Manuscrit Nour Finaallllllll

Mémoire de Stage de Fin d'Étude
En vue de l’obtention du Diplôme du Master de Recherche en
Génétique et Immunologie
Préparé au sein du laboratoire de Parasitologie médicale
biotechnologies et biomolécules
Mise au point de l'étude de facteurs de transcription au niveau des

cellules du sang et du liquide céphalorachidien
Présenté par
Nourhene BENZARTI
Année Universitaire 2022-2023
Soutenu publiquement le (14/01/2024)

devant le Jury composé de
Professeur en Immunologie, Faculté des

Pr. Asma Gatti Présidente
sciences de Tunis
Pr. Makram Essafi Professeur en Examinateur
Pr. Lamia Guizani Tabbane Professeur en immunologie Encadrante
Dédicaces
À Dieu, guide de ma destinée,
Que ce travail soit également dédié à la lumière divine qui a éclairé mon chemin tout au long de cette
aventure. Que la sagesse et la clarté m'accompagnent, et que chaque étape de ce parcours soit sous la
protection bienveillante de la Providence.
À ma mère, qui a toujours encouragé mes rêves, essuyé mes larmes et célébré mes succès, je souhaite
exprimer ma gratitude infinie. À ma superhéroïne du quotidien, qui a combattu chaque défi avec grâce
et résilience, je rends hommage. Chaque ligne de ce travail est imprégnée de l'influence positive de ma
mère, une figure qui m'a montré que la vraie force réside dans l'amour et la compassion.
À mon père, qui a sacrifié tant pour voir ses enfants réussir, je te rends hommage. Ta persévérance et
ton dévouement ont tracé la voie de ma propre détermination.
À mon frère, dont la présence a toujours été un soutien inébranlable, je te rends hommage. Ta
camaraderie et ta compréhension ont été des trésors inestimables tout au long de ce parcours.
À ma petite sœur, qui apporte une lumière spéciale à notre famille, je dédie ces pages remplies de
tendresse.
À mon précieux Lotfi, ton amitié, telle un phare, a éclairé les sentiers incertains de ma vie. Dans les
moments difficiles, tu as été une source de réconfort, offrant un refuge apaisant. Les instants de bonheur
partagés ont été autant de célébrations, scellant des souvenirs qui resteront gravés dans le temps. Que
cette dédicace soit une plongée au cœur des profondeurs de notre amitié, un hommage sincère à la
croissance que nous avons connue ensemble, aux rires qui ont rythmé nos jours, et aux liens
indissolubles qui ont résisté à l'épreuve du temps.
À ma tendre Mayssa, qui a toujours été à mes côtés, je souhaite exprimer ma profonde gratitude. Ton
aide précieuse et ton soutien moral ont été le souffle qui a enrichi ma détermination. Chaque mot
d'encouragement, chaque échange sincère ont constitué des rayons de lumière dans cette aventure,
illuminant les moments difficiles et amplifiant les moments de joie. Ta présence bienveillante a apporté
une dimension inestimable à ce parcours, et je suis reconnaissante de pouvoir partager cette réussite avec
une amie aussi inspirante. Merci pour ta constance, ton soutien indéfectible, et pour avoir été un pilier
solide tout au long de cette expérience.
Ce travail est dédié à deux compagnons de vie, Wissal et Valvoul, avec qui j'ai partagé tant de bons
moments et surmonté ensemble des épreuves difficiles. Votre amitié a été le fil conducteur de cette
aventure, tissant des souvenirs qui resteront gravés dans mon cœur. a wissal, c'est aussi ton amitié sincère
que j'apprécie profondément. Merci de faire partie de ces chapitres remplis de rires et d'affection.
Enfin, à deux anges qui ont illuminé mon parcours. Rafika, une bienfaitrice qui a rendu chaque étape de
mon parcours exceptionnelle. Ta gentillesse, ton amour et ton soutien constant sont les piliers qui ont
enrichi cette aventure. Wassim, qui a brillamment joué le rôle de maître résolveur de problèmes tout au
long de mon parcours. Son expertise et son dévouement ont été des atouts indispensables, contribuant
grandement à la réussite de ce master. Je vous offre ces pages remplies de reconnaissance.
Remerciements
Ce manuscrit marque la conclusion d'une année de recherche intensive au cours de mon programme de
master. En réfléchissant à cette aventure scientifique et humaine, je tiens à exprimer ma profonde
gratitude envers toutes les personnes qui ont contribué à rendre ce travail possible.
Je souhaite débuter ces lignes de remerciements en mettant en lumière le soutien exceptionnel de deux
personnes remarquables, mes professeures Lamia Guizani, professeur au laboratoire Parasitologie
médicale biotechnologies et biomolécules et Meriam Belghith, maître assistante au laboratoire
Transmission, Contrôle et Immunobiologie des Infections à l’Institut Pasteur de Tunis. Leur
encadrement dévoué, leur expertise éclairée et leur soutien constant ont joué un rôle crucial tout au
long de mon parcours de master. Je suis profondément reconnaissante pour les précieuses discussions
que nous avons eues, contribuant de manière significative à l'enrichissement de mes connaissances.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude envers la Professeure Asma Gati, Présidente du jury de mon
mémoire de master. Sa présence, son engagement et son expertise contribuera grandement à la réussite
de cette étape importante de mon parcours académique.
Je souhaite également remercier chaleureusement le Professeur Makrem Essafi , qui a consacré son
temps et ses compétences à évaluer mon travail. Sa précieuse contribution sera essentielle pour
enrichir la qualité de mon mémoire.
Exprimant ma gratitude envers Wafa Ben Hamouda pour son soutien constant et son dévouement, des
éléments cruciaux qui ont contribué significativement à mon succès.
Témoignant ma profonde reconnaissance envers Cyrine Bouabid pour son soutien précieux lors de mes
premiers jours. Sa gentillesse et son assistance ont grandement contribué à rendre cette période plus
agréable et moins stressante.
Un sincère remerciement également au Professeur Aïda Bouratbine, Professeur Hospitalo-

Universitaire et Chef du laboratoire de parasitologie médicale, pour m'avoir chaleureusement accueilli
dans son laboratoire.
Je remercie Docteur Zakaria Saied, et professeur Samia Ben Sassi, de l’institut de neurologie Mongi
Ben Hamida de Tunis. Je vous remercie pour votre disponibilité, votre aide et votre collaboration tout
au long de cette expérience.
.
Table des matières
LISTE DES FIGURES .............................................................................................................................6
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................................8
AVANT-PROPOS ..................................................................................................................................10
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................................12
1. SYNDROME DE BEHÇET .......................................................................................................12
1.1. Historique du syndrome de Behçet.....................................................................................13
1.2. Epidémiologie ....................................................................................................................14
1.3. Les manifestations cliniques de la maladie de Behçet........................................................16
1.4. Mécanismes de la maladie ..................................................................................................17
2. NEURO-BEHÇET .....................................................................................................................18
2.1. Epidémiologie du NB .........................................................................................................19
2.2. Manifestations cliniques neurologique ...............................................................................19
2.3. Réponse immunitaire lors du Behçet et la forme neurologique de la maladie ...................20
3. NF-KB : FACTEUR DE TRANSCRIPTION CLÉ DE LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE ..26
3.1. Structure et fonction de NF-κB ..........................................................................................27
3.2. Mécanismes d’activation de NF-κB ...................................................................................28
3.3. Fonction de NF-kB dans les cellules immunitaires adaptatives .........................................32
3.4. NF-κB dans la régulation de l’inflammasome ....................................................................33
3.5. NF-κB dans les maladies inflammatoires ...........................................................................35
4. INTERLEUKINE-6 (IL-6) .........................................................................................................36
4.1. L’IL-6 et son récepteur .......................................................................................................36
4.2. Fonctions biologiques de l’IL-6 .........................................................................................37
4.3. Signalisation cellulaire de l’IL-6 ........................................................................................38
5. RÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DE L’IL-6 ......................................................................40
5.1. Impact de NF-κB sur la production d’IL-6 .........................................................................42
OBJECTIF DE TRAVAIL .....................................................................................................................44
MATÉRIEL ET MÉTHODES ...............................................................................................................46

1. MATÉRIEL ................................................................................................................................46
1.1. Patients ...............................................................................................................................46
1.2. Individus contrôles .............................................................................................................46
1.3. Éthique................................................................................................................................46
1.4. Approches de travail ...........................................................................................................47
2. MÉTHODES ..............................................................................................................................47
2.1. Conditionnement du prélèvement sanguin .........................................................................47
2.2. Isolement des PBMCs ........................................................................................................47
2.3. Comptage des cellules ........................................................................................................48
2.4. Détection et identification des protéines par Western Blot ................................................49
2.5. Phénotypage lymphocytaire par cytométrie en flux ...........................................................53
Résultats .................................................................................................................................................57
1. EXPRESSION DE L’IL-6 DANS LE LIQUIDE CÉPHALORACHIDIEN ET LES CELLULES

DU SANG PÉRIPHÉRIQUE.............................................................................................................57
2. ACTIVATION DE NF-KB DANS LES CELLULES DU SANG .............................................58
3. ETUDE DE PHOSPHO-STAT3 PAR CYTOMÉTRIE EN FLUX ...........................................59
3.1. Profil des populations lymphocytaires ...............................................................................59
3.2. Analyse comparative de la phosphorylation de STAT3 .....................................................60
DISCUSSION.........................................................................................................................................72
CONCLUSION ......................................................................................................................................77
PERSPECTIVES ....................................................................................................................................80
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................................................82
Liste des abréviations
3
- Foxp3 : Forkhead Box P3
-ADN : Acide Désoxyribonucléique - G-CSF : Facteur de stimulation des

colonies de granulocytes
-ASC : Apoptosis-associated speck-like
protein - GATA-3 : Gata Binding Protein 3
containing a CARD - GM-CSF : Facteur de Stimulation Des

Colonies de Granulocytes-Macrophages
-BAFF : B Cell Activating Factor
- GWAS : Genome Wide Association
-BS : Syndrome de Behçet Study
-CD : Cluster de Différenciation - HLA : Antigènes Des Leucocytes

Humains
-CMH: Complexe Majeur
d'Histocompatibilité - HSV : Virus herpès simplex
- CPA : Cellules Présentatrices d'Antigènes - IFN-γ : Interféron Gamma
- CRP : Protéine C Réactive - Ig : Immunoglobuline
- CVST : Thrombose veineuse cérébrale - IL : Interleukine
- CXCL8 : Interleukine-8 - JAK/STAT : Janus kinase/Signal

Transducer and Activator of
- CXCR3 : Récepteur 3 de La Chemokine Transcription
CXC
- LCR : Liquide Céphalo-Rachidien
- DAMP : Damage-Associated Molecular
- LIF : Leukemia Inhibitory Factor
Pattern
- LT : Lymphocytes T
- DC : Cellule dendritique
-MB : Maladie de Behçet
- DO : Densité Optique
- MMP9 : Matrice Métalloprotéinase 9
- EBV : Epstein Barr virus
- MyD88 : Myeloid Differentiation
- EAE : Encéphalomyélite Autoimmune Primary Response 88
Expérimentale - NB : Neuro-Behçet
- EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid - NEMO : NF-κB Essential Modulator
- ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent - NIK : Nck Interacting Kinase
Assays - NIND : Maladies Neurologiques Non

Inflammatoires
- eNOS : Oxyde nitrique synthase
endothéliale - NLRP3 : NOD-like receptor family,
pyrin domain containing 3
- FITC : Isothiocyanate de Fluorescéine
4
- SVF : Sérum de Veau Foetal - NO : Oxyde Nitrique
- T-bet : Facteur de transcription T-box - PBS : Phosphate-Buffered Saline

expressed in T cells
- PCR : Polymerase Chain Reaction
- TCR : Récepteur des Cellules T
- PE : Phycoerythrin
- Th : Lymphocyte T helper
- RelA : Protéine de RelA
- TGF-β : Facteur de croissance
transformant β - RelB : Protéine de RelB
- TLR : Toll-like receptors - RORC : Récepteur Orphelin Gamma T

(RORγt)
- TNF : Facteur de Nécrose Tumorale
- ROS : Espèces Réactives de L'oxygène
- TNFAIP3 : Facteur de Nécrose Tumorale,
la protéine 3 induite par alpha - RPMI : Roswell Park Memorial
Institute Medium
- TNFR : Récepteur du facteur de nécrose
tumorale - SEP : Sclérose En Plaques
- Tregs : Lymphocytes T régulateurs - SEP-RR : Sclérose En Plaques

Récurrente-Rémittente
- UV : Ultraviolet
- SNC : Système Nerveux Central
- VEGF : Vascular Endothelial Growth
Factor - SNP : Système Nerveux Périphérique
- sIL-6R : Soluble Interleukin-6 Receptor
5
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Manifestations variées de la maladie de Behçet sur différents organes. ................................13

Figure 2: Historique de la maladie de Behçet........................................................................................14
Figure 3: Prévalence de maladie de Behçet dans le Monde. .................................................................15
Figure 4: Manifestations cliniques cutanées de la MB. .........................................................................16
Figure 5: Pathogenèse de la MB. ...........................................................................................................17
Figure 6: Les Facteurs impliqués dans la pathogenèse du syndrome de Behçet. ..................................18
Figure 7: Implication de l'immunité innée dans la maladie de Behçet ..................................................21
Figure 8: Physiopathologie de l’atteinte vasculaire dans le syndrome de Behçet ................................22
Figure 9: Rôle des cellules T et les cytokines dans la maladie de Behçet .............................................24
Figure 10: NF-κB et Inflammation ........................................................................................................27
Figure 11: Structure schématique des différents membres de la famille NF-kB. ..................................27
Figure 12: Voies de signalisation NF-κB canoniques et non canoniques .............................................29
Figure 13: Modulation de la Signalisation NF-κB par la Protéine A20 ................................................31
Figure 14: Cascade de signalisation de NF-kB .....................................................................................32
Figure 15: Récepteurs de type Nod et leurs ligands .............................................................................33
Figure 16: Signalisation NF-κB et inflammasome ................................................................................34
Figure 17: Rôle de NF-κB dans l’activation de STAT3 ........................................................................35
Figure 18: Famille de Cytokines de Type IL-6. ....................................................................................36
Figure 19: Structures de l'IL-6 ...............................................................................................................36
Figure 20: Implications d'IL-6 dans la Modulation de la Réponse Immunitaire. ..................................37
Figure 21: Les rôles multiples de l'IL-6 ................................................................................................38
Figure 22: Voies de signalisation de l’IL-6 ...........................................................................................39
Figure 23: Signalisation en aval du récepteur de l’IL-6 ........................................................................40
Figure 24: Régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du gène IL-6. ................................41
Figure 25: Procédure de séparation des cellules mononucléées du sang périphérique. ........................48
Figure 26: Cellule de Malassez-comptage cellulaire. ............................................................................48
Figure 27: Fondement du dosage protéique par la méthode BCA.........................................................50
Figure 28: Plaque de dosage des protéines. ...........................................................................................50
Figure 29: Principe de cytométrie en flux. ............................................................................................54
Figure 30: Boxplots représentatifs de l’expression relative d’IL-6 dans le LCR et les PBMCs. ..........58
Figure 31: Cinétique d’expression de la sous-unité p65 NF-KB chez les Témoins. .............................59
Figure 32: Marquage CD3 et CD19 au niveau des PBMCs. .................................................................60
Figure 33: Profil des cellules non marquées d’un individu NB.............................................................61
Figure 34: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT non stimulés. .....................................62
6
Figure 35: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT après stimulation à l’IL-6. ................64
Figure 36: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT après stimulation à l’IL-10. ..............66
Figure 37: Représentation des taux de P-STAT3 au niveau des populations CD19. ............................68
Figure 38: Représentation des taux de P-STAT3 au niveau des populations CD3 par histogramme. ..69
7
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Composition des deux gels de migration. ...........................................................................52

Tableau 2: Taux de phosphorylation de STAT3 au niveau des populations CD19. .............................67
Tableau 3:Taux de phosphorylation de STAT3 au niveau des populations CD3. ................................67
8
Avant-propos
9
AVANT-PROPOS
Au fil des décennies, la recherche médicale a fait des avancées significatives dans la compréhension des
maladies auto-immunes, mais certaines conditions demeurent énigmatiques, défiant souvent les efforts
de diagnostic et de traitement. C'est dans ce contexte que s'inscrit notre étude, axée sur la maladie de
Neuro-Behçet, une pathologie rare et complexe.
La maladie de Neuro-Behçet, une manifestation neurologique de la maladie de Behçet, présente des

défis diagnostiques considérables en raison de ses symptômes hétérogènes et de sa rareté. Notre
engagement dans ce projet de recherche découle d'une volonté commune d'améliorer le diagnostic
précoce de cette maladie débilitante.
L'une des caractéristiques notables de la maladie de Neuro-Behçet est la surexpression de l'IL-6 chez les
patients. Pour approfondir notre compréhension de ce mécanisme, nous avons orienté nos efforts vers
l'étude des facteurs de transcription NF-κB par la technique du Western Blot, en nous concentrant
particulièrement sur sa phosphorylation. En examinant ce processus, nous cherchons à élucider le rôle
potentiel de NF-κB dans la surproduction d'IL-6 chez les patients atteints de Neuro-Behçet.
De manière complémentaire, nous avons élargi notre champ d'investigation en examinant le STAT3 et
sa phosphorylation, évaluant la phosphorylation de STAT3 (pSTAT3) chez les patients NB par rapport
aux témoins sains et aux patients atteints de sclérose en plaques (SEP). Les résultats préliminaires
suggèrent un taux élevé de pSTAT3 chez les patients Neuro-Behçet, établissant une distinction
significative par rapport aux groupes contrôle.
En partageant ces résultats, nous aspirons à contribuer à la compréhension accrue de la maladie de

