin (e) erythromycin (i) roxithromycin (i)
lincomycin (i/e) roxithromycin (e) ciprofloxacin (i/e) ofloxacin (e)
chlortetracycline (i) ofloxacin (i) oxoliniq acid (i) oxoliniq acid (e)
chlortetracycline (e) flumequin (i) flumequin (e)
ritonavir (e) doxycycline (e) tetracycline (i/e)
sulfamethazine (i) oxytetracycline (i/e)
sulfamethoxazole (i/e) doxycycline (i)
metoprolol (i) sulfamethazine (e)
daunorubicin (i/e) trimethoprime (i/e)
doxorubicin (i/e) chloramphenicol (i/e)
epirubicin (i/e) metoprolol (e)
cyclophosphamide (i) propranolol (i/e)
ifosfamide (i) cyclophosphamide (e)
ritonavir (e) ifosfamide (e)
zidovudine (i/e)
VII.4. Method application

In order to assess the occurrence of the 30 selected compounds in environmental samples,
especially the anti-HIV ones, this new multi-residue protocol was applied to 10 effluents from
various SWTP. The results are presented on Figure 12. 17 molecules among the 30 were
detected at least once in the SWTP effluents. With 16 different compounds quantified, SE 4
was the most contaminated SWTP effluent in term of diversity; and with 5 different
compounds quantified, CA PA 1 was the less contaminated one. Moreover, with no individual
concentration upper than 21 ng/L, CA PA 1 was also the less contaminated SWTP effluent in
term of quantity. Consequently, it seems that the advanced tertiary treatment applied in this
SWTP (sand filter + ozone oxidation) was very efficient. The most abundant pharmaceuticals
were ofloxacin (SE PA 1), clarithromycin (CA 6-2), ciprofloxacin (SE PA 1) and
roxithromycin (CA 6-2) with maximum concentrations at 1077, 992, 542 and 402 ng/L
respectively. Moreover, 10 molecules were detected in SE PA 1 effluent. Consequently,
despite the tertiary treatment applied in this SWTP (high speed chemical settler + sand filter),
but not equipped with an oxidation stage, SE PA 1 effluent seems highly contaminated and
the treatment applied not sufficiently efficient for these compounds.
Clarithromycin and erythromycin were detected in all samples. With ofloxacin, trimethoprim
and propranolol, identified in 9 of the 10 analyzed samples, they were the most often found
compounds (Figure 13). Roxithromycin, sulfamethoxazole, metoprolol, ritonavir,
ciprofloxacin and zidovudine were also frequently detected, more than 5 out of 10 times. In
consequence, fluoroquinolones and macrolides are both frequent and abundant contrary to
sulfamethoxazole, propranolol and trimethoprime which were frequently found but their
concentrations are quite low with maximum concentrations less than 85 ng/L. For
comparison, tetracycline was found just 2 times but at similar concentration (maximum 96
ng/L). Finally, the 2 anti-HIV, ritonavir and zidovudine, were frequently detected,
respectively in 80 % and 60 % of samples, and at significant concentration. Ritonavir and
zidovudine maximum concentrations were 134 ng/L and 142 ng/L respectively.
438
Publication 2
concentration (ng/L) en antibiotiques, b-bloquants et anti-rétroviraux dans diverses échantillons
d'effluents de STEP
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Figure 12: Concentrations in ng/L of the pharmaceuticals found in treated water.
100%
detection frequency
75%
50%
25%
0%
Figure 13: Detection frequency of the 17 compounds found at least one time in the 10 analyzed samples.
The results of this study are in accordance with other French studies (AFSSA, 2009; Gabet-
Giraud et al., 2010). Indeed, in this study, erythromycin was found in every sample at
concentrations varying between 17 and 182 ng/L and in its study, the French Agency for Food
Sanitary Security (AFSSA, 2009) also found this antibiotic in SWTP effluent at
concentrations slightly higher, between 109 and 562 ng/L. Moreover, metoprolol was
identified in 8 out of 10 samples at concentrations varying between 3 and 168 ng/L in this
study and AFSSA quantified this -blocker in SWTP effluent at similar concentrations (29 -
190 ng/L). Within the AMPERES project, Gabet-Giraud et al. (2010) quantified metoprolol
and propranolol in more than 94% of the effluent samples at concentration levels from 20 to
200 ng/L. At the opposite, none of the 5 antineoplastics looked for in this study dealing with
domestic wastewater were identified, whereas Mullot (2009) quantified cyclophosphamide in
French SWTP effluent, receiving hospital effluent, at 300 ng/L and Coestier et al. (2009)
quantified ifosfamide at 4 ng/L (median concentration) in another French SWTP effluent,
receiving hospital effluent. Otherwise, the anti-HIV zidovudine detected in 6 effluents at
concentrations varying between 15 and 142 ng/L, was also detected in German SWTP
439
Publication 2
effluents by Prasse et al. (2010) at more or less the same range of concentration (98 - 564
ng/L).
The most contaminated effluents (higher concentrations) are not always those that contribute
the most to aquatic systems pollution. Indeed, considering the treated flow (Table 4), the total
daily load discharged by each SWTP was calculated (Figure 14 b). With 59.2 g/d total load
released to the environment, SE PA 1 is the effluent which contributes the more to
environmental pollution. Even if CA 5 is the most contaminated effluent with 2.3 µg/L total
concentration (Figure 14a), its contribution is lower than the one of SE PA 1 with 16.4 g/d
discharged each day. With respectively 22.5 g/d and 5.9 g/d, SE 4 and SE 6 SWTP effluents
also contribute strongly to the pollution of downstream rivers. Those SWTP were all
connected to urban sewage, and performed indifferently carbon removal (C), carbon removal
and nitrification (C + N) or carbon removal, nitrification and denitrification (C + N + DN).
The results also suggest that the lower fluxes have been calculated for SWTP located in rural
areas probably due to the absence of these contaminants in the raw wastewater. Also low
values were calculated for SWTP located in urban areas but equipped with a more advanced
treatment such as membrane bioreactor (SE5) or advanced tertiary treatment with oxidation
(CA PA 1) or refined filtration (SE PA 2) with ultrafiltration (not sand bed filter).
2500 70000
59166
60000
2000
50000
flux (mg/d)
1500
40000
1000 30000
22464
20000 16387
500
10000 5919
262 503 18 23 1622 108
0 0
CA PA SE PA SE PA CA 5 CA 6 - CA 6 - SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 CA PA SE PA SE PA CA 5 CA 6 - CA 6 - SE 4 SE 5 SE 6 SE 9
1 1 2 1 2 1 1 2 1 2
SWTP (a) SWTP (b)
Figure 14: Total concentration (ng/L, a) and total load (mg/d, b) released by the SWTP effluents.
Conclusion
A one step sample preparation protocol and a sensitive analytical methodology for the
analysis of 30 pharmaceutical compounds belonging to 4 therapeutic classes (antibiotics, anti-
HIV, antineoplastics and -blockers) have been developed. The 30 selected pharmaceuticals
were simultaneously extracted by SPE with Oasis HLB cartridges and eluted with a mixture
of pH 7 NMW/ACN (40/60, v/v). To improve extraction efficiency and reproductibility, it
had been shown that samples pH need to be around 5 and that the addition of 10 mM of Na 2-
EDTA in each sample is necessary. Special care was brought to the evaporation/concentration
step and revealed the importance to avoid dryness to preserve fluoroquinolone and quinolone
antibiotics. After the extraction and the evaporation step, all the compounds were analyzed by
LC/MS/MS equipped with a C18 column and an electrospray ionization source. The
constitution of the mobile phases was optimized and led to ultrapure water + 0.3 % HCOOH
and ACN + 0.3 % HCOOH in positive ionization mode and to ultrapure water + 0.1 %
CH3COOH and ACN + 0.1 % CH3COOH in negative ionization mode. 25 molecules and 3
440
Publication 2
internal standards were analyzed in ESI+ and were eluted in less than 8 minutes. 5 compounds
were analyzed in ESI- and were eluted in less than 5 minutes. Because the MDL were
between less than 5 ng/L to 100 ng/L, the optimized methodology allow to quantitatively
analyze environmental samples except for -lactam where semi-quantitative analysis are
possible. This protocol was then successfully applied to real samples from different sewage
treatment plant effluents. Macrolides, fluoroquinolones, sulfonamides, -blockers and anti-
HIV antivirals were the most often found compounds (frequency > 50%). Except
sulfonamides, they were also the most abundant (> 100 ng/L). To the authors’knowledge, it is
the first time that anti-HIV antivirals are include in a multi-residues methodology and are
looked for in French environmental SWTP effluent samples. Ritonavir and zidovudine were
detected respectively in 80 % and 60 % of the analyzed samples and at maximal
concentrations upper than 130 ng/L which underline their importance in the water
contamination and the necessity to document their presence and fate in the aquatic
ecosystems. One perspective of this work will be to increase the molecules selection and to
develop internal calibration in order to decrease the variability of the extraction recoveries and
the problem of the matrix effects. Another perspective will be to develop a specific sample
preparation protocol for -lactam antibiotics, especially amoxicillin.
Acknowledgments
The authors wish to thank the “ Région Aquitaine ” for research funding. They want also
to acknowledge the Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherché, the ANR
SEST DIPERPHA project and the “Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie”
(ADEME) for providing the PhD grant of M.J. Capdeville. The authors thank people who
made the sampling campaign in the context of the ANR Precodd AMPERES project : S.
Martin, J-M. Choubert, J-M. Perret, J-L. Beckert, C. Crétollier, M. Hadjab, L. Rolland, N.
Harouyia, J-C. Alibar et F. Lebars.
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445
446
Publication 3
Publication 3 : Multi-residue simultaneous analysis of 78

pharmaceutical compounds in aqueous samples: development and
application
CAPDEVILLE M.J.1, OBERLE K.2, PIRAM A.1, PARDON P.1, PETIT F.2 AND
BUDZINSKI H.1*
1
France
2
M2C, UMR 6143 CNRS – FED SCALE 4116, Université de Rouen, UFR des Sciences, IRESE B, place Emile
Blondel, 76821 Mont Saint Aignan, France
Tel.: + 33 (0)5 40 00 69 98
Fax: + 33 (0)5 40 00 22 67
A soumettre dans Analytical Bioanalytical Chemistry
Abstract
This paper describes the development, validation and application of a method for the
simultaneous determination of 78 pharmaceutical compounds belonging to 5 therapeutic
classes including antibiotics, -blockers, antineoplastics, anti-HIV antivirals and
phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE 5 inhibitors). The method allows simultaneous
extraction of the compounds by solid phase extraction (SPE) using Oasis HLB cartridges and
water/acetonitrile eluent mixture. The analytes were analysed by rapid resolution liquid
chromatography tandem mass spectrometry (RRLC/MS/MS) using multi-reaction monitoring
mode. The instrumental detection limits varied between 0.1 and 1400 injected pg and method
quantification limits varied between 0.1 and 425 ng/L. The precision was evaluated through
the intra- and inter-day variability, calculated as relative standard deviation, and was around 7
% in ESI+ and 5 % in ESI- and around 54 % in ESI+ (6 days) and 29 % in ESI- (4 days)
respectively. Accuracy of the method was good with an average of 109 % for all the set of the
compounds. The extraction recovery average was 74  39 % nevertheless fifteen compounds
had recoveries lower than 35 % and 2 upper than 120 %. The method was then applied to
water samples from hospital and retirement home sewage effluents as well as influent and
effluent of a sewage treatment plant (SWTP) and surface water impacted by this input
(hospital continuum) and to surface waters impacted by runoff from land use for agricultural
purpose (agricultural continuum). Hospital and retirement home effluents were highly
contaminated by pharmaceuticals (e.g: 345 µg/L in hospital effluent and 87 µg/L in retirement
home effluent in total in winter). Globally, the compounds seem well degraded in the SWTP
(e.g: in summer, total concentration in influent = 20 µg/L and total concentration in effluent =
6 µg/L). Contamination of surface water was weaker, less than 500 ng/L (total concentration
in each sample). Surface water impacted by agricultural runoff was less contaminated (winter
maximal total concentration: 77 ng/L and summer maximal total concentration: 75 ng/L) than
surface water impacted by SWTP release (winter total concentration: 91 ng/L and summer
total concentration: 435 ng/L).
Keywords: pharmaceuticals, SPE, RRLC/MS/MS, multi-residue method, surface and

