REPUBLIQUE DU CAMEROUN REPUBLIC OF CAMEROON

PAIX-TRAVAIL-PATRIE PEACE-WORK-PATHERLAND
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UNIVERSITE DE DSCHAND UNIVERSITY OF DSCHANG
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FACULTE DES SCIENCES FACULTY OF SCIENCES
************** *************
DEPARTEMENT DE DEPARTMENT OF BIOCHIMIE
BIOCHIMIE BP.96
BP.96

CLI :312 ANALYSE BIOMEDICALE

RAPPORT DE STAGE

Thème: MARQUEURS DE DIAGNOSTIC DE LA

TRYPANOSOMIASE.

Rapport de stage académique en vue de l’obtention d’une licence en biochimie

Rédigé par :

ABBA HASSAN

Matricule : Cm-Uds-19SCI2376

Filière : biochimie

Option : Clinique

Sous l’encadrement de :

Pr KUIATE JULES-ROGER

ANNEE ACADEMIQUE: 2021-2022

5
 DEDICACE:
A

Ma chère maman HAPSITA HASSAN

REMERCIEMENTS
i
 Mes remerciements s’adressent en premier lieu à Allah le très haut de m’avoir accordé le
souffle de vie et la force nécessaire de rédiger ce modeste travail.

 AU Pr KUIATE JULES-ROGER Chef de département de Biochimie de l’Université

de Dschang par ailleurs mon encadreur pour son encadrement et suivis tous au longue
de ce travail.
 A tous les enseignants du département Pr GATSING Donatien, Pr WOMENI Hilaire,
Pr ZAMBOU NGOUFACK François, Pr TELEFO Phélix Bruno, Pr KUETE Victor,
Pr TUME Christopher, Pr DZOYEM Jean Paul, Pr SIMO Gustave, Pr MBAVENG
Armelle, Pr TAMOKOU Jean-De-Dieu, Pr KOUITCHEU MABEKU Laure, Pr
BIAPA Prosper, Pr KUATE Dieudonné, Pr KAKTCHAM Pierre Marie, Pr
NJATENG Guy Sédar Singor, Pr KENGNE Anne Pascale, Pr KLANG Julie Mathilde,
Dr AGBOR Esther, Dr NGOH NEWILAH Gerard Bertin, Dr Innocent MBULLI ALI,
Dr GOKA Stéphanie, Dr LACMATA Stephen, Dr FANKAM Aimé, Dr FOGUE
Pythagore, Dr DANDJI Marc et Dr FUL KUH George et Dr MAFFO TAZOHO
Ghislain. qui ne ménage aucun effort pour notre réussite académique.
 A nos ainés de biochimie Mr Michel, Mr Karimo, Mr Bonsou, Mr Tali pour toute
l’aide qu’il nous apporte au quotidien.
 A HASSAN MAHAMAT et BOGUEL SAVALAM mes tubaires.
 A mon grand frère ALI BOGUEL qui est un vrai ami pour moi.
 A mes amis et cousins qui apportent leurs soutient et encouragement au quotidien il
s’agit notamment de : DINAMOU BIENVENU, BRAHIM BOGUEL SAVALAM,
LIMANOU JEANNE, ZAIBANA ABEL, KADESSOU PARFAIT, ABAGUEME TARA,
HLELTA EVE DOUMARSOU, LIDAME GERMAINE, HASSANE ABALI, ADOUM
GOZA,
 A mes frères et amis de Biochimie : ABDRAMANE ABDALLAH, MOUSTAPHA
ADAM SALEH, AMOUSSOU MOUSSA ABDELKERIME, ISSA ALI MAHAMAT,
MASSOUD MAHAMAT, MALDOUME AKOUYA, BEASNAL AGEE, DJIRAINGAR
TOMTE ELYSEE, ALLAMBATENAN INNOCENT, ALLANGOMI FRANCLIN,
DJIALLADE MAKISSI FABIEN, DJIN’YAHSINGNONE KYEBTEUBE, DIEUDONNE
JEAN BAPTIS.

SOMMAIRES
REMERCIEMENT.....................................................................................................................ii

TABLE DES FIGURES.............................................................................................................V

ABREVIATION.......................................................................................................................Vi

ii
RESUME et ABSTRAT..........................................................................................................Vii

INTRODUCTIO.........................................................................................................................1

I. DESCRIPTION DE LA TRIPANOSOMA HUMAINE AFRICAINE...........................2

I.1. Généralités............................................................................................................................2

I.2. Historique de la THA...........................................................................................................2

I.2. Historique de la THA...........................................................................................................3

I.3. Réparation géographique de la THA....................................................................................3

I.4. Taxonomie du trypanosome.................................................................................................4

I.5. Vecteurs................................................................................................................................4

A. Morphologies.......................................................................................................................4

B. Cycle de développement......................................................................................................5

II. LES MARQUEURS DANS LE DIAGNOSTIQUE CLINIQUE..........................................5

II.1. LES MARQUEURS MOLECULAIRES........................................................................5

II.1.1. Different forme des marqueure molaiculaire extre.......................................................6

A. Allozymes.......................................................................................................................6

B. Marqueurs mitochondriaux.............................................................................................6

C. Marqueurs microsatellites...............................................................................................6

II.1.2. Technique untise et sont principe d’utilisation.............................................................7

lI.1.2.1. Détection d’ADN par des sondes..........................................................................7

II.1.2.2. Amplification d’ADN par PCR.............................................................................8

II.1.2.3. L'amplification d’ARN..........................................................................................8

II.1.2.4. LAMP (amplification iso-thermale)....................................................................10

IL.2. LES MARQUEURS IMMUNOLOGIQUE.................................................................11

II.2.1. Le test d’agglutination : CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis). .11

II.2.2. Le test immunofluorescence IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test)..............12

II.2.3. Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)...........................................13

II.3. EXAMENS PARASITOLOGIQUES...........................................................................14

iii
 II.3.1. Examens microscopiques directs............................................................................14

II.3.2. Examens microscopiques après concentration parasitaire......................................15

II.3.3. Techniques de culture des parasites........................................................................16

Ill. Discussion et perspective....................................................................................................16

conclsion...................................................................................................................................18

