Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Ce rapport est le fruit d’un stage que j’ai eu le plaisir de passer au sein du Centre National
des Sciences et Technologies Nucléaires (CNSTN).
Pour finir, je remercie tous mes enseignants de l’Institut Supérieur de biotechnologie Sidi
Thabet pour la richesse et la qualité de leur enseignement.
Sommaire
Dédicaces.....................................................................................................................................................1
Remerciements............................................................................................................................................2
Présentation du CNSTN................................................................................................................................1
Introduction générale...................................................................................................................................1
I- Etude bibliographique...............................................................................................................................2
1-Notions de bases sur le rayonnement ionisant.....................................................................................2
1.1-Les rayonnements ionisants...........................................................................................................2
1.2-Grandeurs et notions de base........................................................................................................2
1.3-Applications pacifiques...................................................................................................................2
2-La lentille...............................................................................................................................................3
Objectif de l’activité.....................................................................................................................................5
II- Matériels et méthodes.............................................................................................................................6
1-Echantillonnage et conduite de l’irradiation.........................................................................................6
1.1-la source radioactive au Cobalt 60.................................................................................................6
1.2- l’accélérateur d’électrons..............................................................................................................7
2-Essai préliminaire : cartographie de la dose..........................................................................................8
3-Détermination de la dose létale 50 (DL50) .............................................................................................8
3.1-Détermination du pourcentage de germination des graines de lentille.........................................9
3.2- Calcul des pourcentages de germination......................................................................................9
4-Teneur en chlorophylle a et b...............................................................................................................9
5. Teneur en Bêta carotène....................................................................................................................10
III - Résultats et discussion.........................................................................................................................11
1-Effet de la dose d’irradiation sur le pourcentage de germination des graines de lentille...................11
1.1- Traitement dans la source gamma..............................................................................................11
1.2. Traitement par l’accélérateur d’électrons...................................................................................13
2. Teneur en chlorophylle a et b.............................................................................................................14
3. Teneur en bêta carotène...................................................................................................................15
IV. Conclusion......................................................................................................................................16
V. Références bibliographiques..............................................................................................................17
Liste des figures
Figure 1: Schéma général de l’application des techniques de mutation par rayonnement ionisant (agent
mutagène physique) dans l’amélioration des plantes..................................................................................3
Figure 2: (a) les graines de lentille ; (b) la plante de lentille.........................................................................4
Figure 3: échantillons de lentilles conditionnés en sachet de polyéthylène.................................................6
Figure 4: Source du CNSTN........................................................................................................................7
Figure 5 : Accélérateur d’électrons du CNSTN..............................................................................................8
Figure 6: Dosimètre RED PERPEX..................................................................................................................8
Figure 7: Protocole expérimental de mesure des teneurs en pigments des échantillons de feuilles de
lentilles M3 et M0.....................................................................................................................................10
Figure 8: Courbe représentative de la variation du pourcentage de germination des graines de lentille en
fonction de la dose d'irradiation gamma....................................................................................................12
Figure 9 : Variation significative de la longueur des racines de lentille au cours de la germination...........12
Figure 10: Courbe représentative de la variation du pourcentage de germination des graines de lentille en
fonction de la dose d'irradiation par les électrons accélérés.....................................................................13
Figure 11 : Variation de la teneur en pigments chlorophylliens dans des plantes M3 et témoins M0.......14
Figure 12 : Variation de la teneur en β-carotène dans des plantes M3 et témoins M0..............................15
Table 1 : Variation de la teneur en pigments chlorophylliens dans des plantes M3 et témoins M0..........14
Table 2 : Variation de la teneur en β-carotène dans des plantes M3 et témoins M0.................................15
Présentation du CNSTN
Le Centre National des Sciences et Technologies Nucléaires (CNSTN) a été créé le 22 novembre
1993. Il a pour but d’accomplir les études et les recherches nucléaires pacifiques impliquées dans
divers domaines, ainsi que la maîtrise et l’application des techniques nucléaires dans différents
domaines [7]:
sciences et technologies nucléaires à caractère pacifique,
collecte et traitement des informations relatives aux sciences, aux recherches et
aux technologies nucléaire,
fourniture de services aux institutions universitaires et aux entreprises publiques et
privées y compris la formation et les stages,
garantie des mesures de sûreté nucléaires et de radioprotection à l’intérieur des
installations du centre et de l’équipement et assurer la protection de
l’environnement lors de ses activités,
statut sur les questions relatives à la réalisation de la sûreté nucléaire et de la
radioprotection
et réalisation de toutes les activités tendant à assurer le développement des
sciences et technologies nucléaires
Introduction générale
Toutes les formes actuelles de vie sont dues à trois facteurs: les mutations, sources essentielles
des variations transmissibles; l'environnement, qui influence la sélection des mutants qui
survivent et se reproduisent et la durée pendant laquelle le génotype et l’environnement
interagissent constamment, ce qui crée le changement évolutif [5]. La recherche de nouvelles
variétés pour la culture et la consommation humaine est connue sous le nom de sélection.
