Développement de Nanoparticules de Silice Mésoporeuse Multifonctionnelles

Développement de nanoparticules de silice
mésoporeuse multifonctionnelles :
Synthèse, caractérisation et applications biomédicales
Thèse
Meryem Bouchoucha
Doctorat en Chimie
Philosophiae Doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
© Meryem Bouchoucha, 2017

Développement de nanoparticules de silice
mésoporeuse multifonctionnelles :
Synthèse, caractérisation et applications biomédicales
Thèse
Meryem Bouchoucha
Sous la direction de :
Freddy Kleitz, directeur de recherche

Marc-André Fortin, codirecteur de recherche
René C.-Gaudreault, codirecteur de recherche
Résumé
Les nanoparticules de silice mésoporeuses (MSNs) sont des matériaux prometteurs pour les applications
biomédicales en raison de leurs propriétés uniques : leur taille modulable, leur grande surface, leur grand volume
poreux, leur morphologie ajustable, et leur surface aisément modifiable. L’objectif principal de cette thèse était
de contrôler ces paramètres afin de développer des MSNs multifonctionnelles pour la livraison des médicaments
et l’imagerie biomédicale. Tout d’abord, une stratégie de fonctionnalisation sélective de la surface externe des
MSNs a été développée pour éviter la perte de porosité due aux procédures conventionnelles de greffage. Un
polymère biocompatible (le polyéthylène glycol) et une molécule sonde d’imagerie par résonance magnétique
(IRM) ont été utilisés. Cette fonctionnalisation a mené à la conception de nanoparticules à fort potentiel pour la
mise au point d’applications thérapeutiques et de diagnostic. Les nanoparticules obtenues se caractérisent par
un fort potentiel de contraste en IRM, par une capacité élevée de chargement des médicaments, et par une
aptitude à assurer une libération contrôlée des médicaments dans des conditions physiologiques. Ensuite, le
contrôle de la taille des MSNs et de leur chimie de surface ont permis un meilleur contrôle de la capacité de
piégeage et de relargage des médicaments (exemples : des agents anticancéreux). Ils ont permis également
une amélioration de leur internalisation, de leur rétention cellulaire, de leur ciblage, de leur diffusion dans les
matrices cancéreuses et de leur action anti-tumorale. Les meilleures performances ont été obtenues avec les
nanoparticules de petites tailles (<50 nm) et fonctionnalisées avec des groupements phosphonates. Par la suite,
afin de développer le potentiel de ciblage de ces produits, les particules ont été fonctionnalisées avec l’anticorps
"Ri7" ciblant les cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique. Lors de tests in vitro et in vivo, les
nanoparticules Ri7-MSN de 50 nm se sont accumulées spécifiquement et massivement dans ces cellules. Ces
résultats ouvrent les portes sur l’utilisation potentielle de telles nanoparticules pour la livraison de médicaments
aux cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique, qui sont impliquées dans plusieurs maladies du
système nerveux central. Finalement, la fonctionnalisation de la surface des MSNs par des composés fluorés
et des chélates de gadolinium a permis de développer des nanoparticules comme sondes potentielles pour l’IRM
binucléaire (IRM du proton et du fluor). Ces particules se caractérisent par leurs excellentes propriétés
relaxométriques et par leur potentiel à être détectées et à générer un contraste positif dans les images d’IRM.
En résumé, l’ensemble de ces travaux a permis de concevoir de nouvelles voies prometteuses pour le
développement de nanovecteurs de silice mésoporeuse pour des applications éventuelles en thérapie et en
diagnostic.
iii
Abstract
Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) have emerged as promising nanomaterials for biomedical applications
owing to their unique properties: tunable size, high surface area, large pore volume, adjustable morphology and
easily modifiable surface. The main objective of this thesis is to control these parameters to develop
multifunctional MSNs for drug delivery and biomedical imaging. First, a selective surface functionalization
strategy of MSNs was developed. Magnetic resonance imaging (MRI) probe molecule and polyethylene glycol
was grafted preferentially at the outer surface. This approach is a straightforward and efficient strategy that leads
to the design of potential theranostic nanoparticles without porosity loss and with high drug loading capacity.
These nanoparticles not only have a remarkable MRI positive contrast enhancement but also allow a controlled
drug release in physiological conditions. Then, the particle size control and surface chemistry functionalization
of MSNs led to better control over loading and release of positively charged drug (doxorubicin (Dox) was used
as an anticancer drug model), intracellular drug release efficiency, intratumoral diffusion, as well as tumor growth
inhibition and therapeutic efficiency. Better performances were obtained with small phosphonated nanoparticles
(< 50 nm). Afterwards, we demonstrated, both in vitro and in vivo, the impact of size and bioconjugation of MSNs
with the antibody "Ri7" on the specific targeting of blood brain barrier endothelial cells (BMEC). 50 nm Ri7-MSN
nanoparticles were shown to accumulate specifically and massively in BMEC. These results open the door to
the potential application of such nanoparticles for therapeutic drug delivery to the endothelial cells of the blood-
brain barrier, which are involved in several central nervous system diseases. Finally, labeling MSNs with fluorine
compounds and gadolinium chelate molecules led to the development of nanoparticles as potential binuclear
MRI probes (1H and 19F). These nanoparticles have shown their excellent relaxometric properties and their ability
to be detected and generate a positive contrast in 1H and 19F MRI image. All this work represents a significant
advance in the design of high colloidal stability silica-based nanovectors, which could provide novel theranostic
nanocompounds.
iv
Tables des matières
Résumé ............................................................................................................................................................. iii
Abstract ............................................................................................................................................................ iv
Tables des matières.......................................................................................................................................... v
Liste des tableaux ............................................................................................................................................ ix
Liste des figures ............................................................................................................................................... x
Liste des abréviations et des sigles.............................................................................................................. xv
Remerciements .............................................................................................................................................. xix
Avant-propos ................................................................................................................................................ xxii
Introduction ....................................................................................................................................................... 1
 Mise en contexte.................................................................................................................................... 1
 Objectifs ................................................................................................................................................. 3
 Structure de la thèse.............................................................................................................................. 5
Chapitre 1 : Théorie .......................................................................................................................................... 7
1.1 Synthèse des nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs)........................................................... 7
1.1.1 Mécanismes de synthèse .................................................................................................................. 9
1.1.2 Contrôle de la taille des pores des MSNs ....................................................................................... 11
1.1.3 Contrôle de la forme des MSNs ...................................................................................................... 11
1.1.4 Contrôle de la taille des MSNs ........................................................................................................ 11
1.1.4.1 Influence du pH........................................................................................................................ 12
1.1.4.2 Influence de la dilution et de la présence d’agents stabilisants ............................................... 13
1.1.4.3 Influence des ratios molaires des réactifs ................................................................................ 14
1.1.4.4 Influence des co-précurseurs de silice :................................................................................... 14
1.2 Chimie de surface et stabilité colloïdale des MSNs ................................................................................ 15
1.3 Fonctionnalisation de la surface des MSNs............................................................................................ 17
1.3.1 Fonctionnalisation de la surface par co-condensation .................................................................... 17
1.3.2 Fonctionnalisation de la surface par post-greffage ......................................................................... 18
1.3.3 Greffage sélectif de la surface interne et externe des MSNs : ........................................................ 19
1.3.3.1 Greffage sélectif par co-condensation ..................................................................................... 19
1.3.3.2 Greffage sélectif par post-greffage .......................................................................................... 20
1.3.4 Revêtement polymérique ................................................................................................................ 22
 Greffage du polyéthylène glycol (PEG) ....................................................................................... 22
1.4 Marquage des MSNs avec des sondes d’imagerie biomédicale (imagerie par résonance magnétique
(IRM) et imagerie optique) ............................................................................................................................ 23
1.4.1 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM ................................................................................ 23
1.4.1.1 IRM du proton (1H) et du fluor (19F) .......................................................................................... 23
1.4.1.2 Marquage des MSNs avec agents de contraste en IRM du 1H ................................................ 24
 Les agents de contraste en IRM du 1H ................................................................................... 24
 Marquage des MSNs avec des chélates de gadolinium ......................................................... 26
1.4.1.2 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM du 19F .............................................................. 28
1.4.2 Marquage des MSNs avec des fluorophores .................................................................................. 29
1.5 MSNs pour la vectorisation des médicaments........................................................................................ 30
1.5.1 Paramètres influençant le ciblage et l’internalisation des MSNs par les cellules ............................ 30
1.5.1.1 Taille des MSNs....................................................................................................................... 30
1.5.1.2 Charge de la surface ............................................................................................................... 32
1.5.1.3 Greffage de ligands de ciblage ................................................................................................ 32
 L’anticorps Ri7 comme ligand ciblant les cellules endothéliales de la barrière
hématoencéphalique ....................................................................................................................... 33
1.5.2 Paramètres influençant l’adsorption et le relargage des médicaments ........................................... 35
v
1.5.2.1 Surface spécifique et porosité.................................................................................................. 35
1.5.2.2. Morphologie des particules ..................................................................................................... 36
1.5.2.3. Chimie de surface ................................................................................................................... 37
1.5.2.4 Stabilité de la silice à l’hydrolyse ............................................................................................. 38
1.6 Techniques de caractérisation : .............................................................................................................. 39
1.6.1 Diffraction des rayons X (DRX) ....................................................................................................... 39
1.6.2 Physisorption d’azote ...................................................................................................................... 41
1.6.3 Microscopie électronique à transmission (MET) ............................................................................. 42
1.6.4 Diffusion de la lumière en mode dynamique (DLS) ......................................................................... 43
1.6.5 Potentiel zêta .................................................................................................................................. 44
1.6.6 Analyse thermogravimétrique (ATG) ............................................................................................... 45
1.6.7 Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) ........................................................... 45
1.6.8 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)............................................................. 46
1.6.9 Spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X (XPS) ......................................................... 46
1.6.10 Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis) ..................................................................................... 47
1.6.11 Spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS) ................................................. 47
1.6.12 Microscopie optique à fluorescence .............................................................................................. 48
1.6.13 IRM et relaxométrie ....................................................................................................................... 48
1.6.14 L’algorithme Voronoi tesselation_EBImage R package……………………………………………….50
Chapitre 2 – Article 1 : Mesoporous Silica Nanoparticles: Selective Surface Functionalization for
Optimal Relaxometric and Drug Loading Performances ............................................................................ 52
Résumé ........................................................................................................................................................ 53
Abstract ........................................................................................................................................................ 54
2.1 Introduction ............................................................................................................................................. 55
2.2 Results and Discussion .......................................................................................................................... 57
2.2.1 Synthesis and Physicochemical Characterization ........................................................................... 57
2.2.2 1H Relaxometric Properties ............................................................................................................ 65
2.2.3 Colloidal Stability ............................................................................................................................. 67
3.2.4 Biocompatibility and Viability Test ................................................................................................... 68
2.2.5 Drug Loading and In vitro Drug Release ......................................................................................... 69
2.3 Conclusion .............................................................................................................................................. 72
2. 4 Experimental section ............................................................................................................................. 73
2.4.1 Materials.......................................................................................................................................... 73
2.4.2 Mesoporous Silica Nanoparticles Synthesis ................................................................................... 73
2.4.3 MSNs Textural Properties and Thermogravimetric Analysis ........................................................... 74
2.4.4 Particle Size and Physicochemical Analysis ................................................................................... 75
2.4.5 MSNs Drug Loading and In vitro Drug Release Assays .................................................................. 76
2.4.6 Cell Viability Study ............................................................................................................................ 76
2.5 Supporting Information ............................................................................................................................ 77
2.6 Acknowledgements ................................................................................................................................ 83
Chapitre 3 – Article 2 : Size-Controlled Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles for Tunable
Drug Release and Enhanced Anti-Tumoral Activity .................................................................................... 84
Résumé ........................................................................................................................................................ 85
Abstract ........................................................................................................................................................ 86
3.1 Introduction ............................................................................................................................................. 87
3.2 Results and Discussion .......................................................................................................................... 89
3.2.1 Synthesis and Characterization of Different-Sized MSNs. .............................................................. 89
3.2.2 Drug Loading, in vitro Drug Release Profiles, and Phosphonate Grafting ...................................... 95
3.2.3 Cell Uptake Studies and Biocompatibility ................................................................................... 101
3.2.4 Intracellular Drug Release and in vitro Cytotoxicity ....................................................................... 103
3.2.5 In vivo Drug Release and Tumor Control ................................................................................... 107
vi
3.3 Conclusion ............................................................................................................................................ 110
3.4 Experimental Section............................................................................................................................ 111
3.4.1 Materials........................................................................................................................................ 111
3.4.2 Small-Sized MSNs (45 nm Diameter) ........................................................................................... 111
3.4.3 Intermediate-Sized MSNs (300, 150, and 90 nm Diameter).......................................................... 111
3.4.5 Large-Sized MSNs (500 nm Diameter) ...................................................................................... 112
3.4.6 Functionalization of MSNs with Phosphonate ............................................................................... 112
3.4.7 Functionalization of MSNs with Fluorophores ............................................................................... 112
3.4.8 X-Ray Diffraction Characterization ................................................................................................ 112
3.4.9 Nitrogen Physisorption Analysis .................................................................................................... 113
3.4.10 Thermogravimetric Analysis (TGA) ............................................................................................. 113
3.4.11 TEM Size Analysis ...................................................................................................................... 113
3.4.12 Dynamic Light Scattering and Zeta Potential Measurements...................................................... 113
3.4.13 NMR Characterization ................................................................................................................. 113
3.4.14 MSN Drug Loading and in vitro Drug Release Assays................................................................ 114
3.4.15 Cell Viability Study ...................................................................................................................... 114
3.4.16 Nanoparticle Cell Uptake Study .................................................................................................. 114
3.4.16 Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane Assay .................................................................... 115
3.4.17 Immunohistofluorescence ........................................................................................................... 116
3.5 Supporting Information ......................................................................................................................... 116
3.6 Acknowledgements .............................................................................................................................. 121
Chapitre 4 – Article 3 : Antibody-Conjugated Mesoporous Silica Nanoparticles for Brain Microvessel
Endothelial Cells Targeting.......................................................................................................................... 122
Résumé ...................................................................................................................................................... 123
Abstract ...................................................................................................................................................... 124
4.1 Introduction ........................................................................................................................................... 125
4.2 Results and Discussion ........................................................................................................................ 126
4.2.1 Physicochemical and Textural Characterization of MSN............................................................... 127
4.2.2 Bioconjugation of Monoclonal Antibody (Ri7) to MSN ................................................................... 131
4.2.3 Colloidal stability ........................................................................................................................... 133
4.2.4 1H Relaxometric Properties and in vitro MRI Cell Imaging ............................................................ 135
4.2.5 Immunohistochemistry Studies on Coronal Brain Sections ........................................................... 136
4.2.6 Development of a quantitative cellular assay ................................................................................ 137
4.2.7 Ri7-MSN Accumulation in Brain Cells ........................................................................................... 139
4.2.8 Uptake Affinity of Ri7-Conjugated MSN ........................................................................................ 142
4.2.9 Assessment of Ri7-MSN50 BBB Targeting Ability in vivo............................................................... 145
4.3 Conclusion ............................................................................................................................................ 146
4.4.1 Materials........................................................................................................................................ 147
4.4.2 Production and purification of Ri7 anti-TfR antibody ..................................................................... 147
4.4.3 Conventional MSN (160 nm in diameter) ...................................................................................... 147
4.4.4 Small sized-MSN (50 nm in diameter)........................................................................................... 147
4.4.5 Amine functionalization ................................................................................................................. 148
4.4.6 DTPA grafting................................................................................................................................ 148
4.4.7 DTPA-Gd(III) Chelation ................................................................................................................ 148
4.4.8 PEG grafting and conjugation of the antibody (Ab: Ri7; IgG) to MSNx-DTPA(Gd) ........................ 148
4.4.9 Antibody labeling with Alexa Fluor®647 ........................................................................................ 149
4.4.10 X-ray diffraction characterization ................................................................................................. 149
4.4.11 Nitrogen physisorption analysis................................................................................................... 149
4.4.12 Thermogravimetric analysis - Differential Scanning Calorimetry analysis (TGA-DSC) ............... 150
4.4.13 TEM particle size analysis........................................................................................................... 150
vii
4.4.14 Dynamic light scattering .............................................................................................................. 150
4.4.15 NMR characterization.................................................................................................................. 150
4.4.16 X-ray photoelectron spectroscopy ............................................................................................... 150
4.4.17 Attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) ..................... 150
4.4.18 1H relaxation analysis and relaxometric properties measurement............................................... 151
4.4.19 MRI cell pellet imaging ................................................................................................................ 151
4.4.20 In vitro cell uptake experiments ................................................................................................... 151
4.4.21 Cellular fluorescence quantification............................................................................................. 152
4.4.22 Immunohistochemistry ................................................................................................................ 152
2.6 Acknowledgment .................................................................................................................................. 156
Chapitre 5 – Article 4 : Fluorinated Mesoporous Silica Nanoparticles for Binuclear Probes in 1H and 19F
Magnetic Resonance Imaging ..................................................................................................................... 157
Résumé ...................................................................................................................................................... 158
Abstract ...................................................................................................................................................... 159
5.1 Introduction ........................................................................................................................................... 160
5.2 Results and Discussion ........................................................................................................................ 162
5.2.1 Synthesis of MSNs, Fluorination and Textural Properties ............................................................. 162
5.2.2 Spectroscopic Characterisation of FMSNs and polyFMSNs ......................................................... 165
5.2.3 Colloidal Stability of FMSNs and polyFMSNs ............................................................................... 168
5.2.4 19F Relaxometric Properties of FMSNs and polyFMSNs ............................................................... 169
5.2.5 1H Relaxometric Properties ........................................................................................................... 171
5.2.6 Magnetic Resonance Imaging Studies (1H and 19F MRI) .............................................................. 174
5.3 Conclusion ............................................................................................................................................ 175
5.4.1 Materials........................................................................................................................................ 176
5.4.2 Synthesis of Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles ..................................................... 176
5.4.2.1 MCM-48 synthesis ................................................................................................................. 176
5.4.2.2 DTPA grafting ........................................................................................................................ 176
5.4.2.3 Grafting of fluorosilane ........................................................................................................... 176
5.4.2.4 Grafting of polyfluorosiloxane ................................................................................................ 177
5.4.2.5 PEG Grafting ......................................................................................................................... 177
5.4.3 Physicochemical characterization ................................................................................................. 177
5.4.3.1 Nitrogen physisorption analysis ............................................................................................. 177
5.4.3.2 Thermogravimetric analysis - Differential Scanning Calorimetry analysis (TGA-DSC) .......... 177
5.4.3.3 TEM size analysis .................................................................................................................. 178
5.4.3.4 Dynamic light scattering ......................................................................................................... 178
5.4.3.5 NMR general characterization ............................................................................................... 178
5.4.3.6 1H relaxation analysis and relaxometric properties measurement ......................................... 178
5.4.3.7 19F relaxometric properties measurement .............................................................................. 178
5.4.3.8 19F MR Imaging ...................................................................................................................... 179
5.6 Acknowledgment .................................................................................................................................. 181
Conclusions et perspectives ....................................................................................................................... 182
Bibliographie…………………………………………………………………………………………………………. 186
viii
Liste des tableaux
Tableau 1.1 Comparaison entre quelques matériaux de silice mésoporeuse
nanostructurés………..................................................................................................... 8
Table 2.1 Physicochemical parameters of MSN-yPEG; MSN-xDTPA and MSN-xDTPA-yPEG
nanoparticles extracted from nitrogen physisorption measurements………………...….… 63
Table S2.1 Physicochemical parameters of MSN-yPEG and MSN-yPEG-xDTPA nanoparticles
obtained from nitrogen physisorption measurements……………………………..………… 82
Table S2.2 Percentage atomic concentrations extracted from the XPS measurements……………… 82
Table S2.3 Release kinetic parameters. Release kinetics parameters were obtained for profiles up
to 90% of total amount released……………………………………………………………..… 83
Table 3.1 Physicochemical parameters of different sized nanoparticles obtained from nitrogen
physisorption measurements…………………………………..…………………………….… 92
Table 3.2 Release kinetics parameters. Release kinetics parameters were obtained for profiles up
to 90% of total amount released……………………………………………………………….. 100
Table S3.1 Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of different-sized pure
nanoparticles…………………………………………………………………………………….. 121
Table S3.2 Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of different-sized phosphonated-
nanoparticles…………………………………………………………………………………….. 121
Table S3.3 Half maximal inhibitory concentrations (IC50, mean ± SD) of Dox@PMSN45,
Dox@PMSN150 and free Dox after 24 h, 48 h and 72 h incubation with cancer cells……. 122
Table 4.1 Physicochemical parameters from nitrogen physisorption measurements (at -196 °C)… 130
Table 4.2 XPS measurements: elemental analysis……………………………………………………… 132
Table S4.1 Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of the nanoparticles, before and
after antibody bioconjugation…………………………………………………………………... 157
Table 5.1 Porosity data of nanoparticles extracted from nitrogen physisorption measurements…... 165
Table 5.2 Percentage atomic concentrations at the surface of MSNs, extracted from the XPS
measurements…………………………………………………………………………………… 168
ix
Liste des figures
Figure 1.1 Images MET et schéma de la structure de surface des pores des MCM-41 (a) et des
MCM-48 (b)……………………………………………………………………….. 9
Figure 1.2 Mécanismes de formation des matériaux mésoporeux : mécanisme coopératif d’auto-
assemblage (voie A) et mécanisme "liquid cristal templating" (voie B)……………………. 10
Figure 1.3 Représentation schématique de l’interaction à l’interface organique-inorganique
impliquée dans la synthèse des silices mésoporeuses de type MCM…………………….. 10
Figure 1.4 Influence du pH sur la vitesse de condensation de la silice et la charge des espèces
siliciques………………………………………………………………………………………….. 13
Figure 1.5 Schéma du mécanisme d’auto-assemblage de la mésostructure des MSNs en présence
d’un agent inhibiteur de croissance (F127)……………………………………….. 14
Figure 1.6 Les différents types de silanols et siloxanes à la surface des MSNs……………………… 15
Figure 1.7 Schéma des moyens de stabilisation d’une nanoparticule : (a) stabilisation stérique et (b)
stabilisation électrostatique…………………………..………………………...………………. 16
Figure 1.8 Schéma illustrant la méthode de co-condensation…………………………………………. 18
Figure 1.9 Schéma illustrant la méthode de post-greffage………………………………………...… 19
Figure 1.10 Stratégies de fonctionnalisation sélective de la surface interne et externe des MSNs par
co-condensation…………………………………………………………………………….. 20
Figure 1.11 Stratégies de fonctionnalisation sélective de la surface interne et externe des MSNs par
post-greffage………………………………………………………………………………… 21
Figure 1.12 Effet de rehaussement et d’atténuation du signal en IRM des agents de contracte positifs
et négatifs……………………………………………………………………………….. 25
Figure 1.13 Structure moléculaire d’exemples de chélate de gadolinium………………………………. 26
Figure 1.14 Schéma de l’accumulation d’un nanomatériau chargé d’un agent anticancéreux par effet
EPR…………………………………………………………….…………………………… 31
Figure 1.15 Représentation d'un anticorps de type IgG (a) et la structure cristallographique de rayons
X d'une molécule d'IgG (b)……………………………………………….. 34
Figure 1.16 Schéma de la barrière hématoencéphalique et des différents mécanismes impliqués
dans le transport trans-BHE de molécules…………………………………………..……….. 35
Figure 1.17 Représentation de la capacité d’adsorption des MCM-48 (Structure en 3D) et des MCM-
41 (structure en 2D) ; sphère : molécule vectorisée……….………………………… 36
Figure 1.18 a) Représentation générale d’une nanoparticule de silice mésoporeuse chargée d’agents
thérapeutiques et fonctionnalisée avec des "gatekeepers" ; b) Illustration du contrôle
d’ouverture et fermeture des pores des MSNs par un "gatekeepers"
polymérique…………………………………………………………………………..………….. 38
Figure 1.19 Représentation des 3 étapes de la dégradation des MCM-41……………………….…….. 39
Figure 1.20 Diffractogramme de silice de type MCM-48 montrant des réflexions (hkl) d’une
mésostructure cubique Ia3d………………………………………………………………….. 40
Figure 1.21 Classification selon l’IUPAC des isothermes de physisorption mise à 41
jour……………….…..
Figure 1.22 Les principaux types de signaux résultants de l'interaction électron-matière…………….. 43
Figure 1.23 Courbes de relaxation longitudinale (T1) et transverse (T2), avec 𝑀 ⃗ comme valeur
initiale du vecteur 49
d'aimantation…………………………………………………………………………..
Figure 2.1 a) MCM-48 nanoparticles imaged by TEM; b) Schematic representation in the Ia3d 3-D
cubic pore network in the MCM-48 particles; c) Schematic representation of the three
steps undertaken to optimize PEG and DTPA grafting……………………………………… 59
x
Figure 2.2 13C CP MAS NMR spectra of: a) MSN-xPEG and b) MSN-yDTPA; x = 10.5% and y = 9%;
similar peaks were found for the different combinations of DTPA and PEG concentrations
investigated…………………………………………………………………….. 60
Figure 2.3 N2 physisorption isotherms (a) and respective NLDFT pore size distributions (b) of MSN-
xPEG nanoparticles………………………………………………………………………. 62
Figure 2.4 a) Longitudinal (1/T1 + C, squares) and transverse (1/T2 + C, diamonds) relaxation rates
of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles, in function of Gd3+ concentration
values. b) T1-weighted MR images of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles
measured at clinical magnetic field strength (1 Tesla, TE/TR = 10.7/1000 ms). Numerical
values indicate the Gd concentrations (mM) measured by ICP-MS…….. 67
Figure 2.5 a) DLS analysis of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG suspension in: water (i), SBF (ii) and
in cell culture medium (iii); b) Zeta potential dependence on pH for MSN-5.7%DTPA-
3.2%PEG before (squares) and after (diamonds) Gd chelation……………… 68
Figure 2.6 Viability of P388 cells treated with MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG (a: resazurin test; b:
trypan blue test) and MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG (c: resazurin test; d: trypan blue
test)………………………………………………………………………………….. 69
Figure 2.7 Daunorubicin release from MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles as a function
of: a) initial time up to 24 h; b) total time up to 216 h (9 days) and c) viability of P388 cells
incubated with free DNR, DNR-loaded nanoparticles at different DNR doses 71
Figure S2.1 Non-grafted MCM-48 nanoparticles: a) low-angle Powder XRD pattern; b) N2
physisorption isotherms and c) respective NLDFT pore size distributions………………... 77
Figure S2.2 Thermogravimetric analysis of a) MSN-xDTPA and b) MSN-yPEG nanoparticles………. 78
Figure S2.3 13C CP/MAS NMR spectra of a) MSN-xPEG and b) MSN-yDTPA nanoparticles………… 78
Figure S2.4 ATR mode IR spectra of a) MSN-xDTPA and b) MSN-yPEG; i: 0%; j: 3%; k: 5.7%; l: 13%;
m: 0%; n: 3.5%; o: 5%; p: 10.5%; q: 17%................................................................. 79
Figure S2.5 29Si MAS NMR spectra of a) MSN-yPEG (i: x=5; j: x=10.5; k: x=17) and b) MSN-xDTPA
(l: y=5.7; m: y=9; n: y=13)………………………………………………………………………. 79

Figure S2.6 NLDFT pore size distributions of MSN-xDTPA nanoparticles……………………………… 80
Figure S2.7 a) 13C CP/MAS NMR spectrum of MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG; and b) ATR-IR spectra of
i) non-grafted MSN and j) MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG nanoparticles………………….. 80
Figure S2.8 a) 13C CP/MAS NMR and b) ATR-IR spectra of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG before
(i) and after (j) DNR loading……………………………………………………………………. 81
Figure S2.9 Cumulative release of Gd(III) ions from of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG at different
pH values…………………………………………………………………………………………. 81
Figure 3.1 TEM images of the different MSNs synthesized in this work, with their corresponding size
distribution: a) and b) MSN45; c) MSN90; d) conventional MSN150; e) MSN300; f) MSN500.
The insets (in a, c and d) are HRTEM images……………………………………... 90
Figure 3.2 a) Powder XRD patterns of MSNx; b) N2 physisorption isotherms of MSNx, the isotherms
for MSN90, MSN150 and MSN500 samples are offset vertically by 200, 400 and 600 cm3STP
g- 1, respectively; c) corresponding NLDFT pore size distributions…………. 92
Figure 3.3 DLS analyses of pure (MSNx: a and b) and phosphonated (PMSNx ; c and d) nanoparticle
suspensions in aqueous (i) and saline solutions (ii; vertical off set)………... 94
Figure 3.4 Doxorubicin release profiles from pure MSNx (a) and PMSNx (b). Inset figure in b (i)
shows the Dox release profiles from PMSNx up to 10 h…………………………………….. 96
Figure 3.5 a) 29Si MAS NMR spectrum of pure MSNx; b) 31P MAS NMR spectrum of PMSNx; c) 13C
CP MAS NMR spectrum of PMSNx and d) 29Si MAS NMR spectrum of PMSNx. Similar
spectra were obtained regardless the size of the nanoparticles. e) Zeta potential profile
of the nanoparticles. f) Schematic representations of the surface of MSN x and PMSNx,
with their corresponding active sites and respective pKa…………………………………… 97
xi
Figure 3.6 TEM images of HT1080 and M21 incubated with PMSN45 (a and b, respectively) and
PMSN150 (d and e, respectively); e) PMSN45 nanoparticles taken up in vesicles and f)
PMSN150 nanoparticles taken up in vesicles…………………………………………………. 102
Figure 3.7 Cell viability assay of M21 and HT1080 cells incubated with PMSN45 (a and c,
respectively) and PMSN150 (b and d, respectively) for 24 h, 48 h and 72 h……………… 103
Figure 3.8 Fluorescence images (obtained at 60×) of M21 cells incubated with Dox@PMSN45-F and
Dox@PMSN150-F for 2 h 30 (a and b, cells). e-h) cross-section images analysis based
on line-scanning profile of green and red fluorescence intensity (green and red curves
respectively) and 24 h (c and d, respectively). Red fluorescence: Dox; green: Alexa
Fluor®488 grafted on nanoparticles; yellow/orange: merged of red and green signals;
blue: anti-mouse IgG Alexa Fluor®408 (stains the cytoplasm of human cancer,
respectively)……………………………………………………………………………………… 105
Figure 3.9 In vitro cytotoxicity of Dox@PMSN45, Dox@PMSN150 and free Dox against M21 cells and
HT1080 cells at different Dox concentrations for 24 h (a and b, respectively), 48 h (c and
d, respectively) and 72 h (e and f, respectively)……………………………………... 107
Figure 3.10 Ex vivo fluorescence images of M21 CAM tumor model treated with Dox@PMSN45 and
Dox@PMSN150 after 1 h (a and b, respectively) and 18 h (c and d, respectively) of post-
intratumoral injection. Images were obtained with IVIS Lumina II imaging system……… 108
Figure 3.11 Fluorescence images of M21 CAM tumor treated with small Dox-loaded nanoparticles
(45 nm) and large Dox-loaded nanoparticles (150 nm) after 1 h and 18 h of post-
intratumoral injection……………………………………………………………………………. 110
Figure 3.12 HT1080 CAM tumor weight at t = 7 days (n = 1 for each condition), normalized to the
weight of tumors at t = 0. Embryos were treated with Dox-containing MSNs
(Dox@PMSN45 and Dox@PMSN150), as well as their "pure" (non-Dox) counterparts
(PMSN45; PMSN150)……………………………………………………………………………... 111
Figure S3.1 TEM images and nanoparticle size distributions of MSNs with an average particle
diameter of 90 nm (MSN90, a) and 300 nm (MSN300, b) obtained by increasing and
decreasing the fraction of F127, respectively………………………………………………… 117
Figure S3.2 DLS analysis of MSN45 (a), MSN90 (b), MSN150 (c), MSN300 (d) and MSN500 (e)
suspensions in aqueous solutions during 24 h (continuous line) and up to 1 week (dotted
line), represented in number-weighted data (A) and intensity-weighted data (B). The
nanoparticles hydrodynamic diameter distributions after 1 week in are offset
vertically…………………………………………………………………………………………... 118
Figure S3.3 Thermogravimetric analysis of phosphonated nanoparticles……………………………..... 118
Figure S3.4 Fitting of ex vitro Dox release data from Dox@PMSNx nanoparticles: plots of log of
cumulative percentage drug release as function of logarithm of the time………………… 119
Figure S3.5 Fluorescence images (obtained at 60×) of M21 cells incubated with Dox@PMSN 45-F for
24 h……………………………………………………………………………………………….. 119
Figure S3.6 Fluorescence images (obtained at 60×) of HT1080 cells incubated with Dox@PMSN 45-F
and Dox@PMSN150-F for 2 h 30 (a and b, respectively) and 24 h (c and d,
respectively)…………………………………………………………………………………….... 120
Figure 4.1 A, B) High-resolution TEM images of MSN50 and MSN160 with corresponding particle size
distributions; C) functionalization steps for DTPA-Gd and antibody grafting………... 128
Figure 4.2 A, B) TEM images of MSN50 and MSN160 after grafting of DTPA; C, D) after grafting of
the antibody………………………………………………………………………………………. 129
Figure 4.3 A) 13C CP/MAS NMR spectrum of MSNx-DTPA; B) 29Si MAS NMR spectrum of MSNx-
DTPA; C) FTIR spectra of functionalized and bioconjugated nanoparticles; D) Schematic
representations of the surface of MSNx-DTPA………………………………….. 131
Figure 4.4 DLS analyses of the nanoparticle suspensions (A and C for MSN50 ; B and D for MSN160)
before and after the antibody grafting, represented in number mode and intensity
mode……………………………………………………………………………………. 135
xii
Figure 4.5 T1-weighted MR images of Ri7-MSN50 (A) and Ri7-MSN160 (B) in aqueous suspensions.
Numerical values indicate the Gd concentrations (mM) measured by ICP-MS. C) Cell
viability assay (trypan blue test) of Ri7-MSN50 and Ri7-MSN160 nanoparticles. D) Pellets
of bEnd5 cells after incubation without (i) or with conjugated MSN (j: Ri7-MSN50; k: IgG-
MSN50; l: Ri7-MSN160 ; m: IgG-MSN160)……………………………………………………….. 137
Figure 4.6 Labeling of brain microvessels by Ri7fl-MSN on mouse brain sections…………………… 138
Figure 4.7 Automated image-based quantification of MSN cellular uptake……………………………. 140
Figure 4.8 Ri7fl-MSN uptake in bEnd5 and N2A cells at different temperatures and incubation
times………………………………………………………………………………………………. 142
Figure 4.9 Cellular accumulation of Ri7fl-MSN50 at different Ri7 concentrations. A-C) Increasing
concentrations of targeted Ri7fl-MSN50, control IgGfl-MSN50 or unconjugated Ri7fl were
incubated with bEnd5 (A) and N2A (B) cells at 37 °C………………………………………. 145
Figure 4.10 Accumulation of Ri7fl-MSN50 in brain microvessels after intravenous injection. Mice were
injected twice with 0.25 nmol of IgGfl-MSN (A) or Ri7fl-MSN (B and C) at 1 h
interval……………………………………………………………………………………………. 147
Figure S4.1 Powder XRD patterns (a), N2 physisorption isotherms (-196 °C) and (b) respective
NLDFT pore size distributions (c) of small and large nanoparticles. The isotherm for large
MSN (MSN160) is offset vertically by 200 cm3 g−1 STP……………………….………. 154
Figure S4.2 Thermogravimetric analysis of small and large functionalized mesoporous silica
nanoparticles (a and b, respectively)………………………………………………………….. 154
Figure S4.3 UV-Visible spectra of Ri7 labeled with Alexa Fluor®647 before and after conjugation to
small and large mesoporous nanoparticles…………………………………………………... 155
Figure S4.4 DLS analyses of Ri7 antibody before and after PEG grafting……………………………… 155
Figure S4.5 Longitudinal (1/T1 + C, squares) and transverse (1/T2 + C, diamonds) relaxation rates of
Ri7-MSN (i.e. MSN-DTPA(Gd)-PEG-Ri7) nanoparticles, as a function of Gd 3+
concentration values…………………………………………………………………………….. 156
Figure S4.6 Specific uptake of mesoporous silica nanoparticles, obtained by subtracting the
fluorescence values of Ri7fl-MSN uptake of that of IgGfl-MSN……………………………... 156
Figure 5.1 TEM image of the MSN core (a), and (b) schematic representation of the two
functionalization routes and related steps……………………………………………………. 163
Figure 5.2 19F (a), 13C CP (b) and 29Si (c) MAS NMR spectrum of nanoparticles; e) molecular
diagrams of DTPA and fluorosilane molecules; d) schematic representations of the

surface of nanoparticles after grafting steps…………………………………………………. 167
Figure 5.3 DLS analysis of pure MSNs (a-i and b-j), FMSN-DTPA (a-ii and a-iii) and PolyFMSN-
DPTA-PEG (b-jj and b-jjj) aqueous suspensions; ii and jj) analysis after 2 h; iii and jjj)
analysis after 1 week……………………………………………………………………………. 170
Figure 5.4 19F R and R relaxation rates (a and b, respectively) of FMSN-DPTA and polyFMSN-
1 2
DTPA-PEG nanoparticles measured by NMR spectroscopy……………………………….. 172
Figure 5.5 NMRD profiles (r1 and r2 inset) at variable magnetic field strengths at 37 °C of FMSN-
DTPA(Gd) suspension (a) and polyFMSN-DPTA(Gd)-PEG suspension (b). Comparison
of relaxivity ratios (r2/r1) measured at clinical magnetic field strength (1.4 T, 60 MHz), 37
°C (c)……………………………………………………………………………………………… 174
Figure 5.6 Influence of temperature on the longitudinal relaxivity (r1) of FMSN-DTPA(Gd)
nanoparticles (b) and polyFMSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles (c) suspended in water
and in hydrogel, measured at 20 MHz. For each temperature, the mean value of 3
measurements is represented with standard deviation between 1% and 3%................... 175
Figure 5.7 T1-weighted 1H MR images of FMSN-DTPA(Gd) suspensions (a) and polyFMSN-
DPTA(Gd)-PEG suspensions (b), measured at clinical magnetic field strength (1.5 Tesla,
TE/TR = 10.8/1000 ms). Numerical values indicate the Gd concentrations (mM)
measured by ICP-MS. c) 19F MR phantom images of polyFMSN-DTPA(Gd)-PEG
nanoparticles acquired in a 9.4 T scanner using an experimental ultra-short echo time
xiii
sequence. The particles were suspended in a capillary tube of diameter of 1 mm (1) and
in a NMR tube of 5 mm (2). Both capillaries appear clearly visible at a low in-plane
resolution of 0.94×0.94mm2……………………………………………………………………. 176
Figure S5.1 Low-angle powder XRD patterns (a), N2 physisorption isotherms (b) and NLDFT pore
size distributions (c) of pure MCM48-Type MSN…………………………………………….. 180
Figure S5.2 TGA analysis of nanoparticles after the grafting of a) DTPA and fluorosilane molecules;
and b) polyfluorosiloxane, DTPA and PEG molecules……………………………………… 181
Figure S5.3 (a) 19F NMR spectrum of FMSN-DTPA colloidal suspension in H2O/D2O (90/10, v/v); (b)
19F signal-to-noise ratio linearity……………………………………………………………….. 181
Figure S5.4 19F relaxation rates (R and R ) of nanoparticles ([F] = 0.01mM) before and after
1 2
gadolinium chelation (FMSN-DPTA and FMSN-DPTA(Gd), respectively)………………... 182
xiv
Liste des abréviations et des sigles
𝐵⃗ Champ magnétique
𝑀⃗ Vecteur d'aimantation
2D Bidimensionnel / bidimensional
3D Tridimensionnel / tridimensional
APTES Aminopropyltriéthoxysilane
ATG Analyse thermogravimétrique
ATR Attenuated total reflectance
BEMC Brain microvessel endothelial cells
BET Brunauer Emmett Teller
BHE Barrière hématoencéphalique
CCD Charge coupled device
CEMC Cellules endothéliales des micro-vaisseaux du cerveau
CERMA Centre de recherche sur les matériaux avancés
CP Cross polarisation/Transfert de polarisation
CPMG Carr – Purcell – Meiboom – Gill
CQMF Centre québécois des matériaux fonctionnels
CR-CHUQ Centre de recherche du Centre hospitalier universitaire de Québec-Université Laval
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide / Bromure de cetyltriméthylammonium
DLS Diffusion de la lumière en mode dynamique
DMEM Milieu Eagle modifié de Dulbecco / Dulbecco’s modified eagle’s medium
DOTA 1,4,7,10-tétraazacyclododecane-1,4,7,10-tétraaminopentaacetique acid
DOX Doxorubicine / doxorubicin
DRX Diffraction des rayons X
DTPA Diethylenetriaminepentaacetic acid / Acide diethylènetriaminopentaacétique
EDX Energy dispersive X-ray spectroscopy / Spectroscopie par dispersion en énergie des rayons
X
EPR Enhanced permeability and retention
FDA Food and Drug Administration
FITC Fluorescein isocianate / Isothiocyanate de fluorescéine
FTIR Fourier Trransform Infrared Spectroscopy / Spectroscopie infrarouge à transformée de
Fourier
Gd Gadolinium
HRTEM High-resolution transmission electron microscopy
HRXPS High-resolution X-ray photoelectron spectroscopy / Spectroscopie photoélectronique induite
par rayons X de haute résolution
ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry / Spectrométrie de masse couplée à un
plasma inductif
Ig Immunoglobuline
IRM Imagerie par résonance magnétique
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
MAS Magic spinning angle / Rotation à l’angle magique
MCM Mobil Composition of Matter / Mobile Corporation Material
MCM-41 Mobil Composition of Matter n°41
MCM-48 Mobil Composition of Matter n°48
MET Microscopie électronique à transmission
MRI Magnetic resonance imaging
MSN Mesoporous silica nanoparticles/Nanoparticules de silice mésoporeuse
NLDFT Non-linear density functional theory
xv
nm Nanomètre / nanometer
NMR Nuclear magnetic resonance
NMRD Nuclear magnetic resonance dispersion / Dispersion de résonance magnétique nucléaire
OE Oxyde d’éthylène
OP Oxyde de propylène
PBS Tampon phosphate salin
PEG Polyéthylène glycol
PEI Polyéthylène imine
PET Positron emission tomography
PFC Perfluorocarbures
r1 Relaxivité longitudinale
R1 Longitudinal relaxation rate
r2 Relaxivité transverse
R2 Transverse relaxation rate
RGD Arginine-glycérine-acide aspartique
RMN Résonance magnétique nucléaire
S Signal
SBF Simulated body fluid
Si Silicium
t½ Temps de demi-vie
T1 Temps de relaxation longitudinale
T2 Temps de relaxation transverse
TE Temps d’écho
TEA Triéthanolamine
TEM Transmission electron microscopy
TEOS Orthosilicate de tétraéthyle / Tetraethyl orthosilicate
TEP Tomographie par émission de positons
TGA Thermogravimetric analysis
TMB Triméthybenzène
TMOS Orthosilicate de tétraméthyle / Tetramethyl orthosilicate
TR Temps de répétition
XPS X-rayphotoelectron spectroscopy /Spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X
XRD X-ray diffraction
xvi
À mes chers parents,
À mon adorable époux,
Que ce travail soit le reflet de vos prières incessantes,

de vos encouragements, et de tous vos sacrifices...
xvii
« L'obstination est le chemin de la réussite »
- Charlie Chaplin -
«Tout ira pour le mieux à la fin. Si ce n'est pas mieux, c'est que ce n'est pas la fin »
- Ed Sheeran -
« La découverte consiste à voir ce que tout le monde a vu et à penser ce que personne n'a pensé »
- Albert Szent-Gyorgyi -
« Pour accomplir des grandes choses, nous devons ne pas seulement agir, mais aussi rêver ; ne pas
seulement planifier, mais aussi croire »
- Anatole France -
xviii
Remerciements
Sans l’aide et le soutien de plusieurs personnes, ce projet n’aurait jamais vu son terme. Je tiens donc à remercier
tous ceux qui, de près ou de loin, m’ont aidée et encouragée tout au long de cette expérience.
Je tiens à exprimer ma gratitude la plus sincère à mon directeur de recherche, professeur Freddy Kleitz, et à
mes co-directeurs, Marc-André Fortin et René C.-Gaudreault. Un grand merci à vous trois pour vos directives
qui ont contribué à la réalisation, avec soin, de ce travail laborieux. Votre expérience et votre expertise ont
grandement enrichi ce travail. C’est toujours agréable et très enrichissent de discuter avec vous et c’était
vraiment un honneur pour moi de travailler avec vous. Je vous remercie aussi pour votre patience et votre
compréhension en dépit de toutes les circonstances et de tous les problèmes rencontrés. J’aimerais remercier
spécialement le professeur Freddy Kleitz pour avoir cru en ma candidature pour mener à bien cette thèse de
doctorat et de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je tiens aussi à lui exprimer ma reconnaissance pour son
encadrement et sa confiance, pour m’avoir permis de travailler avec une grande autonomie, et pour m’avoir
encouragé à aller jusqu’au bout de mes idées. Aussi, il me tient à cœur de le remercier pour m’avoir permis de
voyager à l’autre bout du monde pour présenter mes travaux à des conférences internationales. De la même
manière, je tiens particulièrement à exprimer mes remerciements les plus sincères au professeur Marc-André
Fortin pour la qualité de son encadrement, son suivi constant, son aide si précieuse, et pour ses exigences qui
m’ont permis d’aller toujours plus loin et me surpasser. Je le remercie énormément du fond du cœur pour les
multiples belles opportunités qu’il m’a accordées. Il m’est important d’exprimer aussi ma reconnaissance au
professeur René C.-Gaudreault pour son soutien, ses conseils avisés et ses petits mots d’encouragement qui
me redonnaient toujours espoir pour la suite. Il était pour moi comme un père spirituel.
Je remercie aussi les professeurs Jean-François Lambert, Anna Ritcey et Jesse Greener d'avoir accepté d'être
membres de mon jury et d'évaluer mon travail.
Mes vifs remerciements vont aussi aux professionnels de recherche, notamment Dr Pascale Chevalier, Dr Jean
Lagueux, Mme Marie-France Côté, M. Jacques Lacroix, M. Pierre Audet et Mme Rodica Plesu, pour leur aide
si précieuse. Ils étaient toujours là quand j’avais besoin de leur expertise! C’était vraiment une chance de vous
avoir eu à mes côtés! Un merci spécial à Pascale pour les ″miracles″ qu’elle a faits quand elle réussissait toujours
à analyser les peu de quantités de produit électrostatique et mes échantillons de dernières minutes, pour m’avoir
dépanné et soutenu plusieurs fois durant ma grossesse, et pour son grand cœur et sa générosité. Je remercie
aussi Jean pour les riches discussions qu’on a eus ensemble, pour sa disponibilité et son efficacité hors pair
lors des scans en imagerie par résonance magnétique (IRM), pour sa patience lors des essais radioactifs, pour
sa particularité, ainsi que pour les agréables moments passés avec lui lors de l’atelier à Mons (j’ai vraiment
xix
adoré ces 3 jours de travail intense ensemble.) Merci à Marie-France pour son implication incroyable et sa
patience lors des études in vitro et in vivo ainsi que pour sa gentillesse sans fin. Je remercie aussi Jacques pour
son support lors des premières expériences cellulaires de ma vie. Enfin, à Pierre et Rodica, merci pour la
formation que vous m’aviez donnée pour l’utilisation des appareils du département et pour le temps que vous
m’aviez accordé pour résoudre les différents problèmes techniques.
Je souhaite vivement remercier nos collaborateurs pour le projet BBB au CHUL : Dr Éric Béliveau pour son
implication et sa coopération lors des études in vitro et in vivo, Dr Vincent Emond pour ses conseils et ses
commentaires pertinents, ainsi qu’au professeur Frédéric Calon pour m’avoir permis de travailler dans son
laboratoire avec autonomie. Je remercie de la même manière le professeur Yves Gossuin de m’avoir
chaleureusement accueillie dans son laboratoire et de m’avoir aidée lors des analyses NMRD.
Je tiens aussi à remercier mes collègues et ami(e)s qui ont rendu la vie au laboratoire plus agréable. Une pensée
très particulière à : Fanny, Myriam, Yen, Mathieu, Diane, Lilit, Maëla, Binh et Teresa. Merci les amis pour les
moments très agréables passés ensemble. Merci de m’avoir écouté, encouragé, fait rire et aidé à plusieurs
reprises à ″décrocher un peu″. Merci aussi pour la bonne ambiance, la chaleur et la convivialité que vous avez
apportées au laboratoire ainsi que pour votre soutien en dehors du laboratoire. Vous êtes tout simplement
géniaux et exceptionnels! Je vous adore! Je suis très heureuse de vous avoir connus et vous souhaite, à toutes
et tous, beaucoup de réussite et de bonheur.
Je remercie aussi mes autres collègues : Merci à Maria pour sa joie de vivre, à Mahesh pour sa folie, à Rémy
pour son aide au début de cette thèse, à Luc pour ses conseils durant ma pratique de prédoc, à Solange pour
sa douceur, à Marie et Sébastien pour leur gentillesse, à Jean-François pour m’avoir dépannée pendant ma
grossesse en lavant les supports d’échantillon pour l’analyse XPS, à Louis pour son aide à changer les
bonbonnes d’azote, à Nima et Justyna pour le soutien technique avec les appareils de physisorption. Merci à
Yimu et Simon de m’avoir dépanné ces derniers mois à plusieurs reprises. Je remercie également Luis, Wan,
Andrée-Anne, Lucie et Stéphane d’être aussi sympathiques. Merci aux stagiaires aventureux qui sont venus
nous rendre visite de loin et ont apporté de la joie avec eux, notamment Caroline, Thomas, Christopher et Yen
Chua. Merci aussi à Maxime pour ces délicieux plats. Merci aux étudiants du professeur Anna Ritcey, nos voisins
de bureau, qui étaient toujours prêts à m’emprunter de la verrerie supplémentaire quand je lançais milles
expériences en même temps et qui m’accueillent chaleureusement dans leur laboratoire lors de l’utilisation de
l’ultracentrifugeuse ou de leur puissant bain de sonication.
Pour finir, rien de tout cela n'aurait été possible sans l'amour, la patience, l’encouragement, le support
inconditionnel et le soutien continu des êtres les plus chers à mon cœur : mes parents et mon époux. Merci
d’avoir été toujours là dans les hauts et les bas. Merci d’avoir partagé avec moi mon bonheur quand je me
xx
réjouissais d’expériences qui fonctionnent. Merci d’être toujours à l’écoute quand je racontais les problèmes
scientifiques que j’affrontais, sans nécessairement avoir compris de quoi il s’agissait. Merci d’avoir essuyé mes
larmes avec votre tendresse et vos prières. Je suis heureuse que vous puissiez enfin voir le fruit de mon travail,
de mon acharnement et de tout ce que vous avez fait pour que je puisse aller jusqu’au bout de cette aventure.
Merci papa! Toi qui a cru en moi et qui m’a toujours soutenue et encouragée dans toutes mes démarches, même
si elles m’emmenaient à l’autre bout de la terre. Merci maman! Toi qui prie sans cesse pour moi et qui as tout
abandonné en Tunisie pendant trois précieux mois et es venue me soutenir et m’aider pendant mon
accouchement pour pouvoir avancer dans la rédaction. Merci papa et maman! Je vous dois ce que je suis
aujourd’hui et ce que je serai demain. J’espère que vous êtes fiers de moi et que vous le resterez toujours. Merci
Naoufel! Toi qui m’as comblée par ta tendresse et ton affection tout au long de ces années. Je n’aurais jamais
pu accomplir ce travail tel qu’il est sans ta patience sans fin, ta compréhension et tes sacrifices.
Papa, Maman et Naoufel, aucune phrase aussi expressive soit-elle ne serait suffisante pour vous remercier ou
vous exprimer le degré de ma gratitude et l’ampleur de ma reconnaissance à votre égard. Je vous dis alors tout
simplement que je vous aime du tréfonds de mon cœur ; Que Dieu vous protège!
Enfin, Je remercie mon rayon de soleil de tous les jours, mon petit bébé et ma princesse "Maram". Son sourire
de chaque matin me remplissait d’énergie positive pour aller de l’avant dans cette aventure ; parce qu’être une
nouvelle maman, avoir une charge de cours, achever la rédaction des articles et rédiger une thèse en même
temps, c’est tout une aventure!
xxi
Avant-propos
Cette thèse a été rédigée en utilisant le modèle d’insertion d’articles à raison d’un article par chapitre (les
chapitres 2, 3, 4 et 5). Ce projet de thèse est un projet multidisciplinaire associant des domaines de recherche
complémentaires et ayant nécessité des collaborations impliquant plusieurs laboratoires. Le travail présenté
dans les deux premiers articles (chapitres 2 et 3), a été effectué dans le laboratoire des matériaux fonctionnels
nanoporeux du professeur Freddy Kleitz au département de chimie, le laboratoire des Biomatériaux pour
l'Imagerie Médicale du professeur Marc-André Fortin, et le laboratoire du professeur René C.-Gaudreault (axe
oncologie) au centre de recherche du centre hospitalier universitaire (CR-CHU) de Québec-Université Laval. Le
troisième article, présenté au chapitre 4 de ce manuscrit, a nécessité la collaboration supplémentaire du
laboratoire du professeur Frédéric Calon, axe neuroscience, au centre de recherche du centre hospitalier
universitaire (CR-CHU) de Québec-Université Laval. Le travail présenté dans le dernier article est
principalement effectué dans les laboratoires du professeur F. Kleitz et du professeur Fortin avec quelques
expériences réalisées en coopération avec le centre d’imagerie biomédicale à Lausanne (Suisse) et le service
de physique expérimentale et biologique de l’Université de Mons (Belgique).
La première partie de cette thèse (chapitre 2) présente la fonctionnalisation sélective de la surface externe des
nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs) par un polymère biocompatible (le polyéthylène glycol), et une
molécule sonde d’IRM (le chélate de gadolinium). Cette fonctionnalisation a mené à la conception de
nanoparticules à fort potentiel théranostique sans perte de porosité, avec une capacité de chargement de
médicaments élevée, une performance remarquable pour améliorer le contraste en IRM, et une aptitude à
assurer une libération contrôlée de médicaments dans des conditions physiologiques. Ce travail a été publié en
2014 dans la revue "Advanced Functional Materials" (Facteur d’impact 2014 = 10,4). J’ai réalisé l’ensemble du
travail : de la conception des MSNs multifonctionnelles, à l’évaluation de leurs performances pour des
applications théranostiques. J’ai donc synthétisé tous les matériaux utilisés, j’ai effectué toutes les étapes de la
fonctionnalisation et les caractérisations physicochimiques associées, à savoir : l’analyse thermogravimétrique
(ATG), la physisorption, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie
infrarouge (IR), la microscopie électronique à transmission (MET), et l’analyse par diffusion de la lumière (DLS).
L’analyse par XPS (Spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X) a été effectué par Dr Pascale
Chevalier (professionnelle de recherche au laboratoire du professeur Fortin) et l’analyse DRX par Jean Frenette
(technicien au département de génie des mines, de la métallurgie et des matériaux de l’Université Laval); et je
me suis occupée de la mise en forme des résultats de ces analyses et de l’interprétation des données. J’ai
préparé, planifié, analysé, traité et interprété les tests de viabilité cellulaire qui étaient effectués par M Jacques
Lacroix (professionnel de recherche dans le laboratoire du professeur C.-Gaudreault). J’ai effectué toutes les
mesures relaxométriques, ainsi que le piégeage des médicaments et les tests de relargage. Dr Jean Lagueux
xxii
(professionnel de recherche au laboratoire du professeur Fortin) s’est occupé de l’acquisition des images d’IRM.
Enfin, j’ai produit l’ensemble des figures présentées, j’ai effectué l’interprétation de tous les résultats et contribué
à l’ensemble de la rédaction du manuscrit.
Le deuxième article porte sur l’influence de la taille des MSNs et de leurs propriétés de surface sur leur efficacité
en tant que nanovecteurs de médicaments pour le traitement du cancer en particulier. Ce travail a été publié en
2016 dans la revue "Chemistry of Materials" (facteur d’impact 2016 = 9,4). Le contrôle de la taille des MSNs,
leur fonctionnalisation et les différentes analyses physicochimiques (ATG, MET, physisorption, RMN, DLS et
UV-Visible) ont été élaborés par moi-même. Les images MET de haute résolution ont été enregistrées par Dr
Yongbeom Seo au Korea Advanced Institute of Science and Technology qui se trouve à Daejeon, en Corée du
Sud. L’analyse par XPS a été faite par Dr Pascale Chevalier (professionnelle de recherche au laboratoire du
professeur Fortin), et la caractérisation par DRX par Jean Frenette (technicien au département de génie des
mines, de la métallurgie et des matériaux de l’Université Laval). J’ai réalisé aussi les essais de piégeage des
médicaments et les tests de relargage in vitro. Les expériences sur les études cellulaires, les injections in vivo
et les tests d’immunohistofluorescence ont été faites par Mme Marie-France Côté et moi-même. La préparation
des échantillons pour les observations microscopiques (MET et fluorescence), les tests de cytotoxicité, le
prélèvement et la mesure du poids des tumeurs avant et après traitement, l'étude d'imagerie par fluorescence
ex vivo, la planification des expériences, le traitement des résultats et des images, l’interprétation des données,
et enfin la production des figures ont été effectués par moi-même. J’ai contribué à l’ensemble de la rédaction du
manuscrit.
Le troisième article s’intéresse à l’étude du potentiel des MSNs conjuguées avec un anticorps pour la livraison
des médicaments au cerveau en évaluant leur capacité à cibler les cellules endothéliales de la barrière
hématoencéphalique (la première ligne de défense du cerveau). Cet article est publié en 2017 dans la revue
"Journal of Materials Chemistry B" (facteur d’impact 2017= 4,5). La synthèse des MSNs et l’ensemble des étapes
de fonctionnalisation et des caractérisations (ATG, physisorption, MET, RMN, IR et DLS), ainsi que les mesures
des propriétés relaxométriques ont été élaborés par moi-même. Le greffage de la molécule sonde d’IRM a été
réalisé, sous ma supervision, par la stagiaire Caroline Germain. Pour le lot qui a servi à l’étude in vivo (injection
dans un modèle animal), l’étape du greffage des amines a été effectuée par Dr Pascale Chevalier en raison de
ma grossesse (interdiction de manipuler des solvants organiques à potentiel toxique au laboratoire). Dr Pascale
Chevalier a aussi effectué les analyses XPS. Les études cellulaires ont été réalisées par Dr Éric Béliveau
(stagiaire post-doctoral au laboratoire du professeur Calon) et moi-même. Les images par microscopie
fluorescence, la quantification de l’absorption cellulaire et l’essai in vivo ont été élaborés par le Dr Éric Béliveau.
Dr Jean Lagueux s’est occupé des procédures d’acquisition des images d’IRM. Les figures et la rédaction du
manuscrit ont été faites principalement par Dr Éric Béliveau et moi-même.
xxiii
Le quatrième article porte sur l’étude du potentiel des MSNs multifonctionnelles pour l’IRM binucléaire (IRM du
proton et du fluor). Ce travail est publié en 2017 dans la revue "Langmuir" (facteur d’impact 2017 = 3,8). La
synthèse, la fonctionnalisation, les caractérisations physicochimiques, et les mesures des propriétés
relaxométriques du proton ainsi que ceux du fluor ont été faites par moi-même. M Pierre Audet (professionnel
de recherche au département de chimie de l’université Laval) a mis place la séquence CPMG pour les mesures
des temps de relaxations par RMN. Dr Pascale Chevalier a effectué les analyses XPS. Les valeurs des profils
NMRD ont été mesurées par Dr Yves Gossuin et moi-même pendant un atelier à Mons (Belgique). Les
procédures d’acquisition des images en IRM du proton et celui en IRM du fluor ont été effectués par Dr Jean-
Lagueux et Dr Ruud B. van Heeswijk (stagiaire post-doctoral au centre hospitalier universitaire vaudois à
Lausanne (Suisse)), respectivement. Enfin, j’ai produit l’ensemble des figures présentées, j’ai effectué
l’interprétation de tous les résultats et rédigé l’ensemble du manuscrit.
En plus des travaux qui ont mené aux articles de cette thèse, j’ai contribué aux travaux d’autres étudiants et qui
ont aussi mené à des articles scientifiques déjà publiés ou en cours de réalisation, ainsi :
 J’ai contribué au travail de maitrise de Mme Myriam Laprise-Pelletier en effectuant les caractérisations
physicochimiques des nanoparticules (ATG, RMN, physisorption d’azote, et MET) et en contribuant à
la rédaction des sections correspondantes pour l’article "Metal chelate grafting at the surface of
mesoporous silica nanoparticles (MSNs): physico-chemical and biomedical imaging assessment",
publié dans la revue "Journal of Materials Chemistry B" en Octobre 2014.
 Les nanoparticules de silice mésoporeuse que j'ai synthétisées et la stratégie de greffage des
molécules sondes d’IRM ont servi au travail de thèse de Mme Fanny Silencieux (sous la supervision
du professeur Marc-André Fortin). Je suis deuxième auteure dans un premier article découlant de ces
travaux, intitulé "Mesoporous Silica Nanoparticles under Sintering Conditions: A Quantitative Study" et
publié dans la revue "Langmuir" en Octobre 2015. Dans cet article, j’ai réalisé la synthèse et les
différentes caractérisations physicochimiques des nanoparticules, ainsi que le frittage des échantillons
déposés sur des couches minces. Je suis également co-auteure dans un deuxième article qui est en
cours de finalisation et intitulé "Paramagnetic hydrogels for high signal-enhancement of interventional
biomedical devices in MRI". Pour cet article, j’ai effectué la fonctionnalisation des nanoparticules par
des molécules sondes d’IRM, leur caractérisation physicochimique (par ATG, RMN, physisorption
d’azote, DLS, et MET), ainsi que les mesures des propriétés relaxométriques à différents champs
magnétiques (profils NMRD).
 J’ai également contribué au travail de maitrise de Mme Eya Mejri (sous la direction du professeur Jesse
Greener) sur le développement d’un revêtement intelligent à base de nanoparticules de silices
xxiv
mésoporeuses fonctionnalisées pour le relargage stimulé d’agents antimicrobiens. J’ai synthétisé,
fonctionnalisé et caractérisé (par ATG, RMN, physisorption d’azote, DLS, et MET) les nanoparticules
utilisées pour ce travail. J’ai aussi contribué à la rédaction de l’article correspondant qui est en cours
de finalisation.
 Les nanoparticules de silice mésoporeuse que j’ai développées lors de cette thèse ont été utiles pour
le travail de Mme Estelle Juère (sous la supervision du professeur Freddy Kleitz) et j’ai contribué à la
rédaction de l’article correspondant qui sera soumis bientôt.
Les travaux réalisés au cours de ce doctorat ont été présentés à l’échelle nationale et internationale et plusieurs
prix, bourses et distinctions en ont découlés :
 Prix et bourses :
- Prix de la meilleure présentation par affiche lors du "International Chemical Congress of Pacific
Basin Societies 2015" – Honolulu – Hawaii (25 décembre 2015) ;
- Bourse pour communication scientifique (congrès) de la faculté des études supérieure de
l’Université Laval – Québec (09 octobre 2015) ;
- Bourse pour communication scientifique (congrès) de l’association des étudiantes et des étudiants
de Laval inscrits aux études supérieures (AELIÉS) – Québec (06 septembre 2015) ;
- 3ème prix de la meilleure présentation par affiche lors du colloque annuel des étudiants CERMA
(centre de recherche sur les matériaux avancés) – Université Laval – Québec (28 octobre 2014) ;
- 1er prix de la meilleure présentation orale lors du "1st International Chemical Engineering Congress"
– Djerba – Tunisie (19 décembre 2013) ;
- Bourse d’études : Bourse de doctorat en recherche des Fonds québécois de la recherche sur la
nature et les technologies, FRQNT (avril 2013 – août 2014) ;
- Attestation d’excellence : Parcours académique 2012 – Faculté des sciences et de génie –
Université Laval – Québec (17 mai 2013) ;
- Prix d’excellence – Présentation par affiche lors du 81e Congrès de l’ACFAS – Colloque 128 :
Nanoparticules et Nanomatériaux pour la Médecine – Québec (07 mai 2013) ;
- Prime d’excellence : Performance exceptionnelle-Examen de doctorat – Plan de soutien financier
2012-2013 – Département de Chimie – Université Laval – Québec (avril 2013) ;
- Bourse d’études et d’excellence des Fonds Arthur-Labrie (janvier 2012 – avril 2012) ;
- 1er prix de la meilleure présentation par affiche en nanotechnologie (Prix nano-ulaval) lors du 5 ème
Colloque annuel du CQMF – Trois-Rivières – Québec (05 novembre 2012) ;
xxv
- 1er prix de la meilleure présentation par affiche (Prix Suraj Manrao) lors du "25th MOOT NMR
Minisymposium" – Université Laval – Québec (20 octobre 2012).
 Présentations orales à :
- "International Mesostructured Materials Symposium 9", Brisbane, Australie, 20 août 2015 ;