Liste des figures

Figure 1: : Différents foyers de la THA au Cameroun (Simo, 2001). I.6. Les parasites
responsables des trypanosomes africaines..................................................................................3
Figure 2: Représentation schématique d'une glossine (Pollock, 1982).....................................4
Figure 3:Cycle reproductif de la glossine (Launois et al., 2004)................................................5
Figure 4: Cycle reproductif de la glossine (Launois et al., 2004)...............................................7
Figure 5:principe de l’amplification de l’ARN par PCR............................................................8
Figure 6:Principe de la LAMP (Loop-Mediated isothermal Amplification). Les couples.........9

iv
Figure 7: le test CATT..............................................................................................................11
Figure 8: Principe du test de détection d’anticorps par immunofluorescence indirecte ou
IFAT..........................................................................................................................................11
Figure 9:– Principe de l’ELISA indirect et de l’ELISA Sandwich...........................................12
Figure 10: Les étapes d’un test ELISA indirect de detection d’anticorps................................12
Figure 11:– Aspects morphologiques de trypanosomes responsables de la THA dans un frottis
sanguin......................................................................................................................................13

Abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

CATT Card agglutination test for trypanosomosis

CFT Complement Fixation Test

no-éthyle

v
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA-Ac ELISA de détection d’anticorps

ELISA-Ag ELISA de détection d’antigènes

Ig Immunoglobuline

IL Interleukine

LAMP Loop-mediated isothermal Amplification

MTN Maladies tropicales négligées

OMS Organisation mondiale de la santé

PCR Polymerase Chain Reaction

Se Sensibilité

Sp Spécificité

TAA Trypanosomios animale africaine

THA Trypanosomias humaine africaine

Tbrc Serum resistance-associated (SRA) gene of T. b. rhodesiense

Tbs-GP Trypanosoma brucei gambiense-specific glycoprotein

TDR Test de diagnostic rapide

TH2 T helper

Résumé

Les trypanosomoses africaines regroupent deux maladies : la trypanosomiase humaine

africaine (THA) et la trypanosomose animale africaine (TAA) ou Nagana. Ce sont des
maladies à transmission vectorielle et hémoparasitaires constituant une contrainte majeure au
développement en Afrique subsaharienne. Elles sont causées par des protozoaires sanguins
flagellés communément appelés trypanosomes. Ces parasites sont transmis principalement de
manière cyclique aux hôtes (mammifères et reptiles) par un insecte hématophage, la glossine
ou mouche tsé-tsé. Alors que le nombre de cas de THA est maintenant faible (quelques

vi
milliers de cas) et focalisé dans des petits foyers dits « micro-foyers », la nagana reste
distribuée sur une superficie de 1 millions de 10 Km2 menaçant près de 55 millions de bovins
(Desquesnes et al. 2013) dans 38 pays d’Afrique subsaharienne (Itard et al. 2003, Vreysen et
al., 2013). La nagana est endémique dans les régions où la mouche tsé-tsé est présente.

Un marqueur de diagnostic est une caractéristique mesurable qui peut être dosé dans le
diagnostic d'une pathologie à des fins thérapeutiques ou de suivi de l'état de la pathologie.

Les marqueurs de diagnostic de la THA ou TAA sont nombreuses mais classé en trois grands
groupes : les marqueurs moléculaires ( la recherche de l'ADN ou l'ARN du parasite dans le
sang de la personne infectée) , les marqueurs immunologique ( détection anticorps spécifique
développer par la personne infectée pour une réponse immunologique ou antigènes du
protozoaires recueilli dans le sang de la personne infectée.) et les marqueurs parasitologique
( le protozoaires diagnostiquer dans le sang de la personne infectée). Tous les marqueurs de
cette infections sont diagnostiqués avec des méthodes et techniques bien établi comme la
PCR pour les marqueurs moléculaires, les tests Élisa ou agglutination pour les marqueurs
immunologique et les examens microscopiques direct ou la culture des parasitaires pour les
marqueurs parasitologique. Toute fois d'autres protéines réactives peuvent être dosées en
sérodiagnostic pour la détection de la maladie chez l'homme ou chez les animaux.

En fin cette infraction est dangereuse et nécessite souvent des dépistages massif et actif dans
certains pays subsahariens en vue d'une prise en charge, [le seul test actuellement utilisé en
dépistage de masse est l'agglomération mais nous espérons que ça va s'améliorer avec les
avancements d'outils de diagnostic.

Abstract

African trypanosomiases include two diseases: African human trypanosomiasis (HAT) and
African animal trypanosomiasis (AAT) or Nagana. These are vector-borne and
haemoparasitic diseases constituting a major constraint to development in sub-Saharan Africa.
They are caused by blood-flagellated protozoa commonly called trypanosomes. These
parasites are mainly transmitted cyclically to hosts (mammals and rep-tiles) by a
hematophagous insect, the tsetse fly or tsetse fly. While the number of HAT cases is now low
(a few thousand cases) and focused in small foci called "micro-foci", nagana remains

vii
distributed over an area of 1 million by 10 km2 threatening nearly 55 million cattle
(Desquesnes et al., 2013) in 38 countries in sub-Saharan Africa (Itard et al., 2003, Vreysen et
al., 2013). Nagana is endemic in areas where the tsetse fly is present. A diagnostic marker is a
measurable characteristic that can be assayed in the diagnosis of a pathology for therapeutic
purposes or for monitoring the state of the pathology. The diagnostic markers of HAT or TAA
are numerous but classified into three large groups: molecular markers (the search for the
DNA or RNA of the parasite in the blood of the infected person), immunological markers
(detection of specific antibodies develop by the infected person for an immunological
response or antigens of the protozoa collected in the blood of the infected person.) and
parasitological markers (the protozoa diagnose in the blood of the infected person). All the
markers of this infection are diagnosed with well-established methods and techniques such as
PCR for molecular markers, Elisa tests or agglutination for immunological markers and direct
microscopic examinations or parasite culture for parasitological markers. However, other
reactive proteins can be assayed in serodiagnosis for the detection of disease in humans or
animals. In the end, this offense is dangerous and often requires massive and active screening
in certain sub-Saharan countries for treatment, the only test currently used in mass screening
is the agglomeration but we hope that it will improve with advancements in diagnostic tools.

