Mmarrakchi PDF

N dordre : 2006-37
Annee 2006
Ecole
Centrale de Lyon
de
s, Environnement
Ecole
Doctorale Chimie, Proce
`
THESE
pour obtenir le grade de
Docteur
de lEcole Centrale de Lyon
presentee et soutenue publiquement par
Mouna MARRAKCHI
cembre 2006
le 15 de
D
eveloppement et optimisation de biocapteurs
`
a base de biomol
ecules et de micro-organismes
sur micro
electrodes interdigit
ees
preparee au sein du laboratoire CEGELY
sous la direction de
Mme Nicole JAFFREZIC-RENAULT
M. Claude MARTELET
COMPOSITION DU JURY
M. Didier LEONARD
M. Serge COSNIER
Mme Marie-Claire LETT
Mme Florence LAGARDE
Mme Nicole JAFFREZIC-RENAULT
M. Claude MARTELET
President
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Directrice de thèse
Co-directeur de thèse
(Professeur, UCBL, Lyon)

(Professeur, Universite Joseph Fourier, Grenoble)
(Professeur, Universite Louis-Pasteur, Strasbourg)
(Chargee de recherche CNRS, UCBL, Lyon)
(Directeur de recherche CNRS, ECL, Lyon)
(Professeur, ECL, Lyon)
` la memoire de mes grands-pères

A
Deux personnalites exceptionnelles
- ii -
Remerciements
Meme si une thèse est à la base un travail personnel cest aussi le fruit dune aventure
collective. Je me dois de remercier tout ceux qui y ont participe.
Je tiens à remercier en tout premier lieu Nicole Jaffrezic-Renault pour avoir encadre mon
travail depuis le D.E.A et pendant ces annees de thèse. Ce travail naurait pas vu le jour
sans sa confiance et sa generosite. Je voudrai par ailleurs lui exprimer ma gratitude pour la
rigueur scientifique dont elle a toujours fait preuve ainsi que pour ses qualites humaines et
son soutien permanent meme pendant les moments les plus difficiles.
Je voudrais aussi remercier Claude Martelet pour avoir co-encadre ce travail avec devouement
et disponibilite. Je lui suis reconnaissante pour tout les conseils judicieux et les remarques
pertinentes quil ma prodigues.
Cette thèse à ete entamee au laboratoire IFoS dirige par Daniel Treheux puis continue au
laboratoire CEGELY de lecole Centrale de Lyon dirige par Laurent Nicolas. Je les remercie
sincèrement de mavoir accueilli dans leurs laboratoires respectifs.
Je remercie egalement Serge Cosnier, Professeur à luniversite Joseph Fourier de Grenoble et Marie-Claire Lett, Professeur à lUniversite Louis Pasteur de Strasbourg pour
mavoir fait lhonneur dexaminer ce travail et den etre les rapporteurs.
Je tiens aussi à remercier sincèrement les autres membres du jury Didier Leonard, Professeur à lUniversite Claude Bernard de Lyon et Florence Lagarde, Chargee de recherche
CNRS à lUniversite Claude Bernard de Lyon.
Pendant ces trois ans, jai eu egalement le plaisir de collaborer avec plusieurs laboratoires : le laboratoire de Neurobiologie de lOlfaction et de la Prise Alimentaire, Recepteurs
et Communication Chimique, de lINRA à Jouy-en-Josas : merci à Edith Pajot et Jasmina Minic pour leurs disponibilites, leurs conseils et leurs aides precieuses ; le laboratoire
de genetique moleculaire, genomique, microbiologie de lUniversite Louis-Pasteur duquel je
voudrais remercier specialement Marie-Claire Lett et Didier Lièvremont pour les fructueuses
discussions et les remarques pertinentes que nous avons partage. Je remercie egalement à
Philippe Namour du Cemagref de Lyon pour les analyses de leau par les methodes classiques.
- iii -
Remerciements
Un merci special à Sergei qui ma initie au monde des biocapteurs conductimetriques

avec pedagogie et patience. Je le remercie chaleureusement ainsi que Valentina et tout les
autres amis Ukrainiens : Slava, Alexey, Iryna pour tout les supers moments que nous avons
passe ensemble.
Je noublierai pas de remercier tout les membres du laboratoire CEGELY en particulier
Ricardo, Josiane, Philippe, Gilles, Daniel, Alice, Helène pour leur gentillesse et leur aide.
Un grand merci aussi à Monique pour sa patience, sa gentillesse et sa disponibilite. Sans
son efficacite, le travail au laboratoire naurait pas ete dans les memes conditions.
Je voudrais par ailleurs remercier tout mes amis thesards : Walid, Rita, Iryna, Lotfi,
Yanxia, Saloua, Chaker, Houcine, Amira, Basma, Graziella, Mohsen, Jihède, Messaoud ainsi
que Christelle et Rodica.
Je garderai toujours un excellent souvenir des moments passes au batiment D4 de lEcole
Centrale avec les adorables Dominique, Rita, Anne-Gaelle, Raquel, Denise, Anne-Laure et
toute la compagnie. Merci davoir ete là.
Je ne pourrais pas parler de mon aventure Lyonnaise sans parler des amis qui ont
beaucoup compte pour moi :
mes compagnons de route Boulbaba, Riadh, Fadoua, Emna, Rima, Kaouther, les deux
Sana, Anis, Gaddour, Sonia, Meriem ; je noublierai jamais les fous rires quon a eu
ensemble ni la chaleur des moments quon a partage ; merci davoir toujours ete là
pour moi ; un merci special à Boulbaba et Riadh mes genies informaticiens pour leur
patience et leur aide precieuse pour mes problèmes informatiques et à Riadh qui ma
si gentiment initie au monde du Latex et sans qui ce rapport naurait pas eu cette
forme.
mes amis Khaled, Yassmine, Sana, les deux Melek, Rima, Sabrina, Amine, Salma,
Nejmeddine, Haykel ; merci pour les bons moments que nous avons passe ensemble,
je men souviendrai toujours.
mon ami Nicolas pour les soirees tardives pendant lesquelles les experimentations me
retenaient au laboratoire, et à la fin desquelles il ma gentiment raccompagne, je le
remercie pour sa gentillesse, sa disponibilite et son amitie.
Je voudrais egalement remercier mon oncle Ghanem qui a toujours cru en moi et qui ma
soutenu ainsi que Mohsen, Yosra, Rim et Rami qui ont ete là pour moi lors de mes sejours
Parisiens. Merci aussi à ma cousine Myriam qui ma particulièrement soutenue pendant la
dernière ligne droite de la redaction de cette thèse.
Je ne pourrai pas parler de ma thèse à Lyon sans penser à ma seconde famille, la
famille Chaabouni qui a toujours ete là pour mepauler, me soutenir et mentourer de son
affection. Merci à ma tante Aida et mon oncle Rachid pour leur gentillesse, leur generosite
et tout les sacrifices quils ont fait pour moi. Les mots me manquent pour leur exprimer
toute ma gratitude.
- iv -
Remerciements
Un merci particulier pour mon fiance Tarek qui a toujours ete là pour me soutenir,
meme dans les moments les plus difficiles et mapaiser comme lui seul sait le faire ainsi quà
mes beaux-parents et Melek et Slim pour leur gentillesse et leur affection.
Finalement, je voudrais remercier ma tendre famille : mes deux adorables frères Walid
et Sami pour leur soutien permanent et leur affection ; ma belle-sur Miryam pour sa
gentillesse et sa joie de vivre. Une pens
ee sp
eciale pour mes parents sans qui je
naurais pas
et
e ce que je suis aujourdhui. Ils ont toujours su minculquer la
valeur de la science, mont support
e inconditionnellement pendant toutes mes
etudes et ont fait beaucoup de sacrifices pour moi. Que cette th`
ese leur soit
d
edi
e avec toute mon affection.
Lyon, le 09 novembre 2006
Mouna Marrakchi
-v-
Remerciements
- vi -
R
esum
e
De nos jours, les besoins en biocapteurs dans differents domaines (environnement,
medical...) sont reels. Et cest pour repondre à certains de ces besoins que dans ce
travail nous nous sommes interesses au developpement de differents biocapteurs se
basant sur limmobilisation denzymes et/ou de micro-organismes sur des electrodes
conductimètriques.
La première partie de ce travail a ete consacree au developpement dun biocapteur
enzymatique à base de proteinase K pour le controle de la pollution organique dans les
eaux naturelles à travers le dosage des proteines. Dans la partie suivante, nous nous
sommes interesses au developpement dun biocapteur associant deux activite enzymatique : la -galactosidase et la glucose oxydase et son application au dosage du lactose
dans le lait. La reussite du suivi de la catalyse du lactose par la combinaison de son
hydrolyse enzymatique par la -galactosidase avec loxydation, du glucose genere (catalysee par la glucose oxydase), à laide des electrodes conductimètriques, ont ensuite
ete appliques au dosage du selenite (element toxique à forte dose). Ceci a ete realise
en exploitant la -gal induite dans les cellules bacteriennes de Herminiimonas arsenicoxydans par la presence de selenite. Ainsi, un biocapteur conductimètrique original
associant la glucose oxydase à une bacterie genetiquement modifiee, qui exprime lactivite -galactosidase en presence de selenite, a ete developpe pour la determination
du selenite. Enfin, un biocapteur olfactif se basant sur limmobilisation de levures S.
Cerevisiae genetiquement modifiees, exprimant le recepteur olfactif humain OR17-40
a ete developpe et applique avec succès à la detection de lhelional.
Mots-cl
es : biocapteurs, electrodes conductimètriques, proteinase K, glucose oxydase, beta-galactosidase, Herminiimonas arsenicoxydans, Saccharomyces Cerevisi,
proteines, pollution organique, lactose, selenium, recepteur olfactif, helional.
- vii -
Resume
- viii -
Abstract
Nowadays, the needs in biosensors has proven to be real and relevant in several
fields such as the environment, health,... To meet those needs and expectations, we
focused in this thesis on the design of different biosensors based on enzyme and/or
micro-organisms immobilized on conductometric electrodes. The first part of this
study is dedicated to the use of proteinase K based biosensor to estimate and control
organic pollution in rivers waters through protein titration. The next part describes
the development of a biosensor mixing two distinct enzymatic activities, the betagalactosidase and the glucose oxidase, and its application to lactose determination in
milk. The efficiency of the conductometric biosensor in lactose analysis, as a result of
combination of lactose enzymatic hydrolysis (though beta-galactosidase) and glucose
oxidation (catalyzed by glucose oxidase), were afterwards applied to selenite determination (toxic element if used in important quantities). This was realized by using
Herminiimonas arsenicoxydans bacterial cells where the beta-galactosidase activity
is induced by selenite. Thus, an original conductometric biosensor has been developed, based on the combination of glucose oxidase activity and genetically modified
bacteria, which produced a beta-galactosidase activity in presence of selenite. Finally,
an olfactory biosensor based on the immobilization of a genetically modified Saccharomyces Cerevisi yeast, expressing the human olfactory receptor OR17-40, has been
successfully developed and applied to helional detection.
Keywords : biosensors, conductometric electrodes, proteinase K, glucose oxidase,
beta-galactosidase, Herminiimonas arsenicoxydans, Saccharomyces Cerevisi, proteins, organic pollution, lactose, selenium, olfactory receptor, helional.
- ix -
Abstract
-x-
Introduction g
en
erale
Levolution de la demande et de la necessite dans des situations nombreuses, de
donner une information en temps reel, pour faire face à un evenement critique, a motive la recherche de methodes alternatives. Parmi ces methodes et les dispositifs qui
permettent de les mettre en application, les biocapteurs font partie des filières technologiques les plus prometteuses. En effet, les biocapteurs apparaissent aujourdhui
comme des outils très elegants dans differents domaines : biotechnologies, technologies
biomedicales, environnement, agro- alimentaires... En particulier, des besoins reels
existent pour la determination de divers metabolites et/ou toxiques dans differents
milieux complexes. Les caracteristiques et les performances de ces dispositifs biocapteurs sont très attrayantes : sensibilite, fiabilite, commodite, simplicite, rapidite
(economie des reactifs) et bon marche. Lapparition de plusieurs analyseurs commercialises par plusieurs societes se basant sur differents systèmes de biocapteurs en est
la preuve vivante.
Le principe de base des biocapteurs repose sur la combinaison dun element biologique (cellule, enzyme, anticorps...), dun convertisseur de signal (transducteur) et
dun appareil electrique de mesure. Lelement biologique, par exemple lenzyme glucose oxydase, plonge dans un milieu tel que le sang, se lie à une molecule pour laquelle
il a de laffinite, ici le glucose. La reaction qui sensuit saccompagne de lemission dun
signal qui est converti par lappareil de mesure en une valeur de concentration. Cet
exemple typique avait donne naissance au premier biocapteur et au premier analyseur
de glucose utilise par les diabetiques.
Dans le cadre de ce travail de thèse, on sest interesse à des transducteurs conductimètriques se basant sur des electrodes interdigitees en platine ou en or. Ces transducteurs presentent plusieurs avantages. En effet, non seulement ils ne necessitent
-1-
Introduction generale
pas delectrodes de reference et ne sont pas sensibles à la lumière (comme certains

capteurs potentiometriques) mais en plus ils sont de petites tailles, miniaturisables et
sadaptent à une production à grande echelle et à faible co
ut. Dautre part, plusieurs
combinaisons de biorecepteurs ont ete testes : enzymes, levure et enzyme-bacterie.
Ce manuscrit se compose de six chapitres. Le premier chapitre debute par une
presentation generale du monde des biocapteurs avec un brin dhistorique. Ensuite,
vient une revue de la litterature sur les differents elements dont se compose un biocapteur. En premier lieu, lelement physique : les transducteurs, leurs principes de fonctionnement et quelques exemples dapplication. Ensuite, les differents biorecepteurs
et leurs techniques dimmobilisation les plus utilisees.
Le premier chapitre a ete dedie à une presentation detaillee des microelectrodes
conductimètriques, utilisees dans tout ce travail comme transducteurs. Pour cela, leur
principe general a ete presente ainsi que leur mode de fabrication et le deroulement
des mesures. Les electrodes interdigitees en or et en platine ont aussi ete presentes.
Le troisième chapitre est consacre au developpement dun biocapteur enzymatique faisant intervenir la proteinase K pour la determination des proteines dans les
eaux naturelles comme indicateurs de la teneur en matière organique (MO), qui rend
compte du degre de contamination urbaine de ces eaux.
Le quatrième chapitre traite quand à lui de la mise en place dun biocapteur bienzymatique pour le dosage du lactose. Son application à des echantillons de lait a
ete testee pour montrer son efficacite.
Le cinquième chapitre montre la faisabilite dun concept original utilisant lassociation dune bacterie mutante, dans laquelle le gène codant pour la -galactosidase
(-gal) est induit par le selenium (metallode toxique à forte dose), avec lenzyme
glucose oxydase pour la detection du selenite. En effet, en presence de selenite, la
-gal est produite puis detectee à la suite de laddition de son substrat le lactose et
son hydrolyse en galactose et glucose puis loxydation de ce dernier par la glucose
oxydase.
-2-
Le sixième chapitre presente une etude preliminaire sur la faisabilite dun biocapteur olfactif mettant en uvre une levure genetiquement modifiee avec le gène du
recepteur olfactif humain OR17-40. La possibilite de detecter lhelional à laide du
biocapteur developpe à ete etudiee.
Enfin, les conclusions generales de ce travail ainsi que les perspectives de recherche
achèveront ce manuscrit.
-3-
-4-
Les biocapteurs
Sommaire
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
G
en
eralit
es . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2
Definition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3
Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4
Classification des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
1.1.5
Caracteristiques des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Les transducteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.2.1
Les transducteurs electrochimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.2.2
Les transducteurs optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.2.3
Les transducteurs piezoelectriques . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
1.2.4
Les transducteurs thermiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Les bior
ecepteurs
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1.3.1
Les anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
1.3.2
Les recepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
1.3.3
Les acides nucleiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.3.4
Les cellules animales et vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.5
Les tissus vegetaux ou animaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.6
Les enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.7
Les microorganismes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
Les m
ethodes dimmobilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.4.1
Emprisonnement physique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.4.2
Adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
1.4.3
Liaison covalente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
1.4.4
Reticulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
Conclusion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
-6-
Chapitre 1
Les biocapteurs
1.1
G
en
eralit
es
1.1.1
Introduction
Au cours des 20 dernières annees, la recherche et le developpement dans le domaine

des biocapteurs ont augmente de facon exponentielle que ce soit en terme dinvestissements, de nombre de publications scientifiques (par exemple en effectuant une recherche sur le site Science direct avec le mot biosensor plus que 6000 articles traitant
du sujet ressortent) ou de nombre de chercheurs travaillant sur la thematique dans le
monde entier. Cet interet croissant pour les biocapteurs peut etre attribue aux progrès
technologiques importants dans le domaine de la microelectronique (developpements
dans lindustrie des semi-conducteurs, transducteurs de plus en plus performants et
miniaturises...), des materiaux (materiaux nouveaux...), biologie moleculaire... De
plus, les exigences de plus en plus poussees par rapport au controle de lenvironnement (normes de plus en plus drastiques) ou de la qualite de vie ont fortement
contribue à linteret que suscitent les biocapteurs. En effet, le grand avantage des
biocapteurs reside dans leur concept original autorisant la realisation de systèmes
de mesure integres, autofonctionnels, miniaturisables, aises à mettre en oeuvre et ne
necessitant que peu ou pas de traitement de lechantillon à analyser [Kau02]. De plus,
necessitant des connaissances pluridisciplinaires (figure 1.1), entre autres en biologie et en microelectronique, les biocapteurs ouvrent des perspectives considerables
dans le diagnostic et lindustrie pharmaceutique et dans un grand nombre dautres
-7-
Chapitre 1. Les biocapteurs
domaines. En effet,au niveau de lenvironnement et de lagriculture, les biocapteurs

pourraient jouer un role fondamental : controle de leau, detection des polluants,
pollution des sols... En termes de securite, la detection immediate des polluants utilises comme armes chimiques est egalement primordiale, et certains pays comme les
Etats-Unis
mènent des programmes de Recherche et Developpement specifiques. Les
biocapteurs pourraient aussi avoir des applications dans lindustrie alimentaire, au
niveau du controle des procedes et de la prevention des risques.
Fig. 1.1 Pluridisciplinarite du domaine des biocapteurs
Le marche actuel des biocapteurs est en forte expansion, un tour dhorizon des
nouveaux produits de ce type commercialises ou en phase de letre montre leffervescence du secteur au niveau international. En effet, le marche mondial des biocapteurs
en 1985 etait estime à 5 millions de dollars alors quaujourdhui il depasse les 5
billions [Tur05]. Les biocapteurs pour le glucose occupent encore aujourdhui la plus
grande part du marche en raison de la frequence elevee du diabète insulino-dependant
(plus de 16 millions de diabetiques aux Etats-Unis

dAmerique). Le marche mondial
pour les appareils portables destines à mesurer les glycemies a ete estime en 2002 à
2,7 milliards de dollars par an [Kau02].
-8-
1.1. Generalites
1.1.2
D
efinition
Par definition, un biocapteur est un outil analytique compose dun element biologique appele biorecepteur lie à un transducteur. Le biorecepteur reconnat specifiquement
une molecule du milieu et linformation biochimique qui en resulte est convertie par
le transducteur en un signal analytiquement utile [TTDW01].
La construction dun biocapteur est essentiellement basee sur limmobilisation du
biorecepteur sur le transducteur correspondant (figure 1.2). En effet, cest grace à la
combinaison judicieuse dun composant biologique et dun transducteur quun biocapteur permet la detection et le dosage dun compose dinteret dans un milieu complexe.
Les premiers biocapteurs etudies, puis mis sur le marche, sont des biocapteurs enzymatiques. Les enzymes constituent encore, à lheure actuelle, le composant le plus
utilise dans le developpement des biocapteurs.
Fig. 1.2 Representation schematique dun biocapteur
1.1.3
Historique
Les premiers developpements de biocapteurs ont ete faits par Clark [CL62] par lassociation dune membrane enzymatique contenant la glucose oxydase et une electrode
à oxygène. Ensuite en 1967, Updike et Hicks ont mis au point une electrode enzymatique permettant le dosage de glucose dans une solution biologique [UH67] (La diminution de la concentration doxygène mesuree etait proportionnelle à la concentration
-9-
en glucose). Les idees de Clark sont devenues realite commerciale en 1975 avec la relance reussie (premier lancement 1973) de lanalyseur de glucose par Yellow Springs
Instrument Company (Ohio) base sur la detection amperometrique du peroxyde dhydrogène. Depuis ces premiers developpements, linteret porte aux biocapteurs ne cesse
de grandir et des biocapteurs se basant sur dautres types de transducteurs, autres
que les electrodes ampèrometriques, destines à des applications dans des domaines
divers (biomedical, agro-alimentaires, environnement...), ont vu le jour.
1.1.4
Classification des biocapteurs
Les biocapteurs peuvent etre classes selon plusieurs paramètres qui sont enumeres
ci-après :
1. Classement par type de reconnaissance moleculaire (biorecepteur) : biocapteurs
enzymatiques (avec une enzyme comme biorecepteur), biocapteurs immunologiques, biocapteurs microbiens...
2. Classement par type de transducteur associe : biocapteurs electrochimiques,
biocapteurs optiques, biocapteurs calorimetriques...
3. Classement par espèce(s) detectee(s) : Les biocapteurs peuvent etre classes
egalement suivant les reactions quils permettent de suivre. En effet, on peut
les differencier selon le fait quil permettent de suivre directement un analyte
ou une activite biologique ou indirectement à travers par exemple le suivi dune
inhibition de lactivite catalytique par des toxiques ou metaux lourds.
1.1.5
Caract
eristiques des biocapteurs
Il sagit ici des caracteristiques qui servent à evaluer un capteur et ses qualites
analytiques. Les caracteristiques les plus utilisees sont les suivantes :
1. Selectivite : cest la capacite du biocapteur à distinguer entre des substrats
differents. Cest un paramètre qui depend principalement du composant biologique, bien que parfois le choix du transducteur puisse contribuer à la selectivite.
2. Sensibilite : Ce paramètre correspond au rapport entre laccroissement de la
reponse du capteur et la variation correspondante de la grandeur à mesurer.
- 10 -
1.2. Les transducteurs
3. Reproductibilite : cest parmi les paramètres les plus importants. Il indique la

capacite du biocapteur à donner des reponses très voisines pour des mesures
repetees de la meme quantite de la grandeur à mesurer.
4. Exactitude : Cest laccord entre le resultat de la mesure et la valeur vraie de la
grandeur mesuree et lecart est appele erreur absolue.
5. Limite de detection : Cest la plus petite valeur de la grandeur à mesurer pouvant
etre detectee par le biocapteur dune facon significativement differente du bruit
de fond.
1.2
Les transducteurs
La combinaison dun biorecepteur et dun transducteur devrait deboucher sur

un grand nombre de biocapteurs. En realite, il faut quil y ait compatibilite entre le
transducteur et le biorecepteur pour lobtention dun signal electrique. On ne peut pas,
par exemple, utiliser un transducteur thermometrique si la reaction de transformation
du substrat ne donne pas lieu à une variation denthalpie [Min91]. Quatre systèmes
de transduction, bases sur des principes differents, sont generalement utilises afin de
convertir la reconnaissance moleculaire en un signal electrique exploitable.
1.2.1
Les transducteurs
electrochimiques
Dans les systèmes de transduction electrochimiques, les mesures peuvent etre

conductimètriques, potentiometriques, amperometriques ou impedimetriques...(voir
tableau 1.1 [TTDW01]).
1.2.1.1
Les transducteurs amp

erom`
etriques
Lamperometrie est une technique qui repose sur la determination de lintensite

de courant qui traverse une cellule electrochimique à un potentiel impose. Elle est
fonction de la concentration des espèces electroactives qui seront oxydees ou reduites
à une electrode indicatrice, la seconde etant en general une electrode de reference.
Il est donc possible, après etalonnage, de determiner la concentration de certaines
espèces presentes, par la mesure de lintensite [Min91].
- 11 -
Type de mesure
Transducteur
Exemples delements
detectes
Potentiometrique
Electrode
selective dions
Electrode de verre
Electrode
à gaz
Electrode metallique
Electrode
metallique ou de carbone
Electrode
modifiee chimiquement
K + , Cl , Ca2+ , F
H + , N a+ ...
CO2
Espèces redox
O2 , sucre, alcools...
Sucres, alcools, phenols,
oligonucleotides
uree, espèces chargees
oligonucleotides, antigènes...
H +, K +
Amperometrique
Conductimètrique
Impedancemetriques
Effect de charge
Electrodes
interdigitees
Electrodes
metalliques
Transistor à effet de champ
selectif aux ions (ISFET)
Enzyme FET (ENFET)
uree, creatinine...
Tab. 1.1 Les transducteurs electrochimiques et les methodes de mesure correspondantes
Les biocapteurs amperometriques consistent generalement en une electrode dont

la surface est recouverte dun biofilm dans lequel sont immobilisees des biomolecules.
Dans ce système, lelectrode est maintenue à un potentiel constant permettant dobtenir lelectro-oxydation (ou la reduction) de lun des produits de la reaction enzymatique à la surface de cette dernière generant ainsi un courant electrique dont
lintensite, dans certaines conditions, est proportionnel à la concentration en solution
de lespèce à doser. Lamperometrie est parmi les modes de transduction les plus utilises pour la mise en oeuvre de biocapteurs. La plupart des travaux publies sur les
biocapteurs ampèrometriques à base denzymes concernent le dosage du glucose dans
le sang. Les biocapteurs ampèrometriques ont ete divises en trois generations :
1. Les biocapteurs de première generation ont ete proposes par Clark et Lyon [CL62]
et mis en application par Updike et Hicks, qui ont developpe une electrode enzymatique permettant le dosage de glucose dans une solution biologique [UH67]
(La diminution de la concentration doxygène mesuree etait proportionnelle à
la concentration en glucose). Les idees de Clark sont devenues realite commerciale en 1975 avec la relance reussie (premier lancement 1973) de lanalyseur de
glucose par Yellow Springs Instrument Company (Ohio) base sur la detection
amperometrique du peroxyde dhydrogène.
- 12 -
2. Les biocapteurs de seconde generation emploient un mediateur permettant le

transfert delectrons, qui remplace lO2 . Differents mediateurs ont ete employes
comme le ferrocène, les quinones, colorants de quinoidlike, sels organiques conducteurs, et les viologènes... Lelimination de la dependance par rapport à loxygène
de la première generation, a permis de mieux controler la reaction enzymatique
et les performances du capteur.
3. Les biocapteurs amperomètriques de troisième generation sont marques par la
progression dun système o`
u le mediateur est libre vers un nouveau o`
u lenzyme et le mediateur sont co-immobilises sur la surface de lelectrode. La coimmobilization de lenzyme et du mediateur peut etre accomplie par limmobilisation prealable du mediateur de lenzyme suivie de limmobilisation de lenzyme : limmobilisation des enzymes dans un polymère redox, ou limmobilisation de lenzyme et du mediateur dans un polymère conducteur. Ces biocapteurs de troisième generation offrent tous les avantages des capteurs de seconde
generation, avec de nouvelles caracteristiques. En effet, ces nouveaux biocapteurs presentent une nouvelle autonomie puisque ni lenzyme ni le mediateur
ne doivent etre ajoutes dans le milieu de mesure ce qui facilite la realisation de
mesures repetees.
1.2.1.2
Les transducteurs imp

edancem
etriques (ou imp
edim
etriques)
La spectroscopie dimpedance electrochimique est une technique permettant detudier sensiblement une grande variete de proprietes chimiques et physiques. On observe
actuellement de plus en plus de travaux publies sur les biocapteurs impedimetriques
[GMZ04, PM06]. Ces techniques ont ete developpees notamment pour caracteriser
la fabrication des biocapteurs et pour controler les reactions enzymatiques ou les
phenomènes de reconnaissance moleculaire de fixation de proteines specifiques, de lectines, de recepteurs, dacides nucleiques, de cellules entières ou danticorps. Ces transducteurs sappliquent avantageusement aux reactions daffinite (antigène-anticorps,
chemorecepteurs membranaires) car elles induisent de faibles variations de conductance et de capacitance au niveau de linterface electrode-substrat immobilise.
Dans notre laboratoire, plusieurs travaux ont ete realises utilisant la spectroscopie dimpedance electrochimique (EIS) pour le developpement de biocapteurs. En
effet, elle a ete utilisee pour la caracterisation du comportement et des proprietes des
- 13 -
couches immuno-fonctionnalisees pour le developpement dimmunocapteurs [Hle05,