Neuro-Behçet et, ultimement, à l'amélioration du diagnostic, ouvrant peut-être la voie à des interventions
thérapeutiques plus ciblées et efficaces.
10
Synthèse bibliographique
11
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
1. SYNDROME DE BEHÇET
La maladie de Behçet (MB), est une maladie inflammatoire chronique d’origine indéterminée qui peut
affecter pratiquement tous les organes et systèmes de l’organisme, témoignant de sa complexité
pathologique et de son impact multifactoriel (Fig.1). Elle est actuellement classée parmi les vascularites
primitives non nécrosantes (Zouboulis et Keitel 2002 et Kural-Seyahi et al.2003). Cette pathologie se
caractérise par une inflammation systémique, des dysfonctionnements immunitaires, une évolution
chronique par poussées, et une diversité de symptômes cliniques avec une évolution plus sévère chez
les sujets masculins (Serdaroğlu.1998). Ces symptômes englobent des accès récurrents d'aphtes buccaux
et génitaux, des lésions cutanées évocatrices, des arthrites, des uvéites, des vascularites rétiniennes, des
atteintes neurologiques centrales, des thromboses veineuses, et des lésions intestinales.
Le diagnostic de la MB repose sur des critères cliniques définis par des groupes internationaux d'étude
(Groupe international d'étude.1990). Lorsque la maladie de Behçet affecte le système nerveux, elle est
qualifiée de "Neuro-Behçet" (NB), constituant ainsi une complication sérieuse de cette maladie
multisystémique. Le NB se manifeste par une combinaison de symptômes neurologiques chez les
patients atteints de la maladie de Behçet, incluant des syndromes du tronc cérébral, des présentations
similaires à la sclérose en plaques, des troubles du mouvement, des syndromes méningo-
encéphalitiques, des atteintes de la moelle épinière, des thromboses des sinus veineux cérébraux (CVST)
et une hypertension intracrânienne. Bien que la physiopathologie complète de la MB demeure
incomplètement comprise, elle implique des facteurs infectieux et des anomalies du système
immunitaire, tant inné que adaptatif. Le caractère complexe de la MB engendre une réflexion
approfondie sur sa véritable nature. Cette complexité soulève des questions cruciales, incitant à
déterminer si la maladie relève d'un profil auto-inflammatoire, auto-immun, ou d'une combinaison
subtile des deux.En raison de la complexité de la maladie, de l’implication de plusieurs systèmes et de
la variété des manifestations cliniques, certains préfèrent le terme de syndrome de Behçet (BS) à celui
de maladie (Yazici et al.2003 et Sabahattin Saip et al. 2014).
12
Figure 1: Manifestations variées de la maladie de Behçet sur différents organes (john libbey
eurotext.2017).
1.1. Historique du syndrome de Behçet
Il y a environ 2500 ans, Hippocrate aurait possiblement été le premier à décrire ce qui est maintenant
reconnu comme la maladie de Behçet. Dans son œuvre intitulée "Epidemion" (troisième livre), il évoque
une maladie endémique en Asie mineure, caractérisée par des ulcérations aphteuses, des écoulements
des parties génitales, et une atteinte ophtalmique aqueuse de nature chronique entraînant la perte de la
vue chez de nombreuses personnes.
En 1937, le professeur de dermatologie turc Hulusi Behçet a identifié trois patients présentant des aphtes,
des ulcères génitaux et une uvéite hypopionique (Behçet.1937) pour lesquels il émet une étiologie virale.
L'historique de la maladie de Behçet est illustré dans la figure ci-dessous (Fig. 2).
13
Figure 2: Historique de la maladie de Behçet (Créé par l'auteur).
En 1772, à Lyon, Janin a exposé le cas d'un homme présentant une affection oculaire récurrente.
En 1920, Gilbert a introduit le terme d'"iridocyclite septique" et a attribué à ce syndrome le nom
d’ophtalmie lente
En 1930, Kummer a introduit la notion d'aphtose chronique récidivante.
En 1931, le Dr Adamantiades et Dascalipoulos ont souligné le caractère fébrile de la maladie de Behçet,
associant iritis, ulcérations buccogénitales, phlébite et hydarthrose aux genoux.(J M S Pearce.2006)
En 1937, Hulusi Behçet a identifié une entité regroupant une aphtose buccale, une aphtose génitale, et
une inflammation oculaire caractérisée par une uvéite.(Behçet et al.2010)
1.2. Epidémiologie
La maladie de Behçet était principalement observée le long de l'ancienne Route de la Soie, qui reliait
l'Est à l'Ouest (Davatchi et al.2017). Elle est particulièrement répandue dans les zones situées à l'est du
bassin méditerranéen, notamment en Iran, au Japon et en Afrique du Nord (Fig. 3) (Wechsler et al. 1992
et M. Basaran et al.2004). Elle se manifeste généralement entre 20 et 40 ans avec une prévalence
masculine (Al-Araji and Kidd. 2009). La moyenne d'âge de la maladie se situant autour de 30 ans. Elle
peut cependant, également affecter les nouveau-nés et les enfants.
La prévalence de la maladie est variable en fonction des régions (Fig. 3) Deux raisons majeures
pourraient expliquer cette tendance :
● La migration de populations des régions à forte prévalence vers des régions à prévalence plus
faible, ainsi qu'une meilleure compréhension de la maladie par les professionnels de la santé, ce
qui les conduit à orienter les patients vers des centres spécialisés.
14
● Les facteurs environnementaux (Davatchi et al. 2017).
F
F Figure 3: Prévalence de maladie de Behçet dans le Monde créé par l'auteur.
ii
gg La maladie de Behçet montre une prévalence élevée le long de l'ancienne route de la soie, avec des taux
u significatifs en Iran, au Japon et en Afrique du Nord. La Turquie et l'Iran affichent la plus forte incidence
ur
re mondiale de la maladie, comme rapporté par Wechsler et al en 1992 et Basaran et al en 2004.
S
eE En Tunisie, aucune étude épidémiologique appréciant la fréquence et l’incidence de la maladie de Behçet
SQ
F n’a été conduite à l’exception d’une étude monocentrique décrivant une incidence de 5 nouveaux cas
Ei par an en 2021 (Daoud et al. 2021). Le taux de mortalité global des patients atteints du BS est
Qg
u significativement plus élevé chez les jeunes hommes (<25 ans) et au début de l'évolution de la maladie
Fr chez ceux qui présentent une atteinte des organes principaux (Kural-Seyahi et al. 2003). La fréquence
ie des patients présentant des manifestations neurologiques varie considérablement, de 1,3 à 59 % suivant
\
g* les régions (Oguz, Hizli, et Gonul 2017 et Kim et al. 2019). En Tunisie, selon les études réalisées, elle
uA varie entre 11,6% (Hamzaoui et al. 2006 et hamzaoui et al 2012) 19,2% (Daoud et al. 2021) et 28.1%
R
rA (M.-H. Houman et al. 2013).
eB
I 15
\C
*3
:
AP
1.3. Les manifestations cliniques de la maladie de Behçet
Les symptômes de la MB comprennent des lésions aphteuses dans la bouche et les organes génitaux
(Fig. 4a et Fig. 4b), des manifestations cutanées telles que la pseudofolliculite et l'érythème noueux (Fig.
4c) (Dolan et al.2010), des symptômes oculaires liés à une uvéite, des douleurs articulaires et des
arthrites, des manifestations gastro-intestinales comme des ulcérations de l'œsophage et des problèmes
vasculaires, y compris des lésions veineuses et artérielles (Dolan et al. 2010 et Sabahattin Saip et
al.2014).
Figure 4: Manifestations cliniques cutanées de la MB (Villa-Forte).
16
1.4. Mécanismes de la maladie
La maladie de Behçet est déclenchée par un ensemble de facteurs environnementaux, notamment des
infections, influençant le système immunitaire inné et acquis chez des individus génétiquement
prédisposés (Fig. 5).
Figure 5: Pathogenèse de la MB.
Une activation des lymphocytes T CD4+ est déclenchée par des facteurs environnementaux chez les
individus génétiquement prédisposés. Cette activation conduit à la sécrétion de cytokines qui stimulent
d'autres cellules immunitaires inductrices de l'inflammation, déclenchant ainsi une cascade auto-
immune incontrôlée dans les tissus vasculaires (Zeidan et al. 2016).
Les infections par des bactéries, en particulier le Streptocoque sanguin (Pineton de Chambrun et al.
2012), et par certains virus tels que le virus herpès simplex (HSV) (Eglin et al. 1982), le cytomégalovirus
et l'Epstein Barr virus (EBV) (Pineton de Chambrun et al. 2012; Correia et al. 2015 et Tong et al. 2019).
Cependant, le rôle précis des virus dans la pathogenèse de la maladie reste hypothétique et nécessite
davantage de recherche.
Par ailleurs, les facteurs génétiques, en particulier les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH), jouent un rôle crucial dans la susceptibilité à la MB. L'allèle HLA-B51 du CMH a été fortement
associé à la maladie, avec des implications importantes dans diverses populations ( Mizuki et al. 1997;
Davatchi et al.2008; hormoz et al.2010; Davatchi et al. 2010; et Houman et Bel Feki 2014)(Fig. 6).
17
Figure 6: Les Facteurs impliqués dans la pathogenèse du syndrome de Behçet (Mattioli et al. 2021).
Des facteurs génétiques et environnementaux peuvent contribuer à l’apparition du syndrome de Behçet,

une réponse inflammatoire innée anormale, et une hyperactivité des neutrophiles. Les mutations dans
les cascades auto-inflammatoires comme NF-kB et l'activation du JAK/STAT, associées à un milieu
cytokinique pro-inflammatoire, ainsi que l'implication des lymphocytes T CD8+ et γδ, jouent un rôle clé
dans la maladie.
2. NEURO-BEHÇET
En 1941, le premier cas d'autopsie décrivant l'atteinte neurologique dans la maladie de Behçet a été
rapporté à Berlin (Demir et al.1999).
Le NB est définie comme la présence de symptômes et/ou de signes neurologiques chez des patients
atteints de manière avérée de la MB, elle se manifeste généralement après l'apparition des symptômes
de la MB, bien qu'elle puisse parfois les devancer ou même se présenter comme la première
manifestation de la maladie (Al-Araji et Kidd.2009 et Borhani-Haghighi et al. 2020). Le NB affecte
principalement le système nerveux central (SNC), bien qu'elle puisse également toucher le système
nerveux périphérique et présenter d'autres manifestations peu communes (Al-Araji et Kidd.2009). Les
manifestations neurologiques sont souvent associées à des anomalies détectées dans des études
d'imagerie, l'analyse du liquide céphalorachidien (LCR), les études électrodiagnostiques ou d'autres
outils d'investigation. Le diagnostic peut également être confirmé par des études histopathologiques. Il
est essentiel d'éliminer toutes les hypothèses de diagnostic différentiel avant de conclure qu'il s'agit bien
du NB (Borhani-Haghighi et al. 2020).
18
2.1. Epidémiologie du NB
L'âge de début du NB se situe généralement entre 20 et 40 ans (I.casanova et al.2012). Cependant, une
approche diagnostique particulièrement prudente est recommandée au-delà de l'âge de 50 ans, avec une
exclusion attentive d'autres troubles neurologiques plus courants.
Il convient de noter que les complications neurologiques liées au NB peuvent également survenir chez
les enfants (Fujikawa et Suemitsu.1997 ; Koné-Paut et al.1998). La prévalence du NB parmi les patients
atteints de la MB est estimée à environ 9%, avec une fourchette variant de 1.3% à 59%, selon plusieurs
études (Al-Araji et Kidd, 2009 ; Domingos et al. 2015 ; Kidd, 2017; Borhani-Haghighi et al. 2020). Dans
la plupart de ces études, le NB est significativement plus fréquent chez les hommes et les adultes plus
jeunes (M.-H.Houman et al. 2013 ; Noel et al. 2014).
2.2. Manifestations cliniques neurologique
Les manifestations du NB peuvent être catégorisées en manifestations du SNC et manifestations du

système nerveux périphérique (SNP).
Les manifestations du SNC se divisent en sous-types parenchymateux et non parenchymateux. Le sous-

type parenchymateux est plus répandu et se manifeste par des syndromes du tronc cérébral, des atteintes
hémisphériques, de la moelle épinière et méningo-encéphalitiques.
Le sous-type non parenchymateux inclut la thrombose des sinus veineux cérébraux (CVST) et une
implication artérielle (Benamour et al. 2006; Kebede et al. 2022 ). Les présentations du tronc cérébral
semblent être le syndrome le plus courant (M.-H. Houman et al. 2013 ; Domingos et al. 2015). Les
manifestations du SNP, rarement observées dans le NB, comprennent des neuropathies, des myopathies
et des troubles de la jonction neuromusculaire (Akman-Demir et al. 1999 ; Kalra et al.2013 ; Kalra et
al. 2014).
19
2.3. Réponse immunitaire lors du Behçet et la forme neurologique de la maladie
2.3.1. Réponse Innée
La réponse innée implique plusieurs types de cellules, telles que les cellules NK, les neutrophiles et les
cellules T gamma delta ainsi que les protéines de choc thermique (HSP) et l'oxyde nitrique (NO) (Fig.7).
2.3.1.1. Les HSP : Acteurs Clés de la Physiopathologie de la Maladie de Behçet
Les protéines du choc thermique (HSP), en particulier celles de 60 et 65 kDa, émergent comme des
candidats potentiels d'initiation de la MB ou de ses poussées ( Pervin et al. 1993 ; Direskeneli et al. 2000
; Eksioglu-Demiralp et al. 2001). Ces HSP agissent en tant que transporteurs intracellulaires de protéines
lorsque la cellule est soumise à des conditions stressantes telles que l'infection, l'hypoxie, les
traumatismes, les rayonnements UV et les substances toxiques ( T. Tanaka et al. 1996; W. Hu et al. 1998
; Direskeneli et al.2003; Stanford et al. 2004) .
Le mimétisme moléculaire basé sur l'homologie de séquences entre les peptides HSP microbiens et
F
humains déclenche des réponses auto-immunes chez les patients atteints de la MB (Tong et al. 2019).
i que les molécules HSP soient exprimées par tous les tissus en réponse au stress, la MB affecte
Bien
g
seulement certains tissus. Cette sélectivité pourrait résulter de variations dans l'expression locale de ces
u
protéines avec une préférence d'expression au niveau de la rétine ou de la peau (Benamour et al. 2006).
Les
r peptides de HSP, ont montré une capacité d’activer les cellules Tγδ, déclenchant ainsi une
e
augmentation de la réponse immunitaire, avec une prolifération accrue de LT autoréactifs spécifiques
deS HSP60 humaine (Pervin et al. 1993). Cette prolifération pourrait contribuer à des processus auto-
E
immuns (W. Hu et al. 1998) (Fig. 7).
Q
F
i
g
u
r
e
\
*
A
R
A
B
I
C 20
7
:
Figure 7: Implication de l'immunité innée dans la maladie de Behçet (Tong et al. 2019).
La MB, liée à une prédisposition génétique, pourrait être déclenchée par des infections bactériennes
et/ou virales. Des études suggèrent une mimique moléculaire entre les peptides HSP microbiens et
humains, provoquant des réponses auto-immunes. Des auto-antigènes comme l'antigène S et l'IRBP,
pourraient jouer un rôle crucial dans l’induction l’immunité innée et l’installation d’une inflammation
chronique (Tong et al.2019).
2.3.1.2. Rôle de L'oxyde nitrique
L'oxyde nitrique (NO) est généré à partir de l'arginine par l'enzyme endothéliale appelée oxyde nitrique
synthase (eNOS), exprimée à la surface des cellules endothéliales. Une augmentation des concentrations
de NO a été observée au cours de la maladie de Behçet, dans le sérum, les érythrocytes et le liquide
synovial (Duygulu et al. 2005).
2.3.1.3. Neutrophiles
Les neutrophiles chez les patients atteints de la MB montrent une activation intrinsèque élevée,
potentiellement associée à HLA-B51, et sont généralement impliqués dans l'infiltration périvasculaire
dans les lésions de la MB (Eksioglu-Demiralp et al. 2001). Les neutrophiles hyperactifs peuvent
accroître la chimiotaxie, la phagocytose et la production de superoxyde (Deuter et al. 2008). Des niveaux
élevés de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, notamment l'IL-8, le TNF-α, l'IFN-γ, le
facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF)/G-CSF et le CXCL-8,
peuvent être associés à l'état primaire des neutrophiles (Keller et al. 2005 ; Neves et Spiller.2013). Dans
une série étendue de patients atteints de NB parenchymateux (p-NB), l'examen cellulaire du LCR a
21
révélé une pléiocytose dans environ la moitié des cas avec une prédominance de neutrophiles (
Nakamura et al.1980 ; Akman-Demir et al.1999).
2.3.1.4. Cellules NK
Les cellules NK régulent la fonction de plusieurs cellules immunitaires, notamment les cellules
dendritiques (DC) et les LT, via la sécrétion de cytokines (Serina et Giove.1991). Ces cellules peuvent
produire de grandes quantités d'IFN-γ, du GM-CSF et des chimiokines. Hasan et al. ont rapporté que le
nombre de cellules NK CD56bright CD16- et CD56dimCD16+ étaient réduites dans le sang périphérique
des patients atteints de la MB par rapport au nombre de ces cellules chez les témoins sains (Hasan et al.
2017). Cette diminution peut refléter un recrutement de ces cellules cytotoxiques vers des sites
inflammatoires et l'activation et le maintien de l'inflammation tissulaire par la production de cytokines
Th1(Fig.8). L’unique étude réalisée chez les patients NB a montré que les NK issues du sang
périphérique étaient les principaux producteurs de MMP 9 (Aldinucci et al. 2018).
2.3.2. Réponse adaptative
2.3.2.1. Réponse cellulaire
Dans la MB, il existe une toxicité directe exercée par les lymphocytes en circulation contre les cellules
épithéliales du soi (Takeno et al. 1995 ; Wechsler, et al.1999). La MB est dominée par la réponse
immunitaire des cellules Th1 et Th17 caractérisés par la production d’IL-17 et associées à des maladies
auto-immunes (Fig. 8).
Figure 8: Physiopathologie de l’atteinte vasculaire dans le syndrome de Behçet (Toledo-Samaniego et

