Évaluation des propriétés antibactériennes et

antiadhésives d’un revêtement nanoparticulaire pour

des applications biomédicales

Mémoire

Sahra Fonseca

Maîtrise en biochimie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Sahra Fonseca, 2021

 Évaluation des propriétés antibactériennes et
antiadhésives d’un revêtement nanoparticulaire pour
des applications biomédicales

Mémoire

Sahra Fonseca

Sous la direction de :

Steve Charette, directeur de recherche

Danny Brouard, codirecteur de recherche
Résumé
Les biofilms sont responsables de plus de 75 % des infections microbiennes humaines entraînant un problème
de santé publique important lorsqu’ils croissent sur des surfaces médicales synthétiques. Une stratégie
novatrice pour lutter contre les infections est basée sur l’emploi de biomatériaux fonctionnels ou de revêtements
polymériques aux propriétés antiadhésives présentant une activité antimicrobienne comme le
"Medical Antibacterial Antiadhesive Coating" (MAAC) qui est composé en partie de nanoparticules de silice
fonctionnalisées. Malgré les progrès récents dans le dépistage des agents infectieux et l’implémentation de
mesures visant à améliorer la sécurité transfusionnelle dans les banques de sang, le risque de contamination
des produits sanguins ne peut être réduit à zéro. L’objectif principal de ce projet de recherche visait à évaluer
les performances antimicrobiennes et antiadhésives du revêtement MAAC appliqué à la surface de matériaux
polymériques à usage médical Les objectifs secondaires touchaient la compréhension des mécanismes de
fonctionnement, ainsi que l’évaluation de la cytotoxicité in vitro du revêtement MAAC. À la lumière des résultats
obtenus, une adhérence bactérienne réduite a été observée pour des sections de PVC enduites de MAAC par
rapport au contrôle. Le nombre de S. aureus adhéré au PVC-BTHC et PVC-DEHP a diminué d'environ 63 % et
99 % respectivement après 24 heures de contact en bouillon nutritif. Toujours en milieu nutritif, le MAAC appliqué
en surface de matériaux polymériques a démontré une activité antibactérienne significative (≥ 1 log). Des
performances plus modestes ont été observées en matrices complexes de culots globulaires ou de concentrés
plaquettaires, qui semblent être associées principalement à la densité cellulaire et teneur élevée en protéines
des matrices limitant les interactions entre le MAAC et les bactéries. La viabilité des cellules L929 en présence
du MAAC a été supérieure à 90%. Le MAAC semble donc un bon candidat pour contribuer aux efforts de
prévention des risques associés à la transfusion de produits contaminés.

ii
Abstract
The biofilms are responsible for over 75% of human microbial infections causing a significant public health
concern when grown on synthetic medical surfaces. An innovative strategy to fight against infections link to
medical devices is based on the use of functional biomaterials or polymeric coatings with non-stick properties
exhibiting antimicrobial activity such as “Medical Antibacterial Antiadhesive Coating” (MAAC) based on
functionalized silica nanoparticles. Despite recent advances in the detection of infectious agents and the
implementation of measures to improve transfusion safety in blood banks, the risk of contamination of blood
products cannot be reduced to zero, which could fall below the detection limit currently in place. The main
objective of this research project was to evaluate the antimicrobial and non-stick performance of the MAAC
coating applied to the surface of polymeric materials for medical use. The secondary objectives concerned the
understanding of the action mechanisms, as well as the evaluation of the in vitro cytotoxicity of the MAAC
coating. In light of the results obtained, a reduced bacterial adhesion was observed for PVC sections coated
with MAAC compared to the control. The number of S. aureus adhered to PVC-BTHC and PVC-DEHP
decreased by approximately 63% and 99% respectively after 24 hours of contact in nutrient broth. Still in a
nutrient medium, MAAC applied to polymeric materials demonstrated significant antibacterial activity (≥ 1 log).
Reduce performances were observed in complex matrices of red blood cells or platelet concentrates, which
seem to be associated mainly with cell density and high protein content of the matrices limiting the interactions
between MAAC and bacteria. The viability of L929 cells in the presence of MAAC was greater than 90%. MAAC
therefore appears to be a good candidate for contributing on efforts to prevent the risks associated with the
transfusion of contaminated products.

iii
Table des matières
Résumé........................................................................................................................................................ ii
Abstract ........................................................................................................................................................ iii
Table des matières ...................................................................................................................................... iv
Liste des tableaux ........................................................................................................................................ vi
Liste des figures .......................................................................................................................................... vii
Liste des abréviations .................................................................................................................................. ix
Remerciements ........................................................................................................................................... xi
Avant-propos ............................................................................................................................................... xii
Introduction................................................................................................................................................... 1
Chapitre 1 – Characterization of the Antibacterial Activity of a SiO2 Nanoparticular Coating to Prevent Bacterial
Contamination in Blood Products................................................................................................................... 7
1.1 Résumé .............................................................................................................................................. 7
1.2 Abstract .............................................................................................................................................. 8
1.3 Introduction......................................................................................................................................... 9
1.4 Materials and Methods ...................................................................................................................... 10
1.4.1 Preparation of labile blood products............................................................................................ 10
1.4.2 Medical Antibacterial Antiadhesive Coating................................................................................. 11
1.4.3 Characterization techniques ....................................................................................................... 11
1.4.4. Antibacterial activity .................................................................................................................. 12
1.4.5 In vitro cytotoxicity...................................................................................................................... 13
1.4.6 Statistical analysis...................................................................................................................... 14
1.5 Results and discussion...................................................................................................................... 14
1.5.1 Characterization......................................................................................................................... 14
1.5.2 Antibacterial Activity ................................................................................................................... 16
1.5.3 MAAC in vitro cytotoxicity ........................................................................................................... 20
1.6 Conclusion........................................................................................................................................ 21
1.7 ASSOCIATED CONTENT ................................................................................................................. 22
1.7.1 Supporting Information ............................................................................................................... 22
1.8 ACKNOWLEDGMENT ...................................................................................................................... 22
Chapitre 2 – Évaluer les propriétés antiadhésives du revêtement MAAC appliqué à la surface interne des poches
d’entreposage de PSL................................................................................................................................. 23
2.1 Problématique d’adhésion bactérienne à la surface des MPs ............................................................. 23

iv
 2.1.1 Adhésion volontaire de S. aureus au PVC des poches d’entreposage des PSL ........................... 23
2.2 Problème d’adhésion plaquettaire à la surface du PVC-BTHC ............................................................ 28
Chapitre 3 – Discussion .............................................................................................................................. 33
Conclusion ................................................................................................................................................. 36
Annexe A – Supporting information ............................................................................................................. 38
1. Materials and methods ........................................................................................................................ 39
1.1 Characterization techniques .......................................................................................................... 39
2. Results ............................................................................................................................................... 39
2.2 Characterization ........................................................................................................................... 39
2.2 Antibacterial activity ...................................................................................................................... 42
2.3 MAAC in vitro cytotoxicity.............................................................................................................. 45
Annexe B – Stabilité du revêtement MAAC sur PVC-BTHC .......................................................................... 47
Annexe C – Préparation d’une pochette contenant 50 µm de revêtement MAAC par la Société Canadienne du
Sang (SCS) ................................................................................................................................................ 48
Annexe D – Croissance bactérienne sur silicone et PU en urine artificielle.................................................... 49
Annexe E – Réduction bactérienne sur silicone et PU en urine artificielle...................................................... 50
Annexe F – Dispersion des NP de SiO2 dans la matrice de PU. .................................................................... 51
Bibliographie............................................................................................................................................... 52

v
Liste des tableaux
Table 1. Bacterial culture conditions for antibacterial activity testing¥ ............................................................ 12
Table 2. Cytotoxicity of MAAC in L929 cells ................................................................................................. 21
Table S1. Diameter of silica NP by DLS. ...................................................................................................... 39
Table S2. Dried thickness of the MAAC applied on textured PVC-DEHP by SEM.......................................... 42
Table S3. Atomic distribution on the surface of MAAC treated and untreated PVC-DEHP by EDS probe ....... 46

vi
Liste des figures
Figure 1 - Représentation schématique de la formation d’un biofilm par Achinas et coll................................... 5
Figure 2 – Bider R. et coll. illustrent le plastifiant DEHP (a) libéré dans les culots globulaires (b) pour son
internalisation dans la membrane des globules rouges leur apportant une stabilité qui réduit leur risque
d’hémolyse (c) .............................................................................................................................................. 6
Figure 3 – Représentation chimique du plastifiant BTHC. ............................................................................... 7
Figure 4 – Représentation des faces lisses (A) et texturées (B) des poches d’entreposage composées de PVC-
BTHC en microscopie électronique à balayage .............................................................................................. 1
Figure 5 – Représentation topographique de la surface de PVC en absence (A) ou en présence (B) de brosses
polymériques par Zou et coll. ........................................................................................................................ 2
Figure 6 : Schématisation du concept d’AMP attaché sur la membrane bactérienne par Sun et coll................. 3
Figure 7 - Schématisation du mécanisme d’action du revêtement MAAC en contact avec une suspension
bactérienne par Fonseca et coll. .................................................................................................................... 4
Figure 8 - Représentation de Manfred Rodhe de la membrane des bactéries à Gram négatif (A) et positif (B). 5
Figure 9 – Characterization of functionalized SiO2 NP by TEM and DLS. ...................................................... 14
Figure 10 – SEM/EDS characterization of the RCC bag sections. SEM images of the (A) uncoated and (B) MAAC
coated PVC-DEHP samples. ....................................................................................................................... 15
Figure 11 – Logarithmic bacterial growth (mean ± standard deviation) in nutrient broth (1/500) with an inoculum
of 6 x 105 CFU/mL after 24 hours in contact with untreated (reference) and treated polymeric materials (MAAC)
(n = 3). ....................................................................................................................................................... 17
Figure 12. Logarithmic bacterial growth (mean ± standard variation) in blood products with an inoculum of 6 x
105 CFU/mL after 24 hours in contact with untreated (reference) and treated polymeric materials (MAAC). ... 19
Figure 13 – Adhésion résiduelle de S. aureus sur PVC-DEHP avec et sans revêtement MAAC observée en MEB
(A) et convertie en nombre de bactéries par image par décompte automatisé via Image J (B) (n=1). ............. 25
Figure 14 – Adhésion résiduelle de S. aureus sur PVC-BTHC avec et sans revêtement MAAC observés en MEB
(A) et convertie en nombre de bactéries par image (B) par décompte automatisé via Image J (n=1). ............. 26
Figure 15 – Cascade de formation de fibrine par Smith et coll.140 .................................................................. 29
Figure 16 – Capacité des plaquettes isolés de CP à s’activer (A), leur réserve fonctionnelle (B) et l’activité du
complexe thrombine antithrombine (C) en présence ou absence du revêtement MAAC sur 7 jours (n=3). ..... 31
Figure S1 – SEM images of PVC-BTHC (A), polyurethane (B), silicone (C) and PVC (D) uncoated and coated
samples. Relatively smooth and uniform layer of MAAC coating on the surfaces of the PMs ......................... 40
Figure S1 – SEM images of PVC-BTHC (A), polyurethane (B), silicone (C) and PVC (D) uncoated and coated
samples. Relatively smooth and uniform layer of MAAC coating on the surfaces of the PM ........................... 41
Figure S2 – Bacterial reduction in nutrient broth (1/500) with an inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24 hours in
contact with MAAC treated PM (n=3). .......................................................................................................... 42
Figure S3. Visualization of the antibacterial activity of MAAC on PVC-DEHP (A) untreated and (B) MAAC treated
against a 6 x 105 UFC/mL load of S. aureus................................................................................................. 43
Figure S4 – Bacterial reduction (mean ± standard variation) in blood products with an inoculum of 6 x 105
CFU/mL after 24 hours in contact with treated polymeric materials (MAAC). (A) Bacterial reduction in RCC (PVC-
DEHP) or PC (PVC-BTHC) matrices with three bacteria. .............................................................................. 44
Figure S5 – L929 cells growth following a 24 hours in presence or absence of MAAC. Cell inoculum of 1 x 105
cells/well. .................................................................................................................................................... 45

vii
Figure 17 – Stabilité du revêtement MAAC appliqué sur PVC-BTHC hebdomadairement sur un mois post-
application .................................................................................................................................................. 47
Figure 18 – Scellement de la poche de PVC-BTHC revêtue de 50 µm de revêtement MAAC par la SCS ...... 48
Figure 19 – Logarithme de la croissance bactérienne (moyenne ± écart-type) en urine artificielle avec un
inoculum de 6 x 105 UFC/mL après 24 heures de contact avec les matériaux polymérique non traités (référence)
ou traités avec le revêtement MAAC (MAAC) (n=3)...................................................................................... 49
Figure 20 – Réduction bactérienne en urine artificielle avec un inoculum de 6 x 105 UFC/mL après 24 heures de
contact avec les matériaux polymériques traités avec le revêtement MAAC (n=3). ........................................ 50
Figure 21 – Dispersion des NP de SiO2 avec (B) et sans RBiTC (A) en microscopie à fluorescence (1A et 1B) et
en microscopie optique à champ sombre (2A et 2B)..................................................................................... 51

viii
Liste des abréviations
7AAD 7-Aminoactinomycin D (7-Aminoactinomycine D)

AMP Antimicrobial peptide (Peptide antimicrobien)

AO Acridine orange (Orange d’acridine)

APTMS 3-aminopropyl trimethoxy silane

BTHC Citrate de butyryl-trihexyle

CG Culot globulaire

CP Concentré plaquettaire

DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole (4,6-diamidino-2-phenylindole)

DEHP Phtalate de di(2-éthylhexyle)

DLS Dynamic Light Scattering (Diffusion dynamique de la lumière)

EDS X-ray dispersion spectroscopy (Sonde de rayon X à dispersion d’énergie)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Technique d’immunoabsoption par enzyme

liée)

LBP Labile blood product (Produits sanguins labiles)

MAAC Medical Antibacterial Antiadhesive Coating (Revêtement médical antibactérien et

antiadhésif)

MEB Microscopie électronique à balayage

MP Matériau polymérique

MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide

NB Nutrient broth (bouillon nutritif)

ix
NP Nanopartilce (Nanoparticule)

PBS Phosphate buffer saline

PC Platelet concentrate (Concentré plaquettaire)

PSL Produit sanguins labile

PM Polymeric material (Matériau polymérique)

PRT Pathogen reduction technologie (Technologie de réduction de pathogènes)

PU Polyuréthane

PVC Polyvinyl chloride (Polychlorure de vinyle)

RBC Red blood cell (Globule rouge)

RCC Red cell concentrates (Culot globulaire)

RPMI Roswell Park Memorial Institute medium (Milieu de l’institut mémoriel de Roswell
Park)

SAGM Saline adenine glucose mannitol (Saline adénine glucose mannitol)

SD Standard deviation (Écart-type)

SEM Scanning electron microscopy (Microscopie électronique à balayage)

SN Supernatant (Surnageant)

SiO2 Silica (Silice)

TEM Transmission electron microscopy (Microscopie électronique à transmission)

TTI Transfusion transmitted infection (Infection transmise par transfusion)

UFC Unité formatrice de colonie

x
Remerciements
Je tiens d’abord à remercier mon codirecteur de maîtrise, Danny Brouard, pour son support et sa confiance
dans les deux dernières années. Codirecteur, sans qui, je n’aurais probablement pas eu la chance d’explorer
autant de disciplines, participer à plusieurs congrès scientifiques et développer autant mes relations
interpersonnelles.

Merci également à Steve Charette, directeur de maîtrise, pour sa disponibilité et son soutien administratif,
toujours présent pour aider et faire avancer le projet.

