Hémophilie Doctora LMD

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
‫وزارة التـــــعليم الــعالي و البحث الــعــلمي‬

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE D’ORAN
«MOHAMED BOUDIAF»
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DE GENETIQUE MOLECULAIRE APPLIQUEE
Spécialité : Génétique moléculaire et cellulaire Option : Biologie Moléculaire
THESE
Présentée par
Mademoiselle Meriem ABDI
en vue de l’obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT LMD
Thème
Contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la

population Algérienne
Soutenu le 11/09/2014, devant la commission d’examen composée de :
Qualité Nom et Prénom Grade Etablissement d’origine
Président Mme SAIDI-MEHTAR Nadhira Professeur USTOMB (Oran)

Examinateur Mr BOUDJEMA Abdallah Professeur USTOMB (Oran)
Examinateur Mme MESLI Farida Professeur Université d’Oran
Examinateur Mr SAHRAOUI Tewfik Professeur Université d’Oran
Directrice de Mme ZEMANI-FODIL Faouzia Maître de conf. A USTOMB (Oran)
thèse
Invité Mr BABA-HAMED Mohamed Professeur Université d’Oran
Bey
Invité Mr TOUHAMI Hadj Professeur Centre Hospitalo-
universitaire d’Oran
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS i
LISTE DES ABREVIATIONS ii
LISTE DES FIGURES iii
LISTE DES TABLEAUX iiii
INTRODUCTION GENERALE…………………………………………………………….. 1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE……………………………………………………………... 4
I. Vaisseau sanguin et hémostase……………………………………………………………. 5
1. Vaisseau sanguin………………………………………………………………………….. 5
2. Hémostase…………………………………………………………………………………. 6
2.1. Hémostase primaire………………………………………………………………….. 6
2.2. Hémostase secondaire………………………………………………………………... 7
2.3. Fibrinolyse……………………………………………………………………………. 8
II. Cascade de coagulation…………………………………………………………………... 9
1. La cascade de coagulation classique……………………………………………………... 9
1.1. Voie intrinsèque et voie extrinsèque…………………………………………………….. 9
1.2. Voie commune finale……………………………………………………………………. 11
2. Concept actuel de coagulation: modèle cellulaire……………………………………….. 11
2.1. Etapes de la coagulation………………………………………………………………….. 11
2.1.1. Phase d’initiation…………………………………………………………………….. 11
2.1.2. Phase d’amplification………………………………………………………………… 13
2.1.3. Phase de propagation………………………………………………………………… 13
2.2. Régulation de la coagulation…………………………………………………………….. 15
2.2.1. Régulation positive…………………………………………………………………... 15
2.2.2. Régulation négative………………………………………………………………….. 16
3. Rôle du FVIII dans la coagulation……………………………………………………….. 18
III. Hémophilie A…………………………………………………………………………….. 20
1. Définition et épidémiologie……………………………………………………………... 20
2. Historique de la maladie………………………………………………………………… 20
3. Mode de transmission…………………………………………………………………… 21
4. Aspect clinique………………………………………………………………………….. 23
4.1. Classification…………………………………………………………………………... 23
4.2. Manifestations cliniques d’HA………………………………………………………….. 24
4.3. Diagnostic d’HA………………………………………………………………………… 25
4.4. Traitement……………………………………………………………………………… 25
IV. Aspect moléculaire de l’hémophilie A………………………………………………. 27
1. Description du gène F8…………………………………………………………………... 27
2. Les régions homologues des séquences localisées au niveau du gène F8……………….. 29
2.1. Les régions homologues Int22h…………………………………………………………. 29
2.2. Les régions homologues Int1h…………………………………………………………... 30
3. Protéine FVIII……………………………………………………………………………. 30
3.1. Biosynthèse du FVIII……………………………………………………………………. 30
3.2. Activation du FVIII……………………………………………………………………… 33
3.3. Inactivation du FVIII……………………………………………………………………. 34
3.4. Clairance du FVIII………………………………………………………………………. 36
4. Structure tridimensionnelle du FVIII…………………………………………………….. 37
4.1. Les domaines A………………………………………………………………………….. 39
4.2. Les domaines C………………………………………………………………………….. 41
4.3. Le domaine B……………………………………………………………………………. 42
5. Les interactions moléculaires du FVIII…………………………………………………... 42
5.1. Interaction du FVIII avec le VwF……………………………………………………. 42
5.2. Interaction du FVIII avec les phospholipides………………………………………... 44
5.3. Interaction du FVIIIa avec le FIXa au sein du complexe tenase…………………….. 47
5.4. Interaction avec le substrat FX……………………………………………………….. 48
5.5. Interactions du FVIII avec les LRP dans son catabolisme…………………………… 48
V. Anomalies génétiques responsable d’HA……………………………………………. 49
1. La micro inversion de l’intron 22………………………………………………………... 52
2. La micro inversion de l’intron 1…………………………………………………………. 54
3. Les mutations ponctuelles………………………………………………………………... 55
4. Les mutations de type décalage de cadre de lecture……………………………………... 57
5. Les délétions/insertions…………………………………………………………………... 57
5.1.1. Les délétions…………………………………………………………………………. 58
5.1.2. Les insertions………………………………………………………………………… 59
6. Les duplications………………………………………………………………………….. 59
VI. Développement des anticorps anti-FVIII…………………………………………….. 60
1. Caractéristiques des anticorps anti-FVIII………………………………………………... 60
2. Mécanisme d’action des anticorps anti-FVIII……………………………………………. 61
3. Détection des anticorps anti-FVIII……………………………………………………….. 62
4. Mécanisme immunitaire responsable du développement des inhibiteurs anti-FVIII……. 63
5. Les facteurs de risques associés au développement des inhibiteurs…………….………... 64
5.1.Les facteurs de risque génétiques………………………………………………………… 64
5.1.1. Le type de mutation au niveau du gène F8…………………………………………... 64
5.1.2. Origine ethnique et polymorphismes du gène du FVIII……………………………... 65
5.1.3. Antécédents familiaux……………………………………………………………….. 67
5.1.4. Les gènes de classes I et II du système Human Leucocyte Antigène (HLA)………... 67
5.1.5. Polymorphismes du gène TNFA, IL10 et CTLA4…………………………………… 68
5.1.5.1.Polymorphismes du gène d’IL10…………………………...………………………... 68
5.1.5.2.Polymorphismes du gène TNFA……………………………………………………... 69
5.1.5.3.Polymorphismes du gène CTLA4……………………………………………………. 69
5.2.Facteurs de risque dépendant au traitement……………………………………………… 70
OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE……………………………………………………. 71
POPULATION D’ETUDE & METHODES………………………………………………… 74
I. Population d’étude……………………………………………………………………….. 75
II. Méthodes…………………………………………………………………………………. 74
1. Stratégie d’études moléculaire du gène F8……………………………………………… 74
2. Extraction et dosage de l’ADN………………………………………………………….. 75
3. Amplification des ADN par Réaction d’Amplification en chaîne « PCR »…………….. 75
3.1.Principe…………………………………………………………………………………… 75
4. Détection de la micro-inversion d’intron 22 par PCR Long Range……………………... 77
4.1. Principe…………………………………………………………………………………... 77
4.2. Choix des amorces………………………………………………………………………. 79
4.3. Protocole expérimentale………………………………………………………………..... 79
4.3.1. Amplification de l’intron 22 avec les amorces PBQ…………………………………... 79
4.3.2. Amplification de l’intron 22 avec les amorces ABQ………………………………….. 79
4.3.3. Programme d’amplification……………………………………………………………. 79
4.3.4. Conditions d’électrophorèse…………………………………………………………… 80
5. Détection de la micro-inversion d’intron 1………………………………………………... 80
5.1. Principe…………………………………………………………………………………... 80
5.2. Choix des amorces………………………………………………………………………. 82
5.3. Protocole expérimentale…………………………………………………………………. 82
5.3.1. Amplification de l’intron l’intron 1 avec le Mix C……………………………………. 82
5.3.2. Amplification de l’intron l’intron 1 avec le Mix T……………………………………. 82
5.3.3. Programme d’amplification……………………………………………………………. 82
5.3.4. Conditions d’électrophorèse…………………………………………………………… 83
6. Détection des mutations du gène F8 par séquençage……………………………………… 83
6.1. Principe…………………………………………………………………………………... 83
6.2. Choix des amorces.……………………………………………………………………… 84
6.3. Etapes d’identification de mutations par séquençage…………………………………… 85
6.3.1. Amplification par PCR………………………………………………………………… 85
6.3.2. Purification des produits d’amplification……………………………………………… 85
6.3.3. Réaction de séquence………………………………………………………………….. 86
6.3.4. Purification du produit de réaction de séquence………………………………………. 86
6.3.5. Electrophorèse capillaire………………………………………………………………. 87
6.3.6. Analyse bioinformatique………………………………………………………………. 87
6.4. Nomenclature des variations de séquence……………………………………………….. 87
6.5. Mutation causale/polymorphisme……………………………………………………….. 88
7. Multiplex ligation Probe Amplification (MLPA)…………………………………………. 88
7.1. Principe…………………………………………………………………………………... 88
7.2. Protocole expérimentale…………………………………………………………………. 90
8. Détection des inhibiteurs…………………………………………………………………... 90
9. Analyse statistique…………………………………………………………………………. 90
10. Prédiction d’épitope……………………………………………………………………… 91
11. Etude in silico des effets délétères des mutations………………………………………... 92
11.1. Effets des mutations intronique sur le processus d’épissage…………………………… 92
11.2. Effets sur la structure/fonction de la protéine………………………………………….. 93
11.2.1. Prédiction d’effet de mutation sur la stabilité de la protéine par le logiciel I-Mutant
2.0…………………………………………………………………………………….. 93
11.2.2. Prédiction d’effet de mutation par Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT)………... 93
11.2.3. Prédiction d’effet de mutation par Polymorphism Phenotyping-2 (PolyPhen-2)……. 94
11.2.4. Prédiction d’effet de mutation par Align Grantham Variation Grantham Deviation
(Align GVGD)………………………………………………………………………... 94
11.2.5. Modélisation de la protéine mutée en 3D par le logiciel Swiss-Pdb Viewer………... 95
RESULTATS…………………………………………………………………………………. 96
I. Caractérisation génétique des anomalies moléculaires responsables d’HA dans la
population de l’Ouest Algérien : identification de deux nouvelles mutations………………... 98
1. Introduction……………………………………………………………………………….. 98
2. Résultats…………………………………………………………………………………... 99
2.1. Les micro-inversions de l’intron 22 et 1………………………………………………… 99
2.2. Les mutations ponctuelles………………………………………………………………... 100
2.2.1. Les mutations non-sens………………………………………………………………… 100
2.2.2. Les mutations au niveau d’un site d’épissage…………………………………………. 100
2.2.3. Les variations de séquence…………………………………………………………….. 100
2.2.3.1. Les mutations faux-sens……………………………………………………………... 101
2.2.3.2. Le polymorphisme…………………………………………………………………… 101
2.3. Détermination du statut des mutations détectées………………………………………… 102
2.4. Absence d’identification de mutation responsable de l’HA……………………………... 102
3. Article 1……………………………………………………………………………………. 103
II. Mutations du gène F8 et développement d’inhibiteur chez les patients hémophiles A
originaires de l’Ouest Algérien………………………………………………………………. 113
1. Introduction………………………………………………………………………………. 113
2. Résultats…………………………………………………………………………………... 114
3. Article 2………………………………………………………………………………….. 116
III. Prédiction in silico des effets délétères des mutations responsables d’HA dans la
population Algérienne………………………………………………………………………... 120
1. Introduction……………………………………………………………………………….. 120
2. Résultats…………………………………………………………………………………... 120
2.1.Analyse de la mutation c.5219+1G>T par HSF………………………………………….. 120
2.2.Analyse de la mutation c.5219+1 G>T par ESE Finder………………………………….. 121
2.3.Résultats obtenus par le logiciel I-Mutant 2.0…………………………………………… 121
2.4.Résultats obtenus par le logiciel SIFT……………………………………………………. 123
2.5.Résultats obtenus par le logiciel POLYPHEN-2…………………………………………. 124
2.6.Résultats obtenus par le logiciel Align GVGD…………………………………………… 125
2.7.Construction des structures 3D par le logiciel Swiss PDB Viewer………………………. 126
2.7.1. Paramètres analysés pour la prédiction des effets délétères des mutations faux sens... 126
2.7.1.1.Localisation des résidus substitués au niveau de la structure 3D du FVIII…………... 126
2.7.1.2.Comparaison des changements structuraux de la protéine FVIII….…………………. 127
2.7.1.3.Comparaison des propriétés physicochimiques entre les résidus normaux et mutés… 128
2.7.1.4.Comparaison de taille et orientation de chaine latérale des résidus normaux et mutés 131
DISCUSSION GENERALE………………………………………………………………….. 134
I. Caractérisation génétique des anomalies moléculaires responsables de l’HA dans la
population Algérienne : identification de deux nouvelles mutations………………… 134
II. Mutations du gène F8 et le développement des inhibiteurs chez les patients
hémophiles A Algériens……………………………………………………………… 143
III. Prédiction in silico des effets délétères des mutations responsables de l’HA dans la
population Algérienne………………………………………………………………... 146
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES……………………………………………………… 150
ANNEXES……………………………………………………………………………………. 154
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………………... 163
RESUME
Cette thèse représente une contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la

population Algérienne. Nous avons eu comme premier objectif de caractériser les anomalies
moléculaires du gène F8 responsables l’hémophilie A dans un échantillon constitué de 27
patients appartenant à 21 familles par l’utilisation de différentes méthodes de biologie
moléculaire (PCR Long Rang, PCR triplex, Séquençage et MLPA). L’analyse moléculaire du
gène F8 a permis l’identification des anomalies moléculaires responsables de l’hémophilie A
chez 18 familles. Ces mutations sont de cinq types : la micro-inversion de l’intron 22, la
micro-inversion de l’intron 1, deux mutations nonsenses (c.322A>T, c.5953C>T), une
mutation au niveau d’un site donneur d’épissage (c.5219+1G>T) et trois mutation faux-sens
(c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). A l’exception de la micro-inversion de l’intron 22 qui
est récurrente (57,89%), les autres types de mutations sont spécifiques à chaque famille. Deux
nouvelles mutations (c.5219+1G>T, c.2189G>A) ont été rapportées dans cette étude. Ces
deux mutations n’ont jamais été décrites dans d’autres populations ; elles sont spécifiques à la
population Algérienne. Dans la deuxième partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à
l’étude de la prédisposition génétique au développement des inhibiteurs. Ainsi, une
corrélation entre le statut développement des inhibiteurs et le type de mutation du gène F8 a
été réalisée. Aucune association n’a été identifiée entre le type de mutation du gène F8 et le
développement des inhibiteurs dans cet échantillon. Dans le troisième volet de cette thèse,
nous avons eu comme objectif de contribuer à la compréhension des mécanises moléculaires à
l’origine du déficit de la protéine FVIII. Ainsi, les effets délétères des nouvelles mutations
identifiées dans la première partie de cette étude et de la mutation c.200 A>C (citée dans les
bases de données et non étudiée) ont été prédits en utilisant une combinaison de logiciels
d’étude in silico et de modélisation moléculaire en 3D. La mutation c.5219+1G>T a été
prédite comme responsable d’un saut de l’exon 14. D’autre part, la mutation c.2189G>A a
été prédite comme responsable de la rupture d’un pont disulfure ayant comme effet la
dissociation du domaine A2 responsable d’une déstabilisation du FVIII. La mutation
c.200A>C a été prédite comme délétère au niveau de la structure ainsi que la fonction du
FVIII. Les différences de propriétés physico-chimiques entre les deux aa sont responsables de
la perte des interactions moléculaires au sein de la protéine FVIII. L’ensemble des résultats
obtenus, plaçant les patients hémophiles au centre de cette thématique de recherche, pourra
contribuer à moyen terme à installer un programme « conseil génétique » pour les familles à
risque et à améliorer la prise en charge des patients. A long terme ces résultats pourront
contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de cette
pathologie permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Mot-clés : Hémophilie A, F8, FVIII, anomalies moléculaires, PCR Long Rang, PCR triplex,
Séquençage, MLPA, inhibiteurs, étude in silico.
ABSTRACT
This thesis represents a contribution to the molecular analysis of hemophilia A in the Algerian
population. The aim of the first part of the study was to detect the F8 gene alterations in 27
patients belonging to 21 Algerian families using several biomolecular methods (PCR LR,
triplex PCR, DNA sequencing and MLPA). Molecular analysis of the F8 gene led to the
identification of molecular abnormalities responsible for hemophilia A in 18 families. These
mutations include intron 22 inversion, intron 1 inversion, two nonsense mutations (c.322A>T,
c.5953C>T), one splice site mutation (c.5219+1G>T), and three missense mutations
(c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). Except for intron 22 inversion that is recurrent
(57.89%), the other identified mutations are specific to each family. Two novel mutations
(c.5219 +1 G> T, c.2189G > A) were reported in this study. Both mutations have never been
described in other populations; they seem to be specific to the Algerian population. In the
second part of this study, we aimed to analyze the relationship between F8 gene mutation
types and inhibitor development. We showed that there was any association between F8 gene
mutations and the inhibitor development in our study-group. However, these findings should
be confirmed in a larger group of patients. Furthermore, deleterious effects of mutations on
FVIII protein were assayed using in silico tools and 3D molecular modeling. Thus, the
deleterious effects of novel mutations identified in the first part of this study and the mutation
c.200 A>C (just cited in databases but not studied) were predicted. The donor splice site
mutation (c.5219+1G>T) was predicted to be responsible of exon 14 skipping. Moreover, the
novel missense mutation (c.2189G>A) was predicted to be responsible of the breakdown of a
disulfide bridge (Cys630-Cys711). Disruption of this disulfide bridge leads to an inactivation
of the FVIII by destabilization of the A2 domain. The mutation c.200A > C was predicted to
be deleterious to the FVIII structure and function. Differences in physicochemical properties
between the two aa are responsible for the loss of molecular interactions within the FVIII
protein. These overall results, placing patients with hemophilia A in the center of this area of
research, can help in the medium term to install a genetic counseling program for affected
families and to improve a better medical care of hemophiliac patient. In the long term, these
results will contribute to a better understanding of the molecular causes of this disease and to
fostering newer therapeutic strategies.
Keywords: Heamophilia A, F8, FVIII, mutations, PCR Long Rang, triplex PCR, DNA
Sequencing, MLPA, inhibitor, in silico.
‫ملخص‬
‫ان هذه األطروحة يه عبارة عن مساهمة يف دراسة وراثية جزيئية ملرض اهليموفيليا (أ) يف اجلزائر‪ .‬كأول هدف هلذه األطروحة‬
‫تمثل يف توصيف التشوهات اجلزيئية يف اجلني‪ F8‬املسؤولة عن اهليموفيليا (أ) يف عينة تتكون من ‪ 72‬مريض ينتمون ل‪72‬‬
‫أرسة عن طريق استخدام خمتلف تقنيات ابليولوجيا اجلزيئية ‪(PCR Long Rang, PCR triplex,Séquençage et‬‬
‫)‪ .MLPA‬لقد سمح اتلحليل اجلزييئ بتحديد مخسة أنواع من الطفرات املسؤولة عن اهليموفيليا (أ) يف ‪ 21‬أرسة انقالب‬
‫جزيئ يف اإلنرتون ‪ ،77‬انقالب جزيئ يف إنرتون ‪ ،2‬طفرتان هرائيتان )‪ , (c.322A>T, c.5953C>T‬طفرة يف املوقع املانح‬
‫للربط )‪ (c.5219 + 1G> T‬وثالثة طفرات مغلطة )‪ (c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A‬باستثناء طفرة‬
‫انقالب جزيئ يف اإلنرتون ‪ 77‬كثرية االنتشار (‪ )٪92.15‬فالطفرات األخرى يه حمددة للك أرسة‪ .‬يف هذه ادلراسة لقد تم‬
‫اكتشاف طفرتني جديدتني )‪ (c.5219+1G>T, c.2189G>A‬لم يسبق وصفهما يف الشعوب األخرى و باتلايل فهما‬
‫ختصان الشعب اجلزائري‪ .‬يف اجلزء اثلاين هلذه ادلراسة‪ ،‬انصب اهتمامنا ىلع دراسة االستعداد الورايث النتاج املثبطات‪,‬‬
‫وكذااالرتباط بني حالة االنتاج و نوع الطفرة اجلينية‪. F8‬انلتائج أسفرت عن عدم وجود أي ارتباط بني نوع الطفرات و‬
‫انتاج املثبطات‪ .‬يف اجلزء اثلالث و األخري هلذه ادلراسة سعينا لفهم األيلات اجلزيئية اليت تسبب العجز يف الربوتني‬
‫‪.FVIII‬ذللك تم دراسة اآلثار الضارة للطفرتني اجلديدتني و طفرة‪( C.200 A> C‬مقتبسة من قاعدة ابليانات و غري‬
‫مدروسة) عن طريق استخدام برجميات لدلراسة يف السيليكون و انلمذجة اجلزيئية ثالثية األبعاد‪ .‬ان الطفرة‬
‫‪ c.5219+1G>T‬مسؤولة عن ختطي اكسون ‪ 21‬يف حني أن الطفرة ‪ c.2189G>A‬مسؤولة عن غياب جرس كربييت يف‬
‫الربوتني املسؤول عن احنالل امليدان ‪ A2‬مما يؤدي اىل زعزعة استقرارالربوتني ‪ . FVIII‬الطفرة ‪ c.200A>C‬أظهرت أتار‬
‫سلبية ىلع بنية و وظيفة الربوتني ‪ FVIII‬حبيث االختالفات يف اخلصائص الفزييائية والكيميائية للحمضني االمينني (لزيين و‬
‫ثريونني) تؤدي اىل فقدان روابط جزيئية ىلع مستوى الربوتني ‪ .FVIII‬انلتائج املتحصل عليها يف هذا ابلحث تساعد ىلع ىلع‬
‫املدى املتوسط بوضع برنامج "االستشارة الوراثية" لألرس املعرضة للخطر و حتسني راعية املرىض ‪ .‬أما ىلع املدى الطويل فهذه‬
‫انلتائج ستساهم يف فهم أفضل لآليلات اجلزيئية األصلية هلذا املرض مما يسمح بوضع اسرتاتيجيات عالجية جديدة‪.‬‬
‫كلمات البحث‬
‫اهليموفيليا (أ) ‪، PCR،‬الطفرات‪.F8 ،FVIII،‬‬

A
Mes chers parents
Mes deux sœurs
Mon adorable frère
Mon futur mari
Ma famille & mes amis
REMERCIEMENTS
Mes remerciements s’adressent en premier lieu à Madame le professeur SAIDI-MEHTAR

Nadhira, qui m’a fait l’honneur de présider le jury de cette thèse. Veuillez accepter Madame
le témoignage de ma gratitude et de mon profond respect.
Mes remerciements les plus respectueux vont à Monsieur le professeur BOUDJEMA

Abdallah qui a bien voulu examiner ce travail. Veuillez accepter Monsieur le témoignage de
ma reconnaissance et de mon respectueux hommage.
J’adresse mes vifs remerciements à Mme le professeur MESLI Farida qui a accepté avec une
très grande amabilité d’examiner ce travail. Sensible à l’intérêt que vous avez bien voulu
porter à ce travail, je vous prie de croire en mon éternel respect et ma sincère gratitude
Mes remerciements s’adressent également à Monsieur le Professeur BABA-HAMED