- Colloque annuel du CQMF, Shawinigan, Québec, Canada, 7 novembre 2014 ;
- "1st International Chemical Engineering Congress", Djerba, Tunisie, 17 décembre 2013 ;
- "96th Canadian Chemistry Conference and Exhibition", Québec, Canada, 28 mai 2013 ;
- 81e Congrès de l’ACFAS, Québec, Canada, 7 mai 2013.
 Présentations par affiche à :
- "10th World Biomaterials Congress (WBC) 2016", Montreal, Canada, 17 – 22 Mai 2016 ;
- "The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015", Honolulu, Hawaii, 15 et 17
décembre 2015 ;
- Colloque Etudiant CERMA 2014, Université Laval, Québec, Canada, 28 octobre 2014 ;
- Journée MEDTEQ, IRDPQ, Québec, Canada, 21 octobre 2014 ;
- 1ère journée IMA, Sherbrooke, Québec, Canada, 26 septembre 2014 ;
- "International Symposium – Nanoporous Materials-7", Niagara Falls, Canada, 22 juin 2014 ;
- European Materials Research Society (E-MRS 2014), Lille, France, 29 mai 2014 ;
- 82e Congrès de l’ACFAS, Montréal, Canada, 12 mai 2014 ;
- Colloque annuel du CQMF, Québec, Canada, 7 novembre 2013 ;
- 81e Congrès de l’ACFAS, Québec, Canada, 7 mai 2013 ;
- 5ème Colloque annuel du CQMF, Québec, Canada, 2 novembre 2012 ;
- 25th Moot NMR Minisymposium, Québec, Canada, 20 octobre 2012 ;
- Colloque Etudiant CERMA 2012, Université Laval, Québec, Canada, 7 septembre 2012 ;
- NanoQuébec 2012, Montréal, Québec, Canada, 20 mars 2012.
Finalement, pendant ma thèse de doctorat j’ai eu l’occasion d’enrichir mon expérience académique et
professionnelle en étant chargée de cours et auxiliaire d’enseignement plusieurs fois, en encadrant plusieurs
stagiaires et en m’impliquant dans la vie universitaire :
- Chargée de cours (Matériaux inorganiques et hybrides) au département de chimie – Université

Laval (septembre 2016 – décembre 2016) ;
xxvi
- Auxiliaire d’enseignement des travaux pratiques de synthèse inorganique au département de
chimie – Université Laval (5 fois : janvier 2017 – avril 2017 ; janvier 2015 – avril 2015 ; janvier 2014
– avril 2014 ; janvier 2013 – avril 2013 ; et janvier 2012 – avril 2012) ;
- Auxiliaire d’enseignement des travaux pratiques du cours techniques d’analyse au département
de génie des mines, de la métallurgie et des matériaux de l’université Laval (2 fois : juin 2015 –
juillet 2015 et juin 2013 – juillet 2013) ;
- Encadrement de stagiaire (mars 2015 – août 2015 et avril 2013 – septembre 2014) ;
- Représentante des étudiants au bureau de direction du CERMA (2014 – 2016) ;
- Juge des projets régionaux pour la compétition Expo-Sciences (2012 et 2017) ;
- Co-présidente du comité d’organisation du 5ème colloque des étudiants du CERMA ;
- Animatrice scientifique, mentor à la coupe de science et guide scientifique pour les étudiants du
Cegep (2012 – 2017).
xxvii
Introduction
 Mise en contexte
De nos jours, le secteur biomédical fait face à des besoins accrus en matériaux biomédicaux utilisés pour le
diagnostic et le traitement des maladies. Pour satisfaire ces besoins, le développement des matériaux avancés
pour le génie biomédical est un secteur en forte expansion. Les progrès réalisés dans le domaine des
nanomatériaux destinés à la livraison d’agents thérapeutiques, permettent d’élaborer de nouveaux vecteurs
thérapeutiques prometteurs.
De nombreux médicaments à fort potentiel thérapeutique, présentent une efficacité limitée une fois administrés,
et ce, pour plusieurs raisons. D’abord, plusieurs principes actifs présentent des caractéristiques physico-
chimiques peu propices à leur administration : instabilité/dégradation dans les milieux biologiques ;
insolubilité/hydrophobicité ; poids moléculaire élevé. Ensuite, d’autres agents thérapeutiques se caractérisent
par une toxicité très élevée et/ou une livraison non-ciblée, engendrant plusieurs effets secondaires. Enfin,
certaines molécules bioactives ne peuvent pas affranchir les différentes barrières biologiques pour atteindre leur
site d’action et d’exercer leur activité thérapeutique. La vectorisation des médicaments est donc considérée
comme une solution adéquate pour remédier à tous ces problèmes et améliorer ainsi la qualité et l’efficacité du
traitement. Pour ces raisons, le développement de nanovecteurs de médicaments a pris un essor considérable
au cours des dernières années.
Les hydroxydes doubles couches, les dendrimères, les liposomes, les micelles, et les nanoparticules
polymériques comptaient parmi les premiers matériaux développés pour la vectorisation des médicaments. 1-3 À
cause de leur structure instable, le relargage des médicaments vectorisés dans ces matrices est souvent très
rapide. Ainsi, un relargage prématuré et indésirable est presque toujours observé avant que le vecteur n’atteigne
le site ciblé.4 Pour résoudre ce problème, la recherche s’est orientée ces dernières années vers le
développement de systèmes de livraison de médicaments structurellement plus stables, et en particulier à base
de matériaux inorganiques poreux.5, 6 Ces matériaux se caractérisent par leur stabilité chimique relative, leur
résistance mécanique, leur biocompatibilité, et leur résistance aux attaques microbiennes par rapport à leurs
homologues organiques.7 Ces systèmes sont en mesure de livrer une grande quantité d’agents thérapeutiques
aux sites d’action ciblés (organes, cellules, organites intracellulaires, etc.).4 À cette fin, les nanoparticules de
silice mésoporeuse (MSNs) sont les plus prometteuses.4, 7-9
La silice est souvent considérée comme un matériau de choix pour plusieurs applications biomédicales. 10, 11 Par
exemple, elle est très utilisée dans la formulation d’implants artificiels12 et pour le revêtement de surface d’autres
matériaux inorganiques destinés pour des applications biomédicales.13 En raison de leurs caractéristiques
1
uniques, les nanoparticules de silice mésoporeuse sont considérées comme des candidats de premier ordre
comme vecteurs de livraison des médicaments. En effet, ces nanoparticules se caractérisent par une petite taille
permettant leur administration par voie intraveineuse et orale. Elles peuvent s’accumuler dans les sites ciblés,
et sont internalisées par les cellules.14 Elles se différencient aussi par une grande surface spécifique (~1000 m 2
g-1), par un volume poreux considérable (0,7 - 1 cm3 g-1) et par une porosité facilement modulable, ce qui favorise
le piégeage de grandes quantités de molécules de tailles, de formes, et de fonctionnalités différentes. 9,15 Les
MSNs se distinguent en plus par des propriétés de surface remarquables. En effet, les silices mésoporeuses
ont la particularité d’avoir une surface très riche en sites actifs (les silanols de surface) et facilement modifiables.
La fonctionnalisation de la surface des MSNs permet d’améliorer leurs interactions avec les molécules à
vectoriser et avec les différents compartiments biologiques (tissus, organes, cellules et etc.). Ceci est très
avantageux pour un meilleur contrôle du piégeage, du ciblage, et de la libération des agents thérapeutiques.
Récemment, des essais cliniques utilisant des nanoparticules de silice ont été approuvés par l’agence
américaine d’administration des denrées alimentaires et des médicaments (la FDA). 16, 17
Tout d’abord, plusieurs recherches ont montré le potentiel des nanoparticules de silice mésoporeuse pour la
livraison et le relargage de différents médicaments : l’ibuprofène5, 18-22 (anti-inflammatoire), l’aspirine23, 24
(analgésique et anti-inflammatoire), l’érythromycine23, 25, 26 (antibiotique), etc.7, 8 Ensuite, les recherches se sont
orientées vers l’étude du potentiel des MSNs pour la vectorisation des molécules anticancéreuses notamment
le paclitaxel,27, 28 la camptothécine,29-32 et la doxorubicine,33, 34 molécules typiquement utilisées en
chimiothérapie. Ces recherches ont pour but d’améliorer le traitement du cancer et de diminuer les effets
indésirables de la chimiothérapie. En effet, la chimiothérapie classique (i.e. sans utilisation d’agents de ciblage)
a l’inconvénient d’avoir un mode d’action non-spécifique qui ne tue pas seulement les cellules cancéreuses mais
endommage aussi les cellules saines du corps.35 De plus, seule une très faible fraction de la dose injectée peut
atteindre les tumeurs. Les agents anticancéreux, malgré leur efficacité, sont donc pour la plupart très toxiques.
Lorsqu’ils sont administrés par voie intraveineuse, ils peuvent rencontrer des barrières physiologiques avant
d’atteindre leur site d’action.35 Enfin, très récemment (à partir de 2016), le potentiel des MSNs pour la livraison
des médicaments au cerveau a été envisagé, en évaluant d’abord leur capacité à traverser la barrière
hématoencéphalique (BHE).36-39 La BHE est une barrière biologique qui sépare physiquement le cerveau de la
circulation sanguine. Bien qu’elle protège le cerveau des toxines et des éléments pathogènes, elle constitue
cependant un obstacle qui empêche la majorité des agents thérapeutiques d’y pénétrer. La livraison des
médicaments au cerveau par le biais de nanovecteurs est donc un enjeu majeur pour le traitement de plusieurs
maladies cérébrales et neurodégénératives (par exemple, l'Alzheimer, le Parkinson et le cancer).
La capacité des MSNs à vectoriser les médicaments peut être suivie et mise en image par l’utilisation de sondes
d’imagerie biomédicales greffées à leur surface. Cet avantage permet leur visualisation par un système
2
d’imagerie et favorise leur utilisation pour des applications théranostiques. 40-44 L’appellation "théranostique" est
un terme dérivé de théra(pie) + (diag)nostic. Les applications théranostiques se réfèrent donc à l’utilisation des
MSNs multifonctionnelles à la fois pour des applications en thérapie et en diagnostic. Les nanoparticules
théranostiques offrent en plus l’avantage d’évaluer l’efficacité de la vectorisation et les réponses biologiques au
traitement, in vitro et in vivo.40, 44-47
 Objectifs
L’objectif général de cette thèse est de développer une nouvelle génération de nanovecteurs de médicaments
à base de nanoparticules multifonctionnelles de silice mésoporeuse et d’étudier leur potentiel pour la livraison
des médicaments et pour l’imagerie biomédicale.
Ce travail comprend 4 volets principaux dont chacun a fait l’objet d’un article :
1) Le premier sous objectif était de concevoir des MSNs multifonctionnelles sans perte de porosité et
formant un colloïde stable dans les milieux physiologiques, afin d'obtenir une combinaison optimale
entre leur performance en imagerie médicale et leur capacité de piégeage/libération des médicaments.
Le greffage du PEG sur les MSNs améliore leur biocompatibilité et leur stabilité colloïdale. Leur
fonctionnalisation avec le chélate de gadolinium permet de suivre par imagerie par résonance
magnétique (IRM) leur rétention sanguine et leur accumulation dans les organes. Cependant, le
greffage conventionnel du PEG et des chélates de gadolinium bloque les pores. Ceci s’accompagne
d’une diminution considérable de la surface spécifique et du volume poreux disponibles au piégeage
des médicaments. Pour atteindre donc notre objectif, notre stratégie consistait à greffer le chélate de
gadolinium et le PEG à la surface externe des MSNs, et ce sans en bloquer les pores afin qu’ils restent
accessibles pour la vectorisation des médicaments. Des MSNs de type MCM-48, ayant une structure
mésoporeuse ordonnée en 3D, ont été donc synthétisées et fonctionnalisées avec du PEG et des
chélates de gadolinium selon une méthode simple et efficace de greffage sélectif de la surface externe.
Cette procédure se base sur une fonctionnalisation par post-greffage en utilisant des conditions de
milieu très diluées, afin de limiter les phénomènes de diffusion dans les pores, et en déterminant avec
précision la quantité optimale des molécules à greffer, nécessaire pour couvrir uniquement la surface
extérieure des MSNs. Les matériaux obtenus ont été caractérisés par différentes techniques
physicochimiques. Après la chélation des ions Gd3+, les performances relaxométriques de ces
nanoparticules ont été mesurées et leur capacité à améliorer le contraste en IRM a été démontrée. La
stabilité colloïdale et la cytotoxicité des nanoparticules ont également été vérifiées. Enfin, la capacité
de ces MSNs fonctionnalisées à piéger des médicaments et à contrôler par la suite leur libération dans
3
les milieux pseudo-physiologiques a été évaluée en utilisant la daunorubicine comme agent
thérapeutique anticancéreux.
2) Le deuxième sous objectif consistait à étudier l’influence de la taille et de la chimie de surface des
MSNs sur le contrôle de la libération de médicaments et des performances thérapeutiques
anticancéreuses, in vitro et in vivo. Le contrôle du chargement et de la vitesse de libération de
médicaments est d’une grande importance pour atteindre une efficacité thérapeutique optimale. De
nombreux facteurs, tels que la taille et la chimie de surface, ainsi que les charges de surface et la
stabilité colloïdale des MSNs, pourraient avoir un impact majeur sur les performances des MSNs pour
la livraison des médicaments. Très peu de recherches se sont intéressées à l’influence de ces
paramètres (par exemple, taille, chimie de surface et etc.) sur l'efficacité de la libération des
médicaments. Les travaux antérieurs reposent sur des tests effectués uniquement dans des milieux
similaires aux conditions physiologiques. Or, des études cellulaires et des essais in vivo sont aussi
nécessaires. De plus, des résultats mitigés ont été publiés sur l'effet de la taille des MSNs sur
l'absorption cellulaire et sur le contrôle de la libération de médicaments. Ceci est probablement lié à
une certaine variabilité dans le contrôle des propriétés physicochimiques (ex. la stabilité colloïdale, les
propriétés texturales et structurelles, et leur chimie de surface), en particulier dans le cas des MSNs
de taille inférieure à 100 nm. Pour atteindre notre objectif, le premier défi rencontré était la synthèse de
différentes tailles de MSNs avec des propriétés physicochimiques équivalentes et une grande stabilité
colloïdale. Pour ce faire, la synthèse conventionnelle des MSNs de type MCM-48 a été modifiée et le
contrôle de la taille (de 45 à 500 nm) a été effectué en changeant les ratios molaires des réactifs et/ou
en ajoutant des agents inhibiteurs de croissance de particules. Les caractéristiques structurelles et
texturales des MSNs obtenues, ainsi que leur stabilité colloïdale dans différents milieux, ont été
étudiées. Leur surface a été par la suite fonctionnalisée avec des groupements phosphonates selon
une nouvelle stratégie de post-greffage. L’influence de l’introduction de ces groupements sur la
capacité de piégeage et de libération des médicaments a été étudiée. Ceci a été effectué en utilisant
la doxorubicine, un médicament anticancéreux largement utilisé en oncologie. L’effet de la taille des
MSNs-phosphonate sur la biocompatibilité, la rétention cellulaire, et l'efficacité du relargage des
médicaments in vitro, a été aussi vérifié. Enfin, l'effet de la taille de ces nanoparticules sur leur capacité
à s’accumuler dans la tumeur et à libérer la doxorubicine in vivo, a été évalué à l'aide d’un modèle
original, appelé modèle de l’œuf. Ce modèle in vivo consiste en un embryon de poussin développant
une tumeur suite au dépôt des cellules cancéreuses sur la membrane chorioallantoïque (CAM) d’œuf
de poulet fertilisé (cet essai in vivo est appelé « essai CAM »).
4
3) Le troisième sous objectif consistait à développer des MSNs fonctionnalisées avec un ligand spécifique
capable de déclencher leur absorption par les cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique
(BHE). Les cellules endothéliales des micro-vaisseaux du cerveau (CEMC), appelées aussi cellules
endothéliales de la BHE, sont des composantes clés de la BHE et constituent la première ligne
biologique de défense du cerveau. Les CEMC sont aussi impliquées dans plusieurs maladies du
système nerveux central (SNC). L’une des stratégies prometteuses pour améliorer l’administration des
médicaments au SNC est le développement de nanovecteurs ciblant les CEMC. Pour atteindre notre
objectif, nous avons synthétisé deux tailles de MSNs, de 50 et 160 nm, auxquels l’anticorps « Ri7 » a
été conjugué. Le Ri7 est un anticorps monoclonal qui a la capacité de s’attacher spécifiquement au
récepteur de la transferrine surexprimé à la surface des cellules constituant la barrière
hématoencéphalique. Il a été conjugué aux MSNs par le biais du polyéthylène glycol (PEG). Les
nanoparticules ont été aussi marquées avec des molécules sondes d’IRM. La réussite de la
bioconjugaison et du marquage a été démontrée par différentes analyses physicochimiques. Les
caractéristiques structurales et texturales des MSNs ont été étudiées, ainsi que leur stabilité colloïdale
et leur performance relaxométriques (contraste en IRM). L’influence de la conjugaison du Ri7 aux
MSNs sur l’efficacité de leur internalisation spécifique par les CEMC a été évaluée à la fois in vitro et
in vivo, et comparée à celle des nanoparticules contrôles. L’influence de la taille de ces particules sur
leur accumulation dans les CEMC a aussi été vérifiée. Finalement, l’affinité ligand-récepteur des Ri7-
MSNs a été mesurée et comparée à celle de l'anticorps libre.
4) Le quatrième sous objectif de cette thèse consiste à développer des MSNs comme sondes pour l’IRM
binucléaire (l’IRM du 1H et 19F) pour des applications théranostiques. L’IRM 1H combinée à l’IRM 19F est
un moyen de suivi et de diagnostic prometteur en utilisant la même modalité d’imagerie et en combinant
leurs avantages respectifs. L’IRM du proton offre des images anatomiques de haute résolution, et celle
du fluor permet d’effectuer un traçage quantitatif dû au fait que le fluor est directement proportionnel
au signal détecté sans interférence avec le milieu environnant. Pour cette étude, des MSNs (de type
MCM-48) ont été synthétisées et fonctionnalisées avec des composés fluorés (avec des fluorosilanes
ou des polyfluorosiloxanes) et du chélate de gadolinium. Les nanoparticules obtenues ont été
caractérisées par différentes techniques d’analyse physicochimique. Leur stabilité colloïdale a été aussi
évaluée. Le potentiel de ces nanoparticules pour l’IRM binuclaire (1H et 19F) a été étudié en évaluant
leurs propriétés relaxométriques et leur capacité à être détectée et de générer une image en IRM.
 Structure de la thèse
Cette thèse est composée de 7 parties : 1) une introduction qui met en contexte le sujet traité et présente les
différents objectifs et sous-objectifs de ce travail ; 2) un premier chapitre regroupant les différents aspects
5
théoriques nécessaires à la compréhension du projet ainsi qu’une revue de la littérature ; 3) un deuxième
chapitre présentant le premier article publié dans la revue "Advanced Functional Materials" et intitulé
"Mesoporous Silica Nanoparticles: Selective Surface Functionalization for Optimal Relaxometric and Drug
Loading Performances" ; 4) un troisième chapitre présentant le deuxième article publié dans la revue "Chemistry
of Materials" et intitulé "Size-Controlled Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles for Tunable Drug
Release and Enhanced Anti-Tumoral Activity" ; 5) un quatrième chapitre présentant le troisième article déjà
soumis à la revue "Journal of Materials Chemistry B" et ayant comme titre "Antibody-Conjugated Mesoporous
Silica Nanoparticles for Brain Microvessel Endothelial Cells Targeting" ; 6) un sixième chapitre présentant le
quatrième article soumis à la revue "Langmuir" et nommé "Fluorinated mesoporous silica nanoparticles for
binuclear probes in 1H and 19F MRI" ; Et enfin 7) un septième chapitre de conclusion et de perspectives.
6
Chapitre 1 : Théorie
1.1 Synthèse des nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs)
Selon la Classification selon l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), 48, 49 les matériaux
mésoporeux ont un diamètre moyen des pores compris entre 2 et 50 nm. Le terme « nano » est lié à la taille
nanométrique des particules.
La synthèse des matériaux de silice mésoporeuse se base sur l’utilisation d’agents structurants organiques
autour desquels le précurseur de la silice (de type Si(OR)n se polymérise par l’approche sol-gel, à basse
température et dans des conditions chimiques douces. Cette polymérisation est souvent réalisée par voie
organique où un précurseur organique utilisé (de type Si(OR)n) subit une étape d’hydrolyse suivie d’une
condensation (suite de réactions d’alcoxolation et olation),50 comme il est illustré ci-dessous :
L’hydrolyse est généralement catalysée par une base (ex. NaOH, NH3) ou un acide (HCl). Les réactions de
condensation qui suivent permettent la formation des ponts siloxanes (Si−O−Si) avec la production d’eau et
d’alcool comme sous-produits. La cinétique de ces réactions est influencée par plusieurs paramètres tels que
le pH, la nature et la concentration des catalyseurs, le type de précurseur de silice, le rapport molaire H 2O/Si, la
température, les co-solvants et la solubilité de la silice.
La préparation des matériaux mésoporeux nanostructurés consiste en la dissolution d’un agent structurant dans
un solvant approprié (ex. eau, alcool...), suivie par l'addition d’un précurseur de silice à une température donnée
(exemple : l’orthosilicate de tétraéthyle, TEOS : Si-(OCH2CH3)4, ou l’orthosilicate de tétraméthyle TMOS : Si-
(OCH3)4). Les agents structurants utilisés peuvent être ioniques ou non-ioniques. Les surfactants ioniques, ayant
une chaine carbonée hydrophobe et une tête polaire hydrophile, sont de type [CH3(CH2)nN(CH3)3]+X-. Le
CTAB (CetylTrimethylAmmonium Bromide (n = 15, X : Br)) est l’un des surfactants ioniques les plus utilisés.
Quant aux surfactants non ioniques, ils sont des copolymères di-blocs (de type Brij : CH3-(CH2)n-(OE)m) ou tri-
blocs (de type Pluronic (OEnOPmOEn), composé d’oxyde d’éthylène (OE) et d’oxyde de propylène (OP)). Le
P123 « (OE)20-(OP)70-(OE)20 » et le F127 « (OE)106-(OP)70-(OE)106 » sont les poloxamères les plus utilisés. La
synthèse des silices mésoporeuses nanostructurées peut être réalisée sous des conditions alcalines, acides ou
neutres et peut être combinée avec un traitement hydrothermal ou micro-ondes.
7
Il est à noter qu’à la fin de la synthèse, l’agent structurant doit être éliminé afin d’obtenir la porosité souhaitée et
de générer la structure mésostructure poreuse ordonnée. L’élimination des surfactants est généralement
effectuée par des méthodes d'extraction chimique ou par des procédés de calcination. L’extraction chimique est
une extraction liquide qui se fait avec des alcools pour les surfactants non-ioniques, ou avec un mélange d’acide
et d’alcool pour les surfactants cationiques.51, 52 D’autre part, la calcination est un traitement thermique à haute
température (généralement 550 °C).
Plusieurs types de matériaux mésoporeux nanostructurés ont été développés à ce jour. Les plus connus sont
les M41S (terme générique pour les différents types de matériaux MCM développés par « Mobil » Corporation
(Mobil Composition of Matter), les SBA (Santa Barbara Acids) et les MSU (Michigan State University). Ces
matériaux se différencient par leurs conditions de synthèse (alcaline, acide ou neutre) et par le type de l’agent
structurant utilisé (ionique ou non-ionique), comme résumé ci-dessous (Tableau 1.1).
Matériaux de Condition de Surfactant utilisé Taille des Structure

silice synthèse mésopores mésoporeuse Références
mésoporeuse
Hexagonale 2D ;
MCM (MCM-41, Milieu alcalin CTAX (X : Cl, Br) 1,5 – 10 Cubique 3D ; 50, 53-55
MCM-48, MCM- ou CTAB+Pluronic nm Lamellaire

50)
SBA (SBA-15, Hexagonale 2D ;
SBA-1, SBA-2, Milieu acide Pluronic 4 – 14 nm Cubique 3D ; 50, 56-58
SBA-14, etc.) (OEnOPmOEn) Lamellaire
MSU (MSU-2, Milieu neutre Alkyl-Aryl-PEO ou 2 – 6 nm Hexagonale 2D 50, 59
MSU-3, MSU-H.) Pluronic
Tableau 1.1. Comparaison entre quelques matériaux de silice mésoporeuse nanostructurés.
La synthèse des premières nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs) a été inspirée à partir du protocole
de synthèse de la silice mésoporeuse de type MCM-41 (famille M41S) et en suivant les principes de la synthèse
de Stöber. Cette dernière permet l’obtention de particules monodisperses de silice dense non poreuse dans des
solutions alcooliques et sous des conditions alcalines. Ainsi, la synthèse des premières MSNs avait été effectuée
en milieu basique, en utilisant l'alcool comme co-solvant, l'ammoniaque comme agent catalyseur et l’ammonium
quaternaire cationique comme agent structurant (tensioactif).60
Les MSNs les plus utilisées pour des applications biomédicales appartiennent à la famille des M41S et sont
généralement de type MCM-41 et MCM-48. Ces matériaux se caractérisent par une distribution homogène de
la taille des pores (de 1,5 à 10 nm, selon l’agent structurant et les additifs utilisés) et un arrangement des canaux
(pores) très bien défini. Pour les MCM-41, les canaux sont arrangés selon une symétrie hexagonale (structure
8
en 2D) alors que pour les MCM-48, ils sont interconnectés et organisés selon une symétrie cubique (structure
en 3D) (Figure 1.1). Les murs des pores sont à base de silice amorphe (ponts siloxane + silanols libres à la
surface). Ces deux matrices se caractérisent par une grande surface spécifique, un volume poreux élevé (de
l'ordre de 1000 m2 g-1 et 1 cm3 g-1, respectivement) et une taille modulable (inférieure à 500 nm). Ces
caractéristiques leur confèrent des avantages en termes de transport et de diffusion de matière. Ces
caractéristiques seraient très intéressantes pour des applications telles que la livraison des médicaments.
Figure 1.1 Images MET et schéma de la structure de surface des pores des MCM-41 (a) et des MCM-48 (b). 61
1.1.1 Mécanismes de synthèse

Dès les premières études sur les matériaux mésoporeux ordonnés, deux mécanismes de synthèse ont été
proposés.54 Le premier fait référence à un mécanisme appelé "cooperative templating mechanism" ou
mécanisme coopératif d'auto-assemblage et le second mécanisme est connu sous l’appellation "Liquid Crystal
Templating (LCT)".62 Le mécanisme coopératif d’auto-assemblage (Figure 1.2, Voie A) repose sur le fait que
l'ajout du précurseur de silice conduit à la formation d'une mésophase organisée hybride
(organique/inorganique) par interaction avec les agrégats de tensioactifs formés. Ce mécanisme est donc fondé
sur un auto-assemblage entre les molécules du tensioactif et les précurseurs inorganiques. Précisément,
l’organisation des micelles de tensioactifs se fait en coopération et en même temps avec la polymérisation du
précurseur de la silice autour d’elles, conduisant ainsi à la structuration du système et à la formation d’une
mésophase hybride très organisée. Le mécanisme LCT (Figure 1.2, Voie B) se base sur le fait que le précurseur
de silice se condense directement autour des micelles de surfactants déjà organisées et structurées. Celles-ci
constituent la phase cristal liquide déjà formée.
9
Figure 1.2. Mécanismes de formation des matériaux mésoporeux : mécanisme coopératif d’auto-assemblage
(voie A) et mécanisme "liquid cristal templating" (voie B).62
Pour la synthèse des M41S, le mécanisme LCT était proposé en premier comme stratégie d’obtention des
matériaux de type MCM.54 Cependant, il a été rapidement invalidé par plusieurs études. Pour les silices
mésoporeuses M41S, y compris les MSNs, il est donc désormais admis que la formation de la mésophase
hybride (organique/inorganique) repose sur un mécanisme coopératif qui résulte de l’interaction entre les
précurseurs de silice et les têtes polaires des tensioactifs.63 Il s’agit d’interactions électrostatiques de type S+I-,
avec "S" désignant le tensioactif et "I" la source de silice (Figure 1.3).
Figure 1.3. Représentation de l’interaction à l’interface organique-inorganique impliquée dans la synthèse des
silices mésoporeuses de type MCM.64
10
Ainsi, la synthèse des MSNs se fait généralement en milieu alcalin où les espèces silicates et les oligomères de
silice ont une charge négative. Ils interagissent avec la charge positive du groupe ammonium quaternaire
cationique (le CTAB, fréquemment utilisé comme tensioactif). Il est à noter que des conditions diluées sont
typiquement utilisées lors de la synthèse de ces particules afin d’éviter une agrégation entre les particules.
1.1.2 Contrôle de la taille des pores des MSNs

La porosité des MSNs est facilement contrôlable. Ceci peut se faire simplement soit par la modulation de la
longueur de la chaine carbonée de l’agent structurant utilisé, par la variation du rapport OE/OP lors de l’utilisation
des surfactants non-ioniques, ou par la modification du rapport molaire entre l’alcool et l’eau.65, 66 La température
et le temps du traitement thermique au cours de la synthèse peuvent aussi avoir un impact sur la porosité des
silices mésoporeuses. Par exemple, la taille des pores des MCM-41 peut être augmentée de 3,7 à 5,9 nm par
l’augmentation de la température de synthèse suite à un traitement hydrothermique à haute température. 53 En
outre, l’un des meilleurs moyens pour ajuster la porosité des MSNs est l’ajout d’un agent de gonflement
(triméthybenzène « TMB », hexane...).7,67 Par exemple, la taille des pores MCMs peut être contrôlée dans un
intervalle allant de 2 à 10 nm par ajout de l’agent de gonflement TMB. 54 Ce dernier a pour effet de gonfler les
micelles de surfactant formées en s’incorporant dans la partie hydrophobe de celles-ci, ce qui a pour effet
d’augmenter la taille des micelles et la porosité obtenue par la suite.
1.1.3 Contrôle de la forme des MSNs

Les MSNs sont typiquement de forme sphérique. En effet, l’utilisation d’un co-solvant aprotique pour
homogénéiser le mélange, comme c’est le cas dans la majorité des protocoles de synthèse des MSNs, favorise
l’obtention des particules sphériques avec une surface lisse.40 En changeant les paramètres de synthèse des
MSNs, comme le rapport molaire des réactifs, l’ajout de co-précurseur de silice, la température ou la vitesse
d’agitation, il est possible d’en synthétiser sous d’autres formes : tige/tube/bâtonnet, haricot, hexagone et etc. 66
Par exemple, lorsque les ratios molaires de (TEOS, CTAB et NaOH) sont doublés, la morphologie des
nanoparticules change de la forme sphérique à tubulaire, alors que la structure poreuse et la taille des pores
restent inchangées.4 Un deuxième exemple consistant en l’ajout d’un co-precurseur de silice, un organosilane
(exemple : 3-aminopropyltrimethoxysilane) et/ou un organosiloxane (exemple : N-(2-aminoethyl)-3-
aminopropyltrimethoxysilane), engendre l’obtention de particules sous forme tubulaire courbée. 68 Les MSNs
sphériques sont généralement les plus utilisées et les plus prometteuses pour les applications biomédicales, en
raison de leur interaction cellulaire favorable grâce à l’absence de différentes faces et orientations. 4
1.1.4 Contrôle de la taille des MSNs

La taille des particules est l’un des paramètres clés influençant le comportement des nanoparticules dans le
système biologique. Plusieurs études ont confirmé que la biocompatibilité et la cytotoxicité de ces nanoparticules
11
dépendent de leurs tailles : les MSNs ayant une taille inférieure à 20 nm se sont avérées être plus toxiques que
celles ayant une taille plus grande (20 – 400 nm).14, 69-71 La modulation de la taille des MSNs peut se faire en
contrôlant les étapes de nucléation et de croissance des particules tout au long du processus de synthèse. Les
conditions alcalines sont optimales pour la synthèse des MSNs. En effet, la nucléation y est bien contrôlée, la
solubilité de la silice y est élevée et la croissance des particules y est basée sur le phénomène de murissement
d'Ostwald.50 Ce phénomène implique que la croissance des plus grosses particules se fait au dépend des plus
petites ; les particules les plus petites se dissolvent et se redéposent ensuite sur les plus grandes particules qui
sont moins solubles et plus stables. Plusieurs paramètres ont un effet sur la nucléation et la croissance des
particules : le pH, la température de la réaction, la concentration et le type/nature de la base, la concentration
du surfactant, le degré de dilution (quantité d’eau), le type du précurseur de la silice, le type de l’alcool (co-
solvant), la présence d’agents inhibiteurs de croissance (ex. F127, triéthanolamine…).4, 40, 66, 72 Le contrôle de la
taille des particules se base sur la modulation d’un ou de plusieurs de ces paramètres.
1.1.4.1 Influence du pH
En général et selon le principe sol-gel, dans des conditions acides (A) ou en présence de sels (ex. NaCl), les
particules forment des agrégats et des réseaux tridimensionnels (des gels). Par contre, dans des conditions
basiques, les particules croissent en taille et diminuent en nombre. En effet, pour des pH supérieurs à 7, la
solubilité des silicates augmente fortement, les espèces de silice sont chargées négativement et sont fortement
stabilisées, ce qui conduit préférentiellement à la croissance de grosses particules au lieu d'agrégation en gel. 73
La synthèse des MSNs se fait typiquement dans des conditions alcalines (pH >7,0). La cinétique des réactions
d’hydrolyse et de condensation dépendent fortement de la variation du pH du milieu réactionnel. Dans ces
conditions basiques, les silicates sont chargés négativement et la vitesse d'hydrolyse de TEOS augmente avec
l'augmentation de pH. La vitesse de condensation augmente avec l’augmentation de la densité des silicates
chargés négativement, ce qui favorise l'attaque nucléophile lors de l’étape de condensation (Figure 1.4).
Cependant, la vitesse de condensation de TEOS ne varie pas proportionnellement avec le pH. Sa valeur la plus
élevée est atteinte à un pH aux alentours de 8, et diminue lorsque la valeur du pH est inférieure ou supérieure
à cette valeur optimale.40
12
Figure 1.4. Influence du pH sur la vitesse de condensation de la silice et la charge des espèces siliciques. 40
Le contrôle de la taille des MSNs se fait généralement en diminuant le pH du milieu réactionnel (neutralisation
à pH = 7) après un certain délai (40 à 220 secondes) et ce, afin de favoriser d’une part l’hydrolyse et le
déclenchement rapide de la nucléation, et d’autre part, la réduction de la croissance des germes par la suite.
Des particules entre 20 et 100 nm sont ainsi obtenues.74
Remarque : Il existe très peu de synthèses de nanoparticules de silice mésoporeuse rapportées directement en
milieu acide ou à des pH d’environ 7. La cinétique de nucléation et de croissance des particules, dans un tel
milieu, est très difficile à contrôler et engendre la formation de particules polydisperses. 75
1.1.4.2 Influence de la dilution et de la présence d’agents stabilisants

Afin d’obtenir des MSNs avec une bonne dispersion, il est essentiel d’éviter l'agrégation des particules au cours
de la synthèse. L’agrégation des particules résulte de réactions de condensation entre elles. Pour cela, deux
approches principales ont été utilisées : la première consiste à opérer dans des conditions très diluées, et la
deuxième se repose sur l’utilisation d’agents stabilisants. Le contrôle de la dilution a permis de moduler la taille
des MSNs de quelques centaines à quelques dizaines de nanomètres.74
Parmi ces agents, le poloxamère Pluronic® F127 (tensioactif/polymère non-ionique, (OE) 106-(OP)70-(OE)106) est
largement utilisé. Il agit à la fois comme un agent stabilisant (effet stérique) et un inhibiteur de croissance des
particules. Lors de la synthèse, le F127 s’associe à l’assemblage surfactant cationique-silicate, bloque la
13
croissance des grains et réduit l’agrégation des particules (Figure 1.5). Des MSNs de taille entre 70 et 300 nm
sont obtenues.76-78 Il est à noter que d’autres agents inhibiteurs de croissance, comme la triethanolamine
(TEA),79 le polyéthylène glycol (PEG),80 la L-lysine,81 les surfactants fluoro-carbonnés65 et le propanetriol,82 ont
été utilisés pour stabiliser et réduire la taille des MSNs.
Figure 1.5. Schéma du mécanisme d’auto-assemblage de la mésostructure des MSNs en présence d’un
agent inhibiteur de croissance (Pluronic® F127).76
1.1.4.3 Influence des ratios molaires des réactifs

Le contrôle de la nucléation et de la croissance des particules peut être réalisé aussi en modulant les rapports
molaires des réactifs. Par exemple, la diminution de la concentration de tensioactifs (c'est-à-dire du rapport
molaire surfactant/TEOS), dans les conditions alcalines de synthèse des MSNs de type MCM-41, a permis de
diminuer la taille des nanoparticules de 740 à 65 nm.83, 84
1.1.4.4 Influence des co-précurseurs de silice :

Les expériences montrent que la taille des particules peut être augmentée en utilisant le TMOS comme co-
précurseur de silice avec le TEOS. Le TMOS, plutôt que de générer de nouveaux germes, va réagir
préférentiellement avec les silanols de surface des germes déjà formés par le TEOS, et des plus grosses
particules seront par la suite formées.85
Par ailleurs, plusieurs études montrent que l’utilisation des organosilanes, comme co-précurseurs de silice avec
le TEOS dans le mélange réactionnel, est une stratégie efficace pour former des particules de plus petite taille
comparée à celle où le TEOS est seul utilisé comme source de silice. Ces résultats indiquent donc que les
14
silanes fonctionnels (les organosilanes) peuvent également être utilisés comme bloqueurs de croissance de la
taille des MSNs. L'addition d'organosilanes peut affecter le processus de nucléation et conduire à un plus grand
nombre de germes, c'est-à-dire qu’un plus grand nombre de grains est formé et qu’ainsi des particules de plus
petite taille sont obtenues.40
Remarque : la substitution du TEOS par TMOS peut engendrer la diminution de la taille des MSNs du fait que
la vitesse d’hydrolyse du TMOS est plus élevée que celle du TEOS ; cela favorise une initiation plus rapide de
la nucléation menant à la formation d’un nombre plus élevé de nucléus. Des nanoparticules de quelques dizaines
de nm peuvent ainsi être obtenues.86
1.2 Chimie de surface et stabilité colloïdale des MSNs

La surface des MSNs se caractérise par la présence de groupements fonctionnels qui sont des silanols et des
siloxanes. La Figure 1.6 représente les différents types de ces derniers.
Figure 1.6. Les différents types de silanols et siloxanes présents à la surface des MSNs (— : liaison covalente
; ……. : liaison hydrogène possible)
La réactivité des MSNs dépend de la densité de ces groupements par unité de surface. Elle augmente
principalement avec l’augmentation du nombre des silanols par nm2 de surface. La densité des silanols à la
surface peut être augmentée par hydroxylation de la silice en présence d’eau ; de nouveaux silanols actifs libres
sont ainsi formés à partir des groupements siloxanes. Cette hydroxylation peut se faire par ébullition de
particules calcinées dans l'eau87 ou par hydrolyse acide.88 La protonation et la déprotonation des silanols de
surface dans un milieu aqueux déterminent la charge de surface des MSNs et contrôlent l’ampleur de la
répulsion électrostatique entre les particules une fois mises en suspension. Cette répulsion permet de maintenir
les nanoparticules bien dispersées dans une solution donnée. Elle est donc facteur primordial pour la stabilité
colloïdale des suspensions de MSNs pures (non-fonctionnalisées). Les propriétés de dispersion des MSNs
15
dépendent de leurs propriétés de surface ainsi que de la composition moléculaire/ionique des milieux
environnants.
Le maintien de la stabilité colloïdale des MSNs en milieu biologique est un enjeu majeur. Le séchage des MSNs
après leur synthèse, peut engendrer la formation des ponts siloxane (Si-O-Si) entre les particules suite à des
réactions de condensation supplémentaires, affectant ainsi la redispersion et la mise en suspension. Selon la
densité et le degré de protonation/déprotonation des silanols de surface, des liaisons hydrogènes
(Si−OH…−O−Si) interparticules peuvent aussi avoir lieu lorsque les MSNs sont dispersées en solution. Ces
dernières sont fortes à courte distance et faibles à longue distance. Selon l’intensité des forces d’attraction et
de répulsion, il est parfois difficile de retrouver l’état colloïdal une fois les particules agglomérées. Il est donc
nécessaire de maintenir une certaine distance entre les nanoparticules afin de préserver la stabilité colloïdale.
La présence d’une couche de répulsion autour des nanoparticules, permet généralement de maintenir cet état
colloïdal. Comme illustré à la figure 1.7, la stabilisation des nanoparticules peut être d’origine électrostatique
lorsque les nanoparticules sont chargées ou d’origine stérique lorsqu’elles sont recouvertes de molécules
encombrantes, généralement des polymères. Ces couches de répulsion génèrent une barrière énergétique
empêchant les nanoparticules de se rapprocher les unes des autres. Par exemple, quelques études montrent
que la fonctionnalisation de la surface externe avec des phosphonates 30, du PEI89 (polyéthylène imine) ou du
PEG90,91 améliorer la stabilité colloïdale des suspensions de MSNs dans le PBS « Phosphate Buffered Saline ».
Figure 1.7. Schéma des moyens de stabilisation des nanoparticules : (a) stabilisation stérique et (b)
stabilisation électrostatique. (Malvern Instruments. at http://www.malvern.com/en/)
La taille et les propriétés de surface des MSNs sont les paramètres les plus critiques influençant la dispersion
des particules, leur stabilité colloïdale et leurs propriétés biopharmaceutiques. En plus d’être importante pour
assurer la stabilité colloïdale des MSNs, la fonctionnalisation contrôlée de la surface est aussi primordiale pour
ajouter des fonctionnalités aux nanoparticules et favoriser d’avantage leurs applications biomédicales.
16
1.3 Fonctionnalisation de la surface des MSNs
La surface des matériaux de silice mésoporeuse peut être modifiée par 2 méthodes : par co-condensation
(synthèse en une seule étape) ou par post-greffage (traitement après la synthèse).92 Ces méthodes de
fonctionnalisation permettent d’introduire des groupements fonctionnels supplémentaires aux matériaux
mésoporeux, leur octroyant des propriétés physicochimiques très intéressantes et des domaines d’applications
plus larges. L’introduction de ces fonctionnalités se fait par des liaisons covalentes, par une chimisorption, ou
par des interactions électrostatiques, hydrophobes ou des liaisons hydrogènes. La conjugaison par liaison
covalente est la plus stable, la plus sélective, et la plus utilisée.
Pour des applications biomédicales, la fonctionnalisation des MSNs consiste généralement à introduire des
groupements fonctionnels organiques "R" par l’utilisation des organosilanes (des silanes fonctionnels de type
(R’O)3-Si-R, avec R’: H, CnH2n+2 ...). La fonctionnalisation avec différents groupes organiques peut être réalisée
en variant le résidu "R". Des matériaux hybrides seront donc générés suite à cet assemblage inorganique-
organique (silice-groupement fonctionnel), rassemblant les avantages de la silice inorganique et des
fonctionnalités organiques. La charpente silicique apporte la stabilité thermique et mécanique ainsi que des
avantages structuraux et morphologiques. Les espèces organiques apportent des fonctionnalités
supplémentaires permettant de contrôler d’autres caractéristiques des MSNs (l’hydrophilicité/hydrophobicité, les
propriétés optiques et magnétiques, la porosité, la stabilité colloïdale, les interactions cellulaires, moléculaires,
tissulaires et etc.). Le degré de la fonctionnalisation dépend de la concentration du groupement fonctionnel, de
sa taille moléculaire, de son degré d’hydrophilicité, ainsi que de la disponibilité, de l’accessibilité et de la densité
des silanols de surface.7
1.3.1 Fonctionnalisation de la surface par co-condensation

La fonctionnalisation par co-condensation permet la fonctionnalisation des MSNs en une seule étape de
synthèse (Figure 1.8). Elle consiste en une condensation entre le tetraalkoxysilane (précurseur de silice de type
TEOS ou TMOS) et un ou plusieurs organosilanes (exemple : 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES),
(CH3CH2O)3-Si-NH2).93 Cette méthode a l’avantage d’incorporer directement le groupement fonctionnel en une
seule étape. L’élimination du surfactant (exemple : CTAB) à la fin de la synthèse ne peut se faire que par
extraction chimique pour ne pas détruire le groupement fonctionnel greffé. Cette stratégie a aussi pour avantage
de réduire les risques d’obstruction des pores par les groupements greffés. Cependant, elle présente des
inconvénients tels que : l’élimination incomplète des surfactants, la diminution de l’ordre structural, la distribution
non-homogène des groupements fonctionnels et l’inaccessibilité des fonctionnalités piégées dans la charpente
silicique.64
17
Figure 1.8. Schéma illustrant la méthode de co-condensation (a : mélange de réactifs, b : formation d’une
mésophase organique/inorganique structurée, c : libération des pores et obtention des MSNs
fonctionnalisées).64
1.3.2 Fonctionnalisation de la surface par post-greffage

Le post-greffage, un traitement post-synthèse, est plutôt dirigé par silylation des silanols libres (≡Si-OH) et des
silanols géminaux (=Si-(OH)2) se trouvant à la surface des MSNs (Figure 1.9). Ces groupements sont très
réactifs et constituent les sites actifs pour la fonctionnalisation des MSNs. Il est à noter que la densité des
silanols et leur répartition à la surface dépend du procédé d’élimination du surfactant (calcination ou extraction
chimique)50, 94 et du processus de deshydroxylation/réhydroxylation.50 La réaction de silanisation (entre les
silanols de surface et les organosilanes) est typiquement une réaction d’élimination simple s’effectuant
généralement dans des solvants organiques (exemple : toluène).95 Les propriétés de ces derniers, telles que
leur polarité et leur constante diélectrique, affectent grandement l’efficacité du greffage et la réactivité des
groupements fonctionnels.96 Avantageusement, cette approche offre l’élimination complète des surfactants, la
conservation de la morphologie et de l’ordre structural des MSNs, ainsi que celle de la réactivité et de
l’accessibilité des fonctionnalités introduites. Toutefois, un recouvrement hétérogène de la surface peut avoir
lieu où les groupements fonctionnels greffés se trouvent préférentiellement au niveau des ouvertures/entrées
des pores.96
18
Figure 1.9. Schéma illustrant la méthode de post-greffage (a : MSNs pures, b : MSNs fonctionnalisées). 64
1.3.3 Greffage sélectif de la surface interne et externe des MSNs :

Trois zones des nanoparticules de silice mésoporeuse peuvent être indépendamment fonctionnalisées : la
structure de la silice (groupements fonctionnels piégés dans la charpente silicique), la surface externe
(l’extérieur des particules) et la surface interne (la surface/paroi des pores). Le greffage sélectif de la surface
externe et interne peut s’effectuer par co-condensation ou par post-greffage.
1.3.3.1 Greffage sélectif par co-condensation

La fonctionnalisation sélective du site des nanoparticules mésoporeuses se base sur l’approche de co-
condensation séquentielle. Par variation du temps et de la concentration de l’organosilane (co-précurseur de
silice), il est possible de contrôler le site et l’emplacement des groupements fonctionnels introduits. Ces
groupements peuvent être complètement dispersés à l’intérieur des canaux poreux, concentrés dans une partie
des mésopores, ou préférentiellement placés sur la surface externe des particules (Figure 1.10). 97 Cependant,
un certain pourcentage des groupements fonctionnels greffés n’est pas réactif et ce, parce que ces groupements
sont emprisonnés dans la charpente silicique.
19
Figure 1.10. Stratégies de fonctionnalisation sélective de la surface interne et externe des MSNs par co-
condensation.97
1.3.3.2 Greffage sélectif par post-greffage

Cette approche se base sur le fait que la surface externe de la silice mésoporeuse est plus accessible que la
surface interne des mésopores. En effet, les silanols présents à la surface externe des MSNs sont cinétiquement
plus accessibles pour la fonctionnalisation par rapport aux silanols de la surface interne. 98 La fonctionnalisation
sélective de la surface externe et interne peut se faire selon 3 voies de synthèse distinctes :
- La première consiste à procéder au greffage des groupements fonctionnels avant l’élimination des
surfactants (greffage sur des MSNs "as-synthesized" contenant encore l’agent structurant dans les
pores). Ainsi, le greffage se fait préférentiellement sur la surface externe, vu que les pores sont occupés
par les agents surfactants. Par la suite, l’agent structurant est éliminé et la surface interne est donc
disponible et prête à être fonctionnalisée à son tour (Figure 1.11). Cette méthode a été validée pour le
greffage des groupements alkyles courts et longs (triméthyl- et octyl-diméthylchlorosilyle). 99
- La deuxième repose sur le greffage de la surface externe en premier lieu avec des groupements
fonctionnels assez volumineux (ne pouvant pas pénétrer dans les pores), suivie de la fonctionnalisation
de la surface interne (Figure 1.11).100
20
- La troisième est fondée sur la passivation des groupements silanols de la surface externe en premier.
Ensuite, le greffage peut se faire sélectivement à la surface interne. Finalement, les groupements de
passivation sont éliminés et la surface externe devient disponible et prête à être fonctionnalisée. 101
Figure 1.11. Stratégies de fonctionnalisation sélective de la surface interne et externe de la surface des MSNs
par post-greffage.100
21
1.3.4 Revêtement polymérique
Le revêtement polymérique consiste à envelopper la surface externe des nanoparticules de silice mésoporeuses
d’un polymère. Il est considéré généralement comme un procédé de post-greffage (greffage d’un polymère) 92.
Ce greffage se fait par réaction chimique entre l’extrémité fonctionnelle du polymère et un groupement greffé
sur la surface externe des nanoparticules9. Les polymères les plus utilisés pour le revêtement des silices
mésoporeuses destinées à des applications biomédicales sont les PEG (polyéthylène glycol),102 les PEI
(polyéthylène imine)9 et les dextrans (des polysaccharides).34 En général, les molécules de PEG sont les plus
populaires des revêtements polymériques.
 Greffage du polyéthylène glycol (PEG)