Un merci également à Héma-Québec et Triphyll pour le soutien financier, tout comme Mitacs Accélération pour
la bourse d’étude.

Bien entendu, je tiens aussi à remercier l’ensemble des membres de l’équipe de recherche et développement
d’Héma-Québec pour leur support scientifique et émotionnel. Un merci très spécial à Marie-Pierre Cayer pour
son immense apport à ma formation et son implication continuelle dans le projet. À mon sens, je n’aurais pas
pu mieux trouver comme mentor. Merci pour toute l’aide dans les expériences, la rédaction et les pratiques de
présentations, essentielle selon moi à l’avancée du projet ainsi qu’à mon avancée professionnelle.

Finalement, je ne pourrais passer sous silence le soutien inconditionnel de ma famille, Normand Fonseca, Suzie
Richer, Benjamin Fonseca et Elsa Fonseca, et de mon copain, Sébastien Alain, m’ayant apporté un support
psychologique, financier et ménager, en plus d’une écoute et d’une aide constante à la vulgarisation scientifique.
Un énorme merci!

xi
Avant-propos
Le premier chapitre de ce mémoire contient un article scientifique rédigé en anglais qui a pour but de présenter
les propriétés antibactériennes et une évaluation du caractère cytotoxique d’un revêtement à base de
nanoparticules de silice pour son utilisation potentielle en milieu hospitalier pour prévenir les contaminations
notamment par biofilm. À titre de première auteure de l’article, j’ai réalisé l’ensemble des expériences
présentées, l’analyse des résultats et la rédaction de la première version de l’article sous la supervision de
Marie-Pierre Cayer (Héma-Québec) et de mon codirecteur, Danny Brouard (Héma-Québec). L’article a ensuite
été révisé par Steve J. Charrette (Université Laval), Tanvir K.M. Ahmmed (TriPhyll) et Nima-Khadem-Mohtaram
(TriPhyll), avant la première soumission à l’ACS (Applied Materials and Interfaces) en date du 10 août 2021. La
version présentée dans le présent mémoire est une version ajustée en fonction des commentaires des réviseurs
de l’ACS et prête pour une seconde soumission. Cette version demeure très similaire à la précédente.

xii
Introduction
Les banques de sang sont responsables d’assurer l’approvisionnement en produits sanguins aux hôpitaux
afin de subvenir aux besoins de médecine transfusionnelle.1 L’utilisation du sang et la sélection des produits
sanguins sont déterminées en fonction de la priorité des traitements ainsi que l’âge et le sexe du patient. La
principale contrainte lors de transfusion est la combinaison des dons, où toute incompatibilité ABO pouvant
provoquer des réactions transfusionnelles doit être évitée. Les trois composants du sang total obtenus le plus
souvent par procédés de centrifugation et de filtration, soit le plasma, les concentrés plaquettaires (CP) et les
culots globulaires (CG), représentent les produits plus fréquemment utilisés pour la transfusion.2 Le plasma est
principalement utilisé dans les cas de trauma, les CG représentent l’un des seuls traitements pour restaurer
l’oxygénation tissulaire et les CP sont majoritairement utilisés pour la prévention ou le traitement des
hémorragies chez les patients souffrant de thrombocytopénie.2-4

Le volume d’un don de sang complet se situe généralement entre 450 mL et 500 mL. Dans le but de retirer les
cellules immunitaires des donneurs, les prélèvements subissent une déleucocytation; le plus souvent par
filtration. Dans certains cas, c’est le don de sang complet qui est déleucocyté (whole blood filtration), dans
d’autres ce n’est que le CG seulement (red cell filtration). Le choix du type de processus de traitement favorisé
par chaque banque de sang dépend de plusieurs facteurs opérationnels portant sur la qualité des produits
préparés, chacun d’eux offrant avantages et inconvénients. Notamment, certains processus sont réalisés à froid
(T = [2-6] °C) alors que d’autres sont considérés à chaud (T = [20-24] °C). Seul ces derniers permettront la
préparation de concentrés plaquettaires. Les dons de sang peuvent également être traités de manière
automatisée, comme avec la technologie Reveos (TerumoBCT) par exemple. Les dons de sang récupérés en
dispositifs Reveos doivent être traités à température pièce dans les 12 à 24 heures suivant la complétion du don
et il est normalement nécessaire de combiner les plaquettes récupérées d’au moins quatre donneurs pour la
génération d’un CP.

Généralement, les donneurs doivent attendre un minimum de 56 jours entre les dons. La période peut varier
selon la population de donneurs ou encore, pour certaines circonstances exceptionnelles ayant des impacts
négatifs sur la capacité d’approvisionnement. Les femmes, par exemple, sont parfois appelées à prolonger leur
délai inter dons étant donné en réponse à des réserves de fer anormalement faibles, en raison des
menstruations, entre autres.

Les dons de sang peuvent également être prélevés par aphérèse. L’aphérèse est une procédure impliquant la
séparation et la récupération de composants sanguins en continu pendant le prélèvement. La particularité de
cette procédure vient du fait qu’il est possible de retourner les composants non désirés au donneur. L’avantage
de ce type de don de sang réside essentiellement dans le fait qu’il permet le prélèvement de plusieurs produits

1
simultanément. De cette manière, le processus par aphérèse peut offrir des fréquences de dons plus
rapprochées en évitant le prélèvement des globules rouges. Par contre, l’aphérèse demeure une procédure
longue (généralement entre 30 min à plus d’une heure) et fastidieuse (demande du personnel hautement
qualifié/expert). À Héma-Québec, les deux technologies et leurs dispositifs respectifs sont distribués par la
compagnie TerumoBCT. Malgré toutes les précautions prises par les banques de sang, les risques associés à
la préparation et, ultimement, la distribution de produits contaminés sont toujours existants bien qu’ils soient
réduits au minimum.

Héma-Québec, un organisme à but non lucratif, assure l’approvisionnement constant en produits de qualité
et sécuritaires au Québec, et ce suite à l’enquête sur la crise du sang contaminé par l’hépatite C et le virus de
l’immunodéficience humaine dans les années 1980 et 1990.5 La transmission des virus hépatiques représentait
alors un risque grandissant, et ce, depuis les années 1970, mais toujours en débat à savoir s’il était considéré
comme négligeable.5-7 Malheureusement, au moment de la décision du retrait des produits, des milliers de dons
et dérivés de plasma contaminés avaient déjà été transfusés.6 Depuis lors, de nombreuses mesures ont été
mises en place à l’échelle mondiale pour diminuer et prévenir le risque de contamination des produits sanguins
grâce, entre autres, au contrôle étroit de l’éligibilité des donneurs et du risque transfusionnel.1,6 Malgré
l’implantation de ses mesures préventives, le risque d’infection, et principalement le risque d’infection
bactériennes transmises par transfusion, persiste. Alors que les inoculums initiaux sont susceptibles d’être petits
[1-10 unités formatrices de colonies (UFC) totales], les bactéries peuvent proliférer à des concentrations
potentiellement menaçantes au cours de la période d’entreposage des composants plaquettaires. En effet, les
CP sont plus à risque de contamination bactériennes puisqu’ils sont généralement entreposés à 20-40 °C, dans
des poches perméables aux gaz et sous agitation. La contamination des produits survenant généralement au
moment du don par la flore microbienne humaine, les banques de sang ont également accentué l’importance
d’une décontamination de la zone de ponction et le retrait des premiers millilitres de sang des prélèvements,
allant jusqu’à 35-40 mL, atténuant le risque de contamination résiduelle.8,9

En parallèle, les banques de sang ont investi du temps et des efforts considérables dans l’adoption ainsi
que l’optimisation des performances des méthodes de détection des contaminants.1 Un test analytique pour la
détection des bactéries doit non seulement être générique, afin de détecter l’ensemble des souches, mais aussi
hautement sensible pour déceler la présence de bactéries à de très faibles concentrations.10-12 Les technologies
de détection microbienne automatisées les plus utilisées aujourd’hui se basent sur la croissance des
microorganismes en milieu non spécifique autant en aérobiose qu’en anaérobiose, et permettent une détection
à des concentrations aussi faibles que 1 à 10 unités formatrices de colonies par millilitre ([1-10] UFC/mL).13 Bien
que les techniques analytiques développées pour la détection de contaminants bactériens au niveau des
produits sanguins en banque de sang puissent être particulièrement sensibles, c’est la méthode analytique, plus

2
spécifiquement le prélèvement d’un échantillon représentatif du contenu total du produit, qui demeure un enjeux
par rapport à la puissance de détection des méthodes par culture. Comme il n’est pas possible de récupérer la
totalité du volume des poches d’entreposage des PSL, les performances des tests bactériens peuvent être
améliorées par l’imposition de temps d’attente minimaux avant de procéder au prélèvement et par la
considération de volumes de prélèvement supérieurs.

L’envoi des produits aux centres hospitaliers avant l’obtention des résultats des tests de détection entraine
également un risque potentiel par rapport à la transfusion de produits contaminés.8,9 Étant donné que le
processus de détection demeure long, les CP peuvent effectivement être envoyés aux hôpitaux avant l’obtention
du résultats final pour limiter les pertes de produits. Par contre, le processus est gouverné par une analyse de
risques et tous produits contaminés sont retracés et retirés des inventaires. Si jamais le produit a été transfusé,
des démarches médicales sont entreprises pour assurer la sécurité des patients. À Héma-Québec, un test
automatisé de détection par culture qui utilise des milieux génériques (BacT/ALERT, bioMérieux) a été implanté
en 2003. À l’heure actuelle, le produit sanguin est incubé pendant au moins 48 heures et ne peux pas être
envoyé aux centres hospitaliers avant le délai minimal de 12 heures suivant le lancement du test de détection.
L’analyse demande également la récupération d’un volume minimal, établi à 10mL, pour l’analyse en aérobie et
d’un autre de 10mL pour le test en anaérobie, toujours dans le but de maximiser le potentiel de détection et
réduire les risques de faux-positifs.14,15 Le mécanisme de détection de l’appareil fait intervenir le suivi de la
libération du dioxyde de carbone (CO2) et de la variation de pH dans la bouteille d’échantillonnage en réponse
à une croissance de microorganismes.16 Bien que le test soit fiable et sensible, il demeure possible d’obtenir
des résultats faussement négatifs.17 Il existe une probabilité que la présence de certains contaminants ne soit
pas détectée si le milieu de culture utilisé n’est pas assez spécifique pour en permettre la croissance, par
exemple. C’est d’ailleurs le cas des mycètes dont la présence peut être masquée par la croissance bactérienne
en milieu non sélectif.18 Inversement, le test peut engendrer des résultats faux positifs de contamination dans
les cas où une quantité d’oxygène trop importante est introduite dans la bouteille lors de l’inoculation
occasionnant le rejet inutile de produits sanguins.9 Les données d’Héma-Québec entre 2014 et 2020 montrent
un taux de faux positifs de 0,180 pour les plaquettes. Dans la dernière année, ces faux positifs ont également
été réduits via l’ajout d’un logiciel de compensation par le manufacturier.

Bien que le taux de transfusion de produits sanguins contaminés, tous types de contaminations confondus,
ait diminué à moins d’un par 30 000 produits, il demeure le premier risque transfusionnel.8 La transmission
d’infection bactérienne par transfusion peut se faire autant via les CG que les CP, mais ces derniers sont les
plus susceptibles d’être contaminés dues à leur température d’entreposage plus chaude, propice à la croissance
cellulaire, se rapprochant des valeurs physiologiques.8 En effet, après la séparation des différents composants
sanguins par centrifugation, le plasma est conservé à ≤ -20 °C pour une période maximale d’un an, le CP à

3
température pièce sous agitation jusqu’à cinq ou sept jours d’entreposage dépendant de la banque de sang et
le CG à 4 °C pour une durée maximale de 42 jours. En fait, le risque de contamination initiale des CG et CP est
considéré similaire, mais la réfrigération et l’absence d’agitation des CG diminuent le risque de prolifération
bactérienne.8 Les produits contaminés et transfusés peuvent être issus de résultats faussement négatifs
occasionnés par une contamination bactérienne à des concentrations aussi faibles que 0,002 à 0,3 UFC/mL, ou
encore, à la présence de biofilms qui demeurent plus difficilement détectables. En effet, dans le cas des biofilms,
les méthodes d’analyses utilisées ne permettent pas de les détecter efficacement, surtout lorsqu’ils sont adhérés
aux parois internes des poches d’entreposages.13,14,19-26 Plusieurs cas d’infections par Staphylococcus
epidermidis liés à la transfusion de produits sanguins et causant des réactions septiques sévères, voir fatales,
ont été rapportés dans les banques de sang.25,27 Il a été démontré que le taux de croissance de cette bactérie
est relativement faible et qu’elle peut former des biofilms au niveau des CP.28,29 Pour tenter de réduire ce risque,
certaines banques de sang ont décidées de repousser l’échantillonnage des CP jusqu’à deux jours suivant le
prélèvement pour laisser la chance aux bactéries à faible croissance de pousser. Ce changement a également
permis de repousser le délai maximal de conservation pour les CP de 5 à 7 jours. Il n’empêche que le
prolongement de l’entreposage peut avoir un effet négatif sur la qualité des CP. En effet, la conservation en
poches d’entreposage augmente le risque d’adhésion des plaquettes sur les surfaces de la poche ou entre elles,
et ainsi favorisent l’activation et la coagulation plaquettaire. Des cas d’infection par transfusion de CG causés
par des souches cliniques présentes sous forme de biofilms, notamment avec Serratia marcescens,
Serratia liquefaciens et Staphylococcus aureus, ont également été rapportés.30-33 Bien que ne formant pas de
biofilms, Yersinia enterocolitica demeure le contaminant le plus fréquemment retrouvé dans les CG en raison
de son caractère psychrophile.34

Les matériaux utilisés dans la conception de dispositifs médicaux sont favorables à la prolifération
bactérienne.35 Notamment, les cathéters urinaires représentent plus de 40% des infections contractées en milieu
hospitalier.36-38 Les risques les plus importants pour la santé humaine liés aux infections des voies urinaires
associées à l’utilisation de cathéters sont causés par la prolifération bactérienne ou par l’incrustation de
microorganismes dans les matériaux polymériques (MPs) qui les constituent.37 Les contaminants les plus
fréquents sont S. aureus, Escherichia coli, Proteus mirabilis lié à l’incrustation, Klebsiella pneumoniae,
Enterococcus faecalis, et Pseudomonas aeruginosa.39,40

La problématique d’adhésion microbienne menant à la création d’un biofilm est également une
préoccupation clinique et médicale considérable, notamment dans l’implantation d’organes artificiels et
l’utilisation de dispositifs médicaux.41 La formation de biofilm, responsable de plus de 75% des infections
humaines, est un enjeu majeur pour le domaine de la santé.42,43 Une fois le biofilm formé, il devient pratiquement
impossible de l’éliminer, notamment en raison du pouvoir de protection mutuelle des bactéries impliquées. Il

4
peut s’agir d’une protection physique directe associée à la matrice extracellulaire qui empêche l’entrée dans le
biofilm, ou indirecte via l’état de dormance et la diversité microbienne (Figure 1).44,45

Figure 1 - Représentation schématique de la formation d’un biofilm par Achinas et coll.46

Plus de 80% des bactéries se retrouvent sous forme de biofilm, adhérées sur une interface solide-liquide.
Initialement, les bactéries s’adhèrent sur la surface en question, se multiplient et recrutent différents
microorganismes environnants. S’en suit la maturation du biofilm, dans laquelle la matrice extracellulaire est
générée.3 En général, les bactéries ont tendances à utiliser des débris cellulaires ou des surfaces incurvées
pour s’adhérer.1

