II.

Analyses biochimiques des aliments

L'analyse des aliments est une préoccupation majeure dans la vie d'une société

donnée car elle permet d'établir leur composition en macro et micronutriments. Cette

composition (table) constitue une base fondamentale pour le nutritionniste pour quantifier

les apports alimentaires et les besoins nutritionnels exigibles dans un statut équilibré d'un

individu en bonne santé qui lui assurent l'entretien ou la maintenance, le bon

fonctionnement métabolique et physiologique et la protection de l'organisme contre les

agressions internes (agents infectieux) et externes (pesticides, métaux lourds). Ce souci

est intimement lié à la promotion de la santé et la préservation de ce capital vital (vie) qui

doit s'acquérir au jour le jour pour le bien être personnel.

Pour les organismes normatifs, la table de composition constitue l'assise (le

fondement) principale pour l'établissement des normes de produits et leurs applications

pour une qualité de vie saine et sécurisée. En outre, elle permet la certification des

produits ou denrées alimentaires, à l'état ou transformées, afin de garantir leur usage en

nutrition humaine ou animale.

Pour les laboratoires d'analyses et de contrôle de qualité et de la répression des

fraudes, la composition des aliments au coté des normes de produits et des exigences de

la réglementation en la matière constitue des outils de base pour les services d'inspection

et de contrôle pour établir la conformité des produits avant leur mise à la consommation

par les producteurs afin de satisfaire les attentes du consommateur en matière de qualité

et de sécurité.

En outre et dans le cadre de leurs missions institutionnelles, les laboratoires sont

habilités sur la base de ces données d'assurer et de garantir que les produits

commercialisés ou importés sont conformes aux pratiques de loyauté (honnêteté) et de

transparence dans le souci de protéger le consommateur de toutes fausses allégations de

composition en quantité ou en qualité à travers l'application des lois liées à la répression

des fraudes.

1
II.1. Le matériel

Le matériel utilisé en analyse biochimique des aliments ou autres substrats d'étude

doit être fonctionnel c'est à dire en bon état de marche. L'appareillage ou les instruments

de mesures ne peuvent être utilisés que par un personnel qualifié dûment formé à son

usage afin d'assurer la qualité et la fiabilité des résultats des analyses. Selon les bonnes

pratiques de laboratoires, pour tout matériel il est impératif d'indiquer par la personne en

charge (responsable) la nature et la fréquence des contrôles ou vérifications de son

fonctionnement qui doivent être transcrites (enregistrées) sur le registre des interventions.

D'une manière générale, le laboratoire d'analyse des aliments dispose de deux

catégories d'instruments ou de matériel:

- Le matériel courant de base disponible dans tout laboratoire tels que

agitateurs, bains- marie, étuves, broyeurs, fours, centrifugeuses, pipettes et

micropipettes, plaques chauffantes, chauffe ballons, réfrigérateurs - congélateurs,

distillateur, extracteurs.

- Le matériel de mesure ou d'analyse proprement dit dont l'impact sur la

qualité des résultats est certain tels que les balances, les pH mètres, les

réfractomètres, les spectrophotomètres d'absorption moléculaire (UV/VIS et IR) et

atomique, les chromatographes en phase liquide de haute performance (CLHP) et

en phase gaz couplés à la spectrométrie de masse (SM) ou non.

Les deux types de matériel nécessitent un entretien périodique et des vérifications

régulières de calibration ou d'étalonnage qui doivent être effectuées par des

professionnels qualifiés et autorisés particulièrement pour le matériel lourd

(chromatographes et spectrophotomètres) et doivent être mentionnées dans les

documents.

II.2.Choix des méthodes

Le choix des méthodes d'analyse des aliments ou tout autre matrice est assujetti à

leurs performances analytiques et spécificités techniques (précision, répétabilité,

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reproductibilité, sensibilité) pour une application donnée. Les autorités réglementaires, les

normes nationales algériennes (NA) ou internationales (Codex alimentarius, ISO) et les

organismes commerciaux (OMC) et les associations d'analyses chimiques (AOAC,

IUPAC) peuvent fournir des directives concernant le choix de ces méthodes

accompagnées de protocoles opératoires précis dans un souci d'harmonisation et de

validation de ces outils analytiques.