wastewater samples
447
Publication 3
Introduction
Various authors (Kolpin et al., 2002; Barnes et al., 2008 and Focazio et al., 2008 for the
United States; Chen et al., 2006 and Garcia-Ac et al., 2009 for the Canada; Tamtam et al.,
2008 and Togola and Budzinski, 2008 for France; Quintana et al., 2001; Petrovic et al., 2003;
Rodriguez-Mozaz et al., 2004 and Gros et al., 2009 for Spain; Zoller, 2006 and Avisar et al.,
2009 for Israel; Bendz et al., 2005 for Sweeden; Vieno et al., 2006 for Finland; Zuccato et al.,
2000 for Italy; Kasprzyk et al., 2007 for united Kingdom and Poland; Ternes, 1998; Sacher et
al., 2001 and Prasse et al., 2010 for Germany; Watkinson et al., 2009 for Australia and
Stumpf et al., 1999 for Brazil) have reported that surface waters but also groundwaters are
contaminated by numerous organic compounds such as polycyclic aromatic hydrocarbon
(PAHs) like naphthalene, plasticizers like bisphenol A, fire retardant like tri(2-chloroethyl)
phosphate (TCEP), fragrance like 1,4-dichlorobenzen, herbicide like metolachlor or
pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) like sulfamethoxazole or caffeine.
Among all these organic contaminants, pharmaceuticals represent a group of particular
interest because these compounds are made to be biologically active and to have effect on
organisms. In literature they are reported to be found in surface and drinking waters all around
the world at concentrations between the nanograms and the micrograms per liter (Boxall
2004; Jones et al., 2005; Kümmerer 2009; Mompelat et al., 2009). So, even if they are not
found into the environment at the concentration at which they are administrated to be active
on human beings, it cannot be excluded that they could have effects on aquatic wildlife. As
example, Länge et al. have shown in 2001 the impact of the steroid hormone 17-alpha-
ethinylestradiol on fish at environmental relevant concentration (4 ng/L) and Huggett et al., in
2002 have shown the effect of propranolol on medaka egg hatching at 0.5 µg/L. In
consequence it is important to document the contamination of the environment by the
pharmaceuticals. In that purpose it is necessary to develop multi-residue methods able to
screen the largest possible number of molecules. In this study, 78 molecules belonging to 5
different therapeutic classes (antibiotics, -blockers, antineoplastics, anti-HIV antivirals and
PDE 5 inhibitors) were selected. This selection is presented in Table 1 and molecules chosen
are compared with those belonging to the same therapeutic classes selected in other French
selection. Vulliet et al. (2009) studied 51 pharmaceutical compounds but only 8 antibiotics
and 3 -blockers. The French Agency for the Food Sanitary Security (AFSSA, 2008) selected
74 pharmaceuticals including: 16 antibiotics (5 human and 11 veterinary antibiotics), 1 -
blocker and 9 antineoplastics. Besse and Garric (2007) ﬁnal priority list gathers 40 parent
compounds and 14 metabolites among which 15 antibiotics, 3 -blockers and 7
antineoplastics were recognized. Finally, Algros and Jourdain selected 18 antibiotics (5
human antibiotics, 6 veterinary antibiotics and 7 antibiotics common to human and veterinary
medicines). According to the Table 1, our selection takes into account almost all the
compounds selected in other French studies, except for the antineoplastic class. In addition, it
includes anti-HIV antivirals and PDE 5 inhibitors that are not present in the other French
selection. In comparison with German, Spanish or United States American studies, this 78
pharmaceuticals selection remains one of the most important. Indeed, in Germany, Sacher et
al. (2001) studied 60 pharmaceutical compounds including 25 antibiotics, 7 -blockers and 2
antineoplastics. In the USA, Kolpin et al. (2002), Barnes et al. (2008) and Focazio et al.
(2008) analyzed respectively 42, 35 and 41 pharmaceuticals including 22, 21 and 25
antibiotics. In Spain, Gros et al. (2009) selected also an almost as large list of compounds (73
pharmaceutical molecules) as our. Their selection comprise 25 antibiotics, 9 -blockers, 1
antineoplastic, 12 analgesics, 7 lipid regulators, 5 psychiatric drugs, 4 histamine H 2 receptor
antagonists, 2 -agonists, 3 barbiturates, 3 antihypertensives, 1 diuretic and 1 antidiabetic.
448
Publication 3
Furthermore, among the 78 pharmaceutical compounds selected in this study, 52 are

antibiotics. Some of them are only used in veterinary medicine like ceftiofur, tylosine,
enrofloxacin, marbofloxacin, monensin, salinomycin and virginiamycine whereas others are
used in human and veterinary medicine like amoxicillin, erythromycin, doxycycline and
trimethoprim. Despite, the great number of antibiotics studied by Watkinson et al. (2009) (28
antibiotics), Sacher et al. (2001), Focazio et al. (2008) or Gros et al. (2009), to our
knowledge, it is the first time that such a large diversity of antibiotics (52) is studied.
Table 1: Comparison between studied molecules in the present selection and in other French selections (in
bold common molecules).
Vulliet et al., Besse et Garric, Algros et Jourdain,
class family this article AFSSA, 2008
2009 2007 2007
antibiotics penicillins amoxicillin amoxicillin amoxicillin
ampicillin ampicillin
penicillin G penicillin G
penicillin V
oxacillin
cloxacillin
dicloxacillin
cephalosporins cephalexin cefquinome sulfate ceftriaxone
cefotaxim
cefpodoxime
ceftiofur
cefuroxim
macrolides azithromycin azithromycin
clarithromycin clarithromycin
erythromycin erythromycin erythromycin
josamycin 14-hydroxy- josamycin
roxithromycin roxithromycin clarithromycin roxithromycin
spiramycin spiramycin
tylosin tylosin tylosin tylosin
lincosamides clindamycin clindamycin
lincomycin lincomycin
fuoroquinolones ciprofloxacin danofloxacin ciprofloxacin ciprofloxacin
enrofloxacin enrofloxacin
marbofloxacin
norfloxacin norfloxacin
ofloxacin ofloxacin ofloxacin ofloxacin
quinolones flumequine flumequine
oxolinic acid oxolinic acid
pipemidic acid
tetracyclines chlortetracycline chlortetracycline
doxycycline doxycycline doxycycline doxycycline
oxytetracycline oxytetracycline oxytetracycline
tetracycline tetracycline
sulfonamides sulfadiazine
sulfadimethoxine sulfadimerazine
sulfamerazine (sulfadimidine,
sulfamethazine sulfamethazine) sulfamethazine
sulfamethizole
sulfamethoxazole sulfamethoxazole sulfamethoxazole sulfamethoxazole
sulfanilamide acetyl-
sulfapyridine sulfamethoxazole
sulfathiazole
trimethoprim trimethoprim trimethoprim trimethoprim
phenicols chloramphenicol florfenicol
thiamphenicol
polypeptides bacitracin colistin
virginiamycin
imidazoles metronidazole metronidazole metronidazole
hydroxy-
metronidazole
ionophore monensin
salinomycin
others fusidic acid furosemide fosfomycin fosfomycin
rifampicin tilmicosin dihydrostreptomycin pristinamycin
sulfate
-blockers atenolol atenolol atenolol atenolol
449
Publication 3
Vulliet et al., Besse et Garric, Algros et Jourdain,

class family this article AFSSA, 2008
2009 2007 2007
bisoprolol
metoprolol metoprolol
propranolol propranolol propranolol
sotalol sotalol
timolol
antineoplastic anthracycline daunorubicin
agents doxorubicin
epirubicin
nitrogen mustard cyclophosphamide cyclophosphamide cyclophosphamide
phosphoramid mustard
acrolein
ifosfamide ifosfamide ifosfamide
isophosphoramide
mustard acrolein
others 5-fluorouracil 5-fluorouracil 5-fluorouracil
docetaxel hydroxycarbamide hydroxycarbamide
gemcitabine carboplatin etoposide
methotrexate cytarabine imatinib
tamoxifen bleomycin tamoxifen
PDE 5 inhibitor sildenafil
antivirals nucleoside reverse abacavir
transcriptase lamivudine
inhibitor stavudine
zidovudine
non- nucleoside nevirapine
reverse transcriptase
inhibitor
HIV-1 protease indinavir
inhibitors nelfinavir
ritonavir
saquinavir
Reviews on analytical methods for the determination of pharmaceuticals in water samples

show that the most common techniques used are solid phase extraction (SPE) for pre-
concentration and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) for
analysis (Ternes 2001; Hao et al., 2007; Seifrtová et al., 2009). In consequence those
methodologies were chosen to be optimized in this work to be able to study the selected
compounds. For the analytical part, a Rapid Resolution Liquid Chromatography (RRLC)
system was employed. Like the UPLC, this new generation of LC techniques uses small
diameter particles (1.8 μm) in the stationary phase and short columns, which allow higher
pressures and, ultimately, narrower LC peaks. In addition to providing narrow peaks and
improved chromatographic separations, those new LC techniques can also dramatically
shorten analysis times (Richardson, 2009). Once the molecule selection and the analytical
development done, the entire protocol was applied to a hospital-sewage water treatment plant-
surface water continuum and to an agricultural continuum to study the impact of
pharmaceuticals on aquatic systems directly from the sources (hospital, SWTP effluents or
runoff on land fertilized) to the receiving environment (surface water).
I. Experimental
I.1. Chemicals and materials
Amoxicillin, ampicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, penicillin G, penicillin V,

cephalexin, cefotaxim, ceftiofur, cefuroxim, erythromycin, roxithromycin, spiramycin,
tylosin, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline, oxolinic acid, pipemidic
acid, flumequine, ciprofloxacin, marbofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, sulfadiazine,
sulfadimethoxine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethizole, sulfamethoxazole,
450
Publication 3
sulfanilamide, sulfapyridine, trimethoprim, lincomycin, chloramphenicol, metronidazole,

