PH DThesis FGaudiere

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Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux : Modulation

des comportements cellulaires en fonction du microenvironnement physico-
chimique et mécanique
Thesis · June 2013

DOI: 10.13140/RG.2.1.2376.0487
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Fabien Gaudière
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Université de Rouen
Thèse
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE ROUEN
Discipline : Chimie des matériaux
Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux:

Modulation des comportements cellulaires en fonction du
microenvironnement physico-chimique et mécanique
Le 25 juin 2013
par Fabien GAUDIÈRE
Directeur de thèse M. Hassan ATMANI

Professeur, Université de Rouen
Membres du Jury :
Rapporteurs externes Mme Joëlle AMÉDÉE

Directeur de Recherche INSERM, Université de Bordeaux Segalen
Mme Csilla GERGELY
Professeur, Université de Montpellier II
Examinateurs externes M. Emmanuel PETIT

Maître de Conférences, Université de Picardie
M. Emmanuel PAUTHE
Professeur, Université de Cergy-Pontoise
Examinateurs internes M. Jean-Pierre VANNIER

Professeur, Université de Rouen
Mme Béatrice LABAT
Maître de Conférences, Université de Rouen
M. Guy LADAM
Maître de Conférences, Université de Rouen
Remerciements
J’aimerais adresser mes sincères remerciements aux membres du jury qui ont accepté de
juger ce travail :
Au Pr Joëlle Amédée et au Pr Csilla Gergely, pour avoir accepté de juger ce travail et de

participer à mon jury de thèse en tant que rapporteurs.
Au Dr Emmanuel Petit et au Pr Emmanuel Pauthe pour avoir accepté de participer à mon

jury de thèse en tant qu’examinateurs.
Je tiens à remercier le Pr Jean-Pierre Vannier, directeur de l’EA3829 MERCI de m’avoir

accueilli dans son laboratoire. Je le remercie également d’avoir accepté de participer à mon
jury de thèse.
Je remercie le Pr Hassan Atmani pour la confiance qu’il m’a accordée en m’acceptant au

sein du La2B. Son aide et son soutien m’ont été précieux tout au long de ces années.
Mes sincères remerciements au Dr Béatrice Labat et au Dr Guy Ladam, pour leur confiance
et le temps qu’ils m’ont consacré dès le début de ce projet. Je les remercie également pour la
qualité de leur encadrement. Merci d’avoir toujours été là quand j’en avais besoin, pour
votre soutien et vos encouragements. Vous m’avez tous deux énormément appris.
Je tiens également à remercier le Dr Ingrid Masson de l’EAC CNRS 4396 pour les tests
mécaniques de nos substrats.
Je remercie le Conseil Général de l’Eure et le Grand Évreux Agglomération pour leur

participation au soutien de cette thèse.
À tous les membres du La2B/SMS du Centre Universitaire d’Evreux : Dr Valérie Dupray, Dr

Sandrine Morin, Dr Benjamin Berton, Dr Olivier Thoumire, Lucia Bertolini Forno. Merci
pour le temps que vous m’avez accordé, pour les explications techniques, merci encore
d’avoir répondu à mes questions. Votre aide m’a été précieuse.
1
Merci encore à tous les thésards qui sont passés au La2B ou qui y sont encore : Dr Khalil
Abdelkebir, Dr Audrey Waldschmidt, Dr Nimrod Buchbinder, Araceli Solís Gómez. Merci
aussi aux stagiaires : Romain Cavé, Rim Khelif, Lucía Martínez Jothar, Laure Bélières.
À tout le monde un grand merci pour votre aide, votre solidarité, pour les pauses café et pour
la bonne ambiance ! Merci d’avoir été là quand j’en avais besoin.
Je remercie également l’ensemble du personnel administratif et technique du Centre

Universitaire d’Evreux – Tilly.
Merci aussi au Dr Laurent Bidault et au Dr Pierre Lembré qui, malgré l’éloignement ont
toujours répondu présent pour m’aider (merci pour les papiers !).
Un merci particulier au Dr Mathilde Hindié qui a accompagné mes premiers pas dans le
monde de la recherche. Les conseils que tu m’as donnés pendant mon M2 m’ont été utiles
pendant ces quatre années, et le seront encore.
Merci aussi à mes amis qui ont eu à supporter mes histoires concernant le déroulement de ma
thèse.
Un grand merci à mes parents, de m’avoir porté et accompagné depuis toujours. Sans eux, je
n’en serais pas là aujourd’hui. Merci d’avoir eu foi en moi, d’avoir respecté mes choix. À
Fanny et à Clément aussi.
Un merci tout particulier à ma petite famille, Candice et Valentin, qui ont été sources de
réconforts et de motivation.
2
Table des matières
Liste des abréviations 8
Index des illustrations et tableaux 11
Introduction 18
Chapitre I - Etude Bibliographique 20
I.A Les biomatériaux 21

I.A.1 Généralités 21
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité 21
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux 22
a. Modifications des propriétés intrinsèques 22
b. Traitements de surface 22
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.B.1 Introduction 23
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL 23
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL 27
a. Mécanismes d’assemblage 27
b. Influence des conditions de construction 30
c. Films LbL biomimétiques 33
d. Le système (CSA/PLL) 34
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL 37
a. Réticulation des films LbL 37
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs 38
I.C Le tissu osseux 43

I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse 44
a. La phase organique 44
b. La phase minérale 45
I.C.2 Les cellules osseuses 45
a. Lignée ostéoformatrice 46
b. La lignée ostéorésorbante 47
I.C.3 Le remodelage osseux 47
I.D Interactions cellules-matériaux 49

I.D.1 Influence de la chimie de surface 49
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau 50
a. Topographie 50
b. Mécanique 52
3
I.E Références bibliographiques 55
Chapitre II - Matériels et Méthodes 66
II.A Préparation des substrats 67

II.A.1 Produits et Solutions 67
a. Les tampons 67
b. Les polyélectrolytes 68
II.A.2 Les substrats PDMS 70
II.A.3 Construction des films LbL 71
a. Nettoyage et préparation des surfaces 71
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS 71
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS 72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion
Totale Atténuée, FTIR-ATR 73
a. Principe 73
b. Déroulement de l’analyse 75
c. Appareillage 75
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM 75
a. Principe 76
b. Traitement des données 77
c. Appareillage 78
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D 79
a. Principe 80
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn 81
c. Appareillage 83
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS 84
a. Principe 84
b. Traitement des données OWLS 85
c. Appareillage 86
II.B.5 Essais mécaniques 87
a. Principe 87
b. Déroulement des expériences 89
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation 91
d. Appareillage 91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact 92
a. Principe 92
b. Réalisation des mesures 92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB 93
II.B.8 Microscopie à épifluorescence 93
a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente 93
b. Préparation des substrats et observations 94
4
II.C Fonctionnalisation des films LbL 94
II.C.1 Réticulation par la génipine 94
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine 96
II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire 97
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire 97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue® 98
II.D.4 Évaluation de la différenciation 98
a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL 98
b. Minéralisation de la matrice extracellulaire 99
II.D.5 Tests statistiques 99
II.E Références bibliographiques 100
Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la rigidité du substrat sur le

comportement de préostéoblastes murins MC3T3-E1 102
III.A Introduction 102
III.B Analyse des substrats 105

III.B.1 Substrats PDMS bruts 105
a. Caractérisation mécanique 105
b. Caractérisation de surface 108
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL 112
a. Adsorption de la couche précurseur de PEI 112
b. Caractérisation des films LbL 113
III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.C.1 Morphologie cellulaire 116
III.C.2 Prolifération cellulaire 121
III.C.3 Différenciation cellulaire 123
III.D Conclusion 127
III.E Références bibliographiques 127
Chapitre IV - Influence de la réticulation des films CSA/PLL par la génipine sur le

comportement des préostéoblastes MC3T3-E1 133
IV.A Introduction 133
5
IV.B Caractérisation des films CSA/PLL natifs et réticulés 135
IV.B.1 Caractérisation spectroscopique 135
a. Suivi de la réaction de réticulation par spectroscopie UV-visible 135
b. Analyse des films par spectroscopie FTIR-ATR 138
IV.B.2 Caractérisation structurale et mécanique par QCM-D 139
a. Suivi de la construction et de la réaction réticulation 139
b. Modélisation viscoélastique 141
c. Étude de la stabilité des films 143
IV.B.3 Caractérisation morphologique et structurale par microscopies optique, à
fluorescence et à force atomique 145
a. Cas des films PEI/(CSA/PLL)6 146
b. Cas des films PEI/(CSA/PLL)12 149
IV.B.4 Caractérisation mécanique par nanoindentation AFM 152
IV.C Étude des comportements cellulaires 155

IV.C.1 Adhésion et morphologie cellulaires 155
a. Étude par microscopie optique 155
b. Étude par microscopie à fluorescence 159
IV.C.2 Prolifération cellulaire 161
IV.C.3 Différenciation cellulaire 165
a. Dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) 165
IV.D Conclusion 171
IV.E Références bibliographiques 173
Chapitre V - Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL) en

vue du relargage de composés actifs. 178
V.A Introduction 178
V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD 179

V.B.1 Mise au point de la méthode d’incorporation 179
V.B.2 Influence du précurseur PEI 187
V.B.3 Influence de la charge externe du film et du vecteur 188
V.B.4 Influence de la concentration du vecteur 191
V.C Influence du pH et de la force ionique 192

V.C.1 Influence du pH 193
a. Rinçage à pH 4.5 193
b. Rinçage à pH 8,5 195
V.C.2 Influence de la force ionique 197
6
V.D Conclusion 198
V.E Références bibliographiques 199
Conclusion et Perspectives 202
Liste des communications 206
7
Liste des abréviations
Polymères :
ALG Alginate
CHI Chitosan
CS Chondroïtine sulfate
CSA Chondroïtine Sulfate A ou chondroïtine-4-sulfate
DS Dextrane sulfate
GAG Glycosaminoglycane
HA Acide hyaluronique
HAP Hydroxyapatite
PA Polyacrylamide
PAA Poly(acide acrylique)
PAH Poly(hydrochlorure d’allylamine)
pCD Polymère de cyclodextrines
PDADMAC Poly(chlorure de diallyldimethylammonium)
pDMAEMA Poly[2-(diméthylamino)éthyl methacrylate]
PDMS Poly(diméthylsiloxane)
PE Poly(éthylène)
PEI Poly(éthylène imine)
PGA Poly(acide glutamique)
PLL Poly(L-lysine)
PLLA Poly(acide L-lactique)
PMMA Poly(méthylmétacrylate)
PSS Poly(styrène sulfonate)
PTFE Poly(éthylènetéréphtalate)
βTCP β-Tricalcium phosphate
8
Protéines et facteurs de croissance :
BMP Protéine morphogénique osseuse (« Bone Morphogenic Protein »)

COL Collagène
FGF Facteur de croissance de fibroblaste (« Fibroblast Growth Factor »)
IGF Facteur de croissance de type insuline (« Insuline like Growth Factor »)
PAL Phosphatase alcaline
PhV Phosvitine
TGFβ Facteur de croissance transformant β (Transforming Growth Factor β »)
Fn Fibronectine
Solvants et réactifs :
FITC Fluorescéine isothiocyanate

PNPP p-nitrophénol phosphate
Tris Tris[hydroxyméthyl]aminométhane
DPBS Tampon phosphate salin de Dulbecco (« Dulbecco’s Phosphate Buffer
Saline »)
GnP Génipine
TBBA Acide 4-tert-butylbenzoïque
EDC [1-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl)carbodiimide]
NHS N-hydroxysulfosuccinimide
Appareils et techniques :
AFM Microscopie à force atomique (« Atomic Force Microscopy »)

FTIR-ATR Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en mode de réflexion
totale atténuée (« Attenuated Total Reflectance Fourier Transformed
Infrared spectroscopy »)
MEB Microscopie Électronique à Balayage
OWLS Spectroscopie par guide d’onde optique (« Optical Waveguide Lightmode
9
Spectroscopy »)
QCM-D Microbalance à cristal de quartz avec contrôle de la dissipation (« Quartz
Crystal Microbalance with Dissipation monitoring »)
10
Index des illustrations et tableaux
Illustrations
Figure I-1 : Film de Langmuir-Blodgett et Monocouche Auto-assemblée (SAM) 24
Figure I-2 : Principe de la technique LbL 25
Figure I-3 : Évolution du potentiel Zêta pendant la construction d’un film PEI/(PSS/PAH)n 26
Figure I-4 : Évolution de la masse adsorbée et de l’épaisseur de films LbL, par QCM-D 27
Figure I-5 : Représentation schématique de l’évolution de l’épaisseur des trois zones lors de
la construction d’un film LbL 28
Figure I-6 : Évolution de l’épaisseur de films (HA/PLL) 29
Figure I-7 : Évolution des fréquences normalisées suivies par QCM durant la construction de
films CHI/HA 30
Figure I-8 : Influence de la nature des contre-ions sur la croissance et l’épaisseur de films
LbL 33
Figure I-9 : Évolution (A) de l’épaisseur et de la masse adsorbée suivies par QCM-D et (B)
de l’épaisseur suivie par OWLS pour des films PEI/(CSA/PLL)6 en fonction du nombre de
couches 35
Figure I-10 : (A) Spectres de référence des polyélectrolytes et suivi étape par étape de la
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)12, par FTIR-ATR. (B) Évolution de l’absorbance
moyenne de trois pics spécifiques de films PEI/(CSA/PLL)6/CSA 36
Figure I-11 : Modèle structural proposé pour les films PEI/(CSA/PLL)6, basé sur la QCM-D,
l’OWLS, le FTIR-ATR et l’AFM 36
Figure I-12 : Mécanismes de relargage de composés bioactifs par des films LbL 42
Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses 46
Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux 47
Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains 52
Figure I-16 : Déplacement et accumulation de cellules vers la zone rigide d’un gel présentant
un gradient de rigidité 53
11
Figure I-17 : Influence de la rigidité du substrat sur la différenciation de cellules souches
mésenchymateuses 54
Figure II-1 : Le polyéthylèneimine, PEI 68
Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL 69
Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA 69
Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS 70
Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules 73
Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion 74
Figure II-7 : Profil de décroissance de l’onde évanescente infrarouge (n2 < n1). 74
Figure II-8 : Principe de fonctionnement d’un microscope à force atomique (AFM). 76
Figure II-9 : Evolution de la force F exercée sur la pointe par l’échantillon en charge et en
décharge 77
Figure II-10 : Modèles de pointes sphérique (modèle de Hertz) ou coniques (modèle de

Sneddon) utilisées en nanoindentation par AFM 77
Figure II-11 : Capteur QSX301 (Q-Sense AB) 80
Figure II-12 : Principe de la mesure QCM-D 80
Figure II-13 : Calcul des paramètres (fn ; Dn) par modélisation de la courbe expérimentale
d’amortissement par une sinusoïde amortie 81
Figure II-14 : Profils de l’évolution des paramètres mesurés en QCM(-D) pour un dépôt
rigide (Δf : vert) et pour un dépôt viscoélastique (Δf : bleu ; ΔD : rouge). 82
Figure II-15 : Système QCM-D D300 (Q-Sense AB) 83
Figure II-16 : Architecture de la cellule de mesure. Le sens d’écoulement est indiqué par des
flèches 83
Figure II-17 : Schéma représentant le principe de la spectroscopie optique par guide d'onde 84
Figure II-18 : Évolution typique des angles de couplage αTE et αTM lors du dépôt de matière
sur un guide d'onde OWLS 85
Figure II-19 : Dispositif OWLS comportant l’unité d’injection, le thermostat et la cellule de

mesure et schéma de principe de la cellule de mesure 87
Figure II-20 : Courbe de contrainte-déformation typique d’un matériau ductile 88
Figure II-21 : Exemples de courbes de contrainte-déformation de matériaux présentant des

comportements mécaniques différents 89
12
Figure II-22 : Schéma de fonctionnement d’un banc d’essai 89
Figure II-23 : Formes et dimensions des éprouvettes de PDMS pour les tests en compression
et en tension 90
Figure II-24 : Photographies des montages des tests en compression et en tension

d’échantillons de PDMS 90
Figure II-25 : Déformation (∆L) d’éprouvettes lors d’essais en compression et de traction

sous l’effet de la force axiale (F) 91
Figure II-26 : Illustration graphique de la relation de Young-Dupré reliant la forme d’une

goutte de liquide (angle de contact θ) aux différentes interfaces en jeux à la triple interface
(γLV, γSL et γSV) 92
Figure II-27 : Structure moléculaire de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) 93
Figure II-28 : Mécanisme présumé de la réaction de réticulation d’amines primaires par la

génipine 95
Figure III-1 : Courbes de contrainte-déformation en compression et en traction pour les

substrats PDMS-3, -5, -7, -10 et -20 bruts 106
Figure III-2 : Courbes d’évolution de Einc en fonction de la déformation de l’éprouvette de

PDMS, lors de test en compression et en traction 107
Figure III-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 108
Figure III-4 : Angle de contact statique : images et mesures effectuées avec une goutte de
5µL de tampon Tris – NaCl, à température ambiante, sur les substrats PDMS 110
Figure III-5 : Images MEB d’un substrat PDMS-5 découpé à l’aide d’un emporte pièce, à
deux grossissements différents 111
Figure III-6 : Images MEB de la surface des substrats PDMS-3 et -10 moulés dans des boites
de Pétri 111
Figure III-7 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 112
Figure III-8 : Microphotographies des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés par de
la PEI ou de la PEIFITC 113
Figure III-9 : Spectres FTIR-ATR des substrats PDMS fonctionnalisés par des films
PEI/(CSA/PLL)6/CSA 114
Figure III-10 : Images MEB de substrats PDMS-3 et -10 fonctionnalisés par

PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 114
Figure III-11 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés
par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 115
13
Figure III-12 : Morphologie de cellules MC3T3-E1 cultivées sur les substrats PDMS-3, -5, -
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 117
Figure III-13 : Morphologie de cellules MC3T3-E1 cultivées sur les substrats PDMS-3, -5, -
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 119
Figure III-14 : Images MEB de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 120
Figure III-15 : Prolifération des cellules MC3T3-E1 cultivées sur des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 122
Figure III-16 : Activité de la phosphatase alcaline de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des
substrats PDMS fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 124
Figure IV-1 : Photographie de films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou après 16

heures de traitement réticulant par des solutions GnP25 ou GnP50 136
Figure IV-2 : (A) Évolution de l’absorbance entre 580 nm et 700 nm de films LbL
PEI/(CSA/PLL)18 traités par GnP25 et GnP50, sur une durée de 16h. (B) Évolution moyenne,
pour 2 films GnP50 et 3 films GnP25, de l’absorbance à 600 nm 137
Figure IV-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR d’un film PEI/(CSA/PLL)6 natif, puis
réticulé par une solution de GnP50 138
Figure IV-4 : Évolution des fréquences de résonance Δfn/n et des facteurs de dissipation ΔDn
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)6 traité par la solution GnP50 140
Figure IV-5 : Évolutions moyennes des paramètres de QCM-D lors de la construction, puis
du traitement par une solution de GnP à 0,50% de trois films PEI/(CSA/PLL)6 141
Figure IV-6 : Évolutions moyennes de la masse hydratée Q et de l’épaisseur d, de la viscosité

η, et du module de cisaillement μ de films PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 étudiés par QCM-D 142
Figure IV-7 : Évolution de la fréquence de résonance mesurée par QCM-D, lors de la

construction de films LbL PEI/(CSA/PLL)6 natif ou traité avec la GnP50, puis lors de leur
mise en contact avec la PhV 144
Figure IV-8 : Évolution de la fréquence de résonance normalisée Δf3/3 lors de la construction

d’un film PEI/(CSA/PLL)6-GnP-PhV/(PLL/CSA)2/PLL 145
Figure IV-9 : Images AFM 2D et 3D typiques de films PEI/(CSA/PLL)6, PEI/(CSA/PLL)6-

GnP25 et PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 146
Figure IV-10 : Observations par microspcopie à fluorescence de films PEI/(CSA FITC/PLL)6

aux longueurs d’ondes d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la FITC et de la GnP 148
Figure IV-11 : Microphotographies typiques de films PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par

des solutions GnP25 et GnP50, réalisées en microscopie optique à contraste de phase 149
14
Figure IV-12 : Observations par microspcopie à fluorescence de films PEI/(CSAFITC/PLL)12
aux longueurs d’ondes d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la FITC et de la GnP 150
Figure IV-13 : Images AFM 2D et 3D typiques de films PEI/(CSA/PLL)12,

PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 152
Figure IV-14 : Modules élastiques des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et

réticulés, mesurés par nanoindentation AFM 153
Figure IV-15 : Photographies de cellules MC3T3-E1 observées sur une période de 60

minutes, 24 heures après ensemencement sur un plastique commercial traité pour la culture
cellulaire (TCPS) 156

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 natif 156

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 réticulé par une
solution de GnP25 157

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 réticulé par une
solution de GnP50 157
Figure IV-19 : Photographies de cellules MC3T3-E1, 24 heures après ensemencement sur un

film PEI/(CSA/PLL)12 natif 158
Figure IV-20 : Morphologies typiques de préostéoblastes MC3T3-E1, après 3h de culture sur

les films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou réticulés par des solutions de GnP25
et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle) 160
Figure IV-21 : Morphologies typiques de cellules isolées, après 3h de culture sur le verre, et
sur des films PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 et PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 161
Figure IV-22 : Images de microscopie à fluorescence de cellules MC3T3-E1 après 10 jours

de culture sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par des
solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle) 162
Figure IV-23 : Prolifération de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par les solutions de GnP25 et GnP50, ainsi que sur le
verre (contrôle) 164
Figure IV-24 : Activité de la phosphatase alcaline et quantité totale de protéines

intracellulaires de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
PEI/(CSA/PLL)12 et natifs ou réticulés par les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du
verre (contrôle), après 7 jours de culture 167
Figure IV-25 : Activité de la phosphatase alcaline et quantité totale de protéines

intracellulaires de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
15
PEI/(CSA/PLL)12 et natifs ou réticulés par les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du
verre (contrôle), après 14 jours de culture 169
Figure IV-26 : Microphotographies de cellules MC3T3-E1, cultivées pendant 8 semaines en

milieu ostéogénique sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par
les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle), après à l’Alizarine Red S 171
Figure V-1 : Évolution des fréquences de résonance et des facteurs de dissipation lors de la
construction d’un film PEI/(pCD/PLL)3/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl 180
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl sur un résonateur 5
MHz, avec le détail de la construction du film LbL et sa mise en contact avec la pCD 182
Figure V-3 : Évolution de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique lors de

l’immobilisation de pCD sur un film PEI/(CSA/PLL) 183
Figure V-4 : Évolution moyenne de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique obtenues

pour 4 films PEI/(CSA/PLL)5/pCD 183
Figure V-5 : Évolution des paramètres optiques OWLS, NTE et NTM, lors de la construction
d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 184
Figure V-6 : Conversion des données de la Figure V-5 en indice de réfraction (nOWLS),
épaisseur optique (dOWLS) et masse optique (QOWLS), par le modèle étendu de monocouche
homogène et isotrope pour un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 185
Figure V-7 : Images AFM caractéristiques et valeurs de rugosité Ra des films

