Enzymologie générale : Concepts de base, cinétique enzymatique

Introduction
Cinétique enzymatique : Etude de la vitesse des réactions chimiques catalysées par des Enzymes
Fournit des données sur :
 Mécanisme de la catalyse
 Rôle métabolique de l’Enzyme
 Régulation de l’action enzymatique dans la cellule
 Inhibitions éventuelles (poisons, médicaments)

I. Notions générales
1) Catalyse enzymatique

Un catalyseur : Composé qui augmente la vitesse d’une réaction chimique sans en modifier le résultat et
qui se retrouve inchangé à la fin de la réaction
 Ne crée pas de réaction nouvelle
 Accélère la vitesse de réaction dans des proportions très importantes
 Peut rendre apparentes des réactions spontanément trop lentes pour être détectable

Variation d’énergie au cours d’une réaction avec et sans catalyse

Les catalyseurs abaissent l’énergie d’activation des molécules :
 A T° équivalente : augmentation de la vitesse de réaction en présence d’un catalyseur
Lorsque la réaction est équilibrée (réversible) : augmentation de la vitesse de réaction directe dans
les mêmes proportions que la réaction inverse

2) Définitions
Une enzyme :
Protéine présentant des propriétés de catalyse spécifiques d’une réaction chimique du métabolisme de
l’être vivant qui la produit. Certains acides nucléiques : les ribozymes, peuvent catalyser des réactions
chimiques (épissage de l’ARN)
 Au-moins une enzyme différente par réaction catalysée : plusieurs milliers pour chaque organisme
 Réaction spontanées exceptionnelles (réactions non enzymatique : exemple de glycation des
protéines chez le patient diabétique)
Substrat :
Molécule qui entre dans une réaction pour y être transformée grâce à l’action catalytique d’une enzyme
Produit :
Molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme
Ligand :
Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine
Cofacteur :
Corps chimique intervenant obligatoirement dans une réaction enzymatique :
 Pour transporter ou compléter un substrat
 Pour accepter un produit
 Comme participant à la structure de l’enzyme
Coenzyme :
Molécule biologique intervenant comme cofacteur indispensable dans la catalyse enzymatique d’une
réaction
 Coenzyme libres : interviennent de manière stœchiométriques
 Coenzyme liés : interviennent dans la réaction de manière catalytique

3) Localisation et variations physiopathologiques

Répartition irrégulière d’une enzyme dans les organes et les tissus : exemple des phosphatases (quasi-
totalité des tissus animaux, métabolisme des nucléosides phosphates comme ATP, GMP)
 Toutes les cellules nécessitant de l’énergie doivent en disposer
 Certaines enzymes : Synthétisées par des cellules et organes spécifiques : exemple de la pepsine
(cellules de la muqueuse gastrique des vertébrés)
 Localisation subcellulaire importante :
 Canalisation des réactions enzymatiques en fonction des besoins
 Participe à la régulation cellulaire
Localisation subcellulaire des enzymes :
Noyau : enzymes nécessaires à la biosynthèse des acides nucléiques
Mitochondrie : respiration cellulaire et oxydations phosphorylantes
Réticulum endoplasmique :
.Synthèse des polysaccharides et des glycoprotéines
.Oxydation des composés endogènes (bilirubine)
.Oxydation des composés exogènes (xénobiotiques, médicaments)
Ribosomes : synthèse des protéines
Lysosomes : enzymes de dégradation
Cytoplasme : enzymes solubles (ex : enzymes de dégradation du glucose, la glycolyse)

Dans les cellules, les activités enzymatiques peuvent faire l’objet de nombreuses variations

Variations physiologiques :
Activité des PHOSPHATASES ALCALINES : varie en fonction de l’âge : enfant >>> adulte (impliquées dans la
croissance osseuse)
Variations pathologiques :
Sujets atteints de troubles hépatiques : augmentation de l’activité des TRANSAMINASES : Localisation
surtout dans le foie : lésion de l’hépatocyte -> libération dans la circulation

4) Isoenzymes
Isoenzymes = enzymes (donc protéines) catalysant la même réaction chimique mais de structure différente
 Forme moléculaires multiples des enzymes

 Isoenzyme vrais : synthétisées par des gènes différents

 Isoformes : résultent de modifications post-traductionnelles (pas de variation génétique). Exemple :
Glycosylation, agrégation avec d’autres molécules.