La présence du PEG à la surface des MSNs améliore la stabilité colloïdale des nanoparticules dans les
conditions physiologiques, par stabilisation stérique. Ceci favorise davantage l’administration des MSNs par voie
intraveineuse.91 Le greffage du PEG sur la surface des MSNs permet aussi de minimiser l’adsorption non
spécifique des protéines (ex. les opsonines) sur les nanoparticules et d’éviter au maximum leur reconnaissance,
leur phagocytose et leur élimination par les mécanismes de défense de l’organisme dont le système réticulo-
endothélial (« opsonisation » des nanoparticules).103, 104 La PEGylation permet ainsi d’augmenter le temps de
demi-vie des MSNs dans la circulation sanguine.9, 102, 105, 106 Tous ces avantages de la PEGyaltion des MSNs,
aident à améliorer l’efficacité de la vectorisation des médicaments en augmentant les quantités des MSNs livrés
à l’endroit ciblé. Il existe plusieurs types de PEG fonctionnalisés disponibles dans le commerce (mono-
fonctionnalisés, bi fonctionnalisés, linéaires, branchés, etc.). Ces groupements fonctionnels réactifs ajoutés aux
PEGs sont utilisés pour les conjuguer sur la surface des particules. Lors du greffage du PEG à la surface des
MSNs, il est essentiel de prendre en considération le poids moléculaire du PEG et sa densité à la surface des
particules. Par exemple, plusieurs études montrent que le poids moléculaire optimal du PEG pour minimiser
l’adsorption des protéines sur les particules de silice non-poreuse doit être entre 2000 et 5000 Da, 107 alors que
celui pour tous les MSNs doit se situer entre 10000 et 20000 Da. 108
Il est à noter que le greffage d’éléments de traçage et de ciblage sur la surface des particules se fait
généralement selon le même principe de base que le revêtement polymérique, par réaction chimique entre des
groupements fonctionnels. Cette stratégie de fonctionnalisation permet généralement d’introduire des
caractéristiques théranostiques et de faciliter l’interaction spécifique des nanoparticules avec les cellules et
l’organisme vivant en général.
22
1.4 Marquage des MSNs avec des sondes d’imagerie biomédicale
(imagerie par résonance magnétique (IRM) et imagerie optique)
L’imagerie à l’échelle moléculaire et cellulaire à haute résolution et en temps réel, est l’un des grands défis de
la recherche biomédicale actuelle. Les nanoparticules de silice mésoporeuse, grâce à leurs caractéristiques
uniques, présentent une plateforme de choix pour l’imagerie biomédicale. Le marquage des MSNs avec des
sondes d’imagerie est une approche prometteuse pour le développement de nanovecteurs de médicaments
contenant suffisamment de molécules d’intérêt diagnostique. Cette stratégie est primordiale pour évaluer le
potentiel théranostique des MSNs (c'est-à-dire leur potentiel pour la thérapie et le diagnostic). Ce marquage est
primordial pour détecter les nanoparticules par les diverses techniques d’imagerie biomédicale disponibles, pour
suivre leur comportement in vitro et in vivo et pour évaluer leur capacité à livrer les médicaments à l’organe
ciblé.
Dans la littérature, les MSNs ont été marquées avec différentes sondes d’imagerie biomédicales, notamment :
- avec des entités fluorescentes et bioluminescentes pour l'imagerie optique 46, 109-113 ;
- avec des agents de contraste pour améliorer le contraste en imagerie par résonance magnétique
(IRM)46, 114-118 ;
- avec des radioisotopes pour la tomographie par émission de positons (TEP) 46, 119, 120 et/ou la
tomographie par émission monophotonique (TEMP ou SPECT en anglais pour "single photon emission
computed tomography")120, 121 ; ou
- avec une combinaison de ces sondes pour l’imagerie multimodale. 17, 122, 123
Dans le cadre de cette thèse, l’intérêt sera porté sur le marquage des MSNs avec des sondes d’IRM et
d’imagerie optique de fluorescence.
1.4.1 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM
1.4.1.1 IRM du proton (1H) et du fluor (19F)

L’IRM est une technique d’imagerie non-invasive permettant d’obtenir des images sans l’utilisation de radiation
ionisante. Elle se base sur les principes de la résonance magnétique nucléaire (RMN) des noyaux atomiques.
Le principe de fonctionnement et la procédure d’obtention d’image est décrite en détails dans la section 1.6.13.
En raison de sa grande abondance biologique et isotopique, de son fort moment magnétique et de son
excellente sensibilité, le proton est le noyau le plus utile en IRM biologique. D'autres noyaux peuvent aussi être
détectés. Le fluor notamment, désignant le noyau de l’atome par abus de langage dans la suite du texte, est
très intéressant grâce à son abondance naturelle de 100% et à sa haute sensibilité. En effet le fluor est l’élément
qui possède la plus grande sensibilité en RMN et en IRM après le proton (elle est égale à 83% par rapport à
23
celle de ce dernier). L’IRM du proton (1H) repose donc sur les mécanismes de résonance/excitation et de
relaxation des protons des molécules d’eau en présence d’un champ magnétique externe. L’imagerie du fluor
(19F) produit des images à partir du signal des noyaux atomiques du fluor. Le signal IRM dépend de la
concentration locale en noyaux atomiques correspondants et de leur relaxation. La propriété de relaxation
consiste en une composante longitudinale T1 et composante transverse T2 (plus de détails dans la section
1.6.13).
L'IRM du proton est un outil de diagnostic bien ancré dans la pratique clinique et largement utilisé dans la
recherche préclinique. C’est l'une des modalités d'imagerie les plus puissantes. Elle fournit des images
tridimensionnelles de haute résolution (~200 µm) ainsi que des informations anatomiques et physiologiques.
Afin d’améliorer la qualité du diagnostic, l’utilisation d’agents de contraste s’avère nécessaire. Le signal détecté
ne correspond pas au produit de contraste mais plutôt à celui des protons (1H) situés à proximité de celui-ci et
avec lesquels l’agent de contraste interagit.
D’autre part, l’IRM du fluor est un outil de diagnostic de plus en plus utilisé en recherche préclinique. Elle offre
un grand potentiel pour le suivi cellulaire in vivo et pour l'imagerie moléculaire.124, 125 Comme les tissus
biologiques sont largement dépourvus de fluor, les sondes de l’IRM du 19F, molécule riche en fluor, peuvent être
détectées directement dans les tissus sans aucune interférence et sans bruit de fond du milieu environnant. Le
signal détecté est alors directement proportionnel à la concentration du 19F accumulée dans un compartiment
biologique donné. Par conséquent, l'IRM du fluor permet de réaliser de l’imagerie quantitative. Elle se présente
aussi comme une alternative aux traceurs radioactifs et ce, sans l’utilisation de radioisotopes ni de
rayonnements ionisants. Toutefois, la limite de détection du fluor avec les appareils d’IRM du 19F développés
jusqu’à présent, est assez élevée (de l’ordre de quelques mM). Cette limite contraint à une résolution spatiale
faible ainsi que des temps d’acquisition assez longs pour recueillir un signal.
L’IRM 1H combinée à l’IRM 19F est donc un outil prometteur pour l'imagerie bimodale en utilisant la même
modalité d'imagerie et en combinant leurs avantages respectifs. Le marquage des nanovecteurs avec des
agents de contraste et des sondes d’IRM permet leur détection et leur suivi en IRM lorsque leur accumulation
atteint un certain seuil dans les compartiments biologiques.
1.4.1.2 Marquage des MSNs avec agents de contraste en IRM du 1H
 Les agents de contraste en IRM du 1H

Les agents de contraste d’IRM sont utilisés pour amplifier le contraste entre les tissus hydratés. Ils ont une
influence sur la relaxation des protons des molécules d’eau (1H) qui se trouvent à leur proximité. Plus
précisément, ils ont une capacité à réduire les temps de relaxation longitudinale (T1) et transverse (T2) de ces
protons et d’accélérer ainsi leurs vitesses de relaxation respectives (longitudinale 1/T1 et transverse 1/T2). Cela
24
permet, entre autres choses, d’augmenter le contraste du signal observé en IRM. Cette capacité est mesurée
par une grandeur physique : la relaxivité (r) qui correspond à la vitesse de relaxation normalisée par la
concentration de l’agent de contraste. L’efficacité des agents de contraste est donc quantifiée au moyen des
valeurs de la relaxivité longitudinale (r1) et de celle transverse (r2). En effet, plus un agent a la capacité de
diminuer les temps de relaxation, plus les relaxivités r1 et r2 sont élevées. Ces dernières sont liées aux temps de
relaxation (T1 et T2) par l’équation ci-dessous (Équation 1.1).126
= 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑟 , [𝐴𝑔𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡] (Équation 1.1)

,
Avec : constante = la vitesse de relaxation du milieu aqueux en absence de l’agent de contraste.
Expérimentalement la relaxivité (ri) correspondant à la pente de la droites 1/Ti en fonction de la concentration

de l’agent de contraste. Le rapport r2/r1 permet de comparer les agents de contraste entre eux et de distinguer
le type de contraste qu’ils produisent (rehaussement ou atténuation du signal des zones contenant l’agent). Un
ratio r2/r1 proche de l’unité (1) correspond à un agent de contraste positif qui a un effet de rehaussement de
signal. Alors qu’un rapport r2/r1 élevé (>5) correspond à un agent de contraste négatif qui a un effet d’atténuation
du signal. Ainsi, les agents de contraste sont classés en deux catégories (Figure 1.12) : les agents de contraste
positifs (rehaussement du signal) et les agents de contraste négatifs (atténuation du signal). Les agents de
contraste positifs sont capables de réduire le T1. La zone où ces agents sont localisés apparaît plus brillante sur
les images IRM pondérées en T1. Les agents de contraste négatifs, quant à eux, diminue le T2. La région
contenant ces produits apparait plus foncée sur les images IRM pondérées en T2.
Figure 1.12. Effet de rehaussement et d’atténuation du signal en IRM des agents de contracte positifs et
négatifs.127
Les séquences pondérées en T1, appliquées avec les agents de contraste positifs, offrent généralement des
images d’une résolution et d’un rapport signal sur bruit plus élevés que celles pondérées en T2.128 De plus, ces
25
agents sont exempts des artéfacts d'image caractéristiques des agents de contraste négatifs. 128 Notre intérêt
s’est donc porté sur les agents de contraste positifs, aussi appelés agents de contraste T1.
Les agents de contraste positifs sont généralement composés d’éléments paramagnétiques, c'est-à-dire des
éléments chimiques ayant un moment magnétique non nul, comme le gadolinium, le manganèse etc. Le
gadolinium (Gd3+) est l’agent de contraste positif le plus utilisé. C’est l’élément paramagnétique ayant le moment
magnétique le plus élevé, grâce à ses 7 électrons non appariés.126 Le gadolinium ne peut pas être utilisé sous
sa forme ionique libre du fait de sa grande toxicité. Pour pallier à cet inconvénient, il est souvent utilisé sous la
forme d’un chélate de gadolinium. Il s’agit de complexes obtenus suite à une chélation entre l’ion Gd 3+ et un
ligand organique polydenté. L'affinité du chélate pour le gadolinium doit être élevée pour éviter le relargage de
l’ion gadolinium libre (Gd3+) dans l’organisme. Les polyaminocarboxylates linéaires et macrocycliques, comme
le DTPA (l’acide diethylènetriaminopentaacétique) et le DOTA (l’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-
1,4,7,10-tétraaminopentaacétique), se sont révélé les plus appropriés pour assurer ce rôle.128 Ces derniers sont
actuellement utilisés en clinique.
Figure 1.13. Structure moléculaire de chélates de gadolinium.
Nonobstant leur efficacité et leurs excellentes propriétés relaxométriques, les chélates de gadolinium sont très
peu internalisés et retenus par les cellules ; leur sensibilité est donc faible (1 seul ions Gd par chélate) et leur
utilisation pour le marquage cellulaire est quasi-impossible.129
 Marquage des MSNs avec des chélates de gadolinium

Le marquage des MSNs avec des chélates de gadolinium permet de distinguer la présence des nanoparticules
en imagerie pondérée T1, et ce lorsque leur accumulation atteint un certain seuil dans les organes. Ce marquage
favorise davantage l’accès des molécules d’eau aux ions gadolinium et augmente le nombre d’ions Gd par unité
d’agent de contraste, de 1 Gd/chélate à plusieurs centaines d’ions Gd par nanoparticule. Ceci a pour
26
conséquence d’augmenter les relaxivités relatives (par unité d’agent de contraste). Aussi, ce marquage permet
de surmonter d’autres limitations liées à l’utilisation des Gd-chélates libres, à savoir : leur biodistribution non-
spécifique et leur élimination rapide de l’organisme.130 De plus, l’immobilisation des Gd-chélates sur les
nanoparticules diminue le temps de rotation du complexe, induisant ainsi l’amélioration des propriétés
relaxométriques (augmentation des relaxivités).131 Le marquage des MSNs avec des chélates de gadolinium
offre donc plusieurs avantages potentiels, tels que la possibilité du marquage cellulaire, l’amélioration de la
détection in vitro et in vivo, ainsi que l’évaluation de l’efficacité du ciblage et du traitement. Plusieurs études
montrent le potentiel des MSNs marquées avec les chélates de gadolinium comme nouvelles sondes pour l’IRM.
À cet égard, plusieurs stratégies de greffage ont été présentées, notamment par co-condensation et par post-
greffage.114, 122, 132, 133
Mou et al. et Huang et al. ont été parmi les premiers à synthétiser, des MSNs-DTPA(Gd) par co-condensation
en utilisant un DTPA-silane.132 Les particules obtenues sont sous forme de bâtonnet de 100 nm de largeur et
350-500 nm de longueur. Les DTPA(Gd) greffés étaient présent à la fois à la surface interne et externe de ces
particules. Ces particules possèdent des relaxivités élevées : r1 = 22 s-1 mM-1, r2 = 41 s-1 mM-1 et r2/r1 = 1.86.132
Des MSNs-DTPA(Gd) sphériques, ayant une taille moyenne de 120 nm, ont été par la suite obtenues en
diminuant le ratio DTPA-silane/TEOS et des meilleures propriétés relaxométriques ont alors été obtenues (r 1 =
23 s-1 mM-1, r2 = 34 s-1 mM-1 et r2/r1 = 1.48).122 Ces nanoparticules ont prouvé leur efficacité pour le marquage
cellulaire in vitro pendant 2 h, et in vivo où un rehaussement de signal était toujours détectable au site de
l’injection après 14 jours. Aucune cytotoxicité à court terme (après 2 h) n’a été détectée avec ces nanoparticules
administrées à 300 μg mL-1. Une autre étude a montré le fort potentiel des MSNs-DTPA(Gd)-PEG de 130 nm,
fonctionnalisées par post greffage sur des MSNs-NH2, comme nano-agents de contraste pour l’IRM in vitro et
in vivo.114, 122, 132, 133 Les DTPA(Gd) sont localisés à la surface interne (dans les pores) et externe des MSNs.
Ces particules montrent aussi des relaxivités intéressantes (r1 = 25.7 s-1 mM-1, r2 = 56 s-1 mM-1 et r2/r1 = 2.18).114,
122, 132, 133
La présence des chélates de Gd dans les pores des MSNs présente cependant certaines limitations. Pour que
le système MSNs-DTPA(Gd) présente une bonne relaxivité, il est essentiel que les pores des MSNs soient
suffisamment larges pour incorporer les complexes de gadolinium et surtout pour permettre la bonne diffusion
des molécules d’eau dans les pores. Pour des pores ≤ 3 nm, la diffusion de l’eau au sein de ces particules est
considérablement réduite ce qui diminue le contact entre Gd3+ et les protons des molécules d’eau. En
conséquence, les molécules DTPA-Gd présentes dans les pores sont considérées comme « inactives » en
termes de propriétés relaxométriques et sont susceptibles d’affecter négativement les relaxivités. 134 Une autre
étude rapporte que le greffage des DOTA-Gd à la surface externe et à l’entrée des pores des MSNs par co-
condensation retardée (DOTA-silane utilisé) aboutit à l’obtention de relaxivités les plus élevés (r 1 = 33.6 s-1 mM-
27
1), comparativement au greffage des DOTA-Gd dans les pores par post-condensation classique (r1 = 17.4 s-1
mM-1) et à la méthode de post-greffage (greffage à la surface interne et externe, r 1 = 10.8 s-1 mM-1).135
Par ailleurs, la présence des chélates de gadolinium dans les pores et/ou à l’entrée de ceux-ci, nuit à leurs
applications en tant que nanovecteurs de médicaments, du fait que les pores ne seront plus accessibles pour
piéger les médicaments à transporter/livrer. En effet, les méthodes de greffage susmentionnées entrainent le
plus souvent une diminution dramatique de la porosité des MSNs, paramètre primordial pour des applications
en vectorisation des médicaments. Les applications de ces MSNs marqués avec du DTPA(Gd) se sont limitées
à leur utilisation pour le diagnostic comme sondes d’IRM. Pour des applications théranostiques, de plus amples
investigations au niveau du greffage des chélates de Gd sur les MSNs sont nécessaires.
1.4.1.2 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM du 19F

Les sondes d’IRM du 19F sont des composés fluorés comportant souvent plusieurs atomes de fluor. Parmi ces
composés, les perfluorocarbures (PFC) sont très prometteurs.136 Les PFC possèdent une structure très stable
semblable à celle des hydrocarbures où les atomes d’hydrogène sont remplacés par des atomes de fluor. Ils
peuvent être cycliques ou linéaires sous forme de molécules ou de polymères (ex., perfluoro-15-crown-5-ether,
perfluoropolyether, perfluorodécaline, hexafluorobenzene…). Les sondes fluorées les plus intéressantes pour
l’IRM du 19F sont celles ayant tous les atomes du fluor équivalents chimiquement (c'est-à-dire des atomes de
fluor ayant le même environnement chimique). Ceci est très avantageux pour avoir un seul pic de résonance et
une sensibilité optimale. Ceci permet d’augmenter la sensibilité de ces sondes et d’éviter les artefacts de
déplacement chimique susceptibles d’apparaitre dans les images d’IRM du 19F.137 Les sondes fluorées sont
utilisées généralement sous forme d’émulsions ou de nanocapsules (encapsulation dans une nanoparticule,
généralement dans un polymère) pour faciliter leur dispersion dans des solutions aqueuses et pour obtenir des
préparations injectables par la suite.136
Le marquage des MSNs avec des sondes d’IRM du 19F est considéré comme une stratégie prometteuse non
seulement pour améliorer davantage la solubilité aqueuse des sondes fluorées mais aussi pour augmenter la
concentration locale et la densité en fluor par unité d’agent de contraste. Ceci permet d’augmenter la sensibilité
de détection in vitro et in vivo et donne un avantage à l’utilisation des MSNs pour le marquage cellulaire dans
les études de biodistribution quantitative et dans des applications théranostiques (thérapie et imagerie par IRM
du 19F).
Jusqu’à présent le marquage des MSNs avec des sondes fluorées était fondé sur l’encapsulation des PFC dans
les particules de silice. Cette encapsulation pouvait se faire par piégeage de ces molécules dans les pores des
MSNs ou dans le cœur d’un système « cœur-coquille ». Dans le premier cas, des molécules de C 6F6 sont
piégées dans les pores des MSNs de 100 nm.138 Le système obtenu a montré son potentiel pour le marquage
28
cellulaire des cellules du cancer du poumon où un rehaussement de contraste positif est observé au niveau des
cellules imagées par IRM du 19F avec un T1 de l’ordre de 2.4 s (aucune information sur le T2). Dans le deuxième
cas, le cœur du système cœur-coquille est constitué par le perfluoro-15-crown-5-ether et la coquille est à base
de silice mésoporeuse105 ; les particules obtenues ont une taille moyenne de 80 nm 139, 140 et de 250 nm.141 Les
particules de 250 nm se caractérisent par un T1 de l’ordre de 650 ms (T2 n’est pas rapporté) et ont été utilisées
pour une étude de biodistribution quantitative montrant leur accumulation dans le foie. 141 Les nanoparticules
cœur-coquille de 80 nm rapportées par Kikuchi et al.104, 105 se caractérisent par un T2 de l’ordre de 0.210 s (T1
n’étant pas rapporté) et ont montré un fort potentiel d’accumulation dans les tumeurs (détection in vivo par IRM
du 19F) et à assurer un marquage cellulaire prometteur (rehaussement du contraste des cellules cancéreuses
marquées avec ces nanoparticules en IRM du 19F).
Bien que prometteur, le piégeage/encapsulation des composés fluorés dans les MSNs s’accompagne d’un
risque élevé de leur diffusion à l’extérieur des pores de ces nanoparticules pour se retrouver libre dans le milieu
environnant. Ceci peut mener à des résultats de suivi et de marquage erronés. Pour éviter cette lixiviation
indésirable, de nouvelles approches et stratégies de greffage sont nécessaires.
1.4.2 Marquage des MSNs avec des fluorophores

Les fluorophores conventionnels, comme les colorants fluorescents, les protéines fluorescentes,
bioluminescentes, et les points quantiques (quantum dots), sont les sondes d’imagerie optique de fluorescence
les plus utilisées.142 L’imagerie optique de fluorescence est basée soit sur la fluorescence des tissus, soit sur
celle des fluorophores administrés (détails dans la partie 1.6.12). Dans la littérature, le marquage des
nanoparticules de silice mésoporeuse est généralement obtenu par greffage, au niveau de la surface interne,
des colorants fluorescents tels que : l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) 27, 32, 33, 89, 91, 143-145, la rhodamine
B146, l’Alexa Fluor®145, le vert indocyanine112 et le colorant rouge-nil.147 Ces colorants sont des molécules
organiques appelées fluorochromes. Ils se caractérisent par la présence de groupements chromophores
capables d’émettre une lumière fluorescente suite à leur excitation à une certaine longueur d’onde. La
conjugaison de ces molécules organiques aux nanoparticules peut se faire par co-condensation ou par post-
greffage. Le greffage par co-condensation implique l’utilisation d’un organosilane que l’on fait réagir avec le
fluorophore avant de l’ajouter au mélange réactionnel. Le post-greffage quant à lui repose sur le greffage d’un
fluorosilane sur des MSNs pures ou du fluorophore sur des MSNs déjà fonctionnalisées. Les fluorophores ont
une sensibilité élevée en solution ; ces stratégies de conjugaison les protègent donc du milieu extérieur,
augmente leur stabilité et amplifie l’intensité du signal obtenu. Pour ces raisons, ces sondes d’imagerie sont
généralement emprisonnées dans la charpente silicique ou greffés sur la surface interne des MSNs.
29
Le marquage des MSNs avec des fluorophores comme sondes d’imagerie optique de fluorescence, est une
stratégie pour le traçage cellulaire, les essais in vitro et quelques tests in vivo. En effet, la stabilité optique et
l’intensité élevée des nanoparticules fluorescentes offrent une reconnaissance spécifique, permettent
d’effectuer une analyse ultrasensible, d’estimer l’internalisation et la rétention cellulaire des particules, de suivre
leur biodistribution et leur ciblage spécifique, ainsi que d’évaluer leur efficacité pour la livraison et la libération
des médicaments.148
1.5 MSNs pour la vectorisation des médicaments

La vectorisation des médicaments consiste à transporter et à livrer un principe actif (agent thérapeutique) en
quantité suffisante vers un site ciblé au moyen d’un vecteur adéquat qui contrôle le sort du système in vivo.8
Cette vectorisation permet d’une part, d’éviter l’administration directe du médicament dans l’organisme et d’autre
part, d’améliorer les caractéristiques pharmacocinétiques du principe actif vectorisé.
Les MSNs les plus utilisées et les plus prometteuses pour la vectorisation des médicaments appartiennent à la
famille des M41S et sont typiquement de type MCM.
Le chargement de ces nanovecteurs avec les agents thérapeutiques est dans la majorité des cas une procédure
de post-synthèse fondée sur l’imprégnation des nanoparticules dans une solution où l’agent thérapeutique est
solubilisé.28-30 Toutefois, dans certains cas, ce chargement peut être réalisé par l’encapsulation directe de l’agent
thérapeutique lors de la synthèse des nanoparticules (synthèse et piégeage en une seule étape). 31 Le
médicament est piégé dans les pores des MSNs par adsorption, dans la majorité des cas,149, 150 ou par liaison
covalente, dans de rares cas.150
Plusieurs paramètres peuvent influencer l’efficacité des MSNs comme nanovecteurs pour la livraison des
médicaments. Ces paramètres ont un impact sur l’efficacité du ciblage vers le site d’action (par exemple la
tumeur, le cerveau…) et/ou sur la capacité à piéger et à relarguer les médicaments in situ.
1.5.1 Paramètres influençant le ciblage et l’internalisation des MSNs par les

cellules
1.5.1.1 Taille des MSNs
La taille des MSNs est un facteur crucial pour leurs applications biomédicales. La taille des particules détermine
leur capacité d'internalisation dans les cellules cibles et à pénétrer à travers les tissus. 103, 151, 152
La taille des MSNs conditionne leur utilisation pour la vectorisation des médicaments par voie intraveineuse.
Les nanovecteurs entre 20 et 200 nm peuvent éviter la filtration golmérulaire et l’accumulation très rapide au
30
niveau du système réticulo-endothélial, ce qui permet d’augmenter leur temps de demi-vie dans la circulation
sanguine.34
Grâce à leur taille, les MSNs peuvent assurer une livraison ciblée à la tumeur. Il s’agit d’un ciblage passif de la
tumeur. En effet, les MSNs de taille comprise entre 25 et 300 nm peuvent livrer, d’une manière sélective, les
agents anticancéreux aux tumeurs grâce à un phénomène appelé "effet EPR (Enhanced Permeability and
Retention)".153 Ce phénomène est basé sur le fait que les nanovecteurs peuvent traverser la vascularisation
tumorale en raison de l’abondance de larges pores (fenestration de 80 – 300 nm) anormaux présents dans les
vaisseaux sanguins tumoraux. Ils auraient alors plus de facilité à pénétrer et à s’accumuler dans les tumeurs
qu’à traverser les jonctions inter-endothéliales des tissus normaux dont la fenestration n’a que quelques
nanomètres de diamètre (en moyenne aux alentour de 2 nm) (cf. Figure 1.14).35
Figure 1.14. Schéma de l’accumulation d’un nanomatériau chargé d’un agent anticancéreux par effet EPR. 35
À ce sujet, l’équipe de Tamanoi et al. a mis en évidence la capacité des MSNs de 100 - 130 nm à s’accumuler
préférentiellement dans une tumeur, par le mécanisme EPR, 4 h post-administration intraveineuse. 32 Un
comportement similaire a été rapporté par Hyeon et al. avec des MSNs de 150 - 200 nm. L’accumulation de ces
MSNs dans la tumeur a été observée 24 heures post-administration. 118
L’internalisation cellulaire des MSNs dépend fortement de leur taille. D’une manière générale, les particules de
taille supérieure à 300 nm ont une capacité très réduite à traverser les membranes cellulaires et sont
susceptibles de provoquer une cytotoxicité même à des concentrations modérées (0.2 – 0.5 mg mL-1).103, 154 Par
suite, les MSNs de taille inférieure peuvent être absorbées, généralement par endocytose, par les cellules et ce
31
sans cytotoxicité notable.14 Certaines études suggèrent que la taille optimale des MSNs non-fonctionnalisées
doit se situer aux alentours de 50 nm pour une internalisation cellulaire efficace. L’internalisation de ces
nanoparticules dans les cellules a été plus élevée que celles de plus grande taille (≥ 100 nm : 105, 120, 170 et
280 nm) et même que celles de plus petites tailles (25 – 30 nm).155, 156 En revanche, d'autres études arrivent au
résultat que des MSNs pures et des MSNs recouvertes du PEG est plus efficace avec des nanoparticules de
100 -150 nm, en comparaison avec l’absorption cellulaire des MSNs de 50 – 55 nm. 157, 158
Il s’avère donc difficile de tirer des conclusions à partir des études déjà publiées. Des études plus approfondies
sont nécessaires en utilisant des nanoparticules ayant des propriétés de surface semblables afin d’évaluer avec
précision l’effet de la taille des MSNs sur l’absorption cellulaire et la libération des médicaments.
1.5.1.2 Charge de la surface
Les MSNs non-fonctionnalisées se caractérisent par la présence des groupements silanols à la surface et par
une charge de surface négative dans les pH physiologiques, ce qui favorise l’interaction avec les têtes
hydrophiles des phospholipides de la membrane cellulaire.159 Cette adsorption à la surface des cellules mène
par la suite à leur transport dans le cytosol par endocytose (processus par lequel les cellules
internalisent/absorbent des composés qui ne peuvent diffuser au travers la membrane cellulaire).
Il est difficile de trouver une corrélation entre la charge de surface des nanovecteurs et l’amélioration leur
internalisation cellulaire. Cette internalisation ne dépend pas seulement de la charge de la surface des MSNs
(groupements à la surface) mais aussi de la nature et du type de la cellule. A cet égard, plusieurs groupes ont
rapporté que l’internalisation de MSNs chargées positivement (fonctionnalisées avec des amines) dans des
cellules HeLa (cellules cancéreuses) est nettement améliorée par rapport à celle des MSNs chargés
négativement (MSNs pures).104, 160 En revanche, une meilleure absorption des nanoparticules par les cellules
HEK-293t (Human Embryonic Kidney) est obtenue avec des particules de charge de surface négative (pures et
fonctionnalisées avec des −COOH), qu’avec celles chargées positivement (surface décorée avec des
amines.)161, 162 Il est finalement à noter que certaines études avancent que l’absorption cellulaire des MSNs
chargées, que ce soit positivement ou négativement, est plus efficace que celle des MSNs non-chargées
(charge de surface proche de zéro suite à un revêtement polymérique). 27
1.5.1.3 Greffage de ligands de ciblage

Le greffage de « ligands de ciblage » sur les MSNs est très avantageux pour améliorer leur sélectivité et leur
efficacité en tant que nanovecteurs de médicaments. Ce type de greffage est appelé « ciblage actif ». Le ligand
de ciblage est généralement une molécule (ex. l’acide folique), un peptide (ex. une séquence d’acides aminés :
arginine-glycine-acide aspartique (RGD)) ou une protéine (ex. anticorps). Ces ligands possèdent une grande
32
affinité et une forte sélectivité vis-à-vis d’une cible donnée, telle que les cellules cancéreuses dans une tumeur,
les cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique (BHE), etc. Ce ligand va donc se lier à son
récepteur spécifique se trouvant sur la membrane des cellules ciblées. Dans le but de garantir l’efficacité du
ciblage actif des nanovecteurs, les ligands doivent être greffés sur la surface externe de la nanoparticule, par
une liaison covalente, évitant ainsi leur dissociation dans les conditions physiologiques et maximisant en même
temps leur interaction avec les récepteurs membranaires.
Plusieurs études ont mis en évidence l’intérêt du greffage des ligands de ciblage sur la surface des MSNs pour
augmenter l’efficacité de leur internalisation par les cellules cancéreuses, et ce in vitro et in vivo.89, 103, 163-167
Cette approche permet de cibler avec précision les cellules cancéreuses et de sauvegarder les cellules normales
(saines) via une livraison plus spécifique et plus ciblée des agents anticancéreux à la tumeur. Les ligands de
ciblage des cellules cancéreuses les plus utilisés sont : 1) l’acide folique pour le ciblage des récepteurs folates
surexprimés dans certaines lignées de cellules cancéreuses (ex. cancer des ovaires, de l'endomètre, du sein et
du poumon)89, 91, 168 ; et 2) les peptides RGD et TAT ayant une grande affinité pour les récepteurs d’intégrine
surexprimés dans les cancers métastatiques.156, 169-171
Par ailleurs, la conjugaison de séquence RGD modifiée37 et des anticorps38, 39 aux MSNs s’est avérée une
approche de choix pour améliorer le ciblage de ces nanovecteurs au cerveau. Yang et al. et Zhou et al. 38, 39 ont
montré le potentiel des MSNs conjuguées avec la transferrine pour cibler la barrière hématoencéphalique. Cette
performance se base sur la grande affinité de ce ligand (tranferrine) avec les récepteurs de la transferrine, qui
sont très abondants à la surface des membranes des cellules de la BHE.38, 39
 L’anticorps Ri7 comme ligand ciblant les cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique
Le Ri7 est un anticorps monoclonal appartenant à la famille des IgGs. Les IgGs sont des anticorps (des
immunoglobulines (Ig)) ayant un poids moléculaire de 150 kDa et sont composés de 4 chaines peptidiques
formant un tétramère de structure quaternaire, avec 2 grandes chaines identiques de 50 kDa et deux autres
également identiques de 25 kDa chacune (Figure 1.15).
33
Figure 1.15. Représentation d'un anticorps de type IgG (a) et structure cristallographique de rayons X d'une
molécule d'IgG (b).172
Le Ri7 est un ligand s’attachant spécifiquement au récepteur de la transferrine surexprimé à la surface des
cellules constituant la barrière hématoencéphalique. En fait, la BHE est constituée de cellules endothéliales des
capillaires cérébraux. Elle se différencient par la présence de jonctions intracellulaires très étroites (absence de
fenestrations) et de plusieurs transporteurs et récepteurs pour réguler et restreindre la diffusion de molécules,
comme le glucose, les acides aminés essentielles, l’albumine..., au cerveau173 (Figure 1.16). Le récepteur de la
transferrine est donc un système de transport permettant à ses ligands spécifiques de traverser la BHE et de
pénétrer dans le cerveau. Ce système de transport se base sur un mécanisme d’endocytose par récepteur. Ce
mécanisme consiste en la reconnaissance spécifique entre un ligand et son récepteur, suivie de leur pénétration
dans le cytoplasme de la cellule sous forme de vésicules (Figure 1.16). Le Ri7 possède donc un fort potentiel
de ciblage des cellules endothéliales de la BHE, comme l’ont démontré plusieurs groupes de recherche. 174-177
Le greffage du Ri7 sur les MSNs pourrait être une alternative intéressante pour améliorer la livraison des
médicaments au cerveau en augmentant le potentiel de ces nanovecteurs à se lier à la BHE, à la traverser pour
s’accumuler enfin dans le cerveau.
34
Figure 1.16. Schéma de la barrière hématoencéphalique et des différents mécanismes impliqués dans le
transport trans-BHE de molécules.178
1.5.2 Paramètres influençant l’adsorption et le relargage des médicaments

La modulation des caractéristiques des MSNs permet de contrôler les processus de piégeage et de relargage
des agents thérapeutiques. L’adsorption et la libération des médicaments dépendent non seulement de la
surface spécifique et de la porosité des nanoparticules, mais aussi de leur morphologie et de leur chimie de
surface.
1.5.2.1 Surface spécifique et porosité

La quantité de médicaments que les MSNs peuvent piéger dépend essentiellement de leurs surfaces
spécifiques, de leurs volumes poreux disponibles et du diamètre des pores à leurs surfaces. Plus la surface
spécifique est grande, plus des sites d’adsorption spécifique sont présents et plus le nombre de molécules
susceptibles d’être adsorbées augmente.5 Un diamètre de pore légèrement plus grand que la taille de la
molécule à vectoriser est, en règle générale, suffisant pour permettre l'adsorption du médicament à l'intérieur
des pores (rapport taille des pores / taille de la molécule à piéger > 1). Alors que, pour la vectorisation d’agents
thérapeutiques de grande taille (ex. les protéines, l’ADN, l’ARN…), l’augmentation de la taille des pores est
nécessaire pour améliorer la capacité de leur piégeage dans les pores.179 À titre d’exemple, l’adsorption de
l’ADN a crû à mesure que l’on a augmenté la taille des pores (3,4 à 5,4 et 10 nm). 180
Plusieurs études montrent que le contrôle de la libération des médicaments des pores des MSNs peut s’effectuer
en modulant la taille de ces pores. Précisément, plus les pores sont ajustés à la taille de l’agent thérapeutique
35
vectorisé, plus les phénomènes de diffusion de cette molécule piégée dans les pores sont difficiles, et plus la
cinétique de relargage est lente.26, 181-183 Ceci favorise une élution du médicament continue à long-terme. Par
exemple, la cinétique de relargage de l’ibuprofène, un anti-inflammatoire non stéréoïndien, a diminué en
diminuant le diamètre des pores des MSNs de 3.6 à 2.5 nm184. De plus, la libération de la doxorubicine, un agent
anticancéreux, a été de plus en plus rapide au fur et à la mesure que la taille des pores des MSNs augmentait
de 3.2 à 6.4 et à 12.6 nm.181
1.5.2.2. Morphologie des particules

La morphologie des MSNs s’est révélée être aussi critique pour l’adsorption et le relargage des médicaments.
Tout d’abord, les MSNs de forme sphérique sont classées nettement plus intéressants pour l’adsorption des
médicaments (quantité adsorbée plus grande) que les particules sous forme de bâtonnet 185 et que celles ayant
des formes irrégulières.186
La géométrie des pores et la connectivité entre les pores des MSNs peuvent aussi influencer l’efficacité du
piégeage des médicaments ainsi que la cinétique et le mécanisme de relargage. En effet, l’augmentation de
connectivité entre les pores engendre une augmentation du nombre de sites d’adsorption et de diffusion des
molécules dans les pores lors du piégeage et lors du relargage des médicaments. Ainsi, les MSNs de type
MCM-48 ayant un réseau unique de canaux pénétrants et interconnectés, et une structure cubique poreuse
tridimensionnelle, s’avère être plus avantageux que les MSNs de type MCM-41 ayant une structure hexagonale
bidimensionnelle. Dans ces matrices de porosité interconnectée, la diffusion de la matière est plus facile et le
nombre de sites actifs est plus élevé, offrant une plus grande capacité d’adsorption (Figure 1.17). 26, 187, 188
Figure 1.17. Représentation de la capacité d’adsorption des MCM-48 (Structure en 3D) et des MCM-41
(structure en 2D) ; sphère : molécule vectorisée.187 Grâce à la porosité interconnectée des MCM-48, une plus
grande quantité de médicaments, représentés sous forme de sphères bleues, peut être piégée.
Dans une matrice ayant une mésostructure interconnectée, les phénomènes de diffusion de la matière sont plus
favorables et plus importants que ceux dans une matrice à porosité non-connectée. Par conséquent, la quantité
36
et la vitesse de diffusion des molécules vectorisées dans les MCM-48 seraient plus élevées que celles obtenues
avec les MCM-41.70 Cependant, Popat et al.187 et Izquierdo-Barba et al.188 ont suggéré récemment que les
caractéristiques structurelles des MSNs (3D-cubique et 2D-hexagonale) n’ont une influence que sur leur
capacité de piégeage et ne modifient pas nécessairement les profils de la cinétique du relargage des
médicaments, comme l’ibuprofène188 et des pesticides, comme l’imidaclopride.187
1.5.2.3. Chimie de surface

Les caractéristiques chimiques de la surface des MSNs sont extrêmement importantes puisqu’elles influencent
de manière directe et indirecte l’efficacité des MSNs en tant que nanovecteurs de médicaments. La surface des
MSNs pures (non-fonctionnalisées) se caractérise, comme mentionné précédemment, par la présence des
silanols de surface. L’interaction des groupements fonctionnels des molécules médicamenteuses avec ces
silanols de surface favorise leur adsorption à la surface des MSNs et garantit par la suite leur piégeage dans
les pores.
La fonctionnalisation de la surface interne des MSNs avec des groupements organiques fonctionnels (amines 24,
189, 190, thiols4, phosphonates27, 33, 191, alkyles19, etc.) permet d’introduire des sites d’adsorption supplémentaires.
Ces groupements sont choisis de façon à optimiser les interactions spécifiques entre la surface des MSNs et
les molécules thérapeutiques et augmenter par la suite les quantités vectorisées. Le choix du groupement
organique à greffer dépend des propriétés de la molécule à vectoriser. Par exemple, la fonctionnalisation de la
silice mésoporeuse avec des amines s’est avérée beaucoup plus performante dans le cas où la molécule à
vectoriser présente une charge négative dans les conditions d’imprégnation.189 Par contre, le greffage des
groupements carboxyles est plus avantageux pour les biomolécules chargées positivement. 33 Il est à noter que
les interactions entre la surface des MSNs et les molécules thérapeutiques à vectoriser dépendent également
des propriétés de la solution d’imprégnation, notamment de la nature du solvant et du pH. En pratique, le solvant
est choisi selon la solubilité du médicament pour faciliter l’adsorption en favorisant les interactions avec la
surface des pores et en minimisant, en même temps les interactions solvant-médicament. Le chargement des
MSNs avec les agents thérapeutiques hydrophobes est réalisé dans un milieu non-aqueux ce qui permet de
minimiser la dépendance au pH et de solubiliser les molécules hydrophobes.192 Dans le cas des agents
thérapeutiques hydrophiles, un solvant aqueux est généralement utilisé pour atteindre des pourcentages
d’adsorption plus élevés que ceux obtenus dans un solvant organique.192 Dans ce dernier cas, il faut tenir compte
aussi de l’influence du pH sur l’efficacité de l’adsorption. En effet, comme la charge de l’agent thérapeutique et
celle des groupements à la surface des MSNs varient en fonction du pH, il est important que le pH de la solution
d’imprégnation soit adéquat pour maximiser les interactions attractives entre la surface des MSNs et la molécule
à vectoriser.193
37
En plus d’avoir une influence sur l’efficacité du piégeage des médicaments, les groupements à la surface des
MSNs contrôlent aussi leur relargage. Zeng et al.24 ont conclu que la cinétique de la libération de l’aspirine
diminuait avec l’augmentation du nombre de groupements amines greffés à la surface des MSNs. De leur côté,
Song et al.194 ont rapporté que le relargage de l’ibuprofène est meilleur à partir de la silice mésoporeuse
fonctionnalisée avec des groupements amines, par la méthode de post-greffage que par co-condensation.
Un contrôle précis et sophistiqué de l’élution des médicaments peut se faire par greffage de systèmes sensibles
à une stimulation externe, appelés barrières et connus sous l’appellation de "gatekeepers" 4, 195, 196 (Figure 1.18).
Ces systèmes sont greffés sur la surface externe des nanoparticules au niveau des pores. Leur rôle est de
contrôler l’ouverture et la fermeture des pores. De ce fait, ils peuvent assurer la régulation de l’encapsulation et
du relargage des agents thérapeutiques. Parmi les "gatekeepers" les plus prometteurs, on trouve : la béta-
lactoglobuline,197 la coumarine,198 la cyclodextrine,199-201, le cucurbituril,202-204 le Fe3O4,144, 205 le PAMAM
(polyamidoamine),206 etc. L’activation de ces systèmes est généralement contrôlée par l’un ou l’autre des
facteurs suivants : le changement de pH,199, 200, 202-204 la présence d’enzymes201 ou d’agent redox,207 l’action
d’une irradiation UV34, 198 ou la présence d’un champ magnétique.205
Figure 1.18. a) Représentation générale d’une nanoparticule de silice mésoporeuse chargée d’agents
thérapeutiques et fonctionnalisée avec des "gatekeepers" 4 ; b) Illustration du contrôle d’ouverture et de
fermeture des pores des MSNs par un "gatekeepers" polymérique. 208
1.5.2.4 Stabilité de la silice à l’hydrolyse

Pour une vectorisation efficace, les MSNs doivent avoir une bonne stabilité chimique après leur administration
dans un organisme. Cette stabilité doit être garanti jusqu’à ce que ces nanovecteurs atteignent leur cible. Par la
suite, une dégradation éventuelle de la silice est souhaitée pour l’élimination rapide de ces systèmes de
l’organisme. La dégradation de la silice peut se faire par hydrolyse (dissolution en milieu aqueux).
La dissolution de la silice amorphe en milieu aqueux dépend fortement de nombreux facteurs dont : le pH, la
température, le degré de condensation du matériau, la mésostructure poreuse, la surface spécifique, la porosité
38
et les groupements de surface. Durant le processus de dissolution, la silice sera dépolymérisée par des
procédés d'hydratation, d'hydrolyse, et d'échanges ioniques.86, 209 Plusieurs études montrent qu’une dissolution
de la silice peut avoir lieu dans le fluide corporel et le fluide gastrique. Ces études se basent sur le dosage du
silicium présent dans des milieux simulés riches en sels, à pH = 7 - 7,4 et pH = 1,1 – 1,3 pour le fluide corporel
simulé et le fluide gastrique simulé, respectivement.86, 103, 210, 211 Par exemple, les MSNs de type MCM-41 et de
taille moyenne de 130 nm ont été complètement dégradées in vitro en deux semaines dans les conditions
pseudo-physiologiques (pH = 7).210 Cette dégradation se fait en 3 étapes (Figure 1.19) et dépend de la surface
spécifique, de la porosité, et de la concentration des MSNs. De leur côté, le groupe de recherche d’Etienne et
al. rapporte que la vitesse de dissolution de la silice fonctionnalisée avec des amines est nettement plus élevée
que celle de la silice pure (non-fonctionnalisée).212 La dégradation des MSNs a été aussi démontrée in vitro. Par
exemple, Zhai et ses collaborateurs ont observé que la dégradation des MSNs peut avoir lieu dans le cytoplasme
et dans les lysosomes.213
Figure 1.19. Représentation schématique des 3 étapes de la dégradation des MCM-41 (a : dégradation initiale
rapide, b : formation d’une couche Ca/Mg-silicate, c : dégradation contrôlée). 210
La stabilité des MSNs à l’hydrolyse a un impact sur les profils de relargage des médicaments. La dissolution de
la silice contribue à la libération des médicaments dans les milieux physiologiques et pseudo-physiologiques en
augmentant les quantités de médicaments libérés et leur vitesse de relargage. 197, 214
1.6 Techniques de caractérisation :

1.6.1 Diffraction des rayons X (DRX)
La diffraction des rayons X est une technique de base pour la caractérisation des matériaux solides. Elle permet
de détecter les phases cristallines et les périodicités du réseau présentes dans un échantillon. L’analyse DRX
est basée sur l’interaction de radiation monochromatique (rayons X) avec une disposition périodique d’atomes,
de molécules, d’ions, etc. Plus précisément, ces rayons X interagissent avec des plans d’atomes dans un réseau
3-D qui reflètent la symétrie de la structure par translation. Ces plans sont décrits par les indices de Miller (hkl)
39
qui leurs donnent une orientation dans l’espace. Lorsque le faisceau de rayons X frappe une périodicité donnée
(e.g. un plan (hkl)), il sera diffractée si la loi de Bragg est satisfaite (Équation 1.2). Les réflexions résultantes des
intensités diffractées par les plans (hkl) seront observées sous forme de pics caractéristiques dans le
diffractogramme.
n = 2𝑑 sin 𝜃 (Équation 1.2)
où n : l'ordre de diffraction; λ : la longueur d’onde de la source des rayons X; d : la distance réticulaire

interplanaire et θ : l’angle de diffraction mesuré (l’angle d’incidence des rayons X).
Chaque type de matériau ordonné possède un diffractogramme spécifique. La position et l’intensité des pics
sont fixes et sont caractéristiques de ce matériau. Pour les matériaux de mésostructures poreuses ordonnées,
la périodicité résulte de l’organisation et de l’architecture des pores. Le diffractogramme des silices
mésoporeuses se caractérise par la présence des pics de diffraction à bas angles, typiquement entre 2θ = 0,5°
– 10°. L’occurrence de ces pics n’est pas due à la présence d’une organisation périodique régulière des atomes,
mais plutôt à une périodicité résultante d’un arrangement spécifique des mésopores (cubique, hexagonale,
lamellaire…). Ainsi, dans ce travail, on a eu recours à la caractérisation des matériaux développés par DRX
pour confirmer l’organisation et l’ordre des mésostructures poreuses ; à titre d’exemple : l’arrangement des
mésopores sous forme cubique 3D, dans le cas des MSNs de type MCM-48. La Figure 1.20 montre un
diffractogramme typique de silice mésoporeuse de type MCM-48 avec les différentes réflexions (hkl) d’une
mésostructure cubique Ia3d.
Figure 1.20. Diffractogramme de silice de type MCM-48 montrant des réflexions (hkl) d’une mésostructure
cubique Ia3d.215
40
1.6.2 Physisorption d’azote
La physisorption d’azote est généralement utilisée pour la caractérisation des matériaux poreux et permet
d’analyser d’une manière qualitative et quantitative leurs propriétés texturales, à savoir : la surface spécifique,
le volume poreux, la distribution de la taille des pores et la taille moyenne des pores. C’est une méthode
d’adsorption/désorption physique de gaz (l’azote) sur un solide selon des interactions de faibles énergies (par
exemple : forces van-der Waals et répulsions intermoléculaires). Cette technique consiste à mesurer la quantité
d’azote adsorbée en fonction de la pression relative P/P0 et ce à une température constante (température de
liquéfaction d’azote = 77 K) ; P0 correspond à la pression de saturation du gaz. Le graphique résultant s’intitule
« isotherme de physisorption d’azote ».
L’allure générale des isothermes de physisorption permet dans en premier de déterminer qualitativement les
propriétés texturales du composé étudié. Les différentes isothermes sont classées en types distincts (Figure
1.21). La forme de l'isotherme donne des informations directes sur les interactions solide-gaz (adsorbant-
adsorbat), l'adsorption couche par couche (monocouche-multicouche), le remplissage et la vidange des pores,
ainsi que sur la structure poreuse (taille et forme). Les isothermes de type IV sont caractéristiques des matériaux
mésoporeux (Figure 1.21).
Figure 1.21. Classification selon l’IUPAC des isothermes de physisorption.49
41
L’isotherme de type IV (IV-a et IV-b)se caractérise par une augmentation rapide de la quantité d'azote adsorbée
pour des pressions relatives très faibles, correspondant à l’adsorption d’une monocouche (i). Pour des pressions
relatives plus élevées, l'augmentation progressive du volume adsorbé correspond, quant à elle, à une adsorption
de type multimoléculaire (adsorption multicouche, j). À partir d'une certaine pression, l'augmentation plus rapide
du volume adsorbé traduit un phénomène de condensation capillaire à l'intérieur des mésopores (k), suivi par
un palier de saturation (l). La condensation capillaire peut être accompagnée par une hystérésis qui apparait
lors de la désorption du gaz (Type IV-a, Figure 1.21). Cette hystérésis est due au fait que les réactions
d’adsorption/désorption au niveau des capillarités ne se produisent pas d’une manière réversible et se
produisent uniquement lorsque la taille des pores dépasse une certaine largeur critique (pour des pores plus
larges que ~ 4 nm). Pour des matériaux ayant des mésopores plus petits, des isothermes de type IV-b sont
observés ; dans ce cas, les phénomènes d’adsorption et de désorption sont totalement réversibles. 49
L'exploitation de ces isothermes à l'aide d'algorithmes mathématiques standardisés, permet de quantifier les
paramètres texturaux : la surface spécifique (par l’application de l’équation de BET, "Brunauer Emmett Teller "),
le volume poreux, la distribution de la taille des pores, et la taille moyenne des pores (par application du modèle
NLDFT, "Non Linear Density Functional Theory").
Dans ce travail, la physisorption d’azote a été utilisée pour caractériser et comparer, qualitativement et
quantitativement, les propriétés texturales des MSNs pures et fonctionnalisées.
1.6.3 Microscopie électronique à transmission (MET)

La microscopie électronique à transmission permet d’obtenir directement et à l’échelle nanométrique des
informations structurales sur les matériaux à l’étude.
Le fonctionnement du microscope est basé sur l’émission d’électrons et la détection de signaux provenant de
l’interaction de ces électrons avec l’échantillon. Brièvement, un faisceau d’électrons de très courtes longueurs
d’onde est focalisé par des lentilles électromagnétiques sur un échantillon ultra-mince (épaisseur entre 20 – 200
nm). Ces électrons interagissent avec l'échantillon et plusieurs signaux peuvent résulter de cette interaction.
Ces derniers sont résumés dans la Figure 1.22.
42
Figure 1.22. Les principaux types de signaux résultants de l'interaction électron-matière.216
L’interaction électron-matière dépend fortement de la morphologie, de la cristallographie, de la composition

chimique, et de la densité de l'échantillon. La variation de ces facteurs mène à la variation du contraste observée
sur l’image MET. La MET exploite les électrons qui passent à travers l’échantillon (les électrons transmis et ceux
diffusés, en mode champ clair et en mode champ sombre respectivement). Les images sont enfin enregistrées
à l'aide d'une caméra CCD ("charge coupled device").
La MET peut être couplée à une spectroscopie par dispersion en énergie des rayons X (EDX). En effet, les
rayons X émis de la surface d’un échantillon en MET (Figure 1.22) sont caractéristiques des éléments chimiques
présents dans l’échantillon et peuvent donc être utilisés pour une analyse élémentaire en EDX.
L’intérêt de la MET dans cette thèse est de fournir les informations concernant la morphologie, la distribution
des tailles et la taille moyenne des MSNs synthétisées, avant et après leur fonctionnalisation. En outre, l’intérêt
de l’analyse EDX couplée à la MET dans le premier article est de permettre de cartographier la distribution du
gadolinium dans la MSNs et d’évaluer l’efficacité du greffage préférentiel de la surface externe des
nanoparticules.
1.6.4 Diffusion de la lumière en mode dynamique (DLS)

La DLS est une technique de caractérisation très utilisée pour identifier le rayon hydrodynamique des particules
sphériques en suspension. Elle est adaptée pour les particules de taille comprise entre 0,3 nm et 10 μm. La DLS
mesure le diamètre hydrodynamique des particules. Cette dernière est égale à la somme des tailles réelles des
particules et celles de la sphère d’hydratation se formant autour de la particule lorsqu’en suspension.
43
Cette technique est basée sur la détection de la mobilité des particules en suspension due au mouvement
Brownien. La vitesse du mouvement est définie par un coefficient de diffusion (𝐷) qui est relié au diamètre
hydrodynamique (𝐷 ) des particules par l'équation de Stokes-Einstein (Équation 1.3) :
𝐷= (Équation 1.3)

Où,  : la viscosité du solvant, 𝑇 : la température et 𝑘 : la constante de Boltzmann.
Brièvement, l’échantillon est éclairé par un laser monochromatique et la lumière diffusée est mesurée à l’aide
d’un détecteur placé à 173° par rapport au faisceau incident. L’intensité de la lumière diffusée par une particule
en mouvement fluctue dans le temps. Cette fluctuation de l’intensité est liée à la taille de celles-ci, puisque le
mouvement brownien de petites particules est plus rapide que celui des plus grosses. Le coefficient de diffusion
est ainsi déterminé en analysant la fluctuation de la lumière diffusée en fonction du temps. En analysant
l'intensité du signal par un traitement numérique, un corrélogramme est obtenu. Ce dernier est par la suite
converti en une distribution de taille par le biais de plusieurs algorithmes.
Le recours à la caractérisation par DLS a pour but de mesurer le diamètre hydrodynamique des nanoparticules
mises en suspension dans différents milieux et d’évaluer la stabilité colloïdale des suspensions en analysant la
stabilité du diamètre hydrodynamique en fonction du temps.
1.6.5 Potentiel zêta

Le potentiel zêta correspond à la mesure de la charge électrostatique de la surface des nanoparticules. Plus
précisément, il représente la charge électrique induite par la présence d’ions à la surface d’une particule en
solution. Son amplitude varie donc fortement avec le pH et donne une indication de la stabilité colloïdale des
particules en suspension. Le potentiel zêta de ces particules (ξ) est calculé à partir de la mobilité
électrophorétique (𝑈 ) des particules en utilisant l'équation d'Henry (Équation 1.4) :
ℰ ( )
𝑈 = (Équation 1.4)

Où,  : la viscosité du solvant, f(Ka) : la fonction d’Henry qui est égale à 1.5 et ℰ : la constante diélectrique.
La mobilité électrophorétique est déterminée en mesurant la vitesse de déplacement des particules suite à une
électrophorèse (l’application d’un champ électrique). Suivant le même principe de la DLS, cette vitesse est
obtenue par analyse de la fluctuation de la lumière diffusée par les particules en mouvement.
44
Dans cette étude, la mesure du potentiel zêta a été utile pour comparer la différence du potentiel des
nanoparticules après fonctionnalisation et pour confirmer d’avantage la stabilité colloïdale des nanoparticules à
différents pH, notamment les pH des milieux physiologiques.
1.6.6 Analyse thermogravimétrique (ATG)

L’analyse thermogravimétrique consiste à mesurer la variation de masse (une perte de masse dans la plupart
des cas) d'un échantillon en fonction de la température, selon une vitesse de chauffage donnée. Le tracé de la
vitesse de perte de masse (%/min, normalisés par rapport à la masse du produit) en fonction de la température
(°C) permet d’observer clairement les phénomènes thermiques (par exemple la dégradation de la matière
organique). Ce tracé permet, entre autres choses, de quantifier la perte de masse, de déterminer le degré de
solvation/hydratation de l’échantillon, et d’identifier la température de décomposition.
Dans le cadre de ce travail, cette technique avait pour but de mettre en évidence la présence d’un groupement
organique, après la fonctionnalisation des MSNs, et la quantification des espèces greffées à la surface et/ou
piégées dans les pores des MSNs.
1.6.7 Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)