Malgré l’ubiquité des biofilms, les techniques actuelles pour les étudier divergent et ne sont pas toujours
représentatives des conditions réelles de croissance des microorganismes.12 Plusieurs d’entre elles sont
toujours en développement, notamment celle du dosage colorimétrique au cristal violet (CV).13-16 Cette dernière
est actuellement considérée comme étant la technique de référence et la plus utilisée permettant de quantifier
la biomasse du biofilm en faisant intervenir la mesure de l’intensité de la coloration.16-18 Cette technique est utile
pour évaluer la force d’adhésion et la formation du biofilm d’une souche bactérienne; la reproductibilité des
mesures expérimentales demeure toutefois limitante.14 La biomasse du biofilm peut également être quantifiée
par des méthodes piézoélectriques ou par analyses microscopiques.13,14,16,19 Bien que ces techniques soient
considérées comme étant quantitatives et/ou qualitatives, les conditions analytiques ne sont pas toujours
représentatives de l’environnement réel dans lequel les biofilms se développement.14 Des études récentes font
intervenir des techniques analytiques basées sur des approches microfluidiques qui permettraient de mieux
reproduire les conditions réelles de croissance des microorgansmes.14,20 Ces dernières se basent sur
l’observation en temps réel de la croissance microbienne et de la formation éventuelle de biofilms, en
environnement et en flux contrôlés.20 En effet, la cellule microfluidique, dans laquelle les microorganismes sont
incubés, est déposée sur un microscope optique inversé et leur comportement est observé à des intervalles de

5
temps précis.20 Il n’empêche que les connaissances associées à l’utilisation de la microfluidiques pour l’étude
de biofilms demeurent restreintes et l’approvisionnement en cellules fluidiques de qualité permettant des
mesures répétables demeurent un enjeu à considérer.14

Dispositifs de conservations des produits sanguins

En raison de ses multiples propriétés telles que sa transparence, sa perméabilité aux gaz, sa bonne
résistance aux variations de température, et sa facilité d’intégration dans des procédés de fabrication, le PVC
représente l’un des matériaux les plus utilisés pour la confection de tubes de perfusion et de dispositifs de
prélèvements de composants sanguins.47 Étant néanmoins rigide et friable, un plastifiant peut être ajouté à la
surface. Il s’agit d’un composé chimique lui apportant une certaine souplesse et facilitant ainsi la préparation de
poches spécialement conçues pour la conservation de produits sanguins labiles (PSL). Les poches de PVC
plastifiées, le plus souvent texturées pour optimiser l’efficacité du processus de stérilisation, possèdent des
surfaces hydrophobes favorisant l’adhésion bactérienne et plaquettaire.48-50 Le phtalate de di(2-éthylhexyle)
(DEHP) est le plastifiant le plus utilisé, en quantité de 65 à 70 % en surface, pour la fabrication des poches
d’entreposage des CG en raison de son effet stabilisateur au niveau de la membrane des globules rouges.51-53
En effet, celui-ci se voit libéré dans le produit durant l’entreposage et peut être internalisé par les globules
rouges, leur conférant une stabilité membranaire ayant des impacts positifs sur le taux d’hémolyse du produit
(Figure 2). 51,52

Figure 2 – Bider R. et coll. illustrent le plastifiant DEHP (a) libéré dans les culots globulaires (b) pour
son internalisation dans la membrane des globules rouges leur apportant une stabilité qui réduit leur
risque d’hémolyse (c).54

Toutefois, le DEHP est voué à être retiré du marché dû à son caractère cytotoxique. En fait, depuis 2017,
la Commission de régulation européenne a adopté la règlementation selon laquelle le DEHP doit être utilisé à

6
une concentration massique maximale de 0,1% dans tous dispositifs médicaux. Ce changement se base sur de
récentes études de toxicité chez la souris, perturbant leur système endocrinien.55 Le citrate de butyryl-trihexyle
(BTHC) (Figure 3) est, quant à lui, préférentiellement utilisé pour l’entreposage des CP dû à sa grande
perméabilité à l’air. Il est reconnu pour favoriser la conservation et le maintien de l’intégrité des plaquettes
pendant leur entreposage.56

Figure 3 – Représentation chimique du plastifiant BTHC.

Les poches de PVC-DEHP sont texturées, entre autres, dans le but d’éviter l’adhésion entre les deux
surfaces lors de la fabrication des poches par scellement thermique ou ultrasons. Dans le cas des PVC-BTHC,
certains fabricants (TerumoBCT) préparent les poches en utilisant une face lisse et une face texturée
(Figure 4).57

7
 Vue du dessus Vue de côté
A

Figure 4 – Représentation des faces lisses (A) et texturées (B) des poches d’entreposage composées
de PVC-BTHC en microscopie électronique à balayage.

La combinaison des deux textures permet de réduire l’adhésion bactérienne et plaquettaire sur les faces
internes des poches. En fait, Hadjesfandiari et coll. ont démontré que l’adhésion est réduite sur la surface interne
lisse de la poche. Par contre, une des deux surfaces doit au minimum être texturée pour éviter leur adhésion
durant leur fabrication et les prélèvements ultérieurs.57 D’ailleurs, dans le cas de l’utilisation du BTHC, il est
approprié d’utiliser une composition minimale en plastifiants de 40% pour obtenir une combinaison optimale
entre les propriétés mécaniques et physiques en plus d’avoir une perméabilité adéquate aux gaz. L’adhésion
des bactéries et des plaquettes en surface du PVC plastifié provient de la nature hydrophobe de ce matériau.57

Matériaux d’intérêts propice au développement de biofilms

Les matériaux qui composent les sondes urinaires ont progressivement évolué avec celui du
développement des matières plastiques. Les sondes sont aujourd'hui constituées, en quasi-totalité, de matières
polymériques. Différents matériaux peuvent être utilisés : des polymères thermodurcissables (polyuréthanes

1
(PU) réticulés) ou thermoplastiques (PVC et polyéthylènes) et des élastomères plus souples (silicones et PU
linéaires). Les polyéthylènes et le PVC ont respectivement été abandonnés en raison d’une certaine dégradation
lorsqu’ils sont en contact avec l’urine. Les sondes urinaires sont, à l’heure actuelle, principalement à base de
PU et leurs propriétés varient en fonction de la nature des additifs et plastifiants utilisés dans leur fabrication.58,59
Le silicone est aussi intéressant pour sa stabilité thermique, sa résistance au vieillissement, sa souplesse, sa
biocompatibilité et sa résistance aux incrustations en raison de son caractère hydrophobe.58-60

Plusieurs approches visant à modifier la surface de ces biomatériaux ont été développées pour prévenir la
colonisation des bactéries.61-63 Dans un premier temps, Zou et collaborateurs, cherchant à optimiser le PVC
pour différentes applications médicales, ont étudié le revêtement de brosses polymériques hydrophobes à la
surface du matériau par liaison physique ou chimique. Le but étant de générer une interface biocompatible.
Cette couche inerte agit en tant que barrière pour éliminer les interactions biologiques non spécifiques
(Figure 5).

A B

Figure 5 – Représentation topographique de la surface de PVC en absence (A) ou en présence (B) de

brosses polymériques par Zou et coll. 64

L’ajout de brosses de polymères semble permettre une diminution au minimum de l’adsorption protéique et
cellulaire à la surface du PVC. Toutefois, très peu de recherches ont été menées sur le sujet et sur l’effet des
PVC revêtus de brosses polymériques lorsqu’ils sont en contact avec le sang et ses dérivés.50,65

Également, quelques recherches ont été effectuées sur la modification de surface par fonctionnalisation de
peptides antimicrobiens (AMP) (Figure 6). En fait, les AMPs cationiques se lient aux membranes bactériennes

2
anioniques par attraction électrostatique ce qui conduit éventuellement à la mort des bactéries. Il n’empêche
que le mécanisme d’action des AMPs reste complexe et peu étudié. La principale problématique associée à
l’utilisation des AMPs en clinique est associé à leur cytotoxicité.66,67

Figure 6 : Schématisation du concept d’AMP attaché sur la membrane bactérienne par Sun et coll.68

L’addition de nanoparticules (NP) solides à la composition de polymères synthétiques prend également une
place de plus en plus importante grâce notamment à leur grande variété de compositions et de propriétés qui
contribuant au développement de leurs applications.63 Les équipements chirurgicaux, les appareils de protection
en centres hospitaliers, les textiles, les matériaux d’emballage ou ceux associés à la conservation des aliments,
les systèmes de purification d’eau et les équipements marins représentent certains des nouveaux champs
d’applications des nanoparticules.60,65,66,69,70 L’incorporation de NP de silice (SiO2) dans des revêtements nano-
composites est également reconnue pour améliorer les propriétés mécaniques et optiques de ces derniers.71,72
Elles suscitent également un intérêt pour le développement de revêtements aux propriétés uniques en
permettant un accès à de nombreuses fonctionnalisations de nature organiques et inorganiques.72 Il n’empêche
que le plus grande majorité des applications faisant intervenir des NP SiO2 montrent qu’elles peuvent être
relâchées par des moyens mécaniques comme la friction, par exemple, lorsqu’elles sont utilisées pour le
traitement de l’émail des dents ou de pneus de voiture.71 Les propriétés des NP étant le plus souvent associées
à leur fonctionnalisation de surface, tout processus entrainant leur agglomération peut rapidement devenir un
enjeu. Toutefois, cet effet peut être limité par différentes fonctionnalisations de surface des NP SiO2.72

Récemment, une entreprise canadienne a développé un revêtement nanocomposite dédié pour des
applications avec des dispositifs médicaux exploitant les propriétés hydrophobiques de certains polymères
(MAAC ; Medical Antibacterial Antiadhesive Coating). Plus spécifiquement, des NP SiO2 fonctionnalisées sont

3
incorporées à une matrice de PU utilisée lors de sa synthèse pour lui conférer des capacités multifonctionnelles.
Le revêtement possède des propriétés répulsives de sorte que les bactéries ne peuvent se fixer à la surface de
matériaux recouverts par le MAAC, et il présente une activité antimicrobienne exploitant la reconnaissance de
protéines associées à l’adhérence bactérienne (Figure 7).65

Matrice biologique

Bactérie
Bactérie

Nanoparticule

Saccharide
Nanoparticules de SiO2 fonctionnalisées

Revêtement antimicrobien

Figure 7 - Schématisation du mécanisme d’action du revêtement MAAC en contact avec une

suspension bactérienne par Fonseca et coll.

À la lumière des connaissances actuelles sur les mécanismes d’actions du MAAC, les NP de SiO2 se lient
de façon spécifique aux saccharides de la couche de peptidoglycane des bactéries, induisant ainsi un
changement osmotique menant à la mort cellulaire.65 En tenant compte que les bactéries à Gram positif ont une
couche plus épaisse et plus accessible de peptidoglycane en surface, il est attendu que l’activité du MAAC soit
plus importante pour ces dernières.65,73 En effet, la structure principale des bactéries à Gram positif est le
peptidoglycane, essentiel à leur viabilité et synthèse, d’où le fait qu’il représente une cible fréquemment exploitée
par les antibiotiques.74 La couche de peptidoglycane apporte rigidité à la cellule et elle varie entre 10 et 100 nm
d’épaisseur. 73 En comparaison, la couche de peptidoglycane des bactéries à Gram négatif n’est que de 3 nm
d’épaisseur.73 Son accessibilité est plus complexe étant donné qu’elle se retrouve entre deux membranes
cellulaires, soit les membranes cytoplasmique et externe de la cellule (Figure 8).

4
 A) Gram négatif B) Gram positif

Figure 8 - Représentation de Manfred Rodhe de la membrane des bactéries à Gram négatif (A) et positif
(B).74 (A) Faible couche de peptidoglycane dans l’espace périplasmique entre les membranes externe et
cytoplasmique de la cellule. Présence de lipopolysaccharides accrochés aux deux membranes, et présence de
porines dans la membrane externe. (B) Épaisse couche de peptidoglycane, sans membrane externe. Présence
d’acide lipotéichoïque et téichoïque dans la membrane cellulaire.

Hypothèse

L’utilisation de la technologie MAAC appliquée à la surface de matériaux utilisés dans la conception de

dispositifs médicaux devrait prévenir la contamination bactérienne et la formation de biofilms bactériens, et par
conséquent, réduire les risques d’infections associé à l’utilisation de biomatériaux contaminés et à la transfusion
de produits sanguins infectés. En second lieu, le pouvoir antiadhésif du revêtement MAAC pourrait réduire
l’adhésion plaquettaire diminuant le niveau d’activation observé pendant l’entreposage des CP et préserver leur
pouvoir thérapeutique.

L’hypothèse de recherche sera vérifiée via la réalisation des objectifs spécifiques suivants :

1- Caractériser l’uniformité et les propriétés physiques du revêtement MAAC lorsqu’il est appliqué à la surface
de différents MPs (c.-à-d. PVC, PU et silicone).

5
2- Optimiser le procédé d’application du revêtement MAAC à la surface de MPs (c.-à-d. PVC des poches
d’entreposage de PSL, polyuréthane (PU) et silicone).
3- Mesurer l’effet antibactérien du revêtement MAAC appliqué à la surface de MPs par rapport à différentes
souches bactériennes en suspension dans les matrices suivantes :
a. Milieux nutritifs
b. PSL
c. Urine artificielle
4- Évaluer les propriétés antiadhésives du revêtement MAAC lorsqu’il est appliqué à la surface de MPs
(c.-à-d. PVC, PU et silicone).
a. Mesurer l’impact du MAAC au niveau de l’adhésion et de l’activation plaquettaire.
b. Mesurer l’impact du MAAC au niveau de l’adhésion bactérienne et la formation de biofilms.
5- Évaluer in vitro l’impact du revêtement MAAC sur la viabilité cellulaire.
a. Évaluer in vitro l’impact du MAAC sur la viabilité de lignées cellulaires.
b. Comparer l’évolution de marqueurs de qualité des PSL (c.-à-d. CG et CP) en présence et en
l’absence du MAAC (±MAAC).

Brièvement, ce mémoire couvrira la caractérisation du revêtement MAAC et l’évaluation de ses propriétés

antibactériennes, antiadhésives et cytotoxiques. Bien que des travaux touchant les objectifs 1, 2 et 5b aient été
réalisés, ceux-ci ne seront pas discutés dans le présent mémoire, mais sont disponibles sous forme de
documents indépendants de ce mémoire.

6
Chapitre 1 – Characterization of the Antibacterial
Activity of a SiO2 Nanoparticular Coating to Prevent
Bacterial Contamination in Blood Products
1.1 Résumé
La mise en place de nouvelles techniques pour le contrôle qualité au sein des banques de sang a
considérablement amélioré la sécurité du sang pour les donneurs et les receveurs. Néanmoins, le risque
d'infection transmise par transfusion demeure. L'application d'un revêtement médical antibactérien et antiadhésif
(MAAC) exploitant des nanoparticules de silice fonctionnalisées à la surface des dispositifs médicaux est une
stratégie innovante potentielle pour prévenir les infections dans ce domaine. L'objectif principal de ce projet
visait à évaluer l'activité antibactérienne du MAAC appliquée sur les matériaux polymères (MP) utilisés dans la
conception de dispositifs médicaux (polyuréthane et silicone) et sur la surface interne des poches d’entreposage
de produits sanguins (polychlorure de vinyle (PVC) avec et sans plastifiant). Les propriétés physiques et
d'adhérence des MP traitées ou non au MAAC ont été caractérisées par microscopie électronique. L'activité
antibactérienne des MP revêtus de MAAC a été testée conformément à la norme ISO 22196:2011 contre
certaines espèces bactériennes à Gram positif (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecalis) et à Gram négatif (Escherichia coli, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae). La
cytotoxicité du MAAC a été évaluée sur la lignée cellulaire L929, selon la norme ISO 10993-5. La microscopie
électronique a révélé une surface plus lisse pour les MP enrobées de MAAC par rapport aux MP non enrobées.
Les MP enrobées de MAAC présentaient une activité antibactérienne significative pour toutes les souches
bactériennes testées (réduction ≥ 1 log). La croissance bactérienne a été significativement réduite pour le PVC,
le polyuréthane, le silicone (99-99,999 %) et le PVC plastifié (90-99,9 %) revêtus de MAAC. L'activité
antibactérienne plus faible observée pour le PVC plastifié enduit de MAAC semble être particulièrement observé
avec les sacs de concentré plaquettaire; probablement lié à la composition chimique du plastifiant. La viabilité
des cellules L929 en présence de MAAC était ≥90 %. Cette étude démontre pourquoi le MAAC peut être
considéré en tant que stratégie innovante pour prévenir la contamination bactérienne.