monensin, salinomycin, bacitracin, virginiamycin, rifampicin, fusidic acid, atenolol,
bisoprolol, metoprolol, propranolol, timolol, tamoxifen, docetaxel and cyclophosphamide
were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Cefpodoxime,
azithromycin, clarithromycin, josamycin, enrofloxacin, clindamycin, thiamphenicol, sotalol,
methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, ifosfamide, gemcitabine, 5-fluorouracil,
abacavir, indinavir, lamivudine, nelfinavir, nevirapine, saquinavir, ritonavir, zidovudine and
sildenafil were purchased from LGC Standards (Molsheim, France). Isotopically labelled
compounds were used as internal standard. Amoxicillin-13C6, erythromycin-13C2,
ciprofloxacin-13C2-15N, trimethoprim-13C3, sulfamethazine-13C6 and sulfamethoxazole-13C6
were also purchased from LGC Standards. Ampicillin-15N, penicillin G-d7, norfloxacin-d5,
ofloxacin-d3, chloramphenicol-d5 and sulfadimethoxine-d6 were purchased from Sigma-
Aldrich. Atenolol-d7, propranolol-d7, 5-fluorouracil-15N, tamoxifen-d5 and sildenafil-d3 were
purchased from Cluzeau Info Labo (Sainte Foy la Grande, France). The last 3 internal
standards clarithromycin-d3, lincomycin-d3 and tetracycline-d6 were purchased from Toronto
Research Chemicals (North York, Toronto, Canada). Two individual solutions of each
standard compound were prepared on a weight basis in acetonitrile (100 – 200 µg/mL) and
stored in the dark at -20°C. Two independent mixture solutions were made with each set of
individual stock standard solution (final concentration of the 78 compounds mixture solution
around 1.7 µg/mL). Individual stock solutions of internal standard compounds were also
prepared on a weight basis in acetonitrile (100 – 200 µg/mL), except for compounds
purchased in methanol solution (ciprofloxacin-13C2-15N, trimethoprim-13C3), and were stored
in the dark at -20°C. A unique mixture of all the internal standards was also prepared (final
concentration of the 20 internal compounds solution around 0.8 µg/mL).
The solvents used for the experimentations and the analyses were methanol (MeOH, Merck
Lichrosolv, gradient grade for LC (VWR, Strasbourg, France)), acetonitrile (ACN, Baker,
ultra gradient HPLC grade (Atlantic labo, Bruges, France)), ultrapure water (milliQ,
Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France) and natural mineral water (NMW, Vittel,
Nestlé (France Boissons, Lormont, France)). The reagents used for this study were acetic acid
glacial (CH3COOH, Sharlau, HPLC grade (Atlantic labo)), formic acid (HCOOH, Baker
analyzed, 98% purity (Atlantic labo)), hydrochloric acid (HCl, Baker analyzed reagent, 36.5-
38% purity (Atlantic labo)), sodium hydroxide (NaOH, VWR BDH Prolabo, normapur 97%
purity (VWR)) and ethylene-diamine-tetra-acetic acid dihydrate-disodium salt (Na2-
EDTA.2H2O, Fisher Scientific, analytical reagent grade certified (Fisher bioblock Scientific,
Illkirch Graffens, France)). The cartridges used were Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic
Balance, 200 mg, 6 cc) from Waters (Saint Quentin en Yvelines, France). The filters used
were 0.7 µm glass fibre filter (GF/F, Whatmann (Fisher Bioblock Scientific)) and 1.6 µm
glass fibre filter (GF/A, Whatmann(Fisher Bioblock Scientific)).
All the glassware was washed with osmosis water and then baked at 450°C overnight before
use. The glass fiber filters were also baked at 450°C overnight before use.
I.2. Sample collection
II.1.1. Hospital continuum
When the environment is contaminated by pharmaceutical compounds from human origin,

sewage treatment plant (SWTP) effluents should be monitored as they are the main sources of
451
Publication 3
surface water contamination (Ternes et al., 2004). Hospitals and retirement homes sewage
effluents concentre a large variety of pharmaceutical compounds at huge concentration
because drug consumption is important in these medical centers. For these reasons, samples
were collected along a hospital continuum (HOP). One hospital (87 beds without oncology
unit) and one retirement home (180 beds), sewage effluent as well as an influent and an
effluent of a SWTP (15,000 population equivalents), receiving the wastewater from those
medical center, were analyzed. The treatment processes applied in that SWTP are: physical
treatment (screen raking and grit removal), biological treatment (sequenced aeration tank and
activated sludge) and UV treatment. The surface water impacted by this SWTP input was also
investigated. The sampling points are presented in Figure 1.
Hospital effluent
Retirement home effluent SWTP
Urban effluent : sampling
Figure 1: Sampling points along the hospital continuum.
The samples were collected once during summer season (dry conditions, low intensity
epidemic season) in June 2009 (HOP1) and once during winter season (rainy and high
intensity epidemic season) in December 2009 (HOP2). In summer the samples collected in the
hospital and the retirement home effluents as well as in the surface water were grab samples.
They were manually collected in High Density PolyEthylen (HPDE) bottles. The SWTP
influent and effluent were equipped with a flow-dependant autosampler. The 25 L collecting
container was kept in a refrigerated compartment. The samples were collected in that
container full with around 15 L the sampling day. In winter, the medical center effluents and
the river sampling point were equipped with an autosampler. As a consequence, in winter all
samples were composites samples build up from regular sampling (1 L per hour) during 24h
or 21h and 16h depending autosampler failures. Final samples were build up from 250 mL of
each hourly samples. Sampling characteristics are sum up in Table 2.
Once collected all samples were kept to cold (4°C) and brought back to the laboratory in 24h.
They were filtered in the next 24 hours. Sewage water samples were filtered first on 1.6 µm
and then on 0.7 µm glass fiber filters. Surface water samples were filtered on 0.7 µm glass
fiber filters. Summer samples were kept to cold (4°C) and extracted and analyzed in the next
days. Dissolved phases of the winter samples were frozen (-20°C) in HPDE bottles and
extract and analyzed one month later.
Table 2: Sampling characteristics in summer and in winter along the hospital continuum.
retirement SWTP SWTP river
hospital
home influent effluent (5)
SWTP
influences 87 beds 180 beds 15 000 inhab. eq.
inputs
24h 24h
June 2009 samples (summer) grab grab grab
composite composite
24h 21h 24h 24h 16h
December 2009 samples (winter)
composite composite composite composite composite
452
Publication 3
II.1.1. Agricultural continuum
Because the environment could also be contaminated by pharmaceuticals from veterinary

origin, especially antibiotic compounds, surface water impacted by runoff from land use for
agricultural purposes (cattle feeding or crops) should be studied. Figure 2 shows the samples
collected in the case of surface water along an agricultural continuum (AG). The sampling
sites were chosen depending on how there could be impacted. Site 1 was expected as not or
poorly contaminated because it is not impacted by urban or agricultural activities (forest zone,
no crops nor cattle feeding). Site 2 was impacted by runoff from cattle grazing zone (450
cows with antibiotics and anti-parasitics use). Site 3 is impacted by all the upstream
agricultural zone. Site 4 was expected as the strongest impacted site because it is at the
confluence of 2 small rivers and is used for quantifying the impact of the first small river on
the second one.
cattle
grazing
forest
1
agricultural
3
zone
SWTP
4 5
surface water
hospital continuum
Figure 2: Sampling points (1, 2, 3, 4, 5) along the agricultural continuum.
As for the hospital continuum, the samples were collected once during winter season (rainy
and high intensity epidemic season) in November 2009 (AG1) and once during summer
season (dry conditions, low intensity epidemic season) in June 2010 (AG2). Each sampling
site were equipped with autosampler so all water samples were 24h composite samples
collected in glass bottles. In winter, 1 L was collected every hours and composite samples
were build up with 250 mL from each hourly sample. In summer, 300 mL were collected
every hours and composite samples were build up with 210 mL from each hourly sample.
Nevertheless, in winter, because failure of autosampler, only 3 L were collected on the site 3
(2 L the 2 first hours of the automatic sampling and 1 L 24 hours later manually sampled) and
only 11 L were collected on the site 4. In each case, all the collected volumes were mixed in
order to create the composite samples. Sampling characteristics are sum up in Table 3.
Once collected, winter samples were kept to cold (4°C) and brought back to the laboratory in
24h. They were filtered in the next 24 hours. Once collected, summer samples were kept to
cold (4°C) and brough back to the laboratory in 72h. They were filtered immediately after
they arrived at the laboratory. Every samples were filtered on 0.7 µm glass fiber filters.
Dissolved phases were then frozen (-20°C) in HPDE bottles and extract and analyzed one
month later.
453
Publication 3
Table 3: Sampling characteristics in summer and in winter along the agricultural continuum.
site 1 site 2 site 3 site 4
cattle agricultural stream
Environment forest
grazing (various) 1, 2 and 3
24h 24h 3L 11h
November 2009 samples (winter)
composite composite composite composite
24h 24h 24h 24h
June 2010 samples (summer)
composite composite composite composite
I.3. Sample extraction
The extraction of the compounds was performed by SPE (Solid Phase Extraction) on Oasis
HLB cartridges (200 mg, 6 cc). The protocol is described in Figure 3 and details are provided
in Capdeville et al. (Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics,
-blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid
chromatography tandem mass spectrometry analysis – application to sewage treatment plant
effluents). Briefly the internal standards were added to the samples and then the pH of the
samples was stabilized around 7 with hydrochloric acid or with sodium hydroxide. Next, few
milliliters of a 250 mM solution of Na2-EDTA were added to obtained a final concentration of
10 mM in each sample (for instance 4.16 mL are added for a 100 mL sample). The addition of
EDTA decreases the pH between 4 and 5. The cartridges were conditioned with acetonitrile
and natural mineral water at pH 7. The elution was performed by passing through the
cartridges 5 mL of a NMW/ACN (40/60, v/v) mixture.
Conditioning
5 mL ACN then 5 mL NMW pH 7

Loading sample
water pH 7 + internal standards + Na2-EDTA (final concentration 10 mM)   pH 5