PEI/(CSA/PLL)5± pCD 186
construction d’un film (PLL/CSA)5/PLL/pCD sans couche précurseur de PEI 188
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/CSA/pCD 189
Figure V-10 : Évolution de la masse hydrodynamique lors de l’immobilisation de pCD sur le

film PEI/(CSA//PLL)5/CSA 190
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD° 191
Figure V-12 : Évolution des fréquences de résonance et des facteurs de dissipation lors
d’injections successives (notées Ix) de solutions de pCD à une concentration de 0,1 mg mL-1
et 0,5 mg mL-1 (notée I0,5 mg/mL) au contact d’un film PEI/(CSA/PLL)5 192
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à
pH 4,5 194
16
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis rinçage à pH 4,5 194
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à
pH 8,5 195
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à pH
8,5 196
Figure V-17 : Effet du rinçage à pH 8,5 sur les masses mesurées en par OWLS et par QCM-
D de films PEI/(CSA/PLL)5/pCD 196
Figure V-18 : Effet d’un rinçage à 0,05M NaCl sur la fréquence de résonance et le facteur de
dissipation d’un film PEI(CSA/PLL)5/pCD construit à pH 7,4 et 0,15 M NaCl 197
Figure V-19 : Effet d’un rinçage à 0,01 M NaCl sur les fréquences de résonance et les
facteurs de dissipation d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 198
Tableaux
Tableau I-1 : Exemples de domaines d’application de biomatériaux 21

Tableau II-1 : Spécifications des pointes utilisées en AFM 79
Tableau III-1 : Attribution des bandes spectrales de FTIR-ATR des substrats PDMS 109
Tableau III-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des échantillons de PDMS-3, -5, -7 et -10
traités par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 116
Tableau IV-1: Attribution des bandes FTIR-ATR des films natifs et réticulés 139
Tableau IV-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des films PEI/(CSA/PLL)6 natifs et réticulés
par la GnP 146
Tableau IV-3 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des films PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés
par la GnP 152
17
Introduction
Devant l’allongement de l’espérance de vie, principalement grâce aux progrès médicaux

réalisés depuis quelques dizaines d’années, les matériaux à usage médical connaissent un fort
développement et la recherche dans ce domaine doit faire face à une demande croissante.
Actuellement, les matériaux les plus représentés dans ce domaine sont les métaux, les
céramiques et les polymères. Bien que ces matériaux soient satisfaisants en termes de
biocompatibilité, c'est-à-dire non toxiques et tolérés par le système immunitaire des patients,
leur capacité d’intégration aux tissus hôtes est parfois limitée. Les mécanismes de
biointégration au sein des tissus sont dépendants des propriétés physico-chimiques et
mécaniques de surface de ces matériaux. Un objectif moderne dans la mise au point de
matériaux bioactifs est donc d’orienter les processus biologiques à l’interface de
l’environnement biologique avec l’implant.
Pour concevoir de tels matériaux bioactifs, les recherches se sont orientées vers différentes
modifications par voies chimiques ou physicochimiques, ou vers l’immobilisation directement
en surface de sites d’adhésion cellulaire ou de facteurs de croissance. Cette immobilisation,
par simple adsorption ou greffage covalent, présente le désavantage de provoquer
d’éventuelles dénaturations, et donc une perte de fonctionnalité. Dans le domaine de la
bioactivation de surface des biomatériaux, l’enjeu pour les années à venir consiste à améliorer
les conditions d’immobilisation de ces entités biochimiques, ou à concevoir des revêtements
de surface bioactifs, dont les propriétés physicochimiques, biochimiques, topographiques et
micromécaniques, peuvent être finement contrôlées. Le développement de telles
fonctionnalisations de surface doit nécessairement s’appuyer sur la mise en commun de
compétences variées, à la frontière de la chimie, de la physique, de la biologie et de la
médecine.
Les films « Layer-by-Layer » (LbL), ou multicouches de polyélectrolytes, apparus au
début des années 90, sont une famille de revêtements de surfaces particulièrement intéressante
pour le contrôle du microenvironnement physicochimique et mécanique des cellules. Ils
permettent la conception de structures de tailles nano- à micrométriques, applicables à une
vaste gamme de matériaux de natures chimiques et de géométries variées. Dans le domaine
des revêtements de surface à finalité biomédicale, les potentialités de cette méthode sont
multiples, du fait de la possibilité de les fonctionnaliser par l’adsorption ou de l’incorporation
18
de nombreuses espèces moléculaires, macromoléculaires ou particulaires. De plus, de
nombreuses macromolécules d’origine biologique pouvant être assimilées à des
polyélectrolytes (protéines, polypeptides, polysaccharides…), il est possible de fabriquer des
architectures biomimétiques inspirées des assemblages macromoléculaires qui constituent le
microenvironnement cellulaire au sein des tissus.
C’est dans ce contexte que se situent les travaux effectués lors de ce projet doctoral,
prolongeant les études précédemment menées par Khalil Abdelkebir lors de sa thèse, qui
s’était attachée, en partie, à décrire le mécanisme de croissance et la structure interne de films
LbL constitués de poly(L-lysine) (PLL), un polypeptide cationique biocompatible
couramment utilisé pour la conception de films LbL, et de chondroïtine sulfate A, ou
chondroïtine-4-sulfate (CSA), un polysaccharide anionique présent dans les tissus osseux et
cartilagineux. Ces films LbL sont envisagés ici pour la biofonctionnalisation de surface de
matériaux à visées orthopédique ou dentaire, de manière à améliorer leur ostéoconductivité.
Nous avons étudié les comportements à court, moyen et long terme de préostéoblastes murins
MC3T3-E1 cultivés sur ces films.
Le Chapitre I présente une étude bibliographique concernant les films LbL, ainsi que les
les comportements cellulaires au contact des biomatériaux. Les aspects expérimentaux sont
présentés dans le Chapitre II. Dans le Chapitre III, nous décrivons l’influence combinée de la
chimie externe, contrôlée par des films (CSA/PLL), et de la mécanique de substrats de type
élastomère dont la rigidité est contrôlée, sur les comportements de cellules MC3T3-E1. Dans
le Chapitre IV, nous nous sommes attachés à la réticulation des films (CSA/PLL) par un agent
réticulant d’origine naturelle, la génipine (GnP) et à leur caractérisation chimique et physique
(topographique et mécanique), ainsi qu’à l’effet de ces films sur les cellules. Dans ces deux
études, les comportements cellulaires ont été étudiés en termes d’adhésion, de prolifération et
de différenciation. Le Chapitre V présente une étude préliminaire de l’incorporation d’un
vecteur anionique dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL), comme potentiel
véhicule de biomolécules hydrophobes pour leur délivrance contrôlée in situ.
19
Chapitre I - Etude Bibliographique
I.A Les biomatériaux 21

I.A.1 Généralités 21
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité 21
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux 22
a. Modifications des propriétés intrinsèques 22
b. Traitements de surface 22
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.B.1 Introduction 23
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL 23
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL 27
a. Mécanismes d’assemblage 27
b. Influence des conditions de construction 30
c. Films LbL biomimétiques 33
d. Le système (CSA/PLL) 34
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL 37
a. Réticulation des films LbL 37
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs 38
I.C Le tissu osseux 43

I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse 44
a. La phase organique 44
b. La phase minérale 45
I.C.2 Les cellules osseuses 45
a. Lignée ostéoformatrice 46
b. La lignée ostéorésorbante 47
I.C.3 Le remodelage osseux 47
I.D Interactions cellules-matériaux 49

I.D.1 Influence de la chimie de surface 49
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau 50
a. Topographie 50
b. Mécanique 52
I.E Références bibliographiques 55
20
I.A Les biomatériaux
I.A.1 Généralités
Bien qu’il n’existe pas de définition précise d’un biomatériau, D. Williams en propose une,
lors de la Conférence de Consensus, organisée par la Société Européenne de Biomatériaux à
Chester en 1986: « matériau non vivant utilisé dans un dispositif médical destiné à interagir
avec les systèmes biologiques ».1
La « science des biomatériaux » est l’étude des propriétés physico-chimiques et
biologiques des matériaux et de leur impact sur des systèmes vivants, ce qui implique la
notion de contact entre ces matériaux et des fluides ou des tissus vivants. Outre les implants,
cela concerne également des matériaux se trouvant à la surface du corps, comme les lentilles
de contact, en contact avec la cornée, et autres dispositifs pour la cicatrisation. Cette définition
peut être étendue aux dispositifs utilisés en ingénierie tissulaire et dans les biotechnologies.
D. Williams donne, en 1999, une nouvelle définition des biomatériaux : « matériau prévu
pour être à l’interface de systèmes biologiques dans le but d’évaluer, de traiter, d’augmenter
ou bien de remplacer un tissu, un organe ou encore une fonction du corps humain ».2
Il existe différentes catégories de biomatériaux, qu’il est possible de classer en fonction de
leurs domaines d’application (Tableau I-1).
Tableau I-1 : Exemples de domaines d’application de biomatériaux.
Matériaux Exemples Exemples d’applications

Polymères
Synthétiques Poly(éthylène) (PE) Implants orthopédiques
Polyéthylène(téréphtalate) (PTFE) Prothèses vasculaires
Poly(méthylmétacrylate) (PMMA) Ciments osseux
Naturels Polylactides Sutures
Caprolactone Supports tissulaires
Soie Sutures
Chitine/Chitosan Substitus orthpédiques
Métaux et alliages Titane/alliages de titane Prothèses de hanche
Alliages chrome/cobalt Implants dentaires
Aciers inoxydables Stents
Céramiques Phosphates de calcium (HAP, Implants orthopédiques
βTCP,…)
Alumine, zircone Orthopédie
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité

Initialement, une des grandes problématiques dans le domaine des biomatériaux était
d’utiliser un matériau biocompatible, c'est-à-dire un « matériau inerte, sans effet sur les
21
systèmes vivants ». Par le terme « inerte », il était entendu que le matériau ne devait pas
induire de réaction immunitaire de la part de l’organisme et devant présenter une toxicité
nulle ou minimale. À la fin des années 90, cette définition a évolué et la notion de
biocompatibilité est devenue la « capacité d’un matériau à être utilisé avec une réponse de
l’hôte appropriée dans une application spécifique ». La biocompatibilité n’était donc plus le
seul critère requis pour un biomatériau, et les recherches se sont orientées vers des matériaux
dits bioactifs, participant aux mécanismes de régénération tissulaire. En plus de leur
biocompatibilité, les matériaux doivent (i) pouvoir, le cas échéant, être intégrer aux tissus
environnants en permettant leur invasion par les cellules qui les composent, (ii) permettre le
relargage de composés thérapeutiques spécifiques à l’application ciblée et (iii), concernant les
matériaux résorbables, être biodégradables, les produits de dégradation devant être non
toxiques.
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux

a. Modifications des propriétés intrinsèques
La modification des propriétés intrinsèques des matériaux vise, notamment, à moduler
leurs propriétés mécaniques, leur porosité, leur biodégradabilité, leurs propriétés de relargage
de composés thérapeutiques.
Les modifications en masse de matériaux ont également permis l’apparition de
biomatériaux hybrides, c'est-à-dire fonctionnalisés avec des cellules vivantes, idéalement
autologues. Ce nouveau type de matériau a pour objectif d’accélérer l’intégration à
l’organisme et est envisagé par exemple pour s’affranchir des broches métalliques lors des
réparations osseuses.
b. Traitements de surface
Les propriétés natives des matériaux peuvent se révéler incompatibles avec
l’environnement auquel ils sont destinés. Il est alors possible de les fonctionnaliser en surface,
sur une épaisseur minimale afin de conserver leurs propriétés intrinsèques. Pour cela, les
méthodes de fonctionnalisation de surface les plus pertinentes sont celles qui modifient
l’extrême surface des matériaux, à l’échelle atomique ou moléculaire, ou impliquent le dépôt
de films ultraminces, d’épaisseur nano- à micrométrique.
Il est ainsi possible de contrôler la topographie, la chimie, l’énergie, et les propriétés
mécaniques des surfaces. Les traitements de surface permettent d’exploiter des matériaux aux
propriétés intrinsèques adéquates, mais dont les propriétés de surfaces pourraient entraîner des
22
réactions indésirables, ou inhiber la colonisation par les cellules du tissu hôte environnant.
Parmi les voies envisagées, il est possible de (i) modifier directement la topographie de
surface par voie chimique ou mécanique, afin de favoriser l’ostéointégration par exemple, (ii)
adsorber par simple physisorption des protéines ou des polymères, de manière à former une
monocouche à la surface du matériau, ou (iii) greffer de façon covalente des groupements
chimiques ou des macromolécules, ce qui permet leur immobilisation irréversible.
Depuis une quinzaine d’années, la technique « Layer-by-Layer » (LbL), qui permet de
fonctionnaliser les surfaces en conditions douces (par voie aqueuse), a été envisagée pour des
applications dans le domaine des biomatériaux. La technique LbL et ses applications sont
détaillées ci-dessous.
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL)

I.B.1 Introduction
La méthode « Layer-by-Layer » (LbL) est une technique de fonctionnalisation de surface
polyvalente et simple à mettre en œuvre. Elle offre l’avantage d’être une technique de
fonctionnalisation douce qui ne requiert pas l’usage de solvants chimiques ou de méthodes
physiques agressives. Elle permet de modifier la surface de nombreux types de substrats par la
construction de structures nano- à micrométriques, dont on peut contrôler les propriétés
physico-chimiques. De plus, ces films sont (multi)fonctionnalisables par l’incorporation de
composés bioactifs, tels que des protéines, des facteurs de croissance, ou des nanoparticules.
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL

Pendant la seconde moitié du XXème siècle, la recherche concernant la fonctionnalisation
de surface par des films minces à l’échelle nanométrique pour des applications dans les
domaines de la biologie et de la médecine a été dominée par deux techniques : le dépôt de
films de Langmuir-Blodgett (LB) et les monocouches auto-assemblées (SAMs) (Figure I-1).
23
A B
Figure I-1 : (A) Dépôt d’un film de Langmuir-Blodgett (LB) par trempage d’un matériau à
travers une couche lipidique formée à l’interface air-eau, et (B) Monocouche Auto-assemblée
(SAM) de silane sur du silicium.
La technique de LB consiste à immerger un matériau à travers un film monomoléculaire de

composés amphiphiles formé à l’interface air-eau.3,4 En répétant ce cycle, il est possible de
construire des architectures multicouches, dont l’épaisseur varie de quelques Angströms à
plusieurs nanomètres. Il est ainsi envisageable de fonctionnaliser la surface du matériau et d’y
immobiliser divers composés, comme des protéines. Cependant, cette technique présente
plusieurs inconvénients, notamment les restrictions en termes de géométrie de substrat et de
nature des biomolécules immobilisées, et une instabilité importante du film construit due aux
faibles interactions physiques stabilisant le dépôt.
Les SAMs permettent également de contrôler la chimie de surface des matériaux.5 Ils
peuvent notamment être utilisés pour l’immobilisation de protéines.6,7,8 Mais leurs
applications dans le domaine de la biologie sont limitées car (i) leur nature de monocouche
empêche l’immobilisation importante de biomolécules, (ii) peu de substrats sont éligibles, les
SAMs étant fabriqués uniquement par le greffage de groupements thiols sur des métaux
nobles ou de silanes sur des surfaces hydroxylées, et (iii) leur stabilité chimique est faible
dans les conditions physiologiques.
Depuis une quinzaine d’années, la méthode LbL, introduite par Decher en 1991, 9,10
constitue une alternative intéressante à ces deux techniques pour la fonctionnalisation de
surface pour des applications dans les domaines de la biologie et des sciences médicales.
Cette technique consiste en des dépôts alternés de polymères de charges opposées, en milieu
aqueux. En répétant autant de fois que désirés les cycles d’adsorption de polyélectrolytes, il
est possible de construire des architectures d’épaisseur contrôlée, allant de quelques
nanomètres à plusieurs micromètres.
24
Figure I-2 : Principe de la technique LbL (d’après Decher).10
Les étapes d’adsorption, dont le temps varie de quelques minutes à plusieurs dizaines de
minutes, peuvent être réalisées par immersion d’un matériau dans les solutions de
polyélectrolytes ou par écoulement des solutions au contact de la surface à fonctionnaliser.
Entre chaque étape d’adsorption, une étape de rinçage est nécessaire afin d’éliminer les
polyélectrolytes non ou faiblement liés à la surface et ainsi éviter la contamination de la
solution du polyélectrolyte de charge opposée.
Il a été démontré qu’après chaque rinçage, la surface du film n’est pas neutre, mais expose
des charges correspondant au dernier polyélectrolyte adsorbé. Il y a donc surcompensation de
charges après chaque dépôt. Ce processus, mis en évidence par des mesures du potentiel
Zêta,11,12,13 constitue la force motrice de la construction des films LbL (Figure I-3). Une
description théorique a été fournie par Netz et Joanny.14,15
Les forces permettant la cohésion et la croissance des films LbL de polyélectrolytes sont
principalement de nature électrostatiques coulombiennes. D’autres types d’interactions,
comme les interactions de Van der Waals ou des liaisons H, peuvent néanmoins participer à la
structure et à l’assemblage de ces films.16,17 Enfin, d’autres types d’interactions ont été étudiés
pour l’assemblage et la stabilisation de films LbL : liaisons covalentes,18 interactions
hydrophobes,19 interactions récepteur-ligand, liaisons covalentes de coordination.20
25
Figure I-3 : Évolution du potentiel Zêta pendant la construction d’un film PEI/(PSS/PAH)n.
PEI : poly(éthylène imine) ; PSS : poly(styrène sulfonate) ; PAH : poly(allylamine) (d’après
Ladam et al.).13
L’utilisation des films minces obtenus par la technique LbL dans le domaine de la
fonctionnalisation de matériaux à finalité biologique ou médicale offre plusieurs avantages :
 Ils permettent la fonctionnalisation de matériaux de nature chimique variée (métaux,
céramiques, polymères) et de géométries complexes, à conditions que ceux-ci présentent à
leur surface suffisamment de charges électrostatiques. Dans le cas contraire, il est possible
d’implanter des charges sur la surface de manière à initier l’assemblage du film LbL.10,21,22
 Ils sont construits en conditions auqueuses douces.
 Le contrôle des conditions de construction (nature des polyélectrolytes, force ionique,

pH…) permet de moduler précisément les propriétés physico-chimiques des films (épaisseur,
charge électrostatique de surface, propriétés viscoélastiques…).13,23,24
 Ils peuvent être fonctionnalisés pendant ou après construction par l’incorporation

d’une grande variété de composés d’intérêt (colloïdes conducteurs, semiconducteurs, isolants,
catalyseurs, polyélectrolytes conducteurs, biopolymères, protéines, vésicules lipidiques…) de
manière à leur conférer des propriétés électroniques, optiques, magnétiques, catalytiques,
biologiques ou de relargage.25,26
De plus, la technologie LbL n’est pas applicable uniquement aux polyélectrolytes. Des
films LbL construits à partir d’autres espèces chargées, comme des nanoparticules, des
nanotubes, des colorants organiques, des dendrimères, des porphyrines, des polysaccharides
26
biologiques, des polypeptides, des acides nucléiques, des protéines, des particules virales ont
ainsi été étudiés. Cette polyvalence confère à la technologie LbL un intérêt majeur dans la
fabrication de nano-films pour des applications biomédicales, en offrant une large gamme de
caractéristiques structurales, et des propriétés fonctionnelles.
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL

a. Mécanismes d’assemblage
Lors de la construction d’un film LbL, sa masse et son épaisseur augmentent avec le
nombre de couches adsorbées. En fonction de la nature des polyélectrolytes et des conditions
expérimentales, cette croissance peut s’effectuer de manière linéaire avec le nombre de
couches adsorbées, alors que d’autres systèmes ont une croissance superlinéaire (ou
exponentielle), c’est-à-dire que la prise de masse et d’épaisseur accompagnant chaque
nouvelle couche augmente au cours de la construction (Figure I-4).
A B
Figure I-4 : (A) Évolution de la masse adsorbée lors de la construction d’un film
PEI/(PSS/PAH)5.27 (B) Évolution de l’épaisseur (dQCM-D) et de la masse adsorbée (QQCM-D)
lors de la construction d’un film PEI/(ChS/PLL)6.30 Les mesures sont effectuées par QCM-D
dans les deux cas. PEI : poly(éthylène imine) ; PSS : poly(styrène sulfonate) ; PAH :
poly(allylamine) ; ChS : condroïtine sulfate ; PLL : poly(L-lysine).
Le mécanisme de croissance linéaire concerne les architectures élaborées à partir de

polyélectrolytes ne pouvant diffuser au sein de la structure. L’adsorption de chaque nouvelle
couche se fait par surcompensation des charges de surface, la quantité de polyélectrolytes
déposée étant proportionnelle à la densité de ces charges. Cette dernière varie de manière
cyclique, conduisant à une augmentation linéaire en masse et en épaisseur du dépôt. Ces films
ont une structure globalement stratifiée, avec cependant un certain degré d’interpénétration
entre les couches adjacentes. Ce mécanisme est souvent observé pour des films constitués de
27
polyélectrolytes synthétiques, tels que PSS/PAH13,27 ou des films construits à faible force
ionique,28 ce qui diminue la flexibilité et donc la capacité de diffusion des chaînes au sein de
l’architecture.
Ladam et al. ont proposé, pour des films à croissance linéaire, un mécanisme basé sur un
modèle en trois zones.13 La zone I, interne et proche du substrat, est composée de quelques
couches dont la structure est influencée par la proximité du substrat. La zone “bulk” (zone II)
au sein de laquelle toutes les couches de polyanions, et respectivement polycations, ont la
même épaisseur, et les charges positives et négatives se compensent presque exactement. La
zone III, externe est constituée de quelques couches dont la structure est proche de celle des
polyélectrolytes en solution. Les frontières entre les différentes zones sont graduelles et ne
doivent pas être considérées comme étant aussi marquées que sur le schéma. Les zones I et III
conservent une épaisseur constante, et c’est la zone II qui croît linéairement en épaisseur et en
masse au cours de la construction du film
Figure I-5 : Représentation schématique de l’évolution de l’épaisseur des trois zones lors de
la construction d’un film LbL par adsorptions successives de couches de polyélectrolytes.
Lors de la construction, seule la zone II augmente en épaisseur (Ladam et al.).13
Le régime de croissance exponentiel est, quant à lui, attribué à la capacité d’au moins l’un
des deux polyélectrolytes à diffuser au sein de la multicouche lors de la construction. 29 Ce
mécanisme a été initialement observé pour des films composés de poly(L-lysine) associée à de
l’alginate (PLL/ALG) ou de l’acide hyaluronique (PLL/HA),28 puis a été généralisé pour de
nombreux systèmes et plus récemment pour des films (CSA/PLL).30 Le film joue un rôle de
réservoir de chaînes libres qui diffusent et s’accumulent dans la structure. Lors du rinçage, la
présence d’une barrière électrostatique empêche ces chaînes de diffuser hors du film. Pendant
l’étape d’adsorption du polyélectrolyte de charge opposée, cette barrière électrostatique
28
disparaît, permettant alors aux chaînes libres de diffuser hors du film et de se complexer en
surface avec les chaînes de charge opposée présentes en solution. Le film augmentant en
épaisseur, la taille du réservoir augmente, ce qui permet l’adsorption d’une quantité croissante
de polyélectrolytes d’une étape à l’autre.
Cependant, depuis quelques années, des études ont montré l’existence d’une transition du
mode de croissance d’un régime exponentiel vers un régime linéaire. Ce phénomène, mis en
évidence pour la première fois par Hübsch et al. en 2004 sur des films basés sur la
combinaison d’un polycation (le PAH) et d’un mélange de deux polyanions, l’un (le PSS)
induisant une croissance linéaire avec le polyanion, l’autre (le poly(L-acide glutamique),
PGA) une croissance exponentielle.31 Les auteurs ont constaté un changement dans le régime
de croissance lorsque le film atteint une certaine épaisseur. Un phénomène similaire a
également été observé par Porcel et al. sur des films (PLL/HA),32 dont nous avons vu plus
haut qu’ils présentaient un régime de croissance exponentiel dans les étapes initiales de leur
construction. Pour ces derniers films, la transition intervient après le dépôt de 12 paires de
couches, indépendamment du mode de construction (immersion ou nébulisation) et de la
masse molaire des polyélectrolytes (Figure I-6).
Figure I-6 : Évolution de