viii
 INTRODUCTION

Les trypanosomiases sont des infections dues à des parasites appelés trypanosomes transmis
par des insectes hématophages (qui se nourrissent de sang). Selon l’espèce parasitaire en
cause, on distingue deux types de trypanosomiase : Trypanosoma gambiense et Trypanosoma
rhodesiense sont responsables des deux formes de la trypanosomiase humaine africaine ou
maladie du sommeil, et Trypanosoma cruzi de la trypanosomiase américaine ou maladie de
Chagas. Ce sont des parasitoses graves, potentiellement mortelles et souvent difficiles à traiter

Les trypanosomes sont transmis aux mammifères par des piqûres d'insectes hématophages
appelés mouches tsétsé ou glossines. Ces glossines responsables de la transmission des
trypanosomoses africaines appartiennent au genre Glossina sp. Il existe plusieurs espèces de
glossines et leur distribution est fonction des facteurs éco climatiques. Chaque espèce de
glossine ne transmet qu'un nombre limité d'espèces de trypanosomes et la distribution des
espèces de trypanosomes peut être liée à celle des glossines. De manière générale, la
distribution des trypanosomoses africaines suit celle de leur vecteur et couvre environ 10
millions de Km2, soit un tiers du continent africain (Brunhes et al., 1994).

Un marqueur biologique peut être n’importe quel indicateur biologique mesurable. Par
exemple, les biomarqueurs peuvent être cellulaires ou moléculaires (ADN, ARN, protéines,
métabolites). Ils sont mesurés à partir d’une biopsie tissulaire ou d’une biopsie liquide (sang,
urine, salive….). D’autres biomarqueurs (physiologiques, morphologiques, etc.) peuvent
également être utilisés ou mesurés par imagerie clinique ou médicale.

Cependant l'objectif principal de ce travail est de déterminer les biomarqueurs pour

diagnostiquer cette infection parasitaire. De manière spécifique nous voulons :

Déterminer les marqueurs moléculaires de l'infection et d'écrire le principe de fonctionnement

de cette méthode.

Savoir s'il les autre Marqueurs (physiologique, morphologiques...) Peuvent être exploités dans
les diagnostics clinique de routine.

1
 I. DESCRIPTION DE LA TRIPANOSOMIASE HUMAINE AFRICAINE

I.1. Généralités

La trypanosomiase humaine africaine (THA) commence après l'inoculation du trypanosome

chez le mammifère par la glossine. Les trypanosomes se multiplient sur le site de l'infection
menant à une réponse immunitaire: un gonflement ou chancre détectable sur la peau. Le
développement de la maladie peut être séparé en deux étapes sur la base des symptômes
cliniques observés : la phase hémolymphatique qui est caractérisée par la fièvre, des maux de
tête, des problèmes articulaires et des démangeaisons ; la phase neurologique commence
lorsque le parasite envahit le système nerveux central en passant à travers la barrière hémato-
encéphalique. La période d'incubation de la THA varie de quelques jours à plusieurs semaines
ou mois pour T. b. gambienses (forme aiguë), tandis que chez T. b. rhodienses, la maladie se
révèle souvent fatale dans les 9 à 12 mois, si le malade n'est pas traité.

I.2. Historique de la THA

Le premier cas de la THA a été enregistré au 14ème siècle en Afrique et a été décrit par
l'historien Ibn Khaldoun. Cet historien a parlé de la mort de l'empereur malien, sultan Mari
Jata après une maladie caractérisée par une somnolence diurne prolongé (Williams, 1996). En
1734, l'anglais Akins publie le premier rapport médical sur la maladie du sommeil où il décrit
plus précisément les stades avancés de la maladie, dénommée «sleeping distemper» (Cox,
2004). Livingstone (1852), missionnaire écossais soupçonne la relation entre une mouche et la
maladie et rapporte l'existence de la maladie sur les rives du lac Tanganyika où il perdit tout
le bétail après que celui-ci fût piqué par la mouche tueuse. En 1901, Forde découvre des
trypanosomes (nommés Trypanosoma gambiense par Dutton en 1902) dans le sang d'un
malade. Puis, Castellani en 1903 rapporte la présence du protozoaire dans le liquide
céphalorachidien (LCR) de la majorité des malades. La même année, Bruce fournit la preuve
que la maladie du sommeil est transmise par la mouche tsétsé. En 1910, Stephens et Fantham
décrivent chez un patient de Rhodésie un nouveau trypanosome Trypanosoma rhodesiense.
De morphologie différente, ce dernier s'avère plus virulent pour l'homme que T. gambiense et
est transmis par la glossine (Mulligan, 1970). C'est en 1917 que la première équipe mobile de

2
dépistage de la maladie du sommeil mis sur pied par le Docteur Eugene Jamot a vu le jour au
Cameroun.

I.3. Réparation géographique de la THA

La THA, sur 37 pays d'Afrique et environ 60 millions d'hommes sont exposés aux risques de
cette maladie et près de 70 000 personnes portent une infection active. On estime à moins de 7
000 le nombre de personnes détectées chaque année (Simarro et al., 2011) et près de 100 le
nombre de morts de suite de la maladie du sommeil par jour (Launois et al., 2004). La THA se
présente sous deux formes : la forme chronique qui sévit en Afrique Centrale et occidentale et
qui est due à T. b. gambiense et la forme aiguë présente en Afrique orientale et Australe et qui
est causée par T. b. rhodesiense (Steverding, 2008). Au début du 21ème siècle, plusieurs
foyers actifs de la THA existaient au Cameroun. Ces foyers (Figure 1) étaient regroupés dans
quatre grandes régions géographiques: les foyers de l'Ouest (Fontem, Mamfé et Plaines des
Mbos), les foyers côtiers (Douala et Campo) les foyers de l'Est (Bafia et le bassin du Nyong;
Doumé, Abong-Mbang et Lomié) et les foyers du nord (Logone et Chari). Aujourd'hui,
plusieurs de ces foyers ont disparu à cause des modifications du milieu ou de la lutte. C'est
ainsi que l'urbanisation a entraîné la disparition du foyer de Douala et le climat devenu rude
pour les glossines a favorisé l'extinction du foyer du Logone et Chari. Les foyers de Bafia et
du Haut-Nyong ont été éteints grâce à la lutte anti-vectorielle et l'assainissement du réservoir
animal.