Washing
5 mL NMW pH 7

Drying
1h under vaccum

Elution
5 mL pH 7 NMW/ACN 40/60 (v/v)
Figure 3: SPE protocol for the extraction of pharmaceuticals from the dissolve phase of water samples
(ACN: acetonitrile, NMW: natural mineral water).
The SPE extracts were then concentrated under nitrogen flow at 40°C. The remaining few
microlitres were transferred to a 300 µL insert placed into an injection vial and the first vial
was rinsed tree times with acetonitrile to dissolve and catch the residues. The extracts were
evaporated a second time prior to the analysis in order to change solvent. 300 µL, 200 µL or
100 µL of a mixture of ultrapure water/acetonitrile (90/10, v/v) were added respectively to
454
Publication 3
wastewater, effluent SWTP or surface water extracts before the analysis. The initial sample
volumes were 100 mL for sewage water, 200 mL for SWTP effluent and 300 mL for surface
water.
I.4. Liquid chromatography tandem masse spectrometry
LC analyses were performed using an Agilent 1200 RRLC (Rapid Resolution Liquid
Chromatography) coupled to an Agilent QQQ 6410 triple quadrupole mass spectrometer with
an electrospray ionisation source. To increase the selectivity, compounds were followed in
MRM mode (multi reaction monitoring). Therefore, analytical development began with the
selection of transitions. For confirmatory purpose, two transitions were selected for natural
occurring compounds. Internal standards were followed with only one transition because they
are isotopically labelled compounds which are not likely to be found in environmental
samples and no confirmatory was needed. The first step was the selection of the precursor ion
and the optimization of source parameters to get it: ionization mode (ESI+/ESI-), capillary
voltage (3 kV) and fragmentor energy (individual parameter for each compound). Then
product ions were selected by optimising the collision energy (individual parameter). Finally
the drying gaz (N2) temperature (300°C) and flow (11 L/min) as well as the nebulisation
pressure (30 psi) were optimized in a compromise way. Once the mass spectrometry
parameters obtained, the chromatographic conditions were also developed. Chromatographic
separation was achieved with a Zorbax-SB C18 column (2.1 mm internal diameter and 1.8 µm
particles). A 0.2 µm filter was in front of the column. In the positive ionisation mode, the
compounds were separated on a 10 cm length column whereas only a 5 cm length column was
necessary in the negative ionization mode due to the smallest number of analyzed molecules.
Mobile phases were ultra pure water (A) and acetonitrile (B). To improve compound
separation, resolution and ionization as well as retention time stability, 0.1 % acetic acid in
negative ionization mode and 0.3 % formic acid in positive ionization mode were added to
each mobile phase. Chromatographic gradients are presented in Table 4. The flows were 0.4
mL/min and 0.6 mL/min with the 10 cm and the 5 cm length column respectively. The sample
injection volume was 5 µL.
Table 4: Chromatographic gradients for pharmaceuticals analyzed in ESI+ (left) and ESI- (right).
Time H2O + 0.3 % ACN + 0.3 % Time H2O + 0.1 % ACN + 0.1 %
(minutes) HCOOH (%) HCOOH (%) (minutes) CH3COOH (%) CH3COOH (%)
0 95 5 0 90 10
25 50 50 5 52 48
29.2 40 60 5.5 5 95
30 5 95 8.5 5 95
35 5 95 9 100 0
35.5 100 0
12 100 0
40.5 100 0
41 95 5 12.5 90 10
50 95 5 18 90 10
In the negative ionization mode, all the 27 transitions (twelve standard compounds and 3
internal standards) were followed during all the run time. In the positive ionisation mode,
each of the 149 transitions (66 standard compounds and 17 internal standards) were followed
in a specific window adjusted on the retention time of each compound (“MRMdynamic”).
Each window covers a period of 4 or 8 minutes depending on the compound retention time
455
Publication 3
stability. In this configuration, dwell times were automatically adjusted by the software.
Instrument control and peak integration were carried out using Mass Hunter software
(B.02.01 acquisition and B.03.01 qualitative analysis). The development of mass
spectrometric parameters of the latest internal standards added to the method were performed
thank to the Optimizer option of the software.
I.5. Quantification and method validation
To confirm the identity of the compounds, 4 identification points were used as recommended
by the EU commission decision 2002/657/EC (European Commission 2002): the retention
time (RT), one transition for quantification (TQ) and another one for confirmation (TC) and
the ratio between these 2 transitions.
The analytical validation parameters such as precision, linearity, limits of detection and of
quantification and accuracy were evaluated. Precision correspond to the intra- and inter-day
variability. Intra-day variability corresponds to the relative standard deviation of three
successive injections of a same standard solution. This can be repeated several times, the
same day or at different days. In this case, intra-day variability corresponds to the average of
the various relative standard deviations. Inter-day variability corresponds to the relative
standard deviation of analytical response of sample prepared from the same stock solution and
injected on different days. The sample can be injected several successive times and in this
case, the inter-day variability corresponds to relative standard deviation of the average of
these successive injections. The linearity was evaluated through a series of dilutions of a stock
standard solution mixture of the 78 compounds. Instrumental detection limits (IDL) were
determined using a peak-to-peak signal-to-noise modifying approach. Indeed, as the baseline
was adjusted by the software to 0, those limits were determined only by the height of the
chromatographic peaks as if the height of the noise was 1. Consequently the detection limits
were extrapolated from standard solution injection to a peak height around 10. The
methodological detection and quantification limits were estimated by extrapolation from the
extraction of 200 mL of a NMW spiked at 200 ng/L and for a peak height of 10 and 30
respectively. In order to check the method accuracy, two independent mixtures of the 78
compounds were prepared. One was used to determine the response coefficient between
compounds and their internal standard in the case of internal calibration or was used to
prepare the calibration curve based on a series of dilution in the case of external calibration.
The other one was used to prepare pseudo-unknown concentration samples. Method accuracy
was then determined by comparing the theoretical quantity injected with that calculated either
by internal standard calibration or by external calibration curve. Method accuracy was
checked at the beginning of every analytical sequence. Finally, the whole method developed
was validated on spiked NMW, free from targeted compounds. Several replicates of NMW
were spiked at environmentally relevant concentrations and were submitted to the entire
protocol (SPE + analyses). Extraction recoveries were determined comparing the
concentration obtained, calculated either by internal standard calibration or by external
calibration curve when internal standards are not available, to the theoretical spiking level.
Moreover, to evaluate the performance of the methodology, one NMW spiked was performed
each time in parallel to real sample extraction set. In the same way, to ensure the quality of
sample preparation, laboratory blanks were added every time. These laboratory blanks are
used to assess the potential contamination of real samples during preparation step. In addition,
analytical blank samples, which only contained solvent, were included in every sequence.
They are used to monitor for potential injection-to-injection carryover, as well as instrumental
456
Publication 3
contamination. Besides, to insure the quality of the analytical part, every injection sequence
started with a 3 time standard sample injections. This standard sample was used as a control
card to evaluate the analytical system response and the intra- and inter-day repeatabilities.
II. Results
II.1. Liquid phase chromatography tandem mass spectrometry

development
II.1.1. Mass spectrometry parameters
The development of the MS/MS parameters was performed by injected into a 0.5 mL/min
flow of a 50/50 water/acetonitrile mixture, few micro liters of an individual solution of each
compound. This solution was prepared by diluting 20 µL of the individual stock standard
solution in 180 µL of ultra pure water. The optimization started with the selection of the
precursor ion and the ionization mode to obtain it, by comparing MS Scan spectra. Based on
data found in literature, MS Scan was performed in negative, in positive or in both mode.
Finally 12 compounds were analyzed in negative ionization mode, 9 antibiotics
(chloramphenicol, thiamphenicol, penicillin G, penicillin V, oxacillin, cloxacillin,
dicloxacillin, cephalexin, cefuroxime, fusidic acid), 1 anticancer agent (5-fluorouracil) and 1
anti-HIV antiviral (zidovudine). The 66 remaining compounds were analyzed in positive
ionization mode. The capillary voltage and the fragmentor energy were then optimized,
through the study of the MS Scan spectra, to improve the intensity of the precursor ion. The
selected values were those which gave the most intense ion. Contrary to the fragmentor
energy which is a compound-dependant parameter, the capillary voltage is a common
parameter for all molecules analyzed in a same ionization mode. For this reason, its definitive
adopted value was a compromise between the optimal one of each compound. Once the
precursor ion selected, Daughter Scan spectra were acquired to identify product ions.
Collision energies were chosen to give the maximum intensity of the obtained fragment ion.
The two most intense product ions and their associated collision energy were picked up. To
determine which transitions between those 2 newly obtained will be used for quantification or
confirmatory purpose, chromatograms were needed and so, the chromatographic conditions
should be optimized. Once the chromatographic conditions developed (composition of the
mobile phases, gradient and flow), the solutions used for the first MS/MS parameters
development were individually injected again through the column with the adequate
chromatographic method. The transition which gave the most intense chromatographic peak
was selected as the quantification one and the second one as the confirmation one. These
individual injections allowed also to determine the retention time of each pharmaceutical. All
the analytical conditions obtained are indicated in Table 5. Finally, the 78 standard
compounds mixture solution was injected and the global source parameters such as the drying
gas flow and temperature or the nebulizer gas pressure were optimized in order to obtain the
most intense signal for each transition in a compromise way because those parameters are
common parameters for all the analytes.
457
Publication 3
Table 5: Analytical conditions for the analysis of pharmaceuticals by RRLC/MS/MS in positive and
negative ionization mode (RT: retention time, TQ: transition of quantification, TC: transition of confirmation,
C.E: collision energy, Ac: anticancer agent, Ab: antibiotic, Av: antiviral, b: beta-blocker, i.s: internal standard)
RT fragmentor C.E ratio
class family compounds ESI TQ TC C.E (V)
(min) (V) (V) TQ / TC
Ac anti-metabolite 5-fluorouracil - 0.81 90 129.0 → 42.0 20 129.0 → 58.8 30 13
Ac i.s 5-fluorouracil-15N - 0.81 90 131.0 → 43.0 16
nucleoside reverse
Av zidovudine - 1.48 90 / 100 266.0 → 223.0 2 266.0 → 193.0 6 11
transcriptase inhibitor
Ab phenicol thiamphenicol - 1.66 130 354.0 → 185.0 20 354.0 → 290.2 10 2.2
Ab cephalosporin cephalexin - 1.74 70 346.2 → 233.0 8 346.2 → 268.1 10 1.7
Ab cephalosporin cefuroxim - 2.17 70 423.0 → 207.0 8 423.0 → 318.0 4 1
Ab phenicol chloramphenicol - 3.64 170 321.0 → 152.0 12 321.0 → 257.0 6 1.4
Ab i.s chloramphenicol-d5 - 3.64 110 326.0 → 157.0 14
Ab penicillin penicillin G - 4.32 80 / 70 333.0 → 192.0 4 333.0 → 74.0 24 2.8
Ab i.s penicillin G-d7 - 4.32 85 340.0 → 199.1 2
Ab penicillin penicillin V - 4.82 80 349.0 → 208.1 2 349.0 → 93.0 24 1.2
Ab penicillin oxacillin - 5.15 100 / 70 400.0 → 259.1 10 400.0 → 356.1 2 2.1
Ab penicillin cloxacillin - 5.54 90 434.0 → 293.0 8 434.0 → 257.0 12 16
Ab penicillin dicloxacillin - 6.10 80 468.0 → 327.0 8 468.0 → 424.0 4 2.8
Ab fusidic acid - 7.24 150 515.4 → 393.3 24 515.4 → 455.5 18 1.1
Ac anti-metabolite gemcitabine + 0.84 110 264.0 → 112.0 16 264.0 → 95.0 48 5
nucleoside reverse
Av lamivudine + 1.27 70 230.0 → 112.0 8 230.0 → 95.0 46 5.6
Ab sulfonamide sulfanilamide + 1.29 110 173.0 → 93.0 24 173.0 → 76.0 46 5
Ab imidazole metronidazole + 2.49 80 172.0 → 128.0 12 172.0 → 82.0 26 1.8
Ab penicillin amoxicillin + 3.10 70 / 100 366.1 → 349.1 4 366.1 → 114.0 20 1.3
Ab i.s amoxicillin-13C6 + 3.10 65 372.0 → 355.1 2
b sotalol + 3.24 110 273.1 → 255.1 10 273.1 → 133.0 30 1.5
nucleoside reverse
Av stavudine + 3.62 90 127.0 → 54.0 24 127.0 → 84.0 18 1.9
b atenolol + 3.84 130 267.1 → 145.0 28 267.1 → 74.1 22 1.6
b i.s atenolol-d7 + 3.84 130 274.2 → 145.0 30
Ab sulfonamide sulfadiazine + 4.16 110 251.1 → 156.0 12 251.1 → 108.0 22 1.6
Ab i.s sulfadiazine-13C6 + 4.16 93 257.1 → 162.0 8
Ab sulfonamide sulfapyridine + 5.35 110 250.0 → 155.9 14 250.0 → 92.0 32 1.4
Ab sulfonamide sulfathiazole + 5.47 110 256.0 → 156.0 12 256.0 → 108.0 24 2
Ab sulfonamide sulfamerazine + 5.90 110 265.2 → 156.0 14 265.2 → 108.0 28 1.1
Ab lincosamide lincomycin + 6.38 120 / 110 407.2 → 126.1 30 407.2 → 359.2 18 11
Ab i.s lincomycin-d3 + 6.38 105 410.2 → 129.1 29
nucleoside reverse
Av abacavir + 6.91 150 287.1 → 191.0 18 287.1 → 150.0 32 6.4
Ab quinolone pipemidic acid + 7.21 60 304.2 → 217.3 20 304.2 → 286.3 18 4.3
Ab sulfonamide sulfamethazine + 7.32 130 / 120 279.1 → 186.1 16 279.1 → 92.1 34 2
Ab i.s sulfamethazine- C6 13
+ 7.32 120 285.1 → 98.1 34
Ab sulfonamide trimethoprim + 7.79 140 / 150 291.1 → 230.2 24 291.1 → 261.1 26 1.5
13
Ab i.s trimethoprim- C3 + 7.79 155 294.0 → 233.1 22
Ab penicillin ampicillin + 7.84 110 / 90 350.1 → 106.1 20 350.1 → 192.0 12 2.6
Ab i.s ampicillin- N 15
+ 7.84 105 351.1 → 107.0 21
Ac folic acid antagonist methotrexate + 7.94 150 455.1 → 308.1 18 455.1 → 175.0 42 1.8
Ab sulfonamide sulfamethizole + 8.17 100 271.0 → 156.0 12 271.0 → 108.0 26 2.2
Ab tetracycline oxytetracycline + 8.24 110 / 130 461.1 → 426.1 20 461.1 → 444.1 16 8.7
Ab fluoroquinolone marbofloxacin + 8.44 110 363.1 → 72.1 22 363.1 → 320.1 14 3.5
Ab cephalosporin cefotaxim + 8.64 120 456.2 → 324.0 10 456.2 → 396.2 8 1.1
Ab fluoroquinolone norfloxacin + 8.97 120 320.2 → 276.2 18 320.2 → 302.2 18 1.3
458
Publication 3