La RMN est une technique de spectroscopie incontournable pour étudier l’environnement chimique local des
noyaux atomiques ayant un spin nucléaire non nul. Lorsqu’un noyau est soumis à un champ d’induction
magnétique 𝐵 ⃗, le moment magnétique de son spin nucléaire s’aligne avec le champ 𝐵 ⃗ (axe z). Les moments
magnétiques s’alignent parallèlement et antiparallèlement au champ magnétique, avec un léger excès de ceux
alignés parallèlement puisque cette configuration est la plus stable. Ceci crée un vecteur d'aimantation
macroscopique 𝑀⃗ parallèle à 𝐵 ⃗. Ce vecteur est irradié par la suite par une impulsion de radiofréquence bien
précise (fréquence de résonance spécifique à chaque noyau) qui génère un champ magnétique intermédiaire
𝐵 ⃗ perpendiculaire à 𝐵 ⃗. Ce processus permet donc de communiquer de l’énergie aux spins (absorption
d’énergie et excitation = résonance) et de basculer le vecteur d’aimantation dans le plan (xy). Lorsque l'impulsion
de radiofréquence est arrêtée, il y a une relaxation et un retour des spins à la position d’équilibre initiale ; le
vecteur d'aimantation se réaligne alors le long de l'axe du champ magnétique 𝐵 ⃗. Ce phénomène s’accompagne
par une émission d’un rayonnement électromagnétique qui représente le signal observé en RMN. Le temps de
cette relaxation varie en fonction de l’environnement chimique du noyau et le signal détecté dépendra de ce
temps de relaxation. À un champ magnétique fixe appliqué, la variation de la fréquence de résonance d’un
atome donné avec la structure et l’environnement chimique est appelée déplacement chimique (en ppm : partie
par million). Les déplacements chimiques sont mesurés par rapport à une fréquence de résonance d’un produit
de référence.
45
Dans les milieux anisotropes (ex. les solides), la mobilité des noyaux est très faible et les temps de relaxation
sont parfois extrêmement longs. Par conséquent, des longs temps d’acquisition sont requis. De plus, des pics
assez larges sont souvent obtenus dû à l’anisotropie des interactions dont l’interaction dipôle-dipôle. Ces
contraintes sont réduites en ayant recours à la rotation à l’angle magique (MAS, Magic Spinning Angle) et au
transfert de polarisation (CP, Cross Polarisation) d’un noyau de forte abondance à un second noyau. La rotation
à l’angle magique consiste à faire tourner l’échantillon à 54.7° à une très grande vitesse (> 2 kHz). Le transfert
de polarisation (de 1H à 13C par exemple) permet d’augmenter l’intensité des signaux. Donc, pour pouvoir réaliser
un nombre suffisant d’accumulations en un laps de temps assez court et aussi pour avoir un rapport signal/bruit
assez élevé, il faut recourir à la technique CP-MAS.
Dans ce travail, la caractérisation par RMN du 29Si, 13C, 31P et 19F, visait à confirmer la réussite d’une étape de
fonctionnalisation de la surface des MSNs et/ou de piégeage de médicaments en mettant en évidence la
présence des groupements fonctionnels correspondants (détection de leur empreintes spectroscopiques).
1.6.8 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

La spectroscopie FTIR est une méthode analytique qualitative et quantitative fournissant des informations sur
les détails structuraux des molécules et des matériaux. Elle se base sur l'interaction entre les rayonnements
infrarouges (IR) et les mouvements internes des molécules. Les longueurs d'onde en IR sont proches de
l'énergie de vibration des molécules. Donc, en présence d’un faisceau IR, les liaisons interatomiques, ayant un
moment dipolaire non nul absorbent de la radiation et entrent en vibration à des longueurs d'onde propres à la
nature du groupement. Ces vibrations peuvent être des déformations (rotation, cisaillement et torsion) et/ou des
vibrations de valence ou d’élongation. La longueur d'onde d'absorption dépend surtout de la nature de la liaison
chimique, mais aussi de l'environnement dans lequel elle se trouve. Le spectromètre IR mesure l’intensité de
l’absorption du rayonnement infrarouge en fonction des longueurs d’onde associées et un spectre IR est ainsi
obtenu. L’analyse IR peut se faire en différents modes. L’IR en mode ATR (Attenuated Total Reflectance) fait
usage d’un cristal en contact avec l’échantillon assurant une réflexion totale interne. C’est une technique très
pratique et très facile à utiliser pour l’obtention de spectres de qualité avec des échantillons d’épaisseurs très
réduites.
Pour la présente étude, la FTIR nous renseigne sur la présence des molécules ancrées à la surface et/ou dans
les pores des MSNs et sur la nature de leur interaction avec la charpente silicique.
1.6.9 Spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X (XPS)

La XPS est une technique d’analyse des éléments chimiques de la surface des matériaux. Cette analyse se fait
sur les 5 – 10 premiers nanomètres de la surface d’un échantillon. Une analyse en "survol" permet de déterminer
46
semi-quantitativement la composition atomique d'une surface ; tous les atomes ayant un numéro atomique Z ≥
3 peuvent être détectés. En outre, une analyse en "haute résolution" permet de déduire des informations sur
l’état électronique de ces éléments ainsi que sur leur état chimique (état de liaison avec les autres éléments au
voisinage).
La XPS est basée sur un effet photo-électronique. Brièvement, des photons-X sont envoyés sur l’échantillon à
analyser, provoquant l’ionisation des atomes par effet photoélectrique. Si l’énergie du photon est supérieure à
l’énergie de liaison des électrons de cœur de l’atome, un « photoélectron » sera éjecté avec une énergie
cinétique déterminée. Cette dernière sera mesurée et servira à déduire l’énergie de liaison caractéristique de
celui-ci dans l’atome. L'énergie de liaison dépend de l'élément et de son environnement chimique.
Dans ce travail, la XPS était particulièrement intéressante pour nous renseigner sur les groupements greffés
spécifiquement à la surface externe des MSNs en déterminant la composition élémentaire et l’environnement
chimique des atomes présents à la surface externe des MSNs.
1.6.10 Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis)

La spectroscopie UV-Vis est une technique d’analyse quantitative. Elle est basée sur la capacité des molécules
à absorber des rayonnements en UV-Vis. Brièvement, lorsqu’un échantillon est soumis à un rayonnement de
longueurs d'onde dans l’UV-Vis, certains groupements d’atomes de cet échantillon peuvent absorber ces
radiations et subir par la suite une (ou plusieurs) transition(s) électronique(s). Un spectre de l’absorbance
résultante en fonction de la longueur d’onde est donc obtenu. Le dosage quantitatif des analytes se fait grâce à
la loi de Beer-Lambert (qui montre une relation de proportionnalité entre l'absorbance et la concentration) et en
comparant l'absorbance de l’analyte à une courbe d'étalonnage.
Dans le cadre des travaux présentés dans cette thèse, la caractérisation UV-Vis a été utilisée pour la
quantification de la libération des médicaments piégés dans les pores des MSNs, des anticorps greffés à la
surface, et de la viabilité cellulaires des nanoparticules.
1.6.11 Spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS)

L’ICP-MS est une technique analytique quantitative utilisée pour déterminer la concentration d’analytes
inorganiques en solution à de très faibles concentrations (ppb, ng par litre). Un plasma inductif (argon gazeux
ionisé, en général) va atomiser puis ioniser les analytes présents dans un échantillon. Les ions résultants sont
ensuite focalisés et conduits à un spectromètre de masse qui va les isoler selon leur rapport m/z; "m" étant la
masse du noyau et "z" la charge que celui-ci porte. L’analyse quantitative se fait en se basant sur la
proportionnalité de l’intensité de la radiation et la concentration de l’élément, et ce au moment de la calibration
de l’appareil et au cours de l’analyse.
47
Dans le cadre de cette étude, l’analyse par ICP-MS nous as été utile pour doser la teneur en silicium (Si) et en
gadolinium (Gd) des suspensions de MSNs fonctionnalisées.
1.6.12 Microscopie optique à fluorescence

La microscopie optique à fluorescence permet d’observer des molécules fluorescentes à l’aide d’un microscope.
Ce type de microscope est équipé de filtres d’excitation et d’émission ainsi que de miroirs dichroïques, ce qui
permet de visualiser la fluorescence émise par ces éléments. Les filtres d'excitation permettent de sélectionner
les longueurs d'ondes excitatrices de l'échantillon. Les filtres d'émission, quant à eux, permettent d’éliminer les
longueurs d'ondes parasites susceptibles de brouiller le signal. En son principe, l’échantillon est excité par une
longueur d’onde spécifique ; la lumière émise est par la suite captée par l’objectif, filtrée par les filtres d’émission
puis observée. Les capteurs sont généralement de type CCD et les images obtenues sont donc en noir et blanc.
La coloration de ces images se fait à postériori pour faciliter la visualisation, surtout si l’échantillon présente
différents marqueurs.
Dans ce travail, la microscopie optique à fluorescence a permis d’évaluer l’internalisation cellulaire des
nanoparticules développées après leur fonctionnalisation avec un fluorophore et le relargage de la doxorubicine
(molécule anticancéreuse fluorescente).
1.6.13 IRM et relaxométrie

L’IRM est une technique basée sur les phénomènes de la résonance magnétique nucléaire (RMN) des noyaux
atomiques. Comme expliqué avec plus de détails dans le paragraphe 1.6.7, en présence d’un champ
magnétique externe, les spins nucléaires s’orientent dans une direction parallèle ou antiparallèle au champ
magnétique 𝐵 ⃗ et le long de l’axe z. Un faible excès de spins s’oriente dans la même direction que 𝐵 ⃗
(orientation parallèle), ce qui engendre un vecteur d’aimantation macroscopique 𝑀⃗ qui est responsable du
signal en IRM. Ce vecteur d’aimantation sera basculé périodiquement dans le plan (xy) à l’aide d’une impulsion
radiofréquence, produisant la mise en phase des noyaux atomiques. L’angle de bascule est généralement de
90° et de 180°. Une magnétisation transverse maximale est obtenue en appliquant un angle de 90° (la valeur
de la composante 𝑀 ⃗ est maximale). Lorsque l’application de cette radiofréquence cesse, le vecteur
d’aimantation revient à sa position initiale. Il y aura alors relaxation et retour à l’état d’équilibre. Ce phénomène
est accompagné par l’émission d’un rayonnement électromagnétique détectable en IRM (qui donne lieu au
signal en IRM). Cette relaxation et/ou ce retour à l’état d’équilibre est caractérisé par une relaxation longitudinale
(le long de l’axe z) et une relaxation transverse (dans le plan xy) qui sont décrites par une courbe exponentielle
croissante (recouvrement de 𝑀⃗, Figure 1.23-a) et une courbe exponentielle décroissante (perte de 𝑀 ⃗, Figure
48
1.23-b.), respectivement. En conséquence, deux temps de relaxation sont définis : le temps de relaxation
longitudinale (T1) et le temps de relaxation transverse (T2).
Figure 1.23. Courbes de relaxation longitudinale (T1) et transverse (T2), avec 𝑀 ⃗ comme valeur initiale du
vecteur d’aimantation.126
Dans le cas du T1, il s’agit du temps nécessaire pour que 63% de la composante en z du vecteur d’aimantation
soit récupérée. Cette récupération est possible par un transfert d’énergie vers le milieu, et on parle d’une
relaxation/interaction spin-réseau. Dans le cas du T2, il s’agit plutôt du temps nécessaire pour que la valeur de
la composante transverse soit égale à 37 % de sa valeur initiale. Cette relaxation est due au déphasage
progressif des spins (interactions spin-spin entre les noyaux atomiques).
La mesure des T1 et T2 se fait à l’aide d’un appareil RMN classique ou d’un relaxomètre. Dans le cadre de ce
travail, les T1 et T2 des protons sont mesurés avec un relaxomètre (Bruker minispec 60) et ceux du fluor avec
un appareil RMN liquide (Bruker 500 MHz).
Le signal IRM (S) dépend de la densité locale (ρ) des noyaux atomiques et aussi de leur temps de relaxation
longitudinale (T1) et transverse (T2), comme le montre l’équation du signal ci-dessous (Équation 1.5 valide pour
une séquence écho de spin).
∗
𝑆 ∝𝜌 1−𝑒 1 𝑒 2 (Équation 1.5)
TR et TE sont des paramètres d’acquisition sélectionnés par l’opérateur pour accentuer les effets de contraste
et correspondent aux temps de répétition et d’écho, respectivement. En fait, au cours de l’acquisition d’une
image IRM, plusieurs séquences peuvent être appliquées. Une séquence consiste en une suite d'impulsions de
radiofréquence avec des paramètres TR et TE définis. La séquence écho de spin est fréquemment utilisée lors
d’une analyse IRM et aussi lors de la caractérisation d’un agent de contraste T1 en IRM, et permet d’obtenir des
49
images en contraste positif (pondération T1). Elle consiste à une série d’impulsion de radiofréquence à 90° et à
180° appliquée après le temps . Les impulsions sont ensuite répétées avec un temps d’écart, qui
correspond au temps de répétition (TR). Finalement la reconstruction des images se fait par la codification
spatiale des signaux émis par le sujet, en utilisant une procédure d’application de gradients séquentiels. Plus
précisément, en appliquant trois gradients de champ magnétique (gradients de tranche, de fréquence et de
phase) et en traitant des données par la transformée de Fourier, on peut localiser précisément l’endroit d’où
proviennent les signaux. Finalement, en déterminant l’intensité du signal voxel par voxel, oil est donc possible
de reconstruire les images.
1.6.14 L’algorithme Voronoi tesselation_EBImage R package :

Il s’agit d’un algorithme mathématique de découpage d'un plan en fonction de zone d'influence à partir d'un
point. Dans ce travail, le point est la zone du noyau. Donc, à partir des noyaux, on peut séparer le plan en
cellules qui représente l'espace le plus proche du point. Il est important de soustraire les endroits où il n'y a pas
de cellules et de tenir comptes des particularités de certaines cellules comme un aspect 3D (cellules plus
épaisses près du noyau).
50
Dans la suite de ce manuscrit, les articles seront présentés. Le deuxième chapitre de cette thèse présente donc
le premier article intitulé "Mesoporous Silica Nanoparticles: Selective Surface Functionalization for Optimal
Relaxometric and Drug Loading Performances". Dans ce travail, le PEG et le DTPA-Gd ont été greffées à la
surface externe des MSNs selon une procédure de post-greffage simple et efficace, et ce afin de conserver la
porosité des MSNs et de développer des MSNs multifonctionnelles à la fois pour l’imagerie médicale et la
vectorisation des médicaments. Ensuite, le troisième chapitre présente le deuxième article intitulé "Size-
Controlled Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles for Tunable Drug Release and Enhanced Anti-
Tumoral Activity". Comme mentionné dans le premier chapitre de cette thèse, plusieurs paramètres des MSNs
peuvent avoir une influence sur l’efficacité de ces nanoparticules en tant que nanovecteurs de médicaments.
Dans ce travail, nous avons concentré nos efforts sur l’étude de l’influence de la taille et de la chimie de surface
des MSNs sur le contrôle de la libération de médicaments et des performances thérapeutiques anticancéreuses,
in vitro et in vivo. Puis, le quatrième chapitre présente le troisième article publié dans la revue "Journal of
Materials Chemistry B" et ayant comme titre "Antibody-Conjugated Mesoporous Silica Nanoparticles for Brain
Microvessel Endothelial Cells Targeting". Dans cette partie, nous avons étudiée l’influence de la taille des MSNs
et du greffage du Ri7 sur l’internalisation dans les CEMC, à la fois in vitro et in vivo en ayant recours à l’IRM et
la microscopie en fluorescence. Enfin, le sixième chapitre présente le quatrième article intitulé "Fluorinated
mesoporous silica nanoparticles for binuclear probes in 1H and 19F MRI" et publié dans la revue "Langmuir".
Dans cette étude, des MSNs ont été fonctionnalisées avec des chelates de gadolinium et des composés fluorés
(des molécules de fluorosilane ou des macromolécules de polyfluorosiloxane); et leurs performances
relaxométriques 1H et 19F ont été mesurées.
51
Chapitre 2 – Article 1 : Mesoporous Silica
Nanoparticles: Selective Surface Functionalization
for Optimal Relaxometric and Drug Loading
Performances
Meryem Bouchouchaa,b,c,d, René C.-Gaudreaulte,f, Marc-André Fortinb,c,d,* and Freddy Kleitza,b,*
a Department of Chemistry Université Laval, Québec QC, G1V 0A6, Canada
b Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA) Université Laval, Québec QC, G1V 0A6, Canada
c Centre de recherche du Centre hospitalier universitaire de Québec (CR-CHUQ), axe Médecine Régénératrice,
QC Québec, G1L 3L5, Canada
d Department of Mining, Metallurgy and Materials Engineering Université Laval, Québec QC, G1V 0A6, Canada
e Centre de recherche du Centre hospitalier universitaire de Québec (CR-CHUQ), axe Cancer, Québec QC, G1L
3L5, Canada
f Department of Molecular Medicine, Université Laval, Québec, QC G1V 0A6, Canada
* Corresponding authors
Received: February 14, 2014
Revised: April 3, 2014
Published online: July 28, 2014
Times cited: 22 (until May 2017)
52
Résumé
Les nanoparticules de silice mésoporeuses sont considérées comme étant des biomatériaux très prometteurs
pour la vectorisation des médicaments et le suivi cellulaire, pour lequel l'IRM est la modalité d'imagerie médicale
par excellence. Dans cette étude, des agents de contraste d’IRM (DTPA-Gd) et du polyéthylène glycol (PEG)
sont greffés sélectivement sur la surface des MSNs, afin d'obtenir des performances relaxométriques et de
piégeage de médicament optimales. En fait, le greffage du DTPA et du PEG par les procédures classiques ont
entraîné une obstruction significative des pores des MSNs, ce qui est préjudiciable à la capacité de vectorisation
des médicaments par ces nanoparticules. Ce blocage des pores induit généralement une diminution
spectaculaire de la surface spécifique et du volume poreux, limitant ainsi la capacité de chargement des
médicaments. Par conséquent, ces molécules doivent être sélectivement greffées à la surface externe des
MSNs. Dans cette étude, des MSNs, ayant une mésostructure cubique en 3D, ont été synthétisées et
fonctionnalisées par une procédure de greffage simple et efficace où le DTPA et le PEG sont sélectivement
greffés sur la surface externe des nanoparticules. Aucun blocage des pores n'a été observé et plus de 90% de
la surface spécifique, du volume poreux et du diamètre des pores ont été conservés. Les particules ainsi
obtenues sont colloïdalement stables dans le SBF (fluide corporel simulé) et dans les milieux de culture cellulaire
; elles ne sont pas cytotoxiques et elles ont une capacité de chargement de médicaments élevée. Suite à la
chelation du Gd, de fortes propriétés relaxométriques des nanoparticules ont été observées (r 2/r1 = 1.47, r1 =
23.97 mM−1 s−1), ce qui leur confère un potentiel remarquable d'amélioration du contraste positif. Les particules
développées pourraient servir comme des vecteurs de médicaments, comme nous l’avons démontré avec un
modèle d’agent anticancéreux : la daunorubicine. Les procédures de greffage sélectif de la surface externe,
décrites dans ce travail, représentent une avancée significative dans la conception de nanovecteurs de
médicaments à base de silice, contribuant au développement de nouveaux nanocomposés théranostiques.
53
Abstract
Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) have emerged as promising biomaterials for drug delivery and cell
tracking applications, for which MRI is the medical imaging modality of choice. In this contribution, MRI contrast
agents (DTPA-Gd) and polyethylene glycol (PEG) are grafted selectively at the surface of MSNs, in order to
achieve optimal relaxometric and drug loading performances. In fact, DTPA and PEG grafting procedures
reported until now, have resulted in significant pore obstruction, which is detrimental to the drug delivery function
of MSNs. This usually induces a dramatic decrease in surface area and pore volume, thus limiting drug loading
capacity. Therefore, these molecules must be selectively grafted at the outer surface of MSNs. In this study, 3D
pore network MSNs (MCM-48-type) are synthesized and functionalized with a straightforward and efficient
grafting procedure in which DTPA and PEG are selectively grafted at the outer surface of MSNs. No pore
blocking is observed, and more than 90% of surface area, pore volume and pore diameter are retained. The
thus-treated particles are colloidally stable in SBF and cell culture media, they are not cytotoxic and they have
high drug loading capacity. Upon labeling with Gd, the nanoparticle suspensions have strong relaxometric
properties (r2/r1 = 1.47, r1 = 23.97 mM−1 s−1), which confers a remarkable positive contrast enhancement potential
to the compound. The particles could serve as efficient drug carriers, as demonstrated with a model of
daunorubicin submitted to physiological conditions. The selective nanoparticle surface grafting procedures
described in the present article represent a significant advance in the design of high colloidal stability silica-
based vectors with high drug loading capacity, which could provide novel theranostic nanocompounds.
54
2.1 Introduction
Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) have emerged as promising materials for drug delivery. 4, 7, 8, 103, 167, 186,
217-220 The size, structure, and chemistry of these biocompatible materials can be precisely controlled. 4, 40 MSNs
have been explored as potential drug delivery systems for a variety of therapeutic agents 18, 19, 25, 27, 221-223 (e.g.,
anti-cancer molecules).30, 32, 33, 145, 200, 224-226 In the field of chemotherapy, MSNs have been proven to strongly
accumulate in tumors by passive targeting via the enhanced permeability and retention effect 32, 35, 227 or by active
targeting via grafting of specific cancer cell-targeting molecules.228 Furthermore, mesoporous silica and core-
shell silica-based nanoparticles are now entering clinical trials as therapeutic/diagnostic compounds. 16, 17, 229
Recently, research efforts on MSNs for drug delivery have focused on the development of theranostic
nanoparticles which combine simultaneous therapeutic and imaging capabilities. 45 Imaging the distribution of
drug delivery vectors (in blood and in organs) in the minutes following injection, would allow recording more
precise and more personalized pharmacokinetics and drug delivery data (i.e., overall biodistribution, organ
delivery effectiveness, targeting efficiency). Among imaging modalities, MRI enables whole-body imaging
without the use of ionizing radiation.127 This non-invasive diagnostic tool, which is based on the excitation of 1H
protons in hydrated tissues, is widely used in preclinical research as well as in clinical procedures (e.g., in
oncology).230, 231
Among all structural characteristics of MSNs that make them versatile as drug vectors, the most important are
their high surface area and high pore volume. These characteristics allow the uptake of large amounts of
therapeutic molecules. Nevertheless, in order to design optimal theranostic MSNs that bear a dual capacity as
drug delivery vehicles and imaging probes, these nanoparticles must achieve the following three (3) criteria: 1)
biocompatible (macro)molecules used to enhance colloidal stability and blood retention must be selectively
grafted on the external surface of the particles; 2) biomedical imaging functional groups must be efficiently
grafted at the surface of the pores, and 3) the grafting of all these molecules should not result in a drastic
decrease of the nanoparticle porosity, which is necessary to preserve the drug delivery functionality of the MSNs
nanocarriers.
Polyethylene glycol (PEG) grafted at the outer surface of MSNs, improves their colloidal stability under
physiological conditions, as well as bio- and hemocompatibility. It helps conditioning MSNs for intravenous
injections.102, 105, 108 PEGylation usually increases blood circulation half-life, and allows higher accumulation of
nanoparticles at tumor sites.105, 106, 227, 232, 233 However, almost invariably, the PEG grafting procedures that were
developed thus far have resulted in significant pore obstruction (surface area and pore volume loss between 32
and 70%), which is detrimental to the drug delivery function of MSNs.108, 211, 233-235 One important aspect of this
55
problem relates to the fact that PEG are mobile linear chains that can diffuse slowly into the mesopores and,
ultimately, fill the pore volume.
Imaging probes, which are grafted either at the outer surface or at the mesopore surface of MSNs, allow their
tracking in vivo. In particular, labeling MSNs with Gd-based MRI contrast agents, results in high-relaxivity
imaging probes that are easily tracked in the blood as well as in key organs such as liver and spleen, where they
are expected to accumulate.114, 133, 135, 236 Gd(III) chelates (e.g., DTPA, diethylenetriaminopentaacetic acid)
attached to the surface of nanoparticles, are used as “positive” contrast agents, i.e. their presence at certain
concentrations induces MR signal brightening.47 However, chelate grafting at the surface of MSNs further affects
their final pore volume, and represents another important factor leading to MSNs pore obstruction. For
conventional MSNs with an average pore diameter initially included between 2 – 4 nm, chelate grafting results
in pore diameter decrease in the order of 24 to 63%114, 117 with pore volume and surface area loss of 30 – 52%.114,
117, 134 Although several studies have reported Gd-labeled MSNs (e.g., Gd-chelates- MSNs), none of these have
demonstrated the possibility to label MSNs with MRI contrast agents, while preserving their drug-loading and
elution ability. Indeed, the best case reported featured the retention of only 56% of surface area and pore volume
after grafting of both DTPA-Gd and PEG.133 PEGylation and co-grafting of metal chelates inevitably affect the
availability of drug adsorption sites, and therefore the drug loading capacity of MSNs. This appears to be one of
the main factors limiting the development of MSNs for drug delivery applications. Thus, preserving the porosity
of the nanoparticles (e.g., surface area and pore volume) is of central interest in the current research on MSNs
for drug elution applications.
While PEGylation confers enhanced colloidal stability, and Gd-DTPA the MRI enhancement functionality, the
drug elution capacity of surface-grafted MSNs must also be demonstrated. In vivo, the drugs contained by MSNs
must be efficiently and selectively released at specific sites (a tumor, or a specific organ). For this purpose,
different controlled drug release strategies have been developed until now, based on various stimuli: pH, 33, 197,
198, 200, 204, 226, 237-240 enzyme actions,201, 241 redox reaction,242 photoirradiation,201, 243, 244 to mention a few. Among
these, pH-responsive mechanisms are particularly interesting and widely investigated. For instance, the pH of
extracellular fluid in tumor environment (pH 6.2) is more acidic than in healthy tissues (pH 7.4).245, 246 Moreover,
when MSNs are internalized within cells, they are most often entrapped in endosomes and lysosomes. The pH
of these cellular compartments (pH = 4.5 – 5.5) is lower than that of normal cells (pH ≈ 6). 247 Thus, this pH
transition could also be strategically exploite.248 Different mechanisms have been pro- posed to confer a pH-
delivery functionality to MSNs, based on the grafting of organic functional groups 33 into the MSNs pores, as well
as polymers,249 proteins197 and supramolecular molecules250 on their outer surface. Besides, an efficient pH-
responsive mechanism can simply be based on protonation/deprotonation of the silanol groups (–SiOH) located
56
at the surface of porous silica frameworks. This latter strategy was pursued here to enable the uptake and
release of daunorubicin.
In the present study, MSNs were designed as potential theranostic nanocarriers with the ability to provide: 1)
high drug loading capacity (the highest pore volume achieved thus far for PEG and Gd-chelate-grafted MSNs);
2) the most efficient MRI positive contrast enhancement potential reported thus far for mesoporous silica
nanoparticles; 3) high drug loading and controlled drug release in physiological media. In fact, the design of
optimal drug delivery vehicles is simply not possible if pores are filled-up with PEG, chelates, as well as other
surfactants. The present study is the first demonstration of the preservation of significant pore volumes after
grafting of PEG and Gd-chelates on MSNs. To achieve this goal, MCM-48-type MSNs were synthesized and co-
reacted with DTPA-silane and PEG-silane molecules. The optimal amount of these molecules, necessary to
cover only the outer surface of MSNs, was precisely determined. This specific strategy generates a truly selective
grafting of the outer surface without pore obstruction and porosity loss. After chelation with Gd 3+, the relaxometric
performance of these nanoparticles was measured and demonstrated in vitro with T1-weighted imaging MR
sequences. The colloidal stability and in vitro biocompatibility of these nanoparticles was also investigated.
Finally, the capacity of these functionalized nanoparticles to trap drug molecules and to control their release was
evaluated in PBS (pH 7.4) and in acetate buffer solution (pH 5 and 4).
2.2 Results and Discussion

2.2.1 Synthesis and Physicochemical Characterization
Pristine MCM-48-type mesoporous silica nanoparticles were synthesized according to a previously reported
procedure.78 Transmission electron microscopy (TEM) observations revealed well-defined spherical particles
with an average particle diameter of 150 nm (Figure 2.1-a-b). Low-angle XRD data showed typical peaks of
highly ordered 3-D cubic Ia3d mesopore structure (Figure S2.1-a, Supporting Information-section 2.5). MCM-
48 nanoparticles showed type IV N2 physisorption isotherms characteristic of uniform mesoporous channels
with narrow, cylindrical pores (Figure S2.1-b, Supporting Information-section 2.5). These nanoparticles showed
a high specific surface area (1654 m2.g−1; BET method), and a large total pore volume (0.82 cm3 g−1). The
mean pore diameter was estimated at 3 nm (NLDFT method, Figure S2.1-c, Supporting Information-section
2.5).
The grafting optimization of DTPA and PEG on MSNs was achieved in three steps (Figure 2.1-c). First (step
1), by carefully controlling DTPA grafting; then (step 2), by tuning the amount of PEG used for grafting. For
this, large PEG-silane molecules (20 kDa) were used. The hydrodynamic diameter of 20 kDa PEG is about
9 nm in PBS 10 mM pH 7.4,251 which is well above the diameter of the MSN pores (∼3 nm), in contrast to
the more usual PEG molecules of smaller molecular weight (2.6 nm diameter for 2 kD PEG). Therefore, such
57
large molecules (20 kDa) are not expected to crawl efficiently into the pores of the 150-nm diameter MSNs,
and will most likely remain at the exterior of the MSN structure. At high concentrations, a small but effective
fraction of PEG-silane could be attached on the apertures of the pores, thereby causing pore obstruction and
a subsequent loss of accessible total pore volume. For this reason, it is absolutely important to reach well-
balanced DTPA and PEG grafting conditions. Finally (step 3), DTPA and PEG were successfully used to
demonstrate the possibility of grafting preferentially at the outer surface of MSNs, both the metal chelates
and the biocompatible molecules providing steric hindrance to the MCM-48 system. The resulting
nanoparticles are designated by “MSN-xDTPA-yPEG”, where x corresponds to the percentage of grafted
DTPA-silane and y to the percentage of grafted PEG-silane. In particular, the optimization of DTPA grafting
(step 1 – Figure 2. 1-c) was carried out by adding different amounts of DTPA-silane (DTPA-silane:
DTPA+APTES). According to the thermogravimetric analysis (TGA) results, the percentage of grafted DTPA-
silane (w/w), was varied between 3 and 13% depending of the reaction conditions used (Figure S2.2-a,
Supporting Information-section 2.5). The resulting nanoparticles are designated by “MSN-xDTPA”. The PEG
grafting optimization (step 2 – Figure 2.1-c) was also carried out by adding different amounts of PEG-silane
(20 kDa). The percentage of grafted PEG-silane (w/w), estimated by TGA, ranged between 3.5 and 27%
(Figure S2.2-b, Supporting Information-section 2.5). The resulting nanoparticles are designated as “MSN-
yPEG”.
58
Figure 2.1. a) MCM-48 nanoparticles imaged by TEM; b) Schematic representation in the Ia3d 3-D cubic pore
network in the MCM-48 particles; c) Schematic representation of the three steps undertaken to optimize PEG
and DTPA grafting.
In order to unambiguously demonstrate the efficient grafting of Gd-DTPA and PEG, the new MSNs
derivatives were systematically characterized after each step using solid state NMR, FTIR, N2 physisorption and
XPS measurements. Figure 2.2 shows the 13C CP NMR data for MSN-xDTPA and MSN-yPEG. Characteristic
peaks for DTPA-silane and PEG-silane were revealed for all MSN-xDTPA and MSN-yPEG particles,
respectively. Indeed, the 13C CP MAS NMR spectrum of MSN-yPEG (Figure 2.2-a and Figure S2.3-a, Supporting
Information-section 2.5) showed a typical peak at 70 ppm, which was assigned to ethyl carbons O–(CH2CH2–
O)n.252 Resonances of the remaining ethoxy groups in the –Si–O–CH2CH3 groups appeared at 59 ppm and
15 ppm. All of the 13C CP/NMR spectra of the MSN-xDTPA samples (Figure 2.2-b and Figure S2.3-b,
59
Supporting Information-section 2.5) showed sharp resonances for all DTPA-silane-related carbon atoms
(peak attributions are displayed in Figure 2.2).
PEG-silane: i j
ii
k
DTPA-silane:
i; ii
2
9 5; 6; 7;
8; 9; 10
13 14 11 4 8
10 12 7 1
6 8
5 7 6
3
5
1; 2; 3; 4 1 11
12 14
13
b)
j k
a)
225 200 175 150 125 100 75 50 25 0
Chemical shift / ppm
Assignment δ [ppm]
C(1); C(2); C(3); C(4): C=O in COOH and CONH 172 - 176
C(5); C(6); C(7); C(8); C(9); C(10): CH2-N and CH2-O 58.3 – 54.9
C(11); C(12); C(13); C(14) 43.2; 23.9; 15.5; 11.2
Figure 2.2. 13C CP MAS NMR spectra of: a) MSN-xPEG and b) MSN-yDTPA; x = 10.5% and y = 9%; similar
peaks were found for the different combinations of DTPA and PEG concentrations investigated.
The presence of grafted DTPA-silane and PEG-silane molecules was further confirmed by FTIR spectroscopy.
The MSN-xDTPA spectra (Figure S2.4-a, Supporting Information-section 2.5) showed the asymmetrical C=O
vibration of –COOH at 1719 cm−1 and exhibited also a very weak band (as a shoulder) at 1670 cm−1,
characteristic of the amide band.253 The symmetrical C-H stretching vibrations of –CH2, as well as their
deformation vibration (δC-H) were visible at 2920 and 1389 cm−1, respectively. The presence of PEG-silane
in grafted MCM-48, was evidenced by symmetrical and asymmetrical C-H stretching vibration bands of –
CH2 in the 2800 and 2995 cm−1 frequency range. The δC-H vibrations and the bending vibrational modes
60
(scissoring) of the CH2 group were also noted at 1349, 1455 and 1472 cm−1, respectively (Figure S2.4-b,
Supporting Information-section 2.5). As expected,252 Si MAS NMR spectra of all the samples (MSN-xDTPA
and MSN-yPEG) depicted a broad multicomponent peak in the –88 to –120 ppm range, which is associated
with the Qn groups of the silica framework (Si(OSi)n(OH)4-n; n: [1–3]) (Figure S2.5, Supporting Information-
section 2.5). For samples with high percentages of grafted molecules (> 9% for DTPA-silane and > 10.5%
for PEG-silane), moderate intensity resonances were observed around [-57 – -67] ppm (Figure S2.5,
Supporting Information-section 2.5; j, k, m, n). These signals were attributed to Tn groups (C-Si(OSi)n(OH)3-
n) of the covalently grafted PEG-silane molecules. The grafting of PEG-silane and DTPA-silane on MCM-
48 was successful, as confirmed by NMR and IR.
MSN-yPEG with x ≤ 10.7% are mesoporous materials, as confirmed by their N2 physisorption Type IV
isotherms (Figure 2.3-a). These isotherms are similar to those observed for pristine MCM-48. On the other
hand, MSN-yPEG samples with x > 10.7% show isotherms belonging to type I category (that is,
microporous materials) (Figure 2.3-b), indicating a reduction in the pore size upon grafting with high
amounts of PEG-silane. The results suggest an excessive coverage of PEG chains at the entrance of the
mesopore channels, which might affect the diffusion of nitrogen inside the pores. Increasing concentrations
of PEG-silane used at the grafting step, resulted in higher PEG- related %C content as estimated from
XPS: from 4.5 to 6.2 to 9.6 %C for MSN-3.5%PEG, MSN-5%PEG and MSN-10.5%PEG, respectively (data
not shown). Because XPS is a surface analysis technique (analysis depth around 5 nm), this fact is in line
with the preferential accumulation of PEG at the exterior surface of MSNs when high concentrations of
PEG are used for the grafting. Therefore, the weight loss observed in TGA for high PEG-silane (10.7%) is
most likely attributed to PEG accumulated at the entrance of the mesopores, and attached at or close to
the outer surface of MSNs.
61
a) b)
0.12
MSN: MCM-48 MSN: MCM-48
MSN-3.5%PEG MSN-3.5%PEG
800 MSN-5%PEG MSN-5%PEG
0.10
Adsorbed volume / cm3 g-1
MSN-10.5%PEG MSN-10.5%PEG
MSN-17%PEG MSN-17%PEG
MSN-27%PEG
d(d) / cm3 Å-1 g-1

MSN-27%PEG
0.08
600
0.06
400
0.04
200
0.02
0 0.00
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 4 6 8
Relative pressure P/P0 Pore width / nm
Figure 2.3. N2 physisorption isotherms (a) and respective NLDFT pore size distributions (b) of MSN-xPEG
nanoparticles.
Porosity data obtained from the analysis of MSN-yPEG nanoparticles are reported in Table 2.1. For the
high percentages of grafted PEG-silane (> 10.7%), the values for surface areas and pore volumes
decreased considerably (from 1650 to [792–166] m2 g−1) while the pore sizes were reduced from 3 down
to 2 nm. However, in the case of small amounts of PEG-silane (≤ 5%), more than 84% of the surface area
and pore volume were conserved. In that case, pore sizes decreased slightly from 3 to 2.7 nm. It is
important here to note that the grafting of small percentages of high-molecular-weight PEG-silane (10 and
20 kDa) on MSNs is sufficient to minimize the phagocytosis of MSNs by the mononuclear phagocyte
system, as previously reported.108
The textural properties of MSN-xDTPA samples are summarized in Table 2.1. These data show that the
higher the percentage of grafted DTPA-silane, the lower are the surface area and pore volume.
Consequently, grafting of only small amounts of DTPA-silane or PEG-silane (≤ 5.7%), ensures the
conservation of at least 90% of the MSN surface area and pore volume. Furthermore, the mean pore
diameters of these nanoparticles are almost identical to that of the parent MCM-48 (Table 2.1 and Figure
S2.6, Supporting Information-section 2.5). Thus, the porosity data of MSN-xDTPA and MSN-yPEG indicate
that low percentages of PEG-silane and DTPA-silane (< 6%) ensure a selective grafting of the outer surface
62
of MSNs, preventing the deleterious occlusion of the pores that could impede drug loading. This result
could be explained by two phenomena: (1) first, adsorption sites are more readily accessible on the outer
surface of the nanoparticles; (2) diffusion of molecules into the pores is considered negligible owing to the
low concentration of both DTPA-silane and PEG-silane, as well as to the high molecular weight of PEG-
silane (20 kDa).
BET Surface Pore Volume NLDFT Mean Pore

Area [cm3 g-1] size [nm]
[m2 g-1]
MSN MCM-48 (pristine) 1654 0.82 3
MSN-3.5%PEG 1471 0.70 2.7
MSN-5%PEG 1448 0.68 2.7
MSN-xPEG MSN-10.5%PEG 1267 0.60 2.4
MSN-17%PEG 792 0.41 2.1
MSN-27%PEG 166 0.12 2.1
MSN-3%DTPA 1500 0.74 3
MSN-yDTPA MSN-9%DTPA 1393 0.68 3
MSN-5.7%DTPA 1603 0.74 3
MSN-13%DTPA 1083 0.52 2.9
MSN-DTPA- MSN-5.7%DTPA- 1530 0.74 3
PEG 3.2%PEG
Table 2.1. Physicochemical parameters of MSN-yPEG; MSN-xDTPA and MSN-xDTPA-yPEG nanoparticles

extracted from nitrogen physisorption measurements.
The next step consisted in the design of MSNs grafted with both molecules. This was carried out by
presenting 3.2% of PEG-silane to MSN-5.7%DTPA nanoparticles. As shown in Table 2.1, for this
preparation, more than 90% of the initial porous volume was conserved after functionalization. The final
nanoparticles (MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG) are characterized by high surface area (1530 m2 g−1) and high
pore volume (0.74 cm3 g−1). These values are similar to those measured for pure MSNs (MCM-48).
The present study demonstrates the key importance of grafting the smaller compounds (DTPA-silane), prior
to grafting long molecules (e.g. PEG-silane, 20 kDa). This sequence prevents the occurrence of a strong
competition between the two molecules, and ensures control and reproducibility to the procedure. Indeed, by
presenting DTPA-silane to a preparation of MSN-yPEG (y = 3.5 and 5%), we demonstrated the inhibition
of DTPA-silane grafting, most probably due to the presence of the large PEG molecules (20 kDa) crowding
the outer surface of nanoparticles. In fact, only 1.5% (w/w) of DTPA-silane could be grafted using this
63
reaction sequence (regardless of the initial amount of DTPA-silane added). Moreover, when presenting DTPA-
silane to MSNs after grafting of high molecular weight PEG-silane, DTPA-silane molecules seemed attached
into/at the entrance of the pores (Table S2.1, Supporting Information-section 2.5 ). In contrast, by reacting the
smaller molecules first (DTPA-silane), it became possible to take advantage of the few un-reacted silica
surface regions remaining available for the attachment of PEG-silane. Indeed, after the grafting of 5.7%
DTPA-silane, only 3.2% of PEG-silane were grafted at the outer surface without pore obstruction. This
relatively low percentage attributed to PEG-silane (20 kDa) is however sufficient and considered like an
optimal weight percentage to minimize non-specific protein adsorption at the surface of MSNs and PEG-
MSNs phagocytosis. In fact, it has been observed that, as low is the percentage of grafted high molecular
weight PEG-silane (20 kDa), as low the non-specific protein adsorption (human serum protein) and the
phagocytosis of MSNs by macrophages (with particle sizes of 150 nm).108 Thus, the experimental protocol
developed in the present study allowed for the first time the conservation of 92% of surface area, 90% of pore
volume and 100% of pore diameter of MCM-48 nanoparticles, after grafting of PEG and DTPA molecules.
This is a significant advance in the preparation of MSNs for drug delivery, since preservation of high pore
volume is needed to achieve high drug loads. The presence of both DTPA and PEG on the grafted MSNs
was demonstrated by NMR and FTIR: all peaks and bands characteristic of both DTPA-silane and PEG-
silane were clearly revealed in 13C CP NMR and FTIR spectra (MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG, Figure S2.7,
Supporting Information-section 2.5). In addition, the successful grafting of PEG-silane and DTPA-silane at the
outer surface was also confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis with emphasis on O
(1s), Si (2s), C (1s) and N (1s). Indeed, the XPS data (Table S2.2, Supporting Information-section 2.5) revealed
a significant increase in the carbon atomic percentage (%C) and carbon-to-silicon ratio (C/Si) from 6.2% and
0.235, for the MSN-5.7%DTPA sample, to 8.6% and 0.332 after PEG-silane grafting, respectively. Moreover,
the percentage of nitrogen (%N) only increased slightly (up to 0.8%) after DTPA-silane grafting. It remained
the same after PEG-silane grafting. Furthermore, a nitrogen-to-silicon ratio (N/Si) of about 0.03 was found
after DTPA-silane grafting. This corresponds perfectly to the theoretical N/Si molar ratio calculated from the
grafted percentage (w/w) of DTPA-silane. Because XPS detects the presence of elements in a maximum
depth of a few nanometers only, this exact same N/Si ratio is in line with the presence of DTPA-silane
molecules grafted at the outer surface of MSNs. To compare with the XPS data, the elemental ratios of
nanoparticles in which Gd3+ ions are complexed, were also measured by energy dispersive X-ray spectroscopy
(EDX, coupled on a HRTEM system). While XPS provides elemental ratios from the first nm depth in the
surface, EDX can here provide information from the entire volume of electron attenuation (this corresponds
more or less to the “bulk” volume of MSNs). By focusing the electron beam at the core of the particles, and
then at the outer boundary of MSNs, it was possible to perform a comparative elemental ratio study (Gd/Si).
With XPS, Gd/Si ratios of 0.03 were found, and these were almost exactly the same as those found with
64
EDX at the outer boundary of MSNs (0.034). However, indications of strong segregation were found when the
measurement was performed at the core of MSNs (“bulk” Gd/Si = 0.015). One has to keep in mind that
the electron beam reaching the core of MSNs, also crosses the outer surface twice, and therefore the EDX
spectrum is invariably contaminated by Si and Gd signals from the exterior of the particles. Nonetheless, the
much lower Gd/Si ratio found by focusing the electron beam at the core of MSNs, confirms the strong
segregation of Gd at the exterior of the silica particles compared to the composition of their core.
2.2.2 1H Relaxometric Properties

The relaxometric properties of Gd(III)-chelated MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG were measured in nanopure water,
using a dedicated NMR relaxometer (1.41 T). The relaxation rates (1/T1 and 1/T2) were then plotted in function
of the Gd3+ concentration values (measured by ICP-MS). As shown in Figure 2.4-a, the slope of relaxivity curves
(1/T1,2 = r1, 2 ([Gd3+] + C) provided the relaxivity values (r1, r2), which are used to normalize and compare the
performance of MRI contrast agents. Indeed, high r1 values indicate the potential of Gd-based paramagnetic
contrast agents to induce “signal brightening”. Because the relaxivities are calculated by normalizing the
relaxation rates to the concentration of Gd3+ ions in the compound, the performance of Gd(III)-chelated MSN-
5.7%DTPA-3.2%PEG can be directly compared to that of commercial contrast agents such as Gd-DTPA. In this
way, it is a very quantitative measurement of the “brightness” of the particles in T1-weighted MRI. Also,
paramagnetic “positive” contrast agents must present r2/r1 ratios as low as possible (e.g. 1.1 for Gd-DTPA), in
order to minimize the loss of phase coherence that result in the decrease of the transversal relaxation rates.[32]
This is the case for suspensions of MSNs that present a too strong concentration of Gd3+ ions. At 37 °C, the
following relaxivities were found for Gd(III)-chelated MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG: r 1 = 23.97 mM−1 s−1; r2 = 35.33
mM−1 s−1; r2/r1 = 1.47. Compared with the previously reported Gd-MSNs products, where no apparent attempt
was made to optimize the number of Gd3+ ions per MSNs, the Gd-loaded nanoparticles developed in this
work exhibit the lowest r2/r1 ratio reported thus far for all Gd- loaded MSNs materials.114, 115, 122, 132-134, 254 It
therefore bears the highest potential as a “positive” MRI contrast agent among MSN- based compounds. This
study also confirms the importance of a careful balance of Gd3+ ion load per nanoparticle to achieve high
relaxometric performances. The signal-enhancement performance of Gd(III)-chelated MSN-5.7%DTPA-
3.2%PEG nanoparticles was clearly demonstrated by scanning dilutions of this product in 1Tesla MRI
(Figure 2.4-b). In vitro T1-weighted MR images confirmed the possibility to achieve remarkable positive contrast
enhancement even at very low Gd concentrations. Precisely, a positive contrast enhancement of at least
105% could be achieved even at the following concentrations: [Gd] = 0.04 mM and [Si] = 1.26 mM, as
confirmed by ICP-MS. According to these data, 0.428 nmol nanoparticles per liter is a sufficient concentration
to reach a detectable contrast enhancement in 1 T MRI. Such an optimal performance is attributed to the
presence of Gd-DTPA moieties selectively grafted at the outer surface of the mesoporous silica particles
65
(EDX data, see section 2.2.1). This facilitates the exchange of water bound to the Gd3+ complexation site, with
water from the environment (matrix). Recently, Carniato et al.236 reported that water molecules have a limited
diffusion through the pores of MSNs. Therefore, for optimal relaxometric properties, anchoring Gd-chelates at
the outer surface of MSNs is an essential criteria, and the results of the present study are in line with this
theory. Also, the presence of Gd3+ ions sequestrated at the exterior surface of the particles, far from the
rotational axis of the particles, is expected to have a strong impact on the rotational correlation time of the
contrast agent. In fact, this is one of the main factors guiding their relaxometric performance.197 In general,
aqueous suspensions of large particles and low tumbling rates, produce higher longitudinal relaxivities. In
summary, strong interactions between water and the paramagnetic functions, as well as a selective grafting
of Gd at the outer surface of particles, is a sound strategy to optimize the relaxometric performance of the
contrast agent while minimizing the use of potentially toxic Gd3+ ions.
100
a) b)
80
y = 35.33x - 0.42
R2 = 0.999 0.012 0.08 0.30
60
1/T i / s -1
0.008 0.05 0.20

40
y = 23.97x + 0.37
0.000 0.04 0.16
20 R2 = 0.999
water 0.016 0.12

0
0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4
[Gd] / mM
Figure 2.4. a) Longitudinal (1/T1 + C, squares) and transverse (1/T2 + C, diamonds) relaxation rates of MSN-
5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles, in function of Gd3+ concentration values. b) T1-weighted MR images
of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles measured at clinical magnetic field strength (1 Tesla, TE/TR
= 10.7/1000 ms). Numerical values indicate the Gd concentrations (mM) measured by ICP-MS.
66
In addition, we have studied the stability of Gd3+ chelation and the potential release of Gd3+-DTPA from the
MSNs surfaces. For this, MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles were suspended in PBS pH 7.4 and in
acidic buffer (pH 5), using a dialysis membrane (1000 MW, Spectra/Por #6). Samples of the dialysate were taken
at time points, followed by ICP-MS analysis. The results, depicted in Figure S2.8 (Supporting Information-section
2.5) revealed that, very low amounts of free Gd3+, or Gd3+-DTPA were found in the dialysates after 24h (0.36–
0.42%) with respect to the initial Gd3+ concentration in the colloidal suspension. After 9 days (216 hours), the
release rate levelled-off to values in the range (1–2%), i.e. more than 98% of initial chelated Gd amount remained
attached to the MSNs. Such results indicate that chelated Gd3+ ions are strongly bound to the nanoparticles, and
therefore the contrast-enhancement effects detected in MRI would be directly attributed to the presence of
MSNs.
2.2.3 Colloidal Stability

Biomedical applications require the development of particles that form stable colloids in physiological conditions.
In fact, aggregation phenomena could harm the efficacy of such materials and be deleterious to the patients.103
Preserving the colloidal stability of the MSNs designed for drug delivery is a major issue in the field. For this,
the colloidal stability of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles was investigated and monitored by
dynamic light scattering (DLS). Hydrodynamic diameter measurements were carried out in aqueous
suspension as well as in simulated body fluid (SBF) and in culture medium (DMEM + serum). Hydrodynamic
diameter distributions are shown in Figure 2.5-a. Intensity-weighted data are represented to facilitate the
detection of any sign of aggregation or flocculation. MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles formed a
stable colloidal solution with a hydrodynamic diameter of ≈190 nm in water suspension and around 225 nm
and 229 nm in simulated body fluid and culture medium, respectively. No evidence of agglomeration or
flocculation was found and no significant increase in hydrodynamic diameter was reported at least up to 48
hours, confirming the excellent colloidal performance that these systems could have in physiological media.
In addition, zeta potential analysis revealed a strongly negative surface charge value ≤ –20 mV at pH ≥ 5
due to the presence of DTPA at the outer surface (Figure 2.5-b). This confirmed the adequate colloidal stability
of these nanoparticles in a large range of physiological pH conditions, making these particles suitable for in
vitro and in vivo biomedical applications.
67
a) b)
-5
after 48 h
40 after 24 h -10
just after suspension
-15
Zeta potential / mV
30
Intensity / a.u.
-20
-25
20
-30
iii)
10 -35
ii)
-40
i)
0 -45
10 100 1000 10000 2 4 6 8 10
Hydrodynamic diameter / nm pH
Figure 2.5. a) DLS analysis of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG suspension in: water (i), SBF (ii) and in cell
culture medium (iii); b) Zeta potential dependence on pH for MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG before (squares) and
after (diamonds) Gd chelation.
3.2.4 Biocompatibility and Viability Test

To assess the biocompatibility of the developed nanocarriers, in vitro cytotoxicity tests were performed by
incubating P388 cells with suspensions of MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG and MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG
(concentrations from 0 to 100 µg mL−1) for 24 h and 48 h, and using trypan blue (cell death) and resazurin (cell
proliferation) cell viability essays. P388 cells are strongly phagocytic and they have already shown their capacity
to provide an excellent uptake of MSNs with a mean size of 150 nm.197 Because MSNs are designed to be
administrated intravascularly, it is rational to demonstrate the cell viability by using such a phagocytic white blood
cell line. As shown in Figure 2.6, no cell death and no significant growth inhibition were found at all
concentrations, up to 100 µg mL−1. The preservation of cell viability suggests that both MSN-DTPA- PEG and
MSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles are biocompatible nanocarriers.
68
a) b)
120 120
100 100
Cell viability / %
Cell viability / %
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.2 12.5 25 50 100 0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.2 12.5 25 50 100
Concentration / µg mL-1 Concentration / µg mL-1
24 h 24 h
c) 48 h d) 48 h
120 120
100 100
Cell viability / %
Cell viability / %
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.2 12.5 25 50 100 0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.2 12.5 25 50 100
Concentration / µg mL-1 Concentration / µg mL-1
Figure 2.6. Viability of P388 cells treated with MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG (a: resazurin test; b: trypan blue
test) and MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG (c: resazurin test; d: trypan blue test).
2.2.5 Drug Loading and In vitro Drug Release

The capacity of MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG nanoparticles to entrap and release anticancer agents was
demonstrated with daunorubicin (DNR). Such studies were performed to highlight the potential of MSN-DTPA-
PEG nanoparticles for theranostic applications. The presence of DNR in the loaded particles was evidenced by
13C CP/NMR and FTIR (Figure S2.8, Supporting Information-section 2.5). The DNR adsorption capacity of Gd-
labeled nanoparticles (MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG) was in the order of 8% (w/w) which is two to six times
higher than those of typical MSNs used thus far in previous drug delivery studies (e.g., MCM-41- type). 33, 226
According to this percentage, the amount of loaded DNR is equal to 0.08 mg per mg of nanoparticles which
corresponds to 150 nmol of DNR per mg of nanoparticles. Such enhanced drug adsorption capacities are
attributed to the high surface area and the high pore volume of the DTPA-and-PEG-grafted MCM-48. Indeed,
compared to MCM-41 showing a two-dimensional (2D) pore network, MCM-48 nanoparticles are characterized
69
by higher surface area and easier molecular diffusion inside their open three-dimensional (3D) pore network. 187
Moreover, the drug loading efficiency of MSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles is attributed to the noncovalent
bonds (e.g. electrostatic interactions and hydrogen bonding) between the amine group of DNR and adsorption
sites at the surface of silica (e.g. silanol and siloxane groups). According to the loading conditions of DNR, DNR
adsorption in the silica nanoparticles could be attributed to electrostatic interactions taking place between
positively charged DNR (DNRH+) molecules and deprotonated silanol groups (SiO−), as well as to hydrogen
bonding occurring between uncharged DNR and the silica framework (silanols and siloxane groups).
The drug release efficiency was investigated in vitro in PBS pH 7.4, and in acetate buffer solutions pH 5 and pH
4, which are conditions often used to mimic in vivo media. Figure 2.7-a,b depicts the cumulative DNR release
for MSN-DTPA(Gd)- PEG nanoparticles as a function of time. In acidic conditions, a progressive drug release
was observed in the first 24 hours (about 9.5–12.5 nmol per mg of nanoparticles). After 9 days, the cumulative
release of DNR reached 11 and 14 nmol per mg nanoparticles in pH 5 and pH 4, respectively. These
concentrations are five and six times higher than that observed in PBS at pH 7.4, respectively. Indeed, at pH
7.4, a very slow drug release rate was observed, with the plateau occurring around 150 h (6 days) after beginning
of the experiment. These are demonstrations that drug release can be achieved in a time and pH-dependent
manner. The low release level at pH 7.4 and the higher values achieved under more acidic conditions, are
related to the electrostatic interactions between silica adsorption sites (silanol groups) and daunorubicin. Indeed,
when DNR@MSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles are suspended in acidic solution, the SiO − groups of silica
framework become protonated (SiOH), inducing the liberation of protonated DNR (DNRH +) and, thus, the
observed release. However, when these nanoparticles are suspended in neutral solution (e.g. PBS pH 7.4), the
predominant silanol species are mostly SiO−, which more strongly interact with positively charged protonated
DNR (DNRH+). This proton-sensitive mechanism indicates the possibility to trigger intracellular drug release
once the particles are internalized in cells, enabling the intracellular accumulation of very high amounts of
drugs,33 ultimately enhancing drug efficiency and reducing deleterious effects of free anticancer agents. 226, 227
70
-1
Nanoparticles concentrations / µg mL
0.1 1 10 100
a) b) c)
120
nanoparticles
nanoparticles
14 pH = 4 14
pH = 5 100
12 pH = 7.4 12
Nanoparticles
10 80
Cell viability / %
10
-1
-1
Released DNR / nmol mg

