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Action des hautes pressions hydrostatiques sur la morphologie et l’activité de


différents types de cellules

Thesis · December 1995

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Jean-Marie Perrier-Cornet
University of Burgundy
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Université de Bourgogne
École Nationale Supérieure de Biologie Appliquée
à la Nutrition et à l'Alimentation

THÈSE
présentée pour obtenir le titre de
Docteur de l'Université de Bourgogne
Génie des Procédés

par Jean-Marie PERRIER-CORNET

ACTION DES HAUTES PRESSIONS HYDROSTATIQUES


SUR LA MORPHOLOGIE ET L'ACTIVITE DE DIFFERENTS
TYPES DE CELLULES

soutenue le 12 décembre 1995 devant la commission d'examen composée de :

M. GOMA G. Rapporteur
M. PETITET J.P. Rapporteur

M. BALNY C. Examinateur
M. ENGASSER J.M. Examinateur
M. GERVAIS P. Examinateur
lle
M SIMATOS D. Examinateur
M. TRAITLER Examinateur
à Antoine et à Lucien
REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier Patrick GERVAIS, directeur du laboratoire de Génie des Procédés


Alimentaires et Biotechnologiques de l'ENSBANA, pour son soutien tout au long de
cette thèse dont les débuts ont été plus que difficiles.

Je remercie les membres du jury qui ont bien voulu lire et juger ce travail :
M. BALNY C., Professeur à l'INSERM (unité 128) de Montpellier,
M. ENGASSER J.M., Professeur à l'INPL de Nancy,
M. GOMA G., Professeur à l'INSA de Toulouse,
M. PETITET J.P., Directeur CNRS au LIMHP de Villetaneuse,
Mlle SIMATOS D., Professeur à l'ENSBANA de Dijon,
M. TRAITLER, Responsable Génie Industriel Alimentaire chez Nestlé.

J'associe à ces remerciements tous les collègues et étudiants du laboratoire qui ont
contribué à ce travail et particulièrement Laurent BENEY, Christine EVRARD, Pierre-
André MARECHAL, Inigo MARTINEZ DE MARAÑON et Olivier VITRAC.

Je tiens à remercier particulièrement Muriel HAYERT, dont la collaboration a été


précieuse et qui a largement contribué aux résultats expérimentaux cités dans ce
manuscrit. Son travail permettra sans doute d'aller plus loin dans l'interprétation des
phénomènes mis en évidence dans ces premières expériences.

Je remercie enfin ma tante et mon épouse pour leur participation acharnée et leur
compréhension.

Et je tiens publiquement à m'excuser de la cruauté de ce travail qui consiste à


martyriser et à observer l'agonie de pauvres êtres vivants en les traitant de modèles
thermodynamiques.
« La forme... de chaque partie de la matière, qu’elle soit morte ou vivante, et les
changements de forme qui apparaissent dans son mouvement et dans sa croissance,
peuvent dans tous les cas être décrits comme le résultat de l’action de forces. En bref,
la forme d’un objet est "un diagramme de force" dans le sens qu'à partir d'elle, nous
pouvons juger ou déduire les forces qui agissent ou ont agi. »
D'ARCY THOMPSON, On growth and form
SOMMAIRE
INTRODUCTION 1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 7

A APPROCHE THERMODYNAMIQUE DES HAUTES PRESSIONS 7


A.1 DEFINITION DE LA PRESSION 7
A.1.1 Pression statique dans un fluide 8
A.1.2 Action de la pression sur la matière 11
A.2 ACTION DE LA PRESSION SUR L’EAU 14
A.2.1 Diagramme de phase de l'eau 15
A.2.2 Quelques propriétés singulières de l'eau 17
A.2.3 Interprétation de ces phénomènes 17
A.3 THERMODYNAMIQUE CHIMIQUE SOUS HAUTE PRESSION 18
A.3.1 Bases et formulation mathématique de la thermodynamique 18
A.3.2 Réactions chimiques 26
A.3.3 Changement de volume dû à la rupture des interactions moléculaires 30
B ACTION DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 35
B.1 COMPRESSIBILITE 35
B.1.1 Compressibilité des corps purs 35
B.1.2 Compressibilité apparente de solutés dans de l'eau 35
B.1.3 Compression de la membrane lipidique 40
B.2 MODIFICATIONS CHIMIQUES ET STRUCTURALES 43
B.2.1 Les protéines et les structures enzymatiques 43
B.2.2 Les glucides et les polysaccharides 47
B.2.3 Les lipides et membranes lipidiques 49
C EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 51
C.1 EFFET DE PRESSIONS NON LETALES SUR LA PHYSIOLOGIE DES MICROORGANISMES 51
C.1.1 Pressions limites permettant le développement de la vie 51
C.1.2 Effet de la pression sur la croissance 52
C.1.3 Effet de la pression sur la synthèse de macromolécules 53
C.1.4 Effet sur le catabolisme cellulaire 54
C.1.5 Division cellulaire et différentiation morphologique 54
C.1.6 Réponse spécifique et adaptation à la haute pression 55
C.2 EFFET DE PRESSIONS LETALES SUR LES MICROORGANISMES 57
C.2.1 Évaluation de l'efficacité d'un traitement haute pression sur des microorganismes 57
C.2.2 Facteurs influençant la destruction des microorganismes sous haute pression 59
C.2.3 Action des hautes pressions létales : altération de la morphologie et des fonctions vitales
des microorganismes 67
D APPLICATIONS ALIMENTAIRES 70
E MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUTE PRESSION 71
E.1 MATERIEL EXPERIMENTAL ET MESURES SOUS HAUTE PRESSION 71
E.1.1 Mesures sous pression 71
E.1.2 Cellules optiques expérimentales 73
E.2 ENCEINTES HAUTE PRESSION 74

MATERIELS ET METHODES 77

A MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 77


A.1 CELLULE DE VISUALISATION 77
A.1.1 Cellule à enclumes de diamant 77
A.1.2 Conception et montage de la cellule de visualisation à fenêtres de saphir 79
A.1.3 Environnement de la cellule. 81
A.1.4 Mise au point de la partie optique 81
A.2 CIRCUIT HAUTE PRESSION 86
A.2.1 Circuit manuel "statique" 87
A.2.2 Circuit pneumatique "dynamique" 87
B MATERIEL PILOTE HAUTE PRESSION 89
C CELLULES ET LIPOSOMES UTILISES 90
C.1 LEVURES 90
C.1.1 Souches utilisées 90
C.1.2 Milieux de culture 90
C.1.3 Conditions de culture 91
C.2 SPHEROPLASTES 91
C.3 CELLULES SANGUINES HUMAINES 91
C.4 LIPOSOMES 92
D MESURE DE LA VIABILITE CELLULAIRE 93
E METHODE DE MESURE DU VOLUME CELLULAIRE 95
E.1 ACQUISITION D'IMAGE PROVENANT DU MICROSCOPE 95
E.1.1 Caméra 95
E.1.2 Module d'acquisition d'image 95
E.2 ANALYSE D'IMAGES 97
E.2.1 Segmentation de l'image 97
E.2.2 Détachement des objets binaires 99
E.2.3 Suivi individuel des cellules 99
E.2.4 Analyse individuelle des cellules 100
F PROTOCOLES EXPERIMENTAUX 101
F.1 MESURE DU VOLUME CELLULAIRE 101
F.1.1 Mesure du volume cellulaire de cellules fixées 101
F.1.2 Mesure de la distribution des volumes cellulaires d'une population 102
F.2 MESURE DE LA VIABILITE ET DE LA FUITE DE SOLUTE 104
F.2.1 Traitement dans l'enceinte haute pression 104
F.2.2 Mesure de la viabilité 104
F.2.3 Dosage des ions dans le milieu extracellulaire 104
F.3 MESURE DE LA COMPRESSION DE SOLUTIONS BINAIRES 104
F.3.1 Étalonnage 105
F.3.2 Protocole 106

RÉSULTATS ET DISCUSSION 107

PARTIE I : Mesure des variations du volume cellulaire sous hautes pressions107

A CARACTERISATION DE LA MESURE DU VOLUME DE PARTICULES SOUS HAUTE PRESSION 108


A.1 MESURE DU VOLUME DE PARTICULES INDIVIDUALISEES 108
A.1.1 Étalonnage sur billes de verres 109
A.1.2 Répétabilité de la focalisation sur des cellules de levures 111
A.2 ÉCHANTILLONNAGE DE LA DISTRIBUTION DE VOLUME D'UNE POPULATION DE PARTICULES113
B ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE
PRESSION 115
B.1 EFFET DES PARAMETRES DU TRAITEMENT SUR LA VIABILITE DES LEVURES 115
B.1.1 Effet du niveau de pression sur la viabilité des levures 115
B.1.2 Effet du temps de séjour sous pression sur la viabilité des levures 119
B.2 EFFET DU MILIEU SUR LA BARORESISTANCE DES LEVURES 121
B.2.1 Effet des solutés et de l'activité de l'eau du milieu sur la barorésistance des levures 121
B.2.2 Effet du pH du milieu sur la viabilité des levures 125
C ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT
HAUTE PRESSION 129
C.1 ANALYSE DU VOLUME CELLULAIRE DE LEVURES 130
C.1.1 Variations du volume cellulaire de cellules fixées 131
C.1.2 Variations du volume cellulaire d'une population microbienne 143
C.2 ANALYSE DU VOLUME CELLULAIRE DE CELLULES HUMAINES SANGUINES 149
C.2.1 Évolution du volume de cellules K562 dans un milieu isoosmotique 152
C.2.2 Variation du volume de cellules individuelles dans un milieu hypoosmotique 154
C.3 ANALYSE DU VOLUME DE SPHEROPLASTES DE LEVURES 161
C.4 ANALYSE DU VOLUME DE LIPOSOMES INDIVIDUALISES 163
C.4.1 Variation de volume pendant l'élévation et le maintien en pression 163
C.4.2 Modifications morphologiques lors du retour à pression atmosphérique 167

PARTIE II : Causes et conséquences de la variation de volume 171

A CAUSES DE LA VARIATION DU VOLUME CELLULAIRE PENDANT L'ELEVATION DE PRESSION ET


RELATION AVEC LA VIABILITE 173
A.1 MISE EN EVIDENCE DE LA RELATION COMPRESSION-VIABILITE 173
A.1.1 Mesures de la compression de solutions aqueuses 175
A.1.2 Représentation de la viabilité de Saccharomyces cerevisiae en fonction de la
compression du milieu intracellulaire 180
A.2 INTERPRETATION DE LA RELATION COMPRESSION-VIABILITE 181
A.2.1 Modifications moléculaires 181
A.2.2 Modifications des structures membranaires 183
B CAUSES DE LA VARIATION DU VOLUME CELLULAIRE PENDANT LE MAINTIEN SOUS PRESSION
ET RELATION AVEC LA VIABILITE 185
B.1 MISE EN EVIDENCE D’UN FLUX DE SOLUTE CHEZ LES LEVURES 188
B.1.1 Mise en évidence de la sortie d'ions 188
B.1.2 Autres sorties de solutés 188
B.2 MODIFICATION DES PROPRIETES DE PERMEABILITE DE LA MEMBRANE VIS-A-VIS DES
SOLUTES 189
B.2.1 Relation entre le flux de volume et le flux de soluté 189
B.2.2 Perméabilisation et modifications des systèmes de transport des solutés sous pression194
B.3 ACTION DES HAUTES PRESSIONS SUR LA PRESSION OSMOTIQUE ET CONSEQUENCES POUR LES
CELLULES DE LEVURE 198
B.3.1 Variation de la pression osmotique en fonction de la pression hydrostatique 198
B.3.2 Relation entre variation osmotique et variation du volume cellulaire 200
B.3.3 Conséquence sur la viabilité cellulaire 201
B.4 EFFET SUR LES TRANSFERTS DE MASSE DES CELLULES SANGUINES 202
B.4.1 Flux de solutés 202
B.4.2 Perméabilisation 202
B.4.3 Variation de la pression osmotique 204
CONCLUSION 206

BIBLIOGRAPHIE 210

ANNEXES
Table des symboles
SYMBOLES PRINCIPAUX
a coefficient d’activité
b volume non osmotique (m3)
c concentration (mole/ m3)
n nombre de moles
t temps (s)
x fraction molaire

A surface d’échange membranaire (m2)


B module de compression (Pa)
CP coefficient calorifique molaire à pression constante (J.mol-1)
E énergie totale (J)
F énergie libre ou de HELMOLTZ (J)
G énergie de GIBBS ou enthalpie libre (J)
H enthalpie (J)
J flux (mol.s-1.m-2)
K constante d’équilibre chimique
P pression (Pa)
Q chaleur (J)
R constante des gaz parfaits (J.mol-1.K-1)
S entropie (J.K-1) ou (J. K-1.mol-1)
T température (K)
U énergie interne (J) ou (J.mol-1)
V volume molaire (m3.mol-1)
W travail (J) ou (J.mol-1)

 coefficient d’extension thermique (K-1)


S coefficient de compressibilité adiabatique (Pa-1)
T coefficient de compressibilité isotherme (Pa-1)
 module d’élasticité (Pa)
 coefficient d’activité
 compressibilité absolue (m3.Pa-1)
 potentiel chimique (J.mol-1)
 nombre de charges par molécule
 pression osmotique (Pa)
 densité du fluide
 coefficient de réfection
 potentiel électrique (V)

 coefficient osmotique pratique

INDICES ET EXPOSANTS
i espèce chimique dont la concentration varie
j espèce chimique dont la concentration reste constante
o état standard
s espèce chimique diffusant au travers de la membrane
w eau

SI soluté intracellulaire
SE soluté extracellulaire

. dérivée par rapport au temps


 grandeur molaire partielle
 état transitoire
° relatif à l'état standard

ABREVIATIONS
ADN acide désoxyribonucléique
ATP adénosine tri-phosphate
CIP presse isostatique froide (température ambiante)
CSP protéines induites par un choc thermique négatif
DAC cellule à enclumes de diamant
FTIR spectroscopie infrarouge utilisant la transformation de Fourier
HIP Presse isostatique haute température (température supérieure à 100 °C)
HSP Protéines induites par un choc thermique positif
IR rayonnement infrarouge
LC liquide cristallin
LGPAB laboratoire de génie des procédés alimentaires et biotechnologiques
LIMHP laboratoire d'ingénierie des matériaux et des hautes pressions
Unité CNRS, Université Paris XIII
RMN résonance magnétique nucléaire
SEM microscope électronique à balayage
TEM microscope électronique à transmission
UFC unité formant colonie
UV ultraviolet
WIP presse isostatique chauffée (Warm Isostatic Press)
INTRODUCTION
L'intérêt des hautes pressions pour la biologie et les sciences alimentaires a débuté à la
fin du siècle dernier conjointement à l'essor des techniques hyperbares et à la
découverte de microorganismes au fond des fosses océaniques.
En 1882, la découverte, par l'expédition Talisman, d'organismes vivants à des
profondeurs de 6000 m a amorcé ce qui allait devenir la barobiologie. Quelques
années plus tard, ont été consignées en France les premières observations concernant
l'effet de pressions élevées sur l'action des microorganismes. CERTES (1884), puis
REGNARD (1891) ont publié des articles dans les comptes rendus de l'Académie des
Sciences et de la Société de Biologie de Paris (JOHNSON et EYRING 1970).
En 1899, aux États-Unis, HITE fut le premier auteur à montrer l'intérêt des hautes
pressions pour augmenter la durée de conservation d'aliments, particulièrement du lait
et des jus de fruits (HITE 1899). Il fit construire pour ces expériences des presses
capables de dépasser des pressions de 400 MPa. Il montra non seulement qu'il était
possible de préserver des produits alimentaires pendant plusieurs semaines grâce à
l'application de hautes pressions, mais aussi que cette préservation dépendait du
triplet : niveau de pression, temps d'application et température. De plus, la putréfaction
des aliments pressurisés faisait apparaître une faune microbienne inhabituelle.
Malgré les résultats encourageants obtenus par HITE, cette direction fut délaissée par
les chercheurs.
Jusqu'à 1950, ce domaine a cependant connu un large développement scientifique sans
retombées industrielles immédiates au niveau alimentaire. Les travaux s'orientèrent
plutôt vers la destruction de tous les germes en vue d'une stérilisation de produits
médicaux. En 1918, LARSON montra qu'une pression de 1200 MPa était insuffisante
pour inactiver la totalité des spores de Bacillus subtilis (LARSON et al. 1918). A partir
de 1932, les travaux des chercheurs français BASSET et MACHEBOEUF ont permis de
recenser les pressions d'inactivation de nombreux microorganismes et toxines jusqu'à
1780 MPa (BASSET et MACHEBOEUF 1932). D'autres travaux se sont intéressés à
l'évolution des molécules biologiques sous pression et en 1914, BRIDGMAN montre que
le blanc d'oeuf coagule sous pression (BRIDGMAN 1914).

INTRODUCTION 1
Dans les années 1950, les études se sont recentrées sur la physiologie et le
métabolisme des microorganismes marins ou non à des pressions modérément élevées
(< 200 MPa) (OPPENHEIMER et ZOBELL 1952). A la même époque se développent les
premières études sur la biochimie des protéines et enzymes sous pression (LAIDLER
1950).
Néanmoins, l'utilisation des hautes pressions pour la "pasteurisation" de produits
alimentaires est rare. En 1965, TIMSON et SHORT ont appliqué des hautes pressions
(jusqu'à 1 GPa) sur du lait, identifiant les microorganismes survivants (TIMSON et
SHORT 1965). Cette étude inclut des traitements avec passage dans les différentes
phases solides de l'eau. La baroprotection conférée par des additifs est aussi explorée.
Dans le même temps, des expériences ont été poursuivies sur le comportement des
spores bactériennes sous pression (GOULD et SALE 1972).
Toutefois, depuis une dizaine d'années, le développement des techniques, l'attraction
des marchés agroalimentaire et médical ont dynamisé, par l'intermédiaire du Japon, un
domaine resté jusqu'alors confidentiel.
Sous l'impulsion du Professeur HAYASHI, une collaboration entre l'industrie et la
recherche a permis, au Japon, de produire un travail scientifique considérable et varié,
mais aussi de commercialiser un certain nombre de produits (jus de fruits, compotes,
desserts) sur le marché japonais.
L'application d'une haute pression hydrostatique est notamment capable d'inactiver les
microorganismes. Cependant, comme pour la destruction par effet thermique, les
mécanismes cellulaires impliqués sont encore mal connus. La facilité de mise en
oeuvre des traitements thermiques et le développement de procédés de stérilisation
rapide (UHT, "flash pasteurisation") ont rendu inutile l'identification des cibles
cellulaires de la chaleur pour une optimisation de traitement. Par contre, le coût et la
difficulté technique liés au matériel haute pression freinent le développement
d'applications industrielles, car la résistance de certaines souches microbiennes et
particulièrement des spores implique des niveaux de pression élevés (> 800 MPa) ou
des temps de traitement très longs. La compréhension des phénomènes liés à
l'inactivation des microorganismes et particulièrement les cas d'extrême barorésistance
(milieux concentrés ou déshydratés, formes microbiennes sporulées) devrait en
permettre d'envisager une optimisation du procédé par une réduction des temps de
traitement ou des niveaux de pression.

2 INTRODUCTION
Afin de mettre en évidence et de comprendre les modifications des microorganismes
engendrées par les hautes pressions, de nombreuses expérimentations ont été mises en
oeuvre. Cependant, le nombre de méthodes d'investigation in situ sous pression étant
réduit, les observations sont généralement faites après retour à pression
atmosphérique.
Dans ce cas, la seule variable prise en compte est la viabilité cellulaire. Les conditions
de milieu ou de traitement permettent de mesurer la sensibilité des microorganismes et
les modalités de leur destruction.
L'importance de différents paramètres a ainsi été mise en évidence : temps de séjour
sous pression, température, activité de l'eau du milieu, … Cependant, la description de
la cinétique de l'inactivation microbienne pour chaque paramètre exige un grand
nombre d'expérimentations. De plus, l'importance des phases transitoires d'élévation
de la pression et de détente sont rarement prises en compte.
D'autres investigations ont lieu en continu, mais uniquement sur une activité
enzymatique cellulaire spécifique.
La plupart de ces expériences sont en outre réalisées in vitro sur des systèmes modèles
(enzymes, liposomes). Les résultats obtenus apportent des informations importantes
sur la résistance des systèmes enzymatiques et sur les modifications structurales des
biomolécules. Cependant, leur transposition aux systèmes cellulaires reste difficile, la
cellule constituant un milieu complexe avec de nombreuses interactions entre chaque
composant. Certains microorganismes sont capables de survivre à des niveaux de
pression où la plupart de leurs protéines sont dénaturées in vitro.
Il n'existe pas à ces niveaux (> 200 MPa) d'approche directe et globale de l'évolution
cellulaire au cours du traitement. L'observation microscopique couplée à un système
d'analyse d'images est utilisée depuis longtemps par le laboratoire de Génie des
Procédés Alimentaires et Biotechnologiques de l'ENSBANA de Dijon. Elle permet,
par le suivi du volume cellulaire, une description de la réaction thermodynamique et
physiologique des cellules soumises à différents stress physico-chimiques : chocs
osmotiques, température, pH. Ces études ont permis de mettre en évidence
l'importance des variations de volume sur la viabilité cellulaire, notamment l'influence
de la cinétique d'application de ces stress.
Pour mettre en oeuvre des techniques similaires avec la pression hydrostatique, une
cellule permettant la visualisation sous haute pression a été développée en

INTRODUCTION 3
collaboration avec le laboratoire d'Ingénierie des Matériaux et des Hautes Pressions,
unité CNRS, Université Paris XIII.
L'observation de levures avec cette cellule a demandé une mise au point difficile.
L'objectif de cette thèse est de montrer la faisabilité technique et l'intérêt d'une
approche microscopique dans la compréhension des mécanismes cellulaires induits par
hautes pressions.
L'étude bibliographique des aspects thermodynamiques et biologiques des hautes
pressions permet de faire le point sur les connaissances actuelles dans ces domaines et
fournit des bases pour l'interprétation des phénomènes morphologiques observés.
Dans un premier temps, sont détaillées les mises au point de la cellule de visualisation
et du système de mesure du volume qui y est rattaché. Un étalonnage de la mesure
ainsi obtenue sera réalisé.
Dans un second temps, l'observation microscopique de cellules de levures, de cellules
sanguines humaines et de liposomes sous pression est effectuée. Les conditions de
traitement sont déterminées préalablement par des analyses de la viabilité finale de
cellules de levures.
La cellule vivante étant un système ouvert, la variation du volume cellulaire peut être
reliée à la compression du contenu intracellulaire et/ou aux transferts de masse.
L'analyse de ces variations permet d'approcher les perturbations hydrostatiques
responsables des transferts et de différencier les types de cellules selon leur
comportement morphologique. Ce travail doit contribuer à une meilleure
compréhension des mécanismes d'inactivation par haute pression et permettre
d'envisager une optimisation des procédés de pasteurisation UHP (Ultra Haute
Pression).
Ce travail a fait l'objet de deux publications (PERRIER-CORNET et al. 1995a; PERRIER-
CORNET et al. 1995b), une troisième, concernant les liposomes est en préparation.

4 INTRODUCTION
Note : Dans la langue française compression signifie "action et résultat de l'application
d'une force pressante". L'utilisation de ce terme conduit à de nombreuses ambiguïtés.
Nous avons donc distingué trois emplois différents et défini une expression pour
chacun d'eux :

 l'action de la force pressante sera notée élévation de pression ou pressurisation si


l'intensité de la force croît et diminution de pression, dépressurisation ou détente
dans le cas contraire,

 la variation de volume résultant de l'élévation de pression dans un système fermé,


c'est-à-dire sa compaction intra et intermoléculaire sera notée compression à
l'inverse de la décompression. Elle dépend de la compressibilité du système,

 la variation de volume résultant de l'élévation de pression d'un système ouvert sera


notée contraction ou expansion suivant le signe de la variation. Elle inclut la
variation de volume due à la compression et d'éventuels transferts de masse.

INTRODUCTION 5
6 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

La thermodynamique physique et chimique sous pression est le premier élément à


prendre en compte dans une étude de l'action de la pression au niveau moléculaire. En
effet, elle permet d'établir les lois fondamentales de l'action de la pression sur la
matière.
A partir de la description thermodynamique de ces phénomènes, les modifications
particulières obtenues sur les biomolécules par augmentation de pression seront
ensuite décrites.
L'action des hautes pressions sur les microorganismes sera abordée dans une troisième
partie. Les modifications physiologiques intervenant à une pression modérée et les
conditions d'inactivation à plus haute pression seront successivement envisagées. Les
implications de ces deux parties au niveau des applications industrielles alimentaires
seront brièvement évoquées.
Dans une dernière partie sera enfin présenté le matériel expérimental et industriel
permettant de générer de hautes pressions hydrostatiques et d'effectuer des mesures en
ligne dans ces conditions.

A Approche thermodynamique des hautes


pressions
Cette partie consacrée à la thermodynamique des hautes pressions va permettre dans
un premier temps de définir la pression et son action sur la matière. Puis le
comportement particulier de l'eau sous pression sera présenté dans un second chapitre.
L'évolution sous pression des différentes fonctions thermodynamiques et
thermochimiques sera recensée et formalisée dans un dernier chapitre.

A.1 Définition de la pression


La pression hydrostatique, variable de base de la thermodynamique, a cependant
tendance à être négligée dans l'étude expérimentale des propriétés des corps
condensés. Ce relatif désintérêt tient autant à la faiblesse relative des variations de
pression à la surface de la terre, qu’à la difficulté de générer et d’effectuer des mesures
à très forte pression. La plupart des scientifiques préfèrent se concentrer sur d’autres
APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 7
paramètres plus conventionnels, comme la composition, la température, le potentiel
électrique,  D’autres, par contre s'intéressant à la formation des roches, aux
profondeurs océaniques ou encore aux conditions extraterrestres, sont amenés à
considérer la pression comme une variable déterminante.

A.1.1 Pression statique dans un fluide


Nous nous proposons de définir la pression dans un milieu fluide et plus
particulièrement dans un liquide à l'équilibre. Par définition, un fluide est un corps
continu, sans rigidité, pouvant s'écouler, s'opposant ainsi au solide.

Considérons une force F perpendiculaire à la surface S (on parle de force pressante)
et uniformément répartie sur celle-ci, la pression est définie par :
F
P (1)
S
où P est la pression (en Pa),
F, la norme de la force pressante (en N),
S, la surface d'application (en m2).

Si la force n'est pas uniformément répartie, une surface élémentaire dS peut être
  
définie, sur laquelle agit  F tel que   F  F . L'expression de la pression sera
S

alors :
F
P (2)
dS

Cette pression est exprimée dans le système international en pascal (Pa), avec
1 Pa = 1 N.m-2. De nombreuses autres unités de pression ont été et sont encore
utilisées, quelques unes ainsi que leur facteur de conversion ont été repris dans le
Tableau 1. Cependant pour des raisons de cohérence, nous utiliserons uniquement le
pascal ou plutôt ses multiples, le mégapascal (MPa) avec 1 MPa = 106 Pa et le
gigapascal (GPa) avec 1 GPa = 103 MPa = 109 Pa.

8 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


Tableau 1 : Unités de pression et facteurs de conversion.

Unité Abréviation Conversion en MPa


Atmosphère atm 0,1013
Bar bar 0,1000
-2
Livre par pouce carré psi ou lbf.in 6,897 10-3
Kiloforce par centimètre carré kgf.cm-2 0,1019
Tonne-force par pouce carré tonf.in-2 194,4400
Dynes par centimètre carré dynes.cm-2 10-5
Millimètre de mercure mm Hg 1,34 10-4
Torr torr 1,34 10-4

A.1.1.1 Pression à l'intérieur d'un fluide


Considérant un point M à l'intérieur du fluide, la pression PM est définie comme la
résultante des forces de contact sur la surface élémentaire dS centrée en M. Il est
démontré que cette pression est la même, quelle que soit l'orientation de l'élément de
surface considéré en M (BONNET 1993) : le champ de pression est dit isotrope. Cette
notion n'est pas applicable aux solides pour lesquels les forces ne sont pas
nécessairement normales à la surface.

M
dz
dx
dy y

Considérons un élément de volume parallélépipèdique dV, de dimension dx, dy, dz



 dF
placé au point M(x, y, z). Soit,   la densité volumique en M des forces
dV
   
extérieures (en N.m-3) et i , j , k les vecteurs unitaires du repère,  est alors définie
par:
APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRESSIONS 9
  P P  P 
  grad P  i  j k (3)
x y z

Cette relation différentielle constitue l'équation fondamentale de la statique des fluides


(BONNET 1993).
Dans le cas d'un fluide peu compressible comme l'eau, soumis uniquement au champ
de pesanteur terrestre, l'application de la relation précédente ( 3 ) conduit à la définition
de la densité de pression créée par le champ de pesanteur :
 
grad P   g  P   gh (4)

où g est l'accélération de la pesanteur terrestre (g 9,81 m.s-2),


 la densité du fluide (sans unité),
h, la hauteur de fluide considérée (en m).

Cette équation donne une augmentation de pression de 0,98 MPa pour une hauteur
d'eau d'environ 100 m.

Remarquons que la force exercée sur la surface dS n'est perpendiculaire à cette surface
que si le fluide est parfait. Dans le cas de fluide réel, peuvent s'ajouter des contraintes
de cisaillement dues à la viscosité du fluide. Cependant, à l'équilibre, ces contraintes
s'annulent en l'absence de mouvement et permettent de ne considérer que des forces
pressantes.

A.1.1.2 Pression sur les parois


La même pression s'applique sur les parois à une interface solide-liquide. Par contre, à
une interface liquide-gaz s'applique une force appelée tension superficielle qui résulte
de l'interaction attractive des molécules de l'interface du liquide. Cette force empêche
le liquide d'occuper tout l'espace comme le fait un gaz (BONNET 1993). Dans ce
travail, ces phénomènes seront généralement négligés.

10 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


A.1.1.3 Interprétation moléculaire
Au niveau moléculaire, cette pression peut être interprétée comme la somme de deux
pressions : une pression cinétique (PC) due aux chocs et une pression moléculaire (PM)
(BONNET 1993).
 PC représente le transfert de quantité de mouvement due aux chocs à travers
l'élément dS considéré. Dans tous les cas, PC est positif.
 PM représente les interactions du type électrostatique en général attractives
(PM<0) mais de très faible amplitude (PPC>0).
Dans des états très condensés, PM peut être supérieur à PC, la pression est alors
négative. Le fluide n'a plus besoin de récipient pour le contenir, il est autoconfiné. Ce
cas se rencontre très rarement : plasma, fluide à basse température, fluide
métastable

A.1.2 Action de la pression sur la matière


Les effets de la pression sur la matière suivent le principe de Le CHATELIER-BRAUN
énoncé ainsi : «Si une chose peut diminuer de volume, elle se contractera si on la
comprime» (HEREMANS 1995). Cette réduction peut être obtenue soit par une réaction
chimique, soit par un rapprochement des molécules ou encore par une contraction
intramoléculaire.
L’augmentation de la pression entraîne un rapprochement des molécules, ce qui
augmente leur degré d’interaction et diminue leur mouvement, modifiant ainsi les
propriétés macroscopiques de la matière.

Le volume (ou densité) est la variable conjuguée de la pression. Cette relation apparaît
dans les différentes équations d’état, dont la plus simple est celle des gaz parfaits :
( PV ) T  RT (5)

où V est le volume molaire (en m3.mol-1),


T, la température (en °K),
R, la constante des gaz parfaits (R=8.314 J.K-1.mol-1).

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 11


Pour des gaz réels, l'équation précédente n'est plus applicable ; le développement
limité du facteur de compressibilité Z pour de faibles pressions ou des volumes élevés
fournit les équations du viriel (ABBOTT et VAN NESS 1992) :
PV B C
Z  1  B ' P  C ' P ...  1   2 ... (6)
nRT V V
où B’, C’,... et B, C,... sont les coefficients du viriel ; pour des gaz peu denses, ils
peuvent être reliés aux interactions entre molécules.

Cette équation d'état est la seule pour laquelle des règles de mélange sont
rigoureusement définies. Du fait de la difficulté à estimer les coefficients du viriel, des
équations empiriques ont été développées dont le prototype est l'équation de VAN DER
WAALS (ABBOTT et VAN NESS 1992) :
PV V a
  (7)
nRT V  b RTV
où a et b sont des coefficients positifs, b est appelé covolume et le terme a/V² est
défini comme la pression de cohésion.

Pour les liquides, des équations empiriques plus complexes ont été définies, dont la
plus connue et la plus utilisée est celle proposée par Tait (TAIT 1888) :

V  B P
 C.ln  (8)
V0  B  P0 
où C et B sont des constantes positives,
V=V-V0 est la différence de volume due à la variation de pression de P0 à P.

Ces équations contiennent un nombre restreint de paramètres ajustables. HAYWARD


propose un développement limité du module de compressibilité en fonction de la
pression (HAYWARD 1967) :
PV0
 a  bP  cP 2 (9)
V
où a, b, c sont des constantes.

Ces équations empiriques ne sont satisfaisantes que sur une plage limitée de pressions.
En effet, dans le cas d'une pression suffisamment élevée, le volume calculé à partir de
ces équations est négatif.

12 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


En fait, comme le fait remarquer BRIDGMAN, la compressibilité des liquides est
inversement proportionnelle à la pression (BRIDGMAN 1946). On obtient donc une
représentation quasi linéaire entre les logarithmes du volume et de la pression.
Les solides sont moins compressibles que les liquides (compressibilité de 10 à 100
fois inférieure) car en phase solide, les atomes sont déjà très proches les uns des
autres, leurs orbitales électroniques sont très résistantes et se repoussent entre elles
(BRIDGMAN 1946).
L’augmentation de pression transforme un corps de ses états les plus diffus aux états
les plus denses, généralement de l’état gaz à l’état liquide, puis à l’état solide. La
température de fusion suit la relation :

dTC  VC
 TC ( 10 )
dP H C
où TC représente la température de changement d’état (en °K),
 HC et VC sont respectivement les variations d'enthalpie (en J.mol-1) et de
volume (m3.mol-1) relatives au changement d’état considéré.

Lors d’une fusion par exemple, HF et VF sont généralement positifs et une élévation
de pression entraîne une augmentation de température. Pour des composés organiques,
la variation de température est d'environ 15°C pour 100 MPa (HEREMANS 1995).
L’eau fait exception, car sa phase solide à pression atmosphérique (glace ordinaire) est
moins dense que celle liquide dans les mêmes conditions et la variation du volume
(VF) est alors négative. Cette propriété s’explique en partie par la structure de l’eau
(cf. § A.2 p.14). Les autres changements d’état, telles les transformations
polymorphiques des lipides ou la gélification, seront développés pour chaque classe de
composé impliqué (cf. § B.2.3B.2.3 p.49).

La diminution de volume entraîne une modification continue de toutes les propriétés


macroscopiques du milieu. Ces variations dépendent de la corrélation entre ces
propriétés et trois effets majeurs de la pression sur la matière : la densité, la mobilité
moléculaire et le degré de volume libre des molécules. Par exemple, la constante
diélectrique d’un corps, qui dépend essentiellement du nombre de molécules
polarisables par unité de volume, sera généralement augmentée par la pression. Par
contre, la diffusion ionique ou la viscosité qui dépendent de la mobilité moléculaire
seront réduites par une élévation de pression (HILLS 1972). Cependant, ces prévisions
générales souffrent de nombreuses exceptions dues aux interactions régissant la
APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 13
structure du liquide. L’eau, milieu biologique par excellence, en fait partie. Compte
tenu de son importance en biologie, l’étude des variations de ses propriétés sous
pression ainsi que leurs possibles implications biologiques, ont paru indispensables.

A.2 Action de la pression sur l’eau


L'eau doit ses propriétés physiques exceptionnelles à la liaison hydrogène qui s'établit
entre molécules voisines. Dans une molécule d'eau, la liaison covalente O-H résulte de
la mise en commun d'un électron de chaque atome, mais la répartition électrique
résultante n'est pas homogène : les atomes sont partiellement ionisés. De plus, les trois
atomes ne sont pas alignés (cf. Figure 1).
Cette structure simple confère à la molécule un moment dipolaire important
(1,87 debye) et une capacité à former des liaisons hydrogène.

Figure 1 : Structure électronique de la molécule d'eau.

14 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


A.2.1 Diagramme de phase de l'eau
La Figure 2 présente le diagramme de phase de l'eau dans une large gamme de
températures et de pressions. Il faut noter le nombre important de glaces
polymorphiques stables existantes ; il existerait même, théoriquement, une glace X à
des pressions proches de 100 GPa (PRUZAN 1994). L'eau liquide peut coexister avec
cinq types de glace : Ih, III, V, VI, VII. Certaines restent métastables en dehors de leur
domaine de pression-température défini sur le diagramme de phase, on obtient alors
des zones où plusieurs types de glaces sont présentes simultanément (représentées en
pointillés sur la Figure 2). Conformément à la loi de LE CHATELIER, la densité des
phases croît en suivant une voie isotherme (I<Liquide<III<II<V<VI<VIIIVII). De ce
fait et suivant l'équation ( 10 ), la température de fusion de la glace ordinaire (Ih)
diminue quand la pression augmente. Cette propriété particulière de l'eau pourrait être
utilisée pour décongeler plus rapidement les aliments (DEUCHI et HAYASHI 1992) ou
pour conserver à -18°C des aliments sans risque de cristallisation.

Figure 2 : Diagramme de phase de l'eau jusqu'à 3 GPa (DROST-HANSEN 1972).

500
20 GPa, 440 °C
400 VII

300 Liquide P>100 GPa, Glace X ?

200
Température (°C)

III
100 VI

Ih V
0
60 GPa, -120 °C
-100 II
VIII
0 500 1000 1500 2000 2500
-200
IX
-300

Pression (MPa)

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 15


Figure 3 : Évolution de la dilatation thermique en fonction de la pression (BRIDGMAN 1912).

14

12 80 C

60 C
10
Dilatation thermique (dV/dT)

40 C
8
(mm3.mol-1..K-1)

6 20 C

0C
2

-2
0 200 400 600 800 1000 1200
Pression (MPa)

Figure 4 : Évolution de la viscosité de l'eau en fonction de la pression (FRANKS 1983).


2,2

1,8
2,2 C
1,6
10 C
1,4
20 C
1,2
Viscosité (mPa.s)

30 C
1
50 C
0,8

0,6

0,4 100 C

0,2

0
0 200 400 600 800 1000 1200
Pression (MPa)

16 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


A température ambiante (25°C), une augmentation de la pression ne conduira à la
formation de glace, en l'occurrence de la forme VI, qu'à partir de 884 MPa, ce qui est
élevé pour un liquide. Il semblerait cependant que, même dans son état liquide, des
modifications structurales puissent se produire, intervenant dans les propriétés
particulières de l'eau.

A.2.2 Quelques propriétés singulières de l'eau


Lorsque la pression augmente, certaines propriétés de l'eau ont des évolutions
différentes de celles de la plupart des liquides.
Cinq d'entre elles évoluent à l'inverse des autres liquides :

 sa densité (r) diminue entre 0°C et 4°C,


 sa compressibilité (T) diminue également entre 0°C et 50°C,
 son coefficient de dilatation thermique (a) augmente à température ambiante, en
fonction de la pression (cf. Figure 3),
 sa viscosité () diminue lorsque la pression augmente jusqu'à 150 MPa, pour une
température inférieure à 20°C (cf. Figure 4),
 sa capacité calorifique diminue en fonction de la température entre 0°C et 40°C,
pour des pressions inférieures à 20 MPa.
Il est intéressant de remarquer que toutes ces "anomalies" se produisent dans un
cadran pression-température (0-400 MPa, 0-50°C) largement inclus dans celui exploré
pour les applications biologiques des hautes pressions. Vu l'importance cruciale de
l'eau dans les phénomènes biologiques, il est essentiel de tenir compte de ces
propriétés physico-chimiques sous pression.

A.2.3 Interprétation de ces phénomènes


Deux grands types de modèles ont été développés pour expliquer les propriétés de
l'eau liquide : les modèles continus et ceux de mélange. Un grand nombre de
physiciens ont essayé avec difficulté d'interpréter les propriétés de l'eau en suivant la
théorie cinétique générale des liquides. Cependant, bien que l'eau n'ait pas d'éléments
structurés stables détectables par spectroscopie, des modèles de mélanges reposant sur
la présence de plusieurs structures apportent une interprétation séduisante des
propriétés anormales de l'eau. Ces modèles supposent l'existence pour un temps très
bref (10-11 à 10-12 s) de structures géométriques identifiables, appelées 'clusters' ou
'clathrates'. La structure de ces entités est souvent assimilée à celle de la glace Ih, voire
à d'autres glaces polymorphes lorsque la pression augmente (DROST-HANSEN 1972).

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 17


Elles seraient en perpétuel échange avec de l'eau liquide non structurée. Cette
hypothèse permet une modélisation de l'évolution des propriétés de l'eau sous pression
(KAUZMANN 1975). Des expériences récentes de diffraction X de l'eau sous pression
montrent une fluctuation de la répartition spatiale des molécules d'eau (OKHULKOV et
al. 1994). L'ajustement de cette fonction avec un modèle structural est en accord avec
le diagramme de phase de l'eau. Cet article montre l'intérêt de l'eau dans la
compréhension de la nature de l'état liquide mais aussi que ce problème reste un
problème d'actualité.

A.3 Thermodynamique chimique sous haute pression


Les modifications ou transformations causées par la pression au niveau
macromoléculaire peuvent être décrites par la thermodynamique. Dans ce chapitre,
nous nous intéresserons tout d'abord, aux variations des fonctions d'état, puis aux
déplacements des équilibres chimiques et enfin aux modifications des interactions
moléculaires induites par l'élévation de pression.

A.3.1 Bases et formulation mathématique de la thermodynamique

A.3.1.1 Principes et définitions


La thermodynamique repose sur deux grands principes introduisant chacun une
fonction thermodynamique fondamentale.
La première loi définit une fonction d'état U, appelée énergie interne, dont la variation
dans un système fermé n'échangeant avec l'extérieur que du travail de pression (W) et
de la chaleur (Q) est définie ainsi :
U  W  Q ( 11 )

où U, W, Q sont exprimés en joules.

Le second principe définit une fonction d'état S, appelée entropie, dont la variation
dans un système fermé lors d'une transformation réversible est définie ainsi :
Qrev ( 12 )
S 
T
où T est la température du système (en K),
Qrev, la chaleur échangée au cours de la transformation réversible (en J).

18 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


A.3.1.2 Variations des fonctions d'état
Dans ce paragraphe, sont calculées les expressions mathématiques des variations des
fonctions d'état. La dérivation partielle d'une fonction d'état par rapport à une variable
du système implique que toutes les autres variables soient maintenues constantes,
notamment la composition du milieu.
Pour des systèmes ouverts, on définit le potentiel chimique d'un composant i (i), tel
que la variation d'énergie chimique (dECH) du système due à un flux de matière et/ou à
une modification de la composition chimique (dni) soit :
dE CH    i . dni ( 13 )
i

A partir de ( 11 ), ( 12 ) et ( 13 ), en utilisant des transformations de LEGENDRE, on


introduit aussi les différentes fonctions d'état (cf. Tableau 2) et leurs variations dans
un système ouvert.