Ab i.s norfloxacin-d5 + 8.97 110 325.2 → 281.4 16
Ab fluoroquinolone ofloxacin + 9.02 120 / 90 362.1 → 318.1 18 362.1 → 261.2 30 1.3
Ab i.s ofloxacin-d3 + 9.02 102 365.0 → 321.2 18
Ab tetracycline tetracycline + 9.14 130 / 120 445.1 → 410.1 18 445.1 → 154.1 28 1.8
Ab i.s tetracycline-d6 + 9.14 95 451.2 → 416.1 17
Ab fluoroquinolone ciprofloxacin + 9.38 150 332.1 → 288.2 18 332.1 → 245.1 24 1.4
ciprofloxacin-13C2-
Ab i.s 15 + 9.38 110 336.1 → 291.2 18 26
N
b timolol + 9.99 130 317.1 → 261.0 14 317.1 → 74.0 22 1
Ab fluoroquinolone enrofloxacin + 10.41 130 360.3 → 316.4 20 360.3 → 245.0 28 1.5
b metoprolol + 10.48 140 268.1 → 116.1 18 268.1 → 74.1 22 1
Ab sulfonamide sulfamethoxazole + 10.85 100 / 90 254.1 → 92.1 30 254.1 → 156.1 14 1
sulfamethoxazole-
Ab i.s 13 + 10.85 90 260.1 → 98.1 30
C6
non-nucleoside reverse
Av nevirapine + 11.15 150 267.1 → 226.0 28 267.1 → 80.0 42 2.9
Ac nitrogen mustard ifosfamide + 11.97 130 261.1 → 92.1 28 261.1 → 63.1 52 1.4
Ab tetracycline chlortetracycline + 12.41 120 479.1 → 444.1 22 479.1 → 462.0 16 1
Ac nitrogen mustard cyclophosphamide + 12.47 140 / 130 261.1 → 140.1 22 261.1 → 106.1 18 1.9
Ab lincosamide clindamycin + 13.30 110 425.3 → 126.0 30 425.3 → 377.0 20 18.9
b bisoprolol + 13.51 150 326.2 → 116.0 16 326.2 → 74.0 24 3.3
Ab quinolone oxolinic acid + 13.52 90 262.1 → 244.1 18 262.1 → 216.1 32 7
Ab tetracycline doxycycline + 13.61 130 / 120 445.1 → 428.1 18 445.1 → 410.1 26 17
Ab macrolide spiramycin + 13.80 110 422.4 → 174.2 20 422.4 → 101.0 16 2
Ab macrolide azithromycin + 14,00 70 375.4 → 158.3 22 375.4 → 116.3 24 1.2
Ab sulfonamide sulfadimethoxine + 14.10 100 311.1 → 156.0 18 311.1 → 108.0 26 3.1
Ab i.s sulfadimethoxine-d6 + 14.10 150 317.1 → 162.2 22 30
Ab cephalosporin ceftiofur + 14.42 140 / 130 524.0 → 241.0 16 524.0 → 125.9 46 3.6
b propranolol + 15.06 120 / 130 260.1 → 116.1 16 260.1 → 56.1 32 1.6
b i.s propranolol-d7 + 15.06 110 267.1 → 56.0 36
Ac anthracycline doxorubicin + 15.41 100 / 90 544.1 → 396.9 9 544.1 → 361.0 28 3
Ac anthracycline epirubicin + 16.09 100 / 90 544.1 → 396.9 9 544.1 → 130.1 14 1.1
HIV-1 protease
Av indinavir + 16.58 70 307.7 → 133.0 10 307.7 → 97.0 34 2.7
inhibitor
5 cGMP
viagra phosphodiesterase sildenafil + 17.15 210 / 110 475.1 → 58.1 46 238.1 → 58.1 20 1.3
inhibitor
viagra i.s sildenafil-d3 + 17.11 210 478.2 → 61.0 54
Ab quinolone flumequine + 17.38 90 262.1 → 244.1 18 262.1 → 202.1 36 1.7
Ab macrolide erythromycin + 17.53 150 734.5 → 157.9 36 734.5 → 576.3 18 1.3
Ab i.s erythromycin-13C2 + 17.53 130 736.4 → 159.9 34 20
Ac anthracycline daunorubicin + 17.96 90 528.1 → 321.1 30 528.1 → 363.1 10 1.5
Ab polypeptide bacitracin + 18.35 70 712.0 → 86.1 38 712.0 → 199.0 44 1.4
Ab macrolide tylosin + 18.92 170 916.5 → 174.0 42 916.5 → 772.4 30 5.3
Ab cephalosporin cefpodoxime + 20.17 120 / 150 558.1 → 410.1 14 558.1 → 241.1 20 2.5
Ab polypeptide virginiamycin + 20.91 90 526.2 → 508.1 12 526.2 → 355.1 14 1.5
Ab macrolide clarithromycin + 21,00 150 748.5 → 157.9 30 748.5 → 590.3 18 4.2
Ab i.s clarithromycin-d3 + 21.00 105 751.5 → 161.1 29
Ab macrolide roxithromycin + 21.71 130 / 140 837.5 → 157.9 38 837.5 → 679.3 22 1.2
HIV-1 protease
Av nelfinavir + 23.21 150 568.2 → 330.1 34 568.2 → 467.2 30 2.1
inhibitor
Ab macrolide josamycin + 23.56 160 828.4 → 109.0 46 828.4 → 173.8 34 1.7
HIV-1 protease
Av saquinavir + 23.83 110 336.3 → 285.6 10 336.3 → 128.0 46 1.3
inhibitor
Ac docetaxel + 26.52 90 527.1 → 105.0 46 808.3 → 327.1 22 79
459
Publication 3

Ab tuberculostatic rifampicin + 27.77 160 823.4 → 791.3 18 823.4 → 399.0 20 4.9
HIV-1 protease
Av ritonavir + 28.32 130 / 140 721.2 → 296.0 18 721.2 → 268.1 32 1.6
inhibitor
Ac estrogen antagonist tamoxifen + 29.56 150 372.2 → 72.1 26 372.2 → 129.0 26 25
Ac i.s tamoxifen-d5 + 29.56 170 377.2 → 72.0 24
Ab ionophore salinomycin + 36.13 270 773.4 → 431.1 60 773.4 → 531.3 54 2
Ab ionophore monensin + 36.52 250 693.3 → 675.3 46 693.3 → 461.2 62 1.5
II.1.2. Chromatographic parameters
Once the ability of detecting compounds acquired, the LC parameters could be developed.
The first step consisted in the selection of mobile phases. Due to the hydrophilic
characteristics of a great majority of the targeted compounds, ultrapure water was selected as
mobile phase A. The selection of organic solvent used for mobile phase B was based on
literature data. In numerous articles, methanol (Kasprzyk-Hordern et al., 2007; Vanderford et
al., 2003), acetonitrile (Cahill et al., 2004; Furlong et al., 2008; Ye et al., 2007) or a mixture
of both (Gros et al., 2006; Sacher et al., 2001; US EPA 2007) are used for pharmaceutical
analyses; because penicillin antibiotics react in an unreproducible way with methanol
(AFECT, 1992), acetonitrile was selected. Moreover, one of the big issues in liquid
chromatography is the pressure; the mixture water/acetonitrile is less viscous than the
water/methanol one thus it is another reason to chose acetonitrile rather than methanol at
equivalent effectiveness. To improve ionization process in positive ionization mode, it is
common in LC/MS(/MS) analysis to add acid in mobile phases. Thus, acetic and formic acid
were tested at different proportions, 0.1, 0.3 and 2.5 %. With 0.1 % of acetic acid (pH water =
3.3), the resolution was not good enough, tetracycline, fluoroquinolone and quinolone
chromatographic peaks were too large (e.g: oxytetracycline Figure 4a). With 0.3 % of formic
acid (pHwater = 1.9), good resolution (e.g: oxytetracycline Figure 4b) and good sensitivity was
obtained for a majority of compounds. To define if this chromatogram was obtained because
of formic acid rather acetic one or if it is the pH of the water which allowed to obtain such
chromatogram, a test was performed with 2.5 % of acetic acid which brought the pH of water
around 2. But with these conditions, the sensitivity was really bad (e.g: oxytetracycline Figure
4c). Therefore 0.3 % formic acid in each mobile phase was selected in ESI+.
0.1 % CH3COOH 0.3 % HCOOH 2.5 % CH3COOH