Mohamed Bey. Vos compétences scientifiques seront d’une valeur inestimable pour enrichir
ce travail. Je suis honorée que vous ayez accepté d’en être l’examinateur de cette thèse et je
vous en remercie très chaleureusement.
Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur SAHRAOUI Tewfik. Vous me faites le

grand plaisir d’accepter d’être examinateur de ce travail et de l’enrichir de vos éminentes
compétences dans le domaine. Veuillez y trouver l’expression de mon estime et de mes
sincères remerciements.
Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur TOUHAMI Hadj. Vos compétences

scientifiques seront d’une valeur inestimable pour enrichir ce travail. Je suis honorée de votre
présence dans mon jury de thèse et je vous en remercie très chaleureusement.
L’expression de ma haute reconnaissance s’adresse à ma directrice de thèse madame le
docteur ZEMANI-FODIL Faouzia. Que ce travail soit le témoignage de ma sincère gratitude
et de mon estime pour la confiance, les encouragements et le soutien inconditionnel que vous
avez manifesté à mon égard depuis mon Master et tout au long des années de préparation de
cette thèse.
Je remercie vivement Monsieur le docteur LE BONNIEC Bernard pour m’avoir si

chaleureusement accueilli au sein de l’unité INSERM U765 (Faculté des Sciences
Pharmaceutiques et Biologiques) et de m’avoir initiée à la modélisation moléculaire. Je
souhaite également remercier Madame le docteur COSTA Catherine pour son aide précieuse.
Cette thèse a été réalisée sous la direction du docteur ZEMANI-FODIL Faouzia au sein de
l’équipe «Immunogénétique et pharmacogénétique humaine » dirigée par le professeur
BOUDJEMA Abdallah au niveau du Laboratoire de Génétique Moléculaire et Cellulaire
(LGMC, USTO-MB) dirigé par Madame le professeur SAIDI-MEHTAR Nadhira.
Pour cela je tiens à ré-exprimer mes remerciement à :
Ma directrice de thèse pour toute la confiance qu’elle m’a accordée.
Monsieur le Professeur BOUDJEMA Abdallah pour m’avoir intégrée au sein de son équipe.
Madame le professeur SAIDI-MEHTAR Nadhira pour m’avoir accueillie dans son
laboratoire.
Mes remerciements les plus sincères vont également aux membres du Laboratoire de
Génétique Moléculaire et Cellulaire (LGMC, USTO-MB). Je remercie également Monsieur
BENAISSA Abdenour pour son aide précieuse.
Je tiens à exprimer mes sincères remerciements:

A tous les patients hémophiles et leurs familles.
A tous le staff hospitalier qui a contribué à la réalisation de cette étude, Je pense plus
particulièrement à :
Monsieur, le professeur TOUHAMI, Chef de service d’hématologie du CHU d’Oran.
Madame, le docteur RAHAL, service d’hématologie du CHU d’Oran.
Madame, le docteur CHERIF HOSNI, service d’hématologie du CHU d’Oran.
Monsieur, le docteur MASSOUDI, service d’hématologie du CHU d’Oran.
Madame, le docteur MOULAY SERDOUNE, service d’hémobiologie du CHU d’Oran.
Monsieur, le docteur BENLALDJ, service d’hémobiologie du CHU d’Oran.
Madame, le professeur MESLI, Chef de service d’hématologie du CHU de Tlemcen.
Monsieur, le professeur BELAZAAR, Chef de service d’hématologie du CHU de Sidi Bel
Abbes.
Madame, le professeur MEHALHAL, Chef de service d’hématologie du CHU de Mascara.
Les travaux de cette thèse ont été réalisés au laboratoire de Génétique Moléculaire et
Cellulaire (LGMC, USTO-MB) et soutenus par l’Agence Thématique de Recherche en
Sciences de la Santé (ATRSS ex Agence National pour le Développement de la Recherche en
Santé « ANDRS ») et par la Commission Nationale d’Evaluation des Projets de Recherche
Universitaire (CNEPRU).
A tous ceux qui de prés ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail, qu’ils trouvent
l’expression de mes vifs remerciements.
LISTE DES ABREVIATIONS
3’UTR: Région 3’ non traduite

3D: 3 Dimensions
aa: acides aminés
ADN: Acide Désoxyribonucléique
Align GVGD: Align Grantham Variation Grantham Deviation
APC: protéine C activé
ARNm: Acide Ribonucléique Messager
ASF/SF2: Alternative Splicing Factor/Splicing Factor 2
ASGPR: récepteur à l’asialoglycoproteine
AT: Antithrombine
BLOSUM62: BLOcks SUbstitution Matrix 62
BRCC3: BRCA1/BRCA2-Containing Complex, Subunit 3
Ca2+: ion calcium
CCM: Chemical Cleavage of Mismatch
CD: Cellules Dendritiques
CHAMP: CDC Hemophilia A Mutation Project
CHU: Centres Hospitalo-Universitaires
CPA: Cellules Présentatrices d’Antigènes
CSGE: Conformation Sensitive Gel Electrophoresis
CTLA4: Cytotoxic T Lymphocyte associated protein 4
Cu2+: ion cuivre
DDG: Différence d’énergie libre
ddNTP: didésoxyribonucléotides
dHPLC: denaturing High Performance Liquid Chromatography
DMSO: diméthyle sulfoxide
dNTP: désoxyribonucléotides
EDTA: Ethylène Diamine Tétra Acétique
EJC: Complexe de Jonction des Exons
ENH: Elastases de Neutrophiles Humains
EPCR: Récepteur Endothélial de la Protéine C
ERGIC: Compartiment Intermédiaire entre RE-Golgi
ESE: Exonic Splicing Enhancer
ESE Finder: Exonic Splicing Enhancer-finder
F8: Facteur 8
FEIBA: Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity
FIIa: Facteur IIa
FIX: Facteur IX
FT: Facteur tissulaire
FVa: Facteur Va
FVII: Facteur VII
FVIII: Facteur VIII
FvW: Facteur von Willebrand
FX: Facteur X
FXI: Facteur XI
FXII: Facteur XII
FXIII: Facteur XIII
Gla: Gamma-carboxyglutamic acid-rich du FIXa
GPIIb/IIIa: Glycoprotéine IIb/IIIa
H: Haplotypes
HA: Hémophilie A
HAMSTeRS: Haemophilia A Mutation, Structure, Test, and Resource Site
HAP40: Protéine Associée à l’Huntingtine
HGMD: Human Gene Mutation Database
HGVS: Human Genome Variation Society
HRM: High Resolution Melting Analysis
HSF: Human Splicing Finder
HSPG: Récepteurs à Protéoglycannes à Héparine Sulfate
HLA: Human Leucocyte Antigène
IC: Intervalle de Confiance
IEDB: Immune Epitope Database
IgG: immunoglobulines G
IL2: Interleukine 2
IL4: Interleukine 4
IL10: Interleukine 10
INF-γ: interféron-gamma
ISTH: International Society on Thrombosis and Haemostasis
JCPA: Jours Cumulés en Présence de l’Antigène
kb: kilobases
kDa: Kilo Dalton
LDLR: Récepteurs associées aux Low Density Lipoprotein
LMAN1: Lectin Mannose-Binding 1
LT: Lymphocytes T
LB: Lymphocytes B
MCFD2: Multiple Coagulation Factor Deficiency protein 2
MIB: Malmö Internationale Brother
min: minutes
ml: millilitre
MLPA: Multiplex Ligation Probe Amplification
NMD: Nonsense Mediated mRNA Decay
OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man
OR: Odds Ratio
p : valeur p
PAR: Pseudo Autosomic Region
pb: paires de base
PCR: Polymerase Chain Reaction
PCR LR: Polymerase Chain Reaction Longue Range
PDB: Protein Data Bank
PDF: Produits de Dégradation de Fibrine
pFVIII: FVIII d’origine plasmatique
PG: plasminogène
PLs: phospholipides
PolyPhen-2: Polymorphism Phenotyping-2
SC35: Spliceosomal Component 35
sec: secondes
SIFT: Sorting Intolerant From Tolerant
SNP: Single Nucléotide Polymorphisme
SRp 40: SR protein 40
SRp55: SR protein 55
SVM: Support Vector Machine
TAFI: Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor
TCA: Temps de Céphaline Activée
TFPI: Inhibiteur de la voie du FT
The CANAL Study: Concerted Action on Neutralizing Antibodies in severe hemophilia A
TM: Thrombomoduline
t-PA: Activateur tissulaire du Plasminogène
UB: Unités Bethesda
UI: Unité Internationale
VBP1: Von Hippel-Lindau syndrome binding protein 1
vs: versus
WFH: Word Federation of Hemophilia
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique des trois tuniques constituant un vaisseau sanguin,
adaptée d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
Figure 2 : Représentation schématique des différentes étapes d’hémostase primaire, adaptée

d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
Figure 3: Représentation schématique du mécanisme de fibrinolyse, adaptée d’après (Boneu

& Cazenave, 1997).
Figure 4: Représentation schématique de la cascade de coagulation classique, adaptée d’après

(Sherwood et al, 2006).
Figure 5: Représentation schématique de l’étape d’initiation de la coagulation in vivo, adaptée

d’après (Turpie & Esmon, 2011).
Figure 6: Représentation schématique de l’étape d’amplification de la coagulation in vivo,

adaptée d’après (Turpie & Esmon, 2011).
Figure 7: Représentation schématique de l’étape de propagation de la coagulation in vivo,

Figure 8: Représentation schématique de la transformation de fibrinogène en monomère de

fibrine, adaptée d’après (Turpie & Esmon, 2011).
Figure 9: Représentation schématique des systèmes majeurs de régulation physiologique de

la coagulation, adaptée d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
Figure 10 : Représentation schématique du système inhibiteur APC. A. Activation de la

protéine C en APC. B. Inactivation du FVa par l’APC. C. Inactivation du FVIIIa par l’APC.
Figure 11: Mode de transmission de l’HA. A. Descendance d’un homme hémophile,

B. Descendance d’une femme conductrice.
Figure 12: Localisation chromosomique et structure du gène du F8. (A) Représentation du
chromosome X. (B) Localisation chromosomique du gène F8. (C) Répartition des 26 exons du
gène F8. (D) Représentation des deux gènes additionnels au F8 : F8A et F8B.
Figure 13: Localisation des régions homologues des deux séquences Int22h-1 et Int1h-1 du
gène F8, d’après (Oldenburg & Pavlova, 2006).
Figure 14: Représentation schématique expliquant les étapes de synthèse et sécrétion du

FVIII.
Figure 15 : Représentation schématique de la structure primaire du FVIII.
Figure 16 : Représentation schématique des sites de clivage au niveau de la protéine FVIII

(A) et la structure du FVIII circulant (B).
Figure 17 : Représentation schématique des sites d’activation et de la structure activée de la

protéine FVIII.
Figure 18 : Représentation schématique des mécanismes d’inactivation de la protéine FVIII.
Figure 19: Représentation schématique de différents sites de clivage lors de l’inactivation

protéolytique du FVIII.
Figure 20: Représentation schématique du lieu et mécanisme de clairance. A. Constitution

d’un vaisseau hépatique. B. les cellules et les récepteurs impliqués dans la clairance du FVIII,
d’aprés (Lenting et al, 2007).
Figure 21: Représentation schématique des structures tridimensionnelles du FVIII. D’après

(Ngo et al, 2008; Shen et al, 2008).
Figure 22 : A. Structure tridimensionnelle des domaines A du FVIII. B. Structure

tridimensionnelle de la céruloplasmine C. Capture superposée des deux structure
tridimensionnelle du FVIII et FV. D’après (Shen et al, 2008).
Figure 23 : Modèles moléculaires des domaines A. A. Composition des sous-domaines A,

d’après (Parker & Lollar, 2007). B. Les domaines A1, A2 et A3 forment un hétérotrimère
triangulaire autour d’une symétrie centrale en 3 axes, d’après (Ngo et al, 2008).
Figure 24 : Localisation des ions métalliques de la protéine FVIII, d’après (Ngo et al, 2008).
Figure 25 : Représentation de la structure des domaines C du FVIII. A, d’après (Ngo et al,

2008).
Figure 26 : Localisation des substitutions des aa situées au niveau des domaines C empêchant
la liaison au FvW, d’après (Terraube et al, 2010). Les sphères vertes indiquent les aa dont la
mutation entraine une diminution de la liaison du FvW.
Figure 27: Sites d’interaction du domaine C2 avec la membrane phospholipidique, d’après

(Schatz et al, 2004). Les principaux feuillets β sont représentés en ruban gris foncé. Les quatre
boucles qui interagissent avec la membrane phospholipidique sont représentées en gris clair.
Figure 28: Sites d’interaction impliqués dans la liaison du FVIIIa à la membrane

phospholipidique, d’après (Liu et al, 2010).
Figure 29 : Principaux sites d’interaction du FVIIIa avec le FIXa, d’après (Ngo et al, 2008).
Les sites de liaison du FVIII (molécule de gauche) impliqués dans l’interaction avec le FIXa
(molécule de droite) sont représentés en bleu (558-565), violet (712) et rose (1811-1818).
Figure 30: Distribution des nouvelles mutations responsable d’HA déclaré par la CHAMP par
année de publication, d’après (Payne et al, 2013).
Figure 31 : Structure des chromosomes sexuels mâles humains et la localisation des deux
régions PAR1 et PAR2, d’après (Flaquer et al, 2008).
Figure 32: Représentation schématique du mécanisme responsable de micro inversion de

l’intron 22, adaptée à partir de (Graw et al, 2005).
Figure 33: Représentation schématique du mécanisme responsable de la micro-inversion de

Figure 34: Distribution des mutations ponctuelles sur les différents domaines du FVIII,
d’après (Payne et al, 2013).
Figure 35: Représentation schématique des larges délétions responsables d’HA,

Figure 36: Représentation schématique des épitopes reconnus par les inhibiteurs anti-FVIII.
Figure 37: Mécanismes simplifiés de la réponse immunitaire responsable du développement

des inhibiteurs anti-FVIII, d’après (Cayzac et al, 2010).
Figure 38: Représentation schématique des SNP identifiés au niveau du gène F8,
d’après (Viel et al, 2009).
Figure 39: Représentation schématique des six haplotypes F8, d’après (Viel et al, 2009).
Figure 40: Représentation schématique des deux FVIII thérapeutique Kogenate®

et Recombinate®, d’après (Viel et al, 2009).
Figure 41: Représentation schématique des étapes de la PCR classique d’après (Read et al,
2008).
Figure 42 : Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de

l’intron 22 au niveau du gène F8.
Figure 43: Représentation schématique du profil électrophorétique des résultats de détection

de micro-inversion de l’intron 22 attendus.
Figure 44: Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de


Figure 46 : Représentation schématique du principe de séquençage, d’après (Read et al,

2008).
Figure 47 : Représentation schématique des différentes étapes de MLPA

(http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormMain.aspx).
Figure 48 : Résultat de l’analyse de la mutation c.5219+1G>T par le logiciel HSF.
Figure 49 : Représentation de distribution des motifs de fixation des cinq protéines SR au

niveau de la séquence normale du gène F8 (A) et celle contenant la mutation c.5219+1G>T
(B).
Figure 50 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel I-Mutant 2.0.
Figure 51 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel SIFT.
Figure 52 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel PolyPhen-2.
Figure 53: Exemple de résultat obtenu par Align GVGD.
Figure 54: Localisation de la lysine 48 et cystéine 711 au niveau de la structure

cristallographique de la protéine FVIII.
Figure 55: Structures 3D des deux protéines FVIII normale (A) et mutée (B).
Figure 57 : Les structures schématiques de la lysine et la thréonine.
Figure 58 : Les structures schématiques de la cystéine et la tyrosine.

Figure 59: Capture superposée des deux structures 3D du FVIII sauvage et mutée (vue sur
deux ongles différents à gauche et à droite). La protéine FVIII est représentée sous forme
ribbon de couleur grise. La chaîne latérale de l’aa lysine est représentée en vert tandis que
celle de l’aa thréonine est représentée en rouge.
Figure 60: Capture superposée des deux structures 3D du FVIII sauvage et mutée (vue sur
deux ongles différents à gauche et à droite). La protéine FVIII est représentée sous forme
ribbon de couleur grise. La chaîne latérale de l’aa cystéine est représentée en vert tandis que
celle de la tyrosine est représentée en rouge.
Figure 61: Représentation schématique du mécanisme de la méthylation, adaptée d’après

(Waggoner, 2007).
Figure 62 : Conséquence prédite de l’impact de la mutation c.5219+1G>T sur l’épissage.

LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Classification de la sévérité de l’HA selon les recommandations de la société

internationale de thrombose et de l’hémostase (International Society on Thrombosis and
Haemostasis, ISTH) (White et al, 2001).
Tableau 2 : Liste des mutations responsable d’HA répertoriées dans la CHAMP database
dernière mise à jour Mars 2013 http://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/champs.html.
Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées dans l’amplification par PCR LR.
Tableau 4: Programme d’amplification de la PCR LR.
Tableau 5: Séquences des amorces utilisées dans l’amplification par PCR triplex.
Tableau 6 : Programme d’amplification de la PCR.
Tableau 7: Tableau résumant les résultats obtenus par le logiciel Mutation Taster.
Tableau 8: Détermination du statut des mutations détectées.
Tableau 9 : Les résultats obtenus par le logiciel I-Mutant 2.0.
Tableau 10: Les différentes propriétés physico-chimiques correspondant aux couleurs des aa
obtenus par SIFT.
Tableau 11 : Les résultats obtenus par le logiciel SIFT.
Tableau 12 : Les résultats obtenus par le logiciel PolyPhen-2.
Tableau 13 : Les résultats obtenus par le logiciel Align GVGD.
Tableau 14 : les propriétés physicochimiques des aa lysine et thréonine.
Tableau 15 : Les propriétés physicochimiques des deux aa cystéine et tyrosine.
Tableau 16: Tableau résumant les fréquences des micro-inversions de l’intron 22 et 1 rapportée
dans différentes population.
Tableau 17: Liste de publications rapportant la mutation c.6545G>A responsable de l’HA
(un exemple de chaque population).
Tableau 18 : Tableau résumant les fréquences de développement des inhibiteurs chez les
patients présentant la micro-inversion de l’intron 22.
INTRODUCTION GENERALE
La survenue d’une plaie vasculaire entraîne un mécanisme de défense qui lutte contre
l’issue du sang hors du système vasculaire appelé hémostase. L’hémostase est le processus
physiologique regroupant les différents mécanismes qui assurent la prévention des
saignements spontanés par la formation d’un thrombus plaquettaire qui sera par la suite
consolidé par un réseau de fibrines. Ce processus comprend trois phases très intriquées :
l’hémostase primaire, l’hémostase secondaire et la fibrinolyse.
L’hémostase implique plusieurs facteurs (cellules et protéines) qui seront activés

au site de la brèche vasculaire et régulés spatialement et temporellement par différents
systèmes d’inhibiteurs physiologiques. Un déficit d’un des mécanismes d’hémostase de type
facteurs ou inhibiteurs conduit à l’apparition de plusieurs maladies caractérisées, selon le
système impliqué, par des complications thrombolytiques ou hémorragiques, comme cela a
été longtemps documenté pour l’hémophilie A (HA).
L’HA est une maladie hémorragique rare transmise selon le mode récessif lié au
chromosome X, consécutive à l’absence du Facteur VIII (FVIII). Cette pathologie est associée
à une forte morbidité comprenant les hémorragies, les arthropathies et un risque de mortalité
très élevé. Plusieurs anomalies moléculaires au niveau du gène Facteur 8 (F8) sont à l’origine
du déficit qualitatif ou quantitatif en FVIII.
Le traitement privilégié des accidents hémorragiques chez les patients hémophiles

repose sur l’administration de FVIII thérapeutique d’origine plasmatique ou recombinant.
Cependant, chez environ 30% des patients ce traitement induit la production d’anticorps anti-
FVIII. Ces inhibiteurs dégradent le FVIII, inhibent son activité pro-coagulante et suppriment
tout bénéfice thérapeutique du traitement. L’apparition de ces inhibiteurs plonge les patients
dans une impasse thérapeutique majeure et affecte de façon drastique leur qualité de vie tout
en augmentant dangereusement la morbidité et la mortalité de la maladie.
Au cours de ce travail de thèse, trois principaux axes de recherches ont été développés.
Dans le premier axe, nous avons caractérisé les mutations du gène F8 responsables de l’HA
dans un échantillon de patients de la population Algérienne. A la suite des résultats obtenus
dans le premier axe, deux autres axes de recherche ont été développés.
Dans le deuxième axe de recherche, nous avons recherché l’existence d’une éventuelle
association entre le type de mutation du gène F8 et le développement des inhibiteurs
anti-FVIII. Dans le troisième axe, nous avons prédit les effets délétères des mutations du gène
F8 identifiées en utilisant différents logiciels d’étude in silico et de modélisation moléculaire
en 3 Dimensions (3D).
Cette thèse est divisée en cinq parties; une étude bibliographique où nous décrivons en
six chapitres : la structure du vaisseau sanguin et l’hémostase, la cascade de coagulation,
l’hémophilie A, l’aspect moléculaire de l’hémophilie A, les anomalies génétiques
responsables de l’hémophilie A et le développement d’anticorps anti-FVIII.
Les méthodes utilisées dans cette étude sont détaillées dans la partie population d’étude et
méthodes.
Les résultats obtenus lors de cette étude sont présentés sous forme de deux
publications complétées par des résultats non publiés. Une introduction au contexte de l’étude
et un résumé des principaux résultats obtenus précèdent chaque article. Une discussion
générale des résultats obtenus suit la partie résultats. Cette thèse est terminée par une
conclusion générale et des perspectives.
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Vaisseau sanguin et hémostase
1. Vaisseau sanguin
Chez l’humain, les vaisseaux sanguins sont des structures faisant partie d’un système
circulatoire clos. La fonction de ce système est d’assurer la circulation du sang afin de
permettre les échanges gazeux et le transport des nutriments nécessaires au bon
fonctionnement de chaque organe.
La composition anatomique des vaisseaux sanguins repose sur un assemblage de

plusieurs couches cellulaires et non cellulaires variant selon la nature et le calibre vasculaire.
Les vaisseaux sanguins sont constitués de trois couches, également appelées tuniques séparées
par deux limitantes élastiques ; l’adventice, la média et l’intima (Figure 1) (Mulvany &
Aalkjaer, 1990).
Figure 1 : Représentation schématique des trois tuniques constituant un vaisseau sanguin,

adaptée d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
Selon le type de vaisseau, l’importance des trois tuniques varie, pouvant aller de la
simple monocouche de cellules endothéliales (micro-vascularisation) à des vaisseaux très
épais (artères). L’adventice, couche externe de la paroi vasculaire, est constituée
principalement de collagènes et de fibroblastes. Cette tunique contient également des nerfs
du système nerveux autonome permettant l’innervation du muscle lisse de la média.
La média contient exclusivement des cellules musculaires lisses vasculaires et des
constituants matriciels tels que l’élastine ou le collagène. L’intima ou l’endothélium est
constituée d’une monocouche de cellules endothéliales imbriquées les unes aux autres
directement en contact avec le sang et d’une lame basale formée de collagène et de fibres
élastiques. Les cellules endothéliales sont impliquées dans la régulation de la plupart des
fonctions physiologiques vasculaires tels que l’hémostase, la réponse immunitaire et
inflammatoire, le tonus vasomoteur, la réparation tissulaire ainsi que l’angiogenèse
(Puissant et al, 2014).
Toute altération de l’intégrité d’un vaisseau sanguin met à nu des structures

sous-endothéliales telles que le collagène et le Facteur tissulaire (FT) qui, en contact direct
avec le sang, induisent les phénomènes de l’hémostase (Furie & Furie, 2008; Sere &
Hackeng, 2003).
2. Hémostase
L’hémostase est l’ensemble des phénomènes physiologiques permettant de maintenir

l’intégrité d’un vaisseau sanguin tout en arrêtant le saignement causé suite à une brèche
vasculaire évitant ainsi les thromboses (Turpie & Esmon, 2011). L’hémostase nécessite la
coopération de la paroi vasculaire à l’endroit de la brèche, des cellules sanguines, notamment
les plaquettes, et des protéines plasmatiques. L’hémostase est divisée en plusieurs étapes qui
se déroulent successivement : l’hémostase primaire dont le résultat est la formation du
thrombus plaquettaire ou caillot, l’hémostase secondaire où ce caillot sera consolidé par un
réseau de fibrine, puis la fibrinolyse, l’étape qui permet la dégradation du thrombus et un
retour à la normale de la circulation sanguine.
2.1. Hémostase primaire
L’hémostase primaire représente l’ensemble des interactions complexes entre la paroi

vasculaire, les plaquettes et les protéines adhésives qui aboutissent à l’obturation de la brèche
vasculaire par un thrombus plaquettaire.
Brièvement, l’hémostase primaire débute lorsqu’une brèche apparaît dans la paroi

vasculaire. Cette lésion induit une vasoconstriction locale qui favorise une interaction
des plaquettes au sous-endothélium (Figure 2.A). Cet adhésion est rendue possible par le
Facteur von Willebrand (FvW), sécrété par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes,
qui interagit avec une glycoprotéine membranaire de la plaquette (GPIb) d’une part,
et avec le collagène sous-endothélial d’autre part (collagène de type I). L’adhésion des
plaquettes au sous endothélium entraîne leur activation (Figure 2.B). Une fois activées, ces
plaquettes vont exprimer à leurs surfaces le récepteur spécifique du fibrinogène (sécrété par le
foie) : la glycoprotéine IIb/IIIa (GPIIb/IIIa). L’interaction du fibrinogène avec la GPIIb/IIIa
permet l’agrégation plaquettaire. Ces plaquettes vont constituer entre elles des ponts
inter-plaquettaires par l’intermédiaire du fibrinogène, formant ainsi le clou plaquettaire dont
le principal rôle est d’obstruer la brèche (Figure 2.C) (Clemetson, 2012). Le clou plaquettaire
formé au cours de l’hémostase primaire est fragile et devra être consolidé par un réseau de
fibrine, qui sera par la suite constitué au cours de l’hémostase secondaire.
Figure 2 : Représentation schématique des différentes étapes d’hémostase primaire, adaptée

d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
2.2. Hémostase secondaire
Dans un deuxième temps, l’hémostase secondaire permet de consolider le clou

plaquettaire constitué lors de l’étape d’hémostase primaire grâce à la formation d’un réseau de
fibrine. Cette réaction en chaîne est connue sous le nom de « cascade de la coagulation ».
La physiologie de cette cascade sera revue en détail dans le chapitre intitulé : Cascade de
coagulation (cf. chapitre II). Nous nous intéresserons plus particulièrement à la coagulation
car c’est au cours de cette étape qu’intervient le FVIII, principal acteur de cette étude.
2.3. Fibrinolyse
La fibrinolyse est un processus enzymatique qui intervient de façon physiologique afin

d’éviter le dépôt excessif de fibrine et pour tenter de reperméabiliser un vaisseau sanguin
après formation d’un thrombus. Elle intervient quelques jours après la formation du réseau
de fibrine, grâce à l’action protéolytique de la plasmine dont le précurseur inactif est le
plasminogène (PG). Sous l’influence d’activateurs, essentiellement l’activateur tissulaire du
plasminogène (t-PA), le plasminogène se transforme en plasmine (Figure 3). La plasmine est
une enzyme protéolytique très puissante, capable de dégrader le caillot de fibrine mais aussi
de détruire le fibrinogène voire d’autres facteurs de coagulation (Rijken & Lijnen, 2009). Les
produits de dégradation de fibrine (PDF) seront par la suite éliminés par voie rénale ou
hépatique.
Figure 3: Représentation schématique du mécanisme de fibrinolyse, adaptée d’après (Boneu

