PH DThesis FGaudiere

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Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux : Modulation

des comportements cellulaires en fonction du microenvironnement physico-
chimique et mécanique
Thesis · June 2013

DOI: 10.13140/RG.2.1.2376.0487
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Fabien Gaudière
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Université de Rouen
Thèse
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE ROUEN
Discipline : Chimie des matériaux
Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux:

Modulation des comportements cellulaires en fonction du
microenvironnement physico-chimique et mécanique
Le 25 juin 2013
par Fabien GAUDIÈRE
Directeur de thèse M. Hassan ATMANI

Professeur, Université de Rouen
Membres du Jury :
Rapporteurs externes Mme Joëlle AMÉDÉE

Directeur de Recherche INSERM, Université de Bordeaux Segalen
Mme Csilla GERGELY
Professeur, Université de Montpellier II
Examinateurs externes M. Emmanuel PETIT

Maître de Conférences, Université de Picardie
M. Emmanuel PAUTHE
Professeur, Université de Cergy-Pontoise
Examinateurs internes M. Jean-Pierre VANNIER

Professeur, Université de Rouen
Mme Béatrice LABAT
Maître de Conférences, Université de Rouen
M. Guy LADAM
Maître de Conférences, Université de Rouen
Remerciements
J’aimerais adresser mes sincères remerciements aux membres du jury qui ont accepté de
juger ce travail :
Au Pr Joëlle Amédée et au Pr Csilla Gergely, pour avoir accepté de juger ce travail et de

participer à mon jury de thèse en tant que rapporteurs.
Au Dr Emmanuel Petit et au Pr Emmanuel Pauthe pour avoir accepté de participer à mon

jury de thèse en tant qu’examinateurs.
Je tiens à remercier le Pr Jean-Pierre Vannier, directeur de l’EA3829 MERCI de m’avoir

accueilli dans son laboratoire. Je le remercie également d’avoir accepté de participer à mon
jury de thèse.
Je remercie le Pr Hassan Atmani pour la confiance qu’il m’a accordée en m’acceptant au

sein du La2B. Son aide et son soutien m’ont été précieux tout au long de ces années.
Mes sincères remerciements au Dr Béatrice Labat et au Dr Guy Ladam, pour leur confiance
et le temps qu’ils m’ont consacré dès le début de ce projet. Je les remercie également pour la
qualité de leur encadrement. Merci d’avoir toujours été là quand j’en avais besoin, pour
votre soutien et vos encouragements. Vous m’avez tous deux énormément appris.
Je tiens également à remercier le Dr Ingrid Masson de l’EAC CNRS 4396 pour les tests
mécaniques de nos substrats.
Je remercie le Conseil Général de l’Eure et le Grand Évreux Agglomération pour leur

participation au soutien de cette thèse.
À tous les membres du La2B/SMS du Centre Universitaire d’Evreux : Dr Valérie Dupray, Dr

Sandrine Morin, Dr Benjamin Berton, Dr Olivier Thoumire, Lucia Bertolini Forno. Merci
pour le temps que vous m’avez accordé, pour les explications techniques, merci encore
d’avoir répondu à mes questions. Votre aide m’a été précieuse.
1
Merci encore à tous les thésards qui sont passés au La2B ou qui y sont encore : Dr Khalil
Abdelkebir, Dr Audrey Waldschmidt, Dr Nimrod Buchbinder, Araceli Solís Gómez. Merci
aussi aux stagiaires : Romain Cavé, Rim Khelif, Lucía Martínez Jothar, Laure Bélières.
À tout le monde un grand merci pour votre aide, votre solidarité, pour les pauses café et pour
la bonne ambiance ! Merci d’avoir été là quand j’en avais besoin.
Je remercie également l’ensemble du personnel administratif et technique du Centre

Universitaire d’Evreux – Tilly.
Merci aussi au Dr Laurent Bidault et au Dr Pierre Lembré qui, malgré l’éloignement ont
toujours répondu présent pour m’aider (merci pour les papiers !).
Un merci particulier au Dr Mathilde Hindié qui a accompagné mes premiers pas dans le
monde de la recherche. Les conseils que tu m’as donnés pendant mon M2 m’ont été utiles
pendant ces quatre années, et le seront encore.
Merci aussi à mes amis qui ont eu à supporter mes histoires concernant le déroulement de ma
thèse.
Un grand merci à mes parents, de m’avoir porté et accompagné depuis toujours. Sans eux, je
n’en serais pas là aujourd’hui. Merci d’avoir eu foi en moi, d’avoir respecté mes choix. À
Fanny et à Clément aussi.
Un merci tout particulier à ma petite famille, Candice et Valentin, qui ont été sources de
réconforts et de motivation.
2
Table des matières
Liste des abréviations 8
Index des illustrations et tableaux 11
Introduction 18
Chapitre I - Etude Bibliographique 20
I.A Les biomatériaux 21

I.A.1 Généralités 21
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité 21
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux 22
a. Modifications des propriétés intrinsèques 22
b. Traitements de surface 22
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.B.1 Introduction 23
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL 23
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL 27
a. Mécanismes d’assemblage 27
b. Influence des conditions de construction 30
c. Films LbL biomimétiques 33
d. Le système (CSA/PLL) 34
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL 37
a. Réticulation des films LbL 37
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs 38
I.C Le tissu osseux 43

I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse 44
a. La phase organique 44
b. La phase minérale 45
I.C.2 Les cellules osseuses 45
a. Lignée ostéoformatrice 46
b. La lignée ostéorésorbante 47
I.C.3 Le remodelage osseux 47
I.D Interactions cellules-matériaux 49

I.D.1 Influence de la chimie de surface 49
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau 50
a. Topographie 50
b. Mécanique 52
3
I.E Références bibliographiques 55
Chapitre II - Matériels et Méthodes 66
II.A Préparation des substrats 67

II.A.1 Produits et Solutions 67
a. Les tampons 67
b. Les polyélectrolytes 68
II.A.2 Les substrats PDMS 70
II.A.3 Construction des films LbL 71
a. Nettoyage et préparation des surfaces 71
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS 71
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS 72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion
Totale Atténuée, FTIR-ATR 73
a. Principe 73
b. Déroulement de l’analyse 75
c. Appareillage 75
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM 75
a. Principe 76
b. Traitement des données 77
c. Appareillage 78
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D 79
a. Principe 80
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn 81
c. Appareillage 83
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS 84
a. Principe 84
b. Traitement des données OWLS 85
c. Appareillage 86
II.B.5 Essais mécaniques 87
a. Principe 87
b. Déroulement des expériences 89
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation 91
d. Appareillage 91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact 92
a. Principe 92
b. Réalisation des mesures 92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB 93
II.B.8 Microscopie à épifluorescence 93
a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente 93
b. Préparation des substrats et observations 94
4
II.C Fonctionnalisation des films LbL 94
II.C.1 Réticulation par la génipine 94
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine 96
II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire 97
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire 97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue® 98
II.D.4 Évaluation de la différenciation 98
a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL 98
b. Minéralisation de la matrice extracellulaire 99
II.D.5 Tests statistiques 99
II.E Références bibliographiques 100
Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la rigidité du substrat sur le

comportement de préostéoblastes murins MC3T3-E1 102
III.A Introduction 102
III.B Analyse des substrats 105

III.B.1 Substrats PDMS bruts 105
a. Caractérisation mécanique 105
b. Caractérisation de surface 108
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL 112
a. Adsorption de la couche précurseur de PEI 112
b. Caractérisation des films LbL 113
III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.C.1 Morphologie cellulaire 116
III.C.2 Prolifération cellulaire 121
III.C.3 Différenciation cellulaire 123
III.D Conclusion 127
III.E Références bibliographiques 127
Chapitre IV - Influence de la réticulation des films CSA/PLL par la génipine sur le

comportement des préostéoblastes MC3T3-E1 133
IV.A Introduction 133
5
IV.B Caractérisation des films CSA/PLL natifs et réticulés 135
IV.B.1 Caractérisation spectroscopique 135
a. Suivi de la réaction de réticulation par spectroscopie UV-visible 135
b. Analyse des films par spectroscopie FTIR-ATR 138
IV.B.2 Caractérisation structurale et mécanique par QCM-D 139
a. Suivi de la construction et de la réaction réticulation 139
b. Modélisation viscoélastique 141
c. Étude de la stabilité des films 143
IV.B.3 Caractérisation morphologique et structurale par microscopies optique, à
fluorescence et à force atomique 145
a. Cas des films PEI/(CSA/PLL)6 146
b. Cas des films PEI/(CSA/PLL)12 149
IV.B.4 Caractérisation mécanique par nanoindentation AFM 152
IV.C Étude des comportements cellulaires 155

IV.C.1 Adhésion et morphologie cellulaires 155
a. Étude par microscopie optique 155
b. Étude par microscopie à fluorescence 159
IV.C.2 Prolifération cellulaire 161
IV.C.3 Différenciation cellulaire 165
a. Dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) 165
IV.D Conclusion 171
IV.E Références bibliographiques 173
Chapitre V - Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL) en

vue du relargage de composés actifs. 178
V.A Introduction 178
V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD 179

V.B.1 Mise au point de la méthode d’incorporation 179
V.B.2 Influence du précurseur PEI 187
V.B.3 Influence de la charge externe du film et du vecteur 188
V.B.4 Influence de la concentration du vecteur 191
V.C Influence du pH et de la force ionique 192

V.C.1 Influence du pH 193
a. Rinçage à pH 4.5 193
b. Rinçage à pH 8,5 195
V.C.2 Influence de la force ionique 197
6
V.D Conclusion 198
V.E Références bibliographiques 199
Conclusion et Perspectives 202
Liste des communications 206
7
Liste des abréviations
Polymères :
ALG Alginate
CHI Chitosan
CS Chondroïtine sulfate
CSA Chondroïtine Sulfate A ou chondroïtine-4-sulfate
DS Dextrane sulfate
GAG Glycosaminoglycane
HA Acide hyaluronique
HAP Hydroxyapatite
PA Polyacrylamide
PAA Poly(acide acrylique)
PAH Poly(hydrochlorure d’allylamine)
pCD Polymère de cyclodextrines
PDADMAC Poly(chlorure de diallyldimethylammonium)
pDMAEMA Poly[2-(diméthylamino)éthyl methacrylate]
PDMS Poly(diméthylsiloxane)
PE Poly(éthylène)
PEI Poly(éthylène imine)
PGA Poly(acide glutamique)
PLL Poly(L-lysine)
PLLA Poly(acide L-lactique)
PMMA Poly(méthylmétacrylate)
PSS Poly(styrène sulfonate)
PTFE Poly(éthylènetéréphtalate)
βTCP β-Tricalcium phosphate
8
Protéines et facteurs de croissance :
BMP Protéine morphogénique osseuse (« Bone Morphogenic Protein »)

COL Collagène
FGF Facteur de croissance de fibroblaste (« Fibroblast Growth Factor »)
IGF Facteur de croissance de type insuline (« Insuline like Growth Factor »)
PAL Phosphatase alcaline
PhV Phosvitine
TGFβ Facteur de croissance transformant β (Transforming Growth Factor β »)
Fn Fibronectine
Solvants et réactifs :
FITC Fluorescéine isothiocyanate

PNPP p-nitrophénol phosphate
Tris Tris[hydroxyméthyl]aminométhane
DPBS Tampon phosphate salin de Dulbecco (« Dulbecco’s Phosphate Buffer
Saline »)
GnP Génipine
TBBA Acide 4-tert-butylbenzoïque
EDC [1-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl)carbodiimide]
NHS N-hydroxysulfosuccinimide
Appareils et techniques :
AFM Microscopie à force atomique (« Atomic Force Microscopy »)

FTIR-ATR Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en mode de réflexion
totale atténuée (« Attenuated Total Reflectance Fourier Transformed
Infrared spectroscopy »)
MEB Microscopie Électronique à Balayage
OWLS Spectroscopie par guide d’onde optique (« Optical Waveguide Lightmode
9
Spectroscopy »)
QCM-D Microbalance à cristal de quartz avec contrôle de la dissipation (« Quartz
Crystal Microbalance with Dissipation monitoring »)
10
Index des illustrations et tableaux
Illustrations
Figure I-1 : Film de Langmuir-Blodgett et Monocouche Auto-assemblée (SAM) 24
Figure I-2 : Principe de la technique LbL 25
Figure I-3 : Évolution du potentiel Zêta pendant la construction d’un film PEI/(PSS/PAH)n 26
Figure I-4 : Évolution de la masse adsorbée et de l’épaisseur de films LbL, par QCM-D 27
Figure I-5 : Représentation schématique de l’évolution de l’épaisseur des trois zones lors de
la construction d’un film LbL 28
Figure I-6 : Évolution de l’épaisseur de films (HA/PLL) 29
Figure I-7 : Évolution des fréquences normalisées suivies par QCM durant la construction de
films CHI/HA 30
Figure I-8 : Influence de la nature des contre-ions sur la croissance et l’épaisseur de films
LbL 33
Figure I-9 : Évolution (A) de l’épaisseur et de la masse adsorbée suivies par QCM-D et (B)
de l’épaisseur suivie par OWLS pour des films PEI/(CSA/PLL)6 en fonction du nombre de
couches 35
Figure I-10 : (A) Spectres de référence des polyélectrolytes et suivi étape par étape de la
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)12, par FTIR-ATR. (B) Évolution de l’absorbance
moyenne de trois pics spécifiques de films PEI/(CSA/PLL)6/CSA 36
Figure I-11 : Modèle structural proposé pour les films PEI/(CSA/PLL)6, basé sur la QCM-D,
l’OWLS, le FTIR-ATR et l’AFM 36
Figure I-12 : Mécanismes de relargage de composés bioactifs par des films LbL 42
Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses 46
Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux 47
Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains 52
Figure I-16 : Déplacement et accumulation de cellules vers la zone rigide d’un gel présentant
un gradient de rigidité 53
11
Figure I-17 : Influence de la rigidité du substrat sur la différenciation de cellules souches
mésenchymateuses 54
Figure II-1 : Le polyéthylèneimine, PEI 68
Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL 69
Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA 69
Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS 70
Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules 73
Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion 74
Figure II-7 : Profil de décroissance de l’onde évanescente infrarouge (n2 < n1). 74
Figure II-8 : Principe de fonctionnement d’un microscope à force atomique (AFM). 76
Figure II-9 : Evolution de la force F exercée sur la pointe par l’échantillon en charge et en
décharge 77
Figure II-10 : Modèles de pointes sphérique (modèle de Hertz) ou coniques (modèle de

Sneddon) utilisées en nanoindentation par AFM 77
Figure II-11 : Capteur QSX301 (Q-Sense AB) 80
Figure II-12 : Principe de la mesure QCM-D 80
Figure II-13 : Calcul des paramètres (fn ; Dn) par modélisation de la courbe expérimentale
d’amortissement par une sinusoïde amortie 81
Figure II-14 : Profils de l’évolution des paramètres mesurés en QCM(-D) pour un dépôt
rigide (Δf : vert) et pour un dépôt viscoélastique (Δf : bleu ; ΔD : rouge). 82
Figure II-15 : Système QCM-D D300 (Q-Sense AB) 83
Figure II-16 : Architecture de la cellule de mesure. Le sens d’écoulement est indiqué par des
flèches 83
Figure II-17 : Schéma représentant le principe de la spectroscopie optique par guide d'onde 84
Figure II-18 : Évolution typique des angles de couplage αTE et αTM lors du dépôt de matière
sur un guide d'onde OWLS 85
Figure II-19 : Dispositif OWLS comportant l’unité d’injection, le thermostat et la cellule de

mesure et schéma de principe de la cellule de mesure 87
Figure II-20 : Courbe de contrainte-déformation typique d’un matériau ductile 88
Figure II-21 : Exemples de courbes de contrainte-déformation de matériaux présentant des

comportements mécaniques différents 89
12
Figure II-22 : Schéma de fonctionnement d’un banc d’essai 89
Figure II-23 : Formes et dimensions des éprouvettes de PDMS pour les tests en compression
et en tension 90
Figure II-24 : Photographies des montages des tests en compression et en tension

d’échantillons de PDMS 90
Figure II-25 : Déformation (∆L) d’éprouvettes lors d’essais en compression et de traction

sous l’effet de la force axiale (F) 91
Figure II-26 : Illustration graphique de la relation de Young-Dupré reliant la forme d’une

goutte de liquide (angle de contact θ) aux différentes interfaces en jeux à la triple interface
(γLV, γSL et γSV) 92
Figure II-27 : Structure moléculaire de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) 93
Figure II-28 : Mécanisme présumé de la réaction de réticulation d’amines primaires par la

génipine 95
Figure III-1 : Courbes de contrainte-déformation en compression et en traction pour les

substrats PDMS-3, -5, -7, -10 et -20 bruts 106
Figure III-2 : Courbes d’évolution de Einc en fonction de la déformation de l’éprouvette de

PDMS, lors de test en compression et en traction 107
Figure III-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 108
Figure III-4 : Angle de contact statique : images et mesures effectuées avec une goutte de
5µL de tampon Tris – NaCl, à température ambiante, sur les substrats PDMS 110
Figure III-5 : Images MEB d’un substrat PDMS-5 découpé à l’aide d’un emporte pièce, à
deux grossissements différents 111
Figure III-6 : Images MEB de la surface des substrats PDMS-3 et -10 moulés dans des boites
de Pétri 111
Figure III-7 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 112
Figure III-8 : Microphotographies des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés par de
la PEI ou de la PEIFITC 113
Figure III-9 : Spectres FTIR-ATR des substrats PDMS fonctionnalisés par des films
PEI/(CSA/PLL)6/CSA 114
Figure III-10 : Images MEB de substrats PDMS-3 et -10 fonctionnalisés par

PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 114
Figure III-11 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés
par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 115
13
Figure III-12 : Morphologie de cellules MC3T3-E1 cultivées sur les substrats PDMS-3, -5, -
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 117
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 119
Figure III-14 : Images MEB de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 120
Figure III-15 : Prolifération des cellules MC3T3-E1 cultivées sur des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 122
Figure III-16 : Activité de la phosphatase alcaline de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des
substrats PDMS fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 124
Figure IV-1 : Photographie de films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou après 16

heures de traitement réticulant par des solutions GnP25 ou GnP50 136
Figure IV-2 : (A) Évolution de l’absorbance entre 580 nm et 700 nm de films LbL
PEI/(CSA/PLL)18 traités par GnP25 et GnP50, sur une durée de 16h. (B) Évolution moyenne,
pour 2 films GnP50 et 3 films GnP25, de l’absorbance à 600 nm 137
Figure IV-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR d’un film PEI/(CSA/PLL)6 natif, puis
réticulé par une solution de GnP50 138
Figure IV-4 : Évolution des fréquences de résonance Δfn/n et des facteurs de dissipation ΔDn
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)6 traité par la solution GnP50 140
Figure IV-5 : Évolutions moyennes des paramètres de QCM-D lors de la construction, puis
du traitement par une solution de GnP à 0,50% de trois films PEI/(CSA/PLL)6 141
Figure IV-6 : Évolutions moyennes de la masse hydratée Q et de l’épaisseur d, de la viscosité

η, et du module de cisaillement μ de films PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 étudiés par QCM-D 142
Figure IV-7 : Évolution de la fréquence de résonance mesurée par QCM-D, lors de la

construction de films LbL PEI/(CSA/PLL)6 natif ou traité avec la GnP50, puis lors de leur
mise en contact avec la PhV 144
Figure IV-8 : Évolution de la fréquence de résonance normalisée Δf3/3 lors de la construction

d’un film PEI/(CSA/PLL)6-GnP-PhV/(PLL/CSA)2/PLL 145
Figure IV-9 : Images AFM 2D et 3D typiques de films PEI/(CSA/PLL)6, PEI/(CSA/PLL)6-

GnP25 et PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 146
Figure IV-10 : Observations par microspcopie à fluorescence de films PEI/(CSA FITC/PLL)6

aux longueurs d’ondes d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la FITC et de la GnP 148
Figure IV-11 : Microphotographies typiques de films PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par

des solutions GnP25 et GnP50, réalisées en microscopie optique à contraste de phase 149
14
Figure IV-12 : Observations par microspcopie à fluorescence de films PEI/(CSAFITC/PLL)12
aux longueurs d’ondes d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la FITC et de la GnP 150
Figure IV-13 : Images AFM 2D et 3D typiques de films PEI/(CSA/PLL)12,

PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 152
Figure IV-14 : Modules élastiques des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et

réticulés, mesurés par nanoindentation AFM 153
Figure IV-15 : Photographies de cellules MC3T3-E1 observées sur une période de 60

minutes, 24 heures après ensemencement sur un plastique commercial traité pour la culture
cellulaire (TCPS) 156

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 natif 156

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 réticulé par une
solution de GnP25 157

solution de GnP50 157
Figure IV-19 : Photographies de cellules MC3T3-E1, 24 heures après ensemencement sur un

film PEI/(CSA/PLL)12 natif 158
Figure IV-20 : Morphologies typiques de préostéoblastes MC3T3-E1, après 3h de culture sur

les films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou réticulés par des solutions de GnP25
et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle) 160
Figure IV-21 : Morphologies typiques de cellules isolées, après 3h de culture sur le verre, et
sur des films PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 et PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 161
Figure IV-22 : Images de microscopie à fluorescence de cellules MC3T3-E1 après 10 jours

de culture sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par des
solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle) 162
Figure IV-23 : Prolifération de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par les solutions de GnP25 et GnP50, ainsi que sur le
verre (contrôle) 164
Figure IV-24 : Activité de la phosphatase alcaline et quantité totale de protéines

intracellulaires de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
PEI/(CSA/PLL)12 et natifs ou réticulés par les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du
verre (contrôle), après 7 jours de culture 167
Figure IV-25 : Activité de la phosphatase alcaline et quantité totale de protéines

intracellulaires de cellules MC3T3-E1 cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6
15
PEI/(CSA/PLL)12 et natifs ou réticulés par les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du
verre (contrôle), après 14 jours de culture 169
Figure IV-26 : Microphotographies de cellules MC3T3-E1, cultivées pendant 8 semaines en

milieu ostéogénique sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par
les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle), après à l’Alizarine Red S 171
Figure V-1 : Évolution des fréquences de résonance et des facteurs de dissipation lors de la
construction d’un film PEI/(pCD/PLL)3/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl 180
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl sur un résonateur 5
MHz, avec le détail de la construction du film LbL et sa mise en contact avec la pCD 182
Figure V-3 : Évolution de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique lors de

l’immobilisation de pCD sur un film PEI/(CSA/PLL) 183
Figure V-4 : Évolution moyenne de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique obtenues

pour 4 films PEI/(CSA/PLL)5/pCD 183
Figure V-5 : Évolution des paramètres optiques OWLS, NTE et NTM, lors de la construction
d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 184
Figure V-6 : Conversion des données de la Figure V-5 en indice de réfraction (nOWLS),
épaisseur optique (dOWLS) et masse optique (QOWLS), par le modèle étendu de monocouche
homogène et isotrope pour un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 185
Figure V-7 : Images AFM caractéristiques et valeurs de rugosité Ra des films

PEI/(CSA/PLL)5± pCD 186
construction d’un film (PLL/CSA)5/PLL/pCD sans couche précurseur de PEI 188
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/CSA/pCD 189
Figure V-10 : Évolution de la masse hydrodynamique lors de l’immobilisation de pCD sur le

film PEI/(CSA//PLL)5/CSA 190
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD° 191
Figure V-12 : Évolution des fréquences de résonance et des facteurs de dissipation lors
d’injections successives (notées Ix) de solutions de pCD à une concentration de 0,1 mg mL-1
et 0,5 mg mL-1 (notée I0,5 mg/mL) au contact d’un film PEI/(CSA/PLL)5 192
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à
pH 4,5 194
16
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis rinçage à pH 4,5 194
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à
pH 8,5 195
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du rinçage à pH
8,5 196
Figure V-17 : Effet du rinçage à pH 8,5 sur les masses mesurées en par OWLS et par QCM-
D de films PEI/(CSA/PLL)5/pCD 196
Figure V-18 : Effet d’un rinçage à 0,05M NaCl sur la fréquence de résonance et le facteur de
dissipation d’un film PEI(CSA/PLL)5/pCD construit à pH 7,4 et 0,15 M NaCl 197
Figure V-19 : Effet d’un rinçage à 0,01 M NaCl sur les fréquences de résonance et les
facteurs de dissipation d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD 198
Tableaux
Tableau I-1 : Exemples de domaines d’application de biomatériaux 21

Tableau II-1 : Spécifications des pointes utilisées en AFM 79
Tableau III-1 : Attribution des bandes spectrales de FTIR-ATR des substrats PDMS 109
Tableau III-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des échantillons de PDMS-3, -5, -7 et -10
traités par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA 116
Tableau IV-1: Attribution des bandes FTIR-ATR des films natifs et réticulés 139
Tableau IV-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des films PEI/(CSA/PLL)6 natifs et réticulés
par la GnP 146
par la GnP 152
17
Introduction
Devant l’allongement de l’espérance de vie, principalement grâce aux progrès médicaux

réalisés depuis quelques dizaines d’années, les matériaux à usage médical connaissent un fort
développement et la recherche dans ce domaine doit faire face à une demande croissante.
Actuellement, les matériaux les plus représentés dans ce domaine sont les métaux, les
céramiques et les polymères. Bien que ces matériaux soient satisfaisants en termes de
biocompatibilité, c'est-à-dire non toxiques et tolérés par le système immunitaire des patients,
leur capacité d’intégration aux tissus hôtes est parfois limitée. Les mécanismes de
biointégration au sein des tissus sont dépendants des propriétés physico-chimiques et
mécaniques de surface de ces matériaux. Un objectif moderne dans la mise au point de
matériaux bioactifs est donc d’orienter les processus biologiques à l’interface de
l’environnement biologique avec l’implant.
Pour concevoir de tels matériaux bioactifs, les recherches se sont orientées vers différentes
modifications par voies chimiques ou physicochimiques, ou vers l’immobilisation directement
en surface de sites d’adhésion cellulaire ou de facteurs de croissance. Cette immobilisation,
par simple adsorption ou greffage covalent, présente le désavantage de provoquer
d’éventuelles dénaturations, et donc une perte de fonctionnalité. Dans le domaine de la
bioactivation de surface des biomatériaux, l’enjeu pour les années à venir consiste à améliorer
les conditions d’immobilisation de ces entités biochimiques, ou à concevoir des revêtements
de surface bioactifs, dont les propriétés physicochimiques, biochimiques, topographiques et
micromécaniques, peuvent être finement contrôlées. Le développement de telles
fonctionnalisations de surface doit nécessairement s’appuyer sur la mise en commun de
compétences variées, à la frontière de la chimie, de la physique, de la biologie et de la
médecine.
Les films « Layer-by-Layer » (LbL), ou multicouches de polyélectrolytes, apparus au
début des années 90, sont une famille de revêtements de surfaces particulièrement intéressante
pour le contrôle du microenvironnement physicochimique et mécanique des cellules. Ils
permettent la conception de structures de tailles nano- à micrométriques, applicables à une
vaste gamme de matériaux de natures chimiques et de géométries variées. Dans le domaine
des revêtements de surface à finalité biomédicale, les potentialités de cette méthode sont
multiples, du fait de la possibilité de les fonctionnaliser par l’adsorption ou de l’incorporation
18
de nombreuses espèces moléculaires, macromoléculaires ou particulaires. De plus, de
nombreuses macromolécules d’origine biologique pouvant être assimilées à des
polyélectrolytes (protéines, polypeptides, polysaccharides…), il est possible de fabriquer des
architectures biomimétiques inspirées des assemblages macromoléculaires qui constituent le
microenvironnement cellulaire au sein des tissus.
C’est dans ce contexte que se situent les travaux effectués lors de ce projet doctoral,
prolongeant les études précédemment menées par Khalil Abdelkebir lors de sa thèse, qui
s’était attachée, en partie, à décrire le mécanisme de croissance et la structure interne de films
LbL constitués de poly(L-lysine) (PLL), un polypeptide cationique biocompatible
couramment utilisé pour la conception de films LbL, et de chondroïtine sulfate A, ou
chondroïtine-4-sulfate (CSA), un polysaccharide anionique présent dans les tissus osseux et
cartilagineux. Ces films LbL sont envisagés ici pour la biofonctionnalisation de surface de
matériaux à visées orthopédique ou dentaire, de manière à améliorer leur ostéoconductivité.
Nous avons étudié les comportements à court, moyen et long terme de préostéoblastes murins
MC3T3-E1 cultivés sur ces films.
Le Chapitre I présente une étude bibliographique concernant les films LbL, ainsi que les
les comportements cellulaires au contact des biomatériaux. Les aspects expérimentaux sont
présentés dans le Chapitre II. Dans le Chapitre III, nous décrivons l’influence combinée de la
chimie externe, contrôlée par des films (CSA/PLL), et de la mécanique de substrats de type
élastomère dont la rigidité est contrôlée, sur les comportements de cellules MC3T3-E1. Dans
le Chapitre IV, nous nous sommes attachés à la réticulation des films (CSA/PLL) par un agent
réticulant d’origine naturelle, la génipine (GnP) et à leur caractérisation chimique et physique
(topographique et mécanique), ainsi qu’à l’effet de ces films sur les cellules. Dans ces deux
études, les comportements cellulaires ont été étudiés en termes d’adhésion, de prolifération et
de différenciation. Le Chapitre V présente une étude préliminaire de l’incorporation d’un
vecteur anionique dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL), comme potentiel
véhicule de biomolécules hydrophobes pour leur délivrance contrôlée in situ.
19
Chapitre I - Etude Bibliographique
I.A Les biomatériaux 21

I.A.1 Généralités 21
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité 21
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux 22
a. Modifications des propriétés intrinsèques 22
b. Traitements de surface 22
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.B.1 Introduction 23
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL 23
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL 27
a. Mécanismes d’assemblage 27
b. Influence des conditions de construction 30
c. Films LbL biomimétiques 33
d. Le système (CSA/PLL) 34
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL 37
a. Réticulation des films LbL 37
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs 38
I.C Le tissu osseux 43

I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse 44
a. La phase organique 44
b. La phase minérale 45
I.C.2 Les cellules osseuses 45
a. Lignée ostéoformatrice 46
b. La lignée ostéorésorbante 47
I.C.3 Le remodelage osseux 47
I.D Interactions cellules-matériaux 49

I.D.1 Influence de la chimie de surface 49
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau 50
a. Topographie 50
b. Mécanique 52
I.E Références bibliographiques 55
20
I.A Les biomatériaux
I.A.1 Généralités
Bien qu’il n’existe pas de définition précise d’un biomatériau, D. Williams en propose une,
lors de la Conférence de Consensus, organisée par la Société Européenne de Biomatériaux à
Chester en 1986: « matériau non vivant utilisé dans un dispositif médical destiné à interagir
avec les systèmes biologiques ».1
La « science des biomatériaux » est l’étude des propriétés physico-chimiques et
biologiques des matériaux et de leur impact sur des systèmes vivants, ce qui implique la
notion de contact entre ces matériaux et des fluides ou des tissus vivants. Outre les implants,
cela concerne également des matériaux se trouvant à la surface du corps, comme les lentilles
de contact, en contact avec la cornée, et autres dispositifs pour la cicatrisation. Cette définition
peut être étendue aux dispositifs utilisés en ingénierie tissulaire et dans les biotechnologies.
D. Williams donne, en 1999, une nouvelle définition des biomatériaux : « matériau prévu
pour être à l’interface de systèmes biologiques dans le but d’évaluer, de traiter, d’augmenter
ou bien de remplacer un tissu, un organe ou encore une fonction du corps humain ».2
Il existe différentes catégories de biomatériaux, qu’il est possible de classer en fonction de
leurs domaines d’application (Tableau I-1).
Tableau I-1 : Exemples de domaines d’application de biomatériaux.
Matériaux Exemples Exemples d’applications

Polymères
Synthétiques Poly(éthylène) (PE) Implants orthopédiques
Polyéthylène(téréphtalate) (PTFE) Prothèses vasculaires
Poly(méthylmétacrylate) (PMMA) Ciments osseux
Naturels Polylactides Sutures
Caprolactone Supports tissulaires
Soie Sutures
Chitine/Chitosan Substitus orthpédiques
Métaux et alliages Titane/alliages de titane Prothèses de hanche
Alliages chrome/cobalt Implants dentaires
Aciers inoxydables Stents
Céramiques Phosphates de calcium (HAP, Implants orthopédiques
βTCP,…)
Alumine, zircone Orthopédie
I.A.2 Biocompatibilité et bioactivité

Initialement, une des grandes problématiques dans le domaine des biomatériaux était
d’utiliser un matériau biocompatible, c'est-à-dire un « matériau inerte, sans effet sur les
21
systèmes vivants ». Par le terme « inerte », il était entendu que le matériau ne devait pas
induire de réaction immunitaire de la part de l’organisme et devant présenter une toxicité
nulle ou minimale. À la fin des années 90, cette définition a évolué et la notion de
biocompatibilité est devenue la « capacité d’un matériau à être utilisé avec une réponse de
l’hôte appropriée dans une application spécifique ». La biocompatibilité n’était donc plus le
seul critère requis pour un biomatériau, et les recherches se sont orientées vers des matériaux
dits bioactifs, participant aux mécanismes de régénération tissulaire. En plus de leur
biocompatibilité, les matériaux doivent (i) pouvoir, le cas échéant, être intégrer aux tissus
environnants en permettant leur invasion par les cellules qui les composent, (ii) permettre le
relargage de composés thérapeutiques spécifiques à l’application ciblée et (iii), concernant les
matériaux résorbables, être biodégradables, les produits de dégradation devant être non
toxiques.
I.A.3 Fonctionnalisation des biomatériaux

a. Modifications des propriétés intrinsèques
La modification des propriétés intrinsèques des matériaux vise, notamment, à moduler
leurs propriétés mécaniques, leur porosité, leur biodégradabilité, leurs propriétés de relargage
de composés thérapeutiques.
Les modifications en masse de matériaux ont également permis l’apparition de
biomatériaux hybrides, c'est-à-dire fonctionnalisés avec des cellules vivantes, idéalement
autologues. Ce nouveau type de matériau a pour objectif d’accélérer l’intégration à
l’organisme et est envisagé par exemple pour s’affranchir des broches métalliques lors des
réparations osseuses.
b. Traitements de surface
Les propriétés natives des matériaux peuvent se révéler incompatibles avec
l’environnement auquel ils sont destinés. Il est alors possible de les fonctionnaliser en surface,
sur une épaisseur minimale afin de conserver leurs propriétés intrinsèques. Pour cela, les
méthodes de fonctionnalisation de surface les plus pertinentes sont celles qui modifient
l’extrême surface des matériaux, à l’échelle atomique ou moléculaire, ou impliquent le dépôt
de films ultraminces, d’épaisseur nano- à micrométrique.
Il est ainsi possible de contrôler la topographie, la chimie, l’énergie, et les propriétés
mécaniques des surfaces. Les traitements de surface permettent d’exploiter des matériaux aux
propriétés intrinsèques adéquates, mais dont les propriétés de surfaces pourraient entraîner des
22
réactions indésirables, ou inhiber la colonisation par les cellules du tissu hôte environnant.
Parmi les voies envisagées, il est possible de (i) modifier directement la topographie de
surface par voie chimique ou mécanique, afin de favoriser l’ostéointégration par exemple, (ii)
adsorber par simple physisorption des protéines ou des polymères, de manière à former une
monocouche à la surface du matériau, ou (iii) greffer de façon covalente des groupements
chimiques ou des macromolécules, ce qui permet leur immobilisation irréversible.
Depuis une quinzaine d’années, la technique « Layer-by-Layer » (LbL), qui permet de
fonctionnaliser les surfaces en conditions douces (par voie aqueuse), a été envisagée pour des
applications dans le domaine des biomatériaux. La technique LbL et ses applications sont
détaillées ci-dessous.
I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL)

I.B.1 Introduction
La méthode « Layer-by-Layer » (LbL) est une technique de fonctionnalisation de surface
polyvalente et simple à mettre en œuvre. Elle offre l’avantage d’être une technique de
fonctionnalisation douce qui ne requiert pas l’usage de solvants chimiques ou de méthodes
physiques agressives. Elle permet de modifier la surface de nombreux types de substrats par la
construction de structures nano- à micrométriques, dont on peut contrôler les propriétés
physico-chimiques. De plus, ces films sont (multi)fonctionnalisables par l’incorporation de
composés bioactifs, tels que des protéines, des facteurs de croissance, ou des nanoparticules.
I.B.2 Principes de la technologie des films LbL

