2020 Lyon 063

VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2020 - Thèse n° 063
MISE AU POINT DE LA MÉTHODE D’EXTRACTION DE

L’ADN BACTÉRIEN DE BIOPSIES CUTANÉES CANINES
FIXÉES PAR LE FORMOL PUIS INCLUSES EN PARAFFINE
POUR IDENTIFICATION PAR qPCR
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 29 Octobre 2020
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
PILLON Marielle
Née le 1er mai 1994
à Lyon 8e (69)
VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2020 - Thèse n° 063
MISE AU POINT DE LA MÉTHODE D’EXTRACTION DE

L’ADN BACTÉRIEN DE BIOPSIES CUTANÉES CANINES
FIXÉES PAR LE FORMOL PUIS INCLUSES EN PARAFFINE
POUR IDENTIFICATION PAR qPCR
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 29 octobre 2020
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
PILLON Marielle
Née le 1er mai 1994
à Lyon 8e (69)
1
2
Liste des Enseignants du Campus Vétérinaire de Lyon (01-09-2019)
ABITBOL Marie DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur

ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
ARCANGIOLI Marie-Anne DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
AYRAL Florenc e DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
BECKER Claire DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
BELLUCO Sara DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
BENAMOU-SMITH Agnès DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
BENOIT Etienne DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
BERNY Philippe DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
BONNET-GARIN Jeanne-Marie DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
BOULOCHER Caroline DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
BOURDOISEAU Gilles DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
BOURGOIN Gilles DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
BRUYERE Pierre DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
BUFF Samuel DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
BURONFOSSE Thierry DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
CACHON Thibaut DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
CADORÉ Jean-Luc DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
CAROZZO Claude DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
CHABANNE Luc DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
CHALVET-MONFRAY Karine DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
DE BOYER DES ROCHES Alic e DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
DJELOUADJI Zorée DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
ESCRIOU Catherine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
FRIKHA Mohamed-Ridha DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
GALIA Wessam DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
GILOT-FROMONT Emmanuelle DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
GONTHIER Alain DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
GRANCHER Denis DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
GREZEL Delphine DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
HUGONNARD Marine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
JANKOWIAK Bernard DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
JOSSON-SCHRAMME Anne DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
JUNOT Stéphane DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
KODJO Angeli DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
KRAFFT Emilie DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
LAABERKI Maria-Halima DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
LAMBERT Véronique DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
LE GRAND Dominique DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
LEBLOND Agnès DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
LEDOUX Dorothée DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
LEFEBVRE Sébastien DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
LEFRANC-POHL Anne-Céc ile DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
LEGROS Vinc ent DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
LEPAGE Olivier DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
LOUZIER Vanessa DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
MARCHAL Thierry DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
MOISSONNIER Pierre DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
MOUNIER Luc DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
PEPIN Mic hel DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
PIN Didier DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
PONCE Frédérique DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
PORTIER Karine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
POUZOT-NEVORET Céline DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
PROUILLAC Caroline DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
REMY Denise DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
RENE MARTELLET Magalie DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de c onférenc es
ROGER Thierry DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur
SABATIER Philippe DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
SAWAYA Serge DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
SCHRAMME Mic hael DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
SERGENTET Delphine DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
THIEBAULT Jean-Jac ques DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de c onférenc es
THOMAS-CANCIAN Aurélie DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
TORTEREAU Antonin DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
VIGUIER Eric DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur
VIRIEUX-WATRELOT Dorothée DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de c onférenc es
ZENNER Lionel DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
3
4
REMERCIEMENTS
À Monsieur le Professeur Jean-François NICOLAS,
De la faculté de médecine de Lyon,

Qui nous a fait l’honneur d’avoir accepté la présidence de ce jury de thèse,
Hommages respectueux.
À Monsieur le Professeur Didier PIN
De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

Qui nous a fait l’honneur de soutenir, d’encadrer et de corriger ce travail,
Pour votre disponibilité et votre gentillesse hors normes,
Sincères remerciements.
À Madame la Docteure Zorée DJELOUADJI

Qui nous a fait l’honneur de participer à ce jury de thèse,
Sincères remerciements.
À Madame Nadège MILHAU

Pour avoir été présente tout au long de ce travail,
Pour son aide, son soutien et sa sympathie,
Sincères remerciements
5
6
A mes parents
Pour avoir cru en moi depuis le début et m’avoir permis de réussir. Pour votre soutient au
quotidien et pour tout cet amour qui nous lie. Pour vos petites attentions qui me mettent du
baume au cœur quand j’en ai besoin,
Merci.
A mon Bambin
Pour m’avoir accompagné à mon premier jour d’école et ton soutien tout le long de ce long
parcours scolaire jusqu’à la thèse. Pour avoir été mon modèle et mon protecteur,
Merci.
A Louis
Pour tout ton soutient le long de la rédaction de ce manuscrit et au quotidien. Pour notre amour
et à ce qui nous attends dans le futur.
Merci.
A Papy et Odette,
Pour n’avoir jamais douté de moi et votre bienveillance depuis toutes ces années. Il n’est pas si
loin le temps de l’étude de l’anatomie du têtard à Boisset ! A votre amour inconditionnel,
Merci.
A Mamie,
J’aurai tellement aimé que tu sois là pour l’accomplissement de mon rêve. Je sais que tu es fière
de moi de là-haut. Pour avoir été la meilleure des mamies,
Merci.
A Flora, Amélie, Godefroy et Océane

Pour ces 5 années à apprendre ensemble en TD puis en clinique mais surtout pour tous ces
moments de rigolades, de soutient et de folies en boum. Ils resteront tous inoubliables !
Merci.
A Candice,
Pour m’avoir fait vivre une formidable dernière année d’école et pour avoir trouvé une véritable
amie en toi. Pour tous nos futurs partages de cas, conseils avisés et soutient dans les moments
difficiles de notre métier,
Merci.
A ma lignée,
Pour votre accueil quand j’ai posé mes valises à Marcy. A Clairette et Flavie dont je n’aurai pas
pu rêver mieux et à nos futurs repas ensemble,
Merci.
Aux Dr Julien Edet, Vincent Risse, Sandrine Cayet et… Sophie !

Pour m’avoir accueilli en stage en tant que tout bébé véto et pour m’avoir enseigné tant de
choses pendant tous mes stages dans vos cliniques,
Merci.
A Babouche et Chip, mes petits couics.
A Milka, Flocon, Rio, Actros, Chipie et Kim.
7
8
TABLE DES MATIERES
TABLE DES ANNEXES ..................................................................................................... 13
TABLE DES FIGURES ....................................................................................................... 15
TABLE DES TABLEAUX................................................................................................... 17
LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................. 19
INTRODUCTION ................................................................................................................ 21
PARTIE 1 – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................ 23
I. La biologie moléculaire : de sa naissance dans les années 50 à sa place essentielle en

médecine de nos jours. .................................................................................................... 25
A. Un peu d’histoire .................................................................................................... 25
1. La naissance de la biologie moléculaire ...................................................................... 25
2. La mise au point d’une technique révolutionnaire : la PCR ......................................... 27
3. Les techniques de la biologie moléculaire modernes .................................................. 31
B. L’évolution des techniques d’extraction d’ADN ..................................................... 33
1. La première extraction d’ADN .................................................................................... 33
2. Les extractions en phase liquide ................................................................................. 33
3. Les extractions en phase solide .................................................................................. 34
a. Méthode d'extraction d'ADN basée sur une colonne de silice................................. 35
b. Extraction d'ADN à l'aide d'anion échange de résines ............................................. 35
c. Méthodes d'extraction d'ADN utilisant des billes magnétiques............................... 35
4. La robotisation des techniques d’extraction ............................................................... 36
C. Applications de la biologie moderne en médecine humaine et vétérinaire ............... 37
1. Diagnostic des maladies infectieuses.......................................................................... 37
2. Diagnostic des cancers et médecine personnalisée .................................................... 39
3. Dépistage de maladies génétiques ............................................................................. 40
II. La conservation des prélèvements ............................................................................. 41
A. La conservation par le froid ou cryoconservation .................................................... 41
1. Le principe de la cryoconservation ............................................................................. 41
2. Les cryoprotecteurs et leur toxicité ............................................................................ 43
3. Les limites de la cryoconservation .............................................................................. 44
9
B. La conservation par les fixateurs chimiques ............................................................ 45
1. Quelques exemples de fixateurs de leurs caractéristiques .......................................... 45
2. Les facteurs influençant la fixation ............................................................................. 47
3. Le formol ou formaldéhyde, le fixateur le plus utilisé ................................................. 48
C. Le formol et l’ADN, une association compliquée ................................................... 49
III. Les techniques d’extraction d’ADN à partir d’échantillons biologiques fixés par le
formol puis inclus en paraffine ....................................................................................... 51
A. Les techniques de déparaffinage ............................................................................. 52
1. Le déparaffinage au Xylène – Ethanol......................................................................... 52
2. Le déparaffinage avec divers solvants ........................................................................ 53
3. Le déparaffinage à l’huile minérale ............................................................................ 53
4. Le « déparaffinage » par chauffage ............................................................................ 54
A. La lyse des tissus .................................................................................................... 55
1. Les pré-traitements de lyse ........................................................................................ 55
2. Les solvants de lyse tissulaire ..................................................................................... 55
a. Les tampons à base de tris ..................................................................................... 55
b. Les détergents ....................................................................................................... 56
c. Les alternatives aux tampons et détergents ........................................................... 56
3. Une étape fondamentale : l’incubation avec la Protéinase K ...................................... 56
a. L’influence de la température d’incubation ............................................................ 57
b. L’influence de la durée d’incubation ....................................................................... 58
B. La purification de l’ADN........................................................................................ 59
1. L’extraction au phénol-chloroforme, la technique de référence ................................. 59
2. L’utilisation de colonnes de silice ............................................................................... 60
C. Le dosage et l’évaluation de la qualité de l’ADN extrait ......................................... 62
1. Le dosage en spectrophotométrie .............................................................................. 62
2. L’évaluation du degré de fragmentation de l’ADN : le bio-analyseur........................... 63
PARTIE 2 – ETUDE EXPERIMENTALE ...........................................................................65
I. Introduction et objectifs de l’étude ......................................................................... 67

II. Matériel et méthode.............................................................................................. 68
A. Choix des paramètres de l’étude ............................................................................. 68
1. Choix des échantillons FFPE ........................................................................................... 68
2. Choix des protocoles et des conditions d’extraction ....................................................... 70
3. Choix des méthodes d’analyse de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait ........... 72
a. Spectrophotométrie ............................................................................................... 72
10
b. Migration sur gel d’agarose .................................................................................... 73
c. Réalisation de qPCR ............................................................................................... 73
B. Protocoles expérimentaux de l’étude ......................................................................74
1. Préparation des échantillons à partir des blocs .............................................................. 74
2. Identification des tubes ................................................................................................. 74
3. Protocoles d’extraction .................................................................................................. 75
a. Protocole PROMEGA ReliaPrep FFPE DNA .............................................................. 75
b. Protocole QIAamps DNA FFPE Tissues (QIAGEN) .................................................... 75
c. Protocole MACHEREY NAGEL, Nucleospin DNA isolation from FFPE samples .......... 75
d. Protocole EPICENTRE, MasterPure Complete DNA and RNA purification kit............ 75
e. Protocole PHENOL CHLOROFORME ........................................................................ 76
f. Traitement et stockage des échantillons d’ADN après extraction ........................... 76
4. Dosage des échantillons au BioDrop........................................................................... 76
5. Protocole de migration sur gel d’agarose par électrophorèse ..................................... 76
6. Réalisation des PCR en temps réel ou qPCR ................................................................ 77
C. Analyses des résultats ............................................................................................. 78
1. Analyse des données chiffrées ....................................................................................... 78
2. Analyse des données non chiffrées ................................................................................ 78
III. Résultats................................................................................................................ 79
A. Analyse des quantités d’ADN extraits .................................................................... 79
1. Comparaison des résultats entre les différents protocoles ............................................. 79
2. Influence du temps de lyse ............................................................................................ 80
3. Influence de la technique de déparaffinage................................................................ 81
B. Analyse de la qualité des ADN extraits ................................................................... 82
1. Analyse des ratios A260/A280 et A260/A230 ................................................................. 82
2. Analyse de la fragmentation de l’ADN ............................................................................ 83
C. Résultats de l’amplification des gènes canins par qPCR ..........................................85
1. Détermination de la quantité d’ADN optimale pour la réalisation des qPCR ................... 85
2. Analyse du gène GAPDH ................................................................................................ 87
a. Analyse en fonction du temps de lyse .................................................................... 87
b. Analyse en fonction du kit d’extraction .................................................................. 88
c. Analyse des CTs...................................................................................................... 89
3. Analyse du gène HPRT ................................................................................................... 90
a. Analyse en fonction du temps de lyse .................................................................... 90
b. Analyse en fonction du kit d’extraction .................................................................. 91
c. Analyse des CTs...................................................................................................... 92
11
4. Analyse par échantillon .............................................................................................. 93
5. Comparaison des résultats entre Qiagen et Qiagen bis ............................................... 94
D. Résultats de l’amplification de l’ADN bactérien par qPCR ..................................... 94
IV. Discussion ............................................................................................................. 96
A. Choix du matériel et des paramètres de l’étude ....................................................... 97
B. Analyses des rendements en ADN obtenus selon les protocoles d’extraction ..........98
C. Analyse de la qualité des ADN obtenus .................................................................. 99
D. Analyse de l’amplification des gènes de ménages HPRT et GAPDH .................... 100
E. Influence de la méthode de déparaffinage ............................................................. 101
F. Influence du temps de lyse des échantillons avant extraction ................................ 101
G. Détection des bactéries dans nos prélèvements ..................................................... 102
CONCLUSION .................................................................................................................. 105
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................. 107
ANNEXES ......................................................................................................................... 113
12
TABLE DES ANNEXES
Annexe 1 : Tableau comparatifs des résultats d’extraction dans la littérature, triés selon la
méthode de déparaffinage ................................................................................................... 113
Annexe 2 : Protocole détaillé PROMEGA, ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System ......... 116
Annexe 3 : Protocole détaillé QIAGEN, QIAamps DNA FFPE Tissue ............................... 118
Annexe 4 : Protocole détaillé QIAGEN BIS, QIAamps DNA FFPE Tissue ........................ 120
Annexe 5 : Protocole détaillé MACHEREY NAGEL, NucléoSpin DNA isolation FFPE

sample ................................................................................................................................ 122
Annexe 6 : Protocole détaillé EPICENTRE, MasterPure complete DNA and RNA

purification kit .................................................................................................................... 124
Annexe 7 : Protocole détaillé PHENOL CHLOROFORME ................................................ 126
Annexe 8 : Résultats BRUTS des dosages et des ratios obtenus avec le BioDrop ................ 128
13
14
TABLE DES FIGURES
Figure 1: Hybridation des amorces de la PCR sur le fragment d'ADN cible .......................... 27
Figure 2 : Schéma détaillant deux cycles d'une PCR conventionnelle .................................... 28
Figure 3 : La cinétique de la PCR Conventionnelle ............................................................... 28
Figure 4 : Tracé de PCR en temps réel .................................................................................. 29
Figure 5 : Gamme étalon de la qPCR (A) et Equation de régression linéaire sur échelle
logarithimique déduite de la gamme (B) ............................................................................... 30
Figure 6 : Principe de la chromatographie par adsorption ..................................................... 34
Figure 7 : Robots pour l'extraction d'acides nucléiques automatisés ......................................36
Figure 8 : La cellule et le choc du froid lors de la congélation pour cryoconservation ...........42
Figure 9 : La formation de liaisons covalentes au sein de la molécule d'ADN (A) et entre
l'ADN et les protéines (B) par le formaldéhyde ..................................................................... 49
Figure 10 : Effet de la fixation au formol sur la molécule d'ADN ..........................................50
Figure 11 : Les 3 grandes étapes du protocole d'extraction avec diverses variations ............. 51
Figure 12 : Différents protocoles de déparaffinage au Xylène-Ethanol .................................. 52
Figure 13 : Le protocole d'emploi de l'huile minérale selon la littérature ............................... 54
Figure 14 : Action de la Protéinase K sur l’ADN .................................................................. 56
Figure 15: L'extraction au Phénol Chloroforme (1987) ......................................................... 59
Figure 16 : Extraction d'acides nucléiques sur support solide ................................................ 60
Figure 17 : Le spectre d'absorption d'une solution pure d'ADN ............................................. 62
Figure 18 : Profil de l'échelle de taille ADN par un bio analyseur et son gel correspondant ... 63
Figure 19 : Blocs FFPE de biopsies cutanées canines choisis pour l’étude ............................ 69
Figure 20 : Observation d'une coupe de biopsie d’un furoncle et de son infiltrat
inflammatoire coloré en HE (x 1000) , bloc 4 ....................................................................... 69
Figure 21 : Blocs de biopsies cutanées canines « saines » choisis pour l’étude ...................... 70
Figure 22 : Spectrophotomètre BioDrop ............................................................................... 72
Figure 23 : Cuve d’électrophorèse permettant la migration des échantillons d’ADN sur gel
d’agarose. ............................................................................................................................. 73
Figure 24 : Comparaison des concentrations d’ADN obtenues avec les différents kits
d’extraction (temps de lyse overnight). Les ronds correspondent aux blocs infectés et les
triangles aux blocs témoins ................................................................................................... 79
- Figure 25 : Comparaison des extractions d’ADN (pool des blocs 2,3,5) entre les
différents temps de lyse testés (2h, Overnight ou 48h). ......................................................... 80
Figure 26 : Comparaison des quantités d’ADN entre les protocoles Qiagen et Qiagen bis ..... 81
Figure 27: Moyenne des ratios A260/A280 et A260/A230, indicateurs des contaminations
en protéines et solvants suite à l’extraction d’ADN pour les différents protocoles ................. 82
Figure 28 : Représentation des courbes de spectrophotométrie des échantillons 1E*, 2PC et
4M*...................................................................................................................................... 83
Figure 29: Gels d'agarose 1,2% réalisés à partir d'échantillons obtenus avec les différents
protocoles testés (M : Marqueur de taille) ............................................................................. 83
Figure 30 : Exemple de résultats obtenus pour la gamme de dilution pour l’échantillon 4P ... 85
Figure 31: Courbes de dissociation obtenues lors de la validation des primers GAPDH et
HPRT ................................................................................................................................... 86
Figure 32 :Profils d’amplification du gène GAPDH selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction .............................................................. 87
Figure 33 : Profils d’amplification kit par kit (overnight de lyse) pour le gène GAPDH ........ 88
Figure 34 : Analyse des CTs obtenus pour le gène GAPDH selon les différents temps de lyse
des échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction et selon les kits utilisés .................... 89
15
Figure 35 : Profils d’amplification du gène HPRT selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction .............................................................. 90
Figure 36 : Profils d’amplification kit par kit pour le gène HPRT ......................................... 91
Figure 37 : Analyse des CTs obtenus pour le gène HPRT selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction et selon les kits utilisés .......................... 92
Figure 38 : Exemple de profils d’amplification obtenus pour l’échantillon 4 après extraction
avec les différents kits ..........................................................................................................93
Figure 39 : Comparaison des CTs entre les protocoles Qiagen et Qiagen bis ......................... 94
Figure 40 : Profil d’amplification et courbe de dissociation obtenus par qPCR avec le témoin
positif E.Coli ........................................................................................................................ 94
Figure 41 : Profils d’amplification kit par kit (24h de lyse) pour le gène 16S. ....................... 95
16
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1: Durée de conservation selon la méthode de cryoconservation et le type

d'échantillon à préserver ....................................................................................................... 41
Tableau 2 : Propriétés de divers agents fixateurs seuls ......................................................... 46
Tableau 3 : pH de différentes solutions de fixation ............................................................... 47
Tableau 4 : Influence de la température d'incubation de la Protéinase K sur la qualité de

l'ADN et détermination d’une température dite « idéale » ..................................................... 57
Tableau 5 : Influence de la durée d’incubation de la Protéinase K sur la qualité de l’ADN .... 58
Tableau 6 : Choix des 6 blocs inclus dans l’étude avec le diagnostic histologique associé et
choix des 2 blocs supplémentaires ........................................................................................ 68
Tableau 7 : Choix des six protocoles testés dans l'étude et leur caractéristiques respectives .. 70
Tableau 8 : Annotation des différents tubes selon le bloc et le protocole utilisé ..................... 74
17
18
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide ribonucléique
DMSO : Diméthylsulfoxyde
dNTP : Désoxyribo-nucléotide-triphosphate
dATP : Désoxyribo-adénosine-triphosphate
dGTP : Désoxyribo-guanosine-triphosphate
dCTP : Désoxyribo-cytosine-triphosphate
dTTP : Désoxyribo-thymine-triphosphate
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique
GAPDH : Glycéraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HE : Hematoxyline Eosine
HPRT : Hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase
Kb : Kilo paire de base
Pb : Paire de base
PBS : Tampon phosphate salin (Phosphate Buffered Saline)
PCR : Réaction en chaîne par polymérisation (Polymerase Chain Reaction)
qPCR : Réaction en chaîne par polymérisation quantitative (Quantitative Polymerase Chain

Reaction)
RT-PCR : Transcription inverse par réaction en chaîne par polymérisation (Reverse

Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
SDS : Dodécylsulfate de sodium
Tampon TE : Tampon Tris-EDTA
Taq Polymérase : Thermus aquaticus Polymérase
Tissus FFPE : Tissus Fixé en Formol puis inclus en paraffine (Formol Fixed Paraffine
Embedded)
19
20
INTRODUCTION
La thérapie génique, le séquençage du génome humain et la création de nouvelles

variétés animales ou végétales par transgénèse font partie de ces projets et réalisations
scientifiques qui monopolisent l’intérêt du grand public. Ces possibilités inédites de connaitre
et de modifier le génome sont le fruit d’une science appelée biologie moléculaire, qui s’est
développée au milieu du XXème siècle, à la découverte des mécanismes moléculaires
fondamentaux du vivant. Ces progrès ont transformé profondément de nombreux domaines de
la biologie, incluant le diagnostic médical, tant en médecine de l’homme qu’en médecine
vétérinaire, l’étude des maladies, la médecine légale, l’identification des individus et leur
généalogie ou, encore, la caractérisation de l’ADN ancien. (« Histoire de la biologie
moléculaire » Michel Morange).
L’évolution de la biologie moléculaire est récente et les progrès ont été considérables
sur les cent dernières années depuis la découverte de la double hélice de l’ADN jusqu’au
séquençage d’un génome entier en quelques heures seulement. Toutes ces évolutions ont
notamment été permise par une méthode qui a révolutionné la biologie moléculaire : la
Polymerase Chain Reaction, dite PCR, une technique de polymérisation de nouveaux brins
d’ADN à partir d’un brin mère. En parallèle, avec la mise au point de méthodes de conservation
des prélèvements par le froid ou chimiquement, via des fixateurs comme le formol, les archives
des laboratoires de médecine humaine ou vétérinaire se sont remplis d’échantillons et enrichis
d’informations retenues dans le matériel génétique de ces derniers. Toutefois, pour exploiter
ces ressources, la réussite de l’extraction du matériel génétique est essentielle. Dans le cas des
prélèvements fixés par le formol et inclus en paraffine, cette extraction reste un challenge. En
effet, si de nombreuses études scientifiques ont été réalisées, entre 1950 et aujourd’hui, à la
recherche de la méthode d’extraction idéale d’ADN ou d’ARN, aucun consensus n’en ressort.
La meilleure technique semble dépendante de nombreux facteurs comme le type de tissu étudié,
le temps de fixation par le formol, la quantité de matériel disponible… suggérant que chaque
laboratoire doive établir la méthode la plus appropriée à ces échantillons et à sa problématique.
Dans ce contexte, le but de notre travail a été de mettre au point une méthode
d’extraction adaptée à des biopsies cutanées de chien fixées par le formol et incluses en
paraffine, disponibles dans les archives du laboratoire d’histologie de VetAgro Sup, avec 2
objectifs distincts. Le premier objectif était de pouvoir amplifier de l’ADN canin par qPCR
dans un but de recherche afin, notamment, de pouvoir étudier le matériel génétique (recherche
de mutations…). Le second objectif était un objectif diagnostique, plus précisément, la mise en
évidence d’un agent infectieux, bactérien, via le gène 16S, dans nos biopsies.
Ce travail est divisé en 2 parties. La partie bibliographique présente, dans un premier

temps, l’évolution de la biologie moléculaire et des techniques d’extractions du matériel
génétique au cours du temps ainsi que le rôle central que tient aujourd’hui cette science dans la
médecine tant humaine que vétérinaire. Elle s’intéresse, également, aux méthodes de
conservation des échantillons biologiques ainsi qu’aux protocoles permettant d’en extraire du
matériel génétique de qualité. La seconde partie détaille notre étude expérimentale, du choix
des biopsies cutanées de chien et des protocoles testés pour l’extraction d’ADN, à la réalisation
des qPCR. Les résultats obtenus sont enfin discutés et comparés avec les données de la
littérature.
21
22
PARTIE 1 – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
23
24
I. La biologie moléculaire : de sa naissance dans les années 50 à
sa place essentielle en médecine de nos jours.
D’après Michel Morange, la biologie moléculaire est « l’ensemble des techniques et

des découvertes qui ont permis l’analyse moléculaire des processus les plus intimes du
vivant, et de ceux qui en assurent la pérennité et la reproduction ». En termes de discipline,
elle est le fruit de l’union entre deux branches de la biologie : la génétique et la biochimie
(Morange, 1995).
A. Un peu d’histoire
1. La naissance de la biologie moléculaire
Les fondements de la biologie moléculaire datent du milieu du XIXe siècle avec la

théorie de Charles Darwin sur l’évolution des espèces vivantes. Cette discipline a ensuite connu
d’importants développements jusqu’à devenir un outil indispensable de la biologie moderne
(Berche, 2016).
La biologie moléculaire a réellement débuté lors de la découverte de la structure de

