Manuscrit Jrad Mayssa VF de Soutenance 09 02 2024

Mémoire de Stage de Fin d'Étude
En vue de l’obtention du Diplôme du Master de Recherche en
Génétique et Immunologie
Préparé au sein du Laboratoire de Transmission, Contrôle

et Immunobiologie des Infections
Étude de la réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2

chez les patients immunodéficients
Présenté par
JRAD Mayssa
Année Universitaire 2022-2023
Soutenu publiquement
devant le Jury composé de :
Pr. Asma Gati Professeur en Immunologie, Faculté des Sciences de Tunis Présidente
Maître Assistante en Immunologie, Faculté des Sciences de

Dr. Rym Bouhaha Examinatrice
Tunis
Maître de Conférences Agrégé en Immunologie, Institut

Pr.Ag. Najla Mekki Encadrante
Pasteur de Tunis
Dédicaces
À ma chère famille et mes chers amis,
Ce travail de mémoire est le fruit de nombreuses heures de travail, de recherche et d'efforts. Tout au
long de ce parcours académique, vous avez été une source inestimable de soutien, d'encouragement et
de réconfort.
À l'âme de mon cher grand père bien-aimé,
En dédiant ce travail à votre mémoire, je souhaite honorer votre impact durable sur ma vie et exprimer
ma gratitude éternelle pour tout ce que vous avez fait pour moi.
À ma chère grande mère,
En témoignage de l'amour, de l'inspiration et du soutien inestimables que vous m'avez apportés tout au
long de ma vie et de mon parcours académique, je vous dédie ce travail. Votre présence douce et
bienveillante a toujours été un phare dans ma vie, m'éclairant dans les moments sombres et me guidant
vers la réussite. Que cette dédicace puisse refléter l'amour profond et la gratitude que je ressens envers
vous.
À mes chers parents,
Qui avez toujours cru en moi et en mes rêves, je dédie ce travail. Vous êtes les piliers de ma vie, les
guides qui ont illuminé mon chemin depuis le premier jour. Votre amour inconditionnel, votre soutien
indéfectible et vos sacrifices sans fin ont façonné la personne que je suis aujourd'hui. Dans chaque
moment, que ce soit de joie ou de difficulté, vous avez été là pour moi. Votre présence réconfortante et
vos conseils avisés ont été mes plus grands atouts. Votre amour et votre dévouement sont des trésors
que je chérirai pour toujours.
À ma chère sœur,
Je tiens à exprimer ma sincère gratitude envers ma sœur pour son soutien inestimable tout au long du
processus de réalisation de cette mémoire. Sa contribution précieuse a été un élément essentiel de ce
parcours académique. Merci du fond du cœur pour ton soutien indéfectible.
À mes petits frères,
Cette mémoire est dédiée à vous, mes rayons de soleil constants dans ma vie. Votre présence
dynamique et vos sourires contagieux ont illuminé chaque étape de ce parcours académique.
À ma soleil brillante, Nour,
Ce mémoire est bien plus qu'une simple compilation de faits et de recherches ; il est le reflet de notre
amitié exceptionnelle. À toi, qui a éclairé chaque étape de ce parcours avec ta lumière, je dédie ces
pages remplies d'efforts, de passion, et de détermination. Ta positivité contagieuse a dissipé les nuages
sombres, ta présence constante a transformé les défis en opportunités, les moments difficiles en leçons,
et les victoires en célébrations partagées. Merci d'être le rayon de soleil constant dans mes journées et
dans cette aventure académique.
À ma chère, Wissal,
Ce stage m'a offert un cadeau inestimable : ton amitié. Je suis profondément touchée par cette
opportunité qui nous a permis de renforcer nos liens et de partager des moments précieux ensemble.
Merci infiniment pour ton soutien constant et ta présence bienveillante.
À mes amis : Jihen, Lotfi et Vall,
Qui ont partagé ce voyage avec moi, je vous remercie du fond du cœur pour les moments agréables
passés ensemble. Votre amitié, vos encouragements et nos moments de détente bien mérités ont
contribué à rendre cette expérience encore plus enrichissante.
Remerciements
Je souhaite exprimer ma profonde gratitude envers les personnes qui ont joué un rôle essentiel dans la
réalisation de ce travail de recherche :
Tout d'abord, je tiens à remercier sincèrement Professeur Semia Menif, Directrice Générale de l'Institut
Pasteur de Tunis, pour m'avoir offert la précieuse opportunité de collaborer au sein de cette institution
de renommée.
Mes remerciements les plus chaleureux vont au Pr. Dhafer Laouini, Professeur d'Immunologie et
directeur du Laboratoire de Transmission, Contrôle et Immunobiologie des Infections (LTCII -
LR16IPT) à l'Institut Pasteur de Tunis.
Je souhaite également exprimer ma profonde reconnaissance envers mon encadrante, le Pr.Ag. Najla
Mekki, pour avoir accepté de superviser ce travail avec une grande patience et pour son rôle fondamental
dans la réussite de ce projet. Sa guidance et son mentorat resteront des éléments majeurs de mon parcours
académique et professionnel, et je suis honorée d'avoir eu l'opportunité de travailler avec une personne
d'une telle envergure. Sa présence inestimable dans les moments difficiles a été une source de réconfort
et d'inspiration. Elle a consacré généreusement de son temps, offrant une assistance précieuse qui a
grandement contribué à la réalisation de ce travail. Son engagement constant et sa disponibilité ont été
des atouts essentiels dans les moments de challenge. Merci du fond du cœur.
Ma reconnaissance s'étend également à Pr. Imen Ben Mustapha, Professeur d'Immunologie à la Faculté
de Médecine de Tunis et Chef de Service du Laboratoire de Cyto-Immunologie à l’Institut Pasteur de
Tunis. Je lui suis reconnaissante pour son accueil au sein de son Laboratoire et son suivi attentif de
l'avancement de mon travail.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance envers tous les membres du Laboratoire LTCII, notamment Dr
Tira Meriem, Dr. Ben Ali Meriem, Dr. Ben Abdassalam Chaouki, Dr. Ben Ahmed Melika, Dr. Belghith
Meriem, et Dr. Essafi Makrem, pour leur soutien, leurs encouragements et l'atmosphère conviviale qui
règne au sein de notre Laboratoire. Un remerciement particulier s'adresse à Dr. Ben Abdassalam
Chaouki pour sa collaboration exceptionnelle. Sa contribution précieuse a grandement enrichi notre
travail et a été un pilier essentiel de notre succès.
Je tiens également à exprimer ma profonde gratitude envers Madame Guizani Lamia pour sa
bienveillance et sa générosité intellectuelle. Les moments passés au sein de son Laboratoire resteront
gravés dans ma mémoire comme une période où j'ai pu bénéficier de ses conseils éclairés et de son
soutien inestimable. Elle a créé un environnement stimulant en nous aidant et en nous encourageant à
continuer jusqu'à atteindre nos buts. Merci beaucoup, Madame, pour tout ce que vous avez fait pour
nous.
Je n'oublie pas de mentionner tous les membres du Laboratoire de Cyto-Immunologie de l'Institut

Pasteur de Tunis, en particulier Mme Beya Largueche, Amira Essafi, Arbia Arfaoui et Jaweher, pour
leur assistance.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance infinie envers ma collègue exceptionnelle, Wafa Ben Hammouda,
qui a joué un rôle essentiel dans la réalisation de ce projet. Bien plus qu'une collègue, elle a été ma super-
héroïne, ma magicienne. Sa capacité à fournir efficacement et rapidement tout ce dont j'avais besoin a
été remarquable. Sa disponibilité, sa générosité et sa capacité à anticiper et répondre à chacune de mes
demandes ont été inestimables. Sans son appui indéfectible, je n'aurais pas pu franchir chaque étape de
ce projet avec succès. Sa contribution immense et son dévouement ont véritablement été le pilier de
cette réalisation. Merci du fond du cœur, Wafa, d'être ma magicienne, fournissant chaque élément
nécessaire avec une expertise et une grâce exceptionnelle.
De même, je remercie mes collègues du LTCII pour leur soutien, aide et leurs conseils, en particulier :
Zammeli Amal, Mosleh Wassim, Laamari Rafika et Bouzakoura Firas.
Mes sincères remerciements aux cliniciens pédiatres particulièrement Dr Ilhem Ben Fradj et Dr Ayari
ainsi qu'à mes collègues du Laboratoire de Virologie Clinique de L’IPT, dont la collaboration a été
précieuse pour la réalisation de ce projet.
Enfin, mes remerciements vont également aux patients, à leurs familles et aux témoins pour leur
généreuse contribution à ce projet de mémoire. Votre engagement a été essentiel et a profondément
enrichi cette étude. Merci infiniment.
Merci à tous pour votre précieuse contribution à ce travail de recherche.

Sommaire
LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................................... 2
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................ 5
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................................... 8
AVANT PROPOS ................................................................................................................................. 10
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ..................................................................................................... 13
1. SARS-CoV-2 ............................................................................................................................. 13
1.1. Caractéristiques virologiques du SARS-CoV-2 ................................................................ 13
1.1.1. Structure générale du SARS-CoV-2 .......................................................................... 13
1.1.2. Structure génomique et variabilité génétique ............................................................ 15
1.1.3. Récepteurs cellulaires du SARS-CoV-2 .................................................................... 16
1.1.4. Cycle de multiplication du SARS-CoV-2 ................................................................. 17
1.2. Réponse immunitaire anti-SARS-CoV-2 .......................................................................... 18
1.2.1. Réponse immunitaire innée anti-SARS-CoV-2 ......................................................... 18
1.2.2. Réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2 ................................................. 20
1.2.3. Tempête cytokinique au cours de la COVID-19 ....................................................... 22
1.3. Vaccination anti-SARS-CoV-2 ......................................................................................... 22
2. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS ............................................................................... 23
3. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS ET COVID-19 ...................................................... 24
3.1. Caractéristiques cliniques de la COVID-19 chez les patients immunodéficients ............. 24
3.2. Susceptibilité génétique aux formes sévères de la COVID-19 .......................................... 27
OBJECTIFS DU TRAVAIL ................................................................................................................. 31
COHORTES ET MÉTHODES ............................................................................................................. 34
1. Cohortes..................................................................................................................................... 34
1.1. Témoins ............................................................................................................................. 34
1.1.1. Témoins immunocompétents prélevés au cours de la période pré-endémique ......... 34
1.1.2. Témoins immunocompétents vaccinés ...................................................................... 34

1.2. Patients ayant un déficit immunitaire primitif confirmé.................................................... 34
1.3. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19 ................................................ 35
1.4. Kits et peptides du SARS-CoV-2 ...................................................................................... 36
2. MÉTHODES ............................................................................................................................. 36
2.1. Étude de la réponse immune humorale anti-SARS-CoV-2 ................................................... 36
2.2. Étude de la réponse immune cellulaire anti-SARS-CoV-2 ................................................... 37
2.2.1. Isolement des cellules mononuclées du sang périphérique ....................................... 38
2.2.2. Congélation des cellules mononucléées du sang périphérique .................................. 39
2.2.3. Décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique congelées ............. 39
2.2.4. Stimulation in vitro des cellules mononucléées du sang périphérique ...................... 39
2.2.5. Dosage de l’interféron-γ ............................................................................................ 40
2.2.6. Test QuantiFERON® anti-SARS-CoV-2 .................................................................. 42
2.3. Analyse statistique ............................................................................................................. 44
3. CONSIDÉRATIONS ÉTHIQUES ET CONFLITS D'INTÉRÊTS........................................... 44
RÉSULTATS ........................................................................................................................................ 46
1. DESCRIPTION GLOBALE DES SUJETS ÉTUDIÉS............................................................. 46
1.1. Patients ayant un déficit immunitaire primitif confirmé.................................................... 46
1.2. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19 ................................................ 47
2. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE HUMORALE ............................................................. 49
2.1. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins vaccinés .................................................. 49
2.2. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins pré-endémiques ...................................... 49
2.3. Sérologie anti-SARS-CoV-2 chez les patients DIPs/COVID-19 ...................................... 50
2.3.1. Analyse des résultats obtenus en T0 .......................................................................... 50
2.3.3. Analyse comparative des résultats obtenus en T0 et T1 ............................................ 52
2.4. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les enfants ayant présenté des formes sévères de la
COVID-19 ........................................................................................................................................ 53
3. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE CELLULAIRE ........................................................... 54
3.1. Etude de la réponse cellulaire chez les témoins pré-endémiques ...................................... 55

3.2. Etude de la réponse immune cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19 ....................... 55
3.2.1. Analyse comparative des résultats obtenus en T0 et T1 ............................................ 59
3.1. Etude de la réponse immune cellulaire chez les enfants ayant présenté des formes sévères
de la COVID-19 ............................................................................................................................... 59
DISCUSSION ....................................................................................................................................... 62
1. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE ANTI-SARS-COV-2 CHEZ LES TÉMOINS PRÉ-

ENDÉMIQUES................................................................................................................................. 63
2. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE ANTI-SARS-COV-2 CHEZ LES PATIENTS

DIPs/COVID-19................................................................................................................................ 65
3. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE ANTI-SARS-COV-2 CHEZ LES ENFANTS AYANT

PRESENTE DES FORMES SEVERES DE COVID-19 .................................................................. 67
CONCLUSION ..................................................................................................................................... 70
PERSPECTIVES ................................................................................................................................... 72
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 74
ANNEXE 1 ........................................................................................................................................... 79
Liste des abréviations
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ACE : Enzyme de conversion de l’angiotensine

ADCC : Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps
Agamma : Agammaglobulinémie
AID : Activation-induced cytidine deaminase
AIRE : Autoimmune Regulator
ARN : Acide ribonucléique
ARN 5’-ppp : ARN avec une structure secondaire contenant une terminaison triphosphate en 5'
ARNds : ARN double brin
ATM : Ataxie télangiectasie
C’def : Déficit du complément
CBA : Cytometric bead array
CCL2, CCL3, CCL5 : Chemokine (C-C motif) Ligand 2, 3, 5
CD : Cellule Dendritique
CGD : Granulomatose septique chronique
CVID : Déficit immunitaire commun variable
DAMPs : Signaux moléculaires associés aux dommages
DeltaCoVs : Deltacoronavirus
DIPs : Déficits immunitaires primitifs
EII : Erreurs innées de l’immunité
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Test immuno-enzymatique lié à une enzyme)
FMF : Maladie périodique
HCoV-HKUI : Coronavirus humain HKUI
HCoV-NL63 : Coronavirus humain NL63
HCoV-OC43 : Coronavirus humain OC43
HCoV-229E : Coronavirus humain 229E
HIGM : Syndrome hyper IgM
hrsACE2 : Recombinante soluble humaine de l’ACE2
IFN : Interféron
IFN-γ : Interféron gamma
IFNAR : Interferon Alpha/Beta Receptor
IFNAR1/2 : Récepteurs de l’interféron de type I
IFN-I : Interférons de type I
IgG : Immunoglobuline G
Igs : Immunoglobulines
IL-1 : Interleukin-1
2
IL-6 : Interleukin-6
IRF : Facteur régulateur de l’interféron
IRF3 : Facteur régulateur de l’interféron 3
MBL : Mannose-binding lectin
MAVS : Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein
MERS-CoV : Syndrome respiratoire du Moyen-Orient coronavirus
MYD88 : Myeloid differentiation primary response 88
NALT : Tissu lymphoïde du nasopharynx
NEMO : NF-kB essential modulator
NLRP3 : NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3
nm : Nanomètre
nsp : Non-structural protein
PBS : Phosphate-buffered saline (Solution saline tamponnée au phosphate)
PAMPs : Motif moléculaire associé aux motifs pathogènes
PHA : Phytohémagglutinine
QuantiFERON® : Marque déposée d’un test immunologique
RBD : Receptor-Binding Domain
RIG-I : Récepteur inductible par l’acide rétinoïque
RLR : Récepteurs de type gène I
RTC : Réplication-Transcription Complex
SARS-CoV : Syndrome respiratoire aigu sévère d’origine virale - Coronavirus
SARS-CoV-1 : Syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 1
SARS-CoV-2 : Syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2
STAT1-STAT2-IRF9 : Trimères composés de STAT1, STAT2, et IRF9 phosphorylés
SVF : Stroma-Vascular Fraction (Fraction stroma-vasculaire)
T0 : Moment du diagnostic
T1 : Une année après le diagnostic
TLR : Récepteurs de type Toll
TMB : Tétraméthylbenzidine
TNF-α : Tumor Necrosis Factor alpha
TRAF6 : TNF receptor-associated factor 6
TRAM : TRIF-related adaptor
3
Liste des figures
4
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Aspect d’un coronavirus en microscopie électronique .......................................................... 13