Pendant la seconde moitié du XXème siècle, la recherche concernant la fonctionnalisation
de surface par des films minces à l’échelle nanométrique pour des applications dans les
domaines de la biologie et de la médecine a été dominée par deux techniques : le dépôt de
films de Langmuir-Blodgett (LB) et les monocouches auto-assemblées (SAMs) (Figure I-1).
23
A B
Figure I-1 : (A) Dépôt d’un film de Langmuir-Blodgett (LB) par trempage d’un matériau à
travers une couche lipidique formée à l’interface air-eau, et (B) Monocouche Auto-assemblée
(SAM) de silane sur du silicium.
La technique de LB consiste à immerger un matériau à travers un film monomoléculaire de

composés amphiphiles formé à l’interface air-eau.3,4 En répétant ce cycle, il est possible de
construire des architectures multicouches, dont l’épaisseur varie de quelques Angströms à
plusieurs nanomètres. Il est ainsi envisageable de fonctionnaliser la surface du matériau et d’y
immobiliser divers composés, comme des protéines. Cependant, cette technique présente
plusieurs inconvénients, notamment les restrictions en termes de géométrie de substrat et de
nature des biomolécules immobilisées, et une instabilité importante du film construit due aux
faibles interactions physiques stabilisant le dépôt.
Les SAMs permettent également de contrôler la chimie de surface des matériaux.5 Ils
peuvent notamment être utilisés pour l’immobilisation de protéines.6,7,8 Mais leurs
applications dans le domaine de la biologie sont limitées car (i) leur nature de monocouche
empêche l’immobilisation importante de biomolécules, (ii) peu de substrats sont éligibles, les
SAMs étant fabriqués uniquement par le greffage de groupements thiols sur des métaux
nobles ou de silanes sur des surfaces hydroxylées, et (iii) leur stabilité chimique est faible
dans les conditions physiologiques.
Depuis une quinzaine d’années, la méthode LbL, introduite par Decher en 1991, 9,10
constitue une alternative intéressante à ces deux techniques pour la fonctionnalisation de
surface pour des applications dans les domaines de la biologie et des sciences médicales.
Cette technique consiste en des dépôts alternés de polymères de charges opposées, en milieu
aqueux. En répétant autant de fois que désirés les cycles d’adsorption de polyélectrolytes, il
est possible de construire des architectures d’épaisseur contrôlée, allant de quelques
nanomètres à plusieurs micromètres.
24
Figure I-2 : Principe de la technique LbL (d’après Decher).10
Les étapes d’adsorption, dont le temps varie de quelques minutes à plusieurs dizaines de
minutes, peuvent être réalisées par immersion d’un matériau dans les solutions de
polyélectrolytes ou par écoulement des solutions au contact de la surface à fonctionnaliser.
Entre chaque étape d’adsorption, une étape de rinçage est nécessaire afin d’éliminer les
polyélectrolytes non ou faiblement liés à la surface et ainsi éviter la contamination de la
solution du polyélectrolyte de charge opposée.
Il a été démontré qu’après chaque rinçage, la surface du film n’est pas neutre, mais expose
des charges correspondant au dernier polyélectrolyte adsorbé. Il y a donc surcompensation de
charges après chaque dépôt. Ce processus, mis en évidence par des mesures du potentiel
Zêta,11,12,13 constitue la force motrice de la construction des films LbL (Figure I-3). Une
description théorique a été fournie par Netz et Joanny.14,15
Les forces permettant la cohésion et la croissance des films LbL de polyélectrolytes sont
principalement de nature électrostatiques coulombiennes. D’autres types d’interactions,
comme les interactions de Van der Waals ou des liaisons H, peuvent néanmoins participer à la
structure et à l’assemblage de ces films.16,17 Enfin, d’autres types d’interactions ont été étudiés
pour l’assemblage et la stabilisation de films LbL : liaisons covalentes,18 interactions
hydrophobes,19 interactions récepteur-ligand, liaisons covalentes de coordination.20
25
Figure I-3 : Évolution du potentiel Zêta pendant la construction d’un film PEI/(PSS/PAH)n.
PEI : poly(éthylène imine) ; PSS : poly(styrène sulfonate) ; PAH : poly(allylamine) (d’après
Ladam et al.).13
L’utilisation des films minces obtenus par la technique LbL dans le domaine de la
fonctionnalisation de matériaux à finalité biologique ou médicale offre plusieurs avantages :
 Ils permettent la fonctionnalisation de matériaux de nature chimique variée (métaux,
céramiques, polymères) et de géométries complexes, à conditions que ceux-ci présentent à
leur surface suffisamment de charges électrostatiques. Dans le cas contraire, il est possible
d’implanter des charges sur la surface de manière à initier l’assemblage du film LbL.10,21,22
 Ils sont construits en conditions auqueuses douces.
 Le contrôle des conditions de construction (nature des polyélectrolytes, force ionique,

pH…) permet de moduler précisément les propriétés physico-chimiques des films (épaisseur,
charge électrostatique de surface, propriétés viscoélastiques…).13,23,24
 Ils peuvent être fonctionnalisés pendant ou après construction par l’incorporation

d’une grande variété de composés d’intérêt (colloïdes conducteurs, semiconducteurs, isolants,
catalyseurs, polyélectrolytes conducteurs, biopolymères, protéines, vésicules lipidiques…) de
manière à leur conférer des propriétés électroniques, optiques, magnétiques, catalytiques,
biologiques ou de relargage.25,26
De plus, la technologie LbL n’est pas applicable uniquement aux polyélectrolytes. Des
films LbL construits à partir d’autres espèces chargées, comme des nanoparticules, des
nanotubes, des colorants organiques, des dendrimères, des porphyrines, des polysaccharides
26
biologiques, des polypeptides, des acides nucléiques, des protéines, des particules virales ont
ainsi été étudiés. Cette polyvalence confère à la technologie LbL un intérêt majeur dans la
fabrication de nano-films pour des applications biomédicales, en offrant une large gamme de
caractéristiques structurales, et des propriétés fonctionnelles.
I.B.3 Mécanismes de croissance et structure interne des films LbL

a. Mécanismes d’assemblage
Lors de la construction d’un film LbL, sa masse et son épaisseur augmentent avec le
nombre de couches adsorbées. En fonction de la nature des polyélectrolytes et des conditions
expérimentales, cette croissance peut s’effectuer de manière linéaire avec le nombre de
couches adsorbées, alors que d’autres systèmes ont une croissance superlinéaire (ou
exponentielle), c’est-à-dire que la prise de masse et d’épaisseur accompagnant chaque
nouvelle couche augmente au cours de la construction (Figure I-4).
A B
Figure I-4 : (A) Évolution de la masse adsorbée lors de la construction d’un film
PEI/(PSS/PAH)5.27 (B) Évolution de l’épaisseur (dQCM-D) et de la masse adsorbée (QQCM-D)
lors de la construction d’un film PEI/(ChS/PLL)6.30 Les mesures sont effectuées par QCM-D
dans les deux cas. PEI : poly(éthylène imine) ; PSS : poly(styrène sulfonate) ; PAH :
poly(allylamine) ; ChS : condroïtine sulfate ; PLL : poly(L-lysine).
Le mécanisme de croissance linéaire concerne les architectures élaborées à partir de

polyélectrolytes ne pouvant diffuser au sein de la structure. L’adsorption de chaque nouvelle
couche se fait par surcompensation des charges de surface, la quantité de polyélectrolytes
déposée étant proportionnelle à la densité de ces charges. Cette dernière varie de manière
cyclique, conduisant à une augmentation linéaire en masse et en épaisseur du dépôt. Ces films
ont une structure globalement stratifiée, avec cependant un certain degré d’interpénétration
entre les couches adjacentes. Ce mécanisme est souvent observé pour des films constitués de
27
polyélectrolytes synthétiques, tels que PSS/PAH13,27 ou des films construits à faible force
ionique,28 ce qui diminue la flexibilité et donc la capacité de diffusion des chaînes au sein de
l’architecture.
Ladam et al. ont proposé, pour des films à croissance linéaire, un mécanisme basé sur un
modèle en trois zones.13 La zone I, interne et proche du substrat, est composée de quelques
couches dont la structure est influencée par la proximité du substrat. La zone “bulk” (zone II)
au sein de laquelle toutes les couches de polyanions, et respectivement polycations, ont la
même épaisseur, et les charges positives et négatives se compensent presque exactement. La
zone III, externe est constituée de quelques couches dont la structure est proche de celle des
polyélectrolytes en solution. Les frontières entre les différentes zones sont graduelles et ne
doivent pas être considérées comme étant aussi marquées que sur le schéma. Les zones I et III
conservent une épaisseur constante, et c’est la zone II qui croît linéairement en épaisseur et en
masse au cours de la construction du film
Figure I-5 : Représentation schématique de l’évolution de l’épaisseur des trois zones lors de
la construction d’un film LbL par adsorptions successives de couches de polyélectrolytes.
Lors de la construction, seule la zone II augmente en épaisseur (Ladam et al.).13
Le régime de croissance exponentiel est, quant à lui, attribué à la capacité d’au moins l’un
des deux polyélectrolytes à diffuser au sein de la multicouche lors de la construction. 29 Ce
mécanisme a été initialement observé pour des films composés de poly(L-lysine) associée à de
l’alginate (PLL/ALG) ou de l’acide hyaluronique (PLL/HA),28 puis a été généralisé pour de
nombreux systèmes et plus récemment pour des films (CSA/PLL).30 Le film joue un rôle de
réservoir de chaînes libres qui diffusent et s’accumulent dans la structure. Lors du rinçage, la
présence d’une barrière électrostatique empêche ces chaînes de diffuser hors du film. Pendant
l’étape d’adsorption du polyélectrolyte de charge opposée, cette barrière électrostatique
28
disparaît, permettant alors aux chaînes libres de diffuser hors du film et de se complexer en
surface avec les chaînes de charge opposée présentes en solution. Le film augmentant en
épaisseur, la taille du réservoir augmente, ce qui permet l’adsorption d’une quantité croissante
de polyélectrolytes d’une étape à l’autre.
Cependant, depuis quelques années, des études ont montré l’existence d’une transition du
mode de croissance d’un régime exponentiel vers un régime linéaire. Ce phénomène, mis en
évidence pour la première fois par Hübsch et al. en 2004 sur des films basés sur la
combinaison d’un polycation (le PAH) et d’un mélange de deux polyanions, l’un (le PSS)
induisant une croissance linéaire avec le polyanion, l’autre (le poly(L-acide glutamique),
PGA) une croissance exponentielle.31 Les auteurs ont constaté un changement dans le régime
de croissance lorsque le film atteint une certaine épaisseur. Un phénomène similaire a
également été observé par Porcel et al. sur des films (PLL/HA),32 dont nous avons vu plus
haut qu’ils présentaient un régime de croissance exponentiel dans les étapes initiales de leur
construction. Pour ces derniers films, la transition intervient après le dépôt de 12 paires de
couches, indépendamment du mode de construction (immersion ou nébulisation) et de la
masse molaire des polyélectrolytes (Figure I-6).
Figure I-6 : Évolution de

l’épaisseur de films (HA/PLL),
mesurée par ellipsométrie en
fonction du nombre de couches et
de la masse molaire des
polyélectrolytes : MHA = 130000
g mol-1 et trois MPLL = 20000 (■),
55000 (○) et (▲) 360000 g mol-1
(d’après Porcel et al.).32
Pour l’expliquer, les auteurs ont suggéré qu’une restructuration interne se produit à
l’intérieur des films, conduisant à l’apparition d’une zone interne dense. Cette zone interdirait
la diffusion des chaînes libres, nécessaire à la croissance exponentielle, de sorte que seule une
zone externe de profondeur constante reste accessible à la diffusion. Ainsi, la croissance des
films, certes toujours renforcée par rapport aux films non diffusifs, devient linéaire. Ce
modèle a permis de rendre compte de la transition de régime, mais selon ses auteurs, une
preuve directe de l’existence d’une zone interne dense restructurée restait à apporter.32,33
29
b. Influence des conditions de construction
Un même couple de polyélectrolytes peut, selon les conditions environnementales, former
des films à croissance exponentielle ou linéaire. Il est ainsi possible d’influencer la croissance
et la structure d’un film LbL en modulant notamment la force ionique, le pH ou la
température de construction.
La force ionique joue un rôle important sur la croissance des films LbL. En effet, la
concentration en ions a un effet sur la conformation des polyélectrolytes en solution : une
faible concentration conduit à une répulsion des charges de la chaîne, et donc à une longueur
de persistance importante ; au contraire, une forte concentration permet un écrantage des
charges, permettant à la chaîne d’adopter une conformation entropiquement favorable de
pelote statistique. Des études menées sur différents systèmes LbL montrent que la
modification de la conformation des chaînes de polymères en solution est aussi responsable
d’une modification de la quantité de matière et du régime de croissance des films. Richert et
al ont montré par QCM-D qu’une diminution de la force ionique provoque une diminution de
la quantité de matière adsorbée lors de la construction de films composés de chitosan (CHI) et
d’acide hyaluronique (HA).28 Cette diminution s’accompagne d’une transition du régime de
croissance, qui passe d’une croissance exponentielle pour une concentration de 0,15 M de
NaCl à une croissance linéaire pour une concentration de 10-4 M de NaCl (Figure I-7).
Figure I-7 : Evolution des fréquences

normalisées suivies par QCM durant la
construction de films CHI/HA construits
à pH 5 dans 0,15 M (●), 10-2 M (▼) et
10-4 M (■) NaCl. CHI : chitosan ; HA :
acide hyaluronique (d’après Richert et
al.).28
Les multicouches de polyélectrolytes sont également sensibles à des modifications de

forces ioniques appliquées par post-traitement, c’est-à-dire après leur construction. Ladam et
al. ont montré qu’un film PSS/PAH construit en présence de 0,75 M de NaCl gonflait de
30
manière significative (20%) dans l’eau pure.13 Ce phénomène est induit par la disparition de
l’écrantage des charges qui provoque une réduction des répulsions intra- et intermoléculaires
dans la zone externe du film. Ce gonflement est réversible lors du retour de la force ionique à
sa valeur initiale.
Une étude réalisée par Mjahed et al.34 sur des films composés de cinquante paires de
couches PLL/HA, construits en présence de 0,15 M de NaCl, montre un gonflement de ces
films avec une augmentation de la force ionique. En plus du gonflement des films, les auteurs
ont observé la dissolution des films LbL, par fuite des polyélectrolytes consécutive au
gonflement de la multicouche, lorsqu’ils sont placés à une concentration en NaCl de 0,375 M
pendant un mois. Pour une concentration de 0,48 M, ils ont noté l’apparition de cavités
sphériques au sein de la structure LbL. Dans un deuxième temps, les auteurs ont étudié l’effet
d’une diminution de la force ionique sur ces films. Dans ce cas, les films diminuent en
épaisseur et présentent des cavités si l’écart de concentration en sel par rapport aux conditions
de construction initiales (0,15 M de NaCl) est important.
La densité de charges a également une influence sur la construction des films LbL. Dans le
cas de polyélectrolytes faibles, une variation du pH induit une modification du degré
d’ionisation et donc d’une densité de charges par chaîne. Cette modification du degré
d’ionisation a un effet comparable à celui d’une variation de la force ionique sur la
conformation des polyélectrolytes en solution. Il est donc possible de moduler l’épaisseur des
films en contrôlant le pH auquel les films multicouches sont construits. Shiratori et al.35 ont
ainsi montré que des films composés de couches de poly(acide acrylique) (PAA) et de PAH
construits dans l’eau pure ( pH ~ 7) sont lisses et ultraminces. Dans ces conditions, les chaînes
des deux polyélectrolytes sont très chargées, et adoptent une conformation très allongée du
fait des fortes répulsions électrostatiques intramoléculaires.36 De part et d’autre de cette valeur
de pH, l’une des deux chaînes voit sa densité de charges diminuer. Elle adopte donc une
conformation plus repliée, ce qui conduit à une augmentation de l’épaisseur du film.
Une étude de Choi et al. sur des polyélectrolytes en étoile montre qu’en contrôlant le pH, il
est possible de modifier le mode de croissance de films LbL.37 Des films composés de poly[2-
(diméthylamino)éthyl methacrylate] (pDMAEMA) et PAA construits à un pH situé entre les
pKa respectifs des deux polyélectrolytes sont épais et rugueux. Au contraire, si le polycation
est déposé à un pH supérieur à son pKa et le polyanion à un pH inférieur à son pKa, les films
produits sont lisses et minces. Ce phénomène s’explique par le fait que des polyélectrolytes
pris dans leur état le plus chargé (déprotoné pour les polyanions, soit pH > pKa ; protoné pour
31
les polycations, soit pH < pKa) sont dans une conformation linéaire, due aux répulsions
électrostatiques intramoléculaires.
Il est également possible de faire varier la densité de charges en modifiant la nature
chimique des polyélectrolytes. Par exemple, Steitz et al. ont étudié la formation de films
constitués de polystyrène sulfonate (PSS) et de poly(chlorure de diallyldimethylammonium)
(PDADMAC), ce dernier polyélectrolyte étant modifié par copolymérisation avec des
monomères neutres. Pour que la construction des films (PSS/PDADMAC) soit effective, la
densité de charges doit être d’au moins 70% (soit une densité d’électrons comprise entre
0,374 et 0,393 Å-3).38
La nature des contres ions joue également un rôle important dans le mécanisme de
croissance des films LbL. Les ions utilisés appartiennent habituellement à la série de
Hofmeister, ou série lyotropique, dont l’étude des interactions avec les macromolécules est
connue depuis un peu plus de cent ans.39,40 Cette série est connue pour son rôle dans de
nombreux phénomènes biologiques.41
Bien que les principes de l’effet Hofmeister ne soient pas encore connus avec précision, il
est admis qu’il est plus important dans le cas des anions que dans le cas des cations.42 Les
anions suivants sont classés en fonction de leur capacité à solubiliser des protéines
hydrophobes : ClO4- > SCN- > I- > NO3- > Br- > Cl- > CH3COO- > HCOO- > F- > OH- >
HPO42- > SO42-. Cette série peut être divisée en deux catégories, basées sur les interactions
entre les ions et l’eau : (i) les ions chaotropiques interagissent avec l’eau plus faiblement que
l’eau elle-même, (ii) les ions cosmotropiques interagissent fortement avec l’eau. Ici, l’ion Cl-
est considéré comme un point médian, les ions situés à sa gauche sont chaotropiques, les ions
à sa droite sont cosmotropiques.
Il a été démontré que ces ions influençaient la croissance et l’épaisseur des films LbL
(Figure I-8). Salomäki et al. ont observé une influence de la nature des anions monovalents
sur l’épaisseur et le mécanisme de croissance de films (PSS/PDADMAC).43 Les auteurs
expliquent ce phénomène par le fait que les anions chaotropiques écrantent fortement les
charges des polyélectrolytes, ces derniers adoptant alors une conformation repliée et
conduisent à la formation de films épais et à croissance exponentielle. Un phénomène
comparable a été étudié par Buron et al., sur des films (MADQUAT/PAA), en faisant varier
la nature du cation monovalent.44
32
A B
Figure I-8 : (A) Influence de la nature des anions monovalents de sels de sodium à une
concentration de 0,1 M sur la croissance et l’épaisseur de films LbL (PSS/PDADMAC),
suivies par ellipsométrie (d’après Salomäki et al.)43 et (B) influence de la nature de cations
monovalents de sels de chlorure à une concentration de 10-3 M sur la croissance et
l’épaisseur de films (MADQUAT/PAA), suivies par réflectométrie à angle fixe (d’après Buron
et al.).44
c. Films LbL biomimétiques

Les premières études portant sur les films LbL ont été menées avec des polyélectrolytes
synthétiques, tels que PSS et PAH. La nature polyélectrolytique de nombreuses
macromolécules biologiques (polysaccharides,28 protéines,45 acides nucléiques46) en font des
composés éligibles à la construction de ce type de films. De tels films ont été étudiés,
notamment en vue d’améliorer l’intégration de matériaux implantables au sein de tissus hôtes.
Parmi les biopolymères disponibles pour la construction de multicouches, le chitosan, un
polysaccharide dérivé de la chitine présente dans la carapace des arthropodes, est souvent
utilisé comme polycation. On le retrouve associé à d’autres polysaccharides, 47 ou à des
protéines, comme la gélatine.48
Cependant, afin de mimer le microenvironnement des cellules, il est préférable d’utiliser
des biopolymères naturellement présents dans les matrices extracellulaires (MEC). Dans ce
sens, les glycosaminoglycanes (GAG) sont particulièrement intéressants. Ce sont des
polysaccharides très abondants des MEC animales. Ils sont associés à des protéines pour
former les protéoglycanes. Les GAG ont un rôle structural dans les tissus. Par exemple, le fort
taux d’hydratation de la chondroïtine sulfate A, ou chondroïtine-4-sulfate (CSA), un GAG
trouvé en très grande quantité dans les cartilages,49 lui confère des propriétés de résistance aux
chocs. En plus de leur rôle de soutien des tissus, les GAG sont connus pour servir de
réservoirs de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont relargués soit lors de
dégradations locales de la MEC, soit par lyse enzymatique s’ils sont liés de manière covalente
33
aux GAG. Enfin, la présence de récepteurs de GAG sur les membranes cellulaires (annexines
VI, CD44) permet aux cellules d’adhérer à leur MEC. Les interactions GAG/récepteur
permettent d’activer des voies de signalisation qui conduisent à une modulation des
comportements cellulaires. La PLL est un polymère de lysine, souvent utilisée comme
polycation également pour la construction de films LbL. La lysine est un acide aminé
impliqué dans les interactions entre les GAGs et les protéines.50
d. Le système (CSA/PLL)
Dans le cadre de ce projet doctoral, nous avons choisi de travailler avec le système LbL
composé de (CSA) et de (PLL). Ce système a été préalablement étudié au laboratoire, lors du
travail de thèse de Khalil Abdelkebir, qui en a décrit le mécanisme de croissance et la
structure. Durant les premiers mois de mon projet, j’ai participé à certains de ces travaux.
La CSA est un GAG linéaire de haut poids moléculaire composé d’un enchaînement
d’unités disaccharidiques D-glucuronique-β-1,3-N-acétylgalactosamine-4-sulfate, liées entre
elles par une liaison β-1,4. Les chondroïtines sulfate (CS) sont des GAGs ubiquitaires, qui
font partie des composants majeurs des matrices extracellulaires (MEC) des tissus osseux et
cartilagineux, ainsi que d’autres tissus conjonctifs. On les rencontre notamment dans les
décorines et les biglycanes, deux protéoglycanes majeurs du tissu osseux.51 De par leur
capacité à lier les facteurs de croissance, elles peuvent être utilisées comme des réservoirs, en
vu de relargage moléculaire in situ.52
La PLL est un polypeptide cationique, connue entre autre pour favoriser l’adhésion
cellulaire, via des interactions électrostatiques avec les membranes cellulaires dont la charge
globale est négative à pH physiologique.
Des complexes (CS/PLL) ont été étudiés, soit en solution, soit sous forme de films LbL.
Les films (CS/PLL) ont notamment été utilisés comme substrats pour des cellules
photoréceptrices,53 endothéliales54 et plus récemment, des ostéoblastes.55
Au cours de travaux antérieurs au sein du laboratoire, la croissance et la structure de films
(CSA/PLL) ont été décrites par la combinaison de différentes techniques d’analyse
classiquement utilisées pour l’étude de films LbL : microbalance à quartz avec contrôle de la
dissipation (QCM-D), spectroscopie par guide d’onde optique (OWLS), spectroscopie
infrarouge à transformée de Fourrier en mode de réflexion totale atténuée (FTIR-ATR) et
microscopie à force atomique (AFM).30
34
L’étude du mécanisme de croissance par OWLS (technique de spectroscopie optique)
d’une part, et QCM-D (méthode électroacoustique) d’autre part a notamment révélé une
apparente contradiction, en détectant des régimes de croissance linéaire et exponentielle,
respectivement (Figure I-9).
Il faut noter cependant que ces deux techniques, souvent utilisées en combinaison lors de
l’étude de la croissance de films LbL, apportent des informations différentes : la QCM-D
permet d’étudier la masse hydratée totale du dépôt, c'est-à-dire la matière adsorbée et l’eau
liée au dépôt, par opposition à l’OWLS qui ne renseigne que sur l’évolution de la matière dite
« sèche » constituée de la matière déposée.
A B
Figure I-9 : Évolution (A) de l’épaisseur et de la masse adsorbée suivies par QCM-D et (B)
de l’épaisseur suivie par OWLS pour des films PEI/(CSA/PLL)6 en fonction du nombre de
couches.
Une analyse de la croissance des films PEI/(CSA/PLL)6 par FTIR-ATR, sur des films
séchés après chaque cycle d’adsorption, a permis de montrer que la quantité de matière
augmentait de façon superlinéaire avec le nombre de couches adsorbées (Figure I-10).
Il a par ailleurs été observé par AFM, lors de ces travaux, la présence d’îlots de matière à la
surface des films (CSA/PLL). Tezcaner et al. ont également observé ces îlots à la surface de
films composés de 10 paires de couches.53
35
A B
Figure I-10 : (A) Spectres de référence des

polyélectrolytes et suivi étape par étape de la
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)12, par
FTIR-ATR. (B) Évolution de l’absorbance
moyenne de trois pics spécifiques (situés à
1644 (●), 1053 (■) et 1246 cm-1(▲)) des
polyélectrolytes lors de la construction de
films PEI/(CSA/PLL)6/CSA.
La combinaison de ces différentes techniques d’analyse a permis de conclure à la

coexistence de deux zones distinctes au sein des films (Figure I-11) : (i) une zone interne
dense, dont la croissance est linéaire et (ii) une zone externe diffuse, dont la croissance est
superlinéaire. D’après cette hypothèse, la zone externe est « invisible » à l’OWLS, cette
technique ne permettant de sonder uniquement la zone dense. Au contraire, la QCM-D permet
d’analyser la masse totale du film.
Figure I-11 : Modèle structural proposé pour les films PEI/(CSA/PLL)6, basé sur la QCM-D,
l’OWLS, le FTIR-ATR et l’AFM (d’après Abdelkebir et al.).30
36
I.B.4 Fonctionnalisation des films LbL
a. Réticulation des films LbL
Les films LbL biomimétiques sont des outils prometteurs pour la fonctionnalisation de
surfaces à finalité biomédicale. Cependant, ces films, basés la plupart du temps sur des
interactions faibles, de type électrostatique, sont sensibles à des stimuli chimiques, comme des
variations de pH et de force ionique, ou encore mécaniques. De plus, leur structure très
hydratée empêche souvent leur colonisation par les cellules, ce qui limite les applications
biologiques.
Depuis quelques années, des travaux ont été menés sur la réticulation en vue d’améliorer
leur stabilité en milieu environnant, et également de moduler leurs propriétés mécaniques
intrinsèques. La réticulation par voie chimique consiste en la création de liaisons covalentes
entre les différents composants des films, à l’aide d’un agent réticulant.
Plusieurs agents réticulants ont été utilisés pour la réticulation de films LbL. En 1996,
Brynda et al. ont réticulé un film composé d’héparane et d’albumine sérique humaine par
action de glutaraldéhyde.56 Ils ont noté une augmentation de la stabilité du système en milieu
physiologique. Par la suite, plusieurs études ont montré l’efficacité de la réticulation de films
LbL via la chimie des carbodiimides, qui permet le couplage de groupements carboxyliques et
amines primaires, par la formation d’une liaison amide. Le carbodiimide utilisé dans ces
études ([1-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl)carbodiimide], EDC) est un agent réticulant de
longueur zéro, ce qui signifie qu’il n’y a pas de greffage d’espaceur entre les deux polymères,
et qu’il couple directement les deux fonctions ciblées. Ce protocole, faisant intervenir le
couple EDC/N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) peut être appliqué à de nombreux couples de
polyélectrolytes, pourvu que ces derniers possèdent des groupements carboxyliques et amines.
Richert et al. ont montré que la réticulation des films (PLL/HA) les rendaient plus résistants
aux dégradations enzymatiques, physico-chimiques ou mécaniques.57
Boudou et al. ont montré que la réticulation avait un impact important sur les propriétés
mécaniques des films (PLL/HA) et qu’il était possible de faire varier leur module élastique,
entre 10 kPa et 400 kPa, en utilisant des solutions d’EDC à des concentrations différentes. 58
Cet aspect est très important dans le cas de films utilisés pour des applications biologiques. En
effet, les films (PLL/HA) sont très mous, car très hydratés, et ne permettent donc pas une
adhésion cellulaire suffisante. Plusieurs études ont montré un effet favorable de la réticulation
sur l’adhésion cellulaire.53,58
Récemment, Phelps et al. ont étudié la possibilité de réticulation localisée de films LbL
composés de polypeptides (PLL/PGA), par EDC/NHS, sans modifier la structure interne des
37
films. Pour cela, ils ont utilisé pour la dernière couche formée du PGA activé via le NHS, ils
ont ainsi obtenu une augmentation de l’adhésion cellulaire, par rapport à des films non
réticulés.59
Néanmoins, ces agents réticulants conventionnels peuvent présenter une cytotoxicité
élevée, s’ils se trouvent relargués dans les milieux de culture. En cela, la génipine (GnP), un
produit extrait du fruit de Gardenia jasminoides, constitue une alternative intéressante. La
GnP a été utilisée pour la réticulation de protéines et de différents systèmes à base de
polymères. Bien que le mécanisme de réticulation par la GnP ne soit pas clairement défini, il
est admis que c’est un réticulant bifonctionnel.60,61
L’utilisation de cet agent réticulant a montré des effets bénéfiques, notamment une
diminution des processus inflammatoires et une augmentation de l’adhésion de fibroblastes.
Ce n’est que récemment, et dans un nombre limité de travaux, que la GnP a été utilisée pour
la réticulation de films LbL. Hillberg et al. ont étudié son action sur des films (CHI/HA) et
(CHI/ALG), à croissance respectivement exponentielle et linéaire. 62 Ils ont rapporté une
modification de la mouillabilité et de la rugosité des films, suite à l’action de la GnP.
Cependant, alors que la réticulation des films (CHI/ALG) a un effet promoteur sur l’adhésion
cellulaire, le système (CHI/HA), plus mou, semble toujours défavorable aux cellules, même
après réticulation. La GnP a également été étudiée par Chaubaroux et al. sur des systèmes
composés de collagène et d’alginate (COL/ALG).63 Les auteurs ont montré une amélioration
de la stabilité des films lors de variations de pH, ainsi qu’un effet favorable sur l’adhésion et
la prolifération cellulaire.
Il est intéressant de noter que la GnP ne peut réagir qu’avec les groupements amines
primaires. La structure ainsi obtenue est un réseau semi-interpénétré (semi-RIP) formé d’un
réseau, constitué du polyélectrolyte portant des amines, dans lequel les chaînes de l’autre
polyélectrolyte resteraient libres.
b. Fonctionnalisation de films LbL par des composés bioactifs

Plusieurs études rapportent l’insertion de composés bioactifs au sein des films LbL. Ces
films peuvent être fonctionnalisés par de nombreuses molécules afin de leur conférer des
propriétés bioactives, telles que des macromolécules d’origine biologique (protéines, acides
nucléiques, glycosaminoglycanes), ou des médicaments.
38
Macromolécules d’origine biologique.
La fonctionnalisation de films LbL par des protéines ou des peptides peut avoir plusieurs
objectifs : (i) favoriser l’adhésion cellulaire, par l’utilisation de protéines matricielles ou de
séquences protéiques intervenant dans les interactions cellules-MEC et (ii) moduler les
comportements cellulaires, grâce à des protéines régulant les processus cellulaires in vivo
(facteurs de croissance, cytokines ou hormones).
Un intérêt majeur de l’utilisation de films LbL pour l’immobilisation de macromolécules
est que ce type d’architecture permet de conserver la structure native, et donc la bioactivité,
préservant les interactions avec les cellules. Il a ainsi été montré que la structure secondaire de
protéines insérées dans des architectures LbL était conservée.64 Il a également été démontré
que des immunoglobulines G (IgG) enfouies sous un petit nombre de couches conservaient
leur capacité d’interaction avec leurs antigènes, montrant par là qu’elles avaient gardé leur
structure et leur conformation malgré leur incorporation.65 De plus, Derbal et al. ont démontré
que la phosphatase alcaline adsorbée à la surface ou insérée dans des films (PLL/PGA)
gardait non seulement sa structure, mais aussi son activité enzymatique, même à long terme.66
Wittmer et al. ont montré, sur des cellules hépatiques, qu’une simple adsorption de
fibronectine sur des films LbL composés de 3 paires de couches PLL et de sulfate de dextrane
(DS) permettait une meilleure adhésion, ainsi qu’un meilleur étalement cellulaire, par rapport
aux films sans fibronectine.67 De manière à favoriser l’adhésion cellulaire, différents travaux
ont porté sur la modification de polyélectrolytes par une séquence peptidique intervenant dans
l’adhésion cellulaire via les intégrines, le RGD (Arginine – Glycine – Acide aspartique).
Picart et al. ont greffé de manière covalente cette séquence sur des chaînes de PGA qu’ils ont
utilisées comme dernière couche sur des films (PLL/PGA). 68 L’adhésion d’ostéoblastes
cultivés sur ces films a ainsi été significativement améliorée. Berg et al rapportent des
résultats comparables sur des films (PAH/PAA), dont la dernière couche est constituée de
chaînes de PAH couplées avec le peptide RGD.69
Un autre enjeu de la fonctionnalisation des films LbL par des protéines ou des peptides est
la modulation des comportements à plus long terme. Pour cela, les facteurs de croissance sont
les bio-macromolécules les plus couramment utilisées. De nombreuses études rapportent les
effets promoteurs de films LbL ainsi fonctionnalisés sur la différenciation cellulaire. 70 Ces
architectures offrent en outre la possibilité de cibler spécifiquement certains types cellulaires
ou tissus. Par exemple, sur des films (PLL/CSA), l’immobilisation de FGF (Fibroblast
Growth Factor) permet une augmentation de l’attachement de cellules photoréceptrices d’œil
de porc.53 Crouzier et al. ont montré, sur des films (PLL/PGA), qu’il était possible d’induire
39
la transdifférenciation de cellules musculaires (C2C12) en ostéoblastes, grâce à
l’immobilisation de la BMP2 (Bone Morphogenic Protein 2). 71 Les auteurs ont également
démontré la bonne stabilité de leur système fonctionnalisé par la BMP2, puisque l’effet sur les
cellules a été observé sur trois cultures successives. Plus récemment, une étude in vivo menée
sur des rats, a permis d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants en alliage de titane
(TA6V) fonctionnalisés par des films multicouches (PLL/HA) chargés en BMP2.72 Placés
entre l’aponévrose et le muscle des rats, ces implants ont conduit à la formation d’une matrice
osseuse.
Les acides nucléiques sont une autre classe de bio-macromolécules qui ont fait l’objet
d’études sur leur incorporation au sein de films LbL. Par exemple, l’ADN, chargé
négativement, peut être utilisé comme un polyanion. La construction de films LbL basée sur
l’alternance d’un polycation, en l’occurrence la PLL, et de l’ADN a été rapportée par
Sukhorukov et al..46 L’intérêt de telles constructions est de permettre la transfection des
cellules cultivées à leur surface.73 De plus, Ren et al. ont montré que l’association de l’ADN
avec la PLL par le glutaraldéhyde, au sein d’architectures LbL augmentait la stabilité de
l’ADN en le protégeant notamment de la dégradation enzymatique par les
désoxyribonucléases (DNases) produites par les cellules. Ces résultats prometteurs laissent
envisager l’utilisation d’architectures LbL ADN/polycations sous forme de films73 ou de
capsules74 pour des applications diverses en ingénierie tissulaire ou dans le domaine
biomédical.
Médicaments et petites molécules

Outre les bio-macromolécules, différentes petites molécules bioactives peuvent être
incorporées dans des films LbL.
Le paclitaxel (Taxol), un anticancéreux, a été incorporé avec succès au sein de films LbL
(PLL/HA).75 Une barrière, constituée d’une paire de couches de polymères synthétiques
(PSS/PAH) a permis dans ce cas d’éviter un relargage précoce du médicament, et de favoriser
une bonne adhésion cellulaire. Des antibiotiques peuvent également être incorporés dans des
films LbL,76 ainsi que des anti-inflammatoires, comme le diclofenac de sodium.77
Cependant, des dépôts de médicaments par voie aqueuse ne permettent pas nécessairement
l’insertion de composés hydrophobes dans les films LbL, d’autant plus qu’ils ne possèdent
pas de charge. De plus, 85% des médicaments ayant reçu l’agrément de la FDA (Food and
Drug Administration) entre 1981 et 2002 sont peu solubles dans l’eau.78 Une des voies
envisagées pour parvenir à les incorporer efficacement est l’utilisation de cyclodextrines et de
40
leurs dérivés (polymères, dérivés anioniques ou cationiques). La complexation de molécules
hydrophobes avec les cyclodextrines permet d’augmenter de manière significative leur
solubilité dans l’eau.
Des architectures basées sur des dépôts alternés de polymères de cyclodextrines (CD)
anioniques avec un polycation permettent non seulement d’immobiliser des composés
hydrophobes dans des architectures LbL, mais aussi de contrôler leur relargage. Par exemple,
une étude menée par Smith et al. sur des films LbL composés d’un polycation dégradable
(poly(β-amino esters)) et un polymère anionique de cyclodextrines permet un relargage de
différents médicaments (flurbiprofène et diclofenac) sur une durée de 25 jours.79 D’autre part,
Tabary et al. ont montré qu’il était possible de contrôler la cinétique de relargage d’un
composé hydrophobe modèle (le bleu de méthylène) vectorisé par un polymère de CD, en
modulant l’épaisseur du film LbL.80
Ce type de fonctionnalisation a montré des effets prometteurs sur les cellules cultivées sur
les films traités. Par exemple, l’insertion d’un complexe β-cyclodextrine/piroxicam (un anti-
inflammatoire non stéroïdien) a permis d’induire une réponse cellulaire, dans un délai
dépendant de la profondeur à laquelle se trouve la couche de complexe dans le film.81
Une étude in vivo sur des films LbL composés de films (PLL/PGA) sur lesquels sont
rajoutés trois ou six paires de couches de PGA et de PLL couplé de manière covalente à une
β-cyclodextrine a montré un effet curatif et préventif d’un anticancéreux ainsi vectorisé, le
risedronate, sur des souris présentant des tumeurs osseuses.82 Dans ce cas, le composé actif
n’a pas été incorporé (ou pas seulement) dans les cavités des cyclodextrines sous la forme de
complexes d’inclusion, mais semblait porté par leurs couronnes hydroxylées, via des liaisons
hydrogènes.
Contrôle du relargage
Les composés thérapeutiques n’ont d’intérêt que s’ils sont accessibles aux cellules
cultivées sur les films dans lesquels ils sont incorporés. Il existe plusieurs mécanismes
responsables du relargage de composés thérapeutiques par les films LbL (Figure I-12) : par
diffusion vers le milieu dans lequel est immergé le film, par dégradation partielle ou totale de
l’architecture (par hydrolyse ou dégradation enzymatique), ou par un stimulus
environnemental (variation du pH, de la force ionique, de la température…).83
41
Figure I-12 : Mécanismes de relargage de composés bioactifs par des films LbL : par
diffusion passive, dégradation du film ou en réponse à un signal extérieur (pH, force ionique,
température…) (d’après Pavlukhina et al.).83
La microstructure des films permet de contrôler la cinétique de relargage des composés

vers le milieu dans lequel ils sont immergés. Sur des films dont la porosité est contrôlée,84 il a
été démontré qu’il était possible de moduler la vitesse de relargage de ketoprofène et de
cytochalasine D.85 De plus, les quantités de médicaments insérées sont contrôlables en variant
le nombre de couches poreuses au sein de l’architecture. Comme nous l’avons vu
précédemment, les cyclodextrines sont également un moyen de contrôler les cinétiques de
relargage de composés hydrophobes. Martin et al. ont étudié la cinétique de relargage de
l’acide 4-tert-butylbenzoïque (TBBA), utilisé comme modèle.86 Les auteurs ont montré qu’en
utilisant des films composés de chitosan et d’un polymère de β-cyclodextrine anionique de 10,
16 et 20 paires de couches, la totalité du TBBA était relarguée en 7, 14 et 27 jours
respectivement.
La dégradation des films peut également être envisagée pour rendre les composés actifs
accessibles aux cellules. Les cellules elles-mêmes sont susceptibles de produire en éventail
d’enzymes qui peuvent dégrader lentement les architectures LbL. Par exemple, Jessel et al.
ont montré que la protéine A, une protéine pro-inflammatoire, n’avait pas la possibilité de
diffuser à travers l’architecture LbL quand elle était incluse dans des films polypeptidiques
(PLL/PGA).87 Leurs résultats ont pourtant montré que les cellules cultivées sur ces films
42
produisaient du TNF-α (Tumor Necrosis Factor), indiquant leur interaction avec la protéine A.
Les auteurs ont noté une dégradation locale des films, certainement due à l’action d’enzymes
protéolytiques. Un autre exemple de dégradation enzymatique de films LbL fait intervenir une
DNase.88 Son action hydrolytique sur des films (ADN/poly(chlorure de
diallyldiméthylammonium)), qui nécessite la présence de cations divalents Mg2+ et Ca2+,
permet la dégradation des films, ouvrant ainsi la voie au relargage de composés bioactifs
préalablement insérés dans l’architecture.
Une alternative à la dégradation enzymatique des films LbL est l’utilisation de
polyélectrolytes modifiés chimiquement, de façon à les rendre hydrolysables. Une telle
approche permet un contrôle du désassemblage des films sur des temps longs (jours). Zhang
et al. ont ainsi utilisé des polyamines contenant des groupements esters hydrolysables. 89 Le
temps nécessaire à la dégradation complète des films a pu être modulé de 2 à 14 jours.
Il est possible d’imaginer des systèmes combinant plusieurs mécanismes de délivrance.
Dans leur étude, Smith et al. ont fabriqué des films basés sur l’alternance de polymères de
cyclodextrines anioniques et de polycations hydrolysables.79 Cette combinaison permet de
vectoriser des composés hydrophobes, tout en contrôlant finement la cinétique de relargage.
La littérature rapporte également des études concernant le relargage de composés actifs

dépendant de variations environnementales, telles que des variations de pH,90 de force
ionique91 ou de température.92
D’une manière intéressante, Abdelkebir et al. rapportent le cas d’un système LbL
(CSA/PLL) qui, lorsqu’il est mis au contact d’une phosphoprotéine, la phosvitine (PhV), est
presque totalement dégradé.93 Il s’agit là d’un mode original de dégradation, induite par la
mise en contact du film avec une protéine non-enzymatique. Cette déstructuration basée sur
une interaction plus forte de la PLL avec la PhV qu’avec la CSA, permet d’imaginer des
systèmes LbL biomimétiques, pouvant, en présence de protéines spécifiques, être dégradés et
relarguer des composés actifs.
I.C Le tissu osseux

Le tissu osseux est un tissu conjonctif minéralisé constitué d’une phase minérale et d’une
matrice organique, qui représentent respectivement 70% et 30% du poids sec. C’est cette
composition qui lui confère ses propriétés mécaniques originales. L’eau représente 25% de la
masse osseuse. C’est un tissu innervé et vascularisé qui assure quatre fonctions majeures :
43
 biomécanique : en tant que support mécanique du squelette, c’est lui qui assure la
locomotion.
 protectrice : il assure un rôle de protection de certains organes vitaux, comme ceux
contenus dans la cage thoracique ou le cerveau
 métabolique : il sert de réservoir pour certains sels minéraux, jouant notamment un
rôle important dans le métabolisme phosphocalcique.
 hématopoïétique : il est le siège principal de l’hématopoïèse, c'est-à-dire la création et
le renouvellement des cellules sanguines, qui se fait dans la moelle osseuse.
I.C.1 La matrice extracellulaire (MEC) osseuse

Dans le tissu osseux, la MEC comporte une phase organique et une phase minérale.
a. La phase organique
La matrice organique osseuse, également appelée ostéoïde, est composée à 90% de fibres
de collagène (dont 97% de type I et 3% de type V). Le reste de l’ostéoïde est constitué de
protéines non fibreuses et de protéoglycanes.94
 Les collagènes : ce sont des protéines structurales, qui assurent le soutien mécanique
du tissu osseux. Elles sont assemblées sous forme de fibres, constituées de l’association de
trois chaînes polypeptidiques en hélice gauche α, formant le tropocollagène, l’unité de base
des fibres de collagène. Ces fibres forment un réseau qui permet la fixation de
l’hydroxyapatite (HAp), et donc la minéralisation du tissu.
 Les protéoglycanes : Ils sont composés d’un axe protéique auquel sont liés des GAGs,
formant une structure dite en « peigne ». Dans l’os, les protéoglycanes majoritaires sont les
décorines et les biglycanes. Liés au collagène de type I, ils participent à l’assemblage de la
matrice osseuse. Les GAGs sont des polysaccharides composés d’unités disaccharidiques
sulfatées et/ou carboxylées répétées. Ce sont des composés très hydrophiles, chaque unité
disaccharidique pouvant être entourée de 30 molécules d’eau, qui présentent une forte affinité
pour les cations, de part leur nature anionique, mais aussi pour les facteurs de croissance. Les
plus représentés dans le tissu osseux sont les chondroïtines sulfate et les kératanes sulfate. Les
protéoglycanes ont deux rôles majeurs dans la MEC osseuse, du fait de leur forte capacité à
retenir l’eau : ils confèrent à l’os ses propriétés viscoélastiques et permettent le passage de
nutriments, hormones et métabolites du sang vers les cellules osseuses. Comme dans d’autres
tissus conjonctifs, ils servent aussi de réservoir aux facteurs de croissance.
44
 Les sialoprotéines osseuses : ces protéines contiennent le motif RGD et interviennent
donc dans l’adhésion des cellules à la MEC, via les intégrines.95 La sialoprotéine osseuse II
(BSPII) est exprimée à la fois par les ostéoblastes et les ostéoclastes (voir section suivante).
 L’ostéopontine : cette protéine intervient également dans la résorption osseuse, en
permettant un ancrage des ostéoclastes à la MEC.
 L’ostéocalcine et l’ostéonectine : ce sont deux glycoprotéines ayant une forte affinité
pour l’hydroxyapatite. De par le fait, elles jouent un rôle majeur dans la minéralisation de
MEC osseuse. 96,97 L’ostéocalcine joue également un rôle de régulateur des ostéoblastes et de
la minéralisation.
b. La phase minérale
La phase minérale de la MEC osseuse assure la dureté et la rigidité du tissu. Elle est
constituée de nanocristaux plats d’HAP de 30-50 nm de long, 20-25 nm de large et 1,5-4 nm
d’épaisseur. Sa formule pure est Ca5(PO4)3(OH), correspondant à un ratio Ca/P de 1,67.
Cependant, la structure de l’HAP osseuse se caractérise par de nombreuses lacunes
(hydroxyles) ou substitutions (carbonates, fluor, calcium, magnésium).98 Divers phosphates de
calcium peuvent également intervenir au cours des processus de biominéralisation in vivo ou
in vitro, ou lors de divers processus de préparation de phosphate de calcium à destination
d'applications biomédicales. Notamment, le phosphate de calcium amorphe et le phosphate
octacalcique ont été décrits comme des phases précurseurs dans la formation de l’HAP au sein
des tissus minéralisés.99
I.C.2 Les cellules osseuses

Les cellules osseuses proviennent principalement de deux lignées : d’une part les
ostéoclastes (cellules ostéorésorbantes), et d’autre part les ostéoblastes, les ostéocytes et les
cellules bordantes (cellules ostéoformatrices) (Figure I-13).
45
Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses (d’après
http://www.imperialendo.com/for-patients/endocrine-services/metabolic-bone-and-
parathyroid-disorders).
a. Lignée ostéoformatrice
 Les ostéoblastes : ces cellules proviennent de la différenciation de cellules stromales
de la moelle osseuse. Elles font partie, avec les ostéocytes et les cellules bordantes, des
cellules dites ostéoformatrices. Elles sécrètent de nombreux composants de la phase
organique de la MEC osseuse et participent au contrôle de sa calcification. Au sein du tissu,
elles communiquent entre elles et avec les ostéocytes via des jonctions communicantes. Elles
interviennent indirectement dans la résorption osseuse, en contrôlant l’activité des
ostéoclastes.100 Au cours de la maturation du tissu osseux, c'est-à-dire sa minéralisation, leur
activité diminue et elles peuvent se différencier en ostéocytes et s’entourer de matrice
minéralisée, rentrer en quiescence sous la forme de cellules bordantes, ou mourir par
apoptose.
 Les ostéocytes : ce sont des ostéoblastes différenciés. Ils sont situés dans des niches,
ou ostéoplastes, et totalement entourés de matrice minéralisée. Toutefois, des extensions
passant par un réseau de canicules leur permettent à la fois de communiquer avec les autres
cellules osseuses, notamment les ostéoblastes et les cellules bordantes, et aussi de se nourrir,
via les vaisseaux sanguins qui parcourent le tissu osseux.
 Les cellules bordantes : ce sont des ostéoblastes quiescents, c'est-à-dire n’ayant plus
d’activité métabolique, contrairement aux ostéoblastes. Ces cellules se trouvent, entre autre, à
la périphérie des lacunes formées par l’action des ostéoclastes. Elles interagissent entre elles
46
et avec les ostéocytes par des jonctions communicantes. Elles peuvent redevenir des
ostéoblastes actifs lorsqu’elles sont stimulées.101
b. La lignée ostéorésorbante
Les ostéoclastes sont les seules cellules de cette lignée. Ce sont des cellules dérivées de la
lignée hématopoïétique monocytaire.102 Au cours de leur différenciation, les cellules de cette
lignée deviennent des cellules géantes polynucléées (entre 10 et 20 noyaux). Elles sont très
mobiles et se déplacent le long des travées osseuses d’un site de résorption à un autre. Lors de
leur activation, ces cellules se polarisent et développent, au contact de la surface de l’os une
bordure en brosse, entourée d’un anneau de jonction membrane-MEC. Elles sécrètent alors de
l’acide et des enzymes protéolytiques qui dégradent localement l’os. Ce faisant, elles forment
des lacunes de résorption, appelées lacunes de Howship.
I.C.3 Le remodelage osseux