l’ADN au début des années 50. Dès 1944, l’américain O. Avery et ses collaborateurs,
démontrent que les gènes sont formés d’acide désoxyribonucléique ou ADN. En 1945, E.
Chargaff, établi que cet ADN est constitué de quatre nucléotides que sont l’Adénine, la
Thymine, la Cytosine et la Guanine. Mais c’est en 1953, lorsque James Watson, Francis Crick
et leurs collaborateurs établissent la structure en double hélice de l’ADN, où les deux brins
d’ADN sont enroulés en spirale et forment un escalier en colimaçon que la biologie moléculaire
est réellement née. Cette découverte a eu l’effet d’un coup de tonnerre dans le monde
scientifique et les travaux de Watson et Crick furent récompensés d’un Prix Nobel de
Physiologie et Médecine en 1962 (Morange, 1995 ; Berche, 2016).
A partir cette date, les découvertes se sont enchainées : en 1956, les américains S. Ochoa
et A. Kornberg isolèrent des enzymes, les polymérases, capables de synthétiser de l’ADN et de
l’ARN. Ils reçurent le Prix Nobel de Médecine et Physiologie en 1959. En 1960, François Jacob
et Jacques Monod montrent l’existence de l’ARN messager, un intermédiaire à courte durée de
vie entre les gènes et les protéines présentes dans le cytoplasme.
Suivirent le déchiffrage du code génétique, la découverte de la transcriptase inverse, capable de
transformer l’ARN en ADN, et la découverte des « endonucléases de restriction », capables de
couper la molécule d’ADN à des sites bien spécifiques, qui furent récompensés par un Prix
Nobel de Physiologie et Médecine en 1968, 1975 et 1978, respectivement (Morange, 1995 ;
Berche, 2016).
25
Dans la seconde moitié des années 1970, la technique du séquençage fit son apparition.
Deux méthodes se développent en parallèle : une par l’équipe de Walter Gilbert aux Etats Unis,
et l’autre par Frederick Sanger au Royaume Uni. L’approche de Sanger est une méthode par
synthèse enzymatique sélective, celle de Gilbert utilise une méthode par dégradation chimique
sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger sont récompensés par le prix Nobel de chimie
en 1980. Au cours des 25 dernières années, la méthode de Sanger a été largement développée
grâce à des avancées technologiques importantes. La méthode de Gilbert, quant à elle, nécessite
des réactifs chimiques toxiques et reste limitée quant à la taille des fragments d'ADN qu'elle
permet d'analyser (< 250 nucléotides). Moins facile à robotiser, son usage est aujourd'hui très
limité (Morange, 1995 ; Berche, 2016).
La mise au point des techniques de séquençage a déclenché une « course au génome »,

en commençant par les virus dès 1978. En 1992, l’américain Craig Venter réussit en quelques
mois à séquencer le génome complet de Haemophilus influenzae (1 831 Kb). Le génome de
Escherichia coli (> 4 000 kb) ne sera publié qu’en 1997. Mais ce n’est qu’en 2003, après dix
ans d'efforts, pour un coût de 3,7 milliards de dollars, que Craig Venter épata le monde entier
en achevant la séquence complète du génome humain.
A partir de 1979, les séquences déchiffrées de l’ADN augmentent exponentiellement du

fait de l’automatisation des techniques et une nouvelle discipline voit le jour : la bio-
informatique. En 1982, la première banque de séquences d’ADNs appelée GenBanks est créée
et complétée par l’envoi des séquences déchiffrées par les chercheurspar internet. Aujourd’hui,
ces banques de données permettent de déterminer l’identification et le degré de parenté entre
les espèces vivantes (Morange, 1995 ; Berche, 2016).
Les progrès scientifiques permettent également d’autres découvertes telles que la

recombinaison d’ADN in vitro (1972) et le clonage (1974) conduisant, ainsi, à la naissance
d’une nouvelle discipline : le génie génétique.
Le génie génétique désigne l’ensemble des techniques modernes permettant la
manipulation des gènes, leur isolement, leur caractérisation, leur modification et leur
expression. Ainsi, dès 1978, les premières protéines humaines ayant un potentiel thérapeutique
telles que l’insuline, l’interféron et la somatostatine sont synthétisées par des bactéries. En 1980,
ces protéines humaines peuvent être exprimées dans des cellules animales. C’est également en
1980 que les premières expériences d’intégration d’ADN dans les cellules végétales furent
réalisées conduisant à la création de plantes transgéniques : c’est la naissance des organismes
génétiquement modifiés (OGM). En 1981, fut créée la première souris transgénique et, en 1997,
arriva l’annonce du clonage d’une brebis surnommée Dolly, obtenu à partir d’un noyau d’une
cellule somatique provenant de la glande mammaire d’une brebis, injecté dans un ovule énucléé
de brebis. Suivra la création d’autres plantes et animaux « transgéniques » exprimant des gènes
étrangers, pour le meilleur ou pour le pire (Lionnet et Croquette, 2005).
26
2. La mise au point d’une technique révolutionnaire : la PCR
En 1983, Kary Mullis eut l’idée d’utiliser la technique de séparation des 2 brins d’ADN,
mise au point par Sanger, et d’ajouter un oligonucléotide comme amorce pour l’ADN
Polymérase. Il met ainsi au point une technique révolutionnaire : la Polymerase Chain
Reaction (PCR).
La PCR est une technique d’amplification moléculaire sélective d’une séquence d’ADN
double brin, à partir d’un couple d’amorces s’hybridant de part et d’autre de cette séquence,
afin de produire une grande quantité de séquences d’acides nucléiques et de faciliter son analyse
et son identification. Cette technique permet la multiplication et, donc, la caractérisation, de
n’importe quel fragment d’ADN présent, même à l’état de trace, dans un échantillon biologique.
Cette technique a littéralement bouleversé la biologie et a ouvert des perspectives majeures pour
de nombreux domaines scientifiques comme l’archéologie, la médecine légale, l’écologie, le
diagnostic médical, la génétique ou, même, la généalogie (Lionnet et Croquette, 2005).
Le brevet de la technique fut déposé en 1987, après des étapes d’amélioration et de

simplification, notamment grâce à l’utilisation de la Taq polymérase, une ADN polymérase
stable à haute température évitant des ajouts itératifs de la polymérase, thermosensible, après
chaque cycle de chauffage. En 1993, grâce à ce travail ingénieux, K. Mullis obtient le Prix
Nobel de Chimie (Lionnet et Croquette, 2005).
La PCR est ainsi réalisée grâce à la Taq Polymérase, enzyme polymérisant dans le sens
5’ → 3’ de l’ADN, en présence d’ADN cible correspondant à la séquence à amplifier, de
nucléotides libres nommés « dNTP » : dATP, dCTP, dGTP, dTTP et de deux amorces oligo-
nucléotidiques dites « primers » .
Ces primers comprennent une amorce SENS, correspondant à la même séquence que le
brin sens 5’ → 3’ de l’ADN, complémentaire et antiparallèle au brin antisens auquel elle
s’hybride et une amorce ANTI-SENS, correspondant à la même séquence que le brin antisens
3’ → 5’ de l’ADN, complémentaire et antiparallèle au brin sens auquel elle s’hybride (Figure
1).
Figure 1: Hybridation des amorces de la PCR sur le fragment d'ADN cible
La PCR permet d’amplifier n’importe quelle séquence d’ADN de manière spécifique à

condition de disposer d’amorces adéquates. La spécificité peut ainsi varier selon la nature des
amorces, la région du génome amplifiée, la méthode de révélation et le typage moléculaire.
27
La réaction enzymatique permettant l’amplification se réalise dans un automate, le
thermocycleur, programmé pour réaliser 3 grandes étapes selon différents temps d’incubation et
températures :
La dénaturation du brin d’ADN, 94-97 °C pendant 1 minute.

- L’hybridation des amorces 47-60°C pendant 30 secondes à 1 minute.
- La synthèse ou élongation, 72°C pendant 30 secondes à 1 minute.
Ces étapes sont schématisées en Figure 2 :
Figure 2 : Schéma détaillant deux cycles d'une PCR conventionnelle (© D’après ADEME)
Chaque brin néoformé sert de matrice au prochain cycle, ainsi, l’enchaînement de

plusieurs cycles permet une amplification exponentielle de l’ADN cible : au bout d’un cycle on
obtient 2 copies, au bout de 2 cycles, 4 copies etc… comme le montre la Figure 3. Le nombre
de cycle total est généralement compris entre 30 et 35 (Lionnet et Croquette, 2005).
Figure 3 : La cinétique de la PCR Conventionnelle (© D’après Vierstraete 2001)

28
La présence de cet ADN amplifié peut ensuite être visualisée à la fin des cycles par
migration sur gel d’agarose lors d’une électrophorèse. La quantité d’ADN obtenue peut alors
être quantifié grossièrement à la lecture des gels d’agarose, grâce à la comparaison de l'intensité
des bandes obtenues avec celles d'un marqueur de poids moléculaire. L'œil humain ne
permettant pas de discriminer de façon absolue les différences d'intensité entre les bandes, on
peut avoir recours à un logiciel d'analyse d'images (Lionnet et Croquette, 2005).
Cependant, afin d’affiner cette mesure de la quantité d’ADN amplifié, une variante de
la PCR, nommée PCR en temps réel, PCR quantitative ou qPCR a vu le jour en 1992. Elle
permet de suivre la quantité d’un ADN cible à tout instant de l’amplification grâce à un
marquage fluorescent de l’ADN double brin avec l’utilisation du SYBRTM Green, ou de l’ADN
cible précisément grâce à la sonde d’hydrolyse Taqman. Ces sondes ne fluorescent qu'une fois
fixées à l'ADN (soit à cause d'un « quencher » soit car la fluorescence nécessite un ADN double
brin). Un seuil de fluorescence est établi par le programme de l'appareil de PCR en temps réel.
Une fois que la quantité d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce seuil on obtient
alors un numéro de cycle PCR appelé « Ct » pour « Threshold Cycle » soit « cycle seuil »
(Figure 4) (Poitras et Houde, 2002).
Figure 4 : Tracé de PCR en temps réel
Plus la valeur Ct est faible, plus la quantité de l’échantillon est élevée et inversement.
On obtient ainsi un résultat semi-quantitatif au cours de l’amplification. Pour obtenir un résultat
quantitatif absolu, la valeur Ct est à la base des calculs : la machine de qPCR calcule l’efficacité
E de la PCR grâce à une série de dilutions de 10 en 10 d’une quantité d’ADN initiale connue.
29
Une gamme étalon ou droite de calibration est tracée et à partir de l’équation de
régression linéaire de cette gamme, on déduit le nombre de copie d’ADN présent dans
l’échantillon (Figure 5) (Poitras et Houde, 2002)
Figure 5 : Gamme étalon de la qPCR (A) et Equation de régression linéaire sur échelle
logarithimique déduite de la gamme (B) (© D’après Wikimedia Commons)
La PCR temps réel est ainsi un outil précieux et puissant dans les développements
récents des techniques de biologie moléculaires. Il est utilisé désormais quotidiennement dans
les laboratoires de biologie moléculaire.
Cependant, il faut interpréter les résultats en toute connaissance des limites de la PCR :
- La taille de la cible peut parfois représenter un obstacle si cette dernière est trop
importante (plusieurs Kb).
- La Taq Polymérase est une enzyme peu fidèle en raison de l’absence d’activité
« Proofreading » et son taux d’erreur est d’environ 10-4.
- Les inhibiteurs incomplètement éliminés par l’extraction et la purification représentent

des contaminants gênant la PCR. Ces derniers représentent une préoccupation technique
majeure du laboratoire réalisant les PCR.
30
3. Les techniques de la biologie moléculaire modernes
La biologie moléculaire s’est donc développée à une vitesse phénoménale en partant de

simples découvertes sur le support génétique au milieu du XIXe siècle, jusqu’au séquençage
complet du génome humain, l’amplification de fragments d’ADN par PCR ou même le clonage
d’êtres vivants dans les années 2000. En parallèle de l’essor de cette discipline scientifique, de
nombreuses techniques modernes ont fait leur apparition et ont permis la poursuite de la
progression des connaissances jusqu’à aujourd’hui.
Si la qPCR en temps réel a vu le jour en 1992, cette technique a connu de

nombreuses améliorations avant son utilisation actuelle. Elle constitue un grand progrès par
rapport aux techniques classiques de par sa rapidité, sa sensibilité, sa spécificité accrue et tient
aujourd’hui une place importante dans le domaine du diagnostic médical. L’inconvénient
majeur réside dans le prix de cet équipement qui, dans un contexte d’analyse de routine, ne peut
être amorti que sur un grand nombre d’échantillons. De cette technique est née différentes
variantes comme la PCR multiplexe qui désigne une mise au point de la technique PCR
autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Le
multiplexage permet d’économiser du temps, des réactifs et des consommables et élimine le
problème des erreurs de pipetage. Pour les échantillons précieux ou en faible quantité comme
des échantillons FFPE ou des biopsies de tumeurs, la qPCR multiplexe est souvent une solution
appropriée, car elle permet d’obtenir davantage de résultats que la qPCR simplexe (Uhel et al
2019).
Vers la fin des années 90, est également apparue la technologie des puces à ADN ou
microarrays. Elle permet d’analyser simultanément plusieurs milliers de gènes au sein d’un
seul échantillon. Elle se décline sous de nombreuses formes permettant l’analyse de l’ADN
(génome) ou de l’ARN (transcriptome) d’un organisme. La technique est simplement fondée
sur une amplification d’acides nucléiques suivie d’une hybridation. Elle ne comporte rien de
nouveau, si ce n’est une miniaturisation du système ; l’idée étant d’analyser non pas une
séquence, mais des milliers.
Les puces sont des supports (verre, plastique, nylon) sur lesquelles sont fixées de courtes
séquences nucléotidiques appelées sondes, organisées en unités d’hybridation. Chaque unité
contient plusieurs millions d’exemplaires de la même sonde. Les ARN extraits d’une population
cellulaire sont marqués puis déposés sur la puce. Ils se fixent alors dans les unités d’hybridation
contenant les sondes qui leur sont spécifiques puis sont révélés à l’aide d’un fluorochrome.
L’intensité de fluorescence émise dépend du nombre de molécules d’ARN spécifiquement
appariées. Une plaque pouvant contenir plusieurs milliers de gènes, cette technique a permis
d’établir des corrélations dans les réseaux génétiques qui sous-tendent le fonctionnement de la
cellule (Uhel et al 2019).
Dans les années 2000, le séquençage haut-débit ou next generation sequencing

(NGS) apparaît et démocratise petit à petit le séquençage de très grands génomes à bas prix,
permettant ainsi de compléter encore plus rapidement des banques de génomes. Ces nouvelles
méthodes reposent sur 3 étapes : tout d’abord l’ADN cible est fragmenté en petites séquences
d’environ 500 bases puis amplifié par PCR. Les fragments obtenus sont ensuite séquencés en
pyroséquençage. Ce dernier consiste à ajouter séquentiellement et dans l’ordre une base à partir
de l’extrémité 3’ de l’amorce. Chaque base est marquée par un fluorochrome différent dont le
signal est mesuré par bioluminescence. Cette méthode performante totalement automatisée
31
permet d’analyser jusqu’à 500 Mb de données brutes par run. L’utilisation de logiciels
informatiques permet l’analyse des données. Le développement de ces techniques ont permis
au marché du séquençage de l’ADN d’exploser et de nombreuses applications dans des
domaines variés sont aujourd’hui disponibles (Lamoril et al, 2008).
Enfin, en 2012, une nouvelle technologie, permettant de manipuler rapidement le

génome, est apparue. Dénommée CRISPR-Cas9, ce système dérivé des bactéries a été décrit
par Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier. Ce dernier leur a d’ailleurs permi d’obtenir le
Prix Nobel de Chimie tout récemment (7 Octobre 2020). Il utilise, d’une part des molécules
d’ARN ayant pour cible une séquence spécifique d’ADN et, d’autre part, la nucléase
bactérienne Cas-9. Il permet ainsi de remplacer n’importe quel gène dans n’importe quel
organisme, bactéries, plantes, animaux, y compris les primates. Il est désormais entré dans
l’arsenal des techniques de correction de l’ADN. Avec une grande précision fondée sur la
complémentarité ADN-ARN, on peut facilement corriger une mutation, remplacer un gène
déficient ou néfaste, ou encore stimuler l’activité d’un gène normal. Ce pourrait être un outil
puissant pour des essais de thérapie génique dans le cas de certaines maladies tant humaines
qu’animales (Uhel et al 2019).
Si le début de « la course aux génomes » a marqué l’ère de la biologie moléculaire

moderne, la première étape de tout travail en génie génétique reste l’isolement du matériel de
départ. L’extraction d’ADN est ainsi la première étape de toute manipulation de biologie
moléculaire et les techniques d’extraction ont grandement évolués au cours des années, en
parallèle de l’évolution des techniques du génie génétique.
32
B. L’évolution des techniques d’extraction d’ADN
En parallèle des progrès successifs sur la connaissance des acides nucléiques, les
techniques d’extractions d’ADN ont également dû évoluer et s’améliorer afin de suivre les
exigences de qualité, essentielles à la réussite des techniques modernes de biologie moléculaire
1. La première extraction d’ADN
Le tout premier isolement d’ADN a été réalisé en 1869 par Friedrich Miescher, un
médecin suisse, lors de ses études sur la composition chimique des cellules. Ce dernier
travaillait sur des leucocytes avec pour objectif de purifier et classer les protéines contenues
dans ces cellules. Au cours de ses expériences, il remarque la précipitation de sa solution lors
d’ajout d’acide. Ce précité, originaire des noyaux est alors nommé « nucléine ». Miescher
développe ensuite deux protocoles pour séparer les noyaux des cellules du cytoplasme et pour
isoler ce nouveau composé, aujourd'hui appelé ADN, qui différait des protéines et autres
substances cellulaires (Dahm, 2005).
Cependant, ce n'est réellement qu'en 1958 que Meselson et Stalh ont développé une
procédure de laboratoire de routine pour l'extraction d'ADN. Ces derniers ont effectué une
extraction d'ADN à partir d'échantillons bactériens d'Escherichia coli en utilisant un protocole
de centrifugation en gradient de densité de sel. Depuis lors, les techniques d'extraction d'ADN
ont été adaptées pour effectuer des extractions sur de nombreux types de sources biologiques
(Tan and Yiap, 2009).
2. Les extractions en phase liquide
La méthode d'extraction des acides nucléiques utilisant des solvants organiques a été
initialement développée en 1977 dans le but d’extraire de l’ARN en utilisant de l'isothyocyanate
de guanidium. Elle a ensuite été modifiée par Chomczynski et Sacchi qui ont développé en
1987 un protocole utilisant le guanidium thiocyanate – phénol – chloroforme et une
centrifugation beaucoup plus courte, permettant d'isoler l'ARN, l'ADN et les protéines. Mais,
ce n’est qu’en 1998, grâce aux travaux de Barker et de ces collaborateurs, que le guanidium
thiocyanate fut remplacé par l’alcool isoamylique et que la méthode d’extraction au phénol-
chloroforme utilisée quotidiennement dans tous les laboratoires du monde est née. Face aux
bons résultats obtenus, cette technique devint rapidement la méthode de référence de
l’extraction d’acide nucléique.
L'extraction au phénol-chloroforme est un procédé d'extraction liquide – liquide utilisé

pour isoler les acides nucléiques (ADN comme ARN) en les séparant des protéines. Ce procédé
de séparation repose sur la différence de solubilité des acides nucléiques et des protéines dans
une émulsion à deux phases : une phase aqueuse et une phase organique.
Certaines techniques d'extraction d'acides nucléiques qui évitent l'utilisation de solvants

organiques ont également été développées au fil des ans. En 1988, Miller et coll. ont publié un
protocole permettant de purifier l'ADN par précipitation de protéines à haute concentration en
sel. Le protocole traditionnel implique la désintégration cellulaire initiale et la digestion avec
la SDS-protéinase K, suivies de l'ajout de concentrations élevées de sels, généralement du
chlorure de sodium. Le mélange est ensuite centrifugé pour permettre aux protéines de
précipiter, l’ADN restant dans le surnageant. L'ADN est ensuite précipité à l'éthanol ou à
l'isopropanol de la même manière que celle décrite pour les méthodes aux solvants organiques
(Tan et al. 2009, Dahm, 2005).
33
Ces méthodes de purification utilisant des solvants organiques sont encore couramment
utilisées car la lyse est efficace et les nucléases sont inactivées. Cette approche permet
également de co-purifier les ADN, les ARN et les protéines à partir d’un même échantillon.
3. Les extractions en phase solide
La purification de l'ADN utilisant l'approche de la chromatographie d’adsorption

remonte à 1979, lorsque Vogelstein et Gillespie ont utilisé de la silice sous forme de poudre de
verre dans leur protocole pour purifier des fragments d'ADN préalablement séparés par
électrophorèse sur gel d'agarose. Un certain nombre de procédures différentes utilisant
l'approche d'extraction d'ADN liquide / support solide ont ensuite été développées et sont
utilisées dans la majorité des kits d'extraction disponibles dans le commerce (Dairawan et
Shetty, 2020 ; Chacon-Cortes et Griffiths, 2014).
La chromatographie d’absorption est une méthode analytique permettant la séparation

de molécules entraînées par le passage d’une phase mobile, à travers une phase stationnaire. La
séparation est basée sur l’entraînement différentiel des constituants présents dans la colonne
selon leurs propriétés intrinsèques : la taille, la structure, leur affinité avec la phase stationnaire.
Cette méthode a évolué pour être adaptée à la purification du matériel génétique. L’introduction
aux technologies d’adsorption sur membrane ou colonne de silice apparaît en 1996. Les acides
nucléiques sont adsorbés sur un support en silice en présence de sel chargés positivement
permettant aux molécules d’ADN chargées négativement de se fixer. Le passage des liquides
dans la matrice peut se faire par gravité, centrifugation ou filtration sous vide. Des lavages sont
ensuite réalisés puis l’ADN est élué avec un tampon pour lequel ce dernier a une forte affinité
(Figure 6).
Figure 6 : Principe de la chromatographie par adsorption (© QIAamp® DNA FFPE Tissue

Handbook )
a. Adsorption préférentielle de l’ADN sur la colonne de silice

b. Lavages
c. Elution avec un tampon à forte affinité pour les acides nucléiques
Cette technique révolutionne complètement l’étape de purification des acides nucléiques

grâce à une amélioration significative de la qualité, à un gain de temps de manipulation et à la
diminution du risque toxique (Kocjan et al. 2015). De nombreux kits commerciaux utilisent
aujourd’hui cette méthode pour la rapidité et la facilité d’utilisation. La phase solide peut être
une résine échangeuse d’ions, une matrice en silice, ou bien des billes magnétiques (Dairawan
et Shetty, 2020 ; Chacon-Cortes et Griffiths, 2014).
34
a. Méthode d'extraction d'ADN basée sur une colonne de silice
Les matrices de silice ont des propriétés uniques de liaison à l'ADN. Elles sont
chargées positivement et ont une forte affinité avec la charge négative du squelette de l'ADN.
De nombreux kits commerciaux utilisant des colonnes de silice sont disponibles. Dans ces
protocoles, les échantillons sont incubés avec un tampon de lyse puis sont déposés sur la
colonne. Les contaminants sont éliminés par une série d'étapes de lavage, suivies par une élution
d'ADN sous faible force ionique (pH 7) en utilisant un tampon TE ou de l'eau distillée stérile.
La plupart des protocoles prennent 45 minutes à 1 heure et produisent des rendements élevés
d'ADN avec une contamination minimale (Dairawan et Shetty, 2020 ; Chacon-Cortes et
Griffiths, 2014).
b. Extraction d'ADN à l'aide d'anion échange de résines
La méthode est basée sur l’interaction entre les molécules de surface chargées positivement
(ex : DEAE : diéthylaminoéthyl cellulose) et les phosphates présents dans les squelettes des
acides nucléiques chargés négativement. Les acides nucléiques se fixent sur les molécules de
surface lorsque que la concentration en sel est faible. Les impuretés comme les protéines, les
métabolites sont éliminés par des lavages avec des tampons contenant des concentrations
modérées de sel. Les acides nucléiques sont élués dans un tampon à concentration élevée en
sel. Une précipitation à l’alcool en présence de sel est généralement appliquée pour concentrer
les acides nucléiques après élution. Cette méthode permet de purifier des ADN de grande taille
jusqu’à 150 kb (Dairawan et Shetty, 2020 ; Chacon-Cortes et Griffiths, 2014).
Parmi les supports utilisés, la résine Chelex® 100 est composée de copolymères de
styrène-divinylbenzène. Elle est utilisée dans les protocoles d'extraction d'ADN en tant que
résine échangeuse d'ions chélatrice qui lie des ions métalliques polyvalents tels que les
nucléases. Le protocole de laboratoire initial, utilisant le sang comme source biologique, a été
décrit par Walsh et al en 1991. Les échantillons de sang peuvent être lysés à l'aide de protéinase
K ou incubés à haute température, et l'élimination des contaminants est obtenue en ajoutant de
la résine Chelex® 100, qui les précipite. L'ADN simple brin reste en suspension dans le
surnageant, qui peut être immédiatement utilisé ou concentré par précipitation. Cette résine est
couramment utilisée dans l'extraction d'ADN à partir d'échantillons médico-légaux (Dairawan
c. Méthodes d'extraction d'ADN utilisant des billes magnétiques
Des techniques d'extraction d'acides nucléiques utilisant la séparation magnétique font

leur apparition dans le début des années 1990. Les particules magnétiques sont constituées d'un
ou plusieurs noyaux magnétiques, tels que la magnétite (Fe3O4) ou la maghémite (gamma
Fe2O3), enrobées d'une matrice de polymères ayant une affinité spécifique pour l'ADN. La
séparation des billes magnétiques liées à l'ADN à partir du lysat cellulaire est obtenu en
appliquant un champ magnétique à l'aide d'un aimant externe. Lorsque les billes sont agrégées
au fond du tube, le surnageant est éliminé et le culot lavé avec de l’éthanol. La récupération de
l’ADN est réalisée par une étape de chauffage à 65°C qui permet la séparation des particules
magnétiques et de l'ADN. Le rendement en ADN obtenu par cette méthode est comparable à
celui des méthodes conventionnelles. Le protocole est simple, rapide et efficace. Il évite les
multiples étapes de centrifugation ou de filtration et peut être automatisée facilement (Dairawan
35
4. La robotisation des techniques d’extraction
Ces dernières années, l’évolution des techniques d’extraction a été repoussée jusqu’à la
mise au point de l’extraction automatisée dans le but de simplifier encore l’isolement des
acides nucléiques, réduire le temps de manipulations, d’accroître la sécurité, la reproductibilité
et la qualité des résultats. Ce système est utilisé dans les laboratoires de grande taille et reste
coûteux. La vitesse, la précision et la fiabilité de l’extraction sont maximales avec ce procédé
et le risque de contamination croisée est minimisé. Le temps d’extraction est d’environ 30
minutes entre l’ajout des échantillons et la récupération des acides nucléiques dans leur tampon
d’élution. De nombreux groupes comme QIAGEN® ou PROMEGA® ont notamment lancé leur
propre robot automatisé (Figure 7) :
Figure 7 : Robots pour l'extraction d'acides nucléiques automatisés
A gauche, Promega Maxwell 16 (©Promega Corporation)