II.3. Echantillonnage

La qualité des données biochimiques de composition des aliments, et

éventuellement toxicologiques ou microbiologiques, est intimement dépendante en

grande partie de la qualité de l'échantillonnage en plus de la qualité des analyses

évidemment. L'objectif principal de l'échantillonnage consiste à prélever des échantillons

représentatifs des aliments à l'état ou transformés dans la perspective d'obtenir des

valeurs moyennes fiables en tel ou tel macronutriments ou micronutriments.

L'échantillonnage est une activité qui consiste à sélection et à prélever parmi un lot donné

d'aliments (un chargement, un conteneur, une livraison, un stockage, une importation)

connu ou supposé être produit dans des conditions uniformes un nombre donné en poids

et en nature à des fins d'analyses. Pour lever et dissiper toute ambiguïté (confusion)

terminologique, un échantillon est décrit comme étant une infime ou petite partie d'une

quantité ou d'un volume plus important d'un produit alimentaire qui est collectée puis

envoyée au laboratoire pour analyses selon les recommandations internationales (codex,

AOAC et IUPAC). En général, l'échantillonneur n'est pas un membre du laboratoire et son

activité est totalement indépendante et doit avec le laboratoire dresser en commun un plan

d'échantillonnage. Les échantillons une fois collectés, ils sont envoyés au laboratoire

chargé de sa réception et deviennent des substances à analyser. A partir de ce moment-

là, le laboratoire est responsable de sa traçabilité, c'est-à-dire de son identité de telle

manière à pouvoir le distinguer de toutes les autres substances en sa possession. Pour

cela, à l'arrivée et à la réception des échantillons, il est impératif de procéder à leur

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enregistrement codifié en tant que matrice ou substrat à analyser sur des registres

manuscrits ou électroniques protégés contre toute tentation de falsification engageant

ainsi la responsabilité totale du laboratoire. En outre, il est aussi du ressort (de la

compétence) du laboratoire de préserver l'intégrité des substances à analyser en

garantissant, depuis leur réception jusqu'à leur analyse et éventuellement leur

enlèvement, que leur composition chimique n'est pas altérée ou modifiée. De ce fait, il

est extrêmement important de stocker ces substances si elles ne sont analysées dans

l'immédiat afin d'assurer que les données analytiques soient représentatives de

l'échantillon initial. Au cas contraire, toute détérioration de ces substances durant cette

période invalide les résultats de l'analyse. Les aliments s'altèrent de différentes manières

telles que l'oxydation des huiles, la décomposition des fruits et légumes, la fermentation

des produits laitiers et dérivés (yaourts et fromages), l'infection des viandes qui sont à

l'origine de modifications de leur composition en macro et micronutriments (perte d'eau,

protéines, lipides et vitamines). Par conséquence, l'entreposage des substances à

analyser doit être adapté à chaque type d'aliment. Pour les aliments secs non périssables

(céréales, pâtes, couscous, plomb, lentille pois chiche) ou en boites (conserves) tels que

tomate, confitures, fruits, leur entreposage se fait à température ambiante dans une salle

sèche. A l'opposé, les aliments périssables et fermentescibles doivent être conservés au

réfrigérateur à basse température entre 0 et 4°C et leur analyse doit intervenir dans les 36

heures suivantes après le prélèvement sinon ils sont congelés. La congélation à basse

température à -18°C ou moins et la lyophilisation sont aussi d'autres pratiques dans la

préservation des denrées alimentaires de toute variation de leur composition.

Au niveau de la paillasse, les substances à analyser dont l'identité et l'intégrité ont

été établies au préalable par l'analyste deviennent des prises d'essais. Une fois la prise

d'essai prélevé, l'examinateur doit veiller à remettre le reste à l'endroit où il conservé.