l’épaisseur de films (HA/PLL),
mesurée par ellipsométrie en
fonction du nombre de couches et
de la masse molaire des
polyélectrolytes : MHA = 130000
g mol-1 et trois MPLL = 20000 (■),
55000 (○) et (▲) 360000 g mol-1
(d’après Porcel et al.).32
Pour l’expliquer, les auteurs ont suggéré qu’une restructuration interne se produit à
l’intérieur des films, conduisant à l’apparition d’une zone interne dense. Cette zone interdirait
la diffusion des chaînes libres, nécessaire à la croissance exponentielle, de sorte que seule une
zone externe de profondeur constante reste accessible à la diffusion. Ainsi, la croissance des
films, certes toujours renforcée par rapport aux films non diffusifs, devient linéaire. Ce
modèle a permis de rendre compte de la transition de régime, mais selon ses auteurs, une
preuve directe de l’existence d’une zone interne dense restructurée restait à apporter.32,33
29
b. Influence des conditions de construction
Un même couple de polyélectrolytes peut, selon les conditions environnementales, former
des films à croissance exponentielle ou linéaire. Il est ainsi possible d’influencer la croissance
et la structure d’un film LbL en modulant notamment la force ionique, le pH ou la
température de construction.
La force ionique joue un rôle important sur la croissance des films LbL. En effet, la
concentration en ions a un effet sur la conformation des polyélectrolytes en solution : une
faible concentration conduit à une répulsion des charges de la chaîne, et donc à une longueur
de persistance importante ; au contraire, une forte concentration permet un écrantage des
charges, permettant à la chaîne d’adopter une conformation entropiquement favorable de
pelote statistique. Des études menées sur différents systèmes LbL montrent que la
modification de la conformation des chaînes de polymères en solution est aussi responsable
d’une modification de la quantité de matière et du régime de croissance des films. Richert et
al ont montré par QCM-D qu’une diminution de la force ionique provoque une diminution de
la quantité de matière adsorbée lors de la construction de films composés de chitosan (CHI) et
d’acide hyaluronique (HA).28 Cette diminution s’accompagne d’une transition du régime de
croissance, qui passe d’une croissance exponentielle pour une concentration de 0,15 M de
NaCl à une croissance linéaire pour une concentration de 10-4 M de NaCl (Figure I-7).
Figure I-7 : Evolution des fréquences

normalisées suivies par QCM durant la
construction de films CHI/HA construits
à pH 5 dans 0,15 M (●), 10-2 M (▼) et
10-4 M (■) NaCl. CHI : chitosan ; HA :
acide hyaluronique (d’après Richert et
al.).28
Les multicouches de polyélectrolytes sont également sensibles à des modifications de

forces ioniques appliquées par post-traitement, c’est-à-dire après leur construction. Ladam et
al. ont montré qu’un film PSS/PAH construit en présence de 0,75 M de NaCl gonflait de
30
manière significative (20%) dans l’eau pure.13 Ce phénomène est induit par la disparition de
l’écrantage des charges qui provoque une réduction des répulsions intra- et intermoléculaires
dans la zone externe du film. Ce gonflement est réversible lors du retour de la force ionique à
sa valeur initiale.
Une étude réalisée par Mjahed et al.34 sur des films composés de cinquante paires de
couches PLL/HA, construits en présence de 0,15 M de NaCl, montre un gonflement de ces
films avec une augmentation de la force ionique. En plus du gonflement des films, les auteurs
ont observé la dissolution des films LbL, par fuite des polyélectrolytes consécutive au
gonflement de la multicouche, lorsqu’ils sont placés à une concentration en NaCl de 0,375 M
pendant un mois. Pour une concentration de 0,48 M, ils ont noté l’apparition de cavités
sphériques au sein de la structure LbL. Dans un deuxième temps, les auteurs ont étudié l’effet
d’une diminution de la force ionique sur ces films. Dans ce cas, les films diminuent en
épaisseur et présentent des cavités si l’écart de concentration en sel par rapport aux conditions
de construction initiales (0,15 M de NaCl) est important.
La densité de charges a également une influence sur la construction des films LbL. Dans le
cas de polyélectrolytes faibles, une variation du pH induit une modification du degré
d’ionisation et donc d’une densité de charges par chaîne. Cette modification du degré
d’ionisation a un effet comparable à celui d’une variation de la force ionique sur la
conformation des polyélectrolytes en solution. Il est donc possible de moduler l’épaisseur des
films en contrôlant le pH auquel les films multicouches sont construits. Shiratori et al.35 ont
ainsi montré que des films composés de couches de poly(acide acrylique) (PAA) et de PAH
construits dans l’eau pure ( pH ~ 7) sont lisses et ultraminces. Dans ces conditions, les chaînes
des deux polyélectrolytes sont très chargées, et adoptent une conformation très allongée du
fait des fortes répulsions électrostatiques intramoléculaires.36 De part et d’autre de cette valeur
de pH, l’une des deux chaînes voit sa densité de charges diminuer. Elle adopte donc une
conformation plus repliée, ce qui conduit à une augmentation de l’épaisseur du film.
Une étude de Choi et al. sur des polyélectrolytes en étoile montre qu’en contrôlant le pH, il
est possible de modifier le mode de croissance de films LbL.37 Des films composés de poly[2-
(diméthylamino)éthyl methacrylate] (pDMAEMA) et PAA construits à un pH situé entre les
pKa respectifs des deux polyélectrolytes sont épais et rugueux. Au contraire, si le polycation
est déposé à un pH supérieur à son pKa et le polyanion à un pH inférieur à son pKa, les films
produits sont lisses et minces. Ce phénomène s’explique par le fait que des polyélectrolytes
pris dans leur état le plus chargé (déprotoné pour les polyanions, soit pH > pKa ; protoné pour
31
les polycations, soit pH < pKa) sont dans une conformation linéaire, due aux répulsions
électrostatiques intramoléculaires.
Il est également possible de faire varier la densité de charges en modifiant la nature
chimique des polyélectrolytes. Par exemple, Steitz et al. ont étudié la formation de films
constitués de polystyrène sulfonate (PSS) et de poly(chlorure de diallyldimethylammonium)
(PDADMAC), ce dernier polyélectrolyte étant modifié par copolymérisation avec des
monomères neutres. Pour que la construction des films (PSS/PDADMAC) soit effective, la
densité de charges doit être d’au moins 70% (soit une densité d’électrons comprise entre
0,374 et 0,393 Å-3).38
La nature des contres ions joue également un rôle important dans le mécanisme de
croissance des films LbL. Les ions utilisés appartiennent habituellement à la série de
Hofmeister, ou série lyotropique, dont l’étude des interactions avec les macromolécules est
connue depuis un peu plus de cent ans.39,40 Cette série est connue pour son rôle dans de
nombreux phénomènes biologiques.41
Bien que les principes de l’effet Hofmeister ne soient pas encore connus avec précision, il
est admis qu’il est plus important dans le cas des anions que dans le cas des cations.42 Les
anions suivants sont classés en fonction de leur capacité à solubiliser des protéines
hydrophobes : ClO4- > SCN- > I- > NO3- > Br- > Cl- > CH3COO- > HCOO- > F- > OH- >
HPO42- > SO42-. Cette série peut être divisée en deux catégories, basées sur les interactions
entre les ions et l’eau : (i) les ions chaotropiques interagissent avec l’eau plus faiblement que
l’eau elle-même, (ii) les ions cosmotropiques interagissent fortement avec l’eau. Ici, l’ion Cl-
est considéré comme un point médian, les ions situés à sa gauche sont chaotropiques, les ions
à sa droite sont cosmotropiques.
Il a été démontré que ces ions influençaient la croissance et l’épaisseur des films LbL
(Figure I-8). Salomäki et al. ont observé une influence de la nature des anions monovalents
sur l’épaisseur et le mécanisme de croissance de films (PSS/PDADMAC).43 Les auteurs
expliquent ce phénomène par le fait que les anions chaotropiques écrantent fortement les
charges des polyélectrolytes, ces derniers adoptant alors une conformation repliée et
conduisent à la formation de films épais et à croissance exponentielle. Un phénomène
comparable a été étudié par Buron et al., sur des films (MADQUAT/PAA), en faisant varier
la nature du cation monovalent.44
32
A B
Figure I-8 : (A) Influence de la nature des anions monovalents de sels de sodium à une
concentration de 0,1 M sur la croissance et l’épaisseur de films LbL (PSS/PDADMAC),
suivies par ellipsométrie (d’après Salomäki et al.)43 et (B) influence de la nature de cations
monovalents de sels de chlorure à une concentration de 10-3 M sur la croissance et
l’épaisseur de films (MADQUAT/PAA), suivies par réflectométrie à angle fixe (d’après Buron
et al.).44
c. Films LbL biomimétiques

Les premières études portant sur les films LbL ont été menées avec des polyélectrolytes
synthétiques, tels que PSS et PAH. La nature polyélectrolytique de nombreuses
macromolécules biologiques (polysaccharides,28 protéines,45 acides nucléiques46) en font des
composés éligibles à la construction de ce type de films. De tels films ont été étudiés,
notamment en vue d’améliorer l’intégration de matériaux implantables au sein de tissus hôtes.
Parmi les biopolymères disponibles pour la construction de multicouches, le chitosan, un
polysaccharide dérivé de la chitine présente dans la carapace des arthropodes, est souvent
utilisé comme polycation. On le retrouve associé à d’autres polysaccharides, 47 ou à des
protéines, comme la gélatine.48
Cependant, afin de mimer le microenvironnement des cellules, il est préférable d’utiliser
des biopolymères naturellement présents dans les matrices extracellulaires (MEC). Dans ce
sens, les glycosaminoglycanes (GAG) sont particulièrement intéressants. Ce sont des
polysaccharides très abondants des MEC animales. Ils sont associés à des protéines pour
former les protéoglycanes. Les GAG ont un rôle structural dans les tissus. Par exemple, le fort
taux d’hydratation de la chondroïtine sulfate A, ou chondroïtine-4-sulfate (CSA), un GAG
trouvé en très grande quantité dans les cartilages,49 lui confère des propriétés de résistance aux
chocs. En plus de leur rôle de soutien des tissus, les GAG sont connus pour servir de
réservoirs de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont relargués soit lors de
dégradations locales de la MEC, soit par lyse enzymatique s’ils sont liés de manière covalente
33
aux GAG. Enfin, la présence de récepteurs de GAG sur les membranes cellulaires (annexines
VI, CD44) permet aux cellules d’adhérer à leur MEC. Les interactions GAG/récepteur
permettent d’activer des voies de signalisation qui conduisent à une modulation des
comportements cellulaires. La PLL est un polymère de lysine, souvent utilisée comme
polycation également pour la construction de films LbL. La lysine est un acide aminé
impliqué dans les interactions entre les GAGs et les protéines.50
d. Le système (CSA/PLL)
Dans le cadre de ce projet doctoral, nous avons choisi de travailler avec le système LbL
composé de (CSA) et de (PLL). Ce système a été préalablement étudié au laboratoire, lors du
travail de thèse de Khalil Abdelkebir, qui en a décrit le mécanisme de croissance et la
structure. Durant les premiers mois de mon projet, j’ai participé à certains de ces travaux.
La CSA est un GAG linéaire de haut poids moléculaire composé d’un enchaînement
d’unités disaccharidiques D-glucuronique-β-1,3-N-acétylgalactosamine-4-sulfate, liées entre
elles par une liaison β-1,4. Les chondroïtines sulfate (CS) sont des GAGs ubiquitaires, qui
font partie des composants majeurs des matrices extracellulaires (MEC) des tissus osseux et
cartilagineux, ainsi que d’autres tissus conjonctifs. On les rencontre notamment dans les
décorines et les biglycanes, deux protéoglycanes majeurs du tissu osseux.51 De par leur
capacité à lier les facteurs de croissance, elles peuvent être utilisées comme des réservoirs, en
vu de relargage moléculaire in situ.52
La PLL est un polypeptide cationique, connue entre autre pour favoriser l’adhésion
cellulaire, via des interactions électrostatiques avec les membranes cellulaires dont la charge
globale est négative à pH physiologique.
Des complexes (CS/PLL) ont été étudiés, soit en solution, soit sous forme de films LbL.
Les films (CS/PLL) ont notamment été utilisés comme substrats pour des cellules
photoréceptrices,53 endothéliales54 et plus récemment, des ostéoblastes.55
Au cours de travaux antérieurs au sein du laboratoire, la croissance et la structure de films
(CSA/PLL) ont été décrites par la combinaison de différentes techniques d’analyse
classiquement utilisées pour l’étude de films LbL : microbalance à quartz avec contrôle de la
dissipation (QCM-D), spectroscopie par guide d’onde optique (OWLS), spectroscopie
infrarouge à transformée de Fourrier en mode de réflexion totale atténuée (FTIR-ATR) et
microscopie à force atomique (AFM).30
34
L’étude du mécanisme de croissance par OWLS (technique de spectroscopie optique)
d’une part, et QCM-D (méthode électroacoustique) d’autre part a notamment révélé une
apparente contradiction, en détectant des régimes de croissance linéaire et exponentielle,
respectivement (Figure I-9).
Il faut noter cependant que ces deux techniques, souvent utilisées en combinaison lors de
l’étude de la croissance de films LbL, apportent des informations différentes : la QCM-D
permet d’étudier la masse hydratée totale du dépôt, c'est-à-dire la matière adsorbée et l’eau
liée au dépôt, par opposition à l’OWLS qui ne renseigne que sur l’évolution de la matière dite
« sèche » constituée de la matière déposée.
A B
Figure I-9 : Évolution (A) de l’épaisseur et de la masse adsorbée suivies par QCM-D et (B)
de l’épaisseur suivie par OWLS pour des films PEI/(CSA/PLL)6 en fonction du nombre de
couches.
Une analyse de la croissance des films PEI/(CSA/PLL)6 par FTIR-ATR, sur des films
séchés après chaque cycle d’adsorption, a permis de montrer que la quantité de matière
augmentait de façon superlinéaire avec le nombre de couches adsorbées (Figure I-10).
Il a par ailleurs été observé par AFM, lors de ces travaux, la présence d’îlots de matière à la
surface des films (CSA/PLL). Tezcaner et al. ont également observé ces îlots à la surface de
films composés de 10 paires de couches.53
35
A B
Figure I-10 : (A) Spectres de référence des

polyélectrolytes et suivi étape par étape de la
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)12, par
FTIR-ATR. (B) Évolution de l’absorbance
moyenne de trois pics spécifiques (situés à
1644 (●), 1053 (■) et 1246 cm-1(▲)) des
polyélectrolytes lors de la construction de
films PEI/(CSA/PLL)6/CSA.
La combinaison de ces différentes techniques d’analyse a permis de conclure à la

coexistence de deux zones distinctes au sein des films (Figure I-11) : (i) une zone interne
dense, dont la croissance est linéaire et (ii) une zone externe diffuse, dont la croissance est
superlinéaire. D’après cette hypothèse, la zone externe est « invisible » à l’OWLS, cette
technique ne permettant de sonder uniquement la zone dense. Au contraire, la QCM-D permet
d’analyser la masse totale du film.
Figure I-11 : Modèle structural proposé pour les films PEI/(CSA/PLL)6, basé sur la QCM-D,
l’OWLS, le FTIR-ATR et l’AFM (d’après Abdelkebir et al.).30
36
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL
a. Réticulation des films LbL
Les films LbL biomimétiques sont des outils prometteurs pour la fonctionnalisation de
surfaces à finalité biomédicale. Cependant, ces films, basés la plupart du temps sur des
interactions faibles, de type électrostatique, sont sensibles à des stimuli chimiques, comme des
variations de pH et de force ionique, ou encore mécaniques. De plus, leur structure très
hydratée empêche souvent leur colonisation par les cellules, ce qui limite les applications
biologiques.
Depuis quelques années, des travaux ont été menés sur la réticulation en vue d’améliorer
leur stabilité en milieu environnant, et également de moduler leurs propriétés mécaniques
intrinsèques. La réticulation par voie chimique consiste en la création de liaisons covalentes
entre les différents composants des films, à l’aide d’un agent réticulant.
Plusieurs agents réticulants ont été utilisés pour la réticulation de films LbL. En 1996,
Brynda et al. ont réticulé un film composé d’héparane et d’albumine sérique humaine par
action de glutaraldéhyde.56 Ils ont noté une augmentation de la stabilité du système en milieu
physiologique. Par la suite, plusieurs études ont montré l’efficacité de la réticulation de films
LbL via la chimie des carbodiimides, qui permet le couplage de groupements carboxyliques et
amines primaires, par la formation d’une liaison amide. Le carbodiimide utilisé dans ces
études ([1-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl)carbodiimide], EDC) est un agent réticulant de
longueur zéro, ce qui signifie qu’il n’y a pas de greffage d’espaceur entre les deux polymères,
et qu’il couple directement les deux fonctions ciblées. Ce protocole, faisant intervenir le
couple EDC/N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) peut être appliqué à de nombreux couples de
polyélectrolytes, pourvu que ces derniers possèdent des groupements carboxyliques et amines.
Richert et al. ont montré que la réticulation des films (PLL/HA) les rendaient plus résistants
aux dégradations enzymatiques, physico-chimiques ou mécaniques.57
Boudou et al. ont montré que la réticulation avait un impact important sur les propriétés
mécaniques des films (PLL/HA) et qu’il était possible de faire varier leur module élastique,
entre 10 kPa et 400 kPa, en utilisant des solutions d’EDC à des concentrations différentes. 58
Cet aspect est très important dans le cas de films utilisés pour des applications biologiques. En
effet, les films (PLL/HA) sont très mous, car très hydratés, et ne permettent donc pas une
adhésion cellulaire suffisante. Plusieurs études ont montré un effet favorable de la réticulation
sur l’adhésion cellulaire.53,58
Récemment, Phelps et al. ont étudié la possibilité de réticulation localisée de films LbL
composés de polypeptides (PLL/PGA), par EDC/NHS, sans modifier la structure interne des
37
films. Pour cela, ils ont utilisé pour la dernière couche formée du PGA activé via le NHS, ils
ont ainsi obtenu une augmentation de l’adhésion cellulaire, par rapport à des films non
réticulés.59
Néanmoins, ces agents réticulants conventionnels peuvent présenter une cytotoxicité
élevée, s’ils se trouvent relargués dans les milieux de culture. En cela, la génipine (GnP), un
produit extrait du fruit de Gardenia jasminoides, constitue une alternative intéressante. La
GnP a été utilisée pour la réticulation de protéines et de différents systèmes à base de
polymères. Bien que le mécanisme de réticulation par la GnP ne soit pas clairement défini, il
est admis que c’est un réticulant bifonctionnel.60,61
L’utilisation de cet agent réticulant a montré des effets bénéfiques, notamment une
diminution des processus inflammatoires et une augmentation de l’adhésion de fibroblastes.
Ce n’est que récemment, et dans un nombre limité de travaux, que la GnP a été utilisée pour
la réticulation de films LbL. Hillberg et al. ont étudié son action sur des films (CHI/HA) et
(CHI/ALG), à croissance respectivement exponentielle et linéaire. 62 Ils ont rapporté une
modification de la mouillabilité et de la rugosité des films, suite à l’action de la GnP.
Cependant, alors que la réticulation des films (CHI/ALG) a un effet promoteur sur l’adhésion
cellulaire, le système (CHI/HA), plus mou, semble toujours défavorable aux cellules, même
après réticulation. La GnP a également été étudiée par Chaubaroux et al. sur des systèmes
composés de collagène et d’alginate (COL/ALG).63 Les auteurs ont montré une amélioration
de la stabilité des films lors de variations de pH, ainsi qu’un effet favorable sur l’adhésion et
la prolifération cellulaire.
Il est intéressant de noter que la GnP ne peut réagir qu’avec les groupements amines
primaires. La structure ainsi obtenue est un réseau semi-interpénétré (semi-RIP) formé d’un
réseau, constitué du polyélectrolyte portant des amines, dans lequel les chaînes de l’autre
polyélectrolyte resteraient libres.
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs

Plusieurs études rapportent l’insertion de composés bioactifs au sein des films LbL. Ces
films peuvent être fonctionnalisés par de nombreuses molécules afin de leur conférer des
propriétés bioactives, telles que des macromolécules d’origine biologique (protéines, acides
nucléiques, glycosaminoglycanes), ou des médicaments.
38
Macromolécules d’origine biologique.
La fonctionnalisation de films LbL par des protéines ou des peptides peut avoir plusieurs
objectifs : (i) favoriser l’adhésion cellulaire, par l’utilisation de protéines matricielles ou de
séquences protéiques intervenant dans les interactions cellules-MEC et (ii) moduler les
comportements cellulaires, grâce à des protéines régulant les processus cellulaires in vivo
(facteurs de croissance, cytokines ou hormones).
Un intérêt majeur de l’utilisation de films LbL pour l’immobilisation de macromolécules
est que ce type d’architecture permet de conserver la structure native, et donc la bioactivité,
préservant les interactions avec les cellules. Il a ainsi été montré que la structure secondaire de
protéines insérées dans des architectures LbL était conservée.64 Il a également été démontré
que des immunoglobulines G (IgG) enfouies sous un petit nombre de couches conservaient
leur capacité d’interaction avec leurs antigènes, montrant par là qu’elles avaient gardé leur
structure et leur conformation malgré leur incorporation.65 De plus, Derbal et al. ont démontré
que la phosphatase alcaline adsorbée à la surface ou insérée dans des films (PLL/PGA)
gardait non seulement sa structure, mais aussi son activité enzymatique, même à long terme.66
Wittmer et al. ont montré, sur des cellules hépatiques, qu’une simple adsorption de
fibronectine sur des films LbL composés de 3 paires de couches PLL et de sulfate de dextrane
(DS) permettait une meilleure adhésion, ainsi qu’un meilleur étalement cellulaire, par rapport
aux films sans fibronectine.67 De manière à favoriser l’adhésion cellulaire, différents travaux
ont porté sur la modification de polyélectrolytes par une séquence peptidique intervenant dans
l’adhésion cellulaire via les intégrines, le RGD (Arginine – Glycine – Acide aspartique).
Picart et al. ont greffé de manière covalente cette séquence sur des chaînes de PGA qu’ils ont
utilisées comme dernière couche sur des films (PLL/PGA). 68 L’adhésion d’ostéoblastes
cultivés sur ces films a ainsi été significativement améliorée. Berg et al rapportent des
résultats comparables sur des films (PAH/PAA), dont la dernière couche est constituée de
chaînes de PAH couplées avec le peptide RGD.69
Un autre enjeu de la fonctionnalisation des films LbL par des protéines ou des peptides est
la modulation des comportements à plus long terme. Pour cela, les facteurs de croissance sont
les bio-macromolécules les plus couramment utilisées. De nombreuses études rapportent les
effets promoteurs de films LbL ainsi fonctionnalisés sur la différenciation cellulaire. 70 Ces
architectures offrent en outre la possibilité de cibler spécifiquement certains types cellulaires
ou tissus. Par exemple, sur des films (PLL/CSA), l’immobilisation de FGF (Fibroblast
Growth Factor) permet une augmentation de l’attachement de cellules photoréceptrices d’œil
de porc.53 Crouzier et al. ont montré, sur des films (PLL/PGA), qu’il était possible d’induire
39
la transdifférenciation de cellules musculaires (C2C12) en ostéoblastes, grâce à
l’immobilisation de la BMP2 (Bone Morphogenic Protein 2). 71 Les auteurs ont également
démontré la bonne stabilité de leur système fonctionnalisé par la BMP2, puisque l’effet sur les
cellules a été observé sur trois cultures successives. Plus récemment, une étude in vivo menée
sur des rats, a permis d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants en alliage de titane
(TA6V) fonctionnalisés par des films multicouches (PLL/HA) chargés en BMP2.72 Placés
entre l’aponévrose et le muscle des rats, ces implants ont conduit à la formation d’une matrice
osseuse.
Les acides nucléiques sont une autre classe de bio-macromolécules qui ont fait l’objet
d’études sur leur incorporation au sein de films LbL. Par exemple, l’ADN, chargé
négativement, peut être utilisé comme un polyanion. La construction de films LbL basée sur
l’alternance d’un polycation, en l’occurrence la PLL, et de l’ADN a été rapportée par
Sukhorukov et al..46 L’intérêt de telles constructions est de permettre la transfection des
cellules cultivées à leur surface.73 De plus, Ren et al. ont montré que l’association de l’ADN
avec la PLL par le glutaraldéhyde, au sein d’architectures LbL augmentait la stabilité de
l’ADN en le protégeant notamment de la dégradation enzymatique par les
désoxyribonucléases (DNases) produites par les cellules. Ces résultats prometteurs laissent
envisager l’utilisation d’architectures LbL ADN/polycations sous forme de films73 ou de
capsules74 pour des applications diverses en ingénierie tissulaire ou dans le domaine
biomédical.
Médicaments et petites molécules