Tableau 2 : Définitions et variations des fonctions d'état.


Fonction d'état Définition Différentielle totale Variables naturelles
Énergie interne (U) U = W + Q + ECH dU=TdS-PdV+idni S, V, ni
Enthalpie (H) H = U + PV dH=TdS+VdP+idni S, P, ni
Énergie libre (F) F = U - TS dF=-SdT-PdV+idni T, V, ni
(Énergie de HELMOLTZ)
Enthalpie libre (G) G = U + PV - TS dG=-SdT+VdP+idni T, P, ni
(Énergie de GIBBS)

Par définition des fonctions d'état, ces relations restent vraies au cours d'une
transformation irréversible.
De même, on peut exprimer les variations de V en fonction de P, T, ni :
 V   V   V 
dV    dT    dP     dni ( 14 )
  T  P , ni   P  T , ni i   ni  T , P

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRESSIONS 19


Ces dérivées partielles qui constituent les coefficients de cette équation sont
directement liées à deux propriétés thermodynamiques caractéristiques des corps
purs :
 le coefficient de dilatation thermique isobare  (en K-1) :

1  V 
   ( 15 )
V  T P

 le coefficient de compressibilité isotherme  (en Pa-1) :

1  V 
T    ( 16 )
V   PT
En substituant ces coefficients dans l'équation ( 14 ), on obtient :
dV V
  dT   T dP   i dni ( 17 )
V i V

où Vi est le volume partiel du composant i.

A.3.1.3 Compression hydrostatique


L'augmentation de la pression sur le volume d'un liquide résulte d'un travail
volumique (W=-PdV), fourni en général par un piston. Ce travail est d'autant plus
grand que le liquide est plus compressible (W=PVdP). Sous l'action de la
diminution de volume, le liquide s'échauffe ; l'échauffement maximum est donné par
l'augmentation de la température lors d'une élévation de pression adiabatique et décrit
par l'équation de CLAUSIUS-CLAPEYRON (HEREMANS 1995) :
 T T  V  T
       Cp ( 18 )
  P  S Cp   T  P P

Selon cette équation, l'échauffement moyen de l'eau est de 2°C pour 100 MPa à 25°C,
alors qu'à 0°C, il n'y a pratiquement pas d'augmentation de température, tout au moins
pour une variation de 100 MPa (cf. Figure 5). La réaction inverse se produit lors de la
détente.

20 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


Figure 5 : Augmentation de la température de l'eau pour une élévation de pression
adiabatique en fonction de la température initiale (MAKITA 1992).

40
Variation de température (°C) 80°C
60°C
30
40°C
20°C
20

10°C
10

0
0 200 400 600 800
Pression (MPa)

Des conditions opératoires isothermes impliquent donc un refroidissement constant


par l'extérieur. Du fait de l'absence d'agitation dans la plupart des enceintes haute
pression et de la mauvaise conductivité thermique de l'eau, les conditions isothermes
ne sont approchées que pour des vitesses d'élévation de pression faibles (moins de
0,1 MPa.s-1 (MAKITA 1992)).

L'addition du travail de la pression et de la chaleur dégagée donne la variation


d'énergie interne (cf. Équation ( 11 )). Cette variation est légèrement négative pour une
élévation de pression adiabatique, soit environ -90 J.mol-1 pour 100 MPa à 20°C
(BRIDGMAN 1946).

A.3.1.4 Potentiel chimique et activité

A.3.1.4.1 Cas général


L'énergie de GIBBS est la forme d'énergie la plus couramment utilisée, notamment en
chimie, car elle utilise les variables courantes P et T. On peut donc définir le potentiel
chimique en utilisant la forme différentielle de G :
  G
i    Gi ( 19 )
  ni  T , P , n J

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 21


On a donc :
 i
d i  Vi dP  Si dT    dni ( 20 )
  ni  T , P , n j

où Vi et Si sont respectivement le volume et l'entropie partiels du composant i.

A partir du potentiel chimique pour une phase condensée, d'autres paramètres peuvent
être définis :
 l'activité du composant i (ai) :
o o P 0
0

 i (T , P, xi )   i (T , P)  RT .ln ai (T , P)   i (T , P)   V i dP  RT .ln ai (T , P) ( 21 )
o
P

où xi est la fraction molaire du composant i dans le système,


o
 i ( T , P ) est le potentiel dans les conditions standard (liquide pur pour un
solvant, dilution infinie pour un soluté) à P=P° et x=1.

 le coefficient d'activité (i) :


ai
i  et lim  i  1 ( 22 )
xi xi 1
Le composant est idéal lorsque son coefficient d'activité est égal à 1 et son activité
égale à sa fraction molaire. Dans le cas d'un soluté, l'idéalité est approchée par dilution
infinie.

A.3.1.4.2 Cas particulier de l'eau


- Activité de l'eau
L'importance de l'activité de l'eau et des solutés est fondamentale pour les réactions
biologiques et la survie des cellules (GERVAIS et al. 1992). En effet, le maintien d'un
équilibre osmotique de part et d'autre de la membrane cellulaire est indispensable aux
fonctions de la cellule.
L'augmentation du volume de l'eau est généralement considérée comme indépendante
de la pression ; cependant, pour la gamme de pression utilisée, cette influence ne peut
plus être négligée.
Les équations ( 20 ), ( 21 ) et ( 22 ) permettent d'exprimer la dépendance de l'activité en
fonction de la pression :

22 APPROCHE THERMODYNAMIQUE DES HAUTES PRESSIONS


   i    ln  i  0
   RT    Vi  V i ( 23 )
  P  T , ni   P  T , ni
0
où V i est le volume molaire partiel du composé dans l'état standard : composé pur
pour un solvant, dilution infinie pour un soluté.

Pour une solution idéale (=1), l'activité est donc indépendante de la pression. Cette
équation peut être intégrée si l'on connaît la loi d'évolution du volume partiel en
fonction de la pression. Plus simplement, la variation de volume partielle peut être
considérée en dépendance linéaire de la pression sur l'intervalle de pression,

c'est-à-dire que la compressibilité absolue  i    Vi 


 
est constante. L'expression
  P  T ,nj

du volume partiel devient :


Vi ( P )  Vi ( P0 )   i ( P  P0 ) ( 24 )

L'intégration de l'équation ( 23 ) conduit à une équation simplifiée (OWEN et BRINKLEY


1941) :
  ( P)  0
1 0
ln (i P0 )   (Vi  V i )( P  P0 )  ( i   i )( P  P0 ) 2 ( 25 )
 i  2
0
où Vi ,Vi sont les volumes molaires partiels à la pressions P0,
0
 i , i , les compressibilités absolues partielles de i à la pression P0.
Des expressions plus précises peuvent être obtenues en utilisant des équations
expérimentales comme celle de Tait (cf. Équation ( 8 )).

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 23


- Pression osmotique
Considérons l'équilibre entre une solution aqueuse (B) et de l'eau pure (A) séparées
par une membrane semi-perméable; la différence de potentiel chimique de l'eau (
 wB   wA  1 ) induit un passage d'eau dans le sens décroissant (AB). Ce flux peut
être arrêté par application d'une pression hydrostatique sur le compartiment B. Cette
pression est appelée pression osmotique () et s'exprime en Pa.

A l'équilibre, les potentiels sont égaux de part et d'autre de la membrane :


0 ( 26 )
 wB (T , P   , x B )   wA (T , P,1)   w (T , P)

Si est suffisamment faible, la variation de potentiel chimique peut être considérée


comme élémentaire (dP = ), alors en utilisant ( 20 ) :
  wB ( T , x B )
 wB ( T , P   , x B )   wB ( T , P , x B )    Vw B  ( 27 )
P

l'expression de la pression osmotique se déduit de ( 26 ) et ( 27 ) :


0
 wB (T , P, x B )   w (T , P) RT
  B
 ln a wB ( 28 )
V
w VwB

Plus généralement, l'équilibre entre deux solutions aqueuses d'activités différentes en


relation avec une membrane semi-perméable nécessite l'application d'une pression qui
est en fait la différence des pressions osmotiques (=B-A). Afin de simplifier
l'équation, le volume partiel de l'eau en A et en B peut être considéré peu différent du
volume molaire de l'eau ( VwB  VwA  Vw ) :

 wB   wA RT  a wB 
    ln  ( 29 )
Vw Vw  a wA 

24 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


Expression de la pression osmotique en fonction de la pression hydrostatique
Considérons le déplacement de cet équilibre sous pression, la dérivation de l'équation
( 29 ) par rapport à la pression conduit à la relation suivante :
  a wB  
  ln A  
    RT   aw   a wB  1  Vw  ( 30 )
    ln A 
  P  T ,ni Vw   P  a w  Vw  P 
 
 

D'après ( 23 ) et ( 16 ), l'équation ( 30 ) peut s'exprimer par :


  B  
  ln wA  
    RT   w   a wB  w  VwA  VwB ( 31 )
     ln A   T     Tw 
  P  T ,ni Vw P  aw  Vw
 
 

où  Tw est le coefficient de compressibilité isotherme de l'eau,


VwA , le volume molaire partiel de l'eau dans la solution A.
Dans le cas d'une solution idéale, l'équation ( 31 ) peut être intégrée en négligeant la
dépendance de  Tw en fonction de la pression :
 P
 P0

 exp   Tw ( P  P0 )  ( 32 )

La différence de pression osmotique entre deux solutions dépend donc de la pression


hydrostatique; lorsque les solutions sont idéales, cette évolution dépend directement de
la compression de l'eau.

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 25


A.3.2 Réactions chimiques
A l'aide des variations des fonctions d'état définies précédemment et particulièrement
de l'énergie de GIBBS, la thermodynamique permet de décrire les modifications des
réactions chimiques engendrées par la pression. Ce chapitre traitera successivement de
l'équilibre d'une réaction chimique, puis de sa cinétique.

A.3.2.1 Équilibre
Considérant une réaction chimique de la forme :

 ( i    j X j
) Xi  ( 33 )
i j

où Xi, Xj représentent les différentes substances chimiques, respectivement


substrats et produits,
i, j, les coefficients stœchiométriques de la réaction : positifs pour les produits
(j) et négatifs pour les réactants (i).

Pour une réaction dans un système fermé, le degré d’avancement de la réaction (


dni
d  ), l’affinité chimique et la constante d’équilibre (K) sont définis à partir de G
i
(cf. Tableau 2) :
  G  
 RG =      i  i   RT ln  (ai )  i    RT ln K ( 34 )
    T ,P i  i 

L’équilibre thermodynamique est atteint lorsque G est minimum et sa dérivée donc


nulle. A température et à pression constantes, l'équilibre est atteint pour : RG=0 ou
K=1.
La variation de la constante d’équilibre K en fonction de la pression et de la
température peut être calculée à partir de l'équation ( 34 ) et des définitions du Tableau
2 selon les relations :

26 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


 Température (relation de PLANCK) :
  ln K    R G RH
     ( 35 )
  T  P , ni  T  RT  RT 2

 Pression (équation de VAN'T HOFF) :


  ln K  1  i 1   RV
 
  P  T , ni

RT
 i
T
 
RT i
 iVi 
RT
( 36 )
i

Cette dernière équation confirme le principe de LE CHATELIER ; la pression déplace


l’équilibre dans le sens d'une diminution globale du volume des réactants. L'évolution
d'une réaction est donc prévisible à partir du signe de sa variation de volume partiel.
La variation V négative favorise la formation de produits. Si V est positive, la
réaction est inversée.
L’intégration de cette réaction (MORILD 1981) fait intervenir la compressibilité des
composants :
K P   R V0 1
ln  ( P  P0 )   ( P  P0 ) 2 ( 37 )
K0 RT 2 RT
où est la variation des facteurs de compressibilité des composants de la
réaction.

Une variation simultanée de la pression et de la température conduit à un déplacement


de l'équilibre, donné par la relation suivante (HAWLEY 1978; KUNUGI 1993) :
KP
 G  G0    RT ln  V0  P  P0   S 0  T  T0   2  P  P0  T  T0  ( 38 )
K0
 C
 P  P0   P T  T0 
2 2

2 2T0
où , CP sont les variations respectives d'expansion thermique et de capacité
calorifique à pression constante entre les réactants et les produits de la réaction.

Cette équation permet notamment de décrire le comportement P-T de réactions comme


la dénaturation des protéines et représente pour un G donné une courbe elliptique
(cf. Figure 8).

Cas particulier de l'équilibre acide-base.


Ainsi, la pression agit sur l'équilibre de dissociation de molécules ionisables. S'il s'agit
d'acides faibles ou de bases faibles en solution aqueuse, le déplacement de l'équilibre

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 27


induit une modification d'une variable essentielle dans les équilibres biologiques : le
pH. En considérant un monoacide faible se dissociant dans l'eau suivant l'équilibre :
AH 
KA
 A  H  ( 39 )

où AH, A- sont les formes non dissociées et dissociées de l'acide faible.

La constante d'équilibre est définie, selon ( 34 ), par :

KA 
 A  H    H 
   2
( 40 )
 AH  c  H  AH

où KA est la constante de dissociation,


 I  , rigoureusement l'activité de I, mais si les solutés sont idéaux, on utilise
plutôt la concentration molaire du composant (en mol.m-3),
CAH, la concentration initiale en acide faible (en mol.m-3).

Cette relation n'est valable que dans le cas où l'acide faible est le seul acide ou si les
autres acidités sont négligeables. La dérivée par rapport à la pression de l'équation
( 40 ) donne la variation du pH en fonction de la variation de la constante d'équilibre
dont l'évolution en fonction de la pression peut s'exprimer en utilisant ( 36 ) :

d  pH 

c AH  H   d ( pKa )  1  c AH   V 
 . AH
 ( 41 )
dP 2. c AH   H  dP
  2. c
 AH  
 H    2,3. RT 

où pH = - Log [H+], pKA = - Log KA,


VAH, la variation de volume associée à l'équilibre ( 39 ) (en m3.mol-1).

En résolvant ( 40 ) l'expression du pH ne dépend que de la concentration initiale et de


la constante d'équilibre :

d  pH   2c AH   V   V AH 

 1 .  F (c AH ).  ( 42 )
 4c  K  K  K  4c    2,3. RT  
AH

dP  AH A A A AH 
 2,3. RT 

La variation de volume liée à une ionisation étant généralement négative, le pH d'un


acide faible diminue sous pression, de la même façon le pOH diminue d'une base
faible.
Si initialement CAH = 2.KA soit pH = pKA, alors F(CAH) = 1/3. La variation de pH est
d'autant plus importante que l'espèce non dissociée est majoritaire, donc si CAH est très
supérieur à [H+] alors F(CAH)  1/2. Lorsque le pH est proche de 7, il faut tenir
compte de la dissociation ionique de l'eau dont la variation de volume associée n'est
pas négligeable (Vw = -21 ml.mol-1 (BODANSZKY et KAUZMANN 1962)).

28 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


A.3.2.2 Cinétique
L'étude de la cinétique d’une réaction fait en général intervenir la théorie de l’état de
transition. Selon cette théorie, une réaction chimique passe par un état transitoire Xen
équilibre avec les réactants.

 ( i ) Xi  k    j X j
 X   ( 43 )
i j

La formation des produits est alors proportionnelle à X. Après dérivation, on obtient
la vitesse k de la réaction :
k BT 
k K ( 44 )
h

où k est la vitesse de la réaction (en mol.s-1),


kB, la constante de BOLTZMANN,
h, la constante de PLANCK.

Il est alors possible de prévoir la dépendance de la constante de vitesse en fonction de


la température et de la pression :
 Température

  ln k 

1   ln K  
    
RT  U  

 Ea  ( 45 )
 T P T  T P RT 2
RT 2

où Uest la variation d'énergie interne entre l’état transitoire activé et les réactants
(en J),
Ea, l’énergie d’activation de la réaction (Ea>0) (en J).

 Pression
  ln k    ln K    V 
     ( 46 )
  P T   P T RT

où Vest la variation de volume partiel molaire entre l’état transitoire activé et les
réactants (en m3.mol-1).

La pression peut accélérer ou ralentir une réaction suivant le signe de Valors que
l'élévation de température ne peut que l'accélérer.

Ces effets de la pression sur l'équilibre et la cinétique d'une réaction ne sont


généralement pas négligeables : pour un procédé avec une V de -16 ml.mol-1, une
augmentation de 100 MPa entraîne un doublement de K, pour une variation de volume

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 29


d’activation de -16 ml.mol-1 la même augmentation de pression double la vitesse de
réaction.
Ces variations de volumes concernant l’équilibre (V) ou la cinétique (V) sont
difficiles à prévoir car elles résultent en général de l’addition de plusieurs termes :
 un terme chimique, qui provient de l’association ou de la dissociation de substrats
conduisant à la variation de volume (rupture ou formation de liaisons covalentes),
 un terme de conformation,
 un terme d’interaction moléculaire (liaison hydrogène),
 un terme de solvatation, c’est-à-dire d’interactions avec les constituants du milieu :
eau et solutés (électrostriction),
 un terme de compressibilité des réactants, notamment lorsqu’un des réactants est en
phase gazeuse.

A.3.3 Changement de volume dû à la rupture des interactions moléculaires


Parmi les causes de variation de volume détaillées précédemment, le terme consacré à
l'interaction moléculaire est souvent déterminant pour l'orientation de la réaction. Le
signe de la variation de volume accompagnant la rupture ou la création des principales
interactions est détaillé dans ce chapitre.

A.3.3.1 Les liaisons covalentes


La rupture d'une liaison covalente s'accompagne d'une augmentation de volume
d'environ 10 ml.mol-1, cette réaction est donc inhibée par une augmentation de
pression. La pression renforce les liaisons covalentes et maintient la structure primaire
des molécules, tout au moins jusqu'à des pressions inférieures à 2 GPa. Les réactions
conduisant à la formation d'une liaison covalente sont favorisées si celles-ci
s'accompagnent de la destruction d'une autre liaison covalente. Cette propriété est
notamment exploitée pour des synthèses chimiques industrielles (ammoniaque).

30 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRESSIONS


Figure 6 : Modèle structuré de la solvatation d'un ion (HILLS 1972).

Tableau 3 : Variation de volume molaire et de pH accompagnant la dissociation de quelques


solutés (DISTECHE 1972).
V pH
Composé maximum
(ml.mole-1)
(pour 100 MPa)
Acides faibles
Acide acétique -12 -0,2
Acide formique -9 -0,15
Acide carbonique (K1) -28 -0,5
ATP (pH 7) -24
Acide phosphorique (K1) -17 -0,3
Systèmes tampons et solvant
Tampon acétate -12 -0,2
Tampon phosphate (K1) -16 -0,3
Tampon phosphate (K2) -25 -0,45
Eau -22 -0,35
Tampon Tris-H+ +1 +0,01
Bases faibles pOH
Ammoniaque -29 -0,5
Diéthylamine -27 -0,5

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 31


A.3.3.2 Interactions électrostatiques
Quand un ion entre dans une solution aqueuse, il se produit un phénomène appelé
électrostriction. Le champ électrique de la molécule ionisée aligne radialement les
molécules du solvant (cf. Figure 6), entraînant une réduction globale du volume
(MORILD 1981) :

N 0 z 2 e 2  1   ln D   1    ln r  
Ve      1     ( 47 )
8 0 r  D   P  T   0 D    P  T 

où e est la charge électrique d’un électron (en J),


z, le nombre de charge de l’ion,
0, la permittivité du vide,
D, la constante diélectrique du milieu,
r, le rayon de la particule (en m).

Cette équation donne une variation de volume d’environ -10 ml.mol-1 par ion
monovalent. Par contre, la création d'une liaison électrostatique entre deux ions induit
une variation de volume positive. Avec une molécule amphotère, la pression provoque
une neutralisation partielle des charges et une variation de volume négative de plus
faible amplitude.
Ces variations de volume créées par l'électrostriction vont intervenir dans toutes les
réactions aboutissant à l'apparition d'une ou plusieurs charges sur des particules
différentes, comme la dissociation ionique d'acides faibles, de sels ou même de l'eau.
Ces réactions ont une importance biologique prépondérante car elles modifient
largement des propriétés aussi importantes que le pH et la force ionique de la solution
(cf. Tableau 3).

A.3.3.3 Interactions hydrophobes


Il est très difficile actuellement de décrire quantitativement la variation de volume liée
aux interactions hydrophobes. Celles-ci peuvent être réparties en deux classes :

 la première décrit la solubilisation de molécules apolaires dans l'eau (solvatation


hydrophobe) ; la rupture de ce type d'interaction peut être impliquée dans le
déplissement des protéines,
 la seconde concerne l'interaction entre molécules apolaires en présence d'eau
(interaction hydrophobe) ; elle modélise plutôt les interactions protéine-protéine.

32 APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS


La variation de volume molaire partielle liée à la solvatation de molécules organiques
dans l'eau est plus faible que dans des solvants non-polaires. Une étude effectuée sur
l'association d'acides carboxyliques a montré une augmentation de volume due à
l'association d'environ 1 ml.mol-1 par groupement de méthylène (SUZUKI et TANIGUCHI
1972).
L'interaction protéine-protéine peut être illustrée par la formation de micelles qui
implique une variation de volume positive. Cependant, ces structures étant fortement
compressibles, une pression suffisante peut entraîner une diminution globale du
volume.
Plus généralement, l'association de molécules aliphatiques induit un changement de
volume positif alors que celle de cycles aromatiques est plutôt négative (HEREMANS
1982).

A.3.3.4 Liaisons hydrogènes


Les liaisons hydrogénes sont les interactions faibles les moins affectées par la
pression. En général, la formation d'une liaison hydrogène induit une variation de
volume partiel légèrement négative due à la diminution de la distance inter-atomique.
Cependant, dans le cas de structures volumineuses, cet effet peut être compensé ou
surcompensé par une interaction hydrophobe (TAUSHER 1995). Le calcul des
variations de volume molaire partiel pour la formation d'une liaison hydrogène donne
une gamme comprise entre 0 et -3 ml.mol-1 (MORILD 1981).

Ce chapitre met en évidence un paramètre déterminant pour prévoir l'impact de la


pression sur un phénomène chimique : la variation de volume. Dans cette variation
intervient le type de molécule, mais aussi les interactions créées ou susceptibles d'être
créées avec le milieu.
Du signe d'une variation de volume dépend le maintien ou la rupture d'une structure et
la fonctionnalité d'une molécule, propriétés qui sont fondamentales pour le rôle des
molécules biologiques vis-à-vis des êtres vivants.
La modification de l'ensemble de ces interactions intermoléculaires est impliquée dans
les réactions biologiques.

APPROCHE THERMODYNAM IQUE DES HAUTES PRES SIONS 33


34 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES
B Action des hautes pressions sur les molécules
biologiques
L'action de la pression sur les molécules est double : elle favorise la compaction inter
et intramoléculaire et provoque des modifications chimiques et structurales des
molécules. Ces modifications sur différentes molécules biologiques (lipides, protéines,
glucides) seront ainsi envisagées.

B.1 Compressibilité
L'augmentation de pression entraîne une variation de volume de la substance
considérée. L'étude de cette variation peut s'effectuer :

 sur le soluté pur : la mesure n'est applicable que sur un liquide (lipides, glycérol,
polyéthylène glycol).
 sur des solutions binaires : la mesure du volume s'obtient en comparant la
compressibilité de la solution par rapport à celle du solvant pur, c'est une
compressibilité apparente.

B.1.1 Compressibilité des corps purs


Ce paramètre, purement thermodynamique (cf. Équation ( 16 )), dépend
essentiellement de la compressibilité intrinsèque de la molécule et des interactions
intermoléculaires. Des mesures effectuées sur différents solutés organiques
(cf. Tableau 4) montrent un coefficient de compressibilité isotherme élevé pour les
molécules apolaires, notamment les lipides (de 0,8 à 1 GPa-1). Pour les liquides plus
polaires, ce coefficient est plus faible, sans doute à cause de la présence de liaisons
hydrogènes, comme les alcools (0,6 à 0,8 GPa-1) ou l'eau (0,45 GPa-1). Le glycérol
montre même une compressibilité particulièrement faible (0,22 GPa-1).

B.1.2 Compressibilité apparente de solutés dans de l'eau


Lors de la miction de deux liquides, la compressibilité apparente de la solution dans le
cas idéal est donnée pour un mélange binaire par la relation :
V1 1 V
 x   (1  x ) w  w ( 48 )
V V

où  sont les coefficients de compressibilité isotherme ou adiabatique (en Pa-1) de la


solution (sans indice), du soluté (avec l'indice 1) et du solvant (avec l'indice w),
V, les volumes molaires correspondants (en m3.mol-1),
x, la fraction molaire en soluté.

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 35


Figure 7 : Compressibilité de solutions de polyéthylène glycol (PEG) 200 et 600 (JANNELLI
et al. 1994).

36 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


La compressibilité de solutions aqueuses présente toujours une déviation négative par
rapport à l'idéalité (JACOBSON 1950), comme le montre la Figure 7. Cette déviation
est due aux interactions solvant-solutés et solutés-solutés.

La définition d'un coefficient de compressibilité adiabatique molaire apparent d'un


soluté permet de tenir compte de ces interactions ; il est décrit par l'expression
(CHALIKIAN et al. 1994a) :

11   V1  1
S     S 

1 nV S  nw Vw  S
w
 ( 49 )
V1   P  V1 V1 n1

où  S ,  S , V , n sont respectivement le coefficient de compressibilité adiabatique


apparente (en Pa-1), la compressibilité (absolue) adiabatique apparente molaire,
le volume partiel molaire (en m3.mol-1.Pa-1) et le nombre de moles de la solution
(sans indice), du soluté (avec l'indice 1) et du solvant (avec l'indice w).

Les coefficients de compressibilité adiabatique S sont les plus utilisées car ils
résultent directement de la mesure de la vitesse du son selon la relation (CHALIKIAN et
al. 1994a) :
1
S  ( 50 )
 u2

où  est la densité du solvant,


u, la vitesse du son dans le milieu (en m.s-1).

Cette mesure introduit un coefficient de compressibilité supplémentaire lié à la


relaxation des molécules, coefficient généralement négligé (SARVAZYAN 1979).
La compressibilité isotherme (T) peut être obtenue directement par dilatomètrie ou
plus simplement à partir des résultats précédents suivant la relation :
CV  2T
S  T  T  ( 51 )
CP  CP
où CP et CV sont les coefficients calorifiques respectivement à pression constante et
à volume constant (en J.mol-1),
 et  sont respectivement la densité et le coefficient d'expansion thermique du
milieu (en K-1).

ACTION DES HAUTES PRESSIO NS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 37


L'augmentation de la pression agit sur le volume des molécules biologiques ou plutôt
sur le volume qu'elles occupent dans le solvant considéré. En effet, la compressibilité
spécifique apparente d'un soluté dans de l'eau résulte :
 de la compressibilité intrinsèque de la molécule, c'est-à-dire des modifications des
interactions interatomiques à l'intérieur de la molécule pouvant entraîner une
modification de sa conformation spatiale (compaction, déplissement),
 des interactions entre molécules de soluté (association) ; ces interactions diminuent
à forte dilution et une dilution infinie permet de définir une compressibilité
apparente partielle,
 des interactions avec le solvant, c'est-à-dire l'hydratation des molécules.

En fonction de ces interactions, l'interprétation des données de compressibilité se fait


par la relation (CHALIKIAN et al. 1994a) :
 S   iS  nh . hS   Sw  ( 52 )

où  iS , hS ,  Sw sont respectivement la compressibilité adiabatique intrinsèque de la


molécule, la compressibilité adiabatique apparente de l'eau de la zone
d'hydratation et celle de l'eau solvante,
nh, le nombre de moles d'eau dans la zone d'hydratation ; ce nombre est en
général lié à la surface de la molécule et aux interactions avec les groupes
fonctionnels de cette molécule (électrostriction).

Dans le cas de petites molécules, la compressibilité intrinsèque est souvent négligeable


et la compressibilité apparente dépend beaucoup du comportement de l'eau dans la
zone d'hydratation. Chaque type d'interaction soluté-solvant entraîne une structure
particulière des molécules d'eau environnantes :
 pour les groupes chargés, le champ électrostatique induit une pression interne
supplémentaire sur la zone d'hydratation, ce qui laisse prévoir, à la pression
considérée, une compressibilité de 15 à 20 % inférieure à l'eau solvante. Cette
interaction entraîne une contribution négative, fonction du nombre de molécules
d'hydratation (de -50 à -37 ml.mol-1.GPa-1 pour les sels alcalins, -36
à -23 ml.mol-1.GPa-1 pour les -acides aminés),
 pour les groupes polaires, l'eau de la zone d'hydratation forme des liaisons
hydrogène avec le solvant. Si les groupes polaires sont isolés, l'eau ainsi liée a
encore un comportement proche de l'eau solvante, donnant même une faible
contribution positive (environ +3 ml.mol-1.GPa-1). Par contre, lorsque plusieurs
groupes polaires sont suffisamment proches, les molécules d'eau entre les deux
liaisons sont beaucoup moins mobiles, partiellement immobilisées, entraînant une

38 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


légère contribution négative (environ -6 ml.mol-1.GPa-1), ce qui explique les
compressibilités apparentes décroissantes du méthanol (12,5 ml.mol-1.GPa-1), du
glycolamide (3 ml.mol-1.GPa-1) et du ribose (-12,5 ml.mol-1.GPa-1),
 les groupes apolaires possèdent des propriétés thermodynamiques particulières. A
température inférieure à 30 °C, la structure des molécules d'eau dans la zone
d'hydratation est décrite comme proche de celle de la glace avec donc une
compressibilité plus faible que l'eau (Sh0,18 GPa-1). Par contre, à température
plus élevée, le phénomène inverse se produit : on obtient à 25°C, une contribution
par groupe méthylène (-CH2-) d'environ -2 ml.mol-1.GPa-1.
Ces différents comportements se retrouvent dans les molécules à faible poids
moléculaire figurant sur les Tableau 4a et 5b.
Dans le cas des biopolymères, notamment des protéines, tous les groupes ne sont pas
en contact avec le solvant et seules les fonctions exposées interviennent dans la
compressibilité. D'autre part, la compressibilité intrinsèque des molécules (  iS ) n'est
plus négligeable, elle constitue une contribution positive parfois très importante (
-1
 iT = 5,5 GPa pour le chymotrypsinogène (TAMURA et GEKKO 1995)). Pour des
protéines globulaires natives, c'est la compressibilité intrinsèque qui domine et la
compressibilité apparente est alors positive. Lorsque les protéines sont dénaturées
(thermiquement ou par pression), la surface accessible augmente et cependant la
compressibilité globale augmente, ce qui suppose une action importante sur la
compressibilité intrinsèque (TAMURA et GEKKO 1995).

A faible concentration (0-10 ml), la compressibilité apparente varie de façon linéaire


en fonction de la concentration. La majorité des solutés ayant une compressibilité
apparente inférieure à celle de l'eau, voire négative, l'ajout de soluté conduit à des
solutions moins compressibles que l'eau pure.

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 39


B.1.3 Compression de la membrane lipidique
La compression intrinsèque de la bicouche lipidique est généralement étudiée au
niveau microscopique par des méthodes indirectes : mobilité de sondes fluorescentes
(SCARLATA 1991), diffraction de neutrons (BRAGANZA et WORCESTER 1986b). Ces
résultats montrent un comportement anisotropique de la structure en fonction de la
pression :
 une expansion transversale, conduisant à un épaississement de la membrane, de
4 % à 200 MPa sur une membrane artificielle,
 une contraction latérale de 6 à 14 % à 200 MPa sur la même membrane.
Le coefficient de compressibilité isotherme global (T) est ainsi estimé entre 0,1 et
0,6 GPa-1 à 20°C, ce qui est inférieur à la compressibilité des liquides apolaires.

40 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


Tableau 4a : Coefficients de compressibilité réelle et apparente de quelques composés
chimiques purs ou en solution aqueuse.

Molécules Compressibilité à 25°C Remarques Références

Coefficients de compressibilité des liquides purs


Acide acétique T=0,908 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
Aniline T=0,467 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
Chloroforme T=0,974 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
Eau T=0,457 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
Ethanol T=1,10 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
Éther T=1,85 GPa -1
(WEAST et al. 1985)
Glycérol T=0,22 GPa-1 mesurée à 15 °C (PERRY et al. 1984)
Huiles alimentaires T=0,46 à 0,59 GPa -1
mesurée à 15 °C (PERRY et al. 1984)
Méthanol T=1,61 GPa-1 (WEAST et al. 1985)
n-dodécane T=0,80 GPa-1 (HEREMANS 1982)
n-Hexane T=1,22 GPa -1
(WEAST et al. 1985)

Compressibilité apparente partielle en solution aqueuse


Eau  S = -3 à -35 ml.mol-1.GPa-1 diluée dans (SAKURAI et al. 1994)
différents alcools
Chlorure de métal  S = -36 à -50 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)
alcalin
Méthanol  S = +12,5 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)

Glycolamide  S = +2,74 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)

Ribose  S = -12,5 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)

Sucres  S = -8 à -14 ml.mol-1.GPa-1 (GALEMA et al. 1993)

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 41


Tableau 5b: Coefficients de compressibilité réelle et apparente de quelques molécules
biologiques en solution aqueuse.

Molécules Compressibilité à 25°C Remarques Références

Compressibilité apparente partielle en solution aqueuse


Protéines et dérivés
-Acides aminés  S =-23 à -36 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)

Tri-peptides  S = -39 à -47 ml.mol-1.GPa-1 (HEDWIG 1994)

Protéines globulaires (CHALIKIAN et al. 1994a)


k S = -0,01 à +0,1 ml.g-1.GPa-1

 S = 0,01 à +0,07 GPa-1


Protéines fibrillaires (CHALIKIAN et al. 1994a)
k S = 0 à -0,33 ml.g-1.GPa-1

 S = 0 à -0,23 GPa-1
Ribonucléase A  S = 0,005 GPa-1 native (pH=2, 15°C)
(TAMURA et GEKKO 1995)

 S = 0,035 GPa-1 dénaturation thermique


 S = 0,030 GPa-1 dénaturation pression
 S = -0,290 GPa -1 dénaturation chimique
Myosine  S = 0,04 GPa-1 (TAMURA et al. 1993)

Oligoglycines  S = -26,6 à -42,7 GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994b)

ADN  S =-32 à -76 ml.mol-1.GPa-1 (CHALIKIAN et al. 1994a)

Membranes Phospholipidiques
Liposomes  iT =0,1 à -0,8 GPa-1 compressibilité globale (BRAGANZA et WORCESTER 1986b;
SCARLATA 1991)
1   A =
-1 (BRAGANZA et WORCESTER 1986b)
0,3 à 0,7 GPa compressibilité latérale
 
A   P T

1  e = -0,4 GPa-1 compressibilité axiale (BRAGANZA et WORCESTER 1986b)


 
e   P T

Membranes pourpres  iT =+0,2 GPa-1 compressibilité globale (BRAGANZA et WORCESTER 1986b)


(H. halobium)
1   A = 0,6 GPa-1 compressibilité latérale (BRAGANZA et WORCESTER 1986b)
 
A   P T

42 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


B.2 Modifications chimiques et structurales
B.2.1 Les protéines et les structures enzymatiques
L'action des hautes pressions sur les protéines a fait l'objet de nombreuses recherches
et publications (BALNY et MASSON 1993; GROß et JAENICKE 1994; MOZHAEV et al.
1994). Cet intérêt provient non seulement de l'importance des protéines pour les
fonctions vitales des organismes vivants (enzymes, structures), mais aussi du fait de
leurs propriétés technologiques propres (gélifiant, émulsifiant, catalyse).

B.2.1.1 Dénaturation des protéines


Les protéines ont généralement une structure à trois ou quatre niveaux. Les structures
primaires sont maintenues par des liaisons covalentes et des liaisons peptidiques qui
ne sont généralement pas affectées dans la gamme de pression considérée. Les
structures secondaires sont maintenues par des liaisons faibles (essentiellement des
liaisons hydrogène) et sont donc affectées par de fortes pressions (> 700 MPa) (BALNY
et MASSON 1993). Les structures tertiaires et quaternaires sont maintenues par des
liaisons faibles (hydrogène, hydrophobes) et donc susceptibles d'être modifiées par la
pression.
Dans des conditions définies de température, de pH et d'activité de l'eau, une
augmentation de la pression de 100-150 MPa conduit à la déstructuration de la chaîne
protéique ou à la dissociation de protéines polymèriques. La variation de volume liée à
cette dissociation est toujours négative et parfois élevée en valeur absolue (BALNY et
MASSON 1993). Elle peut être suivie d'une agrégation ou d'une précipitation des sous-
unités.
Des pressions plus élevées (> 200 MPa) peuvent provoquer la dénaturation des
protéines, c'est-à-dire le déplissement de la chaîne polypeptidique, mais aussi la
réassociation des oligomères dissociés. Si la pression reste modérée (200-400 MPa),
cette transformation peut être partiellement ou totalement réversible.
Certaines structures sont particulièrement résistantes, c'est le cas des ribonucléases
(700 MPa) ou encore de l'ADN (1,2 GPa).
Les variations de volume relativement faibles obtenues lors de la dénaturation des
protéines peuvent s'expliquer par les changements limités de structure entre les deux
états considérés. Il est généralement admis que le déplissement des chaînes
polypeptidiques provoque l'exposition de groupes hydrophobes au contact du solvant,
ce que favorise généralement la pression.

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 43


Figure 8 : Diagramme pression-température de la dénaturation du chymotrypsinogène A
(pH=2) (HAWLEY 1971).

500
450 Protéine dénaturée
G < 0
400
350 G=0
Pression (MPa)

XD=0.5
300 S<0 S=0 S>0
250
200 V<0
150 Protéine native V=0
100 G > 0
V>0
50
0
0 10 20 30 40 50
Température (°C)

Tableau 5 : Résultats des modifications chimiques résultant de la dénaturation des


protéines par la pression et la chaleur (HEREMANS 1995).

Température Pression
Liaisons peptidiques rupture pas d'effet
Groupements fonctionnels désamination pas d'effet
Ponts bisulfures rupture pas d'effet
Radicaux thiol oxydation oxydation
Modifications structurales gélification ou précipitation gélification ou précipitation

44 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


La pression peut ainsi induire des modifications de structure durables :
 la cristallisation de certaines protéines à température ambiante (GROß et JAENICKE
1994) ; paradoxalement, la croissance du lysozyme du blanc d'oeuf semble être
inhibée par la pression (GROß et JAENICKE 1991),
 la formation de gels à partir de gélatine (GEKKO 1992), d'albumen (BRIDGMAN
1914), de concentrés protéiques du lait ou du sang (VAN CAMP et HUYGHEBAERT
1995) peut être induite par la pression à température ambiante en fonction du pH
optimal de stabilité de la protéine considérée. Inversement, des gels formés
thermiquement, par exemple, à partir d'ovalbumine ou de protéines de soja sont
déstabilisés par élévation de la pression (GEKKO 1992),
 la précipitation d'oligomères suite à la dissociation ou la dénaturation des protéines
natives, par exemple la myosine (YAMAMOTO et al. 1992) ou la -lactoglobuline
(DUMAY et al. 1994).

B.2.1.2 Comportement pression-température des protéines


La Figure 8 montre le diagramme pression-température typique d'une protéine.
L'équation de cette ellipse représentant l'équilibre natif-dénaturé (G = 0) est donnée
par la relation de CLAUSIUS-CLAPEYRON (KUNUGI 1993) :
  P S
   ( 53 )
  T  G  0 V
Ce diagramme présente une température optimale de stabilité vis-à-vis de la
dénaturation par la pression (S = 0) proche de la température ambiante et une
pression optimale de stabilité pour la dénaturation thermique (V = 0) proche de
200 MPa. Ceci explique les résultats étonnants obtenus par BRIDGMAN montrant la
coagulation du blanc d'oeuf à une pression inférieure lorsque la température est
abaissée (BRIDGMAN 1914).
Ce comportement n'est pas applicable à toutes les protéines : l'existence
thermodynamique d'une forme elliptique dépend des propriétés de compressibilité,
d'expansion thermique et de capacité calorifique de la protéine (cf. Équation ( 38 )).
Les structures et les propriétés des protéines dénaturées thermiquement diffèrent
sensiblement de celles pressurisées, chaque méthode induisant des modifications
(cf. Tableau 5).

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 45


B.2.1.3 Action des propriétés du milieu
Les propriétés du milieu influent sur la pression nécessaire à la dénaturation des
protéines. Le pH, l'activité de l'eau et la force ionique sont particulièrement
importants. Ces aspects ont été moins étudiés que dans le cas de la dénaturation
thermique.
L'influence du pH sur la dénaturation des protéines fournit sous pression la même
courbe en cloche qu'à pression atmosphérique, le pH optimal de stabilité restant
sensiblement le même (KUNUGI 1993). La dénaturation d'une protéine nécessite une
pression plus faible à pH 4 ou à pH 12 qu'à pH 7 (WEBER et DRICKAMER 1983).
D'autre part, l'ajout de solutés osmotiquement actifs protège aussi bien la structure
quaternaire (OLIVEIRA et al. 1994) que la structure tertiaire (DUMAY et al. 1994) des
protéines lors d'une élévation de pression. Les mécanismes de protection ne sont
actuellement pas clairement identifiés.
De même, l'addition de lipides a une action protectrice contre la dénaturation par la
pression pour un certain nombre de polypeptides (CARRIER et al. 1990). La présence
d'un ligand de petite taille (coenzyme, NAD, ions) ou du substrat pour une enzyme
permet une augmentation de la compacité de la molécule et donc une stabilité
meilleure à la pression (GROß et JAENICKE 1994).
L'ajout de solutés va protéger ou déstabiliser la molécule selon la nature de la protéine
considérée.
L'influence des propriétés du milieu sur la stabilité des protéines montre combien il est
difficile de prédire le comportement d'une biomolécule in vivo à partir de résultats in
vitro. La résistance de certains microorganismes à des pressions où la plupart des
protéines sont inactivées in vitro atteste de la limite de cette interprétation.

B.2.1.4 Conséquences sur les enzymes et l'activité enzymatique


A partir des effets thermodynamiques et biochimiques décrits précédemment, il est
possible de prévoir les différents facteurs susceptibles d'agir sur l'activité
enzymatique :

 modification du mécanisme de la réaction, par exemple changement de l'étape


limitante,
 modification de l'accessibilité (ou digestibilité) enzymatique du substrat, notamment
lors de déstructuration de protéines ou de polysaccharides, comme l'amidon pour
l'amylase (EZAKI et HAYASHI 1992),
 variation de la cinétique et de l'équilibre de la réaction catalysée suivant les
variations de volumes des différentes étapes (cf. § A.3.2),
 dénaturation de la structure protéique de l'enzyme aboutissant à une inactivation
irréversible si la pression est suffisante.
46 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES
Lorsque la variation de volume molaire d'une réaction enzymatique catalysée est
négative, à partir d'un niveau de pression suffisant il se produit un effet antagoniste
des deux dernières actions.
La pression peut aussi orienter la sélectivité d'une enzyme si les différentes réactions
catalysées n'ont pas la même variation de volume (MOZHAEV et al. 1994).