A droite, QIAGEN EZ1 Advanced XL (©QIAGEN)
L’automatisation a contribué à augmenter le débit et la fiabilité du processus

d’extraction mais ces systèmes restent peu utilisés en dehors des laboratoires. Pourtant, elle
reste l’avenir de l’extraction d’acide nucléique avec une optimisation de la technique :
purification de l’ADN, extraction simultanée d’ADN, d’ARN et de protéines de divers
organismes…
En conclusion, l'extraction d'ADN a évolué au cours des 145 dernières années et s'est
développée en une diversité de techniques. Il n'y a pas de consensus sur la meilleure méthode
pour l'extraction d'ADN. Les établissements du monde entier choisissent généralement une
méthode en fonction de la disponibilité de l'équipement, des échantillons et des réactifs, ainsi
qu'en tenant compte de la vitesse, des exigences techniques et du coût. Mais surtout, la
technique d'extraction d'ADN choisie doit être en mesure de fournir des échantillons d'ADN en
quantité et de qualité adaptées pour les applications moléculaires souhaitées.
36
C. Applications de la biologie moderne en médecine humaine et
vétérinaire
L’extraction d’ADN à partir de prélèvements biologiques et son analyse via les

techniques modernes de biologie moléculaire est omniprésente en médecine humaine. En effet,
les avancées de la biologie moléculaire ont été spectaculaires dans le domaine du diagnostic et
du suivi de maladies infectieuses comme les endocardites, les prostatites, les infections
oculaires, l’arthrite, les méningites mais, également, dans le suivi de divers cancers et maladies
génétiques. Si le développement des tests en médecine vétérinaire a pris du retard par rapport à
la médecine humaine, l’intérêt est majeur au niveau diagnostique et tend à se développer (Ryan
et al 2007 ; Salisu et al, 2019, Nicollet et al. 2011).
1. Diagnostic des maladies infectieuses
Dans un contexte de diagnostic, les laboratoires de microbiologie clinique ont pour

mission de fournir rapidement des éléments de caractérisation des microorganismes à l’origine
d’une maladie infectieuse. Les données du tableau clinique orientent le choix des prélèvements
et les données issues des analyses biologiques complètent ces informations pour permettre de
choisir la thérapeutique optimale.
L’identification du pathogène est généralement réalisée après isolement, par des
méthodes phénotypiques (galerie API1). Cependant, les méthodes de biologie moléculaire,
telles que les méthodes de diagnostic par PCR en temps réel, prenant pour cible un locus
spécifique du microorganisme testé, permettent l’identification sans avoir recours à un
isolement préalable. Ces méthodes de biologie moléculaire sont très sensibles, peuvent être
standardisées et leur mise en place assez aisée (Audebert et al 2014, Uhel et al 2019).
En effet, par sa capacité à amplifier des séquences d’acides nucléiques présentes en très
faibles quantités dans un échantillon, la PCR est d’un intérêt fondamental dans les domaines
du diagnostic tant en médecine humaine qu’en médecine vétérinaire. Elle permet
d’envisager la détection d’un agent infectieux directement dans un échantillon biologique
complexe même si celui-ci est faiblement contaminé ou dans un mélange d’échantillons de
plusieurs animaux, ce qui est une particularité toute vétérinaire. L’utilisation de cette
technologie est, également, très intéressante quand l’agent pathogène est de culture délicate,
voire impossible, ou lorsque les résultats microbiologiques classiques sont obtenus après un
délai très long ou qu’ils manquent de spécificité. (Nicollet et Maingourd 2014, Uhel et al 2019).
La PCR est décrite comme la technique de choix dans le cadre d’affections bactériennes
lorsque (Koeck 2001) :
- Les bactéries en causes sont non cultivables ou de culture difficile comme les Chlamydies,
les Mycoplasmes, les Rickettsies, les Bartonelles, Borrelia sp.…
- Les bactéries ont une croissance lente comme les Helicobacter, Bordetella sp. ou
Mycoplasma tuberculosis.
- La quantité de bactéries est infime ou lorsqu’un traitement antibiotique a déjà été initié
- Des toxines bactériennes sont en causes comme celles de Corynebacterium diphteriae,

Clostridium difficile ou Staphylococcus aureus.
37
En médecine humaine, la PCR a, par exemple, révolutionné le diagnostic des
endocardites à hémoculture négative qui restent des affections de diagnostic difficile et souvent
retardé. La plupart des études moléculaires publiées pour détecter et identifier l’agent causal
d’une endocardite sont basées sur l’amplification de l’ADN ribosomal 16S, composé de
séquences nucléotidiques particulièrement conservées chez toutes les bactéries. L’analyse de la
séquence du fragment amplifié permet, après comparaison avec des séquences compilées dans
des banques de données, d’identifier l’espèce bactérienne en cause.
Au cours de ces 30 dernières années, la taxonomie bactérienne a été revue sur la base
du séquençage de l’ADNr 16S. C’est, en partie, grâce à l’établissement d’une banque de
données très fournie et représentant plus de cinq mille espèces bactériennes que la PCR
universelle a un intérêt (Podglajen et Mainardi 2007).
En médecine vétérinaire, la PCR est validée pour le diagnostic de nombreuses maladies

infectieuses :
Dans le cas de paratuberculose par exemple, elle consiste à détecter la présence d’un
fragment d’ADN spécifique de Mycobacterium paratuberculosis, et peut être réalisée à partir
des mêmes prélèvements que ceux utilisés pour la culture (ganglions mésentériques ou fèces).
Sa sensibilité est jugée équivalente à celle de la coproculture (méthode de référence), mais la
technique PCR permet d’obtenir un résultat en 48 heures, avec une spécificité estimée à 100 %.
Dans le cas du BVDV, virus à ARN à l’origine de la maladie des muqueuses chez les
bovins, générant des pertes économiques importantes dans les élevages, la PCR a largement
amélioré les possibilités de diagnostic direct de routine à partir de prélèvements sanguins,
d’organe, de cartilage ou de lait et est devenu un outil de dépistage précoce essentiel dans le
cadre des plans d’éradication ou de surveillance des introductions d’animaux (Nicollet et
maingourd 2014).
Dans certains cas, l’utilisation de la PCR permet même d’aller plus loin que
l’identification du microorganisme impliqué. Pour la grande famille des souches de E. coli, par
exemple, une large proportion d’entre elles ne sont pas pathogènes et jouent un simple rôle
commensal. La PCR permet ainsi de détecter spécifiquement certains facteurs de
pathogénicité. Elle diminue d’autant la proportion d’Escherichia coli dits non typables jusque-
là, et souvent associés à des troubles septicémiques. Les résultats obtenus permettent au
praticien d’avoir une interprétation plus complète du “profil” de la bactérie, qui reflète la
symptomatologie observée sur le terrain (Nicollet et maingourd 2014).
Les techniques de biologie moléculaire permettent ainsi d’attribuer un « code barre » au

microorganisme analysé. Cette connaissance quasi exhaustive du génome microbien à la source
de l’infection permet au clinicien de bâtir une stratégie thérapeutique différenciée, adaptée et
économe (Audebert et al 2014).
38
2. Diagnostic des cancers et médecine personnalisée
La majorité des cancers apparaissent à la suite de modifications de l'ADN qui vont conduire à la
multiplication anarchique des cellules et à l'apparition d'une tumeur. Certaines de ces modifications
sont aujourd'hui recherchées en laboratoire grâce aux techniques de biologie moléculaire afin
d'établir un diagnostic précis et d’adapter le traitement à chaque cas.
Le séquençage du génome (ADN) ou du transcriptome (ARN) au niveau de la tumeur

permet de découvrir l’ensemble des altérations qui sont apparues dans les séquences codantes
de l’ADN des cellules malades, en particulier celles qui ont permis à la tumeur de se développer
ou de résister à une thérapie. De même, les puces à ADN vont permettre de visualiser le niveau
d’activité d’un ensemble de gènes prédéfinis (biomarqueurs), reflétant la présence d’altérations
génétiques. Pour chaque gène, il sera possible de déterminer s’il est exprimé normalement, sous-
exprimé, surexprimé ou éteint. La compilation des résultats permet d’associer certains profils à
un pronostic et à une capacité de réponse aux antitumoraux (Minvielle, 2007).
Ces nouvelles techniques permettent ainsi de proposer à chaque patient les médicaments
spécifiquement ciblés sur le profil génétique de sa tumeur. On parle alors d'analyse génomique
et de médecine personnalisée. Chaque tumeur est caractérisée par une combinaison
d’altérations génétiques qui lui est propre. Les anomalies moléculaires identifiées servent
ensuite de repère pour évaluer la réponse au traitement, surveiller l’évolution de la maladie,
détecter une récidive. Grâce à cette médecine, on peut également chercher, dans les cellules de
la tumeur, une altération moléculaire dont les effets peuvent être bloqués par un médicament :
on parle de médicament « ciblé ».
Une telle approche, qui couple le médicament à un biomarqueur, vise à améliorer la prise
en charge des patients tout en en maîtrisant les coûts :
- en évitant la prescription de médicaments inutiles, car inefficaces, potentiellement toxiques et

coûteux, l’objectif est d’éviter des effets indésirables sans bénéfice thérapeutique
- en augmentant la réponse aux traitements grâce à la prescription d’un traitement mieux adapté
aux caractéristiques de la tumeur. Toutefois, ces traitements ciblés sont très onéreux (Minvielle,
2007).
Par exemple dans le cas des cancers du sein, les analyses moléculaires ont plusieurs
objectifs. Elles permettent de classer le cancer avec une valeur pronostique sur le risque de
métastases à distance, de choisir la stratégie thérapeutique la plus appropriée et de personnaliser
le traitement après la chirurgie, améliorant ainsi considérablement la qualité de vie du patient tout
en préservant les chances de guérison. Parmi les options de traitements, l’expression des récepteurs
aux hormones par exemple, prédisent une forte sensibilité à une hormonothérapie via les anti-
oestrogènes avec de bons résultats.
39
3. Dépistage de maladies génétiques
L’accès aux techniques modernes de biologie moléculaire est, également, un immense

progrès dans le domaine du dépistage des maladies génétiques. Les généticiens médicaux
peuvent séquencer les gènes des patients pour déterminer s'il existe un risque de maladies
génétiques. Le diagnostic peut être prénatal ou postnatal et, généralement, réalisé par
séquençage à haut débit (NGS). Dans le cas d’un diagnostic postnatal, l’information sur les
variations génétiques guide la prise en charge thérapeutique et permet de faire du conseil
génétique pour les personnes de la famille. Dans le cas d’un diagnostic prénatal, l’information
génétique va permettre de détecter une maladie héréditaire d'un handicap grave ou de troubles
comportementaux et donner le choix aux parents de poursuivre ou non la grossesse.
De même, chez l’homme, 5 à 10% des cancers surviennent en raison d’une

prédisposition génétique, c’est-à-dire d’une particularité dans le code génétique qui est le plus
souvent héritée et transmissible favorisant la transformation des cellules normales en cellules
cancéreuses. Dans les familles portant cette prédisposition, les cancers surviennent plus tôt que
dans la population générale, ils sont plus fréquents et plusieurs cancers peuvent se succéder au
cours de la vie. L’identification d’une prédisposition génétique dans une famille a pour but de
proposer des mesures de prévention et de dépistage précoce des cancers (Lee et al 2000).
Chez les animaux, aussi, le dépistage de maladies génétiques est important. Au cours
des dernières années, un certain nombre de gènes responsables de maladies héréditaires ont été
identifiés chez les animaux :
- L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive du Golden retriever
- La myélopathie dégénérative chez le Berger allemand, le Boxer, le Berger australien, le
Berger Blanc suisse etc…
- L’ataxie cérébelleuse du Stafforshire Bull Terrier
- La polykystose rénale du British, de l’Exotic Shorthair, du sacrée de Birmanie…
- La cardiomyopathie hypertrophique du Maine Coon
- Etc…
Une fois qu'un gène est identifié, il est facile de développer un test de diagnostic. Cela peut
être utilisé pour confirmer le diagnostic d'une maladie existante, comme pronostic indicateur
qu'un animal finira par développer une maladie, ou sur le statut porteur de l’animal, élément
indispensable pour le pedigree des animaux reproducteurs (Ryan et al 2007).
Conclusion
Depuis les débuts de la biologie moléculaire, au milieu du XIXe siècle, jusqu’aux
techniques performantes de séquençages haut débit des années 2000, le développement des
techniques s’est fait avec rapidité remarquable. Les techniques d’extraction d’ADN sur tissus
frais ont connu de nombreuses évolutions jusqu’à la mise au point de systèmes automatisés
d’extraction d’acide nucléique. Les techniques de biologie moléculaire tiennent aujourd’hui une
place essentielle dans le diagnostic tant en médecine humaine qu’en médecine vétérinaire.
Cependant, elles restent dépendantes de 2 critères essentiels : la conservation des prélèvements
biologiques sur lesquels sont réalisées les extractions et le protocole d’extraction en lui-même,
ce dernier devant impérativement fournir du matériel génétique en quantité et de qualité,
suffisantes. Intéressons-nous en premier lieu aux différentes méthodes de conservation.
40
II. La conservation des prélèvements
La mise au point des techniques de biologie moléculaire et leurs développements sont
liés à la problématique de la conservation des prélèvements biologiques car toutes les
techniques du génie génétique précédemment décrites nécessitent un matériel génétique
d’excellente qualité.
Des chercheurs ont établi que la demi-vie de l’ADN était de 521 ans si ce dernier était
conservé à une température de 13°C. Ainsi, après ces 521 années, la moitié de la molécule est
dégradée à 13°C. L’ADN est donc une molécule stable mais non éternelle. Dès la mort d’un
organisme, la molécule commence son processus de dégradation : les membranes des cellules
cèdent, les tissus se désorganisent et les acides nucléiques, soumis à l’action des DNAses, se
fragmentent. Des réactions d’oxydation poursuivent enfin les dégâts de manière irréversible.
De nos jours, les équipes hospitalières et les laboratoires sont quotidiennement amenés
à conserver du matériel biologique comme des organes, des tissus, des cellules ou des liquides
biologiques afin de réaliser des diagnostics médicaux, des thérapies ou dans le cadre de la
recherche. Des collections et banques d’échantillons ont ainsi créées et conservées. Afin de
pallier aux dégradations des tissus, 2 procédés peuvent être utilisés : la congélation ou la
fixation aux produits chimiques (Venteo et al. 2011).
A. La conservation par le froid ou cryoconservation
1. Le principe de la cryoconservation
La conservation des collections est au centre des interrogations depuis de nombreuses

années. Jusqu’au 17e siècle, la plupart des échantillons sont des pièces de squelettes secs, des
moulages ou des pièces de taxidermie desséchées. La dégradation se faisait plus ou moins
rapidement mais restait inévitablement. Ce n’est que dans les années 1960, avec la
démocratisation du congélateur, que les techniques de congélation se développent.
Aujourd’hui, tous les laboratoires scientifiques du monde entier possèdent bon nombre
d’appareil de refroidissement comme les réfrigérateurs, les congélateurs -20°C ou -80°C ou
cuves à azote liquide à -196°C.
La cryoconservation se définie comme la conservation de matériel biologique à très
basse température. Elle a pour but de préserver l’apparence externe des organismes mais aussi
de ralentir les activités enzymatiques liées à la dégradation afin de pouvoir les étudier par la
suite. Deux méthodes de cryoconservations sont adaptées : la conservation au congélateur très
basse température à -80°C ou dans l’azote liquide à -196°C (Herbin et al. 2013).
A partir de la température et la méthode de conservation choisie, les durées de
conservation sont variables selon le type d’échantillon. Triquet et ses collaborateurs décrivent
ces durées dans leur étude de 1996 (Tableau 1) :
Congélateur -80°C Azote liquide -196°C

Cellules Quelques mois Plusieurs années
Micro-organismes (virus) Plusieurs mois Illimitée
Anticorps Plusieurs années Plusieurs années
ADN Plusieurs années Plusieurs années
ARN Plusieurs mois Illimitée
Tableau 1: Durée de conservation selon la méthode de cryoconservation et le type d'échantillon à

préserver (Triquet et al. 1996)
41
Cependant, un bon nombre de molécules ne supportent pas les modifications chimiques
et physiques de l’environnement pouvant se produire lors de la congélation. En effet, lors du
refroidissement, les cellules sont exposées au choc du froid qui se traduit par des altérations de
membranes cellulaires. L’apparition de cristaux de glace induit à la fois un stress chimique lié
à l’augmentation de la concentration en ions du milieu intracellulaire et un stress mécanique lié
à la forme des cristaux. La remontée de température est à nouveau un stress en raison de la
fusion des cristaux de glace (Figure 8).
Figure 8 : La cellule et le choc du froid lors de la congélation pour cryoconservation (© D’après

Labbe 2013)
Les dommages peuvent cependant être contrôlés par la vitesse de congélation et de

réchauffement (Ryan 2004). La vitesse de refroidissement doit être assez lente pour permettre
la déshydratation cellulaire mais suffisamment rapide pour empêcher les altérations associées
à une déshydratation excessive. Il existe ainsi deux types de congélations selon la vitesse de
refroidissement et selon le but recherché :
La congélation rapide : lorsque le matériel est congelé sans besoin de préserver sa

viabilité, la congélation est réalisée le plus rapidement possible par immersion dans un fluide
réfrigérant comme l’isopentane refroidi par l’azote liquide.
Cette méthode permet une excellente conservation des protéines, des anticorps et des acides
nucléiques. En revanche, la viabilité des cellules n’est pas assurée en raison du « choc du froid »
décrit précédemment : les cristaux de glace intracellulaires se formant avant la déshydratation,
ils déchirent les membranes et entraînent la mort cellulaire.
42
La congélation lente : Cette méthode est utilisée lorsque la viabilité cellulaire doit être
conservée. Il est en effet possible de déterminer, pour un type de cellule donné, une zone de
vitesse de refroidissement adaptée et pour laquelle le taux de survie sera maximum.
Cette méthode est la seule aujourd’hui préservant l’intégrité cellulaire tout en déshydratant
progressivement la cellule pour sa conservation. Elle est largement utilisée pour la conservation
de cellules isolées comme le sperme, les ovocytes, les embryons de 2, 4 ou 8 cellules, ou les
cellules sanguines.
Pour cela, il faut appliquer une vitesse de congélation suffisamment lente pour empêcher
la formation précoce de cristaux de glace intracellulaire mais suffisamment rapide pour éviter
les effets de la déshydratation excessive. En pratique, une vitesse de refroidissement de -1°C à
-3°C par minute semble convenir pour la plupart des cellules animales. Face à ces contraintes,
l’ajout de cryoprotecteurs permet de minimiser les détériorations associées à une vitesse de
congélation non optimale. Bien que les mécanismes impliqués ne soient pas complètement
connus, ces derniers semblent modifier l’état physique de la glace et des solutions
extracellulaires et protègent ainsi les structures internes de la cellule.
2. Les cryoprotecteurs et leur toxicité
Les agents de cryoprotection ou cryoprotecteurs sont des liquides de viscosité élevée

dont les molécules asymétriques favorisent le désordre et ont une forte affinité pour l’eau. Ils
sont nécessaires pour minimiser ou empêcher les détériorations associées à la congélation lente
mais ne protègent pas contre les effets de la congélation rapide et la formation de glace interne
précoce.
Il existe une grande variété de produits chimiques assurant une cryoprotection adéquate
que l’on peut classer en deux catégories (Labbe 2013) :
- Les cryoprotecteurs perméants pénétrant au sein de la cellule sont capables à la fois

de traverser la membrane plasmique et d’être solubles en milieu aqueux. Ils protègent
les structures internes de la cellule. Les plus utilisés sont le glycérol et le
diméthylsulfoxyde ou DMSO et moins largement le méthanol et le propylène glycol
(Ryan 2004). Ils abaissent le point de congélation des milieux et donc la taille des
cristaux et maintiennent une fraction liquide plus importante à l’état vitreux amorphe à
basse température. La concentration ionique est ainsi abaissée ce qui protège le contenu
cellulaire.
- Les cryoprotecteurs imperméants, restent dans le milieu extracellulaire mais

interférent plus ou moins étroitement avec la membrane plasmique des cellules et
limiteraient les dénaturations induites lors de la congélation. Les plus utilisés sont les
sucres comme le saccharose, le fructose ou le lactose, les protéines ou acides aminés
comme les protéines du lait, l’albumine, la proline, ou les protéines antigel comme
l’éthylène glycol et les lipides comme les liposomes ou le jaune d’œuf (Labbe 2013).
43
Plusieurs de ces agents, bien qu’assurant une excellente cryoprotection, ont des effets
secondaires toxiques sur les cultures, rendant leur utilisation prudente :
-La toxicité biochimique. Elle dépend de la concentration et du temps d’exposition à ce dernier

et elle diminue lorsque la température baisse. Cette toxicité résulterait d’effets non spécifiques
sur l’environnement cellulaire et d’interactions spécifiques entre le cryoprotecteur et les
constituants cellulaires en particulier les protéines et les membranes cellulaires en perturbant la
perméabilité membranaire et les pompes ioniques.
-La toxicité osmotique : elle se manifeste lors de l’ajout et du retrait du cryoprotecteur. En

effet, lors de l’exposition à un cryoprotecteur, la cellule se déshydrate et se contracte car le
milieu extracellulaire est hypertonique et la perméabilité membranaire à l’eau est supérieure à
celle des cryoprotecteurs. Si la concentration en cryoprotecteur du milieu est trop élevée, la
contraction osmotique peut être trop importante et irréversible.
-Le pouvoir dénaturant : La propriété amphiphile des cryoprotecteur perméants induit un

pouvoir dénaturant à plus haute température et implique un retrait rapide par changement de
milieu après décongélation dans les 6 à 8 heures (Ryan 2004).
-La génotoxicité : des études ont montré une action génotoxique de certains cryoprotecteurs.
Aye et ses collaborateurs, évaluant la génotoxicité de trois cryoprotecteurs, in vitro, sur une
lignée de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) ont montré que le DMSO n'était pas
génotoxique et que l'éthylène glycol et le propylène glycol induisaient, de façon dose-
dépendante, des ruptures dans les brins d'ADN ainsi que des mutations (Aye et al., 2010).
Afin de limiter la toxicité de chaque solution, une association de différents

cryoprotecteurs (Ethylène glycol, DMSO et Glycérol) semble être la solution pour limiter la
toxicité de chacun et assurer une préservation, cellulaire et moléculaire, adéquate (Best 2015).
3. Les limites de la cryoconservation
La technique de congélation est donc la plus adaptée à la conservation de matériel

biologique vivant et est extrêmement favorable à la conservation des acides nucléiques.
Cependant, l’utilisation en pratique possède des limites :
- Les congélateurs à -80°C sont coûteux à l’achat, au fonctionnement et à l’entretien.