Outre les bio-macromolécules, différentes petites molécules bioactives peuvent être
incorporées dans des films LbL.
Le paclitaxel (Taxol), un anticancéreux, a été incorporé avec succès au sein de films LbL
(PLL/HA).75 Une barrière, constituée d’une paire de couches de polymères synthétiques
(PSS/PAH) a permis dans ce cas d’éviter un relargage précoce du médicament, et de favoriser
une bonne adhésion cellulaire. Des antibiotiques peuvent également être incorporés dans des
films LbL,76 ainsi que des anti-inflammatoires, comme le diclofenac de sodium.77
Cependant, des dépôts de médicaments par voie aqueuse ne permettent pas nécessairement
l’insertion de composés hydrophobes dans les films LbL, d’autant plus qu’ils ne possèdent
pas de charge. De plus, 85% des médicaments ayant reçu l’agrément de la FDA (Food and
Drug Administration) entre 1981 et 2002 sont peu solubles dans l’eau.78 Une des voies
envisagées pour parvenir à les incorporer efficacement est l’utilisation de cyclodextrines et de
40
leurs dérivés (polymères, dérivés anioniques ou cationiques). La complexation de molécules
hydrophobes avec les cyclodextrines permet d’augmenter de manière significative leur
solubilité dans l’eau.
Des architectures basées sur des dépôts alternés de polymères de cyclodextrines (CD)
anioniques avec un polycation permettent non seulement d’immobiliser des composés
hydrophobes dans des architectures LbL, mais aussi de contrôler leur relargage. Par exemple,
une étude menée par Smith et al. sur des films LbL composés d’un polycation dégradable
(poly(β-amino esters)) et un polymère anionique de cyclodextrines permet un relargage de
différents médicaments (flurbiprofène et diclofenac) sur une durée de 25 jours.79 D’autre part,
Tabary et al. ont montré qu’il était possible de contrôler la cinétique de relargage d’un
composé hydrophobe modèle (le bleu de méthylène) vectorisé par un polymère de CD, en
modulant l’épaisseur du film LbL.80
Ce type de fonctionnalisation a montré des effets prometteurs sur les cellules cultivées sur
les films traités. Par exemple, l’insertion d’un complexe β-cyclodextrine/piroxicam (un anti-
inflammatoire non stéroïdien) a permis d’induire une réponse cellulaire, dans un délai
dépendant de la profondeur à laquelle se trouve la couche de complexe dans le film.81
Une étude in vivo sur des films LbL composés de films (PLL/PGA) sur lesquels sont
rajoutés trois ou six paires de couches de PGA et de PLL couplé de manière covalente à une
β-cyclodextrine a montré un effet curatif et préventif d’un anticancéreux ainsi vectorisé, le
risedronate, sur des souris présentant des tumeurs osseuses.82 Dans ce cas, le composé actif
n’a pas été incorporé (ou pas seulement) dans les cavités des cyclodextrines sous la forme de
complexes d’inclusion, mais semblait porté par leurs couronnes hydroxylées, via des liaisons
hydrogènes.
Contrôle du relargage
Les composés thérapeutiques n’ont d’intérêt que s’ils sont accessibles aux cellules
cultivées sur les films dans lesquels ils sont incorporés. Il existe plusieurs mécanismes
responsables du relargage de composés thérapeutiques par les films LbL (Figure I-12) : par
diffusion vers le milieu dans lequel est immergé le film, par dégradation partielle ou totale de
l’architecture (par hydrolyse ou dégradation enzymatique), ou par un stimulus
environnemental (variation du pH, de la force ionique, de la température…).83
41
Figure I-12 : Mécanismes de relargage de composés bioactifs par des films LbL : par
diffusion passive, dégradation du film ou en réponse à un signal extérieur (pH, force ionique,
température…) (d’après Pavlukhina et al.).83
La microstructure des films permet de contrôler la cinétique de relargage des composés

vers le milieu dans lequel ils sont immergés. Sur des films dont la porosité est contrôlée,84 il a
été démontré qu’il était possible de moduler la vitesse de relargage de ketoprofène et de
cytochalasine D.85 De plus, les quantités de médicaments insérées sont contrôlables en variant
le nombre de couches poreuses au sein de l’architecture. Comme nous l’avons vu
précédemment, les cyclodextrines sont également un moyen de contrôler les cinétiques de
relargage de composés hydrophobes. Martin et al. ont étudié la cinétique de relargage de
l’acide 4-tert-butylbenzoïque (TBBA), utilisé comme modèle.86 Les auteurs ont montré qu’en
utilisant des films composés de chitosan et d’un polymère de β-cyclodextrine anionique de 10,
16 et 20 paires de couches, la totalité du TBBA était relarguée en 7, 14 et 27 jours
respectivement.
La dégradation des films peut également être envisagée pour rendre les composés actifs
accessibles aux cellules. Les cellules elles-mêmes sont susceptibles de produire en éventail
d’enzymes qui peuvent dégrader lentement les architectures LbL. Par exemple, Jessel et al.
ont montré que la protéine A, une protéine pro-inflammatoire, n’avait pas la possibilité de
diffuser à travers l’architecture LbL quand elle était incluse dans des films polypeptidiques
(PLL/PGA).87 Leurs résultats ont pourtant montré que les cellules cultivées sur ces films
42
produisaient du TNF-α (Tumor Necrosis Factor), indiquant leur interaction avec la protéine A.
Les auteurs ont noté une dégradation locale des films, certainement due à l’action d’enzymes
protéolytiques. Un autre exemple de dégradation enzymatique de films LbL fait intervenir une
DNase.88 Son action hydrolytique sur des films (ADN/poly(chlorure de
diallyldiméthylammonium)), qui nécessite la présence de cations divalents Mg2+ et Ca2+,
permet la dégradation des films, ouvrant ainsi la voie au relargage de composés bioactifs
préalablement insérés dans l’architecture.
Une alternative à la dégradation enzymatique des films LbL est l’utilisation de
polyélectrolytes modifiés chimiquement, de façon à les rendre hydrolysables. Une telle
approche permet un contrôle du désassemblage des films sur des temps longs (jours). Zhang
et al. ont ainsi utilisé des polyamines contenant des groupements esters hydrolysables. 89 Le
temps nécessaire à la dégradation complète des films a pu être modulé de 2 à 14 jours.
Il est possible d’imaginer des systèmes combinant plusieurs mécanismes de délivrance.
Dans leur étude, Smith et al. ont fabriqué des films basés sur l’alternance de polymères de
cyclodextrines anioniques et de polycations hydrolysables.79 Cette combinaison permet de
vectoriser des composés hydrophobes, tout en contrôlant finement la cinétique de relargage.
La littérature rapporte également des études concernant le relargage de composés actifs

dépendant de variations environnementales, telles que des variations de pH,90 de force
ionique91 ou de température.92
D’une manière intéressante, Abdelkebir et al. rapportent le cas d’un système LbL
(CSA/PLL) qui, lorsqu’il est mis au contact d’une phosphoprotéine, la phosvitine (PhV), est
presque totalement dégradé.93 Il s’agit là d’un mode original de dégradation, induite par la
mise en contact du film avec une protéine non-enzymatique. Cette déstructuration basée sur
une interaction plus forte de la PLL avec la PhV qu’avec la CSA, permet d’imaginer des
systèmes LbL biomimétiques, pouvant, en présence de protéines spécifiques, être dégradés et
relarguer des composés actifs.
I.C Le tissu osseux

Le tissu osseux est un tissu conjonctif minéralisé constitué d’une phase minérale et d’une
matrice organique, qui représentent respectivement 70% et 30% du poids sec. C’est cette
composition qui lui confère ses propriétés mécaniques originales. L’eau représente 25% de la
masse osseuse. C’est un tissu innervé et vascularisé qui assure quatre fonctions majeures :
43
 biomécanique : en tant que support mécanique du squelette, c’est lui qui assure la
locomotion.
 protectrice : il assure un rôle de protection de certains organes vitaux, comme ceux
contenus dans la cage thoracique ou le cerveau
 métabolique : il sert de réservoir pour certains sels minéraux, jouant notamment un
rôle important dans le métabolisme phosphocalcique.
 hématopoïétique : il est le siège principal de l’hématopoïèse, c'est-à-dire la création et
le renouvellement des cellules sanguines, qui se fait dans la moelle osseuse.
I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse

Dans le tissu osseux, la MEC comporte une phase organique et une phase minérale.
a. La phase organique
La matrice organique osseuse, également appelée ostéoïde, est composée à 90% de fibres
de collagène (dont 97% de type I et 3% de type V). Le reste de l’ostéoïde est constitué de
protéines non fibreuses et de protéoglycanes.94
 Les collagènes : ce sont des protéines structurales, qui assurent le soutien mécanique
du tissu osseux. Elles sont assemblées sous forme de fibres, constituées de l’association de
trois chaînes polypeptidiques en hélice gauche α, formant le tropocollagène, l’unité de base
des fibres de collagène. Ces fibres forment un réseau qui permet la fixation de
l’hydroxyapatite (HAp), et donc la minéralisation du tissu.
 Les protéoglycanes : Ils sont composés d’un axe protéique auquel sont liés des GAGs,
formant une structure dite en « peigne ». Dans l’os, les protéoglycanes majoritaires sont les
décorines et les biglycanes. Liés au collagène de type I, ils participent à l’assemblage de la
matrice osseuse. Les GAGs sont des polysaccharides composés d’unités disaccharidiques
sulfatées et/ou carboxylées répétées. Ce sont des composés très hydrophiles, chaque unité
disaccharidique pouvant être entourée de 30 molécules d’eau, qui présentent une forte affinité
pour les cations, de part leur nature anionique, mais aussi pour les facteurs de croissance. Les
plus représentés dans le tissu osseux sont les chondroïtines sulfate et les kératanes sulfate. Les
protéoglycanes ont deux rôles majeurs dans la MEC osseuse, du fait de leur forte capacité à
retenir l’eau : ils confèrent à l’os ses propriétés viscoélastiques et permettent le passage de
nutriments, hormones et métabolites du sang vers les cellules osseuses. Comme dans d’autres
tissus conjonctifs, ils servent aussi de réservoir aux facteurs de croissance.
44
 Les sialoprotéines osseuses : ces protéines contiennent le motif RGD et interviennent
donc dans l’adhésion des cellules à la MEC, via les intégrines.95 La sialoprotéine osseuse II
(BSPII) est exprimée à la fois par les ostéoblastes et les ostéoclastes (voir section suivante).
 L’ostéopontine : cette protéine intervient également dans la résorption osseuse, en
permettant un ancrage des ostéoclastes à la MEC.
 L’ostéocalcine et l’ostéonectine : ce sont deux glycoprotéines ayant une forte affinité
pour l’hydroxyapatite. De par le fait, elles jouent un rôle majeur dans la minéralisation de
MEC osseuse. 96,97 L’ostéocalcine joue également un rôle de régulateur des ostéoblastes et de
la minéralisation.
b. La phase minérale
La phase minérale de la MEC osseuse assure la dureté et la rigidité du tissu. Elle est
constituée de nanocristaux plats d’HAP de 30-50 nm de long, 20-25 nm de large et 1,5-4 nm
d’épaisseur. Sa formule pure est Ca5(PO4)3(OH), correspondant à un ratio Ca/P de 1,67.
Cependant, la structure de l’HAP osseuse se caractérise par de nombreuses lacunes
(hydroxyles) ou substitutions (carbonates, fluor, calcium, magnésium).98 Divers phosphates de
calcium peuvent également intervenir au cours des processus de biominéralisation in vivo ou
in vitro, ou lors de divers processus de préparation de phosphate de calcium à destination
d'applications biomédicales. Notamment, le phosphate de calcium amorphe et le phosphate
octacalcique ont été décrits comme des phases précurseurs dans la formation de l’HAP au sein
des tissus minéralisés.99
I.C.2 Les cellules osseuses

Les cellules osseuses proviennent principalement de deux lignées : d’une part les
ostéoclastes (cellules ostéorésorbantes), et d’autre part les ostéoblastes, les ostéocytes et les
cellules bordantes (cellules ostéoformatrices) (Figure I-13).
45
Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses (d’après
http://www.imperialendo.com/for-patients/endocrine-services/metabolic-bone-and-
parathyroid-disorders).
a. Lignée ostéoformatrice
 Les ostéoblastes : ces cellules proviennent de la différenciation de cellules stromales
de la moelle osseuse. Elles font partie, avec les ostéocytes et les cellules bordantes, des
cellules dites ostéoformatrices. Elles sécrètent de nombreux composants de la phase
organique de la MEC osseuse et participent au contrôle de sa calcification. Au sein du tissu,
elles communiquent entre elles et avec les ostéocytes via des jonctions communicantes. Elles
interviennent indirectement dans la résorption osseuse, en contrôlant l’activité des
ostéoclastes.100 Au cours de la maturation du tissu osseux, c'est-à-dire sa minéralisation, leur
activité diminue et elles peuvent se différencier en ostéocytes et s’entourer de matrice
minéralisée, rentrer en quiescence sous la forme de cellules bordantes, ou mourir par
apoptose.
 Les ostéocytes : ce sont des ostéoblastes différenciés. Ils sont situés dans des niches,
ou ostéoplastes, et totalement entourés de matrice minéralisée. Toutefois, des extensions
passant par un réseau de canicules leur permettent à la fois de communiquer avec les autres
cellules osseuses, notamment les ostéoblastes et les cellules bordantes, et aussi de se nourrir,
via les vaisseaux sanguins qui parcourent le tissu osseux.
 Les cellules bordantes : ce sont des ostéoblastes quiescents, c'est-à-dire n’ayant plus
d’activité métabolique, contrairement aux ostéoblastes. Ces cellules se trouvent, entre autre, à
la périphérie des lacunes formées par l’action des ostéoclastes. Elles interagissent entre elles
46
et avec les ostéocytes par des jonctions communicantes. Elles peuvent redevenir des
ostéoblastes actifs lorsqu’elles sont stimulées.101
b. La lignée ostéorésorbante
Les ostéoclastes sont les seules cellules de cette lignée. Ce sont des cellules dérivées de la
lignée hématopoïétique monocytaire.102 Au cours de leur différenciation, les cellules de cette
lignée deviennent des cellules géantes polynucléées (entre 10 et 20 noyaux). Elles sont très
mobiles et se déplacent le long des travées osseuses d’un site de résorption à un autre. Lors de
leur activation, ces cellules se polarisent et développent, au contact de la surface de l’os une
bordure en brosse, entourée d’un anneau de jonction membrane-MEC. Elles sécrètent alors de
l’acide et des enzymes protéolytiques qui dégradent localement l’os. Ce faisant, elles forment
des lacunes de résorption, appelées lacunes de Howship.
I.C.3 Le remodelage osseux

Le tissu osseux est un tissu dynamique, en perpétuel remaniement. Ce phénomène permet
de maintenir les propriétés mécaniques de l’os, et de réguler le métabolisme phosphocalcique.
Il est le résultat de la coopération des cellules de la lignée ostéorésorbante qui dégrade l’os
vieux, et de la lignée ostéoformatrice, qui va synthétiser une nouvelle matrice.103,104
Chez l’être humain adulte, le renouvellement complet du squelette prend environ 10 ans et
se déroule en cinq étapes (Figure I-14).105
Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux (d’après Funck-Brentano et al.).105
47
Le remodelage débute par une phase d’activation, caractérisée par la rétractation des
cellules bordantes tapissant l’os, ce qui permet le passage des ostéoclastes, qui peuvent alors
accéder à l’os et entamer le processus d’ostéolyse.
Après cette étape d’activation, les ostéoclastes adhèrent à la MEC osseuse, via des
récepteurs membranaires, et forment l’anneau de jonction qui délimite la lacune de Howship.
Cette adhésion fait intervenir d’une part des protéines de la matrice osseuse, notamment
l’ostéopontine, les sialoprotéines osseuses et le collagène de type I, et d’autre part des
récepteurs membranaires de type intégrines. La résorption de la matrice se déroule en deux
étapes : (i) la dissolution de la phase minérale, par la sécrétion d’acides par l’ostéoclaste et (ii)
la dégradation de la matrice organique par des enzymes protéolytiques.
À la fin de cette étape de résorption, les ostéoclastes meurent par apoptose et laissent la
place à des macrophages qui lissent le fond de la lacune. C’est la phase d’inversion.
Intervient alors une étape de formation d’un nouveau tissu osseux. Cette étape est liée à
l’activation des ostéoblastes. Les cellules ostéoprogénitrices présentes au fond de la lacune
prolifèrent et se différencient en ostéoblastes. Ce sont ces cellules, qui se caractérisent par un
haut niveau de sécrétion protéique, et synthétisent la nouvelle MEC. Cette matrice néoformée,
appelée ostéoïde, comble la lacune. Elles sécrètent également de nombreux facteurs de
croissance, dont les BMP, le FGF2, le TGFβ et l’IGF, qui sont stockés dans la MEC. 106 Ces
facteurs de croissance jouent un rôle essentiel dans l’ostéogénèse, en permettant le
recrutement, la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et de leurs précurseurs. La
minéralisation de cette matrice néoformée intervient dans un second temps. Les ostéoblastes
synthétisent, lors des étapes précoces de leur différenciation, un haut niveau de phosphatase
alcaline (couramment utilisé comme marqueur de leur différenciation précoce). Ces cellules
produisent également des vésicules extracellulaires organite-matrice, qui sont des structures
impliquées dans la formation et la nucléation des cristaux de phosphate de calcium.107,108
La dernière étape du remodelage osseux est l’entrée des ostéoblastes non différenciés en
ostéocytes, et des ostéoblastes qui ne sont pas morts par apoptose, dans une phase de
quiescence qui se caractérise par la présence de cellules bordantes à la surface du tissu osseux.
C’est ce tapis cellulaire qui fait office de barrière et empêche les ostéoclastes d’accéder au
tissu osseux.
48
I.D Interactions cellules-matériaux
La biocompatibilité d’un matériau est intimement liée à la capacité qu’ont les cellules d’y
adhérer et d’y entamer des processus cellulaires comme la prolifération ou la différenciation.
Les caractéristiques des matériaux, en surface (chimie, énergie ou topographie) ou en masse
(propriétés mécaniques) peuvent influencer ces comportements cellulaires à plus ou moins
long terme. Cette influence, notamment des propriétés de surface des matériaux, peut
conditionner la façon dont va répondre le tissu hôte ou l’organisme à l’implant, d’où la
nécessité d’adapter ces propriétés à celles du tissu hôte, lors de l’optimisation ou la
conception de biomatériaux.
I.D.1 Influence de la chimie de surface