& Cazenave, 1997).
II. Cascade de coagulation
Comme nous avons mentionné dans le premier chapitre, la cascade de coagulation

permet de consolider le clou plaquettaire constitué lors de l’hémostase primaire.
Elle fait intervenir et interagir de nombreux facteurs procoagulants et anticoagulants.
L’enzyme clé de cette étape est la thrombine (Facteur IIa, FIIa), provenant elle-même de la
transformation de son précurseur inactif, la prothrombine (Facteur II, FII). La thrombine est
capable de cliver le fibrinogène en fibrine. La polymérisation des mailles de fibrine va
permettre la constitution du thrombus fibrinocruorique.
1. La cascade de coagulation classique
Le concept de cascade de coagulation en tant que série d’étapes enzymatiques a été

décrit pour la première fois en 1964 par Davie et MacFarlane (Davie & Ratnoff, 1964;
Macfarlane, 1964). Ce concept a mis en évidence l’activation de précurseurs inactifs, ou
zymogènes, étape nécessaire à la formation finale d’un caillot de fibrine.
La cascade de coagulation classique a été dès lors décrite en deux voies distinctes,
intrinsèque (endogène) et extrinsèque (exogène), convergeant en une voie commune, étape
finale de la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble (Mosesson, 1992).
1.1. Voie intrinsèque et voie extrinsèque
Ces deux voies de cascade de coagulation ont été décrites comme étant soit
dépendantes du contact entre le plasma et une surface chargée négativement (la voie
intrinsèque) soit associées à l’introduction d’éléments, dont l’origine est externe au sang, dans
le plasma (la voie extrinsèque) (Adams & Bird, 2009).
La voie intrinsèque est initiée par le contact entre la circulation sanguine et des
surfaces exposées lors d’une lésion de la paroi vasculaire (Figure 4). Elle requiert donc
uniquement des substances présentes dans le sang et fait intervenir quatre facteurs de
coagulation : Facteur XII (FXII), Facteur XI (FXI), Facteur IX (FIX), et FVIII. La surface
électronégative active le FXII qui active à son tour le FXI. Sous l’action du FXIa, le FIX
devient actif. Le FIXa, fixé aux phospholipides (PLs) en présence d’ions calcium (Ca2+) et de
son cofacteur activé (FVIIIa), va former un complexe activateur du Facteur X (FX) également
appelé complexe tenase intrinsèque.
Figure 4: Représentation schématique de la cascade de coagulation classique, adaptée d’après
(Sherwood et al, 2006).
Cependant, la cascade extrinsèque est ainsi initiée lors d’une lésion tissulaire qui mène
à l’exposition du FT, une glycoprotéine située à la surface des cellules sous endothéliales
(Figure 4). Cette voie implique le FT et le Facteur VII (FVII) (Broze, 1995). Ensemble, ils
forment le complexe tenase extrinsèque (Butenas & Mann, 2002), qui une fois activé exerce
son activité catalytique vis-à-vis du FX, le menant à une forme active (FXa) (Marlar et al,
1982).
1.2. Voie commune finale
Les deux voies convergent ainsi vers l’activation du FX. Le FXa, via le complexe
prothrombinase (FXa/Facteur Va (FVa)/PLs/Ca2+), hydrolyse et active la prothrombine en
thrombine (Figure 4). Finalement, la thrombine transforme le fibrinogène en fibrine et active
le Facteur XIII (FXIII) en FXIIIa (aussi appelé transglutaminase). Le FXIIIa va lier de
manière covalente les rangées de polymères de fibrine solidifiant le caillot et formant ainsi un
réseau de fibrine stable (Naski et al, 1991).
Cependant, ce modèle de voies intrinsèque et extrinsèque constitue un concept ancien

issu d’expériences in vitro. Le déroulement de la coagulation in vivo ne respecte pas cette
distinction. Toutefois, cette conception duelle reste très utile pour l’exploration de la
coagulation, puisque la voie intrinsèque est explorée par le temps de céphaline activée (TCA),
et la voie exogène extrinsèque par le temps de Quick. Le diagnostic des déficits de la
coagulation se fait donc sur ce schéma.
2. Concept actuel de coagulation (modèle cellulaire)
Cette nouvelle vue de cascade de coagulation présente la formation de fibrine comme

le résultat de deux processus complémentaires: la coagulation (représentée par la thrombine)
et l’activation plaquettaire. Ce modèle appelé « cellulaire » qui a été introduit par Hoffman et
Monroe en 2001, décrit la coagulation comme trois phases qui se chevauchent: initiation,
amplification et propagation (Hoffman & Monroe, 2007; Monroe & Hoffman, 2006).
Ce modèle a rejeté la notion précédente d’activation indépendante et axée sur le rôle
synergique et parallèle entre chaque branche de la coagulation tout en prenant en compte un
système vasculaire dynamique. En outre, le modèle a donné une explication plus précise de la
localisation de la formation du caillot en incorporant le rôle de la cellule et en mettant l’accent
sur l’importance du FT.
2.2. Etapes de la coagulation
2.2.1. Phase d’initiation
A l’état physiologique normal, les monocytes et les cellules endothéliales n’expriment

pas de FT, ou bien l’expriment dans une conformation qui ne lui permet pas de s’associer au
FVII de la coagulation. Lors d’une brèche vasculaire, l’activation de ces mêmes cellules
entraine l’expression à leur surface de FT. Des complexes se forment alors entre le FT
membranaire et le FVII circulant, permettant ainsi l’initiation de la cascade de coagulation
(Furie & Furie, 2008; Osterud & Bjorklid, 2006).
La phase d’initiation débute alors avec la présentation du FT à la surface des cellules

endothéliales suite à une lésion de la paroi vasculaire (Figure 5) (Furie & Furie, 2008; Monroe
& Hoffman, 2006). Le FT se lie au FVII pour former un complexe FT-FVII. La formation de
ce complexe permet ainsi l’activation du FVII en FVIIa par modification conformationnelle.
Le complexe FT/FVIIa active le FX, directement ou indirectement par l’intermédiaire du FIX.
Le FXa va ensuite en présence du FVa convertir une faible quantité de prothrombine en
thrombine en quantité insuffisante pour terminer le processus de formation de fibrine (Monroe
& Hoffman, 2006; Turpie & Esmon, 2011). Récemment, il a été démontré que le complexe
FT/FVIIa active également le FVIII, générant précocement dans cette phase d’initiation une
petite quantité de FVIIIa (Soeda et al, 2010). Ces réactions sont très rapides et constituent un
véritable «starter» de la coagulation.
*. activé
Figure 5: Représentation schématique de l’étape d’initiation de la coagulation in vivo, adaptée

d’après (Turpie & Esmon, 2011).
2.2.2. Phase d’amplification
La faible quantité de thrombine formée dans l’étape d’initiation participe activement à

un processus de rétroaction positive pour l’activation des facteurs FXI, FVIII, FV, et en
particulier pour accélérer l’activation plaquettaire (Figure 6) (Furie & Furie, 2008; Monroe &
Hoffman, 2006). Simultanément, ces facteurs activés sont attirés par des mécanismes
chimiotactiques à la surface des plaquettes, où des activations et des amplifications très
rapides se produisent (Turpie & Esmon, 2011).
*. activé
Figure 6: Représentation schématique de l’étape d’amplification de la coagulation in vivo,

2.2.3. Phase de propagation
A la surface des plaquettes activées, le FXIa active le FIX. Ce FIXa, conjointement

avec le FIXa généré par le complexe FT-FVII au cours de l’étape d’initiation, va s’associer au
FVIIIa pour former la tenase intrinsèque, capable de cliver le FX en FXa (Figure 7). Le FXa
va immédiatement se complexer au FVa afin de former le complexe prothrombinase
provoquant une génération explosive de thrombine (Monroe & Hoffman, 2006).
L’amplification du processus au moyen de mécanismes de rétroaction comporte la

thrombine et les plaquettes. L’activation de tous ces éléments permettent de générer de
grandes quantités de FXa. La présence du FVIIIa permet d’accélérer la transformation du FX
en FXa d’un facteur de 105. La quantité importante de FIXa générée par le complexe tenase,
permet la transformation en présence de PLs, du Ca2+ et du FVa d’une quantité importante de
prothrombine en thrombine
*. Activé
Figure 7: Représentation schématique de l’étape de propagation de la coagulation in vivo,

C’est ce pic de thrombine générée appelé « thrombin burst » qui permet une
transformation massive de fibrinogène en monomère de fibrine. Les monomères de fibrine
polymérisent pour former un réseau de fibrine (Figure 8). Parallèlement, la thrombine active
le FXIII en FXIIIa, responsable de la stabilisation du réseau de fibrine (Perez-Gomez &
Bover, 2007).
Figure 8: Représentation schématique de la transformation de fibrinogène en monomère de
fibrine, adaptée d’après (Turpie & Esmon, 2011).
2.3. Régulation de la coagulation
La rapidité de la réponse à une lésion vasculaire est assurée par des phénomènes
d’activation rétroactive qui permettent à la cascade de la coagulation de s’auto-amplifier. Le
fait que ces réactions se déroulent à la surface des membranes cellulaires (plaquettes activées,
cellules endothéliales stimulées), permet de restreindre la localisation de la coagulation au site
même de la brèche vasculaire et ainsi de limiter le risque d’obstruction du vaisseau sanguin.
Toutefois, la coagulation est également soumise à une régulation permettant un maintien de la
fluidité du sang. Il est très important pour l’organisme que les enzymes formées lors de
l’activation de la coagulation ne circulent pas dans le plasma car ils risqueraient d’entraîner
une activation diffuse de la coagulation responsable de processus pathologiques graves.
2.3.1. Régulation positive
L’exemple le plus important de régulation par rétroaction positive est celui de la

thrombine qui, lors de sa génération par le complexe tenase extrinsèque, va transformer non
seulement le fibrinogène en fibrine mais aussi amplifier sa propre génération en activant le
FXI (Gailani & Broze, 1991) et les cofacteurs de la coagulation FV, FVIII (Butenas et al,
1997). En parallèle, la thrombine joue un rôle protecteur du caillot formé par l’activation de
l’inhibiteur Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) (Bajzar et al, 1995).
2.3.2. Régulation négative
Une fois le caillot de fibrine formé au niveau de la lésion, le processus de coagulation

doit être limité pour éviter l’occlusion thrombotique dans les zones vasculaires adjacentes
normales. Si les mécanismes de coagulation ne sont pas contrôlés, la coagulation pourrait se
propager à travers toute l’arborescence vasculaire causant de graves maladies. C’est pour cela
que le très fort potentiel d’amplification de la cascade de la coagulation est finement régulé
par des inhibiteurs physiologiques, permettant de maintenir la fluidité du sang, soit par
inhibition enzymatique ou par modulation de l’activité des cofacteurs. La régulation de la
coagulation est relativement complexe et implique de nombreuses molécules anticoagulantes.
Les principaux systèmes sont : l’antithrombine (AT), l’inhibiteur de la voie du FT (TFPI) et le
système protéine C (Figure 9).
L’inhibiteur le plus important de la coagulation est l’antithrombine (AT) qui va

exercer son action sur toutes les sérines protéases impliquées dans la coagulation, notamment
les FIIa, FXa, FIXa, FXIa, et secondairement les FXIIa et FVIIa (Figure 9) (Olson et al, 1993;
Rau et al, 2007). En effet, l’AT est le principal inhibiteur de la thrombine. Toutefois, l’AT est
également capable d’inhiber le FXa et dans une moindre mesure les FIXa, FXIa et FXIIa.
L’AT forme des complexes équimoléculaires irréversibles avec ces facteurs permettant le
blocage des sites catalytiques de leurs enzymes cibles.
L’inhibiteur de la voie du FT (TFPI) régule l’initiation de la coagulation en inhibant le

FXa et le complexe FT-FVIIa (Figure 9) (Monroe & Key, 2007). En effet, le TFPI est un
inhibiteur de type « Kunitz » synthétisé majoritairement par les cellules endothéliales
(Maroney et al, 2010). Les domaines Kunitz sont des domaines protéiques capables d’inhiber
les sites actifs de certaines protéases en mimant leurs substrats naturels. L’inhibition de
l’initiation de la coagulation par le TFPI se fait en deux étapes. Dans un premier temps, le
TFPI via son domaine « Kunitz II » inhibe le FXa par formation d’un complexe binaire TFPI-
FXa. Dans un second temps, ce complexe se lie au complexe FT-FVIIa grâce à une liaison
entre le premier domaine « Kunitz I » du TFPI et le FVIIa. Il se forme ainsi un complexe
quaternaire FVIIa-FT-TFPI-FXa, au sein duquel les FXa, le FVIIa, et le FT perdent leurs
activités (Monroe & Key, 2007).
Figure 9: Représentation schématique des systèmes majeurs de régulation physiologique de
la coagulation, adaptée d’après (Boneu & Cazenave, 1997).
Le système protéine C est un mécanisme important pour confiner l’activité

procoagulante au site lésé. Ce système comprend des protéines plasmatiques (la protéine C et
la protéine S), des récepteurs membranaires comme la thrombomoduline (TM) et le Récepteur
Endothélial de la Protéine C (EPCR), et a pour cibles les FVa et FVIIIa. Lorsque la thrombine
atteint une cellule endothéliale intacte, elle se lie à la TM pour former le complexe
thrombine/TM (Figure 10.A). En présence de l’EPCR, le complexe thrombine/TM active
alors la protéine C en protéine C activé (APC), qui se lie à son cofacteur, la protéine S, et
inactive les FVa (Figure 10.B) et FVIIIa (Figure 10.C) (Hoffman, 2003).
*. Activé i. Inactivé
Figure 10 : Représentation schématique du système inhibiteur APC. A. Activation de la

protéine C en APC. B. Inactivation du FVa par l’APC. C. Inactivation du FVIIIa par l’APC.
3. Rôle du FVIII dans la coagulation
Le FVIII est une glycoprotéine dont le principale rôle physiologique est celui de
cofacteur du FIXa au sein du complexe tenase. L’activation du FVIII en FVIIIa, sur le site du
thrombus, va lui permettre de se lier au FIXa à la surface des PLs plaquettaire. Sur une
surface phospholipidique, le FVIIIa permet une augmentation de l’activité du FX par le FIX
d’un facteur de 105 (Rawala-Sheikh et al, 1990; van Dieijen et al, 1981). L’activation massive
du FXa est responsable de la génération d’une grande quantité de thrombine, essentielle à la
formation et la protection du caillot contre la fibrinolyse (Von dem Borne et al, 1997).
Lorsque le FVIII fait défaut, qualitativement ou quantitativement, une pathologie
hémorragique survient : il s’agit de l’HA.
Chez les patients hémophiles, l’hémostase primaire se déroule normalement tout

comme la production de FXa et l’obtention d’une faible quantité de thrombine lors de la phase
d’initiation. Toutefois, l’activation du FXa à la surface des plaquettes activées, par le
complexe FIXa-FVIIIa est abolie, induisant une absence de pic de thrombine. Les traces de
thrombine générée par le complexe FT-FVIIa sont insuffisantes pour permettre une
transformation de fibrinogène en fibrine suffisante en périphérie du thrombus (Sixma & van
den Berg, 1984).
III. Hémophilie A
1. Définition et épidémiologie
L’HA (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) #306700) est une maladie
hémorragique grave dont la prévalence est de l’ordre de 1 pour 10000 personnes de sexe
masculin (Skinner, 2012). C’est une maladie héréditaire à transmission récessive liée au
chromosome X, caractérisée par un déficit qualitatif (défauts de fonctionnalité) et/ou
quantitatif (défauts de production) en FVIII pro-coagulant (Hoyer, 1994). Ces déficits sont
causés par différentes mutations siégeant sur le gène F8. Dans les formes sévères de la
pathologie, ces déficits sont associés à des hémorragies spontanées en particulier au niveau
articulaire et musculaire à l’origine d’arthropathies fortement invalidantes conduisant à une
morbidité élevée.
Au niveau mondial et selon l’enquête de la Fédération Mondiale de l’Hémophilie

(Word Federation of Hemophilia 2012, WFH), plus de 142 205 personnes sont atteintes
d’HA. Toutefois, ces données statistiques restent encore sous-estimées dans les pays en voie
de développement. En Algérie, environ 1566 patients sont atteintes d’HA.
2. Historique de la maladie
L’HA n’a été acceptée comme entité clinique qu’à partir du XIXe siècle. Cependant, la
description historique de l’hémophilie, qui n’avait pas encore de nom à l’époque, remonte à
l’Antiquité (Ingram & Norris, 1976). En effet, c’est dans les écrits hébraïques du Talmud de
Babylone, un recueil de discussions rabbiniques du IIe siècle, que l’on trouve la première
trace écrite de la pathologie (Rosner, 1969). Dans cet ouvrage, il est rapporté que plusieurs
sages dispensent la circoncision des petits garçons dont au moins deux frères aînés sont
décédés d’hémorragie après circoncision, expliquant que certaines familles ont le sang très
fluide alors que d’autres ont le sang fermement retenu (Rosner, 1969). C’est en XIIe siècle,
qu’un médecin arabe, Albucasis, a décrit une famille dont les sujets de sexe masculin étaient
décédés suites d'hémorragies consécutives à des blessures mineures (Rosner, 1969).
Ce n’est qu’en 1803 qu’apparaît la première description scientifique de la pathologie

dans une publication de l’américain John Otto (Otto, 1996). L’auteur évoquait déjà la
transmission génétique, qui fut précisée par Nasse en 1820 (Pemberton, 2011).
Le terme « hémophilie » a fait son apparition dans les descriptions de la maladie par
F. Hopff, un étudiant de l’Université de Zurich, en 1828 (Hopff, 1828). Ce mot est composé
de deux mots grecs : « haïma », qui signifie sang, et « philia », qui signifie affection.
Toutefois, ce n’est réellement qu’en 1911 que W. Bulloch et P. Fildes, revoyant les
données souvent confuses accumulées sur l’hémophilie, en définissent les principaux critères:
tendance au saignement excessif depuis l’enfance, allongement du temps de coagulation,
existence d’autres cas identiques dans une même famille et transmission par des femmes
apparemment normales (Ingram & Norris, 1976). L’insuffisance des connaissances sur le
mécanisme de l’hémostase a pendant longtemps conduit à confondre sous le nom
«d’hémophilie » toute diathèse hémorragique caractérisée par un trouble de la coagulation in
vitro.
La cause de ces hémorragies incontrôlées a été mise à jour en 1937 lorsque Patek et
Taylor identifient chez les individus sains, la présence d’un facteur plasmatique capable de
corriger les troubles de la coagulation des hémophiles (Patek & Taylor, 1937). Ils baptisent ce
composé « globuline anti-hémophilique », qu’une nouvelle nomenclature renommera par la
suite « FVIII », l’HA est ainsi caractérisée.
L’ère thérapeutique moderne de l’hémophilie débute en 1964, lorsque la chercheuse

américaine Judith Pool découvre la possibilité de traiter les patients hémophiles avec un
cryoprécipité plasmatique (Pool et al, 1964).
3. Mode de transmission
L’HA est une maladie rare qui touche une naissance sur 10000 enfants de sexe
masculin. Dans les formes « familiales » qui correspondent à 70 % des cas, la transmission de
la maladie se réalise selon un mode récessif lié au chromosome X
(Jayandharan & Srivastava, 2011). Dans les 30% restant, l’HA apparaît de façon
« sporadique » soit à cause d’une mutation dite de novo dans un gamète grand-parental ou par
transmission d’une mutation sur plusieurs générations de femmes conductrices
asymptomatiques (Leuer et al, 2001). Après cette première mutation, la transmission de la
maladie se fait de manière identique aux formes familiales.
De rares cas d’HA féminine ont été décrits et qui sont causés soit par l’inactivation
aléatoire du chromosome X, par la présence de deux copies du gène F8 portant la mutation ou
chez les filles atteintes d’un syndrome de Turner (Bicocchi et al, 2005; Pavlova et al, 2009a).
Le chromosome X est un gonosome (chromosome sexuel) qui présente la particularité

de n’être présent sous forme de paire comme les autosomes uniquement chez la femme.
L’homme est donc hémizygote ; il possède un chromosome X et un chromosome Y. Tandis
que la femme présente deux chromosomes X. Dans les maladies récessives liées à l’X,
l’activité normale du gène siégeant sur le chromosome X va masquer le défaut de coagulation
causée par une mutation du même gène sur l’autre chromosome X chez la femme, faisant
d’elle une conductrice de la pathologie mais non hémophile (Peyvandi et al, 2006). A
l’opposé, l’absence de second chromosome X chez l’homme empêchera une possible
atténuation des effets de la mutation et le rendra sujet aux différentes manifestations cliniques
de l’HA, faisant de lui un hémophile d’un point de vue génétique et clinique.
Comme pour toutes les maladies à transmission récessive liée à l’X, un hémophile
donne naissance à des garçons indemnes et à des filles qui sont des conductrices obligatoires
(Figure 11.A) (Jayandharan & Srivastava, 2012; Peake et al, 1993). Dans 50 % des cas, une
conductrice peut donner naissance à un garçon ou à une fille normale dont la descendance
sera indemne. Dans 25 % des cas, une conductrice donnera naissance à un garçon hémophile
et à une fille conductrice (Figure 11.B) (Jayandharan & Srivastava, 2012).
Figure 11: Mode de transmission de l’HA. A. Descendance d’un homme hémophile,
B. Descendance d’une femme conductrice.
4. Aspect clinique
4.1. Classification
L’HA se manifeste à des degrés plus ou moins importants, en fonction du taux de

facteur de coagulation FVIII déficitaire. Ces degrés sont associés à des manifestations
hémorragiques particulières dans leurs ampleurs, leurs fréquences et leurs localisations.
En clinique l’HA est classée, selon l’activité résiduelle du FVIII mesurée dans le
plasma des patients comparée à celle réalisée sur un plasma sain, en sévère, modérée et
mineure (valeur référence chez une personne saine: 0,50-1,50 Unité Internationale (UI) /
millilitre (ml)) (White et al, 2001) (Tableau I).
Tableau 1: Classification de la sévérité de l’HA selon les recommandations de la société

internationale de thrombose et de l’hémostase (International Society on Thrombosis and
Haemostasis, ISTH) (White et al, 2001).
Classification Taux de FVIII mesuré