Figure 1: : Différents foyers de la THA au Cameroun (Simo, 2001). I.6. Les parasites
responsables des trypanosomes africaines

3
 I.4. Taxonomie du trypanosome

Les trypanosomes sont des protistes (eucaryotes unicellulaires) sanguicoles appartenant à

l’ordre des Kinetoplastidae, à la famille de Trypanosomatidae et au genre Trypanosoma sp
d’après la classification de 1972 par Hoare (Hoare et al., 1972). Ils se caractérisent par la
présence d’un flagelle unique ondulant, d’un mitochondrie unique ramifiée et d’un
kinétoplaste contenant de l’ADN en bâtonnet (Uilenberg, 1998). Il existe plus de 36 espèces
de trypanosomes parasitant une grande variété d’animaux et même de plantes (Murray et al.,
1998). Les espèces infectieuses pour les mammifères ont été divisées en deux groupes selon la
partie du système digestif du vecteur dans laquelle elles se développent en forme méta
cyclique infectante et selon leur mode de transmission à l’hôte vertébré (classification
réactualisée par Enyaru et al., 2010). On distingue ainsi la section de Stercoraria et de la
section Salivaria. Chez les Stercoraria, les trypanosomes ont une évolution dite «
postérograde »chez le vecteur. Les trypanosomes infectants se trouvent dans la partie
postérieure du tube digestif du vecteur et sont déposés sur la peau et les muqueuses avec les
fèces.

I.5. Vecteurs

La mouche tsétsé est un insecte diptère cyclorrhaphe appartenant à la famille des Glossinidae
qui ne comporte qu'un seul genre, Glossina. Les trois sous-genres correspondent à trois
groupes anciennement définis sur les caractéristiques morphologiques et écologiques. Il existe
33 espèces et sous-espèces de tsétsé, réparties en trois sous genres ou groupes (figure 3) dont
les caractéristiques écologiques et comportementales sont très différentes (Leak, 1999).

A. Morphologies

Les glossines sont des insectes dont la principale caractéristique est de posséder une seule
paire d'ailes. La paire postérieure étant transformée en deux petites massues appelées
"haltères". Les glossines ont une taille qui varie entre 6 et 16 mm sans le proboscis. On les
reconnaît facilement grâce à leur trompe située horizontalement dans le prolongement de la
tête, leurs ailes qui se recouvrent au repos et qui présentent une cellule en forme de hache
entre la 4ème et la 5ème nervure, leurs antennes qui portent une soie particulière plumeuse,
l'arista (figure 4). Les mâles sont généralement plus petits que les femelles. Le poids des
adultes est fonction de l'espèce. L'appareil reproducteur externe du mâle se distingue par la

4
phallique (callosité fortement convexe) qui est observable sur la face ventrale de l'abdomen
alors que chez la femelle, on observe plutôt des plaques génitales (figure 5). L'anus et la vulve
sont situés à l'extrémité postérieure et sont entourés par des plaques dont le nombre, la forme,
et la pilosité varient selon les espèces (Launois et al., 2004). Contrairement aux moustiques et
aux tabanidés (taons) chez qui, seules les femelles piquent et se nourrissent de sang, les mâles
butinant le nectar des fleurs, les mâles et les femelles des mouches tsétsé sont hématophages
(Gouteux, 1995).

Figure 2: Représentation schématique d'une glossine (Pollock, 1982)

B. Cycle de développement

Les mouches tsétsé ont un cycle de vie original. Les femelles ne peuvent fertiliser plus d'un
œuf à la fois. Elles conservent chaque œuf dans leur utérus pour avoir une progéniture
développée intérieurement au cours des premiers stades larvaires, la stratégie est appelée
viviparité adénotrophique. Pendant ce temps, la femelle alimente sa progéniture avec une
substance laiteuse qui est sécrétée par une glande modifiée dans l'utérus. Dans le troisième
stade larvaire, la larve laisse l'utérus de la mouche tsétsé et commence une vie indépendante.
Cette étape de la vie est courte et d'une durée de quelques heures. La larve nouvellement
indépendante rampe dans le sol, forme une coque externe dure appelée pupe dans laquelle elle
achève sa transformation morphologique. Les pupes sont petites et mesurent moins de 1,0 cm
de long (Jordan, 1986). Cette étape de la vie a une durée variable, généralement trente à
quarante jours selon les espèces de glossines, selon la température et l'humidité du sol. Dans
les pupes, les larves complètent les deux derniers stades larvaires et le stade de pupaison. À la
fin du stade de pupaison, la jeune mouche utilise des mouvements de la tête pour sortir de la
pupe, après quoi il se déplace dans le sol jusqu'à la surface (figure 6).

5
 Figure 3:Cycle reproductif de la glossine (Launois et al., 2004)

II. LES MARQUEURS DANS LE DIAGNOSTIQUE CLINIQUE

.

Selon la FDA et le NIH, un bio marqueur (ou marqueur biologique) est ”une caractéristique
définie qui est mesurée comme un indicateur des processus biologiques normaux, des
processus pathogènes ou des réactions à une exposition ou une intervention, y compris les
interventions thérapeutiques “.

Le diagnostic classique de THA est base sur les marqueurs immunologiques (antigène) et
parasitologiques (le parasite) mais dans le cadre de ce travaille nous allons nous beaucoup
plus aux marqueurs moléculaires.

II.1. LES MARQUEURS MOLECULAIRES

Les tests moléculaires basés sur la mise en évidence de l’ADN ou de l’ARN trypanosomien
constituent un moyen indirect intéressant pour la détection des parasites, notamment du fait
qu’ils peuvent être pratiqués sur des échantillons mis en réserve (le sang congelé est
préférable au sang conservé sur papier absorbant ou dans un tampon de stockage). La plupart
de ces tests reposent sur l’amplification enzymatique de séquences d’ADN ou d’ARN
spécifiques des trypanosomes, avec visualisation du produit d’amplification. Alors que les
parasites du groupe Trypanozoon (T.brucei, T.evansi et T.equiperdum) peuvent être détectés
à travers des cibles à copie multiple comme l’ADN satellite et l’ARN ribosomique, allozyme,
et l’ADN mitochondriaux. L’identification de T.b.gambiense repose sur la détection du gène
TGSGP qui est à copie unique.