Ex : Lacticodeshydrogènase : LDH (pyruvate  lactate) (stade final de la glycolyse anaérobie) :

 Structure en 4 sous-unités :
 2 types de sous-unités : Chaines M (prédominantes dans les mucles) et Chaînes H (cœur)
 5 isoenzymes différentes : M4, H1M3, H2M2, H3M1, H4
H3M1, H4 :
 Inhibées par un excès de pyruvates : diminution de lactate d’où : métabolisme aérobie renforcé
 Abondantes dans le cœur (métabolisme anaérobie mal toléré)
 Régulation des isoenzymes propre au tissu

5) Proenzymes ou zymogènes
= enzymes synthétisées sous forme de précurseurs inactifs
 Enzymes de la coagulation : risqueraient de provoquer une coagulation du sang dans les vaisseaux
si elles n’étaient pas inactivées (risque de thrombose)
 Enzymes protéolytiques (protéases) : Risques d’hydrolyses in situ des protéines des cellules qui les
élaborent si elles n’étaient pas inactivées.
Transformation proenzyme/enzyme selon plusieurs modalités :
  Par des ions H+ (pepsinogène--> pepsine dans l’estomac)
 Par l’enzyme elle-même (autocatalyse)
 Par une autre enzyme (trypsinogène--> trypsine, sous l’influence de l’entérokinase)

6) Enzymes inductibles

 Enzymes constitutives :

 Présentes dans la cellule, en quantités constantes

 Synthétisées quelles que soient les circonstances

 Enzymes inductibles

 A l’état de trace dans la cellule

 Augmentation c° (plusieurs milliers de fois) sous l’influence de différents facteurs
 L’inducteur peut-être le S, mais :
. Certains S ne sont pas des inducteurs
. Certains inducteurs ne sont pas des S :
Ex : éthanol et γ-glutamyltransférase (GGT)

 Rôle important de l’induction dans la régulation du métabolisme cellulaire : Barbituriques, contraceptif

oraux -> Induction d’EZ hépatiques -> facilite leur élimination

II . Structure et spécificité des enzymes

1) Apoenzyme et coenzyme
Apoenzyme = partie protéique d’une enzyme
 Parfois la seule présente : enzyme entièrement protéique (rare) :
Les holoenzymes
 En général, molécule organique non protéique, indispensable à l’activité, liée à la partie protéique :
Le coenzyme

 Couple apoenzyme/coenzyme :
Devient actif lorsque les 2 parties (inactives séparément) sont réunies :
 Souvent, ions minéraux indispensables : cofacteurs minéraux
 Certains enzymes nécessitent les 2 : coenzyme + cofacteur minéraux

 Certaines enzymes ne possèdent qu’un substrat (rare)

 D’autres possèdent 2 substrats, la réaction s’écrit alors :

 Action d’une enzyme sur son/ses substrat observée isolément : Réaction réversible le plus souvent
 Dans l’organisme : chaînes métaboliques : les réactions enzymatiques ne se déroulent que dans un
sens pour libérer les produits qui sont utilisés comme substrat par une autre enzyme
 Exemple : Cycle de Krebs. Voie finale commune de l’oxydation des molécules biologiques (G,L,P)

But :

 Oxyder les unités Acétyl CoA en CO2

 + production des coenzymes réduits (NADH+
H+ et FADH2) (-> chaine respiratoire)

2) Nécessités auxquelles doit répondre la structure des enzymes

Chaque enzyme est spécifique de son substrat
 Site de reconnaissance pour le/les substrat(s) sur la protéine enzymatique
Aussi => site de fixation du coenzyme et des cofacteurs minéraux (s’ils existent)

 Sur une autre région de l’enzyme : modification électroniques, transferts de charges ou de radicaux :
permet la transformation du substrat.