al. 2022).
22
La thrombose dans la maladie de Behçet résulte de thrombus inflammatoires attachés à la paroi des
vaisseaux, appelés « thromboinflammation ». Les cellules Th1 et Th17, l'activation plaquettaire et la
NADPH oxydase des neutrophiles contribuent à ce processus. Les pièges extracellulaires neutrophiles
(TNE) libérés entretiennent l'inflammation et causent des lésions vasculaires, faisant de la BS un modèle
de thrombose induite par l'inflammation.
2.3.2.1.1. Cellules Th1
La réponse immunitaire de type Th1 joue un rôle important dans la pathogenèse de la MB. Les niveaux
d'expression des cellules Th1 et des cytokines associées sont liés à l'activité de la MB. Des études ont
montré que les fréquences des cellules Th1 et de leurs cytokines, ainsi que du facteur de transcription
T-bet, étaient significativement plus élevées chez les patients atteints de la MB active par rapport à ceux
atteints de la MB inactive (Aridogan et al. 2003).
Les cellules Th1 produisant de l'IFN-γ activent les macrophages, responsables de l'immunité à médiation
cellulaire contre les pathogènes intracellulaires, et sont associées à de nombreuses maladies auto-
immunes spécifiques d'organes, dont la MB (El-Asrar et al. 2011).
2.3.2.1.2. Cellules Th17
Les cytokines l'IL-6, TGF-β, IL-21 et IL-23 favorisent la différenciation des cellules Th0 en cellules
Th17 via notamment l’activation du facteur de transcription STAT3.
Les cellules Th17 produisent ensuite des cytokines telles que l'IL-17A, l'IL-17F, l'IL-21, l'IL-22 et l'IL-
23 pour réguler l'inflammation et l'auto-immunité (Singh et al. 2014) (Fig.9).
L'IL-23 participe à la pathogenèse de la MB en favorisant la production d'IL-17 par les cellules Th17 et
joue donc un rôle important dans l'expansion et la survie de ces cellules (Jiang et al. 2010). L'IL-21 en
combinaison avec l'IL-7 ou l'IL-15, favorise l'expansion des LTCD8+ effecteurs(Zeng et al. 2005), et
peut activer les cellules NK(Kasaian et al. 2002). De plus, l'IL-21 est essentielle pour la différenciation
des LB en plasmocytes et le changement de classe d'anticorps(Ozaki et al. 2004).Dans la MB, les taux
de LTh17 et des cytokines associées sont en corrélation avec l'activité de la maladie. Plusieurs travaux
(Chi et al. 2008; Nanke et al.2017) ont montré que les proportions des cellules Th17 et de leurs cytokines
ainsi que RORγt, un récepteur nucléaire et facteur de transcription clé des TH17, étaient
significativement plus élevées chez les patients atteint de la MB actifs que chez les patients MB
inactifs. De plus, des niveaux élevés d'IL-21 et d'IL-17 ont été retrouvés, dans les sérums de patients
atteints de MB actifs (Na et al. 2013) et des cellules T productrices d'IL-21 et d'IL-17A ont été détectées
dans le LCR, les infiltrats inflammatoires du parenchyme cérébral et les vaisseaux sanguins intra
cérébraux des patients NB (Geri et al. 2011).
Chez les patients atteints de NB, l'expression de RORγt, qui est le facteur de transcription des LTh17, a
été reportée comme étant augmentée dans le LCR des patients NB. Le ratio entre les cellules Th17 et les
23
cellules T régulatrices (Treg) a aussi été démontré comme dans le LCR de ces patients (Hamzaoui et al.
2011).
2.3.2.1.3. Cellules T Régulatrices
Les lymphocytes T régulatrices expriment le facteur Foxp3 et sécrètent les cytokines

immunosuppressives telles que l’IL-10, le TGF-β et l’IL-35 (Fig.9). Les données sur les populations
Treg chez les patients atteints de la MB sont contradictoires. Dans certaines études, le taux d’expression
d’ARNm de Foxp3 s'est avéré augmenté dans le sang périphérique et le LCR (Hamzaoui et al. 2011),
tandis que d’autres études, ont remarqué que les proportions de cellules Treg diminuent comparées aux
contrôles (Geri et al. 2011). Dans une étude réalisée par notre équipe, nous n’avons trouvé aucune
différence significative dans l’expression de Foxp3 dans le LCR et dans le sang des patients atteints NB
en les comparant aux SEP et un groupe témoin (Belghith et al. 2018).
L'IL-10 semble jouer un rôle majeur dans la physiopathologie du NB (Belghith et al, 2018). Cette
cytokine est capable d'inhiber la fonction des cellules présentatrices d'antigènes, d'induire la
différenciation des cellules Treg et la régulation de la prolifération d'autres populations de LT. De plus,
l'IL-10 inhibe l'apoptose des cellules B, favorise leur prolifération et l’expression de molécules de classe
II du CMH ainsi que l'activité cytotoxique des cellules NK.
Les patients atteints de MB traités avec l’anticorps anti-IFN-α montrent une augmentation de l’IL-10. Il
semblerait donc que le mécanisme thérapeutique par l’anti-IFN-α est associé à l'IL-10, confirmant ainsi
les propriétés anti-inflammatoires et immunosuppressives de cette cytokine (Tong et al. 2019).
Figure 9: Rôle des cellules T et les cytokines dans la maladie de Behçet (Tong et al. 2019).
24
Les cellules Th1 et Th17 ainsi que les cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle crucial dans la
pathogenèse de la maladie de Behçet. Les niveaux élevés de Th1 et de cytokines associées, tels que l’IL-
2, l’IL-12, l’IL-18 et l’IFN-γ, sont observés chez les patients actifs. D'autre part, les cellules Th17,
produisant des cytokines comme l’IL-17A, l’IL-21 et l’IL-23, sont également significativement élevées
chez les patients actifs, montrant une implication de l'axe IL-17/23 dans la régulation des réponses
inflammatoires. De plus, l'équilibre entre les cellules Th17/Th1 et Th17/Treg, ainsi que les effets de l'IL-
22, l’IL-37 et l’IL-27, apportent des perspectives importantes sur les mécanismes immunologiques de
la MB.
2.3.2.2. Réponse humorale
Les preuves étayant l'implication des LB dans la pathogenèse de la MB se sont accrues, notamment par
la mise en évidence d'une réponse anormale de cette population à une stimulation antigénique, comme
rapporté par Suzuki et al en 1986. Par la suite, une confirmation supplémentaire est venue de
l'observation d'une augmentation des sous-populations de LB mémoires et activés chez les patients,
comparativement aux individus témoins en bonne santé, comme démontré par Ekşioglu-Demiralp et al
en 1999.
La présence d'anticorps anti-cellules endothéliales dans la MB est associée à une atteinte

ophtalmologique active ou à des lésions de thrombose vasculaire aiguës. La cible antigénique des
anticorps anti-cellules endothéliales dans la MB est la protéine α-enolase, qui participe à la fibrinolyse
(Dinc et al. 2003).
De plus, le BAFF (facteur activateur des LB de la famille du TNF, également appelé BLyS) a été
démontré comme jouant un rôle dans le Behçet et le NB. Les études menées sur des souris transgéniques
pour le BAFF indiquent que la surexpression de ce facteur est liée au développement de pathologies
auto-immunes et inflammatoires (Mackay et Tangye, 2004).
Dans le contexte de la NB, des découvertes récentes suggèrent que le BAFF dérivé du SNC peut
favoriser la survie des lymphocytes B lors d’inflammations. Il est ainsi suggéré que la production de
BAFF dans le SNC est associée à l'évolution progressive du NB (Sumita et al. 2012). De plus, il
influence les réponses des LT en agissant comme co-stimulateur pour les LT naïfs et effecteurs modifiant
la sécrétion de cytokines et favorisant une réponse de type Th1 (Hamzaoui et al, 2008).
2.3.3. Inflammation et Neuro-Behçet
La neuropathologie du NB en phase aiguë implique une méningo-encéphalite avec une infiltration

inflammatoire intense comprenant des polynucléaires, des éosinophiles, des lymphocytes et des
macrophages, avec des zones de nécrose et une perte neuronale apoptotique. La concentration
significativement élevée d'IL-6 dans le LCR de patients atteints de NB aigu et de NB progressif
chronique a été établie et corrèle avec l'activité de leur maladie (S. Hirohata et al. 1997). Ainsi, une
diminution de la concentration d'IL-6 dans le LCR a été observée lorsque les activités pathologiques
25
étaient efficacement maîtrisées (Olson et al. 1998). L'IL-6 est également responsable de la mort
cellulaire (Kaplin et al. 2005) et de la dégénérescence neuronale (Kessler et al. 1993 ; Mach et al. 1997
; Gadient et Otten.1997).
Cette cytokine agit en activant la voie de signalisation de JAK/STAT, entraînant l'expression de iNOS,
puis conduisant à l'activation de la poly (ADP-ribose) polymérase et à la mort cellulaire (Kaplin et al.
2005).
Le TGF-β, l'IL-6 et l'IL-21 semblent activer les LT et promouvoir la différenciation initiale des cellules
Th0 en cellules Th17, conférant une réactivité à l'IL-23 (Veldhoen M.2006; Chen Z.2007), qui est une
étape cruciale pour la stabilisation et l'expansion des cellules Th17. L’étude, dans le LCR, de l’IFN-γ et
de TNF-ɑ n’a montré aucune différence significative entre les patients SEP et les témoins (Borhani
Haghighi et al., 2009). Au sein de notre laboratoire, nous avons démontré que cette réponse
inflammatoire est associée à une augmentation significative de l'expression d'IL-10 dans le LCR des
patients atteints de NB. Cette expression est indépendante de celle observée dans les cellules
mononucléées du sang périphérique (PBMCs), suggérant ainsi que cette cytokine anti-inflammatoire
pourrait être produite à l'intérieur du SNC des patients atteints de NB (Belghith et al. 2018).
⇒ La réponse inflammatoire dans la MB et le NB est caractérisée par une dysrégulation immunitaire

complexe, impliquant une variété de cellules et de cytokines, avec une composante auto-inflammatoire
et auto-immune significative. Ces mécanismes contribuent à la diversité des manifestations cliniques
observées chez les patients atteints de Behçet.
L'IL-6 émerge comme une cytokine centrale dans la maladie de Behçet, jouant un rôle crucial dans
l'activation des cellules immunitaires, la régulation de l'inflammation, et est étroitement corrélée à
l'activité de la maladie ainsi qu'à la présence d'atteintes neurologiques.
3. NF-KB : FACTEUR DE TRANSCRIPTION CLÉ DE LA RÉPONSE

INFLAMMATOIRE
Les protéines NF-κB agissent en tant qu'activateurs transcriptionnels présents dans la cellule sous forme
de dimères. Ils jouent un rôle essentiel dans la coordination des réponses inflammatoires, de l'immunité
innée et adaptative, ainsi que dans la régulation de la différenciation, de la prolifération et de la survie
cellulaires dans la plupart des organismes multicellulaires (Gerondakis et al.2006 ;Vallabhapurapu et
Karin.2009; Hayden et Ghosh.2012 et Hoffmann et Baltimore.2006).
La voie de signalisation NF-κB est sujette à une régulation rigoureuse, et des dysrégulations ont été
associées à un vaste spectre de maladies, des cancers. En effet, cette voie favorise la survie cellulaire en
stimulant l’expression de gènes favorisant la prolifération et en inhibant l’apoptose. Ces dysrégulations
26
sont également à l’origine de troubles inflammatoires et immunitaires, les cytokines pro-inflammatoires