6
 II.1.1. Diffèrent forme des marqueurs moléculaires extraires

A. Allozymes

Les allozymes sont en fait des enzymes du métabolisme de base des cellules. Les allozymes
sont moins polymorphes, notamment chez les organismes parasites, et requièrent de travailler
sur du matériel frais, ce qui s'avère souvent difficile, en particulier dans les pays du Sud. Le
matériel biologique à utiliser doit se trouver en quantité suffisante, ce qui est souvent difficile
pour les organismes parasites, souvent de taille modeste et difficilement cultivable.

B. Marqueurs mitochondriaux

Les marqueurs cytoplasmiques correspondent à des loci présents dans le génome

mitochondrial. L'ADN mitochondrial s'est montré extrêmement informatif dans des études
phytogéographiques, car il présente des taux d'évolution relativement rapides et ne subit pas
de recombinaisons entre loci (Avise et al., 1987 ; Avise, 2000). Cependant, pour les études de
génétique des populations, les propriétés de ces marqueurs sont loin d'être idéales car l'ADN

Mitochondrial présente une hérédité uniparentale, typiquement maternelle. Ces marqueurs

sont haploïdes et ne peuvent par conséquent pas renseigner clairement sur le régime de
reproduction locale de l'espèce étudiée (De Meeûs, 2012).

C. Marqueurs microsatellites

Ce sont des séquences d'ADN formées par des répétitions continues (en tandem) de motifs (2,
3 etc.) composés de 1 à 6 nucléotides. Les microsatellites ont une taille relativement petite.
L'existence des microsatellites dans les génomes est connue depuis plusieurs décennies mais
ils ont été longtemps considérés comme des séquences de peu d'intérêt. Ce n'est qu'à la fin des
années 1980 qu'on a réalisé qu'il s'agissait probablement d'un des plus puissants marqueurs
mendéliens qu'on ait mis en évidence jusqu'à présent. Leur fonction biologique reste floue
(Epplen et al., 1993). Certaines études montrent que les variations de longueur de certains
microsatellites ont des effets phénotypiques sur la physiologie et le développement de certains
organismes (King et Soller, 1998).

7
Avec le développement des outils de la génétique moléculaire, une nouvelle page s'est ouverte
dans la lutte anti-vectorielle. Aujourd'hui, deux approches sont envisageables dans la lutte
anti-vectorielle: la suppression et l'éradication. Le choix d'une des approches va dépendre de
l'isolement ou non des populations de glossines. La suppression désigne la baisse des densités
de glossines en deçà d'un seuil de transmission et qui est adoptée lorsque la population de
glossines concernées n'est pas génétiquement isolée des populations voisines.

II.1.2. Technique utilisé et son principe d’utilisation

lI.1.2.1. Détection d’ADN par des sondes

L’utilisation de sondes marquées a été la première technique moléculaire employée pour

mettre en évidence la présence de trypanosomes du sous-genre Trypanozoon via la détection
de leur matériel génétique. Dans cette technique, l’ADN est dénaturé en portant à ébullition
l’échantillon à analyser. Les brins d’ADN séparés sont par la suite fixés sur une membrane.
L’ADN du parasite est mise en évidence par hybridation d’un oligonucléotide marqué, d’une
dizaine de paires de bases, complémentaire à une portion cible d’un brin de l’ADN des
trypanosomes. Cet oligonucléotide constitue ce que l’on appelle une sonde qui peut être
marquée de deux façons : soit par incorporation d’un composé radioactif (très souvent
l’isotope 32P), soit par un couplage chimique avec une enzyme (phosphatase alcaline). Pour
des nombreuses raisons, notamment la complexité de la technique, l’instabilité (et la
dangerosité) des matériaux radioactifs, la nécessité d’une infrastructure adaptée et d’une
expertise adéquate, cette technique a peu à peu été remplacée par les méthodes
d’amplification d’ADN notamment la PCR et a fini par être abandonnée (Uilenberg, 1998).

Figure 4: Cycle reproductif de la glossine (Launois et al., 2004)

II.1.2.2. Amplification d’ADN par PCR

8
La PCR, pour Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en Chaîne en
français, permet d’amplifier des séquences cibles d’ADN dans un milieu tamponné in vitro
jusqu’à les rendre détectables. Grâce à un couple d’amorces (une pour chaque brin, sens et
anti-sens) complémentaire et flaquant la région cible, une séquence d’ADN peut être recopiée
en plusieurs millions d’exemplaires par une polymérase (Desquesnes and de La Rocque,
1995, Mullis et al., 1986). La réaction enzymatique s’effectue en quelques heures (environ 2
heures) et est contrôlée par des cycles thermiques répétitifs. Après plusieurs cycles
d’amplification, le produit de la PCR appelé « amplicon » est révélé par migration sur un gel
d’agarose couplé à une coloration par un intercalant d’ADN comme le SYBR Green, le
bromure d’éthidium ou encore le Gelred (Uilenberg, 1998).

En termes de sensibilité, la PCR est 20 à 500 fois plus sensible (détection de 120
trypanosomes/mL) comparée aux techniques parasitologiques. Sa spécificité est fonction des
amorces choisies et surtout de la séquence cible à détecter. Ce fe Les types de marqueurs
moléculaires utilisés dans la génétique des populations

II.1.2.3. L'amplification d’ARN

L’amplification d’ARN est une technique initialement développée pour la détection de l’ARN
ribosomique 16S de Trypanozoon. Nommé NASBA (nucleic acid sequence based
amplification), cette technique a été adaptée à la détection de trypanosomes en 2007. Elle se
fait à une température unique et basse (40°C). Cette faible température d’amplification est la
principale faiblesse de la technique, car elle favorise des hybridations non spécifiques
(Mugasa et al., 2008). En outre l’instabilité de l’ARN rend cette technique plus incertaine.
Aucun kit n’a été développé sur cette technique (WHO,2013). Néanmoins, elle a été le
précurseur de la technique LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) qui a été par la
suite développée par Notomi et al. en 2000.