7
1.2 Abstract
Implementation of technological innovations and quality control system processes within blood supply
organizations have significantly improved blood safety for donors and recipients. Nevertheless, the risk of
transfusion-transmitted infection remains. The application of a Medical Antibacterial and Antiadhesive Coating
(MAAC) exploiting functionalized silica nanoparticles on the surface of medical devices is a potential innovative
strategy to prevent infections in this field. The main objective of this project aimed at assessing the MAAC
antibacterial activity applied on polymeric materials (PM) used in the design of medical devices (polyurethane
and silicone) and on the internal surface of blood product storage bags (polyvinylchloride (PVC) with and without
plasticizer). The physical and adhesion properties of PM treated with MAAC or not were characterized by
electron microscopy. The antibacterial activity of MAAC coated PM was tested in accordance with
ISO 22196:2011 standards against selected Gram-positive (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Enterococcus faecalis) and Gram-negative (Escherichia coli, Serratia marcescens, Klebsiella
pneumoniae) bacterial species. The MAAC cytotoxicity was evaluated on the L929 cell line, according to ISO
10993-5 standards. Electron microscopy revealed a smoother surface for MAAC coated PM compared to
uncoated PM. MAAC coated PM exhibited a significant antibacterial activity for all bacterial strains tested (≥ 1
log reduction). Bacterial growth was significantly reduced for MAAC coated PVC, polyurethane, silicone
(99-99.999 %) and plasticized PVC (90-99.9 %). The lower antibacterial activity observed for MAAC coated
plasticized PVC seems to be particularly noticeable with platelet concentrate bags; likely related to the chemical
composition of the plasticizer. The viability of L929 cells in the presence of MAAC was ≥90 %. This study
demonstrates how the MAAC is a innovative strategy to prevent bacterial contamination in specific conditions.

8
1.3 Introduction
Bacterial contamination remains a leading cause of transfusion-transmitted infections (TTI).75 Platelet
concentrates (PC) are a more frequent source of transfusion-associated bacterial sepsis than red cell
concentrates (RCC; 1 in 50,000 vs. 1 in 500,000 transfusions), mainly because the storage of PC at room
temperature is conducive to bacterial growth. The rate of TTI associated with PC transfusions is ~1 in
2,000-3,300 transfusions, whereas that associated with RCC transfusions is ~1 in 38,500 transfusions.75 Serious
reactions occur in 1 % of blood transfusions, with fatal consequences occurring in 1 in
200,000-500,000 transfusions.76 Recent work has shown that plastic materials used to manufacture blood
storage bags are conducive to the formation of biofilms, which complicates the monitoring of bacterial
contamination.77 The most common skin pathogen responsible for PC contaminations is
Staphylococcus epidermidis, which has the ability to form biofilms and lead to severe (and sometimes fatal)
septic reactions if undetected.78-81 TTI in RCC are mostly caused by biofilm-forming bacteria, such as
Serratia marcescens, Serratia liquefaciens and Staphylococcus spp.32,33,82,83 However, Yersinia enterocolitica
remains the most frequent contaminant found in RCC because of its psychrophilic nature.34

To reduce the prevalence of TTI, blood banks have implemented numerous safety measures over the last
decades, including donor screening, disinfection techniques, removal of the first milliliters of whole blood
donation, universal leukocyte reduction, and bacterial contamination tests before transfusion.33 Nevertheless,
only 20 % - 40 % of contaminated blood products can be detected using systematic, automated microbial culture
systems, with most false negatives caused by subthreshold levels of bacterial contamination or undetected inner
wall biofilms.34,79,84-90 This limitation can be partially addressed using pathogen reduction technologies (PRT),
which has been implemented by many blood banks to reduce the likelihood of bacterial, viral and parasitic
contamination in blood components and (more recently) whole blood. PRT is primarily used in high-income
countries given its high implementation/operational costs.34,91-93 This technology depletes a wide range of
potential contaminants through the use of UV illumination, either alone or in combination with photoactive
compounds that cross-link nucleic acids.92-96 Although effective against a wide range of known (and at least
some emerging) pathogens, PRT does not remove all contaminants and, thus, cannot substitute existing
detection tests.92-96

Nanostructures have emerged as a promising tool to prevent viral and bacterial infections.61-63,97,98 The
incorporation of nanoparticles (NP) into synthetic polymers is appealing given the wide variety of NP
compositions, shapes and surface processing functionalities that confer potentially useful properties.63 Work
surfaces preventing non-specific adsorption of proteins and microbes are of particular interest for the protective
equipment of biomedical personnel; for the development of medical devices, textiles, food packaging and

9
storage; in water purification systems and marine equipment.60,66,69,70 However, the use of many NP, such as
metallic one, may hinder some of these practical applications, since some metals (e.g., copper or silver) have
been associated with cytotoxicity and adverse health events.99-102

The “Medical Antibacterial Antiadhesive Coating” (MAAC; TriPhyll, Ontario, Canada) is an anti-bacterial,
hydrophobic nanoparticular coating that was primarily designed for medical device applications. The potential
antimicrobial and anticoagulant properties of MAAC could be used by blood banks as an inner wall coating for
various blood storage bags. Specifically, the MAAC consists of functionalized silica (SiO2) NP that are
incorporated into the polymeric matrices to generate multifunctional capabilities. In fact, the surface of the SiO2
NP is treated with polysiloxane. The NP are covalently linked to the polyurethane matrix to prevent leaking. The
polyurethane matrix is generated by the interaction of the NCO groups of a commercial aliphatic polyisocyanate
with the OH groups of a polyol. The incorporation of inorganic NP into the surface coating offers several
advantages in addition to a demonstrated antibacterial activity, including improved thermal and mechanical
properties (without compromising those of the treated material).62,71,72 The hydrophobic coating acts both as a
repellent (i.e., it prevents bacterial adhesion) and an antimicrobial agent through the recognition of bacterial
adhesion proteins.103 Therefore, the incorporation of NP within polymeric matrixes arouses interest for
multifunctional coating systems combining organic and inorganic related properties.72 However, friction can
cause NP leaking, which may lead to NP agglomeration and (potentially) loss of activity.71 While this can be
prevented by modifying the surface of SiO2 NP 72, doing so might impact the mechanical or bioactive properties
of the polymer.

The present work aims to assess the antibacterial activity of MAAC when applied on the surface of plastic
materials that are used to manufacture storage bags for labile blood products (LBP) and other biomedical
devices that prevent contamination. Potential safety risks were also evaluated using an in vitro cytotoxicity assay.

To the best of our knowledge, this study represents the first evaluation of the antibacterial performance of
a synergistically acting coating in the presence of blood products using a standardized procedure, a matrix that
more closely approximates the actual conditions of future applications.

1.4 Materials and Methods

1.4.1 Preparation of labile blood products
This study was approved by the research ethics committee of Héma-Québec, the blood operator in Québec,
Canada. Briefly, whole blood donations were obtained from healthy volunteers who signed an informed consent
form. Reveos kits (Terumo BCT, Lakewood, CO, USA) were used to collect 450 mL (± 10 %) of blood; donations
were stored 16-24 hours at room temperature before being processed using the Reveos 3C standard protocol,

10
as previously described.104 RCC units were transferred through an inline leukoreduction filter into final RCC
storage bags made of polyvinylchloride (PVC)-diethylhexyl phthalate (DEHP) containing 100 mL of saline
adenine glucose mannitol (SAGM; Terumo BCT) additive solution. Units were then stored at 2-6 °C until use.
Compatible ABO platelet interim units were pooled, and leukoreduction was performed with the Reveos pooling
set (Terumo BCT, cat. 41910) to create the final PC, which can be stored up to seven days at room temperature
under continuous agitation. PC storage bags were made of PVC with a citrate-based plasticizer (butyryl trihexyl
citrate [BTHC]).

Each blood component was isolated by centrifugation. For RCC, a volume of 25 mL per unit was centrifuged
6 minutes at 2500 x g and 4 ℃. Red blood cells were separated from the supernatant and washed twice in
50 mL of sterile saline (0.9 % NaCl). Cells and their corresponding supernatant were then resuspended in a final
25 mL volume of sterile saline. For PC, cells were isolated following the same procedure, except for
centrifugation parameters (10 minutes at 1430 x g and 22˚ C) and the resuspension solution (25 mL of sterile
1X phosphate-buffered saline [PBS, Fisher]).

1.4.2 Medical Antibacterial Antiadhesive Coating

The nanocomposite, polyurethane-based MAAC was provided by TriPhyll, Inc. Hydrophobic SiO2
nanoparticles, which are functionalized with 12-carbon chains, were dispersed in a two-part solvent-borne
polyurethane coating. The liquid phase MAAC was applied to the inner faces of PVC-DEHP containers (for RCC;
Leukotrap RC system, Heamonetics, Boston, MA, USA) and BTHC-PVC (for PC; Reveos pooling set, Terumo
BCT, Lakewood, CO, USA). The inner walls of PC storage bags have one smooth and one textured surface.
The MAAC was applied on the smoother side of PC storage bags. For RCC units, both inner walls were textured,
and the coating was applied on either side. For the other polymeric materials (PM) commonly used in biomedical
devices (i.e., silicone and polyurethane), MAAC was applied directly on sections of 2500 mm2. Before each
application, a 3-aminopropyl trimethoxy silane (APTMS) primer (Sigma; 2 % APTMS, 6 % distilled water and
92 % isopropanol) was deposited on the surfaces to promote coating adhesion.105 The liquid phase MAAC was
then added using a metallic rod specifically designed to apply a 50 µm-thick coating (RD specialties) at the
surface of each PM under study. Each MAAC-treated sample was then dried at 80 ℃ for one hour or until
complete MAAC polymerization.

1.4.3 Characterization techniques

The MAAC was characterized using scanning electron microscopy (SEM; JEOL 6360LV). SEM samples
were mounted on conductive supports and metallized with gold by sputter coating. In parallel, a 5 nm-thick gold
and palladium coating was deposited on similar samples to assess the composition of the molecular surface by
energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS). The size dispersion of SiO2 NP was evaluated by transmission

11
electron microscopy (TEM; JEOL, JEM-1230). Samples were prepared by depositing a 5 µL suspension of the
SiO2 NP and 5 µL of a 3 % uranyl acetate solution on a copper grid previously coated with a carbon film. Residual
liquid was absorbed using filter paper, and the grid was air-dried in a dust-free environment. The hydrodynamic
diameter of SiO2 NP was determined by dynamic light scattering (DLS) measurements. Experimental samples
were obtained by diluting 10 µL of the SiO2 NP suspension in 1 ml of acetone. Each sample was measured in
duplicate, and data were analyzed to obtain the hydrodynamic radius of the NP.106

1.4.4. Antibacterial activity

1.4.4.1 Decontamination sample

Sections of MAAC treated PM, MAAC untreated PM and cover films were decontaminated by rubbing with
ethanol. The residual contaminants were removed by passage through ethanol, then the excess solvent was
removed by two passages in sterile 1X PBS. Before each test, the sections were dried using sterile gas and
placed in a culture petri dish as used in ISO 22196.

1.4.4.2 Microorganisms and growth conditions

Staphyloccocus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 8739), S. epidermidis (ATCC 43862),
S marcescens (ATCC 35984), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), and Enterococcus faecalis (ATCC 47077)
were obtained from the American Type Culture Collection. S. aureus, and S. epidermidis were subcultured in
tryptic soy broth (BD Biosciences); a nutrient broth (NB; Difco) was used for E. coli, S. marcescens and
K pneumoniae; and a brain infusion broth (Fisher Scientific) was used for E. faecalis. All subcultures were
incubated at 37 °C for 24 hours. Lastly, bacterial cultures were frozen in 20 % glycerol at -80 °C until use. When
needed, each culture was subcultured twice onto nutrient agar and incubated at 37 °C for 24 hours. Cultures
were then resuspended in diluted NB or in LBP, as described in Table 1. Antibacterial activity against the bacteria
of interest was evaluated in NB, PC or RCC, as described in Table 1.

Table 1. Bacterial culture conditions for antibacterial activity testing¥

Material PVC-DEHP PVC-BTHC Polyurethane/Silicone

Incubation temperature (℃) 35 4 35 22 35 37

S. aureus S. aureus S. aureus

Positive
N/A S. epidermidis E. faecalis
Gram E. coli E. coli E. coli
Negative
S. marcescens N/A K. pneumoniae
¥
Incubation at ≥ 90% relative humidity for 24 hours

12
1.4.4.2 Antibacterial activity on polymeric material surfaces
Antibacterial activity was evaluated against bacteria loaded at 5.8 Log CFU/mL, following the ISO 22196;
2011 guidelines; the material and incubation temperatures tested for each contaminant are described in Table
1. The final bacterial concentration was adjusted based on the optical density at l = 600 nm measured by
spectrophotometry (Thermo Scientific, Genesys 10S UV-Vis). MAAC-treated and MAAC-untreated sections of
2500 mm2 were placed in direct contact with the bacterial inoculum and were then covered with 0.05 mm-thick
polyethylene films (Delta Scientific). All samples were then subjected to a 24-hours incubation period in a ≥ 90
% relative humidity environment at the optimal storing temperature of the corresponding species (Table 1).
Bacteria were recovered in a soybean casein digest broth with lecithin and polyoxyethylene sorbitan
monooleate.107 Viable bacteria were counted by plating different dilutions on plate count agar, incubating plates
for 24 hours at 37 °C, and counting colonies. Consistent with ISO guidelines, antibacterial activity was estimated
using the following equation:

Antibacterial rate (%) = (NU – NC) x 100 Eq. 1

NU

Where NU is the bacterial count obtained for the control sections after incubation and NC is the bacterial count
observed for the test conditions with the MAAC sections after incubation.

1.4.5 In vitro cytotoxicity

MAAC cytotoxicity was evaluated using the mouse fibroblast cell line L-929 (ATCC CCL-1). Cells were
placed in direct contact with the coating, in accordance with ISO 10993-5; 2009 guidelines. Cells were grown in
Roswell Park Memorial Institute medium (ThermoFisher) supplemented with 10 % fetal bovine serum (Sigma),
without phenol red, at 37 °C / 5 % CO2. After a minimum of two passages, 1 × 105 cells per well were deposited
on MACC-treated and MACC-untreated coverslips in a 12-well plate. The plate was incubated 24 hours at
37 °C / 5 % CO2. A 1 mg/mL solution of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT;
Molecular Probes) was added to each well for 2 hours at 37 °C / 5 % CO2. Finally, the MTT solution was
removed, and a 100 µL aliquot of isopropanol (Fisher) was added to each well. After a 5-minute agitation period,
the optical density at l = 570 nm was measured using a plate reader (BioTek, Synergy H1 microplate reader).