Released DNR / nmol mg
8 8
60 DNR-loaded
nanoparticles
6 6
40
4 4 Free DNR
pH = 4 20
2 2 pH = 5
pH = 7.4
0 0 0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 40 80 120 160 200 240 1e-9 1e-8 1e-7 1e-6 1e-5 1e-4
Time / h Time / h DNR concentrations / mol L-1
Figure 2.7. Daunorubicin release from MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG nanoparticles as a function of: a) initial
time up to 24 h (1 day); b) total time up to 216 h (9 days) and c) viability of P388 cells incubated with free DNR,
DNR-loaded nanoparticles at different DNR doses.
In order to identify in a quantitative manner evidence of mechanisms that have a potential on drug desorption
and release kinetics, in vitro release data (DNR@MSN-DTPA(Gd)-PEG) were fitted using a semi-empirical
power law equation255:
Mt
 k  t n (1)
M
where: Mt is the amount of the drug release at time t (in hours);
M∞ is the total amount of the loaded drug;
k is the kinetic release constant and
n is a release factor
The k value provides information on the release rate and the n value indicates the type of drug release
 Mt 
mechanism.255 Both values (n and k) were calculated from the plot of log   f log t  and compiled in
 Mn 
Table S2.3 (Supporting Information-section 2.5). The release exponent (n) in the more acidic medium (pH = 4),
71
equals to 0.5, and thus presented pure Fickian diffusion, whereas in higher pH medium (pH = 5 and pH = 7.4),
the release exponent shifted to values higher than 0.5 (Table S2.3, Supporting Information-section 2.5),
indicative of a combination of both diffusion and erosion-controlled rate release. 255 Such so-called “erosion”
release was previously attributed to the degradation behavior of calcined, uncalcined and PEGylated silica
nanoparticles in simulated biological medium as discussed by Shi et al.,210 Bein et al.211 and Kuroda et al.,86
respectively. This further explains why in PBS at pH 7.4, the results showed a slow and continuous release over
a 9-day period. On the other hand, as shown in Table S2.3 (Supporting Information-section 2.5), the kinetic
constant (k) value is quite low. This indicates progressive and prolonged release behaviour over time that could
be truly useful to enhance the long-term anticancer drug efficacy and may achieve improved therapeutic efficacy.
The drug release studies were completed with a cell viability study. For this, P388 cells were incubated 24 h with
DNR-loaded nanoparticles and the viability was measured at time points (Figure 2.7-c). Significant inhibition of
cell growth and proliferation were observed for DNR-loaded nanoparticles, while no significant cytotoxicity was
observed with unloaded nanoparticles (free of daunorubicin). Moreover, the cytotoxicity efficacy of the DNR-
loaded nanoparticles was similar to that of free DNR dissolved in DMSO, at equal concentrations of
daunorubicin. DNR is efficiently released in the intracellular medium after cell uptake.
Finally, the present study clearly reveals one potential challenge intrinsic to MSNs as delivery vectors: adsorption
mechanisms taking place between the medicinal compounds and the pore surfaces of the silica framework.
Indeed, the concentration of released DNR drug reported in this study is comparable to those of the literature 224,
226 which, in our case, represents 8–10% of the initially loaded drug. However, higher released drug
concentrations and cumulative drug release were expected in the present study, due to the exceptional drug
loading capacity of this system. Our results suggest the occurrence of strong interactions taking place between
DNR and the silica matrix. Investigations are currently being performed to fully understand and control the exact
adsorption/desorption mechanisms between the drug and the silica matrix. This would be critical information
since this phenomenon has also been suggested by recent studies,249 and because DNR is a widely used
anticancer molecule in drug delivery studies. The level of drug release achieved in the present study is
nonetheless very effective to control cell growth, as shown by the cytotoxicity results.
2.3 Conclusion
This contribution is the first study that confirms the optimal combination of relaxometric performances and drug
adsorption/release capacity of MSN-based drug vectors labeled with metal chelates. The selective grafting of
imaging probes (DTPA-Gd) and biocompatible molecules (PEG) at the outer surface of the particles is a
straightforward strategy to preserve the high porosity of MSNs (a critical parameter for drug delivery function).
The very small amounts of the MRI probe molecule, i.e., Gd-chelate, grafted at the outer surface induces strong
72
relaxometric properties and remarkable positive contrast enhancement in MRI. Owing to the conservation of the
porosity, the obtained multifunctional nanoparticles offer also the advantages of nanocarriers with high drug
loading capacity (demonstrated with daunorubicine, an anticancer drug model). The pH-responsiveness of the
nanocarriers and their high colloidal stability were illustrated, which opens promising applications in tumor drug
delivery applications. This study is a significant and original step toward the development of tailored theranostic
nanocarriers using high porosity MSNs.
2. 4 Experimental section
2.4.1 Materials
Tetraethylorthosilicate (TEOS, 98%), n-cetyltrimethylammonium bromide (CTAB, 99%), Pluronic F127
(EO106PO70EO106, BioReagent), diethylenetriaminepentaacetic dianhydride (DTPA dianhydride, 98%), (3-
aminopropyl)triethoxysilane (APTES, 99%), Gd(CH3CO2)3,xH2O (99,9%) were obtained from Sigma-Aldrich
(Canada) in high purity grade. Polyethylene glycol (PEG-Silane 20 kDa) was purchased from Laysan Bio (Arab,
USA).
2.4.2 Mesoporous Silica Nanoparticles Synthesis

MCM-48-type MSNs with 3-D cubic network, were synthesized as reported in the literature.78 Briefl y, CTAB (1.0
g) and F127 (4.0 g) were dissolved in EtOH 100% (85.41 mL) and 2.8 wt% NH 4OH solution (212.86 mL). Then,
TEOS (3.86 mL) was added at room temperature (RT) under high stirring rate (1000 rpm) for 1 minute. The
reaction mixture was then aged 24 h in static conditions (air, RT). The resulting product was collected by
centrifugation, washed twice with EtOH 95% (250 mL) and dried overnight in air at 65 °C. Finally, the product
was calcined (air, 550 °C, 1 °C min–1, 5 h). DTPA Grafting Optimization: In a flask, DTPA dianhydride (200 mg,
0.56 mmol) was dissolved in anhydrous DMSO (at RT, 3 h stirring and 5 min sonication). Then, APTES (0.1 mL,
0.45 mmol) was added dropwise (for optimum reactivity) and the mixture was stirred overnight at RT, under N 2.
This product was referred to as “DTPA-silane solution”. In another flask, calcined nanoparticles (500 mg) were
suspended in anhydrous toluene (85 mL) and sonicated for at least 30 min. Varying amounts of the DTPA-silane
solution (x = 3, 2, 1 and 0.5 mL) were added one shot to the nanoparticle suspension under inert gas (N 2) and
the mixture was refluxed overnight at 110 °C. The suspension was centrifuged (7500G, 10 min), and the
supernatant discarded. The solid residue was washed twice with EtOH 95%, once with water, and dried under
vacuum at 40 °C. The resulting nanoparticles are designated as “MSN-xDTPA”, where x is the w/w percentage
of grafted DTPA-silane measured by TGA (Figure S2.2-a, Supporting Information-section 2.5). PEG Grafting
Optimization: escalating amounts of PEG-silane (y = 30, 20, 10, 5 mg) were dissolved in anhydrous toluene (15
mL) at RT under inert gas (N2), followed by 6 h stirring and 10 min of sonication. The PEG-silane solution was
then added to the suspension of calcined nanoparticles (300 mg in 85 mL dry toluene) and the final suspension
73
was refluxed under N2 overnight at 110 °C. The product was isolated by centrifugation (7500G, 10 min), washed
twice with EtOH 95%, once with water, and dried under vacuum at 40 °C. The resulting nanoparticles are
designated as “MSN-yPEG” where y is the w/w percentage of grafted PEG-silane as measured by TGA (Figure
S2.2-b, Supporting Information-section 2.5). DTPA-Gd(III) Chelation: Gd(CH 3CO2)3,xH2O (1 mL, 100 mM) was
slowly added to the nanoparticles (10 mg). The obtained suspension was stirred under moderate agitation (60
min, RT). The labeled particles were recovered by centrifugation (7500G, 10 min). These nanoparticles were
washed once with sodium acetate buffer (10 mL, 50 mM) and several times with nanopure water (10 mL).
Between each washing, the T2 of the supernatant was measured with a dedicated TD-NMR relaxometer (Bruker
Minispec 60 mq, 60 MHz, 25 °C). When T2 reached 2300 ms, the supernatant was considered Gd3+ -free and
the particles were then considered purified from un-chelated Gd3+ ions. Finally, Gd-labeled nanoparticles “MSN-
xDTPA-yPEG(Gd)” were dried overnight under vacuum at 40 °C. The successful chelation of gadolinium was
confirmed by IR spectroscopy, based on the disappearance of the asymmetrical C=O vibration of –COOH at
1719 cm−1, and the appearance of the typical vibration mode of DTPA(Gd) at 1591 cm −1, corresponding to
asymmetrical COO− stretching vibration.256
2.4.3 MSNs Textural Properties and Thermogravimetric Analysis

X-ray Diffraction Characterization: XRD measurements were performed using a Siemens D5000 (reflection, θ–
θ configuration; CuKα: λ = 1.541 Å; 40 kV; 30 mA; 1–8° 2θ, step size: 0.02 2θ; 0.02 s/step). The Jade (v 2.1)
software coupled with JCPDS and ICDD (2001 version) databases was used to analyze the XRD data.
Nitrogen Physisorption Analysis: Nitrogen physisorption measurements were performed at −196 °C with an
ASAP 2010, Micromeritics. Before the sorption measurements, the samples were outgassed under vacuum for
at least 6h at 200 °C (for calcined MCM) or 80 °C (for all the functionalized MSNs). The specific surface area
(SBET) was determined using the BET equation in the range 0.05 ≥ P/P 0 ≥ 0.20 and the total pore volume was
obtained at P/P0 = 0.95. Pore diameter was estimated using non-local density functional theory (NLDFT)
methods (Autosorb 1.55 software, Quantachrome Instrument) applying adsorption branch model (considering
N2 sorption at −196 °C in silica with cylindrical pore geometry).49
Thermogravimetric Analysis-Differential Thermal Analysis (TGA-DTA): Measurements were performed using a

Netzsch STA 449C thermogravimetric analyzer, under airflow of 20 mL min –1, with a heating rate of 5 °C min-1,
between 35 and 700 °C. The percentage of grafted molecules (DTPA-silane/APTES and PEG-silane) was
calculated based on the mass loss detected between 160 °C and 530 °C. This temperature range was selected
because the degradation of PEG-silane and DTPA-silane takes place between 180 and 500 °C, and because it
excludes from the calculation the residual solvent (e. g. physisorbed water) and the silica framework
condensation occurring further at higher temperatures.
74
2.4.4 Particle Size and Physicochemical Analysis
TEM and EDX Characterization: The nanoparticles were dispersed in methanol. This suspension (4 µL) was
deposited on a carbon-coated copper grid and images were taken in TEM (JEM-1230) at an accelerating voltage
of 80 keV. Particle size distributions were calculated by ImageJ, based on a sample of at least 1500 particles,
from at least 6 images taken over 6 different quartiles. The Gd/Si ratio in MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG
nanoparticles was measured with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) analyses, performed with a high
resolution TEM (JEOL JEM-2100F, 200 keV).
Particle Size and Zeta Potential Measurements: The hydrodynamic diameter of the nanoparticles and the zeta
potential were measured by dynamic light scattering (DLS), using a Malvern DTS Nano zetasizer 173°
(equilibration time set to 3 min; 3 measurements taken on each sample; only quality criteria data accepted as
valid results). Zeta potential dependence on pH was obtained by measuring the zeta potential in aqueous
solution by adjusting the pH value by the addition of HCl and NaOH (0.02 M).
NMR Characterization: Solid-state magic-angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra
were obtained on a Bruker DRX300 MHz NMR spectrometer. 29Si MAS NMR spectrum was measured at 59.60
MHz using a 7 mm rotor spinning at 4 kHz. The 75.4 MHz 13C CP-MAS spectra were obtained using a 7 mm
rotor spinning at 4 kHz. The chemical shifts are reported in ppm relative to tetramethylsilane (TMS) for 29Si and
relative to adamantane for 13C.
IR Characterization: FTIR-ATR spectra were recorded using a Nicolet Magna FTIR spectrometer with a narrow
band MCT detector and a diamond ATR Golden-Gate accessory (Specac Ltd., London). The spectra were
obtained from 128 scans with a resolution of 4 cm−1.
X-ray Photoelectron Spectroscopy: The chemical composition of the surface was investigated by X-ray
photoelectron spectroscopy, using a PHI 5600-ci spectrometer (Physical Electronics, Eden Prairie, MN). The
main XPS chamber was maintained at a base pressure of 8.10−9 Torr. A monochromatic aluminum X-ray source
(Al kα = 1486.6 eV) at 250W was used to record survey spectra (1400–0 eV) and high resolution spectra with
charge neutralization. The detection angle was set at 45° with respect to the normal of the surface and the
analyzed area was 0.016 cm2 (aperture 5).
1H Relaxation Analysis and Relaxometric Properties Measurement: 400 µL of Gd labeled nanoparticles

suspensions were pipetted into in 6.0 mm NMR tubes. Longitudinal and transversal relaxation times (T1 and T2)
were measured with a TD-NMR relaxometer (Bruker Minispec 60 mq, 60 MHz, 37 °C). The amount of Gd in
each suspension was precisely measured by ICP-MS (Perkin Elmer Elan 6000) after an optimal digestion
procedure in HNO3 and hydrogen peroxide, in order to leach all Gd3+ ions from the silica matrix. Relaxation rates
75
(1/T1 and 1/T2) were plotted against Gd concentration values, and relaxivities (r1 and r2) were calculated from
the slope of these curves.
2.4.5 MSNs Drug Loading and In vitro Drug Release Assays

Drug Loading: MSN-DTPA-PEG nanoparticles with the optimal percentages of grafted PEG-silane and DTPA-
silane, were selected for drug loading measurement procedures. For this, daunorubicin (DNR) is used as model
of anticancer molecules. To load daunorubicin, MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG (25 mg) was suspended in a
daunorubicin solution (5 mg mL−1, in methanol). The suspension was shaken for 24 h at RT in the dark.
Daunorubicin-loaded nanoparticles (DNR@MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG) were obtained by centrifugation
and washed very carefully three times, then dried under vacuum. DNR loading efficiency was evaluated by TGA
and confirmed by UV-Visible spectroscopy.
In vitro Release Studies: The in vitro drug release studies were performed in physiological conditions mimicking
in vivo conditions at 37 °C (PBS at pH = 7.4; acetate buffer solution at pH = 5 and pH = 4). In fact, once
the particles are entrapped in the endosomes/lysosomes of cells, they are submitted to rather harsh acidic
conditions (pH = [3.5–5.5]). For this, acetate buffers are recommended and commonly used as a verification
test for the chemical stability, in particular for FDA-approved MRI nanoparticles.257 PBS was prepared by
dissolving one pouch of phosphate-buffered saline (Sigma Aldrich, Canada) in 1 L of deionized water (yielding
0.01 M PBS solution, pH 7.4 at 25 °C, ionic strength = 162.7 mM). Acetate buffer solution (pH = 4 and pH =
5) was prepared by mixing “v” µL of sodium acetate solution (0.1 M) with “v′” µL of acetic acid (0.1 M). For the
acetate buffer at pH = 4 (ionic strength = 100 mM), v = 57.5 µL and v′ = 442.5 µL were used. For the
acetate buffer at pH = 5 (ionic strength = 100 mM), v = 350 µL and v′ = 150 µL were used. To measure drug
release in PBS, DNR@MSN-DTPA(Gd)-PEG (5 mg) were soaked in PBS pH 7.4 (5 mL) in water bath under
moderate shaking at 37 ± 1 °C. At time points, particles were centrifuged, then the supernatant (release
medium, 1 mL) was removed, and replaced with fresh medium (1 mL). The percentage of daunorubicin
released was evaluated by recording the absorbance of the supernatant at 480 nm. For this, a Varian UV-Vis-
NIR Cary 500 Scan spectrophotometer in double beam configuration and in an acrylic cuvette with a 1 cm
path length was used. Similar experiments were reproduced in acetate buffer.
2.4.6 Cell Viability Study

Cell viability was determined by the trypan blue (cell membrane functional activity) and the resazurin
(mitochondrial function) assays. For this, P388 cells were incubated with nanoparticles (0–100 µg mL−1) in 96-
well plates for 24 h and 48 h, respectively. Then, trypan blue dye solution (0.4% in PBS at pH = 7.4) was
added to the cell suspensions. Non-viable (stained) and viable cells were counted (Cellometer Auto T4 –
76
Nexcelom Bioscience). For the resazurin assay, 7-hydroxy-10-oxidophenoxazin-10-ium-3-one was added to
the cell suspensions, and left for viable cells to reduce the non-fluorescent dye resazurin into the fluorescent
resorufin (7-hydroxy-3-isophenoxazin-3-one). Then, the reaction of resazurin into resorufin was quantified by
fluorescence measurements (excitation, 530 nm; emission, 590 nm) with a 96-well microtiter plate
fluorescence reader (BioTek FL600, Winooski, VT, USA). Background fluorescence emitted from the control
wells containing the medium and resazurin without cells was subtracted from fluorescence values obtained in
the presence of cells and results were then expressed as a percent of the fluorescence of the control cells.
2.5 Supporting Information
a) b) c)
10000
700 0.12
3 -1
Adsorbed volume / cm g
8000 600 0.10
d(d) / cm3 Å-1 g-1

Intensity / a.u.
500
6000 0.08
400
0.06
4000 300
0.04
200
2000
100 0.02
0 0 0.00
2 4 6 8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 4 6 8
2 / ° Relative pressure P/P0 Pore width / nm
Figure S2.1. Non-grafted MCM-48 nanoparticles: a) low-angle Powder XRD pattern; b) N2 physisorption
isotherms and c) respective NLDFT pore size distributions.
77
a) b)
100 100
95
95
90
90
85
Mass / %
Mass / %
85 80
80 75
70
75 MSN-3.5%PEG
MSN-3%DTPA 65 MSN-5%PEG
70 MSN-5.7%DTPA MSN-10.5%PEG
MSN-9%DTPA 60
MSN-17%PEG
MSN-13%DTPA
MSN-27%PEG
65 55
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Temperature / °C Temperature / °C
Figure S2.2. Thermogravimetric analysis of a) MSN-xDTPA and b) MSN-yPEG nanoparticles.
a) b)
DTPA-silane:
9
2
PEG-silane: i j
4
ii 13 14 11 8
k 10 12 7 1
6 8
5 7 6
3
5
i; ii 5; 6; 7;
1
8; 9; 10
1; 2; 3; 4 11 12 14
13
MSN-13%DTPA
MSN-3.5%PEG
MSN-5.7%DTPA
MSN-5%PEG
MSN-10.5%PEG
MSN-3%DTPA
225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0
Chemical shift / ppm Chemical shift / ppm
Figure S2.3. 13C CP/MAS NMR spectra of a) MSN-xPEG and b) MSN-yDTPA nanoparticles.
78
a) b)
C=O
CONH) C-H C-H
C=O C-H
COOH)
N-H
q
l p
o
k n
j m
i
1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 3600 3300 3000 2700 1800 1600 1400 1200
Wavenumber / cm-1 Wavenumber / cm-1

Figure S2.4. ATR mode IR spectra of a) MSN-xDTPA and b) MSN-yPEG; i: 0%; j: 3%; k: 5.7%; l: 13%; m: 0%;
n: 3.5%; o: 5%; p: 10.5%; q: 17%.
Figure S2.5. 29Si MAS NMR spectra of a) MSN-yPEG (i: x=5; j: x=10.5; k: x=17) and b) MSN-xDTPA (l: y=5.7;
m: y=9; n: y=13).
79
0.12
MSN: MCM-48
MSN-3%DTPA
0.10
MSN-5.7%DTPA
MSN-9%DTPA
d(d) / cm3 Å-1 g-1 MSN-13%DTPA
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
2 3 4 5 6
Pore width / nm
Figure S2.6. NLDFT pore size distributions of MSN-xDTPA nanoparticles.
a) b)
PEG-silane: i
ii
DTPA-silane: i; ii
2
9  C=O
13 14 4 CONH)
11 8
10 12 6
7
8 1 N-H
5 7 6 5; 6; 7; C=O C-H
3
5
8; 9; 10 C-H COOH)
1; 2; 3; 4 1
11 12 j
14
13
i
225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 3500 3150 2800 1750 1500 1250
Chemical shift / ppm Wavenumber / cm-1

Figure S2.7. a) 13C CP/MAS NMR spectrum of MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG; and b) ATR-IR spectra of i) non
grafted MSN and j) MSN-5.7%DTPA-3.2%PEG nanoparticles.
80
a) b)
C=C
(Benzene)
j
j
i
i
200 150 100 50 0 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200
Chemical shift / ppm Wavenumber / cm-1
Figure S2.8. a) 13C CP/MAS NMR and b) ATR-IR spectra of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG before (i) and
after (j) DNR loading.
25
pH = 7.4
pH = 5
20
Cumulative release / %
15
10
0
0 30 60 90 120 150 180 210 240
Time / h
Figure S2.9. Cumulative release of Gd(III) ions from of MSN-5.7%DTPA(Gd)-3.2%PEG at different pH values.
81
BET Surface Pore Volume NLDFT Mean
Area [cm3 g-1] Pore size [nm]
[m2 g-1]
MSN MCM-48 (pristine) 1654 0.82 3
MSN-yPEG MSN-3.5%PEG 1471 0.70 2.7
MSN-5%PEG 1448 0.68 2.7
MSN- yPEG –xDTPA MSN-3.5%PEG- 1077 0,52 2.5
1.5%DTPA
(grafting DTPA on
MSN-5%PEG- 1182 0.59 2.5
MSN-yPEG) 1.5%DTPA
Table S2.1. Physicochemical parameters of MSN-yPEG and MSN-yPEG-xDTPA nanoparticles obtained from
nitrogen physisorption measurements.
% C (1s) % N (1s) % O (1s) % Si (2s) C/Si N/Si

(285.0 eV; C-C, C-H) 399.8 eV; 533.0 eV 104.0 eV;
[286.4eV; C-O, C-N] N-H Si-O
{288.3eV; C=O
Amide/Acid}
MSN: MCM-48 1.0 0.0 68.5 30.5 0.003 0
(pristine) (0.1)
[0.6]
{0.3}
MSN-5.7%DTPA 6.2 0.8 66.7 26.3 0.235 0.030
(3.24)
[2.17]
{0.79}
MSN-5.7%DTPA- 8.6 0.8 64.7 25.9 0.332 0.030
3.2%PEG (5.67)
[2.46]
{0.47}
Table S2.2. Percentage atomic concentrations extracted from the XPS measurements.
82
Sample Release exponent n Kinetic constant k [%DNR
released hn-1]
pH7 – DNR@MSN-DTPA(Gd)-PEG 0.59 0.25
Table S2.3. Release kinetics parameters. Release kinetics parameters were obtained for profiles up to 90% of
total amount released.
2.6 Acknowledgements
The authors acknowledge the financial support from the National Science and Engineering Research Council
(Canada) and the Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies (FRQNT). Meryem
Bouchoucha is grateful to FRQNT for a PhD fellowship. The authors would like to thank Mr Jacques Lacroix for
performing cell viability tests and Dr Pascale Chevalier for XPS analysis. Supporting Information is available
online from Wiley InterScience or from the authors.
83
Chapitre 3 – Article 2 : Size-Controlled
Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles
for Tunable Drug Release and Enhanced Anti-
Tumoral Activity
Meryem Bouchoucha†,‡,§, Marie-France Côté‡, René C.-Gaudreault⊥, Marc-André Fortin* ‡,§, Freddy Kleitz* ,†,§
† Department of Chemistry, Université Laval, Québec QC, G1V 0A6, Canada.
‡ Centre de recherche du centre hospitalier universitaire de Québec (CR-CHUQ), axe Médecine régénératrice,
Québec QC, G1L 3L5, Canada.
§ Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA), Université Laval, Québec QC, G1V 0A6, Canada.
⊥ Centre de recherche du Centre hospitalier universitaire de Québec (CR-CHUQ), axe Oncologie, Québec QC,
G1L 3L5, Canada.
Received: March 1, 2016
Revised: May 22, 2016
Published: May 24, 2016
Times cited: 6 (until May 2017)
84
Résumé
Les nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs) sont considérées parmi les nanovecteurs les plus
prometteurs pour l'administration contrôlée des médicaments. Pour concevoir des nanovecteurs de
médicaments idéaux, plusieurs facteurs doivent être pris en compte, tels que la taille et la chimie de surface.
Dans cette étude, nous rapportons jusqu’à quel point la fonctionnalisation de la surface des MSNs et la taille de
ces particules affectent leur performance pour la libération des médicaments et leur capacité thérapeutique. Ce
travail étude l’effet de la taille des MSNs fonctionnalisés sur l’efficacité du relargage des médicaments in vitro et
in vivo, ainsi que sur l’efficacité de la diffusion des nanoparticules, d’une part, et des médicaments, d’autre part,
dans les tissus ciblés (la tumeur, dans ce cas d’étude). Ainsi, des MSNs redispersibles dans un milieu aqueux,
de différentes tailles (entre 45 et 500 nm), ayant des propriétés physicochimiques similaires et une excellente
stabilité colloïdale (dans l’eau et des conditions salines), ont été synthétisées. Leur surface a été fonctionnalisée
par l’ajout d’un phosphonate-silane, selon une nouvelle stratégie de post-greffage, pour un meilleur contrôle du
piégeage et du relargage des médicaments à charge positive. Un relargage plus efficace du médicament (la
doxorubicine) a été obtenu avec les MSNs phosphonatées, comparé à celui obtenu avec les MSNs purs (non-
fonctionnalisées). Cette libération dépend de la taille des particules et du pH du milieu. L'efficacité de l’absorption
cellulaire est beaucoup plus élevée avec les plus petites nanoparticules phosphonatées (45 nm). En outre, la
doxorubicine est libérée des nanoparticules dans les compartiments intracellulaires. L’efficacité de cette
libération dépend de la taille des particules et du temps d’incubation. La diffusion intratumorale des
nanoparticules, ainsi que la libération du médicament et sa diffusion dans la matrice tumorale, est nettement
améliorée avec les plus petites nanoparticules phosphonatées (45 nm), ce qui engendre une inhibition
supérieure de la croissance des cellules cancéreuses et des tumeurs.
85
Abstract
Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) are considered as one of the most promising nanovectors for controlled
drug delivery. For the design of ideal drug nanocarriers, several factors have to be taken into account, such as
size and surface chemistry. Here, we report how MSNs surface functionalization and particle size critically
affect the drug release performances and therapeutic capabilities. We illustrate the size effect of these
functionalized MSNs on in vitro, intracellular, and in vivo drug release efficiency, as well as on nanoparticle and
drug diffusion into the targeted tissues (tumor). For this, dispersible MSNs with different particle sizes (from 500
down to 45 nm), similar physicochemical properties (e.g., structural and textural properties), and high colloidal
stability (even in saline conditions), were synthesized. Their surface was specifically functionalized with a
phosphonate-silane according to a novel postgrafting strategy, for better control over loading and release of
positively charged drugs. An efficient particle-size-dependent and pH-dependent release of the loaded drug (i.e.,
doxorubicin) was achieved in physiological conditions with phosphonated-MSNs compared to pure-MSNs. The
cellular uptake efficiency is much higher with the smallest phosphonated-nanoparticles (45 nm). Furthermore,
doxorubicin is efficiently released from the nanoparticles into the intracellular compartments, and the drug
reaches the nucleus in a time- and particle size-dependent manner. Intratumoral diffusion of the developed
nanoparticles, as well as the drug release and its diffusion into the tumor matrix, is clearly enhanced with the
smallest phosphonated-nanoparticles (45 nm), leading ultimately to a superior cell and tumor growth inhibition.
86
3.1 Introduction
Among the developed nanocarriers in the field of nanomedicine, mesoporous silica nanoparticles (MSNs) have
emerged as one of the most promising nanomaterials for drug delivery applications, owing to their unique
characteristics such as high surface area and pore volume, high in vitro and in vivo biocompatibility, tunable
particle size, and versatile surface chemistry.7, 166, 217, 229, 255, 256 MSNs have been explored for anti-inflammatory,5,
19, 196 antibiotic,25 growth control,257, 258 gene delivery259 and anti-cancer therapeutic agents.69, 165, 180, 225, 260-263 Due
to their large pore volume and surface-to-volume ratios, MSNs offer the possibility to transport large quantities
of drugs into perfused organs via passive (e.g., enhanced permeability and retention (EPR) effect) 35, 227 and/or
active targeting (e.g. specific receptor-mediated recognition).88, 144, 228 In addition, recent studies have shown the
possibility to control drug elution from MSNs structures.195, 196, 264 The main challenge of MSNs for targeted
delivery remains the design of optimal carriers that could more specifically bind to and/or accumulate in the
targeted organs or tissues (e.g., tumors). This strategy would provide higher and more selective drug doses,
while minimizing nonspecific toxicity and side effects. To achieve this goal, size and surface chemistry, as well
as surface charge, must be carefully balanced and controlled.
Particle size determines the cell uptake capacity of nanoparticles and their ability to penetrate through tissues. 102,
150, 151 So far, ambiguous results have been found in the attempts made to correlate MSN size with cell uptake.
For instance, some studies have suggested that 50 nm was an optimum MSN particle size for efficient cell
uptake, by comparison to larger (≥100 nm: 105; 120; 170; 280 nm) and smaller (30−25 nm) ones. 154, 155 In these
studies, pure MSNs showing negative charge (≈ -20 mV at pH 7.4),154 as well as MSNs functionalized with a
nuclear targeted peptide and showing a positive charge (≈ 25 mV; in PBS) 155 were used. In contrast, other
studies involving amine- functionalized and polyethylene glycol (PEG)-coated MSNs, as well as pristine MSNs
(≈−15 mV; PBS pH 7.4), reported that 100−150 nm MSNs could be more efficiently taken up by cells, even
compared to 50−55 nm MSNs.156, 157 However, high cellular uptake alone does not guarantee the functionality
of targeted drug delivery vectors: the compound must circulate in the blood long enough to provide enhanced
and selective uptake by the targeted organs (e.g., tumors).
Small particle size is assumed to correlate with long blood circulation times, and this is considered being
beneficial to the general therapeutic outcome.265, 266 Studies reporting on intravenous injections of pure and
PEGylated MSNs indicated that 80−120 nm particles were less prone to opsonization by the reticuloendothelial
system and therefore less accumulated in the liver and spleen compared to larger nanoparticles (≥ 200 nm) 104
MSNs of sizes ranging between 80 and 120 nm also revealed enhanced accumulation around the leaky regions
of the tumor vasculature.267 Such results suggested the enhancement of passive tumor accumulation of
nanoparticles (due to EPR effect), with decreasing particle size. Furthermore, other reports have shown that
MSNs of mean diameter close to 50 nm could ensure the highest accumulation at the tumor site by passive
87
accumulation (∼ 12%)227 This observation enabled the design of MSNs for active targeting (via acid folic grafting)
that have reached high tumor accumulation (∼23% of the total initial injected MSNs dose)165 However, thus far,
there is still a lack of more comprehensive and thorough studies which correlate particle size and in vitro and in
vivo drug release efficiency, as well as substantiating particle size-dependent nanoparticle and drug diffusion
into diseased tissues (e.g., tumor).
Controlling the drug loading in MSNs, as well as the drug elution rate, is also a major condition to reach
therapeutic efficiency. Indeed, total drug elution and the kinetics of drug release (elution rates) should ideally be
closely matched with the type of disease (e.g., type of cancer), and if possible to its level of malignancy. The
three factors that might have the highest impact on drug release from MSNs are (1) total pore volume, (2) particle
size, and (3) surface physicochemical characteristics. The total pore volume dictates the total capacity of drug
loading per nanoparticle unit. In typical MSNs (e.g., MCM-48), pores account for more than 60−70% of the total
volume of the particle.173 The particle size is expected to have a strong impact on drug elution rate, since the
closer the drug is located from the MSN surface, in principle the higher chances it has of efficiently escaping
from the pore network. Very few reports have until now discussed the impact of MSN size on drug elution
efficiency. Only one study performed in aqueous buffer solution (PBS pH 7.4) has revealed that large particle
sizes (300−500 nm, pure MSNs) resulted in slower drug release rate (vitamine C and dexametasone were used
as drug models), and there was no significant differences on the drug release performances between 55 nm
nanoparticles and 100− 200 nm MSNs.156 This points to a possible limitation of small particles over larger ones:
indeed, there is a risk that by decreasing the size of MSNs, unacceptably fast drug release rates could be
observed, with dramatic impact on the overall efficacy of the compound (i.e., drug release before the MSNs find
its target tissue). In order to ensure optimal drug retention and release control, it might be necessary to
functionalize the pores with molecules that interact with the drugs and, by doing so, prolong their retention in the
highly porous structure. However, to the best of our knowledge, there has been no report clearly substantiating
the MSN size effect on intracellular and in vivo drug release efficiency, as well as on nanoparticles and drug
diffusion into targeted tissues (e.g., in tumors).
In this study, MSNs of various sizes (ranging from 500 to 45 nm) were synthesized, of equivalent surface and
bulk physiochemical properties. Their structural and textural characteristics were studied, as well as their
colloidal stability in different media. We also developed a novel postgrafting strategy using phosphonate silane,
which helps to provide a better control over loading and release of doxorubicin, an anticancer drug widely used
in cancer research and oncology. The biocompatibility and cell retention efficiency, as well as the drug release
and cytotoxicity of drug-loaded nanoparticles, were evaluated in vitro. Finally, the accumulation and diffusion of
the nanoparticles, as well as the drug release kinetics, were evaluated in vivo using the chick embryo
chorioallantoic tumor model.
88
3.2.1 Synthesis and Characterization of Different-Sized MSNs.
The ambiguous results reported in earlier studies,154-157 on the effect of nanoparticle size on cell uptake and drug
release, are most likely related to a certain variability in the control of physicochemical properties (e.g., colloidal
stability, textural and structural properties, and controlled surface potential) of sub-100 nm MSNs. Indeed, it is a
great challenge to ensure these requirements particularly for the synthesis of such small nanoparticles. Previous
attempts to synthesize very small MSNs based on conventional approaches mainly led to the synthesis of
aggregates and/or fused nanoparticles.40 Although great efforts have been dedicated to prepare stable
suspensions of sub-100 nm nanoparticles, only limited success was achieved. For example, stable colloids of
pure and functionalized MSNs suspensions exhibiting diameters from 40 to 150 nm, 25 to 105 nm, 20 to 80 nm,
and 10 to 20 nm have been reported by Bein et al.,78, 268 Shi et al.155, 164, Kuroda et al.85 and Wiesner et al.,269
respectively. However, most of these nanoparticles cannot be redispersed after the drying process, and usually
large agglomerates of nanoparticles are obtained. Recently, Zhao and colleagues successfully synthesized
MSNs that remain highly stable, once redispersible, even after the drying process. The mean sizes of particles
were 48, 72, and 100 nm. This was achieved through adjustments to Bein’s method and by grafting PEG. 165
However, these nanoparticles lost the ordered mesostructure, one of the characteristics of larger conventional
nanoparticles (120−150 nm). Yet, colloidal stability and nanoparticle mesostructure are critical parameters that
impact drug release profiles.
In order to prepare redispersible mesostructured silica nanoparticles with different sizes and high colloidal
stability, we modified the synthesis method of MCM-48 silica particles reported by Kim et al. 77 MSNs were
successfully prepared, with average particle diameters of 45 nm (MSN45), 90 nm (MSN90), 150 nm (MSN150), 300
nm (MSN300), and 500 nm (MSN500), as shown by the TEM images displayed in Figure 3.1. Conventional MCM-
48 type MSNs with mean particle size of 150 nm, were prepared according to a previously reported procedure
with the molar composition of 1:0.16:0.017:605:84:9.16 TEOS:CTAB:F127:H 2O:EtOH:NH3 (Figure 3.1-d).77, 114,
264 Particle size control was achieved by tuning the concentration of the triblock copolymer Pluronic F127 as a
nonionic surfactant.76, 77 Indeed, MSNs with an average particle diameter of 90 nm (MSN90, 3.1c) and 300 nm
(MSN300, Figure 3.1-e), were successfully synthesized by increasing and decreasing the fraction of F127,
respectively. Each sample was prepared at the optimal molar ratio of 1:0.16:y:605:84:9.16
TEOS:CTAB:F127:H2O:EtOH:NH3; y = 0.008 and 0.034 for MSN300 and MSN90, respectively. The optimal
fraction of F127 should be kept between 0.008 and 0.034 to obtain well- dispersed spherical particles of size
included in the range 90−300 nm. By increasing the molar ratio of F127 higher than y = 0.07−0.14, very
polydispersed MSNs are obtained with an average particle diameter of 80 nm ±55 nm (Figure S3.1, Supporting
Information-section 3.5). On the contrary, a decrease in F127 concentration (y = 0−0.001) generates bigger
89
aggregated particles with a mean particle size of about 490−530 nm (Figure S3.2, Supporting Information-
section 3.5), as observed in the literature.77
To achieve improved particle size control, triethanolamine (TEA) was added as a dispersion agent, as coinhibitor
of particle growth and/or as the base catalyzing the hydrolysis and condensation reactions of silicate species.
Thus, easily redispersible small nanoparticles, exhibiting narrow size distribution and mean particle size of 45
nm (MSN45, Figure 3.1-a,b), are successfully obtained by adding TEA instead of ammonia. In this case, TEA is
used as a complexing agent for silicate species (from TEOS) and as a particle growth inhibitor for MSNs. The
molar ratio of this composition was 1:0.16:0.017:605:84:9.16 for TEOS:CTAB:F127:H 2O:EtOH:TEA. Moreover,
nonaggregated large particles (≈500 nm: MSN500; Figure 3.1-f) were prepared by substituting F127 with
triethanolamine (TEA) as the dispersion agent, under an optimal molar composition of 1:0.16:9.15:605:84:9.16
for TEOS:CTAB:TEA:H2O:EtOH:NH3.
Figure 3.1. TEM images of the different MSNs synthesized in this work, with their corresponding size
distribution: a) and b) MSN45; c) MSN90; d) conventional MSN150; e) MSN300; f) MSN500. The insets (in a, c and
d) are HRTEM images.
90
All the obtained particles (from 45 to 500 nm) showed an ordered mesostructure as revealed by the low-angle
XRD patterns (Figure 3.2-a). Well-resolved typical peaks of highly ordered 3D cubic Ia3d MCM-48 mesopore
structure were found for MSNs of particle size ≥150 nm. For sub-100 nm MSNs, the XRD diffraction peaks
appeared broadened and revealed MCM-like mesostructures. This broadening of the diffraction peaks could be
attributed to the decrease in the reflection domains of the mesophase, occurring when the nanoparticle size
decreases. This is observed especially when the particle size falls in the nanoscale range (sub-100 nm). 75
Structural order of the sub-50 nm nanoparticles is rather unusual for MSNs of such small sizes. The
mesostructure order for these nanoparticles (MSN45) is improved compared to that in previous reports, in which
no peaks were usually obtained in the XRD pattern.155, 165 MCM-48 type nanoparticles are very interesting for
drug delivery because of their 3D structure and their open interconnected network. This could improve the drug
diffusion inside and from the pores, enhancing therefore drug loading and controlled drug release capacity. The
nitrogen physisorption results (Figure 3.2-b) showed type IV isotherms for all the developed MSN x, which is
characteristic of uniform mesoporous channels with narrow, cylindrical-like pores. The first capillary
condensation occurred in the same relative pressure range of 0.15−0.3, regardless of the particle size. This
indicates that these different-sized MSNs (from 45 to 500 nm) have almost the same mesopore size. Indeed,
the average pore diameter was estimated at 3.4 nm for MSNx (x = 500; 300; 150; and 90) and 3.6 nm for sub-
50 nm MSNs: MSN45 (NLDFT method, Figure 3.2-c and Table 3.1). The isotherm of sub-50 nm MSNs (MSN 45)
showed slight differences in the heights of the first and the second capillary condensation steps: MSN 45 showed
the smallest step in the first capillary condensation but exhibited the sharpest one in the second capillary
condensation step, above the relative pressure of 0.93, which is related to interparticle voids. This fact is usually
observed with the decrease of the size of very well-dispersed spherical particles.77 As determined from N2
sorption isotherms, all the MSNx samples possess high surface area, around 1200 m2 g−1 (BET method), and
large total pore volume of 1 cm3 g−1 (Table 3.1). From all these results, we can conclude that we successfully
synthesized different-sized mesostructured nanoparticles without introducing major deformations or impairments
to their structural and textural properties. This is rather unusual for such small MSN sizes (especially sub-50 nm
MSNs).
91
a) b) c)
0.14
MSN500 MSN500 MSN500
1600
MSN150 MSN150 MSN150
(211) MSN90 MSN90 0.12 MSN90
1400 MSN45 MSN45
MSN45
Adsorbed volume (cm3 g-1)

1200 0.10
d(d) (cm3 Å-1 g-1)

1000 0.08
800
0.06
600
0.04
(220) 400
(420) (332) 0.02

200
0 0.00
2 4 6 8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 4 6 8
2
Relative pressure (P/P0) Pore width (nm)
Figure 3.2. a) Powder XRD patterns of MSNx; b) N2 physisorption isotherms of MSNx, the isotherms for
MSN90, MSN150 and MSN500 samples are offset vertically by 200, 400 and 600 cm3STP g- 1, respectively; c)
corresponding NLDFT pore size distributions.

Area [m2 g-1] [cm3 g-1] size [nm]
MSN45 1131 0.96 3.6
MSN90 1269 0.95 3.4
Pure nanoparticles MSN150 1299 0.91 3.4

(MSNx) MSN300 1241 0.93 3.4
MSN500 1300 0.93 3.4
PMSN45 850 0.67 3.2
Phosphonated PMSN90 930 0.70 3.0
nanoparticles
(PMSNx) PMSN150 970 0.71 3.0
Table 3.1. Physicochemical parameters of different sized nanoparticles obtained from nitrogen physisorption
measurements.
The colloidal stability of these nanoparticles was investigated in aqueous and saline solutions (e.g., water and
154 mM NaCl) and monitored by dynamic light scattering (DLS). Hydrodynamic diameter distributions are shown
in Figure 3.3-a,b. Number-weighted data showed narrow hydrodynamic particle size distributions. Intensity-
weighted data are also represented to facilitate the detection of signs of aggregation or flocculation. These data
indicated that all the MSNx could be thoroughly suspended and well-dispersed in aqueous and saline solutions,
even after drying and calcination, without any significant evidence of aggregation. The polydispersity index (PDI)
and the hydrodynamic diameters reported in number-weighted data, intensity-weighted data, and Z-average,
92
are summarized in Table S3.1 (Supporting Information, Supporting Information-section 3.5). An acceptable PDI
was recorded (between 0.02−0.14 in aqueous and saline solutions). The hydrodynamic diameters are slightly
larger than the core particle sizes observed by TEM (Figure 3.1) which is usually the case taking into account
the hydration corona around the particles. In addition, this colloidal stability was maintained for at least 1 week
(Figure S3.2, Supporting Information-section 3.5): no evidence of aggregation or flocculation was found and no
significant increase in hydrodynamic diameter was reported. This confirms the excellent colloidal stability of
these systems.
93
a) b)
MSN45 MSN45
MSN90 MSN90
MSN150 MSN150
MSN300 MSN300
60 60
MSN500 MSN500
Intensity (a.u.)
Number (a.u.)
40 40
ii) ii)
20 20
i) i)
0 0
10 100 1000 10 100 1000
Hydrodynamic diameter (nm) Hydrodynamic diameter (nm)
c) d)
PMSN45 PMSN45
60 PMSN90 60 PMSN90
PMSN150 PMSN150
50 50
Number (a.u.)
Intensity (a.u.)
40 40
30 ii) 30 ii)
20 20
10 10
i) i)
0 0
10 100 1000 10 100 1000
Figure 3.3. DLS analyses of pure (MSNx: a and b) and phosphonated (PMSNx ; c and d) nanoparticle
suspensions in aqueous (i) and saline solutions (ii; vertical off set).
Nanoparticles with mean diameter ≤200 nm are widely used in today’s preclinical drug delivery systems because
they have the advantage to (1) be internalized by cells, based on nonspecific cellular uptake mechanism and (2)
to ensure a passive tumor targeting, based on the EPR effect.35 In contrast, cellular uptake, tissue accumulation
94
and blood circulation half-life of bigger particles (200 nm−500 nm) are always limited due to their large sizes. In
addition, when large particles are injected intravascularly, they are rapidly taken up by the reticuloendothelial
system and found in the liver and the spleen.104 From this point in the study, we focused our efforts in reaching
ideal size diameters of optimal nanovectors for intravenous injections. Therefore, we focused our interest in
MSN150, MSN90, and MSN45 nanoparticles.
3.2.2 Drug Loading, in vitro Drug Release Profiles, and Phosphonate Grafting
To study the effect of MSNx size on the drug loading capacity and stimuli-triggered drug release, doxorubicin
(Dox) was used as a model of anticancer agent. First, no significant dependence behavior of the drug loading
efficiency was observed as a function of the particle size. The loading capacities of pure MSN 45, MSN90, and
MSN150 were 2.1%, 2.3%, and 2.4% (w/w), respectively. As these nanoparticles exhibit similar pore diameters
and structural properties, the loaded amount of drug could be mainly determined by the surface area which is in
correlation with the amount of the drug adsorption sites (i.e., silanol groups) at the surface of mesoporous
nanoparticles. No significant difference was found on the surface area values of MSN45, MSN90, and MSN150
(Table 3.1). As a result, the drug loading capacity remains quite similar, as expected.
The effect of MSN size on drug release performances was also investigated in PBS pH 7.4 and in phosphate
buffer solution pH 5, which are conditions often used to mimic in vivo media (Figure 3.4-a). Dox release was pH-
dependent: 15−16% at pH 5 vs. 9% at pH 7. However, a limited amount of drug was released (15−16% even
after 6 days) and very slight size-dependence was observed. The low drug loading capacity of pure MSN x33, 165
and their limited drug release efficiency27 had also been observed in previous studies. We believe that these
behaviors might be attributed to the nature and protonation state of the silanol groups on the nanoparticle surface
and to the strong interactions taking place between Dox and the silica matrix. During the drug loading and release
procedures, silanol groups present at the surface of MSNx are mainly represented as Q 3 and Q2 NMR species
(Figure 3.5-a): Q3 at −110 ppm (one silanol attached to the silicon center) and Q 2 at −101 ppm (two silanols
attached to the silicon center). The pKa of Q3 silanols (deprotonation step for the reaction ≡SiOH ↔ ≡SiO − +
H+) was reported to be around 2 to 4. The pKa of Q2 silanols (deprotonation step for the reaction =Si(OH)2 ↔
=Si(O−)2 + 2 H+) was reported to be around 7 to 8.270, 271 According to 29Si MAS NMR data (Figure 3.5-a), a high
(Q2 + Q3)/Q4 ratio is observed and around 30% of silanols were assigned to Q 2 species. It is assumed that this
fraction of silanols is not quite effective for electrostatic binding during the Dox loading step, and it contributes
to a poor drug release.
95
b)
a) pH 5_Dox@PMSN45 pH 7_Dox@PMSN45
50 pH 5_Dox@PMSN90 pH 7_Dox@PMSN90
pH 5_Dox@PMSN150 pH 7_Dox@PMSN150
pH 5_Dox@MSN45
pH 5_Dox@MSN90 100
pH = 5
40 pH 5_Dox@MSN150
Cumulative release (%)

Cumulative release (%)
pH 7_Dox@MSN45
pH 7_Dox@MSN90 80
30 pH 7_Dox@MSN150 100 i)
Cumulative release / %
80
60
60
20 40
20
40
0
0 2 4 6 8 10
10 Time / h
20 pH = 7
0
0 20 40 60 80 100 120 140 0
Time (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Time (h)
Figure 3.4. Doxorubicin release profiles from pure MSNx (a) and PMSNx (b). Inset figure in b (i) shows the Dox
release profiles from PMSNx up to 10 h.
96
Figure 3.5. a) 29Si MAS NMR spectrum of pure MSNx; b) 31P MAS NMR spectrum of PMSNx; c) 13C CP MAS
NMR spectrum of PMSNx and d) 29Si MAS NMR spectrum of PMSNx. Similar spectra were obtained regardless
the size of the nanoparticles. e) Zeta potential profile of the nanoparticles. f) Schematic representations of the
surface of MSNx and PMSNx, with their corresponding active sites and respective pKa.
To improve the loading and the release efficiency of positively charged water-soluble drugs under physiological
conditions (e.g., Dox, pKa = 8.3), we functionalized the surface of MSNx with phosphonate groups. For this, a
phosphonate silane (THMP, trihydroxysilylpropyl methylphosphonate) was grafted onto MSNx according to a
new postgrafting strategy. Phosphonate groups (pKa = 2) are expected to increase the surface electronegativity
of MSNs and their stability in physiological conditions.30, 33 Furthermore, phosphonate grafting could improve
blood compatibility of the silica nanoparticles. Indeed, it was shown that THMP grafting greatly reduced
nonspecific protein adsorption on the MSNs surface and exhibited similar performance as polyethylene glycol
97
(PEG) grafting.272 In previous reports, MSN functionalization with phosphonate groups had always been based
on the co-condensation method (i.e., adding the organosilane during the synthesis as silica source in addition
to TEOS).30, 33, 272 In this way, a fraction of phosphonate groups are “inactive sites” for drug loading because they
appear to be trapped and incorporated into the pore walls of the silica framework. 63 In addition, the co-
condensation method leads to highly hydroxylated nanoparticles. Consequently, a high fraction of silanol groups
on the surface is present, including Q2 silanols species.63
For these reasons, we decided to develop a postgrafting method, which seemed more suitable to reach our
goals (Dox adsorption and release). Conventional postgrafting strategies reported so far (e.g., in organic or
alcohol media; under inert conditions and reflux) were impractical for the grafting of the phosphonate silane (as
demonstrated in this study; see details in Supporting Information). To circumvent that impairment, we developed
a particular postgrafting strategy, which is carried out in water, under reflux and in acidic conditions (see details
in Experimental section). The weight percentage (w/w) of grafted phosphonated silane molecules (THMP) was
measured by TGA (Figure S3.3, Supporting Information-section 3.5) and it equals to 8.8%, 9.3%, and 9.6% for
PMSN45, PMSN90, and PMSN150, respectively. The successful grafting of the phosphonate silane on MSNx
(PMSNx: PMSN45, PMSN90, and PMSN150) was confirmed by solid state NMR. Figure 3.5-b shows 31P MAS NMR
profiles indicating the presence of phosphonate species (ROP(O)CH3O−) with an intense single peak appearing
at 25.8 ppm. The 13C CP/MAS NMR spectrum (Figure 3.5-c) revealed characteristic peaks of THMP (peak
attributions are displayed in Figure 3.5). More interestingly, the 29Si MAS NMR spectrum of PMSNx (Figure 3.5-
d) showed a sharp decrease in Q3 groups compared to pure MSNx (Figure 3.5-a) accompanied by a quasi-total
elimination of Q2 silanol species after postgrafting of the phosphonate groups. This is due to the condensation
between free silanols on the MSNx surface and silanol groups of THMP. Indeed, Figure 3.5-d shows the
presence of Tn groups (C−Si(OSi)n(OH)3−n) between −50 and −70 ppm originating from the silicon of the
covalently grafted phosphonate silane. Furthermore, a decrease in pore volume, specific surface area, and pore
size was observed after THMP postgrafting (Table 3.1). This is in good agreement with the introduction of
phosphonate groups on the surface of MSNx. Nevertheless, a quite high porosity remained available for Dox
loading: the surface area, the total pore volume, and the mean pore size of PMSNx samples were around 900
m2 g−1, 0.7 cm3 g−1, and 3 nm, respectively (Table 3.1). In addition, the colloidal stability of MSNx was conserved
after phosphonate grafting without any significant evidence of agglomeration or flocculation in aqueous and
saline solutions (Figure 3.3-c,d and Table S3.2 in Supporting Information-section 3.5).
Phosphonate grafting had a considerable impact on the electronegativity of the nanoparticles as demonstrated
by zeta potential measurements (Figure 3.5-e). This implies a more effective electrostatic binding of Dox into
the MSNs pores, from where the drug could be subsequently easily released by acidification of the medium
under abiotic and also biotic conditions. Indeed, the Dox loading efficiency of phosphonate-MSN x is highly
98
improved (7× increase). PMSNx showed a remarkably high adsorption capacity reaching 14% (w/w) (13.1%,
13.7%, and 14.1% (w/w) for PMSN45, PMSN90, and PMSN150, respectively). Such enhancement in Dox
adsorption capacity might be attributed to the electrostatic interactions taking place between positively charged
Dox (DoxH+) molecules and the negative phosphonate groups (ROP(O)-CH3O−) as well as with the remaining
deprotonated Q3 silanol groups (SiO−). Furthermore, this great loading capacity is twice higher than
phosphonated MSNs prepared by the co- condensation method.33 This could be attributed to the high efficiency
of this developed postgrafting strategy, compared to the co-condensation method.
An efficient size-dependent and pH-dependent release of doxorubicin was achieved with the PMSN x systems,
as demonstrated by the pharmacokinetics studies (Figure 3.4-b). The drug release was achieved in a time- and
pH-dependent manner. A similar trend of Dox release profiles at pH 7.4 and pH 5 was observed. Figure 3.4-b
shows also an increase in the Dox release rate with the decrease in the nanoparticle size. Under acidic
conditions, a progressive high drug release was observed in the first 12 h (inset in Figure 3.4-b). It reached 93%
when using small nanoparticles (PMSN45), 79% for PMSN90, and 60% with for larger particles (PMSN150). The
highest burst effect was clearly observed for the smallest nanoparticles. Close to 30% of drug dose was released
during the first hour vs. 23% for PMSN90 and only 10% for larger particles (PMSN150). After 6 days, a subsequent
slow release was observed, and the total cumulative release of Dox reached 100%, 93%, and 80% from PMSN 45,
PMSN90, and PMSN150, respectively. The cumulative releases of Dox under acid conditions are about five times
higher than those observed in PBS at pH 7.4 (Figure 3.4-b). The low release level at pH 7.4 and the higher
values achieved under more acidic conditions are related to the electrostatic interactions between Dox and
adsorption sites at the surface of the nanoparticles (phosphonate and Q 3 silanol groups). Indeed in neutral pH
(pH 7.4), Dox (pKa = 8.2) is positively charged (DoxH+) and strongly bound to the predominant negatively
charged phosphonate and silanol species (ROP(O)-CH3O− and SiO−, respectively). However, by lowering of the
pH, Dox remains positively charged and the (ROP(O)CH3O− and SiO− groups become more and more
protonated (ROP(O)CH3OH and SiOH), inducing the release of Dox. This proton-sensitive mechanism indicates
the possibility to trigger intracellular drug release once the particles are internalized in cells, enhancing therefore
drug efficiency and reducing deleterious effects of free anticancer agents during chemotherapy. The size-
dependent drug release was fitted by a simple mathematical model, in order to extract pharmacokinetic data. In
vitro release data of Dox from PMSNx, at pH 5 and pH 7.4, were fitted using the semiempirical power law equation
below:253
Mt
 k tn
M
99
where Mt is the amount of the drug released at time t (in hours); M∞ is the total amount of the loaded drug; k is
the kinetic release constant; and n is a release factor.
The n value indicates the type of drug release mechanism and the k value provides information on the release
rate.253 Both values (n and k) could be calculated from Higuchi’s model (cumulative % drug release vs. square
root of time) or a Korsmeyer-Peppas plot (log of cumulative % drug release vs log time). Plots are presented in
Figure S3.4 (Supporting Information-section 3.5) and the deduced results (n and k values) are compiled in Table
3.2.
Sample Release exponent n Kinetic constant k [wt.% (hn)-1]

pH 5_Dox@ PMSN45 0.50 38.9
pH 5 pH 5_Dox@ PMSN90 0.51 25.1
pH 5_Dox@ PMSN150 0.58 14.1
pH 7_Dox@ PMSN45 0.7 6.9
pH 7 pH 7_Dox@ PMSN90 0.71 4.6
pH 7_Dox@ PMSN150 0.75 3.3
Table 3.2. Release kinetics parameters. Release kinetics parameters were obtained for profiles up to 90% of
total amount released.
The release exponents (n) in the more acidic medium (phosphate buffer at pH 5) were close to 0.5 for all PMSNx
sizes (45, 90, and 150 nm), and thus presented pure Fickian diffusion. This means that the drug released from
phosphonated nanoparticles mainly follows a model based on the diffusion from the pores. The kinetic release
constant (k), which is directly correlated to the release rate, increased with the decrease in particle size (k =
38.9; 25.1 and 14.1 wt % (hn)−1 for PMSN45, PMSN90, and PMSN150, respectively). The kinetic release constant
for small phosphonated nanoparticles (45 nm) was ≈3 times higher than that for larger phosphonated
nanoparticles (150 nm). This is in good agreement with the increase factor of the nanoparticle size (the size of
PMSN45 is ≈3 times smaller than PMSN150). Consequently, this phenomenon might be attributed to mesoporous
channel lengths and to the drug diffusion rate from the pores. Pore channels and diffusion distances appear
shorter in the smaller nanoparticles compared with the bigger ones. This results in more rapid drug release
kinetics. In addition, the outer/inner surface ratio of the particles is higher for the smaller MSNs compared to the
bigger ones, which increases the initial amount of drug released in the first minutes (burst effect), as has been
observed for the release of Dox in the first hour. It also increases the k value. Meanwhile, a more progressive
and prolonged release was achieved with larger particles (e.g., 150 nm). At pH 7.4, the release exponent (n
value) shifted to 0.7 (Table 3.2), implying a non-Fickian release model, and the kinetic release constant (k value)
was much lower than that at pH 5 (5 times lower, Table 3.2). The kinetic release constant exhibited also a size-
100
dependent behavior (k = 6.9; 4.6 and 3.3 wt % (hn)−1 for PMSN45, PMSN90, and PMSN150, respectively). Those
phenomena are most probably due to a combination of diffusion and erosion-controlled release. Such so-called
“erosion” release is attributed to the degradation behavior of PMSNx nanoparticles at pH 7.4, a phenomenon
that was also observed for MSNs submitted to simulated biological medium (pH 7.4). 85
Based on these in vitro drug release profiles and extracted pharmacokinetic data, sub-50 nm nanoparticles (45
nm) and conventional sized MSNs (150 nm) were chosen for an effective comparative intracellular and in vivo
drug release studies.
3.2.3 Cell Uptake Studies and Biocompatibility