Les enzymes sont souvent constituées de plusieurs sous-unités dissociables (souvent


de façon réversible) par des pressions modérées. Si la conformation fonctionnelle est
maintenue par une liaison ionique, celle-ci est rapidement rompue par l'augmentation
de pression. Cependant, la résistance de certaines peut être très importante, notamment
dans des milieux complexes comme les produits alimentaires : c'est le cas de la
polyphénoloxydase ou de la peroxydase, dont l'activité est préservée dans des haricots
même après un traitement à 900 MPa/15 mn/50 °C. (KNORR 1995).

B.2.1.5 Cas des acides nucléiques


La dissociation de la structure en double hélice de l'ADN entraîne une variation de
volume positive. De plus, dans des conditions standard le point de fusion de l'ADN
augmente avec la pression, soit environ 3°C pour 100 MPa au moins jusqu'à 1 GPa ; il
s'annule à 60°C et semblerait diminuer à température ambiante. Cette variation
positive peut aussi être inversée en présence de proflavine.
La molécule d'ADN est donc en général stable jusqu'à des pressions supérieures à
1 GPa (SUZUKI et TANIGUCHI 1972).

B.2.2 Les glucides et les polysaccharides


Les sucres simples (mono ou oligosaccharides) ne sont pas ou peu affectés par la
pression, car la liaison O glucosidique est très stable. L'hydrolyse enzymatique de
cette liaison aboutit en général à une légère diminution de volume (Saccharase
V = -8 ml.mol-1, Dextranase V = -4 ml.mol-1 ).

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 47


Figure 9 : Diagramme pression-température des bicouches lipidiques du dipalmitoyl
phosphatidylcholine (DPPC) dans de l'eau (WONG 1987). Les différentes phases
sont : liquide-cristalline(LC), gels de type I à V (GI à GV).

Figure 10 : Diagrammes représentant la structure interchaîne de phospholipides dans


différentes phases (WONG et al. 1988).

48 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


Par contre, la pression peut intervenir sur les structures polysaccharidiques maintenues
par des liaisons faibles, par exemple dans la formation de gels. Ces structures sont
particulièrement importantes pour l'industrie agroalimentaire.
D'après la relation ( 10 ), la température de gélification est fonction de la variation de
volume consécutive à la transition solution-gel. Cette valeur est en générale positive,
la formation de gel est donc inhibée par la pression (HEREMANS 1982 ; GEKKO 1992).
Cependant dans certains cas, le phénomène inverse se produit. Des gels d'agarose
peuvent être obtenus à température ambiante en augmentant la pression
(dT/dP = 2,3°C pour 100 MPa). L'eau joue un grand rôle dans la variation de volume
liée à ces structures.
De même, la gélatinisation de l'amidon est favorisée par la pression qui, à plus de
300 MPa, permet ce changement structural à température ambiante. Comme pour les
autres gels, la structure obtenue sous pression n'a pas les mêmes caractéristiques que
celle résultant d'un chauffage. Le gel obtenu par pressurisation est généralement plus
dense, plus ferme et donne une synérèse et une rétrogradation plus lentes.

B.2.3 Les lipides et membranes lipidiques

B.2.3.1 Modifications structurales


Dans la gamme de pressions considérée, les modifications chimiques des lipides sont
relativement limitées et contrairement aux protéines, elles sont réversibles. L'influence
majeure de la pression sur les lipides réside dans la diminution de la température de
transition de phase. Cette variation (dTm/dP) est d'environ de 20°C pour 100 MPa, elle
est indépendante du groupe polaire et de la pression au moins jusqu'à 400 MPa.
Comme l'eau, les lipides montrent un polymorphisme varié (cf. Figure 9). Pour
certains phospholipides, la pression peut induire une interdigitation des chaînes
carbonées (BRAGANZA et WORCESTER 1986a). Elle permet de contrôler le passage
d'une phase à une autre, procédé utilisé pour le tempérage du beurre de cacao
(YASUDA et MOCHIZUKI 1992). Cette transition peut aussi impliquer une séparation de
phase lors de mélange de différents lipides. Cette séparation est décrite comme
préjudiciable pour les propriétés de la membrane.

Les membranes biologiques sont composées principalement de phospholipides à l'état


liquide-cristallin sous forme de bicouche lipidique. La pression a sur les membranes
un effet contraire à celui provoqué par une augmentation de température, notamment

ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES 49


au niveau de la fluidité de la bicouche lipidique. Une élévation de 100 MPa
correspond à une diminution de fluidité comparable à celle obtenue pour un
refroidissement d'environ 3°C. La présence de cholestérol ou de protéines dans la
bicouche lipidique "rigidifie" la membrane qui devient alors moins compressible et ne
montre plus de transition de phase nette. Par contre, la modification de l'état des
lipides proches d'une protéine fonctionnelle peut inhiber son fonctionnement, par
exemple la Na+-K+ ATPase (DE SMEDT et al. 1979). Ce phénomène se produit à des
pressions généralement non dénaturantes pour les protéines, ce qui permet de bien
dissocier les phénomènes.
La pression peut aussi dans certains cas entraîner l'expulsion des protéines incluses
dans la membrane (DECKMANN et al. 1985; LEIKIN et SHINITZKY 1994), alors que dans
d'autres cas elles y demeurent jusqu'à des pressions de 20 GPa (ZAKIM et WONG
1990).

B.2.3.2 Modification des propriétés physiologiques des membranes


Les modifications structurales (fluidité, transition de phase) entraînent des
modifications des fonctions des membranes, notamment de leur perméabilité.
La pression provoque une augmentation de la perméabilité passive de la bicouche
lipidique à des petites molécules comme les ions, le glucose (MACDONALD 1984) ou le
saccharose (WATTIAUX DE CONINCK et al. 1980). Par contre, pour les transports actifs,
le problème revient essentiellement à une interaction lipides-protéines. De nombreuses
études ont montré une inactivation par la pression de la Na+-K+ ATPase (DE SMEDT et
al. 1979; JONA et MARTONOSI 1991; YAMAMOTO et al. 1994). A plus faible pression
(10 MPa), le potentiel d'action des cellules est diminué et leur repolarisation ralentie
(MACDONALD 1984). Quelques transports sont, au contraire, activés par de faibles
pressions, comme le transport de KCl dans les érythrocytes (GIBSON et HALL 1995).

Conclusion
Les molécules biologiques qui forment la structure et assurent les différentes fonctions
des êtres vivants (lipides et protéines) sont donc susceptibles d'être modifiées par les
hautes pressions. Ces modifications peuvent perturber le fonctionnement des cellules
jusqu'à inactivation complète et définitive.

50 ACTION DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MOLECULES BIOLOGIQUES


C Effets des hautes pressions sur les
microorganismes
Dès la fin du siècle dernier, l'inactivation microbienne a été mise en évidence et
proposée comme un moyen de pasteurisation des produits alimentaires (HITE 1899).
Les études scientifiques se sont ensuite intéressées à deux aspects de l'application des
hautes pressions sur les microorganismes :
 un aspect physiologique, concernant la croissance microbienne sous pression
modérée (< 150 MPa) et les perturbations métaboliques induites,
 un aspect plus technologique, concernant les conditions d'inactivation des
microorganismes à des pressions plus élevées.

C.1 Effet de pressions non létales sur la physiologie des microorganismes


Appliquée à des niveaux modérés (< 100 MPa), la pression induit des modifications
du métabolisme et de la croissance des microorganismes. Ces transformations
dépendent des organismes considérés et des conditions du milieu.
La pression peut généralement être appliquée de deux façons : hydrostatique (liquide
uniquement), hyperbarique (liquide et gaz). L'action de gaz sous haute pression a sur
la croissance microbienne un effet spécifique qui dépend du gaz utilisé. L'effet
comparé des hautes pressions hydrostatiques et hyperbariques a fait l'objet de
nombreuses études (THOM et MARQUIS 1984; NELSON et al. 1991). Nous nous
limiterons ici uniquement à la description de l'effet de la pression hydrostatique.

C.1.1 Pressions limites permettant le développement de la vie


L'océan fournit des niches biologiques avec des conditions extrêmes de pression et de
température :
 d'une part les fosses, avec une pression hydrostatique pouvant aller jusqu'à
115 MPa, des températures inférieures à 5°C et une obscurité totale,
 d'autre part les sources hydrothermales, chaudes, avec des températures pouvant
dépasser 100°C et des pressions de 10 à 40 MPa.
Bien que ces conditions atteignent les extrémités physiques connues de la vie sur terre,
elles ne représentent pas nécessairement les limites de la vie, car il est probable que
des organismes puissent vivre dans des conditions de pression (jusqu'à 150 MPa) et à
des températures supérieures (jusqu'à 150°C). A ce propos, une polémique est née à la

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 51


suite d'un article mentionnant la croissance de bactéries dans les "fumeurs noirs", soit
à 250°C et 27 MPa. Cette expérience a été vivement démentie par des expériences
prouvant la rapide dégradation des protéines et des acides aminés dans ces conditions
(BERNHARDT et al. 1984).
Il est possible que dans les profondeurs de la terre, où se trouvent également des
milieux de forte pression, des formes de vie puissent se développer. Dans les puits de
pétrole, dont la profondeur peut atteindre 3000 m, de nombreuses indications prouvent
l'existence de bactéries (MARQUIS 1993).
Par contre, seules de rares études ont été effectuées sur l'action d'une pression
inférieure à 0,1 MPa sur les microorganismes. Il semblerait cependant qu'une pression
inférieure à 1 KPa permette encore la croissance des microorganismes, notamment des
variétés anaérobies, moins gênées que les aérobies par l'appauvrissement de la phase
gazeuse. Certaines bactéries (Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Mycobacterium
phlei) peuvent survivre à des pressions aussi basses que 1,3.10-8 Pa (ZOBELL 1970).

C.1.2 Effet de la pression sur la croissance


Plusieurs types de microorganismes sont identifiés en fonction de leur pression
optimale de croissance (cf. Figure 11). Les microorganismes barotolérants sont
capables de se développer sous des pressions élevées sans grande modification de leur
rythme de croissance. Les microorganismes barophiles (ou baroduriques), par contre,
ont une croissance maximum à pression élevée (30 à 60 MPa) et une diminution de la
pression ralentit leur développement. Ils vivent généralement dans les profondeurs des
océans. Les barophiles stricts sont des types de microorganismes relativement rares, ils
se trouvent le plus souvent à des profondeurs marines extrêmes, jusqu'à 10000 m, et ne
peuvent survivre en surface (PRIEUR 1995).
Les bactéries des sources chaudes (archaebacterium) sont à la fois barophiles et
hyperthermophiles.
Aucune croissance n'a été observée à des niveaux de pression supérieurs à 140 MPa,
même pour des bactéries barophiles strictes (ZOBELL et KIM 1972). A des pressions
proches de la limite de croissance, la division cellulaire est plus affectée que la
production de biomasse, ce qui peut expliquer certains changements de morphologie
(ZOBELL 1970).

52 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


Figure 11 : Schéma de la croissance des microorganismes en fonction de la pression
hydrostatique (JANNASH 1987).

La sensibilité des microorganismes à la pression augmente lorsque l'on s'éloigne des


conditions optimales de croissance (température, pH, ...). Par exemple, dans des
conditions favorables à 37°C, Escherichia coli se développe jusqu'à 50 MPa. Par
contre, à des températures limites de croissance (9°C ou 49°C), une augmentation de
pression peut complètement arrêter la croissance (MARQUIS 1993). De même, la
composition du milieu peut affecter la barorésistance des microorganismes.
La pression affecte toutes les phases de croissance, avec une diminution de sa vitesse
en phase exponentielle et une augmentation du temps de latence dans de fortes
proportions. A pression atmosphérique et à 30°C, le temps de doublement de
Escherichia coli est d'environ 1 h ; sous une pression de 400 MPa ce temps atteint 2 à
3 h, sous 500 MPa 174 h et à 525 MPa aucune division n'est constatée, les bactéries
meurent au bout de 180 h (ZOBELL 1970).
Ces modifications de la croissance microbienne peuvent s'expliquer par l'inhibition
progressive du métabolisme de la cellule ainsi que des mécanismes de réplication et de
division. Cependant, des adaptations spécifiques, notamment au niveau enzymatique,
permettent à certains microorganismes de se développer à des niveaux de pression
élevés.

C.1.3 Effet de la pression sur la synthèse de macromolécules


Des suivis de l'incorporation d'acides aminés marqués dans des protéines microbiennes
ont permis de montrer une nette diminution de la synthèse protéique en fonction du
niveau de la pression hydrostatique appliquée. Les synthèses d'ARN et d'ADN sont

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 53


cependant maintenues, à des pressions où la synthèse de protéines est inactivée
(LANDAU 1970).
L'étape de la biosynthèse sensible à la pression reste encore l'objet d'investigations
(GROß et JAENICKE 1990) qui font bien apparaître les contradictions obtenues entre les
résultats in vitro et ceux in vivo, et donc les difficultés de transposition.
Les causes supposées de l'inactivation de la biosynthèse sont multiples : modification
des vitesses enzymatiques, de la perméabilité de la membrane (LANDAU 1970),
inactivation de la transcription et de la replication (MARQUIS 1976), ... Il semblerait
cependant que la structure la plus sensible soit celle du ribosome et particulièrement
l'unité 30 S (MARQUIS 1993).

C.1.4 Effet sur le catabolisme cellulaire


Pour se développer, une cellule a besoin de réaliser des réactions conduisant à la
production d'énergie. Cette énergie est stockée au niveau cellulaire sous forme de
molécules d'adénosine tri-phosphate (ATP) ou d'autres molécules énergétiques. Il
semblerait que cette production soit moins sensible à la pression que la biosynthèse.
Les réactions d'hydrolyse sont en général favorisées par la pression (MORILD 1981).
Cependant l'action de certaines enzymes du cycle de KREBS semble être inhibée à des
pressions supérieures à 100 MPa. De même, la pression inhibe la réduction de
l'oxygène ou du nitrate.

Bien que le catabolisme ne semble pas être l'étape limitante de croissance dans des
conditions optimales, le changement de source d'énergie affecte largement la
barorésistance du microorganisme. Il peut être expliqué par la vitesse de synthèse
d'ATP qui diffère en fonction du substrat. Sous haute pression, on constate un
appauvrissement du "pool" d'ATP cellulaire, dû notamment à une énergie de
maintenance plus grande. Cette dépense énergétique se retrouve dans le mauvais
rendement de synthèse de matière organique par rapport à la synthèse d'ATP obtenue
sous haute pression chez Streptococcus faecalis (MATSUMARA et MARQUIS 1977). Il
semble donc dans ce cas que l'inhibition de la croissance par la pression peut être
interprétée en fonction de l'équilibre entre la synthèse et la consommation d'ATP.

C.1.5 Division cellulaire et différentiation morphologique


La pression altère le processus de division cellulaire, aussi bien au niveau de la
caryocinèse et de la cytocinèse (MARSLAND 1970) qu'au niveau de l'appareil mitotique
(microtubule d'actine, de myosine, de tubuline) (ZIMMERMAN 1970).

54 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SU R LES MICROORGANISMES


Chez quelques microorganismes, la division cellulaire est plus sensible à la pression
que la biosynthèse et entraîne chez ces cellules un changement typique de
morphologie. Escherichia coli B, par exemple, développe sous pression des filaments
pouvant atteindre 140 m alors qu'à pression atmosphérique, ces bactéries dépassent
rarement 8 m (ZOBELL 1970). L'étape sensible semble être la séparation ou la
formation de paroi transversale. La pression peut entraîner chez d'autres organismes
des modifications morphologiques affectant principalement la paroi mais aussi
l'organisation cytoplasmique (ZOBELL 1970).
Cette inhibition des mécanismes de division cellulaire peut aussi servir à induire une
polyploïdie chez certains organismes (SHIMADA et al. 1992).
Chez les spores bactériennes, un niveau de pression modéré (< 50 MPa) agit comme
un inducteur de germination (GOULD et SALE 1972). Cette propriété a notamment été
utilisée pour la stérilisation, car sous leur forme sporulée, ces bactéries sont
extrêmement barorésistantes et thermorésistantes, alors que sous forme végétative
l'inactivation par pression ou par température est grandement facilitée (NISHI et al.
1994).
La pression peut aussi favoriser le taux de mutations lors d'une longue exposition
(ZOBELL 1970; ROSIN et ZIMMERMAN 1977).

C.1.6 Réponse spécifique et adaptation à la haute pression


L'augmentation de la pression hydrostatique constitue un stress cellulaire qui peut
induire une réponse spécifique de la cellule, favorisant son adaptation aux nouvelles
conditions. Des gènes régulés directement ou indirectement par la pression
hydrostatique ont été mis en évidence notamment sur des bactéries marines
(BARTLETT et al. 1989). La transcription de ces gènes permet à la cellule de synthétiser
des protéines spécifiques. La synthèse de 55 protéines ainsi que de ribosomes par
augmentation de la pression (560 MPa) a été mise en évidence chez Escherichia coli
(WELCH et al. 1993). Ces protéines induites par la pression (PIP ou "Pressure Induced
Proteins") sont proches de celles induites par un choc de température positif (HSP ou
"Heat shock Protein") ou négatif (CSP ou "Cold shock Protein"). L'apparition de
certaines protéines semble en corrélation avec des modifications morphologiques chez
Escherichia coli (GROß et al. 1994). Les microorganismes ont donc une réponse au
stress hydrostatique qui s'apparente à celle obtenue pour d'autres stress physiques ou
chimiques. Cette constatation peut être rapprochée de la barotolérance induite par un

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 55


choc thermique modéré préalable sur Saccharomyces cerevisiae (IWAHASHI et al.
1991), ce stress protège également la cellule d'une exposition à des températures plus
élevées ou d'une congélation.
L'adaptation aux hautes pressions peut conduire à la production de lipides
membranaires polyinsaturés (DELONG et YAYANOS 1985). Ils maintiennent une plus
grande fluidité de la membrane à forte pression. Cette adaptation est similaire à celle
induite par une variation de température (OBUCHI et al. 1992). Les modifications
membranaires induites par un stress physique entraînent une augmentation de la
barotolérance du microorganisme.
Les bactéries marines présentent bien d'autres adaptations, notamment au niveau des
structures enzymatiques et protéiques (SIEBENALLER 1987) ainsi que dans les cycles
anaboliques. La résistance de ces enzymes leur confère un intérêt commercial
grandissant (PRIEUR 1995), certaines enzymes extracellulaires sont déjà
commercialisées: -amylase,  et -glucosidases, protéinases

Conclusion
L'élévation de la pression entraîne donc un ensemble de perturbations physiologiques
conduisant pour une pression suffisante à un arrêt du métabolisme et de la croissance.
Cet état n'est pas irréversible car la cellule est capable de se développer à nouveau si
les conditions redeviennent plus favorables. Pour arrêter définitivement le
développement des microorganismes, l'application de niveaux de pression beaucoup
plus élevés est nécessaire.

56 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


C.2 Effet de pressions létales sur les microorganismes
Des pressions supérieures à 100 MPa, permettent d'inactiver irréversiblement la
plupart des microorganismes. Cette action est d'autant plus intéressante qu'elle permet
d'envisager de nombreux débouchés au niveau alimentaire mais aussi pharmaceutique.
Cette désinfection microbienne reste un vaste sujet de recherche.
 Malgré les résultats obtenus in vitro sur les biomolécules, les causes de la mort des
microorganismes restent encore hypothétiques.
 Le type de microorganisme, les conditions de traitement, les propriétés du milieu
ont une importance cruciale sur l'efficacité du traitement haute pression. De
nombreux problèmes restent à résoudre pour comparer les différents résultats
obtenus et plus encore pour prédire l'efficacité de la pression dans un milieu donné.

C.2.1 Évaluation de l'efficacité d'un traitement haute pression sur des microorganismes
L'estimation de l'impact d'un traitement par haute pression sur la viabilité des
microorganismes est généralement effectuée par étalement et comptage sur boite de
Pétri avant et après traitement. Son efficacité s'exprime par la réduction décimale de la
population finale par rapport à la population initiale (Log[N0/N]). Si l'inactivation est
du premier ordre, ce qui est rarement le cas en pression, l'efficacité du traitement est
une fonction linéaire du temps. La concentration initiale ne semble pas avoir une
action significative sur la cinétique de destruction (ISHIGURO et al. 1993).
Par contre, pour l'évaluation de cette destruction, les conditions de comptage semblent
très importantes :
 le moment de la lecture, car la pression entraîne généralement une augmentation du
temps latence et donc une diminution du nombre de colonies apparentes dans un
premier temps. Des expériences sur Saccharomyces cerevisiae et
Zygosaccharomyces bailii montrent que les comptages peuvent changer entre 48 h
et 72 h ; par contre, ils n'évoluent pratiquement plus au-delà (PANDYA et al. 1995).
 le milieu gélifié du comptage semble induire des différences très importantes. Par
exemple, l'agar simple (PCA) donne des résultats d'efficacité (No/N) 10 fois plus
importants que le trypticase-soja (TSA) pour Escherichia coli après un traitement à
180 MPa pendant 30 mn (ISHIGURO et al. 1993).

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 57


Tableau 6: Efficacité des traitements haute pression sur différents types de microorganismes
dans des milieux modèles simples.
Microorganisme Pression Temps LogN0/N Remarque Références
Levures

Saccharomyces cerevisiae 300 MPa 10 mn >8 pH=4 à 25°C (PANDYA et al. 1995)
Zygosaccharomyces bailii 300 MPa 10 mn >8 pH=4 à 25°C (PANDYA et al. 1995)
Rhodotorula rubra 300 MPa 15 mn >7 25 °C (OXEN et KNORR 1993)
Candida albicans 200 MPa 60 mn 4 40 °C (BUTZ et LUDWIG 1986)
Champignons filamenteux

Aspergillus sydowii 250 MPa 10 mn 2,5 30 °C (KARATAS et AHI 1992)


Aspergillus amstelodami 250 MPa 10 mn 1,5 30 °C (KARATAS et AHI 1992)
Aspergillus oricae 200 MPa 30 mn 3,5 30 °C (BUTZ et LUDWIG 1986)
Paecilomyces fulvus 250 MPa 10 mn 1 30 °C (KARATAS et AHI 1992)
Penicilium roqueforti 300 MPa 20 mn 2 30 °C (KARATAS et AHI 1992)
Bactéries Gram-

Escherichia coli 250 MPa 20 mn 6 25°C (LUDWIG et al. 1992)


Pseudomonas aeruginosa 300 MPa 20 mn >10 20 °C (LUDWIG et al. 1994)
Salmonella typhimurium 345 MPa 20 mn 3 20 °C (METRICK et al. 1989)
Salmonella seftenberg 345 MPa 20 mn 5 20 °C (METRICK et al. 1989)
Vibrio parahaemolyticus T3765 170 MPa 20 mn 6 pH=7 à 23°C (STYLES et al. 1991)
Xanthomonas campestris 300 MPa 5 mn >10 5 °C (HONMA et al. 1993)
Bactéries Gram+

Lactobacillus plantarum 300 MPa 20 mn 3 30 °C (SMELT et al. 1994)


Listeria monocytogenes CA 300 MPa 15 mn 1,8 pH=7 à 23°C (STYLES et al. 1991)
Listeria monocytogenes Scott A 300 MPa 15 mn 3 pH=7 à 23°C (STYLES et al. 1991)
Staphylococcus aureus 400 MPa 20 mn 4 25°C (LUDWIG et al. 1994)
Staphylococcus carnosus 400 MPa 10 mn 1 25°C (EARNSHAW 1995)
Spores Bactériennes

Bacillus stearothermophilus 200 MPa 6h 3 40 °C (LUDWIG et al. 1992)


Bacillus subtilis 200 MPa 6h 5 40 °C (LUDWIG et al. 1992)
Virus

Bacteriophage T4 400 MPa 15 mn 6 30 °C (GROß et LUDWIG 1992)


SIVmac251 et SIVagm 150 MPa 8h 5 21°C (JUKIEWICZ et al. 1995)
Sindbis 250 MPa 30 mn 1,5 37°C (BUTZ et al. 1992)

58 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


L'utilisation de deux milieux de comptage, dont un à faible activité de l'eau, permet
par comparaison du nombre de colonies obtenu sur chaque milieu de faire apparaître
une population altérée par la pression, c'est-à-dire ne se développant plus dans des
conditions difficiles (PANDYA et al. 1995; SATOMI et al. 1995).
Dans le cas de produits alimentaires, l'efficacité du traitement peut être donnée par la
croissance microbienne dans le produit concerné par comptage à différents temps (EL
MOUEFFAK et al. 1994), ou par l'évolution de l'altération microbienne du produit
(acidité, fermentation).
Des mesures par coloration vitale (bleu de méthylène, safranine, érythrosine,
acriflavine) permettent un dénombrement microscopique sur cellule de numération ou
par cytométrie de flux. Elles donnent généralement des efficacités plus faibles que le
comptage sur boite de Pétri et ne permettent pas d'évaluer des résultats de destruction
de population supérieurs à 99 %.

La variation de l'efficacité d'un traitement est induite par les conditions de la mesure et
s'ajoute aux variations des différents paramètres liés au traitement. C'est pourquoi les
résultats obtenus par des auteurs différents devront être comparés avec prudence.

C.2.2 Facteurs influençant la destruction des microorganismes sous haute pression

C.2.2.1 Type et état physiologique des microorganismes


La résistance des organismes à une forte augmentation de pression est variable
(de 100 MPa à 1200 MPa), elle dépend évidemment du type de cellule considéré.
Elle est généralement fonction de la complexité des organismes, de leurs capacités
d'adaptations spécifiques et de leurs protections naturelles. Les différents types de
cellules peuvent être classés par ordre croissant de résistance : les cellules animales,
les champignons filamenteux, les bactéries Gram-, les levures, les bactéries Gram+ et
les spores bactériennes. Une pression de 150 MPa pendant 1 h à 30°C semble
suffisante pour réduire la population de Saccharomyces rouxii de plus de 3 log
(TAMURA et YASUOKA 1989), alors qu'un traitement de 830 MPa, 25°C pendant 2,5 h
ne parvient pas à détruire des bactéries végétatives des genres Microbacterium et
Micrococcus (TIMSON et SHORT 1965). De même, une pression de plus de 1,2 GPa
pendant 14 h ne détruit qu'une partie des spores de Bacillus subtilis (LARSON et al.
1918) et quelques survivants subsistent après un traitement de 1,78 GPa pendant
45 minutes (BASSET et MACHEBOEUF 1932). La résistance des principaux organismes

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 59


étudiés est récapitulée dans le Tableau 6. Ces résultats sont généralement difficiles à
comparer car les conditions de traitement jouent un très grand rôle et ne sont pas
toujours précisées (vitesse de pressurisation, milieu). Les résultats obtenus par un
seul auteur peuvent révéler des écarts importants entre les différentes espèces de
microorganismes, mais aussi entre les serotypes d'un même genre, comme le montrent
les résultats sur Listeria monocytogenes : CA et Scott A (STYLES et al. 1991).

Les bactéries thermorésistantes ne sont pas nécessairement barorésistantes :


Salmonella seftenberg est plus résistante à la chaleur que Salmonella typhimurium
alors qu'elle est plus sensible à la pression (METRICK et al. 1989).
L'état physiologique a, lui aussi, une forte influence sur la résistance des
microorganismes. Les cellules en phase exponentielle (30-50h de croissance) sont plus
sensibles que celles en phase stationnaire, qu'il s'agisse de bactéries (KAJIYAMA et al.
1993; MACKEY et al. 1995) ou de levures (HAMADA, cité par (TONELLO 1995)). Les
cellules de Listeria monocytogenes sont 107 fois plus résistantes en phase stationnaire
qu'en phase logarithmique à un traitement de 400 MPa pendant 10 mn (MACKEY et al.
1995).

C.2.2.2 Conditions de traitement

C.2.2.2.1 Niveau de pression - Temps et cinétique de traitement


Pour les formes végétatives et dans des conditions similaires, l'efficacité du traitement
augmente avec l'élévation du niveau de pression appliqué. Un niveau minimum
(150-200 MPa) est nécessaire pour obtenir un début d'inactivation. L'inactivation des
spores, par contre, est optimale pour une pression de 200 MPa (GOULD et SALE 1972),
car ce niveau de pression est capable d'induire la germination des spores qui, une fois
sous forme végétative, sont plus vulnérables.
Alors que la pression hydrostatique s'applique sans délai à tous les composants du
système, l'inactivation cellulaire dépend fortement du temps de séjour sous pression.
Si une cinétique d'inactivation du premier ordre a été observée chez certains
microorganismes (BUTZ et LUDWIG 1986), ce cas est loin d'être général et les écarts à
ce modèle sont nombreux. La variation du logarithme de la viabilité en fonction de la
pression montre souvent une diminution exponentielle (cinétique du second ordre).
Parfois, cette forme évolue en fonction de la température : à 40°C, un traitement à
250 MPa de Escherichia coli induit une cinétique du premier ordre alors que pour des

60 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


températures inférieures, la cinétique est plutôt du second ordre (LUDWIG et al. 1992).
Dans ce dernier cas, la viabilité diminue très vite durant le premier ¼ d'heure, puis la
destruction se poursuit beaucoup plus lentement. Cette cinétique a été observée chez
de nombreux microorganismes à température ambiante (CARLEZ et al. 1993;
PATTERSON et al. 1995). Certains auteurs ont pu parler d'une sous-population
résistante à la pression (EARNSHAW 1995). Cependant, des expériences sur Salmonella
typhimurium et Salmonella seftenberg qui présentent une cinétique de destruction du
même ordre à 240 et 340 MPa et 23°C, ont montré qu'un second traitement de la
population non inactivée entraînait une cinétique identique au traitement initial
(METRICK et al. 1989). Par contre, sur Saccharomyces cerevisiae à 200 MPa,
EARNSHAW obtient par retraitement de la population survivante une réactivation
inexpliquée (EARNSHAW 1995).
Les mêmes cinétiques peuvent être observées par inactivation thermique ; des études
montrent que dans une population de Saccharomyces cerevisiae en phase
logarithmique, une sous-population non bourgeonnante (mise en évidence par
centrifugation) est plus thermorésistante que les autres cellules d'un âge différent
(PLESSET et al. 1987).
La cinétique d'élévation en pression et de détente est rarement prise en compte, elle
n'est parfois même pas mentionnée. Elle dépend du matériel utilisé et est rarement
contrôlée. Les effets destructeurs d'une décompression rapide ont pourtant été
suggérés (MAKITA 1992). Des essais effectués grâce à la compression de gaz ont
montré une destruction de plus de 90 % des cellules de différentes souches
bactériennes par détente explosive à 6 MPa (FRASER 1951). Plus récemment, des
détentes de 20 MPa en 2 ms n'ont pas provoqué de destruction significative chez
Saccharomyces cerevisiae (BAVOUZET et al. 1994). Par contre, les homogénéisateurs
qui réalisent des détentes très rapides, induisent des destructions importantes sur les
cellules à des pressions modérées (<100 MPa) (BROOKMAN 1974). Cependant, ces
appareils mettent en oeuvre d'autres contraintes : cavitation, cisaillement, impact,
échauffement. Une succession de cycles de pressurisation-détente à 600 MPa et 60°C
réalisés en moins de 10 s divise par 10 la population de Bacillus stearothermophilus
(HAYAKAWA et al. 1994a).

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 61


C.2.2.2.2 Température
L'action de la température peut être en synergie avec la pression. Généralement, à
température ambiante (18°C à 30°C) les microorganismes présentent une résistance
optimale. Le diagramme pression-température pour une destruction donnée a en
général la même forme que celle obtenue pour la dénaturation de protéines sous
pression (GROß et LUDWIG 1992; SONOIKE et al. 1992).
L'élévation modérée de la température (40°C-70°C) permet d'augmenter l'efficacité
des traitements hautes pressions et donc de diminuer le niveau de pression nécessaire
(HITE 1899; JOHNSON et LEWIN 1946; CARLEZ et al. 1992; LUDWIG et al. 1992;
SONOIKE et al. 1992; TONELLO et al. 1992b; CARLEZ et al. 1993; ALEMAN et al. 1994).
L'action de la température est particulièrement efficace pour l'inactivation des spores
bactériennes (LECHOWICH 1993; HAYAKAWA et al. 1994b).
Le diagramme de l'eau (cf. Figure 2) montre qu'il est possible à 200 MPa de diminuer
la température jusqu'à -22°C sans changement de phase ; l'adjonction de soluté permet
encore d'étendre cette gamme (CANSEL et al. 1992). Or, les faibles températures
permettent aussi une augmentation de la destruction microbienne. Escherichia coli,
par exemple, subit, suite à un traitement de 20 mn à 200 MPa, une réduction décimale
de 4 logarithmes à 20°C mais de 8 logarithmes à -20°C (TAKAHASHI 1992). Les études
à température négative, bien qu'elles soient très prometteuses, ne sont encore pas très
nombreuses en Europe.
Quelques auteurs ont essayé d'abaisser suffisamment la température pour provoquer
un changement de phase. Le cycle congélation-décongélation à différentes pressions
semble accentuer la destruction microbienne (environ 2 logarithmes de plus qu'en
milieu liquide) (TIMSON et SHORT 1965). Des systèmes comme la "presse X"
permettant une extrusion sous pression du milieu préalablement congelé, donnent des
destructions intéressantes (MAGNUSSON 1975). Le changement de phase entraîne
souvent des modifications structurales rédhibitoires au niveau de l'objet à traiter,
notamment sur des produits alimentaires, ce qui réduit le champ d'application de ce
type de traitement.
L'effet de la température sur Bacillus stearothermophilus montre une inactivation
équivalente à 5°C et à 65°C, soit 100 fois plus qu'à 20°C (LUDWIG et al. 1992). Il
semblerait que les bactéries psychrophiles (Pseudomonas fluorescens et Listeria
innocua) soient plus sensibles aux pressions à faible température, alors que les

62 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


bactéries thermotolérantes (Citrobacter freundii) seraient plus facilement détruites à
température élevée (CARLEZ et al. 1993).

C.2.2.2.3 Traitements combinés


Devant la résistance de certaines souches, spécialement dans des milieux complexes
(cf. § C.2.2.3), de nombreux travaux ont porté sur la modification du traitement haute
pression par d'autres paramètres que la température et le temps de traitement.
Des effets de cyclages ont été effectués avec succès sur les spores bactériennes
(HAYAKAWA et al. 1994b; LUDWIG et al. 1994). Des études ont montré une destruction
plus large d'Escherichia coli et de salmonelles dans des oeufs, par une succession de
cycles de pression (5 x 2 mn à 300 MPa ou 5 x 1 s à 400 MPa). Par rapport à un
traitement à la même pression pendant un temps équivalent, ce procédé semble limiter
la dénaturation des protéines (CHEFTEL 1992). Par contre, il paraît moins intéressant
pour la stérilisation de la flore du colostrum (TONELLO 1995a).
La combinaison de techniques non thermiques, telles que l'application de champs
électriques (SHIMADA 1992), de champs magnétiques et d'ultrasons sont actuellement
à l'étude (CHEFTEL 1992).

C.2.2.3 Conditions de milieux


Le milieu de traitement des microorganismes affecte significativement leur réponse à
la pression. Les destructions obtenues dans des milieux modèles sont difficiles à
transposer dans des milieux aussi complexes que les aliments. La présence de
protéines, lipides, glucides modifie l'efficacité du traitement et les paramètres du
milieu : pH, activité de l'eau, force ionique. La synergie de la pression et de certaines
substances a été mise en évidence.

C.2.2.3.1 pH
Le pH influe sur la résistance des microorganismes, à pression atmosphérique comme
à pression élevée. La sensibilité des bactéries est accrue à haute pression. Le pH
optimal de résistance est proche de la neutralité : pH 7 pour Escherichia coli à 20°C
(KAJIYAMA et al. 1993) et Listeria monocytogenes (MACKEY et al. 1995), 8 pour
Bacillus subtilis (TIMSON et SHORT 1965). Par contre, les levures sont relativement peu
sensibles au pH du milieu : l'inactivation de Rhodotorula rubra semble indépendante
du pH dans une gamme comprise entre 3 et 8 (OXEN et KNORR 1993). Lors du
traitement de jus de fruits, différentes levures n'ont pas été inactivées par un

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGAN ISMES 63


abaissement du pH de 4,5 à 2,5 (OGAWA et al. 1992). Par contre, il semblerait que le
taux d'altération soit plus élevé à pH 3 (> 99%) qu'à pH 5 pour Zygosaccharomyces
bailii à 250 MPa/30 mn, comme le montre la croissance en milieu à une activité de
l'eau plus faible (PANDYA et al. 1995). L'addition de différents acides organiques ne
semble pas non plus accentuer la destruction des levures (OGAWA et al. 1992).
Dans toutes ces études, le pH est mesuré avant pressurisation ; il varie (en général
diminue) en fonction de la pression (cf. Tableau 3) mais aussi du soluté utilisé pour
modifier le pH. En utilisant un acide fort le pH varie peu, alors qu'avec des acides
faibles la diminution peut être accentuée en fonction du nombres de charges. La
pression agit aussi sur le pOH (-log[OH-]) par l'intermédiaire de la constante de
dissociation de l'eau. Dans tous les cas, l'élévation de pression induit une augmentation
de la force ionique.

C.2.2.3.2 Activité de l'eau et concentration en soluté


En général, l'addition de sels (NaCl) ou de solutés non ioniques (les glucides, les
polyols) protége efficacement les bactéries de l'inactivation par haute pression :
Escherichia coli (TAKAHASHI 1992; KAJIYAMA et al. 1993; SATOMI et al. 1995), flore
bactérienne du lait (TIMSON et SHORT 1965), Listeria monocytogenes (MACKEY et al.
1995), ainsi que les levures : Rhodotorula rubra (OXEN et KNORR 1993),
Saccharomyces cerevisiae (HAYAKAWA et al. 1992, TONELLO et al. 1992b,
TAKAHASHI 1992). Ce phénomène semble lié à l'activité de l'eau du milieu. D'autres
solutés n'ont pas d'effet ou accentuent l'inactivation microbienne (cf. § C.2.2.3.3 p.
67).
La réduction décimale de Rhodotorula rubra est supérieure à 7 après un traitement à
400 MPa pendant 15 mn à une activité proche de 1, alors qu'elle n'est plus que de 2,5
dans un milieu à aw 0,94 (50 % saccharose) et quasiment nulle dans un milieu à aw
0,91 (55 % saccharose ou 13 % NaCl) (KNORR et al. 1992; OXEN et KNORR 1993). De
même sur les jus de fruits, une concentration en sucre de 10° Brix protège
partiellement la population de levures et de moisissures du traitement haute pression ;
un taux de 50° Brix la protège complètement (OGAWA et al. 1992). Plus le milieu est
complexe, plus les microorganismes sont protégés d'un traitement haute pression. Par
exemple, l'inactivation d'Escherichia coli par un traitement à 700 MPa/20°C/30 mn
atteint 7 logarithmes dans un tampon phosphate (pH 7), 4,5 logarithmes dans de la
viande de poulet et à peine 1,5 logarithme dans du lait (PATTERSON et al. 1995). De

64 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


nombreux auteurs obtiennent des résultats similaires (METRICK et al. 1989; STYLES et
al. 1991) ; il semblerait que cette protection soit liée à la teneur en matière sèche du
milieu (TONELLO et al. 1992b).
Un microorganisme ne serait sensible aux hautes pressions que lorsqu'il est dans un
milieu dont l'aw permet sa croissance. Lorsque l'aw est suffisante pour arrêter la
croissance du microorganisme, celui-ci devient barorésistant (OXEN et KNORR 1993).
Un niveau de pression très supérieur ou la combinaison avec un traitement thermique
est alors nécessaire pour obtenir une destruction significative. Dans une solution de
saccharose à activité de l'eau de 0,88, Rhodotorula rubra est inactivée uniquement par
un traitement de 800 MPa/15 mn/ 45 °C (KNORR 1995).
Une modification de la pression osmotique est donc capable d'induire une protection
contre l'augmentation de la pression hydrostatique, comme il a été constaté pour des
stress thermiques (IWAHASHI et al. 1991).
Cette protection est à rapprocher de celle obtenue in vitro sur la dissociation ou sur la
dénaturation des protéines (DUMAY et al. 1994; OLIVEIRA et al. 1994).
La présence d'une phase lipidique dans le produit n'entraîne pas de modification
significative de la barorésistance des microorganismes (KARBSTEIN et al. 1992;
TONELLO et al. 1992b).

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 65


Tableau 7 : Action synergique de différentes substances sur la destruction des
microorganismes par un traitement haute pression

Substance Microorganismes Effet Remarques Référence


testés (Log)
Bactériocine L. Monocytogenes, E. 1à4 (KALCHAYANAND et al.
(pedicine, nisine) Coli, S. Typhimurium 1994)

Hydroxyanisole de L. monocytogenes 6 Pas d'effet du propyl (MACKEY et al. 1995)


butyle (BHA) hydoxybenzoate,
hydroxytoluène de butyle et
sodium ascorbate.
Chitosan E. coli, S. aureus, S. de 3 à 8 (PAPINEAU et al. 1991)
cerevisiae
EDTA, Dowex Flore du lait 0,2 (TIMSON et SHORT 1965)

Ethanol S. cerevisiae <1 Coloration vitale (TAMURA et YASUOKA 1989)


UFC (TONELLO et al. 1992b)
1,5
(TAMURA et al. 1992)
S. Sake 1 à 1,5
Ethanol, méthanol, S. cerevisiae <1 Mesure par coloration vitale. (HAYAKAWA et al. 1992)
propanol, butanol
Extrait de graine Bacillus coagulans 1 à 1,5 Dans du jus de tomate. (ISHIGURO et al. 1993)
d'Adlay Pas d'effet de la protamine et
de la polylysine.
Quinine Escherichia coli 1à2 (JOHNSON et LEWIN 1946)

EDTA, lysozyme, Escherichia coli <1 Pas d'effet d'association des (HAUBEN et al. 1995)
nisine trois substances.
EDTA augmente l'altération
des cellules.

66 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANISMES


C.2.2.3.3 Additions de substances bactériostatiques
Des substances bactériostatiques ou bactéricides peuvent favoriser la stérilisation par
application de hautes pressions (cf. Tableau 7). Pour les bactériocines, cette synergie
proviendrait de leur capacité à inhiber des cellules ayant subi une altération non létale
lors de la pressurisation (KALCHAYANAND et al. 1994), l'activité de ces substances
n'étant apparemment pas affectée par le traitement. La perméabilisation induite par le
traitement haute pression peut favoriser l'action bactéricide de ces substances, mais de
très récentes expériences semblent montrer qu'elles restent sans effet si elles sont
rajoutées après pressurisation, ce qui peut suggérer une variation transitoire de la
perméabilité cellulaire (HAUBEN et al. 1995).
Certains aliments possèdent naturellement des substances bactéricides et les
destructions microbiennes importantes obtenues par haute pression sur ces aliments
peuvent s'expliquer par la synergie entre les hautes pressions et ces substances : les
aliments épicés (KOWALSKI et al. 1992), le colostrum (TONELLO et al. 1992b), 

C.2.3 Action des hautes pressions létales : altération de la morphologie et des fonctions
vitales des microorganismes
L'évolution des microorganismes sous pression est difficile à suivre et les altérations
sont généralement observées immédiatement après retour à pression atmosphérique.
L'analyse de ces altérations est très importante car elle peut fournir des indications
quant aux causes de cette inactivation.