HHZ+ 06, HMA+ 06a]. De plus cette technique a ete utilisee egalement comme moyen
de transduction pour le developpement dimmunocapteur pour la detection de latrazine [HMA+ 06b], lhemoglobine [HMA+ 06a] ou encore dodorants [HJRM+ 07].
Cependant, la caracterisation par la spectroscopie dimpedance electrochimique se
fonde sur un système dont le comportement electrique depend de divers paramètres
qui sont sensibles à differents regimes ou frequences. De plus, pour pouvoir modeliser
les resultats des mesures dEIS, il faut faire des mesures qui sont generalement assez longs puisquil faut de 10 minutes à plus de plusieurs heures pour enregistrer un
spectre dEIS. Evidemment,

ceci depend du processus de relaxation, de la stabilite
du système à letude et de la gamme de frequence choisie. Malheureusement, ceci
peut mener à des erreurs dinterpretation puisque le système a pu avoir change pendant le laps de temps de letude dEIS [PM06]. Par contre, des etudes cinetiques des
phenomènes de reconnaissance peuvent etre realisees en se fixant à une frequence de
lordre de la dizaine de Hz.
1.2.1.3
Les transducteurs potentiom

etriques
La potentiometrie est une methode electrochimique basee sur la mesure de la difference de potentiel entre une electrode de mesure et une electrode de
reference. La determination des potentiels des electrodes permet de mesurer directement la concentration de lanalyte à doser [Min91]. Dans ce type de système, un
equilibre local est etabli à la surface du capteur et conduit à la generation dun potentiel proportionnel au logarithme de la concentration (activite) de lechantillon selon
la loi de Nernst (voir equation ci-après) :
G
en
eralit
es :
- 14 -
E = E0 +
RT
zF
ln a
o`
u:
E : Difference de potentiel qui setablit, `
a lequilibre, `
a linterface entre le capteur et
la solution de mesure
E0 : Potentiel standard de lespèce consideree
R : Constante des gaz parfaits
a : activite de lion `
a mesurer
T : Temperature absolue en Kelvin
z : Valence de lion
F : Constante de Faraday
Les premiers transducteurs potentiometriques utilises sont : les electrodes de verre

pour la mesure du pH ou des ions monovalents, les electrodes specifiques sensibles aux
anions et aux cations et les electrodes à gaz telles que lelectrode à pCO2 ou pNH3 .
Ces electrodes se pretent facilement à la realisation de biocapteurs. La mesure du
potentiel se fait par lintermediaire dune electrode de reference dont le potentiel est
constant et pris comme origine. En general, cest lelectrode au calomel qui est utilisee.
Elle est plongee dans la solution et disposee à cote du biocapteur.
Le deuxième type de capteurs potentiometriques sont les transistors à effet de
champ (FET-Field-Effect Transistor). La methodologie dISFET (transistor à effet de
champ selectif aux ions) (figure 1.3) pour la mesure dions sest developpee sur la base
du transistor MOSFET (transistor à effet de champ à base de metal/oxyde/silicium).
Et cest grace à ce transistor que Bergveld a montre que lutilisation de dispositifs
dont le principe repose sur leffet de champ est possible en milieu electrolytique [Ber70].
Lisolant silice est alors directement au contact de la solution electrolytique et une
chute de potentiel à sa surface devient temoin de modifications à linterface isolant/solution. LISFET est donc, de par la nature de la surface de lisolant, sensible au
pH. Très vite, des efforts ont ete concentres afin de developper des membranes pouvant
couvrir lisolant et ainsi obtenir des capteurs sensibles à dautres ions [Ber03].
- 15 -
lectrode de rfrence
Encapsulant
Canal
mtal
isolant
Fig. 1.3 Representation schematique des transistors MOSFET et ISFET
Dans notre laboratoire plusieurs capteurs à base dISFET ont ete developpes [SJRMC99, DSE+ 06, MDB+ 06]. Parmi ces capteurs, un ISFET pour la detection des ions ammonium a ete mis en place. Pour se faire, une
membrane contenant un ionophore (zeolithe) a etre deposee sur la partie sensible de
lISFET. Les zeolithes sont des aluminosilicates microporeux. Les differents types de
zeolithes se distinguent par la proportion daluminium et de silicium et incidemment
sur le diamètre des pores. Ainsi, les zeolithes nont pas de formule fixe, mais ils se
caracterisent par un rapport (Al+Si)/O = 12 . La presence des pores (voir figure 1.4)
permet la circulation despèces chimiques chargees et notamment lammonium pour
cette zeolithe speciale. Un capteur hautement selectif pour lammonium avec une sensibilite de detection de 32 mV/pNH4 + et une limite de detection de 108 M a ete
obtenu [HKM+ 02].
Exemples dapplication :
Fig. 1.4 A gauche : photo au microscope electronique de la zeolithe ; A droite : schema

de la structure spatiale de la zeolithe
- 16 -
Sur la base de ce capteur contenant la zeolithe, un biocapteur pour le dosage de

luree a ete developpe. En effet, dans les capteurs conventionnels à uree, des electrodes
selectives à pH [GSP+ 97] et à ammonium [ABJ+ 93], ont ete utilisees pour detecter,
respectivement, les ions H + ou ammonium produits par la reaction enzymatique. Le
problème majeur des electrodes à pH est que la reponse du biocapteur est fortement
dependante de la capacite tampon de lechantillon parce que le changement de pH
produit au cours de la reaction de catalyse enzymatique est minimise par le tampon
utilise, ce qui conduit à un intervalle dynamique etroit et une perte de sensibilite du
capteur. Cest pourquoi le biocapteur qui a ete propose dans cette etude etait base
sur celui decrit precedemment avec la membrane polymerique incluant la molecule de
Zeolite. Ainsi, sur ce dernier une seconde membrane contenant des molecules durease
a ete deposee (voir figure 1.5).
Fig. 1.5 Photo du transducteur ISFET avec vue au microscope optique de la partie
sensible avec la membrane enzymatique deposee
Lactivite enzymatique et les caracteristiques analytiques, de lENFET (Enzymatic Field Effect) resultant, pour la detection de luree ont ete etudiees ainsi que la
possibilite de determination de metaux lourds par lintermediaire dun procede dinhibition de lactivite de lurease. La sensibilite de lENFET pour luree a ete estimee
à 15 mV/pUree avec une stabilite dans le temps du biocapteur de plus de 15 jours
et une limite de detection de 3.105 M. La determination de lactivite residuelle de
lurease après exposition du biocapteur enzymatique à des metaux lourds tel que
Hg(II) a montre lefficacite dutilisation de cet ENFET pour la detection des ions
- 17 -
mercures avec une limite de detection de 5.108 M [HRM+ 02].

Malgre dimportants travaux effectues par un certain nombre de laboratoires dans
le domaine des ISFETs et ENFETs, avec un certain nombre de resultats fiables et
prometteurs il ny a toujours pas de version commerciale reussie dun biocapteur
de type ENFET. Cet etat des choses peut etre explique par le fait quil est difficile de concurrencer sur le marche existant des dispositifs traditionnels (par exemple
electrodes de verre ou de pH) commercialises par de grandes societes. Il faut notamment remarquer quil y a quelques annees seulement il nexistait encore que des
echantillons experimentaux dISFET, tandis que de nos jours une douzaines de compagnies [DSE+ 06], y compris certaines tout à fait celèbres, sont impliquees dans leur
fabrication et marketing.
1.2.1.4
Les transducteurs conductim

etriques
La conductimetrie est une technique de mesure electrochimique alternative aux

techniques potentiometriques et ampèrometriques. Cette technique a ete relativement
peu utilisee pour la mise au point de biocapteurs en comparaison des techniques
potentiometriques et ampèrometriques. Cet ecart est apparemment d
u à une moins
bonne connaissance des principes de fonctionnement de ce type de transducteurs
et notamment des micro-electrodes interdigitees [DSP+ 94]. Cependant, ces dernières
annees, on a assiste à un interet croissant pour les biocapteurs conductimètriques vue
le nombre davantages quils offrent :
ne necessitent pas delectrode de reference
utilisation de tension alternative de petite amplitude ce qui permet deviter des
processus faradique delectrode
ne sont pas photo-sensibles
offrent des possibilites de miniaturisation avec un grand degre dintegration
quand la technologie en couche mince (thin-film technology), peu co
uteuse, est
employee.
Le paramètre mesure est la conductivite/resistivite electrique de la membrane biologique. Quand on a un phenomène qui genère la production dions ou delectrons, la
conductivite/resistivite globales du milieu change. Le principe de mesure est detaille
dans le chapitre 2. Dans le domaine des biocapteurs, il peut etre applique à la mesure
- 18 -
des reactions enzymatiques faisant varier la nature et/ou le nombre de porteurs de

charges electriques dans la membrane enzymatique comme cest le cas dans le cadre
de notre etude o`
u la conductimetrie va etre appliquee au dosage des proteines dans
les eaux naturelles par lintermediaire des acides amines charges liberes par laction
hydrolytique des proteases (voir chapitre 3) mais aussi à la detection du selenium en
utilisant laction combinee de lactivite beta-galactosidase liberee par une bacterie et
lactivite de la glucose oxydase immobilisee (chapitre 5). Le tableau 1.2 resume les
resultats des developpements dans le domaine des biocapteurs enzymatiques conductimètriques pendant ces dix dernières annees [DAES06].
Substrat
Uree
Creatinine
L-asparagine
Glucose
Peroxyde dhydrogène
D-aminoacides
Pesticides organophosphores
Acetylcholine
Metaux lourds
Penicilline
Acide urique
Proteines totales
Formaldehyde
4-Chlorophenol
Triazine herbicides
Carbamate pesticides
Enzyme
Urease
Urease-creatinase-creatininase
Creatinine-deiminase
L-asparaginase
Glucose oxydase
Peroxydase
D-aminoacidoxidase
Acetylcholinesterase
Butyrylcholinesterase
Butyrylcholinesterase
Urease
Penicillinase
Uricase
Trypsine
Alcoholoxydase
Tyrosinase
Tyrosinase
Tab. 1.2 Donnees sur le developpement de differents biocapteurs conductimètriques
1.2.2
Les transducteurs optiques
Lavènement des fibres optiques a ouvert de nouvelles voies de recherche dans le

domaine des mesures de paramètres physiques tels que la pression, la temperature,
- 19 -
lacceleration... mais aussi dans le domaine des biocapteurs. Les fibres optiques sont
des guides dondes electromagnetiques pour les frequences optiques (domaine du visible à linfra rouge). Elles ont laspect dun fil souple dont le diamètre exterieur peut
varier de quelques 125 m (fibres de silice) à quelques mm (fibres en plastique) et dont
le cur presente un indice de refraction plus eleve que celui de la gaine. Ici, le système
de mesure sappuie sur les modifications des proprietes optiques engendrees par la reconnaissance moleculaire (variation de labsorbance, de la fluorescence...). Lelement
biologique (en general enzyme) est immobilise, en presence dun intermediaire (colorant), à lextremite ou sur la surface de la fibre optique qui est en contact avec
lechantillon.
Il faut aussi signaler lexistence de systèmes optiques utilisant la resonance plasmonique de surface. En effet, depuis la decouverte, par Kretschmann et Otto en 1968
du phenomène physique dexcitation optique de plasmon de surface, cette technologie
a connu un developpement grandissant dès lors que son utilisation pour la detection
de gaz et de composants biochimiques sest revelee pertinente.
Les biocapteurs se basant sur la resonance de plasmon de surface (SPR) ont
ete appliques largement dans des domaines necessitant le suivi dinteractions biomoleculaires en temps reel [KK99]. Ceci est d
u non seulement au fait que la technique
SPR peut fournir des donnees sur laffinite et la cinetique mais aussi au fait quelle
constitue un dispositif unique permettant lanalyse de differentes interactions du type
peptide-proteine et ceux concernant les fixations cellulaires [BKC+ 06].
Lintroduction recente dappareils commerciaux utilisant cette technique dans
les laboratoires de recherche biologique, chimique et medicale (par exemple pour
la detection de pathogènes [MB06]) a ainsi revolutionne letude des interactions
moleculaires. Aujourdhui, plusieurs societes, dont la pionnière et la plus developpee
Biacore AB (Suède), ont acquis un savoir faire et une matrise du procede. La technologie BIAcore permet detudier les interactions entre biomolecules sans marquage,
dans un debit continu de tampon. Un des reactifs, le ligand, est retenu de manière
specifique sur une interface appelee sensor chip. Les autres paramètres de linteraction (ou analytes) sont injectes à un debit constant par un circuit microfluidique au
contact de linterface. Les sensor chips les plus frequemment utilises sont constituees
dun support de verre recouvert dune fine couche dor et dun hydrogel non reticule
de dextran carboxyle. Ces surfaces conviennent à letude de molecules hydrosolubles
- 20 -
(proteines, acides nucleiques, glycoproteines, etc.) dans un milieu hydrophile [TL96].

1.2.3
Les transducteurs pi
ezo
electriques
Le phenomène de piezoelectricite se manifeste par lapparition dune polarisation

electrique dans certains materiaux dielectriques anisotropes (absence de centre de
symetrie dans la maille cristalline) lorsquils sont deformes sous leffet dune force de
direction convenable. Si lon constitue un condensateur en deposant une paire darmatures metalliques sur les faces opposees dune lame piezoelectrique, il apparat,
sous linfluence dune force, des charges de signes contraires sur les armatures opposees et donc une difference de potentiel, proportionnelle à la force appliquee. Leffet piezoelectrique est reversible : soumis à un champ electrique, de direction convenable, un materiau piezoelectrique se deforme ; il peut en particulier etre excite à sa
resonance mecanique, qui est aigue. Cette propriete trouve application dans des capteurs piezoelectriques utilisant le quartz dont la resonance se produit à une frequence
sensible à differentes grandeurs physiques (temperature, pression) qui peuvent etre
mesurees avec le capteur ainsi constitue [JRMC].
Etant
donne que le phenomène de reconnaissance moleculaire saccompagne dune
variation de masse dans le cas des systèmes daffinite, ceci peut etre avantageusement
exploite de manière analytique grace à lutilisation de ces capteurs piezoelectriques.
Lelement biologique selectif est immobilise sur un quartz vibrant. Le cristal de quartz
est un oscillateur très precis et stable. Le cristal de quartz est le composant primordial
de la microbalance parce quil enregistre quantitativement la masse deposee sur ses
electrodes : lorsque le substrat se fixe sur la surface du biocapteur, la frequence
doscillation du cristal decrot [KPA+ 06]. Ces systèmes de detection sont très sensibles
(detection de picogrammes) ils peuvent convenir pour les mesures en phase gazeuse
(modification de la surface du cristal par des composes organiques ou biologiques qui
vont fixer un substrat gazeux qui peut permettre davoir une meilleure sensibilite
de detection [BJR98]) et en milieux liquides (les applications concernent surtout les
grosses molecules (anticorps, virus) car les variations de masse sont plus nettes).
- 21 -
1.2.4
Les transducteurs thermiques
Linteret de la mise en oeuvre des capteurs enthalpimetriques resulte du fait que

la plupart des reactions biologiques saccompagnent dun degagement de chaleur.
De nature très generale et donc de potentialite elevee, ces capteurs sont cependant
relativement peu sensibles et necessitent des montages differentiels très bien equilibres
afin de compenser toute variation de temperature parasite.
Le changement de temperature, T, est determine par un microcalorimètre et est
relie aux variations denthalpie, H, et la capacite de chaleur du reacteur, Cp par la
relation suivante :
T =
nH
Cp
(1.1)
avec : n : nombre de moles de substrat ayant reagit

Malgre lattrait du caractère universel de la technique, des problèmes dordre technologique, lies notamment aux difficultes dimmobilisation de quantites suffisantes
denzymes au proche contact de la sonde calorimetrique, limitent les performances de
ces biocapteurs.
1.3
Les bior
ecepteurs
Plusieurs biorecepteurs ont ete utilises comme element de reconnaissance moleculaire

pour le developpement de divers biocapteurs (voir figure 1.6).
Lelement de reconnaissance biologique (ou biorecepteur) peut etre :
1. Un element de reconnaissance biocatalytique : dans ce cas, la reponse du biocapteur est basee sur une reaction catalysee par les macromolecules qui sont
presents dans leur environnement biologique naturel, qui ont ete prealablement
extraits ou qui ont ete produits dans des microorganismes. Ainsi, la consommation continue du(des) substrat(s) est assuree par le biocatalyseur immobilise à la
surface du transducteur. Des reponses dynamiques ou après que letat stationnaire du signal soit atteint, sont enregistrees à laide du transducteur integre.
- 22 -
1.3. Les biorecepteurs
Substrat
Ag
Biorcepteur
Enzyme
Anticorps
Rcepteur
ADN
Microorganisme
Transducteur
Fig. 1.6 Representation schematique des differents biorecepteurs
Trois types de biocatalyseurs sont generalement utilises : (a) Les enzyme : le

biorecepteur le plus utilise et le mieux developpe à lechelle industrielle. (b)
Cellules entières (micro-organismes, tels que les bacteries, mycètes,levures, ou
cellules eucaryotes) ou organelles de cellules ou particules (mitochondries, paroi
cellulaire). (c) Partie de tissu (tissu vegetal ou animal). Les biocapteurs faisant
intervenir un element de reconnaissance biocatalytique sont les plus utilises et
seront le type de biocapteurs auxquels on sest interesse dans ce travail.
2. Un element daffinite biologique ou de bio-complexation : dans ce cas la reponse
du biocapteur est basee sur linteraction de lanalyte avec des macromolecules.
Ainsi, un equilibre est generalement atteint et il ny a aucune autre consommation nette de analyte par lagent complexant immobilise. Ces reponses à
lequilibre sont aussi suivies par le transducteur qui est en contact etroit avec le
biorecepteur. La plupart des biocapteurs se basant sur ce type de reconnaissance
utilisent des systèmes anticorps/antigènes [LSC01]. Cependant, plus recemment,
des biocapteurs utilisant des systèmes recepteurs/antagoniste ont ete developpes
(ex les chemorecepteurs).
1.3.1
Les anticorps
Les anticorps sont generalement immobilises chimiquement à la surface du transducteur. Limmobilisation doit etre judicieusement controlee afin dassurer une orientation uniforme des sites recepteurs pour une reaction daffinite optimale. Linteraction avec un antigène ou haptène est specifique et sa detection peut etre amplifiee
à laide de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. Les immunocapteurs resultants
- 23 -
ont ete notamment appliques pour la detection de plusieurs pathogènes : Legionella

pneumophila à laide dun biocapteur se basant sur la resonance plasmonique de surface [BOL+ 04] ; Campylobacter jejuni à laide dun immunocapteur amperometrique
[CLS01] ; Salmonellae à laide dun biocapteur amperometrique comme dans les travaux de Gehring et al. [GCM+ 99] ou dun immunocapteur optique comme dans les
travaux de Kim et al. [KPK06].
1.3.2
Les r
ecepteurs
Les differentes cellules de lorganisme recoivent les informations necessaires à

la modulation de leur activite par lintermediaire de signaux et de molecules extracellulaires. Ces dernières, que ce soient des hormones, des neurotransmetteurs, des
molecules dodorants ou bien des facteurs de croissance, viennent la plupart du temps
se lier à des proteines receptrices qui font partie integrante de la membrane plasmique
de la cellule cible, et qui vont permettre la transmission de linformation à linterieur
de la cellule. Les recepteurs membranaires, eux, constituent linterface entre un stimulus extracellulaire et sa perpetuation dans le cytosol. Ces recepteurs appartiennent
à plusieurs classes de proteines, que lon peut differencier selon leur mode daction et
leur structure moleculaire :
Une première classe de recepteurs comprend les canaux ioniques actives par
un ligand, comme par exemple les recepteurs nicotiniques de lacetylcholine, les
recepteurs de la glycine et les canaux P2X actives par lATP.
Une deuxième classe regroupe les recepteurs comportant une activite enzymatique associee, activable par la liaison du ligand. Cette activite enzymatique,
de type tyrosine-phosphorylase, serine/threonine-phosphorylase ou encore guanylate cyclase, peut etre intrinsèque ou bien directement associee à la proteine
receptrice. Les recepteurs de linsuline, du facteur de croissance des fibroblastes
(EGF), du facteur de croissance des neurones (NGF) ou encore du peptide natriuretique atrial (ANP), en font partie.
Enfin, la troisième grande classe aux nombreux representants, est composee de
recepteurs transduisant le signal par lintermediaire de proteines heterotrimeriques, les proteines-G, donc lactivation par la liaison du ligand à son recepteur
va entraner la modulation de lactivite de differents effecteurs intracellulaires.
- 24 -
Ces derniers peuvent etre des enzymes (adenylate cyclase, GMPc phosphodiesterase, phospholipases...), des canaux ou des echangeurs ioniques. Les recepteurs olfactifs appartiennent à cette classe.
Un grand nombre de travaux de recherche dans le domaine des recepteurs concerne
les neurotransmetteurs, les antagonistes et les neurotoxines. Les neurotransmetteurs
(ou chemorecepteurs), les recepteurs hormonaux et les recepteurs olfactifs sont les
plus utilises pour le developpement de biocapteurs. La fixation du ligand (agoniste
sur le recepteur declenche une reponse physiologique amplifiee qui se traduit par :
(a) louverture de canaux ioniques, (b) induction dun autre recepteur, (c) activation
denzyme(s).
1.3.3
Les acides nucl

eiques
Les acides nucleiques sont des macromolecules biologiques agencees sous forme
de chanes polymeriques constituant le materiel genetique cellulaire. Ils peuvent etre
immobilises en tant que tels (double brin) sur un transducteur physique afin detudier
des interactions avec des drogues synthetiques ou sous forme dune seule chane
dacides nucleiques (un seul brin) dans le but de detecter des processus dhybridation [PF01]. La detection dun fragment dADN specifique par hybridation avec une
chane dADN complementaire a gagne un interet considerable ces dernières annees en
raison de son importance pour le diagnostic precoce des maladies, tels que le cancer,
lhypercholesteremia,... Le decodage du genome humain a sensiblement favorise ce
developpement [SWWL01]. Le principe de transduction le plus utilise avec ce type de
biorecepteur est la detection optique des oligonucleotides marques à laide de fluorochromes. Lanalyse parallèle dun grand nombre de fragments dADN peut etre aussi
realisee à laide de la technique des biopuces à ADN. Lutilisation de lADN double
brin immobilise sur un transducteur optique ou electrochimique a aussi connu des
developpements considerables pour le screening rapide de toxines ou de substances
organiques carcinogènes mais aussi pour lidentification de nouveaux principes actifs
anti-tumoraux [MA04].
- 25 -
1.3.4
Les cellules animales et v

eg
etales
Certains biocapteurs ont ete realises à partir de cellules animales et vegetales

(issues de cultures cellulaires) dont limmobilisation sur des transducteurs potentiometriques (ISFET sensibles au pH) ou optiques (fibre optique) peut avantageusement etre exploitee pour letude de linfluence de paramètres exogènes sur lactivite
cellulaire [Kau02].
1.3.5
Les tissus v
eg
etaux ou animaux
Certains tissus animaux ou vegetaux ont ete utilises pour le developpement de

biocapteurs : par exemple, de fines tranches de tissus vegetaux (banane pour la
detection de dopamine, feuille de concombre pour la detection de cysteine...) ou tissus
animaux (muscles de lapin pour ladenosine 5monophosphate, foie de lapin pour la
guanine...)... De tels systèmes de reconnaissance moleculaire ne necessitent pas dextraction ni de purification, par contre leur selectivite et leur sensibilite sont souvent
limitees et leur mise en oeuvre est complexe.
1.3.6
Les enzymes
Les enzymes sont des proteines globulaires qui jouent le role de catalyseurs biologiques, cest-à-dire quelles règlent et accelèrent la vitesse des reactions biochimiques
sans toutefois etre modifiees ou detruites au cours de ces reactions. Les enzymes
accelèrent 103 à 106 fois la reaction correspondante qui se deroulerait sans catalyseur.
En abaissant lenergie dactivation de la reaction quelle catalyse, une enzyme abaisse
le niveau energetique de letat de transition et accelère ainsi la reaction. Les enzymes
ont une stereospecificite tellement forte quelles effectuent des reactions leur permettant de choisir parmi differents enantiomères ou de discriminer dautres groupes
pratiquement identiques entre eux.
Certaines enzymes sont de nature purement proteique. Dautres sont formees de
deux parties : une proteine et un cofacteur. Le cofacteur peut etre lion dun metal,
notamment du cuivre ou du fer, ou une molecule organique necessaire à la reaction.
La plupart des cofacteurs organiques sont des derives des vitamines (surtout des
vitamines du complexe B). Etant

donne quils travaillent en synergie avec les enzymes,
- 26 -
ces cofacteurs sont appeles coenzymes.