Parfois, le laboratoire d'origine peut être amené à envoyer des substances à analyser à un

autre laboratoire (accrédité) pour une analyse spécialisée (HPLC-MS ou GC-MS) ou au

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regard de ses compétences (CRAPC), dans ce cas là, il doit être clairement indiqué sur le

compte rendu de l'analyse remis au demandeur (client). Enfin et à toute fin utile, il est

impérieux (nécessaire) d'enlever et de conserver les substances à analyser en cas de

litiges ou d'expertise ou dans le cas de substances restantes mais de valeur que

l'expéditeur demande à récupérer (arômes concentrés).

II.4. Dosage des composants des aliments

II.4.1. Eau et humidité

La teneur en eau est la partie réelle totale et dosable d'eau dans les aliments. C'est

un élément essentiel en analyse biochimique au regard de sa variabilité dans les aliments

soit à l'état originel ou transformés. Sa teneur détermine l'aptitude de l'aliment à la

conservation et permet en outre de contrôler leur composition exigible par les bonnes

pratiques de fabrication (normes, réglementations) et de lutter par la même contre toutes

les tentations frauduleuses (0,1% pour la matière grasse laitière anhydre, 5% pour le lait

et le lactosérum en poudre, 12% pour la caséine alimentaire, 14,5% pour la semoule et la

farine de blé dur, 16% pour le beurre, 36% pour le fromage à pâte extra-dure à râper). En

d'autre terme la teneur en eau est une forme d'expression de l'extrait ou de la matière

sèche d'une denrée alimentaire donnée.

Différentes méthodes de dosage ou mesure directe ou indirecte de l'eau extraite

peuvent être mises en œuvres basées sur des propriétés physiques ou chimiques.

La dessiccation (déshydratation ou séchage) par perte de poids est une méthode

indirecte, toutes les matières volatiles sont extraites particulièrement l'eau à une

température comprise entre 100-105°C à l'étuve durant un temps déterminé jusqu'à

l'obtention d'un poids constant. Dans les méthodes officielles de l'AOAC, il est

recommandé pour les aliments d’origine végétale une température de séchage basse

comprise entre 60 et 70°C afin de réduire la destruction des glucides soit sous vide soit

sous un courant d'air. D'autres méthodes de séchage plus rapides et plus adaptées à des

contrôles de qualité de routine peuvent être utilisées telles que le séchage dans un four à

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micro ondes qui exige une surveillance continue (problème de carbonisation) ou à l'aide

d'une lampe infra rouge. Toutes les méthodes par dessiccation ne sont pas adaptées aux

aliments riches en composés volatils tel que les huiles essentielles qui sont entraînées

avec l'eau ce qui risque de fausser les résultats de l'humidité. Pour cela, la méthode de

Dean et Stark, approuvée par l'AOAC, est la méthode de choix pour mesurer la teneur en

eau de ce type d'aliments. Dans cette méthode, l'eau est entraînée par distillation en

présence d'un solvant non miscible tel que le toluène, le xylène puis recueillie dans un

tube gradué. La méthode chimique de Karl Fischer est particulièrement utilisée pour des

aliments à faible teneur en eau ou hygroscopiques. Enfin, la lyophilisation constitue une

méthode alternative de séchage plus douce mais très coûteuse.

Dans les méthodes physiques de détermination de l'humidité telles que la

spectroscopie proche infra rouge (SPIR), la chromatographie en phase gaz et la

résonance magnétique nucléaire (RMN) leur utilisation est très limitée car elles

nécessitent une instrumentation (matériel) très onéreuse (chère).