- Une cuve à azote liquide nécessite des approvisionnements réguliers en azote liquide et les
manipulations sont dangereuses et demandent une formation particulière du personnel ainsi que
le port d’un équipement de protection adapté.
- L’évaporation d’azote entraîne également un risque d’asphyxie d’où des contraintes
importantes au niveau du local de stockage : ventilation suffisante, surveillance de l’air
ambiant.
- L’utilisation de cryoprotecteurs peut endommager l’échantillon biologique par des effets
chimiques et génotoxiques.
- La cryoconservation d’organes entiers n’est toujours impossible même si les recherches
progressent. En effet, ces derniers peuvent être conservés uniquement pendant de courtes
durées, dans un liquide de conservation entre 4°C et 8°C.
44
B. La conservation par les fixateurs chimiques
Comme pour la congélation, la fixation chimique a pour objectif de conserver un

tissu dans l’état le plus proche de l’état physiologique en inhibant sa dégradation, sa
putréfaction et son autolyse. Une des fonctions majeures des fixateurs est de stabiliser les tissus
afin de prévenir leur dégradation par putréfaction ou autolyse. La putréfaction est due à la
dégradation des tissus par les bactéries et peut être partiellement limitée en travaillant de façon
stérile. L’autolyse correspond à une dégradation enzymatique des cellules et de ses constituants.
Les solutions conservatrices ou « fixateurs » datent de la fin du 17e siècle avec la mise
au point d’un mélange pour la préservation d’organismes entiers à base de poivre noir, de
cardamome et de clous de girofle (Herbin et al. 2013). Ces fixateurs stabilisent les protéines, et
protègent les tissus lors des traitements histologiques. Le tournant des techniques de
conservation se situe à la fin du 19e siècle avec la découverte du formaldéhyde dont le mélange
avec de l’eau et de l’alcool donnera le formol vers 1890.
1. Quelques exemples de fixateurs de leurs caractéristiques
Le fixateur modifie la structure des tissus en stabilisant notamment les protéines et les
rend ainsi résistants à tout changement. Cette stabilisation est très importante pour les
différentes étapes de traitement du tissu biologique afin de maintenir en place toutes les
structures histologiques entre elle et de limiter la distorsion des différents éléments tissulaires.
Les fixateurs agissent en effet sur les tissus biologiques aussi bien physiquement que
chimiquement. Les principales modifications physiques sont la rétractation ou le gonflement
des tissus biologiques. La majorité des fixateurs utilisés en histologie correspond à des
mélanges d’agents fixateurs qui vont permettre un équilibre entre ces deux effets. L’utilisation
des fixateurs permet une préparation de l’échantillon biologique à l’inclusion en paraffine grâce
au durcissement tissulaire provoqué par le fixateur (Venteo et al. 2011).
Du fait de leurs différentes propriétés, on distingue différentes catégories d’agents

fixateurs :
- Les fixateurs coagulants ou dénaturants ou précipitants provoquent une dénaturation

irréversible des protéines et forment une trame fibreuse au sein de la cellule.
- Les fixateurs non coagulants créent des liaisons entre les protéines et solidifient la
trame protéique cellulaire. Ces fixateurs sont également appelés additifs
(Formaldéhyde, glutaraldéhydes…)
45
Les fixateurs doivent être choisis en fonction de l’étude future de l’échantillon (Tableau 2).
Agent Action sur les Action sur les Action sur

fixateur Action sur les tissus protéines acides l’activité
nucléiques enzymatique
Gonflement puis
Formaldéhyde rétraction Non coagulant Légère Préservée à
Durcissement Additif extraction froid
Ethanol Rétraction Préservée à

Méthanol Durcissement Coagulant - froid
Acétone
Acide picrique Rétraction Hydrolyse
Pas de durcissement Coagulant partielle Inhibition
Acide acétique Gonflement puis

rétraction +++ - Précipitation Inhibition
Pas de durcissement
Tableau 2 : Propriétés de divers agents fixateurs seuls (Venteo et al. 2011)
Quelques exemples de fixateurs :
- L’éthanol est un alcool préservant la majorité des pigments, dissolvant les graisses et est
souvent utilisé pour la préservation du glycogène. Il entraîne cependant un fort effet de
rétraction des tissus ainsi que leur durcissement. Il a la capacité de précipiter les acides
nucléiques et certaines protéines.
- Le méthanol est un excellent fixateur pour la cytologie et est également utilisé pour les coupes
tissulaires congelées. Ses caractéristiques sont similaires à l’éthanol mais il ne durcit pas autant
les tissus biologiques.
- L’acétone est un fixateur dénaturant les structures tissulaires. Il est plutôt utilisé pour la
fixation de frottis cellulaires et les coupes tissulaires congelées afin de préserver les antigènes
leucocytaires de surface.
- L’acide acétique est ajouté dans les mélanges de fixateurs afin de préserver les chromosomes,
précipiter la chromatine des noyaux et s’opposer à l’action des autres fixateurs du mélange
comme l’éthanol ou l’acide picrique. Il présente une pénétration rapide dans les tissus et les fait
gonfler.
- L’acide picrique est utilisé comme fixateur mais également dans certaines colorations
histochimiques. Souvent mélangé à d’autres fixateurs, il permet d’obtenir des colorations
histologiques de très bonne qualité et très contrastées. En revanche, son faible pH conduit à
l’hydrolyse des acides nucléiques.
- Le liquide de Bouin est un mélange d’acide picrique, de formaldéhyde, d’acide acétique

glacial et d’eau. Il préserve les caractéristiques morphologiques, particulièrement le noyau et le
tissu conjonctif ce qui fait de lui un très bon fixateur pour les études histologiques. En revanche,
les organites cytoplasmiques sont mal conservés et les d’acides nucléiques sont hydrolysés.
46
2. Les facteurs influençant la fixation
La fixation des tissus peut être influencée par différents facteurs à prendre en compte :
- La vitesse de pénétration et de fixation de l’agent fixant dans le tissu biologique,

propre à chaque fixateur.
- Le volume du liquide fixateur : il faut un volume d’au moins dix fois le volume de la
pièce à fixer. Il est nécessaire de recouper les échantillons à des épaisseurs de 0,5cm
maximum afin de favoriser la fixation.
- La durée de fixation : si elle est insuffisante, elle peut être délétère. En revanche, plus
elle est longue, plus les tissus peuvent être endommagés et l’ADN fragmenté.
- La consistance du tissu : plus ce dernier est dense, plus il est difficile à pénétrer par
l’agent fixateur. De plus, un tissu dense comme la prostate ou l’utérus, est plus
susceptible de durcir de façon excessive.
- Le pH de la solution conservatrice. La majorité des solutions ont un pH acide mais ce

dernier peut varier en fonction du mélange d’agents fixateurs choisis (Tableau 3).
FIXATEUR pH à 21°C
Formol 6,9 : Formaldéhyde, eau, alcool 6,9
Formol 7,4 : Formaldéhyde, eau, alcool 7,4
Liquide de BOUIN : Formol, acide 1,4

picrique, acide acétique
Alcool 100° 3,6
Alcool 70° 8,6
Tableau 3 : pH de différentes solutions de fixation (Venteo et al. 2011)
De plus, dans le cas des analyses d’immunohistochimies réalisées sur tissus FFPE, trois
étapes de la fixation sont particulièrement critiques pour la qualité du prélèvement (Bellocq et
al. 2010) :
- L’incubation dans le fixateur doit suivre immédiatement la réalisation du prélèvement

afin de garantir la préservation de l’ADN et de l’ARN.
- La durée de fixation doit être d’au moins 6 heures pour une biopsie et entre 24 et 48h
pour une pièce opératoire
- La température d’enrobage en paraffine ne doit pas dépasser les 58°C

47
3. Le formol ou formaldéhyde, le fixateur le plus utilisé
Le formaldéhyde a été découvert en 1859 par Alexandre Boutlerov mais c’est le

biologiste et chimiste Auguste Trillar qui étudiera ses propriétés conservatrices entre 1888 et
1891. A partir du XXIe siècle, les solutions à base de formaldéhyde sont reconnues pour être
des solutions capables de fixer à long terme toutes sortes de tissus.
De nos jours, le formol est le nom commercial de la solution contenant comme agent
fixateur le formaldéhyde. La solution pure de formol contient environ 40% de formaldéhyde
dissout dans l’eau. La concentration classique de formaldéhyde utilisée pour la fixation d’un
tissu biologique est de 1/10e de la solution pure de formol commercial soit une concentration
de 4% de l’agent fixant. Le temps de fixation va dépendre de la taille de l’échantillon, un temps
de 12 heures est nécessaire pour les biopsies et 24 heures pour les pièces un peu plus grandes
(échantillons de 0,5 cm à 1 cm).
La fixation par le formol est longue et peut être réalisée à 4°C ou à température
ambiante. Une fixation à 4°C évite l'autolyse des tissus mais la cinétique de réaction est plus
rapide à température ambiante. Dans les laboratoires d’histologie, la fixation à température
ambiante est la plus utilisée.
Avec le temps, le formaldéhyde peut s’oxyder en acide formique qui a un effet délétère
sur les tissus. Les solutions tamponnées de formaldéhyde limitent la formation de cet acide mais
ne l’empêche pas totalement.
L’utilisation du formol présente de nombreux avantages :
- Une manipulation facile
- Un stockage à long terme simple et peu coûteux
- Une préservation de l’architecture et de l’intégrité des tissus et protéines afin de réaliser

différentes analyses complémentaires comme l’histologie, l’immunohistochimie, l’hybridation
in situ… Son utilisation est donc peu coûteuse pour de nombreuses applications
En revanche, comme tout produit chimique, le formol reste un produit dangereux. En

France, malgré sa quasi-omniprésence dans les laboratoires d’histopathologie, il est classé
CMR (classifications pour les cancérogènes, mutagènes, toxiques pour la reproduction)
avec ses dérivés. De plus, il a été placé en groupe 1 (cancérigène pour l’homme) par le Centre
international de recherche sur le cancer (CIRC), dépendant de l’OMS, depuis 2004, nécessitant
donc du matériel de protection adapté. De plus, si la fixation par un produit chimique comme
le formol ou le liquide de Bouin a pour effet de préserver les structures tissulaires, ils
polymérisent les protéines et dégradent certains composés cellulaires dont les acides nucléiques
(Le Guellec et al. 2009 & Hofman et al. 2009).
48
C. Le formol et l’ADN, une association compliquée
Si le formol est le fixateur le plus utilisé en histologie, son action les acides nucléiques
pose de nombreux problèmes et rend l’utilisation des prélèvements fixés compliquée pour la
biologie moléculaire. Le formol crée, en effet, des liaisons covalentes au sein de la molécule
d’ADN et entre les bases de l’ADN et les protéines porteuses d’un groupe aminé (Figure 9).
On appelle ces liaisons des « crosslink » ou « ponts ».
Figure 9 : La formation de liaisons covalentes au sein de la molécule d'ADN (A) et entre l'ADN
et les protéines (B) par le formaldéhyde (D’après Hiroshi et al. 2015)
49
Figure 10 : Effet de la fixation au formol sur la molécule d'ADN (D’après Benhattar 2009)
Ces liaisons covalentes sont réversibles par chauffage mais l’ADN se fragmente en
morceaux de 100 à 500 pb (Figure 10). D’ailleurs, dans l’étude de Granato et al. 2014, les
auteurs soulignent que plus le temps de fixation est long, plus l’ADN est détérioré, fragmenté
et de moins bonne qualité. L’équipe d’Alexey Gavrilov a comparé les profils d’amplifications
d’ADN de cellules fixées ou non fixées par le formol. La conclusion de ce travail est que le
degré de détérioration de l’ADN est d’environ 15-20% suggérant que la fixation au formol, bien
que très délétère pour la molécule d’ADN, n’exclut pas totalement les possibilités d’extraction
du matériel génétique et son utilisation (Gavrilov et al.2009).
En conclusion, les deux méthodes de conservation que sont la cryoconservation et la

fixation chimique ont des effets sur les tissus biologiques et les cellules elles-mêmes comme la
rétractation ou le durcissement. Chacune de ces méthodes à ses particularités et le choix de la
méthode dépend de la finalité de la conservation de l’échantillon : un diagnostic rapide où la
conservation des cellules viables passera par la congélation, un diagnostic histologique où une
conservation simple sur du long terme en préservant l’architecture tissulaire passera par un
fixateur chimique. Pour une bonne conservation du matériel génétique, la cryoconservation est
plus adaptée que la conservation par fixateur chimique. Cependant, dans le cadre d’études
scientifiques dites rétrospectives, il est essentiel de considérer l’histoire des 2 techniques de
conservation. En effet, la congélation est une technique très récente et très coûteuse en termes
de stockage des échantillons. En revanche, la technique de conservation par des fixateurs est
beaucoup plus ancienne et plus facile à mettre en œuvre pour le stockage des échantillons. Nous
disposons donc dans les laboratoires, musées et archives mondiales d’immenses collections de
tissus fixées, de valeur inestimable pour l’évolution des connaissances scientifiques.
50
III. Les techniques d’extraction d’ADN à partir d’échantillons
biologiques fixés par le formol puis inclus en paraffine
Les tissus FFPE (Formalin-Fixed, Paraffine Embedded), c’est-à-dire fixés par le formol puis
inclus en paraffine représentent une source inestimable de matériel pour le diagnostic lorsque
les tissus frais ne sont plus disponibles. Toutefois, travailler avec ces tissus demeure un
challenge en raison des ponts formés par le formol entre les protéines et les acides nucléiques
ainsi que les problèmes de fragmentations liées à la conservation des échantillons. De
nombreuses techniques ont été spécifiquement développées au cours des 30 dernières années
afin de pouvoir utiliser ce matériel. Tous les protocoles sont basés sur 3 étapes fondamentales :
- Le déparaffinage
- La lyse des tissus pour libérer l’ADN
- La purification et l’élution de la molécule d’ADN
De nombreux auteurs ont testés différentes méthodes pour chaque étape afin d’extraire un
ADN en quantité suffisante pour son amplification par PCR et surtout de bonne qualité malgré
l’inévitable fragmentation de la molécule causée par la fixation par le formol (Figure 11).
Figure 11 : Les 3 grandes étapes du protocole d'extraction avec diverses variations

possible
51
A. Les techniques de déparaffinage
Le déparaffinage est la première étape de l’extraction des échantillons FFPE. Bien que cette
dernière soit indispensable, elle reste laborieuse et peut induire la perte du matériel génétique
par le retrait des solvants. L’équipe de Huijsmans a tenté un retrait uniquement manuel afin de
limiter les contaminations associées au déparaffinage mais le résultat fut très décevant avec une
qualité finale très médiocre (Huijsmans et al. 2010). En effet, les restes de paraffine induisent
une inhibition de la PCR et donc rendent impossible toute amplification (Pikor et al. 2011). En
termes de qualité finale de la molécule d’ADN, de nombreux auteurs s’accordent à dire que le
déparaffinage est l’étape LA plus importante de tout le processus d’extraction (Weiss et al.
2011, Pikor et al. 2011). D’ailleurs, dans l’étude de Santos, un double déparaffinage, au lieu
d’un seul classiquement, permet une amélioration de la qualité de l’ADN extrait (Santos et al.
2009).
1. Le déparaffinage au Xylène – Ethanol
L’utilisation du xylène et de l’éthanol, la plus ancienne technique, reste largement

répandue pour le déparaffinage comme le montre l’annexe 1.
Le xylène, un hydrocarbure aromatique, est produit à partir du pétrole dans l’industrie

pétrochimique. Il est utilisé en solvant en tant que céruminolytique, déparaffineur dans
l’industrie du cuir et du caoutchouc. Malgré son efficacité instantanée dans la dissolution de la
paraffine, le xylène n’est pas sans danger. La manipulation de cet hydrocarbure doit
impérativement se faire sous une hotte car les vapeurs peuvent conduire à des maux de tête, des
vertiges voire des pertes de conscience. Il irrite fortement les muqueuses nasales et la peau ce
qui justifie le port de gants lors de sa manipulation.
La technique de déparaffinage repose sur un ou deux bains de xylène puis le retrait du
solvant. Des bains successifs d’éthanol à des concentrations décroissantes en partant de
l’éthanol 100%, jusqu’à l’éthanol 70% ou 65% servent ensuite à réhydrater les tissus. Selon les
auteurs, différents protocoles sont utilisés (Figure 12) :
A. Heikal et al. 2014
B. Alvares-Aldana et al. 2015 – Gouveia et al. 2015
Figure 12 : Différents protocoles de déparaffinage au Xylène-Ethanol
52
Une étape facultative : le lavage au PBS : Dans certains protocoles, une étape de
lavage est réalisée après le dernier bain d’éthanol afin, d’une part, de terminer la réhydratation
du tissus et, d’autre part, d’éliminer toute trace de solvant. Afin de réaliser ce lavage, le tampon
phosphate salin ou PBS pour Phosphate buffered saline en anglais, est idéal. Il s’agit d’un soluté
physiologique contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique, du phosphate
monopotassique et un peu de chlorure de potassium. Son action de rinçage s’avère utile afin
d’enlever toute trace de solvant avant la lyse des cellules.
Cette étape n’est pas indispensable mais semble favoriser un meilleur rendement final
et surtout une meilleure qualité d’ADN, moins contaminé en solvants (Gouveia et al. 2014).
En raison de la toxicité du xylène, de nombreuses autres méthodes ont vu le jour ces 20

dernières années dans le but d’assurer un déparaffinage de qualité tout en préservant la santé du
manipulateur.
2. Le déparaffinage avec divers solvants
De nombreux autres solvants peuvent être utilisés en alternative du xylène comme le

Tween 20, l’Hémo-D ou même des « Paraffine dissolver » de kit d’extraction.
Le Tween 20 est un détergent tensioactif non ionique stable et non toxique. Son utilisation
peut même être combinée avec une étape de chauffage au micro-onde permettant le
déparaffinage et un chauffage pour pré-casser les ponts dus au formol (Alvares-Aldana et al.
2015).
L’Hémo-D est un substitut du xylène à base de terpène. Sa toxicité est bien inférieure à
celle du xylène ce qui lui confère un avantage de taille. Il est souvent associé avec des lavages
à l’éthanol tout comme le xylène afin de réhydrater les tissus avant de poursuivre le processus
d’extraction d’ADN (Heikal et al. 2014).
Les paraffine dissolver sont des solvants non toxiques de composition exacte souvent
inconnue car inclus dans les kits d’extraction où la nature des tampons et solvants est tenue
secrète (Joly et al. 2011).
3. Le déparaffinage à l’huile minérale
Toujours dans l’optique de trouver une alternative au xylène, l’huile minérale s’est
développée et démocratisée petit à petit dans les techniques de déparaffinage.
L’huile minérale est issue de la distillation de certains combustibles fossiles comme le

pétrole ou le charbon. Elle est utilisée dans de nombreux domaines dont la mécanique,
électronique ou la cosmétique. Son absence de toxicité et sa simplicité d’emploi sont très
avantageuses. En effet, un seul bain suffit à retirer la paraffine et aucun lavage à l’éthanol n’est
nécessaire. Le nombre de manipulations étant réduit, le risque de contamination en solvant est
ainsi minimisé.
53
Elle est d’ailleurs employée dans plusieurs études (Figure 13) avec des résultats
satisfaisants en termes de qualité d’ADN extrait (Heikal et al. 2014, Joly et al. 2011, Lin et
al.2009, Rabelo-Goncalves et al. 2014).
Figure 13 : Le protocole d'emploi de l'huile minérale selon la littérature
4. Le « déparaffinage » par chauffage
Afin de s’affranchir de tout solvant et donc de contaminant, l’équipe de Steinau innove en

procédant à un chauffage à haute température ou « heat traitement » afin de faire fondre la
paraffine tout en provoquant la lyse des ponts crosslinks associés au formol. Le surplus de
paraffine surnageant est retiré ensuite manuellement (Steinau et al. 2017).
Le problème principal de cette technique réside dans l’impossibilité de retirer totalement la
paraffine fondue sans risquer de retirer du matériel génétique. Ainsi, l’échantillon ne contient
pas de solvant mais il contient des résidus de paraffine tout autant inhibiteurs des enzymes de
la PCR.
54
A. La lyse des tissus
La deuxième étape de l’extraction d’ADN consiste en la lyse des cellules afin de libérer leur
contenu, dont l’ADN, grâce à un tampon de lyse. Le rôle de ce tampon est, non seulement, de
détruite les membranes lipidiques cellulaires mais, également, de maintenir les molécules
d’intérêt dans un environnement stable. Ainsi, des détergents sont utilisés afin de briser les
structures membranaires et des sels sont utilisés afin de réguler l’acidité et l’osmolarité du lysat.
1. Les pré-traitements de lyse
Certains auteurs ont testé l’efficacité d’un traitement de préparation à la lyse tissulaire
afin de renforcer l’action de dénaturation des ponts formés par le formol en utilisant un simple
chauffage (Gilbert et al. 2007), l’utilisation du micro-onde (Singh et al. 2019) ou une solution
de carbonate de lithium LiCO3 (Gilbert et al. 2007).
Le chauffage à 98°C, pendant 15 minutes, après déparaffinage, s’est avéré utile en

favorisant la dénaturation des protéines et permettant l’obtention de fragments d’ADN plus long
in fine tout comme le passage au micro-onde : 2 minutes à 400 MW suffisent afin de fragiliser
les ponts formés par le formol puis 2 minutes à 800 MW afin de les lyser. En revanche,
l’utilisation de carbonate de lithium n’a pas permis d’augmentation de rendement ni
d’amélioration de la qualité de l’ADN extrait.
2. Les solvants de lyse tissulaire
Dès le début des années 1990, de nombreux protocoles virent le jour avec divers solvants
dont les tampons de lyse tissulaire et les détergents comme le SDS, sodium dodecyl sulfate ou
l’alcali avec, chacun, divers degrés de réussite d’extraction (Kocjan et al. 2015).
a. Les tampons à base de tris
Les tampons créent un environnement stable pour les protéines isolées et notamment
pour les acides nucléiques. Le Tris ou Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, est un composé
très courant de solutions tamponnées. L’ajout de sel à la solution permet d’établir une force
ionique dans chaque solution :
- Le tampon Tris-EDTA, souvent abrégé en tampon TE, est très communément utilisé
en biologie moléculaire dans les procédés de manipulation d’ADN ou d’ARN. Il
contient du Tris additionné d’un sel EDTA ou Ethylène diamine tétra acétique, un
chélateur des ions magnésiums Mg2+.
- Le tampon tris-HCl est également très courant. Il contient du tris additionné d’un sel
HCl
On retrouve leur utilisation dans de nombreuses études anciennes et récentes dont Alvares-
Aldana et al. 2015 ou Wienecke et al. 1993, preuve de leur utilisation conservée à travers
l’évolution de la biologie moléculaire au cours du XXIe siècle.
55
b. Les détergents
Les détergents sont des agents tensio-actifs avec une partie hydrophobe et une partie
hydrophile. Ils sont largement utilisés afin de lyser les membranes cellulaires ou bactériennes,
particulièrement chez les bactéries Gram négatives.
Parmi les plus utilisés dans les protocoles d’extraction, nous pouvons citer le SDS ou
sodium dodecyl sulfate, un détergent dénaturant ionique et le Tween 20, un tensioactif non
ionique. Leur action de dissociation ADN-Protéine (Joly et al. 2011) aiderait à la coupure des
ponts formés par le formol lors de l’étape de fixation du tissu.
Leur utilisation est combinée avec un tampon de lyse :
- Tampon TE et SDS (Alvares-Aldana et al. 2015)

- Tampon TE et Tween 20 (Huijsman et al. 2010, Ludyga et al. 2012)
- Tampon Tris HCl et SDS (Gilbert et al. 2007, Shi et al. 2002, Wienecke et al. 1993)
- Tampon Tris HCl et Tween 20
c. Les alternatives aux tampons et détergents
Certains auteurs se sont distingués par leurs essais sur l’étape de lyse cellulaire. Gilbert
et ses collaborateurs (Gilbert et al. 2007) ont testés, notamment, la glycine, un acide aminé
ayant des propriétés de dégradation du formol. L’alcali chaud (pH alcalin supérieur à 9 et
120°C) a également été testé, non pas en alternative mais en complément de la solution de lyse,
déjà à base de tampon et détergent, afin de renforcer l’action de dénaturation des protéines liées
par crosslink par le formol (Shi et al. 2002, Gilbert et al. 2007). Les résultats de ces essais furent
décevants avec un rendement final altéré.
3. Une étape fondamentale : l’incubation avec la Protéinase K
La protéinase K est une enzyme endopeptidasique communément employée en biologie

moléculaire pour la digestion des protéines et l’élimination des contaminants lors de la
préparation des acides nucléiques. Elle permet la digestion des cellules et l’extraction d’ADN
et d’ARN en les isolant des tissus biologiques (Figure 14).
Figure 14 : Action de la Protéinase K sur l’ADN
56
Son action est absolument essentielle dans le protocole d’extraction comme le prouve
l’étude de Huijsman ; Ce dernier compare différents protocoles, avec et sans digestion à la
protéinase K, et arrive à la conclusion que tous ceux n’ayant pas eu cette étape aboutissent à
l’impossibilité d’amplifier l’ADN extrait (Huijsman et al. 2010).
Deux facteurs jouent sur la digestion enzymatique de la protéinase K : la température et

la durée d’incubation.
.
a. L’influence de la température d’incubation
La question de la température idéale d’incubation a suscité l’intérêt dans de nombreuses

études ces dernières années (Tableau 4) :
Température d’incubation Résultats Source
Qualité médiocre à mauvaise

37°C de l’ADN Alvares-aldana et al. 2015
Quantité insuffisante
Carlson et al. 2018

55°C Qualité bonne à médiocre Heikal et al. 2014
Janecka et al. 2015

56°C Qualité bonne à médiocre Okello et al. 2010
Denison et al. 2014
Qualité mauvaise, trop forte Bonin et al. 2013

>65°C température Gilbert et al. 2007
Tableau 4 : Influence de la température d'incubation de la Protéinase K sur la qualité de l'ADN

et détermination d’une température dite « idéale »
Les résultats de ces études ont montré qu’une température comprise entre 55 et 60°C
était optimale pour l’étape de digestion de la protéinase K. Au-delà de 65°C, l’intégrité de la
molécule d’ADN n’est pas assurée (Bonin et al. 2013).
57
b. L’influence de la durée d’incubation
Si les auteurs s’accordent relativement aisément sur une fourchette de température

idéale d’incubation, cela est loin d’être le cas pour la durée d’incubation. De nombreux essais
ont été réalisés entre 1h et 72h d’incubation avec des résultats très hétérogènes (Tableau 5).
Durée d’incubation Résultats Sources

Bonne qualité et quantité
1h (déparaffinage huile Heikal et al. 2014
minérale)
Mauvaise qualité Carlson et al. 2018

3h 48h > 3h Okello et al. 2010
Résultats variables : Bonin et al. 2013

12h Au moins 12h nécessaire Janecka et al. 2015
Largement utilisé : Janecka et al. 2015

Overnight (16h) Résultats similaires à 12h Okello et al. 2010
Denison et al. 2014
Bonne qualité et quantité Weiss et al. 2011
48h Au moins 48h nécessaire Okello et al. 2010
Meilleure qualité par rapport Sengüven et al. 2014