 Les enzymes peuvent faire l’objet d’une régulation :

 Dépend d’un changement de conformation de l’enzyme : forme inactive -> active
 Nécessite fixation de ligand en un point de la protéine : covalente ou non covalente
 Il existe 1 ou plusieurs sites de régulations

3) Site actif

a) Définition, nature, fonctionnement

Site actif : zone de la protéine enzymatique bien délimitée jouant un rôle direct dans l’activité enzymatique
 Constitué d’un petit nombre d’acides aminés, le plus souvent non contigus dans l’enchainement de la
chaîne polypeptidique
 Acide aminé caractérisés par une chaîne latéral :
 De nature chimique particulière (groupement ionisable ou polarisable)
 De structure particulière (encombrement stérique)
 La stéréochimie résultant de leur agencement unique est à l’origine de la stéréospécificité de
reconnaissance entre les acides aminés et le/les ligands
Le site actif d’une enzyme compote 2 sites voisins :
 Le site de fixation du substrat (ou site de reconnaissance)
 Le site responsable de la réaction chimique catalysée : site catalytique
Schéma du site actif du cholinestérase, elle se combine à l’acétylcholine pour l’hydrolyser
Présente au niveau des synapses, elle se combine à l’acétylcholine pour l’hydrolyser :
 Inhibiteurs : Donépézil (AriceptMD), rivastigmine (ExelonMD), galantamine (ReminylMD)
 Traitement de la maladie d’Alzheimer
Site de reconnaissance du substrat :
 Repliement de la chaine d’acides aminés : structure II et III qui favorisent le rapprochement des acides
aminés situés à une grande distance : formation d’une cavité dans laquelle s’insère le substrat
(Si le Substrat = molécule optiquement active : un des isomères reconnu)
Site catalytique :
Nombre restreint d’acides aminé (ou un seul=, dont les chaînes latérales participent à des échanges
d’électron ou de radicaux avec le substrat :
 Souvent situé dans un environnement protéique apolaire qui les rend plus réactifs : ( ex : en servant de
« tunnels » empruntés par les e-)
On parle d’acide aminé central pour celui qui réagit avec le Substrat au sein du site actif
Ce sont souvent :
 Sérine : -OH sur la chaîne latérale
 Cystéine : -SH pour les échanges de protons
 Histidine : structure qui facilite l’échange d’e- entre enzyme et substrat.
L’architecture de l’enzyme rend possible la transformation catalytique en diminuant l’énergie d’activation
nécessaire à la réaction :
 Mise en place du substrat : préparation à la réaction
 Réaction très spécifique : le substrat occupe la position idéale dans l’espace
 Modification électronique du substrat due aux acides aminés de l’enzyme sur les groupement
ionisables (-COO- , -NH3+, dipôles >C=O) : Fragilisation d’une liaison = clivage du substrat en deux
parties

b) Conformation du site actif

Modélisation de la réaction enzyme/substrat
Serrure/clé : modèle de Fisher : très forte complémentarité des structure S et E
Cependant,
 Certains composés ressemblant chimiquement a un substrat, mais avec des groupements moins
volumineux, ne sont pas transformés bien qu’ils s’insèrent mieux dans le SA que le substrat lui-même
 Mécanisme à 2 substrat appelé « fixation ordonnée »
Un substrat S2 ne peut se fixer que si un S l’est déjà.
 Selon l’hypothèse « clé-serrure », S2 devrait se fixer d’emblée

Ajustement induit : modèle de Koshland

Modifications conformationnelles lors de l’association Enzyme/Substrat : orientation optimal des

groupements catalytiques (grâce à la flexibilité des molécules protéiques)
Comparaison des 2 modèles

Autres modèles :
 Modèle « RACK » (tourmenter) : Lumry
Changement conformationnel du substrat pour s’adapter à la structure de l’enzyme :
 Augmentation des liaisons à rompre dans la molécule de substrat