II.4.1. Dosage des protéines et des acides aminés

Le dosage des protéines et de leurs acides aminés dans les aliments est d'une

importance cruciale (capitale) du point de vue nutritionnel car elle constituent la masse

active de notre organisme (muscles, organes, système nerveux et cérébral, hormones,

enzymes, immunoglobulines) qui lui assurent le bon fonctionnement des divers systèmes

physiologiques tel que la digestion, l'immunité, la motilité (mouvement), la sexualité, la

gestation et la lactation pour les femmes, la coagulation…etc. En outre, elles sont

indispensables pour la croissance et le développement du corps (en taille et en poids)

depuis la naissance (lait maternel) en passant par l'enfance et jusqu'à l'age mature et tout

le long de la vie dans le renouvellement et la réparation des tissus (anabolisme).

L'homéostasie de ces fonctions structurelles et métaboliques ne saurait être maintenue

sans un apport de protéines alimentaires satisfaisant en quantité et en qualité c'est-à-dire

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de qualité nutritionnelle bien établie et équilibré en acides aminés indispensables d’où

cette nécessité de les évaluer sous ces deux aspects de l'analyse.

II.4.1.1. Dosage des protéines

En biochimie alimentaire et sciences des aliments, le dosage des protéines est

mesuré à partir de l'azote organique total multiplié par un facteur de conversion

conventionnel (général) ou spécifique. D'une manière générale, l'azote total est mesuré

selon la méthode de Kjeldahl qui est la méthode de référence normalisée. Il existe deux

versions de cette méthode, dans la version macro-Kjeldhal (originale), la prise d'essai est

relativement élevée ce qui nécessite un grand volume d'acide et de catalyseurs. A

l'opposé, la version micro-Kjeldhal est plus communément utilisée du fait de son impact

économique car elle exige moins de réactifs et plus protectrice de l'environnement (rejets

moindres).

Le principe de ce dosage consiste à minéraliser (digérer), dans une première étape,

la matière organique de la prise d'essai par oxydation en présence d'acide sulfurique

(H2SO4) concentré et à chaud (température < 400°C) et d'un mélange de catalyseurs de

K2SO4 (sulfate de potassium) et de CuSO4 (Sulfate de cuivre) qui permettent

respectivement d'élever la température d'ébullition de l'acide et d'augmenter la vitesse de

la minéralisation. A la fin de la réaction, l'azote organique se retrouve sous la forme d'ion

ammonium (NH4+). Dans une second étape, les ions ammonium du minéralisât acide sont

dans un premier temps alcalinisés à l'aide d'une solution de soude (NaOH) en quantité

suffisante (en excès) pour neutraliser l'acide et obtenir l'ammoniac (NH 3) qui est récupéré

par distillation dans le condensât des vapeur d'eau dans un deuxième temps. La dernière

étape de la méthode consiste à doser l'ammoniac du distillat par titrage selon deux voies

(directe ou indirecte):

- Dans le dosage direct, l'ammoniac est recueilli dans une solution d'acide

borique en excès (H3BO3). L'ammoniac ainsi piégé est neutralisé au fur et à mesure de

la distillation par une solution d'acide chlorhydrique ou sulfurique de titre connu (0,1N) en

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 présence d'un indicateur coloré tel que l'indicateur de Tashiro (mélange de rouge de

méthyle et de bleu de méthylène) jusqu' à son point de virage (Noter le volume de titrage

V1). Le dosage direct peut être aussi effectué, rapidement, sur le distillat à la fin de la

distillation.

- Dans la méthode indirecte, l'ammoniac est recueilli dans un volume et en excès d'une

solution étalon d'acide fort (HCl ou H2SO4). L'excès d'acide est ensuite dosé par une

solution titrée de base forte (NaOH) en présence d'un indicateur coloré (rouge de

méthyle) jusqu'au point de virage (Noter le volume de titrage V 1).

Un essai à blanc sans azote (sans la prise d'essai) est réalisé selon le même

protocole en utilisant tous les réactifs du dosage (Noter le volume de titrage V 0).

La teneur en azote total, exprimée en pourcentage est égale à:

% N= (V1-V0). T. 14. 100/M

M: Masse en grammes de la prise d'essai

T: Titre de l'acide ou de la base de titrage en normalité

V0: Titre de l'acide ou de la base utilisée pour le blanc en millilitres

V1: Titre de l'acide ou de la base utilisée pour la prise d'essai en millilitres.