72h à overnight (16h)
Tableau 5 : Influence de la durée d’incubation de la Protéinase K sur la qualité de l’ADN
D’après les résultats du tableau, la détermination d’une durée idéale semble donc
difficile : alors qu’une heure semble donner de bons résultats pour l’équipe d’Heikal (Heikal et
al. 2014), l’étude d’Okello (Okello et al. 2010) recommande au moins 48h d’incubation et celle
de Sengüven (Sengüven et al. 2014) plutôt 72h. Selon l’étude de Kate Reid, le prolongement de
la durée d’incubation permettrait d’augmenter la quantité finale d’ADN amplifiable mais
augmenterait également la concentration d’inhibiteurs de la PCR par accumulation de protéines
digérées (Reid et al. 2017).
Dans ces études, les tissus utilisés sont de nature diverse, expliquant l’hétérogénéité des
résultats. Il semble utile de tester plusieurs durées d’incubation lors de ses mises au point de
protocoles et de sélectionner celle la plus adaptée à ses échantillons.
58
B. La purification de l’ADN
L’étape de purification de l’ADN constitue véritablement l’extraction en elle-même. A

ses début, l’extraction était complexe, chronophage, utilisant des solvants toxiques, avec un
rendement final faible. De nombreuses améliorations ont été mises au point pour la rendre
facile, accessible et efficace (partie bibliographique I. 2). Par soucis de simplification, seules
les méthodes au Phénol-chloroforme et les kits utilisant des colonnes de silice sont présentés en
détails dans les paragraphes suivants, ces dernières étant utilisées dans la partie expérimentale.
1. L’extraction au phénol-chloroforme, la technique de référence
L'extraction au phénol-chloroforme fait intervenir un mélange contenant du phénol, du

chloroforme et de l’alcool isoamylique (ratio de 25 : 24 : 1), commercialisée en prêt à l’emploi.
Le phénol est un acide carbolique qui dénature rapidement les protéines, mais qui est très
corrosif, toxique et inflammable.
Après l’étape de lyse de l’échantillon, le mélange phénol-chloroforme est directement

ajouté à l'échantillon. Après une étape de centrifugation, une émulsion biphasique est obtenue.
La couche hydrophile supérieure contient l'ADN, l'ARN ainsi que d’autres composés
hydrophiles tels que les sels ou les oligosaccharides. La couche hydrophobe inférieure est
composée de solvants organiques, de débris cellulaires, de protéines et d'autres composés
hydrophobes. L'ADN contenu dans la couche hydrophile est, ensuite, précipité avec de l’éthanol
ou de l’isopropanol et une étape de centrifugation (Figure 15).
Figure 15: L'extraction au Phénol Chloroforme (1987)
Malgré la toxicité des solvants utilisés, son utilisation reste le « Gold Standard » pour
la comparaison avec de nouvelles méthodes d’extraction (Alvares-Aldana et al. 2015, Rabelo
Goncalves et al. 2014). Cette méthode douce permet en effet de conserver l’intégrité de l’ADN
et reste une méthode de choix pour isoler des ADN de grande taille (jusqu’à 1 Mbp). Cependant,
c’est une méthode complexe, chronophage, laborieuse et les acides nucléiques extraits ne sont
pas d’une qualité suffisante pour les techniques modernes comme le séquençage (Tan et al.
2009, Dahm, 2005).
59
2. L’utilisation de colonnes de silice
L’introduction des technologies d’adsorption sur membrane ou colonne de silice

apparaît seulement en 1996 et révolutionne complètement l’étape de purification des acides
nucléiques grâce au gain de temps de manipulation et à la diminution du risque toxique (Kocjan
et al. 2015).
Les matrices de silice ont des propriétés uniques de liaison à l'ADN. Elles sont chargées
positivement et ont une forte affinité avec la charge négative du squelette de l'ADN. Des
conditions salines et un pH ≤ 7, obtenus en utilisant des cations de sodium, permettent une
liaison étroite à l'oxygène chargé négativement dans le squelette phosphate de l'ADN.
Certaines protéines et autres composés biochimiques peuvent également se lier à la

colonne, mais ils sont ensuite éliminés en utilisant des tampons de lavage contenant des agents
compétitifs couplés à des étapes de centrifugation. Enfin, l’élution à l’aide d’une solution
alcaline, comme le tampon Tris-EDTA ou tampon TE, permet la récupération des acides
nucléiques purifiés (Chacon et Griffiths 2014).
Ces étapes sont schématisées (Figure 16) :
Figure 16 : Extraction d'acides nucléiques sur support solide (exemple de la colonne de Silice)
Etape 1 : Lyse cellulaire par un tampon de lyse
Etape 2 : Adsorption des acides nucléiques sur la phase solide (colonne de Silice)
Etape 3 : Lavages successifs permettant la purification des acides nucléiques
Etape 4 : Elution au tampon TE (Tris-EDTA) et récupération des acides nucléiques

purifiés
60
La plupart des protocoles prennent environ 40 minutes à 1 heure, produisant des
rendements élevés d'ADN avec une contamination minimale. Face à la grande simplicité de la
technique et ces résultats performants, de nombreux kits commerciaux utilisant des supports à
base de silice sont fabriqués dans le commerce. En annexe 1, un tableau non exhaustif récapitule
les différents protocoles testés et comparés dans la littérature ainsi que leurs résultats en termes
de quantité d’ADN et qualité.
Parmi tous les kits, le plus répandu dans la littérature reste le kit QIAGEN QIAamp
DNA FFPE Tissue kit (Alvares aldana et al. 2015, Carlsson et al. 2018, Ludyga et al. 2012,
Patel et al. 2017, Sarnecka et al. 2019, Heikal et al. 2014). Les résultats obtenus sont
globalement bons avec un ADN en quantité satisfaisante et surtout de bonne qualité.
61
C. Le dosage et l’évaluation de la qualité de l’ADN extrait
1. Le dosage en spectrophotométrie
A la fin d’une extraction d’ADN, il est essentiel de quantifier et d’analyser la pureté des
acides nucléiques extraits. La technique la plus répandue est la spectrophotométrie qui mesure
l’absorbance des acides nucléiques à 260nm, dans l’ultraviolet. De nos jours, de nombreux
spectrophotomètres spécialement dédiés à l’analyse du matériel génétique comme le
Nanodrop™, permettent de réaliser des spectres d'absorbance pour micro-volume (de l’ordre
du µL) sans cuvette ni capillaire. A partir de ces spectres d’absorbance, la concentration et la
pureté d’un échantillon extrait sont déterminés par l’appareil. C’est une méthode simple, rapide
et précise.
Lors de sa mesure, le spectrophotomètre donne le dosage de la solution ainsi qu’une courbe

d’absorption présentée (Figure 17).
Figure 17 : Le spectre d'absorption d'une solution pure d'ADN
Un changement de profil de la courbe est symbole d’impuretés soit en protéines, soit en

solvants, soit les deux. En effet, d’autres composés présents lors de l’extraction absorbent à des
longueurs proches de celles des acides nucléiques : les protéines à 280nm et les solvants à
230nm. En plus de la concentration en acides nucléiques, l’appareil donne ainsi 2 rapports : les
rapports 260nm/280nm et 260nm/230nm donnant une idée de la qualité des acides nucléiques.
- Le rapport 260nm/280nm est utilisé pour évaluer la contamination en protéines de

la solution d’acides nucléiques. On considère une solution pure lorsque le ratio 260/280
est compris entre 1,8 et 2.
- Le rapport 260nm/230nm est le deuxième indicateur de pureté en indiquant la

contamination en solvants comme le phénol, d’EDTA, l’éthanol … Un ratio 260/230
compris entre 1,8 et 2,2 indique une bonne pureté de l’échantillon.
62
2. L’évaluation du degré de fragmentation de l’ADN : le bio-analyseur
L’analyse par spectrophotométrie est indispensable pour obtenir des informations sur la
quantité et la qualité de l’ADN extrait. Cependant, le spectrophotomètre ne donne pas
d’information concernant la fragmentation des acides nucléiques présents au sein de
l’échantillon. L’analyse par un bio-analyseur, qui permet le contrôle de la qualité de l’ADN,
selon des profils basés sur la taille des produits, est donc intéressante. Cet appareil, développé
pour remplacer l’électrophorèse sur gel, permet un gain de temps considérable. Il quantifie la
concentration dans l’échantillon et détermine la longueur des fragments présents. Il est ainsi
devenu un outil presque indispensable au quotidien dans les laboratoires de biologie
moléculaire et de biochimie.
Un exemple de profil obtenu avec un bio analyseur est présenté (Figure 18). L’appareil
donne un profil de détection de la fluorescence par rapport au temps de migration. Une échelle
de taille permet ainsi d’évaluer la fragmentation globale des acides nucléiques présents dans
l’échantillon.
.
Figure 18 : Profil de l'échelle de taille ADN par un bio analyseur et son gel correspondant
Conclusion
Des techniques diverses et variées ont été développées afin de pouvoir utiliser une
source immense de matériel biologique stockés au fils des derniers siècles : les prélèvements
fixés au formol et inclus en paraffine. La bibliographie montre que l’évolution de ces techniques
permet aujourd’hui d’obtenir du matériel de qualité. Cependant, en nous basant sur la trentaine
d’articles analysés et présentés en annexe 1 et sur l’hétérogénéité de leurs résultats, il nous est
impossible de déterminer quelle technique d’extraction sera la plus adaptée aux échantillons
cutanés inclus en paraffine disponibles au laboratoire d’histologie de VetAgro Sup. C’est donc
l’objectif de la partie expérimentale de ce travail.
63
64
PARTIE 2 – ETUDE EXPERIMENTALE
65
66
I. Introduction et objectifs de l’étude
Le développement de la biologie moléculaire ouvre des possibilités immenses en termes

de recherche et de diagnostic dans le domaine médical tant humain que vétérinaire. Les
laboratoires médicaux disposent de nombreux blocs en paraffine stockés qui constituent une
source précieuse de matériel pour ces 2 axes de développement. Cependant, l’utilisation de ce
matériel est freinée par les difficultés liées à l’extraction du matériel génétique. Il est, en
effet, bien établi que la fixation par le formol et l’analyse en biologie moléculaire ne font pas
bon ménage. La fixation par le formol des échantillons génère des fragmentations du matériel
génétique ainsi que des crosslinks entre les bases de l’ADN ou les protéines qui vont altérer sa
qualité. Si certaines de ces altérations, comme les crosslinks, sont réversibles, l’extraction reste
un challenge pour trouver les bonnes combinaisons permettant d’obtenir du matériel en
quantité suffisante et de bonne qualité.
Ces dernières années, de nombreux kits spécifiquement dédiés à l’extraction de ce matériel

génétique particulier ont été développés avec de nouvelles méthodes de déparaffinage comme
l’huile minérale ou l’utilisation de colonne spécifique pour la purification de l’ADN.
Cependant, les données de la littérature comparant ces différents kits donnent des résultats très
variables voire contradictoires quant à la meilleure technique à utiliser. Il semble que les
résultats soient dépendants de nombreux facteurs tels que le type de tampon utilisé lors de la
fixation, le temps de fixation, les conditions de préparation et de stockage des blocs, l’origine
du tissu utilisé… Ces facteurs sont souvent propres à chaque laboratoire, suggérant donc que
chaque laboratoire doive sélectionner le kit le plus approprié à ses échantillons et à sa
problématique.
Au sein du laboratoire de dermatologie de VetAgro Sup, nous disposons de nombreux

prélèvements de peaux qui pourraient fournir des informations précieuses dans le cadre de la
recherche vétérinaire sur les affections cutanées. De même, l’utilisation de la biologie
moléculaire pour le diagnostic serait un atout considérable pour le service. Mes objectifs de
thèses découlent de ces 2 axes :
-Le premier objectif de ce travail a été de déterminer le protocole d’extraction d’ADN le

plus approprié à nos échantillons de peaux, afin de pouvoir étudier ce matériel génétique
dans l’activité de recherche du laboratoire, par exemple pour l’étude des mutations impliquées
dans diverses maladies cutanées. Pour cela, nous avons extrait l’ADN de biopsies cutanées de
chiens avec 6 kits différents puis comparé la qualité de l’amplification, par qPCR, de 2 gènes
de ménages courants chez le chien.
-Le second objectif de ce travail a été de voir s’il était possible d’utiliser cette technique
de qPCR comme outil de diagnostic pour identifier la présence de bactéries dans une
biopsie cutanée canine. En effet, les micro-organismes sont généralement identifiés par leurs
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques. Cependant, les procédures
mises en œuvre prennent du temps et donnent parfois des résultats incorrects ou non concluants.
L'analyse ADN est de plus en plus utilisée pour l'identification des micro-organismes et la mise
au point de cette technique serait d’un intérêt considérable pour le laboratoire. Pour cela, nous
avons extrait avec 6 kits différents l’ADN de biopsies cutanées de chiens, réalisées en zones
d’infection bactérienne, puis nous avons recherché par qPCR la présence d’une séquence
universelle de l’ADN bactérien 16S.
67
II. Matériel et méthode
A. Choix des paramètres de l’étude
1. Choix des échantillons FFPE
Pour cette étude, 8 blocs contenant des biopsies cutanées canines ont été sélectionnés dans
les archives du laboratoire d’histopathologie de VetAgro Sup. Les prélèvements ont été réalisés
entre 2015 et 2020. Lors de la préparation de ces blocs, les biopsies avaient été immédiatement
plongées dans le formol après prélèvement, incubées 24h puis incluses en paraffine et stockées
au laboratoire dans une pièce spéciale. Le diagnostic de dermatose bactérienne a été confirmé
par examen histopathologique.
Parmi ces blocs, 6 (blocs 1 à 6) correspondent à un diagnostic d’infection bactérienne de
type folliculite ou furonculose ; 2 (blocs 19 et 20) à un diagnostic de tumeur bénigne que nous
assimilerons à de la peau saine (Tableau 6).
Numéro Année de Race Diagnostic

Laboratoire Prélèvement Sexe histologique
Age
Dogue allemand Folliculite & furonculose
BLOC 1 19 – 0769 2019 Mâle castré, 6 ans et demi bactérienne
Jack Russel Terrier Pyodermite profonde

BLOC 2 19 – 0564 2019 Femelle, 13 ans bactérienne
Labrador Folliculite & furonculose

BLOC 3 18 – 1519 2018 Mâle entier, 6 ans et demi bactérienne
Bull Terrier Dermatite

BLOC 4 16 – 1709 2016 Mâle entier, 1 an pyogranulomateuse
bactérienne
Labrador
BLOC 5 16 – 0752 2016 Mâle entier, 7 ans Pyodermite bactérienne
Caniche Dermatite
BLOC 6 15 – 0732 2015 Mâle entier, 13 ans pyogranulomateuse
nécrosante bactérienne
BLOC 19 19 - 1672 2019

Biopsies cutanées canines saines de grande taille
BLOC 20 20 - 292 2020
Tableau 6 : Choix des 6 blocs inclus dans l’étude avec le diagnostic histologique associé et choix
des 2 blocs supplémentaires
68
Comme observé sur la figure 19, la taille des biopsies est variable pour chaque bloc et
surtout très faible, de l’ordre du millimètre, notamment pour le bloc 6. Les cas sélectionnés
comportent donc plusieurs biopsies par blocs et 2 blocs par cas afin de disposer de matériel
en quantité suffisante pour toutes les analyses.
Figure 19 : Blocs FFPE de biopsies cutanées canines choisis pour l’étude
Pour tous ces blocs, la présence de bactéries visibles au microscope lors du diagnostic
histologique était un critère essentiel. En effet, lors de la mise au point du test de dépistage de
l’ADN bactérien, nous devions être certains de travailler sur des échantillons positifs. Un
exemple des observations réalisées au microscope après coloration HE est présenté figure 20.
Figure 20 : Observation d'une coupe de biopsie d’un furoncle et de son infiltrat inflammatoire
coloré en HE (x 1000) , bloc 4 (© Didier Pin)
Remarque : dans le but d’améliorer le diagnostic et de faciliter l’observation au microscope,

différentes colorations ont été testées au laboratoire, notamment un kit de coloration de Gram
(Abcam) spécifiquement développé pour des coupes en paraffine. Malheureusement, aucun de
nos essais n’a donné de résultat probant, les nombreuses étapes associées à ces colorations
spécifiques entrainant la perte des bactéries présentes sur la peau. Ces essais ont ainsi confirmé
l’intérêt de mettre au point une technique de diagnostic rapide par qPCR.
69
Dans le cas des 2 blocs de peau « saine » présentés figure 21, la taille des prélèvements
est beaucoup plus importante que pour les blocs 1 à 6. Un seul bloc a donc été utilisé pour cette
étude.
Figure 21 : Blocs de biopsies cutanées canines « saines » choisis pour l’étude
2. Choix des protocoles et des conditions d’extraction
A partir de la littérature (Annexe 1), 6 protocoles ont été choisis, présentés dans le
tableau suivant (Tableau 7).
Nom du Protocole Nom du KIT Fournisseur Déparaffinage Purification ADN
ReliaPrep FFPE Promega® Huile minérale COLONNE =

PROMEGA qDNA Miniprep Cellulose binding
System matrix
QIAGEN QIAamp DNA FFPE Qiagen® Xylène Ethanol COLONNE =

Tissus Silica binding matrix
QIAGEN BIS QIAamp DNA FFPE Qiagen® Deparaffinization COLONNE =
Tissus solution Silica binding matrix
Nucleospin DNA Macherey Paraffin Dissolver COLONNE =
MACHEREY isolation from FFPE Nagel® Silica binding matrix
samples
MasterPure Complete Euromedex Xylène Ethanol Par Précipitation =
EPICENTRE DNA and RNA pour MCP Buffer
purification kit Epicentre®
PHENOL - Sigma® Xylène Ethanol Phénol-chloroforme
CHLOROFORME puis précipitation à
l’isopropanol
Tableau 7 : Choix des six protocoles testés dans l'étude et leur caractéristiques respectives
70
Le choix de ces protocoles est basé sur plusieurs critères :
Les kits commerciaux ont été sélectionnés en fonction des données de la littérature. Le
kit Qiagen QIAamp est le plus utilisé dans les publications. Les autres kits ont été sélectionnés
de façon à avoir une grande la diversité des méthodes de déparaffinage et de purification de
l’ADN, l’idée étant d’avoir un panel des différentes méthodes disponibles (Tableau 8).
Concernant les méthodes de déparaffinage, le Kit Promega nous a permis de tester

l’huile minérale, les kits Qiagen bis et Macherey de tester une solution propre aux fournisseurs,
et les kits Qiagen, Phénol-chloroforme et Epicentre la méthode classique à l’aide de solvants
ici, le xylène et l’éthanol.
Au niveau des méthodes de purification de l’ADN, nous avons choisi de comparer des
kits faisant intervenir des colonnes (Qiagen, Promega et Macherey) versus des méthodes de
précipitation du matériel génétique (Epicentre et Phénol-chloroforme).
Avec le kit Qiagen nous avons eu la possibilité de comparer de manière ciblée l’impact
de la méthode de déparaffinage sur l’extraction. En effet, ce kit est utilisable soit après
traitement au xylène / éthanol soit après utilisation d’une solution de déparaffinage mise au
point par le fournisseur et disponible séparément. Ces 2 protocoles ont été nommés Qiagen &
Qiagen Bis respectivement.
Le Kit Epicentre a été sélectionné car il s’agit du kit de référence utilisé par notre
partenaire du centre Léon Bérard de Lyon avec des résultats très concluants sur des blocs en
paraffine.
Enfin, nous avons choisi de comparer les kits commerciaux modernes à la méthode
traditionnelle de référence, le Phénol-chloroforme, également décrite dans la littérature
comme donnant de bons résultats malgré l’utilisation de solvants toxiques.
Choix des variations à partir du protocole standard :
Tous les kits sélectionnés ont été utilisés en suivant le protocole décrit par le fournisseur.
Quelques variations étaient néanmoins possibles notamment le temps de lyse des échantillons
en début de protocole. En effet, la phase d’incubation avec la protéinase K ne fait pas l’objet
d’un consensus dans la littérature. En nous basant sur les données publiées, nous avons choisi
de tester en priorité une durée d’incubation de :
- 16h dite « Overnight », majoritairement utilisée.
- Une durée plus courte de 2h
- Une durée plus longue, de 48h, également décrite dans la littérature
71
3. Choix des méthodes d’analyse de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait
a. Spectrophotométrie
Après extraction, l’analyse de la quantité et de la qualité de l’ADN a été réalisée via le

spectrophotomètre BioDrop DUO UV (Thermo Fisher Scientific®) illustré Figure 22.
L’analyseur nécessite une très petite quantité de matériel (d’1 à 2 µL) déposée au centre de
la machine. Cette dernière donne alors la concentration de l’ADN en ng/µL, ainsi que la courbe
de spectrophotométrie obtenue entre les longueurs d’onde 220nm et 320nm.
Les ratios A260/280 et A260/230 donnent une information sur la qualité du matériel dosé :
-Le ratio entre l’absorbance à 260nm (A260) et l’absorbance à 280nm (A280) est un indicateur
de la contamination en protéines. Ce ratio doit être compris entre 1,8 et 2 pour une bonne
qualité de l’ADN.
-Le ratio entre l’absorbance à 260nm (A260) et l’absorbance à 230nm (A230) est un indicateur
de la contamination en solvants : Ce ratio doit être proche de 2. Plus la valeur est inférieure
à 2 plus la contamination en solvants est importante.
Figure 22 : Spectrophotomètre BioDrop
(Thermo Ficher Scientific®)
72
b. Migration sur gel d’agarose
Le spectrophotomètre ne donnant aucune information concernant la fragmentation de

l’ADN post-extraction, une analyse au Bioanalyseur aurait été pertinente. Nous avions prévu
cette analyse chez l’un de nos partenaires, basé à Clermont Ferrand. Malheureusement, en
raison du contexte sanitaire, l’analyse n’a pu être réalisée. Afin de palier à ce problème, nous
avons visualisé la fragmentation de l’ADN de manière grossière via une électrophorèse sur gel
d’agarose (Figure 23).
Figure 23 : Cuve d’électrophorèse permettant la migration des échantillons d’ADN sur gel
d’agarose.
c. Réalisation de qPCR
Afin de tester la qualité des échantillons d’ADN extraits, un essai d’amplification par
qPCR est réalisé dans de nombreuses études bibliographiques. En effet, cette analyse permet
d’établir, d’une part, si le matériel génétique n’est pas trop fragmenté pour être exploité et,
d’autre part, s’il ne contient pas trop de résidus de solvants ou d’autres inhibiteurs de PCR. Pour
cela, l’appareil que nous avons utilisé est un thermocycleur qTOWER (Eurobio ®).
Par rapport à notre premier axe de recherche nous avons choisi d’amplifier 2 gènes de
ménage utilisés dans des études précédentes au laboratoire : les gènes GAPDH et HPRT. Ces
gènes sont ceux de la glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et de l’hypoxanthine
guanine phosphoribosyltransférase, respectivement. Leurs séquences, tirées de la littérature
sont les suivantes :
-Pour GAPDH : Forward 5’ – 3’ : TGT-CCC-CAC-CCC-CAA-TGT-ATC

Reverse 3’ – 5’ : CTC-CGA-TGC-CTG-CTT-CAC-TAC
-Pour HPRT : Forward 5’ – 3’ : AGC-TTG-CTG-GTG-AAA-AGG

Reverse 3’ – 5’ : TTA-TAG-TCA-AGG-GCA-TAT
Pour la détection de bactéries dans nos échantillons, nous avons choisi le kit Bacterial
16S rDNA PCR Kit Fast (800), conçu pour amplifier une région d'ADN spécifique (environ
0,8kb) dans la région de l'ADNr 16S bactérien. Cette zone est largement utilisée du fait de sa
structure très conservée dans toutes les espèces bactériennes. Le mix contient une enzyme
haute-fidélité afin de permettre à terme le séquençage du produit amplifié. Les séquences
obtenues pourront ensuite être comparées aux bases de données de séquences des micro-
organismes et ainsi permettre l’identification de la bactérie impliquée.
73
B. Protocoles expérimentaux de l’étude
1. Préparation des échantillons à partir des blocs
Les extractions d’ADN ont été réalisées à partir de coupes de 8µm réalisées au
microtome. Chaque cas sélectionné comprend 2 blocs. Deux coupes ont été réalisées par bloc
puis rassemblées dans un tube Eppendorf de 1,5mL. Au total, chaque tube contient 4 coupes de
8µm. Ces tubes ont été stockés à 4°C jusqu’à utilisation.
2. Identification des tubes
Chaque tube a été identifié par un chiffre, correspondant au numéro du bloc, et une ou
deux lettres, correspondant au protocole réalisé. Un code couleur est établi : les tubes annotés
en bleu correspondent au protocole standard, ceux en rouge à 2h d’incubation de la protéinase
K et ceux en noir, à 48h d’incubation. Une étoile est ajoutée après la lettre s’il s’agit du tube
duplicat de l’extraction. (Tableau 8).
PROTOCOLE STANDARD
Qiagen Qiagen Macherey Promega Phénol- Epicentre
Bis chloroforme
Bloc 1 1Q 1Qbis 1M 1P 1PC 1E
1Q* 1Qis* 1M* 1P* 1PC* 1E*
2Q* 2Qbis* 2M* 2P* 2PC* 2E*
3Q* 3Qbis* 3M* 3P* 3PC* 3E*
4Q* 4Qbis* 4M* 4P* 4PC* 4E*
5Q* 5Qbis* 5M* 5P* 5PC* 5E*
6Q* 6Qbis* 5M* 6P* 6PC* 6E*
Bloc 19 19Q 19M 19P 19PC 19E
Bloc 20 20Q 20M 20P 20PC 20E
VARIATION 2H
Bloc 2 2Q(2) 2M(2) 2P(2) 2PC(2) 2E(2)
Bloc 3 3Q(2) 3M(2) 3P(2) 3PC(2) 3E(2)
Bloc 4 4Q(2) 4M(2) 4P(2) 4PC(2) 4E(2)
Bloc 5 5Q(2) 5M(2) 5P(2) 5PC(2) 5E(2)
VARIATION 48H
Bloc 2 2Q(48) 2M(48) 2P(48) 2PC(48) 2E(48)
Bloc 3 3Q(48) 3M(48) 3P(48) 3PC(48) 3E(48)
Bloc 6 6Q(48) 6M(48) 6P(48) 6PC(48) 6E(48)
Tableau 8 : Annotation des différents tubes selon le bloc et le protocole utilisé
74
3. Protocoles d’extraction
Tous les protocoles d’extraction sont présentés en détails en Annexe (Annexe 2 à 7) et