Figure 2: Structure générale du virus SARS-CoV-2 ............................................................................. 14
Figure 3: Protéines antigéniques du coronavirus SARS-CoV-2. .......................................................... 15
Figure 4: Chronologie d’apparition des variants du SRAS-CoV-2 ....................................................... 16
Figure 5:Cycle de multiplication intracellulaire du SARS-CoV-2 ....................................................... 18
Figure 6: Voie des interférons de type 1 au cours de la COVID-19...................................................... 20
Figure 7 : Réponse immunitaire adaptative anti-SRAS-CoV-2 ............................................................ 21
Figure 8: Répartition de l'âge des patients DIPs/COVID-19 rapportés dans la littérature en fonction du
type du déficit immunitaire primitif ..................................................................................................... 25
Figure 9: Taux de mortalité chez les patients DIPs/COVID-19 ............................................................ 26
Figure 10: Anomalie de la voie des interférons de type 1 par déficit autosomique récessif en IFNAR2
............................................................................................................................................................... 28
Figure 11: Autoanticorps anti-interférons de type I et formes sévères de la COVID-19 ...................... 29
Figure 12: Représentation schématique du protocole d’étude............................................................... 35
Figure 13: Elisa in-house. ...................................................................................................................... 37
Figure 14: Représentation schématique du principe de l’isolement des cellules mononucléées du sang
périphérique ........................................................................................................................................... 38
Figure 15: Représentation schématique du principe de l’ELISA sandwich .......................................... 41
Figure 16: Représentation schématique du protocole du test QuantiFERON SARS-CoV-2 ................ 43
Figure 17: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les témoins vaccinés ..................... 49
Figure 18: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez des témoins pré-endémiques......... 50
Figure 19: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les patients DIPs/COVID-19 prélevés
au moment du diagnostic (T0)............................................................................................................... 51
Figure 20: Sérologies anti SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les patients DIPs prélevés en T1 ... 52
Figure 21: Evolution des sérologies IgG et IgA anti SARS-CoV-2 chez les patients P1 et P2 ............ 52
Figure 22: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les enfants ayant eu une forme sévère
de la COVID-19. ................................................................................................................................... 53
Figure 23: Photo des plaques de proliférations lymphocytaires ............................................................ 54
Figure 24: Exemple d’une courbe standard tracée à partir des densités optiques (DO) correspondant aux
dilutions du standard à des concentrations connues. ............................................................................. 54
Figure 25: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les témoins pré-endémiques ....................... 55
Figure 26: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19 en T0............ 56
Figure 27: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19 en T1............ 57
Figure 28: Taux de l’IFN-γ libéré après activation en utilisant le Test QuantiFERON® ..................... 57
Figure 29: Taux de l’IFN-γ libéré après activation en utilisant le Test QuantiFERON® ..................... 58
5
Figure 30: Evolution de la réponse immune cellulaire anti SARS-CoV-2 chez les patients P1 et P2 .. 59
Figure 31: Résultats de la réponse cellulaire chez les enfants ayant présenté des formes sévères de la
COVID-19 ............................................................................................................................................. 60
Figure 32: Nombre des cas COVID-19 confirmés en Tunisie .............................................................. 62
Figure 33: Effets bénéfiques de la réponse immune croisé ................................................................... 64
6
Liste des tableaux
7
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Interprétation des résultats du test QuantiFERON anti-SARS-CoV-2. ............................... 43

Tableau 2: Profil des patients DIPs/COVID-19 .................................................................................... 47
Tableau 3: Profil des enfants ayant présenté des formes sévères de la COVID-19. ............................. 48
8
Avant-propos
9
Étude de la réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2 chez les patients immunodéficients
Avant-propos
AVANT PROPOS
Les déficit immunitaire primitifs (DIPs) constituent un groupe hétérogène d’anomalies génétiques qui
peuvent affecter des composants distincts de l'immunité innée et/ou adaptative conduisant à une
altération de la réponse immunitaire. Les patients atteints peuvent être susceptibles à une variété de
microorganismes, y compris les virus, et peuvent donc représenter un groupe à risque potentiel
d’infection sévère. Ils doivent donc susciter une attention particulière notamment au cours de la
pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) qui est dû à l’infection par le coronavirus 2 du
syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Cependant, un nombre relativement limité de DIPs
infectés par SARS-CoV-2 a été rapporté particulièrement au début de cette pandémie. Parmi ces patients,
80% n’ont pas nécessité d’hospitalisation et 30% étaient asymptomatiques.
Par ailleurs, ce virus infecte à la fois les adultes et les enfants mais la COVID-19 est principalement
observée chez les adultes et sa gravité est beaucoup plus élevée chez les personnes âgées, en particulier
celles présentant des facteurs de risque spécifiques. Les enfants sont souvent asymptomatiques.
Cependant, les bases immunologiques qui pourraient expliquer la faible fréquence des formes sévères
chez les enfants atteints de la COVID-19 restent encore mal élucidées. Plusieurs hypothèses ont été
émises telle que la faible expression du récepteur ACE2 au niveau de l’épithélium respiratoire de
l’enfant. Cependant, des facteurs liés à des particularités de la réponse immune chez l’enfant, notamment
la présence d’une immunité préexistante qui pourrait être liée à des infections dans le jeune âge par
d’autres coronavirus, l’existence d’une immunité adaptative croisée liée à la vaccination ainsi que la
présence d’une éventuelle immunité innée, pourraient également jouer un rôle important dans cette
protection potentielle et méritent donc d’être étudiés. Ainsi, l’étude des réponses cellulaires mémoires
aiderait à mieux évaluer sa contribution à la prévention des formes symptomatiques et sévères de la
maladie chez l’enfant immunocompétent.
De plus et de façon surprenante, durant cette pandémie, nous avons colligé au Laboratoire de Cyto-
Immunologie de l’Institut Pasteur de Tunis, qui est le seul laboratoire de référence à travers la Tunisie
en matière d’exploration des DIPs, des enfants ayant développé des formes sévères de la maladie à la
recherche d’un DIP sous-jacent.
C’est dans ce cadre que s’intègre ce travail dans lequel nous nous sommes proposés d’évaluer les
caractéristiques de la réponse immunitaire adaptative humorale et cellulaire anti-SARS-CoV-2 chez les
patients confirmés ou fortement suspects de déficits immunitaires primitifs ainsi que chez des témoins
immunocompétents prélevés avant l’apparition de SARS-COV-2.
10
Avant-propos
Des prélèvements nasopharyngés ont été effectués en pleine pandémie Omicron chez des DIPs
asymptomatiques non suspects de COVID-19 (20 cas). La recherche du SARS-CoV-2 au niveau
nasopharyngé effectuée chez des patients DIPs asymptomatiques était négative dans tous les cas. Nous
avons également cherché la présence du virus chez les patients ayant des signes en faveur d’infection
virale (29 cas). Ainsi, nous avons confirmé cette infection chez 11/29 patients. Ces 11 patients ont
bénéficié d’une étude de la réponse immune adaptative.
L’étude de la réponse immune humorale par la quantification des immunoglobulines anti-SARS-CoV-

2 au moment du diagnostic (T0) ainsi qu’une année après (T1) a confirmé l’absence de d’anticorps anti-
SARS-CoV-2 en T0 mais la présence d’IgG anti-N et d’IgG anti-S en T1. La réponse immune cellulaire
a été évaluée en utilisant le kit QuantiFERON® SARS-CoV-2 Extended Set Blood Collection Tubes
chez 6 patients ayant des déficits humoraux en T1. Les résultats obtenus confirment une réponse
immune cellulaire positive après stimulation par un pool de peptides qui couvrent presque tous le
génome du SRAS-CoV-2 et permet donc de susciter une réponse immunitaire spécifique plus complète
médiée par les lymphocytes T.
Par ailleurs, Nous avons étudié le profil sérologique de type IgG et IgA anti-SARS-CoV-2 aussi bien
anti-RBD qu’anti-N et le profil de la réponse immune cellulaire chez des témoins prélevés au cours de
la période pré endémiques. Aucune réaction croisée n’a été trouvé.
11
Synthèse bibliographique
12
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
Bien que les coronavirus soient depuis longtemps connus pour causer des infections respiratoires,
l'émergence du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) en 2019 a marqué
non seulement une nouvelle ère pour cette famille de virus mais aussi un tournant critique dans l'histoire
de la santé mondiale. Son impact dévastateur a rapidement dépassé les frontières géographiques pour
s'étendre à tous les coins du globe. Responsable de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), ce virus
a exposé les vulnérabilités de notre société moderne et a déclenché une pandémie sans précédent, forçant
les nations du monde entier à se mobiliser pour contenir la propagation de la maladie et atténuer ses
effets dévastateurs.
1. SARS-CoV-2
1.1. Caractéristiques virologiques du SARS-CoV-2
Le comité international de la taxonomie des virus classe les coronavirus en 4 genres : (AlphaCoVs,
BetaCoVs, GammaCoVs et DeltaCoVs). Jusqu’en 2019, six étaient connus responsables d’infections
humaines : deux Alphacoronavirus (HCoV-NL63, HCoV-229E) et quatre Betacoronavirus (HCoV-
OC43, HCoV-HKUI, SARS-CoV-1, MERS-CoV) (Kirtipal, Bharadwaj, et Kang 2020).
Le SRAS-CoV-2 est un coronavirus de la famille des Coronaviridae appartenant à la sous-classe des

Bêta-Coronavirus et du sous-genre Sarbecovirus (Zhu et al. 2020).
1.1.1. Structure générale du SARS-CoV-2
Le coronavirus, dont le nom provient de l’aspect en couronne (corona en Latin) en microscopie

électronique des spicules à la surface de l’enveloppe virale, a une forme sphérique d'un diamètre de 100
à160 nm (Figure 1).
Figure 1: Aspect d’un coronavirus en microscopie électronique (Tratner 2003)
13
La structure du SARS-CoV-2, en partie encore hypothétique, comporte une nucléocapside hélicoïdale,

formée de l'ARN viral complexé à la protéine N, à l’intérieur d’une capside de structure icosaédrique,
elle-même entourée d’une enveloppe. Cette dernière est composée par la protéine de membrane (M), la
protéine d’enveloppe (E) et la protéine de pointe (“spike”, S) (Figure 2).
Figure 2: Structure générale du virus SARS-CoV-2 (Kirtipal, Bharadwaj, et Kang 2020)
La protéine S est une glycoprotéine trimérique qui forme des extensions (spicules) à la surface. Elle
constituée de deux sous-unités :
- La sous-unité S1 contient le domaine de liaison au récepteur (receptor-binding domain, RBD).

Cette sous-unité est responsable de la reconnaissance et de la liaison aux récepteurs des cellules
cibles (Figure 3).
- La sous-unité S2 forme la « tige ». Cette sous-unité est impliquée dans la fusion de l’enveloppe
virale avec les membranes cellulaires qui est une étape nécessaire au transfert du génome viral
dans le cytosol (Tortorici et Veesler 2019) (Figure 3).
14
Figure 3: Protéines antigéniques du coronavirus SARS-CoV-2.(« Multiplex Assays for COVID-

19 (SARS-CoV-2) Research Applications | MILLIPLEX® Assays », s. d.)
1.1.2. Structure génomique et variabilité génétique
Le génome des coronavirus (CoV) est composé d'un brin d’acide ribonucléique (ARN) monocaténaire
linéaire non segmenté de polarité positive d'environ 30 kilobases, ce qui en fait le plus grand virus à
ARN pathogène pour l’Homme. Cette taille de génome pourrait être due aux caractéristiques
particulières du complexe réplication-transcription (RTC) des coronavirus, qui comprend plusieurs
enzymes de traitement de l'ARN, notamment l'exoribonucléase 3'-5' de la nsp 14. Cette dernière est
unique aux coronavirus parmi tous les virus à ARN (Jamai Amir et al. 2020).
Le génome du SARS-CoV-2 est organisé en deux régions non codantes en 5’ et 3’ et une codante pour
les quatre protéines structurales (la protéine nucléocapsidique N, la protéine M, la protéine E et la
protéine S) ainsi que les protéines non structurales impliquées notamment dans la réplication
/transcription virale (V. Bonny.et al.2020).
Les gènes des réplicase et transcriptase représentent environ 2/3 de la séquence d'ARN à l’extrémité 5’.
Elles sont composées de deux cadres de lecture ouverts (ORF) qui se chevauchent : ORF1a et ORF1b et
qui codent pour 16 protéines non structurales. Le tiers restant de la séquence de l’ARN code pour quatre
protéines structurales virales classiques. D’autres gènes codant pour certaines protéines accessoires
virales sont entremêlés dans les régions codantes des protéines structurales virales (V. Bonny.et al.2020).
Par ailleurs, les sites de codage et le nombre de ces gènes protéiques accessoires sont une base importante
pour la classification des CoV.
Comme beaucoup d’autres virus à ARN, les coronavirus présentent une variabilité génétique importante.
15
Ceci est le résultat à la fois du manque d’activité de correction d’erreurs de l’ARN polymérase
responsable de la réplication du matériel génétique et de la fréquence élevée de recombinaison (Y. Chen,
Liu, et Guo 2020). La majorité des mutations passent inaperçues. Cependant certaines peuvent conduire
à l'apparition d'une nouvelle souche du virus que l'on désigne sous le nom de variant (Y. Chen, Liu, et
Guo 2020).
Depuis Décembre 2020, cinq variants du SRAS-CoV-2 ont fait leur apparition et ont été identifiés par
l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme étant des sources d'inquiétude (variants
préoccupants (VOC): Alpha (B.1.1.7) (Yi Zhang, Zhang, et Zhang 2022), Beta (B.1.351) (K.-W. K.
Chen, Tsung-Ning Huang, et Huang 2022), Gamma (P.1) (Yi Zhang, Zhang, et Zhang 2022), Delta
(B.1.617.2), Omicron B.1.1.529 (K.-W. K. Chen, Tsung-Ning Huang, et Huang 2022) et Epsilon
(B.1.427/429) (Yi Zhang, Zhang, et Zhang 2022) (Figure 4).
Figure 4: Chronologie d’apparition des variants du SRAS-CoV-2 (Almagro et al. 2022)
1.1.3. Récepteurs cellulaires du SARS-CoV-2
Depuis l'émergence de pandémie de COVID-19, les scientifiques se sont intéressés à l'identification de