 Modèle « STRAIN » (déformer) : Jenks

Combinaison des 2 théories précédentes : changements conformationnels de l’enzyme :
 Contraintes dans la structure du substrat

4) Spécificité des réactions enzymatiques

On distingue plusieurs degrés dans la spécificité :
 Spécificité de réaction :
Un acide aminé :
 Décarboxylation, transamination, décarboxylation, oxydative….
 Décarboxylases, transaminase, décarboxylase, oxydase…
Chaque réaction : l’acide aminé se combine à l’enzyme <-> fonction chimique attaquée placée
favorablement dans le site actif
 Spécificité de substrat :
Le site actif de l’enzyme reconnait la structure de la chaîne latérale de l’acide aminé à métaboliser
 Stéréospécificité :

 Une enzyme reconnaît seulement un acide aminé de la série L ou D

 Spécificité +/- étroite
 Réactifs analytiques en Biochimie Clinique : mesure de nombreux substrat par voie enzymatique :
glucose, cholestérol, triglycérides…

I) Cinétique enzymatique
= Etude des facteurs agissant sur les enzymes pour modifier les vitesses de réactions
 Durée de la réaction
 Concentration en Enzyme
 Présence de substance modifiant la vitesse de réaction : activateurs/inhibiteurs
En faisant varier ces conditions, les systèmes cellulaires adaptent à leurs besoins le débit des voies
Schéma général d’une réaction enzymatique

1) Notions de cinétique des réactions

Conventions d’écriture

a) Vitesse de réaction, Vitesse instantanée

Evolution des concentrations en S (substrat) et de P (produit) au cours de la REACTION ENZYMATIQUE, en
fonction du TEMPS
A chaque temps, on peut définir :
La vitesse instantanée : pente de la tangente à la courbe de vitesse au point correspondant à ce temps

Cependant, mesure de la vitesse dans un ensemble de conditions expérimentales pas suffisante pour
déterminer le mécanisme d’une réaction :
 Nécessite d’établir des équations de la vitesse vis-à-vis des concentrations des réactifs

b) Différentes phases de la réaction enzymatique

La plupart des réactions sont réversibles :
aS1 + bS2  cP1 + dP2
 Equilibre (autant de S1 et S2 décomposé que P1 et P2 reformé)
/ !\ Ne signifie pas vitesse nulle : réaction dans les 2 sens à des vitesses égales :
 Etat stationnaire :
[ ] [ ]
= Keq
[ ] [ ]
Constante d’équilibre = rapport des concentrations des produits formés lorsque l’équilibre est atteint
aS1 + bS2  cP1 + dP2
Variation chimique / physique de l’un des facteurs :  Evolution vers un nouvel équilibre pour s’opposer à
la modification :
 La modification des c° en P1 ou P2 entraîne un déplacement de l’équilibre de gauche à droite pour
maintenir un rapport des c° constant :
S1 + S2  P1 + P2
Différentes phases de la réaction enzymatique
Les 4 phases de la réaction enzymatique

2) Principe de la mesure des vitesses des réactions enzymatiques (Unité)

Vitesse d’une réaction :
= mesure de la quantité de S qui disparait, ou quantité de P qui apparait, par unité de temps
Appelée activité enzymatique : L’activité d’une enzyme est la vitesse de la réaction catalysée par cette
enzyme en conditions de concentrations, de pH et température parfaitement définies
Activité spécifique= activité rapportée à 1 mg de protéine

Unités utilisées en enzymologie :

 Unité internationale (UI) : quantité d’enzyme qui transforme une micromole de substrat en 1 minute
 Katal (unité du système international) (kat) : quantité d’enzyme qui transforme une mole de substrat
en 1 seconde : correspond à des quantités +++ d’enzyme  utilisation de sous-multiples : ukat ou
nkat
1 UI = 16,66 nkat