35000 35000 35000
30000 30000 30000
abundance
25000
abundance
25000
abundance
25000
20000 20000 20000
15000 15000 15000
10000 10000 10000
5000 5000 5000
0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
time (min.) (a) time (min.) (b) time (min.)
(c)
Figure 4: Oxytetracycline chromatograms depending which acid was added to the mobile phases (tests
practiced with a 50 x 2.1 mm C18 column).
460
Publication 3
Moreover, acidification of the mobile phases, stabilized their pH and as a consequence the
protonation of compounds, both in positive and negative modes. Therefore, compounds were
always under the same form which allowed to stabilize their retention time. In ESI-, acid was
not necessary to improve ionization process and the intensity of the signal was the best
without any acid. So in first place, no acid was added to mobile phases. Nevertheless, when
injections were repeated several times it was observed a shift of the retention time of
penicillins and chromatographic peaks were divided into two pieces (Figure 5a). For this
reason, even if sensitivity was less, it was necessary to add acid in mobile phases even in ESI-
-. A good compromise between sensitivity and stability was obtained with addition of 0.1 %
acetic acid in water and in acétonitrile (Figure 5b). Then the gradient elution programs were
developed to separate the analytes one from each other. Because of the great number of
compounds analyzed in positive ionization, it was really difficult to separate totally all
pharmaceuticals but thank to MRM mode, a complete separation of the compounds was not
required. Finally total run time was 18 minutes in negative mode and 50 minutes in positive
mode, re-equilibration time included. Chromatograms obtained in each ionization mode are
presented in Figure 6 and in Figure 7.
(a) (b)
Figure 5: Chromatograms of successive analysis of penicillin G without any acid in mobile phases (a)
and with 0.1 % acetic acid in water and in ACN (b).
Because of the great diversity of molecules analyzed, it was really difficult to have a perfect
Gaussian chromatographic peak for each of them. So in ESI+ (Figure 6), it can be noticed that
indinavir (retention time around 16.6 min), an anti-HIV compound, has a long tail. In the
same way, the four tetracycline antibiotics have chair-shaped peaks and lastly bacitracin
(retention time 18.3 min) does not have a nice resolute peak. In ESI-, it can be notice on
Figure 7 that cephalexin (retention time 1.7 min) has a more than one minute very long tail.
461
Publication 3
18000
16000
14000
12000
10000
abundance
8000
6000
4000
2000
0
2
3
5
8
9
0
12
14
15
19
20
23
25
26
29
31
36
37
11
17
22
28
33
34
time (minutes)
Figure 6: Chromatogram of the 66 pharmaceuticals analyzed in ESI +.
cloxacillin
7000
6000
thiamphenicol
5000
penicillin G
dicloxacillin
fusidic acid
penicillin V
oxacillin
4000
abundance
zidovudinel
cefuroxim
3000
chloramphenicol
5-fluorouracil
2000
cephalexin
1000
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
time (min)
Figure 7: chromatogram of a mixture standard solution analyzed in ESI -.
II.1. Sample preparation development
The SPE protocol was first developed for 30 pharmaceuticals and this development is detailed
in Capdeville et al. (Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics,
-blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid
chromatography tandem mass spectrometry analysis – application to sewage treatment plant
effluents). It was optimized through a series of tests in order to select the sorbent phase (Oasis
HLB, Strata X and ENV+), the elution solvent (MeOH, ACN, MeOH/ACN 50/50 v/v, H2O/
462
extraction recovery (%) extraction recovery (%) extraction recovery (%) extraction recovery (%)
50
100
150
200
250
20
40
60
80
100
120
50
100
150
200
250
0
0
0
0
25
50
75
100
125
150
tetracycline azithromycin amoxicillin
ciprofloxacin
ampicillin
tetracycline (iq) clarithromycin
ciprofloxacin (iq) ampicillin (iq)
oxytetracycline clarithromycin (iq)
penicillin G
enrofloxacin
oxytetracycline (iq) erythromycin penicillin G (iq)
chlortetracycline marbofloxacin erythromycin (iq) penicillin V

penicillin V (iq)
doxycycline marbofloxacin (iq) josamycin extraction recovery (%)
oxacillin
chloramphenicol roxithromycin
25
50
75
100
125
150
0
norfloxacin cloxacillin (iq)
chloramphenicol (iq) roxithromycin (iq) cloxacillin
amoxicillin
norfloxacin (iq) cloxacillin (iq)
thiamphenicol spiramycin
ampicillin
dicloxacillin
thiamphenicol (iq) ofloxacin tylosin
Ab macrolides & lincosamides

Ab penicillins & cephalosporins
ampicillin (iq) (iq)

dicloxacillin
Ab fluoroquinolones & quinolones
Ab tetracyclines and others antibiotics

bacitracin ofloxacin (iq) tylosin (iq) cephalexin
penicillin G
monensin lincomycin cefotaxime
penicillin G (iq)
pipemidic acid
cefpodoxime
virginiamycin lincomycin (iq) penicillin V
oxolinic acid ceftiofur
fusidic acid clindamycin penicillin V (iq)
100 ml
cefuraoxim
metronidazole flumequine clindamycin (iq) oxacillin (iq)
cefuraoxim
cloxacillin (iq)
463
extraction recovery (%) extraction recovery (%) extraction recovery (%) extraction recovery (%)
200 ml
cloxacillin
20
40
60
80
100
120
140
160
20
40
120
140
20
40
60
80
100
80
100
120
140
0
0
60
80
100
0
120
140
20
40
60
0
Publication 3
cloxacillin (iq)
sulfadiazine
abacavir daunorubicin atenolol dicloxacillin
sulfadiazine (iq)
300 ml
indinavir doxorubicin atenolol (iq) dicloxacillin (iq)

sulfadimethoxine
sulfadimethoxine (iq)
cephalexin
epirubicin bisoprolol
lamivudine sulfamerazine
cefotaxime
sulfamerazine (iq)
ifosfamide bisoprolol (iq)
nelfinavir cefpodoxime
sulfamethazine
ifosfamide (iq) metoprolol ceftiofur
sulfamethazine (iq)
nevirapine
sulfamethizole
cefuraoxim
cyclophosphamide metoprolol (iq)
sulfamethizole (iq)
cefuraoxim (iq)
-blockers
ritonavir
sulfamethoxazole
Ab sulfonamides
cyclophosphamide (iq) propranolol

antineoplastic agents
sulfamethoxazole (iq)
sample volumes spiked with the same quantity (iq: internal quantification).
saquinavir
docetaxel propranolol (iq) sulfanilamide
stavudine sulfanilamide (iq)
anti-HIV antivirals & PDE 5 inhibitor

gemcitabine sotalol
sulfapyridine
zidovudine sulfapyridine (iq)
methotrexate sotalol (iq)
sulfathiazole
Figure 8: Evaluation fo the breakthrough volume through extraction recovery for different loading
sildenafil tamoxifen timolol sulfathiazole (iq)
trimethoprim
sildenafil (iq) tamoxifen (iq) timolol (iq)
trimethoprim (iq)
Publication 3
ACN 30/70 v/v), the sample conditions (pH 3, 5, 7 and 9; Na2-EDTA addition) and the
evaporation step conditions (level of dryness, solvent use to dissolve residues: ACN or
H2O/ACN in different proportion). The protocol obtained was then applied for the 78
pharmaceutical selection. The only specific test was the breakthrough volume because this
parameter is compound-dependant. For the 30 pharmaceutical selection it was observed a
decrease in extraction recoveries when the volume loaded was equal to or upper than 500 mL
for a majority of compounds. Consequently, for the 78 selection, 100, 200 and 300 mL were
tested. Those different volumes of NMW were spiked with the same quantity of the 78
standard compound mixture solution of pharmaceuticals and then extracted. This
breakthrough phenomenon was observed for sulfanilamide, chloramphenicol, thiamphenicol,
fusidic acid, tamoxifen, atenolol, lamivudine, stavudine and zidovudine (Figure 8). When
available, it was compensated by the use of the isotopically labelled internal standard as
example for atenolol quantified with atenolol-d7 or tamoxifen quantified with tamoxifen-d5
(Figure 8). Nevertheless, sometimes, if the internal standard used is not the isotopically
analogue of the compound studied, the compensation was not sufficient (e.g.: sotalol
quantified with propranolol-d7). Special attention should be paid to the choice of the internal
standard because an inappropriate internal standard will not allow a proper quantification as
demonstrated by Capdeville and Budzinski (2011). Thus depending on molecules the
breakthrough volume can be 200 mL, 100 mL or even less. Therefore the limit of 200 mL was
selected. Nevertheless, because in some matrix like surface water or groundwater, the
contamination level by pharmaceuticals is very low, the reconcentration have to be important.
Thus, for this matrix, sometimes extraction could be done with bigger volumes than 200 mL
(e.g: 300 mL). In those particular cases, specific care should be wearing to the molecules
listed before when isotopically labelled internal standards are not use for quantification
purpose.
II.2. Method validation

The validation parameters are presented in the Table 6. Instrumental detection limits (IDL),
defined from the direct injection of a standard stock solution, varied between 0.1 injected pg
(flumequine or oxolinic acid) and 1400 injected pg (salinomycin). From the analytical point
of view, 5-fluorouracil in ESI- and sulfanilamide, monensin, salinomycin, bacitracin,
rifampincin, docetaxel and stavudine in ESI+, were the less sensitive compounds (> 20
injected pg). Because, no samples, like raw wastewater or SWTP effluent, free from the
selected compounds exist method detection and quantification limits were extrapolated from
the extraction of NMW spiked at 200 ng/L and using a concentration factor of 1000. MDL
varied between 0.03 (bisoprolol) and 142 (bacitracin) ng/L and MQL varied between 0.1
(oxolinic acid, sulfadimethoxine and bisoprolol) and 425 (bacitracin) ng/L respectively. Those
limits included not only analytical performances but also extraction recoveries. For this
reason, compounds which had bad extraction recoveries, had high MDL and MQL even if
they had good IDL. For example, amoxicillin which had good IDL (2 injected pg) but very
poor extraction recovery (2%) had high MDL (100 ng/L). Conversely, monensin which had
high IDL (27 injected pg) but good extraction recovery (97%) had good MDL (0.5 ng/L).
MDL and MQL were not calculated for 5-fluorouracil because extraction recovery of this
compounds is near zero. Intra-day variability in ESI+ corresponded to the average of six
relative standard deviations from three successive injections. The average of all the sixty-six
compounds was 7 %. Intra-day variability in ESI- corresponded to the average of four relative
standard deviations from three successive injections. The average of the twelve compounds
was 5 %. Except for 5-fluorouracil, azithromycin, monensin, salinomycin, bacitracin and
464
Publication 3
rifampicin as well as tetracyclines, intra-day variability was inferior to 10% which is very
good. Inter-day variability in ESI+ corresponded to the relative standard deviation of six
points (average of three successive injections) between the 8th of January and the 21st of May
2010. The average for the 66 compounds was 54 %. Inter-day variability in ESI-
corresponded to the relative standard deviation of four points (average of three successive
injections) between the 15th of January and the 26th of May 2010. The average for the 12
compounds was 29 %. To compensate those inter-day variations, calibration curve were
practiced at the beginning of every injection sequences. Accuracy of the method was really
good with an average of 109 % for the seventy-eight compounds. Nevertheless, fifteen
pharmaceuticals had more than 120 % accuracy. Extraction recovery average of the 78
compounds is 74  39 % which was very good for a such large selection. Nevertheless,
pharmaceuticals can be divided into 3 groups: i) molecules which had good recovery, between
70 and 120%, and low variability (relative standard deviation not shown) inferior to 25 %
such as roxithromycin, clindamycin, sulfonamides except sulfanilamide, four -blockers,
methotrexate, most of the compounds quantified by internal calibration with their isotopically
labelled internal standard, etc; ii) molecules which had good recovery (70 - 120%) but strong
variability (RSD > 25 %) such as azithromycin, oxolinic acid, monensine, abacavir, etc; and
iii) molecules which had low or bad recovery, less than 70 % or more than 120 %, and
moderate or strong variability, superior to 25 % such as oxytetracycline, virginiamycin,
chloramphenicol, daunorubicin, indinavir, etc. In this last group, distinction can be made
between compounds like dicloxacillin or doxycycline which had medium recovery ( 50 - 60
%) and moderate variability (30 – 40 %) and compounds like amoxicillin and
chlortetracycline which had bad recovery (< 10%) and very strong variability (RSD > 50%).
For the last ones (amoxicillin, cefpodoxime, chlotetracycline, virginiamycin, doxorubicin,
epirubicin, gemcitabine), only semi-quantification can be made. Thanks to the internal
standard addition, some compounds were better quantified. For example, lincomycin
extraction recoveries, quantified by external calibration, were very variable without any
explanation, they could vary between 0 and 70 %. The same inconsistence in the extraction
recovery of this compound was also noticed by Ye et al. (2007). The addition of lincomycin-
d3 corrects this problem and average extraction recoveries were around 104  14 %. For the
great majority of compounds, weakness of the protocol could be compensate by the addition
of isotopically labelled internal standards. Some of this compensation are shown in Figure 8
(e.g. penicillin antibiotics, tamoxifen, tetracycline, etc). Nevertheless in the case of
amoxicillin, even with the addition of amoxicillin-13C6, the extraction recoveries remained
low because the internal standard was lost during the SPE and external calibration was
necessary. For this compound, the SPE protocol developed here was not suitable enough and
a specific one had be optimised. It was the same for the 5-fluorouracil, an antineoplastic
compound. For tetracycline, fluoroquinolone and quinolone antibiotics, it was noticed that
these compounds were lost during the evaporation step if dryness was reach. Thus one
possible way to reduce the loss of those compounds without addition of internal standard is to
be careful during this step. Linearity was not presented in the table but was very good (R² >
0.999) between 30 and 1200 injected pg for 50 compounds. When the correlation coefficient
was less than 0.999 smallest range could be used (bracket method).
465
Publication 3
Table 6: Analytical and experimental method validation parameters.