Les enzymes se differencient des catalyseurs chimiques par leur très grande specificite.
Elles sont groupees en six classes :
les oxydoreductases : catalysent les reactions doxydoreduction. Cette classe
comprend les deshydrogenases, les oxydases, les hydrolases, etc. ;
les transferases : interviennent dans les reactions de transfert dun groupement
fonctionnel sur un recepteur ;
les hydrolases : coupent les liaisons esters, osidiques et peptidiques pour les
hydrolyser ; les proteases, quon va utiliser dans ce travail, appartiennent à cette
classe denzymes ;
les lyases : catalysent la fixation ou le depart dun groupement chimique avec
creation dune double liaison sur le substrat ;
les isomerases : interviennent dans les reactions disomerisation, de racemisation,
depimerisation, de conversion cis-trans ;
les ligases, ou synthetases : permettent la formation de liaisons C-O, C-S, C-N
ou C-C. Ce type de reaction ne peut se produire que si elle est couplee avec
lhydrolyse dun nucleoside-triphosphate.
Ainsi, selon lappartenance à lune de ces six classes numerotees de 1 à 6, chaque
enzyme a un numero. On peut trouver aisement, dans Enzyme Nomenclature, le
numero, la reaction catalysee et quelques references bibliographiques pour chaque
enzyme.
1.3.6.1
Les prot
eases
Les proteases ou proteinases EC 3.4.., sont des enzymes qui catalysent lhydrolyse des liaisons peptidiques dune proteine. Les proteases ou enzymes
dhydrolyse des proteines se repartissent en exopeptidases et endopeptidases. Les
premières detachent les acides amines un à un à partir de leur extremite N-terminale
ou C-terminale. Les endopeptidases, ou plus communement proteases, hydrolysent les
proteines au niveau de sites internes specifiques. La specificite de la reaction est basee
sur la nature des acides amines de lenzyme formant la poche catalytique, et donc
interagissant avec les acides amines du substrat. Cette interaction peut conduire à
G
en
eralit
es :
- 27 -
une basse specificite telle que pour la proteinase K o`

u les acides amines ne sont pas
specifiques mais doivent etre de nature aliphatique, aromatique ou hydrophobe, ou à
une très haute specificite.
La classification des proteases est definie par la nature des acides
amines qui forment la poche catalytique :
Classification :
Les proteases à serine : sont très repandues dans la nature et forment une famille
denzymes apparentees entre elles ainsi quavec certaines esterases. Toutes ces
proteines ont en commun davoir un pole serine (voir figure 1.7 1 ) capable de
former une liaison covalente avec le DIFP (Diisopropylfluorophosphate). Cette
classe peut etre subdivisee en deux sous-groupes : le groupe des proteases similaires à la trypsine et le groupe des proteases similaires à la subtilysine.
Les proteases à cysteine : ce sont des proteases o`
u la cysteine joue dans le site
actif le role quavait la serine chez les proteases à serine. Parmi ces enzymes, on
trouve les lysosomes porteurs de cathepsines B et L et la papane. Ces endopeptidases presentent des homologies de sequence et ont des masses moleculaires
dans la gamme des 25 kD.
Les proteases à aspartate : ce sont des proteases qui nutilisent ni la serine ni
la cysteine dans leur site actif mais lacide aspartique. Parmi ces enzymes, on
trouve la pepsine et la chymosine.
Les metallo-proteases : les enzymes appartenant à cette famille sont inhibees
pour la plupart par les complexants des metaux. Par exemple, la thermolysine
qui est une protease dont chaque molecule contient un ion zinc et quatre ions
calcium.
http ://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif
- 28 -
Fig. 1.7 Schema explicatif du mecanisme moleculaire implique lors de lhydrolyse

proteique catalysee par les proteases à serine
- 29 -
1.3.6.2
La prot
einase K
La proteinase K (EC 3.4.21.14) est une protease classee parmi les endopeptidases à
serine. Beaucoup de travaux se sont interesses à cette enzyme [EHK+ 74, KF76, JM85,
BPS+ 86] et notamment celle extraite du champignon Tritirachium album Limber vue
quelle represente lune des endopeptidases à serine les plus actives [BPS+ 86]. Elle hydrolyse les proteines de toutes origines en quelques heures avec une preference pour les
liaisons peptidiques situees après les acides amines hydrophobes. En effet, le site actif
de la proteinase K se compose de plusieurs sous-sites capables de se combiner avec un
certain nombre de residus dacides amines. La position S1 se compose vraisemblablement dune zone hydrophobe qui interagit avec les chanes laterales de lalanine, de la
leucine, de la phenylalanine et de la tyrosine [KF76]. Le pH optimum pour lactivite
enzymatique de la proteinase K de Tritirachium album est entre 7,5 et 12 (utilisant
lhemoglobine comme substrat) [EHK+ 74].
1.3.6.3
Capteurs enzymatiques
Un capteur enzymatique est la combinaison dun

transducteur (electrochimique, optique..) avec une fine couche enzymatique. Il est
generalement utilise pour suivre la quantite de substrat ou dinhibiteur de lenzyme [DAE+ 01]. La reaction enzymatique assure la transformation du substrat en
produit de reaction detectable par le transducteur (voir figure 1.8).
Principe de fonctionnement :
Fig. 1.8 Representation schematique du fonctionnement dun biocapteur enzymatique
- 30 -
Le processus de fonctionnement de lelectrode enzymatique passe par 5 etapes [GdON85] :

transport du substrat de la solution vers la membrane enzymatique ;
diffusion dans la membrane enzymatique vers le site actif ;
reaction de catalyse de la transformation du substrat ;
migration du produit de la reaction, de la membrane vers la surface de lelectrode ;
mesure de la variation du signal electrique due à la concentration du produit de
la reaction.
La première etape, transport du substrat vers la membrane, depend principalement
du regime de convection assure par la vitesse dagitation de la solution. Ainsi, une
agitation rapide apportera le substrat très rapidement à la surface de lelectrode. Avec
une membrane très mince et en utilisant une enzyme fortement active, les etapes 1 et
4 sont eliminees ou reduites au minimum.
En 1913, L. Michaelis et M. Menten ont propose un
modèle pour decrire les reactions enzymatiques dans lequel ces reactions se deroulent
en 2 etapes :
formation rapide dun complexe enzyme-substrat (E-S)
conversion lente du complexe en produit
Ainsi, on peut dire que lenzyme assure la transformation du substrat en produit de
reaction selon la reaction suivante :
Cin
etique enzymatique :
k1
k2
*
E+S)
E+P
ES
k1
o`
u:
E : enzyme ; S : substrat ; P : produit de la reaction
k1 , k1 , k2 : constantes de vitesse de reaction
- 31 -
(1.2)
La vitesse de la reaction secrit alors :
V =
d[P ]
d[S]
[S]
=
= Vm
dt
dt
Km + [S]
(1.3)
o`
u:
Km : la constante de Michaelis ; avec : Km =
k1 +k2
k1
Vm : la vitesse maximale pour [S] >> Km ; avec : Vm = k2 [E0 ],

[E0 ] est la concentration initiale en enzyme ;
[S] et [P] : concentrations respectives du substrat et du produit de la reaction
Letat stationnaire de la formation de ES est atteint en moins dune milliseconde [Bur00] après mise en contact de lenzyme avec son substrat.
Lorsque [S] >> Km , cest la cinetique enzymatique qui est limitante et la vitesse de
reaction est egale à la vitesse maximale Vm. Ainsi, si on fait varier la concentration
de substrat (à concentration constante denzyme), on peut representer les valeurs
de vitesse Vi en fonction de la concentration du substrat. La courbe obtenue (voir
figure 1.9a) permet de determiner au niveau de lasymptote le Vm apparent et pour
Vm
la concentration du substrat egale au Km apparent (constante de Michaelis).
2
Etant
donne que la determination de Vm à partir de la figure 1.9a nest pas très
exacte, Lineweaver et Burk ont mis au point la representation en double inverse qui
est representee sur la figure 1.9b. En effet, si on calcule, à partir de lequation (1.3),
1
on obtient lequation (1.4).
Vi
Km
1
1
1
=
+
Vi
Vm
[S] Vm
1
Vi
(1.4)
1
= f ( [S]
) est une droite (representee sur la figure 1.9) dont les intersections
extrapolees permettent la determination des valeurs de Km et de Vm . Quand S
1
0 ; V1i V1m ; quand Vi V1i 0, S1 K1m .
S
- 32 -
Vi
1
Vm
Vi
Vm
2
1
Vm
[S]
Km
Km
(a)
(mM -1)
[S]
(b)
Fig. 1.9 (a) Determination des constantes michaeliennes (b) Representation en double
inverse de Lineweaver et Burek
Ainsi, cette representation en double inverse permet de determiner par extrapolation sur une droite (à [S] et Vi ) les valeurs de Km et de Vm . Km
permet de choisir la concentration de S selon le type de dosage : S < Km pour doser
S ; S > 10 Km pour doser E.
1.3.6.4
Influence du pH
Leffet du pH sur la reponse dun capteur enzymatique est principalement liee à

leffet du pH sur lactivite enzymatique. En effet, chaque enzyme possède un domaine
de pH dans lequel elle est active ; au-delà de cet intervalle lenzyme est inactivee. Cette
courbe est generalement en forme de cloche avec un pH optimum et il faut essayer
de travailler à un pH le plus proche possible de ce pH optimum. La sensibilite au pH
des activites enzymatiques peut etre expliquee par le fait que les substrats et les sites
actifs des enzymes portent souvent des groupes fonctionnels acides ou basiques dont
lionisation varie avec le pH. Ces effets de pH varient dune enzyme à une autre.
- 33 -
1.3.6.5
Influence de la temp
erature
Etant
donne que ces biocapteurs se basent sur une reaction enzymatique, une
augmentation de la temperature augmente lactivite catalytique, donc la vitesse de
reaction. Cependant, ceci nest valable que jusquà une valeur maximale, au-delà de
cette temperature une denaturation progressive de lenzyme a lieu. La temperature
augmente egalement la vitesse de diffusion des differentes espèces chimiques dans la
membrane enzymatique, ce qui diminue le temps de reponse du biocapteur.
1.3.7
Les microorganismes
Après le developpement considerable observe dans le domaine des capteurs enzymatiques depuis la première electrode mise en place par Clark et Lyon en 1962 [CL62],
lextension du developpement de ces biocapteurs vers lutilisation dautres espèces biologiques actives tels que les microorganismes est naturelle. En effet, lutilisation de
cellules entières presente plusieurs avantages [TT87] :
regeneration in situ des coenzymes ;
permet deviter le long et co
uteux processus dextraction-purification que necessitent
les autres biorecepteurs tels que les enzymes, les acides nucleiques...
la bioselectivite et la reactivite additionnelle de la membrane cellulaire peuvent
etre exploites avantageusement ;
possibilite de regenerer le biocatalyseur in situ sans necessite de reconstruire le
biocapteur.
avec lavancement considerable dans les techniques de biologie moleculaire et de
lADN recombinant, dextraordinaires possibilites de transformer genetiquement
des microorganismes en vue dameliorer leurs activites enzymatiques ou de leur
permettre dexprimer de nouvelles activites ont ameliore davantage les performances des microorganismes.
Ainsi, plusieurs types de microorganismes ont ete utilises pour mettre au point des biocapteurs microbiens [LCM06]. Les microorganismes utilises peuvent etre des bacteries,
levures ou champignons. Quelques exemples de biocapteurs microbiens sont illustres
dans le tableau 1.3 [LCM06].
- 34 -
Substrat
Microorganismes
Limite de detection
Biocapteurs microbiens amperometriques
DBO
B. subtilis
2-22 mg/l
DBO
Pseudomonas sp.
1-40 mg/l
DBO
Levure SPT1 et SPT2
2 mg/l
DBO
P. putida
0.5 mg/l
DBO
T. candida
7-75 ppm
Ethanol
G. suboxydans
0-25 mg/l
Ethanol
A. niger
1-32 ppm
Ethanol
C. tropicalis
0.5-7.5 mM
Ethanol
A. aceti
< 0.2 mM
Sucre total
G. oxydans
1.1-2.2 g/l
Sucrose
S. cerevisiae
6-100 mM
Composes phenoliques
P. putida
0.1-1.0 M
Cu2 +
S. cerevisiae recombinante
0.5-2 mM
Biocapteurs microbiens potentiometriques
Organophosphates
Flavobacterium sp.
0.025-0.4 mM
Organophosphates
E coli
2 m
Organophosphates
Levure SPT1 et SPT2
2 mg/l
Penicilline
E. coli recombinante
1-16 mM
Tryptophane
E.coli
0-12 m
uree
Bacillus sp.
0.55-550 m
Ethanol
S. ellipsoideus
0.02-50 mM
Sucrose
S. cerevisiae
3.2 M
Biocapteurs microbiens à bioluminescence et fluorescence
Hg 2+
E. coli
0.2 ng/g
Polluants/toxicite
E coli
depends du toxique
Arsenite
E. coli
DBO
P. putida
0.5 mg/l
Tab. 1.3 Quelques exemples de biocapteurs à base de microorganismes
- 35 -
1.4
Les m
ethodes dimmobilisation
Dans un biocapteur, lelement biologique est fixe au proche contact du transducteur ce qui permet une detection immediate et très sensible du processus de reconnaissance moleculaire. De plus, limmobilisation du bio-compose augmente sa stabilite et
permet une reutilisation eventuelle du biocapteur. Plusieurs modes dimmobilisation
de lelement biologique peuvent etre envisages (voir figure 1.10).
Mthodes dimmobilisation
Chimique
Couplage
covalent
Corticulation
Physique
Adsorption
Molcule de reconnaissance
Inclusion
pigeage
Rtention par une

membrane de dialyse
ou dans llectrode
Molcule de co-rticulation
Fig. 1.10 Representation schematique des differentes methodes dimmobilisation de

lelement biologique
1.4.1
Emprisonnement physique
Les methodes demprisonnement physique sont generalement utilisees pour immobiliser les cellules entières et notamment les micro-organismes en raison de leur taille
relativement grande en comparaison des proteines. On peut les retenir dans des gels
dagar ou de polyacrylamide, mais egalement par lintermediaire des membranes de
dialyse ou de filtration, telles que les membrane Millipore 0,22 m en ester cellulosique. On peut citer aussi limmobilisation des cellules entières dans une suspension
de collagène traitee par du glutaraldehyde [Min91].
- 36 -
1.4. Les methodes dimmobilisation
1.4.2
Adsorption
Limmobilisation par adsorption à un support insoluble represente une methode

très douce dimmobilisation. Cette technique a surtout ete utilisee pour limmobilisation denzymes.
Le procede consiste à melanger ensemble lenzyme et le materiau servant de support dans des conditions appropriees. Après un certain temps dincubation, la partie insoluble est separee de la partie soluble par centrifugation ou filtration. Linconvenient principal de cette methode est que lenzyme nest pas fermement liee au
support. Par exemple, ladsorption des enzymes sur une matrice insoluble tel que
du DEAE-sephadex est principalement due à de multiples liaisons saline. Des changements des conditions experimentales telles que le pH, la concentration ionique, la
temperature et le type de solvant peuvent causer la desorption de lenzyme du support
en affectant ces liaisons [Woo85].
1.4.3
Liaison covalente
Cette methode a ete surtout utilisee avec les enzymes. Le couplage covalent pour
limmobilisation des enzymes se base sur la formation de liaison covalente entre les
molecules denzymes et le support. Il est important que les acides amines essentiels
à lactivite catalytique de lenzyme (notamment ceux du site actif) ne soient pas
impliques dans le couplage covalent au support. Etant

donne la difficulte de realiser
ceci, les enzymes immobilisees par cette methode perdent generalement une partie de
leurs activites. Ce problème peut etre evite si lenzyme est immobilisee en presence
de son substrat - une etape du procede qui tendrait à avoir un effet protecteur sur le
site catalytique de lenzyme pendant limmobilisation. Avant le couplage covalent de
lenzyme sur le support, ce dernier doit etre active. Une fois active, le support peut
alors reagir avec les groupes reactifs de lenzyme [Woo85].
1.4.4
R
eticulation
La liaison par reticulation represente un type dimmobilisation au cours duquel les

proteines (enzymes, proteines membranaires dans le cas de cellules entières...) sont
- 37 -
liees entre elles par des liaisons covalentes au moyen dagents de reticulation (glutaraldehyde, acide bis-diazobenzidin-2,2-disulfure). Les enzymes liees par reticulation
peuvent etre preparees par 3 moyens differents :
1. la reticulation des molecules denzyme avec le glutaraldehyde (qui forme des
agregats insolubles) ;
2. ladsorption denzyme sur la surface accompagnee par une reticulation ;
3. limpregnation de matières poreuses avec des enzymes suivie par une reticulation
des enzymes directement dans les pores.
Dans ce travail nous avons principalement utilise la methode de co-reticulation au
glutaraldehyde quon va decrire dune facon plus detaillee ci-dessous.
1.4.4.1
La r
eticulation au glutarald
ehyde
Parmi larsenal de reactifs et des procedures de couplage, le glutaraldehyde (GA)

joue un role crucial d
u à sa fiabilite et sa facilite dutilisation. En effet, le GA est le
reactif de choix dans plusieurs cas necessitant une immobilisation rapide et s
ure de
proteines. De plus, il est peu co
uteux, aisement disponible et facile à utiliser.
HO
OH
IV
H2O
H2O
CHO
H2O
CHO
HO
CHO
OH
OH
II
OH
III
OH
HO
V
Fig. 1.11 Les structures de GA dans une solution acqueuse
Il a ete montre [DW94] que la solution aqueuse commerciale de GA (25 ou 70%)

represente un melange de plusieurs formes de ce reactif. Ces differentes structures du
GA dans leau sont presentees dans la figure 1.11 : GA libre (I), forme lineaire mono
- 38 -
1.4. Les methodes dimmobilisation
(II) et dihydrates (III), hemi-acetal cyclique (IV) et oligomères(V). Ces differentes

formes de GA dependent des conditions de solution. Dans les solutions acides et
neutres le GA existe comme monomère en sa forme daldehyde libre, hydrate ou
` des concentrations elevees il polymerise pour former des oligomèriques
hemi-acetal. A
hemi-acetals. Toutes ces formes de GA peuvent reagir avec des proteines de differentes
manières et mener à leurs immobilisations. Walt et al. [DW94] ont propose les produits
du couplage avec le GA selon la forme dans laquelle il se trouve (voir figure 1.12).
Dans les conditions standards, le GA subit des condensations daldol pour former des
aldehydes multimeriques insatures.
Fig. 1.12 Les reactions de differentes formes de GA avec les enzymes
Dans certains cas, la proteine immobilisee est plus active et/ou plus stable que la
proteine libre, ou la meme proteine immobilisee par nimporte quelle autre methode.
Ceci peut se produire parce que les liaisons multiples, presumes pour se produire
avec le GA, empechent le deploiement de la proteine. Alternativement, la nature
polymèrique du GA forme une longue chane, attachant la proteine à la matrice,
qui permet une plus grande flexibilite pour les changements conformationnels de la
- 39 -
proteine necessaire à son activite [SLB95]. De plus, lutilisation dune proteine inactive, tel que la serum bovine albumine (BSA), avec enzyme et le GA (co-reticulation)
permet, grace à une meilleure repartition des masses des differentes proteines, une
meilleure matrise de lactivite enzymatique sans alterer les proprietes mecaniques
des membranes obtenues.
Ainsi, le glutaraldehyde a ete largement utilise pour le developpement de differents
biocapteurs, sous sa forme liquide [ASMA00] ou vapeur [DSC02, ADS+ 01, LZF+ 99,
MDB+ 06].
1.5
Conclusion
Les nouvelles normes europeennes relatives au controle et la preservation des milieux naturels de la pollution, ainsi que les exigences de plus en plus prononcees relatives au controle et au suivi de differentes espèces dinteret medical (glucose, uree,...)
ou agro-alimentaire (sucres, ethanol, acide lactique...) ont contribue au developpement
des biocapteurs comme outils de choix pour repondre à ces exigences. Plusieurs
equipes de recherches travaillent sur le developpement de differents biocapteurs : enzymatiques, microbiens, immunologiques... Les performances des biocapteurs developpes
dependent fortement du choix du couple biorecepteur-transducteur. Dans ce travail,
nous nous sommes interesses à lutilisation des microelectrodes conductimetriques
comme transducteurs pour le developpement de nos biocapteurs enzymatiques ou
microbiens pour les nombreux avantages quils offrent : petite taille, faible co
ut, facilite dutilisation, possibilites de miniaturisation...
- 40 -
Les micro
ees et les
mesures conductim`
etriques
Sommaire
2.1
Introduction
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2.2
Principe G
en
eral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
2.3
Les micro
electrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
2.4
2.5
2.6
2.3.1
Fabrication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
2.3.2
Les microelectrodes utilisees . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
2.3.3
Nettoyage des electrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
Caract
erisation des
ees . . . . . . . . . . . .
49
2.4.1
Limpedance à linterface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
2.4.2
Model de circuit equivalent des electrodes interdigitees . . . . . . .
51
D
eroulement des mesures avec les micro
electrodes . . . . . . .
53
2.5.1
Montage experimental des mesures conductimètriques . . . . . . .
53
2.5.2
Conditions de mesure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
- 42 -
Chapitre 2
Les micro
ees et
les mesures conductim`
etriques
2.1
Introduction
Depuis le succès quont rencontre les biocapteurs comme outils analytiques attrayants et performants, le nombre de transducteurs developpes pour leur mise en
oeuvre a significativement augmente. Seulement, en comparaison des autres types
delectrodes (potentiometriques tels que les ISFETs, amperometriques,...), lutilisation des microelectrodes interdigitees reste relativement peu etendue. Le suivi de la
conductance dune solution a ete à la base utilise comme moyen de determination des
vitesses de reaction. En effet, ces transducteurs permettent de mesurer les change
ments de conductance dus à la migration dions. Etant
donne que plusieurs reactions
enzymatiques ont comme consequence un changement de la concentration totale
dions elles sont bien adaptees pour leur utilisation en tant quelement sensible pour
le developpement de biocapteurs conductimètriques. Ainsi, ces dernières annees plusieurs publications sont apparues traitant de lutilisation de ces microelectrodes pour
la detection de metaux lourds comme dans les travaux de Chouteau et al. [CDDC05]
et Tuan et al. [ADP+ 06], de pesticides comme dans les travaux de Dzyadevich et
al. [DSC02, DSS+ 94], du glucose comme dans les travaux de Soldatkin et al. [SEJ+ 94]
et de S. V. Dzyadevich et al. [DAS+ 98] ou de luree comme dans les travaux de Lee et
- 43 -
Chapitre 2. Les microelectrodes interdigitees et les mesures conductimètriques
al. [LKK+ 00]... De plus, certains articles passant en revue le developpement de biocapteurs conductimètriques comme celui de Dzyadevych et al. [DAE+ 01] qui constitue
une revue des microelectrodes enzymatiques permettant lanalyse de lactivite catalytique de lenzyme pour son substrat ou de son inhibition par lanalyte, ont ete publies.
Dans ce chapitre nous allons presenter le principe de fonctionnement des capteurs
conductimètriques, la methode de fabrication des electrodes interdigitees et leur mise
en oeuvre pour le developpement de biocapteurs.
2.2
Principe G
en
eral
La conductivite electrique des solutions est, comme on la explique auparavant, directement liee à la presence de charges electriques mobiles, constituees par lensemble
des ions dans la solution. En effet, la conductivite des liquides est le resultat de la dissociation de la substance dissoute, lelectrolyte, en ions et la migration de ces derniers
sous leffet dun champ electrique. En presence du champ electrique, les electrolytes se
dissocient pour donner des ions ou des groupes dions. Quand lelectrode est soumise
à une difference de potentiel, un champ electrique se cree dans lelectrolyte ce qui
provoque le mouvement de ces ions (les anions sont attires par lanode alors que les
cations vont vers la cathode (voir figure 2.1).
Gnrateur
+
+
+
+
+
+
AA-
C+
A- +
C+
- C+
AAA-
C+
- C+
A- +
AA-
C+
C+
C+
Milieu lectrolytique
Anode
C+
Cathode
Fig. 2.1 Migration des ions dans la solution et conductivite de lelectrolyte
- 44 -
2.2. Principe General
Ainsi, le courant dans lelectrolyte est provoque par le mouvement des ions vers
les electrodes o`
u ils sont neutralises en atomes neutres (ou molecules) [DAES06]. Il
est connu que la conductance electrique G dun corps, inverse de sa resistance, est
proportionnelle à la surface S de la section perpendiculaire à la direction du courant
et inversement proportionnelle à sa longueur l :
G=
S
l
avec :
G : Conductance (Siemens)
: conductance specifique ou conductivite, caracteristique du corps ; elle est exprimee
en siemens par centimètre lorsque la surface est donnee en cm2 et la longueur en cm.
S : Surface de la section
l : longueur de la section
Suite à tout ce qui a ete presente ci-dessus, on peut conclure que la mesure conductimètrique, en general, consiste en la determination de la conductivite de la solution
entre deux electrodes parallèles, sa valeur etant la somme des conductivites donnees
par tous les ions dans la solution en question. La mesure de conductance ne peut etre
effectuee en courant continu, car il se produirait alors une polarisation des electrodes
et une electrolyse entranant une variation de resistance. Il est donc indispensable
de realiser la mesure en courant alternatif de frequence suffisamment elevee pour
eliminer ces effets perturbateurs. Par consequent, il est necessaire dabord delucider
les phenomènes provoques par lapplication dun courant alternatif sinusodal dans la
cellule electrolytique et à linterface metal-solution en etudiant les paramètres conditionnant la conductivite de la solution, pour developper le système experimental de
mesure. Cest ce quon va aborder dans le paragraphe suivant.
- 45 -
2.3
Les micro
electrodes
Differents types de microelectrodes ont ete developpes : des microdisques, des