C.2.3.1 Modifications structurales


Les modifications structurales des microorganismes sont généralement mises en
évidence par des techniques de microscopie : microscopie électronique à transmission
(TEM) ou à balayage (SEM), microscopie optique d'épi-fluorescence ou à contraste de
phase. Ces techniques nécessitent généralement un retour à pression atmosphérique et
une préparation spécifique. Des systèmes de cryofracture devraient permettre d'avoir
une fixation plus rapide et moins dommageable (STENNING et al. 1995).

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 67


Des images en SEM font apparaître une légère modification de la structure
intracellulaire de Saccharomyces cerevisiae dès 100 MPa. Cependant, une pression
supérieure à 500 MPa entraîne des destructions majeures au niveau des organes, des
mitochondries et de la membrane nucléaire, et des invaginations de la membrane
plasmique (SHIMADA et al. 1993). Aucune altération de la paroi, si ce n'est au niveau
des cicatrices de bourgeonnement, n'a été constatée, contrairement à des observations
précédentes faites par d'autres auteurs (BUTZ et LUDWIG 1991). Traitées à 200 MPa et
-20°C, les cellules portent de graves dommages au niveau des organites
intracellulaires et de nombreuses invaginations membranaires. Des surfaces à haute
densité électronique apparaissent dans la matrice cellulaire. La microscopie par épi-
fluorescence montre une désorganisation du réseau mitochondrial alors que l'ADN du
noyau n'est pas altéré. Des images en SEM de Candida tropicalis montrent des
ruptures de la membrane et des vacuoles ainsi que l'apparition dans la matrice d'un
empilement de membranes comparable à de la myéline (OSUMI et al. 1992).
Des études microscopiques ont été aussi réalisées sur des bactéries : Xanthomonas
campestris (HONMA et al. 1993), Pseudomonas sp. (KRISS et al. 1967), Listeria
monocytogenes et Salmonella thompson (MACKEY et al. 1994). La constitution de
zones plus denses pourrait être la conséquence d'invaginations transitoires de la
membrane sous l'effet, soit d'un changement de phase de la bicouche lipidique, soit
d'un effet osmotique (MACKEY et al. 1994) ou encore d'une dégradation des protéines
(OSUMI et al. 1992). A des pressions de 500 MPa, il est courant de voir des cellules
largement altérées à coté d'autres apparemment indemnes.
Les marqueurs fluorescents font apparaître aussi une désorganisation du cytosquelette
de la cellule, notamment du réseau de tubuline et d'actine (OSUMI et al. 1992). Cette
dissociation de protéines fibrillaires sous pression a été observée in vitro pour la
myosine (YAMAMOTO et al. 1994).

68 EFFETS DES HAUTES PRESSIONS SUR LES MICROORGANIS MES


C.2.3.2 Fuite de soluté - perméabilisation
L'application de haute pression induit généralement une sortie de solutés
intracellulaires dans le milieu. Cette fuite est le plus souvent suivie par une analyse
spécifique (ions, acides aminés) ou plus simplement par la mesure de l'absorption UV
à 260 nm du milieu extracellulaire, signalant une sortie d'acides aminés ou de
protéines. Des expériences montrent une importante fuite de cations notamment de K+,
d'acides aminés et de glutathion chez Saccharomyces cerevisiae (SHIMADA et al.
1993). Une augmentation de l'absorption U.V. a aussi été observée chez Xanthomonas
campestris (HONMA et al. 1993). Une telle sortie de solutés se rencontre également
chez d'autres organismes : fuite de pigments sur des cellules végétales (DÖRNENBURG
et KNORR 1993), relargage de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de tissus animaux
(SUZUKI et al. 1993; OKAMOTO et al. 1995).

Ces phénomènes sont attribués à une perméabilisation de la membrane plasmique.


Bien que la perméabilité diminue avec l'augmentation de pression dans des
membranes modèles, l'approche d'une transition de phase membranaire provoque une
séparation de phases augmentant considérablement la perméabilité (MACDONALD
1984). Cette modification de la perméabilité cellulaire à proximité du point de
transition membranaire a déjà été mise en évidence sur Escherichia coli par
modification de la composition des acides gras ou la diminution de température
(HAEST et al. 1972).
Ainsi, le saccharose peut sous l'action de la pression pénétrer la membrane
mitochondriale (WATTIAUX DE CONINCK et al. 1980). L'adjonction de substances
baroprotectrices comme le glycérol semble freiner la fuite de K+ sur des erythrocytes
(ONUCHIC et LACAZ-VIEIRA 1985).

La pression est donc susceptible d'inactiver une population microbienne, inactivation


toutefois largement dépendante des conditions de traitement et de milieu. La
modification des biomolécules mais surtout l'inactivation microbienne ont suscité un
intérêt grandissant au niveau de l'industrie agroalimentaire où de nombreux projets de
développement sont en cours.

EFFETS DES HAUTES PR ESSIONS SUR LES MICROORGANISMES 69


D Applications alimentaires

Les applications alimentaires des hautes pressions, entrevues dès le début du siècle
(cf. Introduction), se développent depuis une dizaine d'années. Des nombreuses revues
exhaustives sont consacrées à ce développement (HOOVER et al. 1989; FARR 1990;
CHEFTEL 1991; BALNY et al. 1992; CHEFTEL 1992; TONELLO 1992a; CUOGHI 1993;
JOHNSTON 1994). Une liste des principaux axes de développements envisagés est
fournie dans l'Annexe I. Deux grands axes concentrent la plupart des études actuelles :
la réduction de la charge microbienne et la modification des propriétés de
biomolécules (essentiellement des protéines).
Les produits commercialisés actuellement au Japon utilisent largement ces deux effets
des hautes pressions dont des domaines de prédilection concernent également des
applications très spécialisées, comme l'inactivation de bactéries induisant la nucléation
de la glace (HONMA et al. 1993).

Ces développements semi-industriels ont été possibles grâce à l'évolution du matériel


permettant de créer et de confiner les hautes pressions hydrostatiques utilisées.

70 APPLICATIONS ALIMENT AIRES


E Matériel expérimental et industriel haute
pression
Deux types de matériel peuvent être distingués suivant l'application choisie :
 le matériel expérimental, dédié à des mesures in situ spécifiques et utilisant des
échantillons de faible volume,
 le matériel pilote ou semi-industriel, acceptant de traiter des volumes plus
importants mais disposant d'un nombre limité de capteurs en ligne (température,
pression).

E.1 Matériel expérimental et mesures sous haute pression


E.1.1 Mesures sous pression

Alors que la mise en oeuvre technique de pressions hydrostatiques ne pose plus de


problème au niveau laboratoire, tout au moins jusqu'à des pressions de 1 GPa, les
mesures classiques de paramètres physiques et chimiques sous pression restent pour la
plupart problématiques. L'échantillon est en effet difficilement accessible du fait de
l'épaisseur de l'enceinte métallique qui permet le maintien de la pression.
Face à cet obstacle, de nombreuses études ont été menées en discontinu, les analyses
s'effectuant à pression atmosphérique, avant et après pressurisation. La variation du
temps de maintien sous pression permet cependant de mener des études cinétiques.
Des systèmes plus élaborés réalisent un prélèvement sous pression et donc un suivi
cinétique plus souple à pressions modérées (< 400 MPa) (BALNY et MASSON 1993).
Toutefois, ce type d'investigation ne permet pas de distinguer les effets de la montée et
de la descente en pression, ainsi que l'état réel sous pression.
Depuis longtemps, les chercheurs essayent de mesurer en ligne un certain nombre de
paramètres permettant de mieux décrire le système sous pression.
Le premier de ces paramètres a été la pression elle-même, qui étant isostatique, peut se
mesurer à tout endroit du système :

 soit directement (étalon primaire), en équilibrant la force pressante par une masse :
balance de pression, colonne de mercure, ...
 soit par l'intermédiaire de variations de paramètres physiques connus (étalon
secondaire), nécessitant donc un étalonnage préalable : résistance électrique, jauge
de contrainte, changement de propriétés optiques.

MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION 71


E.1.1.1 Capteurs en place
Ces appareils mesurent la pression jusqu'à 4 GPa, les équations d'état permettant des
estimations jusqu'aux plus hautes pressions (40 GPa).
D'autres mesures de l'état du liquide ont été effectuées par des capteurs ad-hoc :
 mesure volumétrique par déplacement direct d'un piston (LUNDIN et al. 1993),
 mesure de la vitesse du son, grâce à des piézomètres (cf. § B.1.2 p.35) (BRIDGMAN
1946),
 mesure de la température, par l'intermédiaire de thermocouples insérés dans des
"doigts de gant" métalliques,
 mesure de la résistance électrique, de la constante diélectrique ou de la force
électromotrice de solutions (DISTECHE 1972),
 mesure de viscosité, utilisant le déplacement d'une bille (HERBST et al. 1993;
MATTISCHEK et SOBCZAK 1994), …

Parmi ces capteurs, seule la température peut être mesurée en n'importe quel point du
système.

E.1.1.2 Mesures optiques


La possibilité d'inclure des hublots translucides dans les enceintes haute pression
permet une grande variété de mesures optiques :

 spectrophotométrie d'absorption ou de fluorescence U.V., visible, I.R.,


 spectroscopie Raman (GOOSENS et al. 1993; SMELLER et al. 1993),
 spectrométrie infra rouge par transformation de Fourier (FTIR) (AUGER et al. 1988;
PHILP et al. 1990),
 polarisation de fluorescence (PALADINI et WEBER 1981),
 microscopie à faible pression (< 200 MPa) (ZIMMERMAN et ZIMMERMAN 1970),
 mesure de l'état vibratoire des molécules par résonance magnétique nucléaire
(RMN) (MARZKE et al. 1994; MOULLET et al. 1994) ...
La résistance de certains matériaux translucides comme le diamant, le saphir ou plus
rarement le quartz ou certains verres spéciaux permet de réaliser des fenêtres optiques
dans des enceintes haute pression. Le type de mesures désirées, la gamme de pressions
choisie et surtout les contraintes opératoires déterminent la conception des cellules
optiques.

72 MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION


E.1.2 Cellules optiques expérimentales

E.1.2.1 Cellule optique à enclumes de diamant


Les cellules optiques les plus utilisées sont les cellules à enclumes de diamant (DAC).
D'une conception très simple (cf. Figure 12), elles permettent d'atteindre des pressions
très élevées (jusqu'à 280 GPa). L'échantillon est disposé entre deux cristaux de
diamant taillés en forme d'enclume avec un méplat d'environ 0,6 mm. Le joint est
constitué d'une plaque d'acier de 2 mm perforée d'un trou de 0,2 mm. Le volume utile
est ainsi d'environ 0,002 mm3. L'ensemble est mis sous pression par un système de
pince maintenu par une vis. Cette cellule, peu encombrante, s'adapte bien à tout type
d'appareillage de mesures et est encore très utilisée en physique, en chimie, mais aussi
en biochimie (WONG et MANTSCH 1985; HEREMANS 1995).

Figure 12 : Schéma de la cellule à enclumes de diamant de type BLOCH et PIERMARINI.

MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION 73


E.1.2.2 Cellule à fenêtres de saphir
Il existe de nombreux types de cellules à fenêtre de saphir ou de quartz dans la
bibliographie (PALADINI et WEBER 1981; SPITZER et al. 1988; SHIMIZU 1992). Ces
cellules sont en général étudiées pour une observation spectroscopique. Les cellules
permettant la visualisation microscopique ne résistent pas à des pressions supérieures à
50 MPa (ZIMMERMAN et ZIMMERMAN 1970).
La cellule à fenêtre de saphir permet en partie de résoudre les problèmes posés par
celle à enclumes de diamant. La génération de pression se fait par une pompe externe
et permet donc des variations multiples sans déplacement de la cellule. La mesure de
la pression et celle de la température peuvent s'effectuer avec des capteurs standard sur
le circuit haute pression ou in situ.
Par contre, elle nécessite un équipement périphérique plus important : pompe, vannes,
circuit, raccords, capteurs. Les pressions accessibles dans ce type d'enceinte ne
dépassent guère 1 GPa.
La conception de l'enceinte dépend essentiellement du type d'expérimentation à
réaliser. Il en effet est possible d'adapter une double enveloppe pour permettre la
circulation d'un liquide caloporteur et donc une régulation de la température (HAWLEY
1978). L'emplacement des fenêtres à 90° est adapté à des mesures en fluorescence, un
angle entre 0 et 90° permet des mesures de diffraction alors que des fenêtres coaxiales
sont principalement destinées à la spectroscopie d'absorption ou à la microscopie.
De véritables unités "stopped-flow" ont été aménagées à l'intérieur d'enceintes
cylindriques, la chambre de mélange se trouvant entre deux fenêtres de saphir (BALNY
et MASSON 1993; HUBBARD et VAN ELDIK 1995). Ces appareils permettent de mesurer
la cinétique de réactions rapides en suivant l'apparition des produits ou la disparition
des substrats par modification des propriétés optiques du mélange.
D'autres cellules permettent des variations ultra rapides de la température de
l'échantillon sous haute pression. Le chauffage rapide peut être apporté par un laser,
un courant électrique entre deux électrodes (HUBBARD et VAN ELDIK 1995) ou des
micro-ondes (MATUSIEWICZ 1994).

E.2 Enceintes haute pression


La conception actuelle des systèmes haute pression est directement héritée des
enceintes utilisées en chimie et en physique pour la compaction des poudres : les

74 MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION


presses isostatiques (CIP "Cold Isostatic Press"). Cependant, le développement des
hautes pressions notamment au niveau semi-industriel a permis le développement de
systèmes plus spécifiques notamment pour les produits fluides.
L'équipement permettant l'application de haute pression hydrostatique sur de grands
volumes comprend généralement un ou plusieurs cylindres (enceintes) contenant du
liquide de pressurisation et la charge utile et un système permettant de produire du
liquide sous haute pression et de l'injecter dans l'enceinte.
On distingue deux types de récipients haute pression : les cylindres à paroi de faible
épaisseur (canalisation haute pression) et les cylindres à paroi épaisse. La forme
cylindrique généralement adoptée permet de mieux répartir les contraintes tout en
restant fonctionnelle.
Il existe deux façons de comprimer le liquide qui va transmettre la pression au produit
à traiter : la pressurisation directe ou indirecte.
 Pressurisation directe
Le principe de pressurisation directe repose sur le déplacement d'un piston directement
dans l'enceinte (DEPLACE 1995). Ce piston est généralement mis en mouvement par un
circuit primaire (huile) à pression moyenne. Le rapport entre la pression du circuit
primaire et celle de l'enceinte est donné par le rapport des surfaces des pistons sur
lesquelles appuie chaque fluide. L'avantage de ce type de pressurisation est avant tout
son coût, la rapidité de l'élévation de pression, le nombre réduit de connections,
l'encombrement. Cependant ce système est limité par la taille du piston et implique
aussi une diminution du volume utile.

MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION 75


 Pressurisation indirecte
Dans le cas de la pressurisation indirecte, la pression est générée à l'extérieur de
l'enceinte par une pompe. Le liquide ainsi mis en pression est amené à l'enceinte par
des canalisations haute pression. Les pompes utilisées sont de deux types :
 des pompes hydropneumatiques qui permettent une montée directe sous pression
(jusqu'à 700 MPa) à partir de l'air comprimé,
 des groupes hydrauliques composés d'une pompe électrique mettant sous pression
modérée (< 70 MPa) un circuit primaire et d'un amplificateur de pression qui
permet d'obtenir la pression nominale (jusqu'à 1200 MPa) à partir de la pression
primaire.

Ce système, plus souple, préserve le volume utile de l'enceinte et permet une plus
grande gamme de pression. Suivant la conception du système, il est possible d'obtenir
des augmentations en pression très rapides (HAYAKAWA et al. 1994a).

76 MATERIEL EXPERIMENTAL ET INDUSTRIEL HAUT E PRESSION


MATERIELS ET METHODES

Dans cette partie seront présentés les deux types de matériels utilisés pour le
traitement par haute pression hydrostatique et le matériel biologique support des
expérimentations. Les deux principales mesures réalisées au cours de ce travail seront
ensuite détaillées : la mesure de viabilité des cellules et la mesure de volume par
analyse d'images. Enfin, les différents protocoles expérimentaux utilisés lors des
expérimentations seront définis.

A Matériel expérimental haute pression


Ce chapitre détaille d'abord la conception et la mise au point de la cellule de
visualisation, puis présente le circuit haute pression qui alimente cette cellule.

A.1 Cellule de visualisation


Deux cellules permettant l'observation microscopique ont été utilisées : une cellule à
enclumes de diamant et une cellule à fenêtres de saphir. La seconde, conçue pour le
laboratoire, a fait l'objet d'une mise au point spécifique pour observer de petites
particules comme les levures.

A.1.1 Cellule à enclumes de diamant


Une cellule à enclumes de diamant, prêtée par le LIMHP, a été testée au laboratoire
pour l'observation de microorganismes. La distance de travail nécessaire limitait le
grossissement à x4 et, en outre, l'utilisation de cette cellule a mis en évidence plusieurs
inconvénients.
La mesure de la pression n'est possible que par la mesure optique des fréquences de
fluorescence de particules de rubis incorporées dans l'échantillon, technique
incompatible avec l'observation microscopique, et la température n'est pas contrôlée.
Au niveau protocole, le système de serrage nécessite une intervention directe pour
augmenter la pression, ce qui rend difficile le suivi des mêmes microorganismes au
cours de l'expérimentation. Par contre, la mise en place est simple et rapide, elle ne
nécessite aucune connexion.
Si les résultats obtenus avec ce type d'appareil n'ont pas été interprétables (cf. Figure
16 (A)), ils ont permis, par contre, de mieux définir le cahier des charges des
observations microscopiques sous haute pression.

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 77


Figure 13 : Schéma en demi coupe transversale de la cellule de visualisation haute pression.

78

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION


A.1.2 Conception et montage de la cellule de visualisation à fenêtres de saphir

La cellule expérimentale de visualisation a été conçue en collaboration avec le LIMHP


qui l'a réalisée.

A.1.2.1 Fenêtres de saphir

La cellule repose sur deux fenêtres cylindriques de saphir. Le saphir est un matériau
aux propriétés physiques particulièrement intéressantes (cf. Annexe II). Seul le
diamant possède des caractéristiques mécaniques supérieures, mais l'acquisition de
gemmes de cette taille pose des problèmes techniques et surtout financiers. Le quartz
naturel ou synthétique a apparemment de meilleures propriétés optiques que le saphir
mais une résistance mécanique moindre. Des essais avec du quartz ont relevé des
difficultés de montage et un clivage de la pièce à partir de 150 MPa.
Le saphir peut être monté directement sans joints comme l'a décrit POULTER (HAWLEY
1978), le principe d'étanchéité est une simple application du principe de la surface non
supportée développé par BRIDGMAN. Ce type de fixation présente des inconvénients
car il nécessite des surfaces de contact parfaitement polies et le retour à pression
atmosphérique provoque le détachement de la fenêtre. Le maintien de la fenêtre au
support par un serrage externe et l'adjonction de joints permet de prévenir les fuites
possibles durant plusieurs cycles de pression. De plus, une feuille d'or interposée entre
le saphir et la pièce support atténue l'effet des irrégularités de surface.
La taille des hublots de saphir a été choisie afin de résister à des pressions de
700 MPa. Une récente étude (CHERVIN et al. 1994) a permis de définir les zones de
ruptures de cylindres de saphir sous l'effet de la pression, en fonction de l'épaisseur du
saphir et du diamètre de la surface non supportée. Cette étude permet de prévoir le
type de fracture du saphir en fonction du niveau pression utilisé et des dimensions de
la fenêtre. Des cycles de pressurisation/détente ne semblent pas affecter sa résistance.
D'après cette étude, l'épaisseur minimale de la fenêtre de saphir pour un rapport de
diamètres (pièce/ouverture) de ½ et une pression de 700 MPa est d'environ 3 mm. Le
choix d'une épaisseur de 5 mm assure donc un bon coefficient de sécurité.

A.1.2.2 Montage de la cellule de visualisation

La cellule est représentée en coupe transversale sur la Figure 14, accompagnée de la


nomenclature et de l'origine des pièces. Elle est entièrement démontable et permet
d'accéder directement à la surface des fenêtres pour effectuer une préparation
microscopique. De plus, la plupart des pièces devant être changées régulièrement sont
directement accessibles.
Le montage complet ainsi que le rôle de chaque pièce sont détaillés en Annexe III.
MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 79
Figure 14: Coupe transversale de la cellule de visualisation haute pression et nomenclature des
pièces.

REP NB DESIGNATION MATIERE TRAITEMENT FOURNISSEURS


1 1 Enceinte CuBe ST25 P = 1300 MPa Steinless S.A.(France)
2 1 Fenêtre Saphir R.S.A. Le rubis (France)
3 1 Fenêtre Saphir R.S.A. Le rubis (France)
5 1 Embase pour 3 X13T5 (SMV) HV 600 Aubert et Duval (France)
6 1 Contre joint CuZn36Pb3 état H11 + étamage Meca Précis (France)
7 2 Joints n° 013 Comp. n° 8300 Busak+Shamban (France)
8 1 Centreur CuZn36Pb3 état H14 Meca Précis (France)
9 1 Centreur espaceur CuZn36Pb3 état H14 Meca Précis (France)
10 1 Contre joint CuZn36Pb3 état H11 + étamage Meca Précis (France)
11 1 Embase X13T5 (SMV) HV 600 Aubert et Duval (France)
12 1 Centreur de 11 CuZn36Pb3 état H14 Meca Précis (France)
13 1 Joint n° 112 Comp. n° 8300 Busak+Shamban (France)
14 1 Joint HP CuZn36Pb3 état H11 + étamage Busak+Shamban (France)
15 1 Culasse 819 B P = 1300 MPa Aubert et Duval (France)
16 2 Bouchons pour 6,35 819 B P = 1300 MPa Aubert et Duval (France)
17 2 Embouts pour 6,35 819 B P = 1300 MPa Aubert et Duval (France)

80 MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION


A.1.3 Environnement de la cellule.

A.1.3.1 Connexion au circuit haute pression


La cellule est raccordée au circuit principal fournissant le liquide sous haute pression.
Les vibrations engendrées par les manipulations sur le circuit haute pression (vannes,
pompes) et la nécessité de déplacement pour l'observation microscopique ont rendu
indispensable une connexion souple. Des capillaires d'environ 100 m de diamètre
intérieur et 1 mm de diamètre extérieur accordent une grande liberté de mouvement et
suffisent pour amortir les vibrations. Ils sont confectionnés par le LIMHP à partir de
capillaires de chromatographie emboutis dans des raccords haute pression. Le raccord
est en fait la partie la plus sensible du montage et a fait l'objet de mesures de sécurité
particulières.
Pour des pressions plus importantes, une connexion en tube inox haute pression
(diamètre de 6,35 mm) a été réalisée.

A.1.3.2 Solidarisation avec la platine du microscope


La conception du microscope inversé Fluovert (Leitz-Weitzlar, Allemagne) ne
permettait pas de rapprocher suffisamment le plateau et la cellule haute pression de
l'objectif. Des essais de présentation de la cellule de visualisation avec un triaxe se
sont révélés infructueux. L'adjonction d'une bague (Nachet, France), en rehaussant
l'objectif de 16 mm, a permis d'utiliser la platine du microscope. Un porte-objet
spécifique a été réalisé afin de pouvoir utiliser la table de translation x-y.

A.1.4 Mise au point de la partie optique


La connexion optique entre le microscope et la cellule a été la partie la plus délicate de
la mise au point de l'ensemble de visualisation sous pression. La solution retenue est
encore loin d'être complètement satisfaisante.

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 81


A.1.4.1 Problèmes posés
La conception de la cellule impose trois contraintes optiques majeures (cf. Figure
15) :
 une distance minimum de 18 mm entre l'objet et l'objectif,
 un porte-objet (fenêtre de saphir) de 5 mm, épaisseur supérieure à celle d'une lame
de verre classique,
 un alésage dans la pièce (1) de 4,5 mm de diamètre et de 13 mm de longueur
restreignant fortement le cône lumineux de sortie (cf. Figure 15).

L'équipement standard du microscope Leitz n'a permis de visualiser l'intérieur de la


cellule qu'avec un objectif 4x, soit un champ de 4 mm couvrant la totalité de la fenêtre
de saphir.
Un objectif (APO FL GF 20/0,30/00/6,35/45) fourni par la société Nachet (France)
autorise un grossissement nominal de 20x à une distance maximale de 19 mm. Afin
d'obtenir un rapport optique suffisant pour l'analyse d'image, une lentille
supplémentaire (x2) a été interposée au sommet de la tourelle du microscope. Cet
objectif a permis d'effectuer les premières séries de mesures sur la levure
Saccharomyces cerevisiae. L'image obtenue reste cependant d'une faible qualité et le
grossissement est insuffisant pour l'observation de microorganismes d'une taille
supérieure à 10 m de diamètre.

Figure 15 : Diagramme du chemin optique de l'observation microscopique d'un objet dans


la chambre de visualisation.

82 MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION


A.1.4.2 Solutions techniques envisagées
D'autres solutions ont été envisagées, parfois testées, et de nombreuses sociétés ont été
sollicitées afin d'améliorer cette visualisation :
1. Adaptation d'un barreau de saphir afin de raccourcir le trajet optique : cette solution
prévue par le LIMHP pose le problème de l'absorption de la lumière par le saphir et
l'ajout d'une interface saphir-saphir. Cette adaptation n'a donc pas été réalisée. Dans
le même but, un liquide d'indice proche de celui du saphir aurait pu être inséré dans
le puits, mais son utilisation ne peut s'envisager avec un microscope inversé.
2. Réalisation d'un objectif sur mesure : cette solution a été proposée par la société
Nachet (France), qui sur la base de l'objectif précédent (APO 20 x 1,5) a conçu un
nouvel objectif corrigé pour les conditions spécifiques de la cellule haute pression.
Ce prototype n'a pas apporté le gain espéré.
3. Réduction de la distance entre l'objet et l'objectif au moyen d'une fibre optique :
apparemment, la résolution des images transportées par fibre optique n'est pas
suffisante pour la microscopie.
4. Réalisation d'un objectif spécifique adapté à la caméra permettant de s'affranchir du
microscope. La société Defuans Technologie SARL (France) a étudié cette
possibilité et effectué des tests qui se sont révélés peu satisfaisants. Elle a
également envisagé un objectif pouvant pénétrer dans le puits de 4 mm, mais le
coût de cette opération n'a pas permis sa réalisation.
5. Augmentation de l'ouverture du système optique : la société Imasys (France)
présente le Questar (Questar, Angleterre), télescope autorisant des grossissements
élevés (x 1000) à de longues distances de travail, de 4 cm à 1 m. Cet outil, de
conception originale, a été essayé au laboratoire mais n'a pas permis d'obtenir une
qualité d'images supérieures à celles du microscope.
6. Utilisation d'un système microscopique plus performant, notamment au niveau de
l'éclairage : des essais ont été faits avec la dernière génération de microscopes de la
société Nikon (France). Ce microscope permet une focalisation de l'éclairage dans
de très bonnes conditions, ce qui améliore sensiblement la qualité de l'observation.
La plupart de ces solutions optiquement complexes demandent des études longues et
coûteuses. Pour des raisons financières et techniques, aucune de ces solutions n'a été
retenue.

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 83


Figure 16 : Images digitalisées de levures, obtenues avec la cellule à enclumes diamant (A),
avec la cellule de visualisation avant modifications (B) et après modifications (C).

B - Image obtenue avec la cellule de visualisation


(Saccharomyces cerevisiae, objectif X20 Nachet,
A - Image avec la cellule à enclumes de diamant
caméra Cohu)
(Saccharomyces cerevisiae, objectif X4 Leitz,
caméra Cohu)

C - Image obtenue avec la cellule de visualisation


A (Saccharomycopsis fibuligera, objectif x25 Leitz, caméra Sony)

84 MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION


Les optimisations effectuées ont simplement consisté dans la modification d'une des
deux cellules de visualisation. Un usinage de 3 mm de la pièce principale (cf. Figure
14) a permis de faire passer un objectif de plus fort grossissement (Leitz 25x), mais
aussi d'augmenter l'ouverture optique de la cellule. Par contre, cet usinage fragilise la
pièce principale, la pression maximale de son utilisation a donc été réduite par sécurité
à 500 MPa. Dans le même but, une fenêtre inférieure de plus faible épaisseur (3,5 mm)
est en cours d'adaptation. Elle devrait permettre une meilleure visualisation et
donnerait aussi la possibilité de travailler en épi-fluorescence.
Une amélioration a aussi été apportée, au niveau de la caméra. La caméra Cohu
(Japon) utilisée par le laboratoire a un capteur CCD de ½ pouce (1,27 cm) de côté et
dispose d'une matrice 512x512 éléments photosensibles. Cette caméra a été remplacée
par une mini-caméra CCIR modèle iXs 800 de Sony (Japon) dotée d'un capteur CCD
de 1/3 de pouce (0,85 cm) de côté et d'une définition de 758x576. Pour une image
donnée, la seconde caméra offre une définition 2,3 fois supérieure, ce qui autorise, par
exemple, un grossissement plus faible en haut de la tourelle.

A.1.4.3 Évolution de la qualité d'images


La Figure 16 représente l'évolution de la qualité des images au cours de la mise au
point de cette visualisation. Les résultats montrent une nette amélioration de la
définition et une meilleure précision dans les résultats de l'analyse d'image. Toutefois,
la qualité de l'image reste nettement inférieure à celle obtenue entre lame et lamelle à
pression atmosphérique.
D'autres modifications ont permis d'améliorer l'analyse d'objets, notamment par
l'utilisation de matériel biologique de plus grande taille (cellules sanguines) ou plus
contrasté (Saccharomycopsis fibuligera), mais aussi par une optimisation des
techniques d'acquisition et d'analyse d'images.

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 85


A.1.4.4 Autres utilisations
Cette cellule permet la mise en oeuvre d'autres techniques optiques, notamment la
spectroscopie qui apporte des informations supplémentaires sur les longueurs d'ondes
transmises ou réfléchies par l'échantillon. L'adaptation d'un spectroscope a été possible
grâce à l'acquisition d'un ensemble spectroscopique totalement modulable (LOT Oriel,
France) : analyseur, monochromateur et spectroscope, reliés entre eux par fibres
optiques. Cet ensemble peut être utilisé de deux façons :
 en couplant directement les fibres optiques d'émission et de réception à la cellule de
visualisation, on obtient alors une analyse précise du spectre d'absorption de
l'échantillon,
 en adaptant la fibre directement sur la tourelle du microscope, l'analyse du spectre
émis est limitée à une partie du champ microscopique. Dans ce cas, l'éclairage du
microscope sert de source d'émission lumineuse. Cette solution permet,
contrairement au montage précédent, d'analyser un spectre de fluorescence.
La technique de fluorescence permet des mesures très précises (pH, adhésion,
réactions spécifiques, fluidité, perméabilité) réalisables aussi bien par observation
microscopique que par analyse spectroscopique. Cependant, des essais ont montré que
la fluorescence détectée était faible à cause de l'épaisseur des fenêtres de saphir.

A.2 Circuit haute pression


La cellule de visualisation est intégrée dans un circuit haute pression (cf. Figure 17)
comprenant deux parties :

 une partie "statique" (700 MPa) avec une pompe manuelle, qui permet des
augmentations rapides et précises de pression dans un petit volume,
 une partie "dynamique" (400 MPa) avec une pompe hydropneumatique, qui accepte
de plus grands volumes mais offre aussi de nouvelles possibilités : injection,
circulation, chauffage, ...
Dans la configuration adoptée (cf. Figure 17), les deux parties sont interconnectées,
deux vannes permettent l'isolement d'une partie ou de l'autre. Cependant, l'ensemble
reste modulable, il est possible d'en dissocier une partie, par exemple pour atteindre
des pressions de 500 MPa à 700 MPa.

86 MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION


A.2.1 Circuit manuel "statique"
Une pompe manuelle (NOVASWISS, Suisse) d'une cylindrée de 3 ml environ génère
des pressions hydrostatiques de 700 MPa. Basée sur un système de piston-cylindre,
cette pompe fonctionne par déplacement latéral du piston motorisé par rotation d'un
large volant à 3 bras (32 tours/3 ml). Elle permet dans un circuit de petite capacité
(<5 ml), un contrôle précis de la pression et de sa cinétique de variation (jusqu'à
environ 100 MPa.s-1). La recharge du piston à partir d'un petit réservoir se fait sans
chute de pression par un système de double vannes.
Un capteur de pression (G515/7000, Sedeme Kistler, France) d'une précision de 0,1 %
couplé à un conditionneur (UC500A, Sedeme Kistler, France) et un thermocouple de
type K (BUTEC, États-Unis) mesurent en ligne respectivement la pression et la
température.
Une chambre aveugle (LIMHP) de 3 ml fermée par un système de bille autorise la
pressurisation (700 MPa) et la récupération de petits échantillons à des fins
analytiques.

A.2.2 Circuit pneumatique "dynamique"


Une pompe hydropneumatique (DXHW 903, HASKEL, États-Unis) de 2,3 ml de
cylindrée, avec un rapport théorique de 1038 permet d'obtenir une pression maximale
de 519 MPa à partir d'un air moteur à 0,5 MPa. Le débit varie suivant la pression de
3 l.mn-1 à 1,5 l.mn-1. La pression hydrostatique générée est contrôlée par un détendeur
et un manomètre sur l'air moteur. Cette pompe maintient une pression constante même
en cas de fuite, pourvu que le débit de la fuite soit inférieur à celui de la pompe.
Le raccord de cette pompe au circuit principal se fait par un flexible haute pression
(diamètre interne 4,5 mm, pression nominale 400 MPa, Haskel, États Unis). Ce
raccord amortit les vibrations et les variations de pression engendrées par le
fonctionnement de la pompe. Une vanne de régulation (60MV66V, BUTEC, États-Unis)
permet un réglage du débit par augmentation progressive de la perte de charge.

MATERIEL EXPERIMENTAL HAUTE PRESSION 87


Figure 17 : Schéma du circuit expérimental haute pression

88

MATERIEL EXPERIMEN TAL HAUTE PRESSION


Une vanne de détente réglable sur une plage 10-400 MPa (modèle 15700-2, HASKEL,
États-Unis) peut être connectée en aval de la cellule de visualisation. Par un système
de contre pression, elle élimine le surplus de pression hydrostatique. Ce système
utilisé avec la pompe hydropneumatique autorise une circulation de liquide. A cet
effet, en amont de la pompe, une double alimentation assure le changement du milieu
de pressurisation en entraînant une fluctuation de pression inférieure à 5 %. Ce
système a initié le développement au laboratoire GPAB d'un programme de
pressurisation en continu (VITRAC 1995).

B Matériel pilote haute pression


Des expériences sur des presses isostatiques ont été réalisées en complément des
observations microscopiques. Elles permettent de traiter des volumes plus grands mais
obligent à des mesures antérieures et postérieures au traitement.
Deux presses isostatiques différentes ont été utilisées :
 une presse isostatique de 0,8 l/400 MPa (Top'Industrie, France) mise à disposition
par le laboratoire de réactivité des solides de l'Université de Bourgogne. Cet
appareil autorise une vitesse d'élévation de pression d'environ 100 MPa.mn-1 alors
que la détente s'effectue directement à l'aide d'une vanne. L'enceinte n'est pas
régulée en température,
 une presse isostatique de 1,5 l/600 MPa (GEC Alsthom ACB, France) localisée
dans le Hall technologique de Bourgogne Technologie (Dijon). Malgré son plus
grand volume, les performances d'élévation de pression de cet appareil sont
sensiblement similaires. Une double enveloppe permet une régulation en
température de -20°C à 70°C.
Les mesures de viabilité et de fuite d'ions ont été réalisées avec ce matériel.

MATERIELS ET METHODES 89
C Cellules et liposomes utilisés
Afin de pouvoir comparer les comportements morphologiques, deux types de cellule
(levures et cellules sanguines humaines) ainsi que des liposomes et des sphéroplastes
ont été utilisés.

C.1 Levures
C.1.1 Souches utilisées
Deux souches différentes ont été utilisées :
 la levure Saccharomyces cerevisiae souche CBS 1171 est bien connue et largement
utilisée dans la littérature comme au laboratoire GPAB de l’ENSBANA,
 la levure Saccharomycopsis fibuligera souche CBS 2521 présente l'avantage d’être
plus grande que la levure précédente et surtout possède une paroi beaucoup plus
visible au microscope, donnant un meilleur contraste et une focalisation plus aisée.
Sa courbe de croissance est similaire à celle de Saccharomyces cerevisiae en milieu
liquide, mais elle se développe sous forme de filaments lorsque les conditions
deviennent difficiles (au bout de 4 jours de culture environ).
Ces deux souches ont une forme sphéroïde lorsqu’elles sont cultivées en milieu
liquide.

C.1.2 Milieux de culture


Les cultures sont réalisées sur un milieu liquide de Malt Wickerham (MW) constitué
de :
 10 g de glucose,
 3 g d’extrait de levure,
 3 g de peptone pancréatique,
 1,9 g de dihydrogénophosphate de sodium,
 1 l d’eau.

L'activité de l'eau de ce milieu est environ 0,997 et peut être diminuée par ajout de
solutés.
Elle a été mesurée, comme pour les autres milieux utilisés à l'aide d'un osmomètre
Aqualab CX2 (Decagon devices Inc., USA) qui donne la température du point de
rosée de l'échantillon, couvrant une gamme d'activité de l'eau de 0,1 à 1.

90 CELLULES ET LIPOSOMES UTILISES


C.1.3 Conditions de culture
Les deux souches sont conservées à 4°C sur gélose inclinée, composée du milieu Malt
Wickerham (MW) additionné de 15 g de malt agar par litre de milieu.
Une préculture de 48 heures est réalisée en Erlenmeyer de 250 ml contenant 100 ml de
milieu MW stérile à aw désirée. Les levures sont ensuite ensemencées dans un milieu
de même nature afin d’obtenir une population initiale de 105 cellules/ml. Les
Erlenmeyers sont placés sur une table d’agitation à 250 rpm à une température de
25°C pendant 48 heures. Les levures sont alors au début de la phase stationnaire.

C.2 Sphéroplastes
Les sphéroplastes sont des levures dont la paroi a été retirée par action enzymatique.
Ils sont préparés à partir de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle. La lyse
de la paroi est réalisée par deux enzymes : 200 g/ml de zymolysase (Sigma, États-
Unis) et 2 % de -glucuronidase (Sigma, États-Unis) en présence de 2,5 l/ml de -
mercaptoéthanol (Sigma, États-Unis) et de glycérol qui maintient une activité de l'eau
de 0,99 (WOLSKA-MITASZKO et al. 1981). La lyse complète de la paroi est vérifiée par
l'éclatement de la membrane en présence d'eau distillée. Les sphéroplastes sont fixés
selon un protocole identique aux levures.

C.3 Cellules sanguines humaines


Les cellules sanguines utilisées sont des cellules leucémiques humaines issues d'une
lignée résistante à l'étoposide (lignée K 562). Issues d'une tumeur, elles sont en fin de
lignée cellulaire et donc très différenciées (SUGAWARA et al. 1991). L'avantage de ce
type de cellules réside dans leur prolifération spontanée, les mécanismes naturels de
régulation de la mitose étant réprimés. Elles sont cultivées en suspension dans un
milieu complet composé de milieu RPMI 1640 (Polylabo, France) auquel est ajouté
1 % (vol./vol.) de glutamine et du sérum de veau fœtal. Le milieu RPMI est une
solution complexe de sels (majoritairement NaCl), de source de carbone (glucose) et
d'un "pool" complet d'acides aminés ; l'activité de l'eau de cet ensemble est de 0,982.
Les cellules sont cultivées dans des flacons stériles en plastique disposés dans une
étuve à 37°C où le taux de CO2 est contrôlé. Leur viabilité peut être estimée par
l'utilisation d'un colorant d'exclusion : le bleu trypan. Cependant, le bleu de méthylène
peut lui être substitué car, sa faible toxicité, vérifiée pendant un temps équivalent à

MATERIELS ET METHODES 91
celui d'une expérience (30 mn), permet son introduction dès le début de la
manipulation.
Les cellules sanguines sont fixées et observées selon un protocole identique à celui
utilisé pour les levures (cf. § F.1.F.1.1 p. 101). La chambre de visualisation et le milieu
de pressurisation (milieu DPMI) sont maintenus à une température proche de 37°C.

C.4 Liposomes
Les liposomes sont des vésicules formées à partir de phospholipides dans une solution
aqueuse. La fabrication de liposomes unilamellaires est réalisée selon le protocole
suivant :

 mise en solution dans 20 ml de chloroforme de 90 mg de phosphatidylcholine de


jaune d'oeuf (cf. Tableau 8), 3 mg d'acide phosphatidique et 100 mg de
n-acétylglucuroside (rapport molaire lipides/détergent = 0,2),
 évaporation (Rotavapor, Buchi, Suisse) du solvant sous vide pendant 8 heures (bain-
marie à 30°C),
 hydratation du film lipidique résultant avec 20 ml d'une solution de glucose 20 mM,
de façon à obtenir une solution de micelles mixtes (détergent/phospholipides),
 élimination du détergent par dialyse de la solution micellaire avec 5 l de solution
isotonique (système liposomat, Dianorm, Allemagne).
La suspension de liposomes obtenue après 12 heures de dialyse est immédiatement
utilisée.

La fabrication de liposomes contenant du cholestérol est réalisée selon la même


procédure en ajoutant, lors de la mise en solution des lipides dans le chloroforme,
10 mg de cholestérol (soit 20 moles de cholestérol pour 100 moles de phospholipides).

Tableau 8 : Composition lipidique de la phosphatidylcholine du jaune d'oeuf.


C-atomes : Nom de l'acide gras Composition
nb double liaison en %

16:0 Palmitique 32
16:1 Palmitoléique 1,5
18:0 Stéarique 16
18:1 Oléique 26
18:2 Linoléique 13
18:3 Linolénique < 0,3
20:4 Arachidonique 4,8
22:6 Docosahexaénoique 4

92 CELLULES ET LIPOSOMES UTILISES


D Mesure de la viabilité cellulaire

La mesure de la viabilité cellulaire avant et après un traitement est indispensable à


l'évaluation des dommages créés par le traitement à l'ensemble de la colonie et à
l'aptitude de cette dernière à se développer ultérieurement, mais elle ne renseigne
aucunement sur la nature des dégâts causés à la cellule.