In parallel, viability was assessed using a double staining fluorescent microscopy method
(NucleoCounter®NC-250TM, Chemonetec) based on acridine orange (AO) and 4,6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI; solution 18, Chemometec) following the manufacturer’s instructions. Viability was also assessed using a
flow cytometry assay (Accuri C6 cytometer; BD, C6 Flow Cytometer) based on 7-Aminoactinomycin D (7-AAD,
BD Bioscience); viability and cell concentration were determined following the manufacturer's recommendations.

13
1.4.6 Statistical analysis
Bacterial counts were converted to logarithmic values, which were analyzed with standard summary
statistics (i.e., means and standard deviations [SD]). Acceptability criteria for the antibacterial activity and
cytotoxic tests were obtained following ISO standards recommendations.108 The antibacterial and cytotoxicity
assays were performed three times for consistency. Microscopy data were analyzed using ImageJ.109 DLS
results were analyzed using Zetasizer (Malvern).

1.5 Results and discussion

1.5.1 Characterization
The functionalized SiO2 NP had a mean±SD diameter of 20 ± 6 nm based on TEM images and a
hydrodynamic diameter of 37 ± 3 nm based on DLS measurements (Figure 1 and Table S1). The 30 % relative
SD might be due to silane monomers reacting together during synthesis.110,111 The observed size difference
between TEM and DLS can be mostly explained by differences in the sample preparation and analysis methods
used in both techniques: TEM provides information on NPs’ solid diameter, whereas DLS data correspond to an
interpreted hydrodynamic diameter that can be influenced by NPs’ size and behavior in the suspension medium,
which can in turn be affected by functionalized surface molecules.112,113

A B C
15 20
60 10
Intensity (%)

50 8
Intensity (%)

40 6
30 4
20 2
10 0
30 35 40 45
0
15161718192021222324 Hydrodynamic diameter
NP diameter (nm) (nm)

Figure 9 – Characterization of functionalized SiO2 NP by TEM and DLS. (A) Representative TEM
image, (B) size distribution calculated from TEM images of SiO2 NP and (C) DLS spectrum.

Once added to the MAAC polyurethane matrix, SiO2 NP appeared to aggregate during the drying phase
(Figure 2B, white areas). MAAC-treated storage bags presented a smoother and a more uniform surface than
MAAC-untreated bags (Figure 2 and Figure S1). The mean±SD thickness of the dried MAAC was 9 ± 3 µm on
the thinner sections of the textured PVC-DEHP bags and 52 ± 13 µm on the deeper sections (Figure 2 and
Table S2). Similar results were obtained for the other PM considered (Figure S1).

14
 EDS spectra Front section area Cross section area

Figure 10 – SEM/EDS characterization of the RCC bag sections. SEM images of the (A) uncoated and
(B) MAAC coated PVC-DEHP samples.

Since the solvent accounts for 50 % of liquid MAAC, the expected thickness of the coating after the drying
phase should be up to half that of the rod used for its applications owing to solvent evaporation. Because the
rod only controls MAAC thickness in the thinner sections of textured PVC-DEHP, thickness may be greater at
the deeper textured sections of the material. In addition, the relative amount of oxygen at the surface of PVC-
DEHP increased from 7 % to 14 % following MAAC application, and that of silica increased from 0 % to 3 %
(Figure 2, Table S3). The 3 % relative intensity of silica for MAAC-treated PVC-DEHP is not proportional to the
total amount of SiO2 in the coating, which might be explained by the higher carbon chain concentration from the
polyurethane matrix masking the silica signal. The polarizing electric field is unlikely to go through the entire
MAAC layer.114 Figure 2 also shows there is a complete loss of the chlorine signal (from 8 % to 0 %) following
MAAC application. The relative intensity measured for carbon did not change significantly between control and
test conditions (84 % vs. 83 %, Figure 2 and Table S3). The strong increase in oxygen and the SiO2-related
bands in the test conditions confirm the presence of MAAC at the surface of PM as the coating chemical
composition is polyurethane, mostly, and carbon chains functionalized SiO2 nanoparticles in suspension. The
presence of chlorine in the control PVC-DEHP can be attributed to the chemical composition of PVC.115 Indeed,
the DEHP application may not be uniform at the surface of the control section since the plasticizer is not
covalently bound to the plastic material and may be partially released in RCC during storage. 116 The absence of
chlorine-related bands in MAAC-treated samples confirms the presence of a thin coating layer at the top of the

15
PM. Carbon-related signals are expected to be predominant as carbon is one of the major constituents of
DEHP.117

1.5.2 Antibacterial Activity

The antibacterial activity of the MAAC was investigated given its potential application on LBP storage bags
to prevent bacterial contamination and biofilm formation. This protocol is considered the standard when it comes
to testing plastics and other non-porous surfaces with an antimicrobial claim.107 The antibacterial activity of the
MAAC treated-PM against the four strains after 24 hours in nutrient broth (NB) is presented in Figure 11 and
Figure S2. MAAC-treated silicone sections exhibited the highest antibacterial effect, with a mean±SD log
reduction of 5.2 ± 0.8 for S. aureus (p=0.0002), 5.2 ± 0.8 for E. coli (p=0.006), 5.5 ± 1.1 for K. pneumoniae
(p=0.001), and 3.6 ± 0.9 for E. faecalis (p=0.001) (Figure 11). This high antibacterial activity is partially related
to the significant bacterial growth observed for untreated silicone sections (Equation 1). In addition, the
resistance of silicone to various perturbations (e.g., oxidation, environmental degradation, heat, moist, and
various chemical assaults) makes it an optimal material in the biomedical industry. However, silicone is
conducive to bacterial adhesion onto its surface.118 Reductions of similar magnitude were observed for MAAC-
treated PU sections, with a mean±SD log reduction of 4.9 ± 0.4 for S. aureus (p<0.0001), 4.0 ± 0.5 for E. coli
(p=0.0002), 4.6 ± 0.6 for K. pneumoniae (p=0.0004) and 2.9 ± 0.8 for E. faecalis (p=0.002). The antibacterial
activity of MAAC on polyurethane sections could be (in part) attributable to the similar chemical composition of
MAAC and polyurethane. For PVC sections, the mean±SD log reductions were 2.3 ± 1.3 for S. aureus (p=0.041)
and 4.6 ± 1.5 for E. coli (p=0.004) (Figure 11 and Figure S2). The higher variability in the measured log
reductions could be related to the instability of PVC sections at higher temperatures: the release of gaseous
Hydrochloric Acid during polymer drying at 90 °C might partially degrade the PM substrate.119 For PVC-DEHP,
the mean±SD log reductions were 3.8 ± 0.6 for S. aureus (p=0.0004), 3.1±0.1 for E coli (p=0.017), and
3.9 ± 1.7 for S. marcescens (p=0.009). Finally, the weakest antibacterial activity was observed for PVC-BTHC
sections, with mean±SD log reductions of 2.2 ± 2.1 for S. aureus (p=0.115), 1.4 ± 2.1 for E. coli (p=0.447), and
1±1 log for S. epidermidis (p=0.251) (Figure 11 and Figure S2). Under control conditions, both PVC-DEHP and
(in particular) PVC-BTHC were less conducive to bacterial growth than other PM, which may have contributed
to the higher variability in antibacterial activity (Figure 11)

16
 Figure 11 – Logarithmic bacterial growth (mean ± standard deviation) in nutrient broth (1/500) with an
inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24 hours in contact with untreated (reference) and treated polymeric
materials (MAAC) (n = 3). S. a. = Staphylococcus aureus; E. c. = Escherichia coli; S. m.=
Serratia marcescens; S. e. = Staphylococcus epidermidis; K. p. = Klebsiella pneumoniae;
E. f. = Enterococcus faecalis.*Significant growth difference between the reference and the MAAC condition
(p-value < 0.05).

The lower antibacterial activity observed for PVC-BTHC sections may be related to the non-adhesive nature
of this plasticizer, which may cause moderate bacterial growth under control conditions.31,57 A number of studies
of PM topography on bacterial adhesion have also shown that textured surfaces may be beneficial for adhesion,
although this cannot be generalized to all materials.120 Indeed, bacterial adhesion is greatly influenced by the
size and shape of bacteria.120 The majority of platelet contaminants, such as S. epidermidis, may adhere and
grow better on textured than smooth surfaces similar to those of PC storage bags.31 Typically, storage bags
have at least one textured face to prevent fusion during the sealing and sterilization processes.57 However, the
current study conducted tests on the smoother side of platelet storage bags to maintain the textured side intact.
In addition, it is less challenging to apply a uniform coating on smooth surfaces, which may lead to more
reproducible results and less coating delamination. Bacterial growth tests were carried out on smooth as well as
textured PVC surfaces, and there was no significant difference in growth patterns between these surfaces, which
may be related to the BTHC plasticizer. The antibacterial activity calculation recommended by the ISO guidelines
(Equation 1)107 involves the growth of the bacteria under control conditions. The higher bacterial growth variability
observed for PVC-BTHC control sections could explain its weaker MAAC antibacterial activity.73

17
 Bacterial growth in control conditions can also be affected by nutrient concentration, growth phase
(i.e., either stationary or exponential), incubation time, and the starting inoculum concentration. These
parameters are the four critical factors identified by Wigand et al. that can influence the outcome of antibacterial
testing in accordance with the ISO-22196: 2011 guidelines 121

Overall, the mean antibacterial activity was higher for the Gram-positive bacterium S. aureus on all PM
(4.0±1.4 log CFU/mL) than the Gram-negative bacterium E. coli (3.7 ± 1.8 log CFU/mL) (Figure S2). This
observation could be due to hydrogen groups on the surface of SiO2 NP interacting more extensively with the
peptidoglycan saccharides on the surface of Gram-positive bacteria.122 This interaction could destabilize the
bacterial membrane and induce cell death by osmotic shock.122 The lower levels and reduced accessibility of
peptidoglycan on the surface of Gram-negative bacteria could explain this difference.73,122

The antibacterial properties of MAAC have been demonstrated in nutrient broth, with a >90 % reduction of
bacterial growth for all species and PM of interest (coated polyurethane and silicone [99 - 99.999 %] vs. coated
plasticized PVC- [90 - 99.9 %]) (Figure S2). The lower reduction factors observed for plasticized PVC sections
suggest that BTHC and DEHP may interact with the MAAC and partially prevent its antibacterial activity.

Taken together, these results show that the MAAC could be used to prevent bacterial contamination in some
biomedical materials. For example, MAAC could be applied inside urinary catheters, which are mostly made of
polyurethane and silicone, to prevent detrimental infections.60 In addition, the MAAC might interfere with the
metabolism of bacteria by subjecting them to a stressful environment. Indeed, bacteria colonies observed under
test conditions were smaller than those observed under control conditions (Figure S3) 123.

However, the antibacterial efficacy of MAAC for plasticized PVC in nutrient broth medium may not be similar
to that of plasticized PVC in an LBP. Indeed, the bacteria reduction factors were ≤ 90 % in LBP (Figure 12A and
Figure S4A), which doesn’t meet the ISO criteria for antibacterial efficacy.107

18
A B C

Figure 12. Logarithmic bacterial growth (mean ± standard variation) in blood products with an
inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24 hours in contact with untreated (reference) and treated polymeric
materials (MAAC). (A) Logarithmic growth in RCC (PVC-DEHP) or PC (PVC-BTHC) matrices with three
bacteria. Logarithmic bacterial growth of S. aureus in (B) RCC and (C) PC component dilutions in saline
(n=3). S. a. = Staphylococcus aureus; E. c. = Escherichia coli; S. m.= Serratia marcescens;
S. e. = Staphylococcus epidermidis; RBC = red blood cells; SN = supernatant. *Significant growth difference
between the reference and the MAAC condition (p-value < 0.05).

These unexpected results were further investigated in additional experiments in which MAAC’s antibacterial
activity was assessed for each LBP component (i.e., RCC and PC). For RCC, the results suggest that part of
the suboptimal antibacterial activity could be attributed to the high concentration of red blood cells. Indeed, while
S. aureus log reductions of ~0.7 CFU/mL were observed for RCC resuspended in serum (p=0.009) or saline
(p=0.002), a 1.1 ± 0.4 log CFU/mL reduction (p=0.010) was observed for the isolated RCC supernatant
(Figure 12B and Figure S4B). The suboptimal antibacterial activity observed in the presence of red blood cells
is consistent with the hypothesis of Martinez-Camora et al., who postulated that silanol groups on the surface of
SiO2 NP may interact with red blood cell phospholipids and cause hemolysis.124 Reducing the concentration of
red blood cells (1 x 10-9 dilution factor) before exposing them to the MAAC-treated PVC-DEHP increased the
observed log reduction to 1.3 ±0.7 CFU/mL (p=0.025) (Figure 12B and Figure S4B). Given the low magnitude
of this increase, further research is needed to confirm this hypothesis. Currently, hemolysis monitoring is not
possible because the tests were only performed on PM sections. Work is underway to apply the coating directly
to the storage bags without compromising their gas permeability and the MAAC effectiveness to assess the
quality impact on the storage of blood products.

19
 For PC, the high platelet concentration and the plasma constituents may explain the suboptimal
effectiveness of MAAC. Indeed, reduction factors of < 90 % were observed for each isolated component.
Specifically, log reductions of 0.8 ± 0.8 CFU/mL (p=0.131) and 0.4 ± 0.4 CFU/mL (p=0.272) were observed for
platelets resuspended in PBS and only plasma, respectively. These reduction factors are modestly larger than
that obtained with PC samples (0.2 ±0.2 log CFU/mL [p=0.394]; Figure 12C and Figure S4C). The reduction
factor remained < 90 % when using a 1 x 10-6 dilution in PBS (Figure 12C and Figure S4C). In complex matrices,
viscosity can limit molecular and bacterial diffusion and, consequently, their interaction with the coating. In
addition, the adsorption of large, hydrophobic plasma proteins onto the MAAC surface could hinder its
antibacterial activity.124-126

In the present study, E. coli exhibited a slower growth than other species in PC stored under control
conditions (Figure 12A) which, as mentioned earlier, may reduce the calculated antibacterial activity
(equation 1).107 Similar results were obtained using different strains of E. coli that are known to grow in PC,
indicating that these results were not strain-specific (data not shown). These findings are consistent with E. coli
presenting growth difficulties in PC. Platelets can internalize bacteria via TLR-4 receptors and release
microbicidal proteins upon activation, leading to bacterial death.121

The MAAC-induced, two-log reduction in bacterial load (observed in NB) could be interesting for blood
banking operations and medical applications.90 Indeed, contaminations occurring during blood collection is
usually not greater than 100 CFU.90 Consequently, a two-log reduction could be sufficient to reduce the risk of
TTI.90 However, experiments were performed using a small volume of LBP over a 24-hours exposure, in line
with ISO standards. These conditions may not adequately represent routine blood bank operations. Further
research is warranted to explore the effectiveness of MAAC over longer exposures that better capture each
product’s shelf life (i.e., 7 days for PC; 42 days for RCC). In addition, it would be interesting to evaluate the
effectiveness of MAAC applied to PVC sheets before the LBP storage bag manufacturing process.

1.5.3 MAAC in vitro cytotoxicity

Regardless of the cytotoxicity assay used, the viability of L929 cells was consistently ≥ 90 % in MAAC-
treated samples (Table 2). This coating thus meets the ISO 10993-5 guidelines criterion of ≥ 70 % cell viability.108
Viability was ≥ 90 % after 24 hours in contact with the coating, as measured by the MTT colorimetry test.
Moreover, the microscopy-based cell count test and cytometry test confirmed that MAAC does not significantly
affect cell growth. The presence of the non-adhesive MAAC, however, decreases cell adhesion, which is
characterized by rounder cells under optical microscopy (Figure S5).