cibles pour les agents thérapeutiques tels que les récepteurs du SARS-CoV-2. En effet, à l’instar des
coronavirus, et afin d’infecter les cellules humaines, le SARS-CoV-2 lie sa protéine S à un récepteur
cellulaire tel que l’enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (angiotensin converting enzyme 2 ; ACE2)
(Chen, Tsung-Ning Huang, et Huang 2022). C’est une métallo-carboxypeptidase transmembranaire
identifiée pour la première fois comme un homologue de l'enzyme de conversion de l'angiotensine
(ACE). Cette dernière est une enzyme clé du système rénine-angiotensine jouant un rôle important dans
la régulation de la tension artérielle. En effet, elle est responsable de l’hydrolyse de l’angiotensine I en
angiotensine II (vasoconstrictrice) et de la dégradation de la bradykinine (vasodilatatrice) et stimule la
production d’aldostérone par la surrénale.
16
Intégré au sein du système rénine-angiotensine, l’ACE2 joue un rôle dans la conversion de l'angiotensine
I et l’angiotensine II en angiotensine-1-9 et angiotensine-1-7 respectivement (Jackson et al. 2022). Elle
pourrait ainsi contrebalancer les effets de l’ACE jouant un rôle dans le maintien de l’équilibre de la
tension artérielle (vasoconstriction/vasodilatation).
Les cellules qui expriment l’ACE2 sont les cibles préférentielles du SARS-CoV-2 telles que les
pneumocytes de type 2, les entérocytes de l'intestin grêle, les cellules endothéliales, les cellules
épithéliales des tubules rénaux, les neurones ainsi que les cellules musculaires lisses artérielles. Cette
localisation de l'ACE2 explique le tropisme tissulaire du SRAS-CoV-2 pour certains organes tels que le
poumon, l'intestin grêle et le rein (HASÖKSÜZ, KILIÇ, et SARAÇ 2020; Li et al. 2020).
Toutefois, si l’ACE2 est un récepteur d’entrée du SARS-CoV-2, la détresse respiratoire observée au

cours de la COVID-19 peut être améliorée par l’administration d’ACE2 recombinante (rACE2). En
effet, il a été décrit que la diminution de l’expression d’ACE2 pulmonaire était à l’origine d’insuffisance
respiratoire chez les souris infectées par le SARS-CoV-2 (Kuba et al. 2010). Ainsi, l’administration de
rACE2 peut contourner cette baisse et constituer une alternative au cours de la prise en charge de
l’atteinte respiratoire sévère de la COVID-19 (Y. Li et al. 2020). De plus, il a été démontré que la forme
recombinante soluble humaine de ce récepteur (hrsACE2) prévient l’infection par le SARS-CoV-2 des
cellules humaines d’organoïdes vasculaires et rénaux (Monteil et al. 2020).
1.1.4. Cycle de multiplication du SARS-CoV-2
La fusion de la membrane virale avec la membrane de la cellule hôte est déclenchée par la liaison de
sous unité S1 de la protéine S du SRAS-CoV-2 à son récepteur ACE2 au niveau de la cellule cible. Cette
liaison est suivie de son clivage par les protéases de la cellule hôte aboutissant à l’interaction du domaine
S2 et favorisant ainsi l'entrée du virus par endocytose (Kirtipal, Bharadwaj, et Kang 2020 ; HASÖKSÜZ,
KILIÇ, et SARAÇ 2020). Par ailleurs, il a été décrit qu’en absence d’ACE2, le SARS-CoV-2 peut
également utiliser d’autres récepteurs cellulaires de la protéine S pour infecter les cellules cibles (Wang
X et al 2020).
La traduction de l'ARN viral aura lieu à l'intérieur du réticulum endoplasmique des cellules hôtes, ce
qui aboutit à la production de protéines telles que S, E, N et M (Bonny et al. 2020). Ces protéines suivent
la voie de sécrétion vers le compartiment intermédiaire de Golgi. Là-bas, la protéine N va envelopper
le génome d'ARN fraîchement synthétisé, formant ainsi une nucléocapside hélicoïdale. Le processus
d'assemblage des virions est amorcé par la protéine M, grâce à de multiples interactions protéine-
protéine. Ce qui facilite l'incorporation des protéines de la nucléocapside, de l'enveloppe et de la protéine
de pointe dans les particules virales. Par la suite, les progénitures virales bourgeonnent dans le
compartiment intermédiaire appelé réticulum endoplasmique-Golgi (ERGIC) et sont libérées sous
17
forme de vésicules sécrétoires. Ces vésicules fusionnent avec la membrane plasmique de la cellule hôte,
excrétant finalement les particules virales par un processus d'exocytose (Figure 5).
Figure 5:Cycle de multiplication intracellulaire du SARS-CoV-2 (Bonny et al. 2020)
1.2. Réponse immunitaire anti-SARS-CoV-2
Comme pour toute infection virale, le système immunitaire met en jeu au cours de l’infection SARS-
CoV-2 des effecteurs de l’immunité innée et des effecteurs de l’immunité adaptative.
Le premier contact avec le virus a lieu dans les voies respiratoires supérieures, notamment l'épithélium
nasal, les amygdales et les végétations adénoïdes, qui sont associées au tissu lymphoïde du nasopharynx
(NALT) et où l'induction de l'immunité muqueuse se produit (Primorac et al. 2022).
1.2.1. Réponse immunitaire innée anti-SARS-CoV-2
Au cours des infections virales, les effecteurs de l’immunité innée sont les premiers à être mobilisés afin
de limiter l’infection et protéger les cellules voisines. Cette réponse immunitaire repose principalement
18
sur l'induction des interférons de type I (IFN-a et IFN-ẞ) et l'activation des cellules NK.
SARS-CoV-2 est un virus à effet cytopathique qui provoque la destruction des cellules infectées au
cours du cycle de réplication viral, ce qui entraîne la libération de divers PAMPs (motifs moléculaires
associés aux pathogènes), principalement l'ARN viral, et de DAMPs (signaux moléculaires associés aux
dommages), tels que l'ATP et l'ADN de la cellule hôte (Li et al. 2020). L’immunité innée est déclenchée
suite à la reconnaissance des PAMPs et DAMPs par des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR)
tels que les récepteurs RIG-I- like (RLR) et les récepteurs Toll-like (TLR). Les récepteurs RLR tels que
RIG-I et MDA5 sont responsables de la détection des ARN viraux présents dans le cytoplasme. RIG-I
reconnaît spécifiquement les ARN avec une structure secondaire, tels que l'ARN 5'-ppp, tandis que
MDA5 détecte les ARN double brin (ARNds) (Kasuga et al. 2021). Les TLR endosomiaux (TLR3,
TLR7) sont capables de détecter les ARN au niveau des endosomes : les ARNsm pour les TLR7/8 et les
ARNds pour les TLR3.
Les signaux de ces récepteurs induit l’activation de voies de signalisation intracellulaire impliquant
NFκB et les IRF. Ces voies aboutissent à la sécrétion de cytokines telles que les cytokines pro-
inflammatoires (TNF-α, IL-1, IL-6), les chimiokines et les interférons de type I (IFN-I) (Li et al. 2020,
Primorac et al. 2022).
Les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1, IL-6) aboutissant à une hyperperméabilité capillaire et
l’attraction de cellules inflammatoires (Jordan 2021). L'IL-6 est un puissant inducteur de la protéine
réactive du complément (CRP), qui a la capacité d'initier l'activation du complément. Lorsqu'il est
activé, le système du complément joue un rôle central dans la défense de l'hôte contre les infections via
un recrutement efficace de phagocytes et l'engloutissement d'agents pathogènes et de débris cellulaires
par opsonisation (à médiation C3b ou C5). Dans la voie des lectines, la MBL se lie aux réseaux
glucidiques de résidus de mannane et de N-acétylglucosamine à la surface des virus ou des cellules
infectées par un virus, entraînant l'activation de la sérine protéase-2 associée à la MBL (MASP-2)
(Boechat et al. 2021).
Les chimiokines présentes dans la circulation dirigent le recrutement de cellules immunitaires

spécifiques de la réponse innée vers le site de l'infection, notamment les cellules tueuses naturelles
(Natural Killer ; NK) qui jouent un rôle clé dans l'élimination du virus. Les monocytes et les neutrophiles
contribuent à l'élimination des cellules infectées.
Les IFN-I sont des puissants inhibiteurs de la réplication virale. Ils protègent également les cellules
voisines et stimulent le potentiel lytique des cellules NK et des lymphocytes T CD8 permettant la lyse
19
des cellules infectées (Khanmohammadi et al. 2022). En effet, la liaison des interférons de type I à leurs
récepteurs (IFN-α (IFNAR)½), induit les gènes stimulés par l'IFN (ISG) via des trimères STAT1-
STAT2-IRF9 (STAT:transducteurs de signaux et activateurs de transcription ; IRF: facteur régulateur
de l'interféron) (Bastard et al. 2020). Ces gènes cibles codent pour des molécules qui sont dotés d'une
puissante activité antivirale (Ya.dong Goa et al. 2020) (Figure 6).
Figure 6: Voie des interférons de type 1 au cours de la COVID-19 (Ya.dong Goa et al. 2020)
Par ailleurs, il est possible que le SARS-CoV-2 ait développé des mécanismes d'évasion similaires à
ceux observés dans le cas du SAR-CoV et MERS-CoV. En effet, ces 2 virus sont capables d’induire la
formation des vésicules à double membrane dépourvues de PRRs et se répliquer à l’intérieur pour éviter
la détection de leur ARN. De plus, il a été également démontré qu’ils inhibent la synthèse des IFN de
type 1. Ces mécanismes de résistances pourraient être également utilisés par le SARS-CoV-2 (X. Li et
al. 2020).
1.2.2. Réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2
A la réponse immunitaire innée caractérisée par une réaction inflammatoire, succède le développement
d'une réponse immunitaire adaptative.
Comme pour toute infection virale, cette réponse est initiée par l'internalisation, l'apprêtement et la
présentation des antigènes viraux par la cellule dendritique (CD), qui est une cellule présentatrice
d’antigène (CPA) professionnelle. Par la suite, la CD mature migre vers les ganglions lymphoïdes
20
drainants où elle va présenter, par un phénomène de présentation croisée, les peptides viraux aux
lymphocytes T CD4 et T CD8 et initier la réponse immune adaptative (Figure 7).
Figure 7 : Réponse immunitaire adaptative anti-SRAS-CoV-2 (Primorac et al. 2022)
Une réponse lymphocytaire T à la fois CD4+ et CD8+ a été retrouvée chez les patients infectés par le
SARS-CoV-2 même s’ils sont asymptomatiques. L’efficacité et la durée de la protection assurée par
l’immunité cellulaire ne sont encore pas bien définies mais il semble qu’au vu de l’apparition de cellules
souches mémoires, l’immunité cellulaire pourrait persister plus longtemps que l’immunité humorale.
Des données récentes indiquent que la réponse T CD4+ est plus large et plus importante dans les formes
sévères. A l’inverse dans les formes modérées une prépondérance de la réponse T CD8+ a été décrite.
Par ailleurs, à l’instar d’autres infections virales, plusieurs protéines du SARS-CoV-2 peuvent induire
une réponse immunitaire humorale. Cette dernière se caractérise par la production d'anticorps. Le pic de
séroconversion chez les patients symptomatiques est environ au quatorzième jour après l’infection. Ce
pic semble être décalé chez patients peu symptomatiques, comme décrit au cours de l’infection par le
SARS-CoV-1.
21
La réponse humorale est essentiellement de type IgG et IgA. La réponse IgM semble être moins
importante. Les IgM peuvent persister jusqu’à 12 semaines, alors que les IgG persistent plus longtemps.
La réponse anticorps est dirigée contre de nombreuses protéines telles que la protéine N de la
nucléocapside, la protéine S et le domaine de liaison au récepteur (RBD) du virus SARS-CoV-2 (Rokni,
Ghasemi, et Tavakoli 2020). Toutefois, la réponse neutralisante semble être dirigée contre
particulièrement contre la protéine spike. En effet, les anticorps dirigés contre le domaine RBD bloquent
l'interaction entre le domaine RBD et le récepteur ACE2, ce qui entrave la capacité du virus SARS-
CoV-2 à pénétrer dans les cellules cibles (Vabret et al. 2020).
1.2.3. Tempête cytokinique au cours de la COVID-19
La tempête cytokinique est une réponse inflammatoire systémique incontrôlée résultant de la libération
excessive de cytokines pro-inflammatoires (IFN-α, IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, IL-33, TNF-α,
TGFβ, etc.) et de chimiokines (CCL2, CCL3, CCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10, etc.) par les cellules
effectrices du système immunitaire (X. Li et al. 2020). Cette tempête cytokinique est à l’origine, du
syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) et d’une défaillance multi-viscérale systémique
pouvant évoluer dans les cas sévères vers le décès.
En cas d’anomalie des IFN de type 1, il y a un afflux de monocytes/macrophages inflammatoires

pathogènes (Q.Ye et al. 2020). Ces derniers produisent des grandes quantités de cytokines pro-
inflammatoires, de chimiokines et des radicaux oxygénés et nitriques engendrant une destruction
tissulaire. De plus, ils induisent l’apoptose des lymphocytes T ce qui est à l’origine d’une lymphopénie
ainsi qu’une apoptose des pneumocytes alvéolaires et des cellules endothéliales via la surexpression de
Fas-Ligand et du TRAIL-death receptor. Cette dernière sera à l’origine d’une extravasation de liquide
plasmatique responsable de la défaillance respiratoire (Q.Ye et al. 2020).
1.3. Vaccination anti-SARS-CoV-2
Le développement des vaccins anti-SARS-CoV-2 était remarquable et particulièrement caractérisé par

une rapidité exceptionnelle en plus de l’utilisation d’une large panoplie de plateformes vaccinales. Elles
incluent les vaccins à acides nucléiques (ADN et ARN), les vaccins à vecteurs viraux et les vaccins
inactivés (Tung Thanh Le et al, 2020).
Le déploiement à l'échelle mondiale de ces vaccins a significativement réduit la mortalité liée à la

COVID-19. Selon le type de vaccin utilisés, il existe une grande variabilité de la réponse immune
cellulaire et humorale post-vaccinale. En effet, si les vaccins à ARNm et ceux à adénovirus induisent
aussi bien une réponse immune humorale et cellulaire TCD4 et TCD8, les données, quant à la réponse
cellulaire post-vaccins inactivés, en termes d'intensité et d'efficacité, restent à préciser (Teijaro JR et al,
22
2021). Les vaccins à ARNm stimulent la production de lymphocytes TCD4 et TCD8 spécifiques du
SRAS-CoV-2, ainsi que de lymphocytes B mémoire et d'anticorps sériques neutralisants chez plus de
95 % des individus en bonne santé. L’induction d’une réponse mémoire lymphocytaire T permet de
prévenir les formes sévères de l’infection, comme démontré au cours de l’infection à SARS-CoV-1
(Tangye 2023).
La vaccination était particulièrement indiqués chez les sujets à risque de formes graves tels que les
immunodéprimés quelle qu’en soit la cause (Dooling.Dk et al. 2021; M et al. 2021). En Tunisie, comme
dans le monde, les patients ayant un déficit immunitaire primitif ont été priorisés pour l’accès à cette
vaccination malgré que son efficacité, qui varie en fonction de son type, reste incertaine (Amodio et al.
2021).
Par ailleurs, à l’instar des vaccins développés pour le SARS-CoV-1 et le MERS-CoV, la principale cible
antigénique pour le SARS-CoV-2 est la sous-unité S1 de la protéine Spike (Du L et al, 2009 ; Wang Q
et al, 2016 ; Wrapp D et al, 2020).
2. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS

Les déficits immunitaires primitifs (DIPs) aussi appelées erreurs innées de l’immunité (EII) sont un
groupe d’anomalies génétiques qui peuvent affecter des composants distincts de l'immunité innée et/ou
adaptative conduisant à une altération de la réponse immunitaire. Ces maladies sont relativement rares.
Leur incidence varie de 1/5000 à 1/10000 naissances (Casanova et Abel 2022). Cependant, elles sont
plus fréquentes dans les populations d’Afrique du Nord et du Moyen Orient (région MENA)
caractérisées par une forte endogamie comme la nôtre. En effet, la Tunisie présente un taux élevé de
consanguinité pouvant atteindre 50% dans certaines régions rurales (Barbouche et al. 2017).
Actuellement, il a été clairement démontré que la consanguinité favorise l’émergence des maladies
génétiques de transmission autosomique récessive y compris les DIPs (Al Herz W et al, 2014).
Selon l'Union Internationale des Sociétés d'Immunologie, ces maladies monogéniques du système
immunitaire incluent, jusqu’à nos jours, environ 485 DIPs (Stuart Tangye et al 2022). Elles ont été
classées en 10 groupes, en se basant essentiellement sur le type de l’effecteur de l’immunité touché :
- Déficits immunitaires combinés ou cellulaires (DIC) qui affectent à la fois l'immunité cellulaire
et humorale (Exemples : déficit immunitaire combiné sévère, défaut d’expression des molécules
HLA-II, syndrome hyper IgM (HIGM) par déficit en CD40/CD40L, ...).
- Déficits immunitaires combinés syndromiques (Ataxie Télangiectasie, Syndrome hyper IgE,
Syndrome de Wiskott Aldrich, ...).
- Déficits immunitaires humoraux (Exemples : agammaglobulinémie, déficit immunitaire
commun variable (CVID), syndrome hyper IgM par déficit en AID, …).
23
- Dysrégulations immunitaires (Exemples : lymphohistiocytose hémophagocytaire familiale,

IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, liées à l'X), …)
- Déficits des cellules phagocytaires (Exemples : neutropénie congénitale, granulomatose
septique chronique, …).
- Déficits de l’immunité innée (Exemples : syndrome de susceptibilité mendélienne aux
infections mycobactériennes, candidose cutanéomuqueuse chronique, …).
- Maladies auto-inflammatoires (Exemples : Interferonopathies de type 1, maladie périodique,...).
- Déficits du complément
- Insuffisance médullaire
- Phénocopies des DIPs dues soit à des mutations somatiques ou à la présence d’autoanticorps
neutralisants.
Classiquement, les DIPs sont caractérisés par une susceptibilité accrue aux infections à large spectre de
pathogènes. Il s’agit d'infections particulières puisqu'elles peuvent être récurrentes, sévères, traînantes
malgré un traitement bien adapté et/ou récidivantes à son arrêt et souvent fatales. Cependant, les DIPs
peuvent également se révéler par des affections auto-immunes, des cancers et des allergies puisque le
système immunitaire participe aussi aux phénomènes de tolérance des constituants du soi, à la
surveillance antitumorale et à l’homéostasie de l’organisme.
Les DIPs sont classiquement diagnostiqués dans l'enfance mais peuvent également l'être chez les
adultes, soit en raison d'un diagnostic tardif ou d’une révélation tardive de la maladie (Bussone et
Mouthon 2010).
La prise en charge des DIPs implique souvent des traitements spécifiques en fonction du type du déficit,
tels que le traitement substitutif par les immunoglobulines par voie intraveineuse (IVIG) et la greffe de
cellules souches hématopoïétiques.
3. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS ET COVID-19

3.1. Caractéristiques cliniques de la COVID-19 chez les patients immunodéficients
Au cours des deux dernières années, environ 1330 patients ayant un DIP confirmé (patients DIPs) ont
eu une infection SARS-CoV-2 (patients DIPs/COVID-19) (Tangye 2023). Les études publiées ont
rapporté les particularités épidémiologiques, cliniques et évolutives de la COVID-19 chez ces patients
par rapport à la population générale et ont mis en lumière les défis auxquels sont confrontés ces patients.
Parmi ces 1330 patients DIPs/COVID-19, les déficits humoraux étaient les plus fréquents (714 cas),
suivies maladies auto-inflammatoires (96 cas), des déficits combinés (91 cas), des défauts de l’immunité
24
innée (75 cas), des déficits de régulation immune (64 cas), des déficits du système complémentaire (55
cas), des insuffisance médullaire (36 cas), des déficits des cellules phagocytaires (30 cas), des déficits
immunitaires combinés sévères (25 cas), et les phénocopies (Tangye 2023).
L'âge moyen de ces patients DIPs/COVID-19 était inférieur à celui décris dans la population générale
(28 versus 50 ans et plus) (Delavari et al. 2021) (Figure 8).
Figure 8: Répartition de l'âge des patients DIPs/COVID-19 rapportés dans la littérature en

fonction du type du déficit immunitaire primitif (Delavari et al. 2021).
Les valeurs au-dessus des courbes représentent l'âge moyen des patients pour chaque type de DIPs.
Sur le plan clinique, comme décrit chez les immunocompétents, environ 10 % à 20 % des patients DIPs
infectés étaient asymptomatiques, et jusqu'à 30 % à 50% avaient présenté une forme bénigne (Tangye
2023). Les symptômes incluent notamment de la fièvre, de la toux, des maux de tête, des symptômes
des voies respiratoires supérieures, de la fatigue et de la dyspnée (Shields et al. 2021; Delavari et al.
2021; Abolhassani, Delavari, et al. 2022; Goudouris et al. 2021).
Toutefois, les patients DIPs peuvent être vulnérables à l’infection et susceptibles à des formes graves.
En effet, chez ces patients DIPs les formes sévères nécessitant une admission aux soins intensifs, était
non seulement plus fréquentes (10 et 30 % chez les DIPs comparativement à 2 à 5 % pour la population
générale) mais aussi touchant les plus jeunes (Tangye 2023). En plus des facteurs de risque prédictifs
d'hospitalisation aux soins intensifs et de développement de formes sévères et/ou fatales, classiquement
25
décrits pour la population générale (Goudouris et al. 2021), d'autres ont été rapportés chez les patients
DIPs telles que la lymphopénie et l’hypogammaglobulinémie précédant l'infection et l'augmentation des
niveaux de marqueurs d'inflammation systémique subséquent à l'infection.
La grande hétérogénéité des ∼500 types de DIPs rend difficile toute conclusion définitive lors de
l'évaluation de ces patients. Par ailleurs, l’impact de l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les DIPs varie
considérablement en fonction de son type (Abolhassani, Landegren, et al. 2022; Khanmohammadi et al.
2022; Duncan et al. 2022; Zhang et al. 2020). En fait, il semble que certains DIPs entraîneront une plus
grande prédisposition aux formes graves de COVID-19 (anomalies de la voie des interférons de type 1),
tandis que d’autres pourraient, de manière surprenante, contribuer à une évolution moins sévère de la
maladie telle que l’agammaglobulinémie par déficit en BTK (Tangye 2023).
De façon globale, il a été décrit que le taux de mortalité était de 8,5% chez les patients DIPS/COVID-
19 (113 /1328) (Tangye 2023). Cependant, ce taux peut varier en fonction du pays, de l’âge et du type
de DIPs. En effet, il est ∼2 à 4 fois plus élevé que celui dans la population générale au Brésil, en Italie
et au le Royaume-Uni. Il est encore plus élevé (20 à 50 fois) en Iran, en Italie, au Royaume-Uni chez
les patients âgés de 20 à 60 ans. De plus, chez les patients DIPs, une évolution fatale de l’infection par
le SRAS-CoV-2 est plus fréquemment observée à un âge moyen bien plus jeune que dans la population
générale, accentuant la gravité de la situation, surtout aux âges où le SRAS-CoV-2 a une mortalité
généralement faible, voire négligeable (Tangye 2023).
Figure 9: Taux de mortalité chez les patients DIPs/COVID-19 (Tangye 2023).

Agamma: agammaglobulinémie, AIRE: Syndrome d'APECED, ATM: ataxie télangiectasie,
C'def: déficit du complément, CGD: granulomatose septique chronique, FMF: maladie périodique,
IFNAR1/2: les patients présentant des variants pathogènes dans les récepteurs IFN de type I, et IRF7,
MYD88/IRAK4: les patients présentant des variants pathogènes dans IRF7 ou MYD88/IRAK4
perturbant la signalisation IFN de type I.
26
3.2. Susceptibilité génétique aux formes sévères de la COVID-19
Depuis environ une trentaine d’année, certains types de DIPs caractérisés par la survenue d’infections
causées par des germes peu virulents avec un spectre infectieux souvent étroit et par l’absence
d’anomalies immunologiques détectables par les explorations usuelles, ont été identifiés. Ainsi,
plusieurs syndromes de prédisposition génétique aux infections ont été décrits telles que la susceptibilité
mendélienne aux infections mycobactériennes par défaut de l’axe IL-12/IFN-γ la susceptibilité
génétique aux infections fongiques ou candidose cutanéo-muqueuse chronique par anomalie de la voie
des IL-17 et la susceptibilité génétique aux infections à pyogènes par anomalies de la voie NFKB1.
De façon intéressante, vers la fin de l’année 2020, Jean-Laurent Casanova et Laurent Abel ont identifié
les premières étiologies génétiques et immunologiques des formes sévères de COVID-19 (Casanova et
Abel 2022). En effet, ils ont démontré que les défauts génétiques (Figure 10) ou la présence des auto-
anticorps (Figure 11) altérant la voie des interférons de type I (IFN-I) sont responsables des formes
sévères de COVID-19.
Des variants pathogènes au niveau des gènes IFNAR1 et IFNAR2 , codant pour des sous-unités de
récepteurs de l’IFN de type I, ont été associées à une mortalité liée à la COVID-19 chez 57 % des
patients (4/7 patients), avec un âge moyen au décès de 11,8 ans ( Zhang et al. 2020 ; Abolhassani,
Landegren, et al. 2022; Khanmohammadi et al. 2022; Duncan et al. 2022).
27
Figure 10: Anomalie de la voie des interférons de type 1 par déficit autosomique récessif en
IFNAR2 (Duncan et al. 2022)
Par ailleurs, des auto-anticorps neutralisants dirigés contre l'IFN-α2 et/ou -ω ont été identifiés chez 10%
des patients atteints d'une pneumonie grave (Bastard et al. 2020) (Figure10). Chez ces patients,
l’évolution de la maladie était fatale dans 13,8 % (Lemarquis et al. 2021 ; Meyts et al. 2021; Bastard et
al. 2021 ; Meisel et al.,2021 ; Schidlowski et al. 2022). Cette évolution fatales est associées même à des
concentrations faibles d’autoanticorps (inférieures à 10 ng/mL) (Bastard, Gervais, et al. 2021). L'origine
de ces auto-anticorps pourrait être génétique comme observé chez les individus atteints du syndrome
polyendocrinien auto-immun de type 1 (APS-1) ou APECED (Autoimmune Polyendocrinopathy with
Candidiasis and Ectodermal Dystrophy) (Meager et al. 2006; Bastard et al. 2021; Meisel et al.,2021).
C’est un DIP dû à des mutations au niveau du gène AIRE qui code pour un facteur de transcription jouant
un rôle important dans la tolérance centrale. Les patients atteints développent une atteinte auto-immune
polyendocrinienne (insuffisances surrénale, ovarienne, parathyroïdienne …), des auto-anticorps
28
neutralisants contre diverses cytokines tel que les anti-IL-17 (expliquant leur susceptibilité aux
infections fongiques) ( Bastard et al. 2020; Puel et al. 2022) et les interférons de type.
Figure 11: Autoanticorps anti-interférons de type I et formes sévères de la COVID-19 (Bastard

et al. 2020)
Par ailleurs, il a été également décrit que les patients ayant des déficits en MYD88, IRAK, IRF7 ou
TLR7, impliqués dans la régulation de la production d'IFN de type I, ont présentés des formes sévères
et/ou fatales de la COVID-19 (Casanova et Abel 2022; Tangye 2023 )
29
Objectifs du travail
30
OBJECTIFS DU TRAVAIL
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est apparu en Chine, en

Décembre 2019 comme une nouvelle cause de pneumonie virale sévère, appelée la maladie due au
coronavirus, apparue en 2019 (COVID-19).
Depuis cette date, le SARS-CoV-2 continue de se propager dans le monde entier. Ce virus infecte à la
fois les adultes et les enfants mais la COVID-19 est principalement observée chez les adultes et sa gravité
est beaucoup plus élevée chez les personnes âgées, en particulier celles présentant des facteurs de risque
spécifiques. Les enfants sont souvent asymptomatiques. Cependant, les bases immunologiques qui
pourraient expliquer la faible fréquence des formes sévères chez les enfants atteints de la COVID-19
restent encore mal élucidées. Plusieurs hypothèses ont été émises telle que la faible expression du
récepteur ACE2 au niveau de l’épithélium respiratoire de l’enfant. Cependant, des facteurs liés à des
particularités de la réponse immune chez l’enfant, notamment la présence d’une immunité préexistante
qui pourrait être liée à des infections dans le jeune âge par d’autres coronavirus, l’existence d’une
immunité adaptative croisée liée à la vaccination ainsi que la présence d’une éventuelle immunité innée,
pourraient également jouer un rôle important dans cette protection potentielle et méritent donc d’être
étudiés. Ainsi, l’étude des réponses cellulaires mémoires aiderait à mieux évaluer sa contribution à la
prévention des formes symptomatiques et sévères de la maladie chez l’enfant immunocompétent.
Par ailleurs, au cours de cette pandémie COVID-19, une attention particulière devait être portée aux
populations qui pourraient être sensibles à l'infection, tels que les patients ayant un déficit immunitaire
primitif (DIP). Ces derniers sont particulièrement vulnérables à divers micro-organismes, y compris les
virus, et sont donc considérés comme un groupe à risque potentiel pour des infections sévères par le
SARS-CoV-2. Cependant, un nombre relativement limité de patients DIPs infectés par SARS-CoV-2 a
été rapporté notamment au début de la pandémie. Parmi ces patients, 80% n’ont pas nécessité
d’hospitalisation et 30% étaient asymptomatiques. Les caractéristiques de la réponse immunitaire chez
les individus atteints de DIPs restent encore peu étudiées.
D’autre part et de façon intéressante, durant cette pandémie, nous avons colligé au Laboratoire de Cyto-
Immunologie de l’Institut Pasteur de Tunis, qui est le seul laboratoire de référence à travers la Tunisie
en matière d’exploration des DIPs, des enfants ayant développé des formes sévères de la maladie à la
recherche d’un DIP sous-jacent.
31
C’est dans ce cadre que s’intègre ce travail dans lequel nous nous sommes proposés d’évaluer les
caractéristiques de la réponse immunitaire adaptative humorale et cellulaire anti-SARS-CoV-2 chez les
patients confirmés ou fortement suspects de déficits immunitaires primitifs ainsi que chez des témoins
immunocompétents prélevés avant l’apparition de SARS-COV-2.
Les objectifs spécifiques de ce travail étaient d'étudier le profil de la réponse immune humorale et
cellulaire :
- Chez des témoins prélevés avant l’apparition de SARS-CoV-2.
- Chez les patients DIPs confirmés ayant eu une infection SARS-CoV-2.
- Chez des enfants qui ont présenté des formes sévères de la COVID-19.
32
Cohortes et Méthodes
33
Cohortes et méthodes
COHORTES ET MÉTHODES
1. Cohortes
1.1. Témoins
1.1.1. Témoins immunocompétents prélevés au cours de la période pré-endémique
Dans cette étude, nous avons inclus des témoins Tunisiens immunocompétents, prélevés avant
l’apparition du virus SARS-CoV-2 (période pré-endémique) et dont les plasmas ou sérums (19 témoins)
et les cellules mononucléées du sang périphériques (8 témoins) ont été congelées (Accord antérieur (Ref.
LR11IPT02/24/2013) du Comité d'Ethique Bio-Médicale de l’IPT dans le cadre d’un autre projet de
recherche).
Ce groupe de témoins permettra de chercher une éventuelle réponse immunitaire croisée (humorale et/ou
cellulaire) avec SARS-CoV-2.
1.1.2. Témoins immunocompétents vaccinés
Sept témoins immunocompétents vaccinés par un vaccin anti-SARS-CoV-2 à base d’ARN-messager

(ARNm) (BioNTech-Pfizer) ont été inclus dans cette étude. Ils ont eu un prélèvement 1 mois après la
première dose vaccinale et leurs sérums ont été congelés.
Ce groupe de témoins servira à la comparaison de la réponse immunitaire humorale anti-SARS-CoV-2

entre les patients et les témoins immunocompétents vaccinés.
1.2. Patients ayant un déficit immunitaire primitif confirmé
Dans cette étude, nous avons initialement inclus 49 patients dont le diagnostic de déficit immunitaire
primitif a été confirmé par l’exploration immunologique effectuée au sein du Laboratoire de Cyto-
Immunologie de l’Institut Pasteur de Tunis (IPT).
Dans une première étape, tous ont eu des prélèvements nasopharyngés à la recherche de SARS-CoV-2
par RT-PCR. Cette dernière a été faite au Laboratoire de Virologie Clinique de l’IPT (Figure 12). Ces
patients étaient classés en deux groupes :
- Le premier a inclus 20 patients non infectés qui n’avaient pas des signes cliniques en faveur
d’une infection virale. Ces patients ont eu un prélèvement nasopharyngé en pleine pandémie à
la recherche d’un portage asymptomatique de SARS-CoV-2. En fait, nous avons mené une
34
enquête de terrain avec une équipe qui a visité les patients DIPs au niveau de leur foyer familial
et a réalisé les prélèvements pour ceux qui ont accepté de participer à cette étude (consentement
obtenu).
- Le deuxième a inclus 29 patients symptomatiques qui avaient des signes en faveur d’une
infection virale nécessitant une consultation. Les prélèvements ont été effectués chez ces
patients par les médecins traitants.
Dans la deuxième partie, nous avons complété par une étude de la réponse immunitaire humorale et
cellulaire chez les patients dont la recherche de SARS-CoV-2 était positive (patients DIPs/COVID-19)
(Figure 12).
Figure 12: Représentation schématique du protocole d’étude.