Le pourcentage des protéines dans l'échantillon est calculé en le pourcentage

d'azote total (N total) par un facteur de conversion conventionnel de 6,25 qui représente

16% de l'azote protéique. D'autres facteurs, largement adoptés (FAO/OMS) sont utilisés

(6,38 pour le lait et les produits laitiers, 5,83 pour le blé entier, 5,18 pour les amandes).

En plus du dosage indirect des protéines à travers l'azote total, il existe des

méthodes d'analyse directes qui ont été mises au point pour des aliments spécifiques

basées sur des réactions chimiques entre les groupements fonctionnels caractéristiques

des acides aminés constitutifs et les réactifs révélateurs tel que le Folin, le bleu de

coomassie (colorant). Ce sont les méthodes photométriques les plus utilisées en biochimie

et dans l'industrie laitière dont le principe est basé sur la mesure de l'absorbance (A) des

prises d'essai dans le visible et qui permettent d'estimer la teneur en protéines en utilisant

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le sérum albumine bovine (SAB) comme étalon selon la loi de Beer-Lambert

(A = ε.L.C.). Dans le même domaine la spectrométrie infra rouge est aussi employée et

reconnue comme méthode de dosage des protéines et autres macronutriments (lactose et

matière grasse).

II.4.1.2. Dosage des acides aminés

Le dosage des acides aminés et plus particulièrement les indispensables ou

essentiels des protéines alimentaires conventionnelles (animales et végétales) et non

conventionnelles (d'organismes unicellulaires et foliaires) revêt une très grande

importance sur le plan nutritionnel car toute carence constitue un facteur limitant des

aliments que le nutritionniste doit prendre en considération afin d'équilibrer les apports du

quotidien.

Le dosage des acides aminés nécessité au préalable leur libération des protéines

par hydrolyse qui constitue l'étape la plus critique de la procédure. La plupart des acides

aminés sont totalement libérés par hydrolyse acide à l'aide de HCl 6M en absence

d'oxygène. Dans ces conditions le tryptophane est complètement dégradé alors que la

thréonine, la sérine et les acides aminés soufrés (méthionine) sont aussi dégradés mais

partiellement. Des conditions alternatives d'hydrolyse doivent être mises en œuvre pour

les mesurer. Le tryptophane est mesuré après hydrolyse alcaline à l'aide de KOH ou

Ba(OH)2 . Les acides aminés soufrés sont au préalable oxydés à l'aide de l'acide

performique puis hydrolysés. Dans la plupart des laboratoires, la chromatographie liquide

de haute performance (CLHP) est la méthode de choix pour analyser les acides aminés

des hydrolysats de protéines conventionnelles (animales et végétales) ou non

conventionnelles (foliaires ou d'organismes unicellulaires) au regard de ses divers

avantages au niveau des limites de détection qui peuvent atteindre le picomole (10 -12

mole) tout en réduisant le temps de l'analyse. La CLHP sur des phases stationnaires de

type échangeurs d'ions avec dérivatisation post-colonne en présence de ninhydrine ou

sur une phase stationnaire inverse octyl (C8) ou octadecyl (C18) ou avec une
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dérivatisation pré-colonne à l'aide de d'o-phathaldialhyde (OPA) ou phénylisothicyanate

(PITC) constituent des méthodes de séparation de très grandes valeurs car elles

permettent de dresser le profile des acides amines nutritionnellement importants

(aminogramme) avec précision et dans un laps (période) de temps d'une dizaine de

minutes à l'exception du tryptophane qui peut être déterminé par CLHP sans

dérivatisation.

II.4.1. Dosage des lipides et acides gras

Les lipides des aliments constituent la fraction insoluble dans l'eau et soluble et

extractible par les solvants organiques dont la détermination est une exigence normative

qui doit être mentionnée sur l'étiquetage et exigible aussi par les autorités réglementaires

en tant que macronutriment énergétique caractéristique de leur composition biochimique.