La chimie de surface d’un matériau est un paramètre clef dans les interactions cellules-
matériaux. Elle peut être modifiée afin de favoriser l’adhésion et l’étalement des cellules. Il
existe de nombreuses façons de modifier la chimie de surface. Les SAMs notamment offrent
la possibilité de modifier le groupement chimique terminal,109 permettant d’étudier leur
influence sur les comportements cellulaires. Par exemple, il est possible de moduler
l’hydrophobicité d’un matériau en fonctionnalisant sa surface par des groupements méthyle
(-CH3) ou hydroxyle (-OH), qui sont respectivement des groupements hydrophobes et
hydrophiles. En règle générale, l’adhésion cellulaire est favorisée sur des matériaux
hydrophiles.110 Ruardy et al. ont montré que les capacités d’étalement de fibroblastes
augmentaient avec l’hydrophilie, sur des matériaux présentant en surface un gradient
d’hydrophobie.111
Il est également possible, en faisant varier les groupements chimiques à la surface, de faire
varier la charge électrique d’un matériau. Par exemple, des groupements carboxyliques
(-COOH) donnent, à pH physiologique, une surface chargée négativement, alors que des
groupements amine primaire (-NH2) donneront une charge positive. Ce paramètre a également
une influence sur le comportement des cellules, notamment sur leur morphologie. Une surface
chargée positivement favorise l’étalement cellulaire, au point que, sur des ostéoblastes issus
de calvaria de rat nouveaux-nés, la membrane au contact du substrat ne peut être distinguée de
la surface par microscopie électronique à transmission. Sur des substrats chargés
négativement, la membrane est à nouveau visible, et quelques points focaux d’adhésion avec
la surface ont été observés.112 Il est à noter que les matériaux qui limitent l’adhésion et
l’étalement des cellules conditionnent défavorablement le devenir des cellules. En effet, des
49
cellules endothéliales cultivées sur un support conçu pour limiter leur étalement voient leur
survie limitée.113
Cependant, dans des conditions physiologiques, l’adhésion des cellules intervient toujours
après l’adsorption des protéines sur la surface. Cette étape, elle-même conditionnée par la
chimie de surface, en termes de quantité et de conformation, peut fortement influencer les
comportements cellulaires. Par exemple, des fibroblastes cultivés sur des surfaces présentant
des quantités variables de groupements hydrophiles non chargés et de groupements
hydrophobes sont incapables d’y adhérer et meurent. Par contre, si de la fibronectine, une
glycoprotéine matricielle, est adsorbée préalablement, les cellules retrouvent leur capacité
d’adhésion et d’étalement, du fait de la présence de séquences RGD, spécifiquement reconnue
par les intégrines exprimées à la surface des cellules, dans la structure de la protéine.
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau

a. Topographie
Les premières études concernant l’impact de la rugosité des matériaux sur les
comportements cellulaires font intervenir des surfaces dont la rugosité est de l’ordre du
micromètre. Cependant, lors de ces études, les procédés utilisés entraînent des modifications
de la morphologie globale ou de la chimie de surface des matériaux,114,115 paramètres qui
contribuent également à moduler les comportements cellulaires. De plus, il est relativement
rare que les paramètres de rugosité des matériaux soient correctement caractérisés. Certaines
grandeurs, comme la rugosité moyenne (Ra) ou la différence de hauteur entre le point le plus
haut et le point le plus bas de l’échantillon (Rt), sont très souvent utilisées dans les études, au
détriment d’autres paramètres complémentaires comme la périodicité ou les paramètres
hybrides.116 Dans leur étude, Macdonald et al. ont compilé plus de 100 paramètres de rugosité
et les ont corrélés de manière statistique avec des résultats biologiques afin de déterminer
lesquels ont une influence sur les comportements cellulaires.116 Par cette approche, il est
apparu que les paramètres décrivant la morphologie de la surface et le niveau d’organisation
de la topographie sont les paramètres qui ont une influence sur l’adhésion d’ostéoblastes.117
Des études menées sur une lignée de cellules d’ostéosarcome, les cellules MG63, ont
montré que la prolifération et la différenciation étaient améliorées sur des substrats rugueux,
alors que l’adhésion était inhibée.118,119,120 Alors que ces résultats sont en accord avec d’autres
études, il existe dans la littérature différents articles montrant des résultats opposés. Ces
apparentes contradictions montrent que l’influence de la rugosité sur les comportements
cellulaires est une problématique délicate à appréhender et qu’il est nécessaire de prendre en
50
compte non seulement les différents paramètres de rugosité, mais aussi les procédés employés
pour créer cette rugosité.
Il a également été démontré que la rugosité a un impact sur la biosynthèse de facteurs de
croissance par les cellules. 120,121 Lohmann et al. ont montré que cette sensibilité à la rugosité
était plus importante pour des cellules immatures que pour des cellules matures.122
En plus des méthodes classiques employées pour rendre les surfaces rugueuses, la
formation de trous ou de rides régulièrement disposés et de taille contrôlée a été utilisée.
Curtis et al. ont ainsi montré que des cellules cultivées sur des sillons s’orientent le long de
ces structures, et que plus les sillons étaient profonds, que ce soit à l’échelle nanométrique ou
micrométrique, plus ils induisent une orientation des cellules.123 Cependant, plus les sillons
sont larges, moins cette orientation est prononcée. Par ailleurs, des fibroblastes cultivés sur
des surfaces présentant des trous, prolifèrent et migrent davantage d’autant mieux que les
trous sont petits et rapprochés.
Les échelles de rugosités auxquelles sont confrontées et doivent d’adapter les cellules au
sein de leur MEC, in vivo, sont dans le domaine du nanomètre. Ces échelles correspondent à
la taille des fibres de protéines (de collagène notamment) qui régulent les interactions
cellules-MEC, via un processus connu sous le nom d’orientation de contact.124 En utilisant la
lithographie colloïdale, Dalby et al. ont créé des nano-colonnes de 160 nm de haut et 100 nm
de large.125 Les auteurs ont étudié la réponse de fibroblastes cultivés sur ces structures et ont
observé une diminution de l’adhésion et de l’étalement des cellules, due à des points focaux
d’adhésion plus petits et faibles, ainsi qu’à la désorganisation du cytosquelette. Sur des
structures comparables, Andersson et al. ont noté que plus les colonnes sont larges, meilleur
est l’étalement cellulaire, indépendamment de la hauteur des colonnes.126 Les cellules sont
capables de ressentir une profondeur de 35 nm, grâce à leurs filopodes, quand elles sont
cultivées sur des substrats présentant des trous dont le diamètre varie entre 35 et 120 nm. 127
Loesberg et al. ont conclu, sur des substrats nano-structurés (5 à 350 nm de profondeur et 20 à
1000 nm de large), qu’une profondeur de 35 nm représentait un seuil de profondeur
perceptible par les fibroblastes.128 Plusieurs études concernant ce seuil de perceptibilité de la
rugosité par les cellules ont montré que celles-ci pouvaient répondre à des îlots129 ou des
structures vermiformes130 dont la taille est de l’ordre de la dizaine de nanomètre. Ces résultats
suggèrent que ce seuil pourrait être inférieur à 10 nm, mais les effets d’une topographie
inférieure à un tel seuil restent à élucider.
51
b. Mécanique
Les propriétés mécaniques des microenvironnements auxquelles sont confrontées les

cellules au sein de leurs MEC varient d’un tissu à un autre (Figure I-15).131 Ainsi, le tissu
solide le plus mou (le tissu cérébral) a un module élastique de 102 Pa, alors que le tissu le plus
rigide (le tissu osseux) a un module élastique de 109 Pa. Ces différences sont à prendre en
compte lors du développement de biomatériaux. En effet, les cellules sont capables de
ressentir la mécanique de leur substrat et d’y répondre, en adaptant les forces qu’elles
exercent à leur substrat. Cela se traduit par des différences de comportement en fonction de
l’environnement physique.
Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains (d’après Butcher et al.).131
Afin d’étudier l’effet de la rigidité du microenvironnement mécanique sur les cellules,

l’une des stratégies les plus souvent employées est d’utiliser des hydrogels dont le module
élastique peut être finement contrôlé, en mélangeant différents ratios du polymère et de son
agent réticulant, ou en modulant les propriétés du polymère, par exemple le poids moléculaire
des chaînes. Pelham et Wang ont été les premiers, en 1997, à développer la technique de gel
de rigidité contrôlable dans le but d’étudier les comportements cellulaires en fonction des
propriétés mécaniques du substrat.132
Il a notamment été démontré que l’étalement cellulaire était influencé par la rigidité du
substrat. L’aire des cellules étalées augmente avec la rigidité du substrat, ainsi que le nombre
et la taille des points focaux d’adhésion. L’actine, une protéine du cytosquelette, forme des
52
câbles de plus en plus épais. La colocalisation des fibres d’actine avec la phospho-myosine
augmente, traduisant la formation de fibres de stress.133
De nombreuses études ont montré que la vitesse de migration était également dépendante
de la rigidité du substrat. Globalement, les cellules se déplacent plus rapidement sur des
substrats rigides, par rapport à des substrats souples. Un autre phénomène, appelé durotaxie,
par analogie au chimiotaxie, est observé quand les cellules sont cultivées sur des substrats
présentant un gradient de rigidité : les cellules se dirigent vers la zone la plus rigide du
substrat et s’y accumulent (Figure I-16).134
Figure I-16 : Déplacement et accumulation de cellules vers la zone rigide d’un gel présentant
un gradient de rigidité (barre d’échelle = 50 µm) (d’après Zaari et al.).134
Engler et al. ont montré que la différenciation des myoblastes en myocytes était un
phénomène dépendant de la rigidité du substrat.133 Les auteurs ont montré que l’apparition des
striations de myosine sur les filaments d’actine, nécessaire à la formation des sarcomères
(unité de base des myofibrilles du muscle strié), a lieu lorsque les cellules sont cultivées dans
des conditions mécaniques optimales proches de la rigidité moyenne des tissus musculaires.
En 2006, Engler et al. ont publié une étude faisant référence, dans laquelle ils ont démontré
qu’en contrôlant la rigidité de substrats, il était possible de contrôler les voies de
différenciation de cellules souches mésenchymateuses.135 Les auteurs ont réussi, sans ajout de
facteurs biochimiques externes, à induire la différenciation de ces cellules vers des
phénotypes neuronaux, myoblastiques ou ostéoblastiques.
53
Figure I-17 : Influence de la rigidité du substrat sur la différenciation de cellules souches
mésenchymateuses (d’après Engler et al.).135
Le contrôle des différentes propriétés des matériaux ouvre la voie à la conception de

matériaux biomimétiques, offrant la possibilité de contrôler le phénotype des cellules appelées
à coloniser leur surface. Néanmoins, de nombreux mécanismes, tant au niveau cellulaire
qu’au niveau de la fonctionnalisation des matériaux sont mal compris ou restent sujets à
débats. La compréhension des mécanismes par lesquels les cellules ressentent leur
microenvironnement chimique, topographique, ou mécanique pourra permettre la conception
d’outils optimaux pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.
Durant mes travaux de thèse, je me suis intéressé à l’influence de substrats fonctionnalisés

par des films LbL biomimétiques composés de CSA et de PLL, sur les comportements de
préostéoblastes murins MC3T3-E1. La méthode LbL a permis de contrôler la chimie de
surface de matériaux élastomères modèles à rigidité contrôlée, ainsi que les propriétés
mécaniques des films eux mêmes, via la réticulation avec la GnP.
54
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Chapitre II - Matériels et Méthodes
II.A Préparation des substrats 67

II.A.1 Produits et Solutions 67
a. Les tampons 67
b. Les polyélectrolytes 68
II.A.2 Les substrats PDMS 70
II.A.3 Construction des films LbL 71
a. Nettoyage et préparation des surfaces 71
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS 71
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS 72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion
Totale Atténuée, FTIR-ATR 73
a. Principe 73
b. Déroulement de l’analyse 75
c. Appareillage 75
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM 75
a. Principe 76
b. Traitement des données 77
c. Appareillage 78
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D 79
a. Principe 80
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn 81
c. Appareillage 83
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS 84
a. Principe 84
b. Traitement des données OWLS 85
c. Appareillage 86
II.B.5 Essais mécaniques 87
a. Principe 87
b. Déroulement des expériences 89
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation 91
d. Appareillage 91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact 92
a. Principe 92
b. Réalisation des mesures 92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB 93
II.B.8 Microscopie à épifluorescence 93
a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente 93
b. Préparation des substrats et observations 94
66
II.C Fonctionnalisation des films LbL 94
II.C.1 Réticulation par la génipine 94
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine 96
II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire 97
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire 97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue® 98
II.D.4 Évaluation de la différenciation 98
a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL 98
II.D.5 Tests statistiques 99
II.E Références bibliographiques 100
II.A Préparation des substrats
II.A.1 Produits et Solutions

a. Les tampons
Le tampon Tris - NaCl
Les solutions utilisées pour la fabrication des LbL sont réalisées dans du tampon
Tris - NaCl offrant des conditions de pH (7,4) et de force ionique (~ 0,15 M) proches des
conditions physiologiques. Ce tampon est constitué de tris[hydroxyméthyl]aminométhane
(Tris) (C4H11NO3) 10 mM, et de NaCl 150 mM. Pour sa fabrication, les composés sont
dissous dans de l’eau ultrapure EASYpureTM RF (Barnstead) de résistivité 18,3 MΩ cm. Le
pH de la solution obtenue est ensuite ajusté à 7,4 par ajout de quelques gouttes d’acide
chlorhydrique à 0,1 M.
Le tampon DPBS
Pour la réaction de réticulation par la génipine, il est nécessaire d’utiliser un milieu
dépourvu d’amines. Le tampon utilisé est du DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline). Ce
tampon permet de placer les films LbL dans des conditions de pH et de force ionique proche
des conditions offertes par le tampon Tris - NaCl. Le système tampon est basé sur un système
dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)/hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4).
La force ionique est maintenue par l’ajout de NaCl et de KCl. Les différents constituants sont
67
dissous dans de l’eau ultrapure de resistivité 18,3 MΩ cm, comme précédemment, puis le pH
est contrôlé (7,4 - 7,5).
b. Les polyélectrolytes
Le poly(éthylène imine) (PEI).
Le PEI est un polycation synthétique fortement ramifié comportant environ 25 % d’amines
primaires, 50% d’amines secondaires et 25% d’amines tertiaires. Aux pH d’utilisation usuels,
ce polyélectrolyte présente une forte densité de charges positives (pKa ~ 10,0). Nous l’avons
donc utilisé systématiquement pour constituer une monocouche précurseur, afin d’uniformiser
l’état de surface des supports sur lesquels nos films LbL sont construits.1 Il est utilisée à une
concentration de 5 mg mL-1. La structure du PEI est donnée par la Figure II-1.
Figure II-1 : Le poly(éthylène imine), PEI

(Mn = 60000 Da ; Mw = 750000 Da).
La poly(L-lysine) (PLL)
La PLL est un polypeptide constitué d’un enchaînement de l’acide aminé L-lysine. Le
groupement latéral de cet acide aminé porte une fonction amine de pKa ~ 10,5 en position ε.
De ce fait, la PLL est chargée positivement à pH physiologique.2 Ce polyélectrolyte est utilisé
dans un grand nombre de techniques de traitement de surface pour les biomatériaux 3 ou
l’ingénierie tissulaire.4 Il s’agit de l’un des rares polyélectrolytes cationiques permettant de
conférer un caractère biomimétique aux films LbL, quand il est associé à un biopolymère
anionique, comme par exemple un polypeptide (poly(acide glutamique)) ou un polysaccharide
(acide hyaluronique, héparane sulfate,…). Elle est utilisée à une concentration de 1 mg mL-1.
La Figure II-2 donne la structure chimique de la PLL.
68
Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL (Mn =
40000 – 60000 Da).
La chondroïtine sulfate A (CSA)

La CSA est un polysaccharide biologique présent dans les tissus cartilagineux, ainsi que
dans la matrice organique des tissus osseux. C’est un glycosaminoglycane (GAG) linéaire de
haut poids moléculaire composé d’un enchaînement d’unités disaccharidiques d’acide D-
glucuronique-β-1,3-N-acétylgalactosamine-4-sulfate, chaque unité étant liée à la suivante par
une liaison β-1,4. La CSA porte des groupements sulfate (pKa ~ 2 – 2,5) et carboxylate (pKa
~ 3,5 – 4) anioniques à pH physiologique.
Elle est présente dans les biglycanes et les décorines, deux protéoglycanes majeurs du tissu
osseux.5 La CSA a un rôle dans les mécanismes d’action de facteurs de croissance
endogéniques, et elle participe aussi au remodelage osseux et à l’ostéointégration. Du fait de
sa capacité à lier les facteurs de croissance et les composés cationiques, la CSA est utilisée
dans la fabrication de réservoirs pour de la délivrance moléculaire in situ.6 Enfin, elle est
utilisée pour des revêtements de surfaces,7 incorporée à des ciments osseux afin d’en
améliorer la biocompatibilité,8 ou combinée à du collagène pour former des structures
tridimensionnelles poreuses.9 Elle est utilisée à une concentration de 1 mg mL-1. La Figure
II-3 donne la structure chimique de la CSA.
Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA

(Mn = 20000 – 30000 Da).
69
II.A.2 Les substrats PDMS
Dans le cadre de l’étude de l’influence de l’élasticité du substrat dans les interactions
cellules-substrats, des gels ou des élastomères modèles aux propriétés mécaniques contrôlées
par le taux d’agent réticulant, comme le poly(acrylamide) (PA) et le poly(dimethylsiloxane)
(PDMS), sont couramment utilisés. Alors que le PA est limité à des valeurs comprises entre
0,1 et 100 kPa,10 le PDMS donne accès à une gamme d’élasticité plus importante, comprise
entre le kPa et le MPa11. Cela rend le PDMS particulièrement approprié du point de vue
mécanique pour une étude du comportement de cellules osseuses. De plus, du fait de sa
transparence et de sa biocompatibilité, le PDMS est aujourd’hui employé pour des
applications biomédicales comme les lentilles de contact ou les pacemakers12. Cependant, son
usage en tant que biomatériau est limité du fait de sa faible énergie de surface en milieu
aqueux, conduisant à une adsorption massive de protéines à sa surface.13
Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS.
Le PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) est un élastomère hybride de type
polyorganosiloxane d’unités répétées [OSi(CH3)2]n (Figure II-4). Il se présente sous la forme
d’un kit à deux composants, constitué d’une part d’oligomères de diméthylsiloxane présentant
des groupements vinyles terminaux (prépolymère) et d’autre part, de
diméthylhydrogénosilane (agent réticulant). L’agent réticulant subit des hydrosilylations
pendant la réticulation conduisant à la réticulation par la formation de liaisons Si-C. Les
substrats de diverses rigidités sont préparés en modulant le taux, en masse, d’agent réticulant
par rapport au prépolymère. Les taux (agent réticulant:prépolymère) utilisés sont 3:100
(PDMS-3), 5:100 (PDMS-5), 7:100 (PDMS-7), 10:100 (PDMS-10) et 20:100 (PDMS-20).
Ces mélanges sont déposés dans des plaques de culture multipuits, puis placés pendant 5
heures à 65°C pour activer la réticulation.
En vue de leur caractérisation physico-chimique (AFM, FTIR-ATR, mesure d’angle de
contact, observations en microscopie à épifluorescence), des substrats minces de PDMS ont
été fabriqués sur des lamelles de verre de 14 mm de diamètre. Pour préparer ces dépôts, des
solutions à une concentration de 10% (w/w) du mélange (prépolymère/agent réticulant) dans
70
du chloroforme sont réalisées. Pour cela, les mêmes mélanges de prépolymère et d’agent
réticulant sont réalisés, puis dilués dans du chloroforme. Les dépôts sont préparés par
évaporation du chloroforme sur une lamelle de verre. Le dépôt de PDMS ainsi réalisé est
placé pour la réticulation pendant 5 heures à 65°C, c'est-à-dire dans les mêmes conditions que
les substrats préparés dans les plaques de culture multipuits.
II.A.3 Construction des films LbL

a. Nettoyage et préparation des surfaces
Avant toute utilisation, le matériel utilisé pour la construction des films LbL est nettoyé
avec du SDS 0,05 M à 80°C pendant 5 minutes, puis rincé à l’eau ultrapure. L’ensemble du
matériel est ensuite nettoyé avec de l’acide chlorhydrique à 15%, puis rincé à l’eau ultrapure.
Les résonateurs QCM-D sont nettoyés avec un mélange ammoniacal APM (« Ammonia
Peroxide Mix » : mélange 5:1:1 d’eau ultrapure, de peroxyde d’hydrogène 30% et
d’ammoniaque 25%). Les lamelles de verre sont nettoyées avec une solution Piranha
(mélange 3:1 d’acide sulfurique concentré et de peroxyde d’hydrogène 30%) pendant 20
minutes puis abondamment rincées à l’eau ultrapure.
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS

Construction manuelle.
Les lamelles sont placées dans des plaques 24 puits (3526, Corning), mises en contact avec
une solution de PEI à une concentration de 5 mg mL-1 pendant 30 minutes, puis rincées 3 fois
3 minutes avec le tampon Tri - NaCl. Après cette étape permettant l’adsorption d’une couche
précurseur polycationique, les puits sont remplis, de manière alternée, par les solutions de
polyélectrolytes (CSA et PLL), à la concentration de 1 mg mL-1, pendant 10 minutes, en
commençant par la CSA de charge négative, puis rincés trois fois 3 minutes avec le tampon
Tris - NaCl. Il est donc possible de contrôler l’épaisseur du film en modifiant le nombre de
cycles d’adsorptions effectués.14
Construction automatisée.
Il est également possible de construire les films multicouches de manière automatisée.
Pour cela, les substrats sont déposés sur un porte-échantillon en PTFE. Ils sont immergés
manuellement pendant 30 minutes dans une solution de PEI 5 mg mL-1, puis rincés trois fois
avec le tampon. Le porte-échantillon est ensuite fixé sur un bras motorisé mobile en xyz
contrôlé par informatique, permettant les immersions successives dans les solutions de
71
polyélectrolytes et de rinçage. Les substrats sont ainsi mis au contact des solutions de
polyélectrolytes pendant 10 minutes. Chaque étape de rinçage dans le tampon consiste en des
séries de trois immersions de 1 seconde et une immersion de 1 minute dans trois béchers de
80 mL, puis trois immersions de 1 seconde et une immersion de 3 minutes dans deux béchers
de 250 mL.
Fonctionnalisation des substrats PDMS

Les substrats PDMS préparés dans les plaques de culture sont fonctionnalisés in situ,
suivant le même protocole que celui appliqué pour les substrats en verre fonctionnalisés
manuellement. Les films minces de PDMS sont fonctionnalisés à l’aide de l’automate.
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS

Pour les études par QCM-D, les films sont construits dans une cellule thermostatée. Après
installation du résonateur dans la cellule d’écoulement, le circuit est conditionné avec le
tampon Tris - NaCl jusqu’à stabilisation du signal. La construction des multicouches est
initiée par mise en contact, pendant 10 minutes, du résonateur avec une solution de PEI (5 mg
mL-1). Le rinçage est effectué par écoulement de tampon Tris - NaCl dans le circuit, puis un
temps de stabilisation de 10 minutes. Cette séquence est répétée pour les adsorptions alternées
de polyanions et de polycations.
Pour les études par OWLS, le protocole de construction est identique, excepté pour le
mode d’écoulement. Il s’agit ici d’un flux, stoppé pour les polyélectrolytes et continu faible
de la solution de rinçage, au contact du support traité durant la période d’interaction
souhaitée, et non d’un flux initial rapide suivi d’une stabilisation statique. Les polymères sont
laissés au contact du support durant une période de 10 minutes.
Les solutions sont dégazées à l’argon, pour la QCM-D, et aux ultrasons, pour l’OWLS,
avant injection dans le circuit d’écoulement, afin d’éviter la formation de bulles au contact des
résonateurs de QCM-D ou des guides d’onde OWLS.
72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats
II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion Totale
Atténuée, FTIR-ATR
La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) est une technique de
spectroscopie vibrationnelle utilisée pour la caractérisation chimique de composés à l’état
gazeux, liquide ou solide.
a. Principe
Un faisceau infrarouge (de longueur d’onde comprise entre 2,5 – 25 µm) traversant un
échantillon peut, selon sa longueur d’onde, y provoquer des transitions de niveaux
vibrationnels dans les molécules qui le composent, si sa longueur d’onde est voisine de
l’énergie de vibration d’une liaison, fournissant ainsi des informations sur la nature des
liaisons chimiques présentes dans l’échantillon.
Toutes les liaisons chimiques n’absorbent pas dans le domaine infrarouge, cela dépend
notamment de la symétrie de la molécule. Il existe différents modes de vibration symétriques
ou asymétriques, appelés élongations ou déformations (Figure II-5). La masse des atomes
ainsi que leur électronégativité influence également la position des bandes d’absorption. La
signature spectrale infrarouge de l’échantillon permet de définir précisément sa composition
chimique.
Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules : élongations symétriques (a et b) et

asymétriques (c et d), déformations dans le plan symétriques (e et f) et asymétriques (g et h) et
déformations hors du plan, symétriques (i et j) et asymétriques (k et l).
73
L’acquisition du spectre consiste à mesurer l’intensité du faisceau transmis en fonction de
la longueur d’onde. Dans la méthode FTIR, l’échantillon est irradié simultanément à toutes les
longueurs d’onde et la totalité du spectre IR est obtenue directement par la transformée de
Fourier du signal transmis. Cette technique offre des temps d’acquisition courts, permettant
ainsi d’augmenter le nombre d’acquisitions, d’obtenir un bon rapport signal/bruit et donc
d’améliorer la sensibilité de la détection.
Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion.
En mode de réflexion totale atténuée (ATR), le faisceau IR incident est dirigé à travers un
cristal de séléniure de zinc (ZnSe) d’indice de réfraction élevé (n1) (Figure II-6). A l’interface
entre le cristal et le milieu d’indice de réfraction plus faible (n2), le faisceau incident subit une
réflexion interne totale. Si l’angle d’incidence du faisceau excède un angle critique θc,
déterminé par sin θc = n1/n2, il se forme une onde évanescente au point de réflexion dont
l’intensité du champ électrique du faisceau décroît en s’éloignant de la surface du cristal
(Figure II-7). Cette propriété permet de sonder, par la mesure de l’absorption de l’onde
évanescente par le milieu adjacent, des dépôts de matière d’épaisseur micrométrique, et
d’analyser la composition de ce qui se trouve à la surface du cristal.
Figure II-7 : Profil de décroissance de l’onde évanescente infrarouge (n2 < n1).
74
b. Déroulement de l’analyse
Dans ces travaux, la spectroscopie FTIR-ATR a été utilisée pour la caractérisation des
substrats PDMS, ainsi que de divers films LbL.
Les échantillons de PDMS natifs ou fonctionnalisés avec les films LbL sont déposés sur le
cristal de ZnSe. Une moyenne de seize spectres est effectuée pour chaque échantillon, entre
4000 et 600 cm-1, à une résolution de 2 cm-1.
Pour l’étude de la réticulation par la génipine, les films LbL sont construits manuellement
sur le cristal de ZnSe, par adsorptions alternées de CSA et de PLL, sur une couche précurseur
de PEI, en respectant les mêmes durées d’adsorption que dans le protocole décrit
précédemment. Après chaque étape d’adsorption, la solution de polyélectrolytes est éliminée,
puis trois rinçages au tampon Tris - NaCl sont effectués. Après la construction du film
PEI/(CSA/PLL)6, celui-ci est séché sous un léger flux d’argon. Cette étape a pour but
d’éliminer l’eau qui absorbe une grande partie du faisceau infrarouge. Une acquisition du
spectre est alors opérée, entre 1800 et 800 cm-1. Puis l’échantillon est réhydraté, avec du
tampon DPBS, et réticulé pendant seize heures par une solution de génipine à 0,50% (GnP50).
Après réticulation, la solution de génipine est éliminée, le film est rincé une première fois
avec du tampon DPBS, puis une seconde fois avec du tampon Tris - NaCl, afin de le placer
dans les mêmes conditions que lors de la construction. Une nouvelle acquisition est alors
effectuée sur le film réticulé.
c. Appareillage
L’appareil ATR-FTIR utilisé est un système Perkin-Elmer Spectrum BX FTIR System,

donnant accès à la région spectrale 550 – 4000 cm-1 avec une résolution maximale de 1 cm-1.
Le cristal d’ATR est composé de ZnSe (n = 2,42).
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM

La microscopie à force atomique (AFM) est une technique permettant d’obtenir des images
bi et tri-tridimensionnelles d’une surface avec une très haute résolution, pouvant aller jusqu’à
l’échelle atomique. Cette technique permet également d’obtenir, en plus de la topographie et
de la rugosité, des informations sur les propriétés de surface : composantes électriques ou
magnétiques de surface, forces d’adhésion ou propriétés mécaniques de surface. Ces mesures
peuvent être menées à l’air ou en milieu liquide, ce qui dispense d’une étape de séchage qui
75
pourrait entraîner une déstructuration des dépôts. Les échantillons étudiés peuvent être de
diverses natures : métaux, céramiques, polymères, films adsorbés…
a. Principe
L’AFM est basée sur la mesure des forces d’interaction (forces de van der Waals et forces
électrostatiques) entre une surface et une pointe très fine, idéalement monoatomique. Cette
pointe est montée au bout d’un bras de levier (ou cantilever), de constante de raideur k
connue. La déflexion ∆z du bras de levier, induite par la force F exercée par l’interaction avec
la surface, est suivie à l’aide d’un faisceau laser réfléchi par la partie supérieure du bras de
levier et détecté par une photodiode (Figure II-8). La force F est donc reliée à la déflection
∆z par la relation :
Équation II-1
Lors du balayage de la surface par la pointe, tout relief provoque une déviation du faisceau
réfléchi. L’analyse de ces déviations permet de retracer le relief de l’échantillon.
Les déplacements en xyz de l’échantillon sont assurés grâce à une céramique piézoélectrique.
Les déplacements en x et y permettent le balayage latéral de l’échantillon, la direction z
permettant d’éloigner ou de rapprocher l’échantillon de la pointe.
Figure II-8 : Principe de fonctionnement d’un microscope à force atomique (AFM).
L’AFM permet également d’évaluer, par les techniques de nanoindentation, les propriétés
mécaniques des surfaces analysées, par l’étude des courbes de force qui représentent la force
exercée sur la pointe par la surface en fonction de la distance qui les sépare (Figure II-9). Il
est possible, en exerçant une pression sur la surface, de calculer le module élastique, ou
76
module d’Young, des échantillons analysés. Pour cela, il existe différents modèles
mathématiques qui permettent, en connaissant les propriétés du bras de levier et de la pointe
utilisée, de remonter aux propriétés mécaniques de l’échantillon.
Figure II-9 : Evolution de la force F

exercée sur la pointe par l’échantillon en
charge (en bleu) et et en décharge (en
rouge). L’hystérésis observée en décharge
est due aux forces d’adhésion entre la pointe
et la surface.
b. Traitement des données

Les données (images et courbes de force) sont traitées avec le logiciel SPIPTM (Scanning
Probe Image Processor). Les données topographiques fournies par l’analyse des images sont,
entre autres : (i) la rugosité Ra, qui représente la moyenne arithmétique des déviations par
rapport à la hauteur moyenne et (ii) la rugosité Rt qui correspond à la différence de hauteur
entre le point le plus haut de la zone analysée et le point le plus bas.
Pour la détermination des propriétés mécaniques de l’échantillon les deux modèles
d’analyse les plus couramment utilisés sont représentés dans la Figure II-10.
Figure II-10 : Modèles de pointes sphérique (modèle de Hertz) ou coniques (modèle de

Sneddon) utilisées en nanoindentation par AFM, avec Esurface le module d’Young, νsurface le
coefficient de Poisson et (S0-S) la distance de pénétration (indentation) de la pointe dans
l’échantillon.
77
Le premier modèle impliquant un indenteur sphérique rigide sur une surface souple est
décrit par la relation de Hertz :
Équation II-2
Au cours de notre étude, nous avons utilisé des pointes coniques montées sur un bras de
levier rectangulaire. Le modèle mathématique associé est le modèle de Sneddon, permettant
de relier l’indentation effectuée avec une pointe conique rigide sur une surface souple à la
force exercée sur la surface (FSneddon) par la relation :
Équation II-3
Les grandeurs qui caractérisent les indenteurs sont le rayon (RTip) dans le cas de l’indenteur
sphérique de Hertz et le demi angle au sommet α pour l’indenteur conique de Sneddon. Pour
un matériau homogène et isotrope, deux paramètres indépendants permettent de modéliser son
comportement élastique : (i) le module d’Young (Esurface), qui représente le caractère élastique
du matériau, et (ii) le coefficient de Poisson (νsurface), qui permet de caractériser la contraction
du matériau perpendiculairement à la direction de l'effort appliqué et qui représente le
caractère visqueux du matériau. Dans le cadre de ces travaux, les films LbL étant considérés
comme incompressibles, nous avons utilisé un coefficient de Poisson d’une valeur de 0,5.15
La distance (S0-S) correspond à la distance de pénétration (indentation) de l’indenteur dans
l’échantillon par rapport à sa surface.
c. Appareillage
Les caractérisations de topographie et les analyses de nanoindentation ont été réalisées
avec un appareil PicoSPM Body de Molecular Imaging. Le Tableau II-1 regroupe les
données des pointes. Nous avons volontairement utilisé des cantilevers rigides, permettant de
mesurer les propriétés mécaniques de l’ensemble de notre système (multicouche et substrat de
verre sous-jacent, correspondant à un module élastique couplé) et pas uniquement celles du
film LbL, comme c’est le cas dans certains travaux réalisés avec des cantilevers plus souples.
78
Tableau II-1 : Spécifications des pointes utilisées en AFM (données constructeurs).
Application Acquisition d’images / nanoindentation
Topographie
Constructeur Applied Nanostructures Mikromash
Référence HYDRA6V-100NG NSC18/no Al
Cantilever
architecture triangulaire rectangulaire
revêtement Au --
longueur l 100 µm 230 µm
largeur w 18 µm 40 µm
épaisseur t 0,6 µm 3 µm
constante de raideur k 0,292 N m-1 3,5 N m-1
Pointes
forme pyramidale conique
composition nitrure de silicium (Si3N4) silicium (Si)
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D

La microbalance à cristal de quartz (QCM) est un dispositif électroacoustique permettant
de détecter en temps réel et en continu l’adsorption, à partir de phases gazeuses ou liquides,
de quantités de matière très faibles sur la surface d’un capteur (ou résonateur) piézoélectrique.
Cette technique permet la caractérisation de dépôts de matière de quelques ng cm-2 à quelques
µg cm-2, et d’épaisseurs sub-nanométriques à micrométriques. La QCM traditionnelle ne
permet de caractériser que les dépôts rigides, et se révèle imprécise dans le cas de dépôts non-
rigides (viscoélastiques) comme des films de polymères ou de protéines souvent fortement
hydratés. La QCM n’est donc pas adaptée à l’étude des processus mis en jeu à la surface des
biomatériaux, comme les phénomènes d’adsorption protéique ou la fonctionnalisation par des
polymères.
Depuis une quinzaine d’années, la technique QCM-D (« -D » pour « contrôle de la
Dissipation ») complète la QCM traditionnelle, en permettant une mesure plus fiable de la
masse des dépôts viscoélastiques. La QCM-D permet également d’évaluer les propriétés
viscoélastiques de ces dépôts. Il est important de noter qu’en QCM-D, on entend par « dépôt »
l’ensemble de la matière mécaniquement couplée au capteur, ce qui inclut l’eau liée à la
matière adsorbée. La QCM-D donne donc accès à l’ensemble de la masse hydratée ou
« masse humide » du dépôt.
79
a. Principe
Le capteur utilisé, ou résonateur piézoélectrique, est constitué d’une lamelle de quartz
recouverte d’électrodes métalliques (Figure II-11). Le résonateur est caractérisé par des
fréquences de résonance, qui sont ses fréquences propres d’oscillation et sont fonction de ses
propriétés physiques intrinsèques, notamment de sa masse. La fréquence propre la plus basse
est appelée « fondamentale » (f1). Les autres fréquences de résonance, ou harmoniques
impaires (f3, f5, f7…), sont des multiples impairs de f1. L’adsorption de matière à la surface du
résonateur provoque une variation des fréquences de résonance. La QCM-D mesure ces
variations et permet de les relier à la masse et, connaissant la masse volumique, à l’épaisseur
du dépôt.
Figure II-11 : Capteur QSX301 (Q-Sense AB) (~340 µm d’épaisseur ; Ø 14 mm ; électrodes

Au).
Figure II-12 : Principe de la mesure QCM-D.
La QCM-D donne également accès aux variations des facteurs de dissipation Dn. Ces
facteurs caractérisent la vitesse d’amortissement des oscillations libres du résonateur.
Le principe de la mesure des paramètres (fn ; Dn) caractéristiques des propriétés
viscoélastiques du dépôt est rapporté par la Figure II-12 : des oscillations sont imposées au
80
capteur pendant quelques millisecondes par une différence de potentiel oscillante de
fréquence proche de sa fréquence de résonance. Après l’arrêt de ces oscillations forcées, le
dispositif mesure pendant quelques millisecondes la courbe d’amortissement des oscillations
libres. Cette courbe est ensuite modélisée par une sinusoïde amortie (Figure II-13)
d’équation :
Équation II-4
où τ = 1/(πfD) représente le temps caractéristique d’amortissement.
Figure II-13 : Calcul des paramètres (fn ; Dn) par modélisation de la courbe expérimentale
d’amortissement par une sinusoïde amortie.
Nous effectuons le suivi simultané de 4 fréquences de résonance (f1, f3, f5, f7) en procédant
à l’excitation piézoélectrique du résonateur successivement à chacune d’entre elles.
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn

Dans le cas de dépôts de matière rigides et suffisamment minces, les variations de
fréquences ∆fn permettent de remonter, via la relation de Sauerbrey, à la quantité de matière
adsorbée :
Équation II-5
où ρf et δf sont respectivement la masse volumique et l’épaisseur du dépôt, et Cf est la

sensibilité massique reliée à l’épaisseur dq et à la masse volumique ρq du quartz ainsi qu’à la
fréquence de résonance f1. Pour un capteur de fréquence fondamentale 5 MHz, Cf = 17,7 ng
cm-2 Hz-1.
81
Pour des dépôts viscoélastiques, les fréquences de résonance du capteur ne sont plus
influencées uniquement par la masse du dépôt, mais également par ses propriétés
viscoélastiques. Dans ce cas, la relation de linéarité de Sauerbrey n’est plus respectée, comme
l’illustre la Figure II-14.
Figure II-14 : (Gauche) Profils de l’évolution des paramètres mesurés en QCM(-D) pour un
dépôt rigide (Δf : vert) et pour un dépôt viscoélastique (Δf : bleu ; ΔD : rouge). Les valeurs
calculées sont indicatives. Elles sont issues du modèle mécanique équivalent montré à droite
décrivant le résonateur (et son éventuel dépôt viscoélastique) comme un oscillateur
harmonique de Voigt (masse m, viscosité η, module d’élasticité µ).
La Figure II-14 montre que dans certains domaines d’épaisseur (par exemple entre 1,5 et
2,5 µm), une augmentation de la quantité de matière adsorbée sur le capteur se traduit par une
augmentation des fréquences de résonance. Or, selon la relation de Sauerbrey, une adsorption
de matière devrait provoquer leur diminution. De plus, l’influence des propriétés
viscoélastiques sur les différentes harmoniques n’est pas linéaire, ce qui conduit à une
différenciation des valeurs de fréquences normalisées ∆fn/n. Pour interpréter les variations de
fréquences il est alors nécessaire de considérer les valeurs de dissipation ∆Dn liées aux
propriétés mécaniques de la couche adsorbée.
Le traitement des données est effectué à l’aide du logiciel Q-Tools (Q-Sense). Les courbes
de fréquence sont analysées selon le modèle d’oscillateur harmonique de Voigt. Ce modèle
est composé d’une masse m, reliée à un ressort de constante de raideur µ et à un piston de
viscosité η montés en parallèle (Figure II-14). La modélisation consiste à déterminer les
grandeurs m, µ et η du modèle de Voigt dont la courbe d’amortissement se superpose le plus
exactement à la courbe expérimentale.
82
c. Appareillage
L’instrument QCM-D utilisé dans notre étude est le modèle D300 de Q-Sense AB (Figure
II-15). Les capteurs employés, de fréquence propre f0 ~ 5 MHz (et de fréquences harmoniques
f3,5,7 ~ 15, 25, 35 MHz, sont des capteurs QSX 301 (Q-Sense AB) (électrodes d’or) (Figure
II-11).
Unité électronique
Cellule de mesure
Figure II-15 : Système QCM-D D300 (Q-Sense AB).
Le capteur est installé à l’intérieur de la cellule de mesure de telle façon que l’électrode
active du capteur (face interne) constitue le fond de la chambre d’écoulement (Figure II-16).
Le volume de la chambre d’écoulement ainsi constituée est de ~ 100 µL. L’excitation
électrique (par effet piézoélectrique inverse) et la mesure (par effet piézoélectrique) des
oscillations du capteur consécutives à l’excitation sont contrôlées par l’unité électronique
reliée au capteur par l’intermédiaire des deux électrodes en contact avec sa face externe.
Figure II-16 : Architecture de la cellule de mesure. Le sens d’écoulement est indiqué par des
flèches.
83
L’écoulement hydrostatique des solutions d’étude contenues dans le réservoir est contrôlé
par une vanne manuelle. Les fréquences de résonance étant particulièrement sensibles aux
variations de température, la cellule de mesure est thermostatée, et une boucle de température
(T-loop) d’un volume de ~ 500 µL permet, le cas échéant, de thermostater les solutions
préalablement à leur mise en contact avec le capteur. Cette étape est notamment nécessaire
pour l’étude de cinétiques initiales d’adsorption.
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS

La spectroscopie par guide d’onde optique, OWLS (Optical Waveguide Lightmode
Spectroscopy), est une technique optique permettant de détecter en temps réel des dépôts de
matière à la surface d’un support de verre recouvert d’un film guide d’onde, avec une
sensibilité de l’ordre du ng cm-2. Cette technique de spectroscopie donne accès à l’épaisseur
optique du dépôt, jusqu’à quelques centaines de nm, mais aussi à la masse optique des dépôts,
hors hydratation.
a. Principe
La Figure II-17 décrit l’architecture d’un support d’analyse. Il s’agit d’une lame de verre,
recouverte par spin-coating d’un film de Si0.8Ti0.2O2 dont l’épaisseur dF est d’environ 180 nm
et sur lequel est gravé un réseau de diffraction permettant de coupler un faisceau laser
polarisé. Grâce à l’indice de réfraction élevé de ce film (nF ~ 1,8), le faisceau se propage au
sein du film par un phénomène de réflexion totale interne. En fonction de la polarisabilité et
de la quantité des molécules adsorbées, le faisceau est réfléchi avec un certain déphasage.
Figure II-17 : Schéma représentant le principe de la spectroscopie optique par guide

d'onde : (S) support de verre (indice nS) ; (F) film guide d’onde en SiTiO2 (indice nF) sur
lequel est gravé un réseau de diffraction ; (A) matière adsorbée (indice nA) ; (C) solution
d’adsorption ou de référence (indice nC).
84
À cause de ce déphasage, les intensités du champ électrique (mode TE) et du champ
magnétique (mode TM) sont maximales pour certains angles d’incidence. Ces angles
particuliers sont appelés angles de couplages et notés αTE et αTM. Afin de mesurer, pour
chaque mode, les angles α- et α+, un balayage symétrique est réalisé (Figure II-18). La
moyenne des deux valeurs est retenue, de manière à s’affranchir d’un éventuel décalage de la
position d’origine du goniomètre.
À chaque angle de couplage correspond un indice effectif N donné par l’équation :
Équation II-6
N étant l’indice NTE ou NTM, k l’ordre de diffraction, λ (nm) la longueur d’onde du faisceau
incident et Λ (nm) la constante réseau de diffraction. Dans le cas d’un dépôt isotrope, la
variation des indices effectifs est fonction de l’indice de réfraction nA et de l’épaisseur dA de
la couche de matière adsorbée. La mesure continue des indices effectifs permet de suivre
l’évolution structurale du dépôt dans le temps.
Figure II-18 : Évolution typique des angles de couplage αTE et αTM lors du dépôt de matière
sur un guide d'onde OWLS.
b. Traitement des données OWLS

Une couche homogène et isotrope à la surface du support de mesure est définie par sa
concentration cA et son épaisseur dA. La quantité de matière adsorbée Q est obtenue par la
relation suivante :
85
Équation II-7
Son indice de réfraction est obtenue par :
Équation II-8
où nC est l’indice de réfraction de la solution tampon et dn/dC est l’incrément d’indice de

réfraction des composés qui constituent le dépôt. L’Équation II-7 devient alors Formule de
de Feijter :
Équation II-9
Les indices effectifs NTE et NTM étant fonction des paramètres optiques du dépôt nA et dA,
leur mesure donne accès aux paramètres structuraux nOWLS et dOWLS. La formule de de Feijter
donnant accès à la masse optique du dépôt, QOWLS, à partir de l’épaisseur optique et de la
différence entre les indices de réfraction du film et de la solution adjacente, ∆n = (nOWLS – nC)
devient :
Équation II-10
La littérature indique pour divers polyélectrolytes et protéines des valeurs de dn/dC

comprises entre 0,15 et 0,21 cm3 g-1. Nous avons donc utilisé la valeur moyenne dn/dC = 0,18
± 0,03 cm3 g-1. Il est important de noter que QOWLS donne une mesure de la masse « sèche »
du dépôt puisque l’eau liée ne contribue pas à la grandeur ∆n servant à la calculer.
c. Appareillage
L’appareil utilisé est un système OWLS 110 fourni par MicroVacuum Ltd. Ce système est
fourni avec le logiciel commercial d’acquisition et d’analyse BioSense 2.2. La source
lumineuse est un laser He-Ne d’une puissance de 5 mW et de longueur d’onde 632,8 nm
(Figure II-19).
86
Figure II-19 : (Gauche) Dispositif OWLS comportant l’unité d’injection, le thermostat et la
cellule de mesure. (Droite) Schéma de principe de la cellule de mesure.
Le faisceau laser est dirigé sur le support de guide d’onde placé dans la cellule de mesure.
Le balayage des angles d’incidence est assuré par un moteur équipé d’un goniomètre. Les
injections sont assurées via une pompe péristaltique à débit variable et une vanne d’injection.
Afin d’éviter la formation de microbulles dans le circuit d’injection, les solutions sont
dégazées en continu grâce à un générateur d’ultrasons Branson 2510 d’une puissance de
100 W.
II.B.5 Essais mécaniques

a. Principe
Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés au comportement de cellules
cultivées sur des substrats élastomères de PDMS d’élasticité variable. Nous avons mesuré le
module d’Young des substrats au moyen de différents tests mécaniques.
Essai en traction :
Pour la détermination de l’élasticité d’un matériau, l’essai en traction est le test mécanique
le plus souvent utilisé. Il consiste à placer une éprouvette de dimensions connues entre les
mors d’amarrage d’un banc d’essai, puis de lui imposer une déformation par traction. On
enregistre la force et l’allongement que l’on traduit en contrainte-déformation (Figure II-20).
87
Figure II-20 : Courbe de contrainte-
déformation typique d’un matériau ductile.
Les différentes zones sont (1) le domaine
élastique, (2) le domaine plastique et (3) la
zone de striction, puis la rupture de
l’éprouvette. Le module d’Young E est
déterminé dans le domaine élastique.
Cette courbe permet de déterminer le module élastique, ou module d’Young, noté E,

calculé dans le domaine élastique, soit pour une faible déformation, par la loi de
Hooke (Equation II-11):
Équation II-11
Il correspond à la pente de la courbe dans ce domaine.