T0 : Prélèvement au moment du diagnostic positif de la COVID-19 ; T1 : Prélèvement fait après 1 an et demi de l’épisode aigue
1.3. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19
Douze enfants ayant présenté une forme sévère de l’infection COVID-19 confirmée par RT-PCR ont
été inclus dans ce travail. Ces enfants ont été adressés au Laboratoire de Cyto-Immunologie de l’IPT
pour exploration immunologique.
Les renseignements épidémiologiques, cliniques et biologiques standards ont été recueillis à partir des
fiches de renseignements préétablies remplies par les médecins traitants.
35
1.4. Kits et peptides du SARS-CoV-2
- QuantiFERON SARS-CoV-2 Starter Set Blood Collection Tubes (QFN SARS-CoV-2 BCTs)
(ref.cat :626115).
- Kit de dosage par ELISA de l’IFN-γ: BD OptEiaTM Set for Human IFN-g (ref.cat: 555142).
- PepTivator SARS-CoV-2 Protéine S (ref.cat :130-126700). (La souche Wuhan).
- PepTivator SARS-CoV-2 Protéine S Complet B11529/BA5 (ref.cat :130-132-810). (La souche

Omicron).
2. MÉTHODES
2.1. Étude de la réponse immune humorale anti-SARS-CoV-2
L’étude de la réponse immune humorale a été effectuée en utilisant 4 tests ELISA ‘in-house’ semi-
quantitatifs développés et validés à l’Institut Pasteur de Tunis (Benabdessalem et al. 2023).
Les résultats sont exprimés en valeur de densité optique (DO). L’interprétation se fait par rapport à une
valeur seuil d'un échantillon de référence pour chaque test. Ainsi, toute valeur de DO d’un échantillon
supérieure à la valeur seuil du test est considérée comme positive.
Ces tests permettent de détecter les immunoglobulines de type IgG et IgA dirigées contre le domaine de
liaison au récepteur de la protéine de pointe Spike (S-RBD) et les protéines de nucléocapside (N) du
SARS-CoV-2.
Les anticorps de type IgG anti -spike (IgG anti-S-RBD) peuvent être détectés soit suite à une infection
par le SARS-CoV-2 ou une vaccination par un vaccin de type ARN anti-SARS-CoV-2. Les IgG anti-
nucléocapside (IgG anti-N) sont détectés uniquement chez les sujets infectés. La vaccination par un
vaccin de type ARN anti-SARS-CoV-2 n’induit pas la production des IgG-anti-N.
Protocole expérimental :
Des plaques ELISA à 96 puits ont été sensibilisées pendant une nuit à 4°C avec des protéines
recombinantes diluées dans le tampon phosphate salin (PBS) (1 et 2 ng/µl pour les protéines N et S-
RBD du SARS-CoV-2, respectivement) [1] (Figure 13). Après une étape de trois lavages avec du tampon
de lavage (PBS–0.1% Tween 20), elles ont été saturées avec 100 μl de la solution de saturation (4%
d'albumine de sérum bovin dans PBS-T) pendant une heure dans une étuve à 37°C [2] (Figure 13). Une
deuxième série de lavage a été effectuée avant d’ajouter 50µl des échantillons dilués dans le tampon de
lavage (1:200 pour l’ELISA IgG anti-N, 1:400 pour l’ELISA IgG anti-S-RBD et 1:100 pour l’ELISA
36
IgA anti-N et anti-S-RBD) [3] (Figure 13). Les plaques ont été incubées pendant 2 heures dans une étuve
à 37°C puis lavées 6 fois.
L'étape suivante a consisté à ajouter 50 μl d’'anticorps de détection conjugué (peroxidase-conjugated

goat anti-human IgG (Sigma, AG029), dilué au 1/8000ème dans le tampon de lavage pour l’ELISA IgG
anti-N, anti-S-RBD et IgA anti-S-RBD, et au 1/5000ème pour l’ELISA IgA anti-N [4] (Figure 13). Une
incubation d'une heure à 37°C a été réalisée, puis les plaques ont été lavées 6 fois.
Enfin, le substrat (horseradish peroxidase (HRP) chromogenic substrate 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine

(TMB) (BD Biosciences, 555214) a été ajouté pendant 10 minutes à température ambiante [5] (Figure
13) puis la réaction a été arrêtée en ajoutant 50 µL de solution d'arrêt (sulfuric acid (2N)).
La densité optique (DO) a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (Thermo Scientific
MULTISKAN GO©) à 450/630 nm [6] (Figure 13).
Figure 13: Elisa in-house.
2.2. Étude de la réponse immune cellulaire anti-SARS-CoV-2
L’étude de la réponse immune cellulaire a été effectuée par les tests de libération de l’Interféron gamma
(tests “Interferon -Gamma Release Assays” (IGRA)) en utilisant le kit QuantiFERON SARS-CoV-2
Starter extended et/ou après stimulation in vitro des cellules mononucléées du sang périphériques
(PBMCs) par les peptides SARS-CoV-2 suivi d’un dosage de l’IFN-γ dans les surnageants de culture.
37
2.2.1. Isolement des cellules mononuclées du sang périphérique
Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) ont été isolées après centrifugation sur un
gradient de densité constitué d'une solution de Ficoll (eurobio) (Figure 14.A) Ce gradient de densité de
1,077 permet de séparer les populations mononucléées, des polynucléaires et des globules rouges qui
sont plus denses. Le sang a été prélevé de manière stérile sur un anticoagulant (Héparinate de Sodium
ou de Lithium). Le plasma a été récupéré dans des tubes eppendorfs et conservé à -80°C pour une
utilisation ultérieure (tests sérologiques). Le reste de sang a été dilué au demi avec le milieu RPMI 1640
(Roswell Park Memorial Institute medium, SIGMA), auquel ont été ajoutés de la L-glutamine (2mM).
Ensuite, ce mélange a été soigneusement et très doucement coulé dans des tubes inclinés contenant du
Ficoll (eurobio). Le Ficoll doit représenter environ un tiers du volume final. Les tubes ont ensuite été
centrifugés sans frein à 1650 rpm pendant 30 minutes. Après la centrifugation, trois phases distinctes
étaient visibles. La phase intermédiaire qui formait un anneau contenant les PBMCs, a été délicatement
aspirée puis récupérée dans du RPMI puis lavée deux fois à 1200 rpm dans le même milieu.
Enfin, le nombre de cellules a été déterminé à l'aide d'une lame de Malassez (Figure 14.B).
Figure 14: Représentation schématique du principe de l’isolement des cellules mononucléées du

sang périphérique
38
2.2.2. Congélation des cellules mononucléées du sang périphérique
Les PBMCs des patients et des témoins ont été congelés puis gardés à -80°C pour l’étude des réponses
immunes cellulaires. Pour cela, sous une hotte à flux laminaire, 1 ml de solution contenant 500 µl de
SVF et 500 ml RPMI 20% DMSO a été ajoutée goutte à goutte au culot des PBMCs en agitant dans un
bac de glace puis rapidement transféré dans un cryotube de congélation.
2.2.3. Décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique congelées
Les PBMCs sorties du congélateur -80°C ont été partiellement décongelées dans un bain marie à 37°C
en conservant un cristal de glace dans le cryotube. Ensuite, trois lavages rapides en utilisant 10 ml de
milieu RPMI ont été effectués. Chacun implique une centrifugation de 5 minutes à 1500 rpm, suivie de
la récupération du culot dans 10 ml de RPMI.
La détermination du nombre de cellules a été faite en utilisant une lame de Malassez et en utilisant le
bleu de trypan. Ce colorant permet de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes en les colorant.
2.2.4. Stimulation in vitro des cellules mononucléées du sang périphérique
Les PBMCs décongelés et reconstitués dans du RPMI 10% SVF ont été mis dans un flasque de 25 et
incubés pendant 24h à 37°C et 5% de CO2.
Le lendemain, les plaques de culture de 96 puits ont été sensibilisées avec de l'anti-CD3 (Clone UCHT1)
à une concentration finale de 1 µg/ml pendant 2 heures à 37 °C, puis lavée avec du PBS 1X.
Parallèlement, les cellules ont été lavées deux fois avec du RPMI simple puis comptées et ajustées dans
le milieu de culture (RPMI 7 % sérum AB) à une concentration d’un million de cellules par millilitre.
Par la suite, 200 µl (soit à 200 000 PBMCs) ont été distribués dans différents puits de la plaque de culture
déjà sensibilisés avec l’anti-CD3. Ces PBMCs ont été stimulés en duplicate, selon différentes conditions:
- Non stimulé
- Phorbol-12-Myristate -13-Acetate (PMA; 50 ng/ml) et l’ionomycine (Iono; 1µg/ml; SIGMA).
- Anti-CD3 (1µg/ml) et anti-CD28 (1µg/ml)
- “PepTivator SARS-CoV-2 Protéine S” de la souche Wuhan (ref.cat :130-126700) (0,2 µg/ml)
en présence de l’anti-CD3 (1µg/ml) et l’anti-CD28 (1µg/ml)
- “PepTivator SARS-CoV-2 Protéine S Complet B11529/BA5” de la souche Omicron (ref.cat
:130-132-810), (0,2 µg/ml) en présence de l’anti-CD3 (1µg/ml) et l’anti-CD28 (1µg/ml)
39
Parallèlement, nous avons choisi deux pools de peptides dérivés de différentes souches de SARS-CoV-
2 pour cette étude. Le premier pool contient les peptides complet S (ref.cat :130-132-810), couvrant le
domaine S dominant de la souche Omicron (B11529/BA5), en raison de la prévalence du variant
Omicron chez huit patients DIP/COVID-19. Le second pool comprend le peptide S (ref.cat :130-
126700) de la souche Wuhan, contenant des séquences immunodominantes spécifiques.
Les surnageants de culture ont été collectés après 48 heures et stockés à -80°C pour le dosage des
cytokines.
2.2.5. Dosage de l’interféron-γ
Un dosage de l’IFN- γ a été réalisé, au niveau des surnageants de culture, par la technique ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de type sandwich en suivant les instructions du Kit « BD
OptEIATM Set for Human IFN » commercialisé chez BD Biosciences.
Principe :
L’ELISA sandwich permet le dosage de façon spécifique d’une protéine cible dans un liquide biologique
en se basant sur une réaction immunologique antigène-anticorps révélée grâce à une réaction
enzymatique colorimétrique. Elle consiste à piéger les antigènes d’intérêt, entre un « anticorps de capture
» et un « anticorps de détection » (Figure 15).
Au cours d’une première étape dite de “coating”, l’anticorps de capture est lié au plastique du fond des
puits de la microplaque par interaction électrostatique et assure la spécificité de la réaction. La solution
à tester est ensuite déposée dans les puits et l’antigène recherché va se lier spécifiquement à l’anticorps
de capture. Par la suite, l’anticorps de détection qui est capable de se lier à l’antigène capturé est ajouté
dans les puits. Ce dernier est conjugué à une enzyme catalysant une réaction chimique qui transforme
son substrat en composé coloré. La réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie à partir d'une
courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues d'antigène puisque le nombre de
molécules d'anticorps traceur fixées dépend du nombre de molécules d'antigènes immobilisées par
l'anticorps de capture.
40
Figure 15: Représentation schématique du principe de l’ELISA sandwich
Protocol expérimental :
Les plaques ELISA de 96 puits ont été sensibilisées durant une nuit à 4 °C en ajoutant 100 µL d’anticorps
de capture par puits à une concentration finale de 2 µg/mL puis lavées 2 fois avec 200 µl/puits du tampon
de lavage (PBS 1X contenant 0,05% de Tween-20). Par la suite, 200 µL de tampon d’incubation
(solution de lavage constitué de PBS avec 0,05 % de Tween 20 ; Millipore Sigma avec 0,1 % d'Albumine
Sérique Bovine) ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été incubée à température ambiante (TA)
pendant 1h. Après avoir lavé la plaque 5 fois avec la solution de lavage, 100 µl des plasmas dilués au
demi dans le tampon d’incubation ont été ajoutés à chaque puits selon le plan préparé. La plaque a été
recouverte, incubée à température ambiante pendant 2 heures, puis lavée 5 fois. Par la suite, 100 µl de
l’anticorps de détection dilué à 1 µg/mL dans le tampon d’incubation, a été ajouté à chaque puits, et
incubé à température ambiante pendant 1 h. Une autre série de lavage a été effectuée (5 fois) avant
d’ajouter 100 µL/puits de streptavidine-peroxydase de raifort (HRP ; R&D Systems, Minneapolis, MN)
dilués au 1:1000 dans le tampon d’incubation ont été ajoutés et incubés à température ambiante pendant
1 h. Enfin, la plaque a été lavée et 100 µL de substrat enzymatique colorimétrique tétraméthylbenzidine
(TMB) (BD Biosciences) ont été ajoutés à chaque puits et incubés à température ambiante dans
l'obscurité pendant 20 min. La réaction a été arrêtée en ajoutant 50µL de H2SO4 dans chaque puits. La
densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée à 450 nm et 630 nm comme longueur d'onde. Les
valeurs de DO obtenues seront corrigées par rapport à la valeur obtenue pour le blanc utilisé.
41
2.2.6. Test QuantiFERON® anti-SARS-CoV-2
La réponse immune cellulaire anti-SARS-CoV-2 a été également évaluée en utilisant le kit

QuantiFERON® SARS-CoV-2 Extended Set Blood Collection Tubes (QFN SARS-CoV-2 BCTs)
(ref.cat :626115) chez 6 patients immunodéficients prélevés en T1 (P1, P2,P7,P8,P9 et P10).
Il s’agit d’un test quantitatif qui se fait à l’aide des tubes de prélèvement sanguin spéciaux contenant
des antigènes peptidiques conçus pour stimuler les cellules immunitaires à l'aide de protéines spécifiques
au SARS-CoV-2 (Lamara Mahammed et al. 2023). Le kit contient cinq tubes:
- Un tube “Nil” : Ce tube ne contient que de l’héparine. Il s’agit du témoin négatif qui permet de
quantifier le taux de base de l’IFN-γ.
- Un tube “Mitogen” : Ce tube contient la phytohémagglutinine (PHA). Il sert de contrôle positif

permettant de vérifier la capacité proliférative des lymphocytes du patient au moment du
prélèvement et de s'assurer que la technique a été bien faite.
- Un tube “Ag1” : Ce tube contient des peptides dérivés de la sous-unité S1 (domaine de binding
des récepteurs) de la protéine Spike qui stimulent les lymphocytes T CD4.
- Un tube “Ag2” : Ce tube contient des peptides des sous-unités S1 et S2 de la protéine Spike qui
stimulent les lymphocytes T CD4 et CD8.
- Un tube“Ag3” : Ce tube contient des peptides supplémentaires (couvrant les lymphocytes T S,