La viabilité est définie comme la capacité physiologique et anatomique d'un


organisme à vivre pendant un certain temps. Sur des microorganismes, cette propriété
est impossible à déterminer dans l'absolu d'où l'application de critères de viabilité :
 l'aptitude à la division cellulaire, mesurée généralement par la méthode "d'unité
formant colonie" (UFC). Elle repose sur la formation d'une colonie microbienne
visible à partir d'une cellule unique déposée sur un gel nutritif d'agar. Cette mesure
introduit certes quelques biais (cellules accolées, cellules incapables de se
reproduire), mais la mesure de viabilité est très reproductible et permet à l'aide de
dilutions adéquates une grande gamme de mesures (jusqu'à 10 cell.ml-1).
Conformément aux observations citées dans la bibliographie (cf. § C.2.1 p. 57), la
gélose utilisée est un milieu non sélectif et les lectures sont effectuées à 72 h. Le
principal inconvénient de ce type de mesure est qu'elle ne peut s'effectuer en ligne.
Des essais de suivi du bourgeonnement cellulaire ont été réalisés sous microscope
dans la cellule de visualisation afin d'obtenir une mesure de l'aptitude à la division
des cellules observées individuellement au cours de la manipulation. Malgré un
renouvellement permanent du milieu, aucun bourgeonnement n'a pu être détecté.

MATERIELS ET METHODES 93
 La fonctionnalité de la membrane et/ou du métabolisme : l'ajout d'un colorant
vital dans la cellule de visualisation permet de distinguer au microscope les cellules
viables des cellules mortes ; le comptage se fait sur cellule de numération (Cellule
de Malassez). Deux colorants d'exclusion ont été utilisés : le bleu de méthylène
(LEE et al. 1981) et le Viablue II (NCIMB, Écosse) (HUTCHESON et al. 1988) qui ne
pénètrent dans la cellule que lorsque celle-ci n'est plus viable. De plus, si le bleu de
méthylène entre dans une cellule viable dont la membrane est altérée, le colorant y
est oxydé en une forme incolore. Les cellules endommagées présentent alors des
niveaux de coloration différents, en fonction de la vitesse de pénétration du
colorant et de son oxydation (JONES 1987). Le Viablue II est utilisé
préférentiellement car sa coloration est plus facilement identifiable. L'erreur induite
par ce type de mesure est faible (< 10 %) pourvu que le nombre de cellules compté
soit suffisant (LANGE et al. 1993). Cependant, cette technique ne permet pas de
mesurer des viabilités inférieures à 10 %.

94 MESURE DE LA VIABILITE CELLULAIRE


E Méthode de mesure du volume cellulaire
L'étude microscopique du comportement de quelques individus ou d'une population
microbienne met en évidence, par l'intermédiaire de la mesure de l'évolution du
volume cellulaire, les transferts de masse susceptibles d'être provoqués par un stress.
L'analyse d'images microscopiques représente la solution la plus souple car elle
permet de suivre la cinétique de variation de volume d'un même individu ainsi que
d'effectuer d'autres mesures en ligne (viabilité, morphologie, suivi de réactions
spécifiques, ...). Cependant, le calcul du volume se fait à partir du contour observé de
l'objet et suppose donc la connaissance a priori de sa forme spatiale.
L'utilisation de cette technique a donné des résultats encourageants lors de chocs
osmotiques (MARECHAL 1992) et thermiques (GERVAIS et MARTINEZ DE MARANON
1995). Cependant, la mise en oeuvre a dû être sensiblement optimisée, afin de pouvoir
adapter cette technique à la cellule de visualisation haute pression.

E.1 Acquisition d'image provenant du microscope


E.1.1 Caméra
L'image obtenue au microscope est envoyée sur le capteur CCD de la caméra (iXS800,
Sony, Japon) raccordée à la tourelle du microscope inversé (Fluovert, Leitz-Weitzlar,
Allemagne) par une monture C. Le signal délivré répond à la norme européenne CCIR
(575 lignes - 2 trames entrelacées). Cette caméra autorise l'acquisition de 25 images
par seconde et le réglage direct du gain électronique.

E.1.2 Module d'acquisition d'image


Le signal émis par la caméra est digitalisé grâce à une carte d'acquisition (Magic
Color, Matrox, Canada) connectée au bus EISA d'un ordinateur compatible PC (HP
Netserver, Hewlett Packard, États-Unis). Cette carte transforme le signal CCIR en une
matrice 758 x 576 points élémentaires ou pixels représentant chacun un niveau de gris
codé entre 0 et 255. L'image est transférée dans la mémoire de la carte et affichée sur
un moniteur (1707, Sony, Japon).
Un logiciel commande le transfert de l'image de la mémoire de la carte à celle de
l'ordinateur puis à l'unité de disque dur. Le débit de transfert du bus EISA tolère une
acquisition de 25 images par seconde, dans la limite de la mémoire centrale. Par

MATERIELS ET METHODES 95
contre, le stockage sur disque n'admet pas d'acquisitions en ligne aussi rapides (jusqu'à
2 images/s).
Les images peuvent être enregistrées sur un magnétoscope Hi8 (EVO500, Sony,
Japon) pour un traitement ultérieur, ce qui permet de traiter des cinétiques rapides
(25 images/s) dont le déclenchement est a priori inconnu.
La carte est fournie avec une bibliothèque en langage C++ pour le développement
d'applications spécifiques. Ici, deux programmes ont été adaptés aux besoins de
l'expérimentation. Simultanément à l'acquisition d'images, ils enregistrent en outre les
données de la pression et de la température :
 le premier programme réalise l'acquisition d'images numérotées à chaque
sollicitation de l'opérateur, ce qui permet de s'assurer de la focalisation ou de
réaliser un échantillonnage statistique,
 le second effectue cette acquisition à intervalles de temps réguliers sans aucune
intervention ; il est adapté à l'analyse de cinétiques rapides.
De multiples informations (20 à 100 images/expérience) peuvent ainsi être recueillies.
L'étape suivante consiste à extraire l'information de chaque image par un processus de
traitement informatique.

96 METHODE DE MESURE DU VOLUME CELLULAIRE


E.2 Analyse d'images

L'analyse d'images est effectuée avec le logiciel Visilog 4.0 (Noesis, France) sur un
serveur RS6000 (IBM, États-Unis). La technique utilisée reprend les travaux
précédents effectués au laboratoire sur la cellule osmotique (BERNER 1994a). La faible
qualité des images obtenues sous haute pression, l'utilisation d'autres matériaux
biologiques (cellules sanguines, liposomes) ainsi que de nouvelles méthodes
d'acquisition d'images ont nécessité le développement d'un algorithme de traitement
permettant d'extraire les informations contenues dans chaque image. Le programme
d'analyse automatique inclut quatre sous-programmes ou routines, analysés ci-après,
qui permettent d'améliorer sensiblement la qualité de l'analyse et surtout le temps de
traitement.

E.2.1 Segmentation de l'image


La première phase consiste en une segmentation de l'image, c'est-à-dire une séparation
entre le fond et les objets considérés (cellules). Le puits de diamètre de 6 mm où est
canalisé l'éclairage rend inapplicable la microscopie en contraste de phase. Les images
obtenues sont peu contrastées en particulier pour les objets sans paroi (liposomes,
sphéroplastes, cellules sanguines). De plus, l'élévation de la pression entraîne une
concentration du milieu et un flux pouvant modifier la luminosité, ce qui pose de
nombreux problèmes vis-à-vis de la technique de seuillage utilisée précédemment
(BERNER 1994a). La routine utilisée s'appuie sur deux fonctions de Visilog 4.0 :
 mgradient : calcule un gradient morphologique à partir de l'image originale,
 watershed : isole les maximums locaux par la technique de remplissage des creux
et des vallées (NOESIS 1991).
L'utilisation successive de ces deux fonctions permet de dégager tous les objets
indépendamment de la luminosité absolue (cf. Figure 18).

MATERIELS ET METHODES 97
Figure 18 : Segmentation par détection des maximums locaux sur un gradient
morphologique. Afin de suivre le traitement, un élément de l'image (150x200) a
été sélectionné, un graphique montre les niveaux de gris le long de l'axe médian.

Étape 1 : Élément d'une image obtenue par digitalisation


260

240

220

200

180

160

140

120

100

Étape 2 : Calcul du gradient morphologique (mgradient)

30

25

20

15

10

Étape 3 : Étape 4 :
Binarisation par détection des maximums locaux Remplissage des formes

Étape 5 : Étape 6 :
Calcul des distances sur l'image binaire Séparation des formes

98 METHODE DE MESURE DU VOLUME CELLULAIRE


E.2.2 Détachement des objets binaires
Lorsque des objets sont accolés, ils sont considérés comme un objet unique et l'analyse
fournie est alors incohérente. Pour éviter de perdre ces informations un algorithme a
été développé à partir de deux fonctions d'analyse d'image :
 le calcul de la fonction distance sur l'image binaire par addition des érosions
successives (NOESIS 1991),
 la fonction watershed qui, appliquée sur le résultat inversé de l'image précédente,
détecte les contours ainsi que les zones les plus éloignés d'un centre.
Cette routine sur une forme discoïde permet un détachement de toutes les particules
accolées ainsi que la dissociation d'une cellule mère et de son bourgeon, à condition
que la taille du bourgeon soit suffisante.

E.2.3 Suivi individuel des cellules


Lorsqu'elles sont fixées par un polymère, un suivi individuel des cellules de levures est
rendu possible par élaboration d'un masque (BERNER 1994a). Cependant, la cellule de
visualisation subit inévitablement des micro-déplacements, à cause de sa liaison via le
flexible à la platine qui transmet les vibrations des deux pompes. La technique de
masque est alors inefficace : il faut soit reconsidérer manuellement un nouveau
masque en notant les liaisons avec les précédents, soit déplacer automatiquement le
masque, ce que propose la routine développée.
Une zone disposant d'éléments caractéristiques est choisie au centre de l'image
("référence"). L'inertie des objets qui la composent est calculée à chaque image, ce qui
permet, par comparaison à l'image initiale, de déplacer le masque en translation et en
rotation afin qu'il coïncide avec les objets choisis initialement.

MATERIELS ET METHODES 99
E.2.4 Analyse individuelle des cellules
Le module d'analyse individuelle de Visilog permet de calculer de nombreux
paramètres sur chaque cellule, rendant possible un traitement des résultats à
posteriori :

 la surface, exprimée en pixel (unité élémentaire de surface), permet de calculer un


volume en considérant la cellule sphérique :
3
2
4 S ( 54 )
V
3 
où V est le volume de la cellule (en pixel3/2 ou voxel),
S, la surface de l'objet en pixel.
 le facteur de forme qui est le rapport de la surface d'un disque ayant le périmètre de
l'objet sur la surface calculée de l'objet, soit :
L
FC  ( 55 )
4  S

où FC est le facteur de forme,


L, le périmètre de l'objet ou plutôt le nombre de pixels bordant l'objet.
Remarque :
Ce facteur est indépendant de l'orientation et de l'échelle choisies : s'il est
proche de 1, l'objet peut être considéré comme discoïde et des écarts à l'unité
traduisent l'allongement de la forme ou l'irrégularité de la surface ; s'il
dépasse 1,2 l'estimation du volume telle que définie en ( 54 ), n'est plus
applicable.

 les coordonnées (x,y),


 les diamètres de FERET qui permettent de connaître les diamètres horizontaux et
verticaux (NOESIS 1991),
 les paramètres d'inertie (moment sur x, moment sur y, orientation),
 le niveau moyen de gris obtenu sur l'image initiale.

Ces informations calculées pour chaque objet et chaque image sont transférées sur un
fichier exploité ultérieurement sur un tableur. Elles permettent, pour des
échantillonnages statistiques de la population de levures, une sélection automatique
des cellules à partir de critères simples :

 facteur de forme inférieur à 1,25,


 surface comprise entre 50 et 1000 pixels (suivant le grossissement).
Les objets rejetés sont des débris inertes ou, plus rarement, des cellules dont la forme
ne permet pas l'estimation du volume.
100 METHODE DE MESURE DU VOLUME CELLULAIRE
F Protocoles expérimentaux
F.1 Mesure du volume cellulaire
F.1.1 Mesure du volume cellulaire de cellules fixées
Lors de ces expériences, la pression et le temps de traitement ont été fixés
respectivement à 250 MPa et 15 mn. Ces conditions correspondent à une inactivation
de 1 à 3 unités logarithmiques pour des levures, l'observation sur une même image de
cellules inactivées et d'autres viables est alors généralement possible.
La pressurisation et la dépressurisation durent environ 2 mn chacune, ce qui permet
l'acquisition d'images pendant chaque variation de pression.

F.1.1.1 Fixation
Les cellules sont fixées à la surface de la fenêtre de saphir inférieure par
l'intermédiaire du film de polymère. Le chitosan (Fluka - Biochemie N°22741),
polymère cationique, a tout d'abord été utilisé après vérification sur Saccharomyces
cerevisiae de ses capacités d'adhésion et de son innocuité (BERNER et GERVAIS 1994b).
Cependant, face à des problèmes de visualisation et à la suite d'études montrant un
effet antimicrobien du chitosan sous pression (PAPINEAU et al. 1991), un autre
polymère, la poly-L-lysine (solution 0,1 g/l, N°P8920, Sigma, États-Unis) a été préféré
car il est décrit comme neutre vis-à-vis des microorganismes sous pression (ISHIGURO
et al. 1993) et perturbe moins la visualisation.
Le film est confectionné avec une goutte de solution contenant le polymère qui est
déposée à la surface de la fenêtre de saphir inférieure, préalablement montée dans le
corps de la cellule. Après 30 mn environ, le surplus de liquide est évacué et la fenêtre
séchée pendant 30 mn supplémentaires. Une goutte de liquide cellulaire est alors
déposée sur le film de polymère ainsi créé. Les cellules sont laissées pendant environ
30 mn afin qu'elles se déposent et adhèrent au film. Puis, le montage de la chambre est
poursuivi comme indiqué à l'annexe III.

MATERIELS ET METHODES 101


F.1.1.2 Mesures de volume
Le milieu désiré (en général de l'eau) est chargé dans le circuit haute pression (manuel
ou hydropneumatique). Après fermeture du circuit et application d'une légère pression
(< 2 MPa) permettant de résorber les éventuelles bulles de gaz, un champ
microscopique est sélectionné sur la surface accessible de la préparation. Le choix du
champ est déterminé en fonction du nombre de cellules et de leur aspect (taille,
contraste, ).
Lors de l'élévation de pression comme en détente, des clichés précédés d'une mise au
point, sont pris à intervalles réguliers (tous les 25 MPa environ). Sous pression,
l'acquisition se fait toutes les minutes.
Pour ces expériences, le traitement d'images fait intervenir un masque permettant le
suivi des différentes cellules sélectionnées.
Les résultats obtenus sont exprimés en variations relatives de volume en fonction du
volume initial.

Le faible nombre de cellules suivies pour chaque traitement (de 1 à 20 cellules) est un
facteur limitant de ces expériences. De plus, le film de polymère peut induire des
perturbations au niveau membranaire, mais aussi diminuer le contraste des images.

F.1.2 Mesure de la distribution des volumes cellulaires d'une population


Pour compléter les expériences précédentes, des mesures ont été effectuées sans
fixation. Le circuit haute pression est alors directement rempli avec le milieu
contenant les levures.
Dans ce cas, il n'est plus possible de suivre les mêmes cellules au cours du traitement.
Un échantillonnage suffisamment important est donc nécessaire pour avoir une
représentation correcte de la population.
A une pression donnée, des images (entre 10 et 20) sont prises à différents endroits de
la préparation, ce qui correspond à 1000 cellules environ. La durée de cette acquisition
(de 3 à 8 minutes) exclut donc toute analyse cinétique.
Les images sont traitées automatiquement, les levures étant identifiées par des critères
de taille et de forme (cf. § E.2.4 p. 100). Une coloration vitale peut aussi être ajoutée
en début et en fin de manipulation, afin de séparer la population viable de la
population inactivée.

102 PROTOCOLES EXPERIMEN TAUX


Par contre, pour effectuer une sélection automatique efficace suivant la viabilité,
l'échantillon doit être observé entre lame et lamelle. Les cellules non viables, investies
par le colorant, sont assombries et leur niveau de gris moyen est plus élevé que celui
des autres cellules, ce qui permet une identification automatique.
Les résultats concernant le volume d'une population sont donnés sous forme
d'histogrammes en fonction de classes de diamètres. Afin de pouvoir comparer les
histogrammes, des classes en progression géométriques sont utilisées. En effet, dans
un histogramme calculé avec des classes isométriques, si la variation de volume est
fonction du volume initial, les grandes cellules auront une forte variation absolue de
volume et donc un déplacement de plusieurs classes. Par contre, les petites cellules,
malgré une variation relative similaire, resteront dans la même classe. Afin que la
variation de volume induise un déplacement de classe similaire quelle que soit la taille
initiale des cellules, les classes de volume doivent être définies ainsi :
v0  I n  Vn ,Vn1 , v P  (1  f ) v0  v P  I p  (1  f )Vn ,(1  f )Vn1  ( 56 )

où v0, vp sont respectivement les volumes initial et final de la même cellule (en
Voxel ou m3),
f, la variation relative de volume due au traitement, supposée identique quelle
que soit la cellule considérée (f [0,1]),
In, Ip, des classes de volume quelconque,
(Vn), la suite de volumes représentant les bornes des classes de l'histogramme.

Pour obtenir des classes adjacentes quel que soit le volume considéré, il faut que
I P  I n1 :
I p  I n 1  n, Vn 1  (1  f )Vn ( 57 )

La suite (Vn) doit donc être une suite géométrique de raison 1/(1-f). La valeur de f est
obtenue en optimisant le déplacement des fréquences calculées avant et après
traitement.

MATERIELS ET METHODES 103


F.2 Mesure de la viabilité et de la fuite de soluté
F.2.1 Traitement dans l'enceinte haute pression
Les levures en suspension dans le milieu choisi (milieu de culture, eau ou milieu
modèle) sont conditionnées dans des sachets de polyéthylène (Dowtrans, Angleterre)
thermosoudé. Un léger vide est appliqué afin d'éviter une solubilisation excessive des
gaz et une possible rupture du sachet à la détente. Une partie des sachets est introduite
dans l'enceinte qui est remplie d'eau distillée à température ambiante, puis l'ensemble
est mis sous pression à une vitesse déterminée par le débit de la pompe (300 MPa en
3 mn). Les autres sachets laissés à pression atmosphérique serviront de témoin. Le
retour à pression atmosphérique se fait par détente sur une vanne. Les levures traitées
pourront alors faire l'objet de différentes analyses : viabilité, composition du
surnageant, ...

F.2.2 Mesure de la viabilité


La viabilité des levures est évaluée de deux façons :
 les levures sont étalées sur milieu Malt Wickerham gélosé pour réaliser un
comptage du nombre de colonies. Différentes dilutions sont effectuées, de 3 à 6
suivant le résultat attendu et 2 ou 3 boites par dilution sont retenues. Les comptages
sont effectués après 72 h d'incubation à 25°C.
 les levures sont comptées sous microscope dans une cellule de Malassez. Les
cellules non-viables sont distinguées par la coloration vitale (Bleu de Méthylène,
Viablue II). Dix numérations par lame sont effectuées juste après le traitement.

F.2.3 Dosage des ions dans le milieu extracellulaire


L'échantillon traité est centrifugé à 4000 tours/mn pendant 10 mn. Le surnageant est
dilué dans de l'eau distillée et déionisée à une concentration compatible avec la mesure
de l'ion recherché. Les concentrations des ions K+, Na+, Ca2+ sont mesurées par un
spectrophotomètre d'absorption atomique (SP 2900, PYE UNICAM, Angleterre),
utilisant de l'éthylène comme carburant et de l'oxygène comme comburant.
Une courbe d'étalonnage est réalisée pour chaque espèce ionique diluée dans de l'eau
déionisée.

F.3 Mesure de la compression de solutions binaires


La connaissance de la compression permet d'évaluer l'action de la pression sur les
différents milieux utilisés. De nombreuses mesures de compressibilité sont décrites
104 PROTOCOLES EXPERIMEN TAUX
dans la littérature (cf. Tableau 4), mais elles sont généralement fournies à pression
atmosphérique et en solution diluée, ce qui ne permet pas d'estimer la variation de
volume d'une solution sur un intervalle important de pression. Les mesures concernant
des molécules biologiques comme les glucides ou les polyols sont peu nombreuses.
Quelques études utilisent une relation linéaire entre la compressibilité apparente du
soluté et sa concentration molaire dans le cas de solutés non ioniques, ou la racine
carrée de la concentration ionique dans le cas de sels (GIBSON 1935; OWEN et
BRINKLEY 1941). La compression de soluté ionique a été particulièrement étudiée, ce
qui permet notamment de prédire les déplacements d'équilibres chimiques sous
pression de solutions salines complexes, comme l'eau de mer (OWEN et BRINKLEY
1941).
Des mesures de compression ont donc été réalisées en utilisant le matériel existant. La
pompe volumétrique représente en effet un système piston-cylindre intéressant, qui
après étalonnage, permet de suivre les variations du volume en fonction de la pression.
Cette méthode ne fournit pas une précision comparable aux techniques de dilatomètrie
ou de mesure de la vitesse du son, mais elle a montré une bonne reproductibilité.

F.3.1 Étalonnage
Le circuit utilisé ne comporte que la pompe manuelle, les deux vannes et le capteur de
pression. La variation de volume induite par la pompe a été étalonnée par 1/6 de tour.
Afin d'obtenir des mesures absolues, l'évaluation du volume initial du circuit est
nécessaire, ce qui ne peut être réalisé directement. Ce volume a été obtenu en
rapprochant les variations de volume de l'eau pure avec celles fournies par la
littérature (BRIDGMAN 1912). L'estimation du volume initial est de 4,96 ml ( 0,07)
avec une variation de volume de 89 l.tour-1 ( 0,1).

MATERIELS ET METHODES 105


F.3.2 Protocole
La solution à étudier, préalablement dégazée, est introduite dans l'ensemble du circuit
(capteur y compris) grâce à un vide primaire. Après avoir vérifié le remplissage de la
pompe, le circuit est fermé et l'augmentation de pression notée à chaque 1/6 de tour.
Cette mesure donne la pression en fonction de la variation de volume. La plupart des
propriétés thermodynamiques peuvent être calculées à partir de ces données.

106 PROTOCOLES EXPERIMEN TAUX


RESULTATS ET DISCUSSION

PARTIE I : Mesure des variations du volume


cellulaire sous hautes pressions

Le suivi de la variation du volume cellulaire lors de l'élévation de la pression


hydrostatique est effectué à l'aide d'un système d'analyse d'images (cf. § E p. 95). Cette
étude a permis, par l'acquisition d'images de différentes cellules, de mesurer et de
calculer en continu l'évolution du volume cellulaire lors d'une variation de pression
hydrostatique. Cette analyse a nécessité, hormis le traitement informatique, un
étalonnage préalable de la mesure en fonction des différents protocoles utilisés.
Le premier chapitre de cette partie est consacré à ce problème. Le chapitre suivant
s'intéresse à l'influence des différents paramètres sur la viabilité des levures sous haute
pression afin de définir des conditions de traitement optimales pour les expériences
d'observation microscopique.
A l'appui des résultats de ces deux chapitres, des observations et des mesures de la
variation de volume de différents types de cellules placées sous haute pression seront
ensuite présentées.

Afin de faciliter la compréhension des résultats, les points particuliers du protocole de


chaque expérience sont précisés en début de paragraphe. La description des résultats
est mise en évidence par un changement de typographie.

RESULTATS ET DISCUSS ION 107


A Caractérisation de la mesure du volume de
particules sous haute pression
Le système développé autour de la cellule de visualisation autorise, grâce à l'analyse
d'images, une mesure de la surface de projection d'objets microscopiques (jusqu'à
5 µm de diamètre). Les objets considérés étant sphériques, une estimation du volume
est généralement calculée.
Cependant, avant d'interpréter des résultats de variations de volume, il est
indispensable d'estimer la précision de la mesure. L'utilisation d'objets dont le
comportement volumique est connu, a permis de l'étalonner.
Sur ces objets ont été utilisés les deux protocoles mis en œuvre par la suite pour les
cellules de levure :
 un suivi de l'évolution du volume de particules sous pression,
 un échantillonnage du volume d'un ensemble de particules, aussi bien à pression
atmosphérique qu'à des pressions plus élevées.

A.1 Mesure du volume de particules individualisées


De nombreux paramètres interviennent dans l'évaluation de la surface de projection
des cellules, ils conduisent à une erreur expérimentale difficile à évaluer à partir des
sources de variations. Cependant, l'expression des mesures en volume relatif permet
de compenser de nombreuses erreurs systématiques : éclairage, analyse d'images,
indice optique du liquide, …
Par contre, d'autres paramètres peuvent varier au cours du traitement et induire une
erreur sur la mesure relative. L'influence de deux paramètres a été évaluée :
 la focalisation microscopique : elle consiste à s'assurer visuellement que le plan de
focalisation coupe la cellule en son équateur, c'est-à-dire dans sa plus grande
section. Dans cette position les contours de l'objet sont mieux définis,
 la pression hydrostatique : elle peut agir sur l'indice optique ou sur l'absorption
lumineuse du milieu, sur l'agencement des fenêtres (déplacement de la fenêtre
inférieure, élargissement de l'espace entre les saphirs, ...). Ces déplacements sont en
partie compensés par une focalisation systématique avant chaque prise d'image.

108 CARACTERISATION DE L A MESURE DU VOLUME D E PARTICULES SOUS HA UTE PRESSION


A.1.1 Étalonnage sur billes de verres
Afin de mettre en évidence l'impact de la focalisation et de la pression sur la mesure
de surface d'objets par analyse d'image, une expérience a été réalisée sur des billes de
verre de diamètre inférieur à 40 m (Prolabo, France). La compressibilité du verre
étant négligeable au moins jusqu'à 300 MPa, les effets de la pression autres que la
compression de l'objet observé pourront être directement obtenus par les variations
éventuelles de volume engendrées.
La conséquence d'une défocalisation obtenue par un réglage de 5 unités autour de la
position optimale, ce qui correspond à un déplacement de l'objectif d'environ 20 m, a
été prise en compte.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 109
Figure 19 : Effets de la pression et de la focalisation sur l'estimation du volume de billes de
verre (4 billes, diamètre < 40 µm) (HAYERT 1994).
Le signe () représente la mesure moyenne obtenue avec la focalisation
optimale ; les barres (), les variations maximales de volume induites par la
défocalisation.

100%
90%
(% du volume initial)

80%
Volume relatif

70%
60%
50%
40%
Tableau 9 : Analyse de la variance des volumes relatifs de levures au cours d'un traitement
30%
20%
haute pression (250 MPa, 15 mn). Les écarts résiduels représentent les erreurs
10%
0%
dues à la focalisation.0 0 0 0 0 0 0 0 0
Pression (MPa)
Source des Somme des Degré de Moyenne Écart F calculé Probabilité Valeur
variations carrés des liberté des carrés moyen de F/Ho critique de
écarts des écarts Fà5%
Cellules de
0,101 8 0,01260 11 % 12,93 < 0,01 % 1,99
levure
Pression 0,758 9 0,08424 29 % 86,50 < 0,01 % 1,93
Interaction 0,493 72 0,00684 8% 7,02 < 0,01 % 1,37
pression-levures
Focalisation 0,175 180 0,00097 3%
Total 1,527 269

110 CARACTERISATION DE L A MESURE DU VOLUME D E PARTICULES SOUS HAUTE PRESSION


Ces billes sont fixées au saphir selon un protocole similaire à celui des cellules
(cf. § F.1.1 p.101). Elles sont ensuite mises sous pression dans de l'eau jusqu'à
200 MPa avec une saisie d'images à intervalles réguliers de 50 MPa.
Les résultats présentés Figure 19 montrent une variation de volume inférieure
à 3 % due à l'augmentation de pression et une erreur inférieure à 4 % induite par
les deux réglages effectués. Apparemment, la pression entraîne une légère
sous-estimation du volume. Donc, même avec une mauvaise focalisation,
l'erreur relative de mesure du volume n'excède pas ± 2 %.

A.1.2 Répétabilité de la focalisation sur des cellules de levures


La mesure effectuée sur les billes permet un étalonnage de la visualisation sous
pression. Par contre, le contour et la taille des billes de verre s'écartent de celui des
levures. Pour estimer l'erreur commise sur la focalisation des levures, une expérience
de suivi de volume cellulaire a été réalisée de la façon suivante : chaque mesure du
volume des cellules de l'échantillon a été répétée trois fois en renouvelant à chaque
fois une recherche de la focalisation optimale.

Une analyse de la variance à deux facteurs (la pression, les individus) a été
réalisée sur ces mesures (cf. Tableau 9). Outre une influence significative
prévisible de chaque facteur, cette analyse montre un écart moyen résiduel
d'environ 3 % dû aux différentes focalisations. La mesure de volume a donc une
bonne reproductibilité quelle que soit la pression considérée. Cette mesure a de
plus été effectuée sur Saccharomyces cerevisiae avec l'objectif
APO 20 x 0,30 GF (Nachet, France), conditions les plus défavorables pour
l'analyse des levures.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 111
Figure 20 : Effet de la pression sur la distribution des volumes de billes de latex

Distribution initiale
Distribution à 200 MPa après 15 mn
Distribution après retour à pression atmosphérique

100%

90%

80%

70%
(% de la population totale)

60%
Fréquence

50%

40%

30%

20%

10%

0%
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Classes de volume de billes de latex (m3)

112 CARACTERISATION DE LA MESURE DU VOLUME DE PARTICULES SOUS HAUT E PRESSION


A.2 Échantillonnage de la distribution de volume d'une population de
particules
En plus de l'erreur systématique évaluée dans les deux paragraphes précédents, la
mesure de la distribution de volume dans une population pose le problème des
conditions d'échantillonnage. En effet, le choix des images, la technique de détection
automatique ou l'application de pression peuvent introduire un biais dans la mesure de
la distribution de volume. De même, l'acquisition d'une dizaine d'images peut se
révéler non représentative de la population.
Pour évaluer ces erreurs, il aurait été intéressant d'utiliser les mêmes billes de verre
que lors de l'étalonnage précédent. Malheureusement leur distribution de taille est
inconnue et seule une partie des billes est effectivement sphérique. Des billes de latex
d'un rayon moyen de 5,6 m (Coulter Electronics, Angleterre) ont donc été utilisées
car la distribution de taille de ces particules a préalablement été déterminée par le
fabricant. La solution aqueuse contenant les billes a été pressurisée selon le protocole
défini pour les levures (cf. § F.1.2 p. 102).
Les résultats présentés Figure 20 montrent un déplacement vers la gauche de
l'histogramme obtenu à 250 MPa ; ce déplacement a été ajusté à une classe de
volume (cf. § F.1.2 p. 102). Les classes sont décalées d'un facteur 1,07, ce qui
correspond à une diminution de volume d'environ 6,5 %. Cette contraction peut
vraisemblablement être attribuée à la compressibilité des billes de latex.
BRIDGMAN rapporte en effet que la compressibilité du caoutchouc dur est
comparable à celle des liquides pour des pressions modérées (BRIDGMAN
1946), ce qui concorde avec la variation observée. Après retour à pression
atmosphérique, la distribution est sensiblement similaire à la première (écart
moyen inférieur à 5 %), contrairement à celle sous pression. Un test du 2
montre une différence significative uniquement avec la population sous
pression.
La pression n'induit donc pas de modifications de volume irréversibles sur les
billes de latex. De plus, une comparaison avec la distribution de référence de
ces billes de latex donne un écart moyen de 0,5 % et une différence non
significative avec un test du 2.

Cet étalonnage a aussi permis de calculer un facteur de conversion approximatif entre


les pixels et les m2.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 113
Le système de mesure de la distribution de volumes mis en oeuvre permet donc
d'obtenir une distribution satisfaisante des objets à observer malgré le nombre
relativement faible d'objets considérés (environ 500 par distribution).

L'utilisation de cette technique sur des levures ne devrait pas induire d'erreur
supplémentaire car, la concentration cellulaire étant supérieure, le nombre de cellules
pris en compte sera plus important et en phase stationnaire les levures ont, comme les
billes, une distribution unimodale.

Conclusion
Ces étalonnages ont permis d'estimer l'erreur commise aussi bien sur une mesure
individuelle que sur une distribution complète. Les faibles écarts observés dans les
deux cas valident la technique et le protocole. Néanmoins, les interprétations de
variations de volume devront tenir compte d'erreurs systématiques.

114 CARACTERISATION DE L A MESURE DU VOLUME D E PARTICULES SOUS HA UTE PRESSION


B Étude préliminaire sur la viabilité des levures
soumises à un traitement haute pression
Avant d'effectuer un suivi du volume cellulaire, des expériences préliminaires ont été
nécessaires afin de préciser les conditions létales de traitement pour les
microorganismes choisis.
Ces expériences ont deux buts essentiels :
 mettre en évidence et quantifier l'action de différents paramètres sur l'inactivation
provoquée par un traitement haute pression,
 définir à partir de ces données des conditions favorables à l'étude des variations du
volume cellulaire.

Seule l'influence de paramètres nécessaires à la définition d'un barème de traitement


haute pression a été évaluée, ces facteurs concernent :
 le traitement : le niveau de pression et le temps de maintien sous pression, la
cinétique d'élévation de pression étant partiellement abordée,
 les conditions de milieu : la concentration de solutés, l'activité de l'eau et le pH.

L'ensemble de ces expériences a été réalisé en collaboration avec Muriel Hayert.

B.1 Effet des paramètres du traitement sur la viabilité des levures


Deux paramètres indispensables à la définition du traitement ont été pris en compte :
 le niveau de pression,
 le temps de maintien sous pression.

B.1.1 Effet du niveau de pression sur la viabilité des levures

Différents niveaux de pression de 100 à 320 MPa ont été utilisés pour un temps de
séjour de 15 mn environ. La population des deux souches de levures utilisées a été
estimée par la méthode UFC ou par coloration vitale (cf. § F.2.2 p.104). La viabilité
est exprimée en rapportant la population viable après traitement à celle du témoin
n'ayant pas subi le traitement, pour la méthode UFC ; par contre pour la méthode
microscopique, cette viabilité est directement obtenue en divisant le nombre de
cellules viables identifiées par le nombre total de cellules de l'échantillon.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE S OUS HAUTES PRESSIONS 115
Figure 21 : Viabilité de Saccharomyces cerevisiae et Saccharomycopsis fibuligera après un
traitement à un niveau de pression variable durant 15 mn.

Saccharomyces cerevisiae Saccharomycopsis fibuligera


Coloration vitale Coloration vitale
U.F.C. U.F.C.

120%

100%
(UFC et coloration vitale)

80%
Viabilité cellulaire

60%

40%

20%

0%
0 50 100 150 200 250 300 350
Pression (MPa)
appliquée pendant 15 mn

116 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Les résultats présentés Figure 21 montrent une forte diminution de la viabilité
en fonction de la pression, cette inactivation étant plus sensible pour la mesure
par UFC. En effet, après un traitement à 320 MPa pendant 15 mn, dans 1 ml de
milieu, seules 500 cellules de Saccharomyces cerevisiae sont capables de
former une colonie, alors qu'initialement ce nombre était proche de 108 soit une
réduction décimale de 5,3.
Les résultats obtenus sur Saccharomyces cerevisiae sont cohérents avec ceux
rapportés par d'autres auteurs dans des conditions comparables, aussi bien avec
une coloration vitale (HAYAKAWA et al. 1992) qu'avec un comptage sur boite
de Pétri (HOOVER et al. 1989; PANDYA et al. 1995).
Ces résultats montrent aussi que la souche Saccharomycopsis fibuligera est
sensiblement plus résistante à la pression que Saccharomyces cerevisiae. Un
niveau de destruction comparable est obtenu pour Saccharomycopsis fibuligera
pour une pression de 50 MPa supérieure à celle nécessaire pour Saccharomyces
cerevisiae.

La différence entre les méthodes d'estimation (coloration vitale et UFC) est accentuée
par le traitement haute pression. Cet écart signifie donc que les propriétés mises en jeu
par chaque technique ne sont pas affectées avec la même ampleur par le traitement
haute pression. La perméabilité membranaire et l'activité enzymatique cellulaire sont
donc moins perturbées que la capacité de ces cellules à se développer sur un milieu
d'agar nutritive. Cependant, dès 250 MPa, la viabilité estimée par numération
microscopique est au-dessous de la zone d'application conseillée pour cette méthode
(JONES 1987), la relation avec la viabilité n'est plus linéaire. Ces deux méthodes
restent néanmoins bien corrélées.
La valeur donnée par la méthode UFC est essentielle pour les applications
alimentaires, car elle représente un taux de désinfection directement utilisable. La
viabilité estimée par coloration permet, par contre, une mesure rapide et directe qui
peut facilement être exploitée pour la compréhension des mécanismes d'inactivation
cellulaire sous haute pression. Il faudra cependant tenir compte du fait qu'une grande
partie des cellules considérées comme viables au microscope sera incapable de se
développer sur un milieu nutritif.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 117
Figure 22 : Viabilité de Saccharomyces cerevisiae en fonction du temps de séjour à trois
niveaux de pression différents.
La viabilité est estimée par la méthode UFC.
Erreur ! Liaison incorrecte.

118 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRES SION
En considérant la viabilité indiquée par coloration, une pression de 250 MPa pendant
15 mn inactive environ la moitié de la population des levures, ce qui permet avec une
forte probabilité d'avoir des cellules inactivées et viables présentes dans un faible
échantillon comme celui d'un champ microscopique (environ 0,1 mm de côté).
Le temps de séjour sous pression retenu pour effectuer ces expériences est de 15 mn,
car de nombreuses études sur les cinétiques de destruction des levures ont mis en
évidence une rupture de pente autour de ce temps (OXEN et KNORR 1993). Il est
cependant intéressant de connaître l'évolution de la viabilité lorsque ce temps est
réduit.

B.1.2 Effet du temps de séjour sous pression sur la viabilité des levures
La viabilité de Saccharomyces cerevisiae a donc été mesurée après des traitements
utilisant différents temps de séjours sous pression.
Ainsi, la Figure 22 représente l'évolution de la viabilité pour trois niveaux de pression
différents. L'axe des abscisses présente le temps de séjour sous pression. Ce temps
n'inclut pas les durées d'élévation de pression (environ 3 mn) et de détente (environ
1 mn), similaires quel que soit le temps de maintien sous pression. La série "Jet"
correspond à un traitement en continu, où l'élévation de pression est réalisée par une
pompe haute pression et la détente dans l'air par une buse en saphir percée d'un orifice
de 45 µm de diamètre (La Découpe, France) (VITRAC 1995). Ce traitement équivaut à
une augmentation et une diminution de pression extrêmement rapides (inférieure à une
seconde) et un temps de maintien sous pression d'une vingtaine de secondes, les effets
secondaires dynamiques de la détente brutale (échauffements, impact, cisaillement)
ont été réduits lors de cette expérience.
Les traitements décrits par les deux premières séries ("Jet" et "0 mn") bien qu'ils
impliquent tous les deux un temps de séjour sous pression réduit, incluent des durées
d'élévation de pression et de détente différentes (respectivement quelques secondes et
3 mn + 1 mn) et surtout utilisent des techniques distinctes.
Les résultats de la Figure 22 montrent une liaison directe entre la viabilité et le
temps de séjour sous pression, un temps de séjour réduit étant peu destructeur
au moins jusqu'à 250 MPa. Alors que la pression s'applique instantanément et
uniformément à tout le système, l'inactivation microbienne induite par ce
traitement est fonction du temps et n'affecte pas également tous les individus.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 119
Le logarithme de la destruction et le temps de maintien sont fortement liés sur
l'intervalle de temps considéré (0-15 mn). Un maintien d'environ 3 mn à
250 MPa est nécessaire pour diviser la population par 10. Par contre, au-delà de
15 mn, le taux de destruction augmente beaucoup moins vite et une destruction
complète (réduction décimale > 10) nécessite un temps de maintien sous
pression prolongé. Quatre heures à 200 MPa sont nécessaires pour détruire
totalement une culture de Saccharomyces cerevisiae (BUTZ et LUDWIG 1986).
Ces résultats sur la cinétique d'inactivation sont comparables à ceux obtenus sur
Saccharomyces cerevisiae (EARNSHAW 1995) ou sur Rhodotorula rubra (KNORR
1995).
Dans ces deux premières séries d'expérimentations, le milieu dans lequel sont traitées
les levures est celui utilisé pour la culture cellulaire. Or de nombreux auteurs ont mis
en évidence l'importance du milieu sur la résistance des levures à haute pression.

120 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2 Effet du milieu sur la barorésistance des levures
Les caractéristiques du milieu dans lequel se trouvent les levures ont une influence
déterminante sur la survie des microorganismes à un stress et particulièrement lors
d'un traitement haute pression.
L'influence de la variation de deux propriétés importantes a été examinée :
 modification de l'activité de l'eau par ajout de solutés osmotiquement actifs,
 modification du pH du milieu par addition d'acides faibles ou forts.

B.2.1 Effet des solutés et de l'activité de l'eau du milieu sur la barorésistance des
levures
De nombreux auteurs ont mis en évidence le rôle d'adjonction de soluté dans le milieu
pour protéger les cellules traitées sous haute pression (HAYAKAWA et al. 1992;
TAKAHASHI 1992; OXEN et KNORR 1993).
Afin de vérifier ce phénomène, trois solutés sélectionnés en fonction de leur rôle
spécifique et de leur compatibilité avec la croissance cellulaire ont été utilisés :
 le glycérol, synthétisé en grande quantité par les levures lors de chocs osmotiques
(GERVAIS et al. 1992), son passage à travers la membrane peut se faire de façon
passive. Son action protectrice vis-à-vis de la dénaturation des protéines est
reconnue aussi bien pour la dénaturation thermique (GEKKO et TIMASHEFF 1981)
que pour celle obtenue par haute pression (OLIVEIRA et al. 1994),
 le sorbitol est un composé non toxique pour la cellule. Il ne pénètre pas dans les
cellules de levures (NIEDERMEYER et al. 1977),
 le fructose possède un coefficient osmotique élevé et une solubilité importante
(GERVAIS et al. 1988).
L'influence sur la viabilité des levures de l'addition de ces trois solutés à de fortes
concentrations dans le milieu a été étudiée précédemment à pression atmosphérique
(MARECHAL et GERVAIS 1995a). Les concentrations en solutés ont d'ailleurs été
choisies non létales en référence à ces travaux.
Des levures en phase stationnaire ont été mises en suspension dans des milieux
binaires contenant une quantité variable des trois solutés choisis. Ces différents
échantillons ont été traités pendant 15 mn à 270 MPa ou 320 MPa.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 121
Figure 23 : Effet de l'addition de différents solutés sur la viabilité de Saccharomyces
cerevisiae à deux niveaux de pression 270 et 320 MPa appliqués durant 15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.
Figure 24 : Effet de l'activité de l'eau du milieu sur la viabilité de Saccharomyces cerevisiae à
deux niveaux de pression (270 et 320 MPa) appliqués durant 15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.