Le tissu osseux est un tissu dynamique, en perpétuel remaniement. Ce phénomène permet
de maintenir les propriétés mécaniques de l’os, et de réguler le métabolisme phosphocalcique.
Il est le résultat de la coopération des cellules de la lignée ostéorésorbante qui dégrade l’os
vieux, et de la lignée ostéoformatrice, qui va synthétiser une nouvelle matrice.103,104
Chez l’être humain adulte, le renouvellement complet du squelette prend environ 10 ans et
se déroule en cinq étapes (Figure I-14).105
Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux (d’après Funck-Brentano et al.).105
47
Le remodelage débute par une phase d’activation, caractérisée par la rétractation des
cellules bordantes tapissant l’os, ce qui permet le passage des ostéoclastes, qui peuvent alors
accéder à l’os et entamer le processus d’ostéolyse.
Après cette étape d’activation, les ostéoclastes adhèrent à la MEC osseuse, via des
récepteurs membranaires, et forment l’anneau de jonction qui délimite la lacune de Howship.
Cette adhésion fait intervenir d’une part des protéines de la matrice osseuse, notamment
l’ostéopontine, les sialoprotéines osseuses et le collagène de type I, et d’autre part des
récepteurs membranaires de type intégrines. La résorption de la matrice se déroule en deux
étapes : (i) la dissolution de la phase minérale, par la sécrétion d’acides par l’ostéoclaste et (ii)
la dégradation de la matrice organique par des enzymes protéolytiques.
À la fin de cette étape de résorption, les ostéoclastes meurent par apoptose et laissent la
place à des macrophages qui lissent le fond de la lacune. C’est la phase d’inversion.
Intervient alors une étape de formation d’un nouveau tissu osseux. Cette étape est liée à
l’activation des ostéoblastes. Les cellules ostéoprogénitrices présentes au fond de la lacune
prolifèrent et se différencient en ostéoblastes. Ce sont ces cellules, qui se caractérisent par un
haut niveau de sécrétion protéique, et synthétisent la nouvelle MEC. Cette matrice néoformée,
appelée ostéoïde, comble la lacune. Elles sécrètent également de nombreux facteurs de
croissance, dont les BMP, le FGF2, le TGFβ et l’IGF, qui sont stockés dans la MEC. 106 Ces
facteurs de croissance jouent un rôle essentiel dans l’ostéogénèse, en permettant le
recrutement, la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et de leurs précurseurs. La
minéralisation de cette matrice néoformée intervient dans un second temps. Les ostéoblastes
synthétisent, lors des étapes précoces de leur différenciation, un haut niveau de phosphatase
alcaline (couramment utilisé comme marqueur de leur différenciation précoce). Ces cellules
produisent également des vésicules extracellulaires organite-matrice, qui sont des structures
impliquées dans la formation et la nucléation des cristaux de phosphate de calcium.107,108
La dernière étape du remodelage osseux est l’entrée des ostéoblastes non différenciés en
ostéocytes, et des ostéoblastes qui ne sont pas morts par apoptose, dans une phase de
quiescence qui se caractérise par la présence de cellules bordantes à la surface du tissu osseux.
C’est ce tapis cellulaire qui fait office de barrière et empêche les ostéoclastes d’accéder au
tissu osseux.
48
I.D Interactions cellules-matériaux
La biocompatibilité d’un matériau est intimement liée à la capacité qu’ont les cellules d’y
adhérer et d’y entamer des processus cellulaires comme la prolifération ou la différenciation.
Les caractéristiques des matériaux, en surface (chimie, énergie ou topographie) ou en masse
(propriétés mécaniques) peuvent influencer ces comportements cellulaires à plus ou moins
long terme. Cette influence, notamment des propriétés de surface des matériaux, peut
conditionner la façon dont va répondre le tissu hôte ou l’organisme à l’implant, d’où la
nécessité d’adapter ces propriétés à celles du tissu hôte, lors de l’optimisation ou la
conception de biomatériaux.
I.D.1 Influence de la chimie de surface

La chimie de surface d’un matériau est un paramètre clef dans les interactions cellules-
matériaux. Elle peut être modifiée afin de favoriser l’adhésion et l’étalement des cellules. Il
existe de nombreuses façons de modifier la chimie de surface. Les SAMs notamment offrent
la possibilité de modifier le groupement chimique terminal,109 permettant d’étudier leur
influence sur les comportements cellulaires. Par exemple, il est possible de moduler
l’hydrophobicité d’un matériau en fonctionnalisant sa surface par des groupements méthyle
(-CH3) ou hydroxyle (-OH), qui sont respectivement des groupements hydrophobes et
hydrophiles. En règle générale, l’adhésion cellulaire est favorisée sur des matériaux
hydrophiles.110 Ruardy et al. ont montré que les capacités d’étalement de fibroblastes
augmentaient avec l’hydrophilie, sur des matériaux présentant en surface un gradient
d’hydrophobie.111
Il est également possible, en faisant varier les groupements chimiques à la surface, de faire
varier la charge électrique d’un matériau. Par exemple, des groupements carboxyliques
(-COOH) donnent, à pH physiologique, une surface chargée négativement, alors que des
groupements amine primaire (-NH2) donneront une charge positive. Ce paramètre a également
une influence sur le comportement des cellules, notamment sur leur morphologie. Une surface
chargée positivement favorise l’étalement cellulaire, au point que, sur des ostéoblastes issus
de calvaria de rat nouveaux-nés, la membrane au contact du substrat ne peut être distinguée de
la surface par microscopie électronique à transmission. Sur des substrats chargés
négativement, la membrane est à nouveau visible, et quelques points focaux d’adhésion avec
la surface ont été observés.112 Il est à noter que les matériaux qui limitent l’adhésion et
l’étalement des cellules conditionnent défavorablement le devenir des cellules. En effet, des
49
cellules endothéliales cultivées sur un support conçu pour limiter leur étalement voient leur
survie limitée.113
Cependant, dans des conditions physiologiques, l’adhésion des cellules intervient toujours
après l’adsorption des protéines sur la surface. Cette étape, elle-même conditionnée par la
chimie de surface, en termes de quantité et de conformation, peut fortement influencer les
comportements cellulaires. Par exemple, des fibroblastes cultivés sur des surfaces présentant
des quantités variables de groupements hydrophiles non chargés et de groupements
hydrophobes sont incapables d’y adhérer et meurent. Par contre, si de la fibronectine, une
glycoprotéine matricielle, est adsorbée préalablement, les cellules retrouvent leur capacité
d’adhésion et d’étalement, du fait de la présence de séquences RGD, spécifiquement reconnue
par les intégrines exprimées à la surface des cellules, dans la structure de la protéine.
I.D.2 Influence des paramètres physiques du matériau

a. Topographie
Les premières études concernant l’impact de la rugosité des matériaux sur les
comportements cellulaires font intervenir des surfaces dont la rugosité est de l’ordre du
micromètre. Cependant, lors de ces études, les procédés utilisés entraînent des modifications
de la morphologie globale ou de la chimie de surface des matériaux,114,115 paramètres qui
contribuent également à moduler les comportements cellulaires. De plus, il est relativement
rare que les paramètres de rugosité des matériaux soient correctement caractérisés. Certaines
grandeurs, comme la rugosité moyenne (Ra) ou la différence de hauteur entre le point le plus
haut et le point le plus bas de l’échantillon (Rt), sont très souvent utilisées dans les études, au
détriment d’autres paramètres complémentaires comme la périodicité ou les paramètres
hybrides.116 Dans leur étude, Macdonald et al. ont compilé plus de 100 paramètres de rugosité
et les ont corrélés de manière statistique avec des résultats biologiques afin de déterminer
lesquels ont une influence sur les comportements cellulaires.116 Par cette approche, il est
apparu que les paramètres décrivant la morphologie de la surface et le niveau d’organisation
de la topographie sont les paramètres qui ont une influence sur l’adhésion d’ostéoblastes.117
Des études menées sur une lignée de cellules d’ostéosarcome, les cellules MG63, ont
montré que la prolifération et la différenciation étaient améliorées sur des substrats rugueux,
alors que l’adhésion était inhibée.118,119,120 Alors que ces résultats sont en accord avec d’autres
études, il existe dans la littérature différents articles montrant des résultats opposés. Ces
apparentes contradictions montrent que l’influence de la rugosité sur les comportements
cellulaires est une problématique délicate à appréhender et qu’il est nécessaire de prendre en
50
compte non seulement les différents paramètres de rugosité, mais aussi les procédés employés
pour créer cette rugosité.
Il a également été démontré que la rugosité a un impact sur la biosynthèse de facteurs de
croissance par les cellules. 120,121 Lohmann et al. ont montré que cette sensibilité à la rugosité
était plus importante pour des cellules immatures que pour des cellules matures.122
En plus des méthodes classiques employées pour rendre les surfaces rugueuses, la
formation de trous ou de rides régulièrement disposés et de taille contrôlée a été utilisée.
Curtis et al. ont ainsi montré que des cellules cultivées sur des sillons s’orientent le long de
ces structures, et que plus les sillons étaient profonds, que ce soit à l’échelle nanométrique ou
micrométrique, plus ils induisent une orientation des cellules.123 Cependant, plus les sillons
sont larges, moins cette orientation est prononcée. Par ailleurs, des fibroblastes cultivés sur
des surfaces présentant des trous, prolifèrent et migrent davantage d’autant mieux que les
trous sont petits et rapprochés.
Les échelles de rugosités auxquelles sont confrontées et doivent d’adapter les cellules au
sein de leur MEC, in vivo, sont dans le domaine du nanomètre. Ces échelles correspondent à
la taille des fibres de protéines (de collagène notamment) qui régulent les interactions
cellules-MEC, via un processus connu sous le nom d’orientation de contact.124 En utilisant la
lithographie colloïdale, Dalby et al. ont créé des nano-colonnes de 160 nm de haut et 100 nm
de large.125 Les auteurs ont étudié la réponse de fibroblastes cultivés sur ces structures et ont
observé une diminution de l’adhésion et de l’étalement des cellules, due à des points focaux
d’adhésion plus petits et faibles, ainsi qu’à la désorganisation du cytosquelette. Sur des
structures comparables, Andersson et al. ont noté que plus les colonnes sont larges, meilleur
est l’étalement cellulaire, indépendamment de la hauteur des colonnes.126 Les cellules sont
capables de ressentir une profondeur de 35 nm, grâce à leurs filopodes, quand elles sont
cultivées sur des substrats présentant des trous dont le diamètre varie entre 35 et 120 nm. 127
Loesberg et al. ont conclu, sur des substrats nano-structurés (5 à 350 nm de profondeur et 20 à
1000 nm de large), qu’une profondeur de 35 nm représentait un seuil de profondeur
perceptible par les fibroblastes.128 Plusieurs études concernant ce seuil de perceptibilité de la
rugosité par les cellules ont montré que celles-ci pouvaient répondre à des îlots129 ou des
structures vermiformes130 dont la taille est de l’ordre de la dizaine de nanomètre. Ces résultats
suggèrent que ce seuil pourrait être inférieur à 10 nm, mais les effets d’une topographie
inférieure à un tel seuil restent à élucider.
51
b. Mécanique
Les propriétés mécaniques des microenvironnements auxquelles sont confrontées les

cellules au sein de leurs MEC varient d’un tissu à un autre (Figure I-15).131 Ainsi, le tissu
solide le plus mou (le tissu cérébral) a un module élastique de 102 Pa, alors que le tissu le plus
rigide (le tissu osseux) a un module élastique de 109 Pa. Ces différences sont à prendre en
compte lors du développement de biomatériaux. En effet, les cellules sont capables de
ressentir la mécanique de leur substrat et d’y répondre, en adaptant les forces qu’elles
exercent à leur substrat. Cela se traduit par des différences de comportement en fonction de
l’environnement physique.
Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains (d’après Butcher et al.).131
Afin d’étudier l’effet de la rigidité du microenvironnement mécanique sur les cellules,

l’une des stratégies les plus souvent employées est d’utiliser des hydrogels dont le module
élastique peut être finement contrôlé, en mélangeant différents ratios du polymère et de son
agent réticulant, ou en modulant les propriétés du polymère, par exemple le poids moléculaire
des chaînes. Pelham et Wang ont été les premiers, en 1997, à développer la technique de gel
de rigidité contrôlable dans le but d’étudier les comportements cellulaires en fonction des
propriétés mécaniques du substrat.132
Il a notamment été démontré que l’étalement cellulaire était influencé par la rigidité du
substrat. L’aire des cellules étalées augmente avec la rigidité du substrat, ainsi que le nombre
et la taille des points focaux d’adhésion. L’actine, une protéine du cytosquelette, forme des
52
câbles de plus en plus épais. La colocalisation des fibres d’actine avec la phospho-myosine
augmente, traduisant la formation de fibres de stress.133
De nombreuses études ont montré que la vitesse de migration était également dépendante
de la rigidité du substrat. Globalement, les cellules se déplacent plus rapidement sur des
substrats rigides, par rapport à des substrats souples. Un autre phénomène, appelé durotaxie,
par analogie au chimiotaxie, est observé quand les cellules sont cultivées sur des substrats
présentant un gradient de rigidité : les cellules se dirigent vers la zone la plus rigide du
substrat et s’y accumulent (Figure I-16).134
Figure I-16 : Déplacement et accumulation de cellules vers la zone rigide d’un gel présentant
un gradient de rigidité (barre d’échelle = 50 µm) (d’après Zaari et al.).134
Engler et al. ont montré que la différenciation des myoblastes en myocytes était un
phénomène dépendant de la rigidité du substrat.133 Les auteurs ont montré que l’apparition des
striations de myosine sur les filaments d’actine, nécessaire à la formation des sarcomères
(unité de base des myofibrilles du muscle strié), a lieu lorsque les cellules sont cultivées dans
des conditions mécaniques optimales proches de la rigidité moyenne des tissus musculaires.
En 2006, Engler et al. ont publié une étude faisant référence, dans laquelle ils ont démontré
qu’en contrôlant la rigidité de substrats, il était possible de contrôler les voies de
différenciation de cellules souches mésenchymateuses.135 Les auteurs ont réussi, sans ajout de
facteurs biochimiques externes, à induire la différenciation de ces cellules vers des
phénotypes neuronaux, myoblastiques ou ostéoblastiques.
53
Figure I-17 : Influence de la rigidité du substrat sur la différenciation de cellules souches
mésenchymateuses (d’après Engler et al.).135
Le contrôle des différentes propriétés des matériaux ouvre la voie à la conception de

matériaux biomimétiques, offrant la possibilité de contrôler le phénotype des cellules appelées
à coloniser leur surface. Néanmoins, de nombreux mécanismes, tant au niveau cellulaire
qu’au niveau de la fonctionnalisation des matériaux sont mal compris ou restent sujets à
débats. La compréhension des mécanismes par lesquels les cellules ressentent leur
microenvironnement chimique, topographique, ou mécanique pourra permettre la conception
d’outils optimaux pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.
Durant mes travaux de thèse, je me suis intéressé à l’influence de substrats fonctionnalisés

par des films LbL biomimétiques composés de CSA et de PLL, sur les comportements de
préostéoblastes murins MC3T3-E1. La méthode LbL a permis de contrôler la chimie de
surface de matériaux élastomères modèles à rigidité contrôlée, ainsi que les propriétés
mécaniques des films eux mêmes, via la réticulation avec la GnP.
54
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Chapitre II - Matériels et Méthodes
II.A Préparation des substrats 67

II.A.1 Produits et Solutions 67
a. Les tampons 67
b. Les polyélectrolytes 68
II.A.2 Les substrats PDMS 70
II.A.3 Construction des films LbL 71
a. Nettoyage et préparation des surfaces 71
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS 71
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS 72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion
Totale Atténuée, FTIR-ATR 73
a. Principe 73
b. Déroulement de l’analyse 75
c. Appareillage 75
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM 75
a. Principe 76
b. Traitement des données 77
c. Appareillage 78
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D 79
a. Principe 80
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn 81
c. Appareillage 83
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS 84
a. Principe 84
b. Traitement des données OWLS 85
c. Appareillage 86
II.B.5 Essais mécaniques 87
a. Principe 87
b. Déroulement des expériences 89
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation 91
d. Appareillage 91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact 92
a. Principe 92
b. Réalisation des mesures 92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB 93
II.B.8 Microscopie à épifluorescence 93
a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente 93
b. Préparation des substrats et observations 94
66
II.C Fonctionnalisation des films LbL 94
II.C.1 Réticulation par la génipine 94
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine 96
II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire 97
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire 97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue® 98
II.D.4 Évaluation de la différenciation 98
a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL 98
II.D.5 Tests statistiques 99
II.E Références bibliographiques 100
II.A Préparation des substrats
II.A.1 Produits et Solutions

a. Les tampons
Le tampon Tris - NaCl
Les solutions utilisées pour la fabrication des LbL sont réalisées dans du tampon
Tris - NaCl offrant des conditions de pH (7,4) et de force ionique (~ 0,15 M) proches des
conditions physiologiques. Ce tampon est constitué de tris[hydroxyméthyl]aminométhane
(Tris) (C4H11NO3) 10 mM, et de NaCl 150 mM. Pour sa fabrication, les composés sont
dissous dans de l’eau ultrapure EASYpureTM RF (Barnstead) de résistivité 18,3 MΩ cm. Le
pH de la solution obtenue est ensuite ajusté à 7,4 par ajout de quelques gouttes d’acide
chlorhydrique à 0,1 M.
Le tampon DPBS
Pour la réaction de réticulation par la génipine, il est nécessaire d’utiliser un milieu
dépourvu d’amines. Le tampon utilisé est du DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline). Ce
tampon permet de placer les films LbL dans des conditions de pH et de force ionique proche
des conditions offertes par le tampon Tris - NaCl. Le système tampon est basé sur un système
dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)/hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4).
La force ionique est maintenue par l’ajout de NaCl et de KCl. Les différents constituants sont
67
dissous dans de l’eau ultrapure de resistivité 18,3 MΩ cm, comme précédemment, puis le pH
est contrôlé (7,4 - 7,5).
b. Les polyélectrolytes
Le poly(éthylène imine) (PEI).
Le PEI est un polycation synthétique fortement ramifié comportant environ 25 % d’amines
primaires, 50% d’amines secondaires et 25% d’amines tertiaires. Aux pH d’utilisation usuels,
ce polyélectrolyte présente une forte densité de charges positives (pKa ~ 10,0). Nous l’avons
donc utilisé systématiquement pour constituer une monocouche précurseur, afin d’uniformiser
l’état de surface des supports sur lesquels nos films LbL sont construits.1 Il est utilisée à une
concentration de 5 mg mL-1. La structure du PEI est donnée par la Figure II-1.
Figure II-1 : Le poly(éthylène imine), PEI

(Mn = 60000 Da ; Mw = 750000 Da).
La poly(L-lysine) (PLL)
La PLL est un polypeptide constitué d’un enchaînement de l’acide aminé L-lysine. Le
groupement latéral de cet acide aminé porte une fonction amine de pKa ~ 10,5 en position ε.
De ce fait, la PLL est chargée positivement à pH physiologique.2 Ce polyélectrolyte est utilisé
dans un grand nombre de techniques de traitement de surface pour les biomatériaux 3 ou
l’ingénierie tissulaire.4 Il s’agit de l’un des rares polyélectrolytes cationiques permettant de
conférer un caractère biomimétique aux films LbL, quand il est associé à un biopolymère
anionique, comme par exemple un polypeptide (poly(acide glutamique)) ou un polysaccharide
(acide hyaluronique, héparane sulfate,…). Elle est utilisée à une concentration de 1 mg mL-1.
La Figure II-2 donne la structure chimique de la PLL.
68
Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL (Mn =
40000 – 60000 Da).
La chondroïtine sulfate A (CSA)

La CSA est un polysaccharide biologique présent dans les tissus cartilagineux, ainsi que
dans la matrice organique des tissus osseux. C’est un glycosaminoglycane (GAG) linéaire de
haut poids moléculaire composé d’un enchaînement d’unités disaccharidiques d’acide D-
glucuronique-β-1,3-N-acétylgalactosamine-4-sulfate, chaque unité étant liée à la suivante par
une liaison β-1,4. La CSA porte des groupements sulfate (pKa ~ 2 – 2,5) et carboxylate (pKa
~ 3,5 – 4) anioniques à pH physiologique.
Elle est présente dans les biglycanes et les décorines, deux protéoglycanes majeurs du tissu
osseux.5 La CSA a un rôle dans les mécanismes d’action de facteurs de croissance
endogéniques, et elle participe aussi au remodelage osseux et à l’ostéointégration. Du fait de
sa capacité à lier les facteurs de croissance et les composés cationiques, la CSA est utilisée
dans la fabrication de réservoirs pour de la délivrance moléculaire in situ.6 Enfin, elle est
utilisée pour des revêtements de surfaces,7 incorporée à des ciments osseux afin d’en
améliorer la biocompatibilité,8 ou combinée à du collagène pour former des structures
tridimensionnelles poreuses.9 Elle est utilisée à une concentration de 1 mg mL-1. La Figure
II-3 donne la structure chimique de la CSA.
Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA

(Mn = 20000 – 30000 Da).
69
II.A.2 Les substrats PDMS
Dans le cadre de l’étude de l’influence de l’élasticité du substrat dans les interactions
cellules-substrats, des gels ou des élastomères modèles aux propriétés mécaniques contrôlées
par le taux d’agent réticulant, comme le poly(acrylamide) (PA) et le poly(dimethylsiloxane)
(PDMS), sont couramment utilisés. Alors que le PA est limité à des valeurs comprises entre
0,1 et 100 kPa,10 le PDMS donne accès à une gamme d’élasticité plus importante, comprise
entre le kPa et le MPa11. Cela rend le PDMS particulièrement approprié du point de vue
mécanique pour une étude du comportement de cellules osseuses. De plus, du fait de sa
transparence et de sa biocompatibilité, le PDMS est aujourd’hui employé pour des
applications biomédicales comme les lentilles de contact ou les pacemakers12. Cependant, son
usage en tant que biomatériau est limité du fait de sa faible énergie de surface en milieu
aqueux, conduisant à une adsorption massive de protéines à sa surface.13
Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS.
Le PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) est un élastomère hybride de type
polyorganosiloxane d’unités répétées [OSi(CH3)2]n (Figure II-4). Il se présente sous la forme
d’un kit à deux composants, constitué d’une part d’oligomères de diméthylsiloxane présentant
des groupements vinyles terminaux (prépolymère) et d’autre part, de
diméthylhydrogénosilane (agent réticulant). L’agent réticulant subit des hydrosilylations
pendant la réticulation conduisant à la réticulation par la formation de liaisons Si-C. Les
substrats de diverses rigidités sont préparés en modulant le taux, en masse, d’agent réticulant
par rapport au prépolymère. Les taux (agent réticulant:prépolymère) utilisés sont 3:100
(PDMS-3), 5:100 (PDMS-5), 7:100 (PDMS-7), 10:100 (PDMS-10) et 20:100 (PDMS-20).
Ces mélanges sont déposés dans des plaques de culture multipuits, puis placés pendant 5
heures à 65°C pour activer la réticulation.
En vue de leur caractérisation physico-chimique (AFM, FTIR-ATR, mesure d’angle de
contact, observations en microscopie à épifluorescence), des substrats minces de PDMS ont
été fabriqués sur des lamelles de verre de 14 mm de diamètre. Pour préparer ces dépôts, des
solutions à une concentration de 10% (w/w) du mélange (prépolymère/agent réticulant) dans
70
du chloroforme sont réalisées. Pour cela, les mêmes mélanges de prépolymère et d’agent
réticulant sont réalisés, puis dilués dans du chloroforme. Les dépôts sont préparés par
évaporation du chloroforme sur une lamelle de verre. Le dépôt de PDMS ainsi réalisé est
placé pour la réticulation pendant 5 heures à 65°C, c'est-à-dire dans les mêmes conditions que
les substrats préparés dans les plaques de culture multipuits.
II.A.3 Construction des films LbL

a. Nettoyage et préparation des surfaces
Avant toute utilisation, le matériel utilisé pour la construction des films LbL est nettoyé
avec du SDS 0,05 M à 80°C pendant 5 minutes, puis rincé à l’eau ultrapure. L’ensemble du
matériel est ensuite nettoyé avec de l’acide chlorhydrique à 15%, puis rincé à l’eau ultrapure.
Les résonateurs QCM-D sont nettoyés avec un mélange ammoniacal APM (« Ammonia
Peroxide Mix » : mélange 5:1:1 d’eau ultrapure, de peroxyde d’hydrogène 30% et
d’ammoniaque 25%). Les lamelles de verre sont nettoyées avec une solution Piranha
(mélange 3:1 d’acide sulfurique concentré et de peroxyde d’hydrogène 30%) pendant 20
minutes puis abondamment rincées à l’eau ultrapure.
b. Protocole de construction des films sur les supports de verre et de PDMS

Construction manuelle.
Les lamelles sont placées dans des plaques 24 puits (3526, Corning), mises en contact avec
une solution de PEI à une concentration de 5 mg mL-1 pendant 30 minutes, puis rincées 3 fois
3 minutes avec le tampon Tri - NaCl. Après cette étape permettant l’adsorption d’une couche
précurseur polycationique, les puits sont remplis, de manière alternée, par les solutions de
polyélectrolytes (CSA et PLL), à la concentration de 1 mg mL-1, pendant 10 minutes, en
commençant par la CSA de charge négative, puis rincés trois fois 3 minutes avec le tampon
Tris - NaCl. Il est donc possible de contrôler l’épaisseur du film en modifiant le nombre de
cycles d’adsorptions effectués.14
Construction automatisée.
Il est également possible de construire les films multicouches de manière automatisée.
Pour cela, les substrats sont déposés sur un porte-échantillon en PTFE. Ils sont immergés
manuellement pendant 30 minutes dans une solution de PEI 5 mg mL-1, puis rincés trois fois
avec le tampon. Le porte-échantillon est ensuite fixé sur un bras motorisé mobile en xyz
contrôlé par informatique, permettant les immersions successives dans les solutions de
71
polyélectrolytes et de rinçage. Les substrats sont ainsi mis au contact des solutions de
polyélectrolytes pendant 10 minutes. Chaque étape de rinçage dans le tampon consiste en des
séries de trois immersions de 1 seconde et une immersion de 1 minute dans trois béchers de
80 mL, puis trois immersions de 1 seconde et une immersion de 3 minutes dans deux béchers
de 250 mL.
Fonctionnalisation des substrats PDMS

Les substrats PDMS préparés dans les plaques de culture sont fonctionnalisés in situ,
suivant le même protocole que celui appliqué pour les substrats en verre fonctionnalisés
manuellement. Les films minces de PDMS sont fonctionnalisés à l’aide de l’automate.
c. Protocole de construction des films dans les cellules de QCM-D et OWLS

Pour les études par QCM-D, les films sont construits dans une cellule thermostatée. Après
installation du résonateur dans la cellule d’écoulement, le circuit est conditionné avec le
tampon Tris - NaCl jusqu’à stabilisation du signal. La construction des multicouches est
initiée par mise en contact, pendant 10 minutes, du résonateur avec une solution de PEI (5 mg
mL-1). Le rinçage est effectué par écoulement de tampon Tris - NaCl dans le circuit, puis un
temps de stabilisation de 10 minutes. Cette séquence est répétée pour les adsorptions alternées
de polyanions et de polycations.
Pour les études par OWLS, le protocole de construction est identique, excepté pour le
mode d’écoulement. Il s’agit ici d’un flux, stoppé pour les polyélectrolytes et continu faible
de la solution de rinçage, au contact du support traité durant la période d’interaction
souhaitée, et non d’un flux initial rapide suivi d’une stabilisation statique. Les polymères sont
laissés au contact du support durant une période de 10 minutes.
Les solutions sont dégazées à l’argon, pour la QCM-D, et aux ultrasons, pour l’OWLS,
avant injection dans le circuit d’écoulement, afin d’éviter la formation de bulles au contact des
résonateurs de QCM-D ou des guides d’onde OWLS.
72
II.B Analyse et Caractérisation des Substrats
II.B.1 Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier en mode de Réflexion Totale
Atténuée, FTIR-ATR
La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) est une technique de
spectroscopie vibrationnelle utilisée pour la caractérisation chimique de composés à l’état
gazeux, liquide ou solide.
a. Principe
Un faisceau infrarouge (de longueur d’onde comprise entre 2,5 – 25 µm) traversant un
échantillon peut, selon sa longueur d’onde, y provoquer des transitions de niveaux
vibrationnels dans les molécules qui le composent, si sa longueur d’onde est voisine de
l’énergie de vibration d’une liaison, fournissant ainsi des informations sur la nature des
liaisons chimiques présentes dans l’échantillon.
Toutes les liaisons chimiques n’absorbent pas dans le domaine infrarouge, cela dépend
notamment de la symétrie de la molécule. Il existe différents modes de vibration symétriques
ou asymétriques, appelés élongations ou déformations (Figure II-5). La masse des atomes
ainsi que leur électronégativité influence également la position des bandes d’absorption. La
signature spectrale infrarouge de l’échantillon permet de définir précisément sa composition
chimique.
Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules : élongations symétriques (a et b) et

asymétriques (c et d), déformations dans le plan symétriques (e et f) et asymétriques (g et h) et
déformations hors du plan, symétriques (i et j) et asymétriques (k et l).
73
L’acquisition du spectre consiste à mesurer l’intensité du faisceau transmis en fonction de
la longueur d’onde. Dans la méthode FTIR, l’échantillon est irradié simultanément à toutes les
longueurs d’onde et la totalité du spectre IR est obtenue directement par la transformée de
Fourier du signal transmis. Cette technique offre des temps d’acquisition courts, permettant
ainsi d’augmenter le nombre d’acquisitions, d’obtenir un bon rapport signal/bruit et donc
d’améliorer la sensibilité de la détection.
Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion.
En mode de réflexion totale atténuée (ATR), le faisceau IR incident est dirigé à travers un
cristal de séléniure de zinc (ZnSe) d’indice de réfraction élevé (n1) (Figure II-6). A l’interface
entre le cristal et le milieu d’indice de réfraction plus faible (n2), le faisceau incident subit une
réflexion interne totale. Si l’angle d’incidence du faisceau excède un angle critique θc,
déterminé par sin θc = n1/n2, il se forme une onde évanescente au point de réflexion dont
l’intensité du champ électrique du faisceau décroît en s’éloignant de la surface du cristal
(Figure II-7). Cette propriété permet de sonder, par la mesure de l’absorption de l’onde
évanescente par le milieu adjacent, des dépôts de matière d’épaisseur micrométrique, et
d’analyser la composition de ce qui se trouve à la surface du cristal.
Figure II-7 : Profil de décroissance de l’onde évanescente infrarouge (n2 < n1).
74
b. Déroulement de l’analyse
Dans ces travaux, la spectroscopie FTIR-ATR a été utilisée pour la caractérisation des
substrats PDMS, ainsi que de divers films LbL.
Les échantillons de PDMS natifs ou fonctionnalisés avec les films LbL sont déposés sur le
cristal de ZnSe. Une moyenne de seize spectres est effectuée pour chaque échantillon, entre
4000 et 600 cm-1, à une résolution de 2 cm-1.
Pour l’étude de la réticulation par la génipine, les films LbL sont construits manuellement
sur le cristal de ZnSe, par adsorptions alternées de CSA et de PLL, sur une couche précurseur
de PEI, en respectant les mêmes durées d’adsorption que dans le protocole décrit
précédemment. Après chaque étape d’adsorption, la solution de polyélectrolytes est éliminée,
puis trois rinçages au tampon Tris - NaCl sont effectués. Après la construction du film
PEI/(CSA/PLL)6, celui-ci est séché sous un léger flux d’argon. Cette étape a pour but
d’éliminer l’eau qui absorbe une grande partie du faisceau infrarouge. Une acquisition du
spectre est alors opérée, entre 1800 et 800 cm-1. Puis l’échantillon est réhydraté, avec du
tampon DPBS, et réticulé pendant seize heures par une solution de génipine à 0,50% (GnP50).
Après réticulation, la solution de génipine est éliminée, le film est rincé une première fois
avec du tampon DPBS, puis une seconde fois avec du tampon Tris - NaCl, afin de le placer
dans les mêmes conditions que lors de la construction. Une nouvelle acquisition est alors
effectuée sur le film réticulé.
c. Appareillage
L’appareil ATR-FTIR utilisé est un système Perkin-Elmer Spectrum BX FTIR System,

donnant accès à la région spectrale 550 – 4000 cm-1 avec une résolution maximale de 1 cm-1.
Le cristal d’ATR est composé de ZnSe (n = 2,42).
II.B.2 Microscopie à Force Atomique, AFM

La microscopie à force atomique (AFM) est une technique permettant d’obtenir des images
bi et tri-tridimensionnelles d’une surface avec une très haute résolution, pouvant aller jusqu’à
l’échelle atomique. Cette technique permet également d’obtenir, en plus de la topographie et
de la rugosité, des informations sur les propriétés de surface : composantes électriques ou
magnétiques de surface, forces d’adhésion ou propriétés mécaniques de surface. Ces mesures
peuvent être menées à l’air ou en milieu liquide, ce qui dispense d’une étape de séchage qui
75
pourrait entraîner une déstructuration des dépôts. Les échantillons étudiés peuvent être de
diverses natures : métaux, céramiques, polymères, films adsorbés…
a. Principe
L’AFM est basée sur la mesure des forces d’interaction (forces de van der Waals et forces
électrostatiques) entre une surface et une pointe très fine, idéalement monoatomique. Cette
pointe est montée au bout d’un bras de levier (ou cantilever), de constante de raideur k
connue. La déflexion ∆z du bras de levier, induite par la force F exercée par l’interaction avec
la surface, est suivie à l’aide d’un faisceau laser réfléchi par la partie supérieure du bras de
levier et détecté par une photodiode (Figure II-8). La force F est donc reliée à la déflection
∆z par la relation :
Équation II-1
Lors du balayage de la surface par la pointe, tout relief provoque une déviation du faisceau
réfléchi. L’analyse de ces déviations permet de retracer le relief de l’échantillon.
Les déplacements en xyz de l’échantillon sont assurés grâce à une céramique piézoélectrique.
Les déplacements en x et y permettent le balayage latéral de l’échantillon, la direction z
permettant d’éloigner ou de rapprocher l’échantillon de la pointe.
Figure II-8 : Principe de fonctionnement d’un microscope à force atomique (AFM).
L’AFM permet également d’évaluer, par les techniques de nanoindentation, les propriétés
mécaniques des surfaces analysées, par l’étude des courbes de force qui représentent la force
exercée sur la pointe par la surface en fonction de la distance qui les sépare (Figure II-9). Il
est possible, en exerçant une pression sur la surface, de calculer le module élastique, ou
76
module d’Young, des échantillons analysés. Pour cela, il existe différents modèles
mathématiques qui permettent, en connaissant les propriétés du bras de levier et de la pointe
utilisée, de remonter aux propriétés mécaniques de l’échantillon.
Figure II-9 : Evolution de la force F

exercée sur la pointe par l’échantillon en
charge (en bleu) et et en décharge (en
rouge). L’hystérésis observée en décharge
est due aux forces d’adhésion entre la pointe
et la surface.
b. Traitement des données

Les données (images et courbes de force) sont traitées avec le logiciel SPIPTM (Scanning
Probe Image Processor). Les données topographiques fournies par l’analyse des images sont,
entre autres : (i) la rugosité Ra, qui représente la moyenne arithmétique des déviations par
rapport à la hauteur moyenne et (ii) la rugosité Rt qui correspond à la différence de hauteur
entre le point le plus haut de la zone analysée et le point le plus bas.
Pour la détermination des propriétés mécaniques de l’échantillon les deux modèles
d’analyse les plus couramment utilisés sont représentés dans la Figure II-10.
Figure II-10 : Modèles de pointes sphérique (modèle de Hertz) ou coniques (modèle de

Sneddon) utilisées en nanoindentation par AFM, avec Esurface le module d’Young, νsurface le
coefficient de Poisson et (S0-S) la distance de pénétration (indentation) de la pointe dans
l’échantillon.
77
Le premier modèle impliquant un indenteur sphérique rigide sur une surface souple est
décrit par la relation de Hertz :
Équation II-2
Au cours de notre étude, nous avons utilisé des pointes coniques montées sur un bras de
levier rectangulaire. Le modèle mathématique associé est le modèle de Sneddon, permettant
de relier l’indentation effectuée avec une pointe conique rigide sur une surface souple à la
force exercée sur la surface (FSneddon) par la relation :
Équation II-3
Les grandeurs qui caractérisent les indenteurs sont le rayon (RTip) dans le cas de l’indenteur
sphérique de Hertz et le demi angle au sommet α pour l’indenteur conique de Sneddon. Pour
un matériau homogène et isotrope, deux paramètres indépendants permettent de modéliser son
comportement élastique : (i) le module d’Young (Esurface), qui représente le caractère élastique
du matériau, et (ii) le coefficient de Poisson (νsurface), qui permet de caractériser la contraction
du matériau perpendiculairement à la direction de l'effort appliqué et qui représente le
caractère visqueux du matériau. Dans le cadre de ces travaux, les films LbL étant considérés
comme incompressibles, nous avons utilisé un coefficient de Poisson d’une valeur de 0,5.15
La distance (S0-S) correspond à la distance de pénétration (indentation) de l’indenteur dans
l’échantillon par rapport à sa surface.
c. Appareillage
Les caractérisations de topographie et les analyses de nanoindentation ont été réalisées
avec un appareil PicoSPM Body de Molecular Imaging. Le Tableau II-1 regroupe les
données des pointes. Nous avons volontairement utilisé des cantilevers rigides, permettant de
mesurer les propriétés mécaniques de l’ensemble de notre système (multicouche et substrat de
verre sous-jacent, correspondant à un module élastique couplé) et pas uniquement celles du
film LbL, comme c’est le cas dans certains travaux réalisés avec des cantilevers plus souples.
78
Tableau II-1 : Spécifications des pointes utilisées en AFM (données constructeurs).
Application Acquisition d’images / nanoindentation
Topographie
Constructeur Applied Nanostructures Mikromash
Référence HYDRA6V-100NG NSC18/no Al
Cantilever
architecture triangulaire rectangulaire
revêtement Au --
longueur l 100 µm 230 µm
largeur w 18 µm 40 µm
épaisseur t 0,6 µm 3 µm
constante de raideur k 0,292 N m-1 3,5 N m-1
Pointes
forme pyramidale conique
composition nitrure de silicium (Si3N4) silicium (Si)
II.B.3 Microbalance à Cristal de Quartz, QCM-D

La microbalance à cristal de quartz (QCM) est un dispositif électroacoustique permettant
de détecter en temps réel et en continu l’adsorption, à partir de phases gazeuses ou liquides,
de quantités de matière très faibles sur la surface d’un capteur (ou résonateur) piézoélectrique.
Cette technique permet la caractérisation de dépôts de matière de quelques ng cm-2 à quelques
µg cm-2, et d’épaisseurs sub-nanométriques à micrométriques. La QCM traditionnelle ne
permet de caractériser que les dépôts rigides, et se révèle imprécise dans le cas de dépôts non-
rigides (viscoélastiques) comme des films de polymères ou de protéines souvent fortement
hydratés. La QCM n’est donc pas adaptée à l’étude des processus mis en jeu à la surface des
biomatériaux, comme les phénomènes d’adsorption protéique ou la fonctionnalisation par des
polymères.
Depuis une quinzaine d’années, la technique QCM-D (« -D » pour « contrôle de la
Dissipation ») complète la QCM traditionnelle, en permettant une mesure plus fiable de la
masse des dépôts viscoélastiques. La QCM-D permet également d’évaluer les propriétés
viscoélastiques de ces dépôts. Il est important de noter qu’en QCM-D, on entend par « dépôt »
l’ensemble de la matière mécaniquement couplée au capteur, ce qui inclut l’eau liée à la
matière adsorbée. La QCM-D donne donc accès à l’ensemble de la masse hydratée ou
« masse humide » du dépôt.
79
a. Principe
Le capteur utilisé, ou résonateur piézoélectrique, est constitué d’une lamelle de quartz
recouverte d’électrodes métalliques (Figure II-11). Le résonateur est caractérisé par des
fréquences de résonance, qui sont ses fréquences propres d’oscillation et sont fonction de ses
propriétés physiques intrinsèques, notamment de sa masse. La fréquence propre la plus basse
est appelée « fondamentale » (f1). Les autres fréquences de résonance, ou harmoniques
impaires (f3, f5, f7…), sont des multiples impairs de f1. L’adsorption de matière à la surface du
résonateur provoque une variation des fréquences de résonance. La QCM-D mesure ces
variations et permet de les relier à la masse et, connaissant la masse volumique, à l’épaisseur
du dépôt.
Figure II-11 : Capteur QSX301 (Q-Sense AB) (~340 µm d’épaisseur ; Ø 14 mm ; électrodes