HA sévère <0,01 UI /mL (< 1 % de l’activité normale)
HA modérée 0,01–0,05 UI /mL (1-5 % de l’activité normale)
HA mineure >0,05–0,40 UI /mL (5-40% de l’activité normale)
Cette classification permet généralement de prédire le risque hémorragique chez le
patient. Cependant, ce taux n’est pas toujours corrélé au phénotype clinique et c’est ce qui
représente une limite à ce classement sur un critère biologique. La sévérité et la fréquence des
épisodes hémorragiques peuvent être différentes chez des patients avec le même taux
plasmatique de FVIII.
4.1. Les manifestations cliniques
Les manifestations cliniques de l’HA sont essentiellement d’ordre hémorragique et

peuvent avoir différentes conséquences en raison de leurs répétitions ou localisations. Ces
hémorragies sont souvent provoquées et affectent préférentiellement l’appareil locomoteur. Il
s’agit principalement d’hémarthrose ou d’hématome musculaire.
Les conséquences cliniques de l’HA sont directement liées à l’anomalie de la

coagulation engendrée par le déficit en FVIII. Plus le déficit est sévère, plus les
manifestations cliniques sont fréquentes.
Chez l’hémophile sévère, les premiers signes cliniques apparaissent systématiquement

lors de l’acquisition de la marche. Ces manifestations sont le plus souvent spontanées ou
secondaires à des traumatismes minimes et sont essentiellement de type hémarthroses et
hématomes (Jayandharan & Srivastava, 2011). Les hémarthroses affectent essentiellement les
articulations de la cheville, du genou et du coude mais également les épaules, les hanches, les
orteils et les doigts (Alcalay & Deplas, 2002). La répétition des hémarthroses au sein d’une
même articulation peut conduire à une atteinte articulaire sévère conduisant à une arthropathie
hémophilique. En effet, la présence de sang de manière prolongée dans une articulation peut
aboutir à une altération des cartilages, qui, en plus de fortes douleurs, peut donner lieu à des
séquelles invalidantes. Les hématomes sont rarement spontanés mais généralement post
traumatiques (Giridhara Rao & Alok, 2012). Les saignements musculaires observés chez les
hémophiles proviennent des capillaires irriguant les muscles essentiellement au niveau du
muscle psoas-iliaque, des muscles du bras et de l’avant-bras, du mollet ou de la cuisse
(Alcalay, 2009).
A coté de cette forme sévère, les formes modérées et mineures d’HA sont
principalement dues aux accidents hémorragiques provoqués à l’occasion d’une intervention
chirurgicale ou avulsion dentaire (Jayandharan & Srivastava, 2011). De ce fait, ces formes
peuvent être longtemps silencieuses et ne se révèlent qu’à un âge avancé.
4.2. Diagnostic de l’hémophilie A
Le diagnostic néonatal de l’HA sévère est relativement fréquent. Il survient à

l’occasion de manifestations hémorragiques souvent provoquées par un traumatisme
identifiable lié aux conditions obstétricales (ventouses, forceps) ou par un geste chirurgical ou
invasif (test de Guthrie, ponction veineuse, circoncision). Par ailleurs, une découverte de l’HA
sévère après l’âge de deux ans est peu fréquente car l’apprentissage de la marche occasionne
une symptomatologie marquée caractéristique en termes de diagnostic.
Le diagnostic de l’HA est essentiellement biologique (Kitchen et al, 2013). La

réalisation d’un bilan sanguin lors d’un épisode hémorragique ou d’une enquête familiale ou
parfois d’une manière fortuite permet d’effectuer le diagnostic. Ce diagnostic repose sur un
allongement isolé du TCA. Les dosages spécifiques et répétées des facteurs de coagulation de
la voie intrinsèque par méthode chronométriques et chromogéniques permettront de mettre en
évidence et de confirmer le déficit en FVIII (Kitchen et al, 2013).
Le dosage chromogénique comporte deux étapes successives; la première consiste en

l’activation du facteur à doser, dans un mélange réactif de facteurs de la coagulation
composée de substances purifiées. Cette étape est suivie d’une lyse enzymatique d’un substrat
chromogène par le facteur activé qui libère un groupement chromophore quantifiable par
spectroscopie. Cette méthode est la méthode de référence préconisée par la pharmacopée
européenne pour la détermination du titre de FVIII.
Tandis que le dosage chronométrique repose sur le pouvoir de correction du temps de

coagulation d’un plasma déficitaire en FVIII par le plasma dilué du patient. Le temps de
coagulation mesuré est fonction du taux de FVIII du patient ou du témoin. Les résultats sont
exprimés en pourcentage d’activité par rapport au témoin normal.
4.3. Traitement
Il n’existe à ce jour, aucun traitement curatif de l’HA. Le traitement actuel est

essentiellement préventif et consiste en des perfusions de concentrés thérapeutiques de FVIII.
Ce traitement substitutif a pour but de corriger le déficit en FVIII afin de permettre une
hémostase normale.
Deux types de produits thérapeutiques existent actuellement : le FVIII d’origine

plasmatique (pFVIII) et le FVIII recombinant (rFVIII). Le pFVIII est purifié à partir d’un
mélange de plasma de milliers de donneurs sains et subit divers traitements d’inactivation
virale. Les rFVIII sont, quant à eux, produits par génie génétique à partir des séquences
d’Acide Désoxyribonucléique (ADN) de deux donneurs caucasiens (Viel et al, 2009). Les
FVIII thérapeutiques ont une demi-vie moyenne de 12 à 14 heures après administration
(Bjorkman et al, 2009).
Le traitement peut être administré à la demande (accident hémorragique, intervention

chirurgicale) ou bien en traitement préventif tel que le régime prophylaxique. Lorsqu’il est
perfusé à un patient hémophile, ce FVIII thérapeutique se fixe au FvW dans la circulation
sanguine du patient. Le FVIIIa agit comme cofacteur du FIXa, accélérant la conversion du FX
en FXa. Le FXa convertit la prothrombine en thrombine. La thrombine convertit alors le
fibrinogène en un réseau de fibrine.
D’autres traitements sont également utilisés pour traiter les hémorragies des patients
atteints d’HA, en particulier le FVIIa recombinant et un complexe pro-thrombotique, le Factor
Eight Inhibitor Bypassing Activity (FEIBA) contenant plusieurs facteurs de la coagulation
(Mehta et al, 2006). Ces deux préparations sont utilisées chez des patients hémophiles en
échec de traitement avec le FVIII thérapeutique.
VII. Aspect moléculaire de l’hémophilie A
1. Description du gène F8
Le gène codant le FVIII, appelé gène F8, a été cloné en 1984 par l’équipe de Gitschier
(Gitschier et al, 1984). Il est localisé sur l’extrémité distale du bras long du chromosome X (q)
en Xq28 (Figure 12.A) et s’étend sur 186 kilobases (kb), ce qui représente près de 0,1% de la
totalité du chromosome (Figure 12.B) (Poustka et al, 1991). Ce gène est constitué de 26 exons
et 25 introns avec une séquence codante de 7053 nucléotides (Figure 12.C)
(Oldenburg & Pavlova, 2006).
En effet, l’information codante est répartie sur 26 exons dont la transcription et

l’épissage donnent naissance à un acide ribonucléique messager (ARNm) de 9 kb soit 5 % du
gène initial. Les 95 % de séquences restantes correspondent aux introns qui, même s’ils ne
codent pas pour la protéine, peuvent être porteurs d’une mutation responsable d’un déficit en
FVIII. Les exons du gène F8 ont des tailles qui varient entre 69 paires de base (pb) (exon 5)
et 3,1 kb (exon 14). Deux exons sont beaucoup plus longs que les autres : il s’agit de l’exon
14 avec 3106 pb et de l’exon 26 avec 1958 pb dont la majeure partie longue de 1805 pb,
constitue la région 3’ non traduite (3’UTR).
La taille des introns varie de 207 pb (intron 17) à 32,4 kb (intron 22). Six introns sont
distinguables des autres par leur très grande taille qui dépasse 14 kb : il s’agit des introns 1, 6,
13, 14, 22 et 25 parmi lesquels l’intron 22 est le plus long.
L’orientation de lecture de transcription 5’-3’ du gène F8, se fait dans le sens télomère
vers centromère. Ce gène comprend un promoteur de longueur estimée à 1,2 kb, une région
codante de 183 kb faite de 26 exons, 25 introns et une région 3’UTR de 1,8 kb
(Gitschier et al, 1984). La transcription du gène F8 commence au niveau du 170 ème nucléotide
du gène qui se trouve en amant du codon d’initiation de la traduction (ATG)
(Gitschier et al, 1984). Le codon ATG est précédé en 30 nucléotides en amant d’une séquence
GATAAA similaire à la boite TATAAA, indispensable à l’initiation de la transcription par
l’ARN polymérase II. Cette séquence est suivie d’un cadre de lecture ouvert continue
aboutissant à un polypeptide de 2351 acides aminés (aa) (Truett et al, 1985). La région
codante est ensuite suivie d’une autre région non traduite contenant 1805 nucléotides riche en
signaux de polyadénylation de type répétitions AATAAA et CATTG et d’une queue poly A
d’environ 1 kb de longueur (White & Shoemaker, 1989).
Figure 12: Localisation chromosomique et structure du gène du F8. (A) Représentation du

chromosome X (B). Localisation chromosomique du gène F8 (C). Répartition des 26 exons du
gène F8 (D). Représentation des deux gènes additionnels au F8 : F8A et F8B.
Le gène F8 est inhabituel dans le sens où il existe au sein de l’intron 22 un ilot CpG
associé à deux gènes additionnels F8A et F8B, comme cela est représenté sur la Figure 12.D.
Le gène F8A (OMIM#305423) s’étend sur 2 kb et il est transcrit dans le sens inverse du gène
F8 (Levinson et al, 1990). Deux copies homologues de ce gène F8A ont été retrouvées à une
distance d’approximativement 400 et 600kb de la région télomérique du F8
(Naylor et al, 1995). Le F8A code pour une protéine de 40 Kilo Dalton (kDa) appelée protéine
associée à l’huntingtine (HAP40) (Peters & Ross, 2001). L’HAP40 est impliquée dans le
transport et l’endocytose de l’huntingtine, une protéine qui lorsqu’elle est mutée cause la
maladie d’Huntington.
Le gène F8B (OMIM#305424) de 2,7 kb est transcrit dans le même sens que le gène
F8 (Levinson et al, 1992). Le gène F8B utilise pour sa transcription les quatre derniers exons
du gène F8. Ce gène code donc une protéine contenant le domaine C2 de la protéine FVIII.
Toutefois, la fonction biologique de cette protéine reste obscure. En effet, les patients
présentant une délétion de l’exon 23 à 26 ne souffrent d’aucune maladie autre que l’HA
(Casana et al, 2008).
2. Les régions homologues des séquences localisées dans le F8

2.1.Les régions homologues Int22h
La séquence Int22h-1 est une région de 9,5 kb très riche en nucléotides GC localisée
dans l’intron 22 du gène F8 (Figure 13). Cette séquence est dupliquée en deux endroits
différents (- 500 et - 600 kb) hors du gène F8 vers le télomère du chromosome X formant les
séquences homologues extra-géniques Int22h-2 (d’orientation identique à Int22h-1)
et Int22h-3 (d’orientation inverse) (Ross et al, 2005). Grâce aux données du séquençage
complet du chromosome X (NC_000023.9, URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), De Brasi CD
et Bowen DJ ont pu démontrer avec précision que les trois séquences (Int22h-1, Int22h-2 et
Int22h-3) étaient remarquablement similaires (De Brasi & Bowen, 2008). Ainsi, les séquences
Int22h-2 et Int22h-3 montrent 99,93% de similarité, et présentent respectivement 99,18% et
99,24% de similarité avec Int22h-1. Ces séquences homologues sont à l’origine d’un
mécanisme de recombinaison intra-chromosomique responsable de la micro-inversion de
l’intron 22.
Figure 13: Localisation des régions homologues des deux séquences Int22h-1 et Int1h-1 du
gène F8, d’après (Oldenburg & Pavlova, 2006).
2.2.Les régions homologues Int1h
L’intron 1 du gène F8 contient la séquence Int1h-1 de 1041 pb qui est également

dupliquée en dehors du gène F8 en un seul exemplaire Int1h-2 avec 99,9% d’homologie
(Figure 13) (Brinke et al, 1996). Ces deux séquences homologues présentent une orientation
inversée. La séquence int1h-2 est située à environ 140 kb (vers le télomère) de l’extrémité 5’
du gène F8, entre les gènes BRCA1/BRCA2-Containing Complex, Subunit 3
(BRCC3; OMIM#300617) et Von Hippel-Lindau syndrome binding protein 1
(VBP1; OMIM#300133).
A l’instar des séquences Int22h, la forte homologie de séquence entre l’Int1h-1 et

l’Int1h-2 est à l’origine d’un mécanisme de recombinaison intra-chromosomique appelée
micro-inversion de l’intron 1.
3. Protéine FVIII
3.1. Biosynthèse du FVIII
Le type cellulaire responsable de la production du FVIII reste controversé (Yadav et

al, 2012). Différentes observations ont permis de mettre en évidence de l’ARNm du FVIII
dans de nombreux tissus tels que le foie, la rate et les cellules endothéliales
(Jacquemin et al, 2006; Wion et al, 1985), cependant une partie de cette transcription est
probablement illégitime et ne résulte pas en une quantité suffisante de FVIII. Bien que ces
sites de synthèse du FVIII ne soient pas complètement définis, la plupart des données indique
que le plus grand site de synthèse se situe dans le système réticuloendothélial hépatique
(Kelly et al, 1984; Zelechowska et al, 1985).
Le FVIII est synthétisé en une seule chaîne polypeptidique de 2351 aa. La sécrétion de
cette protéine suit un trajet à travers la cellule avant d’être libérée dans le plasma en passant
par le réticulum endoplasmique (RE) puis le compartiment intermédiaire entre RE-Golgi
(ERGIC), et finalement par l’appareil de Golgi (Figure 14).
Figure 14: Représentation schématique expliquant les étapes de synthèse et sécrétion du
FVIII.
Au cours de sa traduction, le FVIII est transloqué dans le RE où il subi un clivage du

peptide signal, réduisant sa séquence à 2332 aa. La pré-protéine FVIII se présente sous
l’arrangement linéaire suivant : NH2-A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2-COOH (Figure 15)
(Lenting et al, 1998; Vehar et al, 1984).
N : sites de N-glycosylation. O : sites de O-glycosylation
Figure 15 : Représentation schématique de la structure primaire du FVIII.

Cette protéine va subir par la suite une mise en conformation grâce aux protéines du
RE. Cette mise en conformation consiste à la formation de ponts disulfures. Deux ponts
disulfures sont formés à l’intérieur de chacun des domaines A1 et A2 tandis qu’un seul pont
est formé dans les domaines A3, C1 et C2 (Selvaraj et al, 2012).
Un système de contrôle de qualité est mis en place afin de vérifier l’intégrité des
protéines nouvellement synthétisées. Ce système utilise les structures glycanniques portées
par la protéine afin de la diriger vers le système de mise en conformation ou de dégradation
(Figure 15) (Lenting et al, 2010; Pipe et al, 1998). Les protéines FVIII mal repliées seront
fixées à des protéines du RE puis dégradées. Tandis que les protéines correctement repliées
quitteront le RE dans des vésicules couvertes pour transiter vers l’appareil de Golgi (Dorner et
al, 1987).
Ces vésicules de transport fusionnent entre elles pour former le compartiment

intermédiaire entre le RE et l’appareil de Golgi (Figure 14). Des protéines cargo se lient au
FVIII favorisant ainsi son transit vers l’appareil de Golgi. Deux protéines ont été décrites
comme participant à ce phénomène ; ce sont la protéine transmembranaire Lectin Mannose-
Binding 1 (LMAN1) et sa partenaire d’interaction Multiple Coagulation Factor Deficiency
protein 2 (MCFD2) (Zhang, 2009). Ces deux protéines sont également importantes pour le
transit intra-cellulaire du FV. Des mutations dans l’un des deux gènes codant pour ces deux
protéines sont responsables du déficit combiné en FV et FVIII (Cunningham et al, 2003;
Zhang et al, 2006).
Le passage de la préprotéine FVIII dans le compartiment intermédiaire ERGIC, puis

l’appareil de Golgi entraîne différentes modifications post-traductionnelles (Figure 14). En
effet, cette préprotéine subit lors de sa maturation dans l’appareil de Golgi, des étapes de
protéolyses intracellulaires. Des protéases, encore mal définies, reconnaîtraient un motif
Arg-X-X-Arg et permettraient les clivages en Arg1313 et Arg1648 dans le domaine B
(Figure 16.A) (Fay, 2004). Ces clivages permettront de générer une protéine FVIII
hétéro-dimérique avec une chaîne lourde de taille variable (A1a1-A2a2-B avec différentes
longueurs du domaine B; 90-200 kDa) et une chaîne légère de taille constante (a3A3-C1-C2;
80 kDa) (Figure 16.B).
Dans la circulation, le FVIII se présente sous forme d’hétéro-dimère composé d’une

chaîne lourde comprenant les domaines A1 (1-336), A2 (373-710) et B (741-1648), et d’une
chaîne légère formée par les domaines A3 (1690-2019 aa) C1 (2020-2172 aa) et C2
(2173-2332 aa) (Wood et al, 1984), reliées par des ions calciques (Figure 16.B). Trois régions
acides entourent le triple domaine A : a1 (337-372 aa), a2 (711-740 aa) et a3 (1649-1689 aa).
La région a3 permet la liaison du FVIII avec le FvW, une molécule chaperonne qui stabilise le
FVIII, le protège d’une dégradation prématurée et permet son acheminement vers le site de
saignement (Kaufman et al, 1997).
Figure 16 : Représentation schématique des sites de clivage au niveau de la protéine FVIII

(A) et la structure du FVIII circulant (B).
3.2. Activation du FVIII
Afin de participer au processus de la coagulation, le FVIII hétéro-dimérique est un

précurseur inactif qui doit être converti en son dérivé actif (Fulcher et al, 1983; Lollar et al,
1984; Toole et al, 1984; Wood et al, 1984). Les principaux activateurs du FVIII sont la
thrombine et le FXa, qui clivent la protéine au niveau des Arginine en positions 372, 740 et
1689, toutes situées à l’extrémité C-terminale des régions acides (Figure 17.A) (Eaton et al,
1986; Vehar et al, 1984). Récemment, un autre activateur, le complexe FT/FVIIa, a aussi
montré sa capacité à cliver le FVIII au niveau des Arginine en position 372 et 740.
Cependant, cette activation est beaucoup plus faible que celle produite par la thrombine
(Soeda et al, 2010).
Ces différentes protéolyses génèrent un dérivé hétérotrimérique, composé du segment
A1a1 (50 kDa; 1-372), du segment A2a2 (43 kDa; 373-740) et du segment A3-C1-C2 (73
kDa; 1689-2332) (Figure 17.B). Ces clivages entraînent la libération du domaine B et de la
région a3 engendrant la perte du site de liaison au FvW (Lenting et al, 2010). L’activation du
FVIII entraîne l’exposition des sites de liaison aux PLs, au FIXa et au FX, permettant la
formation du complexe tenase intrinsèque.
Figure 17 : Représentation schématique des sites d’activation et de la structure activée de la

protéine FVIII.
3.3.Inactivation du FVIII
L’un des moyens pour inactiver le complexe tenase est d’inactiver le FVIIIa.
A ce jour, plusieurs pistes expliquant le mécanisme d’inactivation du FVIII ont été identifiées.
Le FVIII peut être désactivé soit par dissociation spontanée du domaine A2 ou par
dégradation protéolytique (Figure 18). En ce qui concerne le premier mécanisme,
l’hétérotrimére FVIIIa est naturellement instable en raison de la faible affinité du domaine A2
pour le reste de la protéine A1/A3-C1-C2 (Fay & Smudzin, 1992; Wakabayashi & Fay, 2008;
Wakabayashi et al, 2008).
Figure 18 : Représentation schématique des mécanismes d’inactivation de la protéine FVIII.
Cependant le deuxième mécanisme « inactivation du FVIIIa par dégradation

protéolytique » fait intervenir le FIXa, capable de cliver le FVIIIa au niveau des Arginines en
position 336 et 1719 (Figure 19). Ces clivages sont responsables de la libération de la région
a1 réduisant davantage l’affinité du domaine A2 pour le reste de la protéine
(Lenting et al, 1998). D’autre part des protéases, tels que le FXa, la plasmine, le complexe
FT/FVIIa et l’APC, sont également capables d’inactiver le FVIIIa par clivage en position
Arg336 (Figure 18). L’inactivation du FVIIIa par l’APC est différente en raison du clivage
supplémentaire au niveau du résidu 562 qui conduit à la perte de liaison entre le domaine A2
et le FIXa. Toutefois, le FXa et la plasmine procèdent à un clivage additionnel du FVIIIa en
Lysine 36 qui se trouve au sein du domaine A1 (Figure 19) (Fay et al, 1996; Nogami et al,
2007; Nogami et al, 2003; Soeda et al, 2010; Varfaj et al, 2007). Plus récemment, un nouveau
mécanisme d’inactivation du FVIII par des élastases de neutrophiles humains (ENH) a été
identifié (Nogami et al, 2011). Ces ENH inactivent le FVIIIa par clivage au niveau des valines
en position 358, 374 et 708 de la chaîne lourde et de la valine en position 1670 de la chaîne
légère du FVIII. Cependant, cette inactivation serait de 4, 8 et 30 fois moins faible que celle
générée par le FXa, l’APC et la plasmine respectivement. Différents fragments vont être
générés selon le mécanisme d’inactivation du FVIII impliqué (Figure 19).
Figure 19: Représentation schématique de différents sites de clivage lors de l’inactivation
protéolytique du FVIII.
3.4. Clairance du FVIII
L’élimination des fragments générée lors de l’inactivation du FVIII est essentiellement

hépatique (Lenting et al, 2007). Au sein des vaisseaux sinusoïdes hépatiques, deux types
cellulaires peuvent être distingués : les hépatocytes et les cellules stellaires (Figure 20.A). Ces
deux types cellulaires sont séparés des cellules endothéliales sinusoïdales par l’espace de
disse. Les cellules de kuppfer, dérivées des macrophages, se trouvent insérées entre des
cellules endothéliales sinusoïdales.
Dans la circulation sanguine, la majorité du FVIII se trouve lié au FvW. Le complexe

FVIII/FvW est exclusivement éliminé par les cellules de kuppfer via le récepteur LDL
Receptor Lipoprotein 1 (LRP1) (Figure 20.B). Cependant, l’élimination du FVIII libre fait
intervenir quatre récepteurs de clairance (Figure 20.B). Ces récepteurs sont exprimés sur les
hépatocytes : les familles de récepteurs associées aux low density lipoprotein (LDLR)
(Bovenschen et al, 2005a), le récepteur LRP1 (Lenting et al, 1999) et les récepteurs à
protéoglycannes à héparine sulfate (HSPG) (MacArthur et al, 2007) et aux carbohydrates tels
le récepteur à l’asialoglycoproteine (ASGPR) (Bovenschen et al, 2005b).
Figure 20: Représentation schématique du lieu et mécanisme de clairance. A. Constitution

d’un vaisseau hépatique. B. les cellules et les récepteurs impliqués dans la clairance du FVIII,
d’après (Lenting et al, 2007).
4. Structure tridimensionnelle du FVIII
En absence de données cristallographiques aux rayons X dans les années 90, une étude
par microscopie électronique a permis de caractériser le FVIII humain comme une protéine
possédant une tête globulaire d’environ 14 nm de diamètre, avec des appendices satellites
d’environ 50 nm de longueur (Fowler et al, 1990).
Des études basées sur la modélisation par homologie ont été réalisées afin de mieux
comprendre la structure du FVIII. Ces études ont permis de déterminer la structure du
domaine A (Pan et al, 1995; Pemberton et al, 1997) ainsi que celle du domaine C (Pellequer et
al, 1998). Cependant, depuis une dizaine d’années, la cristallisation du domaine C2 du FVIII a
pu révéler à haute résolution atomique la structure de ce domaine (Pratt et al, 1999).
Ce n’est qu’en 2008, que la structure cristallographique du FVIII dépourvu du domaine B
a été rapportée par deux équipes de recherche (Ngo et al, 2008; Shen et al, 2008). Ces deux
études ont permis d’identifier avec une résolution élevée la structure 3D ainsi que
l’organisation en domaines de la protéine FVIII. Ces deux structures sont presque identiques
avec comme seule différence un site de liaison à un ion divalent identifié par Shen et al
(Shen et al, 2008). Ces structure 3D sont répertoriées dans la Protein Data Bank (PDB) sous
les références 3CDZ et 2R7E et sont présentées dans la figure 21.
Figure 21: Représentation schématique des structures tridimensionnelles du FVIII. D’après