Auparavant, il s'agissait essentiellement d'un choix entre les bonnes et les mauvaises plantes.
Pour assurer la sélection de nouvelles variétés de végétaux, les sélectionneurs ont utilisé la
génétique qui est devenue le fondement de la sélection pour la reproduction sexuée après que
Mendel eut découvert les lois de l'hérédité vers le milieu du XIXème siècle [5].
1
I- Etude bibliographique
Les rayonnements ionisants sont des émetteurs d’énergie qui est suffisante pour transformer les
atomes qu’ils traversent en ions. Ils provoquent des effets sur le produit qui différent selon le type
de rayonnement et la dose reçue [9].
Le CNSTN dispose de deux installations d’irradiation : une source gamma (émettrice de photons
γ (cobalt 60) et d’un accélérateur d’électrons.
D• : débit de dose c’est le quotient de dD par dt, où dD est l’incrément de dose pendant
dD
l’intervalle de temps dt correspondant : D∙ = , unité : Gy.min-1 [2]
dt
H : L’indice d’hétérogénéité de la dose est le quotient de D max par D min où D max et D min
sont la dose absorbée maximum et minimum respectivement.
DL50 : dose létale 50 qui n’est que la dose de rayonnement qui nous donne 50% de germination
des graines de lentille.
1.3-Applications pacifiques
Le rayonnement ionisant possède plusieurs applications pacifiques qui sont les suivantes :
Stérilisation
L’irradiation est une méthode sûre et économique de stérilisation des dispositifs médicaux à
usage unique tels que les seringues ou les gants chirurgicaux. L’un des avantages clés de cette
technique est qu’elle permet de stériliser des produits qui sont déjà emballés. De nombreux
accessoires et équipements qui sauvent des vies sont stérilisés par irradiation.
Agriculture
2
Le rayonnement ionisant est utilisé dans l’amélioration des plantes pour produire de nouvelles
lignées génétiques de nombreuses plantes dont l’ail, les bananes, les haricots, l’avocat et les
poivrons. Les nouvelles lignées sont plus résistantes aux parasites et plus adaptables aux
conditions climatiques difficiles [8].
Figure 1: Schéma général de l’application des techniques de mutation par rayonnement ionisant
(agent mutagène physique) dans l’amélioration des plantes [5]
2-La lentille
La lentille (lens caulinaris) est une plante dicotylédone de nombre de chromosomes 2n=14 et
appartient également à la famille des fabaceae. La lentille cultivée ou comestible a des graines
très utilisées en agronomie. Ces graines sont riches en protéines et en féculents. Il s’agit de
gousses aplaties.
En Tunisie, les légumineuses alimentaires constituent une composante de base dans les systèmes
agronomiques traditionnels. Les légumineuses alimentaires occupent moins de 4,5% de terres
arables dans le nord tunisien et moins de 9% de la surface des terres cultivées [3]. Malgré tous
ces aspects favorables, la superficie et le taux de production de ces légumineuses en Tunisie n'ont
pas augmenté dans les dernières années. Il a été reporté que les maladies et les insectes nuisibles
sont les problèmes majeurs de cette culture en Tunisie [1]. En effet, ces nouveaux cultivars
subissaient des dégâts considérables occasionnés par des agents pathogènes.
C’est dans ce contexte que se skitue mon activité pratique durant mon stage au Centre National
de Sciences et Technologies Nucléaires (CNSTN). Il s’agit d’un axe de recherche du laboratoire
3
qui vise la production de nouveaux génotypes de lentille résistants et tolérants aux facteurs de
stress biotiques et abiotiques.
4
Objectifs de l’activité
L’objectif de cette activité est d’abord d’être intégré dans la vie professionnelle et d’apprendre et
maîtriser des techniques qui sont en adéquation avec notre formation.
Au cours de mon stage, je me suis initiée à des techniques bien définies dont la germination des
graines de lentilles en appliquant les bonnes pratiques de fabrication et en gardant les conditions
aseptiques. J’ai également appris différentes méthodes d’irradiations et compris leur intérêt et
domaines d’application.
Nous nous sommes particulièrement intéressés au dosage des pigments dans les lentilles
(chlorophylles et β-carotène) par spectrophotométrie.
5
II- Matériel et méthodes
Le matériel végétal consiste en une variété de lentille ‘’BOULIFA’’, il faut faire un tri des
graines avant irradiation de sorte que sauf les graines saines et homogènes sont choisis
Les graines sont traitées par une source de rayonnement (cobalt 60, Co60) et aux
électrons accélérés au centre national des sciences et de technologies nucléaires de Sidi
Thabet avec un débit de dose de l’ordre de 9.836 Gy min-1 et à température ambiante.