3) Cinétique Michaelienne :
Théorie des vitesses enzymatiques basée sur la fixation du S sur l’E formant le complexe « ES »
a) Variation de la vitesse en fonction du temps
  On admet que la quantité de S très largement supérieur à la quantité d’E de façon à se trouver à des
[S] saturantes et une réaction d’ordre 0.

b) Variation de la vitesse en fonction de la quantité d’enzyme

Pour une quantité définie de S, si l’on fait agir des quantités croissantes d’E, la V augmente
proportionnellement à la quantité d’E :

En se plaçant dans la zone où la vitesse augmente proportionnellement, en présence d’un excès de S, on

peut mesurer la quantité d’E présente :
 Mesure de l’Activité enzymatique en Biologie (enzymes plasmatiques)

c) Effet de la concentration en substrat, vitesse initiale

On s’intéresse à la phase stationnaire (i.e. V de réaction proportionnelle à la quantité d’E présente)
On peut mesurer ces Vi en calculant la différence des concentrations de produit au cours d’un temps
donné, pour chaque [S]
Vitesses initiales en fonction des concentrations en substrat :  Hyperbole :
Lorsque [S]  l’infinie : l’hyperbole se rapproche de son asymptote :

d) Equation de Michaelis et Menten : Hyperbol de Michaelis-Menten (1913)

 Début de la réaction :
  Pendant la phase stationnaire (état d’équilibre) :

[ES] = [E][S] / (k2+k3)/(k1) => [ES] = [E][S] / Km

 Km : constant indépendant de la concentration enzyme

 Considérée comme la constante de dissociation de ES, dans laquelle intervient la réaction :
ES  E + S
 Mais aussi la décomposition :
ES  E + P
 Appelée parfois « constante de dissociation apparente »

 Pour une réaction simple comme ci-dessus :

Son inverse, 1/Km  Affinité de l’E pour son S.
 Plus la valeur de Km est faible, plus grande est l’affinité de l’enzyme pour son substrat
S’exprime en mol/l, valeurs comprise entre 10-2 et 10-8

Pendant la phase stationnaire, la vitesse de la réaction enzymatique est donc :

Cette vitesse sera maximal (Vmax ou Vm) lorsque toute l’enzyme [Et] sera sous forme complexée avec le
substrat :
La vitesse maximal Vm est atteinte lorsque tous les sites enzymatique sont saturés en substrat, c’est-à-
dire lorsque [S] >>> Km

Pour des concentrations faibles en substrat, lorsque [S] <<< Km

Km représente la concentration en substrat pour laquelle la vitesse de la réaction est égale à la MOITIE
de la vitesse maximal
V = [S]

Vitesse alors DIRECTEMENT PROPORTIONNELLE à [S] :

ZONE DE DOSAGE DE SUBSTRATS PAR VOIE ENZYMATIQUE

Pour des concentrations élevées en substrat, lorsque [S] >>> Km

V = Vmax

Vitesse alors INDEPENDANTE à [S] :

Vitesse ZONE
de la réaction
DE MESUREen fonction de la concentration
DES ACTIVITES ENZYMATIQUE en substrat
 (Cinétique Michaelienne : hyperbole)

e) Détermination du Km

 Methode de Lineweaver-Burk
V = Vm [S] / ( [S]+Km)
L’inverse de l’équation de Michaelis-Menten conduit à la formule suivante :

On peut écrire cette équation sous la forme :

Cette équation peut se simplifier et s’écrire

Correspond à l’équation d’une droite : y=ax+b

Représentation graphique :

 Methode de Eadie-Hofstee
En réduisant au même dénominateur l’équation de Michaelis :
 4) Effecteurs physiques ou chimiques de la réaction enzymatique

a) Influence du pH et de la température
Influence du pH
 pH extrêmes : <2 ou >11  dénaturation de la protéine enzymatique (irréversible dès quelques
seconde d’exposition)
Vitesse d’une réaction enzymatique en fonction du pH :

 Passe par un maximum pour une zone de valeurs du pH = pH optimum

 Pour une faible variation de pH : changements de conformation réversibles car :