activant NF-κB, et l’activation de NF-κB induisant à son tour la production de cytokines pro-
inflammatoires ( Leung et al. 2004; Lawrence.2009 ; Baud et Karin.2009 ; Kearns et Hoffmann.2009)
(Fig. 10).
Figure 10: NF-κB et Inflammation
Ce facteur de transcription inductible régule la transcription d’un large set de gènes codant pour des
cytokines, chimiokines et des molécules d'adhésion. Il régule également la prolifération cellulaire,
l'apoptose, la morphogenèse, et la différenciation (T. Liu et al. 2017).
3.1. Structure et fonction de NF-κB
Le facteur nucléaire κB (NF-κB) englobe une famille de cinq membres structurellement apparentés :
NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52) synthétisés sous forme de précurseurs p105 et p100 respectivement, RelA
(p65), RelB, et c-Rel (Fig. 11). Ces membres, forment divers hétéro- ou homo-dimères, pour réguler la
transcription des gènes cibles. La localisation des dimers NF-κB, est contrôlée par les protéines
inhibitrices IκB (inhibitor of NF-κB). Cette famille compte plusieurs membres dont IkBα, β et γ, ainsi
que les précurseurs de NF-κB p50 (p105) et NF-kB p52 (p100). Ces IkB séquestrent les dimers NF-kB
dans le cytoplasme (Leung et Al. 2004 et Beinke et Ley 2004).
Figure 11: Structure schématique des différents membres de la famille NF-kB (Krifi 2018).
27
Tous les membres de la famille NF-kB/Rel possèdent un domaine RHD (Rel Homology Domain). Les
protéines p65/RelA, cRel et RelB possèdent également un domaine de transactivation TAD. La protéine
RelB présente un domaine Leucine Zipper. Les précurseurs p105 et p100 forment après un clivage
protéolytique, respectivement les sous-unités p50 et p52.
3.2. Mécanismes d’activation de NF-κB
L'activation de NF-κB est étroitement régulée. La stimulation, déclenche l'action d’un complexe kinase
composée de trois sous-unités : deux sous-unités catalytiques à activité sérine/thréonine kinase (IKKα
et IKKβ) et une sous-unité régulatrice, NEMO/IKKγ. Ce complexe phosphoryle IkB, entrainant son
ubiquitinylation puis sa dégradation par le protéasome 26S. Les dimères NF-κB libérés migrent ensuite
vers le noyau, où ils se lient à des séquences spécifiques d'ADN, stimulant ainsi la transcription des
gènes cibles. Pour désactiver cette voie, il est nécessaire d'inhiber le complexe IKK, de rétablir la
synthèse des protéines IκB, et de déplacer les dimères NF-κB de l'ADN ainsi que des coactivateurs
transcriptionnels. Ainsi, une compréhension approfondie de ces processus nécessite une présentation
préalable des familles de protéines qui contribuent à la voie de signalisation NF-κB (Hayden et
Ghosh.2012).
3.2.1. Voies de signalisation qui conduisent à l’activation de NF-κB
L'activation de NF-κB peut faire intervenir deux voies de signalisation principales, à savoir les voies
canoniques et non canoniques (ou alternatives). Ces deux voies revêtent une importance cruciale dans
la régulation des réponses immunitaires et inflammatoires (Vallabhapurapu and Karin 2009 ; S. C. Sun
2011)(Fig. 12).
3.2.1.1. Voie canonique
La voie canonique de NF-κB réagit à divers stimuli : les cytokines dont TNFα, interleukine-1, des
protéines bactériennes ou virales, divers signaux de stress ainsi que les récepteurs des LT (TCR) et les
récepteurs des cellules B. (Zhang and Sun 2015). Elle implique NEMO (IKKγ) et les kinases IKKα et
IKKβ qui phosphorylent IκBα au niveau de deux sérines N-terminales, entraînant la dégradation
dépendante de l'ubiquitination de IκBα par le protéasome et libérant les complexes de type p50/p65 qui
migrent dans le noyau (Karin et Delhase.2000; Beinke et Ley.2004 ; Hayden et Ghosh.2008) ( Fig.12).
28
3.2.1.2. Voie non canonique
Contrairement à la voie canonique de NF-κB, la voie non canonique répond de manière sélective à des
stimuli spécifiques, induits par des molécules comme la lymphotoxine β, BAFF (B cell-activating factor
belonging to the TNF family) et le ligand de CD40. Cette voie implique les protéines kinases NIK (Nck
interacting kinase) et IKKα et conduit à la dégradation partielle du précurseur p100, libérant ainsi des
complexes de type p52/relB et p52/relA (Fig. 12) (Senftleben et al. 2001 ; Xiao, Harhaj, and Sun 2001;
Sun and Liu 2011 et Sun 2012 ).
Sur le plan fonctionnel, tandis que la voie NF-κB canonique est impliquée dans presque tous les aspects
des réponses immunitaires, la voie non canonique semble avoir évolué en tant qu'axe de signalisation
supplémentaire collaborant avec la voie canonique pour réguler des fonctions spécifiques du système
immunitaire adaptatif.
Figure 12: Voies de signalisation NF-κB canoniques et non canoniques (Zhang et al.2015).
La voie canonique de NF-κB est activée en réponse à la stimulation de à divers récepteurs, incluant les
récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) et les récepteurs TNF, tandis que la voie
non canonique est activée spécifiquement par certains membres de la superfamille TNFR. Dans la
signalisation canonique, l'activation du complexe IKK, conduit à la phosphorylation et à
l’ubiquitination de IκBα et sa dégradation par le protéasome induisant ainsi la libération et la
translocation dans le noyau de l'hétérodimère NF-κB. La signalisation non canonique repose sur les
kinases NIK et IKKα, permettant de générer p52 et conduisant à la translocation du complexe p52/RelB.
Comparativement, la voie canonique est plus pléiotropique, tandis que la voie non canonique a des
fonctions plus spécifiques. (Zhang et al.2015)
29
3.2.1.3. Mécanisme de Rétrocontrôle Négatif de la Voie NF-κB
Des mécanismes de rétrocontrôle négatif sont en place pour réguler la voie de signalisation NF-κB. Une
activation prolongée de cette voie conduit à l'expression transcriptionnelle d'inhibiteurs spécifiques, tels
que les gènes NFKBIA et IkBƐ. La synthèse de novo de IkBα et son import nucléaire provoquent le
détachement de RelA de l'ADN, favorisant son export dans le cytoplasme. Bien que le détachement des
facteurs NF-κB des promoteurs soit suffisant pour interrompre la transcription, l'export dans le
cytoplasme pourrait maintenir un pool de complexes NF-KB/IKB, permettant une réponse plus rapide à
une stimulation future.
La protéine A20 à doigt de zinc, également connue sous le nom de protéine TNFAIP3 induite par le
TNF-α, induite par NF-κB et différents autres signaux, exerce ses effets sur cette voie immédiatement
après l'activation des récepteurs TNF et des voies TLR/IL-1R (Kelly et al. 2011). Ce processus établit
un contrôle cyclique des réponses cellulaires à l'inflammation assurant une régulation précise et
équilibrée de cette voie essentielle. Le processus débute par l'association du récepteur avec son ligand à
la membrane cellulaire, déclenchant ainsi la liaison et l'activation des protéines membranaires
responsables de la signalisation inflammatoire. La protéine A20 intervient en agissant sur
l’ubiquitination/deubiquitination de différentes protéines intervenant à différents niveaux de la voie de
signalisation NF -κB (Fig.13). Cela se traduit par une inhibition de la phosphorylation dea IκB,
empêchant par conséquent la translocation des sous-unités NF-κB, à savoir p50 et p65, vers le noyau
cellulaire. Cette action prévient la transcription des cytokines pro-inflammatoires, telles que l'IL-8, l'IL-
13 et le TNF-α. Ainsi, A20 exerce un contrôle crucial sur la cascade inflammatoire en régulant ces étapes
clés du processus. (Kelly et al. 2011).
30
Figure 13: Modulation de la Signalisation NF-κB par la Protéine A20 (Kelly et al. 2011).
La protéine A20, régulatrice, exerce un contrôle précis sur la voie inflammatoire en intervenant dans
l'ubiquitination/deubiquitination des protéines impliquées dans la voie de signalisation NF-KB. En
inhibant la phosphorylation de IκB, elle bloque la translocation des sous-unités NF-κB, réduisant ainsi
la réponse inflammatoire.
Fonction de NF-kB dans les cellules immunitaires innées
Bien que structurellement distincts, les récepteurs reconnaissant des motifs moléculaires, présents à la
surface des cellules immunitaires innées et permettant de reconnaître les composants microbiens,
activent la voie canonique NF-κB, induisant la transcription de cytokines pro-inflammatoires et de
chimiokines. Une molécule adaptatrice / MyD88 permet de coupler ces récepteurs à différentes kinases
agissant en aval dont TAK1 qui, une fois activée, catalyse la phosphorylation de IκBα, déclenchant ainsi
l'activation de NF-κB (Fig. 14) (Lu et al.2008 ;Takeuchi et Akira.2010; Kumar et al.2011 ; Newton et
Dixit.2012 et H. Hu et Sun.2016).
NF-κB joue un rôle central en tant que facteur de transcription au niveau des macrophages
inflammatoires M1, et est essentiel à l'activation de nombreux gènes inflammatoires tels que le TNF-α,
l'IL-1β, l'IL-6, l'IL-12, et la cyclooxygénase-2 (Wang et al.2014) .
31
Figure 14: Cascade de signalisation de NF-kB (Xu and Lei 2021).
La signalisation NF-κB est déclenchée par l'activation de différents récepteurs à la membrane

cellulaire. Cette voie régule la cascade inflammatoire en favorisant la phosphorylation de IκB,
permettant la translocation des sous-unités NF-κB, p50 et p65, vers le noyau cellulaire. Une fois dans
le noyau, NF-κB active la transcription des cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-8, l'IL-13 et le
TNF-α, jouant un rôle crucial dans la réponse inflammatoire.
3.3. Fonction de NF-kB dans les cellules immunitaires adaptatives
Les membres canoniques de NF-κB, notamment RelA et c-Rel, occupent une position centrale dans la
médiation de la signalisation du récepteur des LT (TCR) et dans l'activation initiale des LT (Oh et
Ghosh.2013). Cependant, une activation inappropriée de NF-κB peut déclencher une réaction anormale
des LT, associée à des réponses auto-immunes et inflammatoires (M.Chang et al.2011). En outre, NF-
κB exerce un contrôle sur la différenciation des LT CD4 (Zhu et al.2010). Une régulation équilibrée de
NF-κB dans les LT est donc cruciale pour maintenir une réponse immunitaire adaptée et éviter une
activation excessive susceptible de conduire à des troubles auto-immuns. L'activation inappropriée de
NF-κB rend les cellules immunitaires innées hypersensibles à la stimulation des récepteurs de
reconnaissance de motifs moléculaires, tels que les TLR, favorisant ainsi la production accrue d'IL-6 et
32
une différenciation marquée vers le sous-ensemble de LT Th17, caractérisé par une sécrétion importante
de cytokines (M. Chang et al. 2009). NF-κB participe également à la génération des cellules Treg ce qui
confère une dimension paradoxale à sa fonction dans les réponses des LT (M. Chang et al. 2009). La
NIK et la voie NF-κB non canonique jouent un rôle essentiel dans les réponses de rappel des cellules T
effectrices et dans la mémoire antigénique (Croft.2009). En outre, la voie NF-κB non canonique est
indispensable à la fonction effectrice pathologique des cellules Th17 dans la médiation de la
neuroinflammation, incluant l'induction de la cytokine inflammatoire GM-CSF (J. Yu et al.2014).
3.4. NF-κB dans la régulation de l’inflammasome
L’inflammasome est un complexe multiprotéique, formé par un récepteur (tels que les NLR) (Fig.15)
Figure 15: Récepteurs de type Nod et leurs ligands (Kapetanovic and Cavaillon 2007).
Une molécule adaptatrice et la caspase 1, permettant la maturation de cytokines l’IL-1β et l’IL-18

(Fig.16). L'inflammasome NLRP3 est constitué du récepteur NLRP3, de l'adaptateur ASC et de la
procaspase-1. L’activation de l’inflammasome canonique NLRP3 nécessite deux signaux. Le premier
signal résulte souvent de l’engagement d’un récepteur Toll-like et induit l’activation du facteur NF-kB
permet une pré-activation de NLRP3 via des modifications post-traductionnelles ainsi que la
transcription des gènes IL-1β et IL-18 aboutissant à l’expression des pro-IL-1β et pro-IL-18. Un exemple
typique d'amorçage implique la liaison du LPS bactérien à TLR4, activant ainsi la signalisation NF-κB.
Dans le noyau, le NF-κB favorise la transcription de gènes dépendants de NF-κB, tels que NLRP3, Pro-
IL-1β et Pro-IL-18, essentiels à l'activation de l'inflammasome.
33
Le deuxième signal, est un signal de danger (DAMP) permet l’activation de récepteurs intracellulaires /
NLR. Les NLR/NLRP3 sont des récepteurs cytoplasmiques reconnaissant essentiellement des ligands
bactériens. Comme les TLR, l’extrémité carboxy-terminale comporte un domaine leucine-rich repeats
(LRR) composé d’une répétition caractéristique de 20 à 30 acides aminés, riche en leucine. Ce domaine
permet l’interaction entre le récepteur et son ligand. La partie centrale, commune à tous les NLR,
correspond au domaine NBD (nucleotide binding domain). Ce domaine permet l’oligomérisation
dépendante de l’ATP des NLR (Fig 15) en hexamères ou heptamètres, conférant à l’inflammasome sa
forme typique. Le deuxième signal, fourni par les agonistes de NLRP3, déclenche l'assemblage de
l'inflammasome et la sécrétion mature d'IL-1β (Fig.16). Les lésions mitochondriales, largement étudiées
dans diverses maladies, sont des stimuli majeurs de la voie NLRP3. NLRP3 oligomérise avec la protéine
adaptatrice ASC et la pro-caspase 1. Ce recrutement active la caspase 1 qui clive les précurseurs des
cytokines pour générer les formes matures de l’IL-1β et de l’IL-18. (Schroder and Tschopp 2010).. La
voie de signalisation NF-κB joue donc un rôle crucial dans la régulation de l'inflammasome, influençant
le développement de maladies inflammatoires (Guoet al.2015) (Fig. 16).
Figure 16: Signalisation NF-κB et inflammasome (T. Liu et al. 2017).
NF-κB joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammasome NLRP3. L'activation de cet
inflammasome requiert deux signaux : l'amorçage et l'activation. Un exemple typique d'amorçage
implique la liaison du LPS bactérien à TLR4, activant ainsi la signalisation NF-κB. Dans le noyau, le
NF-κB favorise la transcription de gènes dépendants de NF-κB, tels que NLRP3, Pro-IL-1β et Pro-IL-
18. Le deuxième signal, fourni par les agonistes de NLRP3, déclenche l'assemblage de l'inflammasome
et la production de l'IL-1β et l’IL-18 matures. Les lésions mitochondriales, largement étudiées dans
diverses maladies, sont des stimuli majeurs de la voie NLRP3. NF-κB régule négativement l'activation
de l'inflammasome en favorisant l'accumulation retardée du récepteur d'autophagie p62, qui participe
à l'élimination mitophagique des mitochondries.
34
3.5. NF-κB dans les maladies inflammatoires
NF-κB a été associé à la pathogenèse de diverses maladies inflammatoires, telles que la polyarthrite
rhumatoïde, les maladies inflammatoires de l'intestin, la sclérose en plaques, l'athérosclérose, le lupus
érythémateux disséminé, le diabète de type I, la bronchopneumopathie chronique obstructive et l'asthme.
En réponse à divers stimuli cellulaires, NF-κB joue un rôle complexe dans différents types cellulaires et
états pathologiques (T. Liu et al. 2017). L'un des médiateurs inflammatoires clés de la polyarthrite
rhumatoïde, qui est caractérisée par une inflammation et destruction articulaire par des cellules
immunitaires (McInnes and Schett 2011), est le NF-κB, comme démontré dans des études utilisant à la
fois des modèles animaux et des patients humains. Des études précoces ont notamment identifié une
activation de NF-κB dans le tissu synovial de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (Asahara et al.
1995 ; Marok et al. 1996 ; Gilston et al. 1997 ; Miyazawa et al. 1998).
Une interference de signalisation entre NF-κB et STAT3 pourrait etre possible qui joue un rôle crucial
dans l’inflammation et la réponse immunitaire (Fig. 17).
Figure 17: Rôle de NF-κB dans l’activation de STAT3 (Yong et al.2022).
LPS et Ovalbumine induisent une réponse inflammatoire,en activant la voie NF-κB. Sous cette
stimulation, les dimères de NF-κB se dissocient et pénètrent dans le noyau cellulaire, se liant aux
promoteurs des gènes cibles des cytokines proinflammatoires. Ces cytokines, une fois sécrétées, se fixent
aux récepteurs cibles, activant ainsi la voie JAK-STAT. Cette cascade d'événements induit une
régénération cellulaire, une prolifération et d'autres réponses immunitaires, contribuant à la résolution
de l'inflammation et à la réparation tissulaire.
35
4. INTERLEUKINE-6 (IL-6)
4.1. L’IL-6 et son récepteur
L'IL-6 est une cytokine clé dans la régulation de l'inflammation aiguë et chronique. C’est une chaîne
polypeptidique glycosylée présentant un poids moléculaire d'environ 25 kDa, variant selon le degré de
glycosylation et l'espèce. L’IL-6 appartient à une famille de cytokines qui comprend LIF, CNTF, OSM,
IL-11 et CT-1 (Fig. 18). Toutes ces cytokines partagent la glycoprotéine membranaire gp130 en tant que
récepteur commun et sous-unité de transducteur de signal dans leurs complexes récepteurs. Le récepteur
de l'IL-6 (IL-6R) est une glycoprotéine membranaire de type I d'une masse moléculaire de 80 kDa
(Scheller.2011). Ce récepteur de basse affinité est dépourvu d'activité de transduction. La fixation de
l’IL-6 sur ce récepteur induit l’homodimérisation de la gp130 et la transduction du signal.
Figure 18: Famille de Cytokines de Type IL-6.
Ces différentes cytokines agissent via des récepteurs hétérodimériques qui ont en commun la
glycoprotéine membranaire gp130, responsable de la signalisation cellulaire.
L’IL-6 se compose de quatre longues hélices α disposées dans une topologie haut-haut-bas-bas.
Elle présente trois sites de liaison au récepteur clairement définis : le site I (en interaction avec l'IL-6R),
le site II (en contact avec le domaine de type Ig de gp130), et le site III (en contact avec gp130 entre le
domaine I et le domaine II). Le site I est crucial pour déterminer la spécificité de la liaison à l'IL-6R,
tandis que les sites II et III sont essentiels pour recruter deux molécules distinctes de gp130 (Fig.19).
Figure 19: Structures de l'IL-6 (Heinrich et al. 2003).