microsphères, des microcylindres, des microbandes,... Chaque type a un comportement specifique meme si elles ont toutes les meme proprietes. Lassociation de
plusieurs microelectrodes de la meme famille en des reseaux sest egalement averee
interessante [Mor96]. Parmi ces reseaux, les microbandes interdigitees (figure 2.2) ont
ete utilisees dans divers domaines [DSP+ 94].
Fig. 2.2 Photo des bandes interdigitees prise en microscopie optique
Linteret de cette geometrie, par rapport à dautres microelectrodes, reside dans

le fait que lordre de grandeur du courant stationnaire est augmente par lassociation de plusieurs microbandes. Ces electrodes sont constituees de bandes parallèles
alternativement interconnectees entre elles afin davoir alternativement une anode et
une cathode [Fer97]. Cette geometrie est generalement formee de bandes de quelques
dizaines de microns separees par des espacements de quelques microns. Ceci permet
à lespèce generee sur lune des bandes detre reconsommee à la bande suivante. Ces
electrodes interdigitees permettent aussi daugmenter la surface de contact pour la
biomembrane.
2.3.1
Fabrication
Dans ce travail, on a utilise un système de deux paires delectrodes sur une seule
puce (voir figure 2.3). Cette configuration permet de travailler en mode differentiel.
De plus, lutilisation delectrodes interdigitees permet daugmenter la surface de
contact pour la biomembrane. La fabrication des electrodes commence generalement
par la preparation du substrat (silicium [PPH01], verre [DSC02], ceramique (AlO3 )
[ADS+ 01]...). Un masque est utilise pour definir les motifs dans lesquels la couche
mince de chrome puis le film de metal (platine ou or) seront pulverises. Ensuite,
- 46 -
2.3. Les microelectrodes
5,0
30,0
1,5
0,5
1,4
Electrodes
interdigites
Fig. 2.3 Les Electrodes

interdigitees
la technique lift-off permet denlever la resine après le sputtering. Enfin les capteurs sont decoupes en chip [Mai04]. Pour developper nos biocapteurs, deux types
delectrodes interdigitees ont ete utilises et sont presentes dans le paragraphe suivant.
2.3.2
2.3.2.1
Les micro
electrodes utilis
ees
Les micro
ees en platine
Ces capteurs conductimetriques utilises sont composes de deux paires identiques

delectrodes interdigitees en platine sur substrat de verre fabriquees à lInstitut de
Chemo et Biosensorics (M
unster, Allemagne). Les deux paires delectrodes interdigitees en platine de 150 nm depaisseur sont deposees sur un substrat en Pyrex.
Une couche intermediaire de Ti de 50 nm depaisseur est utilisee pour ameliorer
ladhesion du platine sur le substrat. La largeur des doigts constituant les electrodes
interdigitees, ainsi que la distance entre elles est de 10 m alors que leur longueur est
denviron 1 mm, ce qui permet davoir une surface sensible sur chacune des 2 electrodes
denviron 1 mm2 [DSC02, CDCD04]. Pour definir la partie sensible du capteur, la
partie centrale du capteur a ete couverte de resine en epoxyde (voir figure 2.4).
- 47 -
Verre
Verre
Electrode
de platine
10 m
Platine
Rsine de protection
Connections en platine
10 m
Fig. 2.4 Photo du capteur conductimètrique en platine
2.3.2.2
Les micro
ees en Or
Ces electrodes conductimètriques de 0,5 mm depaisseur et de dimensions 530

mm sont aussi formes par deux paires identiques delectrodes interdigitees. Ces electrodes
diffèrent des precedentes du fait quelles sont en or et quelles ont ete fabriquees par
depot sur un substrat en ceramique (AlO3 ) à lInstitute of Semiconductors Physics,
Kiev, Ukraine (Fig. 2.5). Une couche intermediaire de chrome (0,1 nm depaisseur)
a ete employee pour une meilleure adherence de lor. Chaque doigt de lelectrode est
de 20 nm de large et 1mm de long, avec un espacement de 20 nm egalement entre
les doigts. La partie sensible de chacune des deux electrodes est denviron 11,5
mm [ADS+ 01].
Electrode en or
(hauteur 0.2 m)
Substrat en
cramique
20 m
Connexion
Or
Substrat en cramique
Rsine de protection
Membrane
enzymatique
Fig. 2.5 Vue generale des microelectrodes interdigitees en Or
- 48 -
2.4. Caracterisation des electrodes interdigitees
2.3.3
Nettoyage des
electrodes
Avant leur utilisation, les electrodes sont nettoyees avec de lacide sulfo-chromique
(1 ml de H2 SO4 concentre auquel on ajoute une goutte dune solution saturee aqueuse
de K2 cr2 o7 ) puis rincees avec de leau ultrapure et sechees à la temperature ambiante.
2.4
Caract
erisation des
ees
La comprehension de la nature de limpedance à linterface de lelectrolyte-metal

est très importante pour comprendre le principe de base de fonctionnement des
capteurs conductimètriques. Lapproche cle dans ce système est linterpretation des
processus physiques et chimiques qui y ont lieu sous forme dun circuit electrique
equivalent comprenant les differents elements electriques : les condensateurs et les
resistances electriques, qui vont simuler les phenomènes en question.
2.4.1
Limp
edance `
a linterface
Quand un metal (electrode) est place dans un electrolyte (dans lequel les charges
sont transportees par le mouvement des ions), une interface electrique est immediatement developpee. A cause de la distribution heterogène des charges à cette interface, un
potentiel est genere. En 1679, Helmholtz avait suggere que la difference de potentiel
apparat entre deux couches de charges electriques de polarite differente. Une couche
de charges situee sur la surface du metal et lautre, de charge egale et opposee, juste à
linterieur de lelectrolyte. Il y a donc une double couche de charge à linterface qui
se comporte tout comme un condensateur parallèle plat. Cette capacite dinterface a
ete appelee la capacite de double couche, Cdl .
- 49 -
Cependant, quelques charges passent à travers la double couche sous leffet des
reactions electrochimiques qui ont lieu. Une telle fuite de charge induit une resistance
de transfert de charge, Rct dont lexpression est derivee de lequation de ButlerVolmer et, pour de petites amplitudes de signal appliquees, est donnee par :
Rct =
RT
nF i0
(2.1)
o`
u:
R : Constante des gaz parfaits
T : Temperature (K)
Constante de Faraday
n : nombre delectrons impliques dans la reaction au contact de lelectrode
i0 : la densite du courant de transfert.
La diffusion regulière des ions du milieu electrolytique vers linterface provoque
une augmentation de limpedance de linterface metal/electrolyte, notamment dans
le domaine des basses frequences. Cependant, si la frequence dexcitation est elevee
ces ions ne peuvent pas suivre loscillation du champ et limpedance de diffusion tend
vers zero. En 1899, Warburg decrit limpedance de diffusion appelee aussi impedance
de Warburg ZW :
ZW = (1 j)
(2.2)
o`
u:
: frequence angulaire (sec1 )
: coefficient de diffusion ( sec0.5 ).
Limpedance de diffusion est en serie avec la resistance de transfert de charge et les
deux sont en general en parallèle avec la capacite de double couche (voir figure 2.6).
Ce circuit constitue le modèle de circuit equivalent pour limpedance dinterface
le plus utilise. La diffusion et le transfert de charge sont classes comme des processus
faradiques puisquils obeissent à la loi de Faraday alors que le chargement de la
capacite de la double couche est un processus non faradique. Il apparat à partir
de lequation 2.2 que limpedance de diffusion nautorise pas le passage du courant
- 50 -
2.4. Caracterisation des electrodes interdigitees
Cdl
Rsol
ZW
Rct
Fig. 2.6 Modèle de circuit equivalent de limpedance dinterface
continu, vu quelle tend vers linfini quand approche de zero.

2.4.2
Model de circuit
equivalent des
ees
Comme on la dejà presente dans le paragraphe 3.3.2, les transducteurs conductimètriques utilises dans ce travail se constituaient dune paire delectrodes interdigitees (en or ou en platine) deposees sur un substrat en verre ou ceramique.
La caracterisation de ce transducteur a ete developpee dans le travail de S.V.
Dzyadevich [Dzy92]. Ainsi, le modèle de circuit equivalent, des electrodes immergees
dans un electrolyte, presente sur la figure 2.7 a ete etabli.
Cdl
Cdl
Rsol
Rct
Rct
Fig. 2.7 Modèle de circuit equivalent des electrodes interdigitees
En effet, à des frequences superieurs à 10 KHz, limpedance de diffusion ZW peut

etre negligee et limpedance totale du système consiste principalement en la resistance
de la solution delectrolyte, la capacite de la double couche et la resistance de transfert
- 51 -
de charge. Etant
donne quon travaille à 100 KHz ce modèle convient parfaitement à
notre système. Limpedance totale du système peut etre decomposee en :
Z = Zr + Zc
(2.3)
avec :
Zr : composante resistive de limpedance
Zc : composante capacitive de limpedance.
La composante resistive de limpedance totale est mesuree en phase par rapport
au signal dexcitation tandis que la composante capacitive est mesuree en quadrature
par rapport au signal dexcitation. La representation selon le diagramme de Nyquist
de limpedance du système, sur une gamme de frequence suffisamment haute pour
negliger limpedance de Warburg, est schematisee sur la figure 2.8.
Fig. 2.8 Diagramme dimpedance du montage conductimètrique
De plus, les travaux de S. Dzyadevych ont permis de montrer que dans le domaine
des hautes frequences, la valeur de limpedance nest pas affectee par la resistance
de transfert de charge Rct . Dans ce domaine de frequence, limpedance en phase est
egale à la resistance de la solution. Lintensite du signal en phase est egale à :
- 52 -
2.5. Deroulement des mesures avec les microelectrodes
I=
Uexcitation
Uexcitation
=
= Eexcitation G
Zphase
Rsol
(2.4)
o`
u : G est la conductance exprimee en Siemens (S)
Dans notre système de mesure, les electrodes interdigitees sont recouvertes par
la membrane bioactive (enzyme et/ou micro-organisme) pour lelectrode de mesure
et par une membrane de reference (BSA et/ou micro-organisme non actif). La Rsol
sera en fait, la resistance dune de ces membranes. Par ailleurs, les intensites sont
directement converties en une tension (Uout ) au niveau de la detection synchrone
(convertisseur courant/tension) aux bornes de la resistance de charge Rcircuit :
I=
Uout
Rcircuit
(2.5)
En substituant I dans lequation 2.4 par son equivalent dans lequation 2.5 on obtient :
Uout
= Uexcitation G 99K Uout = Uexcitation G Rcircuit
Rcircuit
(2.6)
Ce qui donne :
G=
2.5
2.5.1
Uout
Uexcitation Rcircuit
(2.7)
D
eroulement des mesures avec les micro
electrodes
Montage exp
erimental des mesures conductim`
etriques
Le montage experimental utilise pour la mesure de conductivite au laboratoire est

schematise dans la figure 2.9. Il permet une mesure differentielle entre une electrode
de travail et une electrode de reference.
- 53 -
Dtection
synchrone
SR 510
Signal de rfrence
Gnrateur
Lock - in
GPIB
Enregistreur
lectrode de rfrence
lectrode enzymatique
Fig. 2.9 Montage de la mesure conductimètrique
Comme on la explique plus haut, la conductance totale de notre système est directement proportionnelle à Uout (equation 2.7). Sachant que Uexcitation appliquee a ete de
10 mV et que Rcircuit est de 100 ohm, on obtient en remplacant, dans lequation 2.7,
Rcircuit et Uexcitation par leurs valeurs, la valeur de conductance correspondante G.
La detection Synchrone SR 510 de Stanford Research (figure 2.10) permet de fixer
la phase à laquelle est mesuree le signal de sortie. En effet, la detection synchrone
est utilisee chaque fois que lon veut isoler un signal sinusodal en phase avec une
sinusode de reference. Ainsi, le signal sinusodal de reference genere est transmis à
lelectrode excitatrice de chaque paire. Les signaux sont ensuite filtres par la technique
du lock-in.
- 54 -
2.5. Deroulement des mesures avec les microelectrodes
Fig. 2.10 Photo du lock-in Amplifier SR 510
Cette technique permet de filtrer un signal avec une bande passante arbitrairement faible centree sur la frequence du signal dexcitation [Auv]. Les signaux ainsi
recueillis sont transmis à la detection synchrone qui fait la difference des deux signaux
(electrode de reference et electrode de travail). Cette mesure en mode differentiel permet de neutraliser tous les signaux non specifiques lies, par exemple, à ladsorption
despèces chargees sur lelectrode. La difference de tension (dans notre cas de figure,
proportionnelle avec un coefficient 1, à la difference de conductance) est transmise à
un enregistreur (voir photo du dispositif de mesure, figure 2.11).
Fig. 2.11 Vue Generale du dispositif de mesure conductimetrique
- 55 -
2.5.2
Conditions de mesure
Les mesures conductimètriques ont ete effectuees en appliquant à chaque paire

delectrodes interdigitees une tension alternative de petite amplitude (10 mV) avec
une frequence de 100 kHz. Ces mesures ont ete effectuees à temperature ambiante
(sauf pour les experiences faisant intervenir leffet de la temperature) dans un volume
de 5 ml de tampon phosphate (KH2 P O4 , NaCl) 5 mM, pH 7,4, agite magnetiquement.
Après atteinte dune ligne de base stable du signal de sortie, lanalyte est ajoute au
milieu.
2.6
Conclusions
Dans ce chapitre, nous avons presente le principe de mesures conductimètriques

faisant intervenir des electrodes interdigitees. La methode de fabrication de ces microelectrodes a ete aussi synthetiquement expliquee.
Ces transducteurs conductimètriques offrent plusieurs avantages :
Ils sont produits à grande echelle et à faible co
ut ;
ils ne necessitent pas delectrode de reference ;
ils ne sont pas sensibles à la lumière ;
ils sont de petite taille ;
ils offrent de nombreuses possibilites de miniaturisation.
Tout ces avantages favorisent leur exploitation avantageuse au developpement de
differents biocapteurs electrochimiques comme nous allons le voir dans les chapitres
suivants.
- 56 -
D
eveloppement dun biocapteur
conductim
etrique pour le dosage des
prot
eines dans les eaux naturelles
Sommaire
3.1
Introduction
3.2
Mat
eriels et m
ethodes
3.3
3.4
3.5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
60
3.2.1
Materiels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.2.2
Immobilisation de lenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.2.3
Stockage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
3.2.4
Preparation des echantillons deaux naturelles . . . . . . . . . . . .
61
D
eveloppement et optimisation du biocapteur . . . . . . . . . .
62
3.3.1
Conditions optimales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
3.3.2
Caracteristiques analytiques du biocapteur obtenu . . . . . . . . .
64
3.3.3
Tests preliminaires sur des echantillons deau . . . . . . . . . . . .
66
Application du biocapteur `
a prot
einase K immobilis
ee au contr
ole
de la qualit
e de leau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
3.4.1
Verification des caracteristiques du biocapteur . . . . . . . . . . .
67
3.4.2
Application à lanalyse des eaux de rivières . . . . . . . . . . . . .
68
Conclusions et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
- 58 -
Chapitre 3
D
conductim
etrique pour le dosage
des prot
eines dans les eaux
naturelles
3.1
Introduction
Aujourdhui, lenvironnement et sa protection sont devenus une des preoccupations

les plus importantes des populations et de leurs dirigeants. Ainsi, lUnion europeenne
lui consacre une bonne place dans ses textes legislatifs, notamment dans la directive
2000/60/CE sur leau, transposee en France par la loi ordinaire 2004-338. Dans ce
contexte, on eprouve un besoin de plus en plus urgent de matriser et de controler
les hydrosystèmes et notamment la zone dinterface entre les eaux superficielles et
les eaux souterraines (zone hyporheique). Toutefois, sa localisation et la nature transitoire des processus dassimilation rendent cette unite hyporheique peu etudiee car
elle necessite la conception de nouveaux moyens dinvestigation non destructifs et
non perturbateurs. Les methodes analytiques actuelles ne permettent pas de suivre
en continu la dynamique des rejets sur le milieu (cause brève mais à fort impact sur
le milieu). Les micro-capteurs in situ possèdent les qualites requises pour suivre ces
processus dassimilation hyporheique à travers la mesure en continu de la teneur en
- 59 -
Chapitre 3. Developpement dun biocapteur conductimetrique pour le dosage des proteines

dans les eaux naturelles
MO (Matière Organique assimilable par les organismes vivants) des milieux aquatiques hyporheiques. Or, il existe 3 types de composes organiques qui peuvent etre
utilises pour le suivi de lassimilation : les lipides (10-40% de la MO oxydable), les
glucides (10-15%) et les proteines (20-30%). Parmi ces trois paramètres, la teneur en
proteines semble constituer un bon indicateur dactivite hyporheique [Nam99]. Or les
methodes danalyses classiques des proteines, parmi lesquelles les plus repandues sont
celles basees sur la colorimetrie, peuvent etre sensibles à des paramètres autres que la
quantite absolue de proteines (par exemple, la methode utilisant le bleue de Coomassie depend de la fixation du colorant sur les residus lysine et arginine ; La methode
du biuret, meme si elle est independante de la composition en acides amines, elle
est relativement peu sensible et peut donner des resultats differents selon la purete
de lechantillon). Cest dans ce contexte quon a cherche, dans le cadre dune action
concertee avec le Ministère de la recherche (projet MicaProt) avec le Cemagref de
Lyon, à concevoir des biocapteurs utilisant des proteases immobilisees pour installer
un système de surveillance in situ et en temps reel de la qualite de leau. La proteine
BSA (Bovine Serum Albumine) a ete choisie en premier temps comme proteine de
reference pour le travail de developpement du biocapteur enzymatique.
3.2
3.2.1
Mat
eriels et m
ethodes
Mat
eriels
Lenzyme proteinase K (Tritirachium album), EC 3.4.21.64, lyophilisee, 37 U/mg

proteines et lalbumine de serum bovin (BSA) ont ete fournis par Sigma. Le glutaraldehyde utilise (grade II, 25 % en solution aqueuse) est fourni par Acros Organics.
3.2.2
Immobilisation de lenzyme
Pour la detection de proteines, une enzyme : la proteinase K a ete immobilisee au

contact direct de lelectrode. La proteinase K appartient à la classe des endopeptidases
à serine. Cette protease a ete choisie en raison de son activite proteolytique forte sur
les proteines denaturees mais aussi natives et pour sa gamme de pH optimum etendue
( [EHK+ 74]). Lhydrolyse des proteines au contact de lenzyme produit des peptides
et/ou des acides amines libres charges (figure 3.1) ce qui provoque un changement de
- 60 -
3.2. Materiels et methodes
la conductivite locale au niveau de la membrane enzymatique.

Protinase K
+
H3 N
His Gly Gly Leu Asn Ala Ala Leu Thr
COO
H2O
H2O
+
H3 N
His Gly Gly Leu
COO
Asn Ala Ala Leu

+
H3 N
COO
Thr
COO
Fig. 3.1 Representation schematique de lhydrolyse catalysee par la proteinase K
La detection enzymatique a ete rendue possible grace à limmobilisation de lenzyme sur la surface de lelectrode. Ainsi, on a realise une co-reticulation avec de
lalbumine de serum bovin (BSA) dans une vapeur saturee en glutaraldehyde.
Pour cela, un melange de 4% de proteinase K et 6% de BSA a ete prepare dans
du tampon phosphate 20 mM pH 7.5, avec 10% de glycerol. Pour effectuer la mesure
en mode differentiel on a prepare deux electrodes : une electrode de travail avec à sa
surface la membrane enzymatique et une electrode de reference avec juste un melange
de 10% glycerol et 10% BSA dans le tampon phosphate. Dans une deuxième etape,
une dilution par deux des deux types de membrane a ete testee pour voir leffet sur
la stabilite du biocapteur. Ensuite, les capteurs ont ete places dans une atmosphère
saturee en glutaraldehyde. Après ecoulement du temps dexposition, les membranes
sont sechees à lair libre pendant 15 à 30 minutes.
3.2.3
Stockage
Les biocapteurs sont prepares et puis stockes, entre les differentes experiences, à
4C dans du tampon phosphate 5 mM, pH 7,4.
3.2.4
Pr
eparation des
echantillons deaux naturelles
Les echantillons deau de rivière preleves sont filtres à lavance à laide dun filtre de
0,45 m pour eliminer les micro-organismes et les composes insolubles. Lelimination
des micro-organismes est importante pour ameliorer la stabilite des caracteristiques
physico-chimiques des echantillons pendant la duree des experiences.
- 61 -

3.3
D
eveloppement et optimisation du biocapteur
Cette première serie dexperiences a ete effectuee avec les electrodes interdigitees
en platine sur substrat de verre fabriquees à lInstitut de Chemo et Biosensorics de
M
unster en Allemagne.
3.3.1
Conditions optimales
Le temps dexposition aux vapeurs de glutaraldehyde (ou temps dimmobilisation)

conditionne la qualite de reponse du biocapteur. En effet, pour les temps courts, les
liaisons entre les groupements amines des proteines et le glutaraldehyde ne sont pas
suffisantes pour stabiliser lenzyme et pour obtenir une membrane assez resistante.
Par contre, pour des temps longs, la forte reticulation de lenzyme peut conduire à
son inactivation ou reduire laccessibilite de son site actif au substrat. Cest pourquoi,
comme on peut le voir sur la (figure 3.2), on obtient un optimum de reponse pour un
temps dexposition avec la vapeur de glutaraldehyde de lordre de 20 minutes.
[BSA] = 3mg/l
[BSA] = 5mg/l
Rponse, S
0
5
10
15
20
25
30
Temps d'exposition la vapeur de GA, min
Fig. 3.2 Effet du temps dexposition à la vapeur de glutaraldehyde sur la reponse du

biocapteur
Il faut noter quavec 4% de proteinase K et 6% de BSA, on a observe une mauvaise

- 62 -
3.3. Developpement et optimisation du biocapteur
tenue de la membrane enzymatique. Pour cette raison, une dilution par deux des
deux types de membranes a ete testee pour diminuer lepaisseur de la membrane
et ameliorer ainsi son adherence sur le capteur. Ladherence de la membrane a ete
fortement amelioree.
Leffet de laddition de sel sur la reponse de biocapteur a ete egalement examine.
Comme le montre la figure 3.3a, il ny a pas deffet significatif de laddition du sel sur
la reponse du biocapteur. En effet, le mode differentiel des mesures permet deliminer
les effets de variation de charge non specifiques tel que laddition de sel dans le milieu
de mesure.
24
Rponse pour 10 g/mL BSA
8
7
6
16
Conductance, S
Response, S
20
12
8
4
5
4
3
2
1
0
10
20
40
60
80
100
120
15
20
25
30
Temprature (C)
NaCl, mM
(a)
(b)
Fig. 3.3 Effets du sel (a) et de la temperature (b), sur le reponse du biocapteur
De plus, Etant
donne que le biocapteur à base de proteinase K est destine à
lutilisation in situ pour le controle en continu de la concentration de proteines en tant
quindicateur de matière organique et donc de pollution urbaine, il etait important
detudier leffet de la temperature sur sa reponse, la temperature de leau changeant
entre les differentes saisons. Comme nous pouvons le voir sur la figure 3.3b, la reponse
du capteur enzymatique depend de la temperature. Jusquà 30C la reponse augmente
avec la temperature cest pourquoi pour une analyse rigoureuse, la temperature doit
etre prise en consideration. Ainsi, leffet de la temperature pourra etre corrige en
employant ces resultats. De plus, letude de la reponse du biocapteur au cours du
temps a montre une stabilite de stockage de plus de 30 jours (figure 3.4).
- 63 -

[BSA]= 4 mg/l
[BSA]=6 mg/l
Rponse, S
0
0
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Temps (jours)
Fig. 3.4 Etude

de la stabilite du biocapteur au cours du temps
3.3.2
Caract
eristiques analytiques du biocapteur obtenu
Une reponse typique du biocapteur au BSA, en fonction du temps est representee

sur la (figure 3.5a). Après stabilisation du signal (obtention dune ligne de base
stable) dans du tampon phosphate, linjection de lanalyte (4 ou 6 mg/L) dans le
milieu conduit à une variation significative du signal. La reponse à lequilibre (utilisee
pour nos mesures) est obtenue quand on arrive à un signal stable due au phenomène
dequilibre qui se cree entre le taux de production dions, resultat de la reaction enzymatique à linterieur de la membrane, et le flux de transfert dions apportes par les
molecules du tampon, qui diffusent dans la membrane. On obtient une stabilisation
du signal au bout dune duree inferieure à 8 minutes ce qui veut dire quon peut faire
7 à 10 mesures par heure.
Après toutes les optimisations, la courbe de calibrage du biocapteur a ete etablie.
Comme le montre la figure 3.5b, la gamme de reponse lineaire du biocapteur correspond à des concentrations de BSA allant de 0,4 à 8 mg/l avec une sensibilite de lordre
de 0,88 S/mg BSA. Cette gamme de reponse est bien en adequation avec les valeurs
des vraies concentrations des proteines dans les eaux naturelles [Nam99]. De plus ce
biocapteur offre une gamme de detection plus large et pour des concentrations plus
- 64 -
3.3. Developpement et optimisation du biocapteur
faibles que celle que couvre le capteur ampèrometrique concue par P. Sarkar [Sar00]
(entre 0,25 et 2,5 g/L de BSA).
5,5
4 mg/l BSA
6 mg/l BSA
5,0
7
6
4,5
Rponse, S
3,5
Conductance, S
Rponse
l'quilibre
4,0
BSA
3,0
2,5
2,0
1,5
R2=0,9998
4
3
2
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1
Temps, min
BSA, mg
(a)
(b)
Fig. 3.5 (a) Reponse typique en fonction du temps du biocapteur à proteines (b) Courbe
de calibrage du biocapteur en fonction de la concentration de BSA
La reproductibilite des mesures donnees par le biocapteur a ete egalement etudiee.