La teneur en lipides ou matière grasse totale est très dépendante de la méthode

d'extraction. D'une manière générale, dans la méthode classique d'extraction directe et

continue des lipides, la prise d'essai de l'échantillon sec est préalablement introduite dans

une cartouche cellulosique perméable à l'analyte ou soluté (lipides) qui entraîné par

percolation du solvant d'extraction tel que l'éther de pétrole ou l'hexane (à son point

d'ébullition) dans un extracteur Soxkhlet durant un temps plus ou moins long. L'estimation

ou l'évaluation de la teneur des lipides dans l'aliment est mesurée par gravimétrie (par

pesé) après évaporation du solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif. L'inconvénient

principal de cette méthode est que l'extraction est incomplète pour beaucoup d'aliments

(boulangerie et pâtisserie) et ceux qui contiennent des lipides de structure c'est-à-dire

intégrés à la paroi cellulaire ou liés chimiquement ou complexés à d'autres composés tel

que les protéines (lipoprotéines). Dans ces cas, il s'avère nécessaire d'effectuer au

préalable une désagrégation (désintégration) avant l'extraction soit par voie acide ou

alcaline. Dans l'hydrolyse acide, la désintégration des composés non lipidiques de la prise

est réalisée au moyen de l'acide chlorhydrique 25% et à chaud qui sont séparés du

mélange par filtration puis extraits au Soxkhlet comme précédemment. Dans le cas de la

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désagrégation (dégradation) alcaline ou méthode de Röse-Gottlieb, utilisée pour les

produits laitiers, l'hydrolyse est effectuée à l'aide de l'ammoniac et d'éthanol (solubilisation

des protéines et altération de la membrane du globule gras) et la matière grasse est

extraite à l'éther de pétrole. Les méthodes d'extraction acide et alcaline fournissent des

résultats fiables et sont reconnues comme méthodes officielles par les organismes

normatifs et d'analyses chimiques (AOAC). Cependant, les extraits obtenus par ces

traitements ne conviennent pas pour l'analyse des acides gras du fait de leur oxydation et

des pertes qui peuvent se produire. En industrie laitière, la méthode acido-butyrométrique

de Gerber est la plus utilisée dans cette filière du fait de sa simplicité et maniabilité. Dans

un premier temps, la prise d'essai est désagrégée à chaud à l'aide de l'acide sulfurique à

65% (dégradation des protéines) et l'ajout de l'alcool isoamylique, dans un deuxième

temps, permet la dissolution du gras sous forme de couches bien séparées et une

centrifugation du mélange aboutit à mesurer le volume de la matière grasse par simple

lecture du butyromètre (tube particulier) gradué. Par ailleurs, il est bien connu que

l'extraction des lipides en utilisant un mélange de solvants polaires et apolaires permet

d'obtenir des extraits complets contenant pratiquement tous les lipides de la plupart des

aliments. L'usage de la combinaison chloroforme-méthanol permet, d'une part une bonne

diffusion de l'alcool dans les tissus en plus du pouvoir dissolvant du chloroforme pour les

lipides d'autre part. Cette méthode d'extraction est la plus appropriée, lorsque l'extrait est

utilisé pour mesurer les acides gras et les stérols. La méthode est aussi efficace pour les

aliments complexes et fait partie des méthodes officielles de l'AOAC. Enfin, la

spectroscopie proche infra rouge (SPIR) constituent une méthode alternative aux

méthodes d'extraction chimiques pour certains aliments tel que les céréales et les produits

laitier. En effet, les lipides présentent dans ce domaine spectral de fortes bandes

d'absorption du groupement carbonyle exploitables dans la détermination de leur teneur

dont l'efficacité est dépendante de l'étalonnage réalisé sur des matrices (produits)

comparables et en utilisant un méthode de calibrage approuvée (agréée).

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