122 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2.1.1 Effet des solutés sur la résistance des levures
Les taux de viabilité obtenus par UFC en fonction des différents milieux sont
représentés sur la Figure 23. Cette expérience montre clairement que l'addition
de soluté augmente la viabilité cellulaire, quel que soit le soluté. Pour obtenir
un niveau de destruction similaire, le traitement de microorganismes dans un
milieu concentré exige donc un niveau de pression plus élevé ou un temps de
traitement plus long. L'addition de 15 g de glycérol, 20 g de sorbitol ou 30 g de
fructose à 100 g d'eau réduit l'efficacité d'un traitement à 320 MPa au niveau
obtenu à 270 MPa avec de l'eau seule.
D'autres mesures, à une pression de 400 MPa, ont montré une viabilité
supérieure à 50 % dans un milieu binaire contenant 75 g de fructose pour 100 g
d'eau. A concentration égale le glycérol est le plus baroprotecteur,
contrairement à certaines données bibliographiques (TIMSON et SHORT 1965). Il
a aussi le plus faible poids moléculaire, l'effet du soluté serait donc plutôt lié à
sa fraction molaire.

B.2.1.2 Effet d'une diminution de l'activité de l'eau sur la résistance des levures
L'ajout d'un soluté permet de diminuer l'activité de l'eau du milieu suivant la
concentration molaire et le coefficient osmotique du soluté considéré. A pression
atmosphérique, l'activité de l'eau a une grande importance sur le métabolisme des
microorganismes (GERVAIS 1990). Il est donc intéressant de vérifier si la modification
de cette propriété n'est pas responsable de la baroprotection des levures.
La Figure 24 représente la viabilité cellulaire de levures soumises à un
traitement haute pression en fonction de l'activité de l'eau du milieu. En fait, les
résultats précédents obtenus avec trois solutés et deux niveaux de pression
différents ont été représentés en fonction de cette propriété du milieu. Cette
représentation fait apparaître une liaison linéaire entre l'activité de l'eau du
milieu et la viabilité finale pour un niveau de pression donné. Une diminution
de 0,045 unité d'activité de l'eau, ce qui revient à une augmentation de pression
osmotique d'environ 5 MPa, compense une élévation de 50 MPa de pression
hydrostatique dans la gamme de pression étudiée.
OXEN et KNORR obtiennent des résultats comparables avec la levure Rhodotorula
rubra et d'autres solutés (NaCl, saccharose) (OXEN et KNORR 1993). Dans ces travaux,
les auteurs postulent que l'aw du milieu augmente la barorésistance de la levure
uniquement lorsque la croissance cellulaire est inhibée par ce potentiel hydrique à
pression atmosphérique. Saccharomyces cerevisiae est capable de se développer à une
aw de 0,92 (MARECHAL 1992). Les résultats obtenus ici concernant l'action de l'aw sur

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 123
la barorésistance de Saccharomyces cerevisiae, montrent cependant qu'un effet
significatif est obtenu pour des activités de l'eau supérieures à 0,92.

Les mécanismes de protection cellulaire induits par la diminution de l'a w restent


hypothétiques. Cependant, la variation de l'activité de l'eau du milieu comme celle
d'autres paramètres physico-chimiques déclenche chez la cellule un ensemble de
réactions métaboliques dont la synthèse de protéines spécifiques type HSP (Heat
Shock Protein). La synthèse de ces protéines a été mise en évidence aussi bien pour un
choc thermique que pour un choc hydrique (LEWIS et al. 1995) et même pour une
variation modérée de la pression hydrostatique (WELCH et al. 1993). Ces réactions
consécutives à un stress non létal semblent protéger la cellule d'une perturbation plus
importante ; un choc modéré de température protège par exemple d'un traitement haute
pression (IWAHASHI et al. 1991).

De même, les modifications membranaires induites par une pression osmotique élevée
à pression atmosphérique (TUNBLAD-JOHANSSON et ADLER 1987) pourraient protéger
la cellule des effets des hautes pressions. Certains solutés sont capables à pression
atmosphérique de prévenir une dénaturation de la bicouche lipidique ainsi qu'une
fusion des lipides membranaires (ARAKAWA et TIMASHEFF 1982; STRAUSS et al.
1986).
L'addition de soluté stabilise les biomolécules et atténue la dénaturation par haute
pression (DUMAY et al. 1994; OLIVEIRA et al. 1994).

Ces résultats confirment donc l'importance de l'activité de l'eau dans l'inactivation des
levures par haute pression. La forte protection conférée par la diminution d'aw signifie
que l'aw et la pression hydrostatique agissent de façon opposée sur les mêmes cibles
cellulaires.

124 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
B.2.2 Effet du pH du milieu sur la viabilité des levures
L'influence du pH du milieu sur la barotolérance des microorganismes est très
importante chez les bactéries (KAJIYAMA et al. 1993; MACKEY et al. 1995). Par contre
chez les levures, naturellement résistantes aux milieux acides, l'effet est plus modéré et
des pH inférieurs à 3 sont nécessaires pour accroître l'inactivation cellulaire (OXEN et
KNORR 1993; PANDYA et al. 1995).
Afin de vérifier l'effet du pH sur la barotolérance des levures, un même traitement
(250 MPa/15 mn) a été appliqué dans différents milieux : eau distillée (5,8), milieu de
culture (4,5), solutions aqueuses d'acide phosphorique, d'acide acétique et d'acide
chlorhydrique.

L'acide chlorhydrique est totalement dissocié dans l'eau et la pression fait donc peu
varier le pH de la solution ; par contre les acides acétique et chlorhydrique sont des
acides faibles et ne sont pas complètement dissociés dans l'eau aux pH utilisés.
L'augmentation de la pression modifie leur équilibre de dissociation, entraînant une
légère diminution du pH (cf. § A.3.2.1 p. 26).
Cette variation de pH à 250 MPa peut être calculée à partir de l'équation ( 42 ) (p. 28)
et des valeurs du Tableau 3 (p.31) :
 -0,16 à pH 4 et -0.23 à pH 3 pour l'acide acétique,
 -0,005 à pH 4 et -0.05 à pH 3 pour l'acide phosphorique.

Les viabilités sont estimées par rapport à un témoin maintenu au même pH à pression
atmosphérique. Pour tous les témoins et donc pour la gamme de pH retenue aucune
variation de viabilité de Saccharomyces cerevisiae n'a été observée.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 125
Figure 25 : Effet de l'abaissement du pH du milieu sur la viabilité de Saccharomyces
cerevisiae après un traitement de 250 MPa/15 mn.
Erreur ! Liaison incorrecte.

126 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Les résultats présentés sur la Figure 25 confirment que, pour un pH supérieur
ou égal à 4, l'acidité du milieu n'a pas d'influence sur la viabilité de
Saccharomyces cerevisiae lorsqu'il est maintenu à 250 MPa pendant 15 mn. Par
contre à pH 3, la présence d'acide acétique entraîne un effet destructeur
important alors que les deux autres acides restent inefficaces.

L'action spécifique de l'acide acétique peut certes être due à la variation de pH, plus
importante sous pression. Mais surtout, la forme non dissociée de l'acide acétique est
majoritaire à pH 3 (environ 95 %), du fait d'une constante de dissociation (pKa = 4,2)
supérieure au pH, contrairement à l'acide phosphorique (pKa = 2,2). Or, une substance
de faible poids moléculaire pénètre passivement dans les cellules d'autant plus
facilement qu'elle ne porte aucune charge. A ce pH, l'acide acétique sous sa forme non
dissociée pénètre donc plus facilement dans le milieu intracellulaire. Le cytosol ayant
un pH plus élevé que le milieu, cet acide a tendance à se dissocier et à abaisser
localement le pH lorsqu'il a pénétré dans la cellule. Sous pression, l'acidification
intracellulaire s'accentue par une dissociation supplémentaire de l'acide acétique, mais
aussi par l'inactivation des systèmes de régulation cellulaire du pH, notamment les
systèmes ATPasiques (DE SMEDT et al. 1979; DREYFUS et al. 1988). Cette
acidification du milieu intracellulaire peut agir en conjonction avec la pression pour
modifier les structures cellulaires. A 20°C, la myoglobine, par exemple, est
majoritairement dénaturée à 400 MPa dans un milieu à pH 6 alors que 150 MPa
suffisent dans un milieu à pH 4 (WEBER et DRICKAMER 1983).

Ces expériences montrent que les levures sont peu sensibles à l'acidification du milieu
jusqu'à un pH 3, il n'y a pas d'effet conjugué de la pression et du pH du milieu
extérieur. Par contre, une acidification du milieu intracellulaire favorise l'inactivation
cellulaire par haute pression.
La différence de pH entre le milieu et l'eau distillée n'induit pas de différence
significative sur la viabilité des levures après un traitement haute pression.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 127
Conclusion des expériences préliminaires
Ces expériences ont permis de définir l'influence du traitement et du milieu sur la
viabilité de levures. Pour observer sous pression à la fois des cellules mortes et des
cellules viables à la fin du traitement, les conditions suivantes ont été retenues à partir
des résultats préliminaires :
 niveau de pression : 250 MPa,
 temps de traitement : 15 mn,
 milieu de pressurisation : eau (pH = 6, aw  1) ou milieu de culture cellulaire
(pH = 4,5, aw = 0,997).
Ces expérimentations ont permis de préciser les conséquences sur la viabilité des
levures induites par des variations physico-chimiques du milieu (pH, aw) et de
présenter quelques hypothèses concernant l'inactivation cellulaire par haute pression.
L'augmentation de température due à l'élévation de la pression est négligeable sur le
matériel expérimental, du fait de la vitesse de pressurisation modérée et de la faible
section des tuyauteries qui permet un échange thermique efficace avec l'extérieur.

128 ÉTUDE PRELIMINAIRE SUR LA VIABILITE DES LEVURES SOUMISES A UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C Évolution du volume de cellules et de
liposomes au cours d'un traitement haute
pression
La variation du volume cellulaire constitue une variable particulièrement intéressante
pour appréhender l'équilibre thermodynamique de la cellule : les transferts de masses
induits, les modifications des équilibres physico-chimiques des cellules ou la
compression de la cellule.

Des études ont montré que ce volume pouvait varier chez Saccharomyces cerevisiae
de 110 à 40 % lors d'un stress hydrique à pression atmosphérique (MARECHAL 1992).
Dans ce cas la variation de volume est étroitement liée à des transferts d'eau. Des
travaux complémentaires ont montré que la cinétique de variation de volume, lors d'un
choc osmotique, est même directement liée à la viabilité cellulaire résultante
(MARECHAL et GERVAIS 1995a).

Les travaux sur les hautes pressions prenant en compte les variations du volume
cellulaire sont peu nombreux. Une étude a estimé la variation de volume cellulaire
d'Escherichia coli par perméabilisation chimique (EDTA) et mesure du relargage d'un
composé marqué suite à la compression de la cellule. Avec cette technique, POLLARD
et WELLER obtiennent une diminution de 17,5 % à 200 MPa (POLLARD et WELLER
1966). Cependant la technique est fortement critiquable : seule la différence de
compression entre la paroi cellulaire et le milieu intracellulaire peut être prise en
compte et dans ce cas la mesure semble donc excessive.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 129
La cellule de visualisation développée permet de suivre le volume cellulaire par
microscopie en continu avec une précision raisonnable (cf. § A p.108). Cette approche
originale a été effectuée principalement sur les deux levures Saccharomyces cerevisiae
et Saccharomycopsis fibuligera. Cependant, afin de confirmer les hypothèses
avancées, deux autres modèles ont été étudiés :
 des cellules sanguines humaines (K562),
 des liposomes, qui permettent de modéliser les éventuelles variations d'une
bicouche lipidique.

C.1 Analyse du volume cellulaire de levures


Leur taille et le contraste de leur paroi fait des levures un matériel intéressant pour des
études microscopiques. De plus, les mécanismes métaboliques et physiologiques de
Saccharomyces cerevisiae sont bien connus.

La réaction morphologique de cette levure suite à différents stress (osmotique,


température) a été suivie au laboratoire de Génies des Procédés Alimentaires et
Biotechnologiques de l'ENSBANA avec une méthodologie similaire à celle utilisée
dans cette étude (BERNER et GERVAIS 1994b; GERVAIS et MARTINEZ DE MARANON
1995).
La description exhaustive et exacte du comportement volumique des levures a
nécessité deux types de mesures de volume :
 des mesures de cellules individualisées : l'évolution des mêmes cellules est suivie
pendant la totalité du traitement ("film"). Si elle permet une description complète
des phénomènes, cette mesure est peu représentative de l'évolution de la
population,
 des mesures sur population : un échantillon significatif de cellules est analysé à
différents moments du traitement ("photographie") afin d'estimer la distribution du
volume de la population. Cette méthode donne une évolution partielle mais
significative des phénomènes.

130 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1 Variations du volume cellulaire de cellules fixées
Les variations du volume de cellules individualisées lors d'un traitement haute
pression ont été étudiées progressivement, en trois temps :
 la variation du volume cellulaire en fonction de la vitesse d'élévation de la pression,
 les variations de volume provoquées par l'élévation de la pression et la détente au
cours d'un traitement haute pression,
 la cinétique de variation de volume lors du maintien sous pression.

C.1.1.1 Variation du volume cellulaire lors de l'élévation de la pression.


Dans un premier temps, seule la variation de volume provoquée par l'élévation de la
pression a été prise en compte, afin de mettre en évidence une liaison entre le volume
cellulaire et le niveau de pression. Par analogie avec les travaux effectués sur les chocs
et rampes de pression osmotique (GERVAIS et al. 1992), différentes cinétiques
d'augmentation de pression ont été utilisées. Ces expériences ont été effectuées sur
Saccharomyces cerevisiae avec un objectif Nachet APO 20 x 0,30 GL 20x. De
nombreuses répétitions ont été nécessaires pour pallier la faible précision du système
utilisé.

Les différentes cinétiques de variation de pression sont les suivantes :


 une cinétique rapide : 100 MPa en 4 s environ, la saisie est effectuée
automatiquement, aucune focalisation n'est possible,
 une cinétique plus lente : montée progressive de 100 MPa en 3 mn environ. Une
mise au point est effectuée avant chaque acquisition manuelle,
 une cinétique par paliers : la pressurisation se fait par paliers de 50 MPa durant
2 mn, ce qui permet la prise de trois images régulièrement espacées.

PARTIE I : MESURE DES VARIAT IONS DU VOLUME CELLU LAIRE SOUS HAUTES PR ESSIONS 131
Figure 26 : Variations moyennes du volume de cellules de Saccharomyces cerevisiae fixées,
au cours d'une augmentation de pression jusqu'à 400 MPa à différentes vitesses.
Les barres d'erreurs représentent l'intervalle de confiance à 95 %.

Montée en escalier (paliers de 2 mn/ 50 MPa)


Montée lente (0,5 MPa/s)
Montée rapide (25 MPa/s)
0%

0%
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)

0%

0%

0%

0%

0%
0 100
Pression (MPa)

Figure 27 : Variations du volume moyen de cellules de Saccharomycopsis fibuligera fixées,


pendant un cycle de pression de 250 MPa / 15 mn.

132 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CEL LULES ET DE LIPOSOME S AU COURS D'UN TRAI TEMENT HAUTE PRESSION
105%

100% Pressurisation

95%

90%
Volume cellulaire relatif

Maintien en
(% du volume initial)

pression
85% 250 MPa/15
minutes
Dépressurisation
80%

75%

70%

65%

60%
0 100 200
Pression (MPa)

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULAIRE SOUS HAUTES PRESSIONS 133
Les résultats présentés Figure 26 montrent l'évolution du volume cellulaire en
fonction de la pression. Une contraction similaire est obtenue quelle que soit la
cinétique utilisée. Cette diminution de volume, d'environ 10 % à 200 MPa et
15 % à 400 MPa, est proche de la compression théorique du milieu (eau), soit
7 % à 200 MPa et 11,4 % à 400 MPa (MAKITA 1992). La variation de volume
cellulaire induite par l'augmentation de pression est donc indépendante de la
cinétique d'élévation de pression, tout au moins dans la gamme utilisée et pour
la levure étudiée.

C.1.1.2 Variation du volume cellulaire lors d'un cycle de pression


L'étude des variations du volume cellulaire lors d'un cycle complet de pressurisation a
été effectuée sur Saccharomycopsis fibuligera qui est une levure plus grosse et plus
contrastée que Saccharomyces cerevisiae. Un système optique plus performant a aussi
été utilisé (cf. § A.1.4.2 p. 83).
La Figure 27 représente la variation de volume moyen de cellules de
Saccharomycopsis fibuligera pendant un cycle de pression à 250 MPa. La
diminution de volume (12 %) obtenue pendant l'élévation de la pression est
comparable à celle obtenue avec Saccharomyces cerevisiae et serait donc à
rapprocher de la compression du milieu. Par contre, durant un séjour de 15 mn
sous pression, une diminution supplémentaire du volume moyen d'environ 15 %
est constatée. Cette diminution est identifiable sur les images de projection des
cellules (cf. Figure 28).
Par contre, lors de la détente, l'évolution du volume est comparable à celle
obtenue pendant l'élévation initiale de la pression. A pression atmosphérique,
une différence de 12 % entre les volumes cellulaires moyens initial et final est
enregistrée ; elle correspond globalement à la diminution de volume obtenue
pendant le séjour à 250 MPa. L'observation prolongée des mêmes cellules
montre que cette variation est irréversible.

Si l'on considère la cellule comme un système thermodynamique ouvert, sa variation


de volume est donnée par la relation ( 17 ), qui pour une opération isotherme se
simplifie :
dV V
   T dP   i dni ( 58 )
V i V

Cette relation fait apparaître deux termes :


 un terme de compression (TdP),
 un terme de transfert de masse ((Vi/V)dni). Ce terme rend aussi compte des
variations de volumes dues aux réactions chimiques sises dans la cellule. Ces
variations sont relativement faibles par rapport au volume des réactants, la

134 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COU RS D'UN TRAITEMENT H AUTE PRESSION
dénaturation protéique par exemple implique une variation moyenne
d'environ - 0,2 % (LÜDEMANN 1988). Elles seront donc négligées par la suite.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME C ELLULAIRE SOUS HAUTE S PRESSIONS 135
Figure 28 : Images de cellules de Saccharomycopsis fibuligera suite à une élévation et un
maintien en pression.
Une ligne rouge délimite la surface prise en compte par l'analyse d'image.

A - Image avant traitement.

B - Image des mêmes levures à 250 MPa après 15 mn.

136 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPO SOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Durant la montée et la descente en pression, si l'on suppose la compressibilité
cellulaire proche de celle du milieu, le terme de compression semble dominant et les
transferts réduits. Par contre, pendant le maintien en pression, la variation de la
pression est nulle (dP = 0) ; la variation de volume ne peut alors s'expliquer que par
une sortie de matière de la cellule (eau et/ou soluté).

La majorité du volume cellulaire étant constitué d'eau (plus de 90 % du volume non-


osmotique), cette diminution correspond essentiellement à une sortie d'eau si l'on
suppose a priori qu'il n'y a pas de sortie importante de matériel cellulaire (membranes,
vacuoles, mitochondries).

La pression, en induisant un transfert de masse, a donc modifié l'équilibre physico-


chimique de la cellule. Les différentes hypothèses permettant d'expliquer cette
variation de volume (perméabilisation de la membrane, modification de l'équilibre
osmotique) seront abordées dans la partie suivante (cf. Discussion p. 170).

C.1.1.3 Cinétique de variation de volume à pression constante et relation avec la viabilité


cellulaire
Les expériences précédentes ayant mis en évidence une variation de volume pendant
le temps de maintien sous pression, une analyse plus précise de la cinétique de cette
diminution de volume a été réalisée. De plus, l'injection d'un colorant vital après retour
à pression atmosphérique a permis d'identifier les cellules inactivées par le traitement
et donc de distinguer leurs évolutions.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 137
Figure 29 : Cinétique de variation du volume moyen de cellules de Saccharomycopsis
fibuligera fixées, pendant un cycle de pression de 250 MPa/15 mn.

Cellules viables après traitement


Cellules inactivées après traitement
Moyenne de l'échantillon
Poly. (Cellules inactivées après traitement)

100%
250
90%
200
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)

80%

Pression (MPa)
150
70%

100
60%

50% 50

40% 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Temps (minutes)

Figure 30 : Cinétique de variation du volume de cellules individualisées de Saccharomycopsis


fibuligera, pendant un cycle de pression de 250 MPa/15 mn.

Cellules viables après traitement Cellules inactivées après traitement


Pression
120%
250
100%
Volume cellulaire relatif

200
(% du volume initial)

80%
Pression (MPa)

150
60%

100
40%

20% 50

0% 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Temps (minutes)

138 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1.3.1 Évolution du volume moyen des cellules en fonction de la viabilité
La Figure 29 présente les variations du volume moyen des cellules de
Saccharomycopsis fibuligera pendant un traitement haute pression en fonction
du temps. Les volumes moyens des deux sous-ensembles identifiés après retour
à pression atmosphérique sont aussi calculés : les cellules viables, non teintées
par la coloration et celles inactivées qui, elles, sont perméables au colorant.

Lors de l'élévation de la pression, ces courbes présentent la même diminution


initiale de volume de 10 % attribuée précédemment à la compression du milieu
cellulaire (cytosol et membranes). Durant le maintien en pression, la diminution
progressive du volume moyen est de 20 %. Elle provient presque exclusivement
de l'ensemble des cellules inactivées. En effet, le volume moyen de cette sous-
population diminue de 30 %, variation qui vient s'ajouter à la compression
initiale de 10 %, les cellules viables ne diminuant pas ou très peu (5 %). Lors du
retour à pression atmosphérique, une légère augmentation de volume (5 à 7 %)
est constatée, sensiblement inférieure à la contraction initiale durant l'élévation
de pression.

C.1.1.3.2 Évolution du volume de cellules individualisées


Si les cellules d'une expérience sont considérées comme sur la Figure 30,
individuellement et non plus en moyenne, les cinétiques de variations de
volume obtenues sont très dispersées, notamment pour les cellules identifiées
comme inactivées par le traitement. Leur volume à la fin du temps de maintien
sous pression s'étale, sauf exception, de 40 à 80 %, alors que les cellules viables
restent entre 90 et 100 %.

Une contraction du volume cellulaire de 60 % correspond, en enlevant la compression,


à un transfert de masse de 55 % du volume intracellulaire. Ce chiffre est très proche du
volume non-osmotique (GERVAIS et MARECHAL 1992), défini comme le volume
cellulaire n'intervenant pas dans les transferts osmotiques et comprenant les structures
de grand encombrement stérique (organites, acides nucléiques, protéines) ainsi que les
molécules qui leur sont liées (eau constitutive).

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULA IRE SOUS HAUTES PRESSIONS 139
Figure 31: Cinétiques de variation du volume moyen de cellules de Saccharomycopsis
fibuligera lors d'un second cycle de pression à 250 MPa/15 mn.

Cellules viables après le traitement 2


Cellules viables après le traitement 1, inactivées après le traitement 2
Cellules inactivées après le traitement 1
Pression

110%
250
100%
Volume cellulaire relatif

90% 200
(% du volume initial)

Pression (MPa)

80% 150

70%
100
60%
50
50%

40% 0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (minutes)

140 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.1.3.3 Évolution du volume moyen lors d'un second cycle de traitement
Un cycle supplémentaire de pression, effectué sur les mêmes cellules, a permis
de vérifier l'action de la pression sur le volume des levures inactivées. Les
variations observées sont présentées Figure 31, où elles sont réparties en trois
ensembles : les cellules viables, les cellules viables avant et inactivées après le
second traitement et les cellules mortes avant le traitement. Pour les deux
premières populations, la cinétique de variation de volume est conforme à celle
obtenue lors du premier cycle. Les cellules inactivées, par contre, ne subissent
pas de variations de volume, si ce n'est une légère diminution initiale du volume
attribuée à la compression.

C.1.1.3.4 Analyses de résultats de cinétique de variation de volume sur cellules fixées


Un cycle de pression induit donc un transfert de masse irréversible sur une partie des
cellules de levure. Ce transfert est en relation avec l'inactivation cellulaire. La mesure
de la viabilité ne pouvant s'effectuer en continu, il est difficile de déterminer la
chronologie des phénomènes. Cependant, les expérimentations présentées Figure 22
(p. 118) montrent que la mortalité des levures dépend fortement du temps de maintien
sous pression. La majorité des cellules mortes à la fin du traitement étaient donc
encore viables après l'élévation de la pression. Pourtant il semble, d'après la Figure 30
(p. 138) que toutes ces cellules diminuent de volume dès le début du maintien en
pression. La liaison entre la diminution de volume et la viabilité semble plus complexe
qu'une simple relation de cause à effet.

Conclusion
Ces résultats montrent une variation du volume cellulaire des levures, une partie
(10 %), due à la compression, est réversible, l'autre partie (de 0 à 50 %) est en relation
avec l'inactivation des levures et est irréversible. Cependant, même si ces expériences
ont l'avantage de suivre chaque cellule individuellement durant l'ensemble du
traitement, elles sont réalisées sur de très faibles échantillons (moins de 50 individus).
C'est pourquoi une vérification des conclusions obtenues sur cellules fixées a été
effectuée sur un échantillonnage significatif de la population.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 141
Figure 32 : Évolution du volume de la population de Saccharomycopsis fibuligera pendant un
traitement à 250 MPa/15 mn.

Population initiale
Population à 250 MPa après 15 mn
Population après traitement
20%
(% de la population échantillonnée)

18%
16%
14%
12%
10%
Fréquence

8%
6%
4%
2%
0%

Classes de volumes de S. fibuligera (m3)

142 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.2 Variations du volume cellulaire d'une population microbienne
L'échantillonnage de la population de levures a tout d'abord été effectué aux moments
clés du traitement observés (cf. Figure 27) :
 avant traitement,
 après 15 mn à 250 MPa,
 après traitement.
La relation entre volume et viabilité a ensuite été vérifiée à pression atmosphérique en
comparant les distributions avant et après traitement. Les modifications des conditions
de traitement ont enfin permis de confirmer cette relation.

C.1.2.1 Variations de volume cellulaire d'une population de Saccharomycopsis fibuligera


réalisé par échantillonnage
Un échantillonnage de plus de 1000 cellules est réalisé par analyse d'images à chaque
mesure. Il permet d'établir une distribution de la population et d'obtenir un intervalle
de confiance fiable sur le volume moyen de la population. Cependant, ce dispositif ne
permet pas de suivre les mêmes cellules pendant le traitement et le temps de mesure
(plusieurs minutes) interdit tout suivi de cinétique.

La Figure 32 représente l'évolution de la répartition des volumes de la


population de Saccharomycopsis fibuligera selon le mode de représentation
défini au § F.1.2 p.102. Cette population étant utilisée en phase stationnaire, la
répartition obtenue est de type gaussien. Le déplacement constaté entre la
population initiale et la population à 250 MPa a été ajusté à un déplacement de
classe, soit un facteur f de 1,5 (cf. relation ( 56 ) p. 103) ou une diminution de
volume de 35 %. De retour à pression atmosphérique, la diminution persiste et
même s'accentue. La forme de la distribution évolue peu, il ne semble donc pas
y avoir de classes de volume préférablement atteintes.

La forte diminution de volume obtenue entre la population initiale et les


populations finales sous pression et à pression atmosphérique confirme les
résultats observés sur cellules fixées. La contraction moyenne, à 250 MPa après
15 mn de maintien, est identique à celle obtenue sur des cellules fixées dans les
mêmes conditions (cf. Figure 27 p. 132). Par contre, le volume moyen de la
population diminue après retour à pression atmosphérique contrairement aux
cellules fixées.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 143
Figure 33 : Évolution du volume cellulaire de la population de Saccharomycopsis fibuligera
avant et après un traitement à 250 MPa/15 mn en fonction de la viabilité finale.

Population initiale viable


Population finale : cellules viables
Population finale : cellules inactivées
22%
20%
(% de la population échantillonnée)

18%
16%
14%
12%
10%
Fréquence

8%
6%
4%
2%
0%
5 12 34 92 250 678
Classes de volumes de S. fibuligera (m3)

144 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Cette expérience confirme donc la diminution irréversible du volume de levures après
un traitement de 250 MPa/15 mn. Cependant la Figure 29 montre, sur cellules fixées,
une rétraction est essentiellement due aux cellules inactivées, ce qui n'apparaît pas sur
la distribution finale observée : la population n'est pas bimodale.

C.1.2.2 Variations du volume cellulaire d'une population de Saccharomycopsis fibuligera


en fonction de la viabilité finale
Afin de confirmer la relation entre le volume cellulaire final et la viabilité, des
échantillonnages ont été réalisés avant et après traitement. L'ajout d'un colorant vital a
permis de distinguer à pression atmosphérique les cellules viables des cellules
inactivées.

Les distributions obtenues sont représentées sur l'histogramme de la Figure 33.


La population initiale des cellules mortes ne figure pas car elle représente moins
de 1 % de la population initiale totale. Les variations de volume obtenues sur
chaque sous-population finale sont bien distinctes. En considérant que la
population initiale est affectée par la pression de façon uniforme, la distribution
de la population viable est déplacée d'une classe, soit une diminution de volume
d'environ 26 %, alors que la population inactivée diminue beaucoup plus,
environ 42 %.

Ces résultats confirment donc la relation entre viabilité et diminution de volume final
mise en évidence sur les cellules fixées (cf. § C.1.1.3.C.1.1.3.4 p. 141). Les variations
obtenues pour chaque sous-population sont cependant différentes pour chaque
protocole. La rétraction des cellules viables apparaît plus importante par
échantillonnage de la population. Cet écart peut être dû à la méthode de détection de
viabilité (automatique pour la population), mais aussi au fait que seules quelques
cellules particulières sont choisies lors d'un suivi individualisé de volume.
Le volume moyen obtenu par échantillonnage constitue une valeur plus représentative
des phénomènes affectant l'ensemble de la population.
La variation du volume cellulaire moyen ainsi obtenue peut être pour les levures un
indicateur de l'efficacité d'inactivation du traitement haute pression.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS HAUTES PRESSIONS 145
Figure 34 : Évolution du volume cellulaire moyen final de Saccharomycopsis fibuligera en
fonction du niveau de pression et du temps de séjour.

Volume final pour 200 MPa Volume final pour 250MPa


Volume final pour 300MPa Viabilité pour 200MPa
Viabilité pour 250MPa Viabilité pour 300 MPa

110% 120%

(% de cellules viables par rapport au témoin)


100% 100%
Volume cellulaire final moyen

Viabilité cellulaire (UFC)


(% du volume initial)

90% 80%

80% 60%

70% 40%

60% 20%

50% 0%
Témoin 0 2,5 5 7,5 10 15
Temps à la pression nominale (minutes)

Tableau 10 : Variations du volume cellulaire moyen de Saccharomycopsis fibuligera après un


traitement de 200 MPa pendant 15 mn en fonction de l'aw du milieu de culture.
(HAYERT, 1994)

Milieu de culture et de pressurisation Volume final moyen


Milieu de culture (aw = 0.997) 65,5 %
Milieu de culture avec sorbitol (aw = 0.950) 82,9 %
Milieu de culture avec sorbitol (aw = 0.930) 88,4 %

146 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.1.2.3 Évolution du volume cellulaire final moyen suivant les conditions de traitement
Afin de vérifier la relation viabilité-volume, des mesures du volume de populations
après différents traitements ont été réalisées. Seule la moyenne a été représentée car
les expériences précédentes montrent que toutes les classes de volume sont affectées
de la même façon. L'évolution de la moyenne constitue donc une bonne estimation de
la diminution de volume de la population.
L'influence sur le volume cellulaire de deux facteurs étudiés ci-dessus (cf. § B.B.1
p. 115 et § B.2.B.2.1 p. 121) a été successivement mesurée.

C.1.2.3.1 Évolution du volume cellulaire moyen final en fonction du temps sous pression
La Figure 34 montre l'évolution du volume final moyen des cellules de
Saccharomyces cerevisiae en fonction du temps sous pression.
La diminution du volume final est bien corrélée à la perte de viabilité des
levures provoquée par l'augmentation du temps de maintien en pression. En
négligeant la variation de volume des cellules viables, le volume des cellules
mortes peut être calculé à partir du volume moyen de la population. La
contraction ainsi obtenue est d'environ 25 % quel que soit le traitement
considéré.
Ce calcul confirme donc que les variations des volumes moyens observées sur
l'ensemble d'une population sont dues à l'augmentation de l'inactivation cellulaire.

C.1.2.3.2 Évolution du volume cellulaire moyen final en fonction de l'aw du milieu


Des mesures du volume moyen ont été effectuées avant et après traitement sur une
population de cellules de Saccharomyces cerevisiae mises en suspension dans un
milieu binaire d'eau et de sorbitol à aw réduite à pression atmosphérique.
Les résultats transcrits sur le Tableau 10 révèlent une augmentation du volume
moyen lorsque l'aw diminue. Or, la viabilité augmente lorsque l'aw du milieu
diminue (cf. Figure 24 p. 122). Ces dernières observations confirment encore la
liaison entre le volume moyen final et la viabilité.

Ces expériences mettent en évidence qu'une augmentation de la mortalité cellulaire


des levures résultant de différentes conditions de traitement haute pression, induit une
diminution du volume moyen de la population. Ce phénomène peut être attribué à la
contraction d'environ 30 % des cellules inactivées.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 147
Conclusion

L'ensemble de ces expérimentations sur les levures permet de caractériser le


comportement volumique des cellules lors d'un traitement à 250 MPa pendant 15 mn :
 une contraction initiale en fonction de la pression appliquée est attribuée à la
compaction moléculaire des différents composants de la cellule. Cette diminution
de volume est réversible, le retour à pression atmosphérique entraînant une
augmentation de volume sensiblement équivalente,
 une diminution du volume moyen se produisant principalement pendant le temps de
maintien sous pression et persistant après retour à pression atmosphérique. Il existe
une relation étroite entre cette variation de volume irréversible et la viabilité des
levures, relation confirmée par des traitements induisant différents taux de
mortalité.

L'interprétation de ces variations de volume, en relation avec les hypothèses formulées


dans la bibliographie, devrait permettre de mieux comprendre les phénomènes à
l'origine de l'inactivation cellulaire.
Afin de confirmer les transferts observés sur les levures et de vérifier la relation avec
la viabilité, une analyse de l'évolution du volume sous pression a été réalisée sur des
cellules vivantes très différentes puisque issues d'un organisme pluricellulaire : des
cellules sanguines humaines.

148 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COU RS D'UN TRAITEMENT H AUTE PRESSION
C.2 Analyse du volume cellulaire de cellules humaines sanguines
Les expériences ont été réalisées sur des cellules sanguines humaines issues de
tumeurs (lignée K562). Ces cellules ont l’avantage de se cultiver facilement et d’être
relativement résistantes aux facteurs externes. Elles constituent de plus un matériel
intéressant pour l’étude microscopique, du fait de leur taille comprise entre 10 et
20 µm de diamètre.

Le protocole retenu pour ces expérimentations est identique à celui utilisé pour les
levures à l'exception de quelques modifications :
 la fixation s'est avérée superflue, car les cellules, attirées par gravité à la surface du
saphir inférieur, sont suffisamment adhérentes pour ne pas être entraînées par le
flux créé par la compression du milieu,
 la température de la chambre doit être élevée afin de maintenir une température du
milieu proche de 37°C à l'intérieur de la chambre d'observation,
 un nombre moins important de cellules peut être analysé pour chaque expérience
car les cellules sanguines sont beaucoup plus grosses et la concentration cellulaire
moins importante. Cette diminution du nombre d'informations est en partie
compensée par la meilleure qualité des images.

Seules des mesures sur cellules individuelles ont été effectuées, car un échantillonnage
de ce type de cellule implique un nombre d'images très élevé. L'augmentation de la
concentration cellulaire par dépôt d'un volume de culture plus grand entraîne une
agrégation naturelle des cellules qui empêche toutes mesures.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 149
Figure 35 : Évolution du volume moyen des cellules K562 en fonction de la pression

120%

115%
(% du volume cellulaire initial)

110%
Volume cellulaire relatif

105%

100%

95%

90%

85%

80%
0 50 100 150 200 250 300
Pression (MPa)

150 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAU TE PRESSION
Figure 36 : Cinétique de l'évolution du volume de cellules K562 pendant un traitement haute
pression (250 MPa/15 mn)

Cellules inactivées Cellules viables Pression

1,3
250

1,2
(% du volume cellulaire initial)

200
1,1
Volume cellulaire relatif

Pression (MPa)
1
150

0,9

0,8 100

0,7
50
0,6

0,5 0
0 5 10 15 20 25
Temps (minutes)

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 151
C.2.1 Évolution du volume de cellules K562 dans un milieu isoosmotique
Dans un premier temps, les cellules ont été traitées en utilisant du milieu RPMI
(cf. C.C.3 p. 91) comme fluide de pressurisation. La variation de volume
observée a été analysée, comme pour les levures, en deux parties : tout d'abord
pendant l'élévation de pression, puis lors d'un cycle complet.

C.2.1.1 Variation du volume des cellules K562 lors d'une élévation de pression
L'évolution du volume moyen des cellules durant l'élévation de pression est
présentée Figure 35. Contrairement aux résultats obtenus avec les levures, le
volume moyen des cellules K562 augmente d'un peu moins de 10 % avec un
bon intervalle de confiance. Cette variation paradoxale n'est pas justifiée par
une compression du contenu cellulaire. En effet, si la compression du volume
cellulaire initial est proche de celle du milieu, une élévation de 250 MPa devrait
provoquer une contraction d'environ 8 %.

D'après la relation ( 58 ) p. 134, la variation de volume peut donc s'expliquer par un


transfert de masse (flux de la solution externe) vers le milieu intracellulaire. Ce flux
peut être estimé à environ 18 % du volume cellulaire initial à 250 MPa équivalant à
une variation de volume de 20 % à pression atmosphérique.
Les deux types de cellules réagissent d'une façon totalement opposée :
 le volume des levures diminue, avec une amplitude légèrement supérieure à la
compression du milieu,
 le volume des cellules K562 augmente en fonction de la pression.
Cette variation de volume est plutôt surprenante et contredit, au moins en apparence,
les résultats précédents.

C.2.1.2 Variation du volume des cellules K562 lors du maintien à 250 MPa pendant 15 mn
Comme pour les levures, des études ont été menées afin de suivre le comportement
des cellules K562 pendant le temps de maintien sous pression. Ces cellules offrent à
l'observation visuelle un comportement morphologique caractéristique, là où les
levures ne montrent aucune modification apparente.

152 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 37 : Images de cellules K562 lors d'un traitement haute pression dans un milieu
isoosmotique.

Cellules avant traitement (0,1 MPa - 0 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 10 mn)

Cellules sous pression (250 MPa - 15 mn) Cellules après traitement (0,1 MPa - 20 mn.)

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 153
Pendant le temps de maintien sous pression, les cellules changent brusquement
d'aspect (cf. Figure 37) les unes après les autres. Initialement sphériques avec
des contours bien définis, elles évoluent spontanément vers une forme floue
difficile à focaliser avec le microscope. En présence de colorant vital, ces
cellules altérées se concentrent rapidement et deviennent opaques (cf. Figure
37). Elles sont donc vraisemblablement mortes. La rapidité du changement et la
diminution apparente du volume cellulaire rapprochent ce phénomène d'une
rupture membranaire.

Les résultats de l'analyse d'images n'ont pas été représentés sous forme de moyenne
car ce changement d'aspect se traduit par une diminution du volume cellulaire non
simultané de toutes les cellules. De plus, après cette inactivation brutale, l'évolution du
volume, quand elle est possible, n'est pas toujours précise car la cellule ne peut être
focalisée convenablement. La variation de volume consécutive à cette inactivation
brutale est représentée sur la Figure 36.
Ces résultats montrent qu'une partie des cellules reste viable et maintient un
volume constant (105 % du volume initial) au cours d'un séjour à 250 MPa
pendant environ 15 mn. De retour à pression atmosphérique, le volume
cellulaire final n'est pas significativement différent de l'initial. L'expansion liée
à l'élévation de pression apparaît donc dans ce cas réversible.

Les variations de volume des cellules K562 contrastent avec les résultats
obtenus sur les levures :
 augmentation de volume lors de l'élévation de pression,
 rétraction brutale lors de l'inactivation.
La variation de volume initiale, apparemment en contradiction avec le principe
de LE CHATELIER, implique une entrée de matière mais aussi une tension plus
importante sur la membrane. Afin de vérifier les conséquences de ce transfert
de masse, la tension initiale de la membrane a été augmentée par un léger choc
hypoosmotique précédant le traitement haute pression.

C.2.2 Variation du volume de cellules individuelles dans un milieu hypoosmotique


Les cellules ont été préalablement placées dans un milieu hypoosmotique obtenu par
dilution du milieu RPMI. Cette diminution de la pression osmotique entraîne chez les
cellules sans paroi une augmentation du volume intracellulaire pouvant provoquer la
rupture de la membrane.

154 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 38 : Évolution du volume de cellules K562 après un choc hypoosmotique d'activité de
l'eau de 0,982 à 0,995.

250%

200%
Volume cellulaire relatif
(% du volume initial)

150% Rupture cellulaire

100%

50%
Choc osmotique
aw 0,982 à 0,995
0%
0 50 100 150 200
Temps (secondes)

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 155
Figure 39 : Cinétique de variation du volume de cellules K562 lors d'un traitement haute
pression (250 MPa/15 mn) suite à un choc hypoosmotique, d'activité de l'eau de
0,982 à 0,988.

Volume de cellules K562 Pression

150%
250
140%

130%
200
Volume cellulaire relatif

120%
(% du volume initial)

Pression (MPa)

110% Début de la rupture


cellulaire 150
100%
Choc hypoosmotique
90%
aw 0,982 à 0,988 100
80%

70% 50
60%

50% 0
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Temps (minutes)

156 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.2.2.1 Analyse préliminaire de l'effet d'un choc hypoosmotique à pression atmosphérique

Des expériences préliminaires ont été nécessaires pour déterminer :


 la réaction des cellules à un choc osmotique,
 un niveau de pression osmotique non létale pour les cellules considérées.
Une augmentation brutale de l'aw du milieu de 0,982 à 0,995 réalisée sur les
cellules sanguines montre (cf. Figure 38) une augmentation importante du
volume, supérieure à 200 % du volume initial. Elle est suivie d'une rupture qui
intervient 2 à 3 minutes après le choc hypoosmotique.
Cette expérience a été réalisée sur une chambre de visualisation développée pour les
chocs osmotiques (BERNER et GERVAIS 1994b) qui offre des temps de mélange
inférieurs à 9 secondes. La forte augmentation du volume cellulaire et donc de la
surface membranaire s'explique non seulement par l'élasticité de celle-ci, mais aussi
par la présence de plissements membranaires représentant une "réserve" de surface
estimée à 80 % pour les leucocytes en condition isotonique (SCHMID-SCHÖNBEIN et al.
1981).
Un choc hypoosmotique à une aw de 0,988 montre par contre une élévation de volume
de 20 %, qui ne provoque pas "d'éclatement" des cellules sanguines. Cette
augmentation de volume dure suffisamment longtemps pour envisager une
modification de la pression hydrostatique dans cet état de surtension membranaire.
Ces expériences préliminaires ont permis de définir le niveau de pression osmotique
critique pour la cellule ainsi que son comportement mécanique lors d'une
augmentation de volume. Un choc hypoosmotique non létal (aw 0,988) a donc été
effectué avant traitement haute pression.