sont décrits brièvement ci-dessous. A noter que chaque kit comporte son propre tampon de lyse,
sa protéinase K et ses propres tampons de lavage.
a. Protocole PROMEGA ReliaPrep FFPE DNA
Les tissus ont été déparaffinés à l’huile minérale à 80°C pendant 2 minutes puis lysés
dans du tampon de lyse LBA + protéinase K à 56°C pendant 16h (Overnight), 2h ou 48h. Cette
étape de digestion a été suivie par une étape d’incubation d’1h à 80°C pour éliminer les cross
links. Le lysat a ensuite été déposé sur une colonne à matrice de silice permettant la fixation
de l’ADN et donc sa purification. Après 2 lavages, le matériel génétique a été élué avec 40µl
de tampon d’élution.
b. Protocole QIAamps DNA FFPE Tissues (QIAGEN)
Pour ce kit, 2 protocoles de déparaffinage ont été testés. Pour le protocole noté
QIAGEN, les tissus ont été déparaffinés au Xylène-Ethanol par 2 lavages en xylène suivis de
3 lavages en éthanol (100%, 90% puis 70%). Pour le protocole noté QIAGEN BIS, les tissus
ont été déparaffinés 5 minutes à 56°C avec une solution spécifique développée par le
fournisseur. Après cette étape, les tissus ont été traités de manière similaire : les tissus ont été
lysés dans du tampon ATL + protéinase K à 56°C pendant 16h (Overnight), 2h ou 48h.
L’élimination des cross-links a été réalisée par une incubation d’1h à 80°C. Comme
précédemment, le lysat a ensuite été déposé sur une colonne à matrice de silice. Après 2
lavages, le matériel génétique a été élué avec 40µl de tampon d’élution.
c. Protocole MACHEREY NAGEL, Nucleospin DNA isolation from FFPE samples
Les tissus ont été déparaffinés à l’aide d’un « Paraffine Dissolver » contenu dans le
kit et une incubation à 60°C pendant 5 minutes. Les tissus ont ensuite été lysés dans du tampon
FL + protéinase K à 56°C pendant 16h (Overnight), 2h ou 48h. L’élimination des cross-links a
été réalisée grâce à un tampon spécifique (tampon D-Link) et une incubation à 90°C pendant
30 minutes. Le lysat a ensuite été déposé sur une colonne à matrice de silice et, après 2 lavages,
le matériel génétique a été élué avec 40µl de tampon d’élution.
d. Protocole EPICENTRE, MasterPure Complete DNA and RNA purification kit
Les tissus ont été déparaffinés par 2 lavages en xylène suivis de 3 lavages en éthanol
(100%, 90% puis 70%) puis lysés dans du tampon de lyse + protéinase K à 56°C pendant 16h
(Overnight), 2h ou 48h. Les protéines et autres débris tissulaire ont ensuite été précipités grâce
au tampon MPC. Le matériel génétique a quant à lui été précipité avec de l’isopropanol. Après
un lavage en éthanol, l’ADN a été repris dans 40µL de tampon d’élution.
75
e. Protocole PHENOL CHLOROFORME
Les tissus ont été déparaffinés par 2 lavages en xylène suivis de 3 lavages en éthanol
(100%, 90% puis 70%) puis lysés dans du tampon de lyse + protéinase K à 56°C pendant 16h
(Overnight), 2h ou 48h. Le lysat a ensuite été mélangé à du phénol chloroforme-alcool
isoamylique. Le matériel génique contenu dans la phase aqueuse surnageante obtenue après
centrifugation a été précipité au froid avec de l’isopropanol. Après un lavage en éthanol, l’ADN
a été repris dans 40µL de tampon d’élution.
f. Traitement et stockage des échantillons d’ADN après extraction
Chaque protocole se termine par une ou plusieurs étapes de lavages contenant des solvants,
notamment de l’éthanol. Afin d’éliminer au maximum ces solvants, source de contamination,
tous les ADN repris dans le tampon d’élution ont été incubés 5min à 80°C, bouchon ouvert.
Les échantillons d’ADN ont ensuite été aliquotés dans 3 petits tubes à raison de 10µl/tube puis
stockés à -20°C. Les 10µL d’ADN restant ont été conservés à 4°C pour le dosage au Biodrop.
4. Dosage des échantillons au BioDrop
La quantité de matériel génétique extrait ainsi que sa pureté ont été évaluées grâce au
Biodrop. Après avoir effectué le « blanc » avec 2µL d’eau nucléase free, l’analyseur nécessite
2µL d’échantillon, déposé sur la cupule d’analyse, pour donner la concentration, la valeur
des ratios 260/280 et 260/230 et tracer la courbe de spectrométrie. Lors de chaque dosage,
la mesure a été réalisée en duplicat et les valeurs obtenues ont été rassemblées dans un tableau
présenté en annexe 8 (Annexe 8).
5. Protocole de migration sur gel d’agarose par électrophorèse
Afin d’évaluer la fragmentation des échantillons, des migrations sur gel d’agarose
par électrophorèse ont été réalisées. Au total, 4 gels contenant des échantillons issus de tous les
protocoles d’extraction ont été réalisés. Pour chaque gel, les échantillons ont été sélectionnés
de manière aléatoire.
Les gels ont été préparé à 1,2% d’agarose puis transférés dans la cuve d’électrophorèse
avec du tampon TBE 0,5x froid. Dans chaque puits, 10µL d’un mélange contenant 500ng
d’ADN par échantillon + 3µL de bleu de charge + eau nucléase free, ont été déposé. Pour
chaque gel, le premier et le dernier puits contiennent un marqueur de taille.
La migration a été réalisée à 100V pendant 1h30 puis la révélation a été réalisée avec
un agent intercalent fluorescent le SyBR Gold. Pour cela, le gel a été transféré dans un plateau
contenant du tampon TBE 0,5x et 10µL de SyBR Gold. Après 25 minutes d’incubation à
l’obscurité, le gel a été révélé sous lampe à UV.
76
6. Réalisation des PCR en temps réel ou qPCR
Enfin, la qualité des ADN extraits a été évaluée par qPCR. Les analyses ont été
réalisées en plaques P96 ou en tubes PCR. Chaque puits contient un volume final de 20µL. Cela
comprend :
- 10µL de mix Eurobio® + 1µL du primer forward et 1µL du primer reverse du gène
testé. Le mix a d’abord été préparé en tube avec le volume de mix et de primers nécessaire pour
remplir tous les puits puis il a été distribué selon le plan de plaque.
-200ng d’ADN ajusté à 8µL avec de l’eau nucléase free si nécessaire.
Pour chaque expérience, des témoins négatifs ou NTC où l’ADN est remplacé par de
l’eau ont été réalisés. Ce témoin permet de vérifier l’absence de contamination dans le mix
réactionnel ainsi que d’éventuels dimers de primers. Dans le cas du gène 16S, un témoin positif
d’ADN bactérien Escherichia coli à 1ng/µL a également été réalisé (témoin fourni dans le kit
Takara).
Les conditions du cycle d’amplification pour les gènes GAPDH et HPRT sont les suivantes :
➔ Activation ADN Polymérase et Dénaturation initiale : 3 minutes à 95°C
➔ Dénatureation,Hybridation puis Elongation : 5 secondes à 95°C X 40

30 secondes à 62°C
➔ Melting Curve pour le contrôle de qualité de l’amplification.
Pour le gène 16S, les conditions d’amplifications données par le kit sont les suivantes :
Activation ADN Polymérase et Dénaturation initiale : 2 minutes à 95°C
➔ Dénaturation,Hybridation puis Elongation : 5 secondes à 94°C

2 secondes à 55°C X 40
8 secondes à 68°C
➔ Melting Curve pour le contrôle de qualité de l’amplification.
77
C. Analyses des résultats
1. Analyse des données chiffrées
Les concentrations d’ADN obtenues après extraction avec les différents kits ainsi que
les valeurs de CT des qPCR ont été comparés par analyse statistique. Des tests de comparaison
de données appariées (test T student) ont ainsi été réalisés. Les résultats sont donnés comme
étant significatifs (* sur les graphiques) à p<0,05.
2. Analyse des données non chiffrées
Les gels et les profils d’amplification qPCR ont été évalués de manière qualitative
visuellement. La présence d’un « smear » sur un gel d’agarose traduit une fragmentation du
matériel génétique, des courbes d’amplification très aplaties une contamination en inhibiteur
ou la saturation de la réaction.
78
III. Résultats
A. Analyse des quantités d’ADN extraits
Les résultats chiffrés des différents dosages sont disponibles en annexe (Annexe 8).
1. Comparaison des résultats entre les différents protocoles
Dans un premier temps, nous avons comparé les concentrations d’ADN obtenues pour les
8 blocs de l’étude après extraction avec les différents kits.
Les résultats sont présentés figure 24.
C o n c e n t r a t io n d 'A D N o b t e n u e p a r k it d 'e x tr a c t io n
1 0 0 0
*
C o n c e n t r a t io n d 'A D N e n n g /µ L
7 5 0
5 0 0
2 5 0
0
Y
E
N
A
E
E
R
E
M
G
T
G
E
R
N
E
IA
M
O
H
F
O
IC
C
O
R
R
P
O
L
H
C
L
O
N
E
H
P
Figure 24 : Comparaison des concentrations d’ADN obtenues avec les différents kits
d’extraction (temps de lyse overnight). Les ronds correspondent aux blocs infectés et les triangles aux
blocs témoins
La figure 24 montre que les meilleures concentrations en ADN sont obtenues avec le
protocole Phénol-chloroforme, bien au-dessus des autres kits. Le kit Macherey donne les
seconds meilleurs résultats. Les 3 autres kits (Epicentre, Promega et Qiagen) donnent des
concentrations significativement inférieures. Le kit Epicentre est celui qui donne les résultats
les plus faibles.
Les résultats sont reproductibles entre tous les blocs au sein d’un kit, sauf pour le
Phénol-chloroforme où les concentrations sont très variables d’un bloc à l’autre.
Conclusion
Le protocole qui a les meilleurs rendements est le protocole Phénol-chloroforme mais

ces rendements sont très hétérogènes d’un bloc à l’autre. Le kit Macherey donne les seconds
meilleurs résultats. Les 3 autres kits donnent des résultats significativement inférieurs.
79
2. Influence du temps de lyse
Afin de comparer l’influence du temps de lyse sur l’efficacité des protocoles

d’extraction, les concentrations d’ADN obtenues pour tous les blocs ont été rassemblées. La
figure 25 montre qu’avec les kits Qiagen et Epicentre, l’augmentation du temps de lyse permet
une augmentation de la quantité d’ADN extrait. A 48h, la quantité d’ADN extrait avec le kit
Epicentre est significativement supérieure aux 2 autres temps. Pour les kits Promega et
Macherey par contre, la variation du temps de lyse ne fait pas varier la quantité de matériel
obtenu en fin d’extraction. Enfin, pour le protocole Phénol Chloroforme, la quantité d’ADN
obtenue après 2h de lyse est significativement plus faible que celles obtenues après 24
(overnight) ou 48h de lyse, mais c’est l’incubation de 24h qui donne les meilleurs résultats.
- Figure 25 : Comparaison des extractions d’ADN (pool des blocs 2,3,5) entre les différents
temps de lyse testés (2h, Overnight ou 48h).
Conclusion
Du fait de ces résultats très variables selon les kits, le temps de lyse overnight qui donne
des résultats corrects pour tous les kits a été considéré comme le temps à utiliser pour les
prochaines expériences.
80
3. Influence de la technique de déparaffinage
Les protocoles Qiagen et Qiagen bis qui ne varient que par la méthode de déparaffinage,
permettent de comparer l’effet d’un déparaffinage au xylène versus une solution propre du
fournisseur. Les résultats sont présentés figure 26 : aucune différence significative n’est
observée entre les kits Qiagen et Qiagen bis (p=0.2860).
Figure 26 : Comparaison des quantités d’ADN entre les protocoles Qiagen et Qiagen bis
Conclusion
La méthode de déparaffinage utilisée ne semble pas avoir d’impact sur la quantité

d’ADN extraite.
81
B. Analyse de la qualité des ADN extraits
1. Analyse des ratios A260/A280 et A260/A230
Lors de chaque dosage, le spectrophotomètre BioDrop© donne une valeur de ratio

A260/A280 (contamination en protéines), et de ratio A260/A230 (contamination en solvants).
Pour un ADN de bonne qualité, la valeur de ces deux ratios doit être comprise entre 1,8 et 2,2.
La figure 27 présente la moyenne des ratios obtenus pour chaque kit :
Figure 27: Moyenne des ratios A260/A280 et A260/A230, indicateurs des contaminations en
protéines et solvants suite à l’extraction d’ADN pour les différents protocoles
(P : Promega, Q : Qiagen, Qbis : Qiagen bis, E : Epicentre, M : Macherey, PC : Phénol-

chloroforme
Les résultats montrent que le ratio 260/280 est correct pour tous les kits testés sauf pour
le Phénol-chloroforme pour lequel la valeur est un peu basse (environ 1,5). Dans le cas du ratio
260/230 par contre, une forte contamination en solvants est observée avec tous les kits. Seul le
kit Macherey donne une valeur proche de 1,5, les valeurs pour les autres kits étant inférieures à
1.
Tous ces kits utilisant de l’éthanol pour l’étape de lavage de l’ADN, cette contamination
n’est pas aberrante, cependant, elle aurait dû être limitée par l’étape de chauffage à 80°C des
échantillons à l’issue de l’extraction.
La comparaison entre les kits Qiagen et Qiagen bis montrent que la technique de
déparaffinage influence peu la contamination en solvants ou en protéines, les ratios étant
similaires et de l’ordre 0,4 et 2,1, respectivement.
Conclusion
Pour tous les protocoles testés une forte contamination en solvants est observée à l’issue
de l’extraction sauf pour le kit Macherey où cette contamination est plus restreinte.
82
Les courbes de spectrophotométries données par le BioDrop© sont également
représentatives de la qualité de l’échantillon. Quelques exemples sont donnés en figure 28 :
1E* 2PC 4M*
Figure 28 : Représentation des courbes de spectrophotométrie des échantillons 1E*, 2PC et 4M*
Le profil 1E* correspond à un échantillon pour lequel la quantité d’ADN est très faible
(<10ng/µL) et le rapport 260/230 est inférieur à 0,2.
Le profil 2PC correspond à un échantillon pour lequel la quantité d’ADN est correcte
(=700ng/µL) mais pour lequel le ratio 260/230 reste < 1.
Enfin, le profil 4M* correspond au profil correct attendu. La quantité d’ADN pour cet
échantillon est de 500ng/µL et les ratios 260/280 et 260/230 sont compris entre 1,8 et 2
traduisant d’une bonne qualité de l’ADN extrait.
2. Analyse de la fragmentation de l’ADN
Quatre gels d’agarose 1,2% ont été réalisés afin d’analyser la fragmentation de l’ADN
des échantillons. Deux exemples de gels sont présentés figure 29 :
Figure 29: Gels d'agarose 1,2% réalisés à partir d'échantillons obtenus avec les différents
protocoles testés (M : Marqueur de taille)
83
Sur les 4 gels réalisés, les résultats obtenus sont homogènes et reproductibles :
observation d’un « smear » pour tous les échantillons extraits avec les kits utilisant des colonnes
(Qiagen, Macherey et Promega) et absence de « smear » pour les kits Epicentre et phénol
chloroforme, sans colonne.
Un « smear » témoigne de la présence de fragments d’ADN de taille très

hétérogène. L’hypothèse envisagée pour expliquer ce résultat serait que les kits avec
précipitation du matériel génétique ne permettent de précipiter que les fragments d’ADN de
grande taille, les petits étant perdus et donc invisibles sur le gel. A l’inverse, les kits impliquant
des colonnes retiendraient tous les fragments d’ADN, indépendamment de leur taille, entrainant
la détection de fragments de taille très variable responsable du « smear » observé.
Conclusion
Le matériel génétique obtenu après extraction par les protocoles Phénol chloroforme et
Epicentre apparait moins fragmenté que celui obtenu avec kits impliquant des colonnes.
84
C. Résultats de l’amplification des gènes canins par qPCR
1. Détermination de la quantité d’ADN optimale pour la réalisation des qPCR
Avant de tester la totalité des échantillons en qPCR, il était important de déterminer la

quantité d’ADN de départ à placer dans les tubes afin d’être dans les conditions optimales
d’amplification. En effet, une trop faible quantité de matériel initial peut ne pas être détectée
ou, au contraire, une quantité de matériel trop importante ainsi que la présence de solvant
peuvent inhiber la réaction. Pour cela, nous avons réalisé des dilutions en série de 2 en 2 (800,
400, 200, 100, 50 et 25ng) sur 6 échantillons. Un exemple de résultat est présenté figure 30 pour
le gène GAPDH.
Figure 30 : Exemple de résultats obtenus pour la gamme de dilution pour l’échantillon 4P
Les résultats montrent qu’avec des quantités d’ADN trop importantes (800 et 400ng)
une forte inhibition de l’amplification est observée. A des concentrations trop faibles (25 et
50ng) en revanche, la réaction semble saturer. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des
concentrations de 100 à 200ng.
Conclusion
La comparaison des différents échantillons testés nous a conduit à choisir 200ng comme
concentration optimum pour les prochaines expériences.
85
Validation des conditions d’amplification
A la fin de chaque qPCR, une courbe de dissociation est réalisée. Cette étape consiste à
chauffer le produit obtenu, de 45 °C à 75 °C, par paliers de 0,1 °C, en faisant de l'acquisition
de l'intensité de fluorescence en continu. Le résultat donne les profils illustrés figure 31 pour
chaque gène. La présence d’un seul pic obtenu à la Tm attendue (78°C pour GAPDH et 81°C
pour HPRT) permet de confirmer la présence d’un seul produit de PCR amplifié et sa
spécificité.
Figure 31: Courbes de dissociation obtenues lors de la validation des primers GAPDH et HPRT
Ces courbes de dissociation ont été réalisées à l’issue de chaque qPCR et la spécificité
de l’amplification validée pour toutes les expériences suivantes.
86
2. Analyse du gène GAPDH
a. Analyse en fonction du temps de lyse
Comme le montre la figure 32, tous les échantillons sont amplifiés avec le gène GAPDH
quel que soit le temps de lyse appliqué avant extraction.
Figure 32 :Profils d’amplification du gène GAPDH selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction
Les profils des courbes montrent la présence pour certains échantillons d’un phénomène
d’inhibition, probablement lié à la présence de solvants dans le milieu réactionnel.
Les CTs sont relativement homogènes et majoritairement compris entre 18 et 22.
87
b. Analyse en fonction du kit d’extraction
Comme le montre la figure 33 reprenant les résultats obtenus kit par kit après un temps
de lyse overnight, tous les kits d’extractions ont permis d’extraire du matériel génétique
amplifiable pour le gène GAPDH.
Figure 33 : Profils d’amplification kit par kit (overnight de lyse) pour le gène GAPDH
Si les résultats semblent reproductibles d’un échantillon à l’autre avec le kit Epicentre
et le Phénol-chloroforme, les résultats sont légèrement plus hétérogènes avec les 3 autres kits
alors qu’une quantité semblable de matériel de départ est présente. Cette variation peut
s’expliquer par des qualités différentes du matériel génétique présent dans chaque bloc.
88
c. Analyse des CTs
Lorsque l’on compare les valeurs de CTs entre elles (figure 34), les kits Promega,
Qiagen et Macherey donnent des CTs compris entre 18 et 22 quel que soit le temps de lyse. Le
Phénol-chloroforme et le kit Epicentre, par contre, donnent systématiquement des CTs
supérieurs à 21. De façon surprenante, le phénol chloroforme qui donnait les meilleurs résultats
en quantité d’ADN extrait, donne les CTs les plus tardifs. Les résultats sont d’ailleurs
significatifs entre Phénol-chloroforme et Promega, Macherey et Qiagen à 2h et overnight. De
même, une différence significative est observée entre Epicentre overnight et les 3 autres kits.
Enfin, la comparaison des CTs entre les temps de lyse, overnight et 48h, montre une
légère diminution non significative du CTs (de 1 à 3 selon le kit utilisé) lorsque le temps de lyse
est augmenté.
Figure 34 : Analyse des CTs obtenus pour le gène GAPDH selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction et selon les kits utilisés
Conclusion
Tous les protocoles d’extraction permettent d’amplifier le gène GAPDH. Pour quelques
échantillons, la présence d’inhibiteurs entraine des CTs plus tardifs. Le temps de lyse du tissu,
en début de protocole d’extraction, ne semble pas influencer les résultats d’amplification de
façon significative.
89
3. Analyse du gène HPRT
a. Analyse en fonction du temps de lyse
Comme pour le gène GAPDH, tous les échantillons permettent l’amplification du gène
HPRT quel que soit le temps de lyse appliqué avant extraction (figure 35). La présence d’un
phénomène d’inhibition pour certains échantillons est également observée. L’observation des
profils montre, en revanche, des résultats plus hétérogènes au niveau des CTs avec des
variations allant de 22 à 30 à un temps de lyse overnight.
Figure 35 : Profils d’amplification du gène HPRT selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction
90
b. Analyse en fonction du kit d’extraction
De même, tous les kits d’extractions ont permis d’extraire du matériel génétique
amplifiable pour le gène HPRT (figure 36).
Figure 36 : Profils d’amplification kit par kit pour le gène HPRT
Pour ce gène, les résultats semblent relativement reproductibles (écart de 2 à 3 CTs entre
les échantillons) pour tous les kits sauf pour le kit Qiagen où les résultats sont plus hétérogènes
(CTs entre 18 et 30). Les CTs les plus tardifs sont obtenus avec les kits Qiagen et Epicentre.
91
c. Analyse des CTs
Lorsque l’on compare les valeurs de CTs entre elles (figure 37), une différence
significative entre tous les kits est observée. Les moyennes des CTs varient entre 23,5 et 30,5
pour le temps de lyse overnight et entre 22,5 et 27 pour 2h et 48h. Comme précédemment, la
comparaison des CTs entre les temps de lyse, overnight et 48h, montre une diminution du CTs
lorsque le temps de lyse est augmenté. Cette différence est significative pour les kits Epicentre,
Qiagen et Phénol-chloroforme.
Figure 37 : Analyse des CTs obtenus pour le gène HPRT selon les différents temps de lyse des
échantillons (2h, overnight et 48h) avant extraction et selon les kits utilisés
Conclusion
Comme pour le gène GAPDH, tous les protocoles d’extraction testés permettent
d’amplifier le gène HPRT. Pour quelques échantillons, la présence d’inhibiteurs entraine des
CTs plus tardifs.
92
4. Analyse par échantillon
Comme l’on montré les résultats précédents, les valeurs de CTs obtenues pour les 2
gènes analysés sont très variables selon le kit d’extraction utilisé. Afin de mieux visualiser cette
variation, les résultats ont été sortis échantillon par échantillon. Un exemple des résultats
obtenus pour l’échantillon 4 est présenté figure 38.
Figure 38 : Exemple de profils d’amplification obtenus pour l’échantillon 4 après extraction

avec les différents kits
Les résultats montrent que pour un même échantillon et une même quantité de matériel
de départ (200ng), des valeurs de CTs variants entre 20 et 24 pour le gène GAPDH et entre 23
à 29 pour le HPRT sont obtenues. Ces variations importantes confirment que selon le kit utilisé,
le matériel amplifiable n’est pas identique. Il est donc fondamental de bien choisir son kit
d’extraction en fonction de ses prélèvements et de son objectif d’étude.
93
5. Comparaison des résultats entre Qiagen et Qiagen bis
La comparaison des CTs entre les protocoles Qiagen et Qiagen bis ne montrent aucune
différence significative. Les résultats sont très similaires pour les 2 gènes GAPDH et HPRT
testés (figure 39).
Figure 39 : Comparaison des CTs entre les protocoles Qiagen et Qiagen bis
D. Résultats de l’amplification de l’ADN bactérien par qPCR
Enfin, lors d’une dernière étape, nous avons recherché la présence d’ADN bactérien
dans nos échantillons, aussi bien de biopsies cutanées infectées que de peaux contrôles (témoins
négatifs). Pour cela, 5µL de chaque échantillon, obtenu après un temps de lyse overnight, a été
utilisé pour une qPCR avec des primers spécifiques 16S. Un témoin positif (ADN E.Coli)
contenu dans le kit Takara présent pour chaque expérience permet de valider la qPCR. Cet ADN
contrôle donne les proflis présentés figure 40.
Figure 40 : Profil d’amplification et courbe de dissociation obtenus par qPCR avec le témoin
positif E.Coli
94
Les résultats pour nos échantillons sont présentés figure 41 :
Figure 41 : Profils d’amplification kit par kit (24h de lyse) pour le gène 16S.
Les résultats montrent une détection d’ADN bactérien 16S dans tous les échantillons
infectés avec le kit Epicentre. Avec les kits Qiagen et Macherey seuls 2 échantillons sur 6 (blocs
5 et 6) donnent un signal positif. En revanche, aucun signal n’est observé avec les kits Promega
et Phénol-chloroforme. Avec tous les kits, les 2 échantillons témoins (peau saine) sont négatifs.
Les courbes de dissociation montrent un pic unique et reproductible pour tous les échantillons
positifs, dont la Tm est identique à celle du témoin positif.
Conclusion
Seul le kit Epicentre permet la détection de l’ADN bactérien dans les 6 échantillons
infectés. Seuls 2 échantillons sur 6 sont positifs avec les kits Qiagen et Macherey. Le kit
Epicentre semble le plus adapté pour la détection d’un pathogène.
95
IV. Discussion
Les progrès de la biologie moléculaire ouvrent aujourd’hui des possibilités immenses

en termes de recherche et de diagnostics dans le domaine médical tant humain que vétérinaire.
Certains laboratoires médicaux disposent d’un stock de blocs en paraffine important qui
constitue une source précieuse de matériel pour ces 2 axes de développement. Au sein du
laboratoire de dermatologie de VetAgro Sup, nous disposons de nombreux prélèvements de
peau inclus en paraffine qui pourraient servir aussi bien à améliorer le diagnostic de certaines
maladies que dans le cadre de la recherche vétérinaire.
Cependant, l’utilisation de ce matériel est freinée par les difficultés de l’extraction du