20
 Table 2. Cytotoxicity of MAAC in L929 cells
Viability (%)

Colorimetry Microscopy Cytometry

(MTT) (AO/DAPI) (7-AAD)

L929 control N/A 94 ± 2 92 ± 3

L929 with MAAC 96 ± 7 92 ± 6 91 ± 3

The absence of MAAC cytotoxicity suggests that the hydrophobic SiO2 of the coating could specifically
interact with the saccharides of the peptidoglycan and thus denature the membrane of the bacteria. This could
explain the apparent greater performance of MAAC against Gram-positive strains than Gram-negative strains.
Conversely, as described by Capeletti et al., eukaryotic cells may be protected by the glycocalyx layer on their
surface.122 Further analysis in blood products would be needed for the MAAC to be used by blood banks or for
other biomedical applications. Additional experiments are being conducted to assess the impact of MAAC on
RCC and PC quality markers. Tests are also underway to optimize the coating application on the inner walls of
regular blood product storage bags. This application by direct injection in blood bags may change the final
chemical nature of the coating due to poor drying, in which case it may be necessary to develop a new
manufacturing concept adapted to MAAC.

1.6 Conclusion
According to ISO 22196 safety and effectiveness criteria, the SiO2 nanoparticular MAAC is effective against
a broad spectrum of potentially pathogenic Gram-positive and Gram-negative bacteria. In all cases the
antibacterial reduction is over 90 % in nutrient broth and can be claimed as an antibacterial agent. Despite these
promising results and since the test conditions of the ISO 22196 are not representative do not allow a good
representation of the actual conditions of use, additional experiments in real storage conditions are needed.
Higher contact times and volume tests could help to more thoroughly assess its potential for biomedical
applications. Moreover, it would be relevant to document the antimicrobial spectrum of MAAC for other
contaminants, such as yeasts, molds and viruses.

Knowing that the antibacterial action of MAAC is more pronounced when applied to polyurethane and
silicone, it could be useful to prevent cases of Catheter-associated Urinary Tract Infections.

21
1.7 ASSOCIATED CONTENT
1.7.1 Supporting Information
The following are available, Figure S1: SEM images of PVC-BTHC (A), polyurethane (B), silicone (C) and PVC
(D) uncoated and coated samples. Relatively smooth and uniform layer of MAAC coating on the surfaces of the
PMs. Slight delamination present between the surfaces of the PM and the MAAC coating (A and C, Cross section
area), Figure S2. Bacterial reduction in nutrient broth (1/500) with an inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24 hours
in contact with PM (reference) and MAAC coated PM (n=3). S. a. = Staphylococcus aureus;
E. c. = Escherichia coli; S. m.= Serratia marcescens; S. e. = Staphylococcus epidermidis;
K. p. = Klebsiella pneumoniae; E. f. = Enterococcus faecalis, Figure S3. Visualization of the antibacterial activity
of MAAC on PVC-DEHP (A) uncoated and (B) MAAC coated against a 6 x 105 UFC/mL load of S. aureus. For
the treated sample, 71 colonies were counted on the 100 plate and 19 colonies on the 10-2 plate for the untreated
sample. Smaller colony in the MAAC coated condition (B) compared to the uncoated one (A), Figure S4.
Bacterial reduction (mean ± standard variation) in blood products with an inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24
hours in contact with coated polymeric materials (MAAC). (A) Bacterial reduction in RCC (PVC-DEHP) or PC
(PVC-BTHC) matrices with three bacteria. Bacterial reduction of S. aureus in (B) RCC and (C) PC component
dilutions in saline (n=3). S. a. = Staphylococcus aureus; E. c. = Escherichia coli; S. m.= Serratia marcescens;
S. e. = Staphylococcus epidermidis; RBC = red blood cells; SN = supernatant, Figure S5. L929 cells growth
following a 24 hours in presence or absence of MAAC. Cell inoculum of 1 x 105 cells/well. Final volume of 2 mL
per well. 24 hours contact at 37 ℃, 5 % CO2. The control condition in contact with the bottom of the well (A),
test condition in contact with a glass coverslip coated with 0.1mL of liquid MAAC (B) and a negative control of
the glass coverslip coated with 0,1 mL of liquid MAAC (C) are shown at 100 X, Table S1. Diameter of silica NPs
by DLS, Table S2. Dried thickness of the MAAC applied on textured PVC-DEHP by SEM, Table S3. Atomic
distribution on the surface of MAAC treated and untreated PVC-DEHP by EDS probe. (Annexe A)

1.8 ACKNOWLEDGMENT
We would like to thank Dr. Mehdi Sanjari's (Nanophyll, Ontario) for his support on the project. We would also
like to thank Samuel Rochette (Héma-Québec, Québec) for his support in the revision of the document.

22
Chapitre 2 – Évaluer les propriétés antiadhésives du
revêtement MAAC appliqué à la surface interne des
poches d’entreposage de PSL
2.1 Problématique d’adhésion bactérienne à la surface des MPs
Pour les banques de sang, les risques associés à la contamination de produits sanguins par la présence
de biofilms représentent un enjeu en raison notamment de leur habileté pour adhérer aux surfaces internes des
poches de produit sanguin les rendant plus difficilement détectables les méthodes de détection plus courantes.
En effet, les méthodes se basent sur l’analyse d’un échantillon du produit en phase liquide. Pour qu’un biofilm
soit détecté, il faut que celui-ci se détache d’une paroi le rendant accessible au prélèvement. Le problème vient
donc de la représentativité entre le volume de prélèvement de l’échantillon analytique et le contenu total du
produit sanguin. Les biofilms deviennent plus à risque de causer des infections sévères chez les receveurs de
produits sanguins en raison des problèmes associés à leur détection.127 De plus, contrairement à leur état
planctonique ou en flottaison, les bactéries sous forme de biofilms sont considérées comme étant plus virulentes
et plus difficile à traiter en raison de leur résistance accrue aux défenses de l’hôtes et aux antibiotiques.57

Les risques associés à la formation de biofilms sont plus important pour les CP en raison de leurs conditions
de conservation (sous agitation et à température ambiante) en poches de plastique perméable au gaz qui sont
propices à la prolifération bactérienne.9 La composition des poches d’entreposage en polychlorure de vinyle
(PVC) plastifié hydrophobe est reconnue pour favoriser l’adhésion bactérienne et plaquettaire.57

Les bactéries à Gram positif du type de S. aureus, Cutibacterium acnes et Bacillus cereus sont
majoritairement associées aux contaminations retrouvées avec les PSL. À l’inverse, des contaminations par
bactéries à Gram négatif sont peu fréquentes, mais sont considérées comme étant plus dangereuses étant
donné qu’elles peuvent causer plus rapidement, par production rapide d’endotoxines, des septicémies. Plus
précisément, les recensements de cas de septicémies associés à la transfusion de produits contaminés
positionnent S. aureus en haut de liste avec 43 % des cas reliés à son caractère adhésif et pathogène.128-130

2.1.1 Adhésion volontaire de S. aureus au PVC des poches d’entreposage des

PSL
Dans le but d’évaluer l’impact du revêtement MAAC sur l’adhésion bactérienne et la formation de biofilms,
la souche S. aureus (ATCC 6538 formatrice de biofilm) a été considérée avec deux types de PVC utilisés dans
la confection de poches d’entreposage de PSL, soit le PVC-DEHP et le PVC-BTHC (n=1). La souche
ATCC 6538 a été utilisée à titre comparatif dans le cadre d’essais réalisés dans le respect de la norme
22196; 2011. Plus précisément, des charges bactériennes variant entre 0 et 104 UFC total ont été déposées

23
directement sur des sections de 1 cm2 de PVC±MAAC en plaque 12 puits (CorningTM, Fisher Scientific; Saint-
Laurent, Canada). Les sections ont ensuite été placées à 37 °C sous une agitation de 130 RPM pour une durée
de 24 heures dans le but de favoriser l’adhésion de S. aureus en surface. Suivant la période d’incubation, les
sections ont été récupérées et rincées par trois passages en PBS (Fisher, Saint-Laurent, Canada) d’une durée
de cinq minutes. Le but étant d’éliminer les bactéries non adhérées à la surface. Les sections ont ensuite été
fixées avec du paraformaldéhyde 4 % (Sigma-Aldritch, Oakville, Canada) et incubées 15 minutes à température
pièce à l’abri de la lumière.

L’observation comparative des sections de PVC marquées se fait ensuite en microscopie électronique à
balayage (MEB, JEOL 6360LV). Puis, un minimum de huit images de 1 900 µm2 acquises aléatoirement ont été
analysées par décompte automatisé au moyen du logiciel ImageJ (Java 1.8.0_172). Plus précisément, le logiciel
permet d’éliminer le bruit de fond de chaque image et de quantifier l’intensité de la coloration associée aux
régions d’intérêt. L’analyse d’images permet également de cibler les zones associées spécifiquement aux
bactéries et parvient à identifier à leur bordure, puis d’en faire le dénombrement. 109

Après 24 heures de contact, les images acquises en MEB démontrent visuellement que le nombre de
bactéries S. aureus adhérés sur les deux types de PVC est réduite en présence du MAAC (Figures 13.1 et 14.1).
Les décomptes bactériens réalisés à partir des mêmes échantillons mais au moyen d’une analyse visuelle
confirme la tendance (Figures 13.2 et 14.2); la présence du MAAC réduit l’adhésion bactérienne à hauteur de
90% pour le PVC-DEHP avec un inoculum initial 102 UFC. Une tendance similaire a été observée pour des
inoculums initiaux de 103 UFC (réduction de 85,2 %) et de 104 UFC (réduction de 64,6 %) (Figure 13).

L’efficacité antiadhésive du MAAC tend à diminuer avec l’augmentation de la charge bactérienne. Une
observation qui peut être expliquée par une diminution des interactions entre le revêtement et les bactéries du
volume. Les résultats obtenus devraient toutefois être vérifiés minimalement à deux reprises avant que toute
tendance ne soit confirmée. Il n’empêche que pour l’ensemble des sections analysées, il existe une variation
entre les acquisitions qui est associée à la variabilité de la croissance bactérienne, certes, mais également à la
formation de biofilm en surface. Par exemple, plus le biofilm semble développé, plus il est difficile de délimiter
les bactéries du bruit de fond, tel qu’observé dans le cas des contrôles suivant des inoculums initiaux de 103 et
104 UFC présentés à la Figure 13. Il devient plus complexe pour le logiciel, de même que l’œil humain, de bien
discriminer le nombre de bactéries totales. Dans un cas similaire, l’épaisseur du biofilm n’est pas prise en compte
par l’analyse par image limitée à deux dimensions.

Pour contrer ces problématiques il serait pertinent de reprendre les analyses sur des périodes de temps
moins étendues, peut-être avant la formation suspectée de biofilm ou encore de simplement utiliser une

24
méthode d’analyse alternative. L’utilisation d’une trousse commerciale de marquage à fluorescence, du type
Live/Dead, pourrait être une solution envisagée pour faciliter l’analyse de l’adhésion bactérienne.

A) Observation MEB
0 UFC 102 UFC 103 UFC 104 UFC
CTRL

MAAC

B) Analyse du nombre de bactéries adhérées

14000
Adhésion bactérienne /

12000
10000
1 900um2

8000
6000
4000
2000
0
0 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04
Inoculum bactérien (UFC/puit)
CTRL MAAC

Figure 13 – Adhésion résiduelle de S. aureus sur PVC-DEHP avec et sans revêtement MAAC observée
en MEB (A) et convertie en nombre de bactéries par image par décompte automatisé via Image J (B)
(n=1). L’analyse avec le logiciel Image J se fait sur un minimum de huit images aléatoires de taille de 1 900
µm2 pour chacun des échantillons de PVC-DEHP.

À la lumière des résultats observés, il est possible de remarquer une certaine diminution de l’adhésion avec
le PVC-BTHC, évaluée à 61 %, pour un inoculum initial de 102 UFC. La même diminution atteint 49 % pour un
inoculum de 103 UFC et 50 % pour un inoculum de 104 UFC (Figure 14), toujours à partir des analyses par
imagerie.

25
A) Observation MEB
00UFC
UFC 10100
2 UFC
UFC 10 3 UFC
1000 UFC 1010000
4 UFC
UFC

CTRL
CTRL

MAAC
MAAC

B) Analyse du nombre de bactéries adhérées

4000
Adhésion bactérienne /

3000
2000
1 900um2

1000
0
0 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04
-1000
-2000

Inoculum bacétiren (UFC/puit)

ctrl maac

Figure 14 – Adhésion résiduelle de S. aureus sur PVC-BTHC avec et sans revêtement MAAC observés
en MEB (A) et convertie en nombre de bactéries par image (B) par décompte automatisé via Image J
(n=1). L’analyse avec le logiciel Image J se fait sur un minimum de huit images aléatoires de taille de
1 900 µm2 sur un même échantillon de PVC-BTHC.

26
 Il n’empêche que la réduction de l’adhésion semble plus accentuée pour le PVC-DEHP (Figure 13) ce qui
peut être potentiellement associé au changement de texture de la surface. En effet, pour le PVC-BTHC (Figure
14), l’analyse se fait dans les deux cas (contrôle et MAAC) sur une surface lisse. Dans le cas du PVC-DEHP, le
contrôle est texturé alors que le revêtement MAAC est lisse. Cette texture vient du fait que, lors de son
application, le MAAC remplit les puits de la feuille de PVC-DEHP. Ce changement de texture contribue à
rehausser l’effet antiadhésif du revêtement. La littérature confirme d’ailleurs que l’adhésion bactérienne est
généralement réduite sur une surface lisse composée de PVC-BTHC comparativement à celle texturée.57 Des
essais comparatifs d’adhésion bactérienne avec des surfaces texturées et lisses de PVC pourraient permettre
de vérifier cette hypothèse et l’ajout d’une condition de PVC rigide non traité pourrait également devenir
intéressante. L’absence de plastifiant pourrait permettre de réduire au minimum l’impact de ces composants sur
l’adhésion bactérienne en condition contrôle, un effet directement lié à l’effet antiadhésif du revêtement.

Dans le cadre de travaux futurs, il serait intéressant de normaliser la texture des matériaux étudiés avant
l’ajout du revêtement. L’effet antiadhésif étant associé à la croissance sur contrôle, si celle-ci diffère, il est certain
que l’interprétation des résultats obtenus peut devenir complexe. Pour tenter de conserver la surface texturée,
il serait possible d’utiliser des méthodes alternatives afin d’appliquer le revêtement; par exemple, la
centrifugation, ou une application par dépôt de couches minces pourraient permettre d’atténuer l’impact des
différences entre les textures des matériaux. Il serait aussi possible de créer une surface de PVC-DEHP lisse
sur laquelle le revêtement MAAC pourrait être appliqué, ce qui pourrait permettre d’analyser le comportement
antiadhésif réel, sans qu’il n’y ait d’impact de texture en jeu.