(Ngo et al, 2008; Shen et al, 2008).
Ces études ont non seulement contribué à déterminer les structures 3D du FVIII mais
aussi à mieux comprendre ses interactions moléculaires. En effet, le FVIII joue un rôle central
dans la formation du complexe tenase (FVIIIa/FIXa) responsable de la conversion du FX en
FXa. Pour maintenir l’équilibre hémostatique, ce complexe ne doit être assemblé qu’en cas de
déclenchement de la cascade de coagulation. Dès lors, le FVIII est soumis à une régulation où
le FvW joue un rôle crucial. L’activation du FVIII n’est possible qu’après clivage de la
protéine permettant la dissociation du complexe FVIII/FvW et l’exposition des sites de liaison
aux PLs et aux FIXa. Le FVIII va donc interagir avec ces différents acteurs : FvW, PLs, FX,
FXa et FIXa, en impliquant différents sites de liaison qui se trouvent dispersés sur les
différents domaines de la protéine. Rappelons que le FVIII est composé de trois domaines A
(A1, A2, A3), d’un domaine de liaison B et de deux domaines C (C1, C2). Nous allons par la
suite décrire l’organisation ainsi que les sites d’interactions des différents domaines.
4.1. Les domaines A
Les domaines A du FVIII (Figure 22.A) ont pu être modélisés en référence aux
structures de la nitrite réductase et de la céruloplasmine avec lesquelles ils partagent de fortes
homologies de structures (Figure 22.B). Ces domaines présentent également des homologies
structurales avec le FV (Figure 22.C) (Church et al, 1984; Koschinsky et al, 1986; Pemberton
et al, 1997).
Figure 22 : A. Structure tridimensionnelle des domaines A du FVIII. B. Structure

tridimensionnelle de la céruloplasmine C. Capture superposée des deux structure
tridimensionnelle du FVIII et FV. D’après (Shen et al, 2008).
Des études de structure 3D du FVIII entier ont permis d’identifier de manière précise
l’organisation des différents domaines A. Chaque domaine possède deux sous-domaines
composés de feuillets β repliés en tonneau β, typique d’une structure dite « cupredoxine-like »
(Figure 23.A) (Parker & Lollar, 2007). Les trois domaines A du FVIII sont arrangés en un
hétérotrimère triangulaire autour de trois pseudo-axes symétriques où les domaines A1 et A3
servent de base (Figure 23.B). Cette base va permettre l’interaction avec les domaines C2 et
C1 (Ngo et al, 2008). Des résidus dans les domaines Al et A3 interagissent par des forces
hydrophobes afin de stabiliser le FVIII hétéro-dimérique (Fay, 1988; Sudhakar & Fay, 1998).
Figure 23 : Modèles moléculaires des domaines A. A. Composition des sous-domaines A,
d’après (Parker & Lollar, 2007). B. Les domaines A1, A2 et A3 forment un hétérotrimère
triangulaire autour d’une symétrie centrale en 3 axes, d’après (Ngo et al, 2008).
Les ions métalliques jouent un rôle important dans l’activité et la structure du FVIII.
Quatre ions métalliques ont été identifiés comportant deux ions Ca2+ et deux ions cuivre
(Cu2+). Ces ions sont tous situés au niveau des domaines A du FVIII (Fay, 1988; Ngo et al,
2008; Shen et al, 2008; Tagliavacca et al, 1997; Wakabayashi et al, 2004). Le premier Ca2+
est positionné entre quatre résidus du domaine A1 (Glu110-Asp116-Asp125-Asp126)
(Figure 24.A) (Wakabayashi et al, 2004), tandis que le second qui n’a été observé que par
Shen et al. se situe entre les résidus Asn538 et Asp542 du domaine A2 (Shen et al, 2008). Les
deux ions Cu2+ ont été observés dans les domaines A1 (entre les résidus His267, His315 et
Cys310) (Figure 24.B) et A3 (entre les résidus His1954, His2005 et Cys2000) (Figure 24.C)
(Shen et al, 2008).
La Cys310 de la chaîne lourde et la Cys2000 de la chaîne légère du FVIII semblent

avoir un rôle crucial dans l’association des deux chaînes du FVIII via les ions métalliques
(Tagliavacca et al, 1997; Wakabayashi et al, 2004). Ces deux chaînes sont réassemblées par
les ions Ca2+ et Cu2+.
Figure 24 : Localisation des ions métalliques de la protéine FVIII, d’après (Ngo et al, 2008).
4.2.Les domaines C
Les domaines C présentent un repliement semblable aux membres de la famille des

discoïdines (Baumgartner et al, 1998; Pellequer et al, 1998). Ces domaines sont composés
d’un tonneau de feuillets β déformé. Les domaines C1 et C2 présentent de très fortes
homologies avec les domaines C1 et C2 du FV (Fuentes-Prior et al, 2002; Pratt et al, 1999).
Chaque domaine C projette trois boucles β en forme d’épingle à cheveux. Ces boucles sont
constituées de résidus hydrophobes et basiques qui contribuent à l’interaction du FVIII avec la
membrane phospholipidique (Figure 25). Le domaine C1 est orienté de manière parallèle et se
trouve très proche du domaine C2, une position favorisant leur interaction avec la membrane
phospholipidique (Lu et al, 2011; Ngo et al, 2008).
Figure 25 : Représentation de la structure des domaines C du FVIII. A, d’après (Ngo et al,
2008).
4.3. Le domaine B
Le domaine B est codé par un seul exon : l’exon 14. Ce domaine B ne possède aucune
homologie de séquence avec d’autres protéines connues (Pipe, 2009). Il contient 19 des 25
sites potentiels de glycosylation. Le rôle du domaine B et sa structure restent encore mal
définis. Même s’il n’est pas directement nécessaire pour l’activité pro-coagulante du FVIII, il
semble jouer un rôle majeur dans la transformation/modification et le trafic cellulaire du
FVIII (Pipe, 2009).
D’autre part, le domaine B fortement glycosylé va permettre des interactions avec les
récepteurs reconnaissant les sucres impliqués dans la clairance du FVIII. En effet, les
récepteurs ASGPR reconnaissent les résidus N-glycosylés du domaine B. Ceci favorise la
liaison du FVIII à ces récepteurs lors de la clairance du FVIII (Bovenschen et al, 2005b).
5. Les interactions moléculaires du FVIII

5.1. Interaction du FVIII avec le FvW
Le FvW est une glycoprotéine multimérique qui assure un double rôle dans
l’hémostase. D’une part, le FvW favorise l’adhésion des plaquettes au niveau des sites de
lésions vasculaires. D’autre part et immédiatement après la libération du FVIII dans la
circulation sanguine, le FvW joue un rôle de transporteur du FVIII hétéro-dimérique
jusqu’aux sites lésés.
Une première région d’interaction au FvW a été initialement identifiée entre les
résidus 1670 et 1689 de la région a3 du FVIII. En effet, plusieurs équipes ont montré que des
anticorps monoclonaux, dont les épitopes se situaient au niveau des régions 1670-1684
(Foster et al, 1988) et 1673-1689 (Leyte et al, 1989) étaient capables d’inhiber la liaison du
FVIII au FvW. De plus, la délétion de la région a3 (1649-1689) aboutit à la formation d’un
FVIII mutant incapable de se lier au FvW (Pittman & Kaufman, 1989). Par ailleurs, la
sulfatation de la Tyr1680 semble être particulièrement importante pour la liaison au FvW
puisque son absence diminue la capacité de la liaison FVIII-FvW (Leyte et al, 1991; Saenko
& Scandella, 1997).
Deux séquences d’aa (2181-2243 et 2303-2332) situées sur le domaine C2 sont

également impliquées dans l’interaction au FvW. En effet, il a été constaté que les mutations
des aa dans les boucles hydrophobes Met2199/Phe2200 et Leu2251/Leu2252 entraînaient une
perte d’affinité de ces mutants pour les PLs et le FvW ainsi qu’une perte d’activité spécifique
du FVIII (Gilbert et al, 2002). Il semble donc que ces boucles constituent des motifs de
fixation du FvW au FVIII (Pratt et al, 1999; Stoilova-McPhie et al, 2002).
D’autre part, la région 2303-2332 du domaine C2 représente un site de liaison reconnu à la
fois par le FvW et les PLs (Foster et al, 1990b).
Le domaine C1 a également été proposé comme acteur dans la liaison au FvW,

puisqu’une molécule recombinante C1-C2 se lie deux fois plus au FvW que le domaine C2
isolé (Liu et al, 2010). Liu et al. ont démontré que les résidus Gln 2100 et Arg 2150 sont
importants pour induire une conformation C1-C2 compatible à la liaison au FvW (Liu et al,
2000).
Un autre groupe d’aa dans le domaine C1 semble également jouer un rôle dans cette
interaction. Il s’agit de trois résidus : Ser 2119, Arg 2116 et Tyr 2105. En effet, il a été
constaté qu’un anticorps dirigé contre un épitope du domaine C1 inhibe l’interaction du FVIII
avec le FvW. De plus, une mutation de la Ser2119 en Tyr diminue l’affinité de 80 fois de
cette liaison au FvW (Jacquemin et al, 2000). Récemment, Lu et al. ont pu démontrer par
mutagénèse dirigée du domaine C1 que les résidus Gln 2042 et Tyr 2043 participaient
également à cette liaison (Lu et al, 2011).
De plus, d’autres mutations de type faux-sens ont été identifiées dans les domaines C1
et C2 chez des patients hémophiles présentant une capacité réduite de liaison du FVIII au
FvW (Figure 26) (Terraube et al, 2010). Ces résultats confirment le rôle essentiel des deux
domaines C1 et C2 pour la formation d’un complexe FVIII-FvW stable.
Figure 26 : Localisation des substitutions des aa situées au niveau des domaines C empêchant
la liaison au FvW, d’après (Terraube et al, 2010). Les sphères vertes indiquent les aa dont la
mutation entraine une diminution de la liaison du FvW.
5.2. Interaction du FVIII avec les PLs
La liaison du FVIII à la membrane phospholipidique est un processus clé dans la

cascade de la coagulation. Activé par la thrombine, le FVIIIa agit comme cofacteur dans le
complexe tenase en se liant à cette membrane. En effet, cette surface membranaire permet de
positionner les facteurs de coagulation et leurs cofacteurs dans une configuration optimale
pour une activité enzymatique efficace.
Plusieurs sites de fixation du FVIIIa aux PLs ont été mis en évidence au niveau du
domaine C2 et plus récemment au niveau du domaine C1. La plupart de ces sites d’interaction
avec les PLs sont chevauchants avec ceux du FvW.
Le FVIII se fixe aux PLs membranaires par l’intermédiaire du domaine C2. En effet,
les études de Foster et al. ont montré l’implication des résidus 2303 à 2332 de ce domaine
dans la liaison aux PLs (Foster et al, 1990a). De plus, des études cristallographiques et de
mutagenèse dirigée ont mis en évidence la présence de deux boucles hydrophobes (Met
2199/Phe 2200 et Leu 2251/Leu 2252) qui pénètrent la bicouche lipidique et s’associent avec
les chaînes d’acides gras (Figure 27) (Barrow et al, 2000; Pratt et al, 1999).
Figure 27: Sites d’interaction du domaine C2 avec la membrane phospholipidique, d’après

(Schatz et al, 2004). Les principaux feuillets β sont représentés en ruban gris foncé. Les quatre
boucles qui interagissent avec la membrane phospholipidique sont représentées en gris clair.
Deux autres boucles ont également été proposées dans des modèles 3D, impliquant les
résidus Gln 2222-Lys 2227 et Trp 2313-His 2315 où notamment la fixation d’un anticorps
inhibiteur à la surface du FVIII donne une importance particulière au segment Trp 2313-His
2315 dans la fixation du FVIII aux PLs (Liu et al, 2010; Stoilova-McPhie et al, 2002). Schatz
et al. ont étudié le rôle du Trp 2313 qui est exposé à la surface du domaine C2 en utilisant un
mutant Trp 2313 Ala. Les résultats obtenus ont montré que cette mutation induit une
augmentation de la constante de dissociation de 28 fois dans un test de liaison à la membrane
phospholipidique synthétique (Schatz et al, 2004). Il semble donc que ce résidu ait un rôle
critique dans l’association du FVIII aux PLs.
Le domaine C1 a également été identifié comme jouant un rôle dans l’affinité du FVIII
aux PLs. En effet, Hsu et al. ont montré que plus de 90 % des plaquettes activées se lient à
une molécule recombinante C1-C2 alors que 50 % environ se lient au domaine recombinant
C2 seul (Hsu et al, 2008). De plus, sept mutations localisées dans le domaine C1, au niveau
des résidus Arg 2090/Gln 2091, Lys 2092/Phe 2093, Gln 2042/Tyr 2043 et Arg 2159
semblent affecter l’interaction entre le FVIII et la surface membranaire (Figure 28) (Liu et al,
2010; Meems et al, 2009). L’Arg2159 et les aa adjacents Gln 2042/Tyr 2043 constituent des
zones chevauchantes d’interaction FVIII-PLs/ FVIII-FvW (Liu et al, 2000). Récemment,
Bloem et al. ont confirmé que les deux régions 2092-2093 et 2158-2159 sont impliquées dans
l’interaction aux PLs (Bloem et al, 2013b).
Figure 28: Sites d’interaction impliqués dans la liaison du FVIIIa à la membrane

phospholipidique, d’après (Liu et al, 2010).
5.3. Interaction du FVIIIa avec le FIXa au sein du complexe tenase
Plusieurs sites de liaisons sont impliquées dans l’interaction entre le FIXa et le FVIIIa.
Ces sites se situent sur les domaines A2, A3 et C2 du FVIIIa (Figure 29). Le domaine A2
regroupe la majorité des sites de liaisons avec le FIXa. Les différents résidus impliqués dans
cette interaction sont : Arg 484-Ile 508, Ser 558-Gln 565, Arg 698-Ser 710 et 712 (Bajaj et al,
2001; Fay et al, 1994; Fay et al, 2001; Fay & Scandella, 1999; Jagannathan et al, 2009).
Le site d’interaction au niveau des résidus 558 à 565 est impliqué dans la modulation de
l’activité du FIXa et interagit avec le domaine serine protéase du FIXa (Bajaj et al, 2001;
Jenkins et al, 2002). Ce site d’interaction semble s’étendre aux résidus 511-530, avec un rôle
déterminant de l’Arg 527 (Celie et al, 1999).
Figure 29 : Principaux sites d’interaction du FVIIIa avec le FIXa, d’après (Ngo et al, 2008).
Les sites de liaison du FVIII (molécule de gauche) impliqués dans l’interaction avec le FIXa
(molécule de droite) sont représentés en bleu (558-565), violet (712) et rose (1811-1818).
Le domaine A3 semble contenir un site de liaison de haute affinité avec le domaine

Epidermal Growth Factor-1 (EGF-1) du FIXa (O'Brien et al, 1995). Cette liaison est inhibée
en présence d’un anticorps monoclonal anti-domaine A3 (Lenting et al, 1994). La même
équipe a pu localiser, grâce à des études d’inhibition avec des peptides synthétiques, le site
d’interaction de l’EGF-1 au niveau de la région Glu1811-Lys1818 (Lenting et al, 1996).
Récemment, Bloem et al, ont pu démontrer que la Phe1816 de la région Glu1811-Lys1818
contribue à la liaison au FIXa (Bloem et al, 2013a). Il a été également montré que le domaine
C2 possédait un site d’interaction avec le domaine Gamma-carboxyglutamic acid-rich du
FIXa (Gla) au niveau de la région 2228-2240 (Soeda et al, 2009; Soeda et al, 2011).
5.4. Interaction avec le substrat FX
Peu de données sont disponibles quant à la liaison du FX au FVIII. Cependant, il

semble que la région a1 du FVIII contient un site de fixation pour le domaine serine protéase
du FX au niveau des résidus 337-372 (Lapan & Fay, 1997; Nogami et al, 2003).
Récemment, il a été démontré que le peptide synthétique comprenant les résidus 2007-2016
du domaine A3 était capable de bloquer l’interaction du FX à la chaîne légère du FVIII
et peut donc se lier directement au FX. Par mutagenèse dirigée, Takeyama et al. ont révélé
que la Thr 2012 et la Phe 2014 contribuent avec une affinité relativement élevée à
l’interaction FVIII-FX (Takeyama et al, 2012).
D’autre part, Nogami et al. ont démontré qu’une séquence connue comme contenant
l’épitope de l’anticorps monoclonal murin ESH8 (2253-2270) était capable d’inhiber la
liaison du domaine C2 au FXa (Nogami et al, 1999).
5.5. Interactions du FVIII avec les LRP1 dans son catabolisme
Le FVIII peut se lier à la LRP1 par quatre sites de liaison : la région Arg484- Phe509
(domaine A2) (Saenko et al, 1999; Sarafanov et al, 2006), la région Glu 1811-Lys 1818
(domaine A3) (Bovenschen et al, 2003), la région Ser2173-Tyr2332 (domaine C2) (Lenting et
al, 1999) et dans le domaine C1 au niveau des deux résidus Lys2092 et Phe2093
(Meems et al, 2011).
Le site Arg484-Phe509 est enfoui dans le FVIII et n’est exposé en surface que lorsque
le FVIII est activé. Il ne permet donc la liaison à la LRP1 qu’avec le FVIIIa. La région
Glu 1811-Lys 1818 est par contre exposée à la surface du FVIII, mais elle est masquée par le
VWF qui empêche ainsi la liaison à la LRP1 du FVIII complexé au VWF.
VIII. Anomalies génétiques responsables de l’HA
L’hétérogénéité phénotypique de l’HA est le reflet de la grande variabilité d’anomalies

génétiques responsables de cette pathologie. Ces anomalies se trouvent dispersées dans
l’ensemble de la région génomique du gène F8. Les premières mutations associées à l’HA ont
été identifiées juste après le clonage du gène F8 (Gitschier et al, 1985). Le développement de
techniques de criblage de plus en plus sensibles a permis une avancée rapide dans la détection
de ces mutations, comme en témoigne plusieurs bases de données chargées de répertorier ces
mutations : l’HAMSTeRS (Haemophilia A Mutation, Structure, Test, and Resource Site)
(Kemball-Cook & Tuddenham, 1997), l’HGMD (Human Gene Mutation Database)
(Stenson et al, 2009) et la CHAMP (CDC Hemophilia A Mutation Project)
(Payne et al, 2013).
La CHAMP mutations est actuellement considérée comme la base de référence pour

l’HA. Cette base de données est continuellement mise à jour et regroupe plus de 2556
mutations (Tableau 2). Ces mutations sont très variables incluant les micro-inversions,
les mutations ponctuelles, les mutations de type décalage de cadre de lecture, les délétions
complètes ou partielles du gène, les insertions et les duplications (Tableau 2).
La CHAMP mutation rapporte continuellement les nouvelles mutations responsables

de l’HA ainsi que leurs paramètres cliniques associés. La figure 30 montre le nombre de
nouvelles mutations responsables d’HA déclarés par année de publication dans la CHAMP
(Payne et al, 2013). Le nombre de nouvelles mutations a culminé à 424 nouvelles mutations
répertoriés en 2008, année où les résultats de plusieurs grandes études concernant l’HA ont
été publiés.
Tableau 2 : Liste des mutations responsable d’HA répertoriées dans la CHAMP database
dernière mise à jour Mars 2013 http://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/champs.html.
Type de mutation Nombre de mutations Pourcentage %
Mutations ponctuelles 1730 67,68%

Faux sens 1244 48,7%
Nonsense 290 11,3%
Au niveau des sites d’épissage 196 7,7 %
Mutations de type décalage de 597 23,3%

cadre de lecture
Délétions 419 16,4%
Duplications 129 5%
insertions 25 0,1%
Délétions/insertions 24 0,09%
Délétions 155 6%
Micro-délétions 121 4,7%
Grande délétions 34 0,13%
Insertions 13 0,05%
Petites insertions 7 0,03%
grandes insertions 6 0,02%
Duplications 26 0,1%
Petites duplications 5 0,01%
Grandes duplications 21 0,09%
Autres mutations 21 0,09%

Mutations silencieuses 15 0,05%
Au niveau du promoteur 6 0,04%
Totale 2556 100%
Figure 30: Distribution des nouvelles mutations responsable d’HA déclaré par la CHAMP par
année de publication, d’après (Payne et al, 2013).
La majorité des mutations responsables de l’HA sont rares ou spécifiques à une

famille à l’exception des micro-inversions du gène F8 qui sont relativement communes et
courantes (Bagnall et al, 2002; Lakich et al, 1993). Deux types de micro-inversions
intra-chromosomiques du gène F8 ont été décrits. Il s’agit de la micro-inversion de l’intron 22
et de l’intron 1 dont le mécanisme pathogène est une recombinaison entre les séquences
intra-géniques Int22h-1 et Int1h-1 avec leurs séquences homologues extra-géniques
télomériques respectivement Int22h-2 et Int22h-3, et Int1h-2. Ces deux micro-inversions sont
responsables d’un phénotype sévère de la maladie.
Ces micro-inversions surviennent principalement lors de la méiose masculine où la

partie intermédiaire du chromosome X se trouve libre (Rossiter et al, 1994). En effet, les
chromosomes sexuels s’apparient lors de la méiose uniquement au niveau des régions
pseudo-autosomiques PAR (Pseudo Autosomic Region, PAR1 et PAR2) (Figure 31)
(Flaquer et al, 2008; Helena Mangs & Morris, 2007). La séquence PAR1, de taille
égale à 2,6 Mégabases (Mb), se trouve à l’extrémité des bras courts (p) des deux
chromosomes X et Y (Figure 31) (Graves et al, 1998; Rappold, 1993). Tandis que la PAR2
couvrant 320 kb est située à l’extrémité des bras longs des chromosomes sexuels (Figure 31)
(Freije et al, 1992). Après appariement des deux séquences PAR, la partie intermédiaire du
chromosome X forme une boucle responsable d’appariement entre les séquences homologues.
Les cellules germinales mâles présentent alors dix fois plus de taux de ces micro-inversions
par rapport aux cellules germinales féminines. Lors de la méiose féminine, les deux
chromosomes X sont totalement appariés ce qui réduit le risque de survenue d’un tel
phénomène (Rossiter et al, 1994).
Figure 31 : Structure des chromosomes sexuels mâles humains et la localisation des deux
régions PAR1 et PAR2, d’après (Flaquer et al, 2008).
1. La micro inversion de l’intron 22
La micro-inversion de l’intron 22 constitue l’anomalie la plus fréquente (50%) chez

les patients HA sévères (Lakich et al, 1993). Cette micro-inversion est le résultat d’une
recombinaison intra-chromosomique homologue qui a lieu au cours de la méiose entre la
région intra-génique Int22h-1 (contenue dans l’intron 22 du gène F8) et l’une des deux copies
extra-géniques homologues: int22h-2 (proximale) ou int22h-3 (distale)
(Lakich et al, 1993; Naylor et al, 1995).
Après alignement homologue, la recombinaison a pour effet de déplacer et inverser les

exons 1 à 22 de leur contexte normal (Oldenburg, 2001). Le résultat de cet événement est
l’inversion d’un fragment de 500 kb ou 600 kb ayant pour limite centromérique : Int22h-1
suivi des exons 22 à 1 du gène F8, et pour limite télomérique : Int22h-2 ou Int22h-3
(Figure 32).
L’Int22h-1 et les 22 premiers exons du F8 forment ainsi la limite télomérique du

fragment et présentent une orientation inversée par rapport à celle normale de leur localisation
intra-génique. Le gène F8 est ainsi divisé en deux partie avec sa partie 5’ éloignée à plus de
400 kb vers le télomère et ayant changé d’orientation avec sens de lecture 5’-3’ inversé du
centromère vers télomère, bloquant toute possibilité de transcription complète du gène (Figure
32).
Figure 32: Représentation schématique du mécanisme responsable de micro inversion de