36
Il existe une forme soluble du récepteur de l'IL-6 (sIL-6R) qui intensifie la transmission du signal induit
par l'IL-6 en activant des cellules qui expriment la protéine gp130 mais ne possèdent pas le récepteur
membranaire mbIL-6R. Il est notable que seul un nombre restreint de cellules expriment mbIL-6R à leur
surface et réagissent ainsi à l'IL-6 seule. Ces cellules incluent les macrophages, les neutrophiles, certains
types de LT et les hépatocytes. En revanche, gp130 est ubiquitairement exprimé (Rose-John et al. 2007).
4.2. Fonctions biologiques de l’IL-6
L'IL-6 est un médiateur soluble qui exerce un effet pléiotrope sur l'inflammation, la réponse immunitaire
et l'hématopoïèse (Fig.20) (Toshio Tanaka et al.2014). Au niveau du système immunitaire, elle est
principalement synthétisée par les LT, les LB et les macrophages.
L'IL-6 joue un rôle crucial dans la différenciation des LT CD4 naïfs, ce qui est essentiel pour la transition
entre la réponse immunitaire innée et acquise. En collaboration avec le TGF-β, l'IL-6 est nécessaire à la
différenciation des LT CD4 naïfs en Th17 (Korn et al. 2009). Cependant, cette cytokine bloque
également la différenciation des lymphocytes régulateurs par le TGF-β ( Bettelli et al.2006 ; Magnus et
al. 2010; Toshio Tanaka et al.2014).
Figure 20: Implications d'IL-6 dans la Modulation de la Réponse Immunitaire (Chonov et al.2019).
IL-6 joue un rôle crucial dans la différenciation des LT CD4 naïfs, essentielle pour la transition entre
les réponses immunitaires innée et acquise. En collaboration avec le TGF-β, l'IL-6 guide la
différenciation des LT CD4 naïfs vers le phénotype Th17, tout en bloquant la différenciation des LT
régulateurs par le TGF-β.
L'IL-6 occupe une place centrale dans la régulation du système immunitaire, influençant la balance entre
les réponses immunitaires pro-inflammatoires et régulatrices ( Toshio Tanaka et al.2014).
L'IL-6 est la principale cytokine impliquée dans la synthèse des protéines de la phase aiguë de
l'inflammation. Elle participe à l'inflammation en agissant directement sur les lymphocytes T et B,
favorisant le recrutement des neutrophiles (PNN) au niveau des sites inflammatoires et stimulant la
production des cellules endothéliales. Elle induit la synthèse de protéines de phase aiguë, notamment la
37
CRP, l'amyloïde A sérique (Toshio Tanaka et al.2014), le fibrinogène et l'hepcidine, tout en inhibant la
production d'albumine dans les hépatocytes (Fig. 21).
Dans la MB, des études ont montré que le taux sérique d'IL-6 semble corréler avec l'activité de la maladie
et l'atteinte neurologique (Zhou et al.2012). De plus, une association a été établie entre le polymorphisme
du gène codant pour l'IL-6 et la MB (H. K. Chang et al. 2005).
Des cas isolés de MB avec atteinte neurologique ont également été traités avec succès par le tocilizumab,
un anticorps anti-IL-6 (Urbaniak et al.2012).
Figure 21: Les rôles multiples de l'IL-6
Elle joue un rôle crucial dans la réponse immunitaire en favorisant la production d'anticorps et le
développement des lymphocytes T effecteurs. De plus, l'IL-6 peut influencer la différenciation ou la
prolifération de diverses cellules non immunitaires. Une production excessive et déséquilibrée d'IL-6
est associée à l'apparition ou au développement de différentes maladies, impliquant des éléments tels
que les lymphocytes T régulateurs (Treg), le récepteur du ligand du facteur nucléaire κB, et le facteur
de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF).
4.3. Signalisation cellulaire de l’IL-6
4.3.1. Voies de signalisation activées par IL-6
L'IL-6 transmet son signal par deux voies distinctes : la voie de signalisation classique et la voie de trans-
signalisation (Fig.22). La cascade de signalisation intracellulaire est déclenchée par la formation du
complexe hétérohexamérique, englobant les molécules d'IL-6, de l'IL-6R, et de la gp130.
38
Figure 22: Voies de signalisation de l’IL-6 (Johnson et al.2018).
a. Dans la voie classique, IL-6 se lie à son récepteur cellulaire (IL-6R) qui forme un complexe avec la
gp130, activant la voie JAK/STAT3 pour la transcription des gènes cibles. Ce complexe peut également
activer d'autres voies de signalisation. b. Dans la trans-signalisation, IL-6 se lie au récepteur soluble
(sIL-6R), induisant la dimérisation de gp130 et activant les voies de signalisation en aval. Cette voie
permet à IL-6 d'agir sur des cellules n’exprimant pas l'IL-6R. Les protéines JAK phosphorylent gp130,
facilitant la liaison et la phosphorylation de STAT3, entraînant sa dimérisation, sa translocation
nucléaire et la transcription des gènes cibles.
4.3.1.1. Voie de signalisation classique
La fixation de l’IL-6 entraîne l'activation de la voie de signalisation JAK/STAT3, conduisant à la

transcription des gènes cibles de STAT3. Il est à noter que le complexe IL-6/IL-6R/gp130 peut
également activer d'autres voies de signalisation.
4.3.1.2. Voie de trans-signalisation
Les protéines JAK liés aux récepteurs induisent la phosphorylation de gp130 sur plusieurs résidus
tyrosine, dont quatre résidus C-terminaux servant de sites d'ancrage pour STAT3. Une fois lié à gp130,
STAT3 subit une phosphorylation, induisant sa dimérisation et sa translocation nucléaire, suivies par la
transcription des gènes cibles (Cimica et al. 2011 ; Bournazou and Bromberg 2013).
La régulation négative de cette voie de signalisation est assurée par plusieurs mécanismes faisant
intervenir entre autres les suppresseurs de signalisation des cytokines (SOCS), les protéines inhibitrices
de STAT3 activées (PIAS3), différentes phosphatases, des microARN oncogènes (miARN) (Johnson et
al.2018) (Fig. 23).
39
Figure 23: Signalisation en aval du récepteur de l’IL-6 (Johnson et al.2018).
Les protéines JAK phosphorylent le sous-unité β du récepteur de l'IL-6 (gp130), déclenchant l'activation,
la dimérisation et la translocation nucléaire de STAT3. La régulation négative de cette voie est assurée
à plusieurs niveaux. Elle implique les protéines SOCS1/3 inhibant l'activité kinase de JAK, des
phosphatases (SHP1, SHP2, DUSP22, PTPRD, PTPRT, PTPN1, PTPN2) ciblant STAT3 et des protéines
(PIAS3, PDLIM2). Les micro-ARN oncogéniques (miR-18a, miR-221, miR-222) inhibent PIAS3 et
PDLIM2, et miR-551b-3p favorise STAT3. D'autres micro-ARN (miR-218, miR-34a) régulent IL6R, et
certains (miR-17-5p, miR-20a, miR-124) ciblent STAT3.
5. RÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DE L’IL-6

L'IL-6 agit comme un médiateur essentiel signalant l'émergence d'événements tels que des infections ou
des lésions tissulaires. Lors d'une infection, les cellules immunitaires, notamment les monocytes et les
macrophages, déclenchent la production d'IL-6. De même, en cas de lésions tissulaires non infectieuses,
comme des brûlures ou des traumatismes, l'IL-6 est produite en réponse aux motifs moléculaires associés
aux dommages (DAMP) libérés par les cellules endommagées.
40
L'IL-6 agit comme un signal d'alerte, précédant même l'élévation de la température corporelle et d'autres
réponses inflammatoires. Outre les cellules immunitaires, divers types cellulaires, notamment les
cellules mésenchymateuses, les cellules endothéliales et les fibroblastes, participent à la production d'IL-
6 en réponse à divers stimuli. La stricte régulation de la synthèse de l'IL-6, tant au niveau transcriptionnel
que post-transcriptionnel, souligne son rôle central en tant que médiateur de signalisation, alertant
l'organisme face à des situations d'urgence telles qu'une infection ou une lésion tissulaire (Fig.24).
Plusieurs facteurs de transcription, dont NF-κB, SP1, NF-IL-6, AP-1 et le facteur de régulation de
l'interféron 1, sont impliqués dans la régulation de la transcription du gène IL-6 en réponse à divers
stimuli inflammatoires (Toshio Tanaka et al.2014).
Figure 24: Régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du gène IL-6. (Toshio Tanaka et

al.2014).
La régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du gène IL-6 est orchestrée par diverses

protéines et micro-ARN. NF-IL-6, Tax, TAT, HBVX, Ahr, GR, ER, Rb, PPARα, miR, IRAK1, STAT3,
ORF, TTP, BRF1 influent sur l'expression et la dégradation de l'ARNm de l'IL-6. L'activation de ces
acteurs détermine le destin de l'ARNm d'IL-6.
⇒Cette régulation précise joue un rôle essentiel dans la modulation de la réponse immunitaire et
inflammatoire, démontrant ainsi la complexité des réseaux moléculaires régulant cette cytokine clé.
41
5.1. Impact de NF-κB sur la production d’IL-6
L'IL-6, une glycoprotéine pléiotrope, se distingue parmi les cytokines activant fortement NF-κB
dépendant de leur activation. Elle est sécrétée par divers types cellulaires vasculaires, dont les
macrophages, les lymphocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires
lisses (Brasier 2010). L’activation de NF-κB, suite à une stimulation par le TNF-α par exemple, induit
la synthèse d'IL-6. L'IL-6 nouvellement synthétisée est sécrétée et en se fixant sur son récepteur induit
l’activation des kinases JAK1/JAK2 qui phosphorylent et activent STAT3. Ce dernier pénètre à son
tour sous forme de dimère dans le noyau et à son tour déclenche l'expression de plusieurs gènes, parmi
lesquels SOCS3 impliqué dans la régulation négative de la voie JAK/STAT (McFarland et al. 2013).
42
Objectif de travail
43
OBJECTIF DE TRAVAIL
Notre équipe a réalisé des progrès significatifs en caractérisant le NB, mettant en évidence une
augmentation marquée des cytokines IL-10 et IL-6 ainsi que la présence d'EBV dans le LCR. Alors que
ces résultats sont descriptifs, la recherche actuelle vise à passer à une compréhension fonctionnelle plus
approfondie. Nous nous concentrons sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'augmentation des
cytokines, en particulier en examinant l'activation du facteur de transcription NF-κB et de la STAT3.
Notre attention se porte sur NF-κB en raison de son rôle central dans l'induction des cytokines pro-
inflammatoires et notamment l'IL-6. Nous cherchons à comprendre les mécanismes d'activation de NF-
κB, en particulier en étudiant la phosphorylation de NF-κB, afin de démêler les facteurs déclencheurs
de l'augmentation de l'IL-6 dans le contexte du NB. De même, notre analyse se penche sur STAT3, un
autre acteur crucial dans la signalisation d'IL-6 et d'IL-10.
Notre objectif est de combler le fossé diagnostique entre la SEP et le NB en explorant les mécanismes
moléculaires sous-jacents à l'augmentation des cytokines, en mettant l’accent sur les facteurs de
transcription NF-κB et STAT3. Cette approche fonctionnelle ouvre la voie à une meilleure
compréhension des différences pathologiques entre ces deux maladies neurologiques et pourrait
éventuellement conduire à des avancées dans les stratégies de diagnostic et de traitement.
44
Matériels et Méthodes
45
Matériels et méthodes
MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. MATÉRIEL
1.1. Patients
Nous nous proposons de nous focaliser sur l'analyse de Phosphorylation de NF-kB à partir du sang de
patients atteints de NB ainsi que la phosphorylation de P-STAT3 à partir du sang des patients atteints
de NB et patients SEP, faisant l'objet d'un suivi au service de neurologie de l’Institut Mongi Ben Hamida
au cours de l’année 2023. Au cours de mon stage de master, nous avons recruté 5 patients NB pour
l’étude NF-kB par Western Blot.
Concernant la cytométrie en flux, nous avons utilisé un patient SEP et deux patients NB et un témoin
sain.
Le groupe de patients atteints de Neuro-Behçet présente une atteinte parenchymateuse remplissant

les critères du groupe d'étude international pour la maladie de Behçet (lancet.1990). Le diagnostic de
ces formes neurologiques a fait l’objet d’un consensus international en 2014 (Kalra et al. 2014). Les
patients NB faisant partie de cette étude ont été prélevés lors de leur première admission à l’hôpital.
Aucun patient inclus dans cette étude n’est sous thérapie immunomodulatrice ou immunosuppresseurs
ou au moins trois mois avant le premier prélèvement.
1.2. Individus contrôles
Les individus témoins ont été sélectionnés parmi les stagiaires de l'IPT, en veillant à l’absence de
maladies déclarées. Tous les témoins étaient des jeunes adultes âgés de 20 à 32 ans. Les prélèvements
sanguins des individus témoins ont été réalisés dans des conditions identiques à celles des patients et le
même jour.
De plus, des individus des NIND (Non-Inflammatory Neurological Disorders) ont également été utilisés
comme témoins. Ces individus sont des patients ne présentant pas de maladies neuro-inflammatoires ou
neurologiques et ont été sélectionnés parmi les patients de l'Hôpital Monji Ben Hmida.
1.3. Éthique
Dans cette étude, un consentement éthique concernant l’utilisation de matériel humain est approuvé par
le comité d’éthique de l’Institut Pasteur de Tunis. Chaque patient a donné son consentement par écrit.
46
1.4. Approches de travail
1.4.1. Partie 1 : Etude de l’état de phosphorylation de NF-κB chez les patients atteints de
neuro-Behçet
Nous avons ciblé l’étude de l’état de phosphorylation de NF-κB (p-NF-κB) en raison de l'observation
d'une expression élevée d'IL-6 chez les patients atteints de NB et du rôle crucial de NF-κB dans
l'induction de cette cytokine inflammatoire associée à divers processus pathologiques.
Notre approche méthodologique inclut non seulement l'étude approfondie de la p-NF-κB chez les
patients NB, mais également une comparaison systématique avec un groupe témoin sain. Ces
comparaisons entre les profils de phosphorylation de NF-κB chez les patients et les sujets sains, réalisées
par la technique du Western blot, visent à mettre en évidence les différences significatives, si elles
existent, dans la régulation moléculaire entre les deux groupes et offrant ainsi une perspective plus
complète sur les mécanismes sous-jacents à l'expression exacerbée d'IL-6 observée chez les patients NB.
1.4.2. Partie 2 : Approche d'investigation de la phosphorylation de STAT3 chez les

patients atteints de neuro-Behçet
Dans la seconde phase de notre étude, notre attention s'est portée sur l'investigation de l'activation de
STAT3 en réponse à diverses cytokines. Parmi celles-ci, une attention particulière a été portée sur les
cytokines dépendantes de la protéine GP130, notamment l'IL-6, mais également l'IL-10, au sein d'un
échantillon de deux patients atteints de NB et un atteint SEP.
2. MÉTHODES
2.1. Conditionnement du prélèvement sanguin
2.2. Isolement des PBMCs
L’isolement des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs : Peripheral Blood Mononuclear
cells) à partir de sang prélevé sur tube hépariné, est réalisé par centrifugation sur un gradient de densité
constitué d’une solution de Ficoll -Paque™ (Amersham biosciences). Tout d’abord, le sang est
centrifugé à 1400 rpm pendant 10 minutes afin de récupérer le plasma. Le plasma sera conservé à -80°C
pour le dosage notamment des cytokines. Le sang restant est dilué volume à volume dans du RPMI 1640
stérile (Corning®, Life Sciences) supplémenté de 2 mg/ml de glutamine (Gibco™, Thermo Fisher
Scientific) et 1% de Pénicilline-Streptomycine (Gibco™, Invitrogen). Le sang dilué avec du RPMI est
délicatement coulé sur la couche Ficoll d’un volume correspondant au tiers du volume total, puis
centrifugé pendant 30 minutes à 1650 rpm sans frein. À l'issue de cette séparation, trois phases sont
obtenues : un culot rouge renfermant les globules rouges limité par une fine couche de polynucléaires
de densité supérieure à 1.077, une phase translucide qui correspond au Ficoll (densité = à 1.077) sur
lequel un anneau blanc correspondant aux PBMCs (densité supérieure à 1.077) et au-dessus le RPMI
(Fig.25). Les PBMCs sont alors aspirées à l’aide d’une pipette et lavées deux fois dans du RPMI stérile,
47
à 1250 rpm pendant 10 minutes. Le culot récupéré est resuspendu dans du RPMI et enfin les cellules
sont colorées par un colorant vital (bleu de trypan dilué au 1/20ème) et comptées sur une lame de
Malassez (Carl ROTH®) au microscope optique (OLYMPUS-BH2).
Figure 25: Procédure de séparation des cellules mononucléées du sang périphérique.
2.3. Comptage des cellules
Le comptage ou la numération cellulaire consiste à déterminer le nombre de cellules présentes dans un

volume spécifique d'un liquide. Cette évaluation se réalise directement par comptage au microscope à
l'aide de la cellule de Malassez (Fig.26). Cette dernière, d'un volume total de 1µl, est divisée en 100
petits carrés de quatre types distincts, comme indiqué dans la figure ci-jointe.
Figure 26: Cellule de Malassez-comptage cellulaire.
Les cellules ont été comptées sur une lame de Malassez en utilisant le bleu de trypan (dilution 1⁄2) donc
20µL de suspension cellulaire +20µL bleu de trypan (SIGMA® REF : T8154).
Les cellules ayant perdu leur intégrité membranaire, vont permettre l’entrée du colorant et seront donc
colorées en bleu. Ensuite, la préparation est déposée sur la grille d'une cellule de Malassez et recouverte
par une lamelle. La numération cellulaire est réalisée au microscope en comptant aléatoirement plusieurs
48
carreaux doublement hachurés. Le nombre obtenu est ensuite divisé par le nombre de carreaux utilisés
(MOY). La zone de comptage, représentée par la surface des 100 rectangles, équivaut à un volume de
1µl, la valeur obtenue sera donc multipliée par 100 (nombre de carreaux) pour obtenir le nombre de
cellules par µl. Ce nombre sera ensuite multiplié par 1000 pour obtenir le nombre de cellules par ml et
finalement extrapolé au volume total (Vt) et multiplié par le facteur de dilution (Fd) pour estimer la
concentration globale.
2.4. Détection et identification des protéines par Western Blot
2.4.1. Principe
La technique du Western Blot, ou immunoblot, repose sur une séparation des protéines d'un échantillon
par électrophorèse sur gel, suivie du transfert des protéines sur une membrane. Cette membrane est
ensuite traitée avec des anticorps spécifiques permettant la détection des protéines d'intérêt.
2.4.2. Stimulation des PBMCs par le LPS (lipopolysaccharide) ou le CPG (Cytosine-