Également, la réduction de l’adhésion bactérienne en surface pour les inoculums initiaux de plus de 102
UFC pourrait être associé à une saturation de la charge bactérienne en surface qui serait donc plus facilement
retirée avec le milieu de culture après 24 heures. Il est possible que cette saturation donne lieu à la formation
de biofilm et ce qui est observé ne soit que la couche bactérienne au-dessus de la matrice extracellulaire formée.
Cette deuxième hypothèse semble plus probable dans le cas des PVC-DEHP, mais il est difficile de différencier
la matrice extracellulaire du biofilm de l’aspect texturé du PVC-DEHP. Par contre, les études antérieures sur le
processus de formation de biofilms par S. aureus confirment sa saturation /maximale après 24 heures
d’incubation, expliquant les délais de 18 à 24 heures normalement associés aux études de biofilms.131 Le
comportement du biofilm demeure toutefois dépendant du milieu de culture considéré, notamment de la
présence de chlorure de sodium dans le milieu de culture, nécessaire à la mise en place du biofilm de S.
aureus.131 L’adhésion des bactéries S. aureus en surface du revêtement MAAC, autant pour le PVC-BTHC
(Figure 7) que le PVC-DEHP (Figure 8), est généralement concentrée en amas plutôt qu’étalée uniformément
sur l’ensemble de la surface, tel qu’observé en condition contrôle. Cette tendance pourrait venir du fait que les
bactéries peuvent se lier sur une couche de cellules bactériennes mortes les protégeant de l’action bactéricide

27
du revêtement et mener éventuellement à la formation d’un biofilm. L’hypothèse a d’ailleurs été confirmée par
Su et collaborateurs, identifiant une monocouche cellulaire comme inhibitrice de l’action antibactérienne d’une
matrice polymérique à base de poly(méthacrylique anhydride) biodégradable. Cette même étude suggère
l’utilisation de multicouches dégradables à titre de régénération du pouvoir antibactérien de la matrice.132

L’utilisation de technologies comme celle du suivi de biofilms bactériens en cellules microfluidiques pourrait
permettre de mieux caractériser les impacts du revêtement sur la croissance bactérienne, mais également sa
capacité de formation de biofilms ainsi que les caractéristiques lui étant associées. La contrainte vient ici de la
faisabilité d’application du revêtement MAAC à l’intérieur d’un micro canal, et ce, de façon reproductible et sans
que l’expérience n’induise son détachement.

2.2 Problème d’adhésion plaquettaire à la surface du PVC-BTHC

L’adhésion de plaquettes aux surfaces internes des poches d’entreposage de PVC-BTHC représente
également un enjeu important pour la distribution de ces produits aux hôpitaux.133 Les CP sont normalement
utilisés pour contrôler et prévenir les saignements de patients atteints de cancers, de troubles hématologiques,
pour les chirurgies ou les traumas.133 Bien que seuls des contrôles de stérilité et de pH ne soient utilisés pour
faire état de la qualité des CP avant leur relâchement aux centres hospitaliers, le suivi de marqueurs de qualité
des CP durant l’entreposage demeure important pour éviter une réduction de leur efficacité thérapeutique.133
Les conditions d’entreposage de ces produits, soit le type de poches de conservation, la température
d’entreposage et la durée, en plus de manipulations répétées des produits, peuvent générer des lésions
d’entreposage.133,134 Il peut s’agir de changements physiques ou morphologiques, d’activation plaquettaire, de
changements dans la membrane des glycoprotéines et protéolyse, ainsi que dans l’expression des récepteurs
de surface des plaquettes.134 La perte des fonctions des plaquettes est majoritairement associée à leur réponse
aux stimuli d'activation et au taux de récupération post-transfusionnel qui chute d'environ 30 à 60% pendant
l’entreposage.135 Cette activation peut être causée par l’adhésion des plaquettes aux poches d’entreposage.
L’activation plaquettaire est une conséquence de l’adhésion plaquettaire et peut mener à leur agrégation.136

Dans le but de définir l’impact du revêtement MAAC sur la qualité des CP, ceux-ci ont été déposés sur une
section de PVC-BTHC avec ou sans revêtement MAAC de 1 cm2 pour une période de sept jours en plaque
12 puits (CorningTM, Fisher Scientific; Saint-Laurent, Canada). Après un, quatre et sept jours de contact, une
aliquote du CP a été récupérée pour évaluer son activation et son état de coagulation. En fait, la sélectine P,
également connue sous le nom de CD62, est exprimée par les plaquettes activées et donc le niveau d’activation
plaquettaire peut être mesuré par un marquage en cytométrie du marqueur CD41 (Becton Dickinso,
Mississauga, Canada), propre aux plaquettes, et du marqueur CD62 (Beckman Coulter, Montréal,
Canada).137,138 La coagulation a été évaluée à l’aide de la trousse commerciale de la compagnie Abcam

28
(ab108907; Toronto, Canada). Il s’agit d’un dosage immunoadsorbant lié à une enzyme (ELISA ; Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) qui cible le complexe thrombine-antithrombine. L’antithrombine est en fait le régulateur
final de la coagulation. L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la quantité de complexes
thrombine-antithrombine de l’échantillon. La liaison avec la sérine protéase induit un changement de
conformation qui la coince dans le complexe thrombine-antithrombine (Figure 15).139

Antithrombine

Figure 15 – Cascade de formation de fibrine par Smith et coll.140 Ce modèle divise le système de
coagulation en voies redondantes séparées (extrinsèques et intrinsèques) dont chacune peut entraîner la
génération de FXa. La voie commune aboutit à la génération de thrombine et au clivage subséquent du
fibrinogène en fibrine. Beaucoup d'enzymes et de complexes enzymatiques nécessitent du calcium (Ca2+)
et une liaison aux surfaces membranaires actives (PL) pour une pleine activité.140 L’antithrombine inhibe
l’action de la thrombine.139

La capacité de l’antithrombine de former ce complexe irréversible avec la thrombine et le facteur Xa

démontre que l’activité anticoagulante est toujours fonctionnelle et donc que les fonctions plaquettaires sont
intactes.139,141

La Figure 16 A montre une activation plaquettaire contrôle de 15 ± 12 %, 27 ± 21 % et 25 ± 19 % après

un, quatre et sept jours d’entreposage en plaque 12 puits. Pour les mêmes délais d’entreposage en présence
du revêtement MAAC, une activation plaquettaire 10 ± 11 % (p=0,663), 20 ± 5 % (p=0,634) et 31 ± 8 %
(p=0,622) a été mesurée (Figure 16.A). Les résultats semblent suggérer que le revêtement MAAC ne contribue
pas de manière significative à l’activation des plaquettes du CP. Par contre, un délai prolongé de contact diminue
quant à lui la capacité des plaquettes à s’activer (Figure 10.B). La réserve fonctionnelle passant de 31 ± 32 %
en condition contrôle à 4 ± 7 % (p=0,233) en présence du revêtement après sept jours de contact (Figure 10.B).
À titre de rappel, la réserve fonctionnelle est la capacité des plaquettes à maintenir leur capacité à s’agréger. Il
est à noter que le contact en plaque 12 puits semble également induire ce phénomène, puisque la réserve
fonctionnelle en condition contrôle passe de 69 ± 32 % à 31 ± 3 % entre un à sept jours de contact (Figure

29
10.B). À titre comparatif, les CP entreposés en poche pendant sept jours présentent une activation de 12 % et
une réserve fonctionnelle de 68 %. Il serait préférable de reproduire les essais dans des conditions qui se
rapprochent davantage des conditions réelles d’entreposage des produits sanguins et éviter l’impact de
l’environnement d’entreposage en plaque 12 puits sur les résultats obtenus. La contrainte demeure toujours la
capacité de création de poches d’entreposage contenant le revêtement; qui a été discutée au chapitre
précédent. Celles-ci permettraient de réaliser une étude longitudinale de chacun des composants en volume. Il
n’empêche que les propriétés répulsives de la matrice de PU du MAAC prévient le scellement des poches autant
par procédés thermiques que par ultrasons. L’option d’ajouter le MAAC directement dans la poche ne peut être
considérée en raison de l’absence de contrôle au niveau des conditions d’application, et des problèmes
rencontrés au niveau du séchage. Pour prévenir le problème, il pourrait être pertinent d’ajouter la suspension
nanoparticulaire à une matrice jugée plus compatible avec le procédé actuel, comme le PVC. Encore plus en
amont, ces particules pourraient être incorporées dans la préparation liquide de PVC. Cette stratégie pourrait
même être considérée à titre de solution pour le remplacement futur du DEHP dans les banques de sang.

La très grande variabilité des résultats en plaque montre que la taille d’échantillonnage considérée dans le
cadre de cette étude (n=3) demeure limitée pour représenter un phénomène caractérisé par une certaine
variabilité intrinsèque. Il serait donc nécessaire de répéter les essais avec d’autres échantillons de CP pour
réduire la variation des résultats associée aux changements du comportement sanguin inter-individus, voir inter-
plaquettes. Les plaquettes sont généralement caractérisées par deux phénotypes prédominants, soit pro-
coagulantes ou pro-agrégatives, affectant directement la programmation de leurs fonctionnalités intrinsèques et
extrinsèques, incluant la formation de thrombine.142

30
A) Activation plaquettaire B) Réserve fonctionnelle

60 120
Activation plaquettaire (%)
50 100

Réserve fonctionnelle (%)

40 80

30 60

20 40

10 20

0 0
1 4 7 1 4 7
-10 -20

C) Activité du complexe thrombine-antithrombine

18
16
Thrombine-Antithrombine

14
12
(ng/mL)

10
8
6
4
2
a a a a
0
1 4 7

Figure 16 – Capacité des plaquettes isolés de CP à s’activer (A), leur réserve fonctionnelle (B) et l’activité
du complexe thrombine antithrombine (C) en présence ou absence du revêtement MAAC sur 7 jours (n=3).
(A) et (B) analyse des marqueurs CD41 ET CD62p en cytométrie. (C) ELISA commercial du complexe thrombine-
antithrombine. a : 0 ng/mL. * Différence significative entre les résultats (p-value < 0.05).

31
 L’état de coagulation est réduit de moitié après seulement une journée de contact avec le revêtement MAAC
(Figure 16.C) passant de 12 ± 3 ng/mL en condition contrôle à 6 ± 4 ng/mL en présence du revêtement. Par
contre, la diminution de la capacité des plaquettes de s’activer après quatre jours rend l’interprétation de leur
coagulation particulièrement difficile. En effet, celles-ci ne présentent aucune coagulation (0 ng/mL) autant en
condition contrôle qu’en présence du revêtement MAAC (Figure 16. C). L’augmentation des réplica (n=3)
pourrait également supporter les résultats préliminaires obtenus et réduire l’impact de la variation des donneurs
sur les mesures. La répétition de cette étude en pochettes d’entreposage directement serait probablement plus
concluante.

32
Chapitre 3 – Discussion
Le revêtement MAAC, développé par l’entreprise TriPhyl est anticipé pour présenter un pouvoir
antimicrobien efficace contre les bactéries à Gram positif et négatif ainsi que les mycètes lorsqu’il est appliqué
sur disques d’aluminium. En théorie, les fondements de son activité antimicrobienne se base sur la synergie
entre les propriétés bactéricides des NP de SiO2 et l’action répulsive de la matrice PU.122 La matrice de PU du
revêtement MAAC implique des interactions entre les polyols et les isocyanates. Il est toutefois dit que cette
synthèse soit associée à une faible force mécanique.143 Toutefois, des études antérieures ont identifié que l’ajout
de matériaux organiques et inorganiques en surface pouvait améliorer les propriétés mécaniques du PU.143
C’est d’ailleurs sur ce constat que se base l’incorporation de NP de SiO2 dans le revêtement MAAC. Le
mécanisme d’action exact de ces NP demeure inconnu à ce jour.

La présente étude a permis de valider l’action antibactérienne du revêtement MAAC appliqué sur différents
matériaux polymériques à usage médical, soit le polyuréthane, le silicone et le PVC avec et sans plastifiant, en
matrice simplifiée, soit en bouillon nutritif, permettant une réduction d’au moins un Log10 de la charge des
bactéries à Gram positif et négatif. Cette réduction est plus forte lorsque le revêtement est appliqué sur le silicone
et le polyuréthane. Il est probable que le revêtement interagisse avec le PVC ou les plastifiants utilisés lors de
son application liquide. En fait, aucune délamination ou adsorption n’est visible à la suite de l’application ce qui
suggère que la variabilité entre les plastifiants serait causée par l’interaction du BTHC avec les réactifs initiaux
ou modifiés lors de la polymérisation du MAAC. Dans le but de mieux circonscrire l’effet des plastifiants sur
l’action antibactérienne du MAAC, des essais supplémentaires sur sa stabilité en présence de ces plastifiants
sur une longue période deviendraient nécessaires. Une étude portant sur l’aspect microscopique du revêtement,
évalué par MEB, ainsi que sur le suivi antibactérien selon la norme ISO 22196 serait nécessaire. Les essais
préliminaires réalisés en ce sens montrent une variation dans l’aspect physique du MAAC appliqué sur PVC-
BTHC un mois suivant l’application (Annexe C), caractérisé par des cavités sur toute l’interface du MAAC un
mois suivant l’application. En plus d’avoir une activité antibactérienne efficace, le MAAC a été associé, pour la
première fois, à une diminution de l’adhésion de S. aureus sur les deux types de PVC plastifiés des poches
d’entreposage des PSL. En plus de confirmer les propriétés antibactériennes et antiadhésives du revêtement,
les essais ont permis de valider la cytotoxicité non significative du revêtement MAAC in vitro sur la lignée
cellulaire L-929.

À l’heure actuelle, il ne serait pas avantageux d’ajouter le revêtement MAAC à la surface interne des poches
d’entreposage des PSL étant donné les résultats démontrant son action antibactérienne limitée, en présence
de ces matrices plus complexes. Il est à noter que les procédures standardisées ISO 22196 et ISO 10993-5 ont
été sélectionnées à titre d’études préliminaires dans le but d’une éventuelle accréditation par Santé Canada. Il

33
se peut toutefois que l’étude en fonction de la procédure standardisée ISO 22196 optimisée ne soit pas adaptée
en présence des produits sanguins. Il pourrait être avantageux d’évaluer le comportement du revêtement en
conditions se rapprochant le plus des conditions réelles d’entreposage des PSL. Le court délai d’incubation de
24 heures pourrait également être la cause de l’activité antibactérienne limitée, et donc une prolongation du
délai de contact en matrice complexe pourrait générer une meilleure activité. Par exemple, il pourrait être
bénéfique de répéter les conditions de la norme en suivant quotidiennement l’action antibactérienne du MAAC.
Une étude prolongée se basant sur les délais d’entreposage actuels des produits, pouvant aller jusqu’à sept
jours pour les CP et 42 jours pour les CG, aiderait à cerner les conditions optimales d’utilisation du revêtement
pour améliorer la sécurité des produits sans nuire à leur qualité. Plus d’études sur la charge bactérienne initiale
pourrait également aider à circonscrire les délais minimaux de conservation des produits sanguins pour qu’ils
soient maintenus sécuritaires. Les essais préliminaires réalisés en plaque en présence des PSL, présentés au
chapitre précédent, semblent également avoir des impacts au niveau de la qualité des produits. Une étude plus
approfondie, notamment en considérant des tailles d’échantillonnages plus importantes et plus représentatives
des conditions d’entreposage, permettrait de valider les premiers résultats obtenus avec les CP et les CG. En
effet, la variation inter-donneurs est un enjeu important avec les études impliquant des PSL, et une étude
réalisée à partir d’une tailler d’échantillonnage supérieure à trois serait donc nécessaire pour l’obtention d’une
moyenne plus représentative du comportement du MAAC. En parallèle, il serait pertinent de créer des mimiques
de poches d’entreposage de faible volume dans lequel le MAAC pourrait être appliqué, dans le but de suivre
autant l’action antibactérienne que son impact sur la qualité des produits, et ce sur toute la durée de
l’entreposage.

Des essais d’application du revêtement dans différents formats de pochettes ont été menés, mais son ajout
directement en pochette ne confère pas les mêmes caractéristiques que lors de son application en surface à
l’air libre. En fait, aucune réduction antibactérienne n’a été observée. Ce comportement suggère une mauvaise
évaporation des solvants lors de la période de séchage, et donc un revêtement de nature finale différente. Une
morphologie et un séchage difficilement contrôlables sont généralement observés. Ces tendances sont tirées
du fait qu’aucune évaporation des composants n’était observée dans les pochettes. À l’inverse, l’ajout pré-
scellement du MAAC augmente considérablement l’épaisseur des deux feuilles de PVC et rend difficile la
préparation des poches complexe (Annexe C). La nature réfractaire de la matrice de polyuréthane empêche le
scellement par traitement à haute fréquence ou thermique. Plus d’essais sont donc à prévoir afin d’évaluer et
optimiser le comportement du revêtement MAAC lorsqu’appliqué en conditions réelles d’utilisation pour les
banques de sang. Un procédé d’application différent ou une couche plus fine de revêtement seraient des
avenues à explorer.