Les données du séquençage complet du chromosome X ont confirmé que l’Int22h-2

et l’Int22h-3 sont d’orientation opposée chacun étant intégré dans les bras d’un palindrome
imparfait (Ross et al, 2005). Pour qu’une recombinaison apparaisse entre deux séquences
homologues, il est nécessaire qu’elles soient d’orientation inverse. Cette condition
est respectée pour l’Int22h-1 et l’Int22h-3 ce qui pourrait expliquer la fréquence plus élevée
de la micro-inversion distale de l’intron 22. Cependant, pour l’Int22h-1 et l’Int22h-2
présentant la même orientation le phénomène de recombinaison directe avec inversion
conséquente entre ces deux séquences est impossible (Bagnall et al, 2005).
Pour aboutir à ce processus final créant une micro-inversion proximale, une étape préalable
est nécessaire. L’hypothèse présentée alors par Bagnall et al. consiste en une recombinaison
initiale entre les deux bras du palindrome imparfait créant une micro-inversion des séquences
Int22h-2 et Int22h-3 (Bagnall et al, 2005). Ceci créerait un allèle où l’Int22h-2 serait éloignée
vers la position la plus télomérique et serait d’orientation inverse à celle d’Int22h-1. Cette
micro-inversion serait polymorphique car non délétère pour le gène F8.
2. La micro-inversion de l’intron 1
La première description faisant évoquer la micro-inversion de l’intron 1 a été

rapportée en 1996 par Brinke et al. qui décrivait une inversion altérant le F8 au niveau de son
premier intron (Brinke et al, 1996). Cette micro-inversion est le résultat d’un crossing-over
intra-chromosomique homologue entre une séquence de 1 kb au niveau de l’intron 1 du gène
F8 (Int1h-1) et sa séquence homologue (Int1h-2) répétée dans une orientation opposée à
approximativement 140 Kb de la région télomérique, aboutissant à la rupture de la séquence
du gène F8 (Bagnall et al, 2002) (Figure 33).
Le gène F8 se trouve divisé en deux parties dans des orientations opposées. En effet,
l’exon 1 est déplacé dans la direction opposée à celle des exons 2 à 26. Cette micro-inversion
crée deux transcrits hybrides : l’un sous le contrôle du promoteur du F8 et ne comprend que
l’exon 1 du F8; l’autre sous le contrôle du promoteur du gène BRCC3 et comprend tous les
exons sauf le dernier de BRCC3 et les exons de 2 à 26 du gène F8 (Brinke et al, 1996).
Figure 33: Représentation schématique du mécanisme responsable de la micro-inversion de
En plus des micro-inversions décrites ci-dessus, l’HA est causée par d’autres types de
mutations qui peuvent être divisées en quatre grandes catégories : les mutations ponctuelles,
les mutations de type décalage de cadre de lecture, les délétions/insertions et les duplications
(Payne et al, 2013).
3. Les mutations ponctuelles
La majorité des cas d’HA (environ 67%) a pour origine une mutation ponctuelle dans
le gène F8 (Tableau 2). Ces mutations ponctuelles regroupent les mutations faux-sens, les
mutations non-sens et les mutations au niveau des sites d’épissage. La distribution de ces
mutations est indiquée dans le tableau 2. La majorité des mutations ponctuelles sont des
mutations faux-sens (48,7%), suivis par les mutations non-sens (11,3%) et enfin les mutations
au niveau des sites d’épissage (7,7%) (Tableau 2).
La distribution de ces mutations tout au long des exons du gène F8 codant les
différents domaines de la protéine est représentée dans la figure 34. Les mutations nonsenses
et au niveau des sites d’épissage sont réparties sur l’ensemble des domaines FVIII.
Cependant, les mutations faux-sens sont dispersées tout au long des domaines à l’exception
du domaine B où elles sont relativement rares (Payne et al, 2013).
Figure 34: Distribution des mutations ponctuelles sur les différents domaines du FVIII,
Les mutations faux-sens correspondent à la substitution ponctuelle d’une base d’un

codon, induisant un remplacement d’un aa par un autre. La sévérité de l’HA dépend alors de
la localisation et des propriétés de l’aa substitué. Dans le cas de substitutions d’aa « semi-
conservatrices »; où le nouvel aa est similaire à l’aa d’origine ou respecte sa charge, son
hydrophobicité, sa polarité ou sa forme; la mutation semble être associée à un phénotype
moins sévère, sauf si elle se produit dans une région impliquée dans la structure (au niveau
des ponts disulfures) ou la fonction de la protéine (au niveau des sites fonctionnels de la
protéine) (Bowen, 2002b).
Cependant dans le cas de substitutions « non conservatrices »; où le nouvel aa est

totalement différent de l’aa d’origine; le degré de sévérité de l’HA associé à la mutation est
fonction du degré de déstabilisation de la protéine quelle que soit la région du gène touchée
(Bowen, 2002a).
Parmi les mutations faux sens les plus particulières, les substitutions de type C>T
et G>A au niveau des dinucléotides CpG ont été décrites chez des patients atteints d’HA.
Ces mutations sont provoquées par la désamination spontanée induite par la méthylation de la
5-méthylcytosine (El-Maarri et al, 1998; Youssoufian et al, 1988). Les points chauds pour ce
type de mutation sont les codons : 1689, 1941, 1966, 2147, 2150, 2159, et 2163.
Les mutations non-sens conduisent à l’intégration d’un codon stop à la séquence de

l’ADN de façon prématurée. Ce codon stop est responsable de la production d’une molécule
tronquée non fonctionnelle. Ce type de mutation est ainsi associé à la forme sévère de la
maladie.
Les mutations au niveau des sites d’épissage correspondent à l’ajout ou la suppression

d’un site d’épissage. Ces mutations affectent soit des sites donneurs (GT), soit des sites
accepteurs (AG) d’épissage en positions 5’ et 3’ des régions introniques. Ce type de mutations
conduit à la formation d’un ARNm mature différent menant à une protéine aberrante.
En effet, ce type de mutation peut être responsable soit d’un saut d’exon ou de la formation
d’un site cryptique entraînant la transcription d’une séquence qui à l’état normal n’est jamais
transcrite. Selon le transcrit produit, ces mutations sont associées à des formes variables de
sévérité d’HA (CHAMP mutations).
4. Les mutations de type décalage de cadre de lecture
Les mutations de type décalage de cadre de lecture sont responsable de 23,3% d’HA
(Tableau 2). Ces mutations sont causées par des petites délétions, des insertions ou des
duplications différentes d’un multiple de trois situées dans des régions codantes du gène du
F8. Ces mutations sont responsables d’un décalage du cadre de lecture lors de la traduction de
l’ARNm en protéine, ce qui aboutit le plus souvent à l’apparition d’un codon stop prématuré.
Ce type de mutation est ainsi associé à la forme sévère d’HA (Payne et al, 2013).
5. Les délétions/insertions
Les délétions/insertions sont retrouvées chez 6,05% de la population HA (Tableau 2).

Ces mutations sont le plus souvent responsables d’un décalage du cadre de lecture de l’ADN,
ce qui modifie considérablement la protéine et conduit généralement à une forme sévère de la
pathologie. Des délétions/insertions causées par des erreurs de glissement de l’ADN
polymérase en série de nucléotides d’adénine (A) au niveau du gène F8 ont été rapportées.
Les principaux points chauds pour ces mutations sont les codons : 1191-1194, 1439-1441 et
1588-1590 (Oldenburg & El-Maarri, 2006).
5.1. Les délétions
Les délétions du gène F8 sont responsables de 6% d’HA (Tableau 2). Elles peuvent
être de deux types : les grandes délétions (4,7%) ou les micro-délétions (1,3%) (Tableau 2).
Les grandes délétions regroupent les délétions partielles ou totales du gène qui peuvent
atteindre une région de 210 kb (Figure 35). Au niveau protéique, ces délétions peuvent induire
la disparition de la fonction du FVIII, la suppression d’une partie importante de la protéine
ou introduire un changement du cadre de lecture. Ainsi, ce type de modification est
généralement associé à une forme sévère de l’HA (CHAMP mutations).
Les micro-délétions sont des petites délétions d’un à plusieurs paires de bases
(< 50 pb). Ces micro-délétions peuvent avoir comme conséquence soit un décalage du cadre
de lecture ou l’apparition d’un codon stop à la séquence protéique (CHAMP mutations).
Figure 35: Représentation schématique des larges délétions responsables d’HA,

5.2. Les insertions
Les insertions correspondent à l’ajout d’une séquence nucléotidique à la séquence du

gène. Au niveau du gène F8, deux types d’insertions ont été rapportés : les grandes insertions
(0,02%) et les petites insertions (0,03%) (Tableau 2). Seulement deux type de grandes
insertions de novo sur le gène du F8 (fragments de 2,64 et de 3,8 kb) ont été mis en évidence
au niveau de l’exon 14 et sont associés à la forme sévère de la maladie. Les autres types
rapportés représentent des insertions d’une seule base. Ces dernières sont à l’origine de
l’apparition d’un décalage de lecture responsable de la forme sévère de la maladie (CHAMP
mutations).
6. Les duplications
Un autre type de mutation responsable de l’HA est les duplications du gène F8.
Ces mutations sont responsables d’environ 0,1% des cas d’HA (Tableau 2). Les duplications
peuvent avoir comme effet soit un décalage du cadre de lecture ou de gros réarrangements de
gène de type duplication d’un exon individuel comme cela a été rapporté pour l’exon 24
(Rafati et al, 2011) ou bien d’une région contenant plusieurs exons tels que les duplications
des exons 1 à 5 et des exons 7 à 22 (Rost et al, 2008; Zimmermann et al, 2010).
IX. Développement des inhibiteurs anti-FVIII
Actuellement, la complication majeure consécutive au traitement de l’HA est

l’apparition chez le patient hémophile d’anticorps dirigés contre le FVIII thérapeutique
appelés « anticorps inhibiteurs ». Ces anticorps neutralisent l’activité pro-coagulante du
FVIII. Ainsi, le FVIII thérapeutique administré aux patients est détruit avant d’avoir enrayé
toute hémorragie. L’apparition de ces anticorps plonge les patients dans une impasse
thérapeutique majeure tout en affectant de façon drastique leur qualité de vie et en augmentant
dangereusement la morbidité et la mortalité de la maladie (Darby et al, 2004).
Cette complication a également un impact économique important sur l’augmentation du coût
de la prise en charge de ces patients (Gringeri et al, 2003).
L’apparition d’un anticorps anti-FVIII est précoce dans la vie d’un patient hémophile,
généralement dès les premières injections de FVIII thérapeutique. Ces anticorps apparaissent
souvent au cours des 10 à 50 premiers jours cumulés en présence de l’antigène (JCPA)
(Hay, 2006; Wight & Paisley, 2003). Si aucun anticorps n’apparaît au cours des 50 premiers
JCPAs, sa probabilité de survenue devient faible voire impossible.
Le développement de ces anticorps survient en moyenne chez 30 % des patients

hémophiles A sévères, et 5 % des patients hémophiles A mineurs et modérés
(Oldenburg & Pavlova, 2006). Outre les thérapies de substitution précédemment citées
(cf.III.4.4) visant à court-circuiter le besoin en FVIII, un protocole d’induction de tolérance
immune (ITI) peut être proposé (Astermark, 2011; Astermark et al, 2006a; DiMichele et al,
2007; Hay et al, 2006). Ce protocole consiste à administrer des injections répétées régulière
de très fortes doses de FVIII thérapeutique afin d’induire une anergie et forcer la tolérance
immunitaire au FVIII thérapeutique.
1. Caractéristiques des anticorps anti-FVIII
Parmi les anticorps générés lors de la réponse immunitaire anti-FVIII, un seul type est
responsable de la mise en échec du traitement. En effet, seuls sont impliqués les anticorps
capables d’inhiber le rôle pro-coagulant du FVIII thérapeutique, attribut qui leur a valu
l’appellation d’anticorps « inhibiteurs ».
Les inhibiteurs constituent une population d’immunoglobulines G polyclonale (IgG)
dirigées contre les différents domaines du FVIII thérapeutique. Ces IgG ont été initialement
caractérisés comme appartenant à des sous-classes IgG1 et IgG4 (Fulcher et al, 1987;
Kavanagh et al, 1981). Bien que ces derniers sont les plus abondants chez les patients
développant des inhibiteurs, d’autres études ont montré que le développement des inhibiteurs
implique également des sous-classes IgG2 (Fulcher et al, 1987; Gilles et al, 1993; Reding et
al, 2002; Whelan et al, 2013). Cependant, la prédominance des IgG4 pourrait s’expliquer par
l’administration répétée du produit thérapeutique. En effet, les IgG4 sont une sous-classe
impliquée dans les réactions atopiques déclenchées par une exposition prolongée à certains
allergènes comme le pollen, la poussière ou les acariens (Aalberse et al, 1983).
Les inhibiteurs présentent des sites de liaison tout au long du FVIII thérapeutique
empêchant les interactions entre le FVIII et ses partenaires au cours de la cascade de
coagulation: FvW, PLs, FIX et FX (cf.IV.5) (Figure 36) (Lavigne-Lissalde et al, 2009).
D’autres inhibiteurs interférant avec les activateurs du FVIII (par la thrombine ou FXa) ont
été caractérisés (Meeks et al, 2007; Meeks et al, 2008). Bien que les inhibiteurs de FVIII
reconnaissent les épitopes dans tous les domaines, le domaine A2 et la chaîne légère
(C2, C1 et A3) apparaissent les plus immunogènes (Chaves et al, 2008; Meeks et al, 2007;
Meeks et al, 2008; Scandella et al, 2001).
Figure 36: Représentation schématique des épitopes reconnus par les inhibiteurs anti-FVIII.
2. Mécanisme d’action des anticorps anti-FVIII
Les inhibiteurs anti-FVIII peuvent neutraliser le FVIII par trois grands mécanismes :
par encombrement stérique (Dimitrov et al, 2010; Lavigne-Lissalde et al, 2009; Zhang et al,
2009), par hydrolyse catalytique (Lacroix-Desmazes et al, 2002; Lacroix-Desmazes et al,
1999) ou en formant des complexes immuns qui accroissent la clairance du FVIII
(Kazatchkine et al, 1980). Compte tenu du caractère polyclonal des anticorps, les différents
mécanismes peuvent être impliqués.
Cependant, le principal mécanisme d’action des inhibiteurs du FVIII est un blocage

fonctionnel de la protéine par encombrement stérique. En effet, les principaux épitopes
reconnus par les inhibiteurs se situent sur le domaine A2 de la chaîne lourde, empêchant le
clivage de la thrombine responsable de l’activation du FVIII et de sa fixation au FIXa
(Lubahn et al, 1989) et sur les domaines A3 et C2 de la chaîne légère bloquant l’interaction du
FVIII avec le FIXa (Arai et al, 1989; Zhong et al, 1998), les PLs et/ou le FvW (Arai et al,
1989; Shima et al, 1993). Certains inhibiteurs se lient également à des épitopes formés par
l’association FVIII/FvW et empêchent la dissociation du complexe suite à l’activation du
FVIII par la thrombine (Saenko et al, 1996).
Un autre mécanisme d’inactivation du FVIII par ces inhibiteurs a également été décrit.
Il s’agit de l’hydrolyse du FVIII par des anticorps possédant une activité enzymatique propre
(Lacroix-Desmazes et al, 1999). Ces anticorps « catalytiques » ont été retrouvés chez 50 %
des patients hémophiles A sévères (Lacroix-Desmazes et al, 2002).
Le dernier mécanisme consiste en une accélération de la clairance du FVIII

(Saint-Remy et al, 2004). Des anticorps peuvent être dirigés contre des épitopes non
fonctionnels du FVIII localisés dans les domaines A1, B ou C1. Ces inhibiteurs agissent en
perturbant la stabilité du FVIII et/ou en formant des complexes immuns rapidement captés et
dégradés par les cellules monocytaires macrophagiques (Gilles et al, 1993; Kazatchkine et al,
1980).
3. Détection des anticorps anti-FVIII
La réponse inhibitrice des anticorps, exprimée en unités Bethesda (UB) par ml de

plasma, est évaluée par une variante de la méthode Bethesda (variante Nijmegen)
(Verbruggen et al, 1995). Cette méthode mesure la neutralisation de l’activité pro-coagulante
du FVIII d’un plasma normal par le plasma du patient hémophile. Une UB correspond à la
quantité d’anticorps capable d’inhiber 50% de l’activité pro-coagulante des facteurs de
coagulation.
La titration des inhibiteurs permet de classer les patients en deux groupes : « les
faibles répondeurs» ou « les forts répondeurs » en fonction de la réponse anamnestique à la
réintroduction de FVIII. Un patient est dit « faible répondeur » si le titre des inhibiteurs reste
inférieur ou égal à 5 UB/ml et « fort répondeur » si le titre est supérieur à 5 UB/ml
à la réintroduction du FVIII (White et al, 2001).
4. Mécanisme immunitaire responsable du développement d’inhibiteur anti-

FVIII
L’apparition des inhibiteurs anti-FVIII résulte de la mise en place d’une réponse

immunitaire dirigée contre le FVIII exogène suite à son administration répétée. Cette réponse
est considérée comme une réponse humorale allo-génique classique, dépendante des
lymphocytes T (LT) (Astermark, 2006b).
Dans une première étape, l’antigène FVIII injecté est reconnu et intériorisé par des
cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Différents types de CPA peuvent être impliqués
dans l’absorption du FVIII thérapeutique : les cellules dendritiques (CD), les macrophages et
les lymphocytes B (LB) (Figure 37) (Andre et al, 2009; Astermark, 2010). Dans les
endosomes de ces cellules, l’antigène est dégradé en peptides qui sont ensuite associés à des
molécules du système Human Leucocyte Antigène de classe II (HLA II). A la surface des
CPA, le complexe peptide/HLA II est présenté aux LT environnants (Andre et al, 2009; White
et al, 2005).
Après stimulation antigénique, les CPA activent les LT CD4+ naïfs spécifiques de
l’antigène. Ces cellules peuvent se différencier en deux types cellulaires (Th1 ou Th2) dont le
rôle et le type de cytokines sécrétées sont différents (Ghosh & Shetty, 2009; Romagnani et al,
1997). Les cellules Th1 sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’Interleukine 2
(IL2) et l’interféron-gamma (INF-γ), et peuvent être directement cytotoxiques. Tandis que les
cellules Th2 produisent des cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL4 et l’IL10, qui
inhibent la prolifération et la fonction des cellules Th1 et des CPA.
Ces deux types de LT vont ainsi induire l’activation des LB spécifiques de l’antigène.
Ces derniers se différencient en plasmocytes, sécrétant des anticorps anti-FVIII et en cellules
B mémoire. Les cytokines de type Th1 stimulent le développement des IgG1 et IgG2, alors
que les cellules Th2 stimulent le développement des IgG4. Une nouvelle injection de FVIII
provoque une réponse immunitaire plus rapide et plus intense du fait de l’activation directe
des LB mémoires en cellules sécrétrices d’anticorps anti-FVIII (Cayzac et al, 2010).
Figure 37: Mécanismes simplifiés de la réponse immunitaire responsable du développement

des inhibiteurs anti-FVIII, d’après (Cayzac et al, 2010).
5. Les facteurs de risque associés au développement des inhibiteurs
La survenue des inhibiteurs anti-FVIII est régie par des facteurs de risque propres aux
patients (génétiques) et d’autres dépendant au traitement (environnemental).
5.1. Les facteurs de risque génétiques
Les facteurs de risque génétiques associés au développement des inhibiteurs

comprennent le type de mutation du gène F8, les antécédents familiaux, l’origine éthnique et
les polymorphismes des gènes de certaines cytokines.
5.1.1. Le type de mutation au niveau du gène F8
Le facteur de risque le mieux caractérisé dans le développement des inhibiteurs est le

type de mutation affectant le gène F8. Certains types de mutations modifient
considérablement le risque d’apparition de ces inhibiteurs (Astermark, 2006b; Gouw et al,
2012).
Globalement ces mutations se répartissent en deux groupes (Astermark, 2006b).
Les mutations qui se révèlent fortement délétères et empêchent toute synthèse de la molécule
(les micro-inversions, les délétions étendues et les mutations non-sens). Et celles qui résultent
en une synthèse de FVIII; certes anormale mais significative (mutations faux-sens ou
anomalie d’épissage); pour lesquelles le risque de développement des inhibiteurs est plus
faible et estimé à 10% environ des patients traités (Astermark, 2006b).
Le premier groupe de mutations est associé à un risque de développement des

inhibiteurs élevé, variant entre 20 et 90% des patients traités (Astermark, 2006b).
Ces mutations conduisent à l’expression d’un FVIII fortement tronqué ou absent chez les
patients hémophiles. Le FVIII thérapeutique administré à ces patients sera perçu par leurs
systèmes immunitaires comme un antigène partiellement voire totalement étranger. La rupture
de tolérance pour les antigènes du FVIII chez ces patients est responsable de l’installation
d’une réponse immunitaire contre ce FVIII thérapeutique (Saint-Remy et al, 2004).
5.1.2. Origine ethnique et polymorphismes du gène du FVIII
L’origine ethnique influence clairement le développement des inhibiteurs dans le cas

de l’HA. Ceci avait été noté dès 1984 dans une étude montrant une fréquence plus élevé des
inhibiteurs chez les patients d’origine africaine par rapport à des patients d’origine
caucasienne (20,9% versus (vs) 13,9%) (Gill, 1984). Ce résultat a également été observé dans
l’étude de Malmö Internationale Brother (MIB) où l’incidence de développement des
inhibiteurs était de deux fois plus élevée chez les patients hémophiles A sévères d’origine
africaine par rapport aux patients caucasiens (55,6% vs 27,4%) (Astermark et al, 2001).
D’autres études ont démontré que les patients d’origine africaine ou hispanique ont un risque
accru de formation des inhibiteurs anti-FVIII (Aledort & Dimichele, 1998; Carpenter et al,
2012; Ragni et al, 2009; Scharrer et al, 1999).
Récemment, Viel et al. ont rapporté que les polymorphismes de type

Single Nucléotide Polymorphisme (SNP) identifiés dans le gène F8 sont la cause de cette
différence ethnique. Ces polymorphismes, partiellement en relation avec l’origine ethnique,
pourrait jouer un rôle dans l’induction des inhibiteurs (Figure 38) (Viel et al, 2009).
Les combinaisons alléliques (haplotypes) des quatre SNP identifiés : G1679A (exon10),
A2554G (exon14), C3951G (exon14) et A6940G (exon25) (Figure 38) du gène F8 codent six
protéines sauvages distinctes désignés de H1 à H6 (Figure 39) (Viel et al, 2009).
Figure 38: Représentation schématique des SNP identifiés au niveau du gène F8,
d’après (Viel et al, 2009).
Les haplotypes H1 et H2 sont présents chez toutes les ethnies et correspondent à la

séquence du FVIII thérapeutiques recombinants clonés à partir d’ADN de deux donneurs
caucasiens (Figure 40). Cependant, les haplotypes H3, H4 et H5 ne sont retrouvés que dans la
population d’origine africaine (Figure 39). Viel et al. suggèrent que la discordance entre
l’haplotype codant pour le FVIII administré (H1 ou H2) et celui des patients d’origine
africaine (H3, H4 ou H5) pourrait être à l’origine d’une augmentation du risque d’apparition
des inhibiteurs chez ces populations (Viel et al, 2009).
Figure 39: Représentation schématique des six haplotypes F8, d’après (Viel et al, 2009).
Figure 40: Représentation schématique des deux FVIII thérapeutique Kogenate®
et Recombinate®, d’après (Viel et al, 2009).
5.1.3. Antécédents familiaux
Le risque d’apparition des inhibiteurs augmente de façon significative chez les patients
ayant des antécédents familiaux. En effet, le risque de développement des inhibiteurs chez les
patients présentant des antécédents familiaux était de 48%, tandis que le risque chez les
patients sans antécédents familiaux était de 15% (Astermark et al, 2001).
5.1.4. Les gènes de classes I et II du système Human Leucocyte Antigène (HLA)
Plusieurs études suggèrent que certains allèles HLA pourraient être associés à un
risque élevé d’apparition des inhibiteurs tandis que d’autres seraient protecteurs (Hay, 2006;
Oldenburg et al, 1997).
Des études portant sur le rôle des gènes HLA de classe II dans le développement des
inhibiteurs ont suggéré une faible association. En effet, les premières études restaient peu
concluantes, voire contradictoires (Aly et al, 1990; Frommel et al, 1981; Lippert et al, 1990;
Mayr et al, 1984; Papasteriades et al, 1986). Aly et al, avaient montré une légère sous
représentation des allèles HLA-A3 (6,2 % vs 32,1 %) et HLA-B7 (6,2 % vs 35,7 %) chez les
patients hémophiles A avec inhibiteurs par rapport aux patients sans inhibiteurs
(Aly et al, 1990).
Une étude menée au Royaume-Uni chez 176 hémophiles, a noté une fréquence
significativement élevée de l’allèle DQA1*0102 chez les patients développant des inhibiteurs
porteurs de la micro-inversion de l’intron 22 (Hay et al, 1997). Une autre étude allemande,
portant sur 71 patients atteints d’HA sévère porteurs de la micro-inversion de l’intron 22, a
montré que les allèles (HLA-A*03, HLA-B*07, HLA-C*07, HLA-DQA*0102, HLA-
DQB*0602, et HLA-DRB1*15) étaient plus fréquents chez les cas ayant développé des
inhibiteurs par rapport à ceux ne développant pas des inhibiteurs (Oldenburg et al, 1997).
Oldenburg et al. ont déterminé deux types d’allèles ; les allèles dits « à risque » : allèles HLA-
A*03, HLA-B*07, HLA-C*07, HLA-DQA*0102, HLA-DQB*0602, et HLA-DRB1*15 et les
allèles dits « protecteurs » (DQA0103, DQB0603, DR13).
Récemment, Pavlova et al. ont également étudié l’impact des polymorphismes

génétiques d’HLA classe II (Pavlova et al, 2009b). Ainsi, l’allèle DRB1*1501 était plus
fréquemment présent chez les patients avec inhibiteurs par rapport aux les patients sans
inhibiteurs (20 % vs 11 %, p=0,054). En ce qui concerne le locus DQ, seul l’allèle
DQB1*0602 est significativement plus présent chez les patients avec inhibiteurs
(16 % vs 9 %, p=0,0117). Cette même étude a également démontré l’existence d’une
association positive entre l’haplotype DRB1*1501/DQB1*0602 et le développement des
inhibiteurs chez 260 patients hémophiles sévères (p=0,0423 ; OR=1,9, IC 95% : [1,01-3,57])
(Pavlova et al, 2009b).
5.1.5. Polymorphismes des gènes du TNFA, IL10 et CTLA4
Certains polymorphismes notamment des régions promotrices des gènes codant pour
la cytokine pro-inflammatoire Tumor Necrosis Factor α (TNFα) et la cytokine
anti-inflammatoire IL10 ont été associés au développement des inhibiteurs anti-FVIII
(Astermark et al, 2006c; Pavlova et al, 2009b).
5.1.5.1. Les polymorphismes de l’IL10
L’IL10 est une cytokine anti-inflammatoire exerçant un large spectre de fonctions.