Au).
Figure II-12 : Principe de la mesure QCM-D.
La QCM-D donne également accès aux variations des facteurs de dissipation Dn. Ces
facteurs caractérisent la vitesse d’amortissement des oscillations libres du résonateur.
Le principe de la mesure des paramètres (fn ; Dn) caractéristiques des propriétés
viscoélastiques du dépôt est rapporté par la Figure II-12 : des oscillations sont imposées au
80
capteur pendant quelques millisecondes par une différence de potentiel oscillante de
fréquence proche de sa fréquence de résonance. Après l’arrêt de ces oscillations forcées, le
dispositif mesure pendant quelques millisecondes la courbe d’amortissement des oscillations
libres. Cette courbe est ensuite modélisée par une sinusoïde amortie (Figure II-13)
d’équation :
Équation II-4
où τ = 1/(πfD) représente le temps caractéristique d’amortissement.
Figure II-13 : Calcul des paramètres (fn ; Dn) par modélisation de la courbe expérimentale
d’amortissement par une sinusoïde amortie.
Nous effectuons le suivi simultané de 4 fréquences de résonance (f1, f3, f5, f7) en procédant
à l’excitation piézoélectrique du résonateur successivement à chacune d’entre elles.
b. Interprétation des variations ∆fn et ∆Dn

Dans le cas de dépôts de matière rigides et suffisamment minces, les variations de
fréquences ∆fn permettent de remonter, via la relation de Sauerbrey, à la quantité de matière
adsorbée :
Équation II-5
où ρf et δf sont respectivement la masse volumique et l’épaisseur du dépôt, et Cf est la

sensibilité massique reliée à l’épaisseur dq et à la masse volumique ρq du quartz ainsi qu’à la
fréquence de résonance f1. Pour un capteur de fréquence fondamentale 5 MHz, Cf = 17,7 ng
cm-2 Hz-1.
81
Pour des dépôts viscoélastiques, les fréquences de résonance du capteur ne sont plus
influencées uniquement par la masse du dépôt, mais également par ses propriétés
viscoélastiques. Dans ce cas, la relation de linéarité de Sauerbrey n’est plus respectée, comme
l’illustre la Figure II-14.
Figure II-14 : (Gauche) Profils de l’évolution des paramètres mesurés en QCM(-D) pour un
dépôt rigide (Δf : vert) et pour un dépôt viscoélastique (Δf : bleu ; ΔD : rouge). Les valeurs
calculées sont indicatives. Elles sont issues du modèle mécanique équivalent montré à droite
décrivant le résonateur (et son éventuel dépôt viscoélastique) comme un oscillateur
harmonique de Voigt (masse m, viscosité η, module d’élasticité µ).
La Figure II-14 montre que dans certains domaines d’épaisseur (par exemple entre 1,5 et
2,5 µm), une augmentation de la quantité de matière adsorbée sur le capteur se traduit par une
augmentation des fréquences de résonance. Or, selon la relation de Sauerbrey, une adsorption
de matière devrait provoquer leur diminution. De plus, l’influence des propriétés
viscoélastiques sur les différentes harmoniques n’est pas linéaire, ce qui conduit à une
différenciation des valeurs de fréquences normalisées ∆fn/n. Pour interpréter les variations de
fréquences il est alors nécessaire de considérer les valeurs de dissipation ∆Dn liées aux
propriétés mécaniques de la couche adsorbée.
Le traitement des données est effectué à l’aide du logiciel Q-Tools (Q-Sense). Les courbes
de fréquence sont analysées selon le modèle d’oscillateur harmonique de Voigt. Ce modèle
est composé d’une masse m, reliée à un ressort de constante de raideur µ et à un piston de
viscosité η montés en parallèle (Figure II-14). La modélisation consiste à déterminer les
grandeurs m, µ et η du modèle de Voigt dont la courbe d’amortissement se superpose le plus
exactement à la courbe expérimentale.
82
c. Appareillage
L’instrument QCM-D utilisé dans notre étude est le modèle D300 de Q-Sense AB (Figure
II-15). Les capteurs employés, de fréquence propre f0 ~ 5 MHz (et de fréquences harmoniques
f3,5,7 ~ 15, 25, 35 MHz, sont des capteurs QSX 301 (Q-Sense AB) (électrodes d’or) (Figure
II-11).
Unité électronique
Cellule de mesure
Figure II-15 : Système QCM-D D300 (Q-Sense AB).
Le capteur est installé à l’intérieur de la cellule de mesure de telle façon que l’électrode
active du capteur (face interne) constitue le fond de la chambre d’écoulement (Figure II-16).
Le volume de la chambre d’écoulement ainsi constituée est de ~ 100 µL. L’excitation
électrique (par effet piézoélectrique inverse) et la mesure (par effet piézoélectrique) des
oscillations du capteur consécutives à l’excitation sont contrôlées par l’unité électronique
reliée au capteur par l’intermédiaire des deux électrodes en contact avec sa face externe.
Figure II-16 : Architecture de la cellule de mesure. Le sens d’écoulement est indiqué par des
flèches.
83
L’écoulement hydrostatique des solutions d’étude contenues dans le réservoir est contrôlé
par une vanne manuelle. Les fréquences de résonance étant particulièrement sensibles aux
variations de température, la cellule de mesure est thermostatée, et une boucle de température
(T-loop) d’un volume de ~ 500 µL permet, le cas échéant, de thermostater les solutions
préalablement à leur mise en contact avec le capteur. Cette étape est notamment nécessaire
pour l’étude de cinétiques initiales d’adsorption.
II.B.4 Spectroscopie par Guide d’Onde Optique, OWLS

La spectroscopie par guide d’onde optique, OWLS (Optical Waveguide Lightmode
Spectroscopy), est une technique optique permettant de détecter en temps réel des dépôts de
matière à la surface d’un support de verre recouvert d’un film guide d’onde, avec une
sensibilité de l’ordre du ng cm-2. Cette technique de spectroscopie donne accès à l’épaisseur
optique du dépôt, jusqu’à quelques centaines de nm, mais aussi à la masse optique des dépôts,
hors hydratation.
a. Principe
La Figure II-17 décrit l’architecture d’un support d’analyse. Il s’agit d’une lame de verre,
recouverte par spin-coating d’un film de Si0.8Ti0.2O2 dont l’épaisseur dF est d’environ 180 nm
et sur lequel est gravé un réseau de diffraction permettant de coupler un faisceau laser
polarisé. Grâce à l’indice de réfraction élevé de ce film (nF ~ 1,8), le faisceau se propage au
sein du film par un phénomène de réflexion totale interne. En fonction de la polarisabilité et
de la quantité des molécules adsorbées, le faisceau est réfléchi avec un certain déphasage.
Figure II-17 : Schéma représentant le principe de la spectroscopie optique par guide

d'onde : (S) support de verre (indice nS) ; (F) film guide d’onde en SiTiO2 (indice nF) sur
lequel est gravé un réseau de diffraction ; (A) matière adsorbée (indice nA) ; (C) solution
d’adsorption ou de référence (indice nC).
84
À cause de ce déphasage, les intensités du champ électrique (mode TE) et du champ
magnétique (mode TM) sont maximales pour certains angles d’incidence. Ces angles
particuliers sont appelés angles de couplages et notés αTE et αTM. Afin de mesurer, pour
chaque mode, les angles α- et α+, un balayage symétrique est réalisé (Figure II-18). La
moyenne des deux valeurs est retenue, de manière à s’affranchir d’un éventuel décalage de la
position d’origine du goniomètre.
À chaque angle de couplage correspond un indice effectif N donné par l’équation :
Équation II-6
N étant l’indice NTE ou NTM, k l’ordre de diffraction, λ (nm) la longueur d’onde du faisceau
incident et Λ (nm) la constante réseau de diffraction. Dans le cas d’un dépôt isotrope, la
variation des indices effectifs est fonction de l’indice de réfraction nA et de l’épaisseur dA de
la couche de matière adsorbée. La mesure continue des indices effectifs permet de suivre
l’évolution structurale du dépôt dans le temps.
Figure II-18 : Évolution typique des angles de couplage αTE et αTM lors du dépôt de matière
sur un guide d'onde OWLS.
b. Traitement des données OWLS

Une couche homogène et isotrope à la surface du support de mesure est définie par sa
concentration cA et son épaisseur dA. La quantité de matière adsorbée Q est obtenue par la
relation suivante :
85
Équation II-7
Son indice de réfraction est obtenue par :
Équation II-8
où nC est l’indice de réfraction de la solution tampon et dn/dC est l’incrément d’indice de

réfraction des composés qui constituent le dépôt. L’Équation II-7 devient alors Formule de
de Feijter :
Équation II-9
Les indices effectifs NTE et NTM étant fonction des paramètres optiques du dépôt nA et dA,
leur mesure donne accès aux paramètres structuraux nOWLS et dOWLS. La formule de de Feijter
donnant accès à la masse optique du dépôt, QOWLS, à partir de l’épaisseur optique et de la
différence entre les indices de réfraction du film et de la solution adjacente, ∆n = (nOWLS – nC)
devient :
Équation II-10
La littérature indique pour divers polyélectrolytes et protéines des valeurs de dn/dC

comprises entre 0,15 et 0,21 cm3 g-1. Nous avons donc utilisé la valeur moyenne dn/dC = 0,18
± 0,03 cm3 g-1. Il est important de noter que QOWLS donne une mesure de la masse « sèche »
du dépôt puisque l’eau liée ne contribue pas à la grandeur ∆n servant à la calculer.
c. Appareillage
L’appareil utilisé est un système OWLS 110 fourni par MicroVacuum Ltd. Ce système est
fourni avec le logiciel commercial d’acquisition et d’analyse BioSense 2.2. La source
lumineuse est un laser He-Ne d’une puissance de 5 mW et de longueur d’onde 632,8 nm
(Figure II-19).
86
Figure II-19 : (Gauche) Dispositif OWLS comportant l’unité d’injection, le thermostat et la
cellule de mesure. (Droite) Schéma de principe de la cellule de mesure.
Le faisceau laser est dirigé sur le support de guide d’onde placé dans la cellule de mesure.
Le balayage des angles d’incidence est assuré par un moteur équipé d’un goniomètre. Les
injections sont assurées via une pompe péristaltique à débit variable et une vanne d’injection.
Afin d’éviter la formation de microbulles dans le circuit d’injection, les solutions sont
dégazées en continu grâce à un générateur d’ultrasons Branson 2510 d’une puissance de
100 W.
II.B.5 Essais mécaniques

a. Principe
Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés au comportement de cellules
cultivées sur des substrats élastomères de PDMS d’élasticité variable. Nous avons mesuré le
module d’Young des substrats au moyen de différents tests mécaniques.
Essai en traction :
Pour la détermination de l’élasticité d’un matériau, l’essai en traction est le test mécanique
le plus souvent utilisé. Il consiste à placer une éprouvette de dimensions connues entre les
mors d’amarrage d’un banc d’essai, puis de lui imposer une déformation par traction. On
enregistre la force et l’allongement que l’on traduit en contrainte-déformation (Figure II-20).
87
Figure II-20 : Courbe de contrainte-
déformation typique d’un matériau ductile.
Les différentes zones sont (1) le domaine
élastique, (2) le domaine plastique et (3) la
zone de striction, puis la rupture de
l’éprouvette. Le module d’Young E est
déterminé dans le domaine élastique.
Cette courbe permet de déterminer le module élastique, ou module d’Young, noté E,

calculé dans le domaine élastique, soit pour une faible déformation, par la loi de
Hooke (Equation II-11):
Équation II-11
Il correspond à la pente de la courbe dans ce domaine.

Les courbes de contrainte-déformation présentent des profils différents selon le
comportement mécanique du matériau étudié (Figure II-21). Les matériaux fragiles
présentent uniquement un domaine élastique, mais pas de domaine plastique. Les matériaux
ductiles peuvent subir une déformation irréversible, qui se traduit par la présence d’un
domaine plastique. Enfin, certains matériaux présentent un caractère élastique non linéaire
lors des essais de traction.
88
Figure II-21 : Exemples de courbes de contrainte-déformation de matériaux présentant des
comportements mécaniques différents.
Dans le cas de matériaux présentant un comportement non linéaire, la contrainte n’est pas
la même en fonction du domaine de déformation appliqué au matériau. Le module d’Young
est alors défini comme étant la dérivée discrète de la courbe de contrainte-déformation, en
utilisant des différences finies. On détermine alors le module incrémental Einc.
Essai en compression :
L’essai en compression consiste à placer une éprouvette cylindrique, de rayon et de hauteur
connus, entre deux plateaux lubrifiés parallèles et de lui imposer une déformation par
compression. On enregistre la force et la déformation du cylindre, que l’on reporte sur une
courbe de contrainte-déformation. De la même manière que pour le test en traction, le module
d’Young peut être extrait de la pente de la courbe dans sa partie linéaire (domaine élastique)
par la loi de Hook (Equation II-11).
b. Déroulement des expériences

Les tests mécaniques sont réalisés sur un banc d’essai (Figure II-22).
Figure II-22 : Schéma de fonctionnement d’un banc d’essai (exemple d’un essai en traction).
89
Les dimensions initiales des échantillons ont été préalablement mesurées à l’aide d’un
étrier, avec une valeur moyenne d’au moins trois mesures sur chaque dimension : (i) diamètre
(d0) et hauteur (L0) des échantillons cylindriques pour les essais en compression (Figure II-23
A) et (ii) épaisseur (t0), largeur (w0) et longueur de jauge (LG) des échantillons rectangulaires
pour les essais en traction (Figure II-23 B). Les essais mono-axiaux en compression et en
traction sont réalisés respectivement avec des plaques d’aluminium lubrifiées et à l’aide de
poignées couvertes de ruban adhésif (Figure II-24). La vitesse de la traverse mobile est de 5
mm min-1 pour tous les essais.
Figure II-23 : Formes et dimensions des éprouvettes de PDMS pour les tests (A) en
compression et (B) en tension.
Figure II-24 : Photographies des montages des tests (A) en compression et (B) en tension
d’échantillons de PDMS.
La force axiale (F) et l’extension (∆L) sont enregistrées pendant les essais à une fréquence
de 500 Hz (Figure II-25). La contrainte nominale et la déformation nominale sont calculées à
partir des mesures de force et de déformation.
90
Figure II-25 : Déformation (∆L) d’éprouvettes lors d’essais en (A) compression et (B) de
traction sous l’effet de la force axiale (F).
c. Interprétation des courbes de contrainte-déformation

La contrainte nominale σ est définie par la relation :
Équation II-12
avec A0 l’aire de la section de l’échantillon. La déformation nominale ε est définie par la

relation :
Équation II-13
avec L0 étant la longueur de jauge initiale.

Le PDMS est un élastomère, dont le comportement élastique est non linéaire : il n’existe
pas de relation linéaire entre la contrainte nominale et la déformation nominale. Le module
élastique incrémental (Einc) est alors déterminé par la dérivée discrète :
Équation II-14
c’est à dire par la pente de la courbe de contrainte-déformation, pour les valeurs de ε

faibles.
d. Appareillage
Ces tests mécaniques ont été réalisés sur un banc d’essai MTS Insight Electrochemical
5 kN, équipée de cellules de charge 5 kN, 100 N et 10 N. La machine est pilotée par le
logiciel TestWorks 4 (MTS Systems Corporation, USA).
91
II.B.6 Etude de la mouillabilité par mesure de l’angle de contact
La mesure de l’angle de contact est une technique d’étude de l’énergie de surface d’un
matériau. Elle consiste à étudier l’étalement d’une goutte de liquide à la surface du matériau.
a. Principe
La forme d’une goutte de liquide déposée à la surface d’un matériau est influencée par les
énergies interfaciales des différentes interfaces en jeu : liquide/vapeur (γLV), solide/liquide
(γSL) et solide/vapeur (γSV). L’angle de contact θ entre la tangente à la goutte et la surface du
matériau au niveau de la triple interface (Figure II-26) est donné par la relation de Young-
Dupré :
Équation II-15
Figure II-26 : Illustration graphique de la relation de Young-Dupré reliant la forme d’une

goutte de liquide (angle de contact θ) aux différentes interfaces en jeux à la triple interface
(γLV, γSL et γSV).
En utilisant de l’eau, cette technique permet de définir le caractère hydrophile ou

hydrophobe d’un matériau : plus le matériau est hydrophile, plus la goutte s’étale (angle de
contact faible) et vice-versa.
b. Réalisation des mesures

L’angle de contact statique entre la surface et une goutte de 5 µL de tampon Tris - NaCl est
déterminé par la technique de la goutte pendante, dans les conditions atmosphériques.
L’image de la goutte est enregistrée 3 ms après dépôt. Cette image est ensuite analysée grâce
au logiciel ImageJ afin de déterminer l’angle de contact. Un total de cinq mesures est effectué
sur chaque échantillon.
92
II.B.7 Microscopie Électronique à Balayage, MEB
La microscopie électronique à balayage (MEB) est une technique fournissant des images
de très haute résolution de la surface d’un échantillon.
Les échantillons biologiques contenant beaucoup d’eau, il est nécessaire de les fixer sans
en modifier la structure, puis de les déshydrater avant d’en réaliser l’étude par MEB. De plus,
comme tous les échantillons destinés à être observés en MEB, ils doivent être conducteurs et
sont donc métallisés avant observation. Pour cela, les échantillons sont rincés au tampon PBS,
puis fixés pendant 30 minutes par une solution de glutaraldéhyde à une concentration de
2,5%. Afin de les déshydrater, les échantillons sont immergés dans deux bains successifs
d’acétone. Ils sont ensuite stockés à -80°C jusqu’à utilisation. Préalablement à l’étape de
métallisation, les échantillons sont retirés du congélateur, puis aussitôt placés sous une cloche
à vide en présence de dessicant.
Les échantillons sont revêtus d’or par pulvérisation cathodique avec un métalliseur JFC
1300 Autofine, puis les images sont obtenues grâce à un MEB JCM-5000 Neoscope JEOL.
II.B.8 Microscopie à épifluorescence

a. Marquage de polyélectrolytes par une sonde fluorescente
L’utilisation de la fluorescence permet de visualiser de manière simple et rapide la
présence ou non d’un polymère adsorbé sur une surface. Pour cela, nous avons utilisé deux
types de polyélectrolytes fluorescents, la PEI et la CSA, fonctionnalisés par un fluorophore, la
FITC (λex = 490 nm ; λem = 525 nm), dont la structure chimique est rapportée par la Figure
II-27. Le greffage fait intervenir les groupements amine primaire de la PEI ou les
groupements carboxyle de la CSA et le groupement thiocyanate du FITC.
Figure II-27 : Structure moléculaire de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
93
Pour le marquage, les polyélectrolytes ont été préparés à une concentration de 50 mg mL-1
dans un tampon carbonate/bicarbonate 0,1 M à pH 9,0. Un volume de 100 µL de FITC diluée
dans du DMSO a été ajouté, de manière à obtenir un ratio molaire de nFITC/nPE de 0,4 pour la
PEI et de 2 pour la CSA. La FITC est laissée au contact des polyélectrolytes pendant 12
heures dans la solution de marquage. Cette solution est ensuite dialysée une première fois
contre 1 L d’eau ultrapure pendant 24 heures, puis une deuxième fois contre 5 L d’eau
ultrapure pendant 48 heures.
b. Préparation des substrats et observations

Les solutions obtenues sont diluées dans du tampon Tris - NaCl de manière à obtenir des
concentrations d’utilisation des polyélectrolytes (5 mg mL-1 pour la PEIFITC et 1 mg mL-1 pour
la CSAFITC).
La solution de PEIFITC est mise en contact avec les substrats PDMS pendant 30 minutes,
puis les substrats sont rincés trois fois avec du tampon Tris - NaCl. Les substrats PDMS
utilisés lors de cette étude sont les substrats construits par évaporation de solvant sur lamelles
de verre (§ II.A.2 ).
La CSAFITC est utilisée pour la construction de films PEI/(CSAFITC/PLL)6 et
PEI/(CSAFITC/PLL)12 sur des lamelles de verre, comme décrite précédemment.
Les échantillons sont ensuite montés sur des lames de microscopie avec une résine
MOWIOL 4-88. Après séchage, les lames sont observées à l’aide d’un microscope à
épifluorescence (Scope.A1 Zeiss).
II.C Fonctionnalisation des films LbL

II.C.1 Réticulation par la génipine
La réticulation est une stratégie souvent utilisée pour moduler les propriétés mécaniques
des films LbL. Nous avons utilisé pour cela un agent réticulant naturel et biocompatible, la
génipine (GnP), comme alternative aux agents réticulants usuels potentiellement cytotoxiques
tels que EDC/NHS ou le glutaraldéhyde. Bien que le mécanisme de réticulation ne soit pas
encore clairement établi, nous savons que la GnP est un réticulant bi-fonctionnel qui réagit
avec les amines primaires (Figure II-28).
94
Figure II-28 : Mécanisme présumé de la réaction de réticulation d’amines primaires par la
génipine (d’après Butler et al.).16
Nous pouvons noter que d’après ce mécanisme de réticulation, les chaînes de CSA ne sont
vraisemblablement pas impliquées, puisqu’elles ne possèdent pas de groupements amines.
Lors de la réaction, la GnP se colore en bleu, avec un maximum d’absorbance situé aux
alentours de 590 nm. Ce phénomène permet le suivi de la réaction par spectroscopie UV-
Visible lors de la réticulation de PLL au sein des films (CSA/PLL).
Trois types d’architectures LbL sont utilisées : PEI/(CSA/PLL)6, PEI/(CSA/PLL)12 et
PEI/(CSA/PLL)18. Les films composés de 6 et 12 bicouches sont construits manuellement,
ceux composés de 18 bicouches sont construits de manière automatisée (§ II.A.3 b). Avant
réticulation, les films sont rincés, puis immergés 30 minutes dans du tampon DPBS, afin
d’éliminer le tampon Tris - NaCl.
Les solutions de GnP (Wako Chemicals GmbH) ont été préparées dans du tampon DPBS à
une concentration de 0,50 % (m/m) (22,10 mmol L-1) ou 0,25 % (m/m) (11,05 mmol L-1). Ces
solutions seront par la suite désignées par : GnP25 et GnP50.
Après conditionnement dans du DPBS, les films ont été immergés pendant 16 heures à
température ambiante dans des solutions de GnP50 ou GnP25.
Après réticulation, les films ont été rincés et stockés dans le tampon DPBS. On notera
PEI/(CSA/PLL)i-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)i-GnP50 (avec i le nombre de paires de couches
(CSA/PLL)). Les films non réticulés seront appelés films natifs.
Afin d’étudier la cinétique de réticulation, les lamelles de verre recouvertes d’un film
PEI/(CSA/PLL)18 ont été introduites verticalement dans des cuves de spectroscopie, puis
mises en contact avec la solution de réticulation. Une mesure d’absorbance entre 580 et
95
700 nm a été effectuée toutes les 2 heures, en prenant comme référence une lamelle de verre
recouverte d’un même film immergée dans du tampon DPBS.
II.C.2 Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine

Afin d’explorer la vectorisation et l’incorporation de composés actifs au sein des films
LbL, nous avons étudié l’immobilisation dans les films d’un dérivé polymère de β-
cyclodextrine anionique (noté pCD) comme vecteur potentiel. L’étude a été menée par QCM-
D, OWLS et AFM. Des films PEI/(CSA/PLL)5±CSA ont été mis en contact avec des
solutions de pCD à une concentration de 1 mg mL-1. L’incorporation, dans les mêmes
conditions de l’analogue non chargé (noté pCD0) ou du monomère anionique (noté CD) du
vecteur a été également étudiée.
Dans le cadre d’une collaboration avec le Dr C. Morin du laboratoire COBRA – UMR
6014, les films LbL fonctionnalisés par la pCD ont été envisagés pour de la séparation chirale
d’énantiomères par électrophorèse capillaire. Afin de s’assurer de la stabilité dans les
conditions courantes d’analyses par électrophorèse capillaire, nous avons étudié l'influence du
pH (pH 4,5, tampon acétate ; pH 8,5 tampon Tris – NaCl) et de la force ionique (tampon Tris
avec différentes concentrations de NaCl) sur la stabilité de nos films enrichis en pCD.
II.D Etude des comportements cellulaires

La lignée cellulaire MC3T3-E1 a été établie par Sudo et al.17 en 1983 à partir de la
calvaria, un os plat du crâne de souris nouveau-nées. Elles produisent une matrice
extracellulaire abondante, notamment composée de fibronectine. Ces cellules ont été
sélectionnées pour leur taux élevé de phosphatase alcaline sécrétée lorsqu'elles sont à
confluence. Durant leur croissance, elles montrent une morphologie fibroblastique. Après la
confluence, elles adoptent une organisation en nodules, riches en matrice extracellulaire, au
sein desquels les cellules ont une morphologie d'ostéoblastes.
Ces modifications de morphologie et d'activité métabolique (augmentation de l'activité de
la phosphatase alcaline, synthèse d'une matrice minérale) montrent que ces cellules ont la
capacité de se différencier en ostéoblastes et en ostéocytes, et ainsi former du tissu osseux
calcifié in vitro. Cette différenciation entraîne des modifications phénotypiques des MC3T3-
E1, comme la production de sialoprotéines osseuses, d'ostéopontine, d'ostéocalcine18 et de
collagène I.19
96
La différenciation nécessite la présence (i) d'acide ascorbique, indispensable à
l'hydroxylation du collagène qui peut alors former une triple hélice et s'assembler en fibrilles,
ainsi que (ii) d’une source de phosphate inorganique, souvent le β-2-glycérophosphate.
L'interaction des fibrilles de collagène avec la cellule, via l'intégrine α2β1 permet l'activation
de voies de signalisation aboutissant à l'expression de gènes de différenciation et à la
minéralisation.18
II.D.1 Conditions standards de culture cellulaire

La lignée de préostéoblastes murins MC3T3-E1 est cultivée en routine dans du milieu α-
MEM (Sigma-Aldrich), complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (Sigma-Aldrich), en
présence de 2 mM de L-glutamine (Gibco), de streptomycine (100 µg.mL-1) et de pénicilline
(100 unités.mL-1) (Sigma). Ce milieu sera nommé « standard » par la suite. La culture est
réalisée dans un incubateur à 37°C, sous 5% de CO2 et 95% d’humidité. A 80% de
confluence, les cellules sont décollées de leur support de culture T25 ou T75 (Corning) par
action de trypsine/EDTA (Sigma). Elles sont ensuite centrifugées à 1000 g pendant 5 minutes
et comptées, puis réensemencées à une densité de 1 x 104 cellules cm-2 dans des boîtes de
culture T25 ou T75.
II.D.2 Etude de la morphologie cellulaire

Pour l’observation de la morphologie cellulaire, les cellules sont ensemencées sur les
différents substrats à une densité de 2 x 104 cellules cm-2, dans du milieu de culture standard.
Des photographies sont effectuées à différents intervalles de temps, grâce à une caméra CCD
installée sur un microscope inversé (Motic).
Un marquage fluorescent des MC3T3-E1 est également réalisé, de manière à évaluer
l’organisation du cytosquelette lors des premières heures de contact avec les films LbL.
Celles-ci sont ensemencées à une densité de 2 x 104 cellules cm-2 et cultivées pendant 3
heures sur les différents substrats. Les échantillons sont ensuite rincés au DPBS, puis fixés
avec une solution de paraformaldéhyde à 3 %. Les échantillons sont rincés trois fois au DPBS.
Le marquage est réalisé avec de la phalloïdineFITC (Sigma-Aldrich), qui permet de révéler
l’actine du cytosquelette des cellules, ainsi que du 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui
permet le marquage de l’ADN. Après marquage, les échantillons sont montés sur des lames
de microscope à l’aide d’une résine (Mowiol 4-88) et séchés une nuit à 4°C. Les observations
sont réalisées sur un microscope à épifluorescence (Scope.A1 Zeiss).
97
II.D.3 Viabilité et prolifération : test Alamar Blue®
La viabilité et la prolifération des cellules MC3T3-E1 cultivées sur les différents substrats
sont évaluées par des tests Alamar Blue® (Thermo Scientific Pierce). Ce test basé sur la
réduction d’un indicateur de l’activité mitochondriale des cellules pendant leur prolifération,
est le reflet d’une activité métabolique, et peut également être corrélé avec le nombre de
préostéoblastes.20 Les cellules, au cours de leur prolifération réduisent le marqueur, le faisant
passer du bleu (forme oxydée) au rouge (forme réduite). Le test est réalisé sur une période de
9 jours, une mesure étant réalisée après 2 jours (J2), 5 jours (J5) et 9 jours (J9). Les cellules
sont ensemencées sur les substrats à une densité de 1 x 104 cellules cm-2. Pour chaque point de
cinétique, le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture standard contenant 10%
d’Alamar Blue®. Après 4 heures d’incubation, les absorbances sont mesurées à 570 nm et
600 nm. Le taux de marqueur réduit est calculé d’après les instructions du fabricant. En
parallèle, une courbe de calibration entre le pourcentage de réduction du marqueur et le
nombre de cellules est réalisée, de manière à exprimer les résultats en densité cellulaire.
II.D.4 Évaluation de la différenciation

a. Activité de la phosphatase alcaline, PAL
Les préostéoblastes murins MC3T3-E1 sont ensemencés sur les substrats étudiés, à une
densité volontairement élevée (5 x 104 cellules cm-2), afin de découpler la prolifération et la
différenciation, puis incubées 24 heures dans du milieu de culture standard. Ils sont ensuite
cultivés dans du milieu de culture standard complémenté de 10 mM de β-glycérophosphate
(Sigma-Aldrich), et de 50 µg mL-1 d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich), appelé milieu de
différenciation. En parallèle, afin d’étudier le pouvoir ostéogénique de nos systèmes, d’autres
substrats sont ensemencés par des MC3T3-E1 à la même densité, mais cultivés dans un milieu
de croissance dépourvu de facteurs de différenciation. Les milieux sont changés trois fois par
semaine afin que les cellules bénéficient d’un apport continu en facteurs de différenciation.
Cette étude est réalisée sur 21 jours, une mesure étant réalisée à J7, J14 et J21. Les cellules
sont d’abord rincées au tampon DPBS, récoltées après trypsination, puis lavées deux fois dans
du DPBS. Afin de récupérer la PAL intracellulaire, les cellules sont lysées par un tampon
Tris - Triton 0,1% à pH 10,2, puis congelées/décongelées trois fois.
Le surnageant du lysat cellulaire est récupéré après une centrifugation de deux minutes à
300 g. L’activité de la PAL est déterminée par hydrolyse de p-nitrophénol phosphate (PNPP)
en p-nitrophénol (PNP) : 250 µL de surnageant de lysat sont ajoutés à 1 mL de solution de
PNPP dans du tampon Tris - NaCl à pH 10. Le mélange est incubé pendant deux heures, puis
98
la réaction est stoppée par ajout de 250 µL de NaOH à 3 M (pour une concentration finale de
0,5 M dans le milieu réactionnel).
La quantité de PNP formée est déterminée par spectroscopie UV-visible par mesure de
l’absorbance de la solution obtenue, à 405 nm. La quantité totale de protéines intracellulaires
est dosée par un kit de dosage micro-BCA (Thermo Scientific Pierce). La quantité de PNP
formée est ensuite normalisée par rapport à la quantité totale de protéines, afin d’exprimer
l’activité de la phosphatase alcaline en quantité de PNP formé, par unité de temps et par
quantité de protéines intracellulaires.
b. Minéralisation de la matrice extracellulaire

Afin d’évaluer les capacités de minéralisation de la matrice extracellulaire (MEC) par les
MC3T3-E1 sur les différentes surfaces, les cellules sont ensemencées et cultivées dans les
mêmes conditions que celles décrites pour le dosage de l’activité de la PAL. Les cellules sont
cultivées pendant 8 semaines dans ces conditions.
L’Alizarine Red S (ARS, Sigma) est utilisée ici comme révélateur de la présence de dépôts
de phosphate de calcium. Pour cela, les cellules cultivées en milieu de différenciation sont
rincées au tampon DPBS, puis fixées au formaldéhyde 10% (Sigma) pendant 10 minutes. Les
échantillons sont rincés trois fois à l’eau ultrapure, de manière à éliminer l’agent de fixation,
puis sont ensuite marqués avec une solution d’ARS, à 2% dans l’eau ultrapure, à un pH
compris entre 4,1 et 4,3 (le pH est ajusté grâce à une solution de NaOH à 3 M). Avant
observation, les échantillons sont rincés une nouvelle fois à l’eau ultrapure. L’observation est
effectuée grâce à un microscope inversé (Motic). La présence de dépôt de phosphate de
calcium est révélée par une coloration rouge de l’échantillon.
II.D.5 Tests statistiques

Les tests cellulaires ont été réalisés 3 fois en parallèle. Les résultats sont exprimés par la
moyenne ± écart type sur la moyenne. Les différences statistiques entre deux groupes ont été
définies par le test non paramétrique de Mann – Whitney – Wilcoxon. Le seuil de confiance
est fixé pour une valeur de p inférieur à 0,05.
99
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101
Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la
rigidité du substrat sur le comportement de préostéoblastes
murins MC3T3-E1
III.A Introduction 102
III.B Analyse des substrats 105

III.B.1 Substrats PDMS bruts 105
a. Caractérisation mécanique 105
b. Caractérisation de surface 108
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL 112
a. Adsorption de la couche précurseur de PEI 112
b. Caractérisation des films LbL 113
III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.C.1 Morphologie cellulaire 116
III.C.2 Prolifération cellulaire 121
III.C.3 Différenciation cellulaire 123
III.D Conclusion 127
III.E Références bibliographiques 127
III.A Introduction
La chimie et la mécanique du microenvironnement cellulaire sont des paramètres combinés
qui influencent le comportement cellulaire. Dans les tissus osseux, la fraction organique de la
matrice extracellulaire (MEC), composée de diverses macromolécules (collagène,
protéoglycanes, protéines non collagéniques), offre à la fois un substrat pour les cellules, et un
réservoir pour les cytokines et les facteurs de croissance. De plus, les cellules osseuses
doivent d’adapter aux variations de la rigidité de la MEC accompagnant la minéralisation
durant l’ostéogénèse, et le remodelage osseux. La chimie et la rigidité du substrat doivent
donc être combinées judicieusement lors de la conception de biomatériaux pour l’ingénierie
tissulaire osseuse.1
Les multicouches de polyélectrolytes, ou films « Layer-by-Layer » (LbL), sont des outils
prometteurs pour mimer l’environnement biochimique cellulaire. La construction de ces
102
films, basée majoritairement sur des interactions électrostatiques, peut être effectuée à la
surface de substrats de formes ou de natures chimiques variées,2 ce qui les rend intéressants
pour des applications d’ingénierie tissulaire. De plus, il est possible d’utiliser des
polyélectrolytes biomimétiques et/ou d’origine biologique (polypeptides, polysaccharides et
protéines) biochimiquement favorables au développement cellulaire, à moyen et long terme,
et d’insérer des composés bioactifs au sein des architectures LbL en vue de leur relargage in
situ.3 L’épaisseur des films, qui est principalement contrôlée par le nombre d’étapes
d’adsorption, est un paramètre important dans la modulation des comportements cellulaires.
Alors que l’augmentation de l’épaisseur des films LbL pourrait permettre un chargement plus
important de composés bioactifs, cela a un effet défavorable sur l’adhésion cellulaire, du fait
de leur faible rigidité. Par exemple, les cellules mésenchymateuses humaines (hMSCs) ne
peuvent pas développer de points focaux d’adhésion sur des films (PDADMAC/PSS)50 à
cause de leur trop faible rigidité.4 Il a été démontré qu’une rigidification de ces architectures
par des variations de force ionique5 ou de pH6 avait un effet promoteur sur l’adhésion
cellulaire. Dans le cas de films biomimétiques composés de polysaccharides et/ou de
polypeptides, la stratégie actuelle de rigidification consiste principalement à réticuler les films
par la chimie des carbodiimides (EDC/NHS).7 Ce procédé peut cependant avoir un effet
cytotoxique dans le cas où une fraction de l’agent réticulant n’ayant pas réagi resterait piégée
dans le film LbL.8
De manière à mimer l’environnement mécanique cellulaire, les polymères représentent des
biomatériaux polyvalents, car ils offrent une grande variété de structures chimiques, et parce
qu’ils donnent accès à une large gamme de rigidités, de l’ordre du kPa jusqu’au GPa. L’acide
poly(L-lactique) (PLLA),9 l’alginate10 ou le polyéthylène glycol (PEG)11 par exemple, sont
souvent étudiés comme des substituts osseux potentiels. De façon à étudier d’un point de vue
plus fondamental l’influence de l’élasticité du substrat sur les comportements cellulaires, des
gels ou des élastomères modèles présentant des propriétés mécaniques finement définies par
le taux de réticulation, comme le polyacrylamide (PA), 12,13 le poly(diméthylsiloxane)
(PDMS),1,14 ainsi que de nombreux polysaccharides et/ou polypeptides,15,16 sont souvent
utilisés. Par exemple, il a été démontré que des hMSCs cultivées sur des gels de
polyacrylamide, dont l’élasticité variait de 1 kPa à 34 kPa, adaptaient leur phénotype en
exprimant des protéines précurseur typiques des tissus nerveux sur les gels souples, et des
protéines ostéogéniques sur les gels rigides.12 Alors que les gels de PA ne sont limités qu’à
des rigidités situées entre 0,1 et 100 kPa,17 le PDMS donne accès à une plus large gamme de
rigidités, située entre le kPa et le MPa.18 Cela le rend particulièrement intéressant pour l’étude
103
des comportements des cellules osseuses. De plus, le PDMS est déjà utilisé pour des
applications biomédicales, comme certaines lentilles de contact ou certains stimulateurs
cardiaques, du fait de sa biocompatibilité.19
Dans cette partie du travail, nous avons fonctionnalisé, au moyen de films LbL, des
substrats de PDMS de rigidité contrôlée, pour fabriquer des substrats modèles pour l’étude de
la réponse cellulaire combinée aux signaux chimiques et mécaniques du microenvironnement.
Les films LbL biomimétiques utilisés sont constitués d’un glycosaminoglycane (GAG), la
chondroïtine-4-sulfate, ou chondroïtine sulfate A (CSA), et d’un polypeptide, la poly( L-
lysine) (PLL). Les GAGs sont des polysaccharides anioniques composés d’unités
disaccharidiques sulfatées et/ou carboxylées répétées. Ce sont des composés très hydrophiles,
chaque unité disaccharidique pouvant être entourée de 30 molécules d’eau. 20 Les
chondroïtines sulfates (CS), une catégorie de GAGs ubiquitaires, sont des composants
majeurs des MEC des tissus osseux, cartilagineux, ainsi que d’autres tissus conjonctifs. Elles
sont présentes dans les décorines et les biglycanes, deux des principaux protéoglycanes
osseux.21 Dans les tissus osseux, elles participent au mécanisme d’action de certains facteurs
de croissance endogéniques, et jouent un rôle fonctionnel dans la réparation tissulaire et
l’ostéointégration. Grâce à leur capacité à lier des facteurs de croissance et des composés
cationiques, les CS peuvent être utilisées comme réservoirs pour du relargage moléculaire in
situ.22 Elles ont également été utilisées pour le recouvrement de surfaces, 23 comme des
substituts poreux en combinaison avec le collagène,24 ou intégrées dans la composition de
ciments osseux.25 La PLL est un polypeptide polycationique, connu pour favoriser l’adhésion
cellulaire, via des interactions électrostatiques avec les membranes cellulaires chargées
négativement.26 De manière intéressante, la L-lysine est un acide aminé impliqué dans les
interactions protéines/GAGs.27 Des complexes (CS/PLL) ont été étudiés, soit en solution,28
soit sous forme de films LbL.29 Les films (CS/PLL) ont notamment été utilisés comme
substrats pour des cellules photoréceptrices,30 endothéliales31 et plus récemment, des
ostéoblastes.32
Dans cette étude, nous présentons l’effet combiné de (i) la chimie de surface de substrats
PDMS, contrôlée au moyen de films LbL PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, et (ii) de la rigidité de ces
substrats maintenue dans une gamme pertinente permettant de modéliser les conditions du
tissu osseux. Les substrats sont caractérisés, dans le volume et en surface, par analyse de leurs
propriétés mécaniques, de leur chimie, de leur mouillabilité et de leur topographie. Nous
démontrons que la rigidité des substrats et la chimie de surface sont des paramètres clefs, dont
la combinaison permet de moduler les comportements de préostéoblastes murins MC3T3-E1.
104
III.B Analyse des substrats
III.B.1 Substrats PDMS bruts
a. Caractérisation mécanique
Le PDMS est un élastomère à base de silicone, dont les propriétés mécaniques peuvent être
modulées et contrôlées par différents traitements. Il a été démontré notamment qu’une
augmentation de la température provoque une diminution de module élastique de matériaux à
base de PDMS.33,34 Une autre façon de contrôler les propriétés mécaniques du PDMS est de
mélanger les deux composantes du kit commercial, le pré-polymère et l’agent réticulant, à des
ratios différents. 18,19 Pour notre étude, c’est cette dernière voie qui a été retenue. Un déficit en
agent réticulant laissant des chaînes de polymères libres dans la structure de l’élastomère, la
rigidité s’en trouverait alors diminuée (§ II.A.2 ).
Dans le tissu osseux, les biomatériaux sont soumis à des sollicitations mécaniques aussi
bien en traction qu’en compression en fonction de leur site d’implantation. Il est important de
caractériser les substrats PDMS par des tests de traction et de compression et de déterminer
les propriétés mécaniques intrinsèques correspondantes de nos substrats en fonction de leur
taux de réticulation, afin de reproduire l’environnement mécanique des cellules hôtes,
notamment les ostéoblastes. Afin de couvrir la gamme de rigidités de la matrice osseuse en
cours de maturation (§ I.C.3 ), les ratios que nous avons utilisés sont, en masse, 3:100
(PDMS-3), 5:100 (PDMS-5), 7:100 (PDMS-7), 10:100 (PDMS-10) et 20:100 (PDMS-20).
Dans l’hypothèse de départ, le PDMS-3 est attendu comme étant le substrat le plus souple, le
PDMS-20 comme le plus rigide. Les différents substrats ont d’abord été caractérisés par des
tests mécaniques, en compression et en traction, de manière à déterminer le module élastique
(module de Young) respectifs.
Les courbes de contrainte-déformation (Figure III-1) montrent le caractère non linéaire du
PDMS. En outre, contrairement à ce qui était attendu, c’est le PDMS-10, et non le substrat
PDMS-20, qui est le substrat le plus rigide. Khanafer et al. ont montré que, pour une réaction
de réticulation réalisée pendant 12 heures à 65°C, c’est-à-dire proche de nos conditions, la
rigidité de substrats PDMS est supérieure pour une stœchiométrie de 11,1:100 par rapport à
une stœchiométrie de 10:100, puis diminue pour des stœchiométries plus élevées (12,5:100,
14,3:100, 16,7:100).18 Ils expliquent ce comportement par le fait qu’un excès d’agent
réticulant ralentit la réaction de réticulation, laissant des chaînes de polymère libres.
Cependant, ce comportement semble dépendre des conditions de réticulation. Pour une
105
réaction de 2 heures ou 24 heures à 70°C, Lee et al. ont montré que des substrats PDMS
contenant un excès, par rapport à la stœchiométrie de 10:100 conseillée par fabricant,
présentaient une diminution du module élastique. En effectuant cette réaction en deux temps
(2 heures à 70°C, puis 24 heures à 190°C), les substrats comportant un excès d’agent
réticulant présentaient au contraire un module élastique supérieur (~ 4 MPa) à celui des
substrats de référence (~ 2 MPa).19
Figure III-1 : Courbes de contrainte-