The cellular uptake of PMSNx was investigated by TEM. For this, two human tumor cell lines were used: M21, a
skin melanoma; and HT1080, a highly tumorigenic fibrosarcoma. Small and large phosphonated nanoparticles
entered cancer cells within 5 h of incubation and were entrapped in intracellular compartments (vesicles: e.g.,
lysosomes) through a nonspecific adsorptive endocytosis (Figure 3.6). A size-dependence in cell uptake
efficiency was also observed: it seemed much higher when using the smallest nanoparticles (PMSN 45),
compared to larger ones (PMSN150). This suggests that the physicochemical properties of phosphonated
nanoparticles have significant impact on cell uptake. Higher apparent cell uptake might be attributed to the much
higher external surface of the small-sized MSNs, compared to larger ones. More nanoparticle−cell interactions
lead to much stronger nanoparticle cell uptake.
101
Figure 3.6. TEM images of HT1080 and M21 incubated with PMSN45 (a and b, respectively) and PMSN150 (d
and e, respectively); e) PMSN45 nanoparticles taken up in vesicles and f) PMSN150 nanoparticles taken up in
vesicles.
In vitro cytotoxicity studies were also performed with PMSNx systems using the HT1080 and M21 cell lines,
based on the resazurin (cell proliferation) assay. Small and large nanoparticles showed no significant cytotoxicity
and anti-proliferative effect for cells at concentrations up to 250 μg mL−1 and for incubation times up to 72 h
(Figure 3.7). These results indicate desirable innocuousness of such nanocarriers (i.e., the phosphonated
nanoparticles) for therapeutic drug delivery applications.
102
24 h 48 h 72 h
PMSN45 PMSN150
120
a) 120
b)
100 100
Cell viability (%)
Cell viability (%)

80 80
60 60
M21 cells
40 40
20 20
0 0
0 1.9 3.9 7.8 15.5 31.5 62.5 125 250 0 1.9 3.9 7.8 15.5 31.5 62.5 125 250
Concentration (µg mL-1) Concentration (µg mL-1)
120
c) 120
d)
100 100
Cell viability (%)

Cell viability (%)
80 80
HT1080 60 60
cells
40 40
20 20
0 0
0 1.9 3.9 7.8 15.5 31.5 62.5 125 250 0 1.9 3.9 7.8 15.5 31.5 62.5 125 250
Concentration (µg mL-1) Concentration / µg mL-1
Figure 3.7. Cell viability assay of M21 and HT1080 cells incubated with PMSN 45 (a and c, respectively) and
PMSN150 (b and d, respectively) for 24 h, 48 h and 72 h.
3.2.4 Intracellular Drug Release and in vitro Cytotoxicity

To investigate the size effect on the intracellular drug release, the phosphonated nanoparticles were labeled
with a fluorescent agent (Alexa Fluor® 488 covalently grafted on silica nanoparticles), before Dox loading. These
nanoparticles are referred to as Dox@PMSN45-F and Dox@PMSN150-F, (F: Alexa Fluor® 488). In this study,
M21 and HT1080 cancer cells were incubated for 2 h and for 24 h with the nanoparticles. Merged fluorescent
microscopic images of M21 cells and the corresponding cross-section image analysis (Figure 3.8) confirmed
that small and large nanoparticles were internalized into the cells in a size-dependent manner. They suggest
also that, after endocytosis of the nanoparticles, doxorubicin was efficiently released from the nanoparticles and
reached the nucleus in a time- and particle size-dependent manner. At 2 h, the orange/yellow fluorescence
points (i.e., merge of the green fluorescence of PMSN45-F and the red fluorescence of Dox) were located into
the cytoplasm of the cells (Figure 3.8-a,e). This indicates that small nanoparticles (Dox@PMSN 45-F) were
already efficiently endocytosed by the cells and a major fraction of Dox was not released yet from the
nanoparticles after 2 h of incubation. In contrast, the orange/yellow fluorescence points, observed when using
103
larger Dox-loaded nanoparticles (Dox@ PMSN150-F), were particularly located at the interface cytoplasm/cell
membrane (Figure 3.8-b,f). At 24 h, significantly improved uptake efficiency was observed (Figure 3.8-c,d,g,h).
In addition, the uptake efficiency was closely related to the size of the nanoparticles. It was higher with 45 nm
nanoparticles (Figure 3.8-c,g) than that observed with 150 nm nanoparticles (Figure 3.8-d,h), as observed in our
TEM cell uptake study. These observations establish that small nanoparticles (45 nm) were internalized more
easily and faster than larger nanoparticles (150 nm). Moreover, after 24 h of incubation, the red fluorescence,
related to the released doxorubicin in merged fluorescent images, is mainly observed in the nucleus. This
establishes that a significant fraction of Dox was already released from the nanoparticles and had diffused and
transferred into the cell nuclei. Another fraction of Dox remained in the pores of the silica nanoparticles, as some
yellow/orange fluorescence points are also observed in the cytoplasm (Figure 3.8-c,d and Figure S3.5,
Supporting Information-section 3.5). In addition, green fluorescence points in the merged fluorescent images,
related to nanoparticles once Dox is released, are localized in the cytoplasm. This suggests that after their
endocytosis, the nanoparticles will be localized into lysosomes. Then, free doxorubicin is released from the
nanoparticles into these acidic intracellular compartments. Finally, Dox is subsequently released from the
lysosomes, probably through a proton pump mechanism,33 and diffuses into the nucleus. Similar results were
obtained when incubating the nanoparticles with HT1080 cells (Figure S3.6, Supporting Information-section 3.5).
104
Figure 3.8. Fluorescence images (obtained at 60×) of M21 cells incubated with Dox@PMSN 45-F and
Dox@PMSN150-F for 2 h 30 (a and b, respectively) and 24 h (c and d, respectively). Red fluorescence: Dox;
green: Alexa-Fluor®488 grafted on nanoparticles; yellow/orange: merged of red and green signals; blue: anti-
mouse IgG Alexa Fluor®408 (stains the cytoplasm of human cancer cells). e-h) cross-section images analysis
based on line-scanning profile of green and red fluorescence intensity (green and red curves, respectively).
To harmonize our findings with the improved cancer cell growth inhibition, in vitro cytotoxicity (antiproliferative
activity) of Dox@PMSNx was evaluated with M21 and HT1080 cells (Figure 3.9). Cells were incubated with either
small or large Dox-loaded nanoparticles (Dox@PMSN45 and Dox@PMSN150) or free Dox for 24, 48, and 72 h.
Figure 3.9 confirms that the longer the incubation time of Dox@PMSN45 and Dox@PMSN150 with the tumor cells,
the higher is the antiproliferative effect. Interestingly, the cell growth inhibition efficacy of both Dox-loaded
nanoparticles was higher than that observed with free Dox, at equal concentrations. In addition, the
antiproliferative activity of Dox-loaded nanoparticles was related to nanoparticle sizes. The half-maximal
inhibitory concentration (IC50) values of Dox@PMSNx decreased in parallel with the increase in size of the
phosphonated nanoparticles (Figure 3.9 and Table S3.3 where IC50 values were compiled, Supporting
Information-section 3.5). The IC50 values of the small nanoparticles were approximately 2 times lower than that
of larger nanoparticles, after 48 and 72 h of incubation. The maximum difference between IC50 values was found
at 72 h for M21 cells (IC50 = 0.17, 0.32, and 0.48 μg mL−1 for Dox@PMSN45, Dox@PMSN150, and free-Dox,
respectively) and at 48 h for HT1080 cells (IC50 = 0.03, 0.07, and 0.13 μg mL−1 for Dox@PMSN45,
Dox@PMSN150, and free Dox, respectively). On the basis of IC50 values, it is possible to rank the antiproliferative
activity as follows: Dox@PMSN45 > Dox@ PMSN150 > free Dox. This might be attributed to the efficient size-
dependent cellular uptake of Dox-loaded nanoparticles and to the efficient pH-responsive release of doxorubicin
in a particle size-dependent manner.
105
M21 cells HT1080 cells
a) b)
100 100
24 h 24 h
80 80
Cell viability (%)

Cell viability (%)
60 60
40 40
Dox@PMSN150 Dox@PMSN150
20 20 Dox@PMSN45
Dox@PMSN45
Free Dox Free Dox
0 0
0.1 1 10 0.01 0.1 1
Dox concentration (µg mL-1) Dox concentration (µg mL-1)
c) d)
100 100
48 h 48 h
80 80
Dox@PMSN150
Cell viability (%)

Cell viability (%)
60 Dox@PMSN45
Free Dox 60
40
40
20
Dox@PMSN150
20 Dox@PMSN45
0
Free Dox
0
0.1 1 10 0.01 0.1 1
e) f)
100 100
72 h 72 h
80 80
Cell viability (%)
Cell viability (%)
Dox@PMSN150 Dox@PMSN150
60 Dox@PMSN45 Dox@PMSN45
60
Free Dox Free Dox
40
40
20
20
0
0
0.1 1 10 0.01 0.1 1
Figure 3.9. In vitro cytotoxicity of Dox@PMSN45, Dox@PMSN150 and free Dox against M21 cells and HT1080
cells at different Dox concentrations for 24 h (a and b, respectively), 48 h (c and d, respectively) and 72 h (e
and f, respectively).
106
3.2.5 In vivo Drug Release and Tumor Control
For in vivo studies, intratumoral and intravenous injections of Dox-loaded nanoparticles and free Dox were
performed on M21 and HT1080 tumors grafted onto the chorioallantoic membrane of developing chick embryos.
Dox-loaded nanoparticles (Dox@PMSN45 and Dox@PMSN150) were injected directly into the solid M21 tumors.
Unloaded nanoparticles and a saline solution were also injected as controls. At 1 and 18 h postinjection, tumors
were collected and ex vivo fluorescence imaging was performed to investigate the kinetics of drug release into
the tumor matrix. Ex vivo images of the tumors are displayed in Figure 3.10 after subtraction of the fluorescence
of background (fluorescence of tumors obtained with the control). At 1 h, the fluorescence from doxorubicin was
located in one single point. At 18 h, the fluorescence has diffused in a wider area that seems to be larger in
tumors collected after injection of the smallest Dox-loaded nanoparticles (Dox@PMSN 45).
Figure 3.10. Ex vivo fluorescence images of M21 CAM tumor model treated with Dox@PMSN45 and
Dox@PMSN150 after 1 h (a and b, respectively) and 18 h (c and d, respectively) of post-intratumoral injection.
Images were obtained with IVIS Lumina II imaging system.
To strengthen these observations with semiquantitative visual study, immunohistofluorescence analyses were
performed on the M21 tumors (Figure 3.11). At 1 h post administration, the red fluorescence of Dox was mainly
located around the injection site, for both Dox@PMSN45 and Dox@PMSN150 (Figure 3.11-a−c). At 18 h, the red
fluorescence had well diffused into the tumor matrix. The deep tumor penetration was clearly nanoparticle size-
107
dependent and the highest intratumoral diffusion was observed for Dox@PMSN 45 (Figure 3.11-d,e). This latter
seems to be twice as deep as that of Dox@PMSN150 (Figure 3.11-f), in terms of diffusion depth. This diffusion
could be related to the release of doxorubicin from the nanoparticles or to the diffusion of Dox-loaded
nanoparticles (no Dox release) into the tumor matrix. To clarify these hypotheses, Dox@PMSN 45-F and
Dox@PMSN150-F were also injected into M21 tumors, and the same study was performed. At 1 h, Dox@ PMSN x-
F nanoparticles were mainly localized around the injection site, and doxorubicin was not yet released from the
nanoparticles regardless of particle size. Indeed, after merging, colocalization of the green fluorescence of
nanoparticles, the red fluorescence of doxorubicin, and the blue fluorescence of labeled cancer cells, was
observed (Figure 3.11-g,h). In contrast, at 18 h, nanoparticles (green fluorescence) and doxorubicin (red
fluorescence) were not colocalized and started diffusing into the intratumoral environment (Figure 3.11-j,k,l). The
nanoparticles remained at the periphery of the tumor and doxorubicin had well diffused into the tumor matrix,
suggesting that Dox was thus efficiently released from the nanoparticles. Once the nanoparticles diffused into
the tumor matrix (e.g., acidic extracellular tumor fluid), doxorubicin was released based on a pH-sensitive
mechanism and diffused then efficiently into the tumor tissue. Nanoparticle intratumoral diffusion as well as Dox
release and diffusion into the dense collagen tumor matrix were size-dependent. They were more pronounced
with the smallest nanoparticles, in term of diffusion depth (Figure 3.11-j,k vs Figure 3.11-l). The released Dox in
the extracellular tumor environment might cross the plasma membrane of cancer cells by passive diffusion,
increasing therefore the intracellular drug concentration and leading to tumor growth inhibition.
108
Figure 3.11. Fluorescence images of M21 CAM tumor treated with small Dox-loaded nanoparticles (45 nm)
and large Dox-loaded nanoparticles (150 nm) after 1 h and 18 h of post-intratumoral injection. Red: Dox;
green: Alexa Fluor®488 grafted on nanoparticles; blue (dark or pale or flashy blue): anti-mouse IgG Alexa
Fluor®408 (selectively stains human cancer cells and the tumor tissue in the CAM tumor model); yellow/pale
turquoise: merged of the red, green and blue fluorescence.
To study the effect of nanoparticle size on in vivo drug delivery and tumor growth inhibition, Dox@PMSN45 and
Dox@PMSN150 were administered as a single intravenous injection into chicken embryos (100 μL of
nanoparticles suspension, [NPs] = 3.5 mg mL−1; injected dose of Dox = 50 μg/egg). For this study, HT1080
fibrosarcoma tumors were grafted onto the chick embryo’s chorioallantoic membrane. We also included a saline-
treated control as well as a group of embryos treated with unloaded nanoparticles (without doxorubicin). Seven
days postdrug administration, tumor tissues were excised for accurate weighing and comparative quantitative
analysis of the tumor growth inhibition effect (Figure 3.12; n = 11 for each condition). Treatment with Dox-loaded
nanoparticles clearly reduced tumor growth compared to the saline-treated control. No significant tumor growth
109
inhibition was observed with unloaded nanoparticles, confirming that the obtained tumor growth inhibition was
related to Dox delivery. More interestingly, the tumor growth inhibition was significantly nanoparticle size-
dependent. Dox@PMSN45 showed a higher rate of tumor shrinkage than that observed with Dox@PMSN 150. A
remarkable reduction in the relative tumor weight was observed for chick embryos treated with Dox@PMSN 45
that reached 40% ± 6%, compared to 25% ± 10% of tumor growth inhibition when treated with Dox@ PMSN 150.
The difference was statistically significant (p < 0.05).
Relative tumor weight (%)
100
**
80
**
60
40
Figure 3.12. HT1080 CAM tumor weight at t = 7 days (n = 1 for each condition), normalized to the weight of
tumors at t = 0. Embryos were treated with Dox-containing MSNs (Dox@PMSN 45 and Dox@PMSN150), as well
as their "pure" (non-Dox) counterparts (PMSN45; PMSN150). *: Results were statistically significant (p < 0.05).
These observations might be consistent with the increase of EPR effect when the nanoparticle size decreases,
leading to more efficient accumulation of nanoparticles into the tumor and to better drug delivery. This is also in
agreement with the more pronounced intratumoral Dox release and diffusion that were obtained with small
nanoparticles, leading to better tumor growth inhibition.
3.3 Conclusion
In this contribution, we have demonstrated that particle size tuning of MSNs and their surface functionalization
with phosphonate groups constitute major factors to ensure an efficient drug delivery strategy and to control the
110
drug release rate of doxorubicin. Sub-50 nm MSNs nanocarriers (phosphonated MSNs, 45 nm) have superior
ex vitro, in vitro, and in vivo drug-elution and delivery performances compared to larger ones. This should be
ascribed to the combination of the strong biocompatibility, colloidal stability, efficient passive targeting,
intratumoral diffusion, intracellular retention, and fast controlled release of such small phosphonated
nanoparticles. These small nanoparticles have strong potential for the therapeutic delivery of drugs and may find
significant applications in the treatment of different types of cancers. Finally, this investigation of the effect of
particle size on drug delivery and elution performances represents a key step toward the development of tailored-
made nanovectors for emerging applications in nanomedicine.
3.4 Experimental Section

3.4.1 Materials
(EO106PO70EO106, BioReagent), 3-(trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate monosodium salt solution 50 wt %
in H2O (THMP), and (3-aminopropyl)-triethoxysilane (APTES) were purchased from Sigma-Aldrich (Canada).
Triethanolamine and doxorubicin (Dox, doxorubicin hydrochloride salt >99%) were obtained from Alfa-Aesar
(Canada) and LC laboratories (U.S.A.), respectively. Alexa fluor 488 NHS-ester and Alexa fluor 405 goat
antimouse IgG were purchased from ThermoFisher Scientific/Life Technology (Canada). Mouse G3BP1 (TT-Y,
GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein) was from Santa Cruz biotechnology, Inc. (Canada).
3.4.2 Small-Sized MSNs (45 nm Diameter)

CTAB (663.2 mg), F127 (2.68 g) and triethanolamine (15.64 g) were dissolved in EtOH 100% (57 mL) and water
(125 mL), followed by overnight stirring. TEOS (2.56 mL) was added at room temperature (RT) under high stirring
rate (1000 rpm) for 1 min. The reaction mixture was then aged for 24 h under static conditions (air, RT). After 24
h, 200 mL of ethanol (95%) was added to the obtained translucent, colloidal suspension of the obtained
mesoporous material, in order to facilitate the centrifugation step. The resulting product was then collected by
centrifugation (10 000 rpm), washed twice with water, and dried overnight in air at 65 °C. Finally, the product
was calcined (air, 550 °C, 1 °C min−1, 5 h). The resulting nanoparticles are designated as “MSN45”.
3.4.3 Intermediate-Sized MSNs (300, 150, and 90 nm Diameter)

A synthesis procedure was modified from the method reported by Kim et al.77 Briefly, CTAB (1.0 g) and F127
(“x” g; x = 2, 4, 8 for MSNs with medium particle size of 300, 150, and 90 nm, respectively) were dissolved in
EtOH 100% (85 mL) and 2.9 wt % NH4OH solution (213 mL). Then, TEOS (3.86 mL) was added at room
temperature (RT) under high stirring rate (1000 rpm) for 1 min. The reaction mixture was then aged for 24 h
under static conditions (air, RT). The resulting product was collected by centrifugation (10 000 rpm), washed
111
twice with water, and dried overnight in air at 65 °C. Finally, the product was calcined (air, 550 °C, 1 °C min−1,
5 h). The resulting nanoparticles are designated as “MSNx”, where “x” is the mean particle size in nanometer
scale (namely, 300, 150, or 90 nm).
3.4.5 Large-Sized MSNs (500 nm Diameter)

CTAB (663.2 mg) and triethanolamine (15.64 g) were dissolved in EtOH 100% (57 mL) and 2.9% NH4OH
aqueous solution (141 mL). TEOS (2.56 mL) was added, and the product was treated exactly as aforementioned.
The resulting nanoparticles are designated as “MSN500”.
3.4.6 Functionalization of MSNs with Phosphonate

A total of 0.13 mL of THMP was dissolved in water (13 mL), and the initially highly basic pH of the solution (pH
= 12.1) was adjusted to slight acidic pH (pH should be between 5 and 6). This acidification is very important to
avoid silica hydroxylation and dissolution during the grafting process and to catalyze the condensation between
silanol groups on silica surface and silanol groups of the phosphonate silane (THMP). Then, this solution was
added to the pure MSNx suspension (100 mg in 13 mL of water), followed by overnight reflux at 100 °C. The
functionalized MSNs was isolated by centrifugation (7500G, 10 min), washed three times with water and twice
with ethanol, and dried. The resulting products are designated as “PMSNx” (“x” = mean initial particle size, in
nm).
3.4.7 Functionalization of MSNs with Fluorophores

Fluorescent nanoparticles were prepared by grafting the fluorophore Alexa Fluor® 488. For this, APTES (1%,
molar ratio APTES/TEOS) was added to the reaction after the addition of TEOS for MSN 150 and MSN45,
respectively. Then, a solution of Alexa Fluor® 488 NHS ester (1 mg mL−1 in anhydrous DMSO) was added to
the suspension of MSNx-APTES (100 mg in 10 mL of HEPES buffer pH = 8). The mixture was kept under gentle
stirring for 1 h, in the dark. The suspension was centrifuged (7500G, 10 min) and the supernatant discarded.
The solid residue was washed three times with HEPES buffer and twice with water and dried. The resulting
nanoparticles are designated as “PMSNx-F”.
3.4.8 X-Ray Diffraction Characterization

XRD measurements were performed using a Siemens D5000 (reflection, θ−θ configuration; Cu Kα: λ = 1.541 Å;
40 kV; 30 mA; 1−8° 2θ, step size: 0.02 2θ; 0.02 s/ step). The Jade (v 2.1) software coupled with JCPDS and
ICDD (2001 version) databases was used to analyze the XRD data.
112
3.4.9 Nitrogen Physisorption Analysis
Nitrogen physisorption measurements were performed at −196 °C with an Autosorb iQ2 (Quantachrome
Instrument, Boynton Beach, U.S.A.). Before the sorption measurements, the samples were outgassed under
vacuum at 200 °C for 12 h (for pure MSNs) or 80 °C for 10 h (for functionalized MSNs). The surface area (SBET)
was determined using the BET equation in the range 0.05 ≥ P/P0 ≥ 0.20, and the total pore volume was obtained
at P/P0 = 0.92. Pore diameter was estimated using nonlocal density functional theory (NLDFT) methods applying
adsorption branch model (considering N2 sorption at −196 °C in silica with cylindrical pore geometry).215
3.4.10 Thermogravimetric Analysis (TGA)

Measurements were performed using a Netzsch STA 449C thermogravimetric analyzer, under airflow of 20
mL/min, with a heating rate of 10 °C/min, between 35 and 700 °C. The percentage of grafted phosphonate
groups was calculated based on the mass loss between 200 and 630 °C. The residual solvent (e.g., physisorbed
water) was excluded from the calculation.
3.4.11 TEM Size Analysis

The nanoparticles were dispersed in water, and the suspension (5 μL) was deposited on a carbon-coated copper
grid and dried for at least 24 h. Images were taken with a JEM-1230 TEM at an accelerating voltage of 80 kV.
Particle size distributions were calculated by ImageJ, based on a sample of at least 500 particles, from different
images taken over different quartiles.
3.4.12 Dynamic Light Scattering and Zeta Potential Measurements

The hydrodynamic diameter of the nanoparticles was measured by dynamic light scattering (DLS) using a
Malvern DTS Nano zetasizer 173° (equilibration time set to 3 min; three measurements taken on each sample;
only quality criteria data accepted as valid results). Zeta potential dependence on pH was obtained with the
same equipment, by measuring the zeta potential in phosphate buffers (0.1M).
3.4.13 NMR Characterization

Solid-state magic-angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were obtained on a Bruker
DRX300 MHz NMR spectrometer. The 75.4 MHz 13C cross polarization (CP)/MAS, the 121.4 MHz 31P MAS, and
the 59.6 MHz 29Si MAS NMR spectra were obtained using a 4 mm rotor spinning at 10 kHz. The chemical shifts
are reported in ppm relative to adamantane for 13C, to phosphoric acid for 31P, and to tetramethylsilane (TMS)
for 29Si.
113
3.4.14 MSN Drug Loading and in vitro Drug Release Assays
Pure MSNx as well as functionalized nanoparticles (PMSNx) were loaded with doxorubicin (Dox). For this, 25 mg
of nanoparticles were suspended in a doxorubicin solution (5 mg mL−1 in water at pH = 7.9). The suspension
was shaken for 24 h at RT in the dark. Doxorubicin-loaded nanoparticles (Dox@MSN x and Dox@PMSNx) were
obtained by centrifugation and washed very carefully five times and then dried under vacuum. The total Dox
loading was evaluated by UV−visible spectroscopy. In vitro release studies: PBS (1×; pH = 7.4) and phosphate
buffer solution (1×; pH = 5) were used to mimic in vivo conditions. The Dox-loaded nanoparticles (5 mg) were
soaked in 5 mL of each medium at 37 °C. At time points, particles were centrifuged, and then 1 mL of the
supernatant (release medium) was removed and replaced with fresh medium (1 mL). The percentage of released
doxorubicin was evaluated by recording the absorbance of the supernatant at 480 nm, using a Varian
UV−Vis−NIR Cary 500 Scan spectrophotometer.
3.4.15 Cell Viability Study

Cell viability was determined by the resazurin−resorufin assay (mitochondrial function). Briefly, human skin
melanoma cells (M21) and human fibrosarcoma cells (HT1080, highly tumorigenic) were incubated at 37 °C in
96-well plates for 24, 48, and 72 h, with different concentrations of nanoparticles (pristine and Dox-loaded
PMSNx). Then, 7-hydroxy-10-oxidophenoxazin-10- ium-3-one (resazurin) was added to the cell suspensions,
which is reduced by viable cells into the fluorescent resorufin (7-hydroxy-3- isophenoxazin-3-one) derivative.
After 2 h, the reaction of resazurin into resorufin was quantified by fluorescence measurements (excitation, 530
nm; emission, 590 nm) with a SpectraMax i3x (Molecular devices). Results were performed in triplicate and
expressed as a percentage of the total fluorescence measured in the control cells (mean ± standard deviation).
3.4.16 Nanoparticle Cell Uptake Study

Cells were seeded on glass coverslips in a 24-well plate and cultured at 37 °C in an incubator. After 24 h, the
cells were treated with 25 μg mL−1 of nanoparticles (Dox@PMSN45-F and Dox@PMSN150-F) for 2 and 24 h,
washed with PBS at least 3 times, and then fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min at room
temperature. Finally, the glass coverslips were washed with PBS. Immunofluorescence staining and microscope
observation: Following fixation, the glass coverslips were immersed in a solution of BSA 3% + saponine 0.1%
and placed in an incubator at 37 °C for at least 45 min, and the cells were then incubated at RT for 1 h and 30
min with 40 μL of diluted G3BP1 (a protein that localizes into the cytoplasm in proliferating cells). After being
rinsed with PBS + 0.05% Tween 80 three times, antimouse IgG Alexa Fluor®405 dye was conjugated to G3BP1
by incubating the cells with 40 μL of the corresponding diluted solution (1:1000) at RT for 1 h. Finally, glass
coverslips were washed and then mounted on Superfrost glass microscope slides. Images were collected using
an Olympus (BX51) fluorescence microscope. The contrast in Figure 3.8-a,b was enhanced with ImageJ
114
software to better observe the blue fluorescence. No further adjustments of the fluorescent images were
performed for the rest. Transmission electron microscopy cell uptake study: 2 × 105 cells were incubated for 5
h with nanoparticles (PMSN45 and PMSN150; [NPs] = 200 μg mL−1). Then, the cells were collected by
centrifugation and fixed using 2.5% glutaraldehyde for 48 h at 4 °C, followed by dehydration in a graded series
of ethanol solutions. Finally, they were embedded in epoxy resin and stained with uranyl acetate. Thin sections
were processed with an ultramicrotome (Leica JUNG RM2065) and visualized in TEM (Jeol JEM-1230, 80 kV).
3.4.16 Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane Assay

Fertilized chicken eggs were purchased from Couvoirs Victoriaville (Victoriaville, Québec, Canada) and
incubated for 10 days in a Pro-FI incubator fitted with an automatic egg turner before being transferred to a Roll-
X static incubator for the rest of the incubation time. The eggs were kept at 37 °C in a 60% humidity atmosphere
for the whole incubation period. At 10 days, a hole was drilled (Dremel, Racine, WI) on the side of the embryo,
and a negative pressure was applied to create a new air sac. A window was opened on this new air sac, which
was covered with transparent adhesive tape to prevent contamination. Freshly prepared cell suspensions (M21
or HT1080 cancer cells) were applied directly onto the freshly exposed chorioallantoic membrane (CAM) tissue
through the window: 3.5 × 105 cells/egg for HT1080 cells and 1.5 × 106 cells/egg for M21 cells. Intratumoral
injection: on day 17, the embryos were submitted to low temperature conditions (30 min at 4 °C) to minimize
motion. Then, 2.3 μL of a suspension of nanoparticles (unloaded MSN45, unloaded MSN 150, Dox@PMSN45,
Dox@PMSN150, Dox@PMSN45-F, and Dox@PMSN150-F) in nanopure water ([NPs] = 20 mg mL−1; injected dose
of doxorubicin = 7 μg/tumor) were directly injected in the tumor (30G-needle; Hamilton 1710−100 μL syringe;
Ultra Micropump III injector; Micro 4 Controller from World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL). The
embryos were incubated for 1 and 18 h. At certain time points (1 or 18 h), embryos were euthanized by transfer
at 4 °C. Then, tumors were collected and (1) submitted to very low temperature conditions (−20 °C) and then
imaged by the IVIS Lumina II imaging system or (2) fixed in 4% paraformaldehyde, then embedded in paraffin,
cut with a microtome in slices of 4 μm, and mounted on Superfrost Plus glass microscope slides for
immunohistofluorescence study. Intravenous injection: on day 11, 100 μL of a suspension of nanoparticles in
saline were injected intravenously into embryos for each experiment (Dox-unloaded PMSN45, Dox-unloaded
PMSN150, Dox@PMSN45, Dox@ PMSN150; [NPs] = 3.5 mg mL−1; [Dox] = 0.5 mg mL−1; injected dose of
Doxorubicin = 50 μg/egg → a limited dose of doxorubicin that could be injected in this model if not, the
cytotoxicity of Dox would induce a significant mortality of chick embryos). 100 μL of saline (154 mM + 1%
PenStrep (peniciline + streptomycin)) were also injected as a control. The embryos were incubated for 7 days,
at which time they were euthanized by transfer at 4 °C. Tumors (n = 11 for each condition) were collected, and
the tumor weights were recorded. Data represent the mean ± standard deviation.
115
3.4.17 Immunohistofluorescence
For staining human cancer cells in the chick embryo’s chorioallantoic tumor model, tumor slices were washed
once with toluene for 8 min, twice with EtOH 100% for 1 min, once with EtOH 95% for 1 min, and once with
water for 2 min. Then, tumor slices were immersed in a solution of BSA 3% + saponine 0.1% and placed in an
incubator at 37 °C for at least 45 min. After that, tumor tissue was incubated at RT for 1 h and 30 min with 40
μL of diluted G3BP1 (a ubiquitous protein that localizes to the cytoplasm in proliferating cells) and then washed
two times with PBS + 0.05% Tween 80. A total of 50 μL of antimouse IgG Alexa Fluor®405 (1:1000) was added
to conjugate this secondary antibody dye to G3BP1 at RT. After 1 h, tumor slices were washed four times with
PBS + 0.05% Tween and then glass coverslips were mounted. Images were collected using an Olympus (BX51)
fluorescence microscope. The contrast in Figure 3.11-c was enhanced with ImageJ software to better observe
the red fluorescence. No further adjustments of the fluorescent images were performed for the rest.
Figure S3.1. TEM images and nanoparticle size distributions of MSNs with an average particle diameter of 90
nm (MSN90, a) and 300 nm (MSN300, b) obtained by increasing and decreasing the fraction of F127,
respectively.
116
A) B)
60 60
Intensity / a.u.
Number / a.u.
40 40
e e
b
a c c
b
d d
a
20 20
a b c d e a b c d e
0 0
10 100 1000 10 100 1000
Hydrodynamic diameter / nm Hydrodynamic diameter / nm
Figure S3.2. DLS analysis of MSN45 (a), MSN90 (b), MSN150 (c), MSN300 (d) and MSN500 (e) suspensions in
aqueous solutions during 24 h (continuous line) and up to 1 week (dotted line), represented in number-
weighted data (A) and intensity-weighted data (B). The nanoparticles hydrodynamic diameter distributions after
1 week in are offset vertically.
100
95
90
Mass / %
85
80
PMSN150
PMSN90
75
PMSN45
70
100 200 300 400 500 600 700
Temperature / °C
Figure S3.3. Thermogravimetric analysis of phosphonated nanoparticles
117
2.2
2.0
1.8
log (% Drug release) 1.6
1.4
1.2
1.0
pH 5_Dox@PMSN45
0.8 pH 5_Dox@PMSN90
pH 5_Dox@PMSN150
0.6 pH 7_Dox@PMSN45
pH 7_Dox@PMSN90
0.4 pH 7_Dox@PMSN150
Plot 1 Regr
0.2
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
log (t)
Sample Plot equation R2
pH 5_Dox@PMSN45 y = 0.5069x + 1.5892 0.987
pH 5_Dox@PMSN90 y = 0.5164x + 1.4481 0.973
pH 5_Dox@PMSN150 y = 0.5863x + 1.1712 0.905
pH 7_Dox@PMSN45 y = 0.696x + 0.8548 0.985
pH 7_Dox@PMSN90 y = 0.7192x + 0.6704 0.998
pH 7_Dox@PMSN150 y = 0.7556x + 0.5257 0.970
Figure S3.4. Fitting of ex vitro Dox release data from Dox@PMSNx nanoparticles: plots of log of cumulative
percentage drug release as function of logarithm of the time.
Figure S3.5. Fluorescence images (obtained at 60×) of M21 cells incubated with Dox@PMSN45-F for 24 h.
118
Figure S3.6. Fluorescence images (obtained at 60×) of HT1080 cells incubated with Dox@PMSN 45-F and
Dox@PMSN150-F for 2 h 30 (a and b, respectively) and 24 h (c and d, respectively). The red fluorescence was
from Dox, the green fluorescence was from nanoparticles and precisely from Alexa Fluor®488 grafted on
nanoparticles, the yellow/orange fluorescence is the merged of the red one and the green one, and the blue
fluorescence was from anti-mouse IgG Alexa Fluor®408 dye to stain selectively the cytoplasm of human
cancer cells.
119
MSNx Solution Hydrodynamic diameter [nm] Polydispersion
index
Number mode Intensity mode Z-average (PDI)
MSN45 Water 54.9 96.2 85.2 0.141
Saline 58.1 95.5 91.3 0.145
MSN90 Water 100.6 143.7 130.7 0.089
Saline 101.9 140.7 130.5 0.135
MSN150 water 163.2 191.7 181.1 0.021
Saline 161.2 187.9 179.2 0.045
MSN300 Water 303.1 335.1 310.1 0.024
Saline 357.7 410.2 387.0 0.110
MSN500 Water 505.8 552.3 524.2 0.050
Saline 593.0 621.4 603.6 0.109
Table S3.1. Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of different-sized pure nanoparticles.
PMSNx Solution Hydrodynamic diameter [nm] Polydispersion

index
Number mode Intensity mode Z-average (PDI)
PMSN45 Water 63 101 98 0.131
Saline 59 102 93 0.155
PMSN90 Water 99 141 130 0.052
Saline 105 143 136 0.061
PMSN150 water 173 201 190 0.025
Saline 168 199 188 0.021
Table S3.2. Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of different-sized phosphonated-

nanoparticles.
120
Tumor cells Time (h) Dox@PMSN45 Dox@PMSN150 free Dox
24 h 0.879 ± 0.017 1.039 ± 0.02 4.116 ± 0.02
M21 48 h 0.279 ± 0.005 0.355 ± 0.007 0.741 ± 0.014
72 h 0.187 ± 0.004 0.311 ± 0.006 0.484 ± 0.009
24 h - - -
HT1080 48 h 0.035 ± 0.0007 0.069 ± 0.0014 0.131 ± 0.0065
72 h 0.023 ± 0.0011 0.035 ± 0.0017 0.047 ± 0.0023
Table S3.3. Half maximal inhibitory concentrations (IC50, mean ± SD, µg Dox mL-1) of Dox@PMSN45,
Dox@PMSN150 and free Dox after 24 h, 48 h and 72 h incubation with cancer cells.
THMP conventional post-grafting strategies:
Grafting THMP according to conventional post-grafting strategies was unsuccessful. In fact, several trials were
performed in: 1) Toluene under inert atmosphere and under reflux, 2) in hexane under inert atmosphere and
under reflux, 3) in ethanol or methanol under reflux, and 4) in dichloromethane under reflux, without any success
(0 % (w/w) of THMP was grafted according to TGA and no THMP characteristic peaks were found in 13C CP/MAS
NMR and 31P MAS NMR spectra).
3.6 Acknowledgements
(Canada) and the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FRQNT Team Grant
2013-PR-167010). M.B. is grateful to FRQNT for a Ph.D. fellowship. The authors would like to thank Dr Todd
Galbraith (CHU-LOEX, Quebec) for assistance during the ex vivo fluorescence imaging study and Professeur
Ryong Ryoo and Dr Yongbeom Seo (KAIST, Korea) for inset HRTEM images as well as Ms. Caroline Germain
(student from INSA, Rouen) for assistance in the preparation of particles.
121
Chapitre 4 – Article 3 : Antibody-Conjugated
Mesoporous Silica Nanoparticles for Brain
Microvessel Endothelial Cells Targeting
Meryem Bouchoucha,a,b,c,† Éric Béliveau,d,e,† Freddy Kleitz,a,c,* Frédéric Calond,e,* and Marc-André Fortinb,c,*
a Department of Chemistry, Université Laval, Québec (QC), G1V 0A6, Canada.
b Centre de recherche du centre hospitalier universitaire de Québec (CR-CHUQ), axe Médecine régénératrice,
Québec (QC), G1L 3L5, Canada.
c Centre de recherche sur les matériaux avancés (CERMA), Université Laval, Québec (QC), G1V 0A6, Canada.
d Faculty of Pharmacy, Université Laval, Québec (QC), G1V 0A6, Canada.
e Neurosciences Axis, Centre de recherche du CHU de Québec, Québec (QC), Canada.
+ Equal contribution
Published: August 2017
122
Résumé
Les cellules endothéliales de micro-vaisseaux du cerveau (CEMC) sont la principale composante structurale et
dynamique de la barrière hématoencéphalique (BBB). Elle empêche la majorité des médicaments d'atteindre le
cerveau. Les CEMC sont impliquées dans plusieurs maladies du système nerveux central. De ce fait, le
développement de nanovecteurs capables de s’accumuler spécifiquement dans ces cellules, a été suggéré
comme une approche prometteuse pour optimiser l'administration de médicaments au cerveau et améliorer le
traitement de ces maladies. Dans cette étude, nous rapportons l’effet de la taille des MSNs et de leur
bioconjugaison avec un anticorps sur leur capacité à cibler les CEMC ; et ce par des études in vitro et in vivo.
Pour cela, l’anticorps Ri7 a été conjugué à deux MSNs de tailles différentes (de 50 nm et de 160 nm de diamètre)
à travers le greffage du polyéthylène glycol (PEG). Ces nanoparticules ont été également fonctionnalisées par
un agent de contraste d’IRM (le chélate de gadolinium) et une sonde fluorescente. Une fois en suspension, les
Ri7-MSN ont montré une bonne stabilité colloïdale. L'anticorps Ri7 immobilisé sur la surface des MSNs a
conservé son activité spécifique élevée et sa grande affinité pour son récepteur. Les cellules endothéliales et
neuronales du cerveau marquées avec les nanoparticules Ri7-MSN-DTPA(Gd) ont montré une amélioration
significative du contraste positif à l'IRM. Pour mesurer l’accumulation des Ri7-MSN dans les CEMC in vitro, une
méthode quantitative a été développée. Les résultats obtenus ont révélé que l’endocytose de ces nanoparticules
se fait par le biais des récepteurs de la transferrine et que leur absorption dépend de leur taille et du temps
d’incubation. Une plus grande accumulation spécifique a été observée avec le Ri7-MSN de 50 nm in vitro,
seulement après 10 minutes d'incubation et jusqu'à 4 heures. Ce comportement a été aussi démontré in vivo
suite aux injections des Ri7-MSN par voie intraveineuse. Ces résultats prouvent le potentiel élevé de ces
nanoparticules à cibler les CEMC. Cela ouvre les portes à d’éventuelles applications en ciblage thérapeutique
des CEMC, permettant d’améliorer la vectorisation potentielle des médicaments au cerveau.
123
Abstract
Brain microvessel endothelial cells (BMEC) are the main structural and dynamic component of the blood brain
barrier (BBB), preventing the majority of drugs from reaching the brain. BMEC are involved in wide range of
central nervous system diseases. The development of nanocarriers that trigger receptor-mediated uptake in
these cells has been suggested as a promising approach to increase drug delivery to the brain and improve the
treatment of these diseases. Here, we report the size and the bioconjugation effects of antibody-conjugated
mesoporous silica nanoparticles (MSN) on in vitro and in vivo targeting ability to BMEC. For this, Ri7 antibody
was conjugated to mesoporous silica nanoparticles (MSN) of two different sizes (50 nm and 160 nm diameter)
through a polyethylene glycol (PEG) linker. The particles were also functionalized with a MRI contrast agent
(gadolinium chelate) and with a fluorescent label. The functionalized MSN suspensions showed a good colloidal
stability. The Ri7 antibody immobilized on MSN surface maintained its high specific activity and high binding
affinity, as demonstrated in vitro. Cells incubated with gadolinium-chelated Ri7-MSN showed a significant MRI
positive contrast enhancement, highlighting the potential of such nanoparticles for theranostic applications. To
measure the uptake and affinity of Ri7-MSN nanoparticles to brain endothelial and neuronal cells, cell uptake
studies were performed and a quantitative cellular assay was developed. The results revealed that the
endocytosis of nanoparticles is mediated by transferrin receptors and that Ri7-MSN cellular uptake is size- and
time-dependent. A higher specific uptake was found with the 50 nm Ri7-MSN, only after 10 min of incubation
and up to 4 hours. Upon intravenous injection, 50 nm Ri7-MSN were specifically accumulated in BMEC,
suggesting the strong potential of such nanoparticles for targeting BMEC in vivo. These findings open the door
to therapeutic targeting of BMEC, enabling potential therapeutic drug delivery to the brain.
124
4.1 Introduction
The blood brain barrier (BBB) is a physiological neuroprotective barrier that separates the central nervous
system (CNS) from the blood, protecting it from harmful blood-borne substances.258 However, it also prevents
therapeutic agents to access the CNS, and therefore constitutes a major obstacle to the treatment of various
neurodegenerative disorders and diseases (e.g., Alzheimer's and Parkinson's). Indeed, almost all high-
molecular weight drugs and about 98% of small therapeutic agents cannot pass the BBB and/or reach the CNS,
making brain drug delivery one of the most challenging pharmaceutical problems to-date. 259, 260 Brain
microvessel endothelial cells (BMEC) are the main constituents of the BBB and form a dynamic neurovascular
unit that regulates brain homeostasis. They are connected by tight junctions that restrict the passive diffusion of
elements to the brain. BMEC control the transport of molecules into the brain: for instance, they allow in nutrients
and fluids essential to the metabolism and to the survival of brain cells (e.g., amino acids, glucose, vitamins,
minerals and hormones).261 These essential molecules transit from the blood to the brain by multiple carrier- and
receptor-mediated transport mechanisms.178 Indeed, substances such as transferrin, lactoferrin, insulin and
other peptides are transported across the BBB through the vesicular trafficking system of BMEC.262, 263 The
development of ligand-conjugated nanocarriers having the capacity to trigger the receptor-mediated transport,
figures among the most promising and potentially efficient strategies considered to enhance the access of drugs
to the brain.264-268 BMEC are involved in a wide range of CNS diseases. The development of a drug nanocarrier,
with the capacity to undergo endocytosis into these cells via a receptor-mediated mechanism, opens the door
to the therapeutic targeting of these cells.
Preclinical successes have been reported using nanoparticle formulations targeting BMEC through the
transferrin receptor (TfR), the lactoferrin receptor, the insulin receptor and the low-density lipoprotein receptor-
related-1.267, 268 Among these, transferrin receptors are particularly interesting owing to their high density at the
endothelial cell membranes of the BBB (i.e., BMEC). The rat Ri7 anti-mouse TfR antibody was shown to
accumulate massively in BMEC through transferrin receptor-mediated mechanism, and therefore the antibody
has been intensively characterized in the perspective of developing BBB targeting applications. 174, 175
Mesoporous silica nanoparticles (MSN) are currently one of the most promising biocompatible nanocarriers for
drug delivery and imaging applications.103, 207, 269, 270 They feature unique characteristics such as high surface
area and pore volume, as well as tunable particle size and surface properties. 167, 217, 229, 271 Indeed, MSN have
been used to develop targeted therapeutic delivery vectors with improved control on drug release. 272 During the
last decade, MSN have demonstrated a strong potential for targeted cancer therapy229, 270, 273, 274 and oral drug
delivery197, 275-277. Now, they are entering the clinical stage16, 17 and they are increasingly integrated into
theranostic compounds.46 Indeed, recent research efforts have focused to combine therapeutic and imaging
capabilities in MSN.33, 34 Labeling nanoparticles with biomedical imaging probes, is a valuable tool to enable in
125
vitro and in vivo tracking of nanoparticles. For instance, MSN labeled with Gd-based magnetic resonance
imaging (MRI) contrast agents (e.g., Gd-DTPA, gadolinium-diethylenetriaminopentaacetic-acid) induce a strong
“positive” contrast enhancement effect, which enables their visualization in MRI. 278, 279 These last years, silica-
based nanoparticles have gained attention as a potential system for BBB targeting. 280-283 In particular, MSN have
been very recently considered for brain delivery36-39 and transferrin-conjugated MSN (100 nm diam.) appear to
have strong potential for BBB targeting.38, 39 Nevertheless, the design of functional MSN able to be uptaken by
BMEC is still a challenge and direct evidence of their targeting ability to these cells is still lacking in the literature.
In this study, MSN with two particle sizes (i.e., 50 and 160 nm) were synthesized and functionalized with amine
groups and gadolinium chelates (Gd-DTPA). The BBB-targeting Ri7 monoclonal antibody was conjugated to
MSN via a polyethylene glycol (PEG) linker. This conjugation was evidenced by physicochemical analyses (XPS,
NMR, FTIR, TGA, DLS and TEM). The structural and textural characteristics of MSN were studied, as well as
their colloidal stability and their relaxometric performance (contrast in MRI). The ability of Ri7-MSN to internalize
in BMEC was studied both in vitro and in vivo and the effect of MSN size and Ri7-bioconjugation was evidenced.
For this, a quantitative in vitro assay was developed to investigate the specific uptake of the functionalized
nanoparticles in brain endothelial and neuronal cell lines. The uptake affinity of Ri7-conjugated nanoparticles
was also measured and compared to that of the free antibody. Finally, the accumulation of Ri7-MSN in the brain
was assessed after intravenous injections in the mouse.

As illustrated in Figure 4.1, two MSN systems of spherical nanoparticles were synthesized, one with an average
diameter of 50 nm (MSN50)272 and the second one with 160 nm (MSN160).78 These systems were used to evaluate
the effect of size on the capacity of MSNs target brain cells. Then, amine groups were grafted on the surface of
these MSN, using 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES). Thus-obtained nanoparticles were subsequently
functionalized with the gadolinium chelate (DTPA molecule), yielding MSNx-DTPA nanoparticles (x: 50; 160).
Gadolinium was then chelated to DTPA. After PEG grafting, the antibody (Ab: Ri7 or its isotopic control IgG) was
conjugated to MSNx-DTPA(Gd) nanoparticles to yield MSNx-DTPA(Gd)-PEG-Ab nanoparticles. For simplified
abbreviation, these resulting nanoparticles are designated as Ab-MSNx (x: 50; 160). Because surface chemistry
is a critical parameter having a strong impact on cellular uptake efficiency,272 it is important to compare the
performance of Ri7-MSN nanoparticles to MSN with similar surface chemistry. IgG antibody, a non-specific
antibody that is not considered as TfR ligand, confers to MSN equivalent surface chemistry properties than that
of Ri7-MSN. In this study, IgG-MSN are thus considered as the corresponding control nanoparticles to Ri7-MSN.
126
Figure 4.1. A, B) High-resolution TEM images of MSN50 and MSN160 with corresponding particle size
distributions; C) functionalization steps for DTPA-Gd and antibody grafting.
4.2.1 Physicochemical and Textural Characterization of MSN

Low-angle XRD data of pure nanoparticles showed typical peaks of the ordered 3-D cubic Ia3d mesopore
structure (MCM-48 type)78 (Figure S4.1-a, Supporting Information-section 4.5). Both nanoparticles showed type
IV N2 physisorption isotherms (Figure S4.1-b, Supporting Information-section 4.5), characteristic of uniform
mesoporous channels with narrow and cylindrical pores. These nanoparticles showed a high specific surface
area around 1200 m2 g-1 (BET method, Table 4.1), large total pore volume of 1 cm3 g-1 (NLDFT method, Table
4.1) and a mean pore diameter about 3.5 nm (NLDFT method, Table 4.1 and Figure S4.1-c, Supporting
Information-section 4.5). After the functionalization steps, 11% of amine groups and 4% of DTPA molecules
were grafted on both-sized MSN, as determined by thermogravimetric analysis (TGA, Figure S4.2, Supporting
Information-section 4.5). No changes in particle shape and size were apparent using TEM after amine and DTPA
functionalization (Figure 4.2-A,B). However, a decrease in specific surface area (50%), pore volume (53-56%)
and pore size (about 20-23%) was observed after amine grafting (Table 4.1, MSNx-NH2). This is in good
agreement with the introduction of amine groups on external and inner MSN surface. After DTPA
functionalization, a further slight decrease (of 10%) in surface area and the pore volume were recorded in
127
comparison to MSNx-NH2. The mean pore diameters of MSNx-DTPA were almost identical to that of the parent
MSNx-NH2 (Table 4.1). This indicates that DTPA molecules were preferentially grafted at the outer surface of
nanoparticles, which is recommended for optimal relaxometric properties and MRI contrast enhancement, as
reported and demonstrated in our previous work.278
Figure 4.2. A, B) TEM images of MSN50 and MSN160 after grafting of DTPA; C, D) after grafting of the
antibody.
128
Area [m2 g-1] [cm3 g-1] Size [nm]
MSN50 1032 0.96 3.5
MSN50-NH2 520 0.45 2.8
Small nanoparticles
(MSN 50 nm) MSN50-DTPA 470 0.41 2.8
MSN160 1291 0.91 3.4

MSN160-NH2 650 0.40 2.6
Large nanoparticles
(MSN 160 nm) MSN160-DTPA 580 0.39 2.6
Table 4.1. Physicochemical parameters from nitrogen physisorption measurements (at -196 °C).
The successive grafting of amine groups and DTPA molecules on MSN, was confirmed by solid-state NMR,
Fourier-transform infrared (FTIR) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). 13C CP-MAS NMR spectrum
(Figure 4.3-A) showed sharp resonances for APTES and DTPA-related carbon atoms, as well as the typical
carbon resonance of amide group (at 173 ppm), thus confirming the covalent grafting of DTPA (peaks attributions
are displayed in Figure 4.3-A). 29Si MAS NMR spectrum of MSNx-DTPA nanoparticles (Figure 4.3-B) depicted a
broad multicomponent peak in the -88 to -120 ppm range, which is associated with the Q n groups of the silica
framework (Si(OSi)n(OH)4-n; n: [1–3]). In addition, Tn groups (C-Si(OSi)n(OR)3-n), observed around [-51 – -67]
ppm, of the covalently grafted silane molecules were also evidenced (Figure 4.3-B,D).278 FTIR spectrum of
MSNx-DTPA samples (Figure 4.3-C) showed in particular the asymmetrical C=O vibration of –COOH at 1725
cm-1 and of –CONH at 1675 cm-1 (a shoulder) and the N-H deformation vibration (δN-H) of amide II at 1550 cm-1.
In addition, XPS analysis, with emphasis on Si (2s), C (1s), O (1s) and N (1s), confirmed the presence of DTPA
at the outer surface of MSN, as XPS detects the presence of elements in a maximum depth of a few nanometers
only. The XPS data (Table 4.2) revealed a significant increase in the carbon and nitrogen atomic percentages
(%C, %N), as well as in the carbon-to-silicon and nitrogen-to-silicon ratios (C/Si, N/Si) after APTES and DTPA
grafting. The high-resolution analysis of the C peak showed the presence of C–C and C–H binding (band at 285
eV) and C–N and/or C–O binding (band at 286.5 eV) for MSN x-NH2 and MSNx-DTPA, as well as the occurrence
of a band at 288.8 eV corresponding to C=O amide/acid binding after DTPA grafting. XPS further confirmed the
presence and the chelation of Gd3+ with DTPA (%Gd ≈ 1%, Table 4.2).
129
Figure 4.3. (A) 13C CP/MAS NMR spectrum of MSNx-DTPA. (B) 29Si MAS NMR spectrum of MSNx-DTPA. (C)
FTIR spectra of functionalized and bioconjugated nanoparticles. (D) Schematic representations of the surface
of MSNx-DTPA.
130
% C (1s) % N (1s) % O (1s) % Si (2s) % Gd C/Si N/Si
(285.2 eV; C-C, C-H) 399.8 eV; 532.5 eV 103.8 eV; (3d)
[286.5 eV; C-O, C-N] N-H Si-O
{288.1 eV; C=O
Amide/Acid}
MSN50-NH2 / 19.9 / 19.2 2.9 / 2.8 54.4 / 54.5 22.8 / 23.5 - 0.87 / 0.13 /
MSN160-NH2 (16.8) / (16.2) 0.81 0.12
[3.06] / [2.97]
{-}/{-}
MSN50-DTPA / 25.0 / 23.6 6.0 / 5.1 49.5 / 51.1 19.5 / 20.2 - 1.28 / 0.30 /
MSN160-DTPA (17.9) / (17.33) 1.17 0.25
[5.45] / [5.27]
{1.65} / {1.60}
Ri7-MSN50 / 51.1 / 38.5 12.1 / 9.5 29.8 / 38.1 6.1 / 12.8 0.9 / 8.37 / 1.98 /
Ri7-MSN160 (27.84) / (19.73) 1.1 3.01 0.74
(XPS analysis [15.40] / [12.46]
obtained after Gd {7.86} / {6.31}
chelation to DTPA,
and Ri7
conjugation)
Table 4.2. XPS measurements: elemental analysis.
4.2.2 Bioconjugation of Monoclonal Antibody (Ri7) to MSN