34
 Néanmoins, l’effet antibactérien du MAAC sur le silicone ou le polyuréthane en matrice simple suggère que
le revêtement pourrait efficacement prévenir la contamination bactérienne sur ces surfaces. Ceux-ci étant
majoritairement utilisés pour la création de cathéters urinaires, il pourrait être intéressant d’évaluer l’impact du
MAAC en urine, pour répondre au besoin urgent de réduire le risque de contamination du système urinaire
associé à l’utilisation du dispositif médical. Les essais préliminaires réalisés avec cette matrice plus complexe,
lorsque le MAAC est appliqué sur le silicone et le PU, ne donnent pas une action antibactérienne comparable à
celle observée en bouillon nutritif (Annexe D et E). Le fait d’utiliser la procédure standardisée pour ce genre
d’essais n’est pas optimal. Il pourrait être intéressant d’en faire un montage in vitro ou ex vivo de vessie, ou de
suivre l’action antibactérienne sur une plus longue période.

L’étude de l’action antiadhésive du MAAC pourrait également être repensée pour contrer les
problématiques rencontrés avec le logiciel automatisé ImageJ. En effet, l’intégration de fluorescence pour
marquer autant les bactéries vivantes que mortes pourrait éviter les confusions actuelles lié à la matrice du
revêtement ou à la formation de biofilms. Certains essais préliminaires dévoilent de la complicité de cette
méthode en lien avec l’autofluorescence des matériaux polymériques à l’étude (données non divulguées). Pour
éviter cette problématique, il serait nécessaire de cerner l’étendu d’autofluorescence des matériaux avant de
sélectionner les fluorophores nécessaires.

35
Conclusion
En conclusion, le risque de transfusion de produits sanguins contaminés demeure un enjeu des banques
de sang, et ce, malgré les mesures mises en place pour réduire cette problématique au cours des dernières
années. Une façon de prévenir les contaminations pourrait être d’ajouter un enduit antibactérien, comme le
revêtement MAAC, sur les surfaces internes des poches d’entreposage des produits sanguins labiles. Par
contre, les performances actuelles du revêtement laissent penser que la protection d’un revêtement
antibactérien ne serait pas suffisante pour assurer la sécurité des produits sanguins en banque de sang. L’ajout
d’un revêtement ne comportant que des propriétés répulsives, empêchant ainsi l’adhésion bactérienne et
l’éventuelle formation de biofilms, pourrait être une avenue plus avantageuse. En ce sens, où les bactéries
normalement sous forme de biofilm pourrait être détectées avec les tests courants de détection par culture.
Cette solution ne répond tout de même pas à la problématique liée au contaminant à faible croissance. Dans
un tel cas, il serait préférable de combiner un tel revêtement avec une technologie plus efficace de réduction
des contaminants, comme les technologies de réduction de pathogènes. Avec l’utilisation de ces technologies,
les délais pré-traitements représentent un enjeu important limitant d’ailleurs leur utilisation en banque de sang.
En fait, les bactéries à division rapide pourraient, même si présentent en très faible concentration dans le produit
initialement, atteindre des concentrations trop importantes pour que la technologie soit entièrement efficace.

L’objectif principal du projet visait à évaluer les performances antibactériennes et antiadhésives du

revêtement MAAC. Pour y parvenir, des matériaux polymériques utilisés pour la conception de dispositifs
médicaux ont été enduits de MAAC, puis la croissance bactérienne sur les conditions tests et contrôles a été
mesurée suivant les recommandations de la norme ISO 22196 en matrice simple de bouillon nutritif et dans les
produits sanguins labiles. En parallèle, l’adhésion bactérienne de S. aureus en bouillon nutritif a été évaluée
suivant un contact direct avec les PVC des poches d’entreposage des produits sanguins labile de 24 h et
analysée par microscopie électronique. Bien que démontrant un pouvoir antibactérien et antiadhésif en matrice
simplifiée, à son état actuel, le revêtement ne pourrait être utilisé dans les conditions réelles d’utilisation. En
effet, les essais en matrice complexe ne permettent pas l’obtention de résultats comparables, probablement liés
aux mauvaises interactions de leur composant avec le MAAC.

L’étude visait également l’évaluation de la cytotoxicité du MAAC, par analyse in vitro de la viabilité et
croissance bactérienne des cellules L929 en présence du revêtement selon la norme ISO 10993-5. Au final, le
MAAC ne présente pas de cytotoxicité significative contre cette lignée cellulaire. Des études simultanées en
plaques ont également été réalisées pour suivre le comportement d’activation et de coagulation des plaquettes
mises en contact avec le revêtement sur une durée de sept jours, sans qu’il n’y aille d’effet significatif observé.

36
Il n’empêche qu’un suivi du comportement du MAAC sur le long terme et en conditions réelles d’entreposage
est nécessaire.

Toutefois, les difficultés d’application du revêtement posent problème en ce qui a trait à l’étude
antibactérienne et cytotoxique prolongée du revêtement. Le caractère répulsif de la matrice du MAAC empêche
le scellement par chaleur lorsque celui-ci est appliqué avant la conception des poches, et son ajout en poche
ne confère pas les propriétés souhaitées. L’option la plus envisageable serait d’ajouter la suspension
nanoparticulaire à une matrice de polymère compatible avec le PVC, voir le PVC lui-même.

À la lumière des résultats obtenus, certes le revêtement MAAC semble intéressant pour son utilisation en
banque de sang, mais il pourrait être encore plus efficace lorsqu’enduit sur des surfaces communes plus
facilement applicables, comme des comptoirs ou des poignées de porte. En contexte de banque de sang, à titre
de méthode proactive, il pourrait être combiné à d’autres techniques préventives comme la réduction de
pathogène pour maximiser la réduction du risque de contamination des produits sanguins labiles.

Pour bien définir les conditions idéales d’optimisation du MAAC pour son application et utilisation future, il
demeure toutefois nécessaire de bien comprendre ses propriétés. Actuellement, dans le but de mieux
comprendre le mécanisme d’action du revêtement, la synthèse de NP de silice hydrophobes et fluorescentes
est en cours de réalisation. En plus de permettre une meilleure compréhension des propriétés du MAAC, les
NP pourront servir à évaluer leur dispersion dans la matrice (Annexe F) et le relargage potentiel dans les produits
sanguins. Également, un modèle microfluidique est en développement afin d’étudier l’effet du revêtement MAAC
sur la formation de biofilm en conditions contrôlées, se rapprochant des conditions réelles de contamination.

37
Annexe A – Supporting information
Characterization of the Antibacterial Activity of a SiO2 Nanoparticular Coating to
Prevent Bacterial Contamination in Blood Products

Sahra Fonseca1, 3, Marie-Pierre Cayer1, K.M. Tanvir Ahmmed2, Nima Khadem-Mohtaram2, Steve J. Charette3,
Danny Brouard1, 3

1Héma-Québec, Medical Affairs and Innovation, Québec City, Québec, Canada

2TriPhyll, Mississauga, Ontario, Canada

3Laval University, Québec City, Québec, Canada

38
1. Materials and methods
1.1 Characterization techniques
Several characterization techniques were used to measure the abrasion and weatherability of the coating.
The abrasion resistance was measured by the Taber abraser using ASTM D4060 test standard. Weatherability
tests were conducted according to ASTM D 1654 and ASTM B 117 with no scribing for 100 hours to measure
the salt spray resistance. UV resistance was measured according to ASTM D3424.

2. Results
2.2 Characterization
The abrasion resistance was calculated as loss in weight in mg at a specified number of abrasion cycles,
according to ASTM D4060 standard. A rotary rubbing action was provided by an abrasive wheel at a specified
load. A CS-17 wheel was used to produce abrasion. The CS-17 wheel was chosen as it produces a harsh
abrasion. It has aluminum oxide or silicon carbide abrasive particles. A weight of 1000 g was applied on the
wheel, and the reported weight loss was for 1000 cycle of run. For comparison, ASTM D4060 reported a 49.5 mg
weight loss for polyurethane coating. The abrasion testing measured a weight loss of 27 mg after 1000 cycles
of run. This shows that the coating is protect against regular wear and tear. In terms of weatherability, after 100
hours of salt spray testing, the coating received a rating of 10 out of 10, which shows that the coating is corrosion
resistant in a controlled salt and humid environment. For the UV weatherability test, the coating had less than
1.3% gloss (60°) loss after 500 hrs of UV radiation. This shows that the coating can resist UV and can deteriorate
very slowly with prolonged exposure.

Table S1. Diameter of silica NP by DLS.

Standard
Spectra Size (d.nm) Intensity (%)
Deviation (d.nm)
1 35.86 100 2.51
2 37.37 100 2.93

39
 Front section area Cross section area
A Uncoated

MAAC coated

B Uncoated

MAAC coated

Figure S1 – SEM images of PVC-BTHC (A), polyurethane (B), silicone (C) and PVC (D) uncoated
and coated samples. Relatively smooth and uniform layer of MAAC coating on the surfaces of the
PMs. Slight delamination present between the surfaces of the PM and the MAAC coating (A and C,
Cross section area).

40
C Uncoated

MAAC coated

D Uncoated

MAAC coated

Figure S1 – SEM images of PVC-BTHC (A), polyurethane (B), silicone (C) and PVC (D) uncoated and
coated samples. Relatively smooth and uniform layer of MAAC coating on the surfaces of the PM.
Slight delamination present between the surfaces of the PM and the MAAC coating (A and C, Cross section
area).

41
 Table S2. Dried thickness of the MAAC applied on
textured PVC-DEHP by SEM.
PVC-DEHP MAAC thickness Standard
section
Bottom (µm)
51.6 Deviation
13.3 (µm)
Upper 8.8 2.6

2.2 Antibacterial activity

8
7
Log reduction (CFU/mL)

6
5
4
3
2
1
0
S. e.

E. f.

E. f.
S. a.

E. c.

S. a.
S. m.

E. c.

S. a.

E. c.

S. a.

E. c.

S. a.
K. p.

E. c.

K. p.
PVC-DEHP PVC-BTHC PVC Silicone Polyurethane

Nutrient broth medium

Figure S2 – Bacterial reduction in nutrient broth (1/500) with an inoculum of 6 x 105 CFU/mL after 24
hours in contact with MAAC treated PM (n=3). S. a. = Staphylococcus aureus; E. c. = Escherichia coli; S.
m.= Serratia marcescens; S. e. = Staphylococcus epidermidis; K. p. = Klebsiella pneumoniae; E. f. =
Enterococcus faecalis.

42
 100 10-1 10-2
A

19

71

Figure S3. Visualization of the antibacterial activity of MAAC on PVC-DEHP (A) untreated and (B)
MAAC treated against a 6 x 105 UFC/mL load of S. aureus. For the treated sample, 71 colonies were
counted on the 100 plate and 19 colonies on the 10-2 plate for the untreated sample. Smaller colony in the
MAAC coated condition (B) compared to the uncoated one (A).

43
A B C
3
3 3

Log reduction (CFU/mL)

2,5

Log reduction (CFU/mL)

Log reduction (CFU/mL)

2,5 2,5
2 2 2
1,5 1,5 1,5
1 1 1
0,5 0,5 0,5
0 0
0

none

none
1E-03
1E-06

1E-03
1E-06
1E-03
1E-06
1E-09
none
S. e.
S. a.
E. c.

S. a.
S. m.

E. c.
RCC PC RCC RBC SN PC Platelets Plasma

LBP RCC component PC components

Figure S4 – Bacterial reduction (mean ± standard variation) in blood products with an inoculum of 6 x 105 CFU/mL after
24 hours in contact with treated polymeric materials (MAAC). (A) Bacterial reduction in RCC (PVC-DEHP) or PC (PVC-
BTHC) matrices with three bacteria. Bacterial reduction of S. aureus in (B) RCC and (C) PC component dilutions in saline
(n=3). S. a. = Staphylococcus aureus; E. c. = Escherichia coli; S. m.= Serratia marcescens; S. e. = Staphylococcus epidermidis;
RBC = red blood cells; SN = supernatant.

44
2.3 MAAC in vitro cytotoxicity
A B C

Figure S5 – L929 cells growth following a 24 hours in presence or absence of MAAC. Cell inoculum of
1 x 105 cells/well. Final volume of 2 mL per well. 24 h contact at 37 ℃, 5% CO2. The control condition in contact with the bottom of the well (A), test condition
in contact with a glass coverslip coated with 0.1 mL of liquid MAAC (B) and a negative control of the glass coverslip coated with 0.1 mL of liquid MAAC (C)
are shown at 100X.

45
Table S3. Atomic distribution on the surface of MAAC treated and
untreated PVC-DEHP by EDS probe
% Atomic
material C O Cl Si
PVC-DEHP 84 7 8 0
PVC-DEHP + MAAC 83 14 0 3

46
Annexe B – Stabilité du revêtement MAAC sur PVC-
BTHC
A) Post-application B) Une semaine post-application

C) Deux semaines post-application D) Trois semaines post-application

Figure 17 – Stabilité du revêtement MAAC appliqué sur PVC-BTHC hebdomadairement sur un mois
post-application. Analyse en microscopie électronique à balayage. Présence d’un aspect troué après quatre
semaines d’application, probablement lié à la nature de surface du PVC-BTHC (D)

47
Annexe C – Préparation d’une pochette contenant
50 µm de revêtement MAAC par la Société
Canadienne du Sang (SCS)

Figure 18 – Scellement de la poche de PVC-BTHC revêtue de 50 µm de revêtement MAAC par la SCS.

Brûlure de la poche, associée aux débris de coloration bourgogne et noir, engendrant la fuite du contenu de
la poche. L’aspect brulé peut également affecter la qualité des produits qui y sont conservés.

48
Annexe D – Croissance bactérienne sur silicone et
PU en urine artificielle

Figure 19 – Logarithme de la croissance bactérienne (moyenne ± écart-type) en urine artificielle avec

un inoculum de 6 x 105 UFC/mL après 24 heures de contact avec les matériaux polymérique non traités
(référence) ou traités avec le revêtement MAAC (MAAC) (n=3).

49
Annexe E – Réduction bactérienne sur silicone et
PU en urine artificielle

Figure 20 – Réduction bactérienne en urine artificielle avec un inoculum de 6 x 105 UFC/mL après 24
heures de contact avec les matériaux polymériques traités avec le revêtement MAAC (n=3).

50
Annexe F – Dispersion des NP de SiO2 dans la
matrice de PU.
1) Microscopie à fluorescence 2) Microscopie optique en champ
sombre
A) MAAC avec
SiO2 non
fluorescentes

B) MAAC avec
SiO2
fluorescentes

Figure 21 – Dispersion des NP de SiO2 avec (B) et sans RBiTC (A) en microscopie à fluorescence (1A
et 1B) et en microscopie optique à champ sombre (2A et 2B). Grossissement de 200X. (A1) Les zones
rondes texturées représentent les agrégats de NP de SiO2 dans la matrice de polyuréthane. (A2) Confirmation
de la dispersion des NP de SiO2 dans le revêtement MAAC appliqué sur lame de microscopie. (B1 et B2)
Comparaison du comportement des SiO2 dans la matrice via l’internalisation du fluorophore RBiTC dans la
coquille des SiO2.

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