Les courbes de contrainte-déformation présentent des profils différents selon le
comportement mécanique du matériau étudié (Figure II-21). Les matériaux fragiles
présentent uniquement un domaine élastique, mais pas de domaine plastique. Les matériaux
ductiles peuvent subir une déformation irréversible, qui se traduit par la présence d’un
domaine plastique. Enfin, certains matériaux présentent un caractère élastique non linéaire
lors des essais de traction.
88
Figure II-21 : Exemples de courbes de contrainte-déformation de matériaux présentant des
comportements mécaniques différents.
Dans le cas de matériaux présentant un comportement non linéaire, la contrainte n’est pas
la même en fonction du domaine de déformation appliqué au matériau. Le module d’Young
est alors défini comme étant la dérivée discrète de la courbe de contrainte-déformation, en
utilisant des différences finies. On détermine alors le module incrémental Einc.
Essai en compression :
L’essai en compression consiste à placer une éprouvette cylindrique, de rayon et de hauteur
connus, entre deux plateaux lubrifiés parallèles et de lui imposer une déformation par
compression. On enregistre la force et la déformation du cylindre, que l’on reporte sur une
courbe de contrainte-déformation. De la même manière que pour le test en traction, le module
d’Young peut être extrait de la pente de la courbe dans sa partie linéaire (domaine élastique)
par la loi de Hook (Equation II-11).
b. Déroulement des expériences

Les tests mécaniques sont réalisés sur un banc d’essai (Figure II-22).
Figure II-22 : Schéma de fonctionnement d’un banc d’essai (exemple d’un essai en traction).
89
Les dimensions initiales des échantillons ont été préalablement mesurées à l’aide d’un
étrier, avec une valeur moyenne d’au moins trois mesures sur chaque dimension : (i) diamètre
(d0) et hauteur (L0) des échantillons cylindriques pour les essais en compression (Figure II-23
A) et (ii) épaisseur (t0), largeur (w0) et longueur de jauge (LG) des échantillons rectangulaires
pour les essais en traction (Figure II-23 B). Les essais mono-axiaux en compression et en
traction sont réalisés respectivement avec des plaques d’aluminium lubrifiées et à l’aide de
poignées couvertes de ruban adhésif (Figure II-24). La vitesse de la traverse mobile est de 5
mm min-1 pour tous les essais.
Figure II-23 : Formes et dimensions des éprouvettes de PDMS pour les tests (A) en
compression et (B) en tension.
Figure II-24 : Photographies des montages des tests (A) en compression et (B) en tension
d’échantillons de PDMS.
La force axiale (F) et l’extension (∆L) sont enregistrées pendant les essais à une fréquence
de 500 Hz (Figure II-25). La contrainte nominale et la déformation nominale sont calculées à
partir des mesures de force et de déformation.
90
Figure II-25 : Déformation (∆L) d’éprouvettes lors d’essais en (A) compression et (B) de
traction sous l’effet de la force axiale (F).
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation

La contrainte nominale σ est définie par la relation :
Équation II-12
avec A0 l’aire de la section de l’échantillon. La déformation nominale ε est définie par la

relation :
Équation II-13
avec L0 étant la longueur de jauge initiale.

Le PDMS est un élastomère, dont le comportement élastique est non linéaire : il n’existe
pas de relation linéaire entre la contrainte nominale et la déformation nominale. Le module
élastique incrémental (Einc) est alors déterminé par la dérivée discrète :
Équation II-14
c’est à dire par la pente de la courbe de contrainte-déformation, pour les valeurs de ε

faibles.
d. Appareillage
Ces tests mécaniques ont été réalisés sur un banc d’essai MTS Insight Electrochemical
5 kN, équipée de cellules de charge 5 kN, 100 N et 10 N. La machine est pilotée par le
logiciel TestWorks 4 (MTS Systems Corporation, USA).
91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact
La mesure de l’angle de contact est une technique d’étude de l’énergie de surface d’un
matériau. Elle consiste à étudier l’étalement d’une goutte de liquide à la surface du matériau.
a. Principe
La forme d’une goutte de liquide déposée à la surface d’un matériau est influencée par les
énergies interfaciales des différentes interfaces en jeu : liquide/vapeur (γLV), solide/liquide
(γSL) et solide/vapeur (γSV). L’angle de contact θ entre la tangente à la goutte et la surface du
matériau au niveau de la triple interface (Figure II-26) est donné par la relation de Young-
Dupré :
Équation II-15
Figure II-26 : Illustration graphique de la relation de Young-Dupré reliant la forme d’une

goutte de liquide (angle de contact θ) aux différentes interfaces en jeux à la triple interface
(γLV, γSL et γSV).
En utilisant de l’eau, cette technique permet de définir le caractère hydrophile ou

hydrophobe d’un matériau : plus le matériau est hydrophile, plus la goutte s’étale (angle de
contact faible) et vice-versa.
b. Réalisation des mesures

L’angle de contact statique entre la surface et une goutte de 5 µL de tampon Tris - NaCl est
déterminé par la technique de la goutte pendante, dans les conditions atmosphériques.
L’image de la goutte est enregistrée 3 ms après dépôt. Cette image est ensuite analysée grâce
au logiciel ImageJ afin de déterminer l’angle de contact. Un total de cinq mesures est effectué
sur chaque échantillon.
92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB
La microscopie électronique à balayage (MEB) est une technique fournissant des images
de très haute résolution de la surface d’un échantillon.
Les échantillons biologiques contenant beaucoup d’eau, il est nécessaire de les fixer sans
en modifier la structure, puis de les déshydrater avant d’en réaliser l’étude par MEB. De plus,
comme tous les échantillons destinés à être observés en MEB, ils doivent être conducteurs et
sont donc métallisés avant observation. Pour cela, les échantillons sont rincés au tampon PBS,
puis fixés pendant 30 minutes par une solution de glutaraldéhyde à une concentration de
2,5%. Afin de les déshydrater, les échantillons sont immergés dans deux bains successifs
d’acétone. Ils sont ensuite stockés à -80°C jusqu’à utilisation. Préalablement à l’étape de
métallisation, les échantillons sont retirés du congélateur, puis aussitôt placés sous une cloche
à vide en présence de dessicant.
Les échantillons sont revêtus d’or par pulvérisation cathodique avec un métalliseur JFC
1300 Autofine, puis les images sont obtenues grâce à un MEB JCM-5000 Neoscope JEOL.
II.B.8 Microscopie à épifluorescence

a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente
L’utilisation de la fluorescence permet de visualiser de manière simple et rapide la
présence ou non d’un polymère adsorbé sur une surface. Pour cela, nous avons utilisé deux
types de polyélectrolytes fluorescents, la PEI et la CSA, fonctionnalisés par un fluorophore, la
FITC (λex = 490 nm ; λem = 525 nm), dont la structure chimique est rapportée par la Figure
II-27. Le greffage fait intervenir les groupements amine primaire de la PEI ou les
groupements carboxyle de la CSA et le groupement thiocyanate du FITC.
Figure II-27 : Structure moléculaire de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
93
Pour le marquage, les polyélectrolytes ont été préparés à une concentration de 50 mg mL-1
dans un tampon carbonate/bicarbonate 0,1 M à pH 9,0. Un volume de 100 µL de FITC diluée
dans du DMSO a été ajouté, de manière à obtenir un ratio molaire de nFITC/nPE de 0,4 pour la
PEI et de 2 pour la CSA. La FITC est laissée au contact des polyélectrolytes pendant 12
heures dans la solution de marquage. Cette solution est ensuite dialysée une première fois
contre 1 L d’eau ultrapure pendant 24 heures, puis une deuxième fois contre 5 L d’eau
ultrapure pendant 48 heures.
b. Préparation des substrats et observations

Les solutions obtenues sont diluées dans du tampon Tris - NaCl de manière à obtenir des
concentrations d’utilisation des polyélectrolytes (5 mg mL-1 pour la PEIFITC et 1 mg mL-1 pour
la CSAFITC).
La solution de PEIFITC est mise en contact avec les substrats PDMS pendant 30 minutes,
puis les substrats sont rincés trois fois avec du tampon Tris - NaCl. Les substrats PDMS
utilisés lors de cette étude sont les substrats construits par évaporation de solvant sur lamelles
de verre (§ II.A.2 ).
La CSAFITC est utilisée pour la construction de films PEI/(CSAFITC/PLL)6 et
PEI/(CSAFITC/PLL)12 sur des lamelles de verre, comme décrite précédemment.
Les échantillons sont ensuite montés sur des lames de microscopie avec une résine
MOWIOL 4-88. Après séchage, les lames sont observées à l’aide d’un microscope à
épifluorescence (Scope.A1 Zeiss).
II.C Fonctionnalisation des films LbL

II.C.1 Réticulation par la génipine
La réticulation est une stratégie souvent utilisée pour moduler les propriétés mécaniques
des films LbL. Nous avons utilisé pour cela un agent réticulant naturel et biocompatible, la
génipine (GnP), comme alternative aux agents réticulants usuels potentiellement cytotoxiques
tels que EDC/NHS ou le glutaraldéhyde. Bien que le mécanisme de réticulation ne soit pas
encore clairement établi, nous savons que la GnP est un réticulant bi-fonctionnel qui réagit
avec les amines primaires (Figure II-28).
94
Figure II-28 : Mécanisme présumé de la réaction de réticulation d’amines primaires par la
génipine (d’après Butler et al.).16
Nous pouvons noter que d’après ce mécanisme de réticulation, les chaînes de CSA ne sont
vraisemblablement pas impliquées, puisqu’elles ne possèdent pas de groupements amines.
Lors de la réaction, la GnP se colore en bleu, avec un maximum d’absorbance situé aux
alentours de 590 nm. Ce phénomène permet le suivi de la réaction par spectroscopie UV-
Visible lors de la réticulation de PLL au sein des films (CSA/PLL).
Trois types d’architectures LbL sont utilisées : PEI/(CSA/PLL)6, PEI/(CSA/PLL)12 et
PEI/(CSA/PLL)18. Les films composés de 6 et 12 bicouches sont construits manuellement,
ceux composés de 18 bicouches sont construits de manière automatisée (§ II.A.3 b). Avant
réticulation, les films sont rincés, puis immergés 30 minutes dans du tampon DPBS, afin
d’éliminer le tampon Tris - NaCl.
Les solutions de GnP (Wako Chemicals GmbH) ont été préparées dans du tampon DPBS à
une concentration de 0,50 % (m/m) (22,10 mmol L-1) ou 0,25 % (m/m) (11,05 mmol L-1). Ces
solutions seront par la suite désignées par : GnP25 et GnP50.
Après conditionnement dans du DPBS, les films ont été immergés pendant 16 heures à
température ambiante dans des solutions de GnP50 ou GnP25.
Après réticulation, les films ont été rincés et stockés dans le tampon DPBS. On notera
PEI/(CSA/PLL)i-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)i-GnP50 (avec i le nombre de paires de couches
(CSA/PLL)). Les films non réticulés seront appelés films natifs.
Afin d’étudier la cinétique de réticulation, les lamelles de verre recouvertes d’un film
PEI/(CSA/PLL)18 ont été introduites verticalement dans des cuves de spectroscopie, puis
mises en contact avec la solution de réticulation. Une mesure d’absorbance entre 580 et
95
700 nm a été effectuée toutes les 2 heures, en prenant comme référence une lamelle de verre
recouverte d’un même film immergée dans du tampon DPBS.
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine

Afin d’explorer la vectorisation et l’incorporation de composés actifs au sein des films
LbL, nous avons étudié l’immobilisation dans les films d’un dérivé polymère de β-
cyclodextrine anionique (noté pCD) comme vecteur potentiel. L’étude a été menée par QCM-
D, OWLS et AFM. Des films PEI/(CSA/PLL)5±CSA ont été mis en contact avec des
solutions de pCD à une concentration de 1 mg mL-1. L’incorporation, dans les mêmes
conditions de l’analogue non chargé (noté pCD0) ou du monomère anionique (noté CD) du
vecteur a été également étudiée.
Dans le cadre d’une collaboration avec le Dr C. Morin du laboratoire COBRA – UMR
6014, les films LbL fonctionnalisés par la pCD ont été envisagés pour de la séparation chirale
d’énantiomères par électrophorèse capillaire. Afin de s’assurer de la stabilité dans les
conditions courantes d’analyses par électrophorèse capillaire, nous avons étudié l'influence du
pH (pH 4,5, tampon acétate ; pH 8,5 tampon Tris – NaCl) et de la force ionique (tampon Tris
avec différentes concentrations de NaCl) sur la stabilité de nos films enrichis en pCD.
II.D Etude des comportements cellulaires

La lignée cellulaire MC3T3-E1 a été établie par Sudo et al.17 en 1983 à partir de la
calvaria, un os plat du crâne de souris nouveau-nées. Elles produisent une matrice
extracellulaire abondante, notamment composée de fibronectine. Ces cellules ont été
sélectionnées pour leur taux élevé de phosphatase alcaline sécrétée lorsqu'elles sont à
confluence. Durant leur croissance, elles montrent une morphologie fibroblastique. Après la
confluence, elles adoptent une organisation en nodules, riches en matrice extracellulaire, au
sein desquels les cellules ont une morphologie d'ostéoblastes.
Ces modifications de morphologie et d'activité métabolique (augmentation de l'activité de
la phosphatase alcaline, synthèse d'une matrice minérale) montrent que ces cellules ont la
capacité de se différencier en ostéoblastes et en ostéocytes, et ainsi former du tissu osseux
calcifié in vitro. Cette différenciation entraîne des modifications phénotypiques des MC3T3-
E1, comme la production de sialoprotéines osseuses, d'ostéopontine, d'ostéocalcine18 et de
collagène I.19
96
La différenciation nécessite la présence (i) d'acide ascorbique, indispensable à
l'hydroxylation du collagène qui peut alors former une triple hélice et s'assembler en fibrilles,
ainsi que (ii) d’une source de phosphate inorganique, souvent le β-2-glycérophosphate.
L'interaction des fibrilles de collagène avec la cellule, via l'intégrine α2β1 permet l'activation
de voies de signalisation aboutissant à l'expression de gènes de différenciation et à la
minéralisation.18
II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire

La lignée de préostéoblastes murins MC3T3-E1 est cultivée en routine dans du milieu α-
MEM (Sigma-Aldrich), complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (Sigma-Aldrich), en
présence de 2 mM de L-glutamine (Gibco), de streptomycine (100 µg.mL-1) et de pénicilline
(100 unités.mL-1) (Sigma). Ce milieu sera nommé « standard » par la suite. La culture est
réalisée dans un incubateur à 37°C, sous 5% de CO2 et 95% d’humidité. A 80% de
confluence, les cellules sont décollées de leur support de culture T25 ou T75 (Corning) par
action de trypsine/EDTA (Sigma). Elles sont ensuite centrifugées à 1000 g pendant 5 minutes
et comptées, puis réensemencées à une densité de 1 x 104 cellules cm-2 dans des boîtes de
culture T25 ou T75.
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire

Pour l’observation de la morphologie cellulaire, les cellules sont ensemencées sur les
différents substrats à une densité de 2 x 104 cellules cm-2, dans du milieu de culture standard.
Des photographies sont effectuées à différents intervalles de temps, grâce à une caméra CCD
installée sur un microscope inversé (Motic).
Un marquage fluorescent des MC3T3-E1 est également réalisé, de manière à évaluer
l’organisation du cytosquelette lors des premières heures de contact avec les films LbL.
Celles-ci sont ensemencées à une densité de 2 x 104 cellules cm-2 et cultivées pendant 3
heures sur les différents substrats. Les échantillons sont ensuite rincés au DPBS, puis fixés
avec une solution de paraformaldéhyde à 3 %. Les échantillons sont rincés trois fois au DPBS.
Le marquage est réalisé avec de la phalloïdineFITC (Sigma-Aldrich), qui permet de révéler
l’actine du cytosquelette des cellules, ainsi que du 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui
permet le marquage de l’ADN. Après marquage, les échantillons sont montés sur des lames
de microscope à l’aide d’une résine (Mowiol 4-88) et séchés une nuit à 4°C. Les observations
sont réalisées sur un microscope à épifluorescence (Scope.A1 Zeiss).
97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue®
La viabilité et la prolifération des cellules MC3T3-E1 cultivées sur les différents substrats
sont évaluées par des tests Alamar Blue® (Thermo Scientific Pierce). Ce test basé sur la
réduction d’un indicateur de l’activité mitochondriale des cellules pendant leur prolifération,
est le reflet d’une activité métabolique, et peut également être corrélé avec le nombre de
préostéoblastes.20 Les cellules, au cours de leur prolifération réduisent le marqueur, le faisant
passer du bleu (forme oxydée) au rouge (forme réduite). Le test est réalisé sur une période de
9 jours, une mesure étant réalisée après 2 jours (J2), 5 jours (J5) et 9 jours (J9). Les cellules
sont ensemencées sur les substrats à une densité de 1 x 104 cellules cm-2. Pour chaque point de
cinétique, le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture standard contenant 10%
d’Alamar Blue®. Après 4 heures d’incubation, les absorbances sont mesurées à 570 nm et
600 nm. Le taux de marqueur réduit est calculé d’après les instructions du fabricant. En
parallèle, une courbe de calibration entre le pourcentage de réduction du marqueur et le
nombre de cellules est réalisée, de manière à exprimer les résultats en densité cellulaire.
II.D.4 Évaluation de la différenciation

a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL
Les préostéoblastes murins MC3T3-E1 sont ensemencés sur les substrats étudiés, à une
densité volontairement élevée (5 x 104 cellules cm-2), afin de découpler la prolifération et la
différenciation, puis incubées 24 heures dans du milieu de culture standard. Ils sont ensuite
cultivés dans du milieu de culture standard complémenté de 10 mM de β-glycérophosphate
(Sigma-Aldrich), et de 50 µg mL-1 d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich), appelé milieu de
différenciation. En parallèle, afin d’étudier le pouvoir ostéogénique de nos systèmes, d’autres
substrats sont ensemencés par des MC3T3-E1 à la même densité, mais cultivés dans un milieu
de croissance dépourvu de facteurs de différenciation. Les milieux sont changés trois fois par
semaine afin que les cellules bénéficient d’un apport continu en facteurs de différenciation.
Cette étude est réalisée sur 21 jours, une mesure étant réalisée à J7, J14 et J21. Les cellules
sont d’abord rincées au tampon DPBS, récoltées après trypsination, puis lavées deux fois dans
du DPBS. Afin de récupérer la PAL intracellulaire, les cellules sont lysées par un tampon
Tris - Triton 0,1% à pH 10,2, puis congelées/décongelées trois fois.
Le surnageant du lysat cellulaire est récupéré après une centrifugation de deux minutes à
300 g. L’activité de la PAL est déterminée par hydrolyse de p-nitrophénol phosphate (PNPP)
en p-nitrophénol (PNP) : 250 µL de surnageant de lysat sont ajoutés à 1 mL de solution de
PNPP dans du tampon Tris - NaCl à pH 10. Le mélange est incubé pendant deux heures, puis
98
la réaction est stoppée par ajout de 250 µL de NaOH à 3 M (pour une concentration finale de
0,5 M dans le milieu réactionnel).
La quantité de PNP formée est déterminée par spectroscopie UV-visible par mesure de
l’absorbance de la solution obtenue, à 405 nm. La quantité totale de protéines intracellulaires
est dosée par un kit de dosage micro-BCA (Thermo Scientific Pierce). La quantité de PNP
formée est ensuite normalisée par rapport à la quantité totale de protéines, afin d’exprimer
l’activité de la phosphatase alcaline en quantité de PNP formé, par unité de temps et par
quantité de protéines intracellulaires.
b. Minéralisation de la matrice extracellulaire

Afin d’évaluer les capacités de minéralisation de la matrice extracellulaire (MEC) par les
MC3T3-E1 sur les différentes surfaces, les cellules sont ensemencées et cultivées dans les
mêmes conditions que celles décrites pour le dosage de l’activité de la PAL. Les cellules sont
cultivées pendant 8 semaines dans ces conditions.
L’Alizarine Red S (ARS, Sigma) est utilisée ici comme révélateur de la présence de dépôts
de phosphate de calcium. Pour cela, les cellules cultivées en milieu de différenciation sont
rincées au tampon DPBS, puis fixées au formaldéhyde 10% (Sigma) pendant 10 minutes. Les
échantillons sont rincés trois fois à l’eau ultrapure, de manière à éliminer l’agent de fixation,
puis sont ensuite marqués avec une solution d’ARS, à 2% dans l’eau ultrapure, à un pH
compris entre 4,1 et 4,3 (le pH est ajusté grâce à une solution de NaOH à 3 M). Avant
observation, les échantillons sont rincés une nouvelle fois à l’eau ultrapure. L’observation est
effectuée grâce à un microscope inversé (Motic). La présence de dépôt de phosphate de
calcium est révélée par une coloration rouge de l’échantillon.
II.D.5 Tests statistiques

Les tests cellulaires ont été réalisés 3 fois en parallèle. Les résultats sont exprimés par la
moyenne ± écart type sur la moyenne. Les différences statistiques entre deux groupes ont été
définies par le test non paramétrique de Mann – Whitney – Wilcoxon. Le seuil de confiance
est fixé pour une valeur de p inférieur à 0,05.
99
II.E Références bibliographiques
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101
Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la
rigidité du substrat sur le comportement de préostéoblastes
murins MC3T3-E1
III.A Introduction 102
III.B Analyse des substrats 105