C.2.2.2 Effet d'une élévation de pression hydrostatique sur des cellules K562 en milieu
hypotonique
Une élévation de pression hydrostatique a donc été appliquée immédiatement après un
choc hypoosmotique modéré (aw = 0,988).
Les variations de volume provoquées par les différents traitements sont
représentés Figure 39. Le changement d'aw du milieu induit donc une variation
de volume de 20 %. L'élévation de pression provoque, comme en milieu
isotonique (cf. Figure 35 p. 150), une augmentation supplémentaire du volume
d'environ 15 %. Après 4 mn à 250 MPa, les cellules "explosent" toutes à
quelques secondes d'intervalle. Le changement de morphologie observé
(cf. Figure 40) dans ce cas est tout aussi brusque que le précédent (cf. Figure
37 p. 153) mais s'apparente davantage à l'éclatement observé par choc
hypotonique.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 157
Figure 40 :Images de cellules K562 lors d'un traitement haute pression dans un milieu
hypoosmotique.

Cellules avant traitement (0,1 MPa - 0 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 3 mn)

Cellules sous pression (250 MPa - 8 mn) Cellules sous pression (250 MPa - 8 mn 30s)

158 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Après 5 mn à 250 MPa; il ne reste plus que des enveloppes cellulaires vides qui,
contrairement à l'inactivation en milieu isotonique, ne concentrent pas le colorant
vital.
Malgré la faible aw du milieu, la pression provoque donc une augmentation du volume
des cellules K562. En considérant la compression physique du milieu, cette
augmentation de volume représente un transfert de masse inférieur à 50 % du volume
cellulaire initial en milieu isotonique.

L'expansion résultante est inférieure à celle observée à pression atmosphérique


consécutive à un choc hypotonique plus important (cf. Figure 39). Pourtant, le résultat
est similaire dans les deux cas. La pression semble donc modifier les propriétés
d'extension de la membrane, observation probablement en relation avec le changement
de phase des lipides décrit par de nombreux auteurs (MACDONALD 1984; WONG et al.
1988).
Cette expérience confirme donc le transfert de masse directement engendré par
l'augmentation de pression hydrostatique. L'augmentation de volume résultante et
probablement les modifications des propriétés de la membrane cellulaire sous pression
provoquent un éclatement cellulaire comparable à celui obtenu avec un choc
hypoosmotique létal.

Conclusion de l'analyse du volume de cellules sanguines


L'ensemble de ces expériences montre des comportements morphologiques très
différents de ceux des levures. Pour les cellules sanguines, les transferts de masse
dépendent directement du niveau de pression et non du temps sous pression.
L'inactivation est brutale et directement responsable de la chute de volume sous
pression.
En supposant que la cible de la pression est similaire pour les deux types de cellules,
l'interprétation comparée de ces transferts repose donc sur la différence essentielle
entre la physiologie des deux types de cellules : la paroi des levures. Elle permet entre
autres à la cellule de maintenir une pression de turgescence et la protège notamment
des chocs hypoosmotiques.
A partir de ce constat, il a paru intéressant de supprimer la paroi de levures et de
comparer le comportement volumique avec celui des deux types de cellules observées.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLUME CELLULA IRE SOUS HAUTES PRESSIONS 159
Figure 41 : Variation de volume de sphéroplastes de Saccharomyces cerevisiae lors d'un
traitement 250 MPa/15 mn.

Pression Volume moyen des sphéroplastes

130% 300

120%
250
110%

100% 200
Volume cellulaire relatif

Pression (MPa)
(% du volume initial)

90%
150
80%

70% 100

60%
50
50%

40% 0
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25
Temps (minutes)

160 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.3 Analyse du volume de sphéroplastes de levures
Afin de mieux comprendre les causes des variations observées dans les deux
paragraphes précédents, la paroi des levures a été digérée par action enzymatique
(cf. § C. p. C.291). Les levures prennent alors une forme parfaitement sphérique.
Le suivi du volume sur ces sphéroplastes présente de nombreuses difficultés, il est en
effet impossible de les fixer au saphir et le contraste de la membrane est bien inférieur
à celui de la paroi.

Les résultats obtenus Figure 41 mettent en évidence la faible qualité des


mesures. Il semble cependant que les variations de volume observées sont
inférieures à celles des levures et ne dépassent pas 10 %.
Comme pour les cellules sanguines, l'élévation de pression entraîne une légère
augmentation de volume puis le volume revient à un niveau proche du volume
initial pendant le maintien à 250 MPa. Malheureusement, il est difficile de
vérifier la viabilité finale de ces sphéroplastes qui sont de plus emmenés par le
flux lors de la détente.

Ces observations sont particulièrement intéressantes car elles font le lien entre les
observations recueillies sur les cellules sanguines et sur les levures. Les sphéroplastes
ont un comportement intermédiaire aux deux types cellulaires précédemment
analysés :
 une légère augmentation de volume pendant l'élévation de pression,
 pas de chute brutale du volume pendant le temps de maintien sous pression.
Cependant la faible qualité des images ne permet pas dans l'immédiat de conclure sur
les transferts de masse de ce matériel cellulaire.
Il apparaît donc que la compression de la paroi évite un transfert de masse simultané à
l'élévation de pression. Une compression comparable a été attribuée à la membrane
plasmique dans toutes les expériences, compression parfois masquée par un transfert
de masse. Étant donné l'importance de la membrane lors de ces variations de volume,
il nous a paru indispensable de vérifier cette compression sur un modèle pour lequel
aucun transfert osmotique ou diffusionnel ne peut être induit par la pression.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 161
Figure 42 : Évolution du volume de liposomes fabriqués à partir de phospholipides de jaune
d'oeuf, avec ou sans cholestérol, en fonction de la pression.

Liposomes (phospholipides de jaune d'oeuf)


Liposomes (phospholipides de jaune d'oeuf + cholestérol)

110%

100%
(% du volume initial)
Volume relatif

90%

80%

70%

60%
0 50 100 150 200 250 300
Pression (MPa)

162 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
C.4 Analyse du volume de liposomes individualisés
Les expériences précédentes mettent en évidence l'importance de la membrane dans
les transferts provoqués par la pression, notamment chez la cellule sanguine dont la
membrane, sans protection pariétale, est très sensible aux variations de volume. Une
élévation de pression en milieu légèrement isotonique entraîne apparemment une
rupture membranaire (cf. Figure 40).
Afin de préciser le rôle mécanique de la membrane, une investigation a été réalisée sur
des liposomes de grande taille, pourestimer le rôle de la bicouche phospholipidique
lors du maintien en pression et d'observer d'éventuelles différences de compressibilité
entre la bicouche et le milieu interne. L'observation de liposomes sous pression est
beaucoup plus difficile que celle des levures car, comme les sphéroplastes, ils ne
peuvent être fixés à la fenêtre de saphir. De plus, leur densité est proche de celle du
milieu, ils sont donc facilement entraînés par le flux créé par la compression. Seuls les
liposomes d'une taille suffisamment élevée (> 5 µm de diamètre) peuvent être pris en
compte, or ils constituent la partie minoritaire de l'échantillon. Deux liposomes d'une
taille comparable sont donc rarement dans le même champ microscopique, la
focalisation ne peut s'effectuer alors que sur un seul, voire deux. Ces expériences ont
été réalisées sur des liposomes à base de phospholipides du jaune d'oeuf avec et sans
cholestérol (cf. § C.C.4 p. 92).
Les variations de volume de ces deux types de liposomes ont été analysées d'abord
pendant l'élévation de pression (compression), puis pendant le maintien et le retour à
pression atmosphérique.

C.4.1 Variation de volume pendant l'élévation et le maintien en pression


L'analyse de l’évolution du volume des liposomes fabriqués sans cholestérol
montre tout d'abord une diminution de volume en fonction de la pression
hydrostatique (cf. Figure 42). Dès 150 MPa, cette diminution est d'environ
12 % et n'évolue plus significativement à une nouvelle augmentation de
pression.
Par contre, le volume des liposomes avec cholestérol diminue beaucoup moins
(environ 5 %). Ces variations de volume peuvent être attribuées à la
compressibilité de la bicouche lipidique, car les milieux internes et externes
sont identiques et la membrane est suffisamment perméable pour éviter une
tension mécanique due à une différence éventuelle de compressibilité entre le
milieu interne et la bicouche lipidique.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 163
La diminution de compressibilité observée à 150 MPa sur les liposomes sans
cholestérol peut être attribuée à un changement de phase
Les phospholipides étant à température et à pression ambiantes dans une phase
liquide-cristalline (LC), ils peuvent sous l’influence de paramètres physiques évoluer
vers une phase gel. Or, la compressibilité des phospholipides est plus importante en
phase liquide-cristalline qu'en phase gel (BÖTTNER et al. 1994). Pour les lipides
considérés, cette transition a théoriquement lieu entre - 10°C et 0°C à pression
atmosphérique. L'augmentation de pression élevant la température de transition de 17
à 22°C pour 100 MPa, la transition de phase a donc théoriquement lieu entre 150 MPa
et 200 MPa, ce qui confirmerait cette interprétation.

L'addition de cholestérol diminue la température de transition de phase (HEREMANS


1995), mais surtout diminue la compressibilité latérale des membranes
phospholipidiques dans l'état liquide cristallin (BRAGANZA et WORCESTER 1986b). Il a
un effet structurant sur les phospholipides qui l'entourent. Sous pression il entraîne un
épaississement transversal de la membrane par écartement de l'espace entre les têtes
polaires, diminuant ainsi la compressibilité globale de la vésicule (BRAGANZA et
WORCESTER 1986b). Il prévient aussi l'interdigitation de la bicouche lipidique. Mise
en évidence sur des lipides modèles et sur des membranes cellulaires, elle est favorisée
par des chaînes carbonées longues (BRAGANZA et WORCESTER 1986a). Elle s'observe
sur de nombreux phospholipides à pression atmosphérique en présence d'agents
inducteurs (glycérol, protéine, ions, anesthésique) et semble avoir des implications sur
les caractéristiques de la membrane, notamment en cas de lyse ou de fusion (WONG et
al. 1988).
Les diminutions de volume obtenues lors de cette expérience sont bien inférieures à
celles des liquides apolaires (  S = 1 GPa-1) (HEREMANS 1995) ou à celles mesurées

sur des dispersions aqueuses de phospholipides (  S (LC) = 1,3 GPa-1,  S (Gel)


= 0,47 GPa-1 à 30°C). Par contre, elles sont tout à fait comparables à celles
enregistrées sur des liposomes avec des techniques de fluorescence (SCARLATA 1991)
ou de diffraction (BRAGANZA et WORCESTER 1986b).
A pression constante, le volume reste évidemment constant. Par contre, le
retour à pression atmosphérique met en évidence un phénomène morphologique
particulier sur les vésicules sans cholestérol.

164 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
Figure 43 : Évolution d'un liposome à base de phospholipides du jaune d'oeuf au cours de deux
cycles de pressurisation-détente.

A - (0,1 MPa - 0 mn) B - (300 MPa - 4 mn) C - (250 MPa - 6,5 mn)

D - (225 MPa - 7 mn) E - (100 MPa - 8,5 mn) F - (0,1 MPa - 9,5 mn)

G - (120 MPa - 10,5 mn) H - (300 MPa - 11,5 mn) I - (0,1 MPa - 16 mn)

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 165
Figure 44 : Modèle géométrique simplifié utilisé pour l'analyse de liposomes "bourgeonnant".
4  h 2  h 3
Vcalculé  R 3  r 2  l   r  
3  2 3  6
Scalculé  2R 2 R  h  2r  r  h
r2 1  r
S projection  R 2    2rh  R 2 arcsin   r ( R  h)
2 2  R

où L et 2R sont donnés par l'analyse


d'images, r est obtenu à partir de L, 2R et de
la surface projetée. Les autres variables sont
calculées ainsi :

l  L  R  r  R2  r 2  
h  R  R2  r 2

Figure 45 : Cinétique de l'évolution de la surface et du volume de liposomes sans cholestérol


soumis à des cycles de pression.

Surface de projection obtenue par analyse d'images


Volume calculé à partir du modèle
Surface membranaire calculée à partir du modèle
Pression

130% 350

300
120%

250
(% du volume initial)

110%
Pression (MPa)
Volume relatif

200
100%
150

90%
100

80% 50

70% 0
-4 1 6 11 16
Temps (minutes)

166 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAU TE PRESSION
C.4.2 Modifications morphologiques lors du retour à pression atmosphérique

C.4.2.1 Observation microscopique des liposomes


Lors du retour à pression atmosphérique, une modification de forme des
liposomes sans cholestérol est observée (cf. Figure 43 : images A à F). Au-
dessous de 250 MPa, apparaît une dissymétrie s'amplifiant au fur et à mesure de
la diminution de pression. Ce changement de forme est parfaitement
identifiable, aussi bien visuellement que par l’analyse du facteur de forme et il
n'existe que si la pression dépasse 250 MPa. Des expériences à des pressions
inférieures n’ont pas montré de phénomène similaire.
Un second cycle de pression sur les mêmes liposomes entraîne, durant
l'élévation de pression, une résorption progressive de la vésicule jusqu'à
200 MPa (cf. Figure 45 : images F à H).
A 300 MPa, le liposome est à nouveau sphérique (cf. Figure 43 : image H).
Lors de la seconde diminution de pression un "bourgeonnement" semblable est
visible (cf. Figure 43 : image I). Le détachement de la vésicule n'a cependant
jamais été mis en évidence.

C.4.2.2 Analyse de l'évolution du volume des liposomes


Pour le calcul du volume des liposomes, le modèle sphérique n'est plus utilisable. Un
modèle simple a donc été développé (cf. Figure 3) en référence aux observations
visuelles. La forme modélisée nécessite trois mesures de l'objet : la plus grande
longueur (L) et la plus petite (2R) sont fournies par l'analyse d'images, alors que le
rayon du bourgeon est calculé à partir de la surface de projection et des deux données
précédentes.
Le volume ainsi calculé est représenté sur la Figure 45. La surface de
projection obtenue par analyse d'images a été représentée car elle met en
évidence, pour des valeurs supérieures à 100 %, le changement de forme. De
retour à pression atmosphérique, le volume ainsi calculé s’approche du volume
initial. Il induit une augmentation minime du rapport surface/volume par
rapport à celui de la sphère (< 0,05 %). La surface membranaire calculée à
partir du modèle, subit elle aussi, une compression réversible. Une mesure par
diffraction (Malvern Instrument, Royaume Uni) montre que les distributions de
volume des liposomes avant et après traitement sous pression sont identiques.
Ce changement de forme observé n'implique donc pas de changements majeurs
du volume et de la surface du liposome.

C.4.2.3 Interprétation du phénomène


A notre connaissance, aucune description de ce type n'a été faite sur des liposomes
sous pression. Cependant WATTIAUX DE CONINCK et coll. ont mis en évidence par

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 167
cryofracture une discontinuité dans une membrane mitochondriale lors d’un traitement
à 170 MPa, attribuée à une séparation de phase de la membrane lipidique (WATTIAUX
DE CONINCK et al. 1980). Ces discontinuités ou diminutions locales du rayon de
courbure, bien que de moindre importance, semblent comparables aux modifications
observées sur les liposomes.
L'affirmation d'une relation entre transition de phase et modification de forme est
confirmée par le maintien de la forme sphérique de liposomes contenant du
cholestérol, tout au moins jusqu'à 350 MPa. De plus, à pression atmosphérique, il
existe des descriptions de vésiculation suite à la diminution de température
(STEPONKUS et LYNCH 1989) attribuée à une transition de phase.
Des "ondulations" de la membrane ont été mises en évidence sur des liposomes suite à
l'addition d'alcool (NAGEL et al. 1992). Dans ce cas, les déformations sont attribuées à
une modification structurale de la bicouche lipidique (transition de la phase gel à une
phase gel interdigité) provoquant une séparation entre les phospholipides de chaque
phase. Cette séparation est décrite comme responsable des "ondulations"
membranaires.

Il est donc probable que le phénomène observé soit la conséquence d'une séparation de
phase lipidique durant une transition (soit LC à gel, soit gel à gel interdigité). Cette
transition a lieu durant l'augmentation de pression, mais elle ne peut s'observer du fait
de la forte compaction des phospholipides imposée par la pression. Par contre, la
diminution de pression entraîne une modification de la forme des liposomes car, les
différentes phases n'ayant pas les mêmes propriétés (compressibilité, tension de
surface), leur expansion est différente durant la détente. Ce processus aboutit à des
formes stables à pression atmosphérique bien que ces liposomes soient à nouveau
homogènes. En effet, MICHALET et coll. montrent par des modèles mathématiques que
la sphère n’est pas la seule forme à minimiser l’énergie de courbure (MICHALET et al.
1994).

Conclusion
Ces expériences sur les liposomes ont permis de décrire le comportement de la
bicouche lipidique sous l'action de la pression. Une diminution de volume consécutive

168 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
à l’augmentation de pression a été observée, elle est comparable à celle de l'eau ou à
celle des levures pour les mêmes pressions.
Des phénomènes morphologiques caractéristiques en relation avec une séparation de
phase ont été mis en évidence. En l'absence de cholestérol, la diminution de pression
induit une rupture de symétrie du liposome et la formation d'une excroissance
caractéristique. Une corrélation avec des analyses structurales est cependant nécessaire
à une description complète du phénomène. Malgré les nombreuses différences qui
existent entre les membranes cellulaires et les liposomes, la plupart des phénomènes
observés ont aussi été décrits sur des membranes à pression atmosphérique ou sous
pression (MACDONALD 1984; BRAGANZA et WORCESTER 1986b). Ces changements et
séparations de phases peuvent avoir, au niveau cellulaire, des conséquences très
importantes : perméabilisation passive, fragilité mécanique, modification des enzymes
membranaires. Cette expérience semble bien identifier la membrane comme cible
privilégiée des hautes pressions.

Conclusion sur les variations de volume


Les variations de volume ont été mises en évidence sur différents types de cellules.
Ces données issues d'observations microscopiques apportent des indices précieux sur
les transferts provoqués par les hautes pressions hydrostatiques et sur les perturbations
membranaires.
La relation entre ces observations et la viabilité cellulaire a été mise en évidence sur
les levures et les cellules sanguines.
L'interprétation de ces résultats à l'aide de références bibliographiques et de quelques
expériences complémentaires doit permettre de comprendre les transferts de masse
durant un traitement haute pression, mais aussi d'approcher les mécanismes présidant à
l'inactivation cellulaire.

PARTIE I : MESURE DES VARIATIONS DU VOLU ME CELLULAIRE SOUS H AUTES PRESSIONS 169
170 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LI POSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
PARTIE II : Causes et conséquences de la
variation de volume

L'observation microscopique apporte des informations intéressantes concernant les


variations de volume cellulaire observées et la viabilité finale des cellules.
L'interprétation des causes de ces variations doit permettre de mieux comprendre les
phénomènes liés à l'inactivation cellulaire sous haute pression.

Les résultats de l'expérimentation conduite sur les levures ont mis en évidence une
variation de volume qui se décompose en :
 une variation due à la compression durant l'élévation de la pression qui est
semblable celle obtenue sur les liposomes,
 une variation durant le temps de maintien sous pression due à un transfert de masse,
encore appelé flux de volume (Jv).
Chez les cellules sanguines, ces deux variations semblent se contrarier car les
phénomènes impliqués sont différents.

La thermodynamique des processus irréversibles permet de décrire les interactions


entre les différents flux dans les systèmes hors équilibre. Un système ouvert évolue en
détruisant une partie de son énergie utilisable (exergie). Cette variation d’exergie du
système est équivalente en régime stationnaire au produit de la création d’entropie par
la température du système.
Lorsque le système thermodynamique ne peut plus fournir d’énergie utilisable, il est
alors en équilibre total avec le milieu extérieur. Pour un organisme, cet état est
équivalent à l'inactivation cellulaire. La création d’entropie dans un système ouvert
peut s’exprimer ainsi :
dS
Stotal  total  Schaleur  Smatière ( 59 )
dt

 dans le cas d’une élévation de pression isotherme Schaleur traduit essentiellement


l’évacuation de la chaleur créée par la variation de volume due à la compaction
moléculaire :
PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 171
P dV
Schaleur   ( 60 )
T0 dt

 Smatière prend en compte les différents flux de matière au travers de la membrane.

En supposant que ces flux de matière et de chaleur sont découplés, les transferts de
matière peuvent être décrits par la relation :
1 ~ dni 
Smatière      ( 61 )
T0  i dt 
i

où T0 est la température du milieu,


~ , la différence de potentiel électrochimique généralisé entre les milieux intra
i
et extracellulaires, avec :
~    V P  Z F
 i i i i i i
Zi, la valence du soluté considéré,
F, la constante de Faraday,
i, le potentiel électrique (en V).

Le flux de chaleur est lié à la pression alors que le flux de matière n'en dépend pas
directement.
Ces flux correspondent à des variations du volume cellulaire : une compression
physique et une contraction due à un transfert de masse.
Nous nous proposons donc d'interpréter successivement ces deux variations du volume
cellulaire ainsi que leurs relations avec la viabilité cellulaire.

172 ÉVOLUTION DU VOLUME DE CELLULES ET DE LIPOSOMES AU COURS D'UN TRAITEMENT HAUTE PRESSION
A Causes de la variation du volume cellulaire
pendant l'élévation de pression et relation avec
la viabilité
La variation de volume relevée chez les levures lors d'une augmentation de pression se
mesure par analyse d'images. Pour un niveau de 250 MPa, la diminution du volume
cellulaire est comprise entre 10 et 15 % du volume initial. De nature physique, elle ne
dépend que du niveau de pression utilisé (cf. Figure 26 p. 132). En effet, une variation
similaire est obtenue sur des levures mortes (cf. Figure 31 p. 140) et sur des liposomes
(cf. Figure 42 p. 162).
Cette variation de volume est apparemment sans conséquence pour la cellule car
elle est réversible et une variation rapide de pression au niveau considéré
n'entraîne pas de destruction cellulaire immédiate chez Saccharomyces cerevisiae.
Ce paramètre est cependant important car il représente le résultat macroscopique de la
variation de pression sur l'objet étudié. Nous nous proposons donc d'étudier ici
l'influence éventuelle de cette diminution de volume sur la viabilité, puis les bases de
cette relation.
Cette étude portera uniquement sur les levures car les données de viabilité sur les
cellules sanguines sont peu nombreuses et la compression physique de ces cellules est
apparemment masquée par un transfert de masse.

A.1 Mise en évidence de la relation compression-viabilité

Si l'on considère le système constitué par la cellule fermé et non réactif durant
l'élévation de la pression, la compression isotherme définie par ( 57 ), peut se réduire
ainsi :
dV
   T dP ( 62 )
V

Cette variation de volume dépend de la compressibilité du système mais aussi de la


variation de cette compressibilité en fonction de la pression. Elle est directement liée à
la variation d'énergie libre du système.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 173


Tableau 11 : Propriétés volumétriques des différentes solutions utilisées en fonction de la pression

Soluté Fraction molaire Fraction Densité de la Activité de Volume Compressibilité Variation de


en soluté massique en solution l'eau molaire volume Équation de HAYWARD
soluté (mesurée)
Paramètres et x (%) Fm (%) d aw V (ml) T (V0-V)/V0 m Ko r²
unités (MPa)
Pression - - 0,1 MPa 0,1 MPa 0,1 MPa 0,1 MPa 300 MPa
Eau 0,00 % 0,00 % 1,000 1,000 18,200 4,46E-05 9,28 % 3,306 2242 0,988
Glycérol 0,98 % 4,67 % 1,008 0,985 18,781 3,95E-05 8,58 % 3,217 2531 0,997
3,74 % 16,33 % 1,039 0,961 20,193 3,79E-05 8,17 % 3,441 2639 0,994
9,17 % 32,67 % 1,096 0,913 22,833 3,33E-05 7,44 % 3,443 3000 0,993
16,28 % 49,00 % 1,138 0,808 26,651 2,99E-05 6,81 % 3,533 3346 0,990
28,00 % 65,30 % 1,195 0,657 32,675 2,58E-05 6,17 % 3,296 3871 0,968
79,54 % 95,24 % 1,240 0,380 62,448 2,48E-05 5,79 % 3,853 4027 1,000
90,55 % 98,00 % 1,253 0,405 68,342 2,53E-05 5,70 % 4,380 3947 0,988
Fructose 0,10 % 0,99 % 1,006 0,989 18,258 4,38E-05 9,18 % 3,293 2281 0,986
0,97 % 9,09 % 1,035 0,972 19,134 3,83E-05 8,64 % 2,876 2607 0,998
8,92 % 50,00 % 1,204 0,867 27,268 2,72E-05 6,46 % 3,211 3679 0,990
16,31 % 66,67 % 1,312 0,790 34,255 2,31E-05 5,75 % 2,962 4330 0,992
Sorbitol 0,12 % 1,22 % 1,003 0,987 18,344 5,11E-05 9,09 % 4,485 1956 0,922
1,10 % 10,10 % 1,032 0,975 19,378 3,97E-05 8,58 % 3,269 2516 0,979
9,00 % 50,00 % 1,197 0,889 27,542 3,34E-05 6,63 % 5,105 2991 0,903
NaCl 2,09 % 6,54 % 1,048 0,955 18,175 3,79E-05 8,48 % 2,994 2640 0,995
4,09 % 12,28 % 1,092 0,921 18,181 3,55E-05 7,97 % 3,169 2814 0,986
9,21 % 25,00 % 1,201 0,749 18,242 2,76E-05 6,59 % 3,089 3626 0,972
Urée 0,93 % 3,05 % 1,008 0,987 18,448 4,34E-05 9,12 % 3,284 2302 0,983
16,23 % 39,39 % 1,111 0,846 22,494 3,63E-05 7,69 % 3,829 2751 0,968

174
La variation de volume de 15 % constatée sur les levures peut servir d'inducteur au
transfert de masse obtenu durant le maintien sous pression, alors qu'une compression
plus faible obtenue à un niveau de pression moindre ou par une concentration plus
élevée du milieu serait moins pénalisante pour la cellule.
De plus, une liaison entre compression du milieu et viabilité cellulaire apparaît
clairement :

 l'élévation de pression augmente la compression du milieu et diminue la viabilité,


 l'addition de soluté diminue la compression et augmente la viabilité,
 la variation de température peut aussi modifier la compression du milieu.

Afin de vérifier cette hypothèse, les résultats de l'expérience préliminaire


(cf. § B.B.2.2 p. 125), montrant la viabilité de Saccharomyces cerevisiae dans
différents milieux à plusieurs niveaux de pression, ont été utilisés en considérant non
plus la concentration en soluté ni l'activité de l'eau du milieu mais la compression des
différents milieux.
La variation de volume obtenue par analyse d'images ne permet pas de donner avec
précision la compression des milieux intracellulaires car, la cellule étant un milieu
ouvert, cette mesure prend en compte les éventuels transferts de masse. De plus, la
précision du système n'excède pas 3 % (cf. § A p. 108).
La variation de volume du milieu intracellulaire sera donc estimée à partir de la
compression du milieu externe (solution binaire). Ces données volumétriques ne sont
pas toujours disponibles pour certains solutés biologiques (sucres et polyols) ou sont
difficilement extrapolables, car exécutées à pression atmosphérique et pour une
dilution infinie. Des expériences complémentaires ont donc été menées afin de
mesurer la compression de quelques solutions aqueuses. Des solutions au
comportement connu (NaCl, urée) ont été choisies afin de servir de référence.

A.1.1 Mesures de la compression de solutions aqueuses

Différentes solutions aqueuses de glycérol, sorbitol, fructose, NaCl et urée ont été
préparées jusqu'à saturation de la solution. Des concentrations importantes (fractions
molaires comprises entre 1 et 90 %) ont été utilisées car la précision du système de
mesure (cf. § F.F.3 p. 104) est insuffisante. Il est en effet impossible de mesurer ainsi
une différence d'évolution volumique entre de l'eau et des solutions à très faible
concentration, donc a fortiori d'obtenir la compressibilité apparente partielle du soluté
avec une grande précision.
PARTIE II : CAUSES ET CONSEQU ENCES DE LA VARIATIO N DE VOLUME 175
Figure 46 : Variations du volume relatif de différentes solutions aqueuses d'urée, de glycérol,
de fructose, de NaCl et de sorbitol à 400 MPa en fonction de la fraction molaire en
soluté.

11%
Variation relative de volume ([V0-V]/V0) à 400 MPa

10%

Urée

9%
Glycérol

Sorbitol
NaCl
8%

Fructose

7%
0.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0%
Fraction molaire

176 CAUSES D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L' EL E VA T I ON D E PR E S SI O N E T R E L AT I ON A VE C L A VI A B I LI T E


Figure 47 : Évolution du volume relatif de l'eau et de solutions aqueuses de glycérol, de
fructose et de sorbitol entre 0,1 et 350 MPa.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 177


Les variations relatives de volume (compressions) obtenues entre 0,1 et
400 MPa avec les différentes solutions sont présentées Figure 46. Elles
diminuent en fonction de la concentration quel que soit le soluté utilisé. L'ajout
de soluté induit donc une diminution de la compressibilité du milieu. De petite
taille et solides à l'état pur à température ambiante (à l'exception du glycérol),
ces solutés interviennent davantage par les interactions structurantes avec l'eau
que par leur compressibilité intrinsèque (cf. § B.B.1 p. 35). Un soluté polaire
comme l'urée a une compressibilité apparente négative et faible, alors qu'elle est
beaucoup plus importante pour des solutés hydrophiles ou ioniques. Le nombre
de fonctions hydroxydes permet d'expliquer l'écart entre le glycérol, le fructose
et le sorbitol. Cependant pour les trois solutés indiqués, la variation de volume
ne devient significativement différente entre eux qu'à partir d'une fraction
molaire de 10 % (cf. Figure 47).
Ces mesures de variation de volume ont permis de calculer les paramètres de
l'équation d'état simplifiée définie par HAYWARD (HAYWARD 1967) :
V0 P
 BP  B0  mP ( 63 )
V0  V

où BP représente le module de compression moyen à la pression P (en Pa),


V0, B0, le volume molaire et le module de compression à la pression nulle de
référence,
m, le coefficient de régression.

Les coefficients de cette équation sont obtenus par régression linéaire. Cette équation
permet aussi une estimation de la compressibilité à toutes les pressions :
B0
T  ( 64 )
BP ( BP  P )

Les résultats numériques de cette expérience ainsi que les paramètres de l'équation
( 29 ) ont été regroupés dans le Tableau 11.
Il est possible à partir de ces données d'obtenir la compression d'une solution de
concentration quelconque par interpolation.

178 CAUSES D E L A VA R I A T ION DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L' EL E VA T I ON D E P R E S SI O N E T R E L AT I ON A VE C L A VI A B I LI T E


Figure 48 : Viabilité cellulaire en fonction de la compression du milieu externe après un
traitement à des niveaux de pression de 250 à 400 MPa pendant 15 mn.

Figure 49 : Viabilité cellulaire en fonction de la compression intracellulaire calculée


(cf. § A.1.2.2) après un traitement à des niveaux de pression de 250 à 400 MPa
pendant 15 mn.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 179


A.1.2 Représentation de la viabilité de Saccharomyces cerevisiae en fonction de la
compression du milieu intracellulaire
Une première analyse a été effectuée en estimant la compression du milieu
intracellulaire identique à celle du milieu extracellulaire. Puis, une approche prenant
en compte la régulation osmotique a permis de préciser la compression du milieu
intracellulaire.
Dans toute cette étude, les viabilités exprimées sont celles obtenues après un maintien
de 15 mn sous pression. D'après les expériences (cf. § B.1.B.1.2 p. 119) un temps
minimal de maintien sous pression est nécessaire à la destruction cellulaire.

A.1.2.1 Relation entre viabilité et compression du milieu


A l'aide des résultats de compression précédents, les viabilités (UFC) de
Saccharomyces cerevisiae dans différents milieux (eau, glycérol, sorbitol, fructose) et
à différents niveaux de pression (de 200 à 400 MPa) ont été représentées sur la Figure
48 en fonction de la variation de volume du milieu. Sur cette figure, les deux variables
apparaissent liées (corrélation de 0,7), mais l'influence de la nature du soluté,
notamment du fructose, reste importante.
Une représentation similaire a déjà été proposée pour Saccharomyces cerevisiae
(HAYAKAWA et al. 1992). Les auteurs ont mesuré la compressibilité apparente des
cellules par dilatomètrie. De nombreux milieux y ont été utilisés (sels, alcools, sucres)
avec un seul type de traitement (500 MPa, 5 mn).
Assimiler la compression cellulaire à la variation de volume du milieu n'apparaît pas
satisfaisant. En effet, seul le glycérol pénètre dans la cellule et est susceptible de se
retrouver dans le milieu intracellulaire.

A.1.2.2 Relation entre viabilité et compression d'une solution isoosmotique de glycérol


Un second procédé d'estimation de la compressibilité du milieu intracellulaire s'appuie
sur la connaissance de l'osmorégulation chez les levures. La cellule adapte son
contenu intracellulaire à l'aw extérieure par sortie d'eau, puis par synthèse de solutés
osmorégulateurs (GERVAIS et BATTUT 1989; GERVAIS et al. 1992). La pression de
turgescence en milieu concentré peut être négligée devant la pression osmotique du
milieu extérieur, on peut donc considérer que le milieu intracellulaire est en équilibre
osmotique avec la solution externe. De plus, cette pression osmotique interne est
majoritairement régulée par la synthèse et l'accumulation de glycérol à l'intérieur de la

180 CAUSES D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L' EL E VA T I ON D E PR E S SI O N E T R E L AT I ON A VE C L A VI A B I LI T E


cellule chez Saccharomyces cerevisiae (GERVAIS et al. 1992; BERNER 1994a). La
concentration de glycérol intracellulaire peut donc être calculée à partir de l'aw externe
et la compression cellulaire sera donc estimée par la compression de cette solution de
glycérol.
En utilisant cette analyse, la Figure 49 représente les mêmes données de viabilité que
la Figure 48 en fonction de la compression cellulaire. Cette représentation fait
apparaître une bonne corrélation entre la viabilité et la compression cellulaire
(coefficient de corrélation de 0,82) quel que soit le soluté ou le niveau de pression,
cette relation est même linéaire si l'on considère le logarithme de la viabilité.
Cette relation est intéressante car elle permet théoriquement de prédire la viabilité à
partir de l'aw du milieu et de la pression pour un temps de maintien sous pression
donné.
Par contre, les expériences faisant varier le temps de séjour sous pression
(cf. § B.1.B.1.2 p. 119) montrent qu'un cycle de pressurisation-dépressurisation est
inefficace. La compression ne peut donc justifier à elle seule de la mortalité observée
chez les levures, puisqu'un temps de maintien sous pression est nécessaire (15 mn pour
ces expériences).
Il est possible d'envisager cette compression du milieu intracellulaire comme le facteur
inducteur de perturbations conduisant après un délai variable à la mort cellulaire. Les
phénomènes induits ont donc une constante de temps expliquant les cinétiques de
mortalité observées.

A.2 Interprétation de la relation compression-viabilité


En accord avec les conclusions du paragraphe précédent, l'action de la compression a
été envisagée sur deux catégories de perturbations pouvant avoir des constantes de
temps relativement élevées : les modifications biochimiques des protéines cellulaires
et les modifications fonctionnelles des membranes pouvant induire une diffusion de
solutés.

A.2.1 Modifications moléculaires


La différence de compression entre une solution binaire et le solvant pur peut être
directement reliée à la variation du nombre de molécules d'eau liées au soluté
(cf. § B.1.2 p. 35).

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 181


En effet, la compressibilité apparente qui caractérise cette variation peut être exprimée
selon la relation ( 52 ). La compression apparente (Vapp.) du soluté s'obtient par
intégration :

 
Vapp  Vi  VSh  VSw nh0   hS   Sw nh   ( 65 )

où  hS , Sw sont les compressibilités adiabatiques apparentes (en m3.mol-1.Pa-1) de


l'eau de la zone d'hydratation et de l'eau solvante (considérées comme constantes
sur l'intervalle de pression),
nh0 , nh sont le nombre de moles d'eau dans la zone d'hydratation à pression
atmosphérique et sa variation due à la pression,
Vapp , Vi , VSh , VSw sont respectivement les variations de volume apparent et
intrinsèque du soluté ainsi que les variations de volume de l'eau de la zone
d'hydratation et de l'eau solvante (en m3.mol-1).

La variation intrinsèque du volume moléculaire étant négligeable pour de petites


molécules, la variation apparente du volume de solutés est donc directement reliée à
l'hydratation du soluté et à son évolution sous pression. Cette hydratation est
nécessaire à la dénaturation des biomolécules et particulièrement des protéines. Les
composés polaires type glycérol, glucose, se lient préférentiellement à l'eau. Cet effet,
décrit comme une "exclusion protéique" du cosolvant, permet de protéger les protéines
de la dénaturation thermique (GEKKO et TIMASHEFF 1981).
L'addition de soluté dans une solution aqueuse de protéines provoque une forte
diminution de l'eau libre en fonction de la quantité ajoutée qui peut être assimilé à une
déshydratation (KORNBLATT et al. 1993) partielle des protéines. Cet effet peut être mis
en évidence par la mesure des propriétés thermodynamiques (volume apparent,
compressibilité apparente) de solutions ternaires (SASAHARA et UEDAIRA 1994). La
dénaturation protéique étant liée à l'augmentation de l'hydratation de la molécule,
l'ajout d'un cosolvant polaire stabilise généralement les protéines, alors que l'élévation
de la pression, en augmentant l'hydratation des molécules, favorise leur dénaturation.
La compression d'un milieu aqueux rend compte de l'équilibre d'hydratation entre le
cosolvant et la protéine.
De nombreux exemples décrivent ces actions antagonistes de la pression et de la
modification d'hydratation induite par un soluté. L'ajout de solutés tels que le NaCl ou
le glycérol augmente la pression nécessaire à la dissociation d'une protéine dimérique
(Arc-repressor) (SILVA et WEBER 1993; OLIVEIRA et al. 1994). Une diminution
d'hydratation induite par la présence de solutés provoque sur une enzyme, la EcoRI-

182 CAUSES D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L' EL E VA T I ON D E PR E S SI O N E T R E L AT I ON A VE C L A VI A B I LI T E


DNA, une modification de structure et de fonctionnalité qui peut être retrouvée par
augmentation de pression (ROBINSON et SLIGAR 1994).
La transposition de ces phénomènes au niveau cellulaire est cependant délicate. Si la
stabilité des virus peut être expliquée par les propriétés d'association des sous-unités
protéiques de la capside (SILVA et WEBER 1993), pour des organismes plus évolués
comme les levures, la complexité du milieu, la présence de lipides, la variété du pool
enzymatique rendent délicate toute interprétation moléculaire globale. De plus, de
retour à pression atmosphérique, la cellule dispose théoriquement de systèmes de
réparation.

A.2.2 Modifications des structures membranaires


Le fait que la cellule soit un système hétérogène rend difficile toute interprétation de la
compression observée par analyse d'images. La cellule est constituée d'organites
(noyau, mitochondries, vacuoles) de composition spécifique. Organites et cellules sont
délimités chacun par des membranes qui réagissent selon leur propre compressibilité.
L'hétérogénéité de ces composants aux compressibilités différentes peut aboutir à une
altération des membranes des différents organites (exemple : vacuoles gazeuses
(MARQUIS 1976)).

La présence d'un soluté intracellulaire comme le glycérol, à supposer qu'il soit


suffisamment perméant, pourrait être de nature à homogénéiser les différents
compartiments cellulaires. Les seuls indices à l'appui de cette hypothèse sont les
observations de microscopie électroniques (HONMA et al. 1993; SHIMADA et al. 1993;
MACKEY et al. 1994). Des ruptures des membranes nucléaires, mitochondriale et
vacuolaire sont constatées à un niveau de pression de 400 MPa (SHIMADA et al. 1993).
A des niveaux de pression supérieurs, aucun organite n'est plus observable, la
membrane plasmique est par contre peu atteinte, elle est simplement invaginée par
endroits. La bicouche lipidique est une structure très stable et des déformations
mécaniques importantes sont nécessaires pour obtenir une rupture.
Des microruptures permettraient d'expliquer la variation de volume observée pour une
sortie progressive de composés. La sortie de soluté intracellulaire a d'ailleurs été mise
en évidence par les mêmes auteurs (SHIMADA et al. 1993). L'altération des membranes
des organites peut entraîner le relargage de composés néfastes pour la cellule. Une
hypothèse similaire a été avancée pour les tonoplastes de cellules végétales (KNORR
1995).
Cette hypothèse d'altération mécanique est cependant peu vraisemblable durant la
compression car il est difficile d'envisager une rupture lors de la diminution de

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 183


volume. De plus, la forte viabilité obtenue lors d'une pressurisation et d'une détente
brutale de 250 MPa tend à invalider cette thèse, au moins pour le niveau de pression
considéré.
Au cours des comptages effectués, aucune cellule n'est apparue éclatée comme avec
un homogénéisateur (VITRAC 1995). Des essais ont aussi été réalisés avec des
liposomes : la compressibilité de leur contenu était différente de celle du milieu pour
une activité de l'eau similaire. Ces expériences n'ont pas permis de mettre en évidence
une quelconque altération du liposome.
Par contre, la compression du milieu intracellulaire est susceptible d'induire une
modification de la perméabilité membranaire par des contraintes mécaniques ou des
modifications de l'hydratation des canaux transmembranaires. Cette hypothèse
permettrait d'expliquer la cinétique de dénaturation des levures, mais aussi la sortie de
solutés rapportée par de nombreux auteurs (SHIMADA et al. 1993).

Conclusion
La compression du milieu intracellulaire estimée par la concentration isoosmotique de
glycérol intracellulaire est un paramètre prédictif de la viabilité après un traitement
haute pression. Cette relation est valable quel que soit le soluté ou le niveau de
pression utilisé mais pour un temps de traitement donné. La compression induit donc
des perturbations agissant avec un certain retard.

La compression a un effet inducteur sur des phénomènes conduisant après un certain


temps sous pression à l'inactivation microbienne. Au niveau moléculaire, elle peut être
reliée à une augmentation de l'hydratation des macromolécules qui contribue à leur
dénaturation. Par contre, l'implication de la compression sur les propriétés
membranaires reste à prouver.
Ces phénomènes, susceptibles d'être induits par la compression et aboutissant avec une
constante de temps à l'inactivation des cellules, sont vraisemblablement responsables
de la variation du volume cellulaire des levures obtenue pendant le temps de maintien
sous pression.
Une seconde partie traitera donc des conséquences de la compression du milieu
intracellulaire sur les phénomènes qui ont lieu pendant le temps de maintien sous
pression.

184 CAUSES D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L' EL E VA T I ON D E PR E S SI O N E T R E L AT I ON A VE C L A VI A B I LI T E


B Causes de la variation du volume cellulaire
pendant le maintien sous pression et relation
avec la viabilité
Pendant la phase de maintien sous pression, la pression et la température restent
constantes. Dans ces conditions, les variations du volume cellulaire sont le résultat de
transferts de masse transmembranaires. Ceux-ci peuvent être alors décrits par la
création d'entropie ( Smatière ) définie par l'équation ( 61 ) (p. 172).