intra-day inter-day accuracy3 extraction
IDL1 MDL2 MQL2
compounds internal standard ESI variability variability (n=19) recovery3
(injected pg) (ng/L) (ng/L)
(%) (%) (%) (n=12) (%)
penicillin G penicillin G-d7 - 0.5 0.4 2 3 31 110  24 101  6
penicillin V penicillin G-d7 - 0.5 0.7 2 3 37 107  9 80  18
oxacillin penicillin G-d7 - 0.4 0.5 2 4 54 109  18 77  17
cloxacillin penicillin G-d7 - 0.4 0.5 2 3 21 107  7 80  22
dicloxacillin penicillin G-d7 - 0.7 2 5 2 14 108  11 61  27
cephalexin - 8 6 17 6 30 97  57 61  62
cefuroxim penicillin G-d7 - 2 2.5 8 2 26 100  5 66  15
chloramphenicol chloramphenicol-d5 - 5 2 5 4 18 106  11 156  28
thiamphenicol chloramphenicol-d5 - 5 2 4 7 33 99  8 111  14
fusidic acid - 15 1 3 4 15 148  74 74  66
5-fluorouracil 5-fluorouracil-15N - 165 n.a n.a 12 61 96  23 0
zidovudine - 2 1 3 4 13 107  10 53  15
amoxicillin + 2 100 301 5 70 116  16 22
ampicillin ampicillin–15N + 2 44 132 5 68 97  18 103  15
cefotaxim + 3 2 7 4 41 104  39 22  24
cefpodoxime + 2 100 300 4 36 116  14 34
ceftiofur + 3 2 6 6 38 113  18 26  25
azithromycin clarithromycin-d3 + 11 0.6 2 12 78 105  11 116  52
clarithromycin clarithromycin-d3 + 0.4 0.1 0.2 4 38 100  7 102  8
erythromycin erythromycin-13C2 + 3 0.3 1 5 37 101  8 115  13
josamycin clarithromycin-d3 + 2 0.3 1 5 40 95  7 98  44
roxithromycin clarithromycin-d3 + 1 0.1 0.4 4 37 98  8 101  11
spiramycin + 13 0.3 1 10 48 132  28 68  25
tylosin clarithromycin-d3 + 3 0.5 2 5 52 103  19 126  34
lincomycin lincomycin-d3 + 0.3 0.1 0.2 7 58 144  74 104  14
clindamycin lincomycin-d3 + 0.2 0.1 0.2 3 70 100  9 97  24
ciprofloxacin ciprofloxacin-13C2-15N + 3 0.5 2 10 42 100  8 105  8
enrofloxacin + 2 0.2 0.5 9 88 101  27 74  26
marbofloxacin ofloxacin-d3 + 1 0.1 0.3 5 60 97  3 87  8
norfloxacin norfloxacin-d5 + 2 0.4 2 9 46 114  15 108  10
ofloxacin ofloxacin-d3 + 0.8 0.1 0.3 5 29 97  4 101  13
oxolinic acid + 0.1 0.04 0.1 5 42 113  40 83  26
pipemidic acid + 2 0.4 2 4 39 95  21 37  21
flumequine + 0.1 0.1 0.2 4 51 112  18 71  23
tetracycline tetracycline-d6 + 0.7 0.3 1 13 37 99  8 112  5
oxytetracycline + 1 0.4 2 18 47 114  15 67  25
chlortetracycline + 2 6 18 11 45 126  27 85
doxycycline + 0.9 0.4 2 14 37 113  24 51  13
sulfadiazine sulfamethazine-13C6 + 0.4 0.1 0.3 8 48 101  16 98  17
sulfadimethoxine sulfadimethoxine-d6 + 0.1 0.04 0.1 4 65 94  15 104  12
sulfamerazine sulfamethazine-13C6 + 0.5 0.1 0.4 7 66 93  15 105  8
sulfamethazine sulfamethazine-13C6 + 0.2 0.1 0.2 6 48 98  7 102  10
sulfamethizole sulfamethoxazole-13C6 + 0.4 0.1 0.4 6 70 94  10 89  9
sulfamethoxazole sulfamethoxazole-13C6 + 1 0.3 1 7 49 97  6 105  10
sulfanilamide sulfamethazine-13C6 + 37 24 70 8 79 101  10 38  25
sulfapyridine sulfadimethoxine-d6 + 0.5 0.1 0.3 8 76 93  17 105  9
sulfathiazole sulfamethazine-13C6 + 0.4 0.2 0.5 6 67 93  14 100  15
trimethoprim trimethoprim-13C3 + 0.7 0.1 0.3 7 49 101  8 97  13
metronidazole + 0.4 0.1 0.2 6 50 95  22 65  21
monensin + 27 0.5 2 27 61 156  30 97  73
466
Publication 3
intra-day inter-day accuracy3 extraction

IDL1 MDL2 MQL2
compounds internal standard ESI variability variability (n=19) recovery3
(injected pg) (ng/L) (ng/L)
(%) (%) (%) (n=12) (%)
salinomycin + 1400 7 22 38 80 179  88 210  84
bacitracin + 407 142 425 11 64 140  35 23  20
virginiamycin + 4 9 28 7 46 110  32 8  11
rifampicin + 26 23 69 23 52 124  33 33  23
atenolol atenolol-d7 + 1 0.5 2 5 49 98  7 99  18
bisoprolol propranolol-d7 + 0.2 0.03 0.1 6 83 99  8 108 ± 14
metoprolol propranolol-d7 + 0.9 0.1 0.4 3 55 99  5 111  16
propranolol propranolol-d7 + 0.5 0.1 0.3 3 50 99  6 100  12
sotalol propranolol-d7 + 0.3 0.1 0.3 4 59 95  6 55  3
timolol propranolol-d7 + 0.4 0.1 0.2 2 73 96  6 62  27
docetaxel + 50 22 65 5 46 121  33 31  15
daunorubicin + 2 0.8 3 3 34 99  13 40  22
doxorubicin + 6 20 60 3 50 104  48 79
epirubicin + 13 25 75 4 46 113  30 99
gemcitabine + 3 13 40 7 66 125  72 62
tamoxifen tamoxifen-d5 + 8 0.5 2 6 32 96  6 105  11
methotrexate + 2 0.3 1 9 61 97  21 74  19
cyclophosphamide propranolol-d7 + 1 0.6 2 5 50 123  59 94  23
ifosfamide propranolol-d7 + 1 0.5 2 6 49 94  5 98  26
indinavir + 12 0.6 2 8 25 124  37 61  26
nelfinavir + 0.5 0.4 2 6 33 130  29 15  9
ritonavir + 7 0.8 3 5 28 141  41 58  29
saquinavir + 1 0.2 0.6 3 71 116  23 39  26
nevirapine + 0.5 0.1 0.2 9 75 116  32 86  34
abacavir + 0.5 0.1 0.2 8 53 103  12 84  28
lamivudine + 0.6 0.3 1 7 76 99  44 16  10
stavudine + 22 9 26 7 67 123  33 58  22
sildenafil sildenafil-d3 + 3 0.3 1 5 72 109  19 102  11
1
: Instrumental detection limits obtained by extrapolation of direct injection of standard stock solution (height = 10)
2
: Method detection limits and method quantification limits obtained by extrapolation of a 200 mL natural mineral water
spiked at 200 ng/L and undergoing the whole protocol (concentration factor = 1000) (height = 10 and 30 for MDL and MQL
respectively). n.a: not available
3
: accuracy and recovery quantified by internal standard or by external calibration curve depending on the availability of
internal standard (mean  standard deviation).
II.3. Method application
To verify the developed protocol applicability, the whole methodology was applied to various
samples from different origins and collected at two different seasons (winter and summer).
Hospital continuum monitoring results are presented in Figure 9.
467
Publication 3
retirement home effluent

hospital effluent 58 697
160 584 141 656 25 000
50 000
46 252 21 932
45 000
20 000
40 000
35 000 32 216
15 000
30 000
25 000
10 000 8 858
20 000
15 000 5 412
10 000 7 890 5 000
5 000 1 515 1 189 1 346

820 1 014 25 1 590 694 679 169 13
7 9 10 45 6 36 4 55 31
0 0
Ab b- Ab MC Ab FQ & Ab TC Ab SA others Ab b-bloc. antineo. anti-HIV PDE 5 Ab b- Ab MC Ab FQ & Ab TC Ab SA others b-bloc. antineo. anti-HIV PDE 5
lactam & LC Q inhibitor lactam & LC Q Ab inhibitor
influent summer influent winter effluent summer effluent winter summer winter
14000 SWTP 160 584 141 656 surface water
14 000 50 000
12000
11710 30046 252
11710 45 000
12 000
(ng/l)(ng/l)
10000 250 240