Polyethylene glycol (PEG) spacers can be introduced between a functional molecule such as an antibody, and
a nanocarrier. This hydrophilic, flexible and biocompatible spacer prevents undesirable interactions of the
antibody with the nanoparticle surface, which could alter its functionality. Furthermore, in order to avoid
flocculation and agglomeration, we found essential to first conjugate Ri7 on the PEG molecule, prior to attaching
it to the MSN. Maleimide-PEG-N-Hydroxysuccinimide (MAL-PEG-NHS) was attached to the Ri7 antibody by
reaction of maleimide groups with thiol moieties of the Ri7 antibody. Then, the antibody-PEG-NHS compound
was conjugated to available amine groups on the external surface of MSNx-DTPA(Gd) nanoparticles via the
classical reaction with NHS groups.
Ri7-PEG conjugation was investigated by dynamic light scattering (DLS). The initial hydrodynamic size of Ri7 of
15.7 nm (z-average) increased to 18.1 nm after PEG coupling (Figure S4.3, Supporting Information-section 4.5),
which is in agreement with the small size of PEG (5 kDa). TEM images of Ri7-conjugated nanoparticles (Figure
4.2-C,D) revealed the presence of a thin layer around the MSN. This could be due to the presence of the antibody
around and at the interface of the nanoparticles, as previously observed in the case of coating MSN with protein
component.197 To quantify the antibody content in Ri7-MSN and to further assess the bioconjugation,
thermogravimetric analysis (TGA) and UV-visible data were used (Figure S4.2 and S4.3, respectively,
Supporting Information-section 4.5). In TGA curves, a much more drastic weight loss was observed for antibody-
conjugated MSN, compared with MSN-NH2 and MSN-DTPA only (Figure S4.2, Supporting Information-section
131
4.5). The weight percentage (w/w) of the Ri7-PEG grafted on nanoparticles was 6.5 % and 6.7 %, for Ri7-MSN 50
and Ri7-MSN160, respectively. Ri7 antibodies were pre-labeled with Alexa Fluor®647 (Ri7fl) before conjugation
to MSN (Figure S4.3, Supporting Information-section 4.5). Fluorescent labeling facilitated quantification of the
conjugation yield, as well as calculations related to the number of grafted antibodies per MSN. Indeed, according
to TGA and UV-Vis data, the number of antibodies per nanoparticle was estimated to 17 and 230 for Ri7-MSN 50
and Ri7-MSN160, respectively, which corresponded to a similar surface grafting density (2.1 10 -3 and 2.9 10-3 per
nm2 for MSN50 and MSN160, respectively). By increasing further the amount of Ri7-PEG during the bioconjugation
step, no additional amount of grafted antibody was recorded. These data correspond thus to the maximum
weight percentage of Ri7-PEG that can be grafted and therefore to a saturation of the surface. The complete
coverage of the external surface of MSN with antibodies, aimed at minimizing differences in surface
physicochemical properties between particles of different sizes. Similar surface grafting densities were found for
MSN conjugated with control IgG (Figure S4.2, Supporting Information-section 4.5).
The successful Ri7-MSN conjugation was further confirmed by FTIR and XPS spectroscopic studies. Indeed,
characteristic bands of Ri7 and PEG species were observed (Figure 4.3-C). Ri7-MSN50 and Ri7-MSN160 FTIR
spectra showed the N-H deformation vibration (δN-H) of amide I and amide II of the antibody at 1550 cm-1 and
1530 cm-1, respectively. Moreover, typical bands of the stretching vibrational modes from methylene (CH2) and
terminal methyl (CH3) groups, as well as the deformation vibrations of the CH2 group were observed after Ri7-
PEG grafting in the region between 2800 – 2965 cm-1 and 1300 – 1400 cm-1, respectively. Compared to the
FTIR spectrum of Ri7-MSN160, additional bands were observed in the FTIR spectrum of smaller nanoparticles
(Ri7-MSN50) at 1467 cm-1 and in the region between 3000 – 3300 cm-1 (Figure 4.3-C). The band at 1467 cm-1
could be assigned to the C-N (amide III) stretching vibration affected by hydrogen bindings and coupled with
NH2 deformation in the protein structure of the antibody.284, 285 The region between 3000 – 3300 cm-1 is
characteristic of NH stretching vibrations of proteins and is very sensitive to hydrogen bonds in the protein
structure. Particularly, in the Ri7-MSN50 spectrum, a band at 3290 cm-1 is distinguishable and accompanied with
a second component which absorbs weakly between 3030 and 3100 cm-1, corresponding to the amide A and
amide B vibration modes (N-H stretching affected by hydrogen bonding), respectively. 285 In addition, after Ri7
conjugation to MSN, XPS data showed a remarkable increase in the carbon and nitrogen atomic percentage
(%C, %N) and a dramatic decrease in the silicon atomic percentage (%Si) for both small and large nanoparticles
(Table 4.2). This reflected in an important increase in the carbon-to-silicon and nitrogen-to-silicon ratios (C/Si,
N/Si), which suggests a good coverage of the MSN external surface with the antibody. However, C/Si and N/Si
ratios for Ri7-MSN50 (C/Si = 8.37; N/Si = 1.98) were clearly higher than that of larger MSN (Ri7-MSN 160; C/Si =
3.01; N/Si = 0.74). These observations together with FTIR results, suggest that the orientation of the grafted
antibody could be somewhat different on MSN50 compared to MSN160. This may be explained by the
aforementioned slight difference in surface antibody density between both sizes of MSN.
132
4.2.3 Colloidal stability
Preserving a strong colloidal stability of antibody-labeled MSN at each step of their formulation, is of utmost
importance in the perspective of developing a functional nanovehicle targeted at BMEC. Indeed, agglomerated
antibody-conjugated MSN can simply not be injected i.v. and even the slightest agglomeration could impact on
the BBB permeability efficiency, leading to neuronal damage.38 The colloidal stability of MSN before and after
Ri7 grafting was monitored by DLS in water as well as in phosphate-buffered saline (PBS, pH = 7.4). The DLS
peaks in Figure 4.4 (intensity and number weighted) showed the presence of a single peak before and after Ri7
grafting, without any significant evidence of aggregation or flocculation. The colloidal stability was well preserved
for at least 1 week. The hydrodynamic diameters reported in number-weighted data, intensity-weighted data and
Z-average as well as the polydispersity index (PDI) are summarized in Table S4.1 (Supporting Information-
section 4.5). Acceptable PDIs (range: 0.04 - 0.2) were obtained, ascertaining the low polydispersity of Ri7-MSN
conjugates. After antibody conjugation, hydrodynamic diameter increases of 30 – 40 nm (in number mode) were
systematically recorded. This increase is in agreement with the measured hydrodynamic sizes for Ri7 and Ri7-
PEG (15.7 and 18.1 nm, mentioned above).
133
Nanoparticles 50 nm Nanoparticles 160 nm
A) B)
After Ri7 grafting After Ri7
grafting
Before Ri7 grafting
Before Ri7
60 60 grafting
PBS_1 week
PBS_1 week
Number (a.u.)
/ a.u.
Number (a.u.)
/ a.u.
40 40
Water_1 week Water_1 week
20 PBS_24 h 20 PBS_24 h
Water_24 h Water_24 h
0 0
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
Hydrodynamic diameter (nm)
/ nm Hydrodynamic diameter (nm)
/ nm
C) D)
After Ri7 grafting After Ri7
grafting
Before Ri7 grafting
Before Ri7
60 60 grafting
PBS_1 week PBS_1 week

Intensity (a.u.)
Intensity (a.u.)
/ a.u.
/ a.u.
40 40
Water_1 week Water_1 week
20 PBS_24 h 20 PBS_24 h
Water_24 h Water_24 h
0 0
1 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 10000
Hydrodynamic diameter (nm)
/ nm Hydrodynamic diameter /(nm)
nm
Figure 4.4. DLS analyses of the nanoparticle suspensions (A and C for MSN50 ; B and D for MSN160) before
and after the antibody grafting, represented in number mode and intensity mode.
134
4.2.4 1H Relaxometric Properties and in vitro MRI Cell Imaging
The relaxivity values (r1, r2) of aqueous suspensions of MSN-DTPA(Gd)-PEG-Ri7 nanoparticles were measured
as an assessment of MRI contrast enhancement potential. These values were extracted from relaxivity curves
that represent relaxation rates (1/T1 and 1/T2) in function of the Gd3+concentration (1/T1, 2 = r1, 2 ([Gd3+] + C);
Figure S4.4, Supporting Information-section 4.5). The relaxivities of Gd-labeled Ri7-MSN were r 1 = 21.9 mM-1 s-
1 and r2 = 36.3 mM-1 s-1 (r2/r1 = 1.6), which is consistent with our previous results with DTPA(Gd)-labeled
nanoparticles.278, 279 Then, dilutions of Gd-labeled Ri7-MSN suspensions were MRI-scanned at 1 Tesla. T1-
weighted MR images of Ri7-MSN50 and Ri7-MSN160 (Figure 4.5-A and 4.5-B, respectively) confirmed the
possibility to achieve a positive contrast enhancement even at low Gd concentrations (0.04 – 0.06 mM). Because
several paramagnetic nanoparticles, once internalized in cells, have the tendency to lose their signal-
enhancement properties (i.e., due to a restriction of available free water), we demonstrated the capacity to label
brain endothelioma cells with the functional MSN. For this, Gd-labeled Ri7-MSN (50 and 160 nm) were incubated
with murine brain endothelioma cells (bEnd5). First, in vitro cytotoxicity studies were performed with Ri7-MSN
using murine brain endothelioma cells (bEnd5 cells). As shown in Figure 4.5-C, no significant cytotoxicity was
revealed at nanoparticles concentrations up to 300 μg mL-1, after 4 h of incubation. These results indicate
desirable biocompatibility of such nanocarriers. Then, in vitro MRI cell imaging was performed. In order to make
a fair comparison on the performances of Ri7-MSN nanoparticles, cells were also incubated with the control
nanoparticles, IgG-MSN, having equivalent surface chemistry properties than that of Ri7-MSN but cannot bind
to TfR. After 4 h of incubation, the cells labeled with Ri7-MSN and IgG-MSN appeared positively contrasted
(Figure 4.5-D). The contrast between labeled cells (Figure 4.5-D-j,k,l,m) and unlabeled cells (Figure 4.5-D-i) was
obviously visible, showing the capacity of such systems to labeled bEnd5 cells. Interestingly, a stronger contrast
was evidenced with both sizes of Ri7-conjugated nanoparticles (Figure 4.5-D-j,l), compared to the controls (IgG-
MSN, Figure 4.5-D-k,m). This suggests a higher binding/internalisation rate as well as a prospective targeted
uptake by the Ri7-conjugated MSN. To strengthen these observations with qualitative visual studies,
immunohistofluorescence analysis and cellular fluorescence quantification were performed.
135
Figure 4.5. T1-weighted MR images of Ri7-MSN50 (A) and Ri7-MSN160 (B) in aqueous suspensions. Numerical
values indicate the Gd concentrations (mM) measured by ICP-MS. C) Cell viability assay (trypan blue test) of
Ri7-MSN50 and Ri7-MSN160 nanoparticles. D) Pellets of bEnd5 cells after incubation without (i) or with
conjugated MSN (j: Ri7-MSN50; k: IgG-MSN50; l: Ri7-MSN160; m: IgG-MSN160).
4.2.5 Immunohistochemistry Studies on Coronal Brain Sections

To rule out any interference of the conjugation process with antibody functionality, we verified if conjugation with
Ri7fl conferred to MSN their ability to selectively label endothelial cells of mouse cerebral microvessels. For this,
coronal brain sections were incubated with 15 nM of Ri7fl-MSN suspensions overnight. Figure 4.6 shows that
Ri7fl-MSN nanoparticles were able to label mouse brain microvessels in a size-dependent manner. This confirms
that the grafted Ri7 antibody remained functional and retained its binding affinity after the conjugation steps,
because both sizes of MSN had labeled at least of portion of the brain microvessels. Figure 4.6-A shows that
only a very small proportion of the brain vessels, detected with the potato lectin, were labeled after incubation
with large nanoparticles (Ri7fl-MSN160). We also observed a strong signal (high fluorescence spots) from Ri7fl-
MSN160, which are not superposed with lectin-labeled brain vessels and are similar to that observed with
untargeted control IgGfl-MSN160. This result could be due to the limited penetration of large nanoparticles to brain
tissue slices and/or their limited labeling of brain vessels. In contrast, Figure 4.6-B and 4.6-C show that nearly
all brain microvessels were labeled with the small nanoparticles (Ri7fl-MSN50). The fluorescence signal coming
from the control IgGfl-MSN50 was nearly absent. This suggests the high potential of small nanoparticles to
achieve specific binding/internalization to/in BMEC. To confirm these findings, in vitro cellular uptake assays
were performed.
136
Figure 4.6. Labeling of brain microvessels by Ri7fl-MSN on mouse brain sections. Coronal brain sections (12
µm) of BALB/C mice perfused with PBS were incubated overnight with either 15 nM of control IgGfl-MSN or
targeted Ri7fl-MSN (A: MSN160, B: MSN50). Endothelial cells were selectively labeled with lectin and nuclei
were stained with DAPI. Fluorescent microscopy images were captured with a 10X objective using appropriate
emission and excitation filters for each fluorophore. Pseudocolored magnification images (60X) of Ri7fl-MSN
are shown in C (red: MSN; green: lectin; blue: DAPI).
4.2.6 Development of a quantitative cellular assay

The need for a quantitative cellular assay is essential to determine alterations of antibody function post
conjugation to MSN, particularly in uptake kinetics in the event of a possible affinity shift. The assay must be
sensitive enough to detect small amplitude variations and take into consideration the confluency of cells and the
presence of non-responding cells. We thus developed a fluorescence-based cellular uptake assay using an
automated image-based procedure able to detect every single cell in a population. For each quantification, a
stack of three images was required (Figure 4.7-A). The first image from the DAPI channel isolated the nuclei;
the second image from the RFP channel used lectin as a membrane marker to delineate cell bodies from the
137
background; finally, the third image from the Cy5 channel served to quantify the uptake of Ri7 fl-MSN. For each
stack, individual cells were segmented using the Voronoi tesselation algorithm of the EBImage R package 286,
the DAPI signal as seeds and the lectin signal as cellular mask (Figure 4.7-B).In the illustrated example, 1334
cells were detected. For each cell, the average Cy5 pixel intensity was determined, with a relative fluorescence
mean value of the population of 0.209. As clearly shown in the density plot of Figure 4.7-C, a proportion of cells
may not respond in the assay for different reasons. In the case of neuroblastoma N2A cells from the same
culture well, confluent cells express the TfR whereas non-confluent cells do not. Because these non-confluent
cells also exhibit reduced reactivity to DAPI (Figure 4.7-A and C), most of them are easily removable from the
analysis using the DAPI channel as a threshold. In this example, removing 280 « unreactive » cells increased
the population mean fluorescence to 0.235 (+12%), indicating that these cells indeed affected the results and
should be removed from the analysis. Using this image-based image quantification procedure in 96-wells plates,
the uptake of antibodies and MSN can be studied quantitatively with limited bias coming from cell confluency
and unresponsive cells.
138
Figure 4.7. Automated image-based quantification of MSN cellular uptake. (A) For each well, three differently
positioned stacks composed of the nuclei (DAPI), cell membrane (lectin) and fluorescent antibody were
automatically acquired using the DAPI (ex: 377 nm, em: 447 nm), RFP (ex: 531 nm, em: 593 nm) and Cy5 (ex:
628 nm, em: 685 nm) filters respectively and saved in a 16 bit TIFF format. (B) For each stack, the cells were
segmented with the Voronoi tesselation algorithm of the EBImage R package using the DAPI signal as seeds
and the lectin signal as cellular mask. The average Cy5 pixel intensity (corresponding to Abfl-MSN) was
recorded for each cell and the population average was determined. C) For N2A assays, cells with a low
reactivity to DAPI without an uptake activity were excluded from the analysis.
4.2.7 Ri7-MSN Accumulation in Brain Cells

The cellular uptake studies of Ri7fl-MSN nanoparticles were investigated using two different cell lines derived
from mouse brain: bEnd5 (endothelioma) and N2A (neuroblastoma), in order to prevent cell type-specific
artifactual findings. Cells were incubated with 15 nM Ri7fl-MSN50 and Ri7fl-MSN160 for 10, 20, 40, 90 and 240
139
min. In order to evaluate the specific receptor-mediated targeting capability of Ri7-MSN, cells were also
incubated with control nanoparticles (IgG-MSN). Figure 4.8-A, B, C, D show that the accumulation of Ri7-MSN
was time- and size-dependant, in both brain cells. Indeed, cell-associated fluorescence increased over time
before reaching a plateau, at 90 min in bEnd5 cells and between 40 and 90 min in N2A cells. Moreover,
quantification showed that the mean fluorescence per cell was more elevated with Ri7 fl-MSN compared to control
IgGfl-MSN, for both particles sizes. Interestingly, the signal associated with small control nanoparticles, IgG fl-
MSN50, was near the background level; it represents only 5 – 10 % of the fluorescence values obtained with
Ri7fl-MSN50 (Figure 4.8-B,C). This indicates effective cell recognition and suggests that the cellular uptake of
such nanoparticles is mainly based on a specific transferrin-receptor mediated mechanism. In contrast, the
signal associated with large control nanoparticles (IgG fl-MSN160) was significantly higher and equaled to 50% of
the fluorescence signal measured with Ri7fl-MSN160 (Figure 4.8-A,B). Therefore, these observations reveal that
50 nm nanoparticles have a better capacity to minimize the non-specific binding, leading thus to a better specific
uptake and targeting ability, in comparison with 160 nm particles (Figure S4.6 represents the specific uptake by
bEnd5 cells after subtracting IgGfl-MSN from Ri7fl-MSN fluorescence values, Supporting Information-section
4.5). Importantly, when Ri7fl-MSN were incubated with an excess of free unlabeled Ri7 antibodies to block the
TfR, a competition experiment, the mean fluorescence decreased to levels indistinguishable from those recorded
with IgGfl-MSN for both nanoparticles sizes and in both brain cells. This result indicates that free Ri7 antibodies
inhibit completely the specific cellular uptake of small and large nanoparticles, confirming that the specific uptake
of Ri7-MSN is based on transferrin-receptor mediated mechanism.
140
Figure 4.8. Ri7fl-MSN uptake in bEnd5 and N2A cells at different temperatures and incubation times. Cells
were incubated with targeted Ri7fl-MSN, control IgGfl-MSN or a combination of Ri7fl-MSN with 1 µM unlabeled
Ri7 to block the transferrin receptor. Uptake was stopped by removal of the medium followed by ice-cold
washes and immediate fixation with 10% formalin. Cells were imaged using a Cytation5 multi-mode reader
with a 10X objective (3 images per well). The average pixel intensity corresponding to Ab fl-MSN was recorded
for each cell and the population average of three wells ± SD was calculated and plotted in function of time for
each condition tested. (A and B) Abfl-MSN160 and (C and D) Abfl-MSN50 were compared side by side in bEnd5
(A and C) and N2A (B and D) cells. For each condition, a typical picture is shown at the top of the graphs.
Incubation at 4 °C inhibited internalization compared to 37 °C (E).
141
The observed non-specific signal could be associated to TfR-unrelated binding/adsorption of antibody-
conjugated nanoparticles at the surface of cells, or to non-specific nanoparticles endocytosis into the cells. To
clarify these hypotheses, cellular uptake assay were performed at 4 °C and 37 °C and higher magnification was
used to localize specific versus non-specific fluorescence and (Figure 4.8-E). The endocytosis of nanoparticles
is inhibited at 4 °C and activated at 37 °C. At 4 °C, after treatment with Ri7-MSN nanoparticles, cell contours
were labeled with these nanoparticles in both cell types and for both nanoparticles sizes. This labeling
corresponds to a specific signal associated with cell surface transferrin receptors binding. However, for large
particles, Figure 4.8-E revealed the presence of a lot of bright clusters, randomly distributed on the cell layers.
These clusters were nearly absent for small nanoparticles. At 37°C, the labeling of cell contours was nearly
absent and the corresponding fluorescence was located inside the cells. The labeling was more punctuate in
bEnd5 cells and concentrated in one dot in N2A cells, as previously published with free fluoro-labeled Ri7. 176
These observations suggest the successful endocytosis of Ri7-MSN. For small Ri7-nanoparticles, the
fluorescence was mostly located inside the cells, except of some bright clusters. In contrast, for large Ri7-
particles, the huge number of bright clusters still present. After treatment with IgG-MSN, figure 4.8-E reveals
only the presence of the bright fluorescence clusters randomly distributed on the cell layers and with the same
abundance than that observed after treatment with Ri7-MSN. Therefore, these clusters represent the observed
non-specific signal in figure 4.8-A,B,C,D and are probably the result of adsorptive non-specific interactions with
the extracellular matrix.
In summary, conjugation to Ri7 antibodies conferred to MSN the ability to bind the TfR at the cell surface and
trigger TfR-mediated endocytosis. This internalization process was size- and time- dependent. Higher specific
accumulation and better targeting ability of Ri7-conjugated MSN were found with small nanoparticles. The strong
non-TfR-specific signals encountered with larger Abfl-MSN160 disqualified them as candidates for efficient
targeted delivery to BMEC. This deficiency of larger nanoparticles could be related to their size per se (160 nm)
and/or to a multivalent specific binding of the TfR that can cause receptor crosslinking and prevent
internalization.287 From this point in our study, we therefore decided to focus the rest of this study on the use of
the potent small Ri7fl-MSN50 nanoparticles.
4.2.8 Uptake Affinity of Ri7-Conjugated MSN

We evaluated whether the conjugation of Ri7fl to 50 nm MSN modified its uptake affinity compared to that of the
unconjugated Ri7fl antibody. For this, bEnd5 and N2A cells were incubated for 40 min at increasing
concentrations of Ri7fl-MSN50, control IgGfl-MSN50 and unconjugated (free) Ri7fl. We observed that specific
uptake was achieved up to 15 nM concentration. Higher magnification revealed the presence of Ri7fl-MSN50
across the cytoplasm in bEnd5 cells with minimum of non-specific signal, confirming the highly specific uptake
of this nanocarrier system (Figure 4.9-C). At higher concentrations, non-specific signal (IgG fl-MSN50) was
142
detected and increased steeply thereafter (Figure 4.9-A,B). Thus, in order to evaluate the apparent uptake
affinity of Ri7fl-MSN50, we subtracted the values from IgGfl-MSN50 to distinguish TfR-specific uptake.
Concentrations of the conjugated antibody were used rather than those of the MSN per se in order to facilitate
comparison with the free antibody. Since ~17 antibodies were conjugated to each MSN 50, the real MSN50
concentration is thus 17 times lower. The apparent uptake affinity was estimated by calculating the EC50 (half
maximal effective concentration) of Ri7fl-MSN50, which is compared to that of unconjugated Ri7fl in bEnd5 (17.0
± 2.0 nM and 13.0 ± 0.8 nM, respectively) and in N2A (12.7 ± 1.0 nM and 7.5 ± 0.7 nM, respectively). However,
the slightly inferior affinity of Ri7fl-MSN50 is not surprising to the TfR compared to free antibodies. This could
probably be improved by finely tuning the number of antibodies per nanoparticle to optimize the uptake of Ri7-
MSN50. Figure 4.9-D,E also shows that Ri7fl-MSN50 uptake was inhibited with increasing concentrations of free
unlabeled Ri7, confirming the specificity of the TfR mediated uptake in both brain cell lines. The half maximal
inhibitory concentration (IC50) was determined at 19.8 ± 1.4 nM in bEnd5 and 18.4 ± 1.3 in N2A when incubated
with 15 nM Ri7fl-MSNs, indicating that competition kinetics are similar in both cell lines.
143
Figure 4.9. Cellular accumulation of Ri7fl-MSN50 at different Ri7 concentrations. A-C) Increasing
concentrations of targeted Ri7fl-MSN50, control IgGfl-MSN50 or unconjugated Ri7fl were incubated with bEnd5
(A) and N2A (B) cells at 37 °C. Cellular uptake was stopped by removal of the medium followed by ice-cold
washes and immediate fixation with 10 % formalin. Cells were automatically imaged using a Cytation5 multi-
144
mode reader with a 10X objective (3 images per well). The average pixel intensity corresponding to Ab fl-MSN
was recorded for each cell and the population average of three wells ± SD was calculated and plotted in
function of concentration for each condition tested. The best fitting curves were traced on each graph. A typical
image is shown on the top of the graphs for each concentration tested. C) Representative 60X magnification of
the uptake of 15 nM IgGfl-MSN50 versus 15 nM Ri7fl-MSN50 in bEnd5 cells. D-E) 15 nM Ri7fl-MSN were
incubated in the presence of increasing concentrations of unlabeled Ri7 to block the transferrin receptor in
bEnd5 (D) and N2A (E) cells, as previously described. EC50 and IC50 values were evaluated by non-linear
curve fitting of the five-parameter logistic function.
4.2.9 Assessment of Ri7-MSN50 BBB Targeting Ability in vivo

In vivo studies were carried out to further evaluate the BBB targeting ability of Ri7-MSN 50. For this, 0.25 nmol of
Ri7fl-MSN50 and the control IgGfl-MSN50 were intravenously injected into the tail vein of adult male BALB/C mice.
After 1 hour intravenous injections, mice were sacrificed and coronal brain sections were prepared for
immunohistochemistry. As evidenced in Figure 4.10, a strong fluorescent signal corresponding to the presence
of Ri7fl-MSN50, was found in brain microvessels. This was confirmed by the colocalization of Ri7fl-MSN50
nanoparticles (red fluorescence) with brain microvessels (green fluorescence). This labeling of microvessels
was found throughout the brain. The signal was strongly specific to Ri7fl-MSN50 as no fluorescence was observed
using the same amount of IgGfl-MSN50. This highlights the specific interaction taking place between transferrin
receptors on the surface of BMEC, and the Ri7-conjugated MSN. At high magnification, the speckled fluorescent
signal suggests that Ri7fl-MSN50 were efficiently internalized in the BMEC and are accumulated in intracellular
vesicles rather than uniformly distributed on the surface of brain microvessels. 174, 175 After 1 hour post-injection
of Ri7fl-MSN50, no evidence was found yet, of a penetration of the MSN in the brain parenchyma (no fluorescence
was observed outside microvessels). More investigations are needed to measure the kinetics of uptake and
binding of BMEC in vivo, as well as penetration of Ri7-MSN in the parenchyma. Nonetheless, our results provide
the proof of concept that 50-nm MSN can efficiently target BMEC and be internalized, in vivo. This is due to the
relatively small size of such nanoparticles and to the conjugation with Ri7 antibodies.
145
Figure 4.10. Accumulation of Ri7fl-MSN50 in brain microvessels after intravenous injection. Mice were injected
twice with 0.25 nmol of IgGfl-MSN (A) or Ri7fl-MSN (B and C) at 1 h interval. Animals were sacrificed 1h after
the last injection by transcardial perfusion and coronal brain sections were prepared for immunohistochemistry.
Endothelial cells were selectively labeled with biotinylated lectin followed by detection with Alexa Fluor®488-
labeled streptavidin (green) and nuclei were stained using DAPI (blue). Ri7 fl-MSN50 are in red and colocalized
with brain endothelial cells while IgGfl-MSN50 were not detected. The pictures presented were taken in the
cerebral cortex and typically represent the average accumulation observed in the entire brain from at least 20
different slices.
4.3 Conclusion
MSN (50 nm and 160 nm) conjugated to the antibody Ri7 were found to bind to the transferrin receptor and
BMEC in vitro in a time- and temperature-dependent manner. However, larger 160-nm MSN exhibited high non-
specific binding whereas smaller 50-nm MSN displayed specific targeting. Cells incubated with Gd-functionalized
Ri7-MSN showed a positive contrast enhancement in MRI, highlighting the potential of antibody-conjugated MSN
for theranostic applications. In addition, 50 nm Ri7-MSN have proved their ability to accumulate massively in
BMEC in vivo. Finally, the development of such Ri7-conjugated MSN50, showing a high affinity and targeting
ability to the BMEC, opens new possibilities of therapeutic targeting in diseases of the central nervous system,
in particular neurodegenerative ones.
146
4.4.1 Materials
(EO106PO70EO106, BioReagent), (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and diethylenetriaminepentaacetic
dianhydride (DTPA dianhydride, 98%) were from Sigma-Aldrich (Canada). Triethanolamine was from Alfa-
Aesar (Canada). Alexa Fluor®647 NHS-ester, Alexa Fluor®488-labeled streptavidin, Alexa Fluor®546-labeled
streptavidin, biotinylated potato lectin, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole and Dihydrochloride (DAPI) were
purchased from ThermoFisher Scientific/Life Technology (Canada).
4.4.2 Production and purification of Ri7 anti-TfR antibody

Hybridoma cell lines Ri7217.1.3 (Ri7) secreting a rat monoclonal antibody specific for the mouse TfR1 were
obtained developed from by Dr. Jayne Lesley (Salk Institute, via Dr Pauline Johnson, U. of British Columbia,
Canada). The antibody was designed to target an exofacial epitope on the TfR. Hybridoma cell lines were
cultured in CELLine bioreactors in serum-free mAb medium (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada).
Supernatants were harvested weekly. mAbs were purified using HiTrap protein G columns and the Akta Prime
Plus system (GE Healthcare, Baie d’Urfé, QC, Canada) according to the manufacturer’s recommendations.
Purified antibodies were concentrated with Amicon ultracentrifugal filter units (Millipore, Billerica, MA; molecular
weight cut-off, MWCO 1 4 30 kDa) and subsequently dialyzed against 1X phosphate-buffered saline (PBS) (pH
7.4) using Slide-A-Lyzer dialysis cassettes (MWCO: 10 kDa; Pierce, Rockford, IL).
4.4.3 Conventional MSN (160 nm in diameter)

Larger MCM-48-type MSN were synthesized as reported in the literature.78 Briefly, CTAB (1 g) and F127 (4 g)
were dissolved in EtOH 100% (85.41 mL) and 2.9 wt% NH4OH solution (212.86 mL). Then, TEOS (3.86 mL)
was added at room temperature (RT) under high stirring rate (1000 rpm) for 1 minute. The reaction mixture was
then aged 24 h under static conditions (air, RT). The resulting product was collected by centrifugation (10 000
rpm), washed twice with water and dried overnight in air at 65°C. Finally, the product was calcined (air, 550 °C,
1°C min–1, 5 h). The resulting nanoparticles are designated as "MSN160".
4.4.4 Small sized-MSN (50 nm in diameter)

Smaller MSN were synthesized as reported recently in our previous work.272 Briefly, CTAB (663.2 mg), F127
(2.68 g) and triethanolamine (15.64 g) were dissolved in EtOH 100% (56.64 mL) and water (125.2 mL), followed
by overnight stirring. TEOS (2.56 mL) was added, followed by the same procedure as described above, except
for the addition of 200 mL of ethanol (95%) to the translucent, colloidal suspension of the obtained mesoporous
material prior to the centrifugation step. The resulting nanoparticles are designated as "MSN 50".
147
4.4.5 Amine functionalization
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) was used for MSN functionalization. Pure MSN (400 mg) were
suspended in dry toluene (40 mL). APTES (0.4 mL) was added at once to the nanoparticle suspension under
inert gas and the mixture was refluxed overnight at 110 °C. Functionalized nanoparticles were then centrifuged
(10000 rpm for at least 15 min), washed three times with ethanol and once with acetone and finally dried at 50
°C. The resulting nanoparticles are designated as "MSNx-NH2". The w/w percentage of grafted APTES was
measured by thermogravimetric analysis (TGA).
4.4.6 DTPA grafting

MSNx-NH2 nanoparticles (200 mg) were suspended in anhydrous DMSO (20 mL). In another flask, DTPA
dianhydride (40 mg mL-1) was dissolved in anhydrous DMSO (at RT, under inert gas, 1 h stirring and 15 min
sonication). 0.25 mL of this solution was added dropwise to the nanoparticles suspension (in anhydrous toluene)
and the mixture was stirred overnight at 110 °C, under reflux and inert gas. Functionalized nanoparticles were
then centrifuged (10000 rpm for 15 min at least), washed three times with ethanol and once with acetone and
finally dried at 50 °C. The resulting nanoparticles are designated as "MSNx-DTPA". The w/w percentage of
grafted DTPA was measured by thermogravimetric analysis (TGA).
4.4.7 DTPA-Gd(III) Chelation

Gd(CH3CO2)3,xH2O (1 mL, 50 mM) was slowly added to the nanoparticles (MSNx-DTPA, 10 mg). The obtained
suspension was stirred under moderate agitation (1 h, RT). The labeled particles were recovered by
centrifugation (10 000 rpm, 15 min). These nanoparticles were washed several times with nanopure water.
Between each washing, the T2 of the supernatant was measured with a dedicated TD-NMR relaxometer (Bruker
Minispec 60 mq, 60 MHz, 25 °C). After 5 washing steps, T2 reached 2100 ms; the supernatant was
considered Gd3+-free and the nanoparticles were then considered purified from un-chelated Gd 3+ ions.
4.4.8 PEG grafting and conjugation of the antibody (Ab: Ri7; IgG) to MSN x-
DTPA(Gd)
First of all, Ri7 and IgG were labeled with Alexa Fluor®647 (labeling procedure is described below). Then,
polyethylene glycol (PEG) was covalently attached to the obtained labeled antibody (Ab). For this we used
bifunctional PEG (maleimide-PEG-N-Hydroxysuccinimide, MAL-PEG-NHS). The reaction between PEG and the
antibody is based on the reaction between the available thiol group of the antibody and the maleimide function
of PEG. Briefly, NHS-PEG-MAL (2 mg mL-1, HEPES antibody 0.05M + EDTA 0.1 mM, pH 7) was added to an
equimolar amount of the corresponding labeled antibody (1.5 mg mL-1, HEPES 0.05M + EDTA 0.1 mM, pH 7).
After 1 h incubation at RT, the mixture was purified by centrifugation and washing (5 times) using a Vivaspin
filter device (Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, MMCO, 30 kDa, France). Finally, the obtained antibodies NHS-
148
PEG-Ab (NHS-PEG-Ri7 and NHS-PEG-IgG) were conjugated to MSNx-DTPA(Gd) nanoparticles. Typically, 10
mg of nanoparticles were suspended in HEPES (0.05M, pH 7). Then, 1.55 mg and 0.55 mg of NHS-PEG-Ab
were added to MSN50-DTPA and MSN165-DTPA suspension, respectively. The mixture was kept under moderate
stirring at RT for 1 h. The conjugated nanoparticles were then purified by centrifugation (10000 rpm, 15 min) and
washing (3 times at least with nanopure water). Finally, the obtained MSNx-DTPA(Gd)-PEG-Ab (MSNx-
DTPA(Gd)-PEG and MSNx-DTPA(Gd)-IgG) were suspended in 1 mL of nanopure water. To ensure an easy and
shortened abbreviation, these resulting nanoparticles are also designated just as Ri7-MSN x. The amount of
conjugated antibody per nanoparticle and in the obtained suspensions was quantified by thermogravimetric
analysis and fluorescence and UV-Vis spectroscopy. Equivalent conjugation values were obtained with either
Ri7 or its isotypic control (IgG).
4.4.9 Antibody labeling with Alexa Fluor®647

Antibodies were covalently labeled on the amine groups using Alexa Fluor®647 carboxylic acid succinimidyl
ester dye (Life Technologies, Burlington, ON) in order to obtain a ratio of 3 to 6 molecules of dye per antibody
antibody (degree of labeling, DOL). Typically, 20 nmol antibodies were incubated with 120 nmol of dyes in 0.1
M bicarbonate buffer (pH 8.3) for 1 h at room temperature. Antibodies were dialyzed overnight at 4 °C in the
same buffer to remove unreacted dye using 10 KDa MWCO Slide-A-Lyzer dialysis cassettes (Thermo Fisher
Scientific). The buffer was replaced by water for the last 2 h. Antibody and dye concentrations were estimated
from their respective molar absorption coefficients at 280 nm and 650 nm respectively, and the DOL was
calculated by the ratio of both concentrations (dye/antibody), as instructed by the manufacturer.
4.4.10 X-ray diffraction characterization

XRD measurements were performed using a Siemens D5000 (reflection, θ–θ configuration; CuKα: λ = 1.541 Å;
40 kV; 30 mA; 1–8° 2θ, step size: 0.02 2θ; 0.02 s/step).
4.4.11 Nitrogen physisorption analysis

Nitrogen physisorption measurements were performed at −196° C with an Autosorb iQ2 (Quantachrome
Instrument, Boynton Beach, USA). Before the sorption measurements, the samples were outgassed under
vacuum at 200 °C for 12 h (for pure MSN) or 80°C for 10 h (for functionalized MSN). The surface area (S BET)
was determined using the BET equation in the range 0.05 ≤ P/P0 ≤ 0.20 and the total pore volume was obtained
at P/P0 = 0.925. Pore diameter was estimated using non-local density functional theory (NLDFT) methods
applying adsorption branch model (considering N2 sorption at −196 °C in silica with cylindrical pore geometry).
149
4.4.12 Thermogravimetric analysis - Differential Scanning Calorimetry analysis
(TGA-DSC)
mL/min, with a heating rate of 10 °C/min, between 35 and 700 °C. The percentage of grafted amine and DTPA
groups was calculated based on the mass loss between 200 °C and 630°C. The residual solvent (e.g.,
physisorbed water) was excluded from the calculation.
4.4.13 TEM particle size analysis

The nanoparticles were dispersed in water, the suspension (5 μL), deposited on a carbon-coated copper grid
and dried for at least 24 h. Images were taken in with a JEM-1230 TEM at an accelerating voltage of 80 kV.
4.4.14 Dynamic light scattering

Malvern DTS Nano zetasizer 173° (T = 25 °C, equilibration time set to 3 min; 3 measurements taken on each
sample; only quality criteria data accepted as valid results).
4.4.15 NMR characterization

DRX300 MHz NMR spectrometer. The 75.4 MHz 13C Cross Polarization (CP)-MAS and the 59.6 MHz 29Si MAS
NMR spectra were obtained using a 4 mm rotor spinning at 10 kHz. The chemical shifts are reported in ppm
relative to adamantane for 13C and to tetramethylsilane (TMS) for 29Si.
4.4.16 X-ray photoelectron spectroscopy

Elemental analysis of the surface was investigated by X-ray photoelectron spectroscopy, using a PHI 5600-ci
spectrometer (Physical Electronics, Eden Prairie, MN). The main XPS chamber was maintained at a base
pressure of < 8.10-9 Torr. A monochromatic aluminum X-ray source (Al k = 1486.6 eV) at 250 W was used to
record survey spectra (1400-0 eV) as well as high-resolution spectra. Charge neutralization was applied. The
detection angle was set at 45º with respect to the normal of the surface and the analyzed area was 0.016 cm 2.
4.4.17 Attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-

FTIR)
ATR-FTIR analyses were performed using a Nicolet Magna 550 Fourier transform infrared spectrometer
(Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) equipped with a germanium-coated KBr beamsplitter and a DTGS/KBr
150
detector. 20 mL of the aqueous suspensions of nanoparticles were directly deposited on the Si crystal and then
dried under vacuum at 40 °C. Spectra were recorded in absorbance mode with 120 scans and a spectral
resolution of 4 cm-1.
4.4.18 1H relaxation analysis and relaxometric properties measurement

Longitudinal and transversal relaxation times (T1 and T2) of Gd-labeled nanoparticles suspensions (MSNx-
DTPA(Gd)-Ab) were measured with a TD-NMR relaxometer at clinical magnetic field strength (Bruker Minispec
60 mq, 60 MHz, 1.4 T, 37 °C, 300 μL of suspension in 6.0 mm NMR tubes). The amount of Gd in each suspension
was precisely measured by ICP/MS. Relaxation rates (1/T1 and 1/T2) were plotted against Gd concentration
values, and relaxivities (r1 and r2) were calculated from the slope of these curves. T1-weighted MR images were
measured at clinical magnetic field strength (1 Tesla, TE/TR = 10.7/1000 ms).
4.4.19 MRI cell pellet imaging

Murine brain endothelioma cells (bEnd5 cells, 2.5 × 105) were incubated at 37 °C for 4 h with IgG- and Ri7-MSN
(300 μg mL-1). Then, the cells were washed carefully 3 times and collected by centrifugation. Finally, the tubes
containing the cell pellets were immersed in nanopure water and inserted in a 60-mm-diameter whole-body rat
coil for MR imaging. T1-weighted MR images were measured at clinical magnetic field strength (1 Tesla, TE/TR
= 10.7/1000 ms). Quick quantification by image analysis was performed with ImageJ to confirm contrast
enhancement of Ri7-MSN-treated cells compared to untreated cells and the specificity of Ri7-MSN compared to
IgG-MSN.
4.4.20 In vitro cell uptake experiments

Murine brain endothelioma cells (bEnd5, #96091930, HPACC, Salisbury, UK, 65 000 cells) and neuroblastoma
cells (N2A, #CCL-131, ATCC, Manassas, VA, 60 000 cells) cells were seeded in 96-well plates, respectively 24
h and 48 h before the experiments, and cultured in DMEM supplemented with 10% FBS at 37 °C in a humidified
atmosphere containing 5% CO2. For the experiments, the medium was replaced with the same medium IgG fl- or
Ri7fl-MSN, or the free fluorolabeled antibodies, and incubation was resumed for a specific time. Cell uptake was
stopped by removal of the medium followed by three ice-cold washes with PBS containing Mg 2+ and Ca2+. Cells
were immediately fixed with 10% formalin (pH 7.0) during 20 min at room temperature. Cell membranes were
then labeled with 4 µg mL-1 of biotinylated potato lectin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) during 30 min
followed by a 30 min incubation with 2 µg mL-1 Alexa Fluor®546-labeled streptavidin. Nuclei were stained during
10 min in 1 µg/mL DAPI in PBS. Cells were conserved in PBS until the fluorescence microscopy studies.
151
4.4.21 Cellular fluorescence quantification
All images (1224 px x 904 px, 789 µm x 583 µm) were acquired automatically with a Cytation5 imaging multi-
mode reader (BioTek Instrument, Winooski, VT, USA) using an Olympus UPLFN 10X (NA: 0.3, W.D.: 10 mm)
objective and a brightfield-based autofocus. For each well, three differently positioned stacks composed of the
nuclei, cell membrane and fluorescent antibody/MSN were acquired using the DAPI (ex: 377 nm, em: 447 nm),
RFP (ex: 531 nm, em: 593 nm) and Cy5 (ex: 628 nm, em: 685 nm) filters, respectively, and saved in a looseness
16 bit TIFF format. For each stack, cells were segmented with the Voronoi tesselation algorithm of the EBImage
R package version 4.12.2286 using the DAPI signal as seeds and the lectin signal as cellular mask. The average
Cy5 pixels intensity was recorded for each cell and the population average of three wells ± SD was calculated
for each condition tested. Cells with abnormally low reactivity to DAPI were excluded from the analysis. The
small difference in DOL between Ri7fl and IgGfl was taken into account. For example, a correction factor of 1.65
was applied to IgGfl-MSN50 values when the DOL of Ri7fl and IgGfl were 4.86 and 2.96, respectively. For the
increasing concentration studies, half maximal effective concentration (EC50) values were evaluated by non-
linear curve fitting of the five-parameter logistic function (EC50 ± 95% CI) using R nls function. 49
4.4.22 Immunohistochemistry
Adult male BALB/C mice (Charles River Laboratories Inc., Wilmington, MA) weighing 20 to 30 g were sacrificed
by transcardial perfusion with 50 ml of ice-cold PBS under deep anesthesia with ketamine/xylazine. Brains were
snap-frozen in a 1:1 20% sucrose/OCT solution and stored at −80 °C. Coronal brain sections (12 µm) were
prepared using a cryostat, thaw-mounted onto superfrost plus slides (Fisher Scientific Company, Ottawa, ON,
Canada) and desiccated at 4 °C overnight and stored at −80 °C. For immunohistochemistry, sections were fixed
in 4 % paraformaldehyde (pH 7.4) during 10 min and blocked for 1 h in a PBS (pH 7.4) solution containing 5%
horse serum (Invitrogen) and 0.2% Triton X-100. Sections were then incubated overnight at 4°C with 15 nM
fluorescent IgG- or Ri7-conjugated nanoparticles in the blocking solution. Endothelial cells were selectively
labeled with 5 µg/mL biotinylated potato lectin during 30 min followed by a 30 min incubation with 2 µg/mL Alexa
Fluor®488-labeled streptavidin. Nuclei were stained during 10 min in 1 µg/mL DAPI in PBS. Three PBS washes
were done between each step of the immunohistochemistry. Sections were placed under coverslips with Mowiol
mounting media and imaged with an EVOS Fl auto Imaging System (Life Technologies) with a 10X, 60X or 100X
objectives and DAPI, GFP and Cy5 filter cubes. For in vivo injection experiments, mice were injected twice with
0.25 nmol of IgGfl-MSN or Ri7fl-MSN at 1 h interval, sacrificed 1 h after the last injection before continuing with
tissue processing and immunohistochemistry, as described above. In all cases, poorly perfused animals as
assessed by the presence of blood in the brain were excluded from further analysis.
152
a) b) c)
1400 0.14
MSN50 MSN160 MSN160
(211) MSN160 1200 MSN50 0.12 MSN50
Adsorbed volume (cm g )

3 -1
1000 0.10
d(d) (cm Å g )
3 -1 -1
800 0.08
600 0.06
400 0.04
(220)
(420) (332) 200 0.02
0 0.00
2 4 6 8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 4 6 8
2
Figure S4.1. Powder XRD patterns (a), N2 physisorption isotherms (-196 °C) and (b) respective NLDFT pore
size distributions (c) of small and large nanoparticles. The isotherm for large MSN (MSN 160) is offset vertically
by 200 cm3 g−1 STP.
a) b)
100 100
95
95
90
90
85
85 80
Mass (%)
Mass (%)
80 75
70
75
65 MSN160-NH2
70 MSN50-NH2
60 MSN160-DTPA
MSN50-DTPA
65 MSN160-DTPA(Gd)-PEG-Ri7
MSN50-DTPA(Gd)-PEG-Ri7 55
MSN160-DTPA(Gd)-PEG-IgG
MSN50-DTPA(Gd)-PEG-IgG
60 50
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Temperature (°C) Temperature (°C)
Figure S4.2. Thermogravimetric analysis of small and large functionalized mesoporous silica nanoparticles (a
and b, respectively).
153
4
Ri7-AlexaFluor 647
Ri7-MSN50
Ri7-MSN160
3
Absorbance (a. u.)
0
300 400 500 600 700 800 900
Wavelength (nm)
Figure S4.3. UV-Visible spectra of Ri7 labeled with Alexa Fluor®647 before and after conjugation to small and
large mesoporous nanoparticles.
16 R i7
R i7 -P E G
14
12
Intensity / a.u.
10
1 10 100 1000 10000

H y d ro d y n a m ic d ia m e te r / n m
Figure S4.4. DLS analyses of Ri7 antibody before and after PEG grafting.
154
100
80
Y = 36.35 x - 0.41
60
1/Ti / s-1 40
Y = 21.91 x + 0.35
20
0
0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4
[Gd] / mM
Figure S4.5. Longitudinal (1/T1 + C, squares) and transverse (1/T2 + C, diamonds) relaxation rates of Ri7-
MSN (i.e. MSN-DTPA(Gd)-PEG-Ri7) nanoparticles, as a function of Gd 3+ concentration values.
Figure S4.6. Specific uptake of mesoporous silica nanoparticles, obtained by subtracting the fluorescence
values of Ri7fl-MSN uptake of that of IgGfl-MSN.
155
MSNx Solution Time Hydrodynamic diameter [nm] Polydispersion
index
Number Intensity Z-average (PDI)
mode mode
24 h 57 96 85 0.141
Water
1 week 61 101 98 0.131
MSN50 24 h 62 95 91 0.145
PBS
1 week 59 103 97 0.155
24 h 82 151 141 0.205
Water
1 week 89 160 150 0.154
MSN50-DTPA(Gd)-Ri7 24 h 75 165 147 0.200
PBS
1 week 88 155 151 0.166
24 h 181 206 195 0.045
Water
1 week 181 202 193 0.018
MSN160 24 h 182 210 199 0.058
PBS
1 week 195 219 208 0.037
24 h 220 255 245 0.115
Water
1 week 224 259 243 0.063
MSN160-DTPA(Gd)-Ri7 24 h 240 290 265 0.195
PBS
1 week 227 295 257 0.221
Table S4.1. Hydrodynamic diameters and polydispersion indexes of the nanoparticles, before and after
antibody bioconjugation.
2.6 Acknowledgment
(Canada), the Canadian Institutes of Health (CIHR-NSERC collaborative Health Research Project grant 127778)
and the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FRQNT Team grant 2013-PR-
167010). The authors would like to thank Dr Pascale Chevallier (CHU, Quebec) for XPS analysis and APTES
grafting on 50 nm MSN, Dr Jean Lagueux (CHU, Quebec) for T1-weighted MRI phantoms, Dr Vincent
Emond (CHU, Quebec) for advices during the in vitro and in vivo studies and during the writing of this paper,
Prof. Ryong Ryoo and Dr Yongbeom Seo (KAIST, Korea) for HRTEM images as well as Ms. Caroline Germain
(student from INSA, Rouen) for DTPA grafting.
156
Chapitre 5 – Article 4 : Fluorinated Mesoporous
Silica Nanoparticles for Binuclear Probes in 1H and
19
F Magnetic Resonance Imaging
Meryem Bouchoucha,†,‡,§ Ruud B. van Heeswijk,∥ Yves Gossuin,⊥ Freddy Kleitz,*,†,§ and Marc-Andre Fortin*,‡
†
Department of Chemistry and §Centre de Recherche sur les Materiaux Avances (CERMA), Universite Laval, Quebec,
Quebec G1V 0A6, Canada
‡
Department of Mining, Metallurgy and Materials Engineering, Universite Laval and Centre de Recherche du Centre
Hospitalier Universitaire de Quebec (CR-CHUQ), Axe Medecine Regeneratrice, Quebec, Quebec G1L 3L5, Canada
∥
Department of Radiology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV), 1011 Lausanne, Switzerland
⊥
Service de Physique Experimentale et Biologique, Universite de Mons, 24 Avenue du Champ-de-Mars, 7000 Mons,
Belgium
Published: Septembre 2017
157
Résumé
Lorsque combiné avec l'IRM du 1H, l'IRM du 19F permet d’avoir des informations anatomiques avec une
résolution élevée et d’assurer en même temps un diagnostic quantitatif. Dans cette étude, nous rapportons le
développement de nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs) fluorées, en tant que sondes pour l’IRM
binucléaire (l’IRM du proton et du fluor). Pour cela, des MSNs de type MCM48 ont été synthétisées et
fonctionnalisées avec des molécules de fluorosilane (FMSNs) ou avec des macromolécules de
polyfluorosiloxane (polyFMSNs). Les chelates de gadolinium ont été également greffés à la surface de ces
nanoparticules afin de conférer à ces nanosondes une amélioration du contraste positif en IRM du proton. Les
nanoparticules obtenues ont été caractérisées et leurs performances relaxométriques 1H et 19F ont été mesurées
avec précision. Une étude comparative entre les deux systèmes (FMSNs et polyFMSNs) a été réalisée. De
meilleures relaxivités du fluor ont été obtenues avec les polyFMSNs, par rapport à celles obtenues avec des
FMSNs, engendrant ainsi une meilleure sensibilité du signal en IRM du 19F. De fortes propriétés relaxométriques
1H ont été obtenues pour les deux types de nanoparticules fluorées, et ce à des forces de champs magnétiques
différentes (y compris les champs cliniques où r2/r1 ≈ 1,45). Des mesures relaxométriques ont également été
effectuées sur des nanoparticules piégées dans un hydrogel. Bien qu'une diminution modérée des relaxivités a
été observée pour ces systèmes, le rapport r2/r1 obtenu (≈ 2,2) est adéquat pour engendrer une augmentation
du contraste positif en IRM 1H. Enfin, les études in vitro en IRM du proton et du fluor ont confirmé la capacité
des deux types de nanoparticules fluorées à produire une forte amélioration du contraste positif en 1H et ont
révélé la performance unique des polyFMSNs pour générer des images en IRM du 19F. Les performances
relaxométriques des nanosystèmes fluorées obtenues confirment leur fort potentiel en tant que nanoparticules
sondes pour l’IRM binucléaire (1H et 19F). Ces résultats ouvrent aussi les portes vers de futures utilisations en
tant que nanovecteurs pour des applications théranostiques ou pour le développement de dispositifs
implantables.
158
Abstract
The development of molecular and cellular magnetic resonance imaging (MRI) procedures has always
represented a challenge because of the fact that conventional MRI contrast agents are not directly detected in
vivo; in proton MRI (e.g., with the nucleus 1H), their local concentration is measured through the effect they exert
on the signal of hydrogen protons present in their immediate vicinity. Because the contrast effects generated by
conventional MRI probes superpose to and can often impede the anatomical information contained in 1H MRI
images, new probes based on a nucleus other than 1H, are being developed. In this study, we report on the
development of fluorinated mesoporous silica nanoparticles (MSNs), which could represent an interesting dual
probe that allows two MRI modes: 1H for high-resolution anatomical information and 19F for the detection of
MSNs used as drug delivery agents. MSNs were synthesized and covalently functionalized either with
fluorosilane (FMSNs) or polyfluorosiloxane (polyFMSNs) to enable their detection in 19F MRI. Then, gadolinium
chelates were grafted on the particles to enhance their detectability in 1H MRI. The physicochemical, textural,
and relaxometric properties (1H and 19F relaxation times) of the nanoparticles were measured and compared.
The 19F relaxation properties were found to be dependent on the concentration of fluorine; they were also highly
sensitive to the presence of gadolinium. The shortest relaxation times were obtained with polyFMSNs. At clinical
magnetic field strengths, high 1H relaxivities and low relaxometric ratios (r2/r1 = 1.45; 2.2 for nanoparticles
entrapped in hydrogel) were found for both nanoparticle systems. Finally, the visibility of both systems was
confirmed in 1H, and the detectability of polyFMSNs was confirmed in 19F MRI. This physicochemical and
relaxometric study opens the door to the applications of fluorinated silica nanoparticles as theranostic materials
allowing dual MRI (1H and 19F).
159
5.1 Introduction
Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) are one of the most active research areas in nanoscience and
nanotechnology.40 In the last decades, these materials have been explored for their applications in catalysis, 288
analytical extraction,289 sensing,290, 291 optics,292 drug delivery167 and bioimaging.46 Recently, there has been a
sustained interest for the grafting of fluorinated compounds at the surface of MSNs. This could be an effective
strategy to innovate in the fields of chromatography and molecular separation, 293 biosensors,294 hydrophobic
coatings for optical applications295-297 as well as for catalytical systems298. In fact, one of the greatest assets of
MSNs is the ability to functionalize both their external and their inner surface with different functional groups. To
achieve this goal with fluorinated compounds, new grafting procedures must be developed. In fact, biomedical
imaging is one of the areas that could benefit the most from fluorinated MSNs products; however, biomedical
MSNs must be surface-treated in a certain way as to preserve their hydrophilicity and their colloidal stability.
This represents a certain challenge that must be addressed in a systematic and comprehensive study.
Fluorinated nanoparticles can be detected by 19F magnetic resonance imaging (MRI) and this innovative
bioimaging modality had led to the emergence of new medical procedures (e.g. diagnostics and theranostics). 299
Compared to the other clinical molecular imaging techniques mainly based on the injection of radioisotopes (e.g.
positron emission tomography (PET)), MRI does not rely on ionizing radiation. It is a noninvasive, whole-body
diagnostic tool that is widely used both in preclinical and in clinical procedures. MRI scanners usually detect the
signal from hydrogen protons (1H): the most important advantage of 1H MRI is the capacity to generate
anatomical images from the strong hydrogen contents of the human body. However, the 19F nucleus can also
be very sensitively detected by MRI; it has a 100% natural abundance and it resonates at a frequency
corresponding to 94% of that of 1H. Only a slight change in the radiofrequency wave used to excite the 1H
nucleus is necessary to activate the detection of the signal in 19F MRI. Only limited investment in the hardware
of MRI systems currently installed in hospitals and clinics would be necessary to endow the current infrastructure
with a dual 1H/19F detection capacity. In fact, the interest of the medical imaging community for the potential of
19F MRI has been growing in the past few years.
Because the biological tissues contain only traces of fluorine, probes made of 19F could be detected in MRI at a
potentially very strong signal-to-background ratio.124 The detected signal can be directly correlated with the
concentration of 19F probes accumulated in specific organs. This appears significantly different to the usual
detection of 1H with MRI, which is generally used to generate most clinical MRI anatomical images based on
the very strong signal of protons in the mobile water molecules of biological tissues ( 1H instead of 19F as the
signal nucleus). Hence, 19F-based imaging probes detected with 19F MRI and superposed onto 1H MRI
anatomical maps could provide a strategy similar to that of other imaging procedures where an anatomical
modality [e.g., MRI or computed tomography (CT)] is coupled with a molecular one based on the high-sensitivity
160
detection of radioactive probes [e.g., PET or single-photon emission CT (SPECT)]. In the case of dual 19F/1H
MRI, the major advantage would rely on the possibility to perform totally ionizing radiation-free imaging
sequences. Therefore, fluorine MRI could be used as an alternative to radioactive tracers in certain quantitative
biodistribution studies. The development of probes containing enough fluorine to reach detectability in 19F MRI
is the highest challenge in this field. Therefore, there is a need at the moment to explore different synthetic
routes enabling the production of nanoparticle-based imaging probes having multiple fluorine groups grafted
either at their surface or within their core.
During the past few decades, imaging probes based on 19F (nonsilica) have already been developed for cell
tracking and inflammation imaging.125 These probes were formulated from perfluorocarbon (PFC) molecules
such as perfluoro-crown-ether (CxFyOz) and CxFy because of their high content in fluorine atoms.125, 300 18
Unfortunately, PFC formulations made of nanoemulsions and micelles have several drawbacks such as low
stability, limited aqueous dispersibility, and restricted functionalization capacity. 301 In addition to this, the
molecular detection of PFC probes in 19F MRI is much less sensitive than the detection of radioisotopes in
SPECT and PET imaging; in cell- tracking procedures, it requires the supersaturation of cells by the PFC contrast
agent, often to the limits of cell viability.302
Recently, the encapsulation of PFCs in MSNs has been suggested as a strategy to develop an improved
generation of fluorinated probes. PFCs, in the form of either C6F6 or perfluoro-crown-ether molecules, were either
trapped in the pores of MSNs or encapsulated in the core of “core−MSN−shell” systems. 138, 139, 141 The properties
of these 19F MRI-traceable nanocarriers appeared promising; however, the fluorine compounds were found
prone to diffuse through the pores of the MSNs, as observed for small PFC molecules (e.g., C6F6).138 To avoid
this undesirable leaching of fluorine groups from the surface of silica materials, it is necessary to graft the fluorine
probes with covalent bonds.
Another promising aspect of fluorine-grafted MSNs that has not been explored is the development of dual 19F
and 1H MR imaging probes. Paramagnetic elements such as gadolinium (Gd), chelated in small molecules such
as diethylenetriaminopentaacetic acid (Gd-DTPA), can be attached at the surface of MSNs. The strong
decrease in 1H longitudinal relaxation times observed in the labeled nanoparticles enables their efficient imaging
in T1-weighted 1H MRI. Hence, paramagnetic chelates grafted at the surface of MSNs allow the production of
imaging probes that induce a strong “positive” contrast enhancement effect.278, 279 Then, as a second sequential
radiological step, the concentration of MSN probes could be quantified by 19F MRI (molecular imaging modality).
To the best of our knowledge, there has been no report until now on the potential of MSNs for dual 1H and 19F
MRI procedures.
161
In this study, MSNs (MCM-48-type) were synthesized and functionalized with fluorine-containing molecules
(fluorosilane and polyfluorosiloxane) and with Gd chelates (Gd-DTPA). In both cases, the molecules were
covalently grafted at the surface of MSNs. The nanoparticles were thoroughly characterized, and their colloidal
stability was assessed by dynamic light scattering (DLS). The relaxometric properties of the nanoparticles for
19F and 1H MRI were measured. The 19F relaxometric performance of fluorosilane nanoparticles (FMSNs) was
also compared to that of polyfluorosiloxane nanoparticles (polyFMSNs). In addition, their 1H relaxometric
performance was measured in different media (water and hydrogel) and at various magnetic field strengths.
Finally, the suspensions of nanoparticles were imaged by 1H and 19F MRI (in vitro).