Le développement de cette équation (pour un potentiel électrique nul) permet de


déterminer, pour un soluté et en introduisant certaines approximations, des équations
pratiques de transferts de matière (KEDEM et KATCHALSKY 1958).

 J v  Lp  P     Lp  P  RTcs 

( 66 )

 J s  Ps cs  1   cs J v

où Ju est le flux de volume (en m.s-1),


Js, le flux de soluté (en mol.m-2.s-1),
P, la perméabilité hydraulique spécifique,
Ps, la perméabilité spécifique du soluté,
cs, la différence de concentration en soluté (en mol.m-3),
, le coefficient osmotique pratique du soluté,
, le coefficient de réflexion qui traduit la spécificité de la membrane (1 pour
une membrane semi-perméable, 0 pour une membrane non sélective).

De nombreux auteurs ont utilisé ces équations afin de caractériser la réponse cellulaire
à un stress hydrique (MARECHAL 1992).
Une cellule ne contrôle pas directement ses flux d’eau du fait d’une forte perméabilité
naturelle de la bicouche lipidique et de l’absence de « pompes à eau ». Il existe
pourtant des pores aquifères dont le rôle essentiel est de permettre un passage d’eau
plus rapide notamment lors de chocs osmotiques.
Les flux d’eau sont donc régulés au niveau cellulaire par des flux de solutés. Des
différences de concentrations entre les milieux intra et extracellulaires sont maintenues
par un équilibre entre transport actif, transport couplé ou facilité et perméabilité
passive.
Une pression supérieure à 200 MPa inactive ou déprime fortement tous les transports
actifs. La cellule ne peut donc plus réguler ses transferts de matières qui sont alors
déterminés par :
PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 185
 les conditions initiales, c’est-à-dire la différence de potentiel généralisé entre le
milieu de pressurisation et le milieu intracellulaire (, Cs, ) et son évolution
en fonction de la pression,
 la perméabilité de la membrane (Ps, ) et son évolution sous pression. Cette
perméabilité conditionne la cinétique des différents flux, notamment les flux de
solutés.
La variation de volume observée dans les expériences précédentes correspond au flux
de volume qui peut être assimilé en valeur en raison de la forte teneur en eau du
système, à un flux d’eau ( J v   JiVi  J wVw ).

Pour expliquer ces flux, il est nécessaire de connaître les éventuels flux de solutés
induits par le maintien sous une pression hydrostatique élevée.

1 8C6A U S E S D E L A VA R I A T I ON DU VO L U ME C EL L UL A I R E PE N D A NT L E M AI NT I EN SO US PR E S S I ON ET R E L A T ION A VE C L A VI A B I LI T E
Figure 50 : Sortie d'ions du milieu intracellulaire de levures et viabilité suite à un traitement
haute pression.

Ca++ Na+ K+
Viabilité cellulaire (coloration)

6 100%
90%
(% de cellules viable)

5 80%
(g/108 cellules)
Sortie d'ions

4 70%
60%
3 50%
40%
2 30%
1 20%
10%
0 0%
Témoin 2,5 7,5 15
Temps à 200 MPa (minutes)

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 187


B.1 Mise en évidence d’un flux de soluté chez les levures
Les flux de solutés ont été mis en évidence grâce à la détection dans le milieu de
composés intracellulaires : les ions.

B.1.1 Mise en évidence de la sortie d'ions


Cette sortie de soluté a été mise en a été évidence au laboratoire GPAB par Muriel
HAYERT.
Afin de détecter une éventuelle sortie de solutés pendant le traitement, des cellules de
levures ont été pressurisées dans de l'eau distillée. Ce milieu a été récupéré, séparé des
cellules par centrifugation, puis analysé par spectrophotométrie d’absorption. Un
étalonnage préalable permet d’obtenir à partir de cette mesure la concentration de
particules absorbant dans la longueur d’onde observée. Trois ions ont été recherchés :
le K+, le Na+ et le Ca2+.
Les résultats obtenus montrent l’apparition de ces ions dans le milieu
extracellulaire (cf. Figure 50). Cette concentration mesurée dans le milieu a été
rapportée au nombre de cellules totales et diminuée du relargage observé sur le
témoin dû aux conditions expérimentales : centrifugation, lavage,  Les fuites
de Na+ et de K+ sont particulièrement importantes. Cette sortie d'ions est liée au
temps de pressurisation et donc à la viabilité.

B.1.2 Autres sorties de solutés


Des fuites de solutés de même nature ont été observées sur les levures. SHIMADA et
coll. ont suivi la sortie d'acides aminés, de huit solutés ioniques différents, de
glutathion et de substances absorbant le rayonnement ultraviolet (type protéines,
acides aminés). Ces expériences montrent un relargage particulièrement important de
K+, de Mg2+ et de Na+ ainsi que de glutamine. La quantité relarguée par cellule est
plus importante dans le cas d'un traitement 400 MPa/10 mn que dans le cas d'un
chauffage 100°C/5 mn. Cette sortie d'ions est généralement optimale pour une
pression différente pour chacun. De plus, les ions relargués majoritairement par un
traitement thermique ou une augmentation de pression sont de nature différente.
Les résultats obtenus expérimentalement sur les ions ainsi que d'autres travaux
montrent l'induction d'une sortie importante de solutés par la pression. Les flux de
solutés et d'eau ont donc le même sens chez les levures.

188 CONCLUSION
En s'appuyant sur les flux de volume mis en évidence par l'analyse d'images et les flux
de solutés mentionnés dans la bibliographie et confirmés expérimentalement pour les
levures, les transferts de masse transmembranaires peuvent être expliqués à travers
deux hypothèses :
1. une modification de la perméabilité membranaire largement abordée dans la
bibliographie (transfert diffusionnel),
2. une modification de la différence de pression osmotique entre le milieu
intracellulaire et le milieu extracellulaire (transfert osmotique).

Ces hypothèses font référence à la relation ( 66 ) et ne seront envisagées que pour le


cas des levures, cellules utilisées pour les travaux expérimentaux. Une autre partie sera
consacrée aux cellules sanguines pour déterminer, à l'aide de travaux bibliographiques,
si les mêmes hypothèses peuvent être envisagées.

B.2 Modification des propriétés de perméabilité de la membrane vis-à-vis des


solutés
Une modification de la perméabilité spécifique de la membrane vis-à-vis d'un soluté
entraîne une diffusion de ce soluté suivant le gradient transmembranaire. Cette
diffusion peut entraîner une modification de l'équilibre osmotique et donc un flux
d'eau. Nous nous proposons d'étudier dans ce paragraphe cette dépendance, à partir
des résultats obtenus sur les levures. Les causes probables de la perméabilisation
seront ensuite envisagées.

B.2.1 Relation entre le flux de volume et le flux de soluté

B.2.1.1 La turgescence cellulaire


Si l'on considère une cellule de levure dans des conditions permettant la croissance,
celle-ci maintient, grâce à la sélectivité de sa membrane et à des transporteurs actifs
une différence de pression osmotique entre le milieu intérieur et le milieu extérieur.
Cette différence est appelée pression ou potentiel de turgescence. Elle ne peut exister
que par la présence d'une paroi rigide capable de compenser mécaniquement cette
surpression. Cette différence de potentiel chimique se traduit par une pression
hydrostatique s'appliquant sur tout le contenu du cytoplasme.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 189


Le volume cellulaire est lié à la pression de turgescence par la relation (ZIMMERMANN
1978) :
V  V0
PT     ( 67 )
V0

où PT est la pression de turgescence (en Pa),


, la différence de pression osmotique entre les milieux intra et extracellulaires
(en Pa),
V0, V, les volumes respectivement au repos (sans pression de turgescence) et
avec une pression de turgescence PT (en m3),
, le module d'élasticité de la paroi (en Pa).

Les pressions de turgescence sont très variables suivant les espèces (ZIMMERMANN
1978), le type de paroi mais aussi l'état physiologique des cellules. Du fait de la
difficulté de l'estimation de ce paramètre, seules de rares mesures pertinentes ont été
réalisées sur les levures. MARECHAL, avec une technique de microscopie couplée à un
système d'analyse d'images, obtient pour Saccharomyces cerevisiae des pressions de
turgescence comprises entre 0,28 MPa et 2,31 MPa (MARECHAL 1992).
De même, à l'aide de variations de la pression osmotique, des études permettent de
calculer un module d'élasticité de la paroi : 2 à 7 MPa sur Saccharomyces cerevisiae
(CONWAY et DOWNEY 1961), de 0,9 à 8,5 MPa sur Chlorella emersonii une algue
unicellulaire à paroi (MUNNS et al. 1983). En considérant la cellule comme une sphère
homogène, le module d'élasticité peut être relié à sa géométrie suivant la relation :
e
  ( 68 )
r

où e est l'épaisseur de la paroi (en m),


r, le rayon de la sphère (en m),
, une constante.

Si cette relation permet de décrire des variations d'élasticité obtenues suivant l'âge et le
stade physiologique de la cellule, elle est insuffisante pour décrire la forte diminution
de ce coefficient lorsque l'aw du milieu est élevée (MUNNS et al. 1983).

190 CONCLUSION
B.2.1.2 Déplacement de l'équilibre osmotique par diffusion d'un soluté
Afin d'évaluer l'impact de la fuite de solutés sur la chute de volume et de simplifier
l'expression, la pression osmotique de la cellule sera attribuée à un seul soluté (indice
SI) susceptible de diffuser à travers la membrane sous l'effet d'une augmentation de
pression. De même, l'activité de l'eau du milieu extérieur sera attribuée uniquement à
un soluté (indice SE.).
A partir de l'équation ( 68 ), l'équilibre mécanique cellulaire peut être décrit ainsi :
V  V0
   I   E  RT (  SI cSI   SE cSE )   ( 69 )
V0
où E, I sont les pressions du milieu extracellulaire et du milieu intracellulaire (en
Pa),
E, I sont les coefficients osmotiques pratiques des solutés extracellulaires et
intracellulaires,
cSE, cSI sont les concentrations molaires des solutés extracellulaires et
intracellulaires (en mol.m-3).

La diffusion des solutés implique une variation élémentaire des concentrations du


soluté intracellulaire (dcSI) et du soluté extracellulaire (dcSE), donc une variation de
volume (dV) décrite à l'équilibre par :
dV
  d  RT   SI dcSI   SE dcSE  ( 70 )
V0

Cette équation n'est valable que si le module d'élasticité reste constant. La résolution
de l'équation ( 70 ) en fonction du volume final V aboutit rigoureusement à une
équation du second degré ; par contre en négligeant la variation de concentration due à
 n n  dn  dn
la variation de volume soit dc     l'équation ( 70 ) devient :
 V  b V  dV  b  V

V0
dV  RT  SI dnSI   SE dnSE  ( 71 )
 (Vi  b)
où b représente la partie du volume n'intervenant pas dans les échanges osmotiques
(en m3),
dnSI, dnSE sont les variations élémentaires du nombre de moles de solutés dans la
cellule (en mol),
Vi, le volume cellulaire initial.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 191


Tous les paramètres peuvent être obtenus à partir de la bibliographie à l'exception du
volume de repos (V0) qui se calcule à partir de l'équation ( 69 ) écrite pour l'état initial :
V0 
 ( 72 )
Vi    i

D'après la relation ( 72 ), la fuite de soluté par diffusion peut donc entraîner une
diminution de volume conséquente. L'ampleur du flux de volume dépend de la
quantité de soluté pouvant diffuser et de l'activité de l'eau du milieu externe :
 Si la sortie de soluté reste inférieure à la pression de turgescence, la variation de
volume est créée par la détente élastique de la membrane qui s'équilibre avec la
pression osmotique interne. Pour une fuite de soluté donné, l'amplitude de la
variation dépend du module d'élasticité () et de la pression de turgescence. Ces
deux paramètres diminuent lorsque l'aw du milieu est abaissée (MUNNS et al. 1983).
 Si la fuite de soluté est plus forte que la pression de turgescence ou si la pression de
turgescence est nulle, la sortie de soluté provoque alors une diminution du potentiel
hydrique interne qui devient inférieur à celui du milieu extérieur. Ce différentiel
entraîne pour des raisons osmotiques une sortie d'eau mais aussi une éventuelle
rentrée de soluté dépresseur, similaire au cas d'une rampe de pression osmotique
externe (MARECHAL et al. 1995b). La chute de volume dépendra dans ce cas des
vitesses de diffusion du soluté dépresseur à l'intérieur de la cellule.

Dans les différentes expériences d'analyse du volume cellulaire, le milieu est soit de
l'eau distillée (cellules fixées), soit du milieu de culture à une aw supérieure à 0,997
(population). Les mesures de relargage d'ions ont aussi été réalisées dans de l'eau pure.
La variation de volume est donc décrite par le premier cas.

192 CONCLUSION
B.2.1.3 Application aux résultats expérimentaux obtenus
Un calcul a été effectué à partir de l'équation ( 71 ) et des résultats de sortie d'ions
(cf. Figure 50) afin de déterminer les transferts de matières susceptibles d'être induits.
Les valeurs initiales choisies ont été calculées lors de rampes osmotiques (MARECHAL
1992) :
V b
 i  0,5 MPa ,   2,4 MPa ,   1 ,  60 % ,Vi  150 m3
V
Avec ces valeurs, dans de l'eau distillée, une diminution moyenne de 6 % est obtenue
pour l'ensemble de la population à partir des fuites d'ions analysées après 15 mn à
200 MPa (cf. Figure 50 p. 187). Par contre, si le volume des seules cellules inactivées
diminue, la variation entraînée par la fuite de Na+, K+ et Ca2+ et des anions
correspondants est de 12 %. Cette valeur est encore inférieure à la variation de volume
observée, cependant seuls trois ions ont été pris en compte dans cette approche alors
que SHIMADA et coll. montrent que cette perméabilisation s'étend aux acides aminés et
à d'autres substances dont l'effet osmotique n'est pas négligeable (SHIMADA et al.
1993).
D'ailleurs un calcul similaire sur la base des concentrations de solutés obtenues par ces
auteurs conduit à une variation de volume moyen de 20 % qui représente la perte de la
pression de turgescence ( étant considéré constant).
Cette variation reste inférieure à celle observée par analyse d'images, probablement
parce que la valeur de  dans de l'eau distillée est inférieure à celle choisie (déterminée
à partir d'une aw de 0,99 (MARECHAL 1992)).
Dans l'eau, la perte de la pression de turgescence signifie que le milieu intracellulaire
est extrêmement dilué et donc que le volume de la cellule est uniquement déterminé
par l'équilibre mécanique de la paroi, la perte de matériel cellulaire ne modifiant en
rien son volume final.
La cinétique de la sortie de soluté peut être reliée à celle de la variation de volume en
rapportant la variation obtenue en ( 71 ) par unité de temps et en supposant que le
soluté extracellulaire ne rentre pas dans la cellule :
dn SI Vi  b  dV
 . ( 73 )
dt V0 RT SI dt

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 193


Si le soluté diffuse librement selon son gradient de concentration, sa cinétique de
sortie peut-être décrite par la loi de FICK :
dnSI
 k SI A CSI  ( 74 )
dt

où CSI est la différence de concentration entre le milieu intra et extra cellulaire (en
mol.m-3), cette différence est égale à la concentration intracellulaire (CSI) si l'on
suppose le milieu extracellulaire suffisamment dilué;
A, la surface de la membrane cellulaire (en m2),
kSI, le coefficient de perméabilité cellulaire au soluté intracellulaire (en m.s-1).

La variation moyenne du volume des cellules mortes représentée Figure 28 peut être
estimée à 30 % en 10 mn, soit pour un volume cellulaire moyen de 150 m3, une
variation de 0,075 m3.s-1. En supposant la surface cellulaire constante et égale à
130 m2, la valeur de perméabilité obtenue est d'environ 10-11 m.s-1. Cette valeur est
du même ordre de grandeur que celle obtenue pour un soluté perméant comme le
glycérol (BERNER 1994a).
Dans le cas extrême où il y a rupture de membrane, l'eau et les solutés sortent
ensemble pour des raisons essentiellement mécaniques. Le volume final d'équilibre
doit être le même, la paroi délimitant toujours un volume du fait de sa rigidité.
Cependant la rapidité d'un tel phénomène ne semble pas coïncider avec les cinétiques
observées.
L'analyse de l'équilibre mécanique de la cellule et son application aux résultats
expérimentaux montre qu'il est possible d'interpréter la variation de volume par une
perméabilisation de la membrane cellulaire. Cette variation est directement liée à la
présence de la paroi qui autorise l'existence d'une différence de pression osmotique.
Les causes de cette perméabilisation sont évoquées au le paragraphe suivant.

B.2.2 Perméabilisation et modifications des systèmes de transport des solutés sous


pression
La perméabilisation de la cellule est la conséquence de la modification par la pression
de la membrane et de ses fonctions. La membrane cellulaire est en effet souvent
décrite comme une cible privilégiée des hautes pressions. Les transferts à travers la
membrane peuvent se faire de deux façons :
 par diffusion passive,
 par transport actif ou facilité.
Ces deux types de transport sont généralement affectés par la pression hydrostatique.

194 CONCLUSION
B.2.2.1 Transport passif

B.2.2.1.1 Influence de la pression sur la diffusion de solutés à travers une membrane


La diffusion de solutés à travers une bicouche lipidique modélisée par des liposomes
diminue lorsque la pression augmente (MACDONALD 1984).
Par contre, sur des cellules animales dont les transports actifs ont été bloqués, le
phénomène inverse se produit (HALL et ELLORY 1987).
Chez les microorganismes, la modification de perméabilité induite par la pression
semble plutôt reliée à l'état structural de sa bicouche membranaire (changement de
phase).

B.2.2.1.2 Changement de phase des phospholipides membranaires

Des pressions plus importantes (> 150 MPa) favorisent une transition de phase de la
bicouche de l'état liquide-cristallin à l'état gel. La température de transition dépend des
phospholipides considérés et est en général comprise entre 0 et 40°C pour des lipides
purs à pression atmosphérique (HEREMANS 1995). La pression augmente cette
transition de 20°C/100 MPa. Dans le cas de mélange de lipides et particulièrement
pour les membranes naturelles, cette transition de phase est moins marquée ("moins
coopérative").
Le changement de phase provoqué par augmentation de température sur des
liposomes, provoque une forte augmentation de la perméabilité à différents solutés
(saccharose, sodium) (PAPAHADJOPOULOS et al. 1973). Un phénomène similaire est
observé sur les membranes cellulaires aussi bien par augmentation de température
(HAEST et al. 1972) que par l'augmentation de pression (WATTIAUX DE CONINCK et al.
1980). Cette modification transitoire de la perméabilité serait liée à la séparation de
phase induite par la transition de phase : les lipides dans le même état se rassemblent,
formant des zones aux propriétés différentes. L'interface gel-LC serait responsable de
la plus grande perméabilité aux solutés.
Cette transition de phase a été mise en évidence expérimentalement par observation
microscopique de liposomes (cf. §. C.4 p. 163). Les phénomènes observés lors de cette
expérience montrent une forte perturbation structurale conduisant à une rupture de
symétrie et à une formation d'une vésicule stable à température ambiante.
Au niveau cellulaire de telles perturbations, si elles ont lieu, sont susceptibles de
modifier la structure de la membrane et ses fonctionnalités.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 195


Figure 51 : Représentation schématique des transferts de masse chez les levures sous haute
pression (hypothèses)

Pression Temps Cellule de levure

Equilibre
0,1 MPa 0 mn 100 % mécanique

Pt 

Pressurisation
Sortie de solutés
Sortie d'eau
90 %

250 MPa 3 mn

90 %

Maintien 85 %
en pression

60 %
250 MPa 18 mn

Dépressurisation
90 %

0,1 MPa 21 mn
65 %

M ort cellulaire Cellule viable

196 CONCLUSION
La transition de phase lipidique semble un phénomène prépondérant dans l'altération
de la membrane cellulaire et ses fonctions.

B.2.2.2 Transport actif ou facilité


L'action de la pression sur les différents types de transporteurs a surtout été étudiée sur
des cellules sanguines et à faible pression (< 100 MPa). Hall et coll. ont recensé les
différentes variations de volumes d'activation liées aux principaux transporteurs
impliqués dans les échanges transmembranaires (HALL et ELLORY 1987; HALL et al.
1993).
Les Na+-K+ ATPases membranaires sont les principaux transporteurs actifs de la
membrane. Elles sont rapidement inhibées par la pression (P½ < 60 MPa) et leur
fonctionnement semble lié à la viscosité de la membrane (DE SMEDT et al. 1979;
MACDONALD 1984). De nombreux transports sont couplés à l'ATPase (transporteurs
actifs secondaires) et deviennent donc inopérants sous pression.
A 200 MPa, les transports actifs de toutes les cellules sont inactivés. Or, les
expériences sur les levures montrent que les cellules viables maintiennent leur volume.
La diminution du volume des cellules inactivées est donc plutôt due à la modification
de la perméabilité passive.

Conclusion
La variation de volume des levures peut être en partie expliquée par une sortie de
solutés accompagnée d'un flux d'eau. Cette fuite de solutés est attribuée à une
modification de la perméabilité membranaire.
L'augmentation de la diffusion passive permet d'expliquer les variations de volume des
levures inactivées. Les causes de cette perméabilisation ne sont pas encore
formellement établies, cependant les phénomènes membranaires de transition et de
séparation de phase, confirmés par l'observation morphologique des liposomes
(cf. § C.C.4 p. 163) pourraient largement contribuer à la sortie de solutés.
Cependant, les variations de volume ainsi calculées restent inférieures à celles
observées expérimentalement. De plus, ces phénomènes ne permettent pas a priori de
décrire l'augmentation de volume observée sur les sphéroplastes et sur les cellules
sanguines.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 197


La pression osmotique comme l'activité de l'eau (cf. § A.3.1.A.3.1.3 p. 20) étant
dépendante de la pression, il peut donc être intéressant d'envisager l'impact de cette
modification sur les phénomènes de transferts de masse observés.

B.3 Action des hautes pressions sur la pression osmotique et conséquences


pour les cellules de levure
L'osmose est impliquée indirectement ou directement dans tous les flux d'eau de la
cellule (cf. relation ( 66 ) p. 185). A composition constante, l'équilibre osmotique
dépend de la température mais aussi de la pression hydrostatique du milieu.
Cette modification de la pression osmotique sera décrite dans un premier temps d'un
point de vue théorique, puis les éventuelles conséquences du niveau du volume et de la
viabilité des cellules seront ensuite abordées.

B.3.1 Variation de la pression osmotique en fonction de la pression hydrostatique


L'augmentation de la pression entraîne une variation de la différence de la pression
osmotique (cf. paragraphe A.3.1.4 p 41) ainsi définie :

    VwA  VwB
     Tw  ( 75 )
  P  T ,ni Vw

Une augmentation globale de pression du système entraîne donc une augmentation de


la pression osmotique liée :
 à la compressibilité du solvant, ce terme intervient même dans le cas de solutions
idéales,

 à la différence de volume partiel de l'eau entre les deux solutions et de son


évolution en fonction de la pression ; ce terme est nul pour des solutions idéales (
Vw  Vw ) et il est du même signe que  dans la majorité des cas.

Pour de faibles variations de pression hydrostatique, la contribution de non-idéalité


peut être négligée. Par contre, à de plus hautes pressions, l'écart à l'idéalité s'accentue.
En effet, les interactions responsables d'un comportement se détachant de l'idéalité
sont essentiellement : la taille du soluté, le nombre de molécules d'hydratation et les
interactions soluté-soluté (LILLEY 1985).

La pression semble favoriser les interactions dans le sens d'une diminution de l'aw :

198 CONCLUSION
 la compressibilité des solutés est en général inférieure à celle de l'eau, accentuant
ainsi l'écart de volume spécifique entre les solutés et le solvant,
 l'hydratation implique en général une variation de volume négative et est donc
favorisée par la pression, c'est notamment le cas de l'électrostriction,
 la pression hydrostatique favorise généralement la dissociation de solutés, ce qui
diminue l'activité de l'eau.
Une augmentation de la pression hydrostatique d'un milieu induit donc généralement
une augmentation de la pression osmotique due à la compressibilité de l'eau mais aussi
à l'augmentation des interactions eau-solutés.

B.3.1.1 Amplitude de la variation et conséquence pour l'équilibre osmotique


Il existe peu de valeurs de la variation du volume partiel de l'eau suite à la dissolution
de solutés sous pression. Cependant, cette variation d'environ - 1 ml.mol-1 à pression
atmosphérique est négligeable lorsque l'on considère une élévation de pression
hydrostatique de quelques MPa :
Pour 1 MPa et Vw  10 6 m3 . mol 1
a w ( p)
alors  0,9996
a w (0,1)

Par contre, si l'on envisage une élévation de pression plus importante, cette variation
devient importante :
Pour 250 MPa et Vw  10 6 m3 . mol 1 (supposée constante sur l'intervalle)
a w ( p)
alors  0,9
a w (1)

Pour les électrolytes, de nombreuses données sont disponibles (OWEN et BRINKLEY


1941; HARNED et OWEN 1958) car elles sont facilement obtenues à partir des forces
électromotrices.
Le volume apparent d'un sel est une fonction linéaire de la racine carrée de sa
concentration molaire. Par exemple, pour une solution salée (NaCl) de 1 mol.l-1,
l'augmentation de pression de 0,1 MPa à 250 MPa entraîne une diminution
approximative de l'aw de 0,964 à 0,955.
La pression osmotique créée par une telle solution évolue de 17,0 MPa à pression
atmosphérique à 23,5 MPa sous une pression hydrostatique de 250 MPa.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 199


Lorsque deux solutions sont en équilibre osmotique, il faut tenir compte de la
différence du volume partiel de l'eau entre ces deux solutions. Par exemple, deux
solutions de NaCl et KCl en équilibre osmotique à une aw de 0,97 à pression
atmosphérique présentent à 250 MPa une différence de pression osmotique théorique :
KCl - NaCl = 2,65 MPa.
L'augmentation de la pression osmotique est accentuée par la dissociation ionique de
certains constituants, notamment des acides faibles.

B.3.2 Relation entre variation osmotique et variation du volume cellulaire


La variation de potentiel osmotique est donc une fonction directe de la pression
hydrostatique ; les changements osmotiques interviennent simultanément à l'élévation
de cette pression.
Les levures maintenant une différence de pression osmotique entre les milieux internes
et externes, la pression hydrostatique intervient en accentuant cette différence
(cf. Équation ( 32 )). Le résultat prévisible sera alors une légère augmentation de
volume. Cette variation, calculée à partir de l'équation ( 32 ) donne une expansion du
volume cellulaire inférieure à 2 % pour une augmentation de la différence de pression
osmotique de 10 % (calculée en supposant les solutés internes idéaux et le milieu
externe de l'eau pure).
Ce calcul sous-estime la variation de pression de turgescence. Cependant,
l'augmentation du volume reste faible à cause du module d'élasticité important de la
paroi des levures. Il est concevable que cette faible variation de volume ait été
masquée par la compression du milieu. L'augmentation de pression induit donc une
variation de l'équilibre osmotique équivalente à un choc hypoosmotique susceptible
d'accentuer le relargage de solutés.
Cette augmentation de potentiel est liée à la pression et lors de la détente le
phénomène inverse se produit. Une diminution du volume cellulaire est alors
prévisible et peut être rapprochée des invaginations de la membrane observées sur
Escherichia coli par microscopie électronique, attribuées à des phénomènes
osmotiques (MACKEY et al. 1995).
Cependant, ces observations ne constituent pas une preuve car des modifications
membranaires comme celles mises en évidence au paragraphe C.C.4 (p. 163) peuvent
aussi en être la cause.

200 CONCLUSION
B.3.3 Conséquence sur la viabilité cellulaire
Cette variation de pression osmotique semble avoir des conséquences mineures chez la
levure, capable de supporter des chocs hypoosmotiques plus importants.
Cependant, l'action combinée du froid et d'un choc hypoosmotique est décrite comme
destructrice, même pour des levures (ROSE 1976). Une action combinée similaire peut
être envisagée pour la pression hydrostatique.
Plus vraisemblablement, cette modification de la pression osmotique est susceptible
d'accentuer la sortie de soluté consécutive à la perméabilisation, décrite au paragraphe
précédent.

Conclusion
Même si la pression induit une variation de la pression osmotique non négligeable, il
semble que cet effet est mineur sur les levures au niveau des transferts de masse
observés sous haute pression. Tout au plus, peuvent-ils accélérer la sortie de soluté due
à la perméabilisation membranaire et accentuer la variation de volume.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 201


B.4 Effet sur les transferts de masse des cellules sanguines
Aucune mesure significative de viabilité ou de fuite de solutés n'ayant été réalisée sur
les cellules sanguines, il peut être difficile d'interpréter les variations du volume
cellulaire observées. Cependant, la large bibliographie consacrée à ce type de cellule
ainsi que les observations d'entrée de milieu sous pression incitent à mieux
comprendre les phénomènes impliqués. La comparaison avec les levures devrait
permettre d'expliquer la différence des comportements volumiques.

Nous reprendrons brièvement pour les cellules sanguines les phénomènes analysés sur
les levures :
 flux de solutés,
 perméabilisation,
 modification de la pression osmotique.

B.4.1 Flux de solutés


Des observations de flux de solutés montrent sur des cellules sanguines à de faibles
pressions (< 100 MPa) (HALL et al. 1993) des modifications de perméabilité, faisant
apparaître une inhibition des transports actifs et une augmentation de la perméabilité
passive aux cations, entraînant une entrée de Na+ et de Ca2+ et une sortie de potassium
(HALL et al. 1993).
A plus haute pression (100 à 800 MPa), ONUCHIC montre une sortie du K+
intracellulaire sur des erythrocytes humains (jusqu'à 80 % du contenu initial)
(ONUCHIC et LACAZ-VIEIRA 1985). Cette sortie de potassium est réduite par la
présence de glycérol dans le milieu.

B.4.2 Perméabilisation
Les cellules sanguines n'ayant pas de paroi ne peuvent maintenir une différence de
pression osmotique entre le milieu interne et le milieu externe. Par contre, grâce à un
système de transport actif et de perméabilité sélective, les cellules maintiennent des
gradients de solutés (essentiellement des ions).
Ceux-ci entraînent un déséquilibre ionique entre le milieu intracellulaire et le milieu
extracellulaire appelé potentiel de membrane. Le Tableau 12 donne la composition
moyenne intra et extracellulaire d'une cellule de mammifère et montre un déséquilibre
apparent en charges électriques et en potentiel hydrique, compensé par la présence au

202 CONCLUSION
niveau cellulaire de composés chargés négativement (phosphates, protéines, acides
aminés, acides nucléiques).

Tableau 12 : Comparaison des concentrations ioniques à l'intérieur et à l'extérieur d'une


cellule de mammifère typique (ALBERTS et al. 1983).

Composant Concentration Concentration


intracellulaire (mM) extracellulaire (mM)
Cations
Na+ 5-15 145
K+ 140 5
Mg2+ 30 1-2
Ca2+ 1-2 2,5-5
H+ 4 x 10-5 4 x 10-5
Anions
Cl- 4 110

A l'équilibre, les flux passifs de solutés sont décrits par la relation de


NERNST-PLANCK :
 Z Fc 
Ji   RT i  dci  i i d i  ( 76 )
 RT 

Cependant, en l'absence de transport actif, le potentiel de membrane ne peut plus être


maintenu et la sortie de soluté se fait essentiellement suivant le gradient de
concentration.
La perméabilité au sodium étant plus élevée que celle au potassium, le sodium rentre
théoriquement plus vite dans la cellule, ce qui peut provoquer une augmentation de la
pression osmotique interne et une entrée d'eau.
En supposant que la totalité du sodium rentre sans sortie de potassium, on calcule une
augmentation de volume de 26 %, du même ordre de grandeur que le transfert d'eau
déduit des variations observées sur les cellules K562.
Un blocage du transport actif, par une substance comme l'ouabaïne, provoque
également un gonflement des cellules sanguines (HAROLD 1986).

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 203


Ici, le transfert observé semble plutôt lié à une inactivation des pompages actifs de la
cellule qu'à une perméabilisation passive, ce qui explique l'évolution de toutes les
cellules.
Ce calcul reste cependant approximatif car il ne tient compte ni du passage d'autres
ions, ni du potentiel électrique. En effet, une sortie de potassium a été mise en
évidence sur des érythrocytes sous pression. Elle n'est cependant significative que
pour des niveaux de pression supérieurs à 200 MPa (ONUCHIC et LACAZ-VIEIRA 1985).
Ces remarques tendent à montrer que les flux d'eau et de solutés observés chez les
cellules sanguines peuvent être attribués à une modification de la perméabilité de la
membrane, mais cette interprétation n'explique pas vraiment la liaison directe entre le
niveau de pression et le transfert de masse.

B.4.3 Variation de la pression osmotique


Du fait de l'absence de membrane, les cellules sanguines sont incapables de maintenir
une différence importante de potentiel osmotique. Cependant, la légère différence
existante (4.104 Pa) (ZIMMERMANN 1978) permet notamment à la cellule sanguine de
croître. L'élasticité de la membrane et la présence d'un cytosquelette compensent cette
surpression. Une augmentation de la différence de pression osmotique provoquerait
une entrée d'eau et une variation du volume cellulaire importante du fait du faible
module d'élasticité de la membrane plasmique : environ 2.104 Pa (SCHMID-SCHÖNBEIN
et al. 1981). Cette variation de la différence de potentiel osmotique peut être accrue
par la dissociation de composés, mais aussi par la rentrée d'ions par diffusion
(cf. paragraphe précédent). Le fait que l'expansion du volume cellulaire soit
simultanée à l'élévation de la pression et réversible lors de la détente semble appuyer
cette hypothèse par rapport à celle de la diffusion de solutés.

Conclusion sur les transferts de masse chez les cellules sanguines

L'analyse des variations de volume des cellules sanguines permet de proposer deux
interprétations de l'entrée d'eau observée par analyse d'image : une augmentation de la
pression osmotique interne simultanément à l'élévation de pression et/ou une diffusion
de Na+ plus rapide que la sortie de K+. Ces phénomènes sont susceptibles de
provoquer l'éclatement cellulaire en milieu hypoosmotique. En milieu isotonique, la
mortalité semble plutôt liée à une rupture de la membrane cellulaire dont les causes
restent à élucider.

204 CONCLUSION
Conclusion générale sur les causes de transferts de masse provoquées par
l'élévation de la pression

L'interprétation des phénomènes de transferts de masse observés sur les levures fait
apparaître le rôle essentiel joué par la membrane plasmique qui, altérée, devient plus
perméable aux solutés. La diminution du potentiel de turgescence serait alors
responsable de l'expulsion d'un flux d'eau et de la variation du volume.
Une augmentation de la pression osmotique due à l'élévation de pression hydrostatique
permettrait d'augmenter la pression de turgescence des levures et la diminution du
volume cellulaire consécutive à sa perméabilisation.
Des observations similaires de variation de volume cellulaire ont été observées par
augmentation de température (MARTINEZ DE MARANON, communication personnelle).
Une variation de volume de 20 % liée, comme pour la pression hydrostatique, à la
viabilité est observée aussi bien dans de l'eau pure que dans une solution à a w plus
faible. Dans les deux solutions la diminution de volume peut être attribuée à une
perméabilisation et/ou à une rupture de l'enveloppe conduisant à une perte de matériel
cellulaire. L'action de la pression semble plus modérée que celle de la température car
elle permet de préserver une grande partie des composés intracellulaires. Cette
particularité est exploitée pour les bactéries induisant la nucléation de la glace qui,
bien qu'inactivées par haute pression, gardent leur propriété physique (HONMA et al.
1993).

Pour une application de pression hydrostatique, il a été montré que la compression du


milieu intracellulaire était reliée à la viabilité après 15 mn sous pression. La
perméabilisation mise en évidence pendant le temps de maintien pourrait être induite
par cette compression.
Ces expériences montrent également l'importance de la variation de l'activité de l'eau
sur les transferts de masse induits par la pression sur les cellules et sur la viabilité des
microorganismes sous pression.
L'interprétation de la variation de volume des cellules sanguines et des sphéroplastes
semble très intéressante pour la comparaison de l'impact des différentes causes de
transferts de masse sur le volume cellulaire et sur la viabilité. Elle permettrait de
mieux comprendre pourquoi les cellules avec paroi sont généralement plus résistantes
à la pression hydrostatique.
Cependant, les données à notre disposition sont encore insuffisantes sur ce type de
cellule.

PARTIE II : CAUSES ET CONSEQUENCES DE LA VARIATION DE VOLUME 205


CONCLUSION
Ce travail a tout d'abord permis la mise au point d'un outil de visualisation
microscopique ainsi que d'un ensemble de protocoles optimisant l'observation et la
mesure du volume cellulaire sous haute pression. De même, l'optimisation de la chaîne
d'acquisition et d'analyse d'images a fourni des objets suffisamment importants et nets
pour mesurer des variations minimes du volume des levures (Vlevures150 m3).
L'erreur sur la mesure a été estimée à 3 % par étalonnages.

Les premières observations faites sur différents types de cellules ont montré une
variation de volume significative pour un traitement à 250 MPa pendant 15 mn. La
cellule étant un système thermodynamique ouvert, cette variation peut être attribuée à
un transfert de masse et/ou à une compression du milieu intracellulaire et de
l’enveloppe (paroi et membrane plasmique).

Le comportement morphologique dépend du type de microorganismes considéré :


Chez les levures, une variation de volume liée à la compression est observée lors de
l'élévation de pression, puis un transfert de masse se produit pendant le temps de
maintien sous pression, qui est directement relié à la viabilité cellulaire.
Chez les cellules sanguines, une entrée de soluté simultanée à l'élévation de pression
est constatée. L'augmentation de volume résultante cause l’éclatement de la membrane
lorsque les cellules sont dans un milieu légèrement hypotonique.
La suppression par voie enzymatique de la paroi des levures fournit des sphéroplastes
dont le comportement sous haute pression se rapproche de celui des cellules sanguines
utilisées.
Enfin, des expériences conduites sur des liposomes ont permis de calculer la
compression d'une bicouche phospholipidique et ont mis également en évidence le
changement d'état des phospholipides et la séparation de phases qui en résulte au
niveau de la membrane.
L'ensemble des observations faites sur les levures ainsi que les expériences menées sur
la viabilité et la fuite de solutés chez ces mêmes cellules, ont permis d'interpréter les
variations de volume observées.

206 CONCLUSION
La contraction initiale des levures liée à la compression moléculaire du milieu
intracellulaire peut être directement reliée à la mortalité cellulaire observée après
15 mn sous pression. Cependant, si ce paramètre physique permet de prévoir la
destruction cellulaire, il n'explique pas les mécanismes d'inactivation des levures, qui
demandent un temps de maintien sous pression important. La compression, par ces
implications aux niveaux biochimiques et structuraux, agit donc uniquement en
induisant des perturbations susceptibles de conduire, après un temps de réponse
variable, à l'inactivation cellulaire.
Pendant le temps de maintien sous pression, les transferts de masse sont provoqués par
une perméabilisation des levures et une disparition progressive des gradients
physiologiques de la cellule (pression de turgescence, potentiel de membrane).
L'analyse des transferts de masse, notamment les sorties d'ions mesurées sur les
cellules de levures, montre que la perméabilité membranaire est altérée par
l'application de hautes pressions. Cette perméabilisation peut être la conséquence de la
compression du milieu évoquée précédemment et peut aussi être rapprochée des
phénomènes de séparations de phases des phospholipides membranaires mis en
évidence chez les liposomes.
Les cellules sanguines, ne bénéficiant pas de la protection d'une paroi rigide, sont très
sensibles à un déséquilibre de concentration et/ou de pression osmotique. Les
modifications de ces gradients ainsi qu'une probable fragilisation de la membrane
plasmique induisent une inactivation brutale de la cellule par éclatement ou rupture
membranaire.
L'ensemble de ces travaux sur ces deux types de cellules montre qu'une élévation de
pression suivie d'une phase de maintien de 15 mn agit sur les propriétés mécaniques et
physiologiques de la membrane provoquant une perméabilisation aux solutés et une
sortie d'eau ou une rupture prématurée de la membrane en l'absence de paroi.

CONCLUSION 207
Nous avons par ailleurs montré qu'une cinétique rapide de pressurisation-
dépressurisation avec un temps de maintien sous pression réduit n'affectait pas les
levures. Les temps de maintien sous pression ont donc plus d'effet sur la viabilité que
la cinétique d'élévation de pression.
Des expériences complémentaires doivent être initiées afin d'étudier plus précisément
les propriétés de perméabilité de la membrane sous pression.

Les optimisations effectuées sur la cellule de visualisation permettent actuellement de


suivre quantitativement un certain nombre de paramètres cellulaires sous pression via
l'utilisation de sondes fluorescentes. La variation du pH intracellulaire a été ainsi
mesurée en continu sous haute pression. Des techniques similaires doivent permettre
de suivre la perméabilité, la fluidité de la membrane et certaines activités
enzymatiques. Ces études en cours doivent permettre de mieux détailler les
mécanismes d'inactivation cellulaire.
La possibilité de changement de milieu pendant la pressurisation sans diminution de
pression offre aussi au niveau expérimental des potentialités d'investigations
importantes : comme la réalisation de chocs osmotiques sous pression, de chocs
chimiques, d'injection de colorants, …

Les perspectives actuelles de développement industriel de la technologie haute


pression sont freinées par les coûts du matériel et le temps de traitement nécessaire. De
nombreux projets s'orientent vers des procédés en continu permettant le traitement
direct du produit. Le laboratoire développe un pilote impliquant le traitement en
continu de liquides en utilisant le temps de séjour dans les tuyauteries et la puissance
du jet en sortie. Dans ce cas, l'effet destructeur des hautes pressions est amplifié par
des phénomènes de cisaillement très importants.
Ce travail montre aussi l'importance du milieu sur la viabilité des microorganismes
(aw, compression, pH). L'hydratation du milieu intracellulaire semble ainsi
prépondérante : les spores et les microorganismes déshydratés nécessitent des
pressions très importantes pour leur destruction. Au niveau industriel ceci implique
d'avoir un produit le plus hydraté possible ce qui n'est pas toujours compatible avec les
impératifs technologiques liés au produit. Le traitement par haute pression d'un produit
à une aw proche de 1, suivi d'une opération de concentration/séchage pour un stockage
à une aw plus basse serait théoriquement très efficace, les jus de fruits doivent, par
208 CONCLUSION
exemple, être traités par haute pression avant concentration. Le premier traitement en
milieu dilué assure un fort taux de destruction, le second permet d’inactiver les
microorganismes viables mais altérés par les hautes pressions.

L'avenir des hautes pressions réside probablement dans l'action combinée de plusieurs
traitements (physiques ou chimiques), en tirant avantage des modifications cellulaires
induites par le traitement haute pression (perméabilisation transitoire, fragilisation de
la membrane). Dans ce type d'approche, la compréhension des mécanismes induits par
les hautes pressions apparaît fondamentale.

CONCLUSION 209
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