matériel génétique. La fixation en formol des échantillons génère des fragmentations du
matériel génétique ainsi que des cross-links entre les bases de l’ADN ou les protéines qui vont
altérer sa qualité. Si certaines de ces altérations, comme les cross-links, sont réversibles,
l’extraction reste un challenge pour trouver les bonnes combinaisons permettant d’obtenir du
matériel en quantité suffisante et de bonne qualité. Depuis les années 90, de nombreux kits
d’extraction de ce matériel génétique particulier ont été développés. Une étude, réalisée en 2015
par Kocjan et al, répertorie 69 kits commerciaux spécifiquement dédiés aux prélèvements FFPE
issus de 43 compagnies différentes (Kocjan et al., 2015).
D’après les résultats de la littérature, il n’existe pas de protocole faisant l’unanimité pour
ce type d’extraction et les résultats sont très variables. De nombreuses études testent différents
protocoles d’extraction afin optimiser les techniques adaptées aux tissus FFPE mais les résultats
sont très difficiles à comparer pour plusieurs raisons :
- Les tissus utilisés dans ces études sont de nature très différente. Or, il est bien établi qu’il
existe de larges variations dans la composition cellulaire des différents organes. De même,
certains organes (intestin, pancréas, poumons…) ont, eux-mêmes, une composition hétérogène,
rendant la comparaison des résultats difficiles au sein d’une même étude.
- Il n’existe pas de consensus sur le protocole de fixation d’un prélèvement biologique. Les
protocoles sont très variables, notamment concernant le pH et le temps de fixation. Il a,
cependant, été établi qu’un pH de 7 et un temps de fixation inférieur à 48h permettaient une
forte amélioration de la qualité du matériel génétique extrait.
- Pour de nombreuses études, l’objectif premier n’était pas la biologie moléculaire. Le temps
entre le prélèvement du tissu et le moment où ce dernier est plongé dans le formol est donc très
variable. Or, la dégradation du matériel génétique débute immédiatement après le prélèvement,
d’où la nécessité d’un transfert rapide dans le formol.
- Enfin, la qualité du matériel génétique semble également dépendre du temps et des conditions
de stockage : la fragmentation du matériel génétique augmente avec le temps et la température
de stockage (Reid et al., 2017).
L’ensemble de ces facteurs est propre à chaque laboratoire, suggérant que chaque
laboratoire doive sélectionner le kit le plus approprié à ses échantillons et à sa problématique.
L’objectif de ce travail a été de valider un protocole d’extraction d’ADN à partir de
prélèvements FFPE de notre laboratoire.
96
A. Choix du matériel et des paramètres de l’étude
Pour cette étude, nous avons sélectionné 8 blocs de biopsies cutanées de chiens. Les
biopsies étant de très petite taille (de l’ordre du millimètre) nous avons choisi des cas pour
lesquels ils y avaient plusieurs biopsies par bloc et la possibilité de blocs en doublons afin de
disposer de suffisamment de matériel pour tous nos tests. Dans la littérature, le nombre de blocs
testés dépend des paramètres de l’étude. En effet, plus le nombre de kits testés augmente, plus
le nombre de blocs diminue : test de 2 kits sur 27 blocs (Potluri et al, 2015); test de 7 kits sur 7
blocs (Okello et al., 2010); test de 14 kits sur 4 blocs (Patel et al., 2017). Le nombre de blocs
a également été déterminé en fonction du budget de l’étude, sachant que l’on a choisi de réaliser
chaque extraction en duplicats afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats.
Nous avons sélectionné des blocs récents pour lesquels nous connaissions le processus
de fixation et les conditions de conservation. Dans notre laboratoire, les biopsies sont
directement plongées dans du formol après prélèvement sur l’animal. Après 24h de fixation, les
prélèvements sont déshydratés dans un automate et rapidement inclus en blocs de paraffine. Ce
temps de fixation de 24h semble optimal pour obtenir du matériel génétique de qualité d’après
l’étude de Granato et al. Ce dernier a, en effet, testé plusieurs temps de fixation en formol sur
des prélèvements de peaux de chiens (entre 24 et 150 heures). Leurs résultats montrent que 24h
est le temps le plus adapté pour obtenir de l’ADN amplifiable. Au-delà, l’amplification par
qPCR diminue fortement (Granato et al., 2014). La méthode de stockage des blocs est,
également, essentielle. En effet, lorsque les blocs sont conservés à température ambiante, sans
grande variation de température, l’ADN présent dans les blocs anciens est toujours amplifiable
par qPCR. C’est ce qu’a montré l’étude de Paraider et al. dans laquelle des qPCR ont été
réalisées sur des prélèvements de cœur inclus en paraffine dans les années 1820 (Paraider et
al., 2013).
Nous avons choisi d’utiliser 4 coupes d’une épaisseur de 8µm. Cela nous semblait un
bon compromis entre une quantité de matériel suffisante pour les extractions et la possibilité de
réaliser des duplicats pour chaque test. Dans la littérature, les coupes sont, en général, comprises
entre 5 et 10µm d’épaisseur. La quantité de matériel utilisé semble avoir son importance. En
effet, une étude a testé plusieurs protocoles avec des coupes de 5, 10, 15, 20 et 25µm
d’épaisseur. Si, pour le kit Qiagen, la quantité d’ADN obtenu croît avec l’augmentation de
l’épaisseur des coupes, les autres protocoles ne permettent pas d’obtenir de matériel génétique
avec les plus petites coupes (Seiler et al., 2016).
Parmi les protocoles choisis, le kit « QIAamp DNA FFPE tissue » de Qiagen nous est
rapidement apparu comme incontournable, ce dernier étant utilisé dans 19 publications sur les
32 étudiées. Le protocole Phénol-chloroforme a été, également, un choix évident puisqu’il
s’agit de la méthode de référence présente dans de nombreuses publications (Annexe 1).
Les autres kits ont été sélectionnés de façon à avoir une grande diversité de méthodes de
déparaffinage et de purification de l’ADN. Concernant les méthodes de déparaffinage, le kit
Promega nous a permis de tester l’huile minérale, très en vogue dans les publications (Heikal
et al., 2014 ; Weiss et al., 2011 ; Janecka et al., 2015, Lin et al., 2009).
Le protocole Macherey a été sélectionné car cité dans la dernière étude du laboratoire (Joly et
al., 2011) et est très apprécié par les laboratoires de VetAgro Sup. Enfin, le protocole Epicentre
a été sélectionné, bien que rarement utilisé dans les publications, mais largement utilisé par nos
confrères du centre Léon Bérard de LYON avec des résultats très concluants sur des blocs en
paraffine.
97
Tous ces kits ont été utilisés selon les instructions du fournisseur. Cependant, selon la
littérature, quelques paramètres peuvent être flexibles, notamment le temps de lyse des
échantillons en début de protocole. En effet, en nous basant sur les données publiées, nous
avons choisi de tester, en priorité, une durée d’incubation de 16h dite « Overnight »,
majoritairement utilisée. Une durée plus courte de 2h et une durée plus longue, de 48h,
également décrites dans la littérature, ont été testées en parallèle.
Enfin, nous avons choisi de valider la qualité du matériel extrait par qPCR. Cette
technique est utilisée dans 30 études sur les 32 analysées. Elle permet de vérifier si le matériel
extrait est utilisable pour les techniques modernes de biologie moléculaire. Elle apparait comme
la plus simple à mettre en place, les appareils de qPCR étant plus souvent disponibles dans les
laboratoires que les séquenceurs haut débit (Watanabe et al., 2017) ou les puces à ADN (Potluri
et al., 2015).
B. Analyses des rendements en ADN des protocoles d’extraction
Le premier paramètre mesurable à la fin de l’extraction est le rendement obtenu. Pour

cela, le spectrophotomètre BioDrop® donne, avec une grande précision, la concentration en
ADN en ng/µL de chaque échantillon. Nos résultats montrent que les meilleurs rendements sont
obtenus avec le protocole Phénol-chloroforme, la méthode de référence. Ces résultats sont en
accord avec les données de la littérature. En effet, l’étude de Rabelo Goncalves (Rabelo
Goncalves et al., 2014), comparant les protocoles Phénol-chloroforme, Qiagen et Promega,
montre que, malgré la toxicité du Phénol-chloroforme, ce protocole reste le meilleur quant à la
quantité de matériel génique extrait. D’autres auteurs confirment également ce résultat ( Ludyga
et al., 2012 ; Okello et al., 2010). Sur les 32 études que nous avons analysées, 2 donnent des
résultats contraires avec de bien meilleurs résultats pour le kit QIAamp mais sur des tissus
autres que la peau (Gilbert et al., 2007 ; Sengüven et al., 2014).
Le second meilleur kit, dans nos mains, est le kit Macherey. Bien que peu décrit dans la
littérature, ce kit donne des résultats intéressants. Dans l’étude de Patel, qui utilise également
ce kit, des résultats inverses aux nôtres ont été obtenus : les rendements du kit Qiagen sont 2
fois supérieurs à ceux du kit Macherey. Cependant, les auteurs travaillent sur des prélèvements
de sein et de prostate et non de peau (Patel et al., 2017).
Les kits Qiagen et Promega donnent des résultats significativement inférieurs aux 2
premiers kits, malgré les données très encourageantes de la littérature. Cependant, il faut
considérer que très peu d’études utilisent de la peau comme support d’extraction et que les
résultats sont très variables en fonction du tissu de départ (Reid et al., 2017).
Enfin, le kit Epicentre a, dans nos mains, des rendements très faibles. Sa méthode de
purification de l’ADN, basée sur une simple précipitation, en est certainement la cause. En effet,
il est bien établi que cette méthode est dépendante de la quantité de matériel présente dans le
prélèvement : plus il y a de matériel, meilleurs sont la précipitation et, donc, le rendement. Dans
notre cas, nous utilisons de très petites biopsies, il est donc possible que cela ne soit pas adapté
à ce kit. Les prélèvements manipulés au Centre Léon Bérard sont des prélèvements humains,
issus de chirurgie, de taille beaucoup plus importante.
98
C. Analyse de la qualité des ADN obtenus
En plus de la concentration en ADN, le spectrophotomètre BioDrop® donne des

informations concernant la pureté de l’échantillon grâce au rapport 260/280 (contamination en
protéines) et 260/230 (contamination en solvants). Nos résultats montrent une faible
contamination en protéines, quel que soit le protocole d’extraction utilisé (rapport compris entre
1,8 et 2,2). Par contre, une forte contamination en solvants est observée avec tous les protocoles
(rapport inférieur à 1 sauf pour Macherey où il est environ de 1,5). Ce résultat est assez cohérent
avec les données de la littérature. Patel et al. obtient, également, des ratios 260/230 de l’ordre
de 1,2 lors de sa comparaison de plusieurs protocoles d’extraction. Le kit qui donne la plus
faible contamination en solvants est le kit Macherey, tout comme dans notre étude (Patel et al.,
2017).
Si cette contamination en solvants n’est pas aberrante du fait de l’utilisation de

nombreux solvants au cours du processus d’extraction et, notamment, de l’éthanol pour l’étape
de lavage de l’ADN en fin de protocole, nous avons tenté d’éliminer ces derniers par une étape
d’évaporation de 5 minutes à 80°C après reprise en tampon TE. Malheureusement, cette étape
ne semble pas concluante. Des temps d’incubation plus longs, avec une température plus faible,
seraient à tester. Cependant, cela pourrait, également, nuire à la qualité des ADN. Cette
contamination ne semblant pas un frein pour la réalisation des qPCR, les protocoles ne seront
pas modifiés.
Dans l’étude de Patel et al., la qualité des produits obtenus a, également, été vérifiée par
Bio-analyseur (Patel et al., 2017). Cette analyse aurait été un plus pour notre étude,
malheureusement, le contexte sanitaire ne nous a pas permis de la réaliser. L’analyse de la
fragmentation d’ADN, problème majeur de la fixation par le formol et de la conservation en
blocs de paraffine, a été réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose. Nos résultats montrent la
présence d’un « smear » pour tous les kits utilisant une colonne lors de la purification d’ADN
alors que les protocoles Epicentre et Phénol-chloroforme ne montrent que peu de fragmentation.
Des résultats similaires sont décrits dans les études de Patel et al., et de Ludyga et al.. Ces
derniers présentent des photos de gel, contenant les ADN extraits avec les kits QIAamp et
Phénol-chloroforme, très similaires aux nôtres (Patel et al., 2017 ; Ludyga et al., 2012).
L’hypothèse pour expliquer ce résultat serait que les kits utilisant des colonnes retiendraient les
fragments d’ADN de toutes les tailles, y compris les petits fragments, alors que les autres kits
ne précipiteraient que les gros fragments d’ADN.
Enfin, il est important de noter qu’il n’y a, visiblement, pas de lien entre la quantité et
la qualité du matériel extrait. De même, des ratios de bonne qualité ne garantissent pas la
réussite de l’amplification. Si l’ADN extrait est « propre » c’est-à-dire non contaminé, les ratios
A260/A280 et A60/A230 seront excellents mais si en parallèle il est très fragmenté,
l’amplification peut échouer (Alvarez-Aldana et al., 2015).
99
D. Analyse de l’amplification des gènes de ménages HPRT et GAPDH
Afin de s’assurer du caractère amplifiable des ADN extraits, nous avons sélectionné 2
gènes de ménage, couramment utilisés chez le chien, les gènes HPRT et GAPDH. Notre étude
montre que tous nos échantillons donnent une amplification correcte quel que soit le protocole
utilisé. La présence d’inhibiteurs est cependant observée pour quelques échantillons. Ces
résultats sont en accord avec les données de la littérature. Sur les 32 publications étudiées, toutes
observent une amplification de leurs gènes de ménage ou d’intérêt lorsque les extractions sont
réalisées dans de bonnes conditions. L’équipe d’Alvarez-Aldana observe, même, une meilleure
amplification avec leurs échantillons présentant les ratios 260/280 les plus faibles, confirmant
que le caractère amplifiable de l’ADN n’est pas lié à la contamination en solvants ou en
protéines mais, plutôt, à sa fragmentation (Alvarez-Aldana et al., 2015).
Ce résultat s’explique par le fait que de faibles quantités d’ADN sont utilisées pour la
réalisation de la qPCR. Dans notre étude, nous avons utilisé 200ng d’ADN, permettant de diluer
notre ADN (et donc les inhibiteurs) dans le mix de qPCR. Ainsi, les ADN extraits avec le
protocole Phénol-chloroforme, qui présentent de très bons rendements mais des ratios mauvais,
sont aussi bien amplifiés que les échantillons extraits avec le Kit Macherey, pour lequel les
ratios sont bons mais les rendements plus faibles. Ce phénomène de dilution explique,
également, pourquoi les CTs obtenus avec le protocole Phénol-chloroforme sont beaucoup plus
homogènes que ceux obtenus avec les kits utilisant des colonnes. En effet, tous les échantillons
Phénol-chloroforme ont été utilisés dilués au 1/20 vu les rendements élevés. A l’inverse, les
rendements étant très variables avec les kits utilisant des colonnes, les dilutions ont été ajustées
et sont, également, très variables. Dans la plupart des publications étudiées, une quantité de
matériel génique encore plus faible, entre 20 et 50ng, est utilisée avec des résultats
d’amplification très satisfaisants (Janecka et al., 2015 ; Lin et al., 2009 ; Heïkal et al., 2014).
Pour pallier au problème de fragmentation de l’ADN des prélèvements FFPE, il est très
clairement établi qu’il faut réaliser des amplifications sur de tous petits fragments de gènes.
L’étude d’Obersteller a nettement confirmé cette donnée en comparant l’amplification de 3
gènes de tailles variables : 566pb, 179pb et 65pb. L’amplicon de 566pb n’est détecté dans aucun
des prélèvements, celui de 179pb est partiellement détecté et celui de 65pb est détecté dans tous
les échantillons (Obersteller et al., 2016). Dans notre étude, les fragments amplifiés sont
inférieurs à 150pb, ce qui est en accord avec les données de la littérature.
100
E. Influence de la méthode de déparaffinage
Dans notre quête du protocole idéal d’extraction d’ADN de prélèvements FFPE, nous
avons choisi de nous intéresser à l’influence de la méthode de déparaffinage sur la quantité, la
qualité et le caractère amplifiable de l’ADN. Pour cela, nous avons utilisé plusieurs kits
proposant diverses solutions de déparaffinage. Le kit Promega utilise de l’huile minérale, le kit
Macherey une solution propre au fournisseur et le kit Qiagen nous donnait la possibilité
d’utiliser soit la solution du fournisseur soit la méthode traditionnelle au xylène - éthanol.
Nos résultats montrent des rendements et des rapports 260/280 et 260/230 relativement
identiques entre les 4 protocoles. De même, aucune différence significative de l’amplification
des gènes de ménage n’est observée pour ces échantillons. L’étape de déparaffinage, si elle est
bien réalisée, ne semble pas avoir d’impact sur la qualité et la qualité du matériel extrait.
Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature. Sur les 32 publications analysées,
de nombreuses ont utilisé des méthodes de déparaffinage différentes, sans conclure à un impact
de cette étape. Avec l’hétérogénéité des protocoles et des tissus testés, il est, de toutes façons,
impossible de savoir si les différences observées dépendent de la méthode de déparaffinage ou
du reste du protocole. Plusieurs auteurs préfèrent l’huile minérale à la méthode au xylène -
éthanol (Lin et al., 2009, Heïkal et al., 2014) du fait de son caractère moins toxique et de son
utilisation facile. De même, des auteurs considèrent la solution propre aux fournisseurs comme
plus adaptée car moins toxique et moins contraignante en termes de manipulations. Le seul
point sur lequel les auteurs sont en accord est le fait que l’étape de déparaffinage est
indispensable au protocole d’extraction et à la réalisation de la qPCR (Bonin et al., 2013 ; Weiss
et al., 2011 ; Gilbert et al., 2007).
F. Influence du temps de lyse des échantillons avant extraction

Le temps de lyse des échantillons avant extraction est une étape fondamentale. Sur les
32 publications étudiées, près de la moitié font varier ce paramètre, testant des temps
d’incubation de 2h à 96h. Dans notre étude, nous avons choisi de tester 3 temps : 2h, 16h
(overnight) et 48h. Nos résultats montrent que, pour les protocoles Qiagen, Epicentre et Phéno-
chloroforme, l’augmentation du temps de lyse entraine une légère augmentation du rendement.
Ce résultat est parfaitement logique puisque, pour les protocoles Qiagen et Phénol-chloroforme,
le même tampon de lyse a été utilisé. Dans le cas des kits Promega et Macherey, le temps de
lyse ne semble pas avoir d’influence sur le rendement. De même, le temps de lyse ne semble
pas avoir un gros impact sur les amplifications par qPCR quel que soit le protocole considéré.
Si une légère diminution des CTs est observée pour les 2 gènes de ménage, à 48h, ce temps de
lyse alourdi considérablement le protocole d’extraction.
Ces résultats vont dans le sens des données publiées. De nombreux auteurs considèrent
le temps overnight comme le plus approprié (Janecka et al., 2015 ; Okello et al., 2010 ; Rabelo-
Goncalves et al., 2014 ; Sengüven et al., 2014). Les publications montrent que 2 à 3h de
digestion est un temps un peu trop court pour une bonne digestion du tissu et, surtout, pour
l’élimination des protéines fixées à l’ADN (cross-links) pouvant interférer dans les étapes
suivantes. A l’inverse, des temps d’incubation plus longs (48h ou 72h) n’améliorent que
faiblement le rendement de la méthode et la qualité de d’ADN (Sengüven et al., 2014 ; Weiss
et al., 2011). De même, dans leur étude, Gilbert et al. montre que si le rendement en ADN
augmente avec le temps de lyse (entre 6h et 96h), un temps trop long nuit à la qualité du matériel
extrait (Gilbert et al., 2007).
101
Après avoir fait la synthèse de ces données, nous avons décidé que le temps overnight
était le plus adapté pour la suite de nos expériences.
G. Détection des bactéries dans nos prélèvements
Le second objectif de notre travail était la recherche de bactéries dans des biopsies de
zones de peau infectée, afin d’identifier le pathogène impliqué par séquençage.
Pour cela, nous avons choisi d’amplifier une séquence universelle de l’ADN 16S
bactérien avec un kit spécialement conçu pour réaliser le séquençage du fragment amplifié. Ce
kit contient, notamment, une polymérase haute-fidélité afin d’éviter toute erreur de copie lors
de l’amplification. Cependant, en raison du contexte sanitaire, nous n’avons pas pu aller jusqu’à
l’étape de séquençage finale. Ce travail nous ouvre, néanmoins, d’excellentes pistes de travail
pour la suite du projet.
Nos résultats montrent une amplification de l’ADN bactérien 16S, pour les 6
échantillons testés, avec le kit Epicentre, et pour 2 échantillons sur 6, avec les kits Qiagen et
Macherey. Les échantillons de peau « saine » sont négatifs. La comparaison de la courbe de
dissociation des échantillons amplifiés avec celle du témoin positif (ADN E. coli) confirme la
spécificité de l’amplification. De plus, les 2 échantillons amplifiés avec les kits Qiagen et
Macherey correspondent aux 2 échantillons les plus positifs avec le Kit Epicentre. Mais, de
façon plus surprenante, aucune amplification n’est observée avec les protocoles Phénol-
chloroforme et Promega.
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces résultats. Dans le cas du protocole Phénol-
chloroforme, il faut revenir au mode opératoire. Nous avons choisi d’utiliser, dans tous les puits,
5µL d’ADN extrait, quel que soit le résultat du dosage de l’échantillon. Vu les différences de
rendement entre les kits Epicentre et Phénol-chloroforme, les quantités d’ADN canin présent
dans les puits et pouvant gêner l’amplification du 16S bactérien, sont extrêmement différentes
(> x10 avec Phénol-chloroforme par rapport à Epicentre). La quantité d’ADN bactérien étant
très faible dans nos échantillons, les primers n’ont pas trouvé la cible avec laquelle s’hybrider
dans les échantillons Phénol-chloroforme. Pour les autres kits, les différences observées
viennent, probablement, de la colonne, peut-être moins adaptée à la taille des ADN bactériens
présents.
Dans la littérature, différentes études ont abordé cette problématique de détection de

pathogènes dans les tissus FFPE :
- L’équipe d’Obersteller a, par exemple, recherché la présence de Burkholderia pseudomallei

dans différents organes (foie, rate, poumon, rein, cerveau et cœur) de souris infectées
expérimentalement en comparant cinq kits d’extraction, dont le kit Qiagen et un kit similaire
au kit Epicentre. Les résultats ont montré que, bien que la présence de bactéries ait été confirmée
par culture pour tous les organes, tous les kits ne permettent pas leur détection par qPCR.
Conformément à nos résultats, les kits Qiagen et celui proche de l’Epicentre sont parmi ceux
qui donnent les meilleurs résultats (Obersteller et al., 2016).
102
- L’équipe de Rabelo-Goncalves a recherché la présence d’Helicobacter pylori dans 10 blocs
de foie humain, en comparant 5 protocoles d’extraction, dont le kit Qiagen, le kit Promega et le
protocole Phénol-chloroforme. Le gène 16S, amplifié, a été détecté dans 40 à 50% des
échantillons, pour 4 des 5 kits, et dans 70%, avec le protocole Phénol-chloroforme. Par rapport
à nos échantillons, la quantité de bactéries présentes dans leurs blocs semblait beaucoup plus
importante et que seuls 2µL d’ADN extrait ont été nécessaires pour la qPCR (Rabelo-Goncalves
et al., 2014).
- De même, le kit Qiagen a été utilisé pour rechercher Rickettsia sp. dans des biopsies cutanées.
La qPCR en multiplex, réalisée sur un gène commun aux Rickettsia et sur 3 gènes spécifiques
de 3 espèces, montre une détection dans 100% des échantillons ainsi qu’une identification
précise de la bactérie. Les auteurs précisent qu’en raison de la faible quantité de bactéries
présentes dans les tissus, ils ont réalisé plusieurs coupes de 16µm d’épaisseur, de plusieurs
fragments de tissus, afin de garantir le résultat de l’analyse. Ils concluent à l’avantage de cette
technique, en termes de temps, par rapport à l’immunohistologie (Denison et al., 2014).
- Enfin, l’équipe de Munoz-Cadavid confirme que l’étape de séquençage est bien réalisable sur
les échantillons extraits à partir de paraffine, notamment avec le kit Qiagen, puis amplifiés par
qPCR. En effet, leur étude montre la détection de champignons, dans différents tissus humains
ainsi que leur identification par séquençage, après la qPCR. Comme précédemment, les auteurs
concluent que cette méthode, très efficace, permet un diagnostic rapide et précis en seulement
quelques heures (Munoz-Cadavid et al., 2010).
Ces travaux ouvrent de nombreuses pistes quant à l’exploitations des prélèvements

FFPE au sein du laboratoire d’histologie de VetAgro Sup, tant au niveau du diagnostic que de
la recherche vétérinaire.
103
104
CONCLUSION
L’extraction de l’ADN d’un tissu fixé en formol et inclus en paraffine (FFPE) s’impose
de plus en plus aux scientifiques au fils des années. En effet, la conservation dans le formol des
prélèvements est omniprésente dans les laboratoires et les tissus FFPE représentent une source
immense d’information pour la recherche et le diagnostic tant en médecine de l’homme que
vétérinaire lorsque les tissus frais ne sont plus disponibles. Pour autant, l’extraction des acides
nucléiques de ces tissus reste un challenge malgré les nombreuses études effectuées à la
recherche du protocole idéal ces trente dernières années.
Le but de notre travail était de mettre au point une méthode d’extraction adaptée à des
biopsies cutanées de chiens, traitées dans notre laboratoire, avec 2 objectifs distincts. Le premier
objectif était de pouvoir amplifier de l’ADN canin par qPCR dans un but de recherche afin
d’étudier ce matériel génétique (recherche de mutations…) ; pour cela, l’amplification de 2
gènes de ménages canins (HPRT et GADPH) a été testée. Le second objectif était diagnostique
et, plus précisément la mise en évidence d’un agent infectieux bactérien dans nos biopsies ;
pour cela une amplification du gène bactérien 16S a été réalisée. Six protocoles d’extraction
ont été sélectionnés afin d’avoir un panel des différentes méthodes de déparaffinage, de
purification de l’acide nucléique (avec ou sans colonne d’extraction) et ont été avec la méthode
traditionnelle d’extraction au Phénol-chloroforme. L’important étant d’obtenir un ADN de
bonne qualité, non contaminé par des solvants ou des protéines et amplifiable par qPCR. La
difficulté majeure de cette extraction réside, à la fois, dans la faible quantité de matériel initial
dans le prélèvement et dans la dégradation du matériel génétique lors de la fixation au formol
par formation de ponts appelés « cross-links » entre les bases de l’ADN ou entre l’ADN et les
protéines.
Nos résultats confirment les données de la littérature à savoir que les produits
d’extraction et d’amplification, à partir de prélèvements FFPE, peuvent être très variables en
fonction du kit d’extraction utilisé. Nos dosages au Nanodrop montrent que le protocole
permettant d’obtenir la plus grande quantité d’ADN est le protocole au phénol-chloroforme
suivi par le protocole Macherey. Les 3 autres kits (Epicentre, Qiagen et Promega) donnent des
quantités d’ADN significativement plus faibles. La qualité du matériel extrait est estimée à
l’aide des rapports A260/A280 et A260/A230 qui montrent une faible contamination en
protéines mais une forte contamination en solvants quelque que soit le protocole testé.
Concernant l’amplification des gènes de ménages GAPDH et HPRT, nos résultats révèlent une
bonne amplification des 2 gènes quel que soit le protocole testé même si quelques échantillons
ont des Ct (Seuil de cycle à partir duquel on détecte les gènes) tardifs, du fait de la présence
d’inhibiteurs de PCR (solvants…). Les meilleurs résultats (Ct groupés et bonne amplification)
sont obtenus avec le protocole phénol-chloroforme. La comparaison des méthodes de
déparaffinage ne montre aucune différence significative. De même, la comparaison des temps
de lyse des tissus 2h, 16h (overnight) et 48h ne montrent pas de différences, même si les Ct
obtenus sont légèrement plus précoces (de 1 à 2 Ct) après 48h de lyse. La détection de l’ADN
bactérien 16S, par contre, donne des résultats surprenants. En effet, seul le protocole Epicentre
permet de détecter la présence de cet ADN bactérien dans tous nos prélèvements. Aucune
amplification n’est visible avec les protocoles Phénol-chloroforme et Promega ; seuls 2
échantillons sur 6 sont positifs avec les protocoles Qiagen et Macherey.
105
Il est donc possible d’extraire du matériel génétique, amplifiable, de nos échantillons
cutanés FFPE de chiens. Cependant, nos résultats montrent qu’il faut choisir le protocole en
fonction de l’objectif du projet. Si l’objectif est d’étudier le génome du chien, les protocoles
phénol-chloroforme ou Macherey Nagel semblent les plus adaptés car ils donnent du matériel
génétique en quantité importante. En revanche, si l’objectif est la recherche d’ADN d’origine
bactérienne, le protocole Epicentre semble le meilleur.
Thèse de Mme Marielle PILLON
Le Professeur responsable Le Directeur général

VetAgro Sup campus vétérinaire VetAgro Sup
Le Président de la thèse
Vu et permis d’imprimer
106
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112
ANNEXES
Annexe 1 : Tableau comparatifs des résultats d’extraction dans la littérature, triés selon la méthode de déparaffinage
113
114
115
Annexe 2 : Protocole détaillé PROMEGA, ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System
Protocole extraction d’ADN à partir de tissus en paraffine
PROMEGA ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System
1- Réactifs
-ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega # A2352)

• 50mL Mineral Oil
• 20mL Lysis Buffer (LBA)
• 2 × 1.1mL Proteinase K (PK)
• 32.5mL BL Buffer
• 30mL Wash Solution
• 15mL Elution Buffer
• 2 packages ReliaPrep™ FFPE Binding
Columns (50 columns/package)
-Éthanol absolu pour la biologie moléculaire (VWR # 437433T)
2- Préalables
Ajouter 120mL d’éthanol 100% dans les 30mL de la solution de lavage.
3- Mode opératoire
3.1 Section des échantillons
- Couper 4 coupes de 8 µm d’épaisseur au microtome en jetant les 3 premières étant exposées

à l’air et en conservant les suivantes.
-Eliminer si possible l’excès de paraffine autour des tissus
- Placer les coupes dans un tube eppendorf de 1,5 mL
3.2 Déparaffinage à l’huile minérale
- Ajouter 300 µL d’huile minérale dans les tubes.