9
 Figure 5:principe de l’amplification de l’ARN par PCR

II.1.2.4. LAMP (amplification iso-thermale)

La LAMP est une technique qui permet d’amplifier une séquence cible d’acides nucléiques à
une température unique (isothermale). Elle a été décrite comme étant un test rapide,
spécifique, sensible et relativement simple à mettre en œuvre. Elle est caractérisée par
l’utilisation d’au moins deux couples d’amorces (internes, externes et amorces de bouches)
qui reconnaissance et lient six régions différentes de la séquence cible auxquelles ils sont
complémentaires (Eiken, n.d., Notomi et al., 2000). La réaction se fait généralement entre 62
et 65°C grâce à une polymérase thermostable dotée d’une activité de déplacement de brin. Le
plus souvent cette enzyme est une Bst DNA polymerase (polymérase I de Bacillus
stearothermophilus) qui amplifie en moins d’une heure l’ADN de 109 à 1010 fois (Figure
2.3). Le produit d’amplification de LAMP est un mélange de structures secondaires de tailles
différentes consistant en des répétitions alternativement inversées de la séquence cible sur le
même brin.

Le produit d’amplification peut être visualisé par différentes méthodes. Il est possible de
détecter l’amplicon par électrophorèse sur gel d’agarose et/ou de suivre la turbidité induite par
la formation d’amplicons (Njiru et al., 2008). Cependant, l’électrophorèse peut être lente et la
turbidité est peu sensible. La méthode la plus fréquemment utilisée est le suivi par réaction
colorée d’un composé fluorescent ou d’un agent colorant directement à l’œil. C’est le cas de
la calcéine qui forme un complexe avec le magnésium (magnésium pyrophosphate,
Mg2P2O7) produit par la réaction LAMP, donnant une coloration jaune-verte à la lumière
visible. La berbérine qui est un alcaloïde végétal et le bleu d’hydroxy naphtol peuvent
également être utilisés (Fischbach et al.2015). Les intercalants d’ADN comme le SYBR
Green et le GelRed, bien que potentiellement inhibiteurs de la réaction (notamment le SYBR
Green), sont également très utilisés pour visualiser le produit après la réaction d’amplification
(Silva et al., 2019). Pour toutes ces méthodes, les UV (Ultra-Violet) peuvent être utilisé pour
la visualisation. La révélation dans un système avec flux latéral (chromatographie) et
bandelette réactives a également été mise au point (Njiru, 2012). D’autres études ont permis
de développer une approche quantitative par le couplage de la réaction de la LAMP à la
fluorescence en temps réel (Xia et al., 2014).

10
 Figure 6:Principe de la LAMP (Loop-Mediated isothermal Amplification). Les couples

IL.2. LES MARQUEURS IMMUNOLOGIQUE

Le diagnostic immunologique ou immuno-diagnostic est basé sur la mise en évidence de la

liaison antigène-anticorps formant le complexe immun. Ainsi, ces méthodes vont consister
soit à détecter directement les antigènes parasitaires, relargués dans la circulation sanguine,
par l’intermédiaire d’anticorps spécifiques, soit à détecter la réponse immune de l’hôte contre
l’infection, c’est-à-dire les anticorps produits tels que les immunoglobulines de type M (IgM),
plus précoces, et les immunoglobulines de type G (IgG) plus tardives et persistantes. Les tests
de détection des antigènes parasitaires, signant une infection active, ont très peu été
concluants pour la TAA. Il existe un test rapide d’agglutination que l’on peut utiliser pour le
dépistage de masse. Il existe aussi des tests de diagnostic rapide utilisables à l’échelon
individuel qui se prêtent mieux au dépistage passif et qui sont en cours d’évaluation. Les tests
basés sur l’immunofluorescence ou les tests immuno-enzymatiques (ELISA) exigent plus
d’infrastructures de laboratoire. Le test d’immuno-trypanolyse est réservé aux laboratoires de
référence. Les examens sérologiques ne détectent les anticorps que 3 à 4 semaines après
l’infection et c’est peut-être l’une des raisons pour lesquelles il y a des faux négatifs. Il peut
aussi y avoir des réactions croisées avec d’autres parasitoses, notamment lorsqu’on opère sur
du sang total ou sur de faibles dilutions de sérum ou de plasma. Certains tests de diagnostic
rapide de l’infection à VIH et du paludisme peuvent donner des réactions croisées lorsqu’ils
sont pratiqués sur des échantillons de sang provenant de sommeilleux, ce qui réduit la
spécificité de ces tests.

II.2.1. Le test agglutination: CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)

Le test CATT est basé sur l’agglutination directe des parasites par des immunoglobulines de
type M (IgM) de l’hôte mammifère. Initialement développé pour T. brucei gambiense, il a été

11
adapté à la détection de T. evansi (Songa and Hamers, 1988). Ce test nommé CATT/T. evansi,
permet de mettre en évidence une infection à T. evansi. Dans la pratique, des parasites de la
souche T. evansi RoTat 1.2, purifiés, fixés et colorés et exprimant un antigène variable
prédominant (VSG RoTat 1.2), sont utilisés comme source d’antigène parasitaire. La réaction
d’agglutination se fait par la mise en contact d’un échantillon de sérum ou de sang d’un
animal infecté avec les antigènes parasitaires. Par la suite, les IgM (pentamériques) de
l’animal se lient à plusieurs parasites formant un agglutinât visible à l’œil nu (OIE, 2018b, c)
(Figure7). Très faciles d’usage sur le terrain, le test CATT est très employé dans les études
épidémiologiques notamment pour confirmer le statut d’infection d’un individu. Il permet de
faire un diagnostic actif (mise en évidence d’une infection active) grâce à la détection des IgM
qui sont les premiers anticorps produits généralement en phase précoce, ou parfois dans une
phase tardive avec une parasitémie persistante (OIE, 2018b).

Figure 7: le test CATT

II.2.2. Le test immunofluorescence IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test)

L’IFAT forme avec l’ELISA, les deux tests recommandés par l’OIE pour détecter les
infections à T. brucei, T. vivax et T. congolense. Le test d’immunofluorescence (IFAT)
consiste à faire réagir des trypanosomes préalablement fixés sur une lame avec des anticorps
provenant du sérum d’un animal infecté. Les anticorps fixant les protéines de trypanosomes
sont détectés à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore comme
l’isothiocyanate de fluorescéine. Après fixation des lames au glycérol, la fluorescence est
observée au microscope à fluorescence (OIE, 2018a) (Figure 8).