De plus, l’IL10 stimule la production de tous les types d’IgG in vitro. Le gène IL10
(OMIM#124092) codant cette cytokine est localisé au niveau du bras long du chromosome 1
en 1q31-32. Deux polymorphismes, un de type répétitions variables de tandems
nucléotidiques (VNTR, microsatellite) IL10.G et un autre de type SNP IL10-1082
(c.-1082A>G), ont été identifiés dans le promoteur du gène IL10. Le variant IL10G-1082 a été
associé à une augmentation des taux sériques de l’IL10 (Suarez et al, 2003).
Dans l’HA, ces deux polymorphismes ont été identifiés comme facteurs de risque
génétiques au développement des inhibiteurs (Astermark et al, 2006c; Chaves et al, 2010;
Pavlova et al, 2009b).
5.1.5.2. Le polymorphismes du gène TNFA
Le TNFα est une cytokine assurant un large spectre de fonction. En effet, le TNFα
intervient dans l’inflammation, dans les réponses immunitaires innée et acquise, le sepsis et le
développement des cancers avec des activités paradoxales d’induction de la mort ou
de prolifération cellulaire (Balkwill, 2009).
Le gène TNFA (OMIM#191160) codant cette cytokine est situé au niveau du bras
court du chromosome 6 en 6p21.33. Parmi les polymorphismes les plus étudiés du gène
TNFA, le TNFA-308(c.-308C>A) est un polymorphisme de type SNP localisé dans le
promoteur (Wilson et al, 1993). L’allèle TNFA-308 a été retrouvé associé à une augmentation
de la synthèse de TNFα (Bouma et al, 1996). Une association entre le génotype TNF-308A/A
et le développement des inhibiteurs a été mise en évidence par plusieurs études (Astermark et
al, 2006b; Pavlova et al, 2009b; Zhang et al, 2011). Un autre polymorphisme localisé au
niveau du promoteur du gène TNFA (TNFA-857) a également été associé au développement
des inhibiteurs chez les patients hémophiles (Pinto et al, 2012).
5.1.5.3. Les polymorphismes du gène CTLA4
Le Cytotoxic T Lymphocyte associated protein 4 (CTLA4) est un récepteur

principalement actif sur les LT activés permettant la régulation négative des cellules
effectrices. Ce récepteur est capable d’inhiber la prolifération des LT ainsi que l’activité des
LB (Shevach, 2004).
Le CTLA4 (OMIM#123890) est situé au niveau du bras long du chromosome 2

en 2q33. Le CTLA4-318 (c.-318C>T) est un polymorphisme de type SNP localisé dans le
promoteur du gène CTLA4. L’allèle T du polymorphisme CTLA4-318 a été associé à une
activité augmentée du récepteur CTLA4 sur les LT activés (Wang et al, 2002) bloquant ainsi
l’effet co-stimulateur de la liaison des récepteurs CD28-B7 nécessaire pour la réponse
immunitaire. Une corrélation entre ce polymorphisme et le développement des inhibiteurs
a été suggérée (Astermark et al, 2007). En effet, l’allèle CTLA4-318T a été associé à un effet
protecteur face aux développement des inhibiteurs anti-FVIII (Astermark et al, 2007).
5.2. Facteurs de risque dépendant au traitement
Les facteurs de risques environnementaux impliqués dans le développement des

inhibiteurs comprennent: l’âge à la première exposition du FVIII, l’intensité du traitement,
le mode d’administration du FVIII et le type de produit utilisé (Gouw & Fijnvandraat, 2013).
Santagostino et al. ont suggéré l’existence d’une relation inverse entre l’âge à la
première exposition du FVIII et le risque de développer un inhibiteur
(Santagostino et al, 2005). Goudemand et al. ont trouvé un risque plus élevé chez les patients
plus âgés à la première exposition par rapport aux plus jeunes (Goudemand et al, 2006).
La Concerted Action on Neutralizing Antibodies in severe hemophilia A Study
(CANAL study) a également montré une association hautement significative entre l’âge au
début de la première exposition et un risque accru de développer des inhibiteurs
(Gouw et al, 2007b).
D’autre part, Il semble qu’un premier épisode de traitement intense (≥ 5 jours)

(Gouw et al, 2013) et/ou une chirurgie prédisposent à un risque accru de développer des
inhibiteurs (Gouw et al, 2007b). En effet, les lésions chirurgicales induisent une activation des
cellules endothéliales sécrétant des cytokines pro-inflammatoires dans la circulation
(Astermark, 2006a). Cet environnement pro-inflammatoire participe au recrutement et à
l’activation des effecteurs du système immunitaire.
En ce qui concerne le mode d’administration du FVIII, plusieurs équipes ont montré

que la prophylaxie régulière débutée à un âge précoce protègerait contre la formation des
inhibiteurs (Gouw et al, 2013; Santagostino et al, 2005).
Un autre facteur de risque dépendant du traitement serait la nature du produit FVIII

thérapeutique injecté. D’après goudemand et al. le risque de développer un inhibiteur serait
plus élevé chez les patients traités avec le rFVIII que chez les patients traités avec pFVIII
(Goudemand et al, 2006). Cependant, ce facteur de risque n’a pas été confirmé par d’autres
études (Gouw et al, 2007a; Scharrer et al, 1999). L’association entre le développement des
inhibiteurs et la nature des produits thérapeutiques est toujours controversée jusqu’au jour
d’aujourd’hui.
OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE
L’HA est une maladie hémorragique grave transmise selon le mode récessif lié à l’X.
De nombreuses altérations du gène F8 ont été décrites à l’origine de cette pathologie.
La compréhension de ces anomalies moléculaires est un enjeu majeur à la fois pour le conseil
génétique, la prise en charge médicale des patients et dans les recherches thérapeutiques.
Ce travail de thèse « Contribution à l’étude moléculaire de l’HA dans la population

Algérienne » s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche intitulé «Pathologie moléculaire
du gène F8 de l’HA dans la population Algérienne». Dans ce projet, nous nous sommes
intéressés à l’étude moléculaire de l’HA dans la population Algérienne.
La population Algérienne est une population caucasienne qui présente des influences
importantes venant des populations voisines : africaines et européenne. L’étude moléculaire
de l’HA n’a jamais été réalisée dans la population Algérienne. La présente étude a été
entreprise pour mettre en évidence toutes les spécificités de l’HA dans cette population.
Dans le cadre de cette étude, trois axes de recherches ont été développés.
Dans le premier axe « Caractérisation génétique des anomalies moléculaires responsables de
l’HA dans la population Algérienne », nous avons eu comme objectif de déterminer les
fréquences des micro-inversions des introns 1 et 22 dans notre population. Nous avons ensuite
recherché les autres types d’anomalies génétiques responsables de l’HA afin de déterminer les
particularités du spectre mutationnel du gène F8 dans la population Algérienne.
Dans le deuxième axe de recherche «Mutations du gène F8 et développement des

inhibiteurs chez les patients hémophiles A Algériens», nous avons d’abord déterminé les
fréquences de développement des inhibiteurs dans notre échantillon. Ce travail nous a permis
d’étudier la corrélation entre le type de mutation du gène F8 et le statut inhibiteur des patients
étudiés. Nous nous sommes également intéressés à la recherche d’une éventuelle association
entre les mutations du gène F8 et le développement des inhibiteurs chez les patients
hémophiles.
Le troisième axe de recherche « Prédiction in silico des effets délétères des mutations
responsables de l’HA dans la population Algérienne » a porté sur l’étude in silico des
fonctionnalités des mutations mises en évidence dans l’axe 1 au niveau protéique par
l’utilisation de différents logiciels de prédiction et de modélisation moléculaire en 3D. Nous
avons eu comme objectif de mettre en place un protocole bioinformatique permettant
d’évaluer in silico l’impact des mutations sur l’épissage, la structure et/ou la fonction de la
protéine FVIII.
POPULATION D’ETUDE & METHODES
I. Population d’étude
Ce travail a porté sur l’étude moléculaire de l’HA de 27 patients hémophiles âgés entre
5 et 47 ans et appartenant à 21 familles non apparentés (19 sévère et 2 avec la forme
modérée).
Après recueil du consentement éclairé en accord avec la déclaration d’Helsinki des cas
index et de leurs parents (annexe 1), un volume de 5 ml de sang a été prélevé par patient sur
une solution d’Ethylène Diamine Tétra Acétique (EDTA). Ces prélèvements sanguins nous
ont été fournis par les services d’hématologie des Centres Hospitalo-Universitaires (CHU)
d’Oran, de Tlemcen, de Sidi-Bel-Abbès et de Mascara dirigés respectivement par Pr Touhami,
Pr Mesli, Dr Belazaar et Dr Mehalhal.
Une fiche de renseignement (annexe 2) regroupant les différents paramètres cliniques

nécessaires pour une enquête biologique de l’HA (FVIII:C, la forme de la maladie
(familiale/sporadique) et la sévérité) a été établie pour chaque patient. Les familles ont été
désignées dans cette étude par la mention F suivie d’un chiffre arabe. Les patients ont été
désignés par la mention H suivie du numéro qui leur correspond.
D’autre part, dix échantillons d’ADN de témoins sains Algériens nous ont été fourni par
le Laboratoire de Génétique Moléculaire et Cellulaire (LGMC, USTO-MB).
II. Méthodes
1. Stratégie d’études moléculaire du gène F8
La stratégie d’étude moléculaire du gène F8 responsable de l’HA utilisée est

dépendante de la sévérité de l’HA.
L’approche initiale chez les patients hémophiles sévères était de rechercher la présence
de la micro-inversion de l’intron 22 en utilisant la Polymerase Chain Reaction Longue Range
(PCR LR). En cas de négativité, la micro-inversion de l’intron 1 était recherchée par PCR
triplex. En absence de ces deux micro-inversions, un séquençage des 26 exons du gène F8 et
de leurs régions flanquantes, suivi dans le cas échéant d’un séquençage du promoteur et de la
région 3’UTR, est réalisé.
Concernant les patients hémophiles atteints d’une forme modérée, nous avons procédé
directement à l’analyse complète du gène F8 suivie le cas échéant d’un séquençage du
promoteur et de la région 3’UTR.
2. Extraction et dosage de l’ADN
L’extraction de l’ADN génomique a été réalisée à partir de 5 ml de sang total en

utilisant le kit d’extraction stratagene (Agilent Technologies, France) selon les
recommandations du fournisseur (annexe 3). Ce kit d’extraction offre une méthode simple et
non-toxique qui permet l’isolement d’un ADN de bonne qualité.
L’extraction par kit stratagene repose sur une modification du protocole d’extraction
par « Salting Out » qui consiste à traiter les lysats cellulaires par des solutions salines afin
d’éliminer les protéines associées à l’ADN (Miller et al, 1988). L’extraction se déroule en
trois étapes : la première consiste à une lyse des protéines cellulaires. Cette étape est suivie
d’une élimination des protéines par le sel. La dernière étape consiste en une précipitation de
l’ADN à l’éthanol suivie d’une remise en suspension des méduses dans un tampon de choix.
Les différentes concentrations des ADN extraits ont été mesurées à l’aide d’un
spectrophotomètre mesurant l’absorbance à 260 nm. Les concentrations des différents
prélèvements d’ADN ont ensuite été ajustées par dilution entre 100 et 200 ng/µl.
3. Amplification des ADN par Réaction d’Amplification en chaîne « PCR »
3.1. Principe
L’amplification d’ADN in vitro également appelée Polymerase Chain Reaction (PCR)

est une technique de biologie moléculaire mise au point en 1985 par Karry Mullis
(Mullis et al, 1986). Cette technique permet de produire un grand nombre de copies d’ADN
de longueurs et de séquences bien déterminés à partir d’un brin d’ADN matrice
(Joshi & Deshpande, 2011).
L’amplification est assurée par une enzyme thermorésistante « Taq polymérase »

extraite d’une bactérie thermophile « Thermus acquaticus », qui a une activité polymérasique
5’-3’ (Keeney, 2011). D’une certaine façon, la PCR imite la réplication naturelle de l’ADN.
Le nombre de molécules d’ADN générées est doublé après chaque cycle. Après « n » cycle,
environ 2 n copies d’ADN peuvent être reproduire.
La réaction PCR, assurée automatiquement par un automate « thermocycleur »,

comporte des cycles successifs comprenant chacun trois phases : une dénaturation d’ADN,
une hybridation des amorces et une élongation des brins à partir des amorces (Figure 41).
Figure 41: Représentation schématique des étapes de la PCR classique, d’après (Read et al,
2008).
4. Détection de la micro-inversion d’intron 22 par PCR Long Range
4.1. Principe
La synthèse de longs fragments d’ADN allant jusqu’à 50 kb est actuellement possible

grâce à l’utilisation de la PCR Long Range (PCR LR). Cette PCR consiste à apporter
quelques modifications à la PCR standard pour faciliter la synthèse des longs fragments.
Dans cette PCR, deux Taq ADN polymérase sont conjointement utilisées : une première Taq
avec une activité 5’-3’ et une seconde avec une activité 3’-5’. D’autres modifications sont
également apportées à cette PCR tels que l’ajout de diméthyle sulfoxide (DMSO) et un
analogue de la base dGTP (7-déaza dGTP). Ces derniers permettent l’amplification des
régions riches en GC (Davies & Gray, 2002).
La micro-inversion de l’intron 22 résulte d’un crossing-over intra-chromosomique

entre les deux régions AB (10 kb) et PQ (12 kb). Cette recombinaison permet la formation de
deux nouvelles régions QA et PB mesurant chacune 11 kb (Figure 42). La détection de la
micro-inversion de l’intron 22 a été réalisée dans cette étude par le protocole de PCR LR
préalablement décrit par Liu et al (Liu et al, 1998). Ce protocole consiste en deux PCR LR
triplex ; la première utilisant les amorces A, B et Q et la deuxième comprend les amorces P, B
et Q.
Les amorces P et Q s’hybrident à l’intérieur du gène F8 à des positions respectivement

de -1212 pb et + 1334 pb au niveau de la région Int22h1. Les deux autres amorces A et B
s’hybrident à -167 pb et +118 pb dans les régions Int22h2 et Int22h3. L’amplification des
ADN par les amorces A, B, P et Q permet l’obtention de trois différents fragments :
PQ (12kb), PB et AQ (11kb) et AB (10kb).
Figure 42 : Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de
L’étude de la micro-inversion de l’intron 22 avec les amorces ABQ et PBQ permet

l’obtention de deux profils électrophorétiques distincts. À partir de ces profils, le génotypage
des individus peut être réalisé (Figure 43). La corrélation entre les deux profils (ABQ/PBQ)
permet de déterminer le statut des conductrices. Les amorces ABQ s’hybrident avec la région
BA dans le cas normal et avec les régions BA et QA dans le cas d’une micro-inversion.
Les résultats attendus sur le gel électrophorétique seront donc des bandes de 10 et 11 kb
correspondant à ces deux régions respectivement. Les amorces PBQ s’hybrident avec la
région PQ dans le cas normal et avec la région PB en cas de micro-inversion. Les résultats
d’électrophorèse révéleront une bande de 12 kb correspondant à la région normale et
une bande de 11 kb qui correspond à la région réarrangée. Les conductrices présentent un
pattern additif des deux résultats.
HH : Homme hémophile. HN: Homme normal. FC: Femme conductrice. FN: Femme normale

de la micro-inversion de l’intron 22 attendus.
4.2. Choix des amorces
Afin de réaliser ces amplifications, quatre amorces correspondant aux séquences

d’intérêt (int22h-1, int22h-2 et int22h3) ont été utilisées (Tableau 3).
Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées dans l’amplification par PCR LR.
5' int22h1 P GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC
3' int22h1 Q GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA
5' int22h2/3 A CAC AAG GGG GAA GAG TGT GAG GGT GTG GGA TAA GAA
3' int22h2/3 B CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CAT A
4.3. Protocole expérimental
4.3.1. Amplification de l’intron 22 avec les amorces PBQ
L’ADN génomique (concentré à 50 ng/μl) est amplifié dans un mélange réactionnel

d’un volume final de 25 μl contenant : 50 mM/L de Tris-HCl (pH 9,2), 2,25 mM/L de MgCl2,
7,5% de DMSO, 16 mM/L (NH4)2SO4, 250 mM/L de dGTP, 250 mM/L de déaza-dGTP
(Roche, France), 500 µM/L des autres dNTP et 3,3 U Taq Expand Long Range
(Roche, France). Les concentrations des amorces P, B et Q étaient respectivement de 0,12,
0,12 et 0,4 µM/L (Sigma Aldrich, France).
4.3.2. Amplification de l’intron 22 avec les amorces ABQ

d’un volume final de 25 μl contenant : 50 mM/L de Tris-HCl (pH 9,2), 2,25 mM/L de MgCl2,
7,5% de DMSO, 16 mM/L (NH4)2SO4, 250 mM/L de dGTP, 250 mM/L de déaza-dGTP
(Roche, France), 500 µM/L des autres dNTP et 3,3 U Taq Expand Long Range
(Roche, France). Les concentrations des amorces A, B et Q étaient respectivement.de 0,12,
0,12 et 0,4 µM/L (Sigma Aldrich, France).
4.3.3. Programme d’amplification
L’amplification a été réalisée dans le thermocycleur Biometra T Gradient. Le

programme d’amplification se déroule en trois étapes; une première étape de dénaturation
initiale à 94°C pendant 3 minutes (min), suivie de deux étapes d’hybridation de 10 et 29
cycles respectivement. La première étape d’hybridation de 10 cycles dure un peu plus de
13 min dont 12 secondes (sec) à 94°C, 2 min à 60 °C, 3 min à 65°C, 3 min à 60°C et 5 min
à 65°C. La deuxième étape est similaire à la première à la différence qu’elle comporte 20
cycles ainsi qu’un incrément de 10 sec/cycle pour les 5 dernières minutes y est inséré. La
dernière étape est un cycle d’élongation à 72 °C pendant 7 min. Au total, la réaction
d’amplification dure environ 8 heures (Tableau 7).
Tableau 4: Programme d’amplification de la PCR LR.
T° 94°C 94°C 60°C 65°C 60°C 65°C 94°C 60°C 65°C 60°C 65°C 72°C 4°C
Temps 3min 12sec 2min 3min 3 min 5 min 12sec 2min 3min 3 min 5 min * 7min ∞
Cycles 1 10 20 1
* : incrément de 10 secondes par cycle.
4.3.4. Conditions d’électrophorèse
Le contrôle de l’amplification s’effectue par migration sur un gel d’agarose à 0,8 % en

présence d’un marqueur de taille de 1 kb en Over night à 1V.
5. Détection de la micro-inversion d’intron 1
5.1. Principe
La micro-inversion de l’intron 1 résulte d’un crossing-over intra-chromosomique entre

une séquence de 1 kb au niveau de l’intron 1 du gène F8 (int1h-1) et une séquence homologue
(int1h-2) répétée dans une orientation opposée à approximativement 140 kb de la région
télomérique, ce qui conduit à l’inversion de ces deux régions (Figure 44).
La détection de la micro-inversion de l’intron 1 a été réalisée par le protocole de PCR

triplex préalablement décrit par Bagnall (Bagnall et al, 2002). Ce protocole consiste en deux
PCR triplex ; la première PCR utilise le mix C (amorces Int1h-2F, 9F et 9cR) et la deuxième
utilise le mix T (Int1h-2F, 9F et Int1h-2R).
Figure 44: Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de

L’étude de la micro-inversion de l’intron 1 avec les amorces contenues dans le mix C

et T permet l’obtention de deux profils électrophorétique distincts. À partir de ces profils, le
génotypage des individus peut être réalisé (Figure 45). La corrélation entre les deux profils
(mix C/ mix T) permet de déterminer le statut des conductrices.
Les amorces du mix C s’hybrident avec la région de 1,5 kb dans le cas normal et avec
la région de 1 kb dans le cas d’une micro-inversion. Les résultats attendus sur le gel
électrophorétique seront donc des bandes de 1 et 1,5 kb correspondant à ces deux régions
respectivement (Figure 45). Les résultats d’électrophorèse obtenus par l’amplification avec le
mix T est l’inverse de celui obtenus par l’amplification avec le mix C. Les conductrices
présentent un pattern additif des deux profils électrophorétiques.
HH : Homme hémophile A. FC: Femme conductrice. N: Homme normale.

Afin de réaliser ces amplifications, quatre amorces correspondant aux séquences

d’intérêt ont été utilisées (Tableau 5).
Tableau 5: Séquences des amorces utilisées dans l’amplification par PCR triplex.
9F GTT GTT GGG AAT GGT TAC GG

9cR CTA GCT TGA GCT CCC TGT GG
Int1h-2F GGC AGG GAT CTT GTT GGT AAA
Int1h-2R TGG GTG ATA TAA GCT GCT GAG CTA
5.3. Protocole expérimentale
5.3.1. Amplification de l’intron 1 avec le Mix C
d’un volume final de 50 μl contenant 48 μl de Mix C. Le Mix C est composé de tampon 1X
(Perkin-Elmer, Warrington, Royaume-Uni), 1,5 mM MgSO4, 0,5 mM de chaque dNTP, 5% du
DMSO et 2,5U de Taq polymérase (Perkin-Elmer, Warrington, Royaume-Uni).
Les concentrations des amorces Int1h-2F, 9F et 9cR sont de 200 pM /µl (Sigma Aldrich,
France).
5.3.2. Amplification de l’intron 1 avec le Mix T
d’un volume final de 50 μl contenant 48 μl de Mix T. Le Mix T est composé de tampon 1X
(Perkin-Elmer, Warrington, Royaume-Uni), 1,5 mM MgSO4, 0,5 mM de chaque dNTP, 5% du
DMSO et 2,5U de Taq polymérase (Perkin-Elmer, Warrington, Royaume-Uni). Les
concentrations des amorces Int1h-2F, 9F et Int1h-2R sont de 200 pmol/µl (Sigma Aldrich,
France).
5.3.3. Programme d’amplification
L’amplification a été réalisée dans le thermocycleur Biometra T Gradient.