- Incuber à 80° pendant 2 minutes.
- Vortexer.
116
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 200 µL de tampon de lyse LBA.

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 15 secondes.
Deux phases se forment, une aqueuse au fond et une huileuse surnageante.
- Éliminer la phase surnageante.
- Ajouter 20 µL de Protéinase K et vortexer.
- Incuber à 56° overnight
- Incuber à 80°C pendant 1h
- Laisser refroidir à température ambiante
3.4 Récupération ADN : Colonne de matrice silice
- Ajouter 220 µL de tampon BL.

- Ajouter 240 µL d’éthanol 100% et vortexer. Un précipité peut se former.
- Éliminer la phase huileuse surnageante restante.
- Transférer la phase aqueuse (inférieure) sur la colonne
- Vide le tube collecteur.
3.5 Lavage ADN et élution
- Ajouter 500 µL de la solution de lavage.

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 30 secondes. x2
- Vide le tube collecteur.
- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 3 minutes à vide pour sécher complètement la membrane.
- Transférer la colonne dans un tube eppendorf neuf.
- Ajouter 20 µL de tampon d’élution au centre de la colonne. x2

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 1 minute à température ambiante.
- Préparer trois aliquots de 10 µL et conserver le tube initial avec les 5µL restants pour dosage
au Nanodrop.
117
Annexe 3 : Protocole détaillé QIAGEN, QIAamps DNA FFPE Tissue
QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue (Avec xylène et éthanol)
1- Réactifs
-Xylène (Sigma # 534056-500ml)

-Eau Nucléase free (Qiagen # 129114)
-QIAamp DNA FFPE Tissue Kit pour 50 échantillons (Qiagen # 56404)
-QIAamp MinElute® Columns 50
-Buffer ATL 14 ml
-Buffer AL (12 ml)
-Buffer AW1 (19 ml)
-Buffer AW2 (13 ml)
-Buffer ATE (20 ml)
-Proteinase K (1.25 ml)
2- Préalables
Préparation de l’éthanol 90% et 70% à partir de l’éthanol absolu selon la Table de Gay-Lussac):
-Ethanol 90% : ajouter 20ml d’éthanol et 2.65ml d’eau nucléase free
- Vérifier les tampons AL et ATL : s’ils contiennent un précipité, faire chauffer à 70°C
avec une agitation légère jusqu’à dissolution.
- Préparer les tampons AW1 et AW2 :
AW1 : Ajouter 25 mL d’éthanol 96-100% dans le tampon AW1. Mélanger.
AW2 : Ajouter 30 mL d’éthanol 96-100% dans le tampon AW2. Mélanger.
3- Mode opératoire

- Placer les coupes dans un tube eppendorf de 1,5ml
118
3.2 Déparaffinage au Xylène / Ethanol
- Ajouter 1 mL de Xylène par tube.

-Centrifuger 1min à 10 000rpm. x2
-Eliminer le solvant à la pipette.
- Ajouter 1 mL d’éthanol 100% et centrifuger 1min à 10 000rpm. Retirer l’éthanol.

- Ajouter 1 mL d’éthanol 70% et Centrifuger 1min à 10 000rpm. Retirer l’éthanol.
- Faire sécher l’éthanol à température ambiante sous la sorbonne pendant 5 à 10 minutes.
-Centrifuger 1min à 10 000rpm puis retirer l’éthanol.
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 180 µL de tampon ATL

- Ajouter 20 µL de Protéinase K et vortexer
- Ajouter 200 µL de tampon AL et vortexer.

- Transférer la totalité du lysa dans la colonne.
- Centrifuger à 8 000 rpm pendant 1 minute.
- Vider le tube collecteur.
- Ajouter 500 µL du tampon AW1


- Centrifuger à vide à 10 000 rpm pendant 3 minutes pour sécher complètement la membrane.
- Placer le QIAamp MinElute column dans un tube eppendorf neuf de 1,5 mL.
- Ajouter 20 µL de tampon ATE au centre de la membrane. x2

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 1 minute à température ambiante
119
Annexe 4 : Protocole détaillé QIAGEN BIS, QIAamps DNA FFPE Tissue
QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue (avec deparaffinization

solution)
1- Réactifs
-Deparaffinization solution (Qiagen # 19093)

-QIAamp DNA FFPE Tissue Kit pour 50 échantillons (Qiagen # 56404)
-QIAamp MinElute® Columns 50
-Buffer ATL 14 ml
-Buffer AL (12 ml)
-Buffer AW1 (19 ml)
-Buffer AW2 (13 ml)
-Buffer ATE (20 ml)
-Proteinase K (1.25 ml)
2- Préalables
-Vérifier les tampons AL et ATL : s’ils contiennent un précipité, faire chauffer à 70°C avec une
agitation légère jusqu’à dissolution.
-Préparer les tampons AW1 et AW2 :
-AW1 : Ajouter 25 mL d’éthanol 96-100% dans le tampon AW1. Mélanger.
-AW2 : Ajouter 30 mL d’éthanol 96-100% dans le tampon AW2. Mélanger.
3- Mode opératoire

3.2 Déparaffinage avec solution qiagen
- Ajouter 300 µL de Deparaffinization Solution.

-Vortexer 10 secondes.
- Incuber 5 min à 56°C.
120
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 180 µL de tampon ATL et vortexer
- Centrifuger 1min à 11 000rpm
- Eliminer la phase supérieure bleue
- Ajouter 20 µL de Protéinase K à la phase inférieure et vortexer
- Ajouter 200 µL de tampon AL et vortexer.

- Transférer la totalité du lysa dans la colonne.


- Centrifuger à vide à 10 000 rpm pendant 3 minutes pour sécher complètement la membrane.
- Placer le QIAamp MinElute column dans un tube eppendorf neuf de 1,5 mL.
- Ajouter 20 µL de tampon ATE au centre de la membrane. x2

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 1 minute à température ambiante
121
Annexe 5 : Protocole détaillé MACHEREY NAGEL, NucléoSpin DNA isolation FFPE sample
MACHEREY NAGEL NucleoSpin DNA isolation

from FFPE Tissue
1- Réactifs
-Kit NucleoSpin DNA FFPE XS (Macherey Nagel # 740980.50)

-Paraffin Dissolver (25 mL)
-Lysis Buffer FL (16 mL)
-Decrosslink Buffer D-Link (8 mL)
-Wash Buffer B5 (12 mL)
-Proteinase K (30 mg) et Proteinase Buffer PB (1.8 mL)
-Elution Buffer BE (13 mL)
-NucleoSpin® DNA FFPE XS Columns
2- Préalables
- Préparer le tampon de lavage B5 : Ajouter 48mL d’éthanol 100% dans les 12mL initiaux
du tampon.
- Préparer la solution Protéinase K : Ajouter 1.35mL de tampon PB dans les 30mg de
Protéinase K lyophilisés.
3- Mode opératoire

- Placer les coupes dans un tube eppendorf de 1,5mL
3.2 Déparaffinage au Paraffine Dissolver
- Ajouter 400 µL de Paraffine Dissolver

- Incuber à 60° pendant 5 minutes et vortexer toutes les minutes.
122
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 100 µL de tampon FL et vortexer.

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 1 minute. Deux phases se forment : la phase aqueuse avec
l’ADN au fond et la phase organique surnageante.
- Éliminer la phase organique à la pipette.
- Ajouter 10 µL de Protéinase K et vortexer.
- Vortexer pendant 5 secondes.
3.4 Chauffage + tampon D-Link (réverse l’effet « crosslink » du formol)

- Ajouter 100 µL de tampon D-Link et vortexer
- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 30 secondes
- Incuber à 90°C pendant EXACTEMENT 30 minutes.
- Vortexer 5 secondes et laisser refroidir à température ambiante pendant 2 min
- Centrifuger brièvement pour faire tomber le condensat au fond du tube.
3.5 Récupération ADN : colonne de matrice silice
- Ajouter 200 µL d’éthanol 100% et vortexer.

- Centrifuger à 1 000 rpm pendant 5 secondes
- Transférer la totalité du lysa dans la colonne
- Ajouter 400 µL du tampon de lavage B5

- Vider le tube collecteur. Au 2e lavage, placer un tube eppendorf neuf.
- Ajouter 20 µL de tampon BE au centre de la membrane.

3.7 Elimination de l’éthanol
- Incuber l’éluat (40 µL) à couvercle ouvert pendant 5 min à 90°C

123
Annexe 6 : Protocole détaillé EPICENTRE, MasterPure complete DNA and RNA purification kit
EPICENTRE MasterPure Complete DNA and RNA

Purification kit
1- Réactifs

-Isopropanol (Sigma # 19516-25ml)
-Kit Epicentre # MC85200
- T and C Lysis Solution 60 ml
- MPC Protein Precipitation Reagent 60 ml
- Proteinase K (50 μg/μl) 200 μl
- TE Buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1 mM EDTA) 8 ml
2- Préalables
3- Mode opératoire



124
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 300 µL de solution de lyse tissulaire + 5 µL de Protéinase K par tube et vortexer.

- Incuber à 56° overnight puis vortexer rapidement (10 secondes).
- Refroidir à 4°C pendant 3 à 5 minutes
3.4 Récupération ADN : Solution de précipitation protéique
- Ajouter 150 µL de réactif MPC et vortexer pendant 10 secondes.

- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 10 minutes.
- Pipetter le surnageant dans un tube eppendorf neuf et jeter le culot.
- Ajouter 500 µL d’isopropanol.
- Mélanger manuellement 10 fois sans secouer le tube.
- Retirer avec précaution l’isopropanol.
- Rincer avec 500µl d’éthanol 70%.

- Retirer tous les résidus d’éthanol par pipetage puis laisser sécher 10 minutes à température
ambiante.
- Ajouter 40 µL de tampon TE et vortexer.
- Préparer trois aliquots de 10 µL et conserver le tube initial avec les 10µL restants pour
dosage.
125
Annexe 7 : Protocole détaillé PHENOL CHLOROFORME
PHENOL CHLOROFORME
1- Réactifs

-Phénol / Chloroforme – alcool isoamylique (Sigma # P2069)
-Isopropanol (Sigma # 19516-25ml)
-Solution de lyse tissulaire (Qiagen # 56404)
-Protéinase K (Qiagen # 56404)
-Tampon TE (Qiagen # 56404)
2- Préalables
3- Mode opératoire

- Placer les coupes dans un tube eppendorf de 1,5


126
3.3 Lyse des tissus
- Ajouter 180 µL de solution de lyse tissulaire et 20 µL de Protéinase K.

-Vortexer.
- Incuber à 56° overnight puis vortexer rapidement (10 secondes).
- Refroidir à température ambiante.
3.4 Récupération ADN : Phénol Chloroforme – Alcool isoamylique
- Ajouter 300 µL de Phénol Chloroforme – alcool isoamylique et vortexer pendant 10

secondes.
- Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube eppendorf neuf.
-Ajouter 150µl d’isopropanol
-Incuber 1h au froid (-20°C pendant 10min et 4°C pendant 50min)
- Retirer avec précaution le surnageant.
3.5 Lavage ADN

- Ajouter 150 µL d’éthanol 70%.
- Centrifuger à 10 000 rpm pendant 5 minutes
- Retirer l’éthanol par pipetage puis laisser sécher à température ambiante.
- Ajouter 40 µL de tampon TE
-Vortexer.
- Préparer trois aliquots de 10 µL et conserver le tube initial avec les 10µL restants pour
dosage.
127
Annexe 8 : Résultats BRUTS des dosages et des ratios obtenus avec le BioDrop
Concentration
KIT QIAGEN (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1Q 47,5 3,54 2,113 0,04 0,176 0,01
1Q* 25 5,66 2,282 0,07 0,130 0,02
2Q 83 5,66 2,129 0,01 0,328 0,00
2Q* 52,5 0,71 2,235 0,04 0,295 0,00
3Q 88,5 6,36 2,107 0,01 0,312 0,00
3Q* 63,5 0,71 2,268 0,03 0,340 0,00
4Q 118,5 0,71 2,155 0,01 0,563 0,01
4Q* 134 0,00 2,144 0,02 0,638 0,00
5Q 44,5 0,71 2,283 0,05 0,267 0,00
5Q* 24 0,00 2,667 0,00 0,148 0,00
6Q 21 0,00 2,813 0,34 0,099 0,00
6Q* 22 0,00 2,150 0,00 0,132 0,00
19Q 58 1,41 1,864 0,04 0,608 0,01
20Q 60 0,00 1,962 0,00 0,689 0,00
Concentration
KIT QIAGEN Bis (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1Qb 57,5 0,71 2,040 0,01 0,250 0,01
1Qb* 21,5 2,12 2,122 0,05 0,198 0,01
2Qb 51 0,00 2,134 0,02 0,224 0,00
2Qb* 44 5,66 2,055 0,05 0,198 0,01
3Qb 133,5 0,71 2,205 0,02 0,447 0,00
3Qb* 50 1,41 2,043 0,01 0,248 0,01
4Qb 186 2,83 2,163 0,00 0,540 0,00
4Qb* 49,5 0,71 2,153 0,03 0,242 0,00
5Qb 154,5 0,71 2,113 0,04 0,176 0,01
5Qb* 55,5 0,71 2,076 0,03 0,252 0,00
6Qb 63,5 3,54 2,161 0,02 0,269 0,02
6Qb* 51 2,83 2,121 0,02 0,246 0,01
Concentration
KIT PROMEGA (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1P 18,5 0,71 1,610 0,04 0,421 0,00
1P* 13 0,00 1,625 0,00 0,268 0,00
2P 55 0,00 1,931 0,05 1,183 0,02
2P* 99 18,38 1,943 0,02 1,357 0,01
3P 65,5 0,71 2,080 0,02 0,491 0,01
3P* 74 0,00 2,000 0,00 0,159 0,00
4P 175 2,011 0,412
4P* 107 11,31 1,982 0,00 0,675 0,01
5P 33 2,062 0,066
5P* 27 0,00 1,929 0,00 0,179 0,00
6P 31 2,067 1,033
6P* 22,5 0,71 1,801 0,05 0,643 0,02
19P 198,5 3,54 1,990 0,00 0,614 0,01
20P 261 5,66 2,072 0,00 1,255 0,01
128
Concentration
KIT EPICENTRE (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1E 2 1,000 0,143
1E* 3 0,00 1,500 0,00 0,154 0,01
2E 21,5 2,12 1,959 0,06 0,645 0,03
2E* 13 2,83 1,723 0,21 0,470 0,04
3E 11,5 0,71 1,774 0,08 0,561 0,01
3E* 53 1,41 1,965 0,05 1,277 0,01
4E 29,5 4,95 1,971 0,04 0,972 0,04
4E* 15,5 6,36 1,619 0,07 0,618 0,04
5E 38,5 3,54 2,025 0,04 1,132 0,01
5E* 22 0,00 1,829 0,01 0,820 0,01
6E 43 0,00 1,955 0,00 0,925 0,01
6E* 23,5 7,07 1,797 0,10 0,678 0,03
19E 19,5 0,707 1,797 0,07 0,709 0,01
20E 75 1,414 1,974 0,04 1,364 0,01
Concentration
KIT MACHERY NAGEL (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1M 132 0,00 1,858 0,03 1,078 0,01
1M* 60 8,49 1,769 0,04 0,825 0,03
2M 104 2,83 1,908 0,03 1,175 0,02
2M* 85,5 0,71 1,900 0,02 1,188 0,01
3M 88,5 19,09 1,924 0,00 0,997 0,03
3M* 126,5 0,71 1,903 0,01 0,981 0,00
4M 210,5 2,12 1,940 0,01 1,380 0,01
4M* 497 9,90 1,965 0,00 1,795 0,04
5M 139,5 2,12 1,938 0,03 1,187 0,03
5M* 84 1,41 1,931 0,00 1,245 0,02
6M 79,5 21,92 1,863 0,00 0,924 0,11
6M* 96 2,83 1,865 0,02 0,799 0,04
19M 58 2,83 1,933 0,00 1,871 0,00
20M 38 0,00 2,000 0,00 3,839 0,54
KIT PHENOL Concentration

CHLOROFORME (ng/µL) Ecart-type A260/A280 Ecart-type A260/A230 Ecart-type
1PC 393,5 6,36 1,516 0,00 0,807 0,00
1PC* 480 1,41 1,496 0,01 0,929 0,00
2PC 741,5 19,09 1,532 0,00 0,930 0,00
2PC* 571 1,41 1,513 0,00 0,920 0,00
3PC 432 1,41 1,508 0,00 0,809 0,00
3PC* 557 1,41 1,512 0,00 0,937 0,00
4PC 121,5 10,61 1,530 0,02 0,484 0,00
4PC* 302,5 10,61 1,502 0,00 0,774 0,01
5PC 201,5 9,19 1,538 0,00 0,610 0,01
5PC*
6PC 123 25,46 1,547 0,00 0,467 0,06
6PC* 168 1,41 1,528 0,01 0,580 0,00
19PC 850 1,41 1,846 0,00 1,261 0,00
20PC 1104 7,071 1,593 0,02 1,341 0,03
129
130
PILLON Marielle
MISE AU POINT DE LA MÉTHODE D’EXTRACTION DE L’ADN

BACTÉRIEN DE BIOPSIES CUTANÉES CANINES FIXÉES PAR LE
FORMOL PUIS INCLUSES EN PARAFFINE POUR IDENTIFICATION PAR
qPCR
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 29 Octobre 2020
RESUME :
L’extraction de l’ADN d’un tissu fixé en formol et inclus en paraffine (FFPE) s’impose de plus en
plus en raison de l’omniprésence de ces derniers dans les laboratoires humains et vétérinaires. Le but
de notre travail est de mettre au point une méthode d’extraction adaptée à nos biopsies cutanées
canines pour amplifier de l’ADN canin (gènes GADPH et HPRT) par qPCR et de l’ADN bactérien
via le gène 16S. Six protocoles ont été choisis et comparés avec la méthode traditionnelle d’extraction
au Phénol-chloroforme. L’important est d’obtenir un ADN de bonne qualité et amplifiable par qPCR.
La difficulté majeure de cette extraction réside dans la faible quantité de matériel initial dans le
prélèvement et dans la dégradation du matériel génétique lors de la fixation au formol par formation
de ponts appelés « crosslinks ». Le protocole permettant d’obtenir la plus grande quantité d’ADN est
le protocole au Phénol-chloroforme suivi par le protocole Macherey. Le matériel extrait est contaminé
en solvants sans que cela interfère avec l’amplification des 2 gènes canins. La comparaison des temps
de lyse 2h, overnight et 48h ne montre pas de différences significatives. Tous les échantillons
Epicentre permettent l’amplification de l’ADN bactérien 16S et 2 échantillons sur 6 sont positifs avec
les protocoles Qiagen et Macherey. L’extraction et l’amplification du matériel génique de nos
échantillons est donc possible. Nos résultats montrent qu’il faut choisir le protocole en fonction de
l’objectif du projet : pour l’étude du génome canin, les protocoles Phénol-chloroforme ou Macherey
semblent les plus adaptés et pour la recherche d’ADN bactérien, le protocole Epicentre semble le
meilleur.
MOTS CLES : - Peau - Biopsie

- ADN bactérien - PCR quantitative
JURY : Président : Monsieur le Professeur Jean-François Nicolas
1er Assesseur : Monsieur le Professeur Didier Pin

2ème Assesseur : Madame la Docteure Zorée Djelouadji
Membre invité : Madame Nadège Milhau
DATE DE SOUTENANCE : 29 Octobre 2020
ADRESSE DE L’AUTEUR : 629 chemin de la péronière 69250 Poleymieux au Mont d’Or
131

2020 Lyon 063

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VETAGRO SUP

CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

MISE AU POINT DE LA MÉTHODE D’EXTRACTION DE

MISE AU POINT DE LA MÉTHODE D’EXTRACTION DE

ABITBOL Marie DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur

À Monsieur le Professeur Jean-François NICOLAS,

De la faculté de médecine de Lyon,

À Monsieur le Professeur Didier PIN

De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

À Madame la Docteure Zorée DJELOUADJI

De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

À Madame Nadège MILHAU

De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,

A Flora, Amélie, Godefroy et Océane

Aux Dr Julien Edet, Vincent Risse, Sandrine Cayet et… Sophie !

A Babouche et Chip, mes petits couics.

A Milka, Flocon, Rio, Actros, Chipie et Kim.

TABLE DES ANNEXES ..................................................................................................... 13

TABLE DES FIGURES ....................................................................................................... 15

TABLE DES TABLEAUX................................................................................................... 17

LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................. 19

PARTIE 1 – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................ 23

I. La biologie moléculaire : de sa naissance dans les années 50 à sa place essentielle en

PARTIE 2 – ETUDE EXPERIMENTALE ...........................................................................65

I. Introduction et objectifs de l’étude ......................................................................... 67

CONCLUSION .................................................................................................................. 105

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................. 107

ANNEXES ......................................................................................................................... 113

Annexe 5 : Protocole détaillé MACHEREY NAGEL, NucléoSpin DNA isolation FFPE

Annexe 6 : Protocole détaillé EPICENTRE, MasterPure complete DNA and RNA

Annexe 7 : Protocole détaillé PHENOL CHLOROFORME ................................................ 126

Tableau 1: Durée de conservation selon la méthode de cryoconservation et le type

Tableau 2 : Propriétés de divers agents fixateurs seuls ......................................................... 46

Tableau 3 : pH de différentes solutions de fixation ............................................................... 47

Tableau 4 : Influence de la température d'incubation de la Protéinase K sur la qualité de

Tableau 5 : Influence de la durée d’incubation de la Protéinase K sur la qualité de l’ADN .... 58

ARN : Acide ribonucléique

EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique

GAPDH : Glycéraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Kb : Kilo paire de base

PBS : Tampon phosphate salin (Phosphate Buffered Saline)

PCR : Réaction en chaîne par polymérisation (Polymerase Chain Reaction)

qPCR : Réaction en chaîne par polymérisation quantitative (Quantitative Polymerase Chain

RT-PCR : Transcription inverse par réaction en chaîne par polymérisation (Reverse

SDS : Dodécylsulfate de sodium

Tampon TE : Tampon Tris-EDTA

Taq Polymérase : Thermus aquaticus Polymérase

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Ce travail est divisé en 2 parties. La partie bibliographique présente, dans un premier

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La dénaturation du brin d’ADN, 94-97 °C pendant 1 minute.

Ces étapes sont schématisées en Figure 2 :

Chaque brin néoformé sert de matrice au prochain cycle, ainsi, l’enchaînement de

Figure 3 : La cinétique de la PCR Conventionnelle (© D’après Vierstraete 2001)