12
 Figure 8: Principe du test de détection d’anticorps par immunofluorescence indirecte ou
IFAT..

II.2.3. Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Le test ELISA constitue le « gold standard » du diagnostic sérologique de la trypanosomose

animale africaine (TAA). C’est un test immuno- enzymatique développé en 1971 par Engvall
et Perlmann (Engvall and Perlmann, 1971). Le test repose sur la reconnaissance d’antigènes
parasitaires, fixés sur une microplaque, par des anticorps provenant du sérum ou du plasma
d’un animal infecté. Un anticorps secondaire couplé à une enzyme (le plus souvent la
peroxydase) est ensuite ajouté et vient se fixer sur les complexes immuns lorsqu’ils sont
présents. La présence d’anticorps spécifiques dirigés contre les antigènes parasitaires est mise
indirectement en évidence par l’ajout d’un substrat chromogène qui, suite à l’action de
l’enzyme présence sur l’anticorps secondaire, donne une coloration quantifiable par un
spectrophotomètre (mesure de la densité optique). Il existe plusieurs variants de cette
technique mais le plus employé pour la TAA (décrit ici) est l’ELISA indirect (Figure 2.9A,
Figure 2.10). Les antigènes utilisés peuvent être la fraction soluble d’un lysat total de
trypanosomes (Luckins, 1977) ou une protéine parasitaire spécifique (Boulangé et al., 2002,
Fleming et al., 2014, 2016, Pillay et al., 2013). Les antigènes totaux solubles sont préparés à
partir de trypanosomes (issus du sang de rongeurs infectés) qui sont purifiés par
chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose (Lanham and Godfrey, 1970) puis
lysés et centrifugés pour éliminer les débris cellulaires. Les antigènes spécifiques sont quant-
à-eux des protéines de trypanosomes exprimées de manière recombinante en système
bactérien, ou plus rarement, en système eucaryote (levures, baculovirus, parasites).

Les tests basés sur les antigènes totaux étaient encore il y a peu, les seuls tests ELISA
existants pour la TAA et ces antigènes restent toujours les antigènes de référence
recommandés par l’OIE. Bien qu’ils aient une sensibilité et une spécificité acceptables, ces
tests ne permettent pas une détection « espèce spécifique ». Par ailleurs, la production de
grandes quantités d’antigènes à partir du sacrifice d’un nombre important de rongeurs est
13
éthiquement discutable. De plus, des difficultés de standardisation se posent fréquemment y
compris pour l’IFAT (Ijagbone et al., 1989). De nombreuses études ont été menées pour
pallier ce problème d’harmonisation d’antigènes, notamment par l’utilisation d’antigènes
recombinants. Plusieurs protéines recombinantes ont

Figure 9:– Principe de l’ELISA indirect et de l’ELISA Sandwich.

Figure 10: Les étapes d’un test ELISA indirect de détection d’anticorps

II.3. EXAMENS PARASITOLOGIQUES

Les techniques de diagnostic parasitologique sont base sur le Principe de mise en évidence
des parasites dans un liquide biologique de l’hôte. Le diagnostic peut Porte sur diffèrent
prélèvement dont le sang, le liquide œdémateux, le liquide céphalo-rachidien, les biopsies de
ganglions lymphatiques ou encore les sécrétions génitales pour ce qui concerne la dourine
(Uilenberg, 1998

II.3.1. Examens microscopiques directs

Ces examens sont surtout efficaces pendant la phase aiguë de la maladie au cours de laquelle
la parasitémie est élevée. Les examens microscopiques directs consistent à rechercher les
parasites soit directement dans une goutte de sang frais entre la lame et l lamelle (le plus
souvent) soit après enrichissement. Différentes préparations peuvent être réalisées pour
l’observation au microscope optique à un grossissement de 400 fois (Büscher et al., 2019,

14
Uilenberg, 1998). La préparation d’un état frais (goutte de sang) déposé sur lame permet bien
souvent l’identification des espèces de trypanosomes par l’examen de leur taille et de leurs
mouvements. En effet, T. congolense apparaît court avec une taille d’environ 8 à 24 µm, une
membrane ondulante peu développée. Cependant, toutes ces techniques réunies restent peu
sensibles en phase chronique, au moment où la parasitémie est généralement plus faible que
celle observée en phase aiguë. Ainsi, des méthodes dites de concentration deviennent
nécessaires pour augmenter le volume de sang à examiner et concentrer les trypanosomes.

Figure 11:– Aspects morphologiques de trypanosomes responsables de la THA dans un

frottis sanguin.

II.3.2. Examens microscopiques après concentration parasitaire

Deux techniques de centrifugation sont très largement utilisées pour améliorer la sensibilité de
l’examen microscopique : La technique de Woo (Woo, 1970) ou Hématocrite Centrifugation
Technique (HCT) et sa dérivée plus évoluée, la technique définie par Murray basée sur
l’approche de la couche leucocytaire, BCT (Buffy Coat Technique) (Murray and Dexter,
1988). La technique de Woo se fonde sur la séparation par sédimentation des différents
composants du sang en fonction de leur taille, leur forme et leur densité dans des tubes
capillaires micro hématocrites. Après centrifugation, l’hématocrite permettant d’estimer
l’anémie est déterminée et les trypanosomes sont observés directement dans le tube capillaire
au niveau de la jonction leucocytaire au microscope optique. Pour la BCT, les tubes
capillaires sont coupés au niveau de l’interface couche leucocytaire/plasma. La couche
leucocytaire extrudée sur une lame, recouverte d’une lamelle, est ensuite examinée au
microscope à un grossissement de 400x avec un éclairage de fond sombre ou à contraste de
phase. Comme la technique de Woo, la BCT permet également d’apprécier l’hématocrite

15
(PCV, Packed Cell Volume) et d’estimer la parasitémie par un système de notation (scoring).
Elles sont plus sensibles que l’examen du sang frais avec une sensibilité analytique dépendant
de l’espèce de trypanosome avec limite minimum de détection de 100 à 1000 parasites/ml
(Desquesnes and Dia, 2003, Paris et al., 1982, Uilenberg, 1998). D’autres part, une méthode
de chromatographie est également employée pour enrichir un échantillon de sang en
trypanosomes. Il s’agit de la chromatographie échangeuse d’anions sur résine de
diéthylamino-éthyle (DEAE) exploitant la différence de charges électriques entre les
trypanosomes (à charges neutres) et les éléments figurés du sang dont les érythrocytes
(chargés négativement) en fonction du pH. Les érythrocytes et les cellules blanches sont
capturés dans la colonne tandis que les trypanosomes sont élués. Couplée aux techniques de
centrifugation, elle apporte une grande sensibilité à la détection de trypanosomes (Camara et
al., 2010, Lanham and Godfrey, 1970.