déformation (A) en compression et (B)
en traction pour les substrats PDMS-
3, -5, -7, -10 et -20 bruts, notés 3%,
B 5%, 7%, 10% et 20% respectivement.
Néanmoins, Chambon et al.35 ont montré qu’un déficit en agent réticulant est plus efficace
qu’un excès pour limiter le rendement de la réticulation, c'est-à-dire laisser des chaînes de
pré-polymères dont l’un des deux groupements vinyliques n’a pas réagi. Dans le cadre de
notre étude, la stratégie adoptée pour obtenir les rigidités les plus faibles de la gamme
106
physiologique visée a donc été d’utiliser des ratios inférieurs à 10:100, soit un déficit en agent
réticulant.
Le module élastique incrémental (Einc) est dérivé des courbes de contrainte-déformation
établies par des tests de compression et de traction (voir II.B.5 ). Il augmente de manière
graduelle avec le taux de réticulant jusqu’à une valeur maximale pour le PDMS-10,
correspondant à la stœchiométrie recommandée par le fabricant (Figure III-1).
Du fait du comportement mécanique non linéaire du PDMS, les valeurs de Einc diffèrent,
d’une part avec le domaine de déformation, et d’autre part avec le test mécanique appliqué
(Figure III-2).
Compression Traction
A B
C D
Figure III-2 : Courbes d’évolution de Einc en fonction de la déformation de l’éprouvette, lors

de test (A) en compression et (B) en traction, pour les échantillons de PDMS-3, -5, -7, -10 et -
20 bruts, notés 3%, 5%, 7%, 10% et 20% respectivement. Modules élastiques incrémentaux
des substrats PDMS-3, -5, -7, -10 et -20, dérivés des courbes de contrainte-déformation
établies par les essais (C) en compression et (D) traction.
107
Ces valeurs sont plus importantes en compression qu’en traction, quel que soit le domaine
de déformation. De plus, les tests en compression montrent des rigidités plus élevées dans le
domaine de déformation 15-30% que dans le domaine 5-15% (Figure III-2 C), tandis que le
résultat inverse est obtenu lors des tests en traction (Figure III-2 D).
Ce sont ces différences qui nous ont amenés à nommer les substrats PDMS par leur taux
d’agent réticulant plutôt que par la valeur de leur module élastique.
Le substrat PDMS-20 a été abandonné car sa rigidité se situant entre celle des substrats
PDMS-7 et PDMS-10, il ne présentait pas d’intérêt mécanique pour la suite de l’étude. Par
ailleurs, la présence probable d’agent réticulant libre au sein de sa structure pourrait
potentiellement exercer un effet cytotoxique sur les cellules.
b. Caractérisation de surface
La caractérisation de surface des PDMS bruts préparés avec différents taux d’agent
réticulant avait pour objectif de vérifier qu’ils ne présentaient pas de variations importantes de
leurs propriétés physico-chimiques.
Analyse par FTIR-ATR. La spectroscopie FTIR-ATR apporte des informations sur la

composition de la surface des substrats PDMS (Figure III-3 et Tableau III-1). Les spectres
obtenus par cette technique montrent que malgré les variations de quantité d’agent réticulant,
les substrats ne présentent pas de différence significative dans leur chimie de surface.
Figure III-3 : Spectres d’absorbance FTIR-ATR des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10.
108
Tableau III-1 : Attribution des bandes spectrales de FTIR-ATR des substrats PDMS bruts.
Position Région (cm-1) Corrélation
1 815-785 oscillation CH3 dans Si – (CH3)2
2 865-825 élongation Si – C et Si – O
3 920-875 élongation Si – O
4 1200-930 déformation Si – O – Si
5 1090-1055 élongation Si – O – Si
6 1270-1245 déformation CH3
7 2970-2950 élongation CH3
Mesure de l’angle de contact. Du fait de la nature apolaire des chaînes de siloxane

méthylés, les substrats PDMS sont très hydrophobes. Les mesures d’angle de contact
montrent des valeurs similaires et élevées pour tous les substrats PDMS bruts (118,3 et
128,9°), quel que soit le taux d’agent réticulant (Figure III-4), à priori défavorable au dépôt
de films LbL.
Différentes études montrent qu’il est possible de rendre les substrats PDMS moins
hydrophobes par oxydation de surface, par voie chimique ou physique. Les groupements
méthyles de surface sont alors substitués par des groupements polaires, -OH, -COOH, ou
-NH2 par exemple. Néanmoins, ces traitements n’apportent qu’une diminution provisoire de
l’hydrophobicité de surface, du fait de la mobilité des chaînes dans le PDMS.36 Par
conséquent, nous n’avons pas envisagé de modifier l’hydrophobicité native de nos substrats.
Malgré une légère diminution de l’angle de contact accompagnant l’augmentation du taux
d’agent réticulant entre les différents substrats, la variation d’hydrophobicité entre les
substrats reste négligeable. Cette diminution peut être expliquée par une plus faible quantité
de groupements méthyle disponibles suite à leur recrutement dans le mécanisme de
réticulation (§ II.A.2 ).
109
Figure III-4 : Angle de contact statique : images et mesures effectuées avec une goutte de
5µL de tampon Tris – NaCl, à température ambiante, sur les substrats PDMS-3, -5, -7 et -10.
Topographie et rugosité : MEB et AFM. L’utilisation de la microscopie électronique à

balayage (MEB) permet d’imager la surface de matériaux, et d’obtenir des informations
qualitatives sur la morphologie des substrats PDMS. Dans un premier temps, nous avons
envisagé de travailler avec des substrats circulaires découpés à l’aide d’un emporte-pièce dans
une membrane de PDMS préparée dans une boite de Pétri de 90 mm de diamètre.
Les images MEB de ces échantillons montrent une morphologie ridée de l’ensemble de
leur surface (Figure III-5). De telles structures sont décrites dans des études de nano- ou
micro- structuration de surface de substrats PDMS. Yang et al.37 ont étudié la formation de
ces rides en étirant, puis en relâchant des membranes de PDMS. Ils ont démontré qu’il était
possible de contrôler la morphologie et la taille de ces rides en étirant la membrane de PDMS
selon un ou deux axes et en modulant la force appliquée. Ces substrats structurés offrent un
outil pour l’étude des comportements cellulaires. Dans leurs travaux, Guvendiren et al.38 ont
utilisé cette propriété du PDMS pour fabriquer des moules et ainsi structurer des hydrogels à
base de poly-(2-hydroxyéthyl méthacrylate). Les hydrogels ont ensuite été utilisés pour
étudier le comportement de cellules souches humaines.
110
Figure III-5 : Images MEB d’un substrat
PDMS-5 découpé à l’aide d’un emporte
pièce, à deux grossissements différents
(échelle 100 µm, insert : 10 µm). Les rides
sont causées par l’opération de découpage.
Bien que ces microstructures présentent ainsi un intérêt pour l’étude des comportements
cellulaires, elles étaient inadaptées dans notre cas, puisque nous avions pour objectif de
découpler l’effet de la rigidité de celui de la rugosité. Nous avons donc abandonné le procédé
de perforation à l’emporte-pièce et avons opté pour la fabrication des substrats par moulage,
permettant d’éliminer la formation des rides.
Les images MEB des échantillons de PDMS obtenus par moulage dans des boites de Pétri
de 35 mm de diamètre, selon la méthode détaillée précédemment (Chapitre II) sont montrées
dans la Figure III-6. Les substrats ainsi obtenus présentent une surface lisse.
Figure III-6 : Images MEB de la surface des substrats PDMS-3 et -10 moulés dans des boites
de Pétri (barre d’échelle 10 µm).
Enfin, afin de confirmer que la variation du taux d’agent réticulant n’entraîne pas une
modification de la topographie des substrats, des images de la surface et des mesures de
rugosité Ra ont été effectuées par AFM (Figure III-7).
111
Figure III-7 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 (15 x 15 µm2, z =
500 nm) et valeurs de rugosité moyenne Ra pour chaque type de substrat.
Les substrats PDMS ainsi obtenus peuvent être considérés comme lisses puisque la
rugosité Ra est de l’ordre du nanomètre et identique, quel que soit le taux d’agent réticulant.
Ces substrats étant destinés à être recouverts de films LbL, la rugosité n’est donc pas un
facteur susceptible d’influencer le comportement des cellules préostéoblastiques. En effet,
Abdelkebir et al.39 ont démontré que les films PEI/(CSA/PLL)6 ont une épaisseur de plusieurs
dizaines de nanomètres, ce qui est suffisant pour masquer la rugosité nanométrique des
substrats PDMS.
III.B.2 Substrats PDMS fonctionnalisés par les films LbL

a. Adsorption de la couche précurseur de PEI
Avant la caractérisation des films (CSA/PLL)6±CSA construits sur les substrats PDMS, il
nous est apparu nécessaire de vérifier la présence de la couche précurseur de PEI et ce quel
que soit le ratio d’agent réticulant. Ce polymère très ramifié possède une forte densité de
charges cationiques qui permet un recouvrement uniforme des surfaces. Dans la méthode
LbL, son rôle est de produire un état de surface reproductible, et ainsi d’éliminer les variations
de l’état de surface d’une construction à une autre. Afin de visualiser la couche de PEI, nous
avons marqué le polymère avec un fluorophore (FITC). Ce marqueur fluorescent peut être
utilisé pour marquer et visualiser des macromolécules adsorbées sur des surfaces, comme des
protéines40 par exemple, et a déjà été utilisé pour le marquage de la PEI. 41 La PEIFITC est
112
utilisée comme la PEI non marquée, à une concentration de 5 mg mL-1, en tampon Tri - NaCl
afin d’étudier le recouvrement des substrats PDMS.
La Figure III-8 montre un recouvrement homogène et uniforme des différents substrats
PDMS par la PEIFITC, ce qui valide l’emploi de la PEI comme couche précurseur pour la
construction des films (CSA/PLL)6±CSA.
Figure III-8 : Microphotographies des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés par de
la PEI ou de la PEIFITC (vert).
b. Caractérisation des films LbL

L’étude des propriétés physico-chimiques des substrats PDMS fonctionnalisés par le
système (CSA/PLL)6 ± CSA est nécessaire pour vérifier si d’éventuelles différences de leurs
propriétés physico-chimiques, autres que la rigidité du PDMS sous-jacent et que la nature de
la couche externe du film LbL, peuvent expliquer des différences de comportements
cellulaires.
FTIR-ATR. Le premier de ces paramètres étudiés est la chimie de la surface, par

spectroscopie FTIR-ATR.
La Figure III-9 montre que pour les PDMS fonctionnalisés, les spectres sont dominés par
les bandes caractéristiques du PDMS brut (bande 3, élongation CH3). Les bandes 1 et 2,
correspondant respectivement aux bandes amides II et I montrent sans ambiguïté que les films
LbL (CSA/PLL)6 ± CSA ont effectivement été construits à la surface des substrats. La faible
intensité de ces bandes (1 et 2), comparée à celle du substrat brut, est due à la faible épaisseur
113
du films (CSA/PLL)6 ± CSA, de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres selon Abdelkebir
et al.,42 par rapport à la distance de pénétration de l’onde évanescente dans l’échantillon, qui
est de l’ordre de 2 µm. L’épaisseur du film ne représente ainsi que 5 à 10% de l’épaisseur
totale de l’échantillon sondée par FTIR-ATR.
Figure III-9 : Spectres FTIR-

ATR des substrats PDMS
fonctionnalisés par des films
PEI/(CSA/PLL)6/CSA (bandes 1 :
amide II ;bande 2 :amide I) avec
PDMS-3 brut comme contrôle
(bande 3 : élongation CH3).
Topographie et rugosité : MEB et AFM. Les images MEB (Figure III-10) ont été
effectuées dans des conditions de vide poussé sur des échantillons fixés et déshydratés. On
peut noter la présence d’îlots de matière de 1 à 2 µm de diamètre caractéristiques de
nombreux films LbL biomimétiques, indépendamment de la couche externe et du taux d’agent
réticulant du substrat PDMS.
Figure III-10 : Images MEB de substrats

PDMS-3 et -10 fonctionnalisés par
PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA (d’échelle 20
µm).
114
Afin de vérifier la topographie des échantillons dans des conditions environnementales,
c'est-à-dire hydratés et à pression atmosphérique, des analyses en AFM ont été réalisées.
La Figure III-11 confirme la présence des îlots observés par MEB. Les valeurs de rugosité
Ra montrent une augmentation nette de la rugosité entre les substrats non traités (Figure
III-7) et les substrats fonctionnalisés par les films LbL.
Cette morphologie des films (CSA/PLL) a déjà été décrite dans des travaux précédents
effectués au laboratoire39,42,43 et sont en accord avec les résultats d’une étude précédente
menée sur ce même système par Tezcaner et al.30
Figure III-11 : Images AFM 2D et 3D des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés
par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA (15 x 15 µm2, z = 500 nm).
115
Tableau III-2 : Paramètres de rugosité Ra et Rt des échantillons de PDMS-3, -5, -7 et -10
traités par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, exprimés en nm.
Substrats PDMS-3 PDMS-5 PDMS-7 PDMS-10
Couche PLL CSA PLL CSA PLL CSA PLL CSA
externe
Ra (nm) 33 ± 7 38 ± 3 33 ± 2 34 ± 2 37 ± 2 35 ± 2 35 ± 3 19 ± 1
Rt (nm) 305 ± 52 364 ± 9 400 ± 49 300 ± 12 474 ± 10 410 ± 4 435 ± 46 368 ± 61
La rugosité de surface induite par les îlots de matière est susceptible de moduler les
comportements cellulaires. L’influence de la rugosité des substrats sur les comportements
cellulaires a fait l’objet de nombreuses études. L’adhésion et l’attachement des cellules
ostéoblastiques notamment sont généralement améliorés sur des substrats rugueux par
rapports à des substrats lisses.44 Brett et al. ont démontré que le profil d’expression génique
d’ostéoblastes en culture sur des surfaces de titane était modifié par une augmentation de la
rugosité de leur substrat, par l’expression de gènes potentiellement impliqués dans la
différenciation ostéogénique. 45 Cependant, ces résultats sont observés sur des substrats dont
la rugosité Ra est de l’ordre du micromètre et comparés à des cellules cultivées sur des
substrats, considérés comme lisses, dont la rugosité Ra est de l’ordre de 0,3 µm, supérieur à
celle de nos substrats.
Tous nos échantillons de PDMS fonctionnalisés par les films LbL présentent des rugosités
similaires. C’est pourquoi, malgré l’influence avérée de la rugosité sur les comportements
cellulaires, nous pouvons considérer que seuls les paramètres susceptibles de moduler ces
comportements au cours de notre étude sont la rigidité du substrat PDMS sous-jacent et la
nature de la couche externe des films LbL.
III.C Etude des comportements cellulaires

III.C.1 Morphologie cellulaire
Dans un premier temps, des observations en microscopie optique ont été réalisées 24
heures et 10 jours après ensemencement. La Figure III-12 montre qu’après 24 heures, les
cellules sont capables d’adhérer sur tous les substrats, quelles que soient la chimie de surface
et la rigidité du substrat sous-jacent. On note cependant, dès 24 heures, un effet marqué de la
couche terminale de PLL, sur laquelle on observe une amélioration des capacités d’adhésion
et d’étalement des cellules par rapport aux films terminés par la CSA. Ce premier résultat
116
montre que la couche externe du film LbL, donc la chimie de surface, exerce une influence
sur la morphologie des cellules dès les premiers instants de contact avec leur substrat.
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, à une densité de 2.104 cellules
cm-2, 24 heures après ensemencement (barre d’échelle 200 µm).
117
La rigidité du substrat PDMS sous-jacent module également la morphologie cellulaire. On
observe que les cellules cultivées sur les substrats souples adoptent une morphologie
fusiforme alors que celles cultivées sur les substrats rigides adoptent une morphologie
cuboïdale.
Cependant, lorsque les substrats sont fonctionnalisés par les films PEI/(CSA/PLL)6/CSA, les
cellules sont moins étalées sur les substrats souples (PDMS-3 et -5) que sur les substrats
rigides (PDMS-7 et -10). D’une manière générale, les cellules cultivées sur les films
PEI/(CSA/PLL)6 sont mieux étalées, quel que soit le substrat PDMS considéré. Globalement,
nos résultats montrent que l’adhésion des cellules MC3T3-E1 est donc influencée à la fois par
la chimie de la couche terminale du film LbL et par la rigidité du substrat sous-jacent.
Il est à noter que les MC3T3-E1 sont des ostéoblastes non matures, trouvés dans les os
plats qui subissent une ossification intramembranaire, correspondant à une minéralisation du
tissu fibreux. Ces cellules sont localisées à la surface de l’ostéoïde non minéralisé, composé
d’un réseau de collagène, entouré de glycosaminoglycanes (GAGs), dont la CSA. Il a
récemment été démontré par nanoindentation AFM en conditions humides, que la rigidité
ressentie par les cellules dans cet environnement était de 150 kPa.46 L’environnement
biologique des cellules MC3T3-E1 est donc très proche des substrats PDMS-3, en terme de
rigidité (Figure III-2). Bien que les substrats PDMS-3-CSA offrent aux cellules MC3T3-E1
les conditions mécaniques et chimiques les plus proches de leur environnement naturel, la
couche terminale de CSA semble ne pas promouvoir de façon optimale l’adhésion cellulaire.
Après 10 jours de cultures, nous notons que les cellules sont capables de coloniser leurs
substrats, quelles que soient la rigidité du substrat sous-jacent et la nature de la couche
terminale, avec cependant un effet favorable de la PLL par rapport à la CSA (Figure III-13).
Alors que sur les films terminés par la PLL les cellules forment une monocouche et
approchent de la confluence, elles forment des amas dont la taille augmente avec la rigidité du
substrat sous-jacent quand elles sont cultivées sur une couche terminale de CSA. Ce
comportement peut être attribué au fait que, comme cela a été formulé précédemment, la CSA
ne semble pas avoir un effet favorable sur l’adhésion et l’étalement des cellules, ces dernières
favorisent les interactions cellules-cellules. Plusieurs travaux ont montré les interactions
cellules-cellules protègent les cellules de l’anoïkis, mécanisme d’apoptose déclenché par un
défaut d’adhésion au substrat, notamment via les cadhérines,47,48 ou les jonctions
communicantes.49
118
7 et -10 fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 ± CSA, à une densité de 2.104 cellules
cm-2, 10 jours après ensemencement (barre d’échelle 200 µm).
Dans un deuxième temps, les cellules ont été observées en MEB, après fixation et
métallisation. Après 24 heures de culture, ces observations confirment qu’une couche
terminale de CSA induit une morphologie cellulaire plus ronde et moins étalée qu’une couche
119
terminale de PLL (Figure III-14). L’adhésion des cellules sur CSA paraît donc plus faible
que sur PLL, le polysaccharide pouvant induire un retard dans l’étalement des MC3T3-E1. Au
contact de films terminés par PLL sur les substrats les plus rigides, nous notons que les
cellules sont capables, dès 24 heures, d’entamer des processus cellulaires, comme la mitose.
Cette observation confirme que les films terminés par PLL offrent des possibilités d’adhésion
et d’étalement suffisantes pour que les cellules soient capables de se diviser.
Figure III-14 : Images MEB de

cellules MC3T3-E1 cultivées sur des
substrats (A) PDMS-3 PLL, (B)
PDMS-3 CSA, (C) PDMS-10 PLL et
(D) PDMS-10 CSA, à une densité de
5.103 cellules cm-2, 1 jour après
ensemencement (barre d’échelle 5
µm).
Les GAGs sont des molécules ubiquitaires, retrouvées à la fois dans la matrice
extracellulaire et sur les membranes des cellules. Il a été démontré que certains GAGs, dont
l’héparane sulfate et la CSA empêchent l’adhésion des cellules osseuses humaines au
fragment « heparan-binding » de la fibronectine (Fn).50 Les répulsions électrostatiques entre
les GAGs chargés négativement et la membrane cellulaire, elle aussi chargée négativement,
ainsi que le fort taux d’hydratation de ces molécules, sont susceptibles de limiter l’adhésion
des cellules sur les substrats terminés par CSA.
Des interactions spécifiques sont également envisageables pour expliquer l’adhésion des
MC3T3-E1 à leurs substrats. En effet, ces cellules sont connues pour exprimer le récepteur
CD44,51 une glycoprotéine impliquée dans certains mécanismes d’interaction cellules-
protéines et cellules-cellules. D’une manière intéressante, la CD44 est un récepteur des
cellules pour l’acide hyaluronique, ainsi que d’autres GAGs, dont la CSA.52 L’annexine VI,
un récepteur spécifique des chondroïtines sulfates (CS), connu pour conditionner l’adhésion
120
des cellules à des matrices contenant des GAGs pourrait également être impliquée dans le
mécanisme d’adhésion des cellules sur les films PEI/(CSA/PLL)6/CSA. 53
Des protéines d’adhésion sont aussi susceptibles de s’adsorber à la surface des films LbL.
Cette adsorption intervient très rapidement, avant que les cellules n’entrent en contact avec
leur substrat. Ces protéines d’adhésion sont apportées par le sérum utilisé pour complémenter
le milieu de culture dans lequel les cellules sont ensemencées. La Fn, en particulier, peut être
également apportée par les cellules elles-mêmes, les MC3T3-E1 étant connues pour la
synthétiser et la sécréter très rapidement. Il a été démontré que la Fn s’adsorbe en plus grande
quantité sur une couche positive que sur une couche négative, ce qui peut s’expliquer par la
nature anionique de cette protéine, à pH physiologique.54
Nous pouvons aussi supposer que la Fn, ainsi que d’autres protéines d’adhésion chargées
négativement, s’adsorbent davantage sur les films terminés par la PLL que sur les films
terminés par la CSA, y favorisant l’adhésion cellulaire.
Par ailleurs, l’architecture même des films LbL peut présenter des sites où la PLL serait
accessible aux cellules et favoriserait les interactions cellules-substrats, dans la mesure où les
membranes cellulaires sont chargées négativement et la PLL est de nature cationique.
En résumé, nous avons observé que la réponse à court terme des MC3T3-E1 vis-à-vis de la
morphologie et de l’adhésion, varie non seulement en fonction de la nature chimique de la
couche terminale, avec un effet favorable de la PLL, mais aussi en fonction de la rigidité du
substrat sous-jacent, avec un effet favorable des substrats les plus rigides.
Afin d’étudier l’influence à plus long terme de ces paramètres sur les comportements
cellulaires et de confirmer les observations effectuées en microscopie optique après 10 jours
de culture, nous avons mené une étude quantitative de la prolifération cellulaire.
III.C.2 Prolifération cellulaire

Les capacités de prolifération des MC3T3-E1 ont été mesurées en fonction du temps, de la
rigidité du substrat et de la nature de la couche externe. L’étude a été menée par mesure de
l’activité mitochondriale des cellules grâce au test Alamar Blue® (Figure III-15).
121
Figure III-15 : Prolifération des cellules MC3T3-E1 en fonction de la composition externe de
la surface et de la rigidité des substrats PDMS sous-jacents. Les cellules sont cultivées sur les
substrats PDMS-3, -5, -7 et -10, fonctionnalisés par des films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)6/CSA, notés PLL et CSA respectivement. La prolifération est mesurée par un
test Alamar Blue® après culture pendant 2, 5 et 9 jours. Les résultats sont corrélés avec la
densité cellulaire à l’aide d’une courbe de calibration. * p < 0,05.
Les cellules sont capables de proliférer sur tous les substrats pendant toute la durée du test,
soit 9 jours. Pendant les deux premiers jours, le seul facteur discriminant pour la prolifération
semble être la nature de la couche externe. Durant cette période, l’activité métabolique sur les
substrats terminés par PLL est plus importante que sur les substrats terminés par une couche
de CSA, quelle que soit la rigidité du substrat sous-jacent. De plus, la rigidité n’influence pas
la prolifération.
À partir de 5 jours de culture, et jusqu’à 9 jours, la rigidité du substrat sous-jacent devient
un caractère discriminant. Les cellules commencent à ressentir la rigidité du substrat sous-
jacent. La prolifération est plus importante sur les substrats les plus rigides. Ces travaux sont
en contradiction avec une étude menée par Lee et al., rapportant que la prolifération de
cellules MC3T3-E1 transformées cultivées sur des substrats PDMS revêtus de Fn n’était pas
affectée par les variations de rigidité, sur une période de 10 jours.19 Cependant, nos résultats
sont en accord avec ceux d’une étude de Brown et al., sur des cellules de muscle lisse
vasculaires, montrant l’existence d’un délai dans la réponse cellulaire dû à l’adaptation des
cellules aux conditions de surface, avant qu’elles n’établissent une réponse à la rigidité sur le
long terme.1
122
Une récente étude décrit le comportement de cellules d’ostéosarcome humain cultivées sur
des films (PLL/CS)10 construit sur des substrats de verre, soit de très grande rigidité (~ 70
GPa).32 La prolifération, étudiée sur une période de 7 jours, montre une diminution très
importante de la prolifération cellulaire, indiquant un effet cytophobique de ces films. Les
auteurs attribuent cet effet à la faible rigidité des films (inférieure à 9 kPa), due au fort taux
d’hydratation de la CS (63%). L’environnement serait alors perçu par les cellules comme
fluide, et ne permettrait pas un ancrage suffisant pour qu’elles s’étalent. Les auteurs
rapportent également qu’un système composé d’un film LbL interne (PLL/PGA)9 et d’une
couche externe de CS, plus rigide que le système (PLL/CS)10, maintient le phénotype
prolifératif chez des ostéoblastes. Ce résultat confirme que l’inhibition de la prolifération
observée n’est pas due à un signal chimique de la CS, mais plutôt à sa structure proche d’un
hydrogel, fortement hydraté et souple.
Nos résultats suggèrent une influence combinée de la nature chimique de la couche externe
du film LbL et de la rigidité du substrat PDMS sous-jacent sur l’adhésion et la prolifération
des cellules MC3T3-E1. Afin de vérifier si cette combinaison influence les comportements à
long terme, et permet de contrôler le potentiel ostéoconducteur de nos substrats, les capacités
de différenciation des cellules MC3T3-E1 en ostéoblastes matures ont été examinées par
dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) intracellulaire.
III.C.3 Différenciation cellulaire

La Figure III-16 rapporte les résultats de dosage de l’activité de la PAL réalisée, après 7,
14 et 21 jours de culture, sur les cellules en culture sur les substrats fonctionnalisés, en
fonction de la rigidité, de la chimie de la couche externe et du milieu de culture. Afin
d’étudier les propriétés ostéoconductrices des substrats, les cellules ont été cultivées dans du
milieu de culture standard, c'est-à-dire ne contenant pas de facteurs exogènes de
différenciation. Après 7 jours, l’activité de la PAL est plus importante sur PDMS-3-PLL que
sur PDMS-3-CSA. Nous n’observons pas d’influence de la chimie de surface pour les autres
substrats. Après 14 jours, une influence marquée de la chimie de surface apparaît, avec un
effet globalement promoteur de la couche terminale de PLL par rapport à la couche terminale
de CSA. Après 21 jours, l’activité de l’enzyme est plus élevée sur les substrats terminés par
CSA que sur ceux terminés par une couche de PLL. Ce phénomène pourrait être dû à un
meilleur effet promoteur de la CSA par rapport à la PLL et/ou à un retard dans la biosynthèse
de l’enzyme. De plus, un effet de la rigidité est observé à 14 jours et 21 jours, sur les substrats
123
terminés par la CSA uniquement. Pour ces substrats, nous observons une augmentation de
l’activité de la PAL lorsque la rigidité du substrat sous-jacent augmente.
Milieu standard Milieu ostéogénique
Activité de la phosphatase alcaline (u.a.)
Figure III-16 : Activité de la phosphatase alcaline de cellules MC3T3-E1, en fonction de la

chimie de la couche externe, du substrat sous-jacent et du milieu de culture. Les cellules sont
cultivées sur des substrats PDMS-3, -5, -7 et -10 fonctionnalisés par des films
PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)6/CSA, notés respectivement PLL et CSA. Les cellules sont
cultivées dans du milieu de croissance ou du milieu ostéogénique, puis récoltées après 7, 14
et 21 jours. L’activité enzymatique est normalisée par les protéines intracellulaires totales.
* p < 0,05.
124
En parallèle, des cellules MC3T3-E1 ont été cultivées dans un milieu ostéogénique, c’est-
à-dire contenant des facteurs exogènes de différenciation (acide ascorbique et β-
glycérophosphate). Dans ces conditions, dès 7 jours, nous observons le même effet promoteur
de la couche externe de PLL, que celui détecté à J14 en milieu standard. En revanche, après
14 jours, nous notons une meilleure activité de la PAL sur les substrats terminés par la CSA.
Cet effet est similaire à celui observé en milieu standard, mais intervenant plus tôt. Nous
observons à J14 une dépendance mécanique de l’activité de la PAL, qui augmente clairement
avec la rigidité du substrat sous-jacent pour des films terminés par CSA. Après 21 jours, nous
n’observons plus d’influence ni de la rigidité du substrat sous-jacent, ni de la nature de la
couche externe. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les MC3T3-E1 synthétisent leur
propre matrice. Sous l’action de l’acide ascorbique, elles synthétisent et sécrètent du
collagène de type I, contrôlant ainsi leur environnement chimique et mécanique. De plus, les
cellules ont alors dépassé le maximum de sécrétion de la PAL, qui intervient sous la forme
d’un pic au début de la différenciation en ostéoblastes.
Le rôle de la chimie de la couche externe dans la différenciation des préostéoblastes
MC3T3-E1 peut être relié aux résultats des tests de prolifération. La PLL a une influence
positive sur la croissance cellulaire, comparée à la couche terminale de CSA. Les cellules sont
donc susceptibles d’atteindre la confluence plus rapidement, et de passer d’un phénotype
prolifératif à un phénotype de différenciation plus rapidement. Les résultats de dosage de
l’activité de la PAL montrent que les cellules sont capables de se différencier avec une couche
externe de CSA, quel que soit le substrat sous-jacent, mais avec un retard par rapport aux
cultures sur substrats terminés par la PLL.
La protéine CD44, récepteur spécifique de GAGs, outre son implication dans l’adhésion, la
prolifération ou la migration cellulaire, joue un rôle dans la différenciation ostéogénique,
notamment via l’activation de la protéine Smad 1, sous stimulation par la Bone Morphogenic
Protein 7 (BMP-7).55 Kawano et al. ont démontré que l’acide hyaluronique, un GAG,
combiné à la BMP-2, a un effet positif sur la production de PAL par des ostéoblastes MG63.56
La voie de signalisation impliquée dans ce phénomène passe par la phosphorylation de
protéines Smad 1, 5 et 8. Or, d’après une autre étude de Tanikawa et al.57, cette même voie de
signalisation intervient dans la différenciation d’ostéoblastes humains, via le récepteur CD44,
en présence de galectine-9. Le récepteur CD44 pourrait donc participer à l’activation des
voies de signalisation conduisant à la différenciation d’ostéoblastes. En plus de son action
dans l’adhésion des cellules sur les films PEI/(CSA/PLL)6/CSA, ce récepteur pourrait donc
125
jouer également un rôle dans la différenciation des MC3T3-E1, et notamment dans l’effet
promoteur de la couche terminale de CSA sur l’activité de la PAL à long terme.
Par ailleurs, certaines protéines de la famille des annexines sont des récepteurs de GAGs,
notamment l’annexine VI, qui, comme la CD44, est connue comme un récepteur de la CS,
grâce à laquelle les cellules adhèrent à leur microenvironnement et engagent des voies de
signalisation conduisant à leur différenciation.58 De surcroît, l’annexine VI est connue pour
son rôle dans la minéralisation de la MEC. Elle est retrouvée dans les vésicules
extracellulaires organite-matrice, structures impliquées dans les étapes précoces de la
formation et de la nucléation de cristaux d’hydroxyapatite.59,60
Nos résultats montrent que, lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions
favorables d’adhérence et de prolifération, c'est-à-dire sur des films terminés par la PLL la
rigidité ne joue pas de rôle significatif dans leur différenciation précoce. À l’inverse, quand
elles adhèrent faiblement à leur substrat (sur CSA), la rigidité devient un facteur important
dans le contrôle de la maturation cellulaire.
En outre, comme attendu, la composition du milieu dans lequel les cellules MC3T3-E1
sont cultivées a aussi une influence sur le niveau d’activité de la PAL. L’ajout d’acide
ascorbique et de β-GP dans le milieu de culture, connus et couramment utilisés pour stimuler
l’expression du phénotype ostéoblastique, induit une différenciation plus rapide des MC3T3-
E1. L’acide ascorbique est nécessaire à l’expression de marqueurs ostéoblastiques. Ce facteur
joue un rôle crucial, comme cofacteur, pour la sécrétion de GAGs et la biosynthèse de
molécules de collagène, faisant suite à l’hydroxylation des résidus de proline et de lysine. 61
Dans un milieu de croissance standard, c’est-à-dire sans ces facteurs exogènes, la
différenciation des cellules est décalée dans le temps. Ce délai peut être expliqué par le fait
que les cellules ont sécrété leurs propres facteurs de différenciation autocrines/paracrines,
lesquels ont pu être piégés dans la structure de « nano-hydrogel » du système LbL et
progressivement relargués vers les cellules. Il est établi que dans les tissus, les matrices
cellulaires agissent comme de tels réservoirs pour les cytokines.62 Les GAGs notamment, sont
connus pour participer à la rétention et la diffusion de molécules de signalisation et de
facteurs de croissance.
126
III.D Conclusion
Ce travail présente la régulation combinée du comportement de préostéoblastes par les
propriétés mécaniques de substrats élastomères modèles et par la nature chimique de leur
surface contrôlée au moyen de films LbL. Nous avons utilisé le PDMS comme substrat
modèle pour reproduire le domaine de rigidité des matrices osseuses. Les films LbL composés
de PLL et de CSA, permettent de mimer la composition chimique des matrices osseuses.
Nous avons fait varier la rigidité des substrats PDMS, ainsi que la nature de la couche externe
des films LbL. La variation du taux d’agent réticulant n’a pas d’impact significatif sur la
nanotopographie des substrats, ni sur la structure des films LbL. La rigidité du substrat sous-
jacent et la nature de la couche externe des films sont donc les seuls paramètres susceptibles
d’influencer la réponse cellulaire. Nous avons montré que les préostéoblastes sont capables de
discerner et de s’adapter à la rigidité du PDMS sous-jacent. En particulier, de façon
intéressante, un film terminé par la PLL combiné à un substrat rigide (1-4 MPa) a un effet
favorable sur la prolifération et la différenciation précoce des préostéoblastes. Tandis que les
approches actuelles consistent à contrôler la rigidité des films LbL en les réticulant par voie
chimique, notre travail montre que, du fait de la faible épaisseur des films LbL, les propriétés
mécaniques des substrats sous-jacents sont prédominantes, ce qui permet de s’affranchir de la
réticulation chimique.
Nos résultats sont prometteurs car ils démontrent que le contrôle combiné de la chimie de
surface et de la rigidité du matériau sous-jacent permet d’améliorer l’ostéoconductivité. Il
serait intéressant d’étudier d’autres marqueurs de différenciation, ainsi que la minéralisation
de la matrice extracellulaire, qui reste l’objectif final de biomatériaux osseux.
Enfin, l’approche développée dans cette étude pourrait être adaptée à d’autres systèmes
LbL biomimétiques, de manière à explorer l’influence de divers types de chimie de surface
sur les comportements cellulaires. Les systèmes LbL envisagés doivent cependant permettre
le recouvrement total des substrats, favoriser l’adhésion cellulaire et si possible, autoriser
l’incorporation de composés bioactifs.
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Chapitre IV - Influence de la réticulation des films CSA/PLL par
la génipine sur le comportement des préostéoblastes MC3T3-E1
IV.A Introduction 133
IV.B Caractérisation des films CSA/PLL natifs et réticulés 135

IV.B.1 Caractérisation spectroscopique 135
a. Suivi de la réaction de réticulation par spectroscopie UV-visible 135
b. Analyse des films par spectroscopie FTIR-ATR 138
IV.B.2 Caractérisation structurale et mécanique par QCM-D 139
a. Suivi de la construction et de la réaction réticulation 139
b. Modélisation viscoélastique 141
c. Étude de la stabilité des films 143
fluorescence et à force atomique 145
a. Cas des films PEI/(CSA/PLL)6 146
b. Cas des films PEI/(CSA/PLL)12 149
IV.B.4 Caractérisation mécanique par nanoindentation AFM 152
IV.C Étude des comportements cellulaires 155

IV.C.1 Adhésion et morphologie cellulaires 155
a. Étude par microscopie optique 155
b. Étude par microscopie à fluorescence 159
IV.C.2 Prolifération cellulaire 161
IV.C.3 Différenciation cellulaire 165
a. Dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) 165
IV.D Conclusion 171
IV.E Références bibliographiques 173
IV.A Introduction
Au delà de la biocompatibilité, le biomimétisme est un défi moderne dans les domaines de
l’ingénierie tissulaire et des biomatériaux. Des molécules d’origine biologique peuvent être
immobilisées sur les surfaces de matériaux, de façon à les rendre biomimétiques, et à
reproduire le microenvironnement que les cellules rencontrent au sein de leur matrice
extracellulaire (MEC). Comme nous l’avons évoqué lors du chapitre précédent, les films
« Layer-by-Layer » sont des outils particulièrement prometteurs pour mimer ce
133
microenvironnement biochimique.1 Ces systèmes, d’épaisseur nano- à micrométrique sont
facilement préparés par adsorptions alternées de molécules de charges opposées sur des
surfaces de formes et de natures chimiques variées. Depuis une dizaine d’années, ils ont
suscité un intérêt croissant pour la conception de revêtements biofonctionnels pour les
biomatériaux, de par leur capacité à immobiliser une grande variété d’espèces chimiques ou
biochimiques actives, en vue de leur relargage in situ,2,3 et à moduler les interactions
protéines/surfaces4 et cellules/substrats.5,6 De plus, il est possible d’utiliser des
polyélectrolytes biomimétiques et/ou d’origine biologique (polypeptides, polysaccharides –
GAGs – et protéines) biochimiquement favorables au développement cellulaire, à moyen et
long terme.
Cependant, il a été démontré que les films LbL contenant des GAGs ont des structures très
hydratées, proches des hydrogels, dues à l’affinité de ces macromolécules pour l’eau, chaque
unité disaccharidique pouvant lier 30 molécules d’eau.7 Cette structure a un effet défavorable
sur l’adhésion cellulaire, à cause de sa rigidité trop faible. Il a été démontré en effet, que les
comportements cellulaires ne sont pas affectés uniquement par la composition biochimique
des substrats, mais aussi par leurs propriétés mécaniques.8
Actuellement, la stratégie employée pour rigidifier les films LbL composés de GAGs
consiste à les réticuler à l’aide d’agents réticulants chimiques, les plus communément utilisés
étant les carbodiimides (EDC/NHS), qui couplent les groupements carboxylique et les
groupements amine primaire par la formation de liaisons amides,7 ou le glutaraldéhyde, qui
crée des liaisons entre deux groupements amine primaire.9 Ce procédé peut cependant avoir
un effet cytotoxique dans le cas où une fraction de l’agent réticulant n’ayant pas réagi resterait
piégée dans le film LbL et pourrait être relarguée ultérieurement, d’où la nécessité de trouver
des agents réticulants biocompatibles.
Récemment, la génipine (GnP), un composé iridoïde dérivé du fruit de Gardenia
jasminoides, a reçu un intérêt croissant pour des applications biomédicales. 10,11,12 Il a été
démontré que la GnP réticule des tissus et des biomatériaux contenant des groupements amine
primaire, tout en étant moins toxique que les agents réticulants conventionnels cités
précédemment (5 000 à 10 000 fois moins que le glutaraldéhyde par exemple).13 La GnP a été
utilisée et a montré des résultats prometteurs pour la réticulation de films LbL composés de
GAGs, comme les systèmes chitosan/acide hyaluronique,14 chitosan/alginate14 et
collagène/alginate.15
Il a été montré que la GnP en solution était capable de polymériser en milieu basique (pH
9-11). L’attaque nucléophile des ions OH- sur les molécules de GnP provoque une ouverture
134
de cycle et forme des monomères aldéhydiques pouvant former des oligomères. En revanche,
la GnP ne polymérise pas dans les conditions de pH physiologique, ce qui a par exemple
permis d’améliorer le taux de réticulation de gels de collagène. 16 Nos films (CSA/PLL) étant
construits, et constamment conditionnés, à pH 7,4, la GnP constitue un agent réticulant de
choix pour ces films. Par conséquent, dans nos travaux, nous avons utilisé la GnP pour
réticuler nos films (CSA/PLL). La CSA ne contenant pas de groupements amine primaire, le
traitement des films avec la GnP amène à la création d’une structure en réseau semi-
interpénétré de polymères (semi-RIP), composé d’une architecture de PLL réticulée, au sein
de laquelle les chaînes de CSA restent libres de diffuser. Un tel système, à la surface de
biomatériaux, pourrait montrer des propriétés biochimiques et mécaniques originales
susceptibles d’influencer les comportements cellulaires. Le mécanisme de réticulation des
films LbL par la GnP a été étudié par spectroscopie UV-visible et par microscopie à
épifluorescence. La construction et la stabilité des films ont été analysées par QCM-D ; leur
composition interne et leurs propriétés structurales ont été appréhendées par FTIR-ATR et
AFM. Les comportements cellulaires au contact de ces films à court, moyen et long terme ont
été étudiés in vitro par l’évaluation de la morphologie, de la prolifération et de la
différenciation précoce et tardive de préostéoblastes murins MC3T3-E1.
IV.B Caractérisation des films CSA/PLL natifs et réticulés