Action du pH sur :
 Liaison S/Ez et activité catalytique de l’E
 Degré d’ionisation du S
 Structure des protéines
Etudes in vitro :
Mesure d’activité enzymatiques  Fixer le pH durant toute la mesure
(Surtout si libération de produits + acide ou + basique que le S)
 Mesures en milieu tamponné
Etudes in vivo :
 Milieux biologiques tamponnés : peu de variation du pH physiologique
 Plasma : pH : 7,4
 Certains milieux intracellulaires : lysosomes  pH très acide
  Enzymes lysosomiales adaptées aux pH acides
Autre exemple de pH physiologique extrême :
 Suc gastrique, très acide
Pepsine  fonctionne à pH 1,8
 + loin, au cours de la digestion :
Alcalinisation du contenu intestinal (sécrétion du suc pancréatique)
Trypsine, chymotrypsine : protéinase intestinales adaptées au milieu alcalin

Influence de la température
Augmentation de la vitesse de réactions chimiques avec la température
Augmentation de la température  dénaturation thermique de l’enzyme (>56°C)
Contrôle précis de la Température obligatoire :
 Température à laquelle l’inactivation démarre (variable selon l’enzyme)

 Chaque enzyme  température optimale d’activité

 In vivo : varie de 36 à 40°C ; in vitro : en général, mesures à 37°C

b) Activateurs

 Souvent des ions minéraux :

Ca2, Zn2+, Ni2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+/Fe3+ …

Liaison ions minéraux à la protéine

Modification répartition électronique de la protéine

Modification de conformation  Augmentation de l’activité

Métallo-enzyme : le métal fait partie de la structure enzymatique (ne peut être retiré de l’enzyme
sans la dénaturer)

Enzyme à activateur métallique : enzyme et métal dissociables par méthodes douces (dialyse)

Enzymes nécessitant un métal pour être actives : inhibition par les substances qui chélatent les ions
minéraux

Activation ≠ Induction

- Induction : synthèse de novo de protéines enzymatiques

- Activation : protéine enzymatique présente mais inactive
En général : Induction + lente (L’E doit être synthétisée)
c) Inhibiteurs
Inhibiteur = substance qui a pour effet de diminuer la Vitesse de réaction
Inhibition par excès de substrat
 Inhibition par un analogues structural du substrat
Exemple de la succinate déshydrogénase (dans la membrane interne de la mitochondrie) (EN GENERAL
COMPETITIF)

Oxydation succinate  Fumarate avec transfert des H sur le coenzyme Q

 Diactide à 4°C, se fixe à l’E grâce aux charge – des fonctions acides
Malonate : même distance entre ses 2 charges – que le succinate
 Se fixe sur le SA de l’E (mais l’unique C intermédiaire ne permet pas l’oxydation)

Cinétique de l’inhibition enzymatique :

2 grands types d’inhibition : irréversible / réversible
Inhibition irréversibles (en général non compétitives)
 Se combinent de façon covalente à l’enzyme
 Cas des agents alkoylants

 Action lente (temps de contact inhibiteur/enzyme)

 Non modifié par la dilution ultérieure ou une dialyse du milieu (pour éliminer l’inhibiteur)
 Non spécifiques : toutes les enzymes ayant des groupements thiols seront inhibiées par les agents
alkoylants

Exemple de l’aspirine  Inhibition irréversible de la synthèse des prostaglandine

 Inhibition réversibles (en général compétitives)
 Processus rapide
 Dialyse : permet de restaurer l’activité
 Assez spécifiques

a. Inhibiteur compétitifs

Inhibition compétitive
 Compétition entre le substrat et l’inhibiteur pour se lier à l’enzyme

Liaison enzyme-inhibiteur  Complexe EI inectif :

Ki : constante de dissociation du complexe EI (enzyme inhibiteur)
 Définie par rapport à :
  [E] libre,
 [I]
 [EI]
Les réaction s’écrivent :