phosphate-Guanine)
Une cinétique courte de stimulation des cellules de patients et d'individus sains a été réalisée. La
stimulation des PBMCs a été réalisée par le LPS (100 ng/ml) ou le CpG (3 µg/ml) (CpG ODN 2006
(CarthaGenomics, Tunis, Tunisie), visant spécifiquement l'activation des LB, pendant différents temps.
2.4.3. Extraction des Protéines
A la fin de la stimulation, les cellules ont été récoltées, lavées doucement avec du PBS froid, récoltées
et centrifugées à 1200 tr / min pendant 10 min.
Pour extraire les protéines totales, le culot cellulaire est lysé dans 30 µl de tampon contenant 10 mM de
Tris – HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM de fluorure de sodium (NaF), 2 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA,
2% de Nonidet-P40 (NP-40), 0,75% de désoxycholate de sodium.
Les échantillons sont ensuite incubés pendant 30 min dans la glace avant de subir une centrifugation à
14 000 tr/min pendant 20 min. Tous les surnageants sont finalement récupérés dans des nouveaux tubes
et stockés à -20 ° C.
2.4.4. Dosage protéique
2.4.4.1. Principe
La concentration protéique de chaque extrait a été déterminée par la méthode BCA, un dosage
colorimétrique par l’acide bicinchoninique (Sigma), un réactif chromogène. Cette méthode repose sur
le principe de la réduction de l'ion cuivrique Cu(II) en Cu(I) par les protéines, en milieu alcalin (fig.27).
49
L'acide bicinchoninique hautement spécifique pour le Cu(I), forme un complexe pourpre ayant une
absorbance optique entre 540 et 590 nm. L’absorbance est proportionnelle à la quantité protéique
présente dans l’extrait.
Figure 27: Fondement du dosage protéique par la méthode BCA.
2.4.4.2. Mode opératoire
Le dosage est réalisé dans une plaque de 96 puits (Fig. 28). La protéine BSA (2 mg/ml) est employée
pour créer une gamme standard. Une solution de travail BCA est préparée en combinant 80% volumes
d'acide bicinchonique (SIGMA® B9643) avec 2% volume de la solution de sulfate de cuivre appelée
"Cooper (II) sulfate solution " (SIGMA® C2284).
On ajoute au 5 µl de BSA (utilisée comme protéine étalon) ou au 5µl d'extraits de protéines, 195 ul
d’eau. Des dilutions successives au 1⁄2 sont ensuite réalisées. 100 µl de la solution
BCA/Cooper (composée de 98% de réactif BCA et 2% Cooper (II) sulfate) sont finalement ajoutés dans
chaque puits. La plaque est incubée pendant 30 minutes à 60°C dans l'obscurité avant de mesurer
l'absorbance des protéines par spectrophotométrie.
Une courbe étalon, de concentrations de BSA (Sérum Albumine Bovine), en fonction de leur absorbance
est ensuite tracée. L'équation de la courbe obtenue est ensuite appliquée pour estimer la quantité de
protéines de chaque échantillon grâce à leurs absorbances (densités optiques) à 562 nm.
Figure 28: Plaque de dosage des protéines.
50
2.4.5. Dénaturation des protéines
La dénaturation des protéines consiste en la rupture des liaisons au sein de leurs structures
tridimensionnelles, notamment des dimères et des structures tertiaires. Cette étape est essentielle pour
déterminer de manière précise le poids moléculaire des protéines. Elle est réalisée par un traitement
dénaturant qui utilise trois composants principaux : la chaleur, un détergent ionique, le SDS (sodium
dodécylsulfate) qui confère aux protéines une charge négative permettant la migration des protéines en
fonction du poids moléculaire et un agent réducteur le β-mercaptoéthanol qui garantit la rupture
complète des ponts disulfures. Chaque échantillon a subi une dénaturation d'une quantité équivalente de
protéines dans 1M Tris HCl pH6.8, 2 % de β-mércaptoéthanol, 1% de SDS, bleu de bromophénol et 5%
de glycérol.
2.4.6. SDS page et Western Blot
La séparation des protéines selon le poids moléculaire a été réalisée sur gel de polyacrylamide 10% ou
12% en conditions dénaturantes. Les échantillons protéiques sont fractionnés grâce à leur migration sur
deux gels successifs : un gel de concentration (stacking gel) et un gel de séparation (runing gel). Dès
que les agents de polymérisation ont été ajoutés, le gel de séparation contenant 0.8% de Bis-acrylamide,
12 % d’acrylamide, 375mM de Tris HCl pH 8.8, 0.1 % de SDS, 0.1% d’Ammonium Persulfate (APS)
et 0.04 % de TEMED a été coulé entre la lame et la lamelle (Tableau 1). Après polymérisation du gel
de séparation, le gel de concentration (5 % d’acrylamide, 0.8 % de Bisacrylamide, 125mM de Tris HCl
pH 6.8, 0.1 % de SDS, 0.1 % APS et de 0.01%TEMED) est coulé au-dessus et rapidement le peigne
permettant la formation des puits est placé.
Les protéines migrent vers le pôle positif grâce à leur charge négative conférée par l’ajout du SDS dans
le tampon d’échantillon ainsi que dans le tampon de migration.
51
L’électrophorèse consiste à séparer les protéines, selon leur poids moléculaire, sur un gel de
polyacrylamide SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) formé d’un
gel de concentration et d’un gel de séparation :
Tableau 1: Composition des deux gels de migration.
2.4.7. Migration des protéines
Les extraits protéiques dénaturés, ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire (Thermo Scientific 26616)
sont déposés dans les puits.
La migration est réalisée à voltage constant (100V) dans un tampon composé de 25 mM Tris-Base, 1.92
mM glycine et 0.1% SDS, pendant une heure. Le bleu du tampon de charge permet de suivre la migration
des protéines et déterminer le moment souhaité d'arrêt du processus.
2.4.8. Transfert des protéines sur membrane PVDF
Les protéines sont à la fin de la migration transférées sur une membrane de polyvinylidene fluoride
(PVDF) de 0,45 um (Amersham) préalablement activée dans une solution de méthanol pendant 5
minutes.
Le transfert s'effectue à travers un montage composé de plusieurs éléments déjà imprégnés de tampon
de transfert et à l’aide d’une cassette de transfert, dont le sens de migration se fait du pôle négatif (face
noire de la cassette) vers le pôle positif (face blanche de la cassette). Le gel sur lequel on place la
membrane est pris en sandwich entre deux papiers Wattmann surmonté d’un chiffon. La cassette est
52
immergée dans une cuve remplie de tampon de transfert avec un bac à glace pour éviter la surchauffe
de la membrane. L'ampérage est de 250 à 400 mA et il est surveillé durant cette étape.
2.4.9. Saturation et incubation avec les anticorps
La membrane est incubée dans une solution de PBS 1X, 0,01% de tween 20 (tampon de lavage) et 5%
de lait écrémé (poudre Régilait) pendant 1h à température ambiante. Cette étape vise à saturer et bloquer
les sites libres restants sur la membrane après le transfert. Ensuite, la membrane est lavée avec du PBS
1X contenant 0,2% de Tween 20 et incubée pendant une nuit à +4°C sur l'agitateur avec l'anticorps
primaire (β-actine (Sigma-Aldrich) ou phospho-p65 (cell signaling) préalablement dilué dans le tampon
de saturation. Le jour suivant, les membranes sont lavées trois fois puis incubées avec l’anticorps
secondaire conjugué à la peroxydase, (l’anti-lapin (Dako 1 : 2000) dans notre cas) pendant encore 1h à
température ambiante. Finalement La membrane est soumise à 3 séries de lavages d'une durée de 15 min
chacune avant de passer à l'étape de révélation.
2.4.10. Révélation des protéines par immuno-détection
Pour la détection des protéines, la membrane a été exposée à l'obscurité pendant 1 minute avec le substrat
chimioluminescent (ECL) (Amersham), qui réagit avec l'anticorps secondaire couplé à la HRP, générant
ainsi un signal visible sur un film photographique (Amersham Hyperfilm ECL®- 28-9068-36)
positionné contre la membrane dans une cassette de révélation dans une chambre noire. Ensuite, le film
a été traité avec les solutions révélatrices (carestream-5274394) et fixatrices (carestream-5224381). La
durée d'exposition du film à la membrane a été ajustée en fonction de l'intensité du signal détecté.
2.5. Phénotypage lymphocytaire par cytométrie en flux
2.5.1. Principe
La cytométrie en flux est une technique polyvalente, à la fois qualitative et quantitative, permettant
l'analyse approfondie des cellules. Le processus d'analyse individuelle est réalisé en faisant passer les
cellules en suspension à travers un faisceau lumineux émis par un laser ou une lampe à arc, à une vitesse
de plusieurs milliers d'événements par seconde. Des détecteurs captent les signaux émis par chaque
cellule pour une analyse approfondie. Les signaux mesurés se rapportent principalement aux propriétés
optiques intrinsèques des particules, incluant la diffusion lumineuse, la taille (dispersion avant, FSC), la
structure interne et la granulosité des particules (dispersion latérale, SSC). En outre, des signaux
spécifiques peuvent être mesurés, tels que la fluorescence émise par un anticorps couplé à un
fluorochrome, permettant de marquer spécifiquement certaines cellules. Les signaux optiques collectés
par le cytomètre sont ensuite transformés en signaux électroniques par des photomultiplicateurs. Enfin,
l'ordinateur analyse les données, générant des histogrammes ou des cytogrammes qui représentent
graphiquement les propriétés cellulaires évaluées, offrant ainsi une compréhension approfondie des
caractéristiques des différentes populations cellulaires (Fig.29).
53
Figure 29: Principe de cytométrie en flux.
2.5.2. Analyse de phosphorylation de STAT3
L'exploration de la phosphorylation du STAT3 a été entreprise en raison des concentrations élevées d'IL-
10 et d'IL-6 observées chez les patients atteints de NB, suscitant des interrogations sur le possible impact
de la phosphorylation de STAT3 dans cette perturbation. L'analyse de l'état de phosphorylation de
STAT3 a été réalisée sur les PBMCs des patients SEP et NB et un témoin.
2.5.3. Protocole expérimental de l’étude de phosphorylation du STAT3
2.5.3.1. Stimulation des PBMC
Le facteur de transcription STAT3, est normalement dans le cytoplasme sous forme non phosphorylé.
Sa régulation est assujettie à divers signaux cellulaires, dont des cytokines telles que l'IL-6, l'IL-10 et
les facteurs de croissance.
Pour débuter l'expérience, les cellules sont comptées après une séparation par ficoll, puis resuspendues
à raison d'un million par millilitre de RPMI non supplémenté de sérum de veau fœtal (SVF). Pour le
marquage de pSTAT3, 250 000 cellules sont resuspendus dans 250 µl et sont placées dans chaque tube
de FACS. Chaque individu nécessite un tube stimulé et un tube non stimulé. Ces cellules sont stimulées
avec 25 ng/mL d'IL-6 recombinant et 25 ng/mL d'IL-10 pendant 15 minutes. Cette stimulation se déroule
dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
54
2.5.3.2. Marquage extracellulaire
Les PBMCs sont placés dans un incubateur réglé à 37 °C et 5% de CO2 et incubés en présence de 5µl
d’anticorps anti-CD3 (marquage des lymphocytes T) et 4µl d’anticorps anti-CD19 (marquage des
lymphocytes B). Pour ce faire, nous utilisons 5 µL de phycoérythrine (PE) pour marquer les CD3 et 4
µl de Peridinin-chlorophyll-protein complex-Cyanine5.5 (PerCP-Cy5.5) pour marquer les CD19.
2.5.3.3. Marquage intracellulaire
250µl de Cytofix sont ajoutés aux 250µl de cellules dans chaque tube (250 µL de Cytofix pour 250 µL
de cellules). L’ensemble est incubé pendant 10 minutes à 37 °C en présence de 5% de CO2. Ensuite, les
cellules sont lavées deux fois avec 2 mL de PBS 1X contenant 2% de SVF, puis centrifugées à 1600
rpm pendant 8 minutes à +4°C. Par la suite, 500 µl de Perm Buffer sont ajoutés à chaque tube, suivi d'un
vortex, puis les cellules sont incubées pendant 30 minutes dans la glace. Les cellules sont ensuite lavées
deux fois avec 2 ml de PBS 1X contenant 2% de SVF, puis marquées avec 5 µl d'anticorps anti-pSTAT3
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) de (BD Biosciences 557814). Cette étape d'incubation se déroule
pendant 2 heures à +4 °C, dans l'obscurité, suivie d'un lavage avec 2 ml de PBS 1X contenant 2% de
SVF. Les tubes sont centrifugés à 1600 rpm pendant 8 minutes à +4°C.Finalement, les cellules sont
resuspendues dans 300 µl de PBS 1X contenant 2% de SVF.
2.5.3.4. Lecture des résultats et analyse
Les échantillons traités ont été soumis à une analyse par cytométrie en flux (FACS) pour évaluer
l'expression des marqueurs cellulaires spécifiques. Les résultats obtenus ont ensuite été exportés dans le
logiciel Kaluza (version 2.2.1), où une analyse multiparamétrique a été réalisée.
55
Résultats
56
Résultats
RESULTATS
1. EXPRESSION DE L’IL-6 DANS LE LIQUIDE CÉPHALORACHIDIEN ET

LES CELLULES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE
Nous avons précédemment mené une évaluation approfondie de l'expression de l’IL-6 et l’IL-10 dans
deux compartiments distincts, à savoir le LCR et les PBMCs, chez des patients atteints de maladies
neurologiques.
Concernant le LCR, les résultats de notre étude, présentés dans la Figure 30, indiquent une augmentation
significative de l'expression de l'IL-6 chez les patients atteints de NB par rapport au groupe de maladies
neurologiques non inflammatoires (NIND)(p=0,0006) et par rapport au groupe de patients atteints de
sclérose en plaques (p=0,04). De plus, lors de la quantification de l'ARNm de l'IL-10 à partir des cellules
du LCR, nous avons observé une expression significativement plus élevée chez les patients atteints de
NB par rapport aux patients atteints de SEP et au groupe témoin (p<0,0001).
Parallèlement, dans le cadre de notre analyse des PBMCs (Fig. 30), nous avons également observé une
augmentation statistiquement significative de l'expression des ARNm de l'IL-6 dans le groupe de
patients atteints de NB par rapport aux patients atteints de SEP et au groupe NIND (p=0,0139). De plus,
nous avons constaté une augmentation significative de l'expression de l'IL-10 chez les patients atteints
de NB par rapport aux patients atteints de SEP (p=0,0474).
57
Résultats
Figure 30: Boxplots représentatifs de l’expression relative d’IL-6 dans le LCR et les PBMCs.
Les marqueurs immunologiques IL-6 et IL-10 se révèlent significativement élevés chez les patients
atteints de NB par rapport aux individus souffrant de SEP et du groupe contrôle (NIND) '. Cette
expression accrue d'IL-6 et IL-10 est observée aussi bien dans le LCR que dans les PBMCs.
2. ACTIVATION DE NF-KB DANS LES CELLULES DU SANG

Les PBMCs sont purifiés à partir du sang d’individus sains ou de patients atteints de NB (n=4). Dans
une plaque de 6 puits, 3 106 cellules sont placées dans chacun des puits. Les cellules sont stimulées soit
par LPS (100ng/ml) soit par le CpG (3ug/ml) pendant différents temps. Les protéines provenant de la
lyse de chacun des puits sont dosées et séparées sur un gel de polyacrylamide, avant d’être transférées
sur une membrane PVDF. La membrane est ensuite hybridée avec un anticorps dirigé contre la forme
phosphorylée de p65 puis déshybridée et ré-hybridée avec un anticorps anti-actine pour s’assurer de
l’homogénéité des charges. Nos résultats montrent que la stimulation LPS mais également la stimulation
58
Résultats
CpG induit la phosphorylation de la sous-unité p65 et donc l’activation de NF-kB. Cette phosphorylation
par le LPS est visible dès 5 minutes de stimulation et est maximale 15 minutes après stimulation. Celle
induite par le CpG atteint son maximum 10 minutes après la stimulation (Fig.31).
Figure 31: Cinétique d’expression de la sous-unité p65 NF-KB chez les Témoins.
Le LPS ainsi que les CpG induisent la phosphorylation rapide de la sous-unité p65 de NF-κB, observable
dès 15 minutes en réponse au LPS et dès 10 minutes en réponse aux CpG. Cette phosphorylation rapide
suggère une activation du facteur de transcription NF-κB en réponse à ces stimuli immunologiques
spécifiques.
3. ETUDE DE PHOSPHO-STAT3 PAR CYTOMÉTRIE EN FLUX