II.3.3. Techniques de culture des parasites.

Dans certains cas, l’inoculation, à des rongeurs, de sang d’animaux au statut infectieux
incertain peut être utilisée lorsque qu’on suspecte une infection mais que la parasitémie est
indétectable, ou encore lorsqu’il est nécessaire d’amplifier le parasite pour affiner le
diagnostic d’espèces ou de sous-espèces de trypanosomes. Cette technique est plus sensible
que les méthodes de concentration, mais dépend des espèces de trypanosomes, toutes n’étant
pas infectieuses pour les rongeurs (par exemple T. vivax). De plus, elle achoppe sur le coût,
l’éthique et l’aspect pratique, et le diagnostic n’est pas immédiat (Büscher et al., 2005, Hailu,
2019, Uilenberg, 1998). La culture in vitro (kit KIVI) est également une méthode pour révéler
une infection par les trypanosomes mais reste peu pratique (Verloo et al., 2000). Elle est très
adaptée pour la mise en évidence de T. theileri, qui est une espèce non pathogène, présente en
faible nombre dans le sang mais facilement cultivable. Cette méthode reste cependant
coûteuse et délicate (Truc et al., 1992).

Discussion et Perspectives

L’élaboration d’outils de diagnostic adéquats pour la trypanosomose animale africaine et

trypanosomiase humaine africaine est une priorité car ces outils sont indispensables à la mise
en place des programmes de surveillance et de lutte contre cette maladie. La Remarqué

16
principe à relever ici est que les marqueurs immunologique et parasitologique sont beaucoup
plus utilisés dans le diagnostic courant dans les hôpitaux et cliniques contrairement aux
marqueurs moléculaires ceci s'explique par le fait que les marqueurs moléculaires sont
difficiles à extraire pour l'amplification et certaines techniques de dosage sont chers (LAMP)
par contre les résultats sont beaucoup plus fiable et sécurisé c'est pourquoi nous envisageons
de perspective dans ce sens. Toutefois, le besoin en nouvelles protéines immunoréactives à
utiliser comme antigènes, individuellement ou dans un cocktail pour développer des nouveaux
tests ou améliorer les tests existants, reste important. À l’aide d’un outil de prédiction
d’immunogénicité, une centaine de protéines ont été identifiées avec de tailles comprises entre
20 et 70 kDa et présentant 5 épitopes ou plus dans leurs séquences. L’analyse de la réactivité
des sérums provenant de différentesPour compléter l’analyse protéomique, certaines
expériences pourront être envisagées. Premièrement, l’identité de protéines immunoréactives
détectées lors de l’immunoblotting doit être confirmée. Nous proposons deux expériences
principales pour atteindre cet objectif : 1-/ Analyser et comparer le profil du sécrétome de
glycosylé avec le sécrétome normale et évaluer la réactivité des sérums testés sur ce
sécrétome de- glycosylé ; 2-/ Réaliser une chromatographie d’exclusion et récupérer les
fractions à des tailles correspondantes aux protéines détectées en immunoblotting. Ces
fractions pourraient ensuite être soumises de nouveau à l’immunoblotting et à une nouvelle
analyse protéomique pour identification. Les protéines identifiées par cette analyse pourront
être soumises à une analyse bio-informatique qui aura pour objectif d’identifier les protéines
homologues ou orthologues chez les autres espèces de trypanosome

17
 Conclusion

La trypanosomiase (pour l’Homme) et la trypanosomose (pour l’animal) sont des maladies

qui affectent respectivement les humains et les animaux, domestiques et sauvages. La
trypanosomiase humaine africaine ou maladie du sommeil compte actuellement moins de
1000 cas en Afrique et est limitée à quelques foyers épidémiques (OMS, 2020). Très
récemment, deux pays Ouest africains, en l’occurrence le Togo et la Côte d’ivoire, ont reçu la
validation de l’OMS sur l’élimination de cette maladie comme problème de santé publique
(OMS, 2020, 2021). Cette validation a été obtenue car moins d’un cas par 10 000 habitants a
été noté dans ces pays pendant au moins cinq ans. Cette élimination a été atteinte grâce à la
forte réduction de nombre de cas dans les foyers endémiques par des mesures robustes de
contrôle et de surveillance, au dépistage actif (et passif) des populations à risque et à la lutte
anti-vectorielle (OMS, 2021). Plusieurs autres pays africains ont entamé le processus pour
obtenir cette validation. Citons : Le Bénin, le Burkina Faso, le Cameroun et le Ghana. Ainsi
l’objectif de l’OMS qui est d’éradiquer la maladie du sommeil reste un objectif à porter de
mai si les efforts se poursuivent dans cette voie. De l’autre côté, si la lutte anti-vectorielle
participe également à l’élimination de la trypanosomose animale africaine au travers du
programme PATTEC, les stratégies de contrôle et de surveillance qui dépendent d’un
diagnostic actif (et passif) rencontrent quelques difficultés (revu dans Büsche et al. 2019,
Desquesnes and Dávila, 2002, Ijagbone et al. 1989). Premièrement, un programme de
dépistage harmonisé semble absent. En second lieu les outils de diagnostic adaptés aux études
épidémiologiques sont peu ou pas accessibles (Peeling). L'une des objectifs de nos travaux est
de proposer d'autres alternatives de diagnostic adaptés et facile à pratiquer dans la routine
(diagnostic moléculaires).

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