IV.B.1 Caractérisation spectroscopique
a. Suivi de la réaction de réticulation par spectroscopie UV-visible
Alors que la GnP pure en solution n’est pas colorée, sa réaction (dont le mécanisme n’est
pas parfaitement établi) avec des groupements amine primaire donne une coloration bleue
(appelée bleu de Gardenia).17,18 Cette propriété nous a permis de confirmer par simple
inspection visuelle l’efficacité de la réticulation des films CSA/PLL par la GnP, comme
l’illustre la Figure IV-1 montrant une photographie de films PEI/(CSA/PLL)12 traités pendant
16 heures avec des solutions GnP 0,25% et 0,50% en masse (notées GnP25 et GnP50). Il est à
noter que la coloration d’architectures PEI/(CSA/PLL)6 n’a pas pu être détectée à l’œil nu,
certainement en raison de leur trop faible épaisseur. À ce stade, il est difficile d’évaluer,
même qualitativement, une éventuelle influence de la concentration de GnP sur l’ampleur de
la réticulation.
135
Figure IV-1 : Photographie de films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou après 16
heures de traitement réticulant par des solutions GnP25 ou GnP50.
La longueur d’onde du maximum d’absorption de la GnP conjuguée avec des amines

primaires se situant vers 600 nm,19 nous avons pu utiliser la spectroscopie UV-Visible pour
mener une étude plus quantitative de la réticulation de nos films au cours du temps, et en
fonction de la concentration de GnP. Nous avons travaillé avec des architectures
PEI/(CSA/PLL)18, afin d’augmenter la quantité d’amines présentes dans le film et ainsi, les
valeurs d’absorbance atteintes. La Figure IV-2 A rapporte les spectres d’absorbance entre
560 et 700 nm, établis toutes les heures sur une durée de 16h, lors de la réticulation par les
solutions GnP25 et GnP50. Initialement, l’absorbance des films est nulle, et nous notons
comme attendu, dès t = 1h, l’apparition d’une bande d’absorption à 600 nm. L’intensité de ce
pic augmente au cours du temps, traduisant l’intensification de la coloration bleue, ce qui
confirme l’efficacité de la réticulation.
Bien que le mécanisme de réticulation par la GnP ne soit pas clairement défini, il est admis
que c’est un réticulant bifonctionnel. Les amines primaires de molécules aminées réagissent
d’une part avec l’atome C3 de la GnP selon une attaque nucléophile conduisant à l’ouverture
du cycle de la GnP puis à la substitution de l’atome d’oxygène de ce cycle par une amine
tertiaire ;20,21 d’autre part, avec l’atome C11 du groupement carboxyméthyl, formant une
liaison amide. Butler et al. ont identifié les deux sites fonctionnels par RMN du 13C.60 Dans le
cas des systèmes (CSA/PLL), la GnP réagit probablement avec les amines primaires des
chaînes latérales des résidus de lysine de la PLL, pour conduire à la formation de liens
136
covalents inter- et/ou intra chaînes. La CSA ne présentant pas d’amines primaires, elle ne peut
pas être impliquée dans la réticulation, et il est fortement probable que les films réticulés
(CSA/PLL)-GnP présentent une structure de réseau semi-interpénétré (semi-RIP) constituée
d’un réseau de PLL réticulée contenant les chaînes de CSA à l’état libre.
A B
Figure IV-2 : (A) Évolution de l’absorbance entre 580 nm et 700 nm de films LbL
PEI/(CSA/PLL)18 traités par GnP25 et GnP50, sur une durée de 16h. (B) Évolution moyenne,
pour 2 films GnP50 et 3 films GnP25, de l’absorbance à 600 nm.
La Figure IV-2 A révèle par ailleurs clairement que l’absorbance des films traités avec la
solution GnP50 est supérieure à celle des films traités avec la solution GnP25 et ce, tout au
long du traitement. La Figure IV-2 B montrant l’évolution de l’absorbance à 600 nm
confirme ce comportement. De plus, il apparaît que l’absorbance augmente de manière
linéaire sur l’ensemble de la période étudiée. La GnP étant présente en large excès par rapport
aux groupements amine de la PLL, ce qui indique une réaction de pseudo-ordre zéro, c’est-à-
dire dont la cinétique n’est pas influencée par la concentration de groupements amine. La
vitesse de réticulation (égale ici à la constante de vitesse apparente) est supérieure dans le cas
du traitement avec la solution GnP50, ce qui indique que la réaction possède un ordre par
rapport à la GnP. Le doublement de la concentration de GnP entraîne la multiplication par un
facteur 1,35 (= 0,0073/0,0054) de la constante de vitesse apparente kapp = k[GnP] (avec k
la constante de vitesse et  l’ordre de la réaction par rapport à la GnP), ce qui correspond à un
ordre   0,43. Ce résultat pourrait se révéler utile dans l’élucidation du mécanisme
réactionnel de la GnP, qui reste encore controversé.22
On note enfin que l’absorbance n’atteint pas de plateau maximal sur la période d’étude.
Hwang et al., au contraire, ont décrit à l’aide de mesures de fluorescence, des taux de
137
réticulation de gels de collagène approximativement identiques avec des solutions de GnP de
concentrations différentes (1 mM et 10 mM).23 Le taux de réticulation maximal était
cependant atteint beaucoup plus rapidement avec la plus forte concentration de GnP. Dans
notre cas, il est probable que la réticulation maximale des films ne soit pas atteinte avec un
traitement de 16 heures. Ceci ne constitue pas un inconvénient pour notre étude, puisque ce
traitement produit des films de taux de réticulation vraisemblablement significativement
différents, conformément à l’objectif recherché. Dans la suite de l’étude, les films
PEI/(CSA/PLL)n-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)n-GnP50 sont donc systématiquement produits par
des traitements réticulant de 16 heures, généralement pendant la nuit.
b. Analyse des films par spectroscopie FTIR-ATR

Zhang et al. ont montré que les chaînes d’acide polyacrylique (PAA) constituant les
architectures LbL PAA/chitosan diffusaient hors des films suite à la réticulation du chitosan
par le glutaraldéhyde.24 Nous avons donc analysé les films natifs et réticulés par FTIR-ATR
afin (i) de mettre en évidence les modifications chimiques devant nécessairement
accompagner le processus de réticulation, et (ii) d’évaluer une éventuelle élimination au sein
du film, des chaînes de CSA qui, contrairement aux chaînes de PLL, ne sont pas soumises à la
réticulation par la GnP. Les signatures spectrales d’un film PEI/(CSA/PLL)6 avant et après
réticulation par une solution GnP50 sont montrés dans la Figure IV-3.
Figure IV-3 : Spectres

d’absorbance FTIR-ATR
d’un film PEI/(CSA/PLL)6
natif, puis réticulé par une
solution de GnP50.
On reporte dans le Tableau IV-1 l’ensemble des pics FTIR-ATR contenus dans les
signatures spectrales des films natifs et réticulés. Le spectre du film natif contient les pics
amide I et II caractéristiques de la PLL à respectivement 1630 cm-1 (pic 1) et 1550 cm-1 (pic
138
3), ainsi que le pic amide III et le pic associé aux cycles saccharidiques, caractéristiques de la
CSA, à respectivement 1230 cm-1 (pic 6) et 960-1100 cm-1 (pic 7). Après réticulation, on note
l’apparition de deux nouveaux pics, à 1440 cm-1 (pic 4) et 1370 cm-1 (pic 5), correspondant
respectivement aux groupements méthyle de la GnP, et amine III résultant de la substitution
de l’atome d’oxygène du cycle de la GnP par l’atome d’azote de l’amine I de la PLL. 25,26 La
présence du pic 5 confirme donc le couplage covalent entre PLL et GnP. L’épaulement à 1600
cm-1 (épaulement 2) peut être attribué à la déformation hors du plan des liaisons C–H de la
GnP,26 ou aux liaisons amide (amide I) résultant du couplage covalent entre PLL et GnP.
Tableau IV-1: Attribution des bandes FTIR-ATR des films natifs et réticulés
Position Nombre d’ondes (cm-1) / Forme Attribution
1 1630 / pic amide I (PLL)
2 1600 / épaulement déformation hors du plan C–H (GnP)
3 1550 / pic amide II (PLL)
4 1440 / pic déformation de CH3 (GnP)
5 1370 / pic élongation de l’amine III (GnP)
6 1230 / pic amide III (CSA)
7 960-1100 / pic cycles saccharidiques (CSA)
8 990 / épaulement élongation des doubles liaisons (GnP)
IV.B.2 Caractérisation structurale et mécanique par QCM-D

Après avoir établi au moyen des analyses spectroscopiques décrites ci-dessus, que la
réaction de réticulation des films (CSA/PLL) par la GnP était effective, nous avons utilisé la
QCM-D pour étudier l’impact de ce processus sur la structure et les propriétés viscoélastiques
des films.
a. Suivi de la construction et de la réaction réticulation

La Figure IV-4 montre un exemple des variations des fréquences de résonance et des
facteurs de dissipation mesurées par QCM-D au cours de la construction d’un film LbL
d’architecture PEI/(CSA/PLL)6-GnP50. Après la construction, le film PEI/(CSA/PLL)6 est
rincé et équilibré une première fois avec du tampon DPBS pH 7,4 (RDPBS#1), puis mis en
contact avec la solution GnP50 pendant 16h. Après la réaction, la solution de GnP est
éliminée par un rinçage au tampon DPBS (RDPBS#2). Enfin, le film est équilibré dans le
tampon Tris à pH 7,4 et 0,15 M de NaCl (RTris), afin de replacer le résonateur dans les
139
conditions de référence. Il apparaît que le traitement à la GnP n’affecte pas les fréquences de
résonances, mais provoque un changement significatif du facteur de dissipation traduisant une
modification de la structure du film.
A C
B Figure IV-4 : Évolution (A) des fréquences

de résonance Δfn/n et (B) des facteurs de
dissipation ΔDn lors de la construction d’un
film PEI/(CSA/PLL)6 traité par la solution
GnP50, avec (C) le détail du début de la
construction.
La Figure IV-5 généralise ce comportement en montrant les variations moyennes des

fréquences de résonance normalisées Δf3/3 et des facteurs de dissipation ΔD3 pour trois films
PEI/(CSA/PLL)6-GnP50. D’une part, l’évolution des paramètres QCM-D fait clairement
apparaître la croissance exponentielle des films (CSA/PLL). Ce comportement, déjà décrit en
détail précédemment,27,28 repose sur la capacité d’au moins un des deux composants du film à
diffuser au sein de la structure LbL (§ I.B.3 a). D’autre part, il est confirmé que la mise en
contact des films (CSA/PLL) avec la GnP ne modifie quasiment pas les fréquences de
résonance, tandis que les facteurs de dissipation chutent d’environ 30%. Un comportement
très similaire a été rapporté par Alves et al. lors de la réticulation de films LbL
alginate/chitosan par le glutaraldéhyde.29 De même, Richert et al. ont montré que la
réticulation des films LbL acide hyaluronique/PLL par EDC/NHS induisait une légère
augmentation des fréquences de résonance, mais une nette diminution des facteurs de
dissipation de l’ordre de 50% s’accompagnant d’une augmentation de la densité.8 De manière
140
générale, la diminution des facteurs de dissipation est toujours attribuée à une rigidification
des films LbL. Il est à noter que dans l’étude récente de Chaubaroux et al. consacrée à la
réticulation par la GnP de films LbL alginate/collagène de structure fibrillaire, ni les
fréquences de résonance ni les facteurs de dissipation des films n’ont été affectés par la
réticulation.15 Les auteurs n’ont cependant pas expliqué ce comportement.
A B
Figure IV-5 : Évolutions moyennes des paramètres de QCM-D (fréquence de résonance

normalisée Δf3/3 et facteur de dissipation ΔD3) lors de la construction, puis du traitement par
une solution de GnP à 0,50% de trois films PEI/(CSA/PLL)6. Toutes les valeurs sont mesurées
en tampon Tris à pH 7,4 et 0,15 M NaCl. Les barres d’erreur représentent l’écart-type sur la
moyenne, pour 3 films distincts.
b. Modélisation viscoélastique
L’évolution des paramètres QCM-D a été analysée dans le cadre du modèle viscoélastique
de Voigt.30 Ce modèle représente le film comme un dépôt viscoélastique homogène
caractérisé par sa viscosité , son module de cisaillement , sa densité  et son épaisseur d.
Les valeurs de la viscosité et de la densité de la solution ont été prises égales à 1 mPa et 1020
kg m-3 respectivement, et la valeur de la densité du film a été prise égale à 1100 kg m-3.28 Les
courbes modèles obtenues ont montré un bon accord avec les courbes expérimentales. La
Figure IV-6 montre l’évolution des valeurs moyennes de la masse hydratée Q et des
paramètres d, , et , et des trois films étudiés. On constate que la réticulation n’entraîne
qu’une faible diminution de la masse et de l’épaisseur, conformément à plusieurs travaux
antérieurs consacrés à la réticulation de films LbL par EDC/NHS,31,32,33 ou par le
glutaraldéhyde.29 La réticulation ne provoque donc pas l’effondrement et la compaction des
films LbL que l’on pourrait attendre, comme observé par QCM-D sur des couches de
protéines par exemple.34
Nous trouvons pour la viscosité et le module de cisaillement de nos films (CSA/PLL) des
valeurs du même ordre de grandeur et cohérentes avec les valeurs rapportées dans la
141
littérature lors de la construction et de la réticulation de systèmes LbL biomimétiques. 29,32,33
Tandis que la masse et l’épaisseur, ainsi que la viscosité, présentent une croissance régulière
lors de la construction des films, on note pour le module de cisaillement d’importantes
variations lors des premières étapes de construction, avant d’atteindre une valeur stable. Dans
leur étude sur les films alginate/chitosan par exemple, Alves et al. rapportent une croissance
régulière de ce paramètre.29 Nous n’avons pas d’explication au comportement observé dans
notre cas, mais il se pourrait, comme l’ont suggéré Ladam et al. pour expliquer un
comportement similaire pour les paramètres optiques de films LbL,35 que la reproductibilité
des étapes initiales de construction soit affectée par des états de surface initiaux légèrement
différents d’un résonateur QCM-D à l’autre.
A B
C Figure IV-6 : Évolutions moyennes (A) de

la masse hydratée Q et de l’épaisseur d,
(B) de la viscosité , et (C) du module de
cisaillement  des trois films
PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 étudiés par QCM-
D. Les données brutes ont été analysées
dans le cadre du modèle viscoélastique de
Voigt.30 Les barres d’erreur représentent
l’écart-type sur la moyenne, pour 3 films
distincts.
Concernant l’étape de réticulation, on observe, conformément aux travaux antérieurs,29,32,33

une augmentation légère, néanmoins significative, de la viscosité et du module de cisaillement
sous l’effet de la GnP, ce qui traduit la rigidification de nos films. Ainsi, leur module de
cisaillement augmente de ~750 kPa à ~1 MPa, et leur viscosité augmente de ~15 mPa s à
~20 mPa s. Pour comparaison, Alves et al. ont rapporté pour le système alginate/chitosan une
augmentation du module de cisaillement de ~600 kPa à ~700 kPa, et une augmentation de la
142
viscosité de ~12 mPa s à ~15 mPa s sous l’effet de la réticulation par le glutaraldéhyde.29 Ces
auteurs ont expliqué que la réticulation de leurs films était limitée à la zone externe,
vraisemblablement à cause d’un effet barrière empêchant la diffusion de l’agent réticulant à
l’intérieur du film. Un tel mécanisme, envisageable pour le système alginate/chitosan non
diffusif et à croissance linéaire, serait plus difficile à justifier pour nos films (CSA/PLL) dont
la croissance exponentielle montre le caractère diffusif. À ce stade, il semble donc plus
probable que la GnP diffuse au sein des architectures (CSA/PLL) et y réticule les chaînes de
PLL sur toute l’épaisseur. La structure de réseau semi-RIP que l’on peut raisonnablement en
déduire est compatible avec les augmentations limitées de viscosité et de module de
cisaillement mesurées par QCM-D.
c. Étude de la stabilité des films

Lors de récents travaux au laboratoire, nous avons montré que les films (CSA/PLL)
subissent une dissolution importante en présence de solutions d’une phosphoprotéine, la
phosvitine (PhV), en raison de sa forte affinité pour la PLL.36 Nous avons mis à profit cette
particularité ici, pour tester la stabilité de nos films, et illustrer ainsi par une méthode
supplémentaire l’efficacité de leur réticulation par la GnP. Sur le même principe, dans leur
étude récente, Chaubaroux et al. ont confirmé la réticulation de films alginate/collagène par la
GnP, en vérifiant leur stabilité sous l’effet de variations de pH capables de détruire les films
natifs.15
Nous avons utilisé la QCM-D pour effectuer ce test de stabilité. La Figure IV-7 montre
l’évolution de la fréquence de résonance normalisée Δf3/3 lors de la construction, puis de
l’injection de PhV pour un film natif (Figure IV-7 A) et pour un film réticulé (avec la
solution GnP50) (Figure IV-7 B). La Figure IV-7 C reporte l’évolution étape par étape de la
fréquence de résonance dans les deux cas. Il apparaît clairement que la PhV ne provoque
aucune destruction du film traité avec la GnP, ce qui confirme l’efficacité du processus de
réticulation. En effet, dans le cas du film natif, l’impact structural de la PhV est immédiat et
important : la fréquence de résonance subit une forte augmentation, traduisant une perte de
masse hydratée importante, c’est-à-dire une dissolution du film. Au contraire, dans le cas du
film réticulé, l’effet de la PhV est faible, et consiste plutôt en une légère diminution de la
fréquence de résonance vraisemblablement due à l’adsorption de la protéine à la surface ou à
sa diffusion à l’intérieur de l’architecture LbL. Il se pourrait également que le film réticulé
soit le siège d’un échange compétitif entre les chaînes de PhV et les chaînes de CSA. En effet,
Abdelkebir et al. ont démontré que la déstabilisation des films CSA/PLL par la PhV était due
143
à un phénomène de compétition entre les deux composants anioniques, la PhV présentant une
plus grande affinité pour la PLL que la CSA.36 Cette compétition résulte dans la destruction
du film en raison de la plus grande stabilité des complexes PhV/PLL en solution que sous la
forme de film LbL. Mais dans tous les autres cas rapportés par la littérature, de telles
interactions compétitives entre un composant LbL et un polyélectrolyte en solution ont
conduit à un simple échange dynamique au sein de la structure LbL.37,38,39
A C
B Figure IV-7 : Évolution de la fréquence de

résonance mesurée par QCM-D, lors de la
construction de films LbL PEI/(CSA/PLL)6
(A) natif et (B) traité avec la GnP50, puis
lors de leur mise en contact avec la PhV. (C)
Évolution étape par étape de la fréquence de
résonance dans les deux cas décrits en (A) et
(B).
Des travaux complémentaires, dépassant le cadre du présent travail de thèse, seraient à

entreprendre pour élucider le mode d’interaction entre la PhV et les films PEI/(CSA/PLL)6
réticulés. Le travail antérieur mené au laboratoire par Abdelkebir et al. visait en effet à utiliser
les films LbL comme matrices pour l’immobilisation de la PhV, envisagée alors comme un
modèle des phosphoprotéines du tissu osseux impliquées dans les processus de
biominéralisation.36 Malgré la destruction des films CSA/PLL (non réticulés), il avait été
montré que des chaînes de PhV étaient effectivement immobilisées dans le dépôt final, y
exerçant un effet promoteur significatif sur la nucléation hétérogène du phosphate de calcium.
Il serait donc particulièrement intéressant, pour approfondir ce travail, d’étudier
144
l’enrichissement en PhV de films (CSA/PLL) réticulés, puis d’évaluer l’influence des films
obtenus sur la biominéralisation du phosphate de calcium.
Un résultat préliminaire prometteur de cette approche est montré par la Figure IV-8. La
PhV étant chargée négativement à pH 7,4, elle peut être assimilée à un polyanion. Nous avons
donc envisagé de poursuivre la construction du film PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 au-delà de
l’interaction avec la PhV, par l’injection de PLL cationique (couche PLL#7). L’adsorption de
PLL a été effective, de sorte que nous avons pu reprendre efficacement la construction d’un
film (CSA/PLL) à la surface du film PEI/(CSA/PLL)6-GnP50-PhV. Ce résultat ouvre la voie à
un enrichissement des films en PhV plus important que celui obtenu dans l’étude précédente
et potentiellement, à un effet promoteur encore renforcé de ces films en termes de nucléation
hétérogène du phosphate de calcium.
A B
Figure IV-8 : (A) Évolution de la fréquence de résonance normalisée Δf3/3 lors de la

construction d’un film PEI/(CSA/PLL)6-GnP-PhV/(PLL/CSA)2/PLL. (B) Détail de la reprise
de la construction du film LbL sur la couche de PhV adsorbée sur le film réticulé.

fluorescence et à force atomique
Nous avons approfondi l’étude des films (CSA/PLL) natifs et réticulés au moyen de la
microscopie optique, de la microscopie à fluorescence et de la microscopie à force atomique
(AFM). Deux architectures différentes, PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12, ont été
étudiées, dans leur état natif et leur état réticulé. Il s’agit des architectures sélectionnées pour
l’étude des comportements cellulaires dont les résultats seront décrits au § IV.C. Les
structures de ces deux architectures présentant des différences notables, nous décrirons
séparément les résultats obtenus pour chacune d’entre elles. Tous les films ont été réalisés sur
des lamelles de verre.
145
a. Cas des films PEI/(CSA/PLL)6
En raison de leur faible épaisseur (~100 nm d’après les résultats de QCM-D décrits
précédemment), les films PEI/(CSA/PLL)6 natifs et réticulés ne sont pas observables par
microscopie optique. Plusieurs études ayant décrit des modifications de la topographie de
films LbL sous l’effet de la réticulation,40,41 nous avons utilisé l’AFM pour établir les
morphologies de surface des films. La Figure IV-9 montre les images AFM, et le Tableau
IV-2 rapporte les paramètres de rugosité Ra (moyenne arithmétique des écarts à la hauteur
moyenne sur la zone analysée) et Rt (différence de hauteur entre le point le plus élevé et le
point le plus bas de la zone analysée).
Figure IV-9 : Images AFM 2D et 3D

typiques de films PEI/(CSA/PLL)6,
PEI/(CSA/PLL)6-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)6-
GnP50 (2020 µm2, z = 500 nm ).

par la GnP.
PEI/(CSA/PLL)6
Architecture
Natif GnP25 GnP50
Ra (nm) 19,7 ± 2,8 31,3 ± 0,3 30,3 ± 0,6
Rt (nm) 139,2 ± 15,1 244,4 ± 31,5 232,4 ± 34,8
146
La morphologie des films natifs, constituée d’îlots de matière d’environ 0,5 µm de taille
caractéristique répartis uniformément sur la surface, est conforme à ce qui a été décrit dans les
précédents travaux du laboratoire.28 Ces travaux avaient établi la structure non homogène de
ces films, constitués d’ilôts de matière dans la partie externe, tandis que la zone interne
consiste en un film dense continu. La réticulation des films n’entraîne pas de modification de
la morphologie globale des films, bien que des augmentations relatives significatives de
rugosité (~55% pour la Ra, et ~70% pour la Rt) soient détectées. Comme nous l’avons déjà vu
au § I.D.2 et au § III.B.2 b, les ostéoblastes sont sensibles à la rugosité de leur substrat. Une
augmentation de rugosité, de valeurs nanométriques à des valeurs micrométriques, est
généralement considérée comme favorisant leur capacité de prolifération et de
différenciation.42,43 Toutefois, le seuil de perceptibilité des variations de rugosité de l’ordre de
la dizaine de nanomètres est encore actuellement débattu.44 Nous notons que les morphologies
et les rugosités des films réticulés sont identiques quelle que soit la concentration de GnP
utilisée. L’augmentation relative de la rugosité sous l’effet de la réticulation est
vraisemblablement due à un effondrement plus prononcé du film interne continu que des îlots
de matière externes, sans que l’on puisse à ce stade en fournir une explication précise.
Nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour établir la distribution spatiale des
constituants des films avant et après réticulation. Pour détecter la CSA, nous avons modifié
les chaînes avec des marqueurs fluorescents d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme
décrit dans le § II.B.8 a. Pour détecter la PLL, nous avons mis à profit la forte
autofluorescence qu’émet la GnP une fois couplée avec les groupements amine.23 Nous avons
travaillé avec des films PEI/(CSAFITC/PLL)n, PEI/(CSAFITC/PLL)n-GnP25 et
PEI/(CSAFITC/PLL)n-GnP50 construits sur des lamelles de verre. Les résultats pour les films
constitués de 6 paires de couches concernés ici, sont montrés dans la Figure IV-10. Pour le
film natif, l’uniformité de la distribution de la CSAFITC confirme que la surface est totalement
recouverte par le film. La sensibilité de l’appareillage ne permet cependant pas, compte tenu
de la faible quantité de matière qui constitue les films, de détecter d’éventuelles
hétérogénéités plus fines. Comme attendu, aucune fluorescence n’est détectée lorsque le film
est irradié à la longueur d’excitation de la GnP. Pour les deux films réticulés à GnP25 et
GnP50, on observe bien une fluorescence uniforme de la GnP, qui confirme l’efficacité du
traitement réticulant. Aucune différence d’intensité n’a pu être détectée à l’œil nu ou sur les
images, pour les deux concentrations de GnP testées. De façon surprenante, on n’observe plus
la fluorescence de la CSAFITC après réticulation. Ce comportement inattendu ne peut pas être
147
dû à une éventuelle élimination de la CSAFITC sous l’effet de la réticulation, puisqu’on a
vérifié précédemment par FTIR-ATR la présence de la CSA dans les films réticulés.
PEI/(CSAFITC/PLL)6
λex = 490 nm λex = 550 nm
λem = 525 nm λem = 575 nm
Figure IV-10 : Observations par

microspcopie à fluorescence de films
PEI/(CSAFITC/PLL)6 aux longueurs d’ondes
d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la
FITC (gauche) et de la GnP (droite).
De façon intéressante, il nous est apparu que les longueurs d’onde d’excitation et d’émission
de la GnP couplée sont très proches de celles de d’isothiocyanate de tetraméthylrhodamine
(TRITC) (λex = 550 nm ; λem = 575 nm), qui forme avec le FITC un couple donneur-accepteur
typique de la méthode FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer ou Transfert
d'Énergie par Résonance de type Förster), avec le FITC comme donneur et le TRITC comme
accepteur. Le FRET est basé sur un transfert d’énergie électronique entre le donneur
fluorescent, excité à sa longueur d’onde d’excitation, et un accepteur fluorescent, à condition
qu’ils soient suffisamment proches, soit quelques dizaines d’angströms au maximum. Ce
phénomène se traduit par une extinction de la fluorescence du donneur. Cette technique est
couramment utilisée pour colocaliser au sein de systèmes complexes des composés marqués
respectivement avec le donneur et avec l’accepteur. Ainsi, pour la première fois à notre
connaissance, nous avons probablement mis en évidence l’existence du couple
148
donneur/accepteur FITC/GnP, qui permet ici d’établir par FRET la colocalisation exacte des
chaînes de CSA et de PLL dans toute la structure de nos architectures PEI/(CSA FITC/PLL)6
réticulées par la GnP.
b. Cas des films PEI/(CSA/PLL)12

Contrairement aux films PEI/(CSA/PLL)6, les films PEI/(CSA/PLL)12 contiennent
suffisamment de matière pour être visualisés par microscopie optique à contraste de phase.
Des microphotographies typiques rapportées dans la Figure IV-11 montrent une structure
optiquement hétérogène des films natifs, suggérant la coexistence de domaines de densités
distinctes au sein des films. Quelle que soit la concentration de GnP utilisée, cette structure
hétérogène ne semble aucunement modifiée par le traitement.
Figure IV-11 : Microphotographies typiques de films PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par

des solutions GnP25 et GnP50, réalisées en microscopie optique à contraste de phase.
Les observations des films PEI/(CSAFITC/PLL)12 natifs réalisées par microscopie à

fluorescence (Figure IV-12) révèlent une hétérogénité de la distribution des chaînes de
CSAFITC, sous la forme de domaines enrichis qui semblent correspondre exactement à la
structure optique décrite ci-dessus. De même que pour les films PEI/(CSAFITC/PLL)6, (i)
comme attendu, aucune fluorescence n’est détectée par irradiation du film natif à la longueur
d’onde d’excitation de la GnP, tandis que (ii) les deux films réticulés à GnP25 et GnP50
produisent bien une autofluorescence de la GnP confirmant l’efficacité du traitement
réticulant, de manière identique pour les deux concentrations de GnP testées, et (iii) la
fluorescence de la CSAFITC disparaît après réticulation.
Il est à noter que la distribution de la GnP au sein des films réticulés révèle le maintien
d’une hétérogéneité structurale comparable à celle mise en évidence par la distribution de la
CSAFITC au sein des films natifs, et à celle observée par microscopie optique pour les films
natifs et réticulés. Il s’agit d’un résultat cohérent, si l’on considère que les domaines riches en
149
CSA doivent nécessairement être enrichis également en PLL, du fait de l’association des deux
polyélectrolytes lors de la construction des films.
Concernant la disparition de la fluorescence de la CSAFITC après réticulation, nous pouvons
à nouveau l’expliquer par le processus de FRET entre le FITC et la GnP couplée, et en
déduire l’exacte colocalisation de la CSA et de la GnP, sous l’effet d’une réticulation effective
sur toute l’épaisseur de l’architecture LbL. Nous ne pouvons toutefois exclure que la
disparition de la fluorescence de la CSAFITC soit due à l’élimination de la CSA par diffusion
hors du film lors de la réticulation de la PLL.
PEI/(CSAFITC/PLL)12
λex = 490 nm λex = 550 nm
λem = 525 nm λem = 575 nm
Figure IV-12 : Observations par

microspcopie à fluorescence de films
PEI/(CSAFITC/PLL)12 aux longueurs d’ondes
d’excitation (λex) et d’émission (λem) de la
FITC (gauche) et de la GnP (droite).
Les données AFM des films PEI/(CSAFITC/PLL)12 natifs (Figure IV-12 et Tableau IV-3)
montrent une topographie de surface uniforme similaire à celle des films PEI/(CSAFITC/PLL)6,
et ne mettent pas en évidence d’hétérogénéité topographique. L’hétérogénéité optique et
chimique observée par microscopie optique et par microscopie à fluorescence semble donc
liée à la coexistence interne de domaines de densités et de compositions distinctes au sein
d’une architecture LbL uniforme en épaisseur, plutôt qu’à des îlots de matière externes
150
distribués sur la surface. La coexistence d’une zone interne dense et d’une zone externe plus
diffuse a notamment été suggérée pour expliquer la transition croissance
exponentielle/croissance linéaire observée pour les films LbL diffusifs au-delà d’une dizaine
de paires de couches (§ I.B.3 a).45 Les domaines riches en CSA au sein de nos films
PEI/(CSA/PLL)12 pourraient ainsi faire partie d’une telle zone interne dense.
Il est plausible que le traitement avec la GnP puisse agir différemment sur les domaines de
densités différentes, comme le suggèrent les images AFM des films réticulés. En effet, on
note sur ces derniers, de façon similaire pour les deux concentrations de GnP testées, une forte
augmentation de la rugosité associée à l’apparition de structures dont la taille caractéristique
(~5 µm) et la distribution évoquent fortement celles des domaines riches en CSA observés par
microscopie à fluorescence. Hillberg et al. ont également montré que la réticulation du
système LbL biomimétique à croissance exponentielle acide hyaluronique/chitosan,
conduisait à une augmentation des paramètres de rugosité, d’autant plus grande que la
concentration de la solution de GnP utilisée est importante.14 Cependant, la rugosité moyenne
de leurs films reste inférieure à 10 nm.
Deux mécanismes peuvent contribuer à l’apparition des structures détectées à la surface
des films : il peut s’agir (i) des domaines riches en CSA ayant mieux résisté, grâce à leur
densité supérieure et/ou à leur structure d’hydrogel très hydraté et incompressible, que les
zones intermédiaires moins riches en CSA, à l’effondrement provoqué par la réticulation ; ou
(ii) des structures « fantômes » de ces domaines, constitués de réseaux de PLL appauvris en
CSA par diffusion des chaînes vers le milieu extérieur (comme décrit par Zhang et al. pour les
chaînes de PAA lors de la réticulation du système PAA/chitosan par le glutaraldéhyde)24 et
gonflés sous l’effet des répulsions électrostatiques entre les chaînes de PLL. Des mesures
complémentaires de FTIR-ATR, et/ou de microscopie à fluorescence mettant en jeu une CSA
modifiée par un marqueur fluorescent différent, devraient permettre d’élucider cette question.
Néanmoins, Zhang et al. provoquent le départ des chaînes de PAA par des rinçages successifs
de leur système à pH 9,0, de manière à déprotoner les groupements amine primaire du
chitosan, et ainsi diminuer les interactions entre les composants du système LbL.
151
Figure IV-13 : Images AFM 2D et 3D
typiques de films PEI/(CSA/PLL)12,
PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 et
PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 (2020 µm2, z =
1,5 µm).

par la GnP
.
PEI/(CSA/PLL)12
Architecture
Natif GnP25 GnP50
Ra (nm) 13,6 ± 2,0 176,7 ± 4,3 163,5 ± 14,5
Rt (nm) 208,9 ± 18,6 1280,7 ± 104,8 994,4 ± 106,9
Les différences majeures de rugosité observées entre les films PEI/(CSA/PLL) 12 natifs et
réticulés sont susceptibles de contribuer à d’éventuelles différences de comportements
cellulaires des ostéoblastes. En revanche, la topographie de surface similaire pour les films
réticulés avec les solutions GnP25 et GnP50, ne semble pas pouvoir constituer un facteur
discriminant dans le comportement des cellules sur ces deux types de films.
IV.B.4 Caractérisation mécanique par nanoindentation AFM

Pour approfondir l’évaluation des propriétés viscoélastiques initiée, pour les architectures
PEI/(CSA/PLL)6 uniquement, par QCM-D au § IV.B.2.b, nous avons mesuré par
nanoindentation AFM en milieu liquide les modules élastiques de films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés. Les résultats sont rapportés dans la Figure IV-14. Il faut
152
noter que nous avons choisi, pour effectuer les mesures, d’utiliser des pointes d’AFM de
constante de raideur plus élevée que les pointes habituellement employées (§ II.B.2 b), de
façon à sonder l’ensemble du système (substrat de verre + film). En effet, il est avéré que les
cellules sont sensibles aux propriétés mécaniques de leur substrat sur des profondeurs de
plusieurs µm, soit supérieures à l’épaisseur de nos films.46 En effet, nous avons
précédemment démontré que des préostéoblastes murins MC3T3-E1 étaient capables de
ressentir la rigidité de substrats aux propriétés mécaniques contrôlées fonctionnalisés par des
films PEI/(CSA/PLL)6. Il nous semblait donc justifié de ne pas nous limiter à la
caractérisation mécanique de la zone externe du substrat.
Figure IV-14 : Modules élastiques des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et

réticulés, mesurés par nanoindentation AFM. Les barres d’erreur représentent l’écart-type
sur la moyenne, pour 5 mesures réalisées en des points distincts de la surface.
Globalement, les valeurs des modules élastiques obtenues, comprises entre 170 kPa et
280 kPa, sont dans une gamme cohérente avec les valeurs rapportées dans la littérature pour
de nombreux systèmes LbL.48,47,49 Ces valeurs sont inférieures d’un facteur 3 à 4 à celles du
module de cisaillement mesurées par QCM-D pour les architectures PEI/(CSA/PLL)6, ce qui
n’est pas surprenant compte tenu des modes d’excitation mécanique différents en QCM-D
(cisaillement dans le plan du film) et en nanoindentation AFM (compression perpendiculaire
au plan du film). Les films PEI/(CSA/PLL)6 natifs ont un module élastique légèrement
supérieur à celui des films PEI/(CSA/PLL)12 natifs. Richert et al. ont également rapporté dans
le cas de films acide hyaluronique/PLL,48 une diminution du module élastique, d’ampleur
comparable, avec l’augmentation du nombre de paires de couches. Les raisons de cette
diminution de la rigidité avec l’épaisseur ne sont pas clairement connues. Toutefois, les films
153
LbL biomimétiques composés de GAGs sont connus pour être fortement hydratés, par
conséquent nous pouvons raisonnablement penser que le taux d’hydratation augmente avec le
nombre de couches de CSA, donc avec l’épaisseur des films conduisant à un amoindrissement
de la rigidité. Par ailleurs, dans notre cas, il se pourrait que la couche de PEI sous-jacente
fortement chargée impose une cohésion, et donc une rigidité, renforcées dans la zone du film
proche du substrat de verre. Il est également probable que la plus grande rigidité des films
minces soit liée à une plus grande contribution de la rigidité du verre sous-jacent au module
élastique global mesuré par AFM. Cette différence est à nouveau observée, certainement pour
les mêmes raisons, pour les films réticulés avec la solution GnP25 ou avec solution GnP50.
Pour les deux types d’architecture, l’impact de la réticulation sur la rigidité est relativement
faible. On note ainsi, de façon cohérente avec les résultats de QCM-D, une augmentation du
module élastique limitée à quelques dizaines de kPa, quelles que soient l’architecture et la
concentration de GnP utilisée. Des augmentations comparables de la rigidité des films LbL
acide hyaluronique/PLL,47,48,49 et acide hyaluronique/chitosan,49 après réticulation par
EDC/NHS ont été rapportées.
Concernant l’influence de la concentration de GnP utilisée pour réticuler les films, il faut
distinguer le cas des films PEI/(CSA/PLL)6, pour lesquels la rigidité augmente légèrement
avec la concentration de GnP, de celui des films PEI/(CSA/PLL)12 dont la rigidité est
similaire pour les deux concentrations de GnP testées. Nous n’avons pas d’explication à ce
stade, sur cette différence de comportement des deux architectures. Néanmoins, nous
envisageons des caractérisations mécaniques complémentaires par nanoindentation AFM
utilisant cette fois des cantilevers plus souples pour nous permettre de sonder les propriétés
mécaniques intrinsèques des films en s’affranchissant de la contribution du verre sous-jacent.
À l’issue de la caractérisation structurale et mécanique, il est établi que la réticulation par

la GnP entraîne des modifications structurales, notamment une rigidification et une
augmentation de la rugosité de nos films CSA/PLL. Quelle que soit l’architecture considérée,
les deux concentrations de GnP utilisées ont conduit à des films très similaires en terme de
structure et de propriétés mécaniques telles que déterminées par microscopie optique, par
microscopie à fluorescence et par nanoindentation AFM. D’après le suivi des réactions de
réticulation par spectroscopie UV-visible établissant des différences de cinétique selon la
concentration utilisée, il est plausible que les films traités avec la solution GnP25 aient un
taux de réticulation inférieur à celui des films traités avec la solution GnP50. Cette différence
de taux de réticulation pourrait ne pas entraîner, comme nous l’avons observé, de différence
154
nette de la rigidité telle qu’évaluée par nanoindentation AFM, c’est-à-dire par l’application de
contraintes mécaniques de courte durée. Cependant, il n’est pas possible d’exclure que, sous
l’effet de contraintes appliquées pendant des temps longs, comme les cellules les appliquent
sur leurs substrats, un taux de réticulation plus faible permette un écoulement (ou fluage) plus
important des chaînes constituant le film. Ceci résulterait en un moindre caractère élastique à
long terme du substrat, ce qui pourrait influencer les comportements cellulaires.
IV.C Étude des comportements cellulaires

Les cellules, avant de pouvoir migrer et coloniser leur microenvironnement, ont besoin de
pouvoir adhérer à leur substrat et de s’y étaler. Les films LbL à base de polysaccharides tels
que la CSA sont des structures réputées très hydratées et peu rigides, et de ce fait,
défavorables à l’adhésion cellulaire.50 Comme nous l’avons vu, la réticulation est une
stratégie éprouvée pour rigidifier ce type de films et ainsi, y améliorer l’adhésion cellulaire.
Nous avons vu dans la section précédente que la réticulation des films (CSA/PLL) par la GnP
augmentait relativement faiblement, mais cependant significativement leur rigidité. Dans un
premier temps, nous cherchons à vérifier si l’adhésion, l’étalement et la morphologie de
préostéoblastes murins MC3T3-E1 in vitro sont plus favorables sur les films réticulés que sur
les films natifs, et à étudier comment cela se traduit à court, moyen et long-terme en évaluant
leur prolifération, la biosynthèse de phosphatase alcaline, ainsi que la minéralisation de leur
matrice extracellulaire.
IV.C.1 Adhésion et morphologie cellulaires

a. Étude par microscopie optique
L’adhésion et l’étalement des cellules ont été observés par microscopie optique à contraste
de phase sur une période de 60 minutes, 24 heures après l’ensemencement sur du plastique de
culture commercial (TCPS) en guise de contrôle, ainsi que sur des architectures
PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natives ou réticulées avec la solution GnP25 ou la
solution GnP50. Le contrôle sur le TCPS (Figure IV-15) permet de montrer que les cellules
ont la capacité, dans des conditions favorables, d’adopter un étalement suffisant et de se
diviser (cercle rouge). Sur un film PEI/(CSA/PLL)6 natif (Figure IV-16), nous constatons que
même après 24 heures, une majorité de cellules n’est pas parvenue à adhérer efficacement de
façon à s’étaler. Quelques-unes sont néanmoins capables d’adhérer suffisamment pour
émettre des pseudopodes et migrer (cercle rouge).
155
minutes, 24 heures après ensemencement sur un plastique commercial traité pour la culture
cellulaire (TCPS). Le cercle rouge indique une cellule suivie lors de sa mitose (barre
d’échelle : 100 µm).
Globalement, les films natifs semblent donc nettement défavorables au développement

cellulaire, ce qui est conforme aux résultats de plusieurs études ayant déjà décrit l’adhésion de
divers types cellulaires à la surface de films LbL constitués de polysaccharides.

minutes, 24 heures après ensemencement sur un film PEI/(CSA/PLL)6 natif. Le cercle rouge
indique une cellule qui émet un lamellipode pour se déplacer (barre d’échelle : 100 µm).
156
Dans le cas des films réticulés (Figure IV-17 et Figure IV-18) les observations montrent
que les préostéoblastes sont capables d’adhérer, de s’étaler (flèches jaunes), et de se diviser
(cercles rouges) de manière équivalente au contrôle et ce, indépendamment de la
concentration de GnP utilisée pour la réticulation. Ces substrats semblent donc clairement
favorables au développement cellulaire, du moins pendant les premières 24 heures.

solution de GnP25. La flèche jaune indique une cellule parfaitement étalée. Le cercle rouge
indique une cellule en cours de mitose (barre d’échelle : 100 µm).