Le programme d’amplification se déroule en trois étapes; une première étape de dénaturation
initiale à 94°C pendant 5 min, suivie d’une étape de 35 cycles. Cette étape consiste en une
dénaturation à 94°C pendant 30 sec, une hybridation à 60°C pendant 30 sec, et une élongation
à 72°C pendant 2 min. La dernière étape est un cycle d’élongation à 72 °C pendant 7 min
(Tableau 6).
Tableau 6 : Programme d’amplification de la PCR.
94° 94° 60° 72° 72° 4°

5min 30sec 30sec 2min 7min 
1cycle 35cycles 1cycle
5.3.4. Conditions d’électrophorèse
Le contrôle de l’amplification s’effectue par migration sur gel d’agarose à 0,6 % en

présence d’un marqueur de taille de 1 kb à 100V pendant 60 min.
6. Détection des mutations du gène F8 par séquençage
La recherche de mutations du gène F8 a été réalisée après amplification par PCR en

séquençant l’intégralité de la séquence codante correspondant aux 26 exons ainsi que les
régions introniques en amont et en aval des exons sur au moins 20 pb. En absence de
mutations dans cette région, le promoteur et la région 3’UTR ont été par la suite séquencés.
6.1. Principe
Le séquençage consiste à déterminer la succession des nucléotides d’un fragment

d’ADN donné. Son principe consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l’aide d’une
amorce complémentaire à un fragment d’ADN à séquencer (Figure 46). L’élongation de
l’amorce est réalisée par une ADN polymérase avec une activité 3’-5’. Les quatre
désoxyribonucléotides (dNTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration des quatre
didésoxyribonucléotides (ddNTP) marqués par des fluorochromes différents (Sanger et al,
1992). Lorsqu’un ddNTP est incorporé à la séquence d’ADN, l’ADN polymérase ne peut plus
continuer la polymérisation et la réaction d’extension s’arrête. En effet, ces ddNTP sont
dépourvus de groupement hydroxyle en 3’ et ne peuvent pas former une liaison
phosphodiester 3’-5’. Il en résulte des fragments d’ADN de tailles variables qui sont ensuite
séparés par électrophorèse au pouvoir résolutif de 1 pb (Sanger et al, 1977).
Les fragments sont séparés en fonction de leurs tailles, les plus petits migrant plus
rapidement. Quand ces fragments passent devant la cellule de détection, un faisceau laser
excite leur fluorescence. La fluorescence ainsi émise par chaque ddNTP est collectée par une
caméra CCD et restituée sous forme de chromatogrammes.
Figure 46 : Représentation schématique du principe de séquençage, d’après (Read et al,
2008).
Une série de trente deux couples d’amorces ont été utilisées dont 7 pour l’exon 14 afin
d’amplifier les 26 exons du gène F8 (annexe 4). Chaque exon est amplifié par un couple
d’amorces comprenant une vingtaine de nucléotides en amont et en aval afin d’analyser les
sites d’épissage. Tandis que huit autres couples d’amorces ont été utilisés pour l’amplification
du promoteur et de la région 3’UTR du gène F8 (annexe 4).
Les séquences des amorces ont été sélectionnées par Catherine Costa et collaborateurs
(laboratoire de biochimie et de génétique à l’hôpital Henri MONDOR, France) à partir de la
séquence du gène F8. Ces amorces sont tous pourvues d’une queue identique (Common
tailing primers). En effet, les amorces sens ont tous une queue (tail) commune. Les amorces
reverse présente également une autre queue commune. La présence de ces séquences permet
d’utiliser qu’un primer de séquence sens unique (5’U) et reverse (3’U) lors de l’étape de
réaction de séquence.
6.3. Etapes d’identification de mutations par séquençage
La procédure d’identification de mutations par séquençage se divise en six étapes

successives :
6.3.1. Amplification par PCR
Au cours de cette étape chaque région (exons, promoteur ou 3’UTR) est amplifiée en
utilisant les amorces spécifiques. L’ADN génomique (concentré à 50 ng/µl) est amplifié dans
un mélange réactionnel contenant du tampon d’amplification 1X (Applied Biosystem, Foster
City, Etats-Unis), 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP, 10 pM de chaque couple d’amorces
(Sigma Aldrich, France) et 1U de Taq polymérase Gold (Applied Biosystem, Foster City,
Etats-Unis).
L’amplification a été réalisée dans le thermocycleur Biometra T Gradient. Le

programme d’amplification comporte une première étape de dénaturation initiale à 95°C
pendant 10 minutes suivie de 35 cycles comportant chacun 30 secondes de dénaturation à
95°C, 30 secondes d’hybridation des amorces à 58°C et 1 minute d’extension d’amorces à
72°C. Un dernier cycle d’extension finale des amorces est effectué pendant 5 minutes à 72°C
afin d’épuiser le reste de la Taq polymérase.
Le contrôle d’amplification s’effectue par électrophorèse sur gel d’agarose concentré à

2%. La migration est réalisée à 109 Volts pendant 30 min.
6.3.2. Purification des produits d’amplification
Cette étape a pour objectif l’élimination des amorces et des dNTPs en excès dans les
produits d’amplification avant séquençage par l’action d’une phosphatase alcaline et d’une
exonucléase. Cette purification a été réalisée en utilisant le kit ExoSAP-IT (Affymetrix, Paris,
France). Un volume de 1μl d’ExoSAP-IT est ajouté à l’amplimère. Ce mélange est ensuite
incubé pendant 15 min à 37°C puis pendant 15 min à 80°C.
6.3.3. Réaction de séquence
La troisième étape du séquençage consiste en une réaction de séquence. Cette PCR

non conventionnelle permet la formation de nombreuses copies d’ADN de différentes tailles
du fragment d’ADN à séquencer. Au cours des cycles de polymérisation, la taille du fragment
d’ADN dépendra du nombre de dNTP qui seront polymérisés par l’ADN polymérase avant
qu’un nucléotide terminateurs de chaînes et fluorescents (ddNTP) ne viennent s’incorporer à
la séquence d’ADN.
Les réactions de séquences ont été effectuées suivant le protocole recommandé par
Applied Biosystems pour le kit de séquençage BigDye®Terminator v3.1. Un volume de
0,5 μl d’amplimère purifié est utilisé pour la réaction de séquence, avec 0,125X du réactif
BigDye Terminator (Applied Biosystem, Foster City, Etats-Unis), 0,75X de tampon du
BigDye Terminator (Applied Biosystem, Foster City, Etats-Unis), 0,2 pM/μl d’amorces
universelles de séquençage, complété par de l’eau à 10 μl. Cette étape est effectuée une fois
avec l’amorce universelle sens et une autre fois avec la reverse.
Le programme permettant la réaction de séquence comprend une dénaturation initiale

à 96°C pendant 10 min suivie de 25 cycles de réaction de séquence (96°C 10 sec, 58°C 2 min
25 sec). La conservation est réalisée à 10 °C.
6.3.4. Purification des produits de réaction de séquence
La purification du produit de réaction de séquence permet d’éliminer les réactifs en

excès et de reprendre le produit final dans une solution adaptée à la migration
électrophorétique.
Cette purification repose sur une purification EDTA/éthanol. 11,36mM d’EDTA,

0,27M d’acétate de sodium, 83% d’Ethanol sont ajoutés au produit de réaction de séquence.
Ce mélange est incubé pendant 15 min à 37°C puis centrifugé 45 minutes à 2000g à 4°C.
Le culot est ensuite repris dans 15 μl de Hi-Di formamide (Applied Biosystem, Foster City,
Etats-Unis).
6.3.5. Electrophorèse capillaire
Les différents échantillons préparés ont été chargés sur les séquenceurs
ABI PRISM 310 et ABI PRISM 3130XL (Applied Biosystem, Foster City, Etats-Unis) pour
réaliser l’électrophorèse capillaire. Les fragments d’ADN injectés vont migrer le long du
capillaire contenant le POP-6 (Applied Biosystem, Foster City, Etats-Unis) à une vitesse qui
dépendra de leurs tailles.
6.3.6. Analyse bioinformatique
La recherche de variations à partir de l’électrophérogramme est effectuée à l’aide du

logiciel d’analyse de séquence Sequence Scanner (Applied Biosystem, Foster City,
Etats-Unis). Ce logiciel permet l’inspection de la séquence sous forme de tracé constitué de
pics de différentes couleurs correspondant à chacune des bases de la séquence analysée.
Les séquences nucléotidiques obtenues à l’aide de chaque couple d’amorces, soit une
séquence avec l’amorce sens et avec l’amorce reverse, ont été utilisées pour comparaison par
le logiciel MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Les séquences
reverses ont préalablement été inversées en utilisant le logiciel en ligne Reverse Complement
(http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html). Toutes les séquences nucléotidiques
obtenues ont été alignées entre elles, et comparées à celles de la séquence de référence
(GenBank, NM_000132.3) et des dix ADN témoins de la même origine. De cet alignement
multiple, nous avons pu déterminer toutes les variations de séquence du gène F8 chez les
patients hémophiles étudiés.
6.4. Nomenclature des variations de séquence
Une mutation peut être décrite par référence à l’ADNc ou à la protéine codée par cet
ADN. La description commence par le préfixe c. ou p. respectivement selon le référentiel
utilisé. Pour l’ADNc, le symbole > signifie substitué en. Les nucléotides sont numérotés à
partir d’un point de départ fixé par consensus et répertorié dans les banques de données.
La numérotation des résidus nucléotidiques est indiquée suivant la nomenclature

internationale approuvée par le Human Genome Variation Society (HGVS) en utilisant la
séquence référence du gène F8 (GenBank, NM_000132.3). Le nucléotide +1 correspond à
l’adénine du codon d’initiation de la traduction ATG. Un nucléotide d’un intron porte le
numéro du dernier nucléotide de l’exon qui précède suivi du signe + et sa position dans
l’intron.
Tandis que la nomenclature des variations de séquence au niveau protéique a été basée
à la fois sur la nomenclature approuvée par l’HGVS et la nomenclature d’HAMTeRS. La
nomenclature HGVS diffère de celle d’HAMTeRS en 19 premiers aa correspondant au
peptide signal. Pour ces deux nomenclatures, nous avons utilisé les codes des aa de trois
lettres (annexe 5). Un codon stop est respectivement symbolisé par la lettre * et X en utilisant
les nomenclatures HGVS et HAMTeRS. Afin d’éviter toute confusion dans ce manuscrit, la
position des aa suivant la nomenclature HAMSTeRS est indiquée entre parenthèses.
6.5. Mutation causale/polymorphisme
Le logiciel en ligne Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/) a été utilisé pour

classer les variations de séquence du gène F8 identifiées en mutation causale ou
polymorphisme (Schwarz et al, 2010).
Ce logiciel emploie la classification de Bayes afin de prévoir quel est le potentiel pour
qu’une altération soit causale. Cette classification est constituée d’une base de donnés de tous
les tests et les caractéristiques des altérations et calcule les probabilités afin de déterminer si la
variation de séquence correspond à une mutation responsable de la maladie (disease causing)
ou bien à un polymorphisme sans conséquence sur la protéine (polymorphism).
7. Amplification multiplex de sondes dépendant d’une ligation

(Multiplex ligation Probe Amplification, MLPA)
En absence de détection par séquençage de mutations responsables de l’HA, nous

avons recherché les gros réarrangements du gène F8 de type délétions/duplication en utilisant
la méthode Amplification multiplex de sondes dépendant d’une ligation (MLPA).
7.1.Principe
La MLPA est une méthode permettant la détection de variations de nombre de copies

d’un locus. C’est une méthode de détection ciblée qui possède l’avantage d’étudier un grand
nombre de loci simultanément (Read et al, 2008; Rost et al, 2008).
Le principe de cette méthode est d’obtenir pour chaque locus, un fragment amplifié de
différentes tailles afin de les différencier et de les quantifier après électrophorèse. A chaque
région étudiée correspond un couple de sondes de tailles différentes. Ces sondes comportent
deux parties: l’une complémentaire de la séquence cible qui va permettre une hybridation
spécifique au locus étudié (Figure 47.A). L’autre étant un des deux oligonucléotides communs
à chaque couple de sondes va permettre l’amplification par PCR de toutes les régions étudiées
avec le même couple d’amorces (Figure 47.A).
Figure 47 : Représentation schématique des différentes étapes de MLPA

(http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormMain.aspx).
La réaction MLPA se déroule en trois étapes (Figure 47):
1. Etape d’hybridation: l’ADNg dénaturé est mis en présence des couples de sondes. Ces
sondes vont s’hybrider de façon spécifique à leurs séquences cibles.
2. Etape de ligation: chaque couple de sonde va se lier pour former une séquence unique.
3. Etape d’amplification: la dernière étape consiste en une amplification par PCR
multiplex en utilisant un couple d’amorces commun à tous les fragments.
L’utilisation d’un seul couple d’amorces permet d’avoir des conditions d’amplification
identiques pour chaque fragment.
Une migration des produits d’amplification obtenus est réalisée par électrophorèse sur
séquenceur afin de séparer les fragments en fonction de leur tailles et de les quantifier.
Chaque fragment peut donc être visualisé sous forme d’un pic qui, selon son amplitude par
rapport au témoin, permet la détection du nombre de copies au niveau du locus.
7.2. Protocole expérimentale
La méthode MLPA a été réalisée en utilisant le kit F8-P178 (MRC-Holland) selon les
instructions du fournisseur. Cette méthode a été réalisée au niveau du laboratoire de biochimie
et de génétique à l’hôpital Henri MONDOR, France.
Pour chaque réaction, 250 ng d’ADN ont été dénaturés et hybridés avec le mélange de
sondes spécifiques des exons du gène F8. Après migration des produits de PCR sur le
séquenceur ABI 3130XL, les données ont été visualisées par le logiciel GeneMapper®
et analysées par le logiciel Coffalyser™ (MRC-Holland). Les résultats obtenus ont été
comparés au résultat d’un échantillon témoin. La différence des hauteurs de pic par rapport au
témoin indique un changement du nombre de copies de l’exon cible.
8. Détection des inhibiteurs
La recherche et le titrage des inhibiteurs anti-FVIII ont été réalisés par la méthode
Bethesda préalablement décrite par Verbruggen et al (Verbruggen et al, 1995). Ce test était
systématiquement réalisé une fois tous les 3 mois au niveau du laboratoire d’hémobiologie
du CHU d’Oran. Un titre d’inhibiteur positif a été défini comme étant égal ou supérieure à
0,6 UB/ml. Les patients présentant une valeur supérieure à 5 UB/ml ont été classés comme
fort répondeurs. Inversement, un titre d’inhibiteur inferieur à 5 UB /ml classait les patients
comme faibles répondeurs.
9. Analyse statistique
Le groupe de patients hémophiles a été réparties en deux groupes : « inhibiteur positif»

et « inhibiteur négatif ».
L’évaluation de l’association entre les mutations du gène F8 et le risque de
développement des inhibiteurs a été réalisée par l’utilisation du modèle de régression
logistique simple. Dans la régression logistique, l’évaluation de l’influence des mutations du
gène F8 sur le développement des inhibiteurs est déterminée en calculant la probabilité p
(valeur p), l’odds ratio (OR) et l’intervalle de confiance (IC) fixé à 95%.
Ces valeurs statistiques ont été calculées par le logiciel Epi-InfoTM version 7.1.2.0, en utilisant
le test exacte de Fisher.
La valeur p représente le degré de significativité qui correspond à la probabilité qu’un

résultat d’une étude épidémiologique puisse être attribué au seul hasard. Les résultats sont
considérés comme étant statistiquement significatifs lorsque la valeur p est égale ou inférieure
à 0,05 (p≤ 0.05). Ainsi, la différence de distribution entre les deux groupes, pour les mutations
du gène F8, est donc statistiquement significative et ces mutations peuvent être considérées
comme étant associées au développement des inhibiteurs.
L’OR est une mesure statistique qui permet d’apprécier l’intensité de cette association.
Un marqueur protecteur se traduit par un OR compris entre 0 et 1. Tandis que pour un
marqueur prédisposant, la valeur de l’OR est supérieure à 1. Cette association est jugée
statistiquement significative lorsque l’IC à 95 % de l’OR ne comporte pas la valeur 1.
10. Prédiction d'épitope
La grande majorité des épitopes reconnus par les LB sont de deux types : continus et
discontinus. Un épitope continu est un épitope constitué d’aa successifs dans la séquence
primaire de la protéine FVIII. Un épitope discontinu (conformationnel) est constitué de
segments non contigus de la séquence d’aa. Le repliement de la protéine FVIII permet le
rapprochement de certains résidus éloignés dans la séquence primaire.
Afin de prédire les effets des mutations faux-sens sur l’apparition de ces épitopes
reconnu par les LB, deux logiciels bioinformatiques ont été utilisés: l’Immune Epitope
Database (IEDB) (http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input) et le BEPIPRED
(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred).
11. Etude in silico des effets délétères des mutations
Les variations de bases au niveau des gènes sont, le plus souvent, responsables de
troubles fonctionnels des protéines concernées menant à l’apparition de plusieurs maladies.
Ces variations peuvent se produire au niveau d’une région codante (exon) ou au niveau des
introns et peuvent donc avoir des effets sur le processus d’épissage et/ou sur la
structure/fonction de la protéine. Plusieurs logiciels destinés à prédire les différents effets
délétères des mutations ont été développés.
Après classification des variations de séquences en « polymorphisme » et « mutation

causale », les effets délétères des mutations ont été prédits en utilisant une combinaison de
logiciels in silico actuellement disponible en fonction de la localisation des mutations
(intronique et exonique).
11.1. Effets des mutations intronique sur le processus d’épissage
L’influence des mutations introniques sur l’efficacité d’épissage a été prédite en

utilisant les logiciels Human Splicing Finder Version 2.4.1 (HSF, http://www.umd.be/HSF/)
et Exonic Splicing Enhancer-finder (ESE Finder, http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE/).
Le logiciel HSF, gratuitement accessible en ligne, permet l’identification des

potentiels sites donneurs et accepteurs d’épissage d’une séquence donnée
(Desmet et al, 2009). En effet, ce logiciel permet en une seule requête d’évaluer l’impact
potentiel des mutations sur les sites donneurs et accepteurs d’épissage ainsi de prédire les
différents sites cryptiques d’une séquence donnée.
Le logiciel ESE Finder, également accessible en ligne, facilite l’analyse rapide des
séquences régulatrices activatrices d’épissage (ESE) (Cartegni et al, 2003). Ces séquences
représentent les sites de fixation de différentes protéines riches en sérine impliquées dans le
processus d’épissage (SR : Alternative Splicing Factor/Splicing Factor 2 (ASF/SF2),
Spliceosomal Component 35(SC35), SR protein 40 (SRp 40) et SR protein 55 (SRp55)).
ESE Finder prédit l’effet des mutations par recherche de séquences potentielles de fixation de
ces quatre protéines SR.
11.2. Effets des mutations exonique sur la structure/fonction de la protéine
11.2.1. Prédiction d’effet de mutation sur la stabilité de la protéine par le logiciel I-
Mutant 2.0
En tenant compte de la structure tertiaire de la protéine, l’effet stabilisant ou

déstabilisant des mutations faux sens a été évalué en utilisant le logiciel I-Mutant 2.0
(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html). I-Mutant 2.0 est basé sur une approche
de type Support Vector Machine (SVM) qui estime la différence d’énergie libre (DDG) entre
la protéine sauvage et mutée (Capriotti et al, 2005). Une valeur positive (DDG>0) implique
une augmentation de la stabilité des protéines, tandis qu’une valeur négative (DDG<0)
suggère une mutation déstabilisante.
11.2.2. Prédiction des effets des mutations par Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT)
Le logiciel Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT), gratuitement accessible en ligne

(http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), s’appuie sur l’homologie de séquences pour prédire
les effets délétères des mutations faux-sens. Il trie la substitution en fonction de degré de
conservation d’un aa dit intolérant par rapport au tolérant et prédit l’effet phénotypique de
cette substitution sur la fonction de la protéine (Ng & Henikoff, 2003).
SIFT prédit si une substitution sera tolérée ou non à chaque position de la séquence.
Une substitution d’aa dite tolérante est considérée comme n’ayant pas d’effet délétère sur la
fonction de la protéine. A l’inverse, une substitution dite intolérante semble avoir un impact
entraînant la perte partielle ou totale de la fonction protéique (Ng & Henikoff, 2003).
Le postulat utilisé par SIFT est que toute évolution d’une protéine est corrélée à sa
fonction protéique. Cela implique que les parties fonctionnelles qui sont sous forte pression de
sélection sont donc conservées. La forte probabilité d’avoir un effet délétère provient d’une
substitution d’aa survenant à une position fortement conservée d’une famille de protéine ; et
inversement, une faible probabilité suggère que la variation siège en une position peu
conservée.
La probabilité, pondérée en fonction du nombre de séquences alignées, est calculée en
comparant la matrice de mutation issue de l’alignement multiple avec celles prédites par
BLOcks SUbstitution Matrix 62 (BLOSUM62). SIFT calcule des probabilités normalisées
pour toutes les substitutions possibles à chaque position et les probabilités inférieures à un
seuil prédéfini seront considérées comme délétères < 0,05.
11.2.3. Prédiction des effets des mutations par Polymorphism Phenotyping-2
(PolyPhen-2)
Polymorphism Phenotyping-2 (PolyPhen-2) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)

prédit l’impact possible d’une substitution d’aa sur la fonction protéique en se basant sur des
règles empiriques faisant appel à trois types d’informations issues des banques de données
et de calcul (Sunyaev et al, 2000):
1. Les informations pour les substitutions connues à une position donnée, contenant les
annotations de séquences.
2. L’alignement multiple.
3. Les informations structurales provenant de banque de données de structure PDB.
Les substitutions sont classées en 4 niveaux : erreur, bénignes, potentiellement

délétères et probablement délétères. La prédiction dite « bénigne » signifie que la fonction de
cette protéine ne semble pas être affectée par cette variation. A l’inverse, la prédiction dite
« probablement délétère » signifie que la protéine a une forte probabilité d’être altérée par
cette variation.
11.2.4. Prédiction des effets des mutations par Align Grantham Variation Grantham
Deviation (Align GVGD)
Align Grantham Variation Grantham Deviation (Align GVGD) est un logiciel gratuit
(http://agvgd.iarc.fr/) qui combine l’alignement multiple de séquence protéique ainsi que les
caractéristiques biophysiques des aa afin de prédire l’effet d’une substitution sur la fonction
protéique (Tavtigian et al, 2008).
Ce logiciel repose sur la mesure des deux scores prédictifs : GV et GD.

La variation biochimique à chaque position d’alignement entre différentes espèces (Homo
sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Oryctolagus cuniculus, Sus scrofa, Bos taurus,
Ovis aries, Canis familiaris, Gallus gallus) est convertie en un score appelé GV. Tandis que la
différence de propriétés physicochimiques entre l’aa sauvage et muté est calculée et
représentée par un indice de différence appelé GD. Les résultats sont déterminés à partir de
ces deux scores et sont répartis en sept classes : C0, C15, C25, C35, C45, C55, C65. Les
classes (C45 à C65) signifient que la mutation affecte la fonction, elle est dite « more likely to
affect the function ». Tandis que les classes (C0 à C25) indiquent que la substitution n’affecte
pas la fonction, elle est dite « less likely to affect the function » (Tavtigian et al, 2008).
11.2.5. Modélisation de la protéine mutée en 3D par le logiciel Swiss-Pdb Viewer
La modélisation par homologie est une méthode prédictive basée sur l’élaboration
d’une structure 3D dont la séquence en aa est connue. Les structure 3D des protéines FVIII
natives et mutées ont été construite par le logiciel Swiss Pdb Viewer (http://spdbv.vital-it.ch/)
à partir des données cristallographiques publiées dans la PDB sous le code : (PDB ID: 3CDZ).
Les modèles 3D renfermant les mutations à analyser sont comparés avec celui construit à
partir de la séquence normale.
Pour chaque mutation, plusieurs paramètres ont été étudiés et comparés à partir des
deux structures 3D construites et superposées. Les substitutions d’aa ont été analysées en
fonction de la localisation des résidus substitués au niveau de la structure 3D du FVIII, des
changements structuraux de la protéine FVIII, des propriétés physicochimiques des aa et de la
taille et l’orientation des chaines latérale