Comme le montre la figure 3.6, une reproductibilite elevee (de lordre de 3 %) a ete
obtenue.
8
[BSA]=6 mg/l
Reproductibilit = 3.3 %
Conductance, S
0
1
Numro de mesure
Fig. 3.6 Etude de la reproductibilite du biocapteur
- 65 -

3.3.3
Tests pr
eliminaires sur des
echantillons deau
Pour etudier la performance du biocapteur obtenu dans la detection des proteines

dans leau de rivière, deux echantillons deaux (Rhone, Saone) et une eau à la sortie
dune station depuration (Aurignac) ont ete preleves avec laide du Cemagref de
Lyon. En premier lieu, on a commence par mesurer la reponse du biocapteur suite à
laddition de 8 mg/L BSA puis on a ajoute des volumes croissants deau dAurignac
pour voir sil existe deventuels effets dactivation ou dinhibition de lenzyme (et par
consequent du biocapteur) sous laction de quelques molecules de polluants.
Comme le montre la fig. 3.7a, une reponse proportionnelle au volume deau dAurignac ajoute a ete obtenue, ce qui montre bien quil ny a aucun effet significatif
dinhibition ou dactivation des contaminants de leau.
Rponse du biocapteur
Mthode MicroBCA
18
3,8
50
3,6
16
Conductance, S
R2=0.97625
12
10
40
3,2
30
3,0
2,8
20
2,6
10
2,4
2,2
10
20
30
40
50
60
70
80
volume d'eau ajout, l
Protines, mg/l
Rponse, S
3,4
14
2,0
Aurignac
Rhne
Sane
eau
(a)
(b)
Fig. 3.7 (a) Test de leffet de leau sur la reponse du biocapteur (b) Comparaison de la
reponse du biocapteur avec les valeurs donnees par la microBCA
Ensuite, les trois echantillons deau ont ete analyses par une methode traditionnelle
de dosage des proteines qui est la microBCA (à base dacide bicinchroninic pour la
detection et la quantification colorimetrique des proteines totales dans les solutions
aqueuses diluees) [SKH+ 85]. Les concentrations en proteines donnees sont comparees
aux valeurs de reponse du biocapteur (figure 3.7b). Les deux methodes sont en accord
dans la classification des trois eaux en terme de concentration en proteines : leau la
plus concentree etant celle dAurignac (microBCA : 50,8 mg/L) puis leau de la Saone
(microBCA : 0,7 mg/L) et finalement leau du Rhone (micro BCA : 0,6 mg/L) donnant
- 66 -
3.4. Application du biocapteur `

a proteinase K immobilisee au contr
ole de la qualite de leau
respectivement des valeurs de conductance de 3,65, 2,8 et 2,5 S.

Cette comparaison uniquement qualitative montre aussi que la BSA ne peut pas
etre employee comme etalon pour la determination de la concentration en proteines
dans les eaux naturelles. En effet, les proteines des eaux sont differentes en taille et
en nature ce qui intervient dans la manière dont Elles sont hydrolysees et analysees
par le biocapteur ; en comparaison la BSA est une proteine complexe et de taille assez
importante. Faisant suite à cette première partie, on tend à etablir une calibration du
biocapteur à laide de plusieurs echantillons deaux naturelles pour une determination
rigoureuse des concentrations des proteines dans leau.
3.4
Application du biocapteur `
a prot
einase K immobilis
ee
au contr
ole de la qualit
e de leau
Suite à une interruption dapprovisionnement des electrodes interdigitees de platine prealablement fournies par lInstitut de Chemo et Biosensorics de M
unster en
Allemagne ; nous avons utilise pour la suite de cette etude et pour toutes les parties
qui vont suivre ce travail, les electrodes interdigitees en or fabriquees à lInstitut of
Semiconductors Physics de Kiev en Ukraine. Comme nous allons le voir, les resultats
obtenus avec les deux types delectrodes sont comparables.
3.4.1
V
erification des caract
eristiques du biocapteur
La reponse du biocapteur, realise comme decrit dans le paragraphe 3.2 sur les
nouvelles electrodes interdigitees en or, en fonction de la concentration en BSA est
presentee sur la figure 3.8. Ainsi, en comparaison aux resultats obtenus avec les
electrodes en platine, lordre de grandeur de la reponse est comparable. La gamme
lineaire pour la determination de BSA a legèrement change en passant de lintervalle
entre 0,4 à 8 mg/L à celui entre 0,8 à 6 mg/L. De plus, lanalyse statistique de la
reponse du biocapteur après plusieurs repetitions selon la methode AFNOR1 XP T90210 ont montre une bonne reproductibilite, une repetabilite constante et une limite
de detection denviron 0,5 mg/L de BSA.
1
AFNOR SAGAWEB, 1999. Norme XP T90-210. AFNOR, 11-20.
- 67 -

5
5,5
R2=0.98246
4,5
4,0
Conductance, S
Conductance, S
5,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
1
[BSA], g/mL
10
11
12
13
14
[BSA], g/mL
Fig. 3.8 Courbe de calibration de la BSA avec les electrodes interdigitees en or
3.4.2
Application `
a lanalyse des eaux de rivi`
eres
Après etude des caracteristiques conductimetriques du capteur avec la proteinase

K immobilisee, nous avons examine les reponses du biocapteur en question suite à
laddition de quelques echantillons deau preleves en des points differents de la rivière
près de Lyon (Rize aval D112, Rize aval pont de Cusset, canal de Jonage, Rhone
Fessine, Chaudanne drain, Chaudanne aval Leclerc, Yzeron pont de Chabrol).
Comme on la signale precedemment, au depart lidee etait de rapporter la reponse
du biocapteur, après injection deau de rivière (diluee au besoin), sur la courbe
detalonnage de la BSA pour obtenir la concentration en proteines dans lechantillon.
Cependant, les experiences ont montre que la BSA ne peut pas etre employee comme
etalon pour la determination de la concentration de proteines dans les eaux de rivière
(paragraphe 3.3.3).
Cest pour cette raison que les echantillons deaux de rivières ont ete additionnellement analyses à laide de methodes danalyses classiques pour les comparer avec les
valeurs donnees par le biocapteur.
- 68 -
3.4. Application du biocapteur `

a proteinase K immobilisee au contr
ole de la qualite de leau
3.4.2.1
Comparaison avec le carbone organique total (COD)
Etant
donne que les proteines servent dindicateur de la matière organique dans
les effluents nous avons commence par la comparaison de la reponse du biocapteur
avec les valeurs de carbone organique dissous (COD) fournis par le Cemagref. Les
resultats sont presentes sur la figure 3.9.
12
10
R2=0,89424
COD
0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Conductance, S
Fig. 3.9 Comparaison de la reponse du biocapteur avec les valeurs de COD
Comme on peut le voir, une correlation lineaire entre le COD et la conductance

donnee par le biocapteur a ete obtenue. Ceci confirme bien que les proteines constituent un bon estimateur de la matière organique dans les eaux de rivière.
3.4.2.2
Comparaison avec la concentration en prot

eines totales d
etermin
ee par
la m
ethode classique microBCA
de verifier la validite des mesures effectuees par le biocapteur developpe, nous

Afin
avons realise un dosage des proteines à laide dune methode colorimetrique classique :
la microBCA. Les resultats sont presentes sur la figure 3.10. Une bonne correlation
a ete obtenue. Cependant, il y a un petit ecart d
u à une sensibilite moindre de la
methode classique pour les basses concentrations en proteine.
- 69 -

30
R2=0.92082
25
q [BSA], g/mL
20
15
10
0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Conductance, S
Fig. 3.10 Comparaison de la reponse du biocapteur avec les valeurs donnees par la microBCA
3.5
Conclusions et perspectives
Le biocapteur conductimetrique avec la proteinase K immobilisee semble offrir des

potentialites importantes pour la detection des proteines dans les eaux naturelles. En
effet, la gamme de dosage, entre 0,8 à 6 mg/L, est en adequation avec les gammes
moyennes de concentrations observees en milieu naturel [Nam99]. De plus, ce biocapteur montre une bonne reproductibilite (3,3%), une repetabilite constante et une
limite de detection denviron 0,5 mg/L BSA. Le temps de reponse est suffisamment
rapide (valeurs à lequilibre de 7 à 8 minutes).
Letude de leffet de la temperature sur la reponse du biocapteur a montre la
capacite du biocapteur à travailler à des temperatures basses (10o C) ce qui est très
important pour son utilisation sur site (fluctuations de la temperature de leau selon
les saisons). De plus, la stabilite elevee du biocapteur au cours du temps (superieure
à 1 mois) a ete montree.
La confrontation des reponses du biocapteur après linjection de differents echantillons
deaux de rivière de la region Lyonnaise avec les valeurs de carbone organique dissous
- 70 -
3.5. Conclusions et perspectives
et les teneurs en proteines determines par une methode colorimetrique classique (la
microBCA protein Assay) ont montre de bonnes correlations, preuves de la fiabilite
du biocapteur conductimètrique dans le dosage des proteines dans les eaux naturelles.
En perspectives, on se propose de :
Tester limmobilisation de plusieurs proteases en meme temps sur les electrodes
(par exemple ajout de la trypsine et de la pronase en plus de la proteinase K)
pour essayer dameliorer encore les caracteristiques analytiques du biocapteur
(hydrolyse plus efficace de lensemble des proteines).
Mieux preparer ces biocapteurs à lutilisation in situ en ajoutant une protection physique autour de la membrane enzymatique (par exemple en instaurant
un système de tube dans lequel le capteur est protege avec acheminement de
lechantillon à laide dun système de pompes. Cette etude sera confiee à une
societe specialiste dans le developpement et la commercialisation de capteurs,
interessee par la commercialisation de notre biocapteur.
- 71 -
D
conductim`
etrique pour le dosage du
lactose dans le lait
Sommaire
4.1
Contexte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.2
Introduction
76
4.3
Mat
eriels et m
ethodes
4.4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
4.3.1
Materiels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
4.3.2
Immobilisation des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
4.3.3
Stockage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
4.3.4
Preparation des echantillons de lait . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
R
esultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1
79
4.4.3
Dosage du lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Etude
de la stabilite du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Etude
des eventuelles interferences avec le glucose . . . . . . . . .
81
4.4.4
Dosage du lactose dans le lait . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
4.4.2
4.5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
80
83
- 74 -
Chapitre 4
D
conductim`
du lactose dans le lait
4.1
Contexte
La conception de ce biocapteur a vu le jour suite à lidee de mettre au point

un biocapteur hybride utilisant la glucose oxydase et la bacterie Herminiimonas arsenicoxydans dont le gène codant pour la -galactosidase est induit par le selenium
(presente dans le chapitre 5. En effet, avant de developper ce biocapteur complexe, on
a voulu dabord verifier si la combinaison entre les activites catalytiques de ces deux
enzymes (la glucose oxydase et la -galactosidase) sur le lactose permet davoir une
variation de charge suffisante pour etre mesuree avec les electrodes conductimètriques.
De plus, etant donne que le lactose est quantitativement le sucre le plus important
du lait, il est interessant davoir des outils de controle en continu et en temps reel de
ce sucre que ce soit pendant le processus de fabrication (des laits pauvres en lactose
pour les personnes intolerantes à ce sucre, par exemple) ou pour le controle qualite
de la matière première.
- 75 -
Chapitre 4. Developpement dun biocapteur conductimètrique pour le dosage du lactose

dans le lait
4.2
Introduction
En plus de constituer une source denergie, le lactose aide le corps à absorber les sels mineraux. Malheureusement il existe chez certaines personnes une intolerance au lactose due à un deficit congenital ou acquis en une enzyme, la lactase, specifique de la muqueuse (couche de cellules recouvrant linterieur des organes
creux) de lintestin. Plusieurs travaux utilisant differents systèmes enzymatiques se
sont interesses au developpement de biocapteurs pour la determination du lactose.
La majorite de ces biocapteurs se basent sur des electrodes ampèrometriques sur
lesquelles on a immobilise deux enzymes (glucose oxydase et -galactosidase dans
des films de Langmuir-Blodgett [SSM+ 04]), trois enzymes (horseradish peroxidase,
glucose oxidase and -galactosidase dans des films de N af ionr [LYS+ 97]) ou meme
trois enzymes et le ferrocène (glucose oxidase, -galactosidase et mutarotase dans la cyclodextrin [LLY+ 98]). Cependant aucun biocapteur pour le lactose se basant sur un
transducteur conductimètrique nexiste. De plus, plusieurs des biocapteurs existants
sont sensibles à plusieurs sucres en meme temps [MKND05] et ne permettent donc pas
dobtenir selectivite vis à vis du lactose. Ainsi, dans ce travail, on sest interesse au
developpement dun biocapteur bi-enzymatique utilisant la glucose oxydase (GOx)
associee à la beta-galactosidase pour le dosage du lactose (reactions enzymatiques
mises en jeu presentees sur la figure 4.1). On essaiera deliminer les interferences avec
le glucose en immobilisant sur lelectrode de reference un melange de glucose oxydase
et de BSA. Ensuite, des tests avec des echantillons reels de lait commercial ont ete
effectues.
4.3
4.3.1
Mat
eriels et m
ethodes
Mat
eriels
La glucose oxidase (GOD) (EC 1.1.3.4, 130 U/mg) est un don genereux du laboratoire de Biomolecular Electronics, IMBG, Kiev, Ukraine. Lalbumine de serum bovin
(BSA), le lactose et le glucose ont ete fournis par sigma ainsi que le glutaraldehyde,
grade II, 25% en solution aqueuse.
- 76 -
Galactose
Gluconolactone
Glucose oxidase
Lactose
Glucose
H20
Gluconic acid
Fig. 4.1 Reactions enzymatiques catalysees par la -galactosidase et la glucose oxydase
4.3.2
Immobilisation des enzymes
Limmobilisation des deux enzymes : la glucose oxydase (GOD) et la -galactosidase

(Gal) se fait en deux etapes (voir figure 4.2) :
1- Un melange contenant 5% GOD (w/w), 5 % BSA et 10% glycerol dans du
tampon phosphate 20 mM pH 7,4, a ete prepare. 0,2 L de cette solution enzymatique
est ensuite deposee sur les parties sensibles des electrodes de travail et de reference.
Le capteur est ensuite place dans une atmosphère saturee en glutaraldehyde pendant
30 minutes afin de permettre la co-reticulation de lenzyme avec la BSA.
2- Une solution A (melange contenant 5% Gal (w/w), 5 % BSA et 10% glycerol
dans du tampon phosphate 20 mM pH 7,4) a ete preparee. 0,2 L de cette solution est
ensuite deposee sur lelectrode de travail contenant dejà la première couche de GOD.
Sur lelectrode de reference, 0,2 L de la solution B (10% de BSA et 10% glycerol
toujours dans le meme tampon phosphate) est deposee sur lelectrode de reference.
- 77 -

dans le lait
Vapeur de glutaraldhyde
BSA GOD
BSA
lectrodes
Interdigites
-Gal
Glutaraldhyde
30 min
Schage
30 min
Glutaraldhyde
Tampon phosphate 20 mM
30 min
Fig. 4.2 Representation schematique des etapes dimmobilisation des deux enzymes sur
le transducteur
4.3.3
Stockage
Les biocapteurs sont stockes, entre les differentes experiences, à 4C dans du tampon phosphate 5 mM, pH 7,5.
4.3.4
Pr
eparation des
echantillons de lait
On a reparti des volumes de 1 mL de laits commerciaux dans des tubes eppendorf.

Les tubes sont ensuite centrifuges puis le culot contenant les proteines insolubles ainsi
que le surnageant contenant la matière grasse du lait sont elimines. La partie mediane
du tube, recuperee, est diluee deux fois puis conservee pour servir comme solution
mère pour le dosage du lactose dans le lait à laide du biocapteur.
- 78 -
4.4. Resultats et discussion
4.4
4.4.1
R
esultats et discussion
Dosage du lactose
La reponse du biocapteur en fonction du temps pour le lactose est representee sur

la figure 4.3.
6
Conductance, S
+
0,4 mM
lactose
0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Temps (min)
Fig. 4.3 Reponse typique en fonction du temps du biocapteur après ajout du lactose
Comme on peut le voir, la reponse à la saturation du signal est obtenue au bout

de 4 minutes maximum. Ainsi, le temps de reponse du biocapteur est très interessant
pour son utilisation pour des controles en temps reel.
La determination de la reponse du biocapteur en fonction de la concentration du
lactose nous a permis de tracer les courbes de calibrage presentees sur la figure 4.4. La
partie (a) montre une saturation du biocapteur obtenue à partir de 1 mM de substrat.
Ainsi, comme le montre la courbe (b), le biocapteur developpe permet une calibration
lineaire du lactose dans un intervalle de concentration allant de 60 à 800 M (0,03
à 0,3 g/L). Cette gamme de detection est beaucoup plus basse que celles obtenues
avec les biocapteurs enzymatiques developpes par Amarita et al. [AFA97] et Sharma
et al. [SSM+ 04].
- 79 -

dans le lait
12
12
10
R2=0,99334
Conductance, S
Conductance, S
10
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
100
200
300
[Lactose], mM
400
500
600
700
800
900
[Lactose], M
(a)
(b)
Fig. 4.4 (a) Reponse du biocapteur en fonction de la concentration de lactose (b) Gamme
lineaire de calibration du lactose
4.4.2
Etude
de la stabilit
e du biocapteur
La figure 4.5 montre levolution, au cours du temps, de la reponse du biocapteur

pour differentes concentrations de lactose.
16
Jour 1
Jour 2
Jour 5
14
Conductance, S
12
10
8
6
4
2
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
[Lactose], mM
Fig. 4.5 Evolution

de la reponse du biocapteur au cours du temps
On remarque une diminution qui commence à etre visible à partir du cinquième

jour pour les concentrations les plus elevees de lactose (perte de 28,5 % de la reponse
pour 1 mM de lactose en passant du jour 1 au jour 5 ). Cependant pour les teneurs plus
- 80 -
faibles en lactose (se situant dans la gamme lineaire), on a une variation negligeable
de la conductance. Au-delà de 9 jours, une chute considerable de la reponse a ete
observee. Ainsi, il est preferable de remplacer les membranes enzymatiques au moins
une fois par semaine.
Etude
des
eventuelles interf
erences avec le glucose
4.4.3
Comme on la presente precedemment, on avait immobilise la glucose oxydase sur

les deux electrodes (de reference et de travail) pour navoir deffet sur la conductance
que suite à lhydrolyse du lactose par la -galactosidase immobilisee sur lelectrode de
travail. Leffet du glucose doit etre neutralise par le mesure differentielle (hydrolyse
par la glucose oxydase immobilisee sur les deux electrodes).
Pour verifier ceci, on a prepare un biocapteur suivant les etapes decrites dans
la section 4.3 sauf que dans letape 1 on a remplace, sur lelectrode de reference,
la membrane contenant la glucose oxydase par une membrane inactive (BSA). Les
reponses de ce biocapteur pour le lactose et le glucose sont presentees dans la figure 4.6
(a).
6
7
6
Conductance, S
Conductance, S
Rponse au lactose
Rponse au glucose
4
3
0,4 mM
Rponse au lactose
Rponse au glucose
3
2
0,4 mM
1
1
0
0
-1
-1
Temps, min
Temps, min
(a)
(b)
Fig. 4.6 Reponse en fonction du temps pour le lactose et le glucose (a) du biocapteur sans
la Gox dans la membrane de reference (b) du biocapteur avec la Gox dans la membrane de
reference
On voit bien quon a une reponse importante pour le glucose et une reponse pour
- 81 -

dans le lait
le lactose. Pour le biocapteur dans lequel on a ajoute la GOD dans la membrane

de reference (figure 4.6 (b)), on a juste un petit pic qui redescends rapidement. Ce
pic peut etre attribue au temps dhomogeneisation de la quantite de glucose arrivant
sur chacune des deux electrodes. Ainsi, on voit bien que le biocapteur obtenu est
bien selectif au lactose. Il faut noter quil serait toujours possible dutiliser le premier biocapteur (membrane de reference sans GOD) pour deventuelles applications
necessitant une estimation de la quantite de glucides (glucose inclu).
4.4.4
Dosage du lactose dans le lait
Deux echantillons differents de laits commerciaux (A et B) prealablement prepares

comme decrit dans la section 4.3 et dilues 2 fois, ont ete testes avec le biocapteur
developpe.
12
R2=0,99334
10
Rponse, S
Lait B
Y = 1,43832 + 34,09142 * x
Lait A
0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
[Lactose], g/L
Fig. 4.7 Determination de la concentration de lactose dans des echantillons de laits commerciaux
En reportant les valeurs de conductances donnees par le biocapteur sur la droite

de calibration du lactose (voir figure 4.7) on a trouve les concentrations suivantes
pour les echantillons A et B respectivement : 0, 053 et 0,0604 g/L. Le taux de dilution etant de 1/1000 (sans compter la legère concentration de depart du lait obtenue
par lelimination du surnagent de matière grasse et du culot de proteines après centrifugation), on a ainsi des concentrations de 53 et 60,4 g/L de lactose dans ces laits
- 82 -
commerciaux ce qui est en adequation avec les valeurs reelles qui se situent aux alentours de 50 g/L.
4.5
Le biocapteur conductimètrique developpe pour le dosage du lactose a montre

lefficacite de lassociation entre les activites enzymatiques de la -galactosidase et la
glucose oxydase pour lobtention dun signal conductimètrique exploitable.
Ce biocapteur presente une gamme lineaire de reponse se situant entre 60 et 800
M. Son temps de reponse est rapide puisque, suite à linjection du lactose, la stabilisation du signal de sortie (conductance) est atteinte en quelques minutes (4 minutes).
Ceci permet une utilisation en temps reel pour le controle qualite dans des processus
de fabrication par rapport à dautres biocapteurs pour lestimation du lactose dans
le lait qui necessitent plus de 50 minutes de temps danalyse [AFA97].
Pour ce qui est de la stabilite du biocapteur, il est recommande de changer les
membranes enzymatiques toutes les semaines. Ceci ne pose pas de problèmes vu la
facilite de mise en uvre de ces membranes enzymatiques.
Les dosage du lactose dans des echantillons de lait commerciaux à laide du biocapteur developpe montrent lefficacite de ce dernier pour le suivi de la concentration
de ce disaccharide.
La reussite du suivi des effets de charge, resultant de la combinaison de lhydrolyse
enzymatique du lactose par la -galactosidase avec loxydation du glucose catalysee
par la glucose oxydase, à laide des electrodes conductimètriques va etre exploitee
dans le chapitre suivant et appliquee au dosage du selenium, en exploitant une gal induite dans les cellules bacteriennes de Herminiimonas arsenicoxydans par la
presence de selenium.
- 83 -
D
conductim`
etrique hybride `
a base de
bact
erie mutante et de glucose oxydase
pour la d
etection du s
el
enite
Sommaire
5.1
Contexte et motivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
5.2
Mat
eriels et m
ethodes
89
5.3
5.2.1
Reactifs utilises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
5.2.2
Caracteristiques de la souche bacterienne . . . . . . . . . . . . . .
90
5.2.3
Culture bacterienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
5.2.4
Immobilisation des enzymes puis des bacteries . . . . . . . . . . .
92
5.2.5
Exposition des bacteries au selenium . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
R
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
Tests preliminaires et etudes des caracteristiques analytiques du

biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
Effets de la concentration en lactose utilisee sur la sensibilite du

biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
Comparaison des reponses du biocapteur obtenues selon le mode

dexposition au selenium adopte . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
Dosage du selenite après optimisation . . . . . . . . . . . . . . . .
98
99
- 86 -
Chapitre 5
D
conductim`
etrique hybride `
a base
de bact
erie mutante et de glucose
oxydase pour la d
etection du
s
el
enite
5.1
Contexte et motivations
Le selenium (Se) est un element naturellement present dans la plupart des roches et
sols. Le selenium traite est principalement employe dans les industries delectronique
et du verre et comme composant des colorants pour plastiques, peintures, encres,
et caoutchouc... Il est egalement employe comme additif alimentaire. Certains composes du selenium sont très mobiles et fortement solubles dans leau ce qui implique
une plus grande chance dexposition à ces composes. Le selenium peut contaminer leau de surface dans les eaux de drainage et dirrigation. De plus, des etudes
ont montre que le selenium peut etre stocke dans les tissus dorganismes aquatiques [RLW06] puis probablement concentre dans la chane alimentaire [Age03]. Bien
que le selenium soit un oligoelement indispensable à lorganisme, il devient toxique
sil depasse une certaine dose. En effet, la prise excessive de selenium peut causer
- 87 -
Chapitre 5. Developpement dun biocapteur conductimètrique hybride `

a base de bacterie
mutante et de glucose oxydase pour la detection du selenite
des effets nefastes sur la sante, qui sont generalement observes à des doses excedant
5 fois la dose alimentaire recommandee (RDA). La RDA actuelle pour le selenium,
etablie par The Food and Nutrition Board of the National Research Council (National Academy of Sciences : NAS) est 55 g/jour pour les adultes (approximativement 0,8 g/kg/jour). Le niveau superieur tolerable actuel selon le NAS de prise
de selenium (UL) est de 400 g/jour (approximativement 5,7 g/kg/jour. Lingestion de quantites elevees de selenium peut causer des problèmes gastro-intestinaux
(vomissement, diarrhee), des alterations des cheveux et des ongles, et des manifestations neurologiques comprenant des acroparesthesies, faiblesse, convulsions, et une
diminution de la fonction cognitive [RSL+ 04, TZW+ 02, Tin03, BZ05]. Pour toutes
ces raisons, le controle de la concentration en selenium est inclus dans la directive
integree du controle preventif de la pollution (IPPC) de lunion europeenne. Ainsi,
plusieurs methodes analytiques pour la quantification du selenium ont ete developpees
[GNLSR06, CFP+ 06, MBMGSM06, VDB+ 01]. La majorite de celles-ci impliquent la
detection par spectrometrie dabsorption atomique [LGC97], par spectrometrie de
masse [TXW05], ou par spectrometrie de fluorescence atomique [SLFC03]. Cependant, malgre les nombreux avantages quils offrent (simplicite et rapidite des mesures
qui nexigent pas doutils de laboratoire sophistiques) très peu de methodes à base de
capteurs ont ete developpees pour la quantification du selenium [LdB00, CM04]. Un
seul biocapteur permettant une detection qualitative du selenium se basant sur lutilisation dun papier chromatographique associe à linhibition de lenzyme carboxyl
esterase a ete decrit [SK01].
Le selenium est present sous plusieurs formes redox, principalement les formes
toxiques et solubles : seleniate (SeV I O4 2 ) et selenite (SeIV O3 2 ). Bien que les mecanismes de la toxicite des seleniates et de selenites ne soient pas totalement elucides, il
y a de bonnes raisons de penser que le caractère toxique de ces composes est lie à
leur pouvoir oxydant. La reactivite elevee du selenite avec les groupements thiol peut
expliquer son caractère toxique. Le selenite reagit notamment avec le glutathion pour
former du selenodiglutathion, produisant les composes fortement toxiques, H2 O2 et
O2 2 .
Les bacteries ont developpe divers strategies leur permettant de contrebalancer la
toxicite des metaux lourds et metallodes [Nie99, LNBL03, SHS+ 05, Sil98]. Plusieurs
operons de resistance à des metaux sont situes sur des transposons et des plasmides.
Cependant, recemment certains gènes chromosomiques de resistance aux metaux ont
- 88 -
ete egalement identifies dans plusieurs espèces bacteriennes. Il a egalement ete rapporte que diverses espèces de bacteries eliminent le caractère toxique du selenite en
le reduisant en selenium elementaire (insoluble et non-toxique) [SO99]. Cest dans ce
contexte que nous nous sommes interesses à une souche dune bacterie gram negative :
Herminiimonas arsenicoxydans (ULPAs1). Une bacterie mutante de la souche UlPAs1
dans laquelle le transposon mini-Tn5 lacZ2 [LHJT90] o`
u les Tn-elements sont inseres
dans les gènes induits par le selenium. En effet, chez ce mutant on assiste à une induction de lexpression du gène lacZ (et donc production de lenzyme -galactosidase)
en presence de selenite. Plusieurs travaux ont exploite le couplage entre la reconnaissance biologique utilisant des gènes reporter pour le developpement de biocapteurs
à cellules entières [DBF+ 00, TvdM06, FIM+ 05].
Ainsi, dans ce chapitre, on a developpe un biocapteur conductimètrique hybride
pour la detection du selenite à laide dune bacterie contenant le gène lac Z comme
reporter associee à lactivite enzymatique de la glucose oxydase. En presence du
selenite, la -galactosidase est produite puis detectee à la suite de laddition de son
substrat le lactose et son hydrolyse en glucose et galactose. La glucose produit est
à son tour oxyde par la glucose oxidase provoquant des changements de conductivite au niveau de la membrane enzymatique (comme on la dejà vu dans le chapitre precedent). Ces changements de conductivite seront mesures par les electrodes
conductimètriques [DAE+ 01, ADV+ 04, MDN+ 05], et ainsi, on arrive à correler la valeur de la conductance à lactivite -galactosidase produite et donc à la quantite de
Se(IV) presente.
5.2
5.2.1
Mat
eriels et m
ethodes
R
eactifs utilis
es
La glucose oxidase (GOD) (EC 1.1.3.4, 130 U/mg) est un don genereux du laboratoire de Biomolecular Electronics, IMBG, Kiev, Ukraine. Lalbumine de serum
bovin (BSA), le lactose et le glucose ont ete fournis par Sigma ainsi le glutaraldehyde
utilise (grade II, 25 % en solution aqueuse. Une solution mère aqueuse de Se(IV) (457
mM) a ete preparee par dissolution de la quantite adequate de selenite de sodium
(N a2 SeO3 , Aldrich) dans de leau ultrapure.
- 89 -

a base de bacterie
5.2.2
Caract
eristiques de la souche bact
erienne
La souche utilisee est une souche aerobie gram negative (ULPAs1), isolee dun milieu industriel de traitement deaux residuaires contamine avec de larsenic [WLP+ 99].
Cette bacterie a ete isolee et etudiee dans le laboratoire de Genetique Moleculaire,
Genomique, Microbiologie, de luniversite Louis-Pasteur Strasbourg, France. La caracterisation phenotypique et genotypique complète de cette souche a montre que
cette bacterie represente une nouvelle espèce du genre recemment decrit Herminiimonas [FRN+ 05]. Cette souche, appelee Herminiimonas arsenicoxydans [MSR+ 06],
est capable de reduire le nitrate en nitrite. Elle est depourvue darginine dihydrolase,
de -galactosidase et durease. Elle ne produit pas dindole à partir du tryptophane
et nhydrolyse ni larginine ni la gelatine. De plus, elle nassimile pas : le glucose, le
sucrose, larabinose, le mannose, le mannitol, le N-acetyle-glucosamine, le maltose, le
gluconate, le caprate, ladipate, le citrate, le malate, lacetate de phenyl, lethanol et
le methanol. Ainsi, les seules sources de carbone utilisees par la bacterie en culture
etaient le lactate de sodium et la peptone. La bacterie a manifeste un metabolisme
aerobie chimio-organotrophe utilisant loxygène en tant quaccepteur delectrons final. La souche a une croissance mesophile entre 4o C et 30o C avec une temperature
optimale de croissance aux alentours de 25o C et un pH optimal entre 7 et 8,5. La
croissance de lisolat de bacteries dans le CDM agar na pas montre dinhibition par
la tetracycline et lampicilline, alors que la kanamycine, le chloramphenicol, la streptomycine et le trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-smx) inhibent la croissance des
cellules [WLP+ 99].
La souche ULPAs1 est resistante à plusieurs des metaux et metallodes testes
en plus de lAs(III) (MIC, 5 mM), à savoir, Se(IV) (MIC, 5 mM), Mn(II) (MIC,
5 mM), Cr(III) (MIC, 5 mM), Sb(III) (MIC, 1 mM), Ni(II) (MIC, 2 mM), Cd(II)
(MIC, 1,42 mM), et Pb(II) (MIC, 1,2 mM). En revanche, la souche ULPAs1 est
sensible à Hg(II), Cu(II), et à Cr(VI). Pour identifier le gène qui est implique dans
la resistance à leffet toxique des metaux et metallodes, le criblage dune collection
de mutants a ete realise. Ainsi, une collection de plus de 5000 mutants a ete produite
par mutagenèse aleatoire de la souche mère Herminiionas arsenoxydans à laide du
transposon mini-Tn5 [MLS+ 03]. Parmi ces 5000 mutants testes, 34 ont montre une
activite -galactosidase en presence dun metal ou metallode toxique (preuve que le
transposon a bien ete introduit en aval dun promoteur regule par un toxique). Dans
- 90 -
ce travail on sest interesse au mutant K5 qui a montre une induction de lexpression

de lactivite -galactosidase en presence dions selenites.
5.2.3
Culture bact
erienne
La souche ULPAs1 et son mutant K5 ont ete cultives dans un milieu chimiquement
defini (CDM), qui a ete prepare comme suit : 100 ml de la solution A (81.2 mM
MgSO4 . 7H2 O, 187 mM NH4 Cl, 70 mM N a2 SO4 , 0.574 mM K2 HPO4 , 4.57 mM CaCl2 .
2H2 O, 446 mM lactate de sodium). 2,5 ml de solution B (4.8 mM F e2 SO4 .7H2 O), et
10 ml de la solution C (950 mM NaHCO3 ) sont melangees puis le volume est porte
à 1 litre avec de leau ultrapure. Le pH final du milieu est denviron 7,2. Toutes les
solutions ont ete preparees avec de leau filtree (avec le système de Milli-Q ; Millipore)
precedemment sterilise à lautoclave (à 120o C pendant 20 minutes). La solution A a
ete sterilisee à lautoclave (à 120o C pendant 20 minutes), alors que les solutions B et
C ont ete sterilisees par filtration (avec des filtres Millipore de 0,45 m de diamètre de
pores). Les cultures bacteriennes ont ete menees dans 2 ml de milieu CDM additionne
de 25 g/l kanamycine à 25o C et agitees à 250 t/mn dans un shaker rotatoire (Grant,
OLS 200) pendant 72h (voir figure 5.1). Les cultures sont ensuite centrifugees pendant
10 minutes à 5000 t/mn. La base bacterienne est conservee à 4o C en attendant son
immobilisation sur lelectrode conductimetrique.
Fig. 5.1 Photo de lappareil incubateur-agitateur utilise pour la culture bacterienne
- 91 -

a base de bacterie
5.2.4
Immobilisation des enzymes puis des bact

eries
Pour la construction de notre biocapteur, deux etapes dimmobilisation sont necessaires :

1- Immobilisation des enzymes : Un melange contenant 5% GOD (w/w), 5 % BSA
et 10% glycerol dans du tampon phosphate 20 mM pH 7,4 a ete prepare. 0,2 L de
cette solution enzymatique est ensuite depose sur les parties sensibles des electrodes
de travail et de reference. Le capteur est ensuite place dans une atmosphère saturee en
glutaraldehyde pendant 30 minutes afin de permettre la co-reticulation de lenzyme
avec la BSA. Après immobilisation, le biocapteur est seche 30 minutes à lair (voir
figure 5.2).
Vapeur de glutaraldhyde
BSA GOD
Schage
lectrode
Interdigite
30 min
Glutaraldhyde
Bactrie
Schage
30 min
Glutaraldhyde
Fig. 5.2 Representation schematique des differentes etapes de la procedure dimmobilisation de la GOD et de la bacterie
2- Immobilisation des bacteries : 0,5 L du culot de la culture bacterienne de

la souche K5 et de la souche ULPAs1 (membrane inactive) ont ete deposes, respectivement, sur la surface de lelectrode de travail et de lelectrode de reference ; le
biocapteur est ensuite incube pendant 30 minutes dans une vapeur saturee en glutaraldehyde et finalement seche à lair pendant 30 minutes. La photo prise au microscope
electronique à balayage (MEB) de la membrane hybride (fig. 5.3) montre un depot
de bacteries couvrant la surface entière de lelectrode.
- 92 -
Cramique
lectrode en or
Fig. 5.3 Image de lelectrode de travail observee au MEB
5.2.5
Exposition des bact

eries au s
elenium
Deux procedures differentes dexposition des bacteries au selenium ont ete testees :
1. Post-exposition : Le biocapteur prepare en utilisant la culot de la culture
bacterienne comme decrit precedemment est incube dans le milieu CDM, additionne dune certaine concentration de selenium, pendant un temps defini.
2. Pre-exposition : Dans ce cas, la culture de bacteries est exposee au selenium
avant immobilisation. Les memes etapes sont effectuees pour la culture de bacteries,
par contre, après centrifugation, une quantite bien determinee de selenium est
ajoutee au milieu CDM puis ce denier est rajoute au culot bacterien. Après 90
heures dincubation, la culture de bacteries a ete centrifugee pendant 10 minutes
à 5000 t/mn puis, comme decrit precedemment, le culot bacterien est utilise pour
la realisation du biocapteur.
Finalement, avant son utilisation, chaque biocapteur est transfere dans du tampon
phosphate de 5 mM, pH 7,4 pendant 15 minutes.
- 93 -

a base de bacterie
5.3
5.3.1
R
Tests pr
eliminaires et
etudes des caract
eristiques analytiques du
biocapteur
Les premières experiences ont ete realisees avec un biocapteur prepare en utilisant
le culot de culture bacterienne comme decrit dans la section 5.2.4 et la post-incubation
avec 0,5 mM de selenium a ete appliquee pendant 90 heures. Des exemples dallures
de courbes typiques representant les reponses du biocapteur suite à lajout de lactose
dans la cellule de mesure sont presentes sur la figure 5.4. La ligne de base de reponse
a ete enregistree dans le tampon avant linjection du substrat. La reponse à lequilibre
du biocapteur a ete obtenue environ 4 à 6 minutes après lajout du lactose.
1,0
1,2 mM Lactose
0,8 mM Lactose
0,2 mM Lactose
0,9
0,8
Conductance, S
0,7
Rponses
lquilibre
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
Temps, min
Fig. 5.4 Reponse typique du biocapteur en fonction du temps après ajout du lactose
Ensuite, la reponse du biocapteur (expose prealablement pendant 90 h à 0,5 mM

selenite) a ete mesuree pour differentes concentrations de lactose. Comme on peut le
voir sur la figure 5.5, la conductance à lequilibre est directement proportionnelle à
la quantite de substrat dans une gamme de concentration du lactose comprise entre
0,2 et 2 mM.
- 94 -
1,4
2
R =0,98532
1,2
Conductance, S
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
[Lactose], mM
Fig. 5.5 Courbe de calibration du lactose avec le biocapteur incube pendant 90 heures en
presence de 0,5 mM de selenite
Afin de confirmer que les reponses obtenues precedemment reflètent bien une induction de lactivite -galactosidase par le selenium, on a compare les reponses des
biocapteurs incubes 72 heures, respectivement, sans Se, en presence de 0,3 mM de Se
et en presence de 0,5 mM de Se pour 1 mM lactose (figure 5.6).
0.5 mM Se
1,4
1,2
Rponse, S
1,0
0,8
0.3 mM Se
0,6
0,4
Blanc
0,2
0,0
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Concentration de Se dans le milieu d'incubation
Fig. 5.6 Comparison des reponses du biocapteur temoin avec le biocapteur incube en
presence de differentes concentrations de Se
Ainsi, on a pu constater que la conductance augmente avec la concentration de Se,

ce qui montre bien la faisabilite de notre biocapteur à base de GOD et de bacteries
pour la detection du selenite.
- 95 -

a base de bacterie
5.3.2
Effets de la concentration en lactose utilis

ee sur la sensibilit
e du
biocapteur
Pour determiner la concentration (ou lintervalle de concentration) de lactose

ideal(e) pour la detection du Se, on a etudie le changement de la sensibilite du biocapteur avec la variation de concentration en lactose injectee et ceci en comparant
les differentes valeurs de conductance obtenues pour chaque concentration de lactose
pour des bacteries exposees à 0,3 et 0,5 mM Se (voir fig. 5.7).
2,2
[slenium] = 0,3 mM
[slenium] = 0,5 mM
2,0
2 mM Lactose
1,8
1.6 mM Lactose
1,6
1 mM Lactose
Rponse, S
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
[Lactose], mM
Fig. 5.7 Determination de la concentration de lactose à ajouter pour une sensibilite

optimale du biocapteur
Les resultats montrent que la sensibilite augmente avec la diminution de la concentration de lactose. En effet, pour 1mM de lactose injectee, la valeur de conductance
augmente de 136% environ en passant de 0,3 à 0,5 mM Se alors que pour 1,6 et 2
mM elle naugmente que de 77% et 33%, respectivement. Suite à ces observations, des
concentrations de 1 et 1,6 mM de lactose ont ete employees pour toutes les experiences
qui ont suivi.
- 96 -
5.3.3
Comparaison des r
eponses du biocapteur obtenues selon le mode
dexposition au s
el
enium adopt
e
La comparaison des reponses des biocapteurs obtenues après pre-exposition ou

post-exposition en presence de 0,5 mM Se est presentee sur la figure 5.8. Comme
on peut le voir, une conductance plus elevee est obtenue dans le cas du biocapteur
prepare avec des bacteries pre-exposees au selenite avant leur immobilisation sur la
surface de lelectrode.
1,6
Post-exposition
Pr-exposition
1,4
Conductance, S
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1
1,6
[Lactose], mM
Fig. 5.8 Comparaison des reponses du biocapteurs selon le mode dexposition au selenite
La perte de signal en appliquant la post-exposition est encore plus visible pour

une concentration de lactose de 1,6 mM puisquon assiste à une perte de signal de
lordre de 40% alors que pour 1 mM lactose, elle est de 22% seulement. Ceci peut etre
explique par le fait que quand le biocapteur entier est incube avec le selenium (postexposition), cette etape se faisant à temperature ambiante pour induire lexpression
de la -galactosidase, on peut assister à une perte dactivite de la glucose oxydase qui
se manifeste par une diminution visible de la reponse du biocapteur notamment quand
on augmente la concentration de lactose utilisee pour le test. Cependant, etant donne
que la glucose oxydase est une enzyme robuste, on peut toujours utiliser la methode
de post-exposition si on veut travailler avec des echantillons reels notamment si on
- 97 -

a base de bacterie
travaille avec une concentration de lactose de lordre de 1 mM.

5.3.4
Dosage du s
el
enite apr`
es optimisation
Après tous ces tests preliminaires et ces optimisations, une courbe de calibration
du biocapteur conductimètrique pour la determination du selenite a ete etablie. Pour
cela, la reponse du biocapteur a ete testee pour des concentrations de selenite allant
de 0,1 à 0,5 mM (en realisant des triplicats de mesure) selon la methode de preexposition. Ensuite, les resultats de la quantification du selenite, obtenues avec 1 et
1,6 mM lactose, ont ete reportes sur la figure 5.9.
1,8
[Lactose] = 1 mM
[Lactose] = 1,6 mM
1,6
1,4
Rponse, S
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
[Slenite], mM
Fig. 5.9 Courbe de calibrage par la methode de pre-exposition pour la determination du

selenite
Ainsi, une reponse lineaire a ete obtenue pour une gamme de concentration de Se
(IV) allant de 0,1 à 0,5 mM (correspondant à un intervalle de concentrations entre 7 et
39 ppm). Cette gamme de determination du Se est deux fois plus etendue que celle (4 à
20 ppm) obtenue par le capteur chimique developpe par Coo et Martinez [CM04]. On
a par contre note quavec la methode de pre-exposition, on a obtenue une sensibilite
meilleures avec 1,6 mM lactose quavec 1 mM. Ceci peut etre explique par le fait
quen exposant le biocapteur au Se selon la methode de post-exposition, on a assiste
- 98 -
à une perte de sensibilite beaucoup plus importante pour 1,6 mM lactose que pour 1
mM (comme on lavait vu sur la figure 5.8).
5.4
Ce travail nous a permis de montrer la faisabilite dun biocapteur conductimetrique

hybride associant la glucose oxydase, en tant que biorecepteur enzymatique, à une
bacterie genetiquement modifiee, qui exprime lactivite -galactosidase en presence
de selenite, pour la determination du selenite. Ce système original utilisant une enzyme et une cellule entière permet la quantification du selenite dans la gamme de
concentrations entre 7 et 39 ppm.
Cette methode est egalement très interessante parce quelle permet douvrir des
voies pour utiliser differents micro-organismes genetiquement modifies, contenant ce
gène reporter (gène Lac Z ), associes à ce transducteur conductimètrique pour la
detection dautres polluants, en particulier differents metaux lourds comme le Pb et
le Mn. Dautre part, la caracterisation dautres souches de cette bacterie, du point
de vue resistance à differents metaux lourds, permettraient de les utiliser pour le
developpement dautres biocapteurs. Enfin, dautres mesures avec dautres degres
doxydation du selenium et des metaux lourds permettrait de mieux apprehender la
selectivite de ce biocapteur.
- 99 -
Faisabilit
e dun biocapteur olfactif `
a base
de levures exprimant le r
ecepteur humain
OR17-40
Sommaire
6.1
Introduction
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
103
6.2
Contexte et motivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
104
6.3
Les r
ecepteurs olfactifs et la perception de lodeur . . . . . . .
105
6.4
6.5
6.6
6.3.1
Presentation generale du système olfactif . . . . . . . . . . . . . . 105
6.3.2
Structure des recepteurs olfactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
6.3.3
Activation des recepteurs couples aux proteines G et la transmission

du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.3.4
Mecanismes moleculaires de la transduction et de la regulation du

signal olfactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
6.3.5
Le recepteur OR17-40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Mat
eriels et m
ethodes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
111
6.4.1
Produits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.4.2
Preparation des milieux de Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.4.3
Culture des levures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.4.4
Immobilisation des levures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.4.5
Preparation des solutions dodorant . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
R
114
6.5.1
Optimisation de limmobilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.5.2
Detection de lhelional par le biocapteur olfactif . . . . . . . . . . . 115
- 101 -
118
- 102 -
Chapitre 6
Faisabilit
e dun biocapteur olfactif
`
a base de levures exprimant le
r
ecepteur humain OR17-40
6.1
Introduction
Le système olfactif des mammifères peut identifier et distinguer un grand nombre

de molecules odorantes. La detection dodorants chimiquement distincts resulte de
lassociation des ligands odorants avec les recepteurs specifiques sur les neurones sensoriels olfactifs. La decouverte et la caracterisation faite par Buck et al. [BA91] des
18 membres differents dune grande famille multigenique qui code pour sept proteines
transmembranaires, dont lexpression est limitee à lepithelium olfactif, et qui constitue la famille diverse de recepteurs odorants (recepteurs couples aux proteines G) a
ouvert la voie à des avancees importantes dans le domaine de lolfaction. De plus,
lidentification et le clonage de lessentiel du repertoire de gènes fonctionnels codant
pour les recepteurs odorants humains realise par Zozulya et al. [ZEN91] a ete une
avancee importante pour la comprehension de la specificite ligand-recepteur et le codage combinatoire des stimulus odorants dans lolfaction humaine.
Aujourdhui, la quantite de brevets deposes sur les recepteurs olfactifs (ORs) rend
compte de limportance des applications industrielles attendues sur ce domaine, qui
depasse la physiologie sensorielle. Etant

donne la fonction remplie par ces recepteurs,
- 103 -
Chapitre 6. Faisabilite dun biocapteur olfactif `

a base de levures exprimant le recepteur
humain OR17-40
les applications attendues sont nombreuses. Plusieurs brevets revendiquant lutilisation des sequences dans la creation de biocapteurs pour la detection dodeurs dans les
domaines de lindustrie pharmaceutique, laquaculture, lalimentaire, lindustrie des
parfums ont ete deposes.
6.2
Contexte et motivations
Actuellement plusieurs centaines de capteurs electroniques sont commercialises,