5.2.1 Synthesis of MSNs, Fluorination and Textural Properties
As illustrated in Figure 5.1, two types of fluorinated nanoparticles were synthesized from the pure MSNs of the
MCM-48 type.
Figure 5.1. TEM image of the MSN core (a), and (b) schematic representation of the two functionalization
routes and related steps.
In the first functionalization strategy, we used a small fluorosilane molecule as the source of fluorine (dimethoxy-
methyl(3,3,3-trifluoropropyl)silane). This compound contains three fluorine atoms per molecule (molecular
162
diagram illustrated in Figure 1). In the second functionalization strategy, the source of fluorine was a
polyfluorosiloxane macromolecule (i.e., poly(methyl-3,3,3-trifluoropropylsiloxane). This polyfluorosiloxane is a
polymer of the fluorosilane molecule (n = 14) and contains 42 fluorine atoms per macromolecule. Its molecular
structure is illustrated in Figure 5.1.
In the first functionalization strategy, simple fluorosilane molecules were grafted at the surface of MSNs (“F” =
(3,3,3-trifluoropropyl)methyldimethoxysilane; illustrated in Figure 5.1); however, the first step was the grafting of
the DTPA chelation agent to allow the subsequent labeling of paramagnetic Gd3+ according to our previously
reported work.278 The resulting nanoparticles are referred to as “MSN-DTPA”. Then, the nanoparticles were
functionalized with fluorosilane, yielding fluorosilane-labeled nanoparticles (“FMSN-DTPA”). Finally, Gd3+ was
chelated in DTPA, and the resulting fluorinated nanoparticles were designated as “FMSN-DTPA(Gd)”.
In the second functionalization strategy, polyfluorosiloxane molecules were grafted on MSNs (“polyF” =
poly(methyl-3,3,3- trifluoropropylsiloxane; illustrated in Figure 5.1). These molecules were grafted first, using a
thermal immobilization procedure performed at 200 °C and under nitrogen atmosphere. This step led to
polyfluorosiloxane-labeled nanoparticles (“polyFMSN”). Then, DTPA molecules were grafted at the surface,
yielding polyfluorosiloxane-labeled nanoparticles (“polyFMSN-DTPA”). To disperse polyFMSN-DTPA in
aqueous media, hydrophilic PEG chains (20 kDa) were grafted at the surface of this system. Finally, after Gd3+
chelation, the resulting fluorinated and PEGylated nanoparticles were designated as polyFMSN-DTPA(Gd)-
PEG. For simplified abbreviation, FMSN-DTPA and polyFMSN-DTPA-PEG nanoparticles are simply referred to
as FMSNs and polyFMSNs in the following text.
Pristine MSNs were visualized by transmission electron microscopy (TEM), which showed well-defined spherical
particles of an average particle size of 140 nm (Figure 5.1-a). Low-angle X-ray diffraction (XRD) data revealed
the typical peaks of the ordered 3-D cubic Ia3d mesopore structure (Figure S5.1-a, Supporting Information-
section 5.5). This structure is a signature of the MSNs belonging to the MCM-48 type. N2 physisorption results
showed a type IV isotherm (Figure S5.1-b, Supporting Information-section 5.5), which is associated with the
presence of uniform, narrow, and cylindrical mesoporous channels. The following values were also extracted
from the N2 physisorption measurements: high specific surface area (1200 m2 g−1; using the BET method; see
Table 1); large total pore volume (1 cm3 g−1; NLDFT method; Table 1); and mean pore diameter of 3.4 nm
(NLDFT method, Table 1 and Figure S5.1-c, Supporting Information-section 5.5)).
163
Sample Description BET Surface Pore Volume NLDFT Mean
Area [cm3 g-1] Pore size [nm]
[m2 g-1]
MSN MCM-48 (pristine) 1254 0.95 3.4
MSN-DTPA MCM48-6.3%DTPAsilane 1190 0.91 3.4
FMSN-DTPA MCM48-8.5%Fluorosilane 950 0.76 3.0
polyFMSN MCM48-18%polyFlurosiloxane 937 0.75 2.8
polyFMSN- MCM48-18%polyFlurosiloxane- 886 0.72 2.8
DTPA 4.3%DTPA
polyFMSN- MCM48-18%polyFlurosiloxane- 759 0.61 2.8
DTPA-PEG 4.3%DTPA-2%PEG
Table 5.1. Porosity data of nanoparticles extracted from nitrogen physisorption measurements.
TGA of the MSN-DTPA nanoparticles (Figure S5.2-a) showed a weight loss of 6.3% (i.e., after the grafting of
DTPA only). For FMSN-DTPA, an additional weight loss of 8.5% was found after fluorosilane grafting. These
fractions correspond to the thermal decomposition of DTPA and fluorosilane molecules. For polyFMSN, the
mass percentage (w/w) attributed to polyfluorosiloxane reaches 18%. This led to fluorine contents of 0.06 g per
gram of polyFMSNs versus 0.02 g of fluorine per gram of FMSNs. Additional weight losses of 4.3 and 2% were
observed on polyFMSN profiles after the grafting of DTPA and PEG, respectively (Figure S5.2-b, Supporting
Information-section 5.5). The hydrophobic or hydrophilic character of the MSN surfaces was also evaluated. For
this, pure and F-modified nanoparticles were suspended in water and dried at 50 °C overnight before TGA
measurement. The initial part of the TGA profiles showed a rapid weight loss of 9.8, 1, and 0.7% for pure MSNs,
FMSNs, and polyF-MSNs, respectively. This corresponds to the total evaporation of water molecules
physisorbed at the different surfaces of the nanoparticles (both external and inner surfaces).
The characteristics of the porosity were measured after each functionalization step, and the data are
summarized in Table 5.1. For fluorosilane-nanoparticles, 100% of the mean pore diameter and more than 90%
of the MSN surface area and the pore volume of pure MSNs were conserved after DTPA grafting (Table 5.1).
This suggests that the DTPA molecules were preferentially grafted at the outer surface of nanoparticles, as
reported and demonstrated in our previous work.278 After fluorosilane grafting, the specific surface area, the pore
volume and the pore size decreased to 950 m2 g-1, 0.76 cm3 g-1 and 3 nm, respectively (Table 5.1). This is in
good agreement with the introduction of fluorosilane molecules also at the inner mesopore surface. After
polyfluorosiloxane functionalization, the specific surface area, pore volume and pore size was equal to 937 m 2
g-1, 0.75 cm3 g-1 and 2.8 nm, respectively (Table 5.1). This suggests the presence of polyfluorosiloxane on the
entire exposed MSN surface (i.e., external and inner surface). After DTPA grafting, a very slight decrease (about
5%) of the surface area and pore volume (886 m2 g-1 and 0.72 cm3 g-1, respectively) was recorded, in comparison
164
to polyFMSN nanoparticles. The mean pore diameter remained the same (2.8 nm). The additional grafting of
2% PEG led to a further slight decrease (about 15%) of the surface area and pore volume (759 m 2 g-1 and 0.61
cm3 g-1, respectively) was also recorded. The mean pore diameter remained unchanged (2.8 nm). Overall, the
porosity data confirm that high pore volumes and surface areas are preserved for both systems (FMSNs and
polyFMSNs). No evidence was found of pore blocking, which is an essential condition for considering these
imaging probes for future drug delivery applications.
5.2.2 Spectroscopic Characterisation of FMSNs and polyFMSNs

For FMSN-DTPA and polyFMSN-DPTA-PEG nanoparticles, the successful grafting of all molecules on MSNs
was confirmed by solid-state NMR and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Figure 5.2-a shows 19F MAS
NMR spectra for both fluorinated nanoparticles, indicating a single resonance peak at -73 ppm corresponding to
−CF3 species. The 13C CP-MAS NMR spectra (Figure 5.2-b) revealed characteristic resonance peaks of all the
carbon atoms of the grafted molecules (DTPA-silane and fluorosilane molecules for FMSN-DTPA nanoparticles;
polyfluorosiloxane, DTPA-silane and PEG-silane molecules for polyFMSN-DPTA-PEG nanoparticles). The
assignments of each peak are indicated in Figure 5.2-b. The solid-state 29Si MAS NMR spectra (Figure 5.2-c),
of both fluorinated nanoparticles, depicted a broad multicomponent peak in the -88 to -120 ppm range. This peak
is associated with the Qn groups of the silica framework (Si(OSi)n(OH)4-n; n: [1–3]). A resonance of short intensity
was also found at -54 ppm, which is related to T1 groups (C-Si(OSi)3) of the covalently-grafted DTPA-silane
molecules. Due to the low amount of grafted PEG, the corresponding 29Si NMR peak was in the background
noise level. Additional resonances were observed around [-5 – -24 ppm] for fluorosilane-nanoparticles,
corresponding to Dn groups (R2-Si(OSi)n(OR)2-n; n: [1–2]). This confirms the covalent grafting of fluorosilane
molecules at the MSNs surfaces. For polyF-nanoparticles, 29Si NMR spectrum revealed also a peak at -22 ppm.
This signal peak presents a shoulder in the range of [-16 – -19 ppm]. This indicates the generation of new silicon
species, which can be attributed to the resonances of the polyfluorosiloxane backbone (D2' groups) and that of
the polyfluorosiloxane group chemically bonded onto the silica particles (D2 groups),293 respectively (Figure 5.2-
c and 5.2-e).
165
Figure 5.2. 19F (a), 13C CP (b) and 29Si (c) MAS NMR spectrum of nanoparticles; e) molecular diagrams of
DTPA and fluorosilane molecules; d) schematic representations of the surface of nanoparticles after grafting
steps.
XPS detects the presence of elements in a maximum depth of a few nanometers only. In the present study, the
particles were XPS-analyzed at each step of the functionalization process to confirm the element ratios at the
surface of nanoparticles. The elemental composition analysis performed before and after the DTPA grafting on
pristine MSNs (Table 2) showed an increase both in the carbon atomic percentage (% C; up to 10.9%) and in
the carbon-to-silicon ratio (C/Si, up to 0.42). High-resolution analysis (HR-XPS) was performed on the C(1s) and
166
N(1s) peaks of MSN-DTPA, and this revealed an association between the C(1s) band at 288.8 eV and the
appearance of nitrogen (% N = 1.2%). Both bands were ascribed to the C=O amide/acid (a component of the
DTPA molecules). After fluorosilane functionalization of MSNs-DTPA (FMSNs), the atomic percentage of carbon
(%C) and carbon-to-silicon ratio (C/Si) increased further to 14.2% and 0.55. The strong presence of fluorine (%F
= 4.5%) was highlighted, as well as a new C(1s) band at 292.6 eV corresponding to C atoms linked to F (Table
5.2). Overall, these results revealed the presence of DTPA and fluorosilane molecules at the outer surface of
the MSNs.
% C (1s) % N (1s) % O (1s) % Si (2s) % F (1s) C/Si F/Si

(285.2 eV; C-C, C-H) 399.8 eV; 532.5 eV 103.8 eV;
[286.5 eV; C-O, C-N] N-H Si-O
{289.1 eV; C=O
Amide/Acid}
<292.8 eV; C-F (CF3)>
MSN: MCM-48 1.0 - 68.5 30.5 - 0.003 -
(pristine) (0.2)
[0.8]
{-}
<->
MSN-DTPA 10.9 1.2 62.1 25.8 - 0.42 -
(7.35)
[2.47]
{1.07}
<->
FMSN-DTPA 14.2 1.0 54.7 25.6 4.5 0.55 0.18
(8.51)
[3.18]
{1.04}
<1.47>
polyFMSN 14.0 - 53.0 23.4 9.7 0.60 0.41
(9.19)
[1.65]
{-}
<3.16>
polyFMSN-DTPA 16.8 0.35 51.4 22.4 9.05 0.75 0.4

(11.47)
[3.58]
{0.14}
<1.61>
polyFMSN-DTPA- 18.1 0.2 51.7 21.6 8.4 0.84 0.39

PEG
(11.32)
[4.66]
{0.30}
<1.71>
Table 5.2. Percentage atomic concentrations at the surface of MSNs, extracted from the XPS measurements.
167
The presence of DTPA and PEG at the outer surface of polyMSNs was also confirmed by XPS analysis, with
high-resolution peaks measured on F(1s), C(1s), N(1s), O(1s) and Si(2s). The grafting of polyfluorosiloxane at
the surface of MSNs is reflected by a strong F(1s) peak, as well as by a C(1s) band at 292.6 eV (ascribed to
C−F). The atomic percentage of fluorine (%F = 9.7%) is considerably higher than that observed on FMSNs (%F
= 4.5%). Significant increase in %C (14%) and C/Si (0.6) ratio were also found after polyfluorosiloxane grafting,
and this increase is related to the carbon backbone of the polyfluorosiloxane. After the grafting of DTPA, these
values reached 16.8% (%C) and 0.75 (C/Si), respectively. The presence of nitrogen was also evidenced based
on the detection of nitrogen (%N = 0.35) and the C(1s) bond at 288.8 eV (C=O amide/acid), as for MSN-DTPA
nanoparticles. After PEG grafting, an additional increase of %C and C/Si ratio was evidenced (%C = 18.1%;
C/Si = 0.84).
5.2.3 Colloidal Stability of FMSNs and polyFMSNs

The measurement of relaxometric properties of fluorinated and paramagnetic contrast agents requires a precise
measurement of 19F and 1H relaxation times. However, a fundamental prerequisite for this is to demonstrate
the colloidal stability of the nanoparticles over time. The colloidal stability of FMSN- DTPA and polyFMSN-DTPA-
PEG suspensions in nanopure water as well as in phosphate-buffered saline [(PBS), pH = 7.4] was measured
by DLS. The hydrodynamic diameter profiles are shown in Figure 5.3 (intensity weighted). The hydrodynamic
diameter distributions of pristine MSNs, FMSN-DTPA, and polyFMSNs-DTPA-PEG were all included in a similar
size range, with mean values of 183−193 ± 45 and of 181−203 ± 57 nm for particles suspended in nanopure
water and in PBS, respectively. These values appear higher than the TEM mean particle size, which is expected
taking into account the hydration corona around the particles. In addition, a very low polydispersity index (PDI)
was obtained (PDI = [0.04−0.121] and [0.06−0.02] for nanoparticles suspended in water and in PBS,
respectively). No evidence was found of agglomeration or flocculation. A robust colloidal stability was found for
a period of at least 1 week following preparation (Figure 5.3-a-ii and 5.3-b-jj).
168
a) b)
195 nm 180 nm
182 nm
30 185 nm 30
185 nm
Intensity (a.u.)
Intensity (a.u.)
183 nm
20 20
10 10
iii) jjj)
ii) jj)
i) j)
0 0
50 100 500 50 100
100 500
Figure 5.3. DLS analysis of pure MSNs (a-i and b-j), FMSN-DTPA (a-ii and a-iii) and PolyFMSN-DPTA-PEG
(b-jj and b-jjj) aqueous suspensions; ii and jj) analysis after 2 h; iii and jjj) analysis after 1 week.
5.2.4 19F Relaxometric Properties of FMSNs and polyFMSNs

The 19F relaxometric properties of the nanoparticle suspensions were measured by NMR spectroscopy. First,
the 19F NMR spectra obtained with FMSN-DTPA colloidal suspensions revealed a single resonance peak at
−68.4 ppm. This peak was estimated sufficiently narrow to be useful for detection in the MRI studies planned as
next steps of this study (Figure S5.3-a, Supporting Information-section 5.5). The shape of this peak confirms the
single chemical environment of 19F nuclei contained in the –CF3 groups in the fluorinated-MSNs samples. Single
peaks are ideal for 19F MRI applications because they prevent the occurrence of chemical shift artifacts which
are frequent with fluorinated molecules. This effect fractionates the signal, and as a result, MRI artefacts can be
generated.137 The –CF3 groups are also very advantageous for in vitro and in vivo 19F MRI because of their
relatively long T2, compared to –CF2 groups present in many perfluorocarbons (e.g., perfluoro-crown-ether,
C6F6). The relatively long T2 of –CF3 groups reduce MR signal attenuation, leading therefore to better 19F MRI
detection.137 The 19F NMR spectra were integrated over the entire resonance peak, and the data were plotted
against F concentration to confirm that the signal is directly proportional to the 19F content of the suspensions
(Figure S5.3-b, Supporting Information-section 5.5). Very high signal-to-noise linearity ratio (r 2 = 0.999) were
obtained.
169
After integration of the total signal intensity, the relaxation times (T1 and T2) of fluorine were measured. The
corresponding relaxation rates R1 and R2 (R1 = 1/T1 and R2 = 1/T2) were then plotted in function of fluorine
concentration. Trifluoroacetic acid (TFA) was used as a 19F NMR reference to quantify the concentration of
fluorine. This measurement revealed a dependence of relaxation rates on the fluorine concentration, in a similar
manner as for paramagnetic contrast agents for 1H MRI. Figure 5.4 shows the relaxation curves obtained for
FMSNs and polyFMSNs. The relaxation curves reveal dependence between the relaxation rates (R 1, R2) and
the fluorine concentration, [19F] up to 9 mM. R1 and R2 values increased with the increase of fluorine
concentration ([19F]). However, a sharper variation of the transverse relaxation rate (R2) as a function of fluorine
concentration was observed (Figure 5.4-a versus Figure 5.4-b), and this reflects an increase of mutual
interactions between 19F nucleuses at higher concentrations. In fact, it is expected that transverse or spin-spin
relaxation (T2) is more affected by fluorine concentration than longitudinal, or spin-lattice relaxation (T1).137 This
is exactly the case here: the R1 relaxation rates are much lower than the R2 ones (Figure 5.4). Interestingly,
better relaxometric properties were obtained with polyFMSNs compared to FMSNs. The R1 curve of polyFMSNs
is slightly above R1 curve of FMSNs, indicating similar longitudinal relaxivities for both fluorinated nanoparticles
(Figure 5.4-a). However, the R2 of polyFMSNs were significantly lower than that of FMSNs (r2 = 4.69 s-1 mM-1
for polyFMSNs versus 14.05 s-1 mM-1 for FMSNs, Figure 5.4-b). Hence, the spins of fluorine atoms contained in
the relatively long molecular chains of polyFMSNs are less susceptible to influence each other compared with
the more closely spaced −CF3 moieties grafted at the surface of FMSNs, which are grafted with short, less
mobile, less flexible molecules. A combination of short T1 and as long T2 as possible is necessary to allow a
persistent and high signal in 19F MRI.
170
a) b)
1.8 FMSN-DTPA 120 FMSN-DTPA
polyFMSN-DTPA-PEG polyFMSN-DTPA-PEG
1.6
100
1.4
80
R2 (s-1)
R1 = 0.154x + 0.493 R2 = 14.05x + 2.561
R1 (s-1)
1.2 (r² = 0.994) (R² = 0.985)

60
1.0
R1 = 0.126x + 0.493 40
0.8 (r² = 0.996)
20
0.6 R2 = 4.69x – 2.667
(R² = 0.980)
0
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10
19 19
F concentration (mM) F concentration (mM)
19 19
(quantification by NMR 500 MHz, F reference : trifluoroacetic acid) (quantification by NMR 500 MHz, F reference : trifluoroacetic acid)
Figure 5.4. 19F R1 and R2 relaxation rates (a and b, respectively) of FMSN-DPTA and polyFMSN-DTPA-PEG
nanoparticles measured by NMR spectroscopy.
After chelation of Gd3+ by the DTPA attached at the surface of FMSN and polyFMSNs, a strong increase in the
relaxation rates of 19F nuclei was observed: 3 and 9 times higher than that obtained before gadolinium chelation,
respectively (Figure S5.4, Supporting Information-section 5.5). This indicates that the relaxation of 19F nuclei
can be influenced by the presence of Gd ions in their vicinity. Hence, the strong interactions between the electron
spins of the paramagnetic ions and the magnetic moments of the 19F nuclei have a dramatic impact on the
capacity of fluorine to relax its energy. Also, the discrete distribution of Gd ions at the nanoparticle surfaces can
alter the local magnetic fields, giving rise to an inhomogeneous magnetic field that affects the dipolar interactions
between the 19F nuclei and the Gd3+ ions.303, 304 However, the R1 and R2 relaxation rates of 19F do not increase
in the same proportion; in fact, a much stronger impact on transverse relaxation (R2) could impede the capacity
of the contrast agent to produce a strong and lasting 19F MRI signal, as stronger spin−spin interactions are
more susceptible to cause spin dephasing and ultimately signal attenuation.
5.2.5 1H Relaxometric Properties

The 1H relaxometric properties of FMSN-DTPA(Gd) and polyFMSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles were studied
in a large range of magnetic field strengths, from 0.015 to 300 MHz. Usually, MRI scanners in the clinics operate
in the range of 1.41−3.0 T (60−120 MHz). Longitudinal (T1) and transversal (T2) proton relaxation times were
measured. Then, the corresponding relaxivity values (i.e., relaxation rates normalized to Gd3+ concentration; r1
and r2) were calculated to assess the 1H relaxometric potential of each type of nanoparticles. To study the
influence of medium viscosity on the 1H relaxometric properties, measurements were performed not only in
171
water but also with hydrogel-entrapped nanoparticles. NMRD profiles obtained on these systems are shown in
Figure 5.-a,b. Similar profiles were revealed between FMSN-DTPA(Gd) and polyFMSN-DTPA(Gd)-PEG, with
nanoparticles either suspended in water or entrapped in hydrogel. The longitudinal relaxivity (r1) was quite
constant at low fields (<20 MHz). Although we cannot rule out the possible presence of a few detached Gd-
DTPA molecules in the samples, the NMRD spectra appear similar to those of Gd-bound large complexes (e.g.,
Gd-containing proteins, Gd-MSN). They do not present the typical characteristics of Gd-DTPA molecules.
At higher fields, r1 values increase and peak in the range of 20−60 MHz, followed by a sharp decrease. For the
transversal relaxivity (r2), a sharp increase was noted at higher fields. This shape of NMRD profile is typically
observed for nanoparticles and macromolecules labeled paramagnetic chelates.279, 305, 306 With respect to the
suspension medium, at high magnetic field strength (>20 MHz), the longitudinal relaxivity (r1) of nanoparticles
in aqueous suspension was higher than that of nanoparticles entrapped in hydrogel, and this is for both types of
nanoparticles. In fact, the r1 values were typically 1.5−2 times higher in this range of magnetic field strengths.
Also, the maximum peak seems to appear at higher magnetic field for nanoparticles suspended in water (40−60
MHz), compared to the particles entrapped in hydrogel (22.7−29 MHz). These relaxometric differences may be
due to the constrained diffusion of water in the hydrogel network. In addition, the longitudinal relaxivity values
depend on the global correlation time of the interaction between water 1H protons and the contrast agent. At
high field strengths (>10−20 MHz), this correlation time is limited either by the exchange−correlation time or by
the rotational time.305 Hence, the higher the viscosity of a Gd nanoparticle contrast media, the longer the
exchange− correlation time and the longer the rotation time of this compound. Each of these factors has an
impact on the relaxometric performance, and this could explain the slightly reduced performance of the contrast
agent entrapped in hydrogel.
Overall, the relaxivity values of polyFMSN-DPTA(Gd)-PEG nanoparticles were lower than that of FMSN-
DPTA(Gd) nanoparticles (Figure 5.5-a and 5.5-b). This is most probably because of difference in hydrophobicity
between both types of nanoparticles. The fluorine content in polyF-MSNs is significantly higher than that in
FMSNs, leading therefore to higher hydrophobicity and a resulting lower water penetration toward the
paramagnetic cores directly attached at the silica walls. Nevertheless, similar r2/r1 ratios were found at clinical
magnetic fields for both nanoparticle types (Figure 5.5-c). In water, values of 1.45 and 1.44 were found for the
r2/r1 ratios of FMSNs and polyFMSNs at 1.4 T (60 MHz), respectively, whereas in the hydrogel, their
counterparts were 2.2 and 2.15 (an increase of about 1.5×, see Figure 5.5-c). It is generally assumed that
positive contrast agents must present r2/r1 ratios as close as possible to 1 to be considered as efficient MRI
signal enhancers. Hence, these results confirm the high potential of both polyFMSN- DTPA(Gd)-PEG and
FMSN-DTPA(Gd) as “positive” contrast agents for proton MRI at clinical magnetic field strengths. The slight
172
decrease in relaxometric properties noted for hydrogel- entrapped samples is not expected to have a strong
impact on their performance as “positive” contrast agents.
a) b)
30 25
40 40
Water Water
30 30
mM )
mM )
25
-1
-1
Hydrogel 20 Hydrogel
20 20
-1
-1
r (s
r2 (s
2
10 10
20
15
r1 (s-1 mM-1)
r1 (s-1 mM-1)
0 0
0 1 10 100 1000 0 1 10 100 1000
15 Proton Larmor Frequency (MHz) Proton Larmor Frequency (MHz)
10
10
5
5 Nanoparticles in water
Nanoparticles in water Nanoparticles
Nanoparticles in in water
water
Nanoparticles
Nanoparticles in hydrogel
in hydrogel Nanoparticles in in
Nanoparticles hydrogel
hydrogel
0 0
0 0 1 10 100 1000 0 0 1 10 100 1000
Proton Larmor Frequency (MHz) Proton Larmor Frequency (MHz)
c)
3.0
Nanoparticles in water
2.5 Nanoparticles in hydrogel
2.0
r2/r1
1.5
1.0
0.5
0.0
FMSN- polyFMSN-
DTPA(Gd) DTPA(Gd)-PEG
Figure 5.5. NMRD profiles (r1 and r2 inset) at variable magnetic field strengths at 37 °C of FMSN-DTPA(Gd)
suspension (a) and polyFMSN-DPTA(Gd)-PEG suspension (b). Comparison of relaxivity ratios (r 2/r1)
measured at clinical magnetic field strength (1.4 T, 60 MHz), 37 °C (c).
In addition, we studied the impact of the temperature on the longitudinal relaxivity (r1) of nanoparticles
suspended in water and in hydrogel. The longitudinal relaxation time (T1) was measured in a range of 5−37 °C,
and the relaxivities were calculated (Figure 5.6). A very limited impact of temperature on the relaxometric
properties was found for each type of nanoparticles suspended in water. In the hydrogel, however, the
longitudinal relaxivity (r1) increased with the temperature. The diffusion of water molecules, the
exchange−correlation time, and the rotational correlation time are all strongly affected by the modulations of
solvent viscosity induced by temperature changes. The impact of temperature is thus stronger with hydrogel-
entrapped nanoparticle suspensions.
173
a) b)
20 10
8
15
r1 (s mM )
r1 (s mM )
-1
-1
6
10
-1
-1
4
Nanoparticles in water Nanoparticles in water
5
Nanoparticles in hydrogel 2 Nanoparticles in hydrogel
Plot 1 Regr Plot 1 Regr
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40
T (°C) T (°C)
Figure 5.6. Influence of temperature on the longitudinal relaxivity (r1) of FMSN-DTPA(Gd) nanoparticles (b)
and polyFMSN-DTPA(Gd)-PEG nanoparticles (c) suspended in water and in hydrogel, measured at 20 MHz.
For each temperature, the mean value of 3 measurements is represented with standard deviation between 1%
and 3%.
5.2.6 Magnetic Resonance Imaging Studies (1H and 19F MRI)

The signal enhancement from water protons (1H) was measured in 1.5 T MRI by imaging tubes containing Gd-
chelated fluorinated nanoparticles suspended in water (Figure 5.7-a). The two types of nanoparticles (Gd-labeled
FMSNs and Gd-labeled polyMSNs) produce positive contrast enhancement in T1-weighted imaging even at very
low Gd concentrations ([Gd] = 0.04−0.05 mM; at least 99% of contrast enhancement was observed).
The generation of 19F-based MR images was also demonstrated. For this, a phantom study was performed
using imaging tubes containing FMSNs and polyFMSNs. Both systems were scanned with a 9.4 T animal
scanner (Figure 5.7). Interestingly, the 19F signal of FMSNs was too low to allow efficient image extraction and
even at high fluorine concentration ([F] = 118 mM; [nanoparticles] = 100 mg mL−1). This low signal level was
mainly attributed to the relatively low fluorine concentration grafted per unit of FMSN. The very short T2
relaxation time of FMSNs most likely causes rapid signal decay and impedes the detection of enough 19F signal
between each one of the MR excitations.
For polyFMSNs, on the other hand, 19F MR images were efficiently generated for the concentration [19F] = 190
mM, which corresponds to a concentration of nanoparticles as high as 60 mg mL −1. The much more efficient
174
signal detection measured with polyFMNSs was attributed to the longer T2 values (19.4 ms) measured on these
suspensions. Finally, the 19F MRI signal from polyFMSNs that were dispersed in NMR tubes of 5 mm diameter
was much more efficiently detected than those suspended in capillary tubes of smaller diameters (e.g., 1 mm
diameter, Figure 5.7). These results are consistent with the fact that for 5 mm diameter NMR tubes, the MRI
voxels are completely enclosed within the volume of the tube, whereas for the 1 mm tubes, partial volume effects
might decrease the total signal detected per voxel. These results indicate the necessity to concentrate fluorinated
nanoparticles up to a certain level to visualize them in MRI voxels (at least 60 mg mL−1 for polyFMSNs). In
addition to high fluorine concentration, long spin−spin relaxation times (T2) must be achieved to reach high
signals in 19F MRI. In the present study, this was achieved by labeling MSNs with polyfluorosiloxane
macromolecules.
Figure 5.7. T1-weighted 1H MR images of FMSN-DTPA(Gd) suspensions (a) and polyFMSN-DPTA(Gd)-PEG

suspensions (b), measured at clinical magnetic field strength (1.5 Tesla, TE/TR = 10.8/1000 ms). Numerical
values indicate the Gd concentrations (mM) measured by ICP-MS. c) 19F MR phantom images of polyFMSN-
DTPA(Gd)-PEG nanoparticles acquired in a 9.4 T scanner using an experimental ultra-short echo time
sequence. The particles were suspended in a capillary tube of diameter of 1 mm (1) and in a NMR tube of 5
mm (2). Both capillaries appear clearly visible at a low in-plane resolution of 0.94×0.94mm 2.
5.3 Conclusion
Novel fluorinated MSNs were developed, and their properties as 19F contrast agents were comprehensively
measured. A variant of these nanoparticles was also labeled with Gd paramagnetic chelates and was tested for
dual 19F/1H MRI. The grafting of polyfluorosiloxane macromolecules demonstrated an effective strategy to
increase the density of fluorine atoms at the surface of MSNs. This grafting procedure had a strong impact on
the total signal detected in 19F MRI. The 19F relaxation properties were found to be dependent on the fluorine
concentration (at least up to [19F] = 9 mM). Similar longitudinal 19F relaxivites were found for FMSNs and
polyFMSNs; however, the transverse 19F relaxivities were significantly lower for the polyFMSNs. As a result,
the latter system was more easily detectable and provided a stronger signal enhancement. Gd-labeled MSNs
produce a strong signal in T1-weighted 1H MRI. The presence of Gd at the surface of FMSNs was also
associated with a significant increase in 19F relaxivities. Unfortunately, a stronger impact on the transverse
175
relaxivity could impede the possibility of detecting these probes. Finally, suspensions of polyFMSNs were
imaged in 19F MRI at 9.4 T. The relaxometric properties of FMSNs and polyFMSNs nanoparticles could be
exploited further in the design of biomedical objects such as implantable devices for drug delivery or other
theranostic applications. The dual detection of 1H and 19F MRI signals could represent an interesting alternative
to the use of radioactive molecules in MRI−PET or in MRI−SPECT.

5.4.1 Materials
Tetraethylorthosilicate (TEOS, 98%), Pluronic F127 (EO106PO70EO106, BioReagent), n-
cetyltrimethylammonium bromide (CTAB, 99%), (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and
diethylenetriaminepentaacetic dianhydride (DTPA dianhydride, 98%) were from Sigma Aldrich (Canada).
(3,3,3-trifluoropropyl)methyldimethoxysilane (98%) and Poly(methyl-3,3,3-trifluoropropylsiloxane) were from
Gelest (USA).
5.4.2 Synthesis of Functionalized Mesoporous Silica Nanoparticles
5.4.2.1 MCM-48 synthesis

MCM-48-type mesoporous silica nanoparticles were synthesized as reported in the literature. 78 In brief, CTAB
and F127 were dissolved in 298 mL of H2O/NH3/EtOH (NH4OH(aq) 2.9 wt%)/EtOH = 2.5/1 (v/v)). Then, TEOS
(3.86 mL) was added at room temperature (RT) under high stirring rate (1000 rpm) for 1 minute. The reaction
mixture was then aged 24 h in static conditions (air, RT). The resulting product was collected by centrifugation,
washed twice with water (250 mL) and dried overnight in air at 65°C. Finally, the product was calcined (air,
550°C, 1°C/min, 5h).
5.4.2.2 DTPA grafting

DTPA molecules were selectively grafted at the outer surface of MSNs as previously reported. 278 DTPA
dianhydride (65 mg) was dissolved in anhydrous DMSO (at RT, 2 h stirring and 15 min sonication). Then, APTES
(55 μL) was added dropwise and the mixture was stirred overnight at RT, under N 2. The DTPA-silane solution
was added to a suspension of nanoparticles (1 g in 170 mL of dry toluene) and the mixture was stirred overnight
at RT and under inert gas. The obtained nanoparticles were then centrifuged (10000 rpm for 15 min at least),
washed twice with ethanol, once with water and once with acetone and finally dried at 50 °C. The weight
percentage of grafted DTPA was measured by thermogravimetric analysis (TGA).
5.4.2.3 Grafting of fluorosilane

Fluorosilane molecules (dimethoxy-methyl(3,3,3-trifluoropropyl)silane) were used to graft fluorinated moieties at
the surface of MSNs. MSN-DTPA nanoparticles (1 g) were suspended in dry toluene (170 mL). Fluorosilane (5
176
mL of high purity commercial dimethoxy-methyl(3,3,3-trifluoropropyl)silane solution, 98%) was added to the
nanoparticles suspension under inert gas. The mixture was refluxed overnight at 110 °C. Functionalized
nanoparticles were then centrifuged (10000 rpm for 15 min at least), washed three times with ethanol and once
with acetone and finally dried at 50 °C. The w/w percentage of grafted fluorosilane was measured by TGA.
5.4.2.4 Grafting of polyfluorosiloxane

Polyfluorosiloxane macromolecules (poly(methyl-3,3,3-trifluoropropylsiloxane), Mn = 2400 Da) were also used
as a source of fluorine, and the grafting procedure was inspired from previous work. 293 Briefly, 400 mL of 12.5%
(w/v) solution of polyfluorosiloxane in dichloromethane was added to 200 mg of MSNs, previously outgassed
overnight at 120 °C. This mixture was slowly stirred at room temperature for 3 h, and then placed in a fume hood
for evaporation of the dichloromethane at room temperature (for 1 week at least). Then, the nanoparticles were
thermally treated in a tubular oven under a nitrogen atmosphere (at 200 °C for 12 h) to ensure the immobilization
of polyfluorosiloxane molecules onto silica surface. After that, nanoparticles were washed twice with
dichloromethane, twice with ethanol, once with acetone and finally dried at 50 °C. The w/w percentage of grafted
polyfluorosiloxane was measured by TGA.
5.4.2.5 PEG Grafting

PEG-silane (20 KDa) was dissolved in dry toluene under N2 (0.5 mg mL-1). The PEG-silane solution was then
added to the suspension of calcined nanoparticles (500 mg in 100 mL dry toluene) and the final suspension was
refluxed under N2 overnight at 110 °C. After centrifugation (7500G, 10 min), the product was washed twice with
EtOH 95%, once with water, and dried at 50 °C. The w/w percentage of grafted PEG was measured by TGA.
5.4.3 Physicochemical characterization
5.4.3.1 Nitrogen physisorption analysis

Nitrogen physisorption measurements were performed at −196 °C with an Autosorb iQ2 (Quantachrome
Instrument, Boynton Beach, USA). Before the sorption measurements, the samples were outgassed under
vacuum at 200 °C for 12 h (for pure MSNs) or 80 °C for 10 h (for functionalized MSNs). The surface area (S BET)
was determined using the BET equation in the range 0.05 ≥ P/P0 ≥ 0.20 and the total pore volume was obtained
at P/P0 = 0.95. Pore diameter was estimated using non-local density functional theory (NLDFT) methods applying
adsorption branch model (considering N2 sorption at −196 °C in silica with cylindrical pore geometry).307
5.4.3.2 Thermogravimetric analysis - Differential Scanning Calorimetry analysis (TGA-

DSC)
mL/min, with a heating rate of 10 °C/min, between 35 and 700 °C. The percentage of grafted amine and DTPA
177
groups was calculated based on the mass loss between 180 °C and 630 °C. The residual solvent (e.g.,
physisorbed water) was excluded from the calculation.
5.4.3.3 TEM size analysis

The nanoparticles were dispersed in water. The suspension (5 μL) was deposited on a carbon-coated copper
grid and dried for at least 24 h. Images were taken with a JEM-1230 TEM at an accelerating voltage of 80 kV.
5.4.3.4 Dynamic light scattering

Malvern DTS Nano zetasizer 173° (T = 25 °C, equilibration time set to 3 min; 3 measurements taken on each
sample; only quality criteria data accepted as valid results).
5.4.3.5 NMR general characterization

DRX300 MHz NMR spectrometer. The 75.4 MHz 13C CP-MAS, the 282.2 MHz 19F MAS and the 59.6 MHz 29Si
MAS NMR spectra were obtained using a 4 mm rotor spinning at 10 kHz. The chemical shifts are reported in
ppm relative to adamantane for 13C, to trifluoroacetic acid (TFA) for 19F and to tetramethylsilane (TMS) for 29Si.
5.4.3.6 1H relaxation analysis and relaxometric properties measurement

400 μL of Gd-labeled nanoparticles suspensions were pipetted into in 6.0 mm NMR tubes. Longitudinal and
transversal relaxation times (T1 and T2) were measured with a TD-NMR relaxometer (Bruker Minispec 60 mq,
60 MHz, 37 °C). The amount of Gd in each suspension was precisely measured by ICP-MS after an optimal
digestion procedure in HNO3 and hydrogen peroxide, in order to leach all Gd3+ ions from the silica matrix.
Relaxation rates (1/ T1 and 1/ T2) were plotted against Gd concentration values, and relaxivities (r1 and r2) were
calculated from the slope of these curves. NMRD profiles: Nuclear magnetic relaxation dispersion (NMRD)
profiles (T1) of aqueous suspensions were measured from 0.015 to 40 MHz with a Spinmaster fast field cycling
relaxometer (STELAR, Mede, Italy) at 37 °C, using 600 mL of nanoparticles suspension. Then, longitudinal and
transverse relaxation times (T1 and T2) were measured by using Bruker MiniSpec relaxometers (20 and 60 MHz)
and a Bruker AMX300 system (300 MHz). The temperature was set to 37 °C for all measurements and the
standard echo time of 1 ms was used. Finally, the relaxivities (r1 and r2) were calculated after normalization of
the relaxation rates (1/T1 and 1/T2) to the Gd3+ concentration values (measured by ICP-MS).
5.4.3.7 19F relaxometric properties measurement

The measurements of fluorine relaxation times (T1 and T2) were performed with aqueous suspensions containing
10% D2O. They were acquired at 470.5 MHz without 1H decoupling on Bruker 500 MHz NMR spectrometer. All
178
measurements were performed at 25 °C. T1 and T2 were reported for the single fluorine peak at -68.4 ppm. The
longitudinal relaxation time (T1) was measured by the standard inversion recovery method, and the transverse
relaxation time (T2) was measured by the spin-echo method and the Carr – Purcell – Meiboom – Gill (CPMG)
pulse sequence. For each measurement, a minimum of 12 data points were acquired.
5.4.3.8 19F MR Imaging

The particles were scanned with a 9.4 T Varian animal scanner with a RF surface coil, using an experimental
UTE (ultra-short echo time) sequence to avoid T2 signal loss. The obtained image was interpolated 4 times.
Then, an average of 4 slices was performed in the third dimension (the acquisition was 30×30 mm 2 field of view
with a 32×32 mm2 matrix), corresponding to a slice thickness of 3.75 mm.
a) b) c)
1400 0.14
1200 0.12
Adsorbed volume (cm g )
3 -1
1000 0.10
d(d) (cm3 Å-1 g-1)

800 0.08
600 0.06
400 0.04
200 0.02
0 0.00
2 4 6 8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 4 6 8
2
Figure S5.1. Low-angle powder XRD patterns (a), N2 physisorption isotherms (b) and NLDFT pore size
distributions (c) of pure MCM48-Type MSN.
179
a) b)
100 100
95 95
90 90
Mass (%)
Mass (%)
85 85
80 80
polyFMSN
75 75
MSN-DTPA polyFMSN-DTPA
FMSN-DTPA polyFMSN-DTPA-PEG
70 70
100 200 300 400 500 600 700 100 200 300 400 500 600 700
Temperature (°C) Temperature (°C)
Figure S5.2. TGA analysis of nanoparticles after the grafting of a) DTPA and fluorosilane molecules; and b)
polyfluorosiloxane, DTPA and PEG molecules.
a) b)
3e+5
3e+5
Signal intensity (u.a.)
2e+5
2e+5
1e+5
y = 29401x + 801.59
2
R(r² = 0.9997)
0.9997
5e+4
0
-63 -64 -65 -66 -67 -68 -69 -70 -71 -72 -73 0 2 4 6 8 10
Chemical shift (ppm) [F] (mM)
Figure S5.3. (a) 19F NMR spectrum of FMSN-DTPA colloidal suspension in H2O/D2O (90/10, v/v); (b) 19F
signal-to-noise ratio linearity.
180
3.0 40
Before Gd-chelation
After Gd-chelation
2.5
30
2.0
R1 (s-1)
R2 (s-1)
1.5 20
1.0
10
0.5
0.0 0
R1 R2
Figure S5.4. 19F relaxation rates (R1 and R2) of nanoparticles ([F] = 0.01mM) before and after gadolinium
chelation (FMSN-DPTA and FMSN-DPTA(Gd), respectively).
5.6 Acknowledgment
(Canada, Discovery grant 355524-2012) and the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les
Technologies (Team Grant 2013-PR-167010)). The authors would like to thank M. Pierre Audet (Département
de Chimie, Université Laval, Quebec) for his assistance in 19F relaxometric measurements. Prof. Matthias Stuber
and M. Roberto Colotti (University Hospital of Lausanne, Switzerland) are also acknowledged for access to 19F
MR Imaging and for contributing to image acquisition, respectively.
181
Conclusions et perspectives
Dans cette thèse, un contrôle précis de la synthèse et de la fonctionnalisation des nanoparticules de silice
mésoporeuse a été réalisé. Plusieurs caractérisations ont été effectuées pour étudier et confirmer les propriétés
morphologiques, texturales et structurales de ces nanoparticules, ainsi que pour mettre en évidence la réussite
de leur fonctionnalisation. La modulation de la taille des MSNs et de leur chimie de surface, tout en conservant
leur grande porosité après fonctionnalisation, a permis de développer des MSNs multifonctionnelles d’une
grande stabilité colloïdale et à fort potentiel pour la livraison des médicaments et l’imagerie biomédicale.
En premier lieu, grâce à une procédure de greffage sélectif de la surface externe des MSNs par le PEG et le
chélate de gadolinium (DTPA-Gd), une combinaison optimale entre la capacité de ces particules à améliorer le
contraste positif en IRM et leur performance pour le piégeage et la libération des médicaments a été démontrée
pour la première fois. Cette procédure de greffage est une stratégie simple et efficace qui a permis de préserver
la grande porosité des nanoparticules après leur fonctionnalisation. En effet, plus que 90% de la surface
spécifique et du volume poreux et 100% du diamètre des pores ont été conservés après le greffage du PEG et
du DTPA-Gd. Ces nanoparticules ne présentent aucune cytotoxicité préliminaire et se caractérisent par leur
grande stabilité colloïdale dans les milieux pseudo-physiologiques. La présence du DTPA-Gd à la surface
externe des MSNs a été très avantageuse pour l’obtention de nanoparticules avec d’excellentes propriétés
relaxométriques en IRM du proton, voire même avec les meilleures performances relaxométriques rapportées
jusqu’à présent dans la littérature sur les MSNs paramagnétiques. Le greffage du PEG et du DTPA sans blocage
des pores des MSNs a permis de conserver la grande capacité des ces nanoparticules à piéger des grandes
quantités du médicament, la daunorubicine. Les MSNs développées ont aussi prouvé leur capacité à assurer
une libération contrôlée de médicaments en fonction du pH du milieu, ce qui ouvre les portes sur des applications
théranostiques très prometteuses en oncologie.
En second lieu, grâce au contrôle de la taille des MSNs et de leur chimie de surface, des meilleures
performances de piégeage, de libération contrôlée de médicaments et d’effet thérapeutique anticancéreux ont
été obtenues. Des MSNs de taille variable, entre 45 et 500 nm, ayant une grande stabilité colloïdale et présentant
des propriétés physicochimiques texturales et structurales semblables, ont été synthétisées avec succès. Une
nouvelle procédure de post-greffage de groupements phosphonates sur les MSNs a été mise en œuvre.
L’influence de la présence de ces groupements fonctionnels à la surface des MSNs sur l’amélioration de la
capacité de piégeage et de contrôle du relargage des médicaments (la doxorubicine) a été observée. L’effet de
la réduction de la taille des MSNs-phosphonate sur l’amélioration de leur capacité à s’accumuler dans les
cellules cancéreuses, à libérer la doxorubicine, à inhiber la croissance des cellules cancéreuses, et à engendrer
une grande activité antiproliférative et antitumorale, a été aussi observé in vitro et in vivo. Ces résultats sont très
182
prometteurs pour des applications potentielles des MSNs de petite taille (< 50 nm) comme nanovecteurs pour
le traitement de différents types de cancers.
En troisième lieu, grâce à la conjugaison de l’anticorps Ri7 aux MSNs, des nouveaux nanovecteurs Ri7-MSNs
pour le ciblage potentiel des cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique ont été développés.
L’effet de la fonctionnalisation avec l’anticorps Ri7 sur l’amélioration de l’accumulation de ces nanovecteurs
dans les cellules endothéliales des micro-vaisseaux du cerveau (CEMC) a été observé in vitro et in vivo. Une
grande affinité entre les Ri7-MSNs et les récepteurs transferrines surexprimés à la membrane des CEMC a été
confirmée. De plus, le greffage des chélates de gadolinium (DTPA-Gd) a permis de montrer la capacité
supplémentaire de ces nanoparticules pour le marquage des cellules endothéliales et neuronales du cerveau,
mettant en évidence le potentiel de tels nanosystèmes pour des applications théranostiques. La taille des
nanoparticules s’est aussi avérée cruciale pour assurer leur internalisation sélective : les MSNs de 50 nm ont
une capacité supérieure à s’accumuler spécifiquement et massivement dans les CEMC, par comparaison aux
MSNs de 160 nm. Ces résultats fournissent la preuve du concept de la grande influence et importance du
greffage de ligand spécifique pour assurer le ciblage actif des MSNs aux CEMC. Cela ouvre les portes à des
applications potentielles pour la livraison de médicaments aux cellules endothéliales de la barrière
hématoencéphalique, qui sont impliquées dans plusieurs maladies du système nerveux central.
En dernier lieu, la fonctionnalisation de la surface des MSNs par des composés fluorés et des chélates de
gadolinium a permis de développer de nouvelles nanoparticules comme sondes potentielles pour l’IRM
binucléaire (IRM du proton et du fluor). Deux types de nanoparticules fluorées ont été synthétisés : les FMSNs
et les polyFMSNs, où un greffage d’une molécule simple de fluorosilane et d’une macromolécule de
polyfluorosiloxane a été réalisé, respectivement. Les deux types de nanoparticules ont montré leur grande
capacité à engendrer un contraste positif en IRM du proton. Une dépendance des relaxivités du 19F vis-à-vis de
la concentration en fluor a été révélée pour la première fois pour ces deux systèmes fluorés. Toutefois, le
marquage des MSNs avec du polyfluorosiloxane est le plus avantageux pour augmenter la concentration de
fluor par nanoparticule, et pour améliorer les relaxivités du fluor et l’efficacité de détection du signal 19F en IRM
du fluor. Ces résultats montrent le potentiel de ces nouvelles MSNs-DTPA(Gd) fluorées pour l’imagerie bimodale
(l’IRM du 1H/19F).
En résumé, cette thèse a porté sur différents aspects allant de la synthèse et de la fonctionnalisation des MSNs,
jusqu’à l’évaluation de leurs applications biomédicales. La contribution scientifique de ces travaux peut être
considérée comme un pas supplémentaire vers l’ingénierie de la nouvelle génération de nanovecteurs de silice
mésoporeuse pour des applications théranostiques émergentes.
183
Néanmoins, des études complémentaires sont nécessaires afin de compléter les connaissances et d’établir le
potentiel translationnel de ces produits comme nanovecteurs de médicaments. D’une part, le ciblage des MSNs
multifonctionnelles développées pour le traitement et le diagnostic du cancer peut être amélioré en greffant des
ligands de ciblage actif à la surface externe de ces nanoparticules. Ensuite, un suivi de la biodistribution des
ces nanovecteurs et de leur accumulation sélective dans la tumeur seraient nécessaires sur un modèle animal.
Concernant le contrôle de la taille des MSNs, le développement de nanoparticules de taille encore de plus petite
est envisageable en modulant davantage les ratios molaires des réactifs, la nature de la base, les concentrations
et le choix de l’agent inhibiteur de croissance, en contrôlant avec précision le pH du milieu réactionnel, ou même
en utilisant le TMOS comme précurseur de silice. Des particules de tailles moyennes de 20-25 nm seraient très
avantageuses pour des applications en oncologie et aussi pour la livraison des médicaments au cerveau. En
effet, même en présence de PEG, l’opsonisation des MSNs de taille ≥ 80 nm est trop rapide. En réduisant
davantage la taille de ces nanoparticules, leur rétention sanguine s’améliorerait par l’augmentation leur temps
de demi-vie dans la circulation sanguine. L’augmentation de la rétention sanguine des nanoparticules injectées
par voie intraveineuse est un grand défi pour favoriser leurs applications potentielles pour le traitement du cancer
et des maladies cérébrales.
Pour ce qui est des Ri7-MSNs développées pour le ciblage potentiel des cellules endothéliales de la barrière
hématoencéphalique, il s’agit de l’une des 3 premières études publiées sur le sujet (développement de MSNs
conjuguées avec un ligand de ciblage spécifique pour la livraison à la barrière hématoencéphalique). Ainsi,
plusieurs études complémentaires peuvent être entreprises. La conformation de l’anticorps sur les
nanoparticules pourrait être étudiée en profondeur en ayant recours au dichroïsme circulaire. Une autre preuve
directe de l’orientation de la couche d’anticorps sur les MSNs peut être obtenue par interférométrie à double
polarisation en déterminant la densité et l’épaisseur de ce recouvrement. Pour les études in vitro, il serait
intéressant de confirmer l’internalisation spécifique versus non-spécifique des MSNs en microscopie
électronique à transmission et en microscopie confocale. Aussi, d’autres contrôles pourraient s’ajouter aux
expériences, comme les MSNs pures non fonctionnalisées, pour mettre en évidence l’avantage du Ri7 et du
marquage avec les chélates de gadolinium. Pour les études in vivo, une étude de biodistribution serait
nécessaire afin d’évaluer l’efficacité du ciblage des cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique.
En plus, le potentiel de ciblage de ces nanoparticules au cerveau pourrait être évalué; par exemple, en étudiant
l’internalisation des nanoparticules in vivo au cours de temps et la possibilité de leur transcytose à l’intérieure
du cerveau. Par ailleurs, le potentiel de ces nanoparticules pour la vectorisation des médicaments devrait être
confirmé en étudiant leur capacité à piéger et à libérer des médicaments.
Enfin, malgré le fort potentiel des MSNs fluorées pour l’IRM binuclaire (1H et 19F), la limite de détection élevée
des appareils d’IRM du fluor a fait en sorte d’utiliser une suspension très concentrée en nanoparticules, ce qui
ouvre le débat sur leurs éventuelles applications biomédicales. En fait, ceci pourrait limiter leur utilisation pour
184
le marquage cellulaire par exemple. Cependant, de telles nanoparticules peuvent avoir un potentiel élevé en
tant que nanoformulations théranostiques pour l’administration par voie orale. Ces nanoparticules fluorées
pourraient aussi être exploitées pour des applications émergentes en bionanotechnologie, telles que : le
revêtement de surface et le dépôt de films, le développement de dispositifs microfluidiques intelligents (lab-on-
chip) et les biocapteurs.
Aussi, il serait intéressant d’élargir l’ingénierie des nanoparticules de silice mésoporeuse en modulant la taille
de leurs pores pour leur application en thérapie génique, par exemple. Un autre aspect primordial qui concerne
le sort de ces nanoparticules in vivo est à être abordé. Il est judicieux, en effet, que des études approfondies
soient menées sur le comportement de ces nanoparticules après leur administration : il s’agit de leur
biodistribution et de leur éventuelle élimination par l’organisme. Ceci permettera de déterminer leur potentiel
réel pour des applications en thérapie et diagnostic. Par ailleurs, l’évaluation de la biocompatibilité des MSNs et
de leur toxicité à grande échelle est nécessaire. En effet, plusieurs aspects toxicologiques des MSNs, tel que
l’immunotoxicité et la génotoxicité, doivent être étudiés. En effet, la sécurité de ces nanoparticules pour le corps
humain reste encore à être déterminée. Concentrer les efforts de la recherche dans ces directions, va
certainement aider à évaluer le potentiel réel de ces nanovecteurs pour des applications chez le patient et la
possibilité de commercialiser cette nanotechnologie. Pour finir, il est clair que la recherche dans le domaine des
MSNs pour la vectorisation des médicaments et l’imagerie biomédicale n’est pas encore achevée et que leur
avenir sur le marché pharmaceutique, bien que prometteur, reste encore à déterminer.
185
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201

Développement de Nanoparticules de Silice Mésoporeuse Multifonctionnelles

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Développement de nanoparticules de silice

© Meryem Bouchoucha, 2017

Freddy Kleitz, directeur de recherche

(l: y=5.7; m: y=9; n: y=13)………………………………………………………………………. 79

diagrams of DTPA and fluorosilane molecules; d) schematic representations of the

À mon adorable époux,

Que ce travail soit le reflet de vos prières incessantes,

- "International Mesostructured Materials Symposium 9", Brisbane, Australie, 20 août 2015 ;

 Présentations par affiche à :

- Chargée de cours (Matériaux inorganiques et hybrides) au département de chimie – Université

Matériaux de Condition de Surfactant utilisé Taille des Structure

MCM-48, MCM- ou CTAB+Pluronic nm Lamellaire

SBA-14, etc.) (OEnOPmOEn) Lamellaire

MSU (MSU-2, Milieu neutre Alkyl-Aryl-PEO ou 2 – 6 nm Hexagonale 2D 50, 59

MSU-3, MSU-H.) Pluronic

Tableau 1.1. Comparaison entre quelques matériaux de silice mésoporeuse nanostructurés.

1.1.1 Mécanismes de synthèse

1.1.2 Contrôle de la taille des pores des MSNs

1.1.3 Contrôle de la forme des MSNs

1.1.4 Contrôle de la taille des MSNs

1.1.4.2 Influence de la dilution et de la présence d’agents stabilisants

1.1.4.3 Influence des ratios molaires des réactifs

1.1.4.4 Influence des co-précurseurs de silice :

1.2 Chimie de surface et stabilité colloïdale des MSNs

1.3.1 Fonctionnalisation de la surface par co-condensation

1.3.2 Fonctionnalisation de la surface par post-greffage

1.3.3 Greffage sélectif de la surface interne et externe des MSNs :

1.3.3.1 Greffage sélectif par co-condensation

1.3.3.2 Greffage sélectif par post-greffage

 Greffage du polyéthylène glycol (PEG)

1.4.1 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM

1.4.1.1 IRM du proton (1H) et du fluor (19F)

1.4.1.2 Marquage des MSNs avec agents de contraste en IRM du 1H

 Les agents de contraste en IRM du 1H

= 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑟 , [𝐴𝑔𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡] (Équation 1.1)

Avec : constante = la vitesse de relaxation du milieu aqueux en absence de l’agent de contraste.

Expérimentalement la relaxivité (ri) correspondant à la pente de la droites 1/Ti en fonction de la concentration

Figure 1.13. Structure moléculaire de chélates de gadolinium.

 Marquage des MSNs avec des chélates de gadolinium

1.4.1.2 Marquage des MSNs avec des sondes d’IRM du 19F

1.4.2 Marquage des MSNs avec des fluorophores

1.5 MSNs pour la vectorisation des médicaments

1.5.1 Paramètres influençant le ciblage et l’internalisation des MSNs par les

1.5.1.1 Taille des MSNs

1.5.1.2 Charge de la surface

1.5.1.3 Greffage de ligands de ciblage

1.5.2 Paramètres influençant l’adsorption et le relargage des médicaments

1.5.2.1 Surface spécifique et porosité

1.5.2.2. Morphologie des particules

1.5.2.3. Chimie de surface

1.5.2.4 Stabilité de la silice à l’hydrolyse

1.6 Techniques de caractérisation :

n = 2𝑑 sin 𝜃 (Équation 1.2)

où n : l'ordre de diffraction; λ : la longueur d’onde de la source des rayons X; d : la distance réticulaire

Figure 1.21. Classification selon l’IUPAC des isothermes de physisorption.49

1.6.3 Microscopie électronique à transmission (MET)

L’interaction électron-matière dépend fortement de la morphologie, de la cristallographie, de la composition

1.6.4 Diffusion de la lumière en mode dynamique (DLS)

Où,  : la viscosité du solvant, 𝑇 : la température et 𝑘 : la constante de Boltzmann.

1.6.5 Potentiel zêta

1.6.6 Analyse thermogravimétrique (ATG)

1.6.7 Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)

1.6.8 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)