solution de GnP50. La flèche jaune indique une cellule parfaitement étalée. Le cercle rouge
indique une cellule en cours de mitose (barre d’échelle : 100 µm).
157
Pour les architectures PEI/(CSA/PLL)12, l’observation des cellules sur une période de 60
minutes n’a pas été possible en raison de l’hétérogénéité optique de ces films, décrite au §
IV.B.3.b, empêchant de distinguer suffisamment nettement les cellules étalées de leur
substrat. Cependant, la Figure IV-19 confirme clairement l’effet inhibiteur des films natifs
sur l’adhésion cellulaire, contrairement aux films réticulés, sur lesquels nous parvenons à
distinguer un bon étalement des cellules.
PEI/(CSA/PLL)12 PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 PEI/(CSA/PLL)12-GnP50
Figure IV-19 : Photographies de cellules MC3T3-E1, 24 heures après ensemencement sur un

film PEI/(CSA/PLL)12 natif (barre d’échelle : 100 µm). L’hétérogénéité optique du substrat
rend difficile le suivi des cellules dans le temps.
Il a été démontré que l’étalement, ainsi que la capacité de mouvement et de migration qui
en découle, qui conditionnent les comportements cellulaires à plus long terme, sont gouvernés
en grande partie par la rigidité du substrat. Une fois l’adhésion cellulaire établie, notamment
au niveau des points focaux d’adhésion via les intégrines, l’étalement ne peut intervenir
efficacement que si le cytosquelette à la possibilité de s’organiser sous la forme de fibres de
stress. Les fibres de stress, constituées de protéines contenues dans le cytosol (notamment
l’actine F), constituent les supports des contraintes mécaniques exercées sur le substrat par la
cellule lors de son étalement, de ses mouvements et de sa migration. Or, la formation des
points focaux et l’assemblage des fibres de stress nécessitent une rigidité suffisante du
substrat.51,52 Il a par ailleurs été montré dans certains cas, que des variations du module
élastique des substrats de quelques dizaines de kPa seulement, pouvaient suffire à déclencher
ou à inhiber la formation des fibres de stress.53 Il est probable que la rigidification, pourtant
limitée, de nos films (CSA/PLL) par la GnP soit ainsi à l’origine du meilleur étalement des
préostéoblastes par rapport aux films natifs.
158
b. Étude par microscopie à fluorescence
Nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour étudier l’organisation du
cytosquelette des préostéoblastes MC3T3-E1 cultivés sur les films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)12 natifs ou réticulés par la GnP. L’actine et les noyaux ont été marqués par la
phalloïdineFITC et par le DAPI, respectivement. Nous avons d’abord observé la morphologie
cellulaire 3 heures après l’ensemencement (Figure IV-20). Sur le verre les cellules montrent
un étalement et une organisation du cytosquelette typiques de cellules préostéoblastiques
présentant une bonne adhésion. En revanche, sur les films natifs, conformément aux
observations de microscopie optique réalisées après 24 heures de culture, les cellules adhèrent
faiblement, et ne sont pas capables de s’étaler et d’organiser leur cytosquelette d’actine.
L’adhésion sur les films PEI/(CSA/PLL)6 semble cependant un peu moins défavorable que
sur les films PEI/(CSA/PLL)12. Sur les films réticulés l’adhésion à 3 heures apparaît
nettement favorisée par rapport aux films natifs, et atteint des résultats comparables à ceux
obtenus sur le verre quelles que soient, en première approche, l’architecture et la
concentration de GnP considérées.
Une comparaison fine de l’organisation du cytosquelette en fonction de l’architecture,
révèle cependant, dans le cas des films réticulés, des différences morphologiques nettes. En
effet, comme le montre la Figure IV-21, le cytosquelette des cellules cultivées sur les films
PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 présentent, au contraire de celles cultivées sur le verre et sur les
films PEI/(CSA/PLL)6-GnP50, de nombreuses extensions correspondant vraisemblablement à
la formation de filopodes. Nous avons observé les mêmes différences typiques pour les films
traités avec la solution GnP25. Il est intéressant de constater que les extensions du
cytosquelette se superposent sans ambigüité avec la topographie de la surface, en se
développant préférentiellement dans les sillons séparant les îlots de matière. Cependant, il
nous est à l’heure actuelle impossible de conclure quant à une influence de la topographie ou
d’une éventuelle hétérogénéité de la rigidité des films réticulés, ces îlots étant susceptibles, de
par la structure riche en CSA, de présenter une rigidité moindre que le reste de l’architecture.
En effet, à la fois la topographie et la mécanique des substrats sont connus pour influencer
l’adhésion et l’étalement cellulaire. Une étude plus fine des propriétés mécaniques des films
PEI/(CSA/PLL)12 et réticulés nous permettra d’évaluer cette hétérogénéité mécanique.
159
Figure IV-20 : Morphologies typiques de préostéoblastes MC3T3-E1, après 3h de culture sur
les films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs, ou réticulés par des solutions de GnP25
et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle). Les cellules ont été ensemencées à une densité de
2104 cellules cm-2. Les cellules ont été fixées, marquées au DAPI (bleu) pour le noyau, et à
la phalloïdineFITC (vert) pour l’actine préalablement à l’observation par microscopie à
fluorescence.
Cette observation confirme l’influence que peut exercer la topographie du substrat sur la
morphologie cellulaire à court terme et donc, potentiellement, sur les comportements
cellulaires ultérieurs.54 On sait par exemple que sur des surfaces « rugueuses », les points
focaux d’adhésion sont localisés dans la périphérie des cellules, alors que sur des surfaces
« lisses », ils sont répartis de façon homogène à l’interface cellule/substrat.55,56 Des travaux
supplémentaires sont envisagés pour caractériser le recrutement des intégrines au niveau des
points focaux d’adhésion, en fonction de la topographie de la surface explorée par les cellules.
160
A B
Figure IV-21 : Morphologies typiques de

C cellules isolées, après 3h de culture sur
(A) le verre, et sur des films (B)
PEI/(CSA/PLL)6-GnP50 et (C)
PEI/(CSA/PLL)12-GnP50. Les cellules
ont été fixées, puis marquées comme
précédemment. Le film réticulé émet une
autofluorescence rouge due à la GnP. Les
flèches indiquent les extensions
cytoplasmiques remarquables. Des
observations similaires ont été faites pour
les films réticulés avec la solution GnP25.
IV.C.2 Prolifération cellulaire

Les cultures cellulaires initiées pour l’étude morphologique décrite ci-dessus ont été
poursuivies jusqu’à 10 jours, en vue d’inspecter par microscopie à fluorescence la capacité
des cellules à proliférer et à coloniser les différents substrats (Figure IV-22). Comme attendu,
la faible adhésion cellulaire observée sur les films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs
s’est traduite par une absence quasi-totale de colonisation des surfaces. Comme pour
l’adhésion à court terme, la prolifération à 10 jours sur les films PEI/(CSA/PLL)6 semble un
peu moins défavorable que sur les films PEI/(CSA/PLL)12. Au contraire, les films réticulés
avec la GnP ont entraîné une prolifération cellulaire importante, d’ampleur similaire à celle
détectée sur le verre, sous la forme de couches cellulaires denses bidimensionnelles, à
l’exception des films PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 où les cellules se sont organisées en amas
tridimensionnels. La formation de tels amas cellulaires a été décrite en cas de déficience de
l’adhésion cellulaire sur le substrat.57 Dans ce cas, les cellules renforcent les interactions
cellules-cellules au moyen de jonctions communicantes et de liaisons entre les cadhérines, ce
qui les protège du mécanisme d’anoïkis, c’est-à-dire de l’apoptose induite par défaut
d’adhésion. Il se pourrait donc que, en dépit de capacités d’adhésion aux temps courts
161
similaires sur les architectures PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 et PEI/(CSA/PLL)12-GnP50,
l’adhésion cellulaire à plus long terme soit dégradée sur les films PEI/(CSA/PLL)12-GnP25.
Figure IV-22 : Images de microscopie à fluorescence de cellules MC3T3-E1 après 10 jours

de culture sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par des
solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle). Les cellules ont été
ensemencées à une densité de 2104 cellules cm-2. Les cellules ont été fixées, marquées au
DAPI (bleu) pour le noyau, et à la phalloïdineFITC (vert) pour l’actine préalablement à
l’observation.
Nous avons également mené une étude quantitative de la prolifération des cellules MC3T3-
E1 sur une période de 9 jours, en fonction de l’architecture LbL et de la concentration de la
solution de GnP utilisée (Figure IV-23). Les cellules ont été ensemencées à une densité de
1104 cellules cm-2. La prolifération a été évaluée d’après l’activité mitochondriale des
162
cellules par le test Alamar Blue® (§ II.D.3 ). Comme attendu suite aux résultats qualitatifs
préalables d’adhésion et de prolifération, il est confirmé que les cellules ne sont pas capables
de proliférer sur les films PEI/(CSA/PLL)12 natifs, et prolifèrent faiblement sur les films
PEI/(CSA/PLL)6 natifs. Cette différence pourrait s’expliquer par la différence de quelques
dizaines de kPa entre les modules élastiques des deux architectures (Figure IV-14, § IV.B.4 ).
Il a en effet été montré que de telles différences étaient suffisantes dans certains cas pour
modifier les comportements cellulaires.53
Sur les films réticulés, l’excellente capacité de prolifération des cellules est confirmée,
atteignant pour les films PEI/(CSA/PLL)6 notamment, des valeurs très proches de celles
mesurées sur le substrat de référence de verre. La prolifération est identique pour les deux
concentrations de GnP étudiées, ce qui indique que dans ce cas, les cellules ne sont pas
influencées par la faible différence de rigidité entre les films. Cette observation peut paraître
surprenante, puisque pour une différence de rigidité similaire, la prolifération sur les films
natifs et sur les films PEI/(CSA/PLL)6-GnP25 est elle, très différente. En réalité, comme nous
l’avons suggéré à la fin du § IV.B.4 , il devient peut-être hasardeux ici de confronter
strictement les comportements cellulaires aux modules élastiques couplés évalués par
nanoindentation AFM. En effet, il se peut que les cellules ressentent, sous l’effet des
contraintes mécaniques qu’elles appliquent sur des temps longs et du probable fluage que cela
provoque au sein des films, une différence de module élastique à long terme (ou module de
fluage) nettement supérieure à la différence de module élastique mesurée par nanoindentation
AFM, entre les films natifs et réticulés.
163
Figure IV-23 : Prolifération de cellules
MC3T3-E1 cultivées sur des films
PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12
natifs et réticulés par les solutions de
GnP25 et GnP50, ainsi que sur le verre
(contrôle). La prolifération est mesurée
par le test Alamar Blue®, après 2, 5 et 9
jours de culture.
Comme pour les films PEI/(CSA/PLL)6, la prolifération des cellules sur les films
PEI/(CSA/PLL)12 est également globalement très favorisée par la réticulation. Cependant, il
n’y a qu’aux temps courts, soit à J2, qu’elle est aussi favorable et ce, pour les deux
concentrations de GnP, que sur le verre et les films PEI/(CSA/PLL)6 réticulés. Au-delà, elle
augmente moins rapidement dans le temps que sur ces derniers, ce qui pourrait à nouveau
s’expliquer par la rigidité légèrement inférieure, d’après les mesures de nanoindentation
AFM, des films PEI/(CSA/PLL)12 réticulés. Il se peut également que le domaine de rugosité
et la topographie spécifique de ces films, constituée des îlots de matière décrits
précédemment, constituent un frein à la prolifération. On note en outre, d’après les mesures à
J5, que la prolifération ralentit davantage sur les films PEI/(CSA/PLL)12-GnP25 que sur les
films PEI/(CSA/PLL)12-GnP50. Nous ne pouvons pas attribuer cette différence à une moindre
rigidité à court terme, puisque les modules élastiques mesurés par nanoindentation AFM sont
identiques pour les deux protocoles de réticulation. En revanche, il est possible qu’en raison
d’un taux de réticulation plus faible, les films traités avec la solution GnP25 présentent un
164
module de fluage plus faible que les films réticulés avec la solution GnP50. Les cellules sont
par ailleurs connues pour sécréter de nombreuses enzymes. Il a par ailleurs été démontré que
des films LbL biomimétiques étaient sensibles à une dégradation enzymatique.40 Une
dégradation et donc, une diminution de rigidité à court comme à long terme, plus lente pour
les films les plus réticulés pourraient constituer une explication complémentaire ou alternative
à la meilleure prolifération des cellules à J5 sur les films PEI/(CSA/PLL)12-GnP50. Notons
que les mêmes raisons (module de fluage plus faible, et dégradation enzymatique plus rapide)
peuvent entraîner le défaut d’adhésion soupçonné d’être à l’origine des amas cellulaires sur
les films PEI/(CSA/PLL)12-GnP25, comme discuté précédemment.
Entre 5 jours et 9 jours de culture, le retard de la prolifération par rapport au verre est
confirmé, mais étonnamment, elle stagne sur les films réticulés avec la solution GnP50,
aboutissant à un niveau plus faible que sur les films réticulés avec la solution GnP25 sur
lesquels elle a continué à augmenter. À ce stade, il serait prématuré de tirer de ce résultat une
conclusion quant à un potentiel effet inhibiteur des films PEI/(CSA/PLL)12-GnP50 sur le
développement cellulaire. En effet, les cellules sont susceptibles d’avoir atteint plus
rapidement sur ces films que sur les autres substrats, le passage du phénotype prolifératif au
phénotype de différenciation. Ce point sera discuté dans la section suivante présentant les
résultats de différentiation.
IV.C.3 Différenciation cellulaire

L’influence des films LbL sur les comportements cellulaires à long terme a été évaluée par
(i) le suivi de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL), qui est un marqueur précoce de la
différenciation des préostéoblastes en ostéoblastes matures, et (ii) l’observation de la
minéralisation de la matrice extracellulaire, stade final de la différenciation ostéoblastique, au
moyen du marquage spécifique du phosphate de calcium à l’Alizarine Red S.
a. Dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL)

Les études de différenciation des préostéoblastes MC3T3-E1 sont généralement menées en
milieu ostéogénique (c’est-à-dire du milieu standard complémenté avec du β-
glycérophosphate et de l’acide L-ascorbique, connus pour stimuler l’expression du phénotype
ostéoblastique). Afin d’évaluer les éventuelles propriétés ostéoconductives intrinsèques de
nos substrats, nous avons également cultivé les cellules en milieu de culture standard. Les
cellules ont été ensemencées à une densité élevée (5104 cellules cm-2), c'est-à-dire dans des
conditions de quasi-confluence, afin de limiter la durée de la phase de prolifération. À cette
165
densité, le cycle cellulaire est bloqué par des interactions cellules-cellules via les cadhérines,
qui stabilisent mécaniquement les interactions entre cellules adjacentes. Il a également été
montré que ces interactions améliorent les capacités de différenciation ostéogénique des
cellules souches mésenchymateuses.58 Les cellules sont d’abord toutes ensemencées dans du
milieu standard, sans facteurs exogènes de différenciation, et cultivées pendant 24 heures.
Après ce délai, la culture est poursuivie, soit en milieu standard, soit en milieu ostéogénique.
Dans les deux cas, les cellules sont cultivées pendant 7 et 14 jours, puis récoltées pour le
dosage de la PAL et pour le dosage de la quantité totale de protéines intracellulaires qui est
proportionnelle.
La Figure IV-24 rapporte l’activité de la PAL, ainsi que la quantité totale des protéines
intracellulaires (par rapport à laquelle l’activité de la PAL est normalisée), en fonction de
l’architecture des films (nombre de paires de couches et conditions de réticulation), et du
milieu de culture standard (Figure IV-24 A&B) ou ostéogénique (Figure IV-24 C & D) en
milieu de culture standard. Quelle que soit la durée de la culture, l’activité de la PAL sur les
films natifs, quoique non négligeable, est clairement plus faible que sur les films réticulés, ce
qui indique un effet nettement favorable de la réticulation des films en termes de
potentialisation de la différenciation des cellules. De surcroît, la quantité de cellules est
beaucoup plus faible sur les films natifs que sur les films réticulés, conformément aux
résultats d’adhésion et de prolifération. Les films natifs ne peuvent donc être considérés
comme potentiellement ostéoconducteurs, contrairement aux films réticulés. C’est pourquoi il
n’est pas pertinent de comparer de façon plus approfondie les activités de la PAL sur les films
natifs et sur les films réticulés.
166
Différenciation J7
A B
Milieu standard
C D
Milieu ostéogénique
Figure IV-24 : (A et C) Activité de la phosphatase alcaline (PAL) et (B et D) quantité totale

de protéines intracellulaires des cellules MC3T3-E1 cultivées en (A et B) milieu standard ou
(C et D) milieu ostéogénique, en fonction de l’architecture des films (CSA/PLL) et de la
concentration d’agent réticulant. Les cellules sont cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés avec les solutions GnP25 ou GnP50, ainsi que sur le
verre (contrôle), puis récoltées après 7 jours. L’activité enzymatique est normalisée par
rapport à la quantité totale de protéines intracellulaires. On attribue la valeur 100% aux
mesures effectuées sur les substrats de contrôle en verre. * p < 0,05.
Après 7 jours de culture en milieu standard, la quantité de cellules d’une part, et l’activité
de la PAL d’autre part, sont similaires sur tous les films réticulés et sur le contrôle de verre, ce
qui indique que les différences structurales, mécaniques et topographiques des différents
substrats ne modulent pas, à ce stade, la différenciation des cellules. En revanche, après 14
jours, la potentialisation de la différenciation est nettement améliorée par rapport au contrôle,
sur les films réticulés avec la plus forte concentration de GnP, tandis qu’elle est inchangée sur
les films réticulés avec la plus faible concentration de GnP. Ces comportements
s’accompagnent respectivement d’une nette diminution et d’une nette augmentation de la
167
prolifération des cellules par rapport au contrôle. Il semble donc que les films les moins
réticulés favorisent la prolifération, éventuellement tridimensionnelle, tandis que les films les
plus réticulés favorisent l’engagement des cellules vers leur changement de phénotype. Étant
donné que ces comportements sont observés pour les deux types d’architectures, ils ne sont
pas conditionnés par les différences de topographie entre ces dernières. Seule la différence de
propriétés mécaniques des films réticulés avec différentes concentrations de GnP, permet
d’expliquer ces résultats ; soit par la promotion de la différenciation par un taux de
réticulation supérieur, soit par un retard de la différenciation due à l’adaptation des cellules,
via une phase proliférative, sur les substrats ayant un taux de réticulation inférieur.
La Figure IV-25 rapporte pour les cultures en milieu ostéogénique les données
équivalentes à celle décrites par la Figure IV-24 pour le milieu standard.
À nouveau, l’activité de la PAL est nettement renforcée sur les films réticulés par rapport
aux films natifs. De même qu’en milieu standard, en raison de la faible quantité de cellules
sur les films natifs, ces derniers ne peuvent pas être considérés comme potentiellement
ostéoconducteurs, et nous ne les comparerons pas davantage, en termes de potentialisation de
la différenciation cellulaire, aux films réticulés.
Après 7 jours de culture en milieu ostéogénique, contrairement au milieu standard, les
quantités de cellules et les activités de la PAL diffèrent selon l’architecture et la réticulation.
Sur les films PEI/(CSA/PLL)12 réticulés, nous observons dès 7 jours, le même comportement
de prolifération et de différenciation qu’à 14 jours en milieu standard avec, de façon
encourageante, un net effet promoteur des films traités avec la plus forte concentration de
GnP sur la différenciation, par rapport aux films traités avec la plus faible concentration de
GnP et au substrat de verre. Nous avons déjà observé un tel raccourcissement de la période
préalable à une transition phénotypique vers la phase de différenciation en présence de milieu
ostéogénique par rapport au milieu standard, lors de l’étude de l’adaptation des cellules
MC3T3-E1 aux propriétés mécaniques de gels de PDMS recouverts de films (CSA/PLL).46
Sur les films PEI/(CSA/PLL)6, de façon surprenante, c’est avec les films réticulés avec la plus
faible concentration de GnP que la potentialisation de la différenciation, associée à une
moindre quantité de cellules, est la meilleure, tandis que les films traités avec la plus forte
concentration de GnP, induisent des comportements de différenciation et de prolifération
similaire au contrôle. Un suivi fin de la cinétique de l’activité de la PAL pourrait permettre de
comprendre ce résultat inattendu, qui va à l’encontre de la tendance établie avec les films
PEI/(CSA/PLL)12 en milieu ostéogénique à 7 jours et les films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)12 à 14 jours en milieu standard, selon laquelle les films les plus réticulés sont
168
de meilleurs promoteurs de la différenciation. Cependant, compte-tenu des propriétés
potentiellement ostéoconductrices équivalentes des films PEI/(CSA/PLL)12-Gnp50 mises en
évidence par notre étude, l’élucidation de l’effet des films PEI/(CSA/PLL)6 réticulés nous
semble être un enjeu secondaire. En effet, ces derniers, plus minces et de volume plus faible
que les premiers, présentent un intérêt moindre en tant que possibles réservoirs de composés
actifs en vue de combiner les propriétés bioactives intrinsèques des films avec le relargage de
composés bioactifs.
Différenciation J14
A B
Milieu standard
C D
Milieu ostéogénique
Figure IV-25 : (A et C) Activité de la phosphatase alcaline (PAL) et (B et D) quantité totale

de protéines intracellulaires des cellules MC3T3-E1 cultivées en (A et B) milieu standard ou
(C et D) milieu ostéogénique, en fonction de l’architecture des films (CSA/PLL) et de la
concentration d’agent réticulant. Les cellules sont cultivées sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et
PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés avec les solutions GnP25 ou GnP50, ainsi que sur le
verre (contrôle), puis récoltées après 14 jours. L’activité enzymatique est normalisée par
rapport à la quantité totale de protéines intracellulaires. On attribue la valeur 100% aux
mesures effectuées sur les substrats de contrôle en verre. * p < 0,05.
169
Après 14 jours en milieu ostéogénique, les films les moins réticulés présentent, comme en
milieu standard, une meilleure colonisation cellulaire que les films les plus réticulés. À
nouveau, la moindre élasticité à long terme de ces films peut avoir induit une phase adaptative
de prolifération des cellules. Cependant, contrairement au milieu standard, cette différence de
prolifération ne s’accompagne plus à ce stade d’aucune différence en termes de
potentialisation de la différenciation. Ce comportement est certainement dû au fait que sur
tous les substrats, le pic d’activité de la PAL est intervenu précocement par l’effet du milieu
ostéogénique, amenant les cultures après 14 jours dans un état commun tardif stable de
différenciation. Cette explication est appuyée par l’étude de Dalby et al., montrant que
l’expression de la PAL augmente pendant les 7 premiers jours, puis décroit pendant les 7
jours suivants, les cellules exprimant alors des marqueurs de différenciation tardifs
(ostéopontine, ostéocalcine).59
b.Minéralisation de la matrice extracellulaire

Un marquage à l’Alizarine Red S a été réalisé sur des cellules cultivées pendant 8 semaines
sur les différents substrats, en milieu ostéogénique, de manière à révéler le calcium contenu
dans la matrice extracellulaire (MEC). La Figure IV-26 montre les microphotographies
réalisées en microscopie optique à contraste de phase de nodules typiques observés sur les
substrats. Les cellules cultivées sur les films PEI/(CSA/PLL)6 natifs parviennent à s’organiser
en nodules, mais ne sont pas capables de minéraliser leur MEC, comme indiqué par l’absence
de coloration rouge. Sur les films PEI/(CSA/PLL)12 natifs, malgré la faible prolifération
observée dans les 9 premiers jours, les cellules ont toutefois réussi à s’adapter à la surface de
ces films sur le long terme, mais elles ne sont pas organisées et donc, pas capables de former
de MEC minéralisée.
Au contraire, de façon encourageante, les cellules cultivées sur tous les films réticulés
induisent, comme sur le contrôle de verre, la formation de nodules minéralisés révélés par la
coloration rouge traduisant la présence de calcium au sein des nodules. En première
approximation, sur la base de la taille des nodules minéralisés typiques observés, il semble
confirmé que les films offrant les meilleures conditions pour la différenciation ostéogénique
et par suite, pour la minéralisation de la MEC, sont les films PEI/(CSA/PLL)12-GnP50.
170
Figure IV-26 : Microphotographies de cellules MC3T3-E1, cultivées pendant 8 semaines en
milieu ostéogénique sur des films PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12 natifs et réticulés par
les solutions GnP25 et GnP50, ainsi que sur du verre (contrôle). La présence de calcium dans
la MEC est révélée par l’Alizarine Red S (coloration rouge).
IV.D Conclusion
Dans ces travaux, nous avons étudié la réticulation de films (CSA/PLL) par la GnP, un
agent réticulant d’origine naturelle. Nous avons fait varier (i) l’épaisseur des films LbL, par
l’utilisation de deux architectures, l’une composée de 6 paires de couches, l’autre de 12, et (ii)
les concentrations des solutions de GnP utilisées (0,25% et 0,50% en masse). Sur les films
PEI/(CSA/PLL)6, la réticulation provoque des modifications de rugosité Ra et Rt, traduisant un
possible effondrement d’une partie du film. Cependant, les différences de rugosité observées
171
entre les films natifs et réticulés semblent indépendantes de la concentration de GnP utilisée.
Des résultats similaires ont été observés sur les films PEI/(CSA/PLL)12, mais avec des
différences plus importantes entre les films natifs et réticulés, faisant apparaître des îlots de
matière, similaires à des structures déjà visibles par microscopies optique et à fluorescence sur
les films non réticulés. Il est donc raisonnable de penser que ces structures particulières sont
composées de zones denses et enrichies en polyélectrolytes déjà présentes dans les films
natifs, mais masquées par une zone diffuse. Par ailleurs, la combinaison de la spectroscopie
FTIR-ATR et de la microscopie à épifluorescence nous a permis de mettre en évidence un
phénomène de FRET entre la GnP ayant réagi avec les groupements amine primaire des
chaînes de PLL et la FITC, une sonde fluorescente utilisée pour marquer la CSA. Ce résultat
inattendu nous a confirmé que la réticulation intervenait sur toute l’épaisseur du film, et pas
uniquement sur les couches externes. Des analyses par FTIR-ATR sont cependant prévues sur
les films composés de 12 paires de couches, afin de s’assurer que la CSA n’est pas chassée de
l’architecture lors du traitement réticulant.
La QCM-D et la nanoindentation AFM ont confirmé que la réticulation provoque une
modification, certes limitée, des propriétés mécaniques des films de l’ordre de quelques
dizaines de kPa, d’après les mesures par nanoindentation. La réticulation par la GnP a un effet
favorable sur l’adhésion, l’étalement et la prolifération des préostéoblastes murins
MC3T3-E1. Bien que les cellules soient sensibles à des variations de rigidité de l’ordre de
quelques dizaines de kPa, il est probable que l’effet promoteur de l’étalement cellulaire soit en
partie imputable à la formation d’une architecture de PLL réticulée, réduisant l’écoulement
des polyélectrolytes lors de l’application de forces par les cellules lors de leur étalement.
Nos films ainsi réticulés acquièrent une structure de semi-RIP, dont les propriétés
physicochimiques et mécaniques apportent aux préostéoblastes MC3T3-E1 un
microenvironnement ostéoconducteur, en les orientant vers un phénotype d’ostéoblastes
matures, capables de minéraliser leur MEC. La minéralisation est cependant moins prononcée
pour les cellules cultivées sur les films réticulés que sur le verre. L’incorporation de composés
bioactifs dans les films pourrait permettre d’optimiser les comportements des cellules.
172
IV.E Références bibliographiques
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Chapitre V - Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine au sein
de films (CSA/PLL) en vue du relargage de composés actifs.
V.A Introduction 178
V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD 179

V.B.1 Mise au point de la méthode d’incorporation 179
V.B.2 Influence du précurseur PEI 187
V.B.3 Influence de la charge externe du film et du vecteur 188
V.B.4 Influence de la concentration du vecteur 191
V.C Influence du pH et de la force ionique 192

V.C.1 Influence du pH 193
a. Rinçage à pH 4.5 193
b. Rinçage à pH 8,5 195
V.C.2 Influence de la force ionique 197
V.D Conclusion 198
V.E Références bibliographiques 199
V.A Introduction
Les travaux décrits dans ce chapitre font partie d’un projet en cours visant à fonctionnaliser
des films LbL par des composés actifs à des fins (i) de relargage thérapeutique et (ii) de
séparation chirale par la technique de l’électrophorèse capillaire. Ce travail a fait l’objet du
co-encadrement d’une stagiaire de Master 2 Recherche, Rim Khelif, pendant 5 mois.
Depuis environ deux décennies, les films LbL suscitent l’intérêt de nombreuses équipes de
recherche pour la très grande diversité de leurs propriétés chimiques et physiques, ainsi que
pour leur grande polyvalence, en raison de la possibilité d'y incorporer des composés
fonctionnels (§ I.B). L’étude des propriétés physicochimiques de la structure et du
comportement des films LbL vise à approfondir leurs nombreuses perspectives d’application
dans le domaine de la fonctionnalisation de surface, notamment pour les biomatériaux.1
De nombreux médicaments sont des molécules hydrophobes, difficiles à immobiliser au
sein d’architectures LbL quand le traitement est réalisé en milieu aqueux. Il est donc possible
178
d’utiliser des cyclodextrines afin de les solubiliser préalablement. Ce procédé
d’immobilisation, utilisé avec succès pour le Piroxicam, un anti-inflammatoire non stéroïdien,
vectorisé par des monomères de cyclodextrines anioniques, a donné des résultats prometteurs
en termes de diminution de la réponse inflammatoire.2 Cependant, la fonctionnalisation par
des monomères de cyclodextrines résulte en un relargage rapide du composé. Des films LbL
construits avec des polymères de cyclodextrines électriquement chargés ont montré qu’il était
possible de contrôler la cinétique de relargage du médicament immobilisé.3,4
Au cours de ce travail, nous avons étudié l'incorporation d'un dérivé anionique d’un
polymère de cyclodextrine (noté pCD) au sein de films LbL constitués de chondroïtine sulfate
A (CSA) et de poly(L-lysine) (PLL). L'objectif est d'enrichir la surface de biomatériaux avec
des composés bioactifs hydrophobes en les vectorisant par le pCD. Il est difficile
d’immobiliser des molécules hydrophobes sur des films LbL quand le traitement est réalisé en
milieu aqueux, il est donc possible d’utiliser des cyclodextrines afin de les solubiliser.
Dans un premier temps, nous avons étudié les interactions du vecteur pCD avec les films
biomimétiques (CSA/PLL) en conditions physiologiques (pH 7.4, 0,15 M NaCl). Nous avons
notamment observé l'influence de la présence ou non d'une couche précurseur de
polyéthylèneimine (PEI) préalable à la construction des films (CSA/PLL), de la nature de la
couche externe, et de la concentration du vecteur en solution, sur la quantité immobilisée.
Hormis les applications dans le domaine du relargage de médicaments par les
biomatériaux, l'immobilisation de dérivés de cyclodextrine sur des surfaces est prometteuse
pour des applications de séparation chirale dans les méthodes chromatographiques.5 En effet
les cyclodextrines sont des composés chiraux pouvant interagir différemment avec les deux
énantiomères d'un mélange racémique. Dans le cadre d'une collaboration avec le laboratoire
COBRA – UMR 6014 (Dr. C. Morin), spécialisé dans le développement de méthodes
analytiques par électrophorèse capillaire, nous avons ainsi étudié l'influence du pH et de la
force ionique sur la stabilité de nos films enrichis en pCD, afin d'évaluer leur comportement
dans des conditions courantes d'analyses par électrophorèse capillaire.
V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD

V.B.1 Mise au point de la méthode d’incorporation
La technique LbL étant basée principalement sur les interactions électrostatiques entre
deux polyélectrolytes de charges opposées, nous avons dans un premier temps envisagé la
construction de films formés par des dépôts alternés de pCD et de PLL cationique, sur une
179
couche précurseur de PEI, afin d’obtenir des architectures du type PEI/(pCD/PLL)i, i
correspondant au nombre de paires de couches.
Les concentrations des solutions des polyanions et polycations sont les mêmes que lors de
la construction de films PEI/(CSA/PLL), soit 5 mg mL-1 pour la PEI et 1 mg mL-1 pour pCD
et PLL. L’analyse par QCM-D de la construction d’un film PEI/(pCD/PLL)3/pCD (Figure
V-1) montre que le dérivé de cyclodextrine s’est adsorbé favorablement sur la couche de PEI.
Figure V-1 : (A) Évolution des fréquences de

résonance et (B) des facteurs de dissipation
lors de la construction d’un film
PEI/(pCD/PLL)3/pCD à pH 7,4 et 0,15 M
B NaCl sur un résonateur 5 MHz.
Les injections successives de PLL et pCD montrent des variations cycliques des
paramètres de QCM-D, traduisant une prise de masse hydratée lors des injections de pCD et
une perte de masse hydratée au contact de la PLL. Ces phénomènes se compensent, de sorte
que la construction du film a été globalement ineffective. Deux hypothèses peuvent expliquer
l’allure cyclique des courbes : (i) la PLL provoque une désorption partielle de pCD par
complexation, puis l’injection suivante de pCD compense cette désorption ; (ii) la PLL
provoque un effondrement et une densification de la couche de pCD entraînant un relargage
d’eau, puis l’injection suivante de pCD provoque la désorption de la PLL par complexation et
le retour à la couche de pCD hydratée initiale. Dans les deux cas, le comportement observé
semble reposer sur une plus grande stabilité des complexes pCD/PLL en solution que sous la
180
forme de dépôts LbL en surface. Un mécanisme similaire a été mis en évidence dans une
étude récente au laboratoire pour les films phosvitine/PLL. Le suivi de la construction des
films par OWLS permettrait de détecter quelle étape provoque une désorption de matière et
ainsi, confirmer l’une ou l’autre des hypothèses énoncées. Cependant, cette question ne
présentait pas un intérêt crucial dans notre étude, compte tenu de l’échec de la construction ;
c’est pourquoi nous ne l’avons pas approfondie.
L’échec de la construction a été d’autant plus surprenant qu’il existe dans la littérature des
exemples d’architectures LbL à finalité biomédicale basées sur des dépôts alternés d’un
polymère de cyclodextrine électriquement chargé et d’un polyélectrolyte de charges
opposée.3,4 Martin et al. ont utilisé un polymère anionique de CD, fabriqué par polymérisation
de β-CD et d’acide citrique (CTR).3 Les auteurs ont montré l’efficacité de la construction des
films LbL associant ce polymère anionique à du chitosan. Leurs résultats ont fait apparaître,
en OWLS, une augmentation de la masse du film après chaque étape d’adsorption, ainsi que
des inversions cycliques de la charge de surface, détectées par détermination du potentiel
Zêta.
Les films LbL permettant l’immobilisation par post-traitement de protéines,6 de
nanoparticules,7 ou encore de petites molécules,8 nous avons envisagé, comme méthode
alternative, de fonctionnaliser une matrice LbL préexistante à l’aide de la pCD. Pour cela,
nous avons choisi d’utiliser les films (CSA/PLL) dont nous maîtrisons bien la structure. Le
suivi par QCM-D de l’incorporation du vecteur dans ces films a révélé une forte augmentation
des facteurs de dissipation suite à l’injection de pCD. Dans la suite de l’étude, nous nous
sommes limités à cinq paires de couches (CSA/PLL) de manière à rester dans le domaine de
dissipation accessible à la mesure. Les films ont été construits dans les mêmes conditions que
précédemment (§ II.A.3 c).
La Figure V-2 montre le suivi des variations des fréquences de résonance et des facteurs
de dissipation par QCM-D au cours de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD. Nous
pouvons noter que les courbes de fréquences normalisées (∆fn/n) ne sont pas rigoureusement
superposées (Figure V-2 A). Elles sont même très distinctes lors de l’étape d’adsorption du
polymère de cyclodextrine pCD, ce qui indique le caractère non rigide du dépôt.9 Ce caractère
viscoélastique est confirmé par l’augmentation très importante des facteurs de dissipation
(∆Dn) (Figure V-2 B). La mise en contact de ce film avec la pCD provoque également une
forte diminution des fréquences de résonance. Au contraire, la mise en contact du film avec le
monomère anionique de cyclodextrine (noté CD) ne provoque pas de variation de ∆f3/3
(Figure V-2 D).
181
A C
B D
Figure V-2 : Évolution (A) des fréquences de résonance et (B) des facteurs de dissipation
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl sur un
résonateur 5 MHz, avec (C) le détail de la construction du film LbL et sa mise en contact avec
la pCD. « R » indique le rinçage du film avec du tampon Tris. (D) Évolution de Δf3/3 lors de
la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/CD.
D’une manière générale, la fréquence fondamentale (∆f1) est exclue de l’analyse

quantitative car elle est affectée par les conditions de montage du résonateur, propres à chaque
expérience,10 contrairement aux harmoniques supérieures. Cependant, les trois autres
harmoniques sont suffisantes pour appliquer le modèle d’analyse de Voigt, qui permet, dans le
cas de dépôts viscoélastiques, de convertir les données QCM-D brutes en masse
hydrodynamique. La masse hydrodynamique d’un dépôt correspond à sa masse hydratée, soit
les masses additionnées de la matière adsorbée et de l’eau piégée dans le dépôt. L’épaisseur
hydrodynamique est obtenue en divisant la masse hydratée par la masse volumique du dépôt
(1,1 g mL-1).11
182
L’épaisseur hydrodynamique et la masse hydratée des films, d’après le modèle de Voigt
appliqué aux 3ème, 5ème et 7ème harmoniques, subissent une augmentation très importante sous
l’effet de la pCD (Figure V-3 et Figure V-4).
Figure V-3 : Évolution de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique lors de

l’immobilisation de pCD sur un film PEI/(CSA/PLL)5 comme décrit dans la Figure V-2.
Figure V-4 : Évolution moyenne de l’épaisseur et de la masse hydrodynamique obtenues pour

4 films PEI/(CSA/PLL)5/pCD. Les barres d’erreur représentent les écarts-types sur la
moyenne.
183
La Figure V-4 montre l'évolution moyenne de l'épaisseur et de la masse hydrodynamique
pour 4 architectures PEI/(CSA/PLL)5/pCD identiques, ce qui permet de vérifier ainsi la
reproductibilité et le caractère général du comportement observé. L’augmentation en
épaisseur et en masse hydrodynamique sous l’effet de la pCD est de 180 ± 100%.
En outre, d’après la forte augmentation des facteurs de dissipation (Figure V-2 B), il est
vraisemblable que l'augmentation de masse soit constituée d'une contribution importante
d'eau, traduisant un possible gonflement du dépôt. Les cyclodextrines étant des molécules très
riches en groupements hydroxyles, et donc très hydrophiles, une forte hydratation du film par
adsorption de pCD est plausible. Afin d’approfondir ces aspects, nous avons caractérisé les
films par OWLS et AFM.
La technique OWLS donne accès à la masse « sèche » des films (§ II.B.4 ). Contrairement
à la QCM-D, elle ne détecte pas l'eau liée à ces derniers. Nous avons caractérisé trois films
PEI/(CSA/PLL)5/pCD par OWLS.
Figure V-5 : Évolution des paramètres optiques OWLS, (A) NTE et (B) NTM, lors de la
construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD.
La Figure V-5 montre l'évolution typique des paramètres optiques mesurés par la
technique (les indices effectifs NTE et NTM) pour l'une des constructions réalisées. Une étude
des indices effectifs obtenus dans le cadre du modèle « étendu » de monocouche homogène et
isotrope développée par Picart et al.12 permet d’obtenir des informations qualitatives en
termes d’indice de réfraction, d’épaisseur optique et de masse optique (Figure V-6).
184
A C
Figure V-6 : Conversion des données de la

B
Figure V-5 en (A) indice de réfraction
(nOWLS), (B) épaisseur optique (dOWLS) et (C)
masse optique (QOWLS), par le modèle étendu
de monocouche homogène et isotrope pour
un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD.
Les données obtenues par OWLS confirment l’immobilisation d’une quantité significative
de vecteur pCD à la surface ou au sein des films. Il était attendu que la prise en masse
détectée par cette technique soit moins importante que celle détectée par QCM-D. La
comparaison des masses hydratées (QCM-D) et sèches (OWLS) permet d’évaluer à 90% la
quantité d’eau constituant la masse totale des films.
Pour l’étude par AFM, des films PEI/(CSA/PLL)5 et PEI/(CSA/PLL)5/pCD ont été
construits sur des lames de verre, en milieu tampon Tris – NaCl, comme décrit précédemment
(§ II.B.2 ). Ces films ont été imagés par AFM, en milieu liquide, afin de déterminer
l’influence de l’immobilisation du vecteur pCD sur leur morphologie. Les analyses ont été
réalisées sur trois zones distinctes, sur une surface de 20 x 20 µm (Figure V-7).
185
Figure V-7 : Images AFM caractéristiques et valeurs de rugosité Ra des films
PEI/(CSA/PLL)5± pCD.
Les valeurs de rugosité Ra calculées pour les films PEI/(CSA/PLL)5 et

PEI/(CSA/PLL)5/pCD sont également rapportées dans la Figure V-7. Pour le film non traité,
la rugosité Ra est de l’ordre de 20 nm, ce qui est cohérent avec les valeurs habituelles. Le
traitement par le vecteur pCD n’a pas d’influence sur la topographie des films. De plus, nous
pouvons noter que la morphologie typique des films (CSA/PLL) est conservée après
traitement avec le vecteur. Les deux films présentent des îlots de matière typiques de ce type
d’architecture. Ces résultats sont compatibles avec un gonflement des films (CSA/PLL) lors
de l’incorporation du vecteur sans toutefois en donner la confirmation.
Globalement, le comportement observé par QCM-D et OWLS est prometteur puisqu'il

suggère que le vecteur s'adsorbe (ou s'incorpore) favorablement sur (ou dans) le film. Il est
important de noter que l'immobilisation présumée du vecteur est un phénomène irréversible
dans nos conditions (Tris pH 7,4 et 0,15 M NaCl), puisque l’épaisseur et la masse du film
mesurées par les deux techniques sont peu influencées par l'étape de rinçage.
A ce stade, cette prise de masse des films semble trop importante pour pouvoir être
attribuée à une simple adsorption de surface. Il est plutôt probable que le vecteur soit
incorporé dans la structure interne des films par diffusion.
Comme cela a été décrit précédemment, la croissance du film PEI/(CSA/PLL)5 suit un
régime de croissance exponentielle. Il s'agit d'un système diffusif, c'est-à-dire qu'au moins un
des deux polyélectrolytes est capable de diffuser au sein de la structure du film. Ce
comportement n'est pas surprenant pour un système constitué d'un polysaccharide et d'un
polypeptide. La littérature montre que ce type de système LbL est souvent à croissance
exponentielle13 et les études menées récemment au sein du laboratoire sur le mécanisme de
croissance et la structure des films (CSA/PLL) ont démontré le régime de croissance
exponentiel de ce système.14 Il est donc raisonnable d’envisager une incorporation de pCD
basée sur la diffusion de ce polymère au sein du système (CSA/PLL).
186
Afin de définir les conditions optimales d'immobilisation du vecteur pCD par les matrices
(CSA/PLL), nous nous sommes par la suite attachés à décrire l’influence de :
 l'absence de la couche « précurseur » de PEI,
 la charge de la couche terminale du film (CSA ou PLL) et du vecteur,
 la concentration de la solution de pCD.
V.B.2 Influence du précurseur PEI