o`
u chaque capteur chimique est cree pour detecter un ligand. Cependant ces capteurs chimiques ne permettent pas didentifier plusieurs odeurs à la fois. Les avancees
realisees dans la comprehension des mecanismes de la reception olfactive, et dans
les techniques dexpression des differents recepteurs olfactifs dans differents systèmes
heterologues (notamment les levures [RW98]) rendent de plus en plus attractive lidee
de construire un système olfactif artificiel (nez bioelectronique) avec des biocapteurs, qui presentent des reactions croisees et differentes sensibilites pour les odorants.
Ainsi, plusieurs travaux decrivant des methodes de detection dodorants utilisant
differents types de biorecepteurs ont ete publies. Certains utilisent limmobilisation du
recepteur olfactif proteique en lui-meme [Wu99] ; dautres mettent en uvre des fractions membranaires de microorganismes exprimant le recepteur olfactif tels que Saccharomyces cerevisiae [HJRM+ 07, GCE+ 06] ou Escherichia coli [SKP06]. Un autre
type de biocapteur olfactif utilisant lantenne dun insecte comme element sensible a
ete decrit par Schutz et al. [SSS+ 00]. La plupart de ces methodes utilisent le système
de transduction piezoelectrique. Malgre les echanges ioniques qui ont lieu suite à la
fixation de lodorant sur le recepteur olfactif, aucune methode utilisant un transducteur conductimètrique pour la detection dodorants na ete encore developpee.
Ce travail a ete entrepris suite aux differents tests realises avec des preparations
membranaires du recepteur olfactif du rat I7 par Hou et al. [HJRM+ 07]. En effet,
dans le cadre du projet Action concertee : biocapteur olfactif et du projet Europeen Single protein nanobiosensor gird array (SPOT-NOSED) visant à elaborer
des micro et nanobiocapteurs olfactifs pour le developpement de nez electroniques,
Yanxia Hou avait travaille sur plusieurs techniques dimmobilisation de recepteurs
olfactifs sur des electrodes dor pour la detection dodorants [Hou05]. Elle a pu ainsi
detecter des molecules dodorant par les recepteurs olfactifs du rat (OR I7)immobilises
- 104 -
6.3. Les recepteurs olfactifs et la perception de lodeur
dans leur fraction membranaires, à laide de mesures de spectroscopie dimpedance

electrochimique.
Après la reussite de Minic et al. dans lexpression du recepteur olfactif humain
OR 17-40 chez la levure Saccharomyces cerevisiae [MPG+ 05], nous avons pense à
immobiliser ces cellules entières sur des electrodes interdigitees pour la detection de
lhelional.
6.3
6.3.1
Les r
ecepteurs olfactifs et la perception de lodeur
Pr
esentation g
en
erale du syst`
eme olfactif
Un millier de gènes, soit environ 1% du genome, est destine à exprimer des

recepteurs olfactifs. Le système olfactif est donc equipe dun grand nombre de recepteurs
qui constitue dailleurs la plus grande famille de gènes connue à lheure actuelle.
La muqueuse olfactive est le siège de la perception des molecules odorantes. Chez
les vertebres superieurs, elle est localisee dans la region dorsale posterieure de la
cavite nasale. Sa surface se restreint à quelques cm2 mais, du fait de sa position et
de larchitecture de la cavite nasale, qui canalise lair vers cette zone, laccès des
molecules odorantes sur la muqueuse olfactive est optimal. Depuis la face apicale, la
muqueuse olfactive comporte un mucus et deux couches de tissus, lepithelium olfactif
et la sous-muqueuse, separes par une lame basale (lamina propria).
Lepithelium olfactif est constitue de trois types cellulaires : les cellules de soutien,
les cellules basales et les cellules neuroreceptrices : les neurones olfactifs (Figure 6.1 1 ).
Les cellules de soutien setendent de la lame basale jusquà la lumière nasale o`
u elles
se terminent en formant des microvillosites. Elles se juxtaposent entre les neurones
olfactifs, permettant ainsi de les isoler les uns des autres. Les cellules de soutien participent aussi à la regulation des concentrations ioniques, notamment à la regulation
potassique qui est perturbee lors dune depolarisation des neurones olfactifs. De facon
generale, elles contribuent à la regulation de lenvironnement des neurones olfactifs.
Les neurones recepteurs olfactifs, sont formes dun axone qui se projette vers la region
bulbaire et dune dendrite qui se termine dans le mucus par une protuberance do`
u
1
http ://www.123bio.net/revues/vmatarazzo/fig2.html
- 105 -

humain OR17-40
Fig. 6.1 Representation schematique dune coupe depithelium olfactif de vertebre
emergent plusieurs cils. Cest au niveau de ces cils que seffectue la transformation
du signal chimique (la molecule odorante) en signal electrique. La membrane des cils
olfactifs contient lensemble des elements proteiques necessaires pour declencher le potentiel de recepteur, ce dernier etant à lorigine du potentiel daction si son amplitude
est suffisante.
Comme nous lavons indique precedemment, la muqueuse olfactive des vertebres
est recouverte dun mucus. Parmi les proteines secretees dans ce mucus, il a ete observe
des proteines capables de lier les molecules odorantes : les OBPs. Ces proteines solubles appartiennent à la famille des lipocalines. Cette famille comprend des proteines
capables de transporter des molecules lipophiles comme le cholesterol, les sterodes et
le retinol.
La presence de molecules odorantes au niveau de lepithelium olfactif conduit à
la genèse dun message electrique transmis par le nerf olfactif à un relais, le bulbe
olfactif puis à diverses structures centrales.
- 106 -
6.3.2
Structure des r
ecepteurs olfactifs
Les recepteurs olfactifs appartiennent à la super-famille des recepteurs couples aux

proteines G (RCPGs). Les RCPGs sont des proteines monomeriques et intramembranaires de quelques centaines dacides amines (300 à 1200 residus environ) dont la
caracteristique majeure est leur organisation en sept regions hydrophobes en helice
comme le montre la figure 6.2.
Fig. 6.2 Schema representatif de la structure des recepteurs couples aux proteines-G
Des etudes ont montre le caractère transmembranaire des domaines hydrophobes

et ont permis dassigner une orientation à la proteine : lextremite amino-terminale est
extracellulaire alors que lextremite carboxy-terminale est intracellulaire. La longueur
des extremites amino- et carboxyterminales, de meme que celle de certaines boucles
extra- ou intracellulaires, varie selon le recepteur 2 .
Les nombreux RCPGs clones peuvent etre repartis en trois grands groupes, en
fonction des homologies de sequence primaire quils presentent entre eux :
Le groupe I est constitue des recepteurs apparentes à la rhodopsine, cest-à-dire la
grande majorite des RCPGs que sont les recepteurs des composes amines, puriques
2
Daprès Jean-Marie
http ://www.123bio.net
BOTTO,
une
classification
- 107 -
des
Recepteurs
Couples
aux
Proteines-G,

humain OR17-40
et lipidiques, de certains peptides, des glycoproteines, des proteases, ainsi que les
recepteurs sensoriels qui repondent aux stimuli gustatifs, olfactifs et visuels.
Le groupe II rassemble les recepteurs de certaines hormones peptidiques (calcitonine, CRF, GIP, glucagon et glucagon-like peptide, GH-RH, PTH et PTH-RP,
PACAP, secretine et VIP), ainsi que de lhormone diuretique.
Enfin, le groupe III, le moins represente, est compose des huit sous-types de
recepteurs metabotropiques de lacide glutamique associes au recepteur des glandes
parathyrodes, sensible aux ions Ca++ (Ca++ -sensing) et du recepteur de lacide aminobutyrique (GAB).
6.3.3
Activation des r
ecepteurs coupl
es aux prot
eines G et la transmission du signal
Les proteines-G jouent un role central dans la signalisation intracellulaire. Elles

amplifient les reponses des recepteurs et influencent lamplitude et les delais des signaux eux-memes. Elles orientent egalement les signaux en couplant les recepteurs à
leurs effecteurs appropries. Les proteines-G existent sous deux etats conformationnels,
lune active qui est liee au GTP et lautre inactive liee au GDP. Dans les cellules non
stimulees, le GTP est hydrolyse par lactivite GTPase et par consequent la forme liee
au GDP, inactive, predomine. Les recepteurs mis en jeu par les ligands augmentent la
vitesse de lechange GDP-GTP et, de ce fait, la quantite de proteine G activee, liee au
GTP. Les proteines-G qui nous interessent ici sont des heterotrimères composes dune
sous-unite , liant le GDP ou le GTP et dun complexe indissociable en milieu
physiologique. La sous-unite donne son identite à la proteine G. En liant le GTP,
cette sous-unite se dissocie du complexe et stimule selectivement les proteines
effectrices (voir figure 6.3)3 .
http ://www.123bio.net/revues/nzsurger/
- 108 -
Fig. 6.3 Cycle dactivation des recepteurs couples aux proteines-G
6.3.4
M
ecanismes mol
eculaires de la transduction et de la r
egulation du
signal olfactif
Comme on la vu dans le paragraphe 6.3.1, avec le concours des OBPs, les molecules
dodorants se fixent plus facilement sur le mucus de la muqueuse olfactive pour entrer en contact avec les recepteurs olfactifs. Chez les mammifères, une fois que les
recepteurs olfactifs fixent la molecule odorante, une cascade devenements (figure 6.4)
qui transforme lenergie de liaison chimique en un signal neuronal (cest-à-dire, un
changement du potentiel de membrane des neurones sensoriels olfactifs (OSNs)).
Cette cascade commence par lactivation de la proteine G par le complexe ligandrecepteur comme on la explique dans le paragraphe precedent. Cette dernière va
à son tour activer ladenylate cyclase qui catalyse la production du second messager intracellulaire lAMP cyclique (AMPc ) à partir de lATP intracellulaire. Cest ce
messager intracellulaire qui controle louverture des canaux ioniques notamment le
- 109 -

humain OR17-40
Fig. 6.4 Les mecanismes de transduction du signal olfactif
canal ionique permeable aux cations (Ca2+ , N a+ ). Ce flux dions Ca2+ et N a+ rend
le potentiel à linterieur de la cellule moins negatif. A laugmentation du calcium
intracellulaire suit une activation des canaux chlorure qui sont calcium-dependants.
Louverture du canal chlorure augmente la depolarisation du neurone. La transduction
est operee quand le courant recepteur devient generateur en induisant la naissance
dun ou plusieurs potentiels daction dans le segment initial de laxone [Hol97]. Le
potentiel daction est alors transmis au bulbe olfactif par lintermediaire des axones
à travers tout le circuit neuronal menant finalement à lidentification de lodeur.
6.3.5
Le r
ecepteur OR17-40
Les progrès importants realises ces dernières annees dans lexpression fonctionnelle des recepteurs olfactifs à la surface de la membrane plasmique de differentes cellules heterologues [RW98, WOW+ 99, MPG+ 05, LPG+ 03, MSSPA05] ont permis une
meilleure connaissance des mecanismes de lolfaction. Le système olfactif des vertebres
a une enorme puissance discriminatoire des odorants. Les humains, par exemple,
sont connus pour etre capables de faire la distinction entre des milliers de molecules
differentes dodeur. Meme des changements subtils dans la structure moleculaire dun
- 110 -
odorant peut mener à provoquer des changements dans lodeur percue [WOW+ 99].
En effet, dans le cas du recepteur olfactif humain OR 17-40, une analyse dune centaine dodorants differents a permis didentifier un seul composant comme etant le
seul agoniste efficace de ce recepteur : lhelional (figure 6.5).
Fig. 6.5 Structure chimique de lhelional
Une autre equipe (Jacquier et al.) sest aussi interessee à lanalyse des proprietes
structurales des molecules odorantes activant le recepteur OR 17-40 en examinant une
collection dune centaine de derives chimiques apparentes à lhelional. Ils ont pu ainsi
montrer que la presence dun groupement aldehyde relie à un anneau aromatique par
lintermediaire dune chane de 3 à 5 carbones semble essentielle pour la liaison au
recepteur OR 17-40 ; alors quun groupement methylique en position ou semble
etre necessaire pour son activation [Jac05].
Ainsi, dans ce chapitre on se propose de fixer la levure Saccharomyces cerevisiae avec le recepteur humain OR 17-40 exprime à sa membrane (comme decrit
dans [MPG+ 05]) sur les transducteurs conductimètriques en vue detudier la faisabilite dun biocapteur olfactif à cellules entières.
6.4
6.4.1
Mat
eriels et m
ethodes
Produits
Les produits utilises pour la preparation du milieu de culture ont ete approvisionnes chez differents fournisseurs :
Adenine, glucose et galactose chez Sigma ;
Yeast nitrogen base (YNB) chez Difco ;
- 111 -

humain OR17-40
Adenine, Synthetic drop-out CSM media without HIS, LEU, TRP, URA (CSMX) chez QBiogen ;
Acide lactique chez Fisher.
Lhelional est un don genereux de Givaudan-Roure (Dubendorf, Switzerland) ;
lheptanal (purete 95%) a ete commande chez Aldrich. Le dimethylsulfoxide (DMSO)
(purete 99%), la polylysine et la concanavaline A ont ete approvisionne chez Sigma.
6.4.2
Pr
eparation des milieux de Culture
Milieu A : 6,7 g YNB + 0,74 g CSM-X avec 950 mL eau ultrapure. On aliquote
le volume dans des petits flacons de 100 ou 200 mL puis on les autoclave ;
Milieu glucose : Milieu A + 40 mg/L adenine (à partir dune solution mère 20%)
+ 2% glucose (solution mère 20%) ;
Milieu lactate : Milieu A + 40 mg/L adenine + 3% lactate (solution mère 30%) ;
Milieu galactose : Milieu A + 40 mg/L adenine + 2% galactose (solution mère
20%).
Les solutions mères de glucose (20%), lactate (30%), galactose (20%) et adenine
(20%) sont preparees puis autoclavees.
6.4.3
Culture des levures
Le recepteur olfactif humain OR17-40 a ete fonctionnellement exprime dans la

souche MC18 de la levure S. cerevisiae comme decrit dans le travail de Minic et
al. [MPG+ 05]. Dautres levures exprimant le recepteur à la somatostatine (SSTR2)
ont aussi ete cultives pour etre immobilisees sur lelectrode de reference (dans les
mesures differentielles). La culture des levures se fait selon les etapes suivantes :
Culture 1 : on fait pousser les levures dans 2 mL de milieu glucose pendant 24
heures à 30C sous agitation à 200 rpm.
Centrifugation et lavage : les cultures sont centrifugees pendant 5 minutes à
4000 rpm puis lavees à leau ultrapure sterile deux fois afin deliminer toute
trace du milieu glucose.
Culture 2 : Les cellules sont ensuite incubees à 30C pendant 4 à 6 heures dans
2 mL de milieu lactate pour bien eliminer le glucose.
Centrifugation : on recentrifuge les cellules à 4000 rpm pendant 5 minutes.
- 112 -
Induction de lexpression des recepteur olfactifs : incubation dans 5 mL de milieu

galactose à 15C pendant 60 h pour avoir une densite optique (DO) à 600 nm
comprise entre 1 et 3.
A la fin de linduction, les levures sont conservees à -4o C.
6.4.4
Immobilisation des levures
Après centrifugation de la culture, on elimine le surnageant contenant le milieu de

culture et on recupère le culot cellulaire. On depose 0,7 L de la solution 0,1 % de
polylysine (figure 6.6), prealablement preparee, sur les deux electrodes (de reference
et de travail) ; sechage à lair pendant 15 minutes. Les electrodes sont ensuite lavees
delicatement 3 fois avec leau ultrapure. Apres leur sechage à lair, 0,7 L de levures
sont deposees sur chaque electrode (S. cerevisiae exprimant le recepteur SSTR2 sur
lelectrode de reference et S. cerevisiae exprimant le recepteur olfactif OR 17-40 sur
lelectrode de travail). Enfin, on laisse secher 20 min à lair.
Fig. 6.6 Structure chimique de la polylysine
Le depot dune double couche de polylysine a aussi ete teste. On suit les memes
etapes que precedemment avec à la fin ajout de 0,7 L de polylysine sur la couche de
levures. Une deuxième methode dimmobilisation faisait intervenir la concanavaline
A (1 mg/mL) au lieu de la polylysine suivant les memes etapes que pour la première
methode dimmobilisation.
- 113 -

humain OR17-40
6.4.5
Pr
eparation des solutions dodorant
Les solutions dhelional sont preparees frachement chaque jour de mesures. La

solution mère dhelional (101 M) est preparee en ajoutant 10 L de la solution
` partir de cette solution,
dhelional pur à 510 L de DMSO (dimethyl sulfoxide). A
3
une dillution (10 M) est directement preparee en diluant 10 L de la solution mère
(101 M) dans 990 L deau ultrapure. Les dilutions suivantes sont preparees par des
dilutions successives 1 :10 dans leau ultrapure.
6.5
6.5.1
R
Optimisation de limmobilisation
Comme decrit precedemment, nous avons essaye deux protocoles dimmobilisation

avec la polylysine : mono- et double-couche. Les resultats obtenus pour une concentration dhelional de 1013 M sont representes sur la figure 6.7.
4,0
Rponses pour 10
-13
M hlional
3,5
3,0
Rponse, S
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
--
1 couche polylysine
2 couches polylysine
Fig. 6.7 Optimisation de limmobilisation avec la polylysine
On observe une reponse de lordre de 34% de la reponse initiale (avec une seule
couche) suite à lajout dune couche de polylysine supplementaire. Ceci peut etre
explique par une moins bonne accessibilite des recepteurs olfactifs membranaires pour
la fixation de lodorant.
- 114 -
Limmobilisation avec la concanavaline A nayant pas donne des resultats satisfaisants, nous avons donc retenu la pre-fonctionnalisation de lelectrode avec la polylysine, comme methode dimmobilisation, pour toute la suite des mesures.
6.5.2
6.5.2.1
D
etection de lh
elional par le biocapteur olfactif
R
eponse en fonction du temps
La cinetique de la reponse du biocapteur avec les levures exprimant le recepteur

OR17-40 est presentee sur la figure 6.8. Lallure de la courbe montre une augmentation
rapide du signal suivie dune chute legèrement plus lente. Cette allure de courbe est
similaire à celle observee par Ko et al. avec un biocapteur fonctionnalise avec des
cellules embryonnaires humaines (HEK-293) exprimant le recepteur olfactif du rat
I7 [KP05]. Ainsi, la formation-dissociation du complexe ligand-recepteur fait varier
significativement la conductance à la surface de lelectrode. Le temps de reponse, très
court, est de lordre de 20 secondes.
5
-11
Avec 10 M hlional
Contrle sans hlional
Conductance, S
-1
-5
10
15
20
25
30
35
40
Temps, secondes
Fig. 6.8 Cinetique de la reponse du biocapteur avec les levures exprimant le recepteur
OR 17-40
On remarque egalement, quon obtient une legère reponse lors de lexperience de

- 115 -

humain OR17-40
controle (o`
u lhelional est remplace par leau ultrapure diluee dans le DMSO à un
taux de dilution egal à celui de lodorant). Ceci peut etre explique par le fait que la
membrane cellulaire peut adsorber une partie du solvant (adsorption non specifique).
6.5.2.2
R
eponse en fonction de la dose dodorant
Les reponses du capteur conductimetrique avec la levure exprimant le recepteur

OR17-40 à differentes concentrations dhelional allant de 1013 à 108 M sont presentees
sur la figure 6.9.
2,0
H-C = variation de conductance

= (rponse du biocapteur pour l'hlional) - (rponse du biocapteur pour le contrle)
1,8
1,6
1,4
(H-C), S
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1x10-14
1x10-13
1x10-12
1x10-11
1x10-10
1x10-9
1x10-8
Hlional, M
Fig. 6.9 Reponse en fonction de la concentration dodorant
On observe une reponse, en fonction de la concentration, en forme de cloche avec

un maximum de reponse autour de 1011 M dhelional. Au-delà de cette concentration
on a une diminution de la reponse jusquà 1010 M puis un second pic de reponse vers
108 M. Ces reponses diffèrent des courbes classiques de dosage qui generalement
se terminent par un palier de saturation [MDB+ 06]. Cependant ce phenomène a dejà
ete observe par Krautwurst et al. qui, en exprimant un recepteur chimerique dans les
cellules HEK293, ont observe des reponses moins importantes pour des concentrations
dodorant (octanal) de 1 et de 30 M que celle obtenue pour 10 M [KYR98]. Gomila
- 116 -
et al. ont, quant à eux, observe une chute dexpression vers 107 M pour le recepteur
I7 du rat [GCE+ 06]. De meme, Levasseur et al. ont trouve des resultats comparables
aux notres quand ils ont quantifie la reponse du recepteur olfactif humain OR17-40
chez les cellules ODORA suite à lexposition à differentes doses dhelional. En effet,
ils ont observe egalement un maximum pour 1011 M helional [LPG+ 03]. Ainsi, les
resultats de la detection de lhelional par le biocapteur conductimètrique à base de
cellules entières montrent bien son aptitude pour le suivi du phenomène biologique
de reconnaissance de lodorant par le recepteur olfactif specifique correspondant.
6.5.2.3
Etude
de la r
ep
etitivit
e des r
eponses
Après letude de la reponse du biocapteur en fonction de la dose de lodorant, on

sest interesse à la repetitivite des mesures. Pour cela, on a effectue deux mesures suite
à des additions successives de 108 M dhelional et une mesure, après 20 minutes de
repos, avec la meme concentration dodorant. Comme le montre la figure 6.10, une
perte denviron 26% du signal est observee entre deux ajouts successifs de la meme
concentration dhelional. Cette perte devient de 6% après un temps de repos de 20
minutes est attendu entre les deux mesures. Ainsi, il est necessaire de laisser un certain
intervalle de temps entre deux mesures pour permettre la relaxation du recepteur
après son changement de conformation suite à la fixation du ligand (odorant).
2,5
Rponses pour 10-8 M Hlional (H) ou contrle
Conductance, S
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Contrle
1er ajout H
2me ajout H
Successif au 1erajout
3me ajout H
aprs 20 min de repos
Fig. 6.10 Etude

de la repetitivite des mesures du biocapteur pour la detection de lodorant
- 117 -

humain OR17-40
Enfin, on a voulu mettre à lepreuve la selectivite du biocapteur conductimètrique

pour lodorant specifique du recepteur olfactif humain 17-40. Pour cela, on a compare
les reponses du biocapteur à lhelional avec celles obtenues suite à laddition dun odorant non specifique : lheptanal. Comme le montre la figure 6.11, on a une variation
de signal très faible pour lheptanal alors que la reponse est bien nette pour lodorant specifique (lhelional) ce qui montre bien que le biocapteur developpe permet de
suivre uniquement les phenomènes electriques dus à la fixation du ligand specifique
du recepteur olfactif humain OR17-40 exprime au niveau de la membrane cellulaire
de la levure Saccharomyces cerevisiae.
1,8
Contrle (C)
-8
10 hlional (H)
H-C
1,6
Conductance, S
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Heptanal
Hlional
Fig. 6.11 Selectivite du biocapteur pour lodorant specifique du recepteur olfactif humain
OR17-40
6.6
Ce chapitre a permis de montrer la faisabilite dun biocapteur olfactif pour la

detection de lhelional, à laide de levures S. Cerevisiae exprimant le recepteur olfactif
humain OR17-40 fixees sur un microtransducteur conductimetrique.
Le biocapteur ainsi developpe a montre une reponse quasi-instantanee (une dizaine
de secondes pour atteindre le maximum) à lhelional. La reponse en fonction de la
- 118 -
concentration de lodorant a montre une courbe en forme de cloche avec un premier

maximum de reponse autour de 1011 M dhelional puis un deuxième pic vers 108
M. Ce phenomène ayant dejà ete observe avec des tests directs (dosages calciques par
exemple) sur des cellules exprimant differents recepteurs olfactifs [KYR98, GCE+ 06,
LPG+ 03], on a pu conclure que le biocapteur conductimètrique permet bien de mimer
le phenomène biologique de fixation de lodorant par le recepteur olfactif specifique. De
plus, le biocapteur obtenu est bien selectif de lodorant ligand (helional) du recepteur
olfactif humain 17-40 puisquil a donne un signal très faible suite à lajout dun odorant
non specifique : lheptanal.
Ces resultats preliminaires ouvrent la voix à plusieurs perspectives. En effet, il
serait interessant delargir la gamme de dosage pour des concentrations plus elevees
dhelional. Dautres caracteristiques analytiques du biocapteur sont aussi à determiner
tels que la stabilite au cours du temps. Enfin, il faut noter que ce système pourrait etre
applique à dautres recepteurs olfactifs specifiques de certaines molecules odorantes
dinteret medical tels que le formaldehyde (cancer de la prostate) [SSH+ 99] ou encore
lhexanal et lheptanal (cancer des poumons) [LDY+ 05, DZL04].
- 119 -