N et M, ainsi que d’autres peptides de protéines codées par le génome complet du SRAS-CoV-
2). Il permet de susciter une réponse immunitaire spécifique plus complète médiée par les
lymphocytes T.
Le protocole a été effectué selon les recommandations du fournisseur (Figure 16). En effet, les tubes ont
été préalablement chauffés à 37°C pendant 15 minutes dans l’étuve. Par la suite, un prélèvement sanguin
de 1 ml a été effectué par ponction veineuse directement dans chaque tube. Les tubes ont été agités
fermement mais sans décoller le gel et rapidement mis dans un incubateur maintenu à une température
de 37°C ± 1°C pendant 16 heures. Une fois cette incubation terminée, les plasmas ont été récupérés
après centrifugation pendant 15 minutes à une vitesse de 2000 à 3000 RCF (g), puis conservés à -80°C.
La stimulation cellulaire a été suivie d’un dosage de l’IFN- γ au niveau des plasma récupérés, par la
technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de type sandwich en suivant les instructions
du Kit « BD OptEIATM Set for Human IFN » commercialisé chez BD Biosciences.
42
Figure 16: Représentation schématique du protocole du test QuantiFERON SARS-CoV-2
L’interprétation des résultats a été faite selon les recommandations du fabricant (Tableau1).
Tableau 1: Interprétation des résultats du test QuantiFERON anti-SARS-CoV-2.
Nil Ag1 Antigène Ag2 Antigène Ag3 Antigène Mitogène Résultat de QFN Interprétation
(IU/ml) moins Nil moins Nil moins Nil moins Nil SARS
(IU/ml) (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml)
≤8.0 ≥0.15 et - - - Réactive Réponse

≥25% de Nil SARS-CoV-2
détecté
- ≥0.15 et ≥0.15 et
<25% de Nil <25% de Nil
<0.15 ou <0.15 ou <0.15 ou ≥0.50 Non-réactive Réponse SARS-

≥0.15 et ≥0.15 et ≥0.15 et CoV-2
<25% de Nil <25% de Nil <25% de Nil NON détecté
<0.15 ou <0.15 ou <0.15 ou <0.50 Indéterminé indéterminé

≥0.15 et ≥0.15 et ≥0.15 et
<25% de Nil <25% de Nil <25% de Nil
≥8.0* -
Les réponses au Mitogen (et parfois les réponses aux antigènes Ag) peuvent être en dehors de la plage
du lecteur de microplaques. Cela n'a pas d'impact sur les résultats du test.
*Dans les études cliniques, moins de 0,25% des sujets présentaient des taux d'IFN-γ > 8,0 UI/ml pour
la valeur Nil.
43
2.3. Analyse statistique

Des analyses statistiques utilisant des tests non paramétriques comme Kruskal-Wallis, spearman et
pearson ont été réalisées avec GraphPad Prism version 5.
3. CONSIDÉRATIONS ÉTHIQUES ET CONFLITS D'INTÉRÊTS

Un consentement éclairé a été obtenu pour tous les patients et/ou leurs tuteurs légaux. L’adhésion à la
déclaration d’Helsinki et l’absence de conflit d’intérêt lié à ce travail scientifique ont bien été établies.
Le comité d’éthique local de l'Hôpital d’enfant a donné son approbation pour mener cette étude
(Annexe1).
44
Résultats
45
Résultats
RÉSULTATS
1. DESCRIPTION GLOBALE DES SUJETS ÉTUDIÉS
1.1. Patients ayant un déficit immunitaire primitif confirmé
Dans une première partie de ce travail, nous avons inclus, 49 patients tunisiens ayant un DIP confirmé.
Tous ont bénéficié d’un prélèvement nasopharyngé à la recherche de SARS-CoV-2 par RT-PCR.
Parmi ces 49 patients DIPs, 20 étaient asymptomatiques pour la COVID-19. Ces patients ont été visités
par une équipe de terrain et ont eu, en pleine période Omicron, des prélèvements nasopharyngés à la
recherche d’un portage asymptomatique de SARS-CoV-2. Ils étaient répartis en 12 garçons et huit filles
avec un âge allant de 8 mois à 32 ans. Parmi ces patients, cinq avaient un déficit immunitaire des cellules
phagocytaires (granulomatose septique chronique), cinq un déficit immunitaire combiné (DIC), neuf
une agammaglobulinémie et un un déficit immunitaire commun variable (CVID). La recherche du
SARS-COV-2 par RT-PCR, faite au Laboratoire de Virologie Clinique de l’Institut Pasteur de Tunis,
était négative pour tous ces patients DIPs.
Par ailleurs, nous avons également effectué des prélèvements nasopharyngés à la recherche de SARS-
CoV-2 chez 29 patients symptomatiques ayant présenté des signes cliniques en faveur d’une infection
virale. Ainsi, le génome du SARS-COV-2 a été détecté chez 11 patients (patients DIPs/COVID-19)
(Tableau 2). Il s’agit de 5 filles et 6 garçons. Deux avaient une agammaglobulinémie, trois un déficit
immunitaire commun variable (CVID), trois un syndrome hyper IgM (HIGM), un déficit immunitaire
combiné, un une ataxie télangiectasie et un greffé pour un XLP probable.
L'âge de ces patients était en moyenne de 17 ans avec des extrêmes allant de 6 ans à 41 ans. Une seule
patiente avait présenté une forme sévère nécessitant un séjour en réanimation et aucun des 10 restants
n’a nécessité une hospitalisation.
46
Résultats
Tableau 2: Profil des patients DIPs/COVID-19
Pts Type de Age Infection Pvt T0 Pvt T1 IVIG

DIPs
COVID-19
P1 Agamma 7 ans 30/07/2021 Oui Oui Oui
P2 CVID 30 ans 21/01/2022 Oui Oui Non
P3 AT 8 ans 29/07/2021 Oui Non Oui
P4 HIGM 6 ans 24/01/2022 Oui Non Oui
P5 CVID NP Oui Non Non
P6 CVID 23 ans NP Oui Non Oui
P7 CVID 41 ans 29/1/2022 Oui # Oui Oui
P8 HIGM§ 20 ans 21/2/2022 Non Oui Non
P9 HIGM§ 22 ans 21/2/2022 Non Oui Non
P10 Agamma 8 ans 18/1/2022 Oui # Oui Non
IVIG: date de la dernière prise des immunoglobulines par voie intraveineuse, Pvt T0 : date du premier
prélèvement, Pvt T1 : date du deuxième prélèvement, HIGM: Hyper IgM, CVID : déficit immunitaire
commun variable, DIC: Déficit immunitaire combiné, Gamma : Agammaglobulinémie, AT : Ataxie
télangiectasie, NF: non fait, NP : non précisé, Pts :patients
# Pas de sérum pour ce prélèvement
§ HIGM par déficit en AID confirmé
1.2. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19
Dans ce travail, nous avons inclus 12 enfants sans antécédents pathologiques notables adressés au
Laboratoire de Cyto-immunologie de l’IPT pour une infection COVID-19 sévère et/ou atypique. Onze
étaient des nourrissons avec un âge qui variait de 20 jours à 7 mois (Tableau 3). Ils étaient répartis en 6
filles et 6 garçons.
Onze ont présenté une infection SARS-CoV-2 sévère nécessitant un séjour en réanimation et un seul a
présenté un syndrome inflammatoire multisystémique (Multisystem inflammatory syndrome in
children : MISC) post-COVID-19 (S4) (Tableau 3).
47
Résultats
Une investigation immunologique de base (numération formule sanguine, dosage pondéral des
immunoglobulines (Ig) sériques, phénotypage lymphocytaire et test du nitrobleu de tétrazolium) a été
faite chez quatre patients (S1, S2, S3 et S4). Elle nous a permis d’éliminer un DIP classique chez eux.
Les autres qui étaient âgés de 50 jours en moyenne (avec des extrêmes allant de 20 à 80 jours), nous ont
été adressés uniquement dans le cadre de ce projet pour l’étude de la réponse immunitaire anti SARS-
CoV-2.
Tableau 3: Profil des enfants ayant présenté des formes sévères de la COVID-19.
Pts Sexe Âge Csg COVID-19 Forme clinique
S1 M 45 jours Oui NP Pneumopathie SARS-CoV-2 compliquée d'un

SDRA et un choc septique
S2 F 6 ans Non 30/10/2020 Pneumopathie SARS-CoV-2 compliquée d'un

SDRA
S3 F 5 mois Non NP Pneumopathie SARS-CoV-2 compliquée d'un

SDRA avec ventilation mécanique
S4 M 7 mois Non 12/04/2021 MIS-C
S5 M 68 jours Non 24/07/2021 Séjour en Réanimation
S6 F 68 jours Non 12/07/2021 Séjour en Réanimation
S7 F 80 jours NP 17/07/2021 Séjour en Réanimation
S8 F 47 jours NP 14/08/2021 Séjour en Réanimation
S9 F 20 jours Non 24/7/2021 Séjour en Réanimation
S10 M 45 jours Non 09/07/2021 Séjour en Réanimation
S11 M 40 jours NP 16/08/2021 Séjour en Réanimation
S12 M 35 jours NP 21/07/2021 Séjour en Réanimation
M: Masculin, F: Féminin, Csg: consanguinité parentale, NP : non précisé, MIS-C : Multisystem inflammatory
syndrome in children, SDRA : syndrome de détresse respiratoire aigue
48
Résultats
2. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE HUMORALE

2.1. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins vaccinés
Dans cette étude de la réponse immune humorale, nous avons inclus sept témoins immunocompétents
Tunisiens prélevés un mois après la première dose de vaccin anti-SARS-CoV-2 de type ARNm. Ainsi,
tous avaient des taux positifs d'IgG anti-RBD (Figure 17.A) et quatre avaient des niveaux positifs d'IgG
anti-N (Figure 17.B). Concernant les anticorps de type IgA, un seul avait un taux IgA anti-RBD positif
(Figure 17.C) et aucun n’avait des IgA anti-N (Figure 17.D).
Les analyses comparatives des résultats obtenus chez ces témoins vaccinés révèlent des différences
significatives entre les niveaux d'IgA anti-RBD et d'IgG anti-RBD avec un p =0,0381, ainsi qu'entre les
niveaux d'IgA anti-N et d'IgG anti-N avec un p = 0,0463 (Figure 17.E).
Figure 17: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les témoins vaccinés
La moyenne est indiquée par une barre horizontale. Le seuil de positivité est indiqué par un trait
discontinu pour chaque type d’ELISA.
2.2. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins pré-endémiques
La quantification des IgG anti-RBD, des IgG anti-N, des IgA anti-RBD et des IgA anti-N anti-SARS-
CoV-2 par ELISA a montré que tous les échantillons (19 sérums ou plasma) étaient négatifs (Figure 18).
49
Résultats
Figure 18: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez des témoins pré-endémiques
Le seuil de positivité de chaque type d’ELISA est indiqué par un trait discontinu. La moyenne est
indiquée par une barre horizontale.
2.3. Sérologie anti-SARS-CoV-2 chez les patients DIPs/COVID-19
2.3.1. Analyse des résultats obtenus en T0
La sérologie anti-SARS-CoV-2 a été effectuée chez six patients au moment du diagnostic positif de la
COVID-19 (En temps T0, Tableau 2). Ainsi, un seul a présenté un résultat positif pour les anticorps IgG
anti-S-RBD, dépassant le seuil de 0,7 (Figure 19). Il s’agit du patient P2 âgé de 30 ans et ayant un déficit
immunitaire commun variable. Le dosage des IgG anti-N était négatif chez lui.
50
Résultats
T0
Figure 19: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les patients DIPs/COVID-19
prélevés au moment du diagnostic (T0)
Par ailleurs, six patients ont eu un prélèvement à distance de l’épisode aigu (T1). Il a été fait après 1 an
et demi en moyenne avec des extrêmes allant de 21 mois à 18 mois. Ainsi, l’étude de la réponse
sérologique en T1 a montré qu’ils étaient tous positifs pour les IgG anti-RBD ainsi que pour les IgG
anti-N à l’exception d’une patiente (P9) qui avait une sérologie IgA anti-N négative (Figure 20).
Concernant l’étude de sérologie de type IgA, les 6 patients étaient négatifs pour la sérologie IgA anti-N
et un seul (P2) avait une sérologie IgA anti-S positive (Figure 20).
51
Résultats
T1
Figure 20: Sérologies anti SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les patients DIPs prélevés en T1
2.3.3. Analyse comparative des résultats obtenus en T0 et T1
Uniquement deux patients P1 et P2 ont eu deux prélèvements (T0 et T1) (Figure 21).
Figure 21: Evolution des sérologies IgG et IgA anti SARS-CoV-2 chez les patients P1 et P2
Le seuil de positivité est indiqué par un trait discontinu pour chaque type d’ELISA.
T0 : Histogrammes en étoile, T1 : Histogrammes en cercle
52
Résultats
2.4. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les enfants ayant présenté des formes sévères de
la COVID-19
Les sérums de douze enfants ayant eu des formes sévères de la COVID-19 ont été étudiés. Parmi eux,
huit avaient des taux positifs aussi bien d'IgG anti-RBD que d'IgG anti-N (Figure 22 A et B). Un seul
patient (S5) avait une discordance sérologique avec une sérologie négative pour les IgG anti-RBD mais
positive IgG anti-N.
Seulement deux (S12 et S8) des douze enfants (17%) avaient une sérologie positive pour les IgA anti-
RBD (Figure 22 C). La sérologie IgA anti-N était négative pour tous ces enfants (Figure 22. D).
L’étude de la corrélation entre les taux d'IgG anti-RBD et ceux d'IgG anti-N se révèle significative, avec
un coefficient de corrélation (r) de 0.6853 et un p-value de 0.0170 (Figure 22.F).
Les résultats de notre analyse statistique révèlent l’absence de différence significative entre les taux des
IgG anti-N et IgG anti-RBD et une différence significative, avec un p-value de 0.0009.
Figure 22: Sérologies anti-SARS-CoV-2 de type IgG et IgA chez les enfants ayant eu une forme
sévère de la COVID-19.
53
Résultats
3. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE CELLULAIRE