Afin de déterminer la dose létale 50 (DL 50) on a utilisé une gamme de doses : (0, 50, 100,
200, 300, 400, 500, 600, 700 et 750 Gy).
Les échantillons sont bien conditionnés, sous vide dans des sachets de polyéthylène pour
le traitement par l’accélérateur d’électrons. Concernant les traitements par les rayons , on
a conditionné les graines dans des tubes PPE de 10 ml.
7
Figure 5 : Accélérateur d’électrons du CNSTN
Le dosimètre utilisé (Red Perpex) va être collé aux échantillons et moyennant la variation de son
absorbance optique et une courbe d’étalonnage, nous aurons une idée sur la répartition de la dose
dans les échantillons testés.
8
3.1-Détermination du pourcentage de germination des graines de lentille
Cette étape consiste à étudier l’influence des différents types de traitements d’irradiation (rayons
et électrons accélérés) sur le pourcentage de germination des graines de lentilles. Pour chaque
dose, un triplet de 20 graines de lentilles ont été soumises à des doses différentes de rayonnement
(de 0 Gy à 1000Gy).
Après irradiation des échantillons, on effectue une stérilisation des graines à l’aide de l’eau de
javel dilué en exerçant une agitation mécanique afin de débarrasser les graines de lentilles de la
poussière et d’éventuelles contaminations par les microorganismes. Ensuite, un rinçage abondant
avec l’eau distillée stérile est réalisé et est suivi de trois lavages d’une durée moyenne de 5
minutes. Toutes ces étapes de désinfection des graines de lentille pour la mise à germination se
font dans des conditions aseptiques. Suite aux lavages successifs, les graines sont mises à germer
dans des boites de pétri stériles contenant du papier filtre stérile et humide. L’incubation des
boites pour la mise à germination est faite à une température de 25 ◦C pendant 10 jours et à
l’obscurité.
4-Teneur en chlorophylles a et b
Pour évaluer la capacité photosynthétique des plantes issues du " plant breeding program" des
mesures des teneurs en pigments doivent être faites régulièrement.
La teneur en chlorophylles ‘a et b’ est mesurée par une technique colorimétrique qui consiste à
mettre quelques feuilles de lentilles (70 mg) issues des différents échantillons (témoins, M2 56,
M2 54, M2 130) dans des bouteilles en verre. On leur ajoute 3ml d’acétone 85%. Une incubation
de 24 heures au minimum est nécessaire pour extraire les pigments à mesurer [4].
9
Des mesures des absorbances optiques des extraits sont réalisées en utilisant les équations
suivantes :
5. Teneur en β-carotène
Les caroténoïdes sont des pigments colorés en rouge aux fortes concentrations et en jaune en
solution diluée. Ils peuvent être dosés par colorimétrie directe au voisinage de 450 nm. Par
convention, les caroténoïdes totaux sont exprimés en β-carotène. On pèse environ 1g de feuille
dans une fiole de 20 ml et on complète avec l’éther de pétrole, puis on mesure l’absorbance de la
solution à 452 nm [4].
M3 et M0
10
III - Résultats et discussion
Les expérimentations décrites ci-après rentrent dans le cadre du lancement d’un nouveau
projet de recherche visant la production de nouvelles variétés de lentille résistantes aux stress
biotiques. Au cours de ce stage, j’ai eu une initiation aux techniques d’irradiation utilisées
comme agent mutagène physique dans le but d’induire des mutations génomiques au hasard.
La première étape réalisée dans ce contexte consiste en l’étude de l’effet de la nature et du type
de rayonnement utilisé sur la variation du pourcentage de germination des graines de lentille. En
effet, la germination traduit le fait que lorsqu'une semence viable est placée dans des conditions
adéquates de lumière, de température, d'oxygène et d'humidité, elle donne lieu à une plantule qui
émerge de la surface du sol, ou de tout autre medium utilisé dans les tests de germination.
Une gamme de doses des rayons et d’électrons accélérés a été appliquée sur les graines et une
courbe montrant la variation des taux de germination en fonction des doses appliquées et du type
de traitement a été tracée. Les résultats résumés dans les figures7 et 8 montrent les variations de
germination des graines en fonction des doses et du traitement étudiées.
Dans le but d’observer et d’évaluer les changements induits par l’irradiation sur le pourcentage
de germination (% Ger) des graines de lentille, des mesures des % Ger ont été effectués sur des
échantillons en triplet d’une vingtaine de graines de lentille irradiées à des doses d’irradiation
croissantes allant de 0 jusqu’à 1000Gy. Le % Ger de la lentille M0 non irradiée, est choisi comme
référence.