humain OR17-40
- 120 -
Conclusion g
en
erale
et perspectives
De nos jours, les besoins en biocapteurs visant des applications specifiques sont
reels. Et cest pour repondre à certains de ces besoins que dans ce travail nous nous
sommes interesses au developpement de differents biocapteurs utilisant des transducteurs conductimetriques se basant sur deux reseaux delectrodes interdigitees pour
des mesures en mode differentiel permettant deviter les interferences non specifiques.
Dans un premier temps, avec la proteinase K comme biorecepteur, nous avons
developpe un biocapteur pour la detection des proteines dans les eaux naturelles
(comme indicateurs de la teneur en matière organique et donc de la pollution urbaine). Un travail doptimisation prealable a permis de determiner le temps dexposition à la vapeur de glutaraldehyde (20 minutes) pour une reponse optimale. Ensuite,
letude de leffet de la temperature sur la reponse du biocapteur a montre la capacite
du biocapteur à travailler à des temperatures basses (10o C) : paramètre important
pour son utilisation sur site (fluctuations de la temperature de leau selon les saisons). De plus, le biocapteur developpe à montre une stabilite elevee au cours du
temps (superieure à 1 mois) ainsi quune bonne reproductibilite (3,3%). Letude de la
reponse du biocapteur en fonction de la concentration de BSA (proteine de reference)
a montre une gamme lineaire de dosage, entre 0,8 à 6 mg/L (en adequation avec
les gammes moyennes de concentrations observees en milieu naturel), une limite de
detection denviron 0,5 mg/L BSA et un temps de reponse rapide (valeurs à lequilibre
atteints au bout de 7 à 8 minutes). Enfin, la confrontation des reponses du biocapteur, pour differents echantillons deaux de rivière de la region Lyonnaise, avec les
valeurs de carbone organique dissous et les teneurs en proteines determines par une
- 121 -
Conclusion generale et perspectives
methode colorimetrique classique (la microBCA protein Assay) ont montre de bonnes
correlations, preuves de la fiabilite du biocapteur conductimètrique dans le dosage des
proteines dans les eaux naturelles. En perspectives de ce travail, limmobilisation de
plusieurs proteases en meme temps sur les electrodes (par exemple ajout de la trypsine et de la pronase en plus de la proteinase K) pour essayer dameliorer encore les
caracteristiques analytiques du biocapteur (hydrolyse plus efficace de lensemble des
proteines) est envisagee. De plus, la preparation de ces biocapteurs à leur utilisation
sur site, en ajoutant une protection physique autour de la membrane enzymatique,
avec acheminement de lechantillon à laide dun système de pompes, sera etudiee par
une societe specialiste dans le developpement et la commercialisation de capteurs,
interessee par notre biocapteur à proteines.
Dans la partie suivante, nous nous sommes interesses au developpement dun biocapteur associant deux activite enzymatique : la -galactosidase et la glucose oxydase
et son application au dosage du lactose dans le lait. Le biocapteur obtenu presente
une gamme lineaire de reponse se situant entre 60 et 800 M, un temps de reponse
rapide (4 minutes) ainsi quune duree de vie superieure à une semaine. Ensuite, des
dosage du lactose dans des echantillons de lait commerciaux à laide de ce biocapteur
bi-enzymatique ont montre lefficacite de ce dernier pour le suivi de la concentration
de ce disaccharide.
Ces resultats montrant la reussite du suivi des effets de charge, resultant de la combinaison de lhydrolyse enzymatique du lactose par la -galactosidase avec loxydation
du glucose catalysee par la glucose oxydase, à laide des electrodes conductimètriques
ont ete appliques au dosage du selenite (element toxique à forte dose), en exploitant
une -gal induite dans les cellules bacteriennes de Herminiimonas arsenicoxydans par
la presence de selenite. En effet, un biocapteur conductimetrique hybride associant la
glucose oxydase, en tant que biorecepteur enzymatique, à une bacterie genetiquement
modifiee, qui exprime lactivite -galactosidase en presence de selenite, a ete developpe
pour la determination du selenite. Ce système original utilisant une enzyme et une
cellule entière a permis la quantification du selenite à des concentrations entre 7 et
39 ppm. La reussite du dosage du selenite à laide de ce biocapteur ouvre des voies
pour utiliser differents micro-organismes genetiquement modifies, contenant ce gène
reporter (gène Lac Z ), associes à ce transducteur conductimètrique pour la detection
dautres polluants. Les perspectives dautres mesures avec dautres formes oxydees du
- 122 -
selenium et des metaux lourds permettraient de mieux apprehender la selectivite de

ce biocapteur.
Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous nous sommes interesses au
developpement dun biocapteur olfactif se basant sur limmobilisation de levures S.
Cerevisiae genetiquement modifiees, exprimant le recepteur olfactif humain OR17-40.
La detection de lodorant à laide du biocapteur ainsi developpe a ete montree avec
une reponse quasi-instantanee (une dizaine de secondes) à lhelional. La reponse en
fonction de la concentration de lodorant a montre une courbe en forme de cloche avec
des maximums de reponse autour de 1011 et 108 M dhelional. Par ailleurs, letude
de la specificite du biocapteur pour lodorant specifique du recepteur olfactif 17-40 a
montre sa selectivite. Ces resultats preliminaires ouvrent la voix à plusieurs perspectives notamment pour lapplication de ce type de mesures conductimètriques associes
à des cellules exprimant differents recepteurs olfactifs pour le suivi de differentes
molecules odorantes dinteret medicale, pharmaceutique ou agro-alimentaire.
- 123 -
- 124 -
Annexe A
Dosage des prot

eines par la
m
ethode BCA (BCA Protein
Assay Kit)
Le reactif est constitue dacide bicinchoninique (BCA) et dions cuivriques
en milieu alcalin. Les ions cuivreux generes par reduction par les proteines forment
avec le BCA un complexe stable et intensement colore (max = 562 nm). Cest une
methode sensible et rapide qui resiste aux detergents comme le Triton ou le SDS.
Principe
R
eactifs
Le reactif de travail BCAT M : Le melange extemporane (50 :1, Reactif A :B)

est constitue de : 50 volumes de reactif A (solution de carbonate de sodium,
bicarbonate de sodium, acide bicinchoninique et tartrate de sodium dans NaOH
0,1 M) + 1 volume de reactif B (sulfate de cuivre 4%).
BSA : BSA à 2 mg/mL en 0,9% NaCl et 0,05% azide sodium.

Etalon
Pipette multicanale Biohit.
eau ultra pure (H2 Oup ).
Mat
eriel
Plaque microtitration (96 puits)

Pipetmans P20, P100
- 125 -
Annexe A. Dosage des proteines par la methode BCA (BCA Protein Assay Kit)
Pipette multicanal Biohit (1000 L)

Reservoir à reactif
Lecteur de plaques ; Thermomax microplate reader (B. Braun, Science Tec)
en microplaques de 96 puits : 3 puits
pour chaque concentration de BSA ont ete prepares : blanc, 0, 25, 50, 75, 100, 150,
200 et 400 mg/L.
Pr
eparation de la gamme standard BSA
La microplaque sera rempli comme suit :

10 L par puits H2 Oup pour le blanc
10 L par puits chaque point de la gamme etalon
10 L par puits echantillon deau pur et dilue.
Ensuite, 190 L de reactif de travail BCA sont ajoutes dans chaque puits. Puis
incubation de la plaque 30 min à 37o C à letuve. Enfin, lecture de la densite optique
(DO) à 540 nm.
- 126 -
Annexe B
Liste des publications et

communications scientifiques
B.1
Revues internationales
M. Marrakchi, F. Lagarde, M-C. Lett, D. Lièvremont, C. Martelet, N. JaffrezicRenault, Feasibility of a conductometric hybrid biosensor using heavymetal resistant bacterium and glucose oxidase for selenium detection,
Biosensors and Bioelectronics, soumis.
M. Marrakchi, J. Vidic, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, E. Pajot, New olfactory biosensor system based on interdigitated microelectrodes and
immobilized yeasts expressing the human receptor OR17-40, European
Biophysics Journal, soumis.
M. Marrakchi, S.V. Dzyadevych, F. Lagarde, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault,
Conductometric biosensor based on glucose oxidase and beta-galactosidase
for specific lactose determination in milk, Materials Science and Engineering C, accepte.
M. Marrakchi, S.V. Dzyadevych, Ph. Namour, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault,
An enzyme biosensor based on gold interdigitated thin film electrodes
- 127 -
Annexe B. Liste des publications et communications scientifiques
for water quality control, Analyticals Letters, accepte.

M. Marrakchi, S.V. Dzyadevych, O.A. Biloivan, C. Martelet, P. Temple, N.
Jaffrezic-Renault, Development of trypsin biosensor based on ion sensitive field-effect transistors for proteins determination, Materials Science
and Engineering C 26 (2006) 369-373.
A novel proteinase k biosensor based on interdigitated conductometric electrodes for proteins determination in rivers and sewers water,
Sensors and Actuators B 111-112 (2005) 390-395.
M.L. Hamlaoui, R. Kherrat, M. Marrakchi, N. Jaffrezic-Renault, A. Walcarius,
Development of an ammonium ISFET sensor with a polymeric membrane including zeolite, Materials Science and Engineering C 21 (2002) 25-28.
M.L. Hamlaoui, K. Reybier, M. Marrakchi, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, R.
Kherrat, A. Walcarius, Development of a urea biosensor based an a polymeric membrane including zeolite, Analytica Chimica Acta 466 (2002)
39-45.
B.2
Conf
erences internationales
M. Marrakchi, F. Lagarde, M-C Lett, D. Lièvremont, C. Martelet, N. JaffrezicRenault, Faisabilit

e dun biocapteur hybride utilisant une bact
erie r
esistante
aux m
etaux lourds et la glucose oxydation pour la d
etection du s
el
enium,
communication orale, 5èmes journees Maghreb-Europe sur les materiaux et leurs
applications aux dispositifs et capteurs, MADICA 2006, Mahdia, Tunisie, 30 octobre - 1er novembre 2006.
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Annexe B. Liste des publications et communications scientifiques
B.3
Conf
erences nationales
M. Marrakchi, F. Lagarde, M-C Lett, D. Lièvremont, C. Martelet, N. JaffrezicRenault, Faisabilit

e dun biocapteur conductim
etrique hybride utilisant une bact
erie r
esistante aux m
etaux lourds et de la glucose oxydase pour la d
etection du s
el
enium, communication orale, 19èmes entretiens Jacques Cartier : Nanobiotechnologies pour lanalyse et la conversion
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- 144 -
Liste des figures

1.1
Pluridisciplinarite du domaine des biocapteurs . . . . . . . . . . . . .
1.2
Representation schematique dun biocapteur . . . . . . . . . . . . . .
1.3
Representation schematique des transistors MOSFET et ISFET . . .
16
1.4
A gauche : photo au microscope electronique de la zeolithe ; A droite :

schema de la structure spatiale de la zeolithe . . . . . . . . . . . . . .
16
Photo du transducteur ISFET avec vue au microscope optique de la

partie sensible avec la membrane enzymatique deposee . . . . . . . .
17
1.6
Representation schematique des differents biorecepteurs . . . . . . . .
23
1.7
Schema explicatif du mecanisme moleculaire implique lors de lhydrolyse proteique catalysee par les proteases à serine . . . . . . . . . . .
29
Representation schematique du fonctionnement dun biocapteur enzymatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
(a) Determination des constantes michaeliennes (b) Representation en

double inverse de Lineweaver et Burek . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
1.10 Representation schematique des differentes methodes dimmobilisation

de lelement biologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.11 Les structures de GA dans une solution acqueuse . . . . . . . . . . .
38
1.12 Les reactions de differentes formes de GA avec les enzymes . . . . . .
39
2.1
Migration des ions dans la solution et conductivite de lelectrolyte . .
44
2.2
Photo des bandes interdigitees prise en microscopie optique . . . . . .
46
1.5
1.8
1.9
- 145 -
LISTE DES FIGURES
2.3
Les Electrodes
interdigitees
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
2.4
Photo du capteur conductimètrique en platine . . . . . . . . . . . . .
48
2.5
Vue generale des microelectrodes interdigitees en Or . . . . . . . . . .
48
2.6
Modèle de circuit equivalent de limpedance dinterface . . . . . . . .
51
2.7
Modèle de circuit equivalent des electrodes interdigitees . . . . . . . .
51
2.8
Diagramme dimpedance du montage conductimètrique . . . . . . . .
52
2.9
Montage de la mesure conductimètrique . . . . . . . . . . . . . . . .
54
2.10 Photo du lock-in Amplifier SR 510 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
2.11 Vue Generale du dispositif de mesure conductimetrique . . . . . . . .
55
3.1
Representation schematique de lhydrolyse catalysee par la proteinase K 61
3.2
Effet du temps dexposition à la vapeur de glutaraldehyde sur la reponse

du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
3.3
Effets du sel (a) et de la temperature (b), sur le reponse du biocapteur
63
3.4
Etude
de la stabilite du biocapteur au cours du temps . . . . . . . . .
64
3.5
(a) Reponse typique en fonction du temps du biocapteur à proteines

(b) Courbe de calibrage du biocapteur en fonction de la concentration
de BSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
3.6
Etude de la reproductibilite du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . .
65
3.7
(a) Test de leffet de leau sur la reponse du biocapteur (b) Comparaison

de la reponse du biocapteur avec les valeurs donnees par la microBCA
66
3.8
Courbe de calibration de la BSA avec les electrodes interdigitees en or
68
3.9
Comparaison de la reponse du biocapteur avec les valeurs de COD . .
69
3.10 Comparaison de la reponse du biocapteur avec les valeurs donnees par

la microBCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
4.1
Reactions enzymatiques catalysees par la -galactosidase et la glucose

oxydase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- 146 -
77
LISTE DES FIGURES
4.2
Representation schematique des etapes dimmobilisation des deux enzymes sur le transducteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
Reponse typique en fonction du temps du biocapteur après ajout du

lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
(a) Reponse du biocapteur en fonction de la concentration de lactose

(b) Gamme lineaire de calibration du lactose . . . . . . . . . . . . . .
80
4.5
Evolution
de la reponse du biocapteur au cours du temps . . . . . . .
80
4.6
Reponse en fonction du temps pour le lactose et le glucose (a) du biocapteur sans la Gox dans la membrane de reference (b) du biocapteur
avec la Gox dans la membrane de reference . . . . . . . . . . . . . . .
81
Determination de la concentration de lactose dans des echantillons de

laits commerciaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
4.3
4.4
4.7
5.1
Photo de lappareil incubateur-agitateur utilise pour la culture bacterienne 91
5.2
Representation schematique des differentes etapes de la procedure dimmobilisation de la GOD et de la bacterie . . . . . . . . . . . . . . . .
92
5.3
Image de lelectrode de travail observee au MEB . . . . . . . . . . . .
93
5.4
Reponse typique du biocapteur en fonction du temps après ajout du

lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
Courbe de calibration du lactose avec le biocapteur incube pendant 90

heures en presence de 0,5 mM de selenite . . . . . . . . . . . . . . . .
95
Comparison des reponses du biocapteur temoin avec le biocapteur incube en presence de differentes concentrations de Se . . . . . . . . .
95
Determination de la concentration de lactose à ajouter pour une sensibilite optimale du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
Comparaison des reponses du biocapteurs selon le mode dexposition

au selenite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
Courbe de calibrage par la methode de pre-exposition pour la determination

du selenite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
- 147 -
LISTE DES FIGURES
6.1
Representation schematique dune coupe depithelium olfactif de vertebre106
6.2
Schema representatif de la structure des recepteurs couples aux proteinesG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
6.3
Cycle dactivation des recepteurs couples aux proteines-G . . . . . . . 109
6.4
Les mecanismes de transduction du signal olfactif . . . . . . . . . . . 110
6.5
Structure chimique de lhelional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.6
Structure chimique de la polylysine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.7
Optimisation de limmobilisation avec la polylysine . . . . . . . . . . 114
6.8
Cinetique de la reponse du biocapteur avec les levures exprimant le

recepteur OR 17-40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.9
Reponse en fonction de la concentration dodorant . . . . . . . . . . . 116
6.10 Etude
de la repetitivite des mesures du biocapteur pour la detection
de lodorant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
6.11 Selectivite du biocapteur pour lodorant specifique du recepteur olfactif
humain OR17-40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
- 148 -
Liste des tableaux

1.1
Les transducteurs electrochimiques et les methodes de mesure correspondantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
1.2
Donnees sur le developpement de differents biocapteurs conductimètriques 19
1.3
Quelques exemples de biocapteurs à base de microorganismes . . . . .
- 149 -
35
LISTE DES TABLEAUX
- 150 -
Table des mati`

eres
Remerciements
iii
R
esum
e
vii
Introduction g
en
erale
1 Les biocapteurs
1.1
1.2
Generalites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2
Definition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3
Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4
Classification des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
1.1.5
Caracteristiques des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Les transducteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.2.1
Les transducteurs electrochimiques . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.2.1.1
Les transducteurs amperomètriques . . . . . . . . . .
11
1.2.1.2
Les transducteurs impedancemetriques (ou impedimetriques) 13
1.2.1.3
Les transducteurs potentiometriques . . . . . . . . .
14
1.2.1.4
Les transducteurs conductimetriques . . . . . . . . .
18
Les transducteurs optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.2.2
- 151 -
`
TABLE DES MATIERES
1.3
1.2.3
Les transducteurs piezoelectriques . . . . . . . . . . . . . . . .
21
1.2.4
Les transducteurs thermiques . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Les biorecepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
1.3.1
Les anticorps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
1.3.2
Les recepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
1.3.3
Les acides nucleiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.3.4
Les cellules animales et vegetales . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.5
Les tissus vegetaux ou animaux . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.6
Les enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
1.3.6.1
Les proteases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
1.3.6.2
La proteinase K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
1.3.6.3
Capteurs enzymatiques . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
1.3.6.4
Influence du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
1.3.6.5
Influence de la temperature . . . . . . . . . . . . . .
34
Les microorganismes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
1.3.7
1.4
1.5
Les methodes dimmobilisation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.4.1
Emprisonnement physique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
1.4.2
Adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
1.4.3
Liaison covalente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
1.4.4
Reticulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
1.4.4.1
La reticulation au glutaraldehyde . . . . . . . . . . .
38
Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
2 Les micro
ees et les mesures conductim`
etriques 43
2.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2.2
Principe General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
- 152 -
`
TABLE DES MATIERES
2.3
Les microelectrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
2.3.1
Fabrication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
2.3.2
Les microelectrodes utilisees . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
2.3.2.1
Les microelectrodes interdigitees en platine
. . . . .
47
2.3.2.2
Les microelectrodes interdigitees en Or . . . . . . . .
48
Nettoyage des electrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
Caracterisation des electrodes interdigitees . . . . . . . . . . . . . . .
49
2.4.1
Limpedance à linterface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
2.4.2
Model de circuit equivalent des electrodes interdigitees . . . .
51
Deroulement des mesures avec les microelectrodes . . . . . . . . . . .
53
2.5.1
Montage experimental des mesures conductimètriques . . . . .
53
2.5.2
Conditions de mesure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
2.3.3
2.4
2.5
2.6
3 D
eveloppement dun biocapteur conductim
des prot
eines dans les eaux naturelles
59
3.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
3.2
Materiels et methodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.2.1
Materiels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.2.2
Immobilisation de lenzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
3.2.3
Stockage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
3.2.4
Preparation des echantillons deaux naturelles . . . . . . . . .
61
Developpement et optimisation du biocapteur . . . . . . . . . . . . .
62
3.3.1
Conditions optimales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
3.3.2
Caracteristiques analytiques du biocapteur obtenu . . . . . . .
64
3.3.3
Tests preliminaires sur des echantillons deau . . . . . . . . . .
66
3.3
- 153 -
`
TABLE DES MATIERES
3.4
3.5
Application du biocapteur à proteinase K immobilisee au controle de

la qualite de leau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
3.4.1
Verification des caracteristiques du biocapteur . . . . . . . . .
67
3.4.2
Application à lanalyse des eaux de rivières . . . . . . . . . . .
68
3.4.2.1
Comparaison avec le carbone organique total (COD)
69
3.4.2.2
Comparaison avec la concentration en proteines totales determinee par la methode classique microBCA
69
Conclusions et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
4 D
eveloppement dun biocapteur conductim`
du lactose dans le lait
75
4.1
Contexte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.2
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
4.3
76
4.3.1
Materiels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
4.3.2
Immobilisation des enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
4.3.3
Stockage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
4.3.4
Preparation des echantillons de lait . . . . . . . . . . . . . . .
78
Resultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
4.4.1
Dosage du lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
4.4.2
Etude
de la stabilite du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . .
80
4.4.3
Etude
des eventuelles interferences avec le glucose . . . . . . .
81
4.4.4
Dosage du lactose dans le lait . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
83
4.4
4.5
5 D
eveloppement dun biocapteur conductim`
etrique hybride `
a base de
bact
erie mutante et de glucose oxydase pour la d
etection du s
el
enite 87
5.1
Contexte et motivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- 154 -
87
`
TABLE DES MATIERES
5.2
5.3
89
5.2.1
Reactifs utilises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
5.2.2
Caracteristiques de la souche bacterienne . . . . . . . . . . . .
90
5.2.3
Culture bacterienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
5.2.4
Immobilisation des enzymes puis des bacteries . . . . . . . . .
92
5.2.5
Exposition des bacteries au selenium . . . . . . . . . . . . . .
93
Resultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
5.3.1
Tests preliminaires et etudes des caracteristiques analytiques

du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
Effets de la concentration en lactose utilisee sur la sensibilite

du biocapteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
Comparaison des reponses du biocapteur obtenues selon le mode

dexposition au selenium adopte . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
Dosage du selenite après optimisation . . . . . . . . . . . . . .
98
99
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.4
6 Faisabilit
e dun biocapteur olfactif `
a base de levures exprimant le
r
ecepteur humain OR17-40
103
6.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
6.2
Contexte et motivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
6.3
Les recepteurs olfactifs et la perception de lodeur . . . . . . . . . . . 105

6.3.1
Presentation generale du système olfactif . . . . . . . . . . . . 105
6.3.2
Structure des recepteurs olfactifs . . . . . . . . . . . . . . . . 107
6.3.3
Activation des recepteurs couples aux proteines G et la transmission du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.3.4
Mecanismes moleculaires de la transduction et de la regulation

du signal olfactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
6.3.5
Le recepteur OR17-40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

- 155 -
`
TABLE DES MATIERES
6.4
6.5
6.6
Materiels et methodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.4.1
Produits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.4.2
Preparation des milieux de Culture . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.4.3
Culture des levures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.4.4
Immobilisation des levures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.4.5
Preparation des solutions dodorant . . . . . . . . . . . . . . . 114
Resultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

6.5.1
Optimisation de limmobilisation . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.5.2
Detection de lhelional par le biocapteur olfactif . . . . . . . . 115

6.5.2.1
Reponse en fonction du temps . . . . . . . . . . . . . 115
6.5.2.2
Reponse en fonction de la dose dodorant
6.5.2.3
Etude
de la repetitivite des reponses . . . . . . . . . 117
. . . . . . 116
Conclusions et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Conclusion g
en
erale et perspectives
121
Annexes
124
A Dosage des prot

eines par la m
ethode BCA (BCA Protein Assay Kit)125
B Liste des publications et communications scientifiques
127
B.1 Revues internationales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

B.2 Conferences internationales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
B.3 Conferences nationales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
Bibliographie
131
Liste des figures
148
- 156 -
`
TABLE DES MATIERES
Liste des tableaux
149
Table des mati`

eres
157
- 157 -

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N dordre : 2006-37

de lEcole Centrale de Lyon

presentee et soutenue publiquement par

(Professeur, UCBL, Lyon)

` la memoire de mes grands-p`eres

Un merci special `a Sergei qui ma initie au monde des biocapteurs conductimetriques

pas delectrodes de reference et ne sont pas sensibles `a la lumi`ere (comme certains

Classification des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Caracteristiques des biocapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les transducteurs electrochimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les transducteurs optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les transducteurs piezoelectriques . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les transducteurs thermiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les acides nucleiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les cellules animales et vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les tissus vegetaux ou animaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Au cours des 20 derni`eres annees, la recherche et le developpement dans le domaine

Chapitre 1. Les biocapteurs

domaines. En effet,au niveau de lenvironnement et de lagriculture, les biocapteurs

Fig. 1.1 Pluridisciplinarite du domaine des biocapteurs

(plus de 16 millions de diabetiques aux Etats-Unis

Fig. 1.2 Representation schematique dun biocapteur

Chapitre 1. Les biocapteurs

Classification des biocapteurs

1.2. Les transducteurs

3. Reproductibilite : cest parmi les param`etres les plus importants. Il indique la

La combinaison dun biorecepteur et dun transducteur devrait deboucher sur

Dans les syst`emes de transduction electrochimiques, les mesures peuvent etre

Les transducteurs amp

Lamperometrie est une technique qui repose sur la determination de lintensite

Chapitre 1. Les biocapteurs

Tab. 1.1 Les transducteurs electrochimiques et les methodes de mesure correspondantes

Les biocapteurs amperometriques consistent generalement en une electrode dont

1.2. Les transducteurs

2. Les biocapteurs de seconde generation emploient un mediateur permettant le

Les transducteurs imp

Chapitre 1. Les biocapteurs

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Les transducteurs potentiom

1.2. Les transducteurs

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Chapitre 1. Les biocapteurs

Fig. 1.3 Representation schematique des transistors MOSFET et ISFET

Fig. 1.4 A gauche : photo au microscope electronique de la zeolithe ; A droite : schema

1.2. Les transducteurs

Sur la base de ce capteur contenant la zeolithe, un biocapteur pour le dosage de

Chapitre 1. Les biocapteurs

mercures avec une limite de detection de 5.108 M [HRM+ 02].

Les transducteurs conductim

La conductimetrie est une technique de mesure electrochimique alternative aux

1.2. Les transducteurs

des reactions enzymatiques faisant varier la nature et/ou le nombre de porteurs de

Tab. 1.2 Donnees sur le developpement de differents biocapteurs conductim`etriques

Les transducteurs optiques

Lav`enement des fibres optiques a ouvert de nouvelles voies de recherche dans le

Chapitre 1. Les biocapteurs

1.2. Les transducteurs

(proteines, acides nucleiques, glycoproteines, etc.) dans un milieu hydrophile [TL96].

Le phenom`ene de piezoelectricite se manifeste par lapparition dune polarisation

Chapitre 1. Les biocapteurs

Les transducteurs thermiques

Linteret de la mise en oeuvre des capteurs enthalpimetriques resulte du fait que