Afin d’étudier la réponse immunitaire cellulaire, nous avons commencé par une mise au point des tests
de proliférations cellulaires in vitro pour optimiser le protocole (concentration de peptides, anti-CD3 et
anti-CD28, temps d’incubation, ...). Par la suite, la réponse immune adaptative cellulaire a été réalisé en
stimulant, le même jour dans les mêmes conditions, les PBMCs décongelés des témoins et des patients
inclus. La figure 23 montre le plan réel des plaques de proliférations lymphocytaires effectuées.
Figure 23: Photo des plaques de proliférations lymphocytaires
L’activation cellulaire a été suivie d’un dosage par ELISA de l’interféron gamma dans les surnageants
de culture (Figure 24).
3,5
y = 0,0015x + 0,0698
3
R² = 0,9831
2,5
1,5
0,5
0
0 500 1000 1500 2000 2500
Figure 24: Exemple d’une courbe standard tracée à partir des densités optiques (DO)
correspondant aux dilutions du standard à des concentrations connues.
Une courbe de tendance linéaire est tracée permettant de calculer l’équation y = ax+b. Le coefficient
(R2) est affiché sur le graphique.
54
Résultats
Le test QuantiFERON® a été utilisé pour évaluer la réponse cellulaire chez uniquement les six
patients DIPs/COVID-19 en T1.
3.1. Etude de la réponse cellulaire chez les témoins pré-endémiques
L’étude de la réponse immunitaire adaptative cellulaire a été faite en utilisant des PBMCs décongelés
de huit témoins prélevés avant l’apparition du SARS-CoV-2. Deux ont été éliminé des analyses des
résultats car les cellules n’ont pas répondu à la stimulation par la PMA/Iono (Contrôle positif).
Pour les cinq restants, les résultats n’ont pas montré une différence statistiquement significative entre
les puits activés par les peptides du SARS-CoV-2 et les puits « anti-CD3+anti-CD28 » (Figure 25).
Figure 25: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les témoins pré-endémiques
La moyenne est indiquée par une barre horizontale
3.2. Etude de la réponse immune cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19
L'évaluation de la réponse immunitaire cellulaire anti-SARS-CoV-2 a été analysée chez six patients au
moment du diagnostic positif de la COVID-19 (en T0, Tableau 2) après stimulation des PBMCs
décongelés et dosage de l’IFN-γ au niveau des surnageants de cultures.
55
Résultats
Parmi ces patients, P3 et P5 n'ont pas bien répondu à la stimulation par les peptides Complets S et S. En
revanche, P4 a montré une réponse plus marquée à la stimulation par les peptides S par rapport à celle
par les peptides Complets S (Figure 26).
L’analyse des résultats a été faite de façon individuelle pour chaque malade car ils n’ont pas le même
type de DIPs. Ainsi, comme le montre la figure 26, P1, P2 et P6 ont un taux plus élevé d’IFN-γ dans le
surnageants de culture après activation par les peptides Complets S par rapport au non stimulé. La
réponse retrouvée chez P5 parait faible comparativement aux autres patients.
T0
Figure 26: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19 en T0
L'évaluation de la réponse immunitaire cellulaire anti-SARS-CoV-2 a été analysée chez six patients
après environ 1 an de l’épisode infectieux aigu (en T1, Tableau 2). Elle a été faite par les deux méthodes :
(1) après stimulation in vitro des PBMCs décongelés et dosage de l’IFN-γ au niveau des surnageants de
cultures et (2) après stimulation in vitro du sang total frais en utilisant le test commercialisé
QuantiFERON anti SARS-CoV-2.
Résultats obtenus après stimulation in vitro des PBMCs décongelés :
La figure 27 montre que le taux d’interféron gamma dans les surnageants de culture était supérieur au
non stimulé notamment chez les patients P1, P7 et P9.
56
Résultats
T1
Figure 27: Résultats de l’étude la réponse cellulaire chez les patients DIPs/COVID-19 en T1
Résultats obtenus après stimulation in vitro du sang total frais par le test QuantiFERON :
L’analyse de résultats obtenus par le test QuantiFERON® faite en respectant les recommandations du
fabricant en T1 (Tableau 1), a confirmé une réponse positive pour tous les patients (Figure 28) :
- P1, P7, P8, P9, et P2 ont une réponse positive pour le tube Ag1
- P1, P7, P8, P9 ont une réponse positive pour le tube Ag2
- P1, P7, P10, P8, P9, et P2 ont une réponse positive pour le tube Ag3
T1
Figure 28: Taux de l’IFN-γ libéré après activation en utilisant le Test QuantiFERON® en T1
57
Résultats
Comparaison du taux d’IFN-γ libéré entre la stimulation des PBMCs décongelés et celle du sang total
frais par le test QuantiFERON :
La comparaison des résultats du dosage de l’IFN-γ après stimulation en utilisant les deux techniques
révèle des variations statistiquement significatives entre la réponse cellulaire anti-SARS-CoV-2 induite
par la protéine S complète et les Ag1et Ag2 du QuantiFERON®. Cependant, il n’y a pas une différence
significative entre le taux d’IFN-γ induit par la protéine S complète et le Ag3.
Figure 29: Taux de l’IFN-γ libéré après activation en utilisant le Test QuantiFERON®
58
Résultats
3.2.1. Analyse comparative des résultats obtenus en T0 et T1
La comparaison de la stimulation entre T0 et T1 faite uniquement chez les patients P1 et P2 révèle une
amplification de la réponse immunitaire aussi bien après stimulation par la protéine S complète que par
la protéine S.
Figure 30: Evolution de la réponse immune cellulaire anti SARS-CoV-2 chez les patients P1 et
P2
3.1. Etude de la réponse immune cellulaire chez les enfants ayant présenté des formes
sévères de la COVID-19
Pour les onze enfants restants, qui ont développé des formes graves de COVID-19, les résultats n’ont
pas montré une différence statistiquement significative entre les puits activés par les peptides du SARS-
CoV-2 et les puits « anti-CD3+anti-CD28 » (Figure 31).
59
Résultats
Figure 31: Résultats de la réponse cellulaire chez les enfants ayant présenté des formes sévères
de la COVID-19
60
Discussion
61
Discussion
DISCUSSION
La COVID-19 est une maladie infectieuse virale de type zoonose émergente causée par le SARS-CoV-
2. Les premiers cas humains ont été signalés dans la ville de Wuhan en Chine en Décembre 2019. Depuis
cette date, ce virus s’est propagé dans le monde entier avec 701,208,611 de cas confirmés et près de
6,965,376 décès ont été enregistrés à la date du 08/01/2024. Au cours de cette pandémie COVID-19, la
communauté scientifique ont effectué un effort global afin de développer des moyens préventifs et
curatifs pour diminuer aussi bien la morbidité que la mortalité causée par le SARS-COV-2.
En Tunisie, la pandémie COVID-19 a été officiellement déclaré depuis le 2 mars 2020. L'ensemble des
24 gouvernorats étaient touchés. Comme dans le monde, plusieurs vagues se sont succédés (Figure 32).
Figure 32: Nombre des cas COVID-19 confirmés en Tunisie

(« Tunisia COVID - Coronavirus Statistics - Worldometer », 2024.)
Comme dans le monde, cinq variants d’intérêts ont été également décrit en Tunisie (VOC) : Alpha, Bêta,
Gamma, Delta et Omicron.
Après la souche sauvage, la VOC Alpha est apparue vers MARS 2021. Environ deux mois après, le
VOC Delta a été enregistré et depuis Décembre 2021 le VOC Omicron est devenu prédominant.
Discussion
Au moment de la conception et au cours de la réalisation de cette étude, les variants Delta et Omicron
existaient en Tunisie et les tests QuantiFERON n’était pas encore disponibles. Ainsi, nous avons opté
pour réaliser l’étude de la réponse immune cellulaire après activation des PBMCs décongelés par des
pools de peptides commercialisés.
Nous avons choisi deux pools de peptides dérivés de différentes souches de SARS-CoV-2 : (1) peptides
complet S (ref.cat :130-132-810) qui couvrent le domaine S dominant de la souche Omicron
(B11529/BA5) puisque huit patients DIP/COVID-19 avaient le variant Omicron. (2) Le second pool
contient le peptide S (ref.cat :130-126700) de la souche Wuhan avec des séquences immunodominantes
spécifiques.
Concernant l’étude de la réponse immune humorale, nous avons choisi de doser les IgG et les IgA de
type anti-RBD et anti-N. L’IgA est une immunoglobuline est particulièrement importante pour
l’immunité des muqueuses pourrait jouer un rôle dans la neutralisation virale à ce niveau. De plus et de
façon intéressante, il a été décrit que une augmentation précoce d’IgA est corrélée avec le risque de
développement d'une forme sévère de la COVID-19 (Vâţă et al. 2022).
1. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE ANTI-SARS-COV-2 CHEZ LES

TÉMOINS PRÉ-ENDÉMIQUES
Le SARS-Cov-2 infecte à la fois les adultes et les enfants mais les enfants immunocompétents sont
souvent asymptomatiques. La présence d’une immunité préexistante croisée liée à des infections dans
le jeune âge par d’autres coronavirus, ou liée à la vaccination pourrait jouer un rôle important dans cette
protection potentielle (Figure 33).
63
Discussion
Figure 33: Effets bénéfiques de la réponse immune croisé (Murray et al. 2023)
L’existence d’une réponse immunitaire croisée préexistante au SRAS-CoV-2 a été rapporté dans la
littérature. Cependant, son origine exacte et ses effets restent encore mal élucidés et sont des points
d'intérêt considérables pour la recherche (Murray et al. 2023). Une forte prévalence des infections par
les β-CoV HCoV-OC43 qui sont très similaire avec SARS-CoV-2 chez les enfants âgés de moins de 5
ans a été rapporté dans la littérature (Nickbakhsh et al. 2020; Monto et al. 2020; Gaunt et al. 2010).
Cependant, pour les sujets âgés de plus de 65 ans, les α-CoV 229E qui sont faiblement similaire au
SARS-CoV-2, sont plus fréquents (Nickbakhsh et al. 2020; Monto et al. 2020; Gaunt et al. 2010).
Par ailleurs, des épitopes de lymphocytes T et B avec une réaction croisée ont été prédits par des outils
informatiques. Ces épitopes sont localisés dans des zones de forte homologie entre le SRAS-CoV-2 et
les HCoV, incluant notamment la protéine de nucléocapside, la région de la protéine Spike, et les PSN
trouvés dans l'ORF14.
Dans ce travail, nous avons évalué la réponse immune adaptative (humorale, et cellulaire) anti-SARS-
CoV-2 chez des témoins Tunisiens pré-endémiques à la recherche d’une immunité antérieure croisée.
Nous avons étudié le profil sérologique de type IgG et IgA anti-SARS-CoV-2 aussi bien anti-RBD
qu’anti-N au niveau des sérums de 19 témoins immunocompétents prélevés au cours de la période pré-
endémique. Ainsi, aucun de ces sérums n’a été positif. Nos résultats sont en contradiction avec ceux
64
Discussion
rapportés par Bacher et al. 2020 et Mateus et al. 2020 qui ont confirmé la présence d’une réactivité
immunitaire envers les épitopes du SRAS-CoV-2 dans des échantillons prélevés avant l'émergence de
la COVID-19. Cette discordance peut être expliqué par la spécificité antigénique de nos tests ELISA.
L’utilisation d’autres tests ELISA avec une spécificité antigénique différente peut donner des résultats
différents. En effet, certains auteurs, ont montré que la séropositivité est essentiellement dirigée contre
la sous unité S2 (Ng et al. 2020 ; Anderson et al. 2021).
Par ailleurs, plusieurs études ont également montré l’existence d’une réponse immunitaire cellulaire
croisée. Les épitopes responsables de cette immunité cellulaire croisée sont plus fréquents que ceux
responsable de l’immunité humorale croisée. Ils incluent en plus de la protéine N structurale, des
protéines non structurales tel que ORF1 (Nina L.B et al. 2020;Swadling et al. 2022). Ceci pourrait aussi
expliquer l’absence de réaction cellulaire croisée dans nos résultats.

PATIENTS DIPs/COVID-19.
Les DIPs sont des maladies génétiques du système immunitaire. Elles sont classiquement responsables
d’une susceptibilité accrue aux infections. Cependant, les DIPs peuvent également s'associer ou se
révéler par des allergies, des cancers, des manifestations auto-immunes et auto-inflammatoires. Ces
maladies notamment celles de transmission autosomique récessive sont relativement fréquentes dans les
populations d’Afrique du Nord et du Moyen orient, caractérisées par un environnement de consanguinité
élevée (Barbouche et al., 2017). C’est pourquoi, les DIPs constituent un vrai défi en matière de santé
publique et un intérêt accru doit être attribué aux malades atteints qui sont vulnérables et peuvent
présenter des formes sévères d’infections telle que la COVID-19.
Au moment de la conception de cette étude, peu de données étaient publiés concernant l’infection
COVID-19 chez les patients ayant immunodéficients. De plus et de façon surprenante, uniquement
quelques descriptions de patients DIP/COVID-19 étaient publiés (Brough et al. 2020; Soresina et al.
2020). De plus en ces moments, la plus large étude internationale ayant colligée tous les cas rapportés
dans le monde avait inclue uniquement 94 patients (Zhang et al. 2020). C’est dans ce cadre que nous
nous sommes intéressés à l’étude de la prévalence de l’infection SARS-CoV-2 ainsi que l’évaluation du
profil de la réponse immune cellulaire et humorale chez les patients DIPs infectés par le SARS-CoV-2.
Ainsi, dans une première partie de cette étude, nous avons effectué une enquête de terrain et nous avons
réalisé 20 prélèvements nasopharyngés à recherche de SARS-COV-2chez des patients DIPs
asymptomatiques en pleine pandémie Omicron. Ces patients avaient des types différents de DIPs
(cellulaires, humoraux et des cellules phagocytaires). Les résultats virologiques de la RT-PCR ont
65
Discussion
confirmés qu’ils étaient négatifs. Ainsi, aucune infection ou portage asymptomatique n’a été retrouvé
chez ces patients DIPs. Ces résultats contrastent avec ceux de Giardino et al. en 2022 qui ont rapporté
que près de 30% des patients DIPs étaient complètement asymptomatiques et 50% présentaient des
symptômes légers à modérés. L’absence de formes asymptomatiques ici retrouvée pourrait être dû à des
pratiques comportementales rigoureuses chez ces patients vulnérables, notamment le port systématique
du masque, le respect strict de la distanciation sociale, et l'auto-isolement (Cousins et al. 2022).
Par ailleurs, malgré la pleine pandémie COVID-19, en Tunisie, nous avons colligés uniquement 11
patients DIPs ayant eu une infection SARS-CoV-2. Comme décrit dans la littérature, nous avons
confirmé la prédominance de la COVID-19 chez les patients ayant des déficits humoraux. En effet,
dans la revue de Tangye 2023, environ 60% des ∼1330 patients DIPS/COVID-19 rapportés dans le
monde avaient des déficits humoraux. Ceci est en partie expliqué par la prédominance de ce type de
DIPs dans la plupart des séries publiés ainsi que dans le registre du « Jeffrey Modell Centres Network »
en 2018 (n = 46 077) (Modell et al. 2018). Par ailleurs, différents types de DIPs étaient touché par la
COVID-19 dans la littérature (Tangye. 2023).
La majorité (11/12) des patients ici décrits a présenté des formes modérées de la maladie avec une prise
en charge à domicile. Ceci concorde avec les résultats de la série étudiée par (Giardino et al. 2022), où
le taux d'hospitalisation était significativement inférieur à celui rapporté dans d'autres études. Aucun
décès lié à la COVID-19 n'a été enregistré parmi nos patients. Cela contraste avec les conclusions de
(Shields et al. 2021), qui a rapporté une mortalité globale de la COVID-19 d’environ 10%. Ce taux de
mortalité est 10 fois plus élevés que dans la population générale (Delavari et al. 2021).
Les résultats des sérologie étudiées au moment du diagnostic de la COVID-19 (en T0, (entre 2019 et
2022), ont confirmé l’absence d’IgG ainsi d’IgA chez cinq les patients. Sterlin et al. 2021ont décrit que
les réponses humorales spécifiques au SRAS-CoV-2 étaient précoces. Cette disparité peut être expliquée
par le fait que ces patients ont des déficits touchant l'immunité humorale.
De façon, surprenante, une sérologie positive de type IgG aussi bien anti-N qu’anti-RBD a été confirmé
chez les patients en T1. Devant cette situation, nous avons évoqué en premier lieu la possibilité que le
traitement substitutif par immunoglobulines intraveineuses (IVIG) administré chez ces patients pourrait
expliquer cette positivité. Pour vérifier cette, hypothèse, nous avons tester deux lots différents (en 2023)
d’IVIG et nous avons confirmés qu’ils contiennent des IgG anti RBD et des IgG anti-N dirigés contre
SARS-CoV-2. Ce traitement pourra ainsi contribuer à la protection de ces patients vulnérables.
Le patient P2 qui est agé de 30 ans et chez qui le diagnostic de DICV a été confirmé, avait une sérologie
IgG anti RBD positive mais anti N négative enT0. Cette négativité initiale pourrait être due au fait que
les IgG anti-N augmente progressivement dans les 1 à 3 semaines suivant l’apparition de l'infection (Sun
66
Discussion
et al., 2020.). En T1, c’est le seul qui avait une sérologie positive de type IgA. Ce profil pourrait être
expliqué par la vaccination faite pour ce patient. Le traitement par les IVIG ne peut pas expliquer cette
positivité car les IVIG sont purifié et contiennent spécifiquement des IgG.
Ces observations soulignent la dynamique temporelle complexe de la réponse immunitaire après une
infection virale, avec des variations dans la production et la persistance des différents types d'anticorps.
Concernant, l’étude cellulaire, l’interprétation des résultats reste à faire avec précautions puisque on ‘n’a
pas des seuils de positivité des tests de stimulation invitro des PBMCs décongelés. L’inclusion de
témoins sains infectés et/ou des témoins vaccinés aidera à mieux analyser les résultats de cette partie.
Par ailleurs, nous n’avons pas pu réaliser des tests statistiques puisque l’effectif des patients était faible
et le suivi n’a pas pu étre réalisé que chez deux patients. Les patients DIPs sont vulnérables et on n’a
pas réaliser un suivi régulier chez ces patients.
Les réponses immunes adaptatives cellulaires et humorales à mémoires qui font suite à l'infection
naturelle ou la vaccination sont spécifiques du pathogène. Les lymphocytes B mémoires spécifiques et
les anticorps anti-SARS-CoV-2 de haute affinité contribuent à la prévention contre les infections
ultérieure par le SARS-CoV-2. Les lymphocytes T ne jouent pas un rôle direct dans la prévention de
l'infection, mais peuvent être extrêmement importants dans le contrôle de la pathogenèse virale en raison
de leur capacité à reconnaître et à lyser les cellules infectées par le virus chez les patients infectés de
manière aiguë et préviennent les formes graves de la maladie(Lim et al. 2022).