La phosphorylation de STAT3 (P-STAT3) au niveau des cellules de deux patients atteints de NB, d'un
patient atteint de SEP et d'un témoin a été analysée par cytométrie en flux. Nous avons utilisé un
anticorps anti-STAT3 phosphorylé marqué au fluorochrome FITC. De plus, un anticorps anti-CD3
Phycoérythrine (PE) a été employé comme marqueur pour les lymphocytes T, tandis que les
lymphocytes B ont été marqués avec l'anticorps anti-CD19 Peridinin chlorophyll protein-Cyanine5.5
(PerCP-Cy5-5-A). Les PBMCs préalablement stimulés par l’IL-6 (25 ng/mL) ou l’IL-10 (25 ng/mL),
ont été évalués pour les niveaux de phosphorylation de STAT3 au sein des populations B et T.
Notre étude a consisté en deux séries d'expériences distinctes, comparant un individu témoin sain à un
patient atteint de NB d'une part, et un patient atteint de SEP également à un patient de NB d'autre part.
3.1. Profil des populations lymphocytaires
Nous avons, dans un premier temps, analysé le profil cellulaire au niveau des PBMCs non stimulés, chez
un patient NB, un témoin sain et un patient SEP (Fig .32). Les marquages montrent que les populations
de lymphocytes T (CD3) sont prédominantes par rapport aux lymphocytes B (CD19) au niveau des
PBMCs purifiés aussi bien à partir du sang de témoin qu’à partir du sang de malades. En effet, chez le
patient SEP, il existe 59% de cellules CD3+ et 10.38% de cellules CD19+. Chez le patient NB1, elle est
de 9.99% tandis que chez le témoin, elle est de 11,2%.
59
Résultats
Figure 32: Marquage CD3 et CD19 au niveau des PBMCs.
Les marquages des PBMCs montrent une prédominance des lymphocytes T (CD3) par rapport aux
lymphocytes B (CD19) chez le NB (38%) et chez le SEP (59%). Les pourcentages de CD19 sont
comparables entre tous les individus (9.99% pour le NB ,10,38% pour le patient SEP et 11.2% chez le
témoin).
3.2. Analyse comparative de la phosphorylation de STAT3
3.2.1. Au niveau des PBMCs non stimulés
Pour étudier la phosphorylation de STAT3 par cytométrie en flux, les cellules non marquées sont, dans
un premier temps, considérées. La Figure 33 montre les PBMCs non marquées de patients NB.
60
Résultats
Figure 33: Profil des cellules non marquées d’un individu NB.
PE: Marquage de CD3 ; FITC: Marquage de PSTAT3; PerCP-CY5-5-A:Marquage de CD19.
L'analyse des niveaux de phosphorylation de STAT3 au niveau de cellules non stimulées montre que
concernant les témoins, les pourcentages de cellules présentant une phosphorylation de STAT3 sont
respectivement de 6,55% pour les lymphocytes B et 8,48% pour les LT (CD3).
Cette analyse révèle une augmentation significative du nombre de cellules présentant une
phosphorylation de STAT3 chez les patients atteints de NB (NB1 et NB2), tant au niveau des LT que
des LB. Les résultats obtenus révèlent une augmentation remarquable au sein des lymphocytes B, avec
un pourcentage de 47.46% chez NB1 et 40.85% chez NB2, tandis qu’au niveau des lymphocytes T, elle
est moins prononcée, affichant un taux de 16.46% chez NB1 et 15.38% chez le patient NB2. Ainsi la
moyenne des deux patients est de 15,92% pour les LT et 44.15% pour les LB.
Par ailleurs, l’analyse des cellules non stimulées chez un patient SEP révèle un nombre moins important
de lymphocytes présentant une phosphorylation de STAT3, avec 19.81% au sein de LB et 12.2% chez
les LT (Fig .34).
61
Résultats
Figure 34: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT non stimulés.
Chez le témoin, une phosphorylation est détectée même à l'état non stimulé, bien que de manière
faible.Comparativement, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), une phosphorylation
légèrement plus marquée est observée chez les deux populations de LT et de LB. Cependant, chez le
patient atteint de NB, un pourcentage significatif de LB exprimant la protéine STAT3, soulignant une
activation plus prononcée de cette voie de signalisation.
62
Résultats
3.2.2. Phosphorylation de STAT3 des PBMCs stimulées par l’IL-6
Au niveau de tous les individus, la stimulation par l'IL-6 induit une augmentation significative de nombre
de LB et des LT présentant une phosphorylation de STAT3. Le pourcentage des LB est de 11.26% chez
le témoin et de 34.81 % chez le patient NB1 et 30.97% chez NB2. Concernant les LT, cette augmentation
est encore plus prononcée. En effet, 51.39% des cellules sont positives au niveau du patient NB1 et
55.25% chez NB2, contre 19.64% au niveau du témoin (Fig. 35). Ainsi la moyenne des deux patients
NB est de 53,32% pour les LT et de 32,89% pour les LB.
Concernant les patients atteints de SEP, après stimulation par l'IL-6, on observe une augmentation
significative du nombre de lymphocytes positifs pour la phosphorylation. Le pourcentage atteint 25.43%
des LB et 34.61% des LT.
63
Résultats
Figure 35: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT après stimulation à l’IL-6.
La stimulation par l'IL-6 induit une augmentation du pourcentage de lymphocytes T exprimant STAT3
phosphorylé, en particulier chez les patients atteints de SEP et de NB. Pour les lymphocytes B, la
stimulation par l'IL-6 semble légèrement augmenter le pourcentage de lymphocytes B exprimant STAT3
phosphorylé chez les patients atteints de SEP. Cependant, ce pourcentage semble diminuer au niveau
des patients atteints de neuro-Behçet.
3.2.3. Phosphorylation de STAT3 des PBMCs stimulés par l’IL-10
Chez les témoins sains, une augmentation significative de LB présentant une phosphorylation de STAT3
est observée suite à la stimulation par l'IL-10 (22.96%). Les patients SEP présentent également une
64
Résultats
hausse de LB présentant une phosphorylation de STAT3, atteignant 29.29%, comparable à celle des
témoins. En revanche, chez les patients atteints de NB, ce pourcentage est encore plus marqué, culminant
à 44.71% chez NB1 et 46.71% chez NB2 avec une moyenne de 45.71% (Fig. 36).
En ce qui concerne les LT, la stimulation par l'IL-10 provoque une légère augmentation du pourcentage
de cellules présentant une phosphorylation de STAT3 chez les témoins sains, atteignant 19,51%. Les
patients atteints de SEP présentent également une augmentation significative de LT positifs, soit
32,15%. Cette augmentation est nettement plus prononcée chez les patients NB, où 53,40% chez NB1
et 53,02% chez NB2 des LT qui sont positifs (Fig.36). La moyenne de LT présentant une
phosphorylation de STAT3 chez les deux patients NB est de 53.21%
65
Résultats
Figure 36: Phosphorylation de STAT3 au niveau des LB et LT après stimulation à l’IL-10.
En réponse à la stimulation par l'IL-10, il ya une augmentation du pourcentage de lymphocytes T

exprimant STAT3 phosphorylé, et cette augmentation est plus prononcée chez les patients atteints de NB
que chez ceux atteints de SEP. En ce qui concerne les lymphocytes B, la stimulation par l'IL-10
n'entraîne pas de modification significative du pourcentage de lymphocytes B exprimant STAT3 chez les
patients NB. En revanche, chez les patients SEP, une légère augmentation de ce pourcentage.
66
Résultats
Les résultats ont été organisés et présentés de manière structurée dans deux tableaux distincts pour
faciliter l'analyse comparative des niveaux de phosphorylation de STAT3. Dans le premier tableau, les
données concernant la phosphorylation de STAT3 au sein de la population des cellules CD3 ont été
consignées, permettant ainsi de visualiser spécifiquement la réponse des lymphocytes T à la stimulation
par l'IL-6 et l'IL-10 (Tableau 2). D'autre part, le deuxième tableau contient les valeurs correspondantes
pour la population des cellules CD19, mettant en lumière la réponse des lymphocytes B à ces mêmes
stimuli (Tableau 3).
Tableau 2: Taux de phosphorylation de STAT3 au niveau des populations CD19.
Tableau 3:Taux de phosphorylation de STAT3 au niveau des populations CD3.
67
Résultats
Ensuite, les résultats ont été synthétisés visuellement à travers des histogrammes, permettant ainsi une
compréhension plus intuitive de l'impact de la stimulation par l'IL-6 et l'IL-10 sur les lymphocytes B et
les lymphocytes T dans différents groupes de patients, à savoir ceux atteints de sclérose en plaques, de
neuro-Behçet, ainsi que l’individu témoin. Ces représentations graphiques offrent une vue d'ensemble
claire et comparative des réponses immunologiques induites par ces cytokines dans les différents
contextes pathologiques.
Dans chaque histogramme, les pourcentages de LB (Fig. 37) et de LT (Fig.38) positifs à la

phosphorylation de STAT3 après stimulation par l'IL-6 et l'IL-10 ont été représentés pour les trois
groupes de sujets. Cette approche permet d'évaluer la réponse des lymphocytes de manière spécifique et
de comparer les niveaux d'activation entre les différents groupes.
Figure 37: Représentation des taux de P-STAT3 au niveau des populations CD19.
Dans le cas non stimulé, les patients NB1 et NB2 présentent un taux élevé du pourcentage de LB
présentant une phosphorylation de STAT3. La stimulation par l'IL-6 entraîne une diminution du
pourcentage de LB présentant une phosphorylation de STAT3, chez les deux patients NB1 et NB2 par
rapport au Témoin et au patient SEP.
68
Résultats
Figure 38: Représentation des taux de P-STAT3 au niveau des populations CD3 par histogramme.
Dans le cas non stimulé, les patients NB1 et NB2 présentent des niveaux légèrement plus élevés de
phosphorylation de STAT3 au niveau des populations de CD3 par rapport aux témoins et aux patients
SEP. La stimulation par l'IL-6, induit une augmentation du pourcentage de LT présentant une
phosphorylation de STAT3 chez les témoins et les patients NB. En revanche, la stimulation par l'IL-10
entraîne une augmentation du pourcentage de LT présentant une phosphorylation de STAT3 moins
importante que celle induite par l'IL-6 chez les témoins, tandis que chez les patients NB, elle reste
significativement élevée. Chez les patients SEP, l’augmentation du pourcentage de LT présentant une
phosphorylation de STAT3 induite par l'IL-10 et l’IL-6 est moins prononcée que chez les patients NB.
La phosphorylation de STAT3 dans les PBMCs non stimulées révèle une augmentation significative
chez les patients atteints de NB, en particulier au niveau des lymphocytes B. Chez les patients NB, une
forte expression de STAT3 phosphorylé est observée même sans stimulation, avec des taux nettement
plus élevés que chez les témoins et les patients atteints de sclérose en plaques.
Après stimulation par l'IL-6, une augmentation significative du pourcentage de LB et de LT exprimant

STAT3 phosphorylé est observée chez tous les individus. Cependant, chez les patients atteints de NB,
cette augmentation semble être légèrement moindre par rapport aux autres groupes. Cependant, en raison
du petit nombre de patients dans l'étude, il est difficile de déterminer si cette différence est
statistiquement significative.
69
Résultats
La stimulation par l'IL-10 entraîne également une augmentation du pourcentage de LB et de LT positifs