III.B.1 Substrats PDMS bruts 105
a. Caractérisation mécanique 105
b. Caractérisation de surface 108
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL 112
a. Adsorption de la couche précurseur de PEI 112
b. Caractérisation des films LbL 113
III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.C.1 Morphologie cellulaire 116
III.C.2 Prolifération cellulaire 121
III.C.3 Différenciation cellulaire 123
III.D Conclusion 127
III.E Références bibliographiques 127
III.A Introduction
La chimie et la mécanique du microenvironnement cellulaire sont des paramètres combinés
qui influencent le comportement cellulaire. Dans les tissus osseux, la fraction organique de la
matrice extracellulaire (MEC), composée de diverses macromolécules (collagène,
protéoglycanes, protéines non collagéniques), offre à la fois un substrat pour les cellules, et un
réservoir pour les cytokines et les facteurs de croissance. De plus, les cellules osseuses
doivent d’adapter aux variations de la rigidité de la MEC accompagnant la minéralisation
durant l’ostéogénèse, et le remodelage osseux. La chimie et la rigidité du substrat doivent
donc être combinées judicieusement lors de la conception de biomatériaux pour l’ingénierie
tissulaire osseuse.1
Les multicouches de polyélectrolytes, ou films « Layer-by-Layer » (LbL), sont des outils
prometteurs pour mimer l’environnement biochimique cellulaire. La construction de ces
102
films, basée majoritairement sur des interactions électrostatiques, peut être effectuée à la
surface de substrats de formes ou de natures chimiques variées,2 ce qui les rend intéressants
pour des applications d’ingénierie tissulaire. De plus, il est possible d’utiliser des
polyélectrolytes biomimétiques et/ou d’origine biologique (polypeptides, polysaccharides et
protéines) biochimiquement favorables au développement cellulaire, à moyen et long terme,
et d’insérer des composés bioactifs au sein des architectures LbL en vue de leur relargage in
situ.3 L’épaisseur des films, qui est principalement contrôlée par le nombre d’étapes
d’adsorption, est un paramètre important dans la modulation des comportements cellulaires.
Alors que l’augmentation de l’épaisseur des films LbL pourrait permettre un chargement plus
important de composés bioactifs, cela a un effet défavorable sur l’adhésion cellulaire, du fait
de leur faible rigidité. Par exemple, les cellules mésenchymateuses humaines (hMSCs) ne
peuvent pas développer de points focaux d’adhésion sur des films (PDADMAC/PSS)50 à
cause de leur trop faible rigidité.4 Il a été démontré qu’une rigidification de ces architectures
par des variations de force ionique5 ou de pH6 avait un effet promoteur sur l’adhésion
cellulaire. Dans le cas de films biomimétiques composés de polysaccharides et/ou de
polypeptides, la stratégie actuelle de rigidification consiste principalement à réticuler les films
par la chimie des carbodiimides (EDC/NHS).7 Ce procédé peut cependant avoir un effet
cytotoxique dans le cas où une fraction de l’agent réticulant n’ayant pas réagi resterait piégée
dans le film LbL.8
De manière à mimer l’environnement mécanique cellulaire, les polymères représentent des
biomatériaux polyvalents, car ils offrent une grande variété de structures chimiques, et parce
qu’ils donnent accès à une large gamme de rigidités, de l’ordre du kPa jusqu’au GPa. L’acide
poly(L-lactique) (PLLA),9 l’alginate10 ou le polyéthylène glycol (PEG)11 par exemple, sont
souvent étudiés comme des substituts osseux potentiels. De façon à étudier d’un point de vue
plus fondamental l’influence de l’élasticité du substrat sur les comportements cellulaires, des
gels ou des élastomères modèles présentant des propriétés mécaniques finement définies par
le taux de réticulation, comme le polyacrylamide (PA), 12,13 le poly(diméthylsiloxane)
(PDMS),1,14 ainsi que de nombreux polysaccharides et/ou polypeptides,15,16 sont souvent
utilisés. Par exemple, il a été démontré que des hMSCs cultivées sur des gels de
polyacrylamide, dont l’élasticité variait de 1 kPa à 34 kPa, adaptaient leur phénotype en
exprimant des protéines précurseur typiques des tissus nerveux sur les gels souples, et des
protéines ostéogéniques sur les gels rigides.12 Alors que les gels de PA ne sont limités qu’à
des rigidités situées entre 0,1 et 100 kPa,17 le PDMS donne accès à une plus large gamme de
rigidités, située entre le kPa et le MPa.18 Cela le rend particulièrement intéressant pour l’étude
103
des comportements des cellules osseuses. De plus, le PDMS est déjà utilisé pour des
applications biomédicales, comme certaines lentilles de contact ou certains stimulateurs
cardiaques, du fait de sa biocompatibilité.19
Dans cette partie du travail, nous avons fonctionnalisé, au moyen de films LbL, des
substrats de PDMS de rigidité contrôlée, pour fabriquer des substrats modèles pour l’étude de
la réponse cellulaire combinée aux signaux chimiques et mécaniques du microenvironnement.
Les films LbL biomimétiques utilisés sont constitués d’un glycosaminoglycane (GAG), la
chondroïtine-4-sulfate, ou chondroïtine sulfate A (CSA), et d’un polypeptide, la poly( L-
lysine) (PLL). Les GAGs sont des polysaccharides anioniques composés d’unités
disaccharidiques sulfatées et/ou carboxylées répétées. Ce sont des composés très hydrophiles,
chaque unité disaccharidique pouvant être entourée de 30 molécules d’eau. 20 Les
chondroïtines sulfates (CS), une catégorie de GAGs ubiquitaires, sont des composants
majeurs des MEC des tissus osseux, cartilagineux, ainsi que d’autres tissus conjonctifs. Elles
sont présentes dans les décorines et les biglycanes, deux des principaux protéoglycanes
osseux.21 Dans les tissus osseux, elles participent au mécanisme d’action de certains facteurs
de croissance endogéniques, et jouent un rôle fonctionnel dans la réparation tissulaire et
l’ostéointégration. Grâce à leur capacité à lier des facteurs de croissance et des composés
cationiques, les CS peuvent être utilisées comme réservoirs pour du relargage moléculaire in
situ.22 Elles ont également été utilisées pour le recouvrement de surfaces, 23 comme des
substituts poreux en combinaison avec le collagène,24 ou intégrées dans la composition de
ciments osseux.25 La PLL est un polypeptide polycationique, connu pour favoriser l’adhésion
cellulaire, via des interactions électrostatiques avec les membranes cellulaires chargées
négativement.26 De manière intéressante, la L-lysine est un acide aminé impliqué dans les
interactions protéines/GAGs.27 Des complexes (CS/PLL) ont été étudiés, soit en solution,28
soit sous forme de films LbL.29 Les films (CS/PLL) ont notamment été utilisés comme
substrats pour des cellules photoréceptrices,30 endothéliales31 et plus récemment, des
ostéoblastes.32
Dans cette étude, nous présentons l’effet combiné de (i) la chimie de surface de substrats
PDMS, contrôlée au moyen de films LbL PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, et (ii) de la rigidité de ces
substrats maintenue dans une gamme pertinente permettant de modéliser les conditions du
tissu osseux. Les substrats sont caractérisés, dans le volume et en surface, par analyse de leurs
propriétés mécaniques, de leur chimie, de leur mouillabilité et de leur topographie. Nous
démontrons que la rigidité des substrats et la chimie de surface sont des paramètres clefs, dont
la combinaison permet de moduler les comportements de préostéoblastes murins MC3T3-E1.
104
III.B Analyse des substrats
III.B.1 Substrats PDMS bruts
a. Caractérisation mécanique
Le PDMS est un élastomère à base de silicone, dont les propriétés mécaniques peuvent être
modulées et contrôlées par différents traitements. Il a été démontré notamment qu’une
augmentation de la température provoque une diminution de module élastique de matériaux à
base de PDMS.33,34 Une autre façon de contrôler les propriétés mécaniques du PDMS est de
mélanger les deux composantes du kit commercial, le pré-polymère et l’agent réticulant, à des
ratios différents. 18,19 Pour notre étude, c’est cette dernière voie qui a été retenue. Un déficit en
agent réticulant laissant des chaînes de polymères libres dans la structure de l’élastomère, la
rigidité s’en trouverait alors diminuée (§ II.A.2 ).
Dans le tissu osseux, les biomatériaux sont soumis à des sollicitations mécaniques aussi
bien en traction qu’en compression en fonction de leur site d’implantation. Il est important de
caractériser les substrats PDMS par des tests de traction et de compression et de déterminer
les propriétés mécaniques intrinsèques correspondantes de nos substrats en fonction de leur
taux de réticulation, afin de reproduire l’environnement mécanique des cellules hôtes,
notamment les ostéoblastes. Afin de couvrir la gamme de rigidités de la matrice osseuse en
cours de maturation (§ I.C.3 ), les ratios que nous avons utilisés sont, en masse, 3:100
(PDMS-3), 5:100 (PDMS-5), 7:100 (PDMS-7), 10:100 (PDMS-10) et 20:100 (PDMS-20).
Dans l’hypothèse de départ, le PDMS-3 est attendu comme étant le substrat le plus souple, le
PDMS-20 comme le plus rigide. Les différents substrats ont d’abord été caractérisés par des
tests mécaniques, en compression et en traction, de manière à déterminer le module élastique
(module de Young) respectifs.
Les courbes de contrainte-déformation (Figure III-1) montrent le caractère non linéaire du
PDMS. En outre, contrairement à ce qui était attendu, c’est le PDMS-10, et non le substrat
PDMS-20, qui est le substrat le plus rigide. Khanafer et al. ont montré que, pour une réaction
de réticulation réalisée pendant 12 heures à 65°C, c’est-à-dire proche de nos conditions, la
rigidité de substrats PDMS est supérieure pour une stœchiométrie de 11,1:100 par rapport à
une stœchiométrie de 10:100, puis diminue pour des stœchiométries plus élevées (12,5:100,
14,3:100, 16,7:100).18 Ils expliquent ce comportement par le fait qu’un excès d’agent
réticulant ralentit la réaction de réticulation, laissant des chaînes de polymère libres.
Cependant, ce comportement semble dépendre des conditions de réticulation. Pour une
105
réaction de 2 heures ou 24 heures à 70°C, Lee et al. ont montré que des substrats PDMS
contenant un excès, par rapport à la stœchiométrie de 10:100 conseillée par fabricant,
présentaient une diminution du module élastique. En effectuant cette réaction en deux temps
(2 heures à 70°C, puis 24 heures à 190°C), les substrats comportant un excès d’agent
réticulant présentaient au contraire un module élastique supérieur (~ 4 MPa) à celui des
substrats de référence (~ 2 MPa).19
Figure III-1 : Courbes de contrainte-

déformation (A) en compression et (B)
en traction pour les substrats PDMS-
3, -5, -7, -10 et -20 bruts, notés 3%,
B 5%, 7%, 10% et 20% respectivement.
Néanmoins, Chambon et al.35 ont montré qu’un déficit en agent réticulant est plus efficace
qu’un excès pour limiter le rendement de la réticulation, c'est-à-dire laisser des chaînes de
pré-polymères dont l’un des deux groupements vinyliques n’a pas réagi. Dans le cadre de
notre étude, la stratégie adoptée pour obtenir les rigidités les plus faibles de la gamme
106
physiologique visée a donc été d’utiliser des ratios inférieurs à 10:100, soit un déficit en agent
réticulant.
Le module élastique incrémental (Einc) est dérivé des courbes de contrainte-déformation
établies par des tests de compression et de traction (voir II.B.5 ). Il augmente de manière
graduelle avec le taux de réticulant jusqu’à une valeur maximale pour le PDMS-10,
correspondant à la stœchiométrie recommandée par le fabricant (Figure III-1).
Du fait du comportement mécanique non linéaire du PDMS, les valeurs de Einc diffèrent,
d’une part avec le domaine de déformation, et d’autre part avec le test mécanique appliqué
(Figure III-2).
Compression Traction
A B
C D
Figure III-2 : Courbes d’évolution de Einc en fonction de la déformation de l’éprouvette, lors

de test (A) en compression et (B) en traction, pour les échantillons de PDMS-3, -5, -7, -10 et -
20 bruts, notés 3%, 5%, 7%, 10% et 20% respectivement. Modules élastiques incrémentaux
des substrats PDMS-3, -5, -7, -10 et -20, dérivés des courbes de contrainte-déformation
établies par les essais (C) en compression et (D) traction.
107
Ces valeurs sont plus importantes en compression qu’en traction, quel que soit le domaine
de déformation. De plus, les tests en compression montrent des rigidités plus élevées dans le
domaine de déformation 15-30% que dans le domaine 5-15% (Figure III-2 C), tandis que le
résultat inverse est obtenu lors des tests en traction (Figure III-2 D).
Ce sont ces différences qui nous ont amenés à nommer les substrats PDMS par leur taux
d’agent réticulant plutôt que par la valeur de leur module élastique.
Le substrat PDMS-20 a été abandonné car sa rigidité se situant entre celle des substrats
PDMS-7 et PDMS-10, il ne présentait pas d’intérêt mécanique pour la suite de l’étude. Par
ailleurs, la présence probable d’agent réticulant libre au sein de sa structure pourrait
potentiellement exercer un effet cytotoxique sur les cellules.
b. Caractérisation de surface
La caractérisation de surface des PDMS bruts préparés avec différents taux d’agent
réticulant avait pour objectif de vérifier qu’ils ne présentaient pas de variations importantes de
leurs propriétés physico-chimiques.
Analyse par FTIR-ATR. La spectroscopie FTIR-ATR apporte des informations sur la

composition de la surface des substrats PDMS (Figure III-3 et Tableau III-1). Les spectres
obtenus par cette technique montrent que malgré les variations de quantité d’agent réticulant,
les substrats ne présentent pas de différence significative dans leur chimie de surface.
Figure III-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10.
108
Tableau III-1 : Attribution des bandes spectrales de FTIR-ATR des substrats PDMS bruts.
Position Région (cm-1) Corrélation
1 815-785 oscillation CH3 dans Si – (CH3)2
2 865-825 élongation Si – C et Si – O
3 920-875 élongation Si – O
4 1200-930 déformation Si – O – Si
5 1090-1055 élongation Si – O – Si
6 1270-1245 déformation CH3
7 2970-2950 élongation CH3
Mesure de l’angle de contact. Du fait de la nature apolaire des chaînes de siloxane

méthylés, les substrats PDMS sont très hydrophobes. Les mesures d’angle de contact
montrent des valeurs similaires et élevées pour tous les substrats PDMS bruts (118,3 et
128,9°), quel que soit le taux d’agent réticulant (Figure III-4), à priori défavorable au dépôt
de films LbL.
Différentes études montrent qu’il est possible de rendre les substrats PDMS moins
hydrophobes par oxydation de surface, par voie chimique ou physique. Les groupements
méthyles de surface sont alors substitués par des groupements polaires, -OH, -COOH, ou
-NH2 par exemple. Néanmoins, ces traitements n’apportent qu’une diminution provisoire de
l’hydrophobicité de surface, du fait de la mobilité des chaînes dans le PDMS.36 Par
conséquent, nous n’avons pas envisagé de modifier l’hydrophobicité native de nos substrats.
Malgré une légère diminution de l’angle de contact accompagnant l’augmentation du taux
d’agent réticulant entre les différents substrats, la variation d’hydrophobicité entre les
substrats reste négligeable. Cette diminution peut être expliquée par une plus faible quantité
de groupements méthyle disponibles suite à leur recrutement dans le mécanisme de
réticulation (§ II.A.2 ).
109
Figure III-4 : Angle de contact statique : images et mesures effectuées avec une goutte de
5µL de tampon Tris – NaCl, à température ambiante, sur les substrats PDMS-3, -5, -7 et -10.
Topographie et rugosité : MEB et AFM. L’utilisation de la microscopie électronique à

balayage (MEB) permet d’imager la surface de matériaux, et d’obtenir des informations
qualitatives sur la morphologie des substrats PDMS. Dans un premier temps, nous avons
envisagé de travailler avec des substrats circulaires découpés à l’aide d’un emporte-pièce dans
une membrane de PDMS préparée dans une boite de Pétri de 90 mm de diamètre.
Les images MEB de ces échantillons montrent une morphologie ridée de l’ensemble de
leur surface (Figure III-5). De telles structures sont décrites dans des études de nano- ou
micro- structuration de surface de substrats PDMS. Yang et al.37 ont étudié la formation de
ces rides en étirant, puis en relâchant des membranes de PDMS. Ils ont démontré qu’il était
possible de contrôler la morphologie et la taille de ces rides en étirant la membrane de PDMS
selon un ou deux axes et en modulant la force appliquée. Ces substrats structurés offrent un
outil pour l’étude des comportements cellulaires. Dans leurs travaux, Guvendiren et al.38 ont
utilisé cette propriété du PDMS pour fabriquer des moules et ainsi structurer des hydrogels à
base de poly-(2-hydroxyéthyl méthacrylate). Les hydrogels ont ensuite été utilisés pour
étudier le comportement de cellules souches humaines.
110
Figure III-5 : Images MEB d’un substrat
PDMS-5 découpé à l’aide d’un emporte
pièce, à deux grossissements différents
(échelle 100 µm, insert : 10 µm). Les rides
sont causées par l’opération de découpage.
Bien que ces microstructures présentent ainsi un intérêt pour l’étude des comportements
cellulaires, elles étaient inadaptées dans notre cas, puisque nous avions pour objectif de
découpler l’effet de la rigidité de celui de la rugosité. Nous avons donc abandonné le procédé
de perforation à l’emporte-pièce et avons opté pour la fabrication des substrats par moulage,
permettant d’éliminer la formation des rides.
Les images MEB des échantillons de PDMS obtenus par moulage dans des boites de Pétri
de 35 mm de diamètre, selon la méthode détaillée précédemment (Chapitre II) sont montrées
dans la Figure III-6. Les substrats ainsi obtenus présentent une surface lisse.
Figure III-6 : Images MEB de la surface des substrats PDMS-3 et -10 moulés dans des boites
de Pétri (barre d’échelle 10 µm).
Enfin, afin de confirmer que la variation du taux d’agent réticulant n’entraîne pas une
modification de la topographie des substrats, des images de la surface et des mesures de
rugosité Ra ont été effectuées par AFM (Figure III-7).
111
Figure III-7 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 (15 x 15 µm2, z =
500 nm) et valeurs de rugosité moyenne Ra pour chaque type de substrat.
Les substrats PDMS ainsi obtenus peuvent être considérés comme lisses puisque la
rugosité Ra est de l’ordre du nanomètre et identique, quel que soit le taux d’agent réticulant.
Ces substrats étant destinés à être recouverts de films LbL, la rugosité n’est donc pas un
facteur susceptible d’influencer le comportement des cellules préostéoblastiques. En effet,
Abdelkebir et al.39 ont démontré que les films PEI/(CSA/PLL)6 ont une épaisseur de plusieurs
dizaines de nanomètres, ce qui est suffisant pour masquer la rugosité nanométrique des
substrats PDMS.
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL

a. Adsorption de la couche précurseur de PEI
Avant la caractérisation des films (CSA/PLL)6±CSA construits sur les substrats PDMS, il
nous est apparu nécessaire de vérifier la présence de la couche précurseur de PEI et ce quel
que soit le ratio d’agent réticulant. Ce polymère très ramifié possède une forte densité de
charges cationiques qui permet un recouvrement uniforme des surfaces. Dans la méthode
LbL, son rôle est de produire un état de surface reproductible, et ainsi d’éliminer les variations
de l’état de surface d’une construction à une autre. Afin de visualiser la couche de PEI, nous
avons marqué le polymère avec un fluorophore (FITC). Ce marqueur fluorescent peut être
utilisé pour marquer et visualiser des macromolécules adsorbées sur des surfaces, comme des
protéines40 par exemple, et a déjà été utilisé pour le marquage de la PEI. 41 La PEIFITC est
112
utilisée comme la PEI non marquée, à une concentration de 5 mg mL-1, en tampon Tri - NaCl
afin d’étudier le recouvrement des substrats PDMS.
La Figure III-8 montre un recouvrement homogène et uniforme des différents substrats
PDMS par la PEIFITC, ce qui valide l’emploi de la PEI comme couche précurseur pour la
construction des films (CSA/PLL)6±CSA.
Figure III-8 : Microphotographies des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés par de
la PEI ou de la PEIFITC (vert).
b. Caractérisation des films LbL

L’étude des propriétés physico-chimiques des substrats PDMS fonctionnalisés par le
système (CSA/PLL)6 ± CSA est nécessaire pour vérifier si d’éventuelles différences de leurs
propriétés physico-chimiques, autres que la rigidité du PDMS sous-jacent et que la nature de
la couche externe du film LbL, peuvent expliquer des différences de comportements
cellulaires.
FTIR-ATR. Le premier de ces paramètres étudiés est la chimie de la surface, par

spectroscopie FTIR-ATR.
La Figure III-9 montre que pour les PDMS fonctionnalisés, les spectres sont dominés par
les bandes caractéristiques du PDMS brut (bande 3, élongation CH3). Les bandes 1 et 2,
correspondant respectivement aux bandes amides II et I montrent sans ambiguïté que les films
LbL (CSA/PLL)6 ± CSA ont effectivement été construits à la surface des substrats. La faible
intensité de ces bandes (1 et 2), comparée à celle du substrat brut, est due à la faible épaisseur
113
du films (CSA/PLL)6 ± CSA, de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres selon Abdelkebir
et al.,42 par rapport à la distance de pénétration de l’onde évanescente dans l’échantillon, qui
est de l’ordre de 2 µm. L’épaisseur du film ne représente ainsi que 5 à 10% de l’épaisseur
totale de l’échantillon sondée par FTIR-ATR.
Figure III-9 : Spectres FTIR-

ATR des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films
PEI/(CSA/PLL)6/CSA (bandes 1 :
amide II ;bande 2 :amide I) avec
PDMS-3 brut comme contrôle
(bande 3 : élongation CH3).
Topographie et rugosité : MEB et AFM. Les images MEB (Figure III-10) ont été
effectuées dans des conditions de vide poussé sur des échantillons fixés et déshydratés. On
peut noter la présence d’îlots de matière de 1 à 2 µm de diamètre caractéristiques de
nombreux films LbL biomimétiques, indépendamment de la couche externe et du taux d’agent
réticulant du substrat PDMS.
Figure III-10 : Images MEB de substrats

PDMS-3 et -10 fonctionnalisés par
PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA (d’échelle 20
µm).
114
Afin de vérifier la topographie des échantillons dans des conditions environnementales,
c'est-à-dire hydratés et à pression atmosphérique, des analyses en AFM ont été réalisées.
La Figure III-11 confirme la présence des îlots observés par MEB. Les valeurs de rugosité
Ra montrent une augmentation nette de la rugosité entre les substrats non traités (Figure
III-7) et les substrats fonctionnalisés par les films LbL.
Cette morphologie des films (CSA/PLL) a déjà été décrite dans des travaux précédents
effectués au laboratoire39,42,43 et sont en accord avec les résultats d’une étude précédente
menée sur ce même système par Tezcaner et al.30
Figure III-11 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés
par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA (15 x 15 µm2, z = 500 nm).
115
Tableau III-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des échantillons de PDMS-3, -5, -7 et -10
traités par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, exprimés en nm.
Substrats PDMS-3 PDMS-5 PDMS-7 PDMS-10
Couche PLL CSA PLL CSA PLL CSA PLL CSA
externe
Ra (nm) 33 ± 7 38 ± 3 33 ± 2 34 ± 2 37 ± 2 35 ± 2 35 ± 3 19 ± 1
Rt (nm) 305 ± 52 364 ± 9 400 ± 49 300 ± 12 474 ± 10 410 ± 4 43

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Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux : Modulation

Thesis · June 2013

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE ROUEN

Discipline : Chimie des matériaux

Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux:

par Fabien GAUDIÈRE

Directeur de thèse M. Hassan ATMANI

Rapporteurs externes Mme Joëlle AMÉDÉE

Examinateurs externes M. Emmanuel PETIT

Examinateurs internes M. Jean-Pierre VANNIER

Au Pr Joëlle Amédée et au Pr Csilla Gergely, pour avoir accepté de juger ce travail et de

Au Dr Emmanuel Petit et au Pr Emmanuel Pauthe pour avoir accepté de participer à mon

Je tiens à remercier le Pr Jean-Pierre Vannier, directeur de l’EA3829 MERCI de m’avoir

Je remercie le Pr Hassan Atmani pour la confiance qu’il m’a accordée en m’acceptant au

Je remercie le Conseil Général de l’Eure et le Grand Évreux Agglomération pour leur

À tous les membres du La2B/SMS du Centre Universitaire d’Evreux : Dr Valérie Dupray, Dr

Je remercie également l’ensemble du personnel administratif et technique du Centre

Index des illustrations et tableaux 11

Chapitre I - Etude Bibliographique 20

I.A Les biomatériaux 21

I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.C Le tissu osseux 43

I.D Interactions cellules-matériaux 49

Chapitre II - Matériels et Méthodes 66

II.A Préparation des substrats 67

II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.E Références bibliographiques 100

Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la rigidité du substrat sur le

III.A Introduction 102

III.B Analyse des substrats 105

III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.D Conclusion 127

III.E Références bibliographiques 127

Chapitre IV - Influence de la réticulation des films CSA/PLL par la génipine sur le

IV.A Introduction 133

IV.C Étude des comportements cellulaires 155

IV.D Conclusion 171

IV.E Références bibliographiques 173

Chapitre V - Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL) en

V.A Introduction 178

V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD 179

V.C Influence du pH et de la force ionique 192

V.E Références bibliographiques 199

Conclusion et Perspectives 202

Liste des communications 206

BMP Protéine morphogénique osseuse (« Bone Morphogenic Protein »)

FITC Fluorescéine isothiocyanate

AFM Microscopie à force atomique (« Atomic Force Microscopy »)

Figure I-2 : Principe de la technique LbL 25

Figure I-6 : Évolution de l’épaisseur de films (HA/PLL) 29

Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses 46

Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux 47

Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains 52

Figure II-1 : Le polyéthylèneimine, PEI 68

Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL 69

Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA 69

Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS 70

Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules 73

Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion 74

Figure II-8 : Principe de fonctionnement d’un microscope à force atomique (AFM). 76

Figure II-10 : Modèles de pointes sphérique (modèle de Hertz) ou coniques (modèle de