La figure 9 illustre la variation % Ger de la lentille en fonction de la dose d’irradiation pour les
échantillons traités dans la source .
11
100
90
Dose (Gy)
Les résultats obtenus à partir de la germination des graines de lentille ayant subi une irradiation
avec des rayonnements sont concluants. Le taux de germination pour l’ensemble des
échantillons témoins a été meilleur et supérieur pour les lots de graines traités avec les doses
croissantes de rayonnements. Cependant, une variabilité en fonction des doses est notable (figure
9). Ainsi, on a constaté que le taux de germination de graines est, pour chaque dose, intimement
lié à la dose absorbée.
D’après les résultats précédents, on a enregistré une valeur de dose létale 50 DL50 aux alentours
de 450Gy.
12
1.2. Traitement par l’accélérateur d’électrons
En effet, cette manipulation consiste à voir et à analyser l’influence du type d’agent mutagène
(type d’installation et nature des radiations) sur la radiosensibilité des graines de lentille et de
déterminer par la suite la dose mutagène la plus adéquate.
100
90
Germination rate (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 200 300 400 500 600 700 850 1000
Dose (Gy)
13
2. Teneur en chlorophylles a et b
Les mesures de la variation des paramètres phénotypiques et biochimiques de la plante dans un
programme de radio mutagenèse sont importantes. En effet, au cours des générations, une
évaluation des paramètres de croissance des génotypes est primordiale [6].
Dans ce même cadre, des mesures des teneurs en pigments chlorophylliens (chlorophylle a et b)
et en caroténoïdes (β-carotène) ont été réalisé sur des échantillons de plantes M3 de la troisième
génération du plant "breeding program" déjà lancé au laboratoire.
Le tableau 1 résume la variation de la quantité des pigments en µg/g de matière fraîche des
échantillons de lentille en fonction des générations.
Table 1 : Variation de la teneur des pigments chlorophylliens dans des plantes M3 et témoins M0.
35
30
µg/g de matière fraiche
25
20
chl a
15 chl b
10
5
0
Témoin M0 M3-54 M3-56 M3-130
Figure 6 : Variation de la teneur des pigments chlorophylliens dans des plantes M3 et témoins M0.
14
3. Teneur en β-carotène
Le tableau 2 montre la variation de la quantité de carotènes total en µg/g de matière fraîche des
échantillons de féverole en fonction de la dose de rayonnement appliquée montre une
augmentation progressive. En effet, les résultats montrent bien une variation significative pour la
teneur en carotène total par rapport aux témoins non traités.
0.14
0.12
0.1
µg/g de matière fraiche
0.08
0.06
0.04
0.02
0
Témoin M0 M3-54 M3-56 M3-130
Figure 7 : Variation de la teneur en β-carotène dans des plantes M3 et témoins M0.
15
IV. Conclusion
Le pourcentage de germination varie selon l’agent mutagène physique utilisé. En effet, les
graines de lentilles ont montré une radiorésistance aux électrons accélérés puisque la DL 50
est aux alentours de 700 Gy pour ce traitement tandis qu’elle est 450 Gy pour l’irradiation
. Cela nous informe sur la capacité de pénétration du rayonnement en fonction de la
technique utilisée.
Suite aux mesures des teneurs en pigments, les génotypes M3 ont montré une variation
significative par rapport au témoin M0. Ceci nous donne une idée sur la variation de la
capacité photosynthétique qui est corrélée avec les changements phénotypiques générés
par la mutation
16
V. Références bibliographiques
[1] Anonyme (2006). Direction des Grandes Cultures. Direction des cultures fourragères et des
légumineuses à grains.
[2] Code de bonne pratique pour le contrôle dosimétrique du traitement ionisant des denrées
alimentaires- édition Chiron.
[3] Kharrat, M., Ben Salah, H., Halila, H.M., (1991). Faba bean status and prospects in Tunisia.
Options Méditerranéennes - Série Séminaires – n°10 : 169-172.
[4] Lichtentaler H.K., Wellburn A.R., (1985). Determination of total carotenoids and
chlorophylls a and b of leaf in different solvents. Biol. Soc. Trans., 11: 591-592.
[5] Novak F.J., Brunner H., (1992). Sélection des plantes: mutations induites pour de meilleures
récoltes, AIEA BULLETIN, 4
[6] Sonia Mejri, Imen Hemissi, Chiheb Brinsi, Amine Asmi, Mouldi Saidi & Yassine Mabrouk
(2021). Dose Dependent Effects of Gamma Radiation on Growth Parameters of Lens culinaris
Medikus subsp. Culinaris". Acta Scientific Agriculture 5.7: 83-89
[7] www.cnstn.tn/ Site officiel du centre national des sciences et technologies nucléaires.
17