40 000
10 000
concentration
8000
7115 35 000
200 32 216
concentration
8 000 7115
6000 30 000
4601 3902 150
6 000 3736
4000 3443 25 000
4601 3902
1763 2138
3736 100 87
4 000
2000 1666
3443 924 20 000
729 442 148 716 302
1763 323 467 215 245 205
2138 37
41 357 210 111 14 169 65 26 2 15 000
188 27 5 1 32
2 000 1666 10 924 53 50 36 30
0 442 148 716 302 25
729 467 245
215 others 15
Ab b-41 Ab MC Ab 323
FQ & Ab TC Ab SA b-bloc. antineo. anti-HIV PDE 9
27 5
205 7 890
5 4
357 210 111 14
10 169 65 53 26 2 10
188000 51 1,5 6 0,6 0,13
0 lactam & LC Q Ab inhibitor 0
Ab b- Ab MC Ab FQ & Ab TC Ab SA others b-bloc. antineo. anti-HIV PDE 5
5 000 1 515 antineo. anti-HIV PDE 5
Ab b- Ab MC Ab FQ & Ab TC Ab SA others Ab b-bloc.
lactam & LC Q Ab inhibitor lactam 820
& LC Q1 014
25 1 590 694
7 9 10 inhibitor
45
0
Figure 9: Pharmaceuticals contamination along the hospital continuum.
Ab b- Ab MC Ab FQ Ab TC Ab SA others b-bloc. antineo. anti-HIV PDE 5
lactam & LC &Q Ab inhibitor
Table 7: Sum of the pharmaceutical loads (mg/d) and removl (%) in the SWTP for each antibiotic families
or therapeutic classes.
winter summer
influent effluent removal influent effluent removal
(mg/d) (mg/d) (%) (mg/d) (mg/d) (%)
Ab -lactams 3 283 184 94 0 0
Ab macrolides &
15 496 7 497 52 9 661 3 703 62
lincosamides
Ab quinolones &
1 991 944 53 749 679 9
fluoroquinolones
Ab tetracyclines 668 46 93 234 30 87
Ab sulfonamides 4 158 3 221 23 980 451 54
Ab others 1 104 239 78 355 136 62
-blockers 32 018 17 560 45 24 590 7 846 68
antineoplastics 119 10 92 0 0
anti-HIV 1 360 844 38 4 490 431 90
sildenafil 0 7 57 10 83
total 60 196 30 551 49 41 117 13 285 68
The studied hospital does not treat cancer patients that is why almost no anticancer were
detected in the hospital effluent. -blockers and above all antibiotics were the most found
compounds and as it can be expected, the concentrations were higher in winter (343.4 µg/L
for the sum of the compounds) than in summer (48.7 µg/L for the sum of the compounds).
Looking at the use of these drugs, it seems logical that they are found more in winter than in
summer. In winter, -lactams (160.6 µg/L) and fluoroquinolones and quinolones (141.7 µg/L)
468
Publication 3
were the most important ones whereas in summer, macrolides were the largest (46.2 µg/L). In
retirement home effluent, antibiotics and -blockers are the most abundant compounds.
Antibiotics were found principally in winter (winter: 81.3 µg/L, summer: 2.7 µg/L). -blocker
concentrations were almost the same independently of the season (winter: 5.4 µg/L, summer:
8.9 µg/L) which is logical regarding the use of these drugs and the sample origin. In SWTP,
macrolide antibiotics and -blockers were the most important compounds found for the 2
seasons (Figure 9 SWTP) nevertheless, anti-HIV drugs, sulfonamide, fluoroquinolone and
quinolone antibiotics were also detected in high concentrations. Sulfonamides were found at
quite high concentrations in those samples (> 200 ng/L in summer and > 700 ng/L in winter)
whereas they were found at very low quantity in hospital and retirement home effluents which
means that they were more used in ambulatory medicine than in hospital one. All
pharmaceutical classes were well degraded in that SWTP with concentration in effluent
(winter: 6.8 µg/L, summer: 6.3 µg/L for the sum of the compounds) lower than in influent
(winter: 13.4 µg/L, summer: 19.6 µg/L for the sum of the compounds). By taking into account
the flow in the SWTP (2,100 m3/d in dry conditions (summer) and 4,500 m3/d in wet
conditions (winter)), loads of pharmaceuticals were calculated (Table 7). As for the
concentration data, macrolide antibiotics and -blockers were the groups of compounds which
contribute the more to the raw and the treated wastewater contamination. In winter, in one
day, the SWTP release 17.6 g of -blockers and 7.5 g of macrolides and in summer, the
SWTP release 7.8 g of -blockers and 3.7 g of macrolides. At the opposite, contrary to
macrolides and -blockers, the seasonal variation of the loads of anti-HIV was not the same
than the seasonal variation of the concentrations. Indeed, the anti-HIV SWTP effluent
concentration was higher in summer (205 ng/L) than in winter (188 ng/L) whereas the anti-
HIV SWTP effluent load was higher in winter (844 mg/d) than in summer (431 mg/d). As a
consequence, surface water received more anti-HIV in winter than in summer. The same trend
is observed for all compounds if their quantity were summed. Releases are more important in
winter than in summer. In total, in one day, in winter, 60.2 g of the studied pharmaceuticals
entered into the SWTP and 30.5 g were discharge into the surface water; in summer, 41.1 g of
the studied pharmaceuticals entered into the SWTP and 13.3 g were discharge into the surface
water. Nevertheless, surface water was more contaminated in summer (435 ng/L for the sum
of the compounds) than in winter (91 ng/L for the sum of the compounds). Consequently,
surface water was more impacted by the SWTP discharge in summer especially by -blocker
compounds, may be because of the dilution phenomena which were less important. Finally,
by taking into account the differences between the influent and the effluent loads, removal
rate in the SWTP were calculated for each antibiotic families or therapeutic classes. In winter,
-lactams, tetracyclines and antineoplastics were well removed with removal rate upper than
90 %. At the opposite, sulfonamides and anti-HIV were slightly removed with respectively 23
% and 38 % of removal rate. Except for quinolones and fluoroquinolones, summer removal
rates were better or more or less the same than winter ones. Moreover, the global removal
rate, calculated from the total loads (sum of each groups loads), was better in summer (68 %)
than in winter (49 %). So it appeared that the SWTP is more efficient in summer than in
winter.
Agricultural continuum monitoring results are presented in Figure 10. Pharmaceutical

concentrations were really lower in those samples (< 40 ng/L) compare to the hospital
continuum ones. River 1 and 2 were mainly contaminated by antibiotics. Detection of
lincomycin, tylosin and enrofloxacin (3.2 ng/L in summer) antibiotics in the river 1 and
detection of lincomycin, enrofloxacin (2.9 ng/L in summer) and sulfadiazine (0.5 ng/L in
summer) antibiotics in river 2, indicate an agricultural influence of the contamination,
probably in relation with cattle breeding activities. Indeed, those antibiotics are used in
469
Publication 3
veterinary medicine and were already detected in manures from live stock by Hu et al. (2010)
and Martinez-Carballo et al. (2007). Moreover, enrofloxacin and tylosin are used only in
veterinary treatment. River 3 and 4 were contaminated by antibiotics but also by -blockers
and by anti-HIV and antineoplastics in summer for river 3. The presence of these various
pharmaceutical classes suggests a human origin of the contamination. Moreover, the detection
of oxytetracycline and sulfadiazine, antibiotics used in veterinary medicine and already
detected in manures from live stock by Hu et al. (2010) and Martinez-Carballo et al. (2007),
suggests also an agricultural influence of the contamination of those river. Otherwise, the
number of antibiotics detected in each river (Table 8) and the total concentration of
pharmaceuticals increase along the continuum. As a consequence, site 4 was more
contaminated (77 ng/L in winter and 75 ng/L in summer for the sum of the compounds) than
sites 1 (12 ng/L in winter and 6 ng/L in summer for the sum of the compounds) and 2 (7 ng/L
in winter and 8 ng/L in summer for the sum of the compounds). Contrary to the hospital
continuum where a decrease of the contamination was observed along the continuum (Figure
11a), an increase of the contamination was observed along the agricultural continuum with the
increase of the anthropic pressure (Figure 11b).
river 1 river 2
12 5 5
10 5
10
4
8 4 3
3
6 3
2
4 3
2 1 1
1
2
2 1 0,5 0,5
0,8
0,2 1 0,1
0 0
summer winter
river 3
160 584 141 656
river 4
25 50 000 46 252 40 37
45 000
20 35
20
40 000 30 27
15 25 21
35 000
13 32 216
10 1111 20 16
30 000 14
10 8 15
25 000 8
10
5 3 2 20 000 3 3 5
2 4
1 0,7 5 0,8 2 1 0,6
0 15 000 0
10 000 7 890
5 000 1 515
820 1 014 25 1 590 694
7 9 10 45
0
Figure
Ab 10: Pharmaceuticals
b- Ab MC Ab FQ Ab TCcontamination alongantineo.
Ab SA others b-bloc. the agricultural
anti-HIV PDE 5continuum.
lactam & LC &Q Ab inhibitor
Table 8 : Number of antibiotics detected at each sampling site along the agricultural continuum in
summer and in winter.
river 1 2 3 4
nb Ab summer 6 7 12 15
nb Ab winter 5 5 9 15
470
Publication 3
summer winter
summer winter
345
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0
0
hospital retirment SWTP SWTP river
1 2 3 4
home influent effluent
(a) sampling sites (b)
Figure 11: Total concentration (Σ78) in winter and in summer of the studied pharmaceuticals along the
hospital continuum (a) and the agricultural continuum (b).
Conclusion
The developed multi-residue method, based on SPE following LC/MS/MS analysis, was
successfully applied to the analysis of numerous pharmaceuticals belonging to 5 therapeutic
classes in various types of water samples, from the most simple such as surface water to
complex ones like wastewater samples. This method allows simultaneous extraction of 78
compounds with a wide panel of physico-chemical properties. Extraction recoveries were
really good, between 70 and 130 %, for 44 compounds and good, between 35 and 70 %, for
24 ones. Respectively, 7 and 2 compounds had extraction recoveries between 10 and 35 %
and upper than 130%. 8 were only semi-quantified because of their poor extraction recoveries,
inferior to 10 %. Specific SPE should be optimized in the future for amoxicillin and 5-
fluorouracil. The molecules were analyzed by RRLC/MS/MS in positive or in negative
ionisation mode which provided suitable speed, selectivity and sensibility (MQL between 0.1
and 132 ng/L except amoxicillin 300 ng/L, cefpodoxime 300 ng/L and bacitracin 425 ng/L)
for routine environmental monitoring. The application of this protocol revealed a strong
contamination of hospital and retirement home wastewater effluents with seasonal variability
(antibiotic contamination was stronger in winter than in summer). However it can be seen an
important decrease in pharmaceutical contamination along the hospital continuum (from 345
µg/L in hospital effluent to 91 ng/L in surface water in winter for the sum of the compound).
Results of the agricultural continuum study has revealed a low contamination by
pharmaceuticals (< 40 ng/L) but an influence of the agricultural practices especially in river 1
and 2. Moreover, it can be seen an increase in pharmaceutical contamination along the
agricultural continuum with the increase of the anthropic pressure. The perspective of that
work is the use of the developed protocol for chemical analyses in parallel to microbiological
studies in order to monitor the impact of antibiotic contamination on bacterial antibiotic-
resistance phenomenon.
Acknowledgments
The authors wish to thank the “ Région Aquitaine ” and program FLASH (CNRS-Ec2Co
and CPERA2E Seine Aval) for research funding. They want also to acknowledge the
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherché, the ANR SEST DIPERPHA
project and the “Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie” (ADEME) for
providing the PhD grant of M.J. Capdeville. The authors thank people who made the
sampling campaign in the context of the FLASH project.
471
Publication 3
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Par Marion-Justine CAPDEVILLE

POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

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CHAPITRE 1 : GENERALITES ................................................................................................................. 35

VIII.2. Français ................................................................................................................................. 100

OBJECTIFS DE CES TRAVAUX DE THESE ......................................................................................... 105

CHAPITRE 2 : LES COMPOSES ETUDIES ............................................................................................ 109

CHAPITRE 3 : MATERIEL ET METHODE ........................................................................................... 147

CHAPITRE 4 : DEVELOPPEMENTS ANALYTIQUES ......................................................................... 185

CHAPITRE 5 : APPLICATIONS ENVIRONNEMENTALES ................................................................. 223

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