ENFANTS AYANT PRESENTE DES FORMES SEVERES DE COVID-19
De manière surprenante, nous avons colligés au Laboratoire de Cyto-Immunologie de l’IPT, des enfants
sans antécédents personnels ou familiaux notables et en bonne état de santé apparente, qui ont présenté
des formes sévères inhabituelles de la COVID19. Parmi ces enfants, huit était des nourrissons
nécessitant un séjour en réanimation. Ceci était vers la fin de la vague Delta. Cette Observation était
unique et en contradiction avec la tendance générale où les enfants présentent souvent des formes
bénignes, voire asymptomatiques, de la COVID-19 (Khoury et al. 2023). Un bilan immunitaire
standards a été fait chez 4 patients et nous a permis d’éliminer un DIP classique pouvant s’associer à
cette symptomatologie clinique.
Concernant les résultats de l’étude de la réponse immune humorale, la sérologie IgG positive chez ces
nourrissons peut être faussement positive et due au passage transplacentaire des IgG d’origine
maternelle. La sérologie positive de type IgG anti-RBD associée à une sérologie IgG anti-N négative
qui témoigne classiquement d’une immunité anti-vaccinale observé chez un nourrisson conforte cette
explication du passage d’IgG d’origine maternelle.
67
Discussion
De façon surprenante, deux nourrissons, âgés d'un mois et demi, avaient une sérologie de IgA anti RBD
positive. Classiquement le taux des IgA sériques au cours de cette tranche d’âge est faible (entre 1 à
3mois, l’IgA varie de 0,03 à 0,57) ( Pace et al. 2020 ; Trofin et al. 2022). Comme précédemment
rapporté, leur augmentation précoce peut être en rapport avec la sévérité du tableau clinique (Vâţă et al.
2022).
Par ailleurs, ces manifestations sévères non décrites dans la littérature, soulèvent des questions quant à
la nature de la souche virale en circulation ou à l'état de leur système immunitaire. Dans de tels cas, il
devient impératif de procéder au séquençage de la souche virale afin de déterminer si celle-ci présente
des caractéristiques particulièrement virulentes. Un séquençage à haut débit chez ces patients permettra
de confirmer ou infirmer l’hypothèse d’une susceptibilité génétique à des formes sévères de COVID-
19.
68
Conclusion et perspectives
Conclusion
CONCLUSION
SARS-CoV2 infecte à la fois les adultes et les enfants mais la COVID-19 est principalement observée
chez les adultes et sa gravité est beaucoup plus élevée chez les personnes âgées, en particulier celles
présentant des facteurs de risque spécifiques tel qu’un déficit immunitaire primitif. Les patients atteints
de déficits immunitaires primitifs peuvent représenter un groupe à risque d’infection virale sévères et
nécessitent donc une attention particulière.
L’objectif général de cette étude était d’évaluer le profil de la réponse immune adaptative cellulaire et
humorale chez des patients confirmés ou fortement suspects de déficits immunitaires primitifs ainsi que
chez des témoins immunocompétents prélevés avant l’apparition de SARS-COV-2. Les résultats
obtenus ont ensuite été discutés par rapport à ceux de la littérature.
Ce présent travail constitue la première étude Tunisienne investiguant la réponse immune adaptative
anti-SARS-CoV-2 post infectieuse chez des patients confirmés ou fortement suspects de DIPs. Il s’agit
également de la première étude Tunisienne qui a étudié la réponse immune anti-SARS-CoV-2 pré-
endémique. Cependant le faible effectifs aussi bien des patients que des témoins constituent un point
faible de cette étude et pourrait avoir caché certaines associations.
Dans ce travail, nous avons confirmé la faible prévalence de la COVID-19 chez les patients DIPs, même
en pleine pandémie. Ceci pourrait être dû aux mesures hygiéniques plus strictes. Nous avons aussi
montré, comme décrit dans la littérature, la prédominance de la COVID-19 chez les patients ayant des
déficits humoraux. En effet, uniquement 11 patients immunodéficients avaient une infection SARS-
CoV-2 confirmée. Il s’agit d’une : agammaglobulinémie (2cas), CVID (4cas), HIGM (3cas), ataxie
télangiectasie (1cas) et XLP greffé (1cas). Parmi ces patients, 9 étaient traités par les immunoglobulines
par voies intraveineuses. La quantification des immunoglobulines anti-SARS-CoV-2 au moment du
diagnostic (T0) ainsi qu’une année après (T1) a confirmé l’absence de d’anticorps anti-SARS-CoV-2 en
T0 mais la présence d’IgG anti-N et d’IgG anti-S en T1. Par ailleurs, la quantification de ces Igs de type
IgG anti-N et anti-S faite pour deux lots différents du traitement substitutif par les immunoglobulines
par voie intraveineuse était positive. Ceci pourra contribuer à la protection des patients qui reçoivent ce
traitement contre l’infection anti SARS-CoV-2.
L’évaluation de la réponse immune cellulaire a montré une réponse positive chez les patients ayant un
déficit humoral après stimulation par un pool de peptides du SRAS-CoV-2. Cette réponse immune
pourrait participer à la protection de ces patients immunodéficients contre les formes graves de la
maladie.
70
Conclusion
Par ailleurs, nous avons également étudié la réponse immune aussi bien humorale que cellulaire faite
chez des témoins prélevés avant l’apparition du SARS-CoV-2 (pré-endémique) à la recherche d’une
réponse immune croisée qui pourraient expliquer la faible fréquence des formes sévères chez les enfants
atteints de la COVID-19. Ainsi, nos résultats étaient négatifs et aucune réponse anti SARS-CoV-2 n’a
été détecté chez les témoins pré-endémiques.
Nous avons également colligé au cours de cette étude, des enfants ayant présenté des formes atypiques
sévères nécessitant un séjour en réanimation et/ou d’évolution fatales. Des études plus approfondies
chez ces patients tel qu’un séquençage à débit de l’exome mérite d’être effectué à la recherche d’une
prédisposition génétique aux formes sévères de la COVID-19.
71
Perspectives
PERSPECTIVES
- Etudier le profil de la réponse immune cellulaire chez des témoins immunocompétents et ou

des témoins vaccinés.
- Compléter par un dosage des cytokines par “Cytometric Bead Array” (CBA) au niveau des
surnageants de culture des PBMCs stimulés par les peptides du SARS-CoV-2 en utilisant le kit
LEGENDplexTM 1X.
- Réaliser un séquençage haut débit chez les nourrissons qui ont présenté des formes sévères de
COVID-19.
- Réaliser un séquençage des souches virales retrouvés chez les nourrissons qui ont présenté des
formes sévères de COVID-19.
72
Références bibliographiques
73
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ANNEXES
ANNEXE 1
Résumé
Au cours de la pandémie COVID-19, une attention particulière devait être portée aux populations qui pourraient
être sensibles à l'infection, tels que les patients ayant un déficit immunitaire primitif(DIPs). Ces derniers peuvent
représenter un groupe à risque potentiel d’infection sévère. Cependant, un nombre relativement limité de DIPs
infectés par SARS-CoV-2 a été rapporté particulièrement au début de la pandémie. C’est dans ce cadre que
s’intègre ce travail dans lequel nous nous sommes proposés d’étudier le profil de la réponse immunitaire
adaptative cellulaire et humorale, anti-SARS-CoV-2 chez les patients confirmés ou fortement suspects de DIPs
ainsi que chez des témoins pré-endémiques. Onze patients DIPs/COVID-19 ont été ainsi inclut dans ce travail
dont 10 avaient des DIPs humoraux sous traitement par les immunoglobulines par voie intraveineuse (IVIG).
Nous avons confirmé l’existence d’une réponse immune cellulaire positive pour ces dix patients. Par ailleurs,
l’étude de la réponse immune adaptative faite chez des témoins pré-endémiques n’a pas montré la présence
d’une réponse immune croisée. Par ailleurs, nous avons colligé au cours de cette étude, des enfants ayant
présenté des formes atypiques sévères nécessitant un séjour en réanimation et/ou d’évolution fatales.
En conclusion, nous avons confirmé la faible prévalence de la COVID-19 chez les patients DIPs, même en
pleine pandémie. Ceci pourrait être dû aux mesures hygiéniques plus strictes. Nous avons aussi montré, comme
décrit dans la littérature, la prédominance de la COVID-19 chez les patients ayant des déficits humoraux. Le
traitement substitutif par les IVIG qui actuellement contiennent anticorps anti-SARS-CoV-2 pourra contribuer
à la protection des patients qui le reçoivent. Par ailleurs, la réponse cellulaire mémoire chez ces patients participe
potentiellement à leur protection contre les formes graves de la maladie. Pour les enfants ayant eu des formes
sévères de la maladie, un séquençage à haut débit de l’exome mérite d’être effectué à la recherche d’une
prédisposition génétique aux formes sévères de la COVID-19.
MOTS CLES : Déficits immunitaires primitifs, COVID-19, SARS-CoV-2, Réponse immune adaptative,
Immunité croisée
Abstract
Patients with inborn errors of immunity (IEI) are more prone to infection with a variety of micro-organisms
including viruses. Interestingly and at least in the first year of the pandemic, COVID-19 disease has been
reported only in a few IEI patients, but since that time, larger series have been published particularly during the
more recent waves of SARS-CoV2 variants. Clearly, the identification of the major components of the immune
system critical to successful responses to SARS-CoV2 and its variants in IEI patients with COVID-19, could
pave the way to important insights into pathogenesis of this infection. In this study, eleven EII/COVI-19 patients
were included with mainly Humoral EII (10/11patients). A positive cellular immune response was confirmed in
these patients. However, the study of the adaptive immune response in pre-endemic controls did not show the
presence of a cross-over immune response. The study of the adaptive immune response in pre-endemic controls
did not show the presence of a cross-over immune response. Thus, we confirmed the low prevalence of COVID-
19 in EII patients. This could be due to stricter hygiene measures. We have also shown, the predominance of
COVID-19 in patients with humoral deficiencies. Intravenous immunoglobulin replacement therapy, which
currently contains anti-SARS-CoV-2 antibodies may protect them. Moreover, the memory cell response in these
patients is potentially involved in their protection against severe forms of the disease. We also collated data on
children who developed severe and/or life-threatening SARSCoV-2 infection/COVID-19. Whole-exome
sequencing of these patients could identified pathogenic variants.
KEYWORDS: Inborn errors of immunity, COVID-19, SARS-CoV-2, Adaptative immune response, Cross
reactive immunity

Manuscrit Jrad Mayssa VF de Soutenance 09 02 2024

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Mémoire de Stage de Fin d'Étude

En vue de l’obtention du Diplôme du Master de Recherche en

Préparé au sein du Laboratoire de Transmission, Contrôle

Étude de la réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2

Maître Assistante en Immunologie, Faculté des Sciences de

Maître de Conférences Agrégé en Immunologie, Institut

À ma chère famille et mes chers amis,

À l'âme de mon cher grand père bien-aimé,

À ma chère grande mère,

À mes chers parents,

À mes petits frères,

À ma soleil brillante, Nour,

À mes amis : Jihen, Lotfi et Vall,

Je n'oublie pas de mentionner tous les membres du Laboratoire de Cyto-Immunologie de l'Institut

Merci à tous pour votre précieuse contribution à ce travail de recherche.

LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................................... 2

LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................ 5

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................................... 8

AVANT PROPOS ................................................................................................................................. 10

SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ..................................................................................................... 13

1.1. Caractéristiques virologiques du SARS-CoV-2 ................................................................ 13

1.1.1. Structure générale du SARS-CoV-2 .......................................................................... 13

1.1.2. Structure génomique et variabilité génétique ............................................................ 15

1.1.3. Récepteurs cellulaires du SARS-CoV-2 .................................................................... 16

1.1.4. Cycle de multiplication du SARS-CoV-2 ................................................................. 17

1.2. Réponse immunitaire anti-SARS-CoV-2 .......................................................................... 18

1.2.1. Réponse immunitaire innée anti-SARS-CoV-2 ......................................................... 18

1.2.2. Réponse immunitaire adaptative anti-SARS-CoV-2 ................................................. 20

1.2.3. Tempête cytokinique au cours de la COVID-19 ....................................................... 22

1.3. Vaccination anti-SARS-CoV-2 ......................................................................................... 22

2. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS ............................................................................... 23

3. DÉFICITS IMMUNITAIRES PRIMITIFS ET COVID-19 ...................................................... 24

3.1. Caractéristiques cliniques de la COVID-19 chez les patients immunodéficients ............. 24

3.2. Susceptibilité génétique aux formes sévères de la COVID-19 .......................................... 27

OBJECTIFS DU TRAVAIL ................................................................................................................. 31

COHORTES ET MÉTHODES ............................................................................................................. 34

1.1. Témoins ............................................................................................................................. 34

1.1.1. Témoins immunocompétents prélevés au cours de la période pré-endémique ......... 34

1.1.2. Témoins immunocompétents vaccinés ...................................................................... 34

1.3. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19 ................................................ 35

1.4. Kits et peptides du SARS-CoV-2 ...................................................................................... 36

2.1. Étude de la réponse immune humorale anti-SARS-CoV-2 ................................................... 36

2.2. Étude de la réponse immune cellulaire anti-SARS-CoV-2 ................................................... 37

2.2.1. Isolement des cellules mononuclées du sang périphérique ....................................... 38

2.2.2. Congélation des cellules mononucléées du sang périphérique .................................. 39

2.2.3. Décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique congelées ............. 39

2.2.4. Stimulation in vitro des cellules mononucléées du sang périphérique ...................... 39

2.2.5. Dosage de l’interféron-γ ............................................................................................ 40

2.2.6. Test QuantiFERON® anti-SARS-CoV-2 .................................................................. 42

2.3. Analyse statistique ............................................................................................................. 44

3. CONSIDÉRATIONS ÉTHIQUES ET CONFLITS D'INTÉRÊTS........................................... 44

1. DESCRIPTION GLOBALE DES SUJETS ÉTUDIÉS............................................................. 46

1.1. Patients ayant un déficit immunitaire primitif confirmé.................................................... 46

1.2. Enfants ayant présenté des formes sévères de COVID-19 ................................................ 47

2. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE HUMORALE ............................................................. 49

2.1. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins vaccinés .................................................. 49

2.2. Sérologies anti-SARS-CoV-2 chez les témoins pré-endémiques ...................................... 49

2.3. Sérologie anti-SARS-CoV-2 chez les patients DIPs/COVID-19 ...................................... 50

2.3.1. Analyse des résultats obtenus en T0 .......................................................................... 50

2.3.2. Analyse des résultats obtenus en T1 .......................................................................... 51

2.3.3. Analyse comparative des résultats obtenus en T0 et T1 ............................................ 52

3. ÉTUDE DE LA RÉPONSE IMMUNE CELLULAIRE ........................................................... 54

3.1. Etude de la réponse cellulaire chez les témoins pré-endémiques ...................................... 55

3.2.1. Analyse des résultats obtenus en T0 .......................................................................... 55