 Equation de Michaelis : Km affecté d’un coefficient qui dépend de : [I] ; et l’inverse de Ki (i.e. affinité
de l’E pour l’I)
Km modifié = Km app (km apparent) : il faut + de S pour obtenir une vitesse égale

Inhibition compétitive : représentation selon Lineweaver-Burk

L’inhibiteur compétitif agit comme si la constante Km augmentait :

 Km app n’est pas une constante : dépend de la [I]
 Un excès de substrat peut déplacer l’inhibiteur du complexe EI et donc lever (au moins en partie)
l’inhibition.
Ressemblance structurale entre S et I non indispensable :
 Des substances des structure différente de celle du S peuvent se fixer réversiblement sur le SA (ex :
via des liaisons hydrophobes)
 Inhibiteurs compétitif utilisés en thérapeutique

Exemple 1 : Ethanol et intoxication par l’alcool à bruler »

= composé ménager : éthanol + méthanol (5%)
Forte toxicité : Métabolisé par l’alcool deshydrogénase en formaldéhyde, très toxique pour les tissus
(cristallin  risque de cécité) :
Ch3-OH  HCHO
 Perfusion d’une solution diluée d’éthanol  inhibiteur compétitif
De plus, l’alcool deshydrogénase oxyde l’éthanol en acétaldéhyse :
CH3-CH2-OH  CH3-CHO

Exemple 2 : inhibiteurs des PDE (phosphodiestérases)

= superfamille d’enzymes dégradant les seconds messagers intracellulllaires :
 Adénosine monophosphate cyclique (AMPc)
 Guanosine monophosphate cyclique (GMPc)

Sildénafil ou Viagra : analogue de GMPc

 Inhibiteur compétitif de la PDE de type 5 spécifique du GMPc, augmentation de l’effet du signal
transmis par NO dans les corps caverneux du pénis  renforce l’érection

b. Inhibiteur non compétitifs

Liaison de l’inhibiteur sur l’enzyme sur un site indépendant du SA
Constante Km de l’E vis-à-vis du S représente :
La constante de dissociation du complexe ES mais aussi,
 Celle du complexe ESI(enzyme-substrat-inhibiteur) en EI et S libre
Constante Ki de l’E vis-à-vis de l’I :
La Constante de dissociation du complexe EI mais aussi,
 Celle du complexe ESI en ES et I libre

Inhibition non compétitive : équation de MICHELIS-MENTEN

Vm affectée d’un coefficient qui dépend de :
 [I] et 1/Ki : i.e. l’affinité de l’E pour l’I

Inhibition non compétitive : représentation selon LINEWEAVER-BURK

 Inhibition non compétitive : inhibition de l’ANHYDRAS CARBONIQUE par l’ACETAZOLAMIDE, utilisé
comme diurétique

d) Effecteurs allostériques
ALLOSTERIE :
Phénomène par lequel des protéines oligomériques (donc constituées de plusieurs sous unités) passent
d’un état inactif à un état actif en changeant de conformation
 Changement de
 Conformation de chaque monomère
 Disposition dans l’espace des protomères, les uns / aux autres.
 Se produit à la suite de la liaison d’un ligand, qui peut être : un effecteur ou le substrat

MECANISME ALLOSTERIQUE
ère
Fixation d’une 1 molécule de ligand
 Changement de conformation du 1er protomère
 Fixation facilitée d’une 2ème molécule de ligand sur le 2ème protomère
 Changement de conformation  fixation facilitée d’une 3ème molécule de ligand etc…
  Effet coopératif entre les protomères

 Lorsque l’effet de coopérativité est provoqué par le S lui-même :

 Effet homotrope
 Si c’est un effecteur différent du S ;
 Effet hétérotrope

 Transition allostérique  Modification des forces de liaisons des s/s-u (sans aller jusqu’à la
dissociation)
 Molécule entière : état tendu (T) // relâché R. Transformation réversible

ENZYME ALLOSTERIQUES : MODELISATION

Modèle concerté : Monod

Passage des sous-unités forme T  R et inversement : de façon concertée.