Le PEI est souvent utilisé dans la technologie LbL pour former une couche précurseur
avant la construction des films LbL.15 Comme cela a été décrit précédemment §II, ce
polymère très branché et possédant une forte densité de charges positives a pour rôle de
produire un état de surface reproductible et de s’affranchir des variations de l’état de surface
des substrats d’une construction à l’autre. Il a par ailleurs été démontré que la couche
précurseur de PEI permet au film d’atteindre plus vite un régime régulier de croissance en
masse et en épaisseur.16 Cependant, nous pourrions raisonnablement craindre que les chaînes
de PEI sous-jacentes interviennent dans le mécanisme d’immobilisation du pCD et que ce
dernier ne soit pas propre au système (CSA/PLL). Nous avons donc étudié l’immobilisation
de pCD sur des films (CSA/PLL)5 construits sans couche précurseur de PEI.
La Figure V-8 montre l'évolution des paramètres QCM-D au cours de la construction d'un
film (CSA/PLL)5/pCD. Les résultats, en accord avec la littérature, montrent que dans le cas du
film (CSA/PLL)5 les variations de fréquences et de dissipation atteintes sont nettement plus
faibles que pour le film construit en présence d'une couche précurseur (Figure V-2). Ceci
s'explique par le fait que les premières étapes d'adsorption de CSA et de PLL sont moins
efficaces en raison d'une densité de charges plus faible sur le substrat.
La mise en contact du film avec la solution de pCD 1 mg mL-1 provoque également de
fortes variations des paramètres QCM-D. Le mode d’interaction de la pCD avec les films
(CSA/PLL) ne semble donc pas être conditionné par la présence ou l’absence de PEI.
Cependant, d’après la QCM-D, l’interaction semble moins importante en absence qu’en
présence de PEI. L'immobilisation de pCD ne semble donc pas gouvernée uniquement pas la
nature (composition et charge) de la dernière couche, mais également par son épaisseur.
187
A C
B Figure V-8 : Évolution (A) des fréquences de

(PLL/CSA)5/PLL/pCD sans couche
précurseur de PEI, avec (C) le détail de la
construction du film LbL et la mise en
contact avec la pCD.
Ce résultat, s’il est lié à la moindre épaisseur du film, est compatible avec un mode
d'immobilisation basé sur l'incorporation du vecteur par diffusion à l'intérieur des films, plutôt
que sur une simple adsorption de surface. Le film pourrait ainsi constituer un réservoir pour
l'incorporation de pCD. Afin de confirmer cette hypothèse, une étude portant sur
l’incorporation de pCD sur des films constitués d’un nombre variable de couches (CSA/PLL)
devra être réalisée.
Pour la suite de ce travail, toutes les expériences sont menées sur des films construits avec
une couche de précurseur PEI, afin de prendre pour références les conditions les plus
favorables en termes de quantité de pCD immobilisée.
V.B.3 Influence de la charge externe du film et du vecteur

Le vecteur pCD étant un dérivé anionique de β-cyclodextrine, nous l’avons jusqu’à
maintenant mis en contact avec un film terminé par une couche polycationique de PLL, de
façon à favoriser l’immobilisation par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques
attractives. Afin de confirmer la nature des interactions mises en jeu, nous avons étudié par
QCM-D (i) l’interaction du pCD avec un film terminé par une couche polyanionique de CSA
188
et (ii) l’interaction de l’analogue non chargé de pCD (noté pCD0) avec un film terminé par
PLL.
A C
B Figure V-9 : Évolution (A) des fréquences de

PEI/(CSA/PLL)5/CSA/pCD, avec (C) le détail
de la construction du film et LbL et la mise
en contact avec la pCD.
La Figure V-9 montre l'évolution des paramètres QCM-D lors de la construction d'un film
PEI/(CSA/PLL)5/CSA/pCD. Il apparaît que l'immobilisation du vecteur anionique pCD est
moins favorable sur un film terminé par une couche anionique (CSA) que sur un film terminé
par une couche cationique (PLL). Les attractions électrostatiques jouent donc un rôle
significatif dans l'immobilisation du vecteur. Cependant, il est probable que ces interactions
ne soient pas les seules en jeu, puisque l'immobilisation est tout de même importante sur une
surface chargée négativement. Notamment, les liaisons polaires et hydrogènes pourraient
jouer un rôle, puisque aussi bien le polysaccharide que le pCD sont des composés polaires et
riches en groupements donneurs et accepteurs de liaisons hydrogènes.
189
Figure V-10 : Évolution de la masse hydrodynamique lors de l’immobilisation de pCD sur le
film PEI/(CSA//PLL)5/CSA décrit dans la Figure V-9.
La traduction des données de QCM-D, en épaisseur hydrodynamique et masse hydratée,

d’un film PEI/(CSA/PLL)5/CSA/pCD permet d’estimer la différence de matière incorporée
dans un film terminé par une couche cationique (PLL) (Figure V-3) et un film terminé par
une couche cationique (CSA) (Figure V-10) à environ 10 µg cm-2.
La Figure V-11 montre l’évolution des paramètres QCM-D d’un film PEI/(CSA/PLL)5
mis en contact avec une solution de l'analogue non chargé pCD° du polymère pCD.
La très faible variation des paramètres QCM-D fait apparaître clairement que le pCD° n'est
pas immobilisé à la surface du film. Ce résultat démontre que, même si elles ne sont pas les
seules en jeu, les interactions électrostatiques attractives sont indispensables à
l'immobilisation du vecteur. Des interactions basées uniquement sur des liaisons polaires et/ou
hydrogènes ne sont pas suffisantes pour amorcer la diffusion du pCD au sein de la matrice
LbL.
190
A C
B Figure V-11 : Évolution (A) des fréquences

de résonance et (B) des facteurs de
dissipation lors de la construction d’un film
PEI/(CSA/PLL)5/pCD°, avec (C) le détail de
la construction du film LbL et la mise en
contact avec la pCD0.
V.B.4 Influence de la concentration du vecteur

Afin d'optimiser la quantité de vecteur incorporée dans les matrices (CSA/PLL), nous
avons étudié l'influence de la concentration de la solution de pCD. Une solution de pCD de
concentration 0,1 mg mL-1 a donc été mise en contact avec un film PEI/(CSA/PLL)5.
L’influence des injections successives sur les paramètres QCM-D sont visibles sur la Figure
V-12.
Comme attendu, la première injection de pCD à 0,1 mg mL-1 provoque l'immobilisation du
vecteur. L’immobilisation observée avec cette solution est cependant de moindre ampleur que
celle observée avec une solution de pCD à 1 mg ml-1 (Figure V-2). En réalisant des
renouvellements de la solution de pCD à 0,1 mg mL-1 (notés I2 à I7), nous avons observé que
chaque injection provoquait une nouvelle immobilisation de pCD sur le film
PEI/(CSA/PLL)5, jusqu’à saturation du film.
191
A C
B Figure V-12 : Évolution (A) des fréquences

de résonance et (B) des facteurs de
dissipation lors d’injections successives
(notées Ix) de solutions de pCD à une
concentration de 0,1 mg mL-1 et 0,5 mg mL-1
(notée I0,5 mg/mL) au contact d’un film
PEI/(CSA/PLL)5, avec (C) le détail de la
construction du film LbL et la mise en
contact la pCD à une concentration de 0,01
mg mL-1.
Ce résultat montre que la stabilisation des paramètres QCM-D observée après chaque
injection de cette solution de pCD était due non pas à une saturation du film, mais à
l’épuisement de la solution contenue dans la chambre d’écoulement. La saturation du film
intervient après quatre injections de pCD à 0,1 mg mL-1. Une dernière injection de pCD à 0,5
mg mL-1 n’a pas provoqué d’immobilisation supplémentaire, ce qui confirme la saturation du
film. Les valeurs obtenues en termes de fréquences et de facteurs de dissipation sont très
similaires à celles observées avec une injection unique de pCD à 1 mg mL-1 (notons qu’il a été
vérifié dans ce cas qu’une seconde injection n’augmentait pas la prise de masse – données non
montrées). Ces résultats confirment la forte affinité des films pour le vecteur, et confirme que
l’incorporation du pCD n’est pas régie par un équilibre.
V.C Influence du pH et de la force ionique

En marge de notre projet visant à utiliser le pCD pour relarguer des composés bioactifs,
nous avons étudié, dans le cadre d’une collaboration avec le laboratoire COBRA – UMR
6014, des films (CSA/PLL) enrichis avec le pCD à des fins de séparation chirale par
192
électrophorèse capillaire. Les cyclodextrines sont couramment utilisées, en tant que phase
stationnaire, pour la séparation d’énantiomères par chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC)17 ou par électrophorèse capillaire.18 La démarche envisagée est d’utiliser
les matrices LbL (CSA/PLL) comme phases stationnaires déposées à la surface des
capillaires, afin d’en améliorer la sélectivité chirale.
Les analyses peuvent donc nécessiter des conditions de pH et de force ionique différentes
des conditions utilisées jusqu’alors pour construire nos films. Notre objectif est donc de
vérifier leur stabilité sous l’effet d’un changement de pH ou de diminution de la force ionique.
Des variations de pH ou de force ionique sont en effet connues pour pouvoir déstabiliser les
films LbL. Par exemple, sur des films LbL composés de poly(chlorure de
diallyldimethylammonium) et de poly(acide acrylique) fonctionnalisés par post-traitement
avec des nanoparticules, un rinçage à pH 9 provoque un relargage beaucoup plus important
des nanoparticules qu’à pH 7.7 Les auteurs expliquent ce phénomène par les différences de
densités de charges des polyélectrolytes au sein de l’architecture LbL. Mjahed et al. ont étudié
la dissolution de films, induite par des modifications de la force ionique, sur des films LbL à
croissance exponentielle.19
Les films utilisés lors de cette étude sont construits dans les conditions habituelles, c'est-à-
dire selon une architecture PEI/(CSA/PLL)5/pCD à la concentration de 1 mg mL-1, en milieu
tampon Tris à pH 7,4 et 0,15 M NaCl. Les films sont ensuite rincés par des solutions à pH 4,5
(tampon acétate), de pH 8,5 (tampon Tris) ou de force ionique 0,05 M ou 0,01 M.
V.C.1 Influence du pH
a. Rinçage à pH 4.5
La Figure V-13 montre l’évolution des paramètres QCM-D sous l’effet du rinçage d’un
film PEI/(CSA/PLL)5/pCD construit dans les conditions standard, puis rincé par une solution
tamponnée à pH 4,5 (RpH4.5).
L’étude de l’évolution des paramètres de QCM-D montre que le tampon pH 4,5 a peu
d’influence sur le film, et ne semble pas le détruire. Cependant, il nous est impossible de
conclure avec certitude quant à la parfaite stabilité du film sur la base de cette seule
expérience. En effet, les faibles variations des paramètres de QCM-D peuvent résulter d’un
éventuel relargage de pCD, compensé par un gonflement simultané du film PEI/(CSA/PLL)5
sous-jacent.
193
A B
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du
rinçage à pH 4,5.
Afin de vérifier cette hypothèse, un film PEI/(CSA/PLL)5 non traité avec le vecteur pCD a
été rincé dans les mêmes conditions que le film précédent, à savoir avec le tampon à pH 4,5.
La Figure V-14 montre que le film est parfaitement stable lors du rinçage.
A B
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis rinçage à pH
4,5.
Nous n’observons pas de gonflement du film dans ces conditions de pH. L’architecture
PEI/(CSA/PLL)5/pCD n’est donc pas affectée par la diminution du pH et conserve la quantité
de pCD immobilisée par post-traitement dans les conditions standard de construction. Il est
donc envisageable d’utiliser une architecture de ce type pour la séparation d’analytes chiraux
en milieu acide.
194
b. Rinçage à pH 8,5
La même démarche a été appliquée pour le rinçage à pH 8,5 d’un film
PEI/(CSA/PLL)5/pCD construit dans les conditions standard. Les paramètres de QCM-D
montrent une forte diminution de la masse hydratée après le rinçage à pH 8,5, se traduisant
par une augmentation de la fréquence et une diminution de la dissipation jusqu’à des valeurs
intermédiaires (Figure V-15).
A C
B D
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du
rinçage à pH 8,5, avec le détail des différents rinçages pour (C) les fréquences de résonance
et (D) les facteurs de dissipation.
Au contraire, le rinçage à pH 8,5 du film sans pCD ne provoque pas de modification de ces
paramètres (Figure V-16). Ces résultats suggèrent que le rinçage à pH 8,5 provoque un
relargage de pCD sans altérer l’architecture des films LbL.
195
A B
lors de la construction d’un film PEI/(CSA/PLL)5 à pH 7,4 et 0,15 M NaCl, puis lors du
rinçage à pH 8,5.
La Figure V-17 A montre l’évolution de la masse optique, mesurée par OWLS, d’un film
PEI/(CSA/PLL)5/pCD construit dans les conditions standard, après un rinçage avec une
solution tampon de pH 8,5. Ce résultat montre, de manière cohérente avec les résultats
obtenus par QCM-D (Figure V-17 B), que le rinçage à pH 8,5 s’accompagne d’un relargage
de matière significatif.
A B
Figure V-17 : Effet du rinçage à pH 8,5 sur les masses mesurées en (A) par OWLS et (B) par
QCM-D de films PEI/(CSA/PLL)5/pCD.
Néanmoins, la quantité de matière relarguée est inférieure à la prise en masse

accompagnant le post-traitement par la solution de pCD. Il se pourrait que le rinçage à pH 8,5
atténue le taux de protonation (c'est-à-dire la densité de charges) des chaînes de PLL
constituant le film, notamment à sa surface, limitant ainsi les interactions électrostatiques
attractives entre le film et le pCD et provoquant le relargage partiel de cette dernière.
196
Malgré ce relargage, la quantité résiduelle pourrait suffire pour la séparation d’analytes
chargés.
V.C.2 Influence de la force ionique

Les conditions de force ionique ont une grande influence sur la conformation des
polyélectrolytes. En effet, les contre-ions en solution se concentrent autour des charges des
polyélectrolytes, ce qui provoque un écrantage des interactions électrostatiques (attractives et
répulsives) intra- et intermoléculaires. La construction et la cohésion des films LbL étant
fondées en grande partie sur des interactions électrostatiques, les variations de force ionique
sont donc susceptibles d'altérer leur structure.20
En électrophorèse capillaire, la séparation des analytes est d'autant plus efficace que la
tension appliquée aux bornes du capillaire est élevée. Or, à cause du trop fort effet Joule
qu’elles engendrent, les forces ioniques élevées limitent l'accès à des voltages élevés. A
l'inverse, des films LbL construits dans des conditions de force ionique faible sont de faible
épaisseur. D’après l’hypothèse formulée plus haut, c'est-à-dire si la quantité de pCD
incorporée au sein du film est fonction de l’épaisseur du film (CSA/PLL), construire les films
à faible force ionique devrait limiter les quantités de pCD immobilisées. Nous avons donc
vérifié l’effet de rinçages à des forces ioniques décroissantes sur les paramètres QCM-D de
films construits dans les conditions standard de pH et de force ionique.
La Figure V-18 décrit l'effet d'un rinçage à 0,05 M NaCl. Hormis un faible gonflement
apparent du film se traduisant par une légère prise de masse et une légère augmentation de la
dissipation du film, le film semble très stable lors de ce traitement.
A B
Figure V-18 : Effet d’un rinçage à 0,05M NaCl sur la fréquence de résonance et le facteur de
dissipation d’un film PEI(CSA/PLL)5/pCD construit à pH 7,4 et 0,15 M NaCl.
197
La Figure V-19 rapporte le cas d'un rinçage à 0,01 M NaCl, réalisé sur un film chargé de
pCD. Le film est construit dans les conditions standard, c'est-à-dire en tampon Tris à pH 7,4
et 0,15 M NaCl. Le rinçage par le tampon à 0,01 M NaCl, juste après retour dans le tampon de
référence, provoque une perte de masse partielle ainsi qu’une rigidification, se traduisant
respectivement par une augmentation de la fréquence de résonance et une augmentation du
facteur de dissipation. Cependant, il n’est pas possible de conclure quant à un possible
dégonflement, accompagné d’une perte d’eau, ou à un relargage possible du vecteur pCD.
A B
Figure V-19 : Effet d’un rinçage à 0,01 M NaCl sur (A) les fréquences de résonance et (B) les
facteurs de dissipation d’un film PEI/(CSA/PLL)5/pCD.
Une optimisation des interactions électrostatiques entre les chaînes de CSA et de PLL à
l’intérieur du film, lorsque celui-ci se trouve appauvri en contre-ions, pourrait expliquer une
perte d’eau. Un relargage de pCD pourrait quant à lui s’expliquer par un renforcement des
interactions répulsives entre CSA et pCD, tous deux polyanioniques, en l’absence de contre-
ions. Une étude de ce phénomène par OWLS lors d’expériences ultérieures devra permettre
d’élucider ce comportement par le suivi de l’évolution de la masse sèche consécutive au
rinçage.
V.D Conclusion
Au cours de ces travaux, nous avons montré qu’il était envisageable d’incorporer au sein
des films LbL (CSA/PLL) un dérivé anionique de polymère de cyclodextrine pour
potentiellement :
(i) Réaliser le relargage de médicaments hydrophobes in situ.
(ii) Effectuer la séparation chirale de mélanges d'énantiomères par électrophorèse
capillaire.
198
Bien qu’il semble impossible de construire des films LbL basés sur l’alternance de pCD
anionique et de PLL cationique, il est envisageable de fonctionnaliser une matrice
préexistante de (CSA/PLL) à l’aide du vecteur dérivé de cyclodextrine. Son mécanisme
d’incorporation, pour ce type d’architecture, semble fondé sur la capacité du vecteur à diffuser
au sein du film et d’y interagir avec les différents composants de manière électrostatique et,
dans une moindre mesure, par l’établissement de liaisons hydrogènes. La comparaison des
résultats de QCM-D et de OWLS nous montre que l’incorporation du vecteur pCD
s’accompagne d’une forte augmentation du taux d’hydratation de la multicouche. Ce
gonflement vraisemblablement dû à l’eau liée à la pCD, ne semble cependant pas déstructurer
le film, ses caractéristiques morphologiques et topographiques étant globalement bien
conservées.
À l’heure actuelle, ce projet fait l’objet du stage de Romain Cavé, étudiant en Master 2
Recherche, qui vise à étudier l’incorporation de complexes pCD/composés bioactifs au sein
des films. Les travaux en cours concernent la caractérisation des complexes entre divers
médicaments hydrophobes et le vecteur, par spectroscopie UV-Visible et FTIR-ATR, ainsi
que l’élucidation de leur mécanisme d’incorporation du vecteur au sein des films LbL, par
FTIR-ATR et QCM-D. L’action des médicaments ainsi incorporés sur les préostéoblastes
MC3T3-E1 est également étudiée.
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201
Conclusion et Perspectives
Les films LbL sont des outils prometteurs pour la fonctionnalisation de matériaux à finalité
biomédicale. L’utilisation de polyélectrolytes d’origine biologique offre la possibilité de
construire des architectures biomimétiques, permettant de se rapprocher de la composition
biochimique des matrices extracellulaires. Cependant, il faut garder à l’esprit que de
nombreux signaux perçus par les cellules dans leur microenvironnement naturel sont aussi de
nature physique (topographique, mécanique). C’est la combinaison de ces signaux
multifactoriels (chimique, biochimique, physicochimique et mécanique) que nous avons voulu
appréhender dans ce travail.
La première partie de ce travail, présentée dans le Chapitre III, a concerné l’influence

combinée de la chimie externe contrôlée par des films (CSA/PLL)6±CSA, et de la rigidité du
substrat sous-jacent, sur les comportements de préostéoblastes murins MC3T3-E1, à court,
moyen et long terme. Ces substrats étaient composés de PDMS, un élastomère dont la rigidité
peut être modulée en faisant varier le ratio d’agent réticulant/polymère de base. Dans ces
conditions, nous avons obtenu 4 types de substrats, dont nous avons déterminé les propriétés
mécaniques, dans le cadre d’une collaboration avec le Dr Ingrid Masson (EAC CNRS 4396,
Université de Paris-Est Créteil Val de Marne). Les films LbL déposés à la surface des
substrats PDMS avaient pour architectures : PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)6/CSA, c'est-
à-dire qu’ils se terminaient par PLL ou CSA, respectivement. Les substrats de PDMS ainsi
fonctionnalisés ont été analysés en termes de chimie de surface (par FTIR-ATR et
microscopie à fluorescence) et de topographie (par AFM). Ces deux paramètres étant
similaires quelle que soit la rigidité du PDMS sous-jacent, les paramètres susceptibles
d’influencer les comportements cellulaires étaient donc la nature de la couche externe des
films LbL (PLL ou CSA) et/ou la rigidité sous-jacente, du fait de la faible épaisseur des films
LbL (~ 100 nm). À court terme, nous avons effectivement observé un effet promoteur d’une
couche externe de PLL sur l’adhésion et l’étalement cellulaire, indépendamment de la rigidité
du substrat PDMS. À moyen terme, nous avons noté un effet combiné des deux paramètres :
d'une part, les cellules ont mieux proliféré sur les substrats les plus rigides, et d'autre part,
pour une même rigidité, nous avons retrouvé un effet favorable pour une externe de PLL. À
plus long terme, les films terminés par PLL combinés à un substrat rigide ont montré
également un effet promoteur sur la différenciation des préostéoblastes. Ces résultats sont
202
prometteurs, car ils démontrent qu’en contrôlant la rigidité du substrat sous-jacent et la chimie
de surface, il est possible d’améliorer l’ostéoconductivité des biomatériaux.
Le deuxième aspect développé lors de cette thèse a concerné la réticulation des films LbL
(CSA/PLL) par voie chimique, grâce à un agent réticulant naturel, la génipine (GnP), de
manière à améliorer les propriétés mécaniques intrinsèques des films et ainsi à favoriser les
comportements cellulaires. En effet, de nombreux films LbL à base de biopolymères sont très
hydratés et donc défavorables à l’adhésion cellulaire, étape initiale cruciale dans les processus
qui conduisent à la colonisation du microenvironnement par les cellules. Actuellement, les
principaux réticulants chimiques des films LbL sont les carbodiimides (EDC/NHS) ou le
glutaraldéhyde. Cependant, ces deux agents réticulants sont potentiellement cytotoxiques s’ils
se trouvent libres et piégés dans les architectures LbL, d’où l’intérêt de trouver une
alternative. Nous avons utilisé la GnP pour réticuler des films LbL (CSA/PLL) de deux
épaisseurs différentes : PEI/(CSA/PLL)6 et PEI/(CSA/PLL)12. La première partie du travail a
consisté à étudier la réticulation et son effet sur les propriétés chimiques (FTIR-ATR),
physicochimiques et mécaniques (QCM-D et AFM) des films. Par ailleurs, la combinaison de
la spectroscopie FTIR-ATR et de la microscopie à épifluorescence nous a permis de mettre en
évidence un phénomène de FRET entre la GnP et la FITC couplée aux chaînes de CSA. Ce
résultat inattendu nous a confirmé que la réticulation intervenait sur toute l’épaisseur du film
et pas seulement dans les couches externes, en formant vraisemblablement un semi-RIP
constitué d’une matrice de PLL réticulée dans laquelle les chaînes de CSA sont libres de
diffuser. Nous avons également étudié les propriétés mécaniques des films réticulés, par
QCM-D et par nanoindentation AFM. Ces deux techniques ont montré que les modifications
des propriétés mécaniques ont été peu affectées par la réticulation. Néanmoins, nous avons
noté un effet très favorable et précoce des films réticulés sur les comportements cellulaires,
dès les 3 premières heures de culture. Il est donc vraisemblable que les cellules ressentent,
non seulement une faible variation du module d'élasticité (quelques dizaines de kPa mesurées
en AFM), mais aussi une modification de la déformabilité des films du fait de la formation
d’un réseau de PLL, sous l’effet des forces de traction accompagnant leur étalement. Les
analyses concernant les comportements cellulaires à plus long terme (prolifération et
différenciation) ont montré un effet ostéoconducteur des films (CSA/PLL) réticulés,
contrairement aux films natifs.
203
Le Chapitre V a été consacré à l’étude de l’incorporation d’un polymère de β-cyclodextrine
anionique (pCD), dans les films LbL (CSA/PLL). Le but de cette étude était de démontrer la
possibilité d’enrichir les films avec des composés bioactifs hydrophobes sous forme de
complexes avec ce vecteur. La première partie a consisté à comprendre et à définir les
conditions optimales d’immobilisation du pCD, en termes d’architecture de la multicouche, de
structure du pCD et de sa concentration. Les résultats des analyses effectuées en QCM-D,
OWLS et AFM ont suggéré que l’incorporation de la β-cyclodextrine au sein de l’architecture
LbL provoque un gonflement homogène du film. Les architectures obtenues sont stables,
l’immobilisation du vecteur étant irréversible. Dans le cadre d’une collaboration avec le Dr C.
Morin du laboratoire COBRA – UMR 6014, nous avons également étudié la stabilité des
films LbL fonctionnalisés par le pCD, en vue d’une éventuelle utilisation comme phase
stationnaire en électrophorèse capillaire. En effet, les cyclodextrines peuvent être utilisées
pour la séparation d’énantiomères, du fait de leur sélectivité chirale. Cette technique implique
l’utilisation de conditions de pH et de force ionique très diverses. Nous avons montré que nos
films étaient résistants, dans une certaine mesure, aux variations de ces deux paramètres.
Néanmoins, l’analyse structurale des films devra être approfondie, et leur potentiel comme
séparateur chiral en électrophorèse capillaire devra être confirmé expérimentalement.
Les perspectives de ce travail concernent d’une part l’influence des propriétés mécaniques
des substrats sur les comportements cellulaires. Il serait intéressant de fonctionnaliser les
substrats de PDMS avec les films (CSA/PLL) réticulés par la GnP. Les cellules étant capables
de ressentir et de répondre (i) aux rigidités des substrats sous-jacents et (ii) aux propriétés
mécaniques intrinsèques des films LbL, l’influence combinée de ces deux paramètres pourrait
constituer un axe d’approfondissement. Cette approche pourrait également être appliquée à
d’autres systèmes LbL biomimétiques de manière à optimiser la spécificité vis-à-vis des
cellules. D’autre part, un stage de Master 2 Recherche est actuellement au cours au laboratoire
(Romain Cavé), concernant la vectorisation et le relargage de principes actifs à destination des
cellules, sur la base des travaux présentés dans le Chapitre V. Ce projet a pour but la mise au
point de l’immobilisation de molécules bioactives hydrophobes dans les architectures LbL,
via le dérivé de β-cyclodextrine, afin de promouvoir l’ostéoconductivité des films LbL. Des
tests sur l’influence de ces médicaments sur les comportements cellulaires sont en cours.
Cette méthode de bioactivation de systèmes LbL par un composé d’intérêt pourrait par la suite
être appliquée à des substrats présentant des propriétés mécaniques optimales, en combinant
les propriétés mécaniques sous-jacentes et/ou intrinsèques au film LbL. Par ailleurs, il est
204
envisageable d’immobiliser au sein de ces films des molécules hydrophiles de type facteurs de
croissance (BMP2, FGF2,…) susceptibles d’améliorer les processus cellulaires à leur contact.
Dans ses travaux de thèse au laboratoire, Khalil Abdelkebir a étudié la nucléation
hétérogène de phosphate de calcium (CaP) à la surface des films LbL (CSA/PLL), conduisant
au dépôt d’une couche de CaP à la surface des films. Une telle couche pourrait faire office de
barrière aux molécules actives vectorisées par les films fonctionnalisés par le pCD, dans le but
de contrôler leur relargage in situ, lors de la dégradation de la couche de CaP par des
ostéoclastes.
205
Liste des communications
Articles publiés
 Gaudière F, Masson I, Morin-Grognet S, Thoumire O, Vannier J-P, Atmani H, Ladam G,
Labat B, “Mechano-Chemical Control of Cell Behavior by Elastomer Templates Coated with
Biomimetic Layer-by-Layer Nanofilms”, Soft Matter 2012;8;8327-8337
 Abdelkebir K, Morin-Grognet S, Gaudière F, Coquerel G, Labat B, Atmani H, Ladam G,
“Biomimetic Layer-by-Layer Templates for Calcium Phosphate Biomineralization”, Acta
Biomaterialia 2012;8;3419-3428
 Abdelkebir K, Gaudière F, Morin-Grognet S, Coquerel G, Atmani H, Labat B, Ladam G,
“Protein-Triggered Instant Disassembly of Biomimetic Layer-by-Layer Films”, Langmuir
2011;27;14370-14379
 Abdelkebir K, Gaudière F, Morin-Grognet S, Coquerel G, Labat B, Atmani H, Ladam G,
“Evidence of Different Growth Regimes Coexisting within Biomimetic Layer-by-Layer
Films”, Soft Matter 2011;7;9197-9205
 Hindié M, Degat M-C, Gaudière F, Gallet O, Van Tassel P R and Pauthe E. “Pre-osteoblasts
on Poly(L-lactic acid) and Silicon Oxide: Influence of Fibronectin and Albumin Adsorption”,
Acta Biomaterialia 2011;7;387-394
Conférence invitée
 Gaudière F, “Biomimetic LbL Coatings Osteoconductivity: Combined Effects of Surface
Chemistry and Substrate Stiffness”, Cycle Thématique Biomatériaux pour la Santé, January,
2012, Cergy-Pontoise, France
Présentations orales
 Gaudière F, Morin-Grognet S, Vannier J-P, Atmani H, Ladam G, Labat B, “Enhanced
osteoconductivity of genipin-crosslinked Layer-by-Layer films”, THERMEC’2013,
International Conference on Processing & Manufacturing of Advanced Materials, December,
2013, Las Vegas, USA
 Labat B, Morin-Grognet S, Gaudière F, Bertolini-Forno L, Vannier J-P, Ladam G, Atmani H
“Osteoconductivity of crosslinked biomimetic LbL films atop nano/microstructured Ti-6Al-
4V”, ISSIB 2013 4th International Symposium, September, 2013, Rome, Italy
 Ladam G, Abdelkebir K, Gaudière F, Labat B, Morin-Grognet S, Atmani H “Bio-inspired
Polyelectrolyte Multilayers as Templates for the Deposition of Thin Calcium Phosphate
Coatings”, TMS 2013 142nd Annual Meeting & Exhibition, March, 2013, San Antonio, USA
206
 Abdelkebir K, Gaudière F, Labat B, Morin-Grognet S, Atmani H, Ladam G “Bio-inspired
Polyelectrolyte Multilayers: Buildup Mechanism and Influence on Calcium Phosphate
Biomineralization”, E-MRS 2012 Fall Meeting, 2012, September, Warsaw University of
Technology, Pologne
 Gaudière F, Morin-Grognet S, Atmani H, Labat B, Ladam G. “Cross-Linking of Biomimetic
films for Biomaterials Coating ”, 2012 Ph.D. Students Day, SPMII Doctoral School, June,
2012, Saint Etienne du Rouvray, France
 Gaudière F, Martinez LA, Masson I, Morin-Grognet S, Coquerel G, Perez E, Atmani H,
Ladam G, Labat B. “Combinatory Effects of Biomimetic Coatings and Substrates Stiffness on
Osteoblast Response” , European Society of Biomaterials, 24th European Conference on
Biomaterials, September, 2011, Dublin, Ireland
 Morin Grognet S, Gaudière F, Bertolini-Forno L, Thoumire O, Coquerel G, Atmani H,
Ladam G, Labat B. “Cytocompatibility of a Microstructured and Biofunctionalized Titanium
Alloy (Ti-6Al-4V)”, Société Française de Physique, Congrès Général de la SFP, July, 2011,
Bordeaux, France
 Gaudière F, Masson I, Morin-Grognet S, Thoumire O, Atmani H, Ladam G, Labat B.
“Combinatory Effects of Biomimetic Coatings and Substrates Stiffness on MC3T3-E1
Preosteoblasts Response”, 2011 Ph.D. Students Day, SPMII Doctoral School, April, 2011,
Saint Etienne du Rouvray, France
 Pédéhontaa-Hiaa G, Gaudière F, Labat B, Ladam G, Morin C, Le Derf F. “Conception et
Caractérisation de Phases Stationnaires Chirales à Base de Multicouches de Polyélectrolytes
pour l’Electrochromatographie Capillaire”, 9ème Congrès Francophone de l’AfSep, March,
2011, Toulouse, France
 Gaudière F, Abdelkebir K, Senger B, Coquerel G, Atmani H, Labat B, Ladam G.
“Discussion sur la Complémentarité des Techniques OWLS, QCM-D et FTIR-ATR pour la
Caractérisation de Films « Layer-by-Layer » Biomimétiques”, Société Française de Physique,
12èmes Journées de la Matière Condensée, August, 2010, Troyes, France
 Gaudière F, Degat M-C, Hindié M, Gallet O, Van Tassel PR, Pauthe E. “Osteoblast-
Biomaterial Interactions : Influence of Adsorbed Protein”, American Chemistry Society, ACS
– Spring 2010 National Meeting & Exposition, March, 2010, San Francisco, USA
 Hindié M, Gaudière F, Degat M-C, Gallet O, Van Tassel P, Pauthe E. “Osteoblast Adhesion
and Activity On Biomaterial Surfaces: Influence of Adsorbed Protein”, American Institute of
Chemical Engineers, AIChE 2009 annual meeting, November, 2009, Nashville, USA
207
Posters
 Morin-Grognet S, Labat B, Gaudière F, Bertolini Forno L, Vannier J-P, Ladam G, Atmani
Hassan. “Ostéoconductivité de films LbL biomimétiques réticulés à la surface d’alliages Ti-
6Al-4V nano/microstructurés”, Société Française de Physique, Congrès Général de la SFP,
July, 2013, Marseille, France
 Gaudière F, Masson I, Moring-Grognet S, Thoumire O, Atmani H, Ladam G, Labat B.
“Osteoconductivity of Biomimetic LbL Thin Films Atop a Bone Mechanomimetic Substrate”,
Biointerface, 22nd Annual Biointerface Conference 2012, October, 2012, Dublin, Ireland
 Gaudière F, Masson I, Morin-Grognet S, Atmani H, Ladam G, Labat B. “Substrate Stiffness
and Biomimetic Nano-coatings: a Promising Combination for Bone Biomaterials”, Colloids
and Nanomedicine 2012, July, 2012, Amsterdam, The Netherlands
 Abdelkebir K, Gaudière F, Labat B, Morin-Grognet S, Atmani H, Ladam G. “Bio-Inspired
Polyelectrolyte Multilayers: Buildup Mechanism and Influence on Calcium Phosphate
Biomineralization”, Colloids and Nanomedicine 2012, July, 2012, Amsterdam, The
Netherlands
 Morin-Grognet S, Gaudiere F, Bertolini-Forno L, Thoumire O, Atmani H, Ladam G,. Labat
B. “LbL Coatings on Microstructured Titanium Alloy Ti-6Al-4V: Osteoblast Response”,
Symposium International, Interface Biology of Implants, May, 2012, Rostock, Germany
 Gaudière F, Masson I, Morin-Grognet S, Coquerel G, Atmani H, Ladam G, Labat B. “Effets
Combinatoires de Revêtements Biomimétiques et de la Rigidité du Substrat sur le
Comportement de Préostéoblastes MC3T3-E1”, Société Française de Physique, Congrès
Général de la SFP, July, 2011, Bordeaux, France
 Hindié M, Gaudière F, Degat M-C, Gallet O, Van Tassel P, Pauthe E. “Influence of
Fibronectin and Albumin-Competitively Adsorbed on Base Material and/or Present in Cell
Culture Media- onto Osteoblastic Cell Behaviour”, Symposium International, Interface
Biology of Implants, May 2009, Rostock, Germany
Prix scientifique
 Meilleure présentation orale à la Journée des Doctorants 2012, École Doctorale SPMII,
Physique et Science des Matériaux
208
Résumé. Ce travail s'inscrit dans le contexte de la fonctionnalisation de surfaces par la méthode "Layer-by-
Layer" (LbL). Plus spécifiquement, il porte sur l'optimisation des surfaces de biomatériaux orthopédiques ou
dentaires en proposant des revêtements biomimétiques pour le contrôle du microenvironnement cellulaire
favorisant l'ostéointégration. Notre choix s'est porté sur des films LbL biomimétiques composés de chondroïtine
sulfate A (CSA) et de poly( L-lysine).
Nos travaux s’organisent selon trois axes. Dans un premier temps, nous décrivons l’influence de la rigidité de
substrats élastomères modèles de PDMS et de la chimie de surface, contrôlée par les films LbL, sur les
comportements de préostéoblastes murins MC3T3-E1, à court, moyen et long terme. Après avoir étudié les
propriétés mécaniques du substrat sous-jacent et caractérisé les propriétés physico-chimiques des films LbL au
moyen de techniques d’analyses complémentaires (microscopie à épifluorescence, FTIR-ATR, AFM, QCM-D),
nous démontrons une influence combinée de ces paramètres sur les principaux processus cellulaires (adhésion,
prolifération et différenciation).
Par la suite, nous décrivons la réticulation de ces films par un agent réticulant naturel, la génipine. Après avoir
étudié le mécanisme de réticulation de nos films par cet agent réticulant et son impact sur les propriétés
physicochimiques et mécaniques des films, nous mettons en évidence leurs propriétés ostéoconductives.
Enfin, nous explorons l’incorporation d’un polymère de β-cyclodextrine au sein de l’architecture LbL, en vue de
réaliser la vectorisation et le relargage de composés bioactifs à destination des cellules.
Mots clés : films LbL ; substrats élastomères ; réticulation ; génipine ; cyclodextrine ; relargage moléculaire ;
ostéoblastes ; ostéoconductivité
Adresse : EA3829 MERCI, La2B, Centre Universitaire d’Évreux, 1 rue du 7 ème Chasseurs BP281 27002 Évreux
Cedex.
Abstract. This work deals with surface functionalization by the “Layer-by-Layer” (LbL) method. It focuses on
the surface optimization of orthopedic and dental biomaterials by proposing biomimetic coatings to control the
cellular microenvironment with the aim of promoting osseointegration. We chose biomimetic LbL films
composed of chondroitin sulfate A (CSA) and poly( L-lysine).
Our works follow three axes. First, we describe the influence of the rigidity of elastomeric model substrates
composed of PDMS, and the surface chemistry, controlled by LbL films, on the short-, mid- and long-term
behaviour of murine preosteoblast-like cells MC3T3-E1. After describing the mechanical properties of the
underlying substrate and characterizing the physico-chemical properties of LbL films using complementary
techniques (epifluorescence microscopy, FTIR-ATR, AFM, QCM-D), we demonstrate a combined influence of
these parameters on the major cellular processes (adhesion, proliferation and differentiation).
Thereafter, we describe the cross-linking process of these films by genipin, a natural cross-linker. After
analyzing the cross-linking mechanism and its influence on the physico-chemical and mechanical properties of
our LbL films, we highlight their osteoconductive properties.
Finally, we explore the incorporation of a β-cyclodextrin polymer within the LbL architecture, with the purpose
of bioactive compounds vectorization and subsequent release to cells.
Key words: LbL films; elastomeric substrates; crosslinking; genipin; cyclodextrin; molecular release;
osteoblasts; osteoconductivity
Address: EA3829 MERCI, La2B, Centre Universitaire d’Évreux, 1 rue du 7ème Chasseurs BP281 27002
Évreux Cedex.
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Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux : Modulation

Thesis · June 2013

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE ROUEN

Discipline : Chimie des matériaux

Développement de revêtements bioactifs pour les biomatériaux:

par Fabien GAUDIÈRE

Directeur de thèse M. Hassan ATMANI

Rapporteurs externes Mme Joëlle AMÉDÉE

Examinateurs externes M. Emmanuel PETIT

Examinateurs internes M. Jean-Pierre VANNIER

Au Pr Joëlle Amédée et au Pr Csilla Gergely, pour avoir accepté de juger ce travail et de

Au Dr Emmanuel Petit et au Pr Emmanuel Pauthe pour avoir accepté de participer à mon

Je tiens à remercier le Pr Jean-Pierre Vannier, directeur de l’EA3829 MERCI de m’avoir

Je remercie le Pr Hassan Atmani pour la confiance qu’il m’a accordée en m’acceptant au

Je remercie le Conseil Général de l’Eure et le Grand Évreux Agglomération pour leur

À tous les membres du La2B/SMS du Centre Universitaire d’Evreux : Dr Valérie Dupray, Dr

Je remercie également l’ensemble du personnel administratif et technique du Centre

Index des illustrations et tableaux 11

Chapitre I - Etude Bibliographique 20

I.A Les biomatériaux 21

I.B Les films « Layer-by-Layer » (LbL) 23

I.C Le tissu osseux 43

I.D Interactions cellules-matériaux 49

Chapitre II - Matériels et Méthodes 66

II.A Préparation des substrats 67

II.B Analyse et Caractérisation des Substrats 73

II.D Etude des comportements cellulaires 96

II.E Références bibliographiques 100

Chapitre III - Effets combinés de la chimie de surface et de la rigidité du substrat sur le

III.A Introduction 102

III.B Analyse des substrats 105

III.C Etude des comportements cellulaires 116

III.D Conclusion 127

III.E Références bibliographiques 127

Chapitre IV - Influence de la réticulation des films CSA/PLL par la génipine sur le

IV.A Introduction 133

IV.C Étude des comportements cellulaires 155

IV.D Conclusion 171

IV.E Références bibliographiques 173

Chapitre V - Incorporation d’un dérivé de cyclodextrine au sein de films (CSA/PLL) en

V.A Introduction 178

V.B Construction des films et incorporation du vecteur pCD 179

V.C Influence du pH et de la force ionique 192

V.E Références bibliographiques 199

Conclusion et Perspectives 202

Liste des communications 206

BMP Protéine morphogénique osseuse (« Bone Morphogenic Protein »)

FITC Fluorescéine isothiocyanate

AFM Microscopie à force atomique (« Atomic Force Microscopy »)

Figure I-2 : Principe de la technique LbL 25

Figure I-6 : Évolution de l’épaisseur de films (HA/PLL) 29

Figure I-13 : Représentation schématique des différentes cellules osseuses 46

Figure I-14 : Cycle du remodelage osseux 47

Figure I-15 : Propriétés mécaniques des différents tissus humains 52

Figure II-1 : Le polyéthylèneimine, PEI 68

Figure II-2 : La poly(L-lysine), PLL 69

Figure II-3 : La chondroïtine sulfate A, CSA 69

Figure II-4 : Prépolymère du polydiméthylsiloxane, PDMS 70

Figure II-5 : Modes de vibrations des molécules 73

Figure II-6 : Principe d’un cristal ATR multiréflexion 74