pour la phosphorylation de STAT3 chez tous les groupes. Chez les patients NB, cette augmentation est
encore plus marquée que chez les témoins et les patients SEP.
70
Discussion
71
Discussion
DISCUSSION
Le diagnostic du Neuro-Behçet pose des défis considérables en raison de sa rareté et de la sévérité de
ses manifestations cliniques, ainsi que de l'absence de critères validés ou de tests spécifiques pour une
confirmation définitive. Souvent, le processus diagnostique repose sur une approche d'élimination,
excluant d'autres causes potentielles telles que les étiologies infectieuses, neurodégénératives et
malignes. Cette démarche, bien que nécessaire, peut être complexe et nécessiter un temps considérable.
Par conséquent, le défi majeur réside dans la reconnaissance des signes spécifiques du NB parmi une
gamme de symptômes neurologiques possibles. Les efforts de recherche et l'établissement de critères
diagnostiques plus spécifiques sont nécessaires pour faciliter une identification plus rapide et précise de
la maladie, améliorant ainsi la prise en charge des patients et ouvrant la voie à des options thérapeutiques
adaptées (Biniwale et al. 2020).
Dans une approche exploratoire d’un marqueur potentiel discriminant entre les deux maladies
neurologiques : NB et SEP, notre équipe s’est intéressée depuis quelques années à l’étude de l'expression
différentielle de cytokines et des facteurs de transcription associés aux réponses immunitaires cellulaires
inflammatoires et régulatrices.
Les résultats antérieurs montrent une augmentation significative de la synthèse de l'IL-6 au niveau du
LCR et des PBMCs de patients NB. Ces conclusions sont cohérentes avec les travaux antérieurs de
Hirohata et de ses collaborateurs (Hirohata et al. 1997), qui ont démontré une corrélation entre les
niveaux d'IL-6 et l'activité de la maladie. Ces résultats renforcent la pertinence clinique de l'IL-6 comme
marqueur potentiel de l'activité de la maladie chez les patients atteints de NB, soulignant ainsi son rôle
dans le suivi et la compréhension de l'évolution de la pathologie et qu'elle soit significativement
augmentée dans le LCR des personnes souffrant d'une forme progressive de la maladie (Aridogan et al.,
2003; Akman-Demir et al., 2008a; Saruhan-Direskeneli and Direskeneli, 2021).
Dans notre travail, nous avons étudié dans un premier temps la phosphorylation et donc l’activation du
facteur de transcription NF-κB, acteur clé dans le développement pathologique de plusieurs maladies
inflammatoires, parmi lesquelles la polyarthrite rhumatoïde (PR), les maladies inflammatoires de
l'intestin (MICI), la SEP, le lupus érythémateux disséminé, le diabète de type I et l'asthme (Pai and
Thomas 2008; Novack 2011). Dans un deuxième temps nous nous sommes intéressés au facteur de
transcription STAT3 dont l’activation persistante peut contribuer au développement d'une inflammation
72
Discussion
chronique pouvant évoluer vers des maladies auto-immunes. De ce fait, STAT3 est une cible importante
pour la recherche dans les maladies inflammatoires, le cancer et les maladies auto-immunes (X. Liu et
al. 2008 ; H. Yu, Pardoll, and Jove 2009 et Cimica et al. 2011).
L’augmentation de la production de l’IL-6 observée au niveau du LCR et des PBMCs de patients NB
est sans doute sous la dépendance du facteur de transcription NF-κB. Malheureusement, nous n'avons
pas pu démontrer l'activation de ce facteur au niveau des PBMCs des patients au cours de cette étude.
Des prélèvements supplémentaires de patients seront nécessaires pour confirmer cette activation.
Par ailleurs, dans une étude antérieure menée par notre équipe, l'IL-10 a été identifiée comme un
marqueur potentiellement discriminatif entre les patients souffrant de NB et ceux atteints de SEP
(Belghith et al., 2018). L'augmentation de l’IL-10, reconnue pour ses propriétés anti-inflammatoires,
dans des maladies inflammatoires telles que le NB peut sembler surprenante, mais cela n'est pas une
exception. En effet, cette observation trouve des parallèles dans plusieurs maladies auto-immunes et
auto-inflammatoires. Des niveaux sériques élevés d'IL-10 ont été documentés dans diverses maladies
auto-immunes humaines. Par exemple, chez les patients atteints de lupus érythémateux systémique, des
études ont montré que des taux élevés d'IL-10 sont corrélés à l'activité de la maladie (Houssiau et al.,
1995; Mongan et al., 1997). Des investigations ont également révélé que les PBMCs cultivées chez ces
patients produisent spontanément des quantités importantes d'IL-10 (Lalani et al., 1997). De plus, la
production accrue d'IL-10 a été observée dans les lymphocytes T synoviaux de patients atteints de
polyarthrite rhumatoïde, dans le sérum de patients souffrant de sclérodermie, de la maladie de Kawasaki,
et du syndrome lymphoprolifératif auto-immun (ALPS). Des niveaux élevés d'IL-10 ont également été
démontrés dans les cellules cultivées de patients atteints de polymyosite et de dermatomyosite (Moore
et al. 2001). L’augmentation de l'expression de l'ARNm de l'IL-10 par les PBMC et/ou différents tissus
a été associée à plusieurs maladies auto-immunes telles que le syndrome de Sjögren, la maladie de
Basedow, la myasthénie, le syndrome lymphoprolifératif auto-immun (ALPS) et le psoriasis (Lalani et
al., 1997; Lopatin et al., 2001; Mirakian et al., 2001; Moore et al., 2001; Melgar et al., 2003). Ces études
suggèrent que la dysrégulation de l'IL-10 joue un rôle crucial dans le développement des maladies auto-
immunes. Bien que l'association entre la maladie et les niveaux d'IL-10 soit évidente, il est moins clair
si la production d'IL-10 précède l'apparition de la maladie ou si elle résulte de son activité. De plus, bien
que la progression de la maladie auto-immune puisse influencer les niveaux d'IL-10 et d'autres
cytokines, des études familiales suggèrent que les différences génétiques héréditaires jouent un rôle
73
Discussion
majeur dans la régulation de la production d'IL-10 et contribuent au phénotype des maladies auto-
immunes (Lindqvist, 1999; Gibson et al., 2001).
Des résultats antérieurs de notre groupe, ont montré que la stimulation in vitro des cellules B du sang
périphérique de patients atteints de NB par le CpG, a entraîné une expression précoce et concomitante
de l'ARNm de l'IL-6 et de l'IL-10. La source cellulaire de l'IL-10 dans le LCR des patients atteints de
troubles neuro-immunologiques demeure peu explorée. Des études antérieures du groupe ont montré,
par cytométrie en flux que dans le LCR de patients atteints de SEP et de NB, recrutés au stade initial de
la maladie, avant toute intervention thérapeutique, les LB étaient à l’origine de la production d’IL-10
(Maghrebi et al. 2022). Il a déjà été proposé que le SNC est un environnement favorisant les LB dans
une multitude de troubles neurologiques, notamment dans le modèle de la SEP (Uccelli et al., 2005;
Touil et al., 2018). La proportion accrue des LB sécréteurs d'IL-10 dans le LCR des patients atteints de
NB, telle que décrite dans notre étude, trouve une corroboration dans les résultats rapportés par Yang et
ses collègues (Yang et al., 2010). Ces derniers ont démontré que le facteur d'activation de cellules B
(BAFF) peut induire une expansion de la sous-population de LB produisant de l'IL-10, mettant en jeu
plusieurs mécanismes potentiels tels que la différenciation des LB régulateurs, leur prolifération et leur
survie.
Dans la maladie de Behçet, les LB jouent un rôle actif dans le processus inflammatoire, comme en
témoigne la présence de LB CD20+ dans les sections pulmonaires d'artères chez les patients atteints de
Behçet (Hirohata and Kikuchi, 2009). De plus, une expression régulée à la hausse de l'ARNm de BAFF
a été observée dans les biopsies cutanées de neuropathie bénigne (NB) (Hamzaoui et al., 2008a). Des
études antérieures ont également révélé des niveaux élevés de BAFF dans le liquide céphalorachidien
(LCR) des patients atteints de NB, sans corrélation avec les niveaux sériques de BAFF.
Des recherches antérieures ont montré que les LB producteurs d'IL-10 expriment souvent simultanément
des cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-6 et le TNFα (Lighaam et al., 2018). Dans une étude
précédente de notre laboratoire, nous avons étudié plus spécifiquement l'induction de l'IL-6 dans les LB
en raison de son lien avec l'activité du système nerveux central dans la NB (Hirohata et al., 1997).
Dans une étude antérieure menée dans notre laboratoire, nous avons évalué cette hypothèse en stimulant
in vitro les LB de patients atteints de NB et de SEP, ainsi que des témoins, avec du CpG. Nous avons
observé chez les patients atteints de NB une expression élevée et simultanée d'IL-10 et d'IL-6, tandis
74
Discussion
que les LB des patients SEP n'ont montré qu'une sécrétion d'IL-10, avec des niveaux d'expression plus
bas par rapport aux patients atteints de NB. De plus, les LB des patients SEP ont présenté un défaut dans
leur capacité à sécréter de l'IL-10 après une stimulation prolongée, comme décrit dans des études
antérieures (Bar-Or et al., 2010; Ireland et al., 2012). Nous avons également réalisé une analyse des
récepteurs pour évaluer un éventuel défaut d'expression dans les maladies neurologiques étudiées
(Murray, 2007). Nous avons observé une augmentation de l'IL-10Rb dans les cellules du LCR des
patients atteints de NB et de SEP par rapport aux contrôles, liée à un environnement inflammatoire
accru, comme en témoigne également l'augmentation d'autres cytokines telles que l'IL-22, décrite
comme élevée dans le LCR des patients atteints de SEP et de NB (Perriard et al., 2015; Tong et al.,
2019).
De manière intéressante, une surexpression de l'IL-6ST (gp130) a été observée chez les patients atteints
de SEP par rapport aux patients atteints de NB dans le sang et le LCR, sans différence significative dans
l'expression de l'IL-6Rα. Cette surexpression pourrait favoriser le développement des lymphocytes T
auxiliaires de type 17 (LTh17) chez les patients SEP (Bin Dhuban et al., 2019; Holz et al., 2018). De
plus, la régulation négative de la gp130 chez les patients NB pourrait induire les macrophages et les
neutrophiles à libérer des cytokines pro-inflammatoires (Holz et al., 2018). La différence d'expression
de la gp130 entre les deux maladies pourrait expliquer l'augmentation de l'expression intrathécale d'Ig
et la présence de bandes oligoclonales (BOC) dans le LCR des patients SEP (Hirano et al., 1986; Hunter
and Jones, 2015; Scherger et al., 2019).
En conclusion, en se liant à leurs récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules, l'IL-6 et l’IL-10
déclenchent une cascade d'événements intracellulaires et induisent l’activation de la voie JAK/STAT et
plus particulièrement STAT3. Nos résultats montrent une augmentation des pourcentages de LB
exprimant STAT3 phosphorylés au niveau des LB de malades NB ainsi qu’une diminution de la
phosphorylation de STAT3 dans les mêmes cellules en réponse à une stimulation IL-6. L'expression de
l'ARNm des récepteurs de l'IL-6 et de l'IL-10 a été évaluée et montre que celle de la sous-unité du
récepteur de l'IL-6ST surexprimée chez les patients SEP, était significativement plus faible chez les
patients NB, tandis que celle de l'IL-10Rb était augmentée (Maghrebi et al, 2022). Une diminution de
l’expression du récepteur de l’IL-6 pourrait donc expliquer la diminution des lymphocytes B exprimant
STAT3 phosphorylé en réponse à la stimulation par cette cytokine..
75
Conclusion
76
Conclusion
CONCLUSION
Actuellement, la rareté de la maladie de neuro-Behçet et la difficulté de son diagnostic en l'absence de
marqueurs spécifiques, constituent des obstacles majeurs pour une prise en charge optimale. Notre
équipe vise à l’identification de marqueurs discriminants ainsi qu’une meilleure compréhension des
mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réponse immunitaire observée. Cette approche, basée sur
des marqueurs moléculaires spécifiques, ouvre la voie à des thérapies ciblées, qui pourraient représenter
une avancée majeure pour améliorer la gestion de la maladie.
Un premier marqueur de la maladie de NB est l’IL-6 dont la sécrétion est élevée chez les patients dont
le diagnostic est définitif, cette cytokine est secrétée de façon importante aussi bien dans le sang que
dans le LCR des patients et corrèle avec l’activité de la maladie.
Dans le but de comprendre les bases moléculaires de la maladie et d’identifier de nouveaux marqueurs
qui pourraient aider au diagnostic, nous nous sommes intéressés à l’étude de deux facteurs de
transcription : STAT3 et NF-kB.
Dans un premier temps, nous avons étudié l’activation du facteur de transcription NF-kB pouvant
expliquer la stimulation de la production des cytokines et notamment de l’IL-6. Nous avons optimisé les
blots en utilisant les PBMCs de témoins afin de préparer le protocole que nous allons appliquer aux
échantillons de patients.
Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’état de phosphorylation de STAT3 par cytométrie en flux
en utilisant des échantillons provenant de deux patients présentant deux maladies inflammatoires
différentes, la SEP et le NB. Nous avons mis en évidence une augmentation du pourcentage de LB
présentant ce facteur de transcription sous sa forme phosphorylée, suite aux stimulations des cellules
avec l’IL-6 et l’IL-10, chez les patients atteints de NB.
Comprendre le rôle de ces différents facteurs de transcription peut aider à une meilleure compréhension
des mécanismes moléculaires des maladies neurologiques en général et du NB en particulier. Cibler les
facteurs de transcription pourrait également servir d’outils de diagnostic ou constituer une stratégie
thérapeutique prometteuse. En effet, la dérégulation des facteurs de transcription est une caractéristique
commune à la majorité des cancers humains et est impliquée dans un grand nombre de maladies
humaines, inflammatoires ou autres. Une meilleure compréhension des pathologies, des mécanismes de
régulation transcriptionnelle et de leur fonction précise ainsi que le développement de nouvelles
technologies, ont permis de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les facteurs de
77
Conclusion
transcription. Différentes petites molécules qui interagissent de diverses manières avec les facteurs de
transcription pour moduler leur expression, leur dégradation, leur interaction avec l'ADN ou d'autres
protéines, sont actuellement utilisées ou évaluées pour le traitement du cancer (Hagenbuchner et
Ausserlechner 2016 ; Lambert et al. 2018). Malgré les difficultés qui restent à surmonter (méthodes
d'administration, effets compensatoires et pléiotropes), le ciblage des facteurs de transcription pourrait
représenter de nouvelles stratégies thérapeutiques pour reprogrammer la réponse immune.
78
Perspectives
79
PERSPECTIVES
En perspective, une exploration plus approfondie de l'action des lymphocytes B co-exprimant l'IL-6 et
l'IL-10 dans les stades initiaux de la maladie de Behçet pourrait éclairer la pathogenèse des troubles
neurologiques associés à cette condition. Des investigations complémentaires sur le phénotype et la
fonction des cellules productrices d'IL-10 dans le neuro-Behçet sont nécessaires pour mieux comprendre
la progression de la maladie et l'impact de divers traitements immunomodulateurs au sein d'une cohorte
élargie. Il serait également pertinent d'étudier la discordance de l'expression de l'IL-6 et de son récepteur
IL6ST dans le liquide céphalorachidien des patients atteints de neuro-Behçet afin de décrypter l'axe de
signalisation de cette cytokine et son effet sur les cellules du système nerveux.
Notre prochaine phase de recherche se concentrera sur l'exploration de la protéine A20, identifiée en
tant que protéine ubiquitine ligase et inhibiteur crucial de la voie de signalisation NF-κB. Nous
envisageons que la sous-expression de la protéine A20 pourrait être le déclencheur de
l'hyperphosphorylation observée dans la maladie de Neuro-Behçet.
Bien que nous n'ayons pas encore examiné l'activation de NF-κB chez les patients atteints de Neuro-
Behçet, nos attentes reposent sur la possibilité d'une surexpression par rapport aux témoins sains. Nous
postulons que cette activation pourrait être étroitement liée à une diminution de l'expression de la
protéine A20, un inhibiteur potentiel.
Par ailleurs, en particulier, notre prochaine étape consistera à étudier la protéine A20, Une sous-
expression de la protéine A20 pourrait potentiellement être à l'origine de l'hyperphosphorylation
observée, et cette investigation fournira des informations cruciales sur les mécanismes sous-jacents à la
maladie de neuro-Behçet, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour des approches thérapeutiques
ciblées.
80
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RÉSUMÉ
La maladie de Neuro-Behçet, une manifestation neurologique rare de la maladie de Behçet, présente des
défis diagnostiques en raison de sa complexité symptomatique. C’est une maladie inflammatoire
caractérisée par une production importante d’IL-6 et d’IL-10 aussi bien au niveau des cellules du sang
qu’au niveau des cellules du liquide céphalo-rachidien.
Cette étude vise à améliorer le diagnostic précoce en identifiant des marqueurs discriminants mais
également à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les
manifestations cliniques du neuro-behçet.
Nous avons exploré l’état de phosphorylation et donc d’activation du facteur de transcription NF-κB qui
pourrait expliquer la réponse inflammatoire et la synthèse importante de l’IL-6 observée au niveau des
cellules du sang et celles du LCR. Nous nous sommes également intéressés au facteur de transcription
STAT3 qui pourrait être activé par les cytokines produites, notamment l’IL-6 et l’IL-10. L'évaluation de
la phosphorylation de STAT3 a révélé des niveaux significativement plus élevés de pSTAT3 chez les
patients Neuro-Behçet par rapport aux témoins sains et aux patients atteints de SEP.
Mots-clés : Neuro-Behçet ; Neuro-inflammation ; IL-6 ; IL-10 ; NF-κB ; STAT3
ABSTRACT
Neuro-Behçet's disease, a rare neurological manifestation of Behçet's disease, poses diagnostic

challenges due to its complex symptoms. It is an inflammatory condition characterized at the
immunological level by a significant production of IL-6 and IL-10 in both blood cells and
cerebrospinal fluid.
This study aims to enhance early diagnosis by identifying discriminative markers and gaining a better
understanding of the molecular mechanisms underlying the immunological manifestations of neuro-
Behçet. We investigated the phosphorylation and activation of the transcription factor NF-κB,
potentially explaining the inflammatory response and the significant IL-6 synthesis observed in blood
and cerebrospinal fluid cells. Additionally, we examined the phosphorylation of the transcription
factor STAT3, activated by cytokines such as IL-6 and IL-10. Evaluation of STAT3 phosphorylation
revealed significantly higher percentage of lymphocytes B expressing pSTAT3 in Neuro-Behçet
patients compared to healthy controls and those with multiple sclerosis.
Keywords: Neuro-Behçet; Neuro-inflammation; IL-6; IL-10; NF-κB; STAT3.

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Mémoire de Stage de Fin d'Étude

En vue de l’obtention du Diplôme du Master de Recherche en

Mise au point de l'étude de facteurs de transcription au niveau des

Année Universitaire 2022-2023

Soutenu publiquement le (14/01/2024)

Professeur en Immunologie, Faculté des

À Dieu, guide de ma destinée,

Un sincère remerciement également au Professeur Aïda Bouratbine, Professeur Hospitalo-

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................................6

LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................................8

SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................................12

1. SYNDROME DE BEHÇET .......................................................................................................12

1.1. Historique du syndrome de Behçet.....................................................................................13

1.2. Epidémiologie ....................................................................................................................14

1.3. Les manifestations cliniques de la maladie de Behçet........................................................16

1.4. Mécanismes de la maladie ..................................................................................................17

2.1. Epidémiologie du NB .........................................................................................................19

2.2. Manifestations cliniques neurologique ...............................................................................19

2.3. Réponse immunitaire lors du Behçet et la forme neurologique de la maladie ...................20

3. NF-KB : FACTEUR DE TRANSCRIPTION CLÉ DE LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE ..26

3.1. Structure et fonction de NF-κB ..........................................................................................27

3.2. Mécanismes d’activation de NF-κB ...................................................................................28

3.3. Fonction de NF-kB dans les cellules immunitaires adaptatives .........................................32

3.4. NF-κB dans la régulation de l’inflammasome ....................................................................33

3.5. NF-κB dans les maladies inflammatoires ...........................................................................35

4. INTERLEUKINE-6 (IL-6) .........................................................................................................36

4.1. L’IL-6 et son récepteur .......................................................................................................36

4.2. Fonctions biologiques de l’IL-6 .........................................................................................37

4.3. Signalisation cellulaire de l’IL-6 ........................................................................................38

5. RÉGULATION DE LA SYNTHÈSE DE L’IL-6 ......................................................................40

5.1. Impact de NF-κB sur la production d’IL-6 .........................................................................42

OBJECTIF DE TRAVAIL .....................................................................................................................44

MATÉRIEL ET MÉTHODES ...............................................................................................................46

1.1. Patients ...............................................................................................................................46

1.2. Individus contrôles .............................................................................................................46

1.4. Approches de travail ...........................................................................................................47

2.1. Conditionnement du prélèvement sanguin .........................................................................47

2.2. Isolement des PBMCs ........................................................................................................47

2.3. Comptage des cellules ........................................................................................................48

2.4. Détection et identification des protéines par Western Blot ................................................49

2.5. Phénotypage lymphocytaire par cytométrie en flux ...........................................................53

1. EXPRESSION DE L’IL-6 DANS LE LIQUIDE CÉPHALORACHIDIEN ET LES CELLULES

2. ACTIVATION DE NF-KB DANS LES CELLULES DU SANG .............................................58

3. ETUDE DE PHOSPHO-STAT3 PAR CYTOMÉTRIE EN FLUX ...........................................59

3.1. Profil des populations lymphocytaires ...............................................................................59

3.2. Analyse comparative de la phosphorylation de STAT3 .....................................................60

-ADN : Acide Désoxyribonucléique - G-CSF : Facteur de stimulation des

containing a CARD - GM-CSF : Facteur de Stimulation Des

-CD : Cluster de Différenciation - HLA : Antigènes Des Leucocytes

- CPA : Cellules Présentatrices d'Antigènes - IFN-γ : Interféron Gamma

- CRP : Protéine C Réactive - Ig : Immunoglobuline

- CVST : Thrombose veineuse cérébrale - IL : Interleukine

- CXCL8 : Interleukine-8 - JAK/STAT : Janus kinase/Signal

- EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid - NEMO : NF-κB Essential Modulator

- ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent - NIK : Nck Interacting Kinase

Assays - NIND : Maladies Neurologiques Non

- T-bet : Facteur de transcription T-box - PBS : Phosphate-Buffered Saline

- TLR : Toll-like receptors - RORC : Récepteur Orphelin Gamma T

- Tregs : Lymphocytes T régulateurs - SEP-RR : Sclérose En Plaques

- sIL-6R : Soluble Interleukin-6 Receptor

Figure 1: Manifestations variées de la maladie de Behçet sur différents organes. ................................13

Tableau 1: Composition des deux gels de migration. ...........................................................................52

La maladie de Neuro-Behçet, une manifestation neurologique de la maladie de Behçet, présente des

En partageant ces résultats, nous aspirons à contribuer à la compréhension accrue de la maladie de