L’enzyme comporte :
 1 site pour fixer et transformer le S (un par protomère)
 1 site distinct pour fixer une molécule différente ; inhibiteur
 Parfois, 3ème site pour fixer un activateur.

Modèle séquentiel : Koshland

Les protomères ne changent pas simultanément de conformation mais de façon séquentielle.

L’effecteur allostérique peut avoir un effet positif : i.e., fixation de la molécule d’effecteur sur le site
allostérique.
 Modification du S.A. de l’enzyme :
 Augmentation des capacités de liaison du S
  Augmentation de l’activité de l’enzyme

CINETIQUE D’UNE ENZYME ALLOSTERIQUE

≠ d’hyperbole (enzyme michaeliennes)

Variation des constantes de vitesse et d’affinité en fonction des ligands

CINETIQUE D’UNE ENZYME ALLOSTERIQUE

Lineveawer-Burk

Traitement d’une enzyme allostérique par des agents physique (chauffage) ou chimiques (urée, dérivés
mercuriques) :
 Perte de la sensibilité de l’enzyme aux effecteurs allostériques : = désensibilisation
Cependant, l’activité enzymatique persiste ; site allostérique seul détruit. Il en résulte  Perte du
phénomène de coopérativité
 La cinétique devient hyperbolique
 Mécanisme d’action d’une enzyme allostérique typique :
L’ASPARTATE TRANSCARBAMOYLASE (ATCase)
Catalyse la 1ère étape de la synthèse des pyrimidines :

 Liaison coopérative des 2 S  Déclenche la catalyse

 Inhibée par le CTP, P final de la voie : diminution de l’affinité de l’ATCase pour les S
 Activée par l’ATP, senseur énergétique cellulaire

Structure 3D de l’ATCase :
 6 sous-unités catalytique (C) : fixent les substrats
 6 sous-unités régulatrices (R) : fixent ATP ou CTP

Etat T : défavorable à la catalyse, stabilisé par le CTP

Etat R : favorable à la catalyse, stabilisé par l’ATP ou les substrats :
 La fixation sur une sous-unité régulatrice d’un modulateur positif écarte les sous-unités catalytiques en
les faisant pivoter autour d’un axe symétrie
 Changement conformationnel les rendant plus actives

Les enzymes allostériques :

 Fonction régulatrice dans le métabolisme (voies de biosynthèse)
 Corrélation étroite protéines allostériques / rétro-contrôle (feed-baack)
(i.e., inhibition par un des produits terminaux du métabolisme)

INHIBITION PAR RETROCONTROLE SIMPLE ou FEED BACK

Diminution des concentrations en S1, S2, S3 et X1

INHIBITION PAR RETROCONTROLE EMBOITE

INHIBITION PAR RETROCONTROLE SEQUENTIEL

Ces mécanismes :
 Régulation de la biosynthèse des acides aminés, en particulier.
 II) Classification des enzymes - Nomenclature

Exemple : LES OXYDO-REDUCTASE

Exemple d’utilisation en clinique

LA LACTAE DESHYDROGENASE (LDH)

Enzyme cytoplasmique, marqueur de cytolyse d’origine hépatique, cardiaque …
Réaction catalysée (in vivo)
L-Lactate + NAD+  Pyruvate NADH – H+
Réaction utilisée pour mesure d’activité (in vitro)
Pyruvate + NADH-H+  Lactate + NAD+

Justification du sens de réaction choisi :

  Pyruvate + stable en solution que lactate
 [pyruvate] critique : 10 Km inhibent  Utilisation de [pyruvate] < 10Km
 2ème substrat : NADH-H+ utilisé à la concentration de 10Km

En pratique :
Dans un tube :
 Tampon
 Pyruvate Démarrage par l’échantillon contenant la LDH
 NADH-H+

Variation (diminution) d’absorbande à 340 nm  transformation NADH-H+/NAD+

Spectres d’absorbance de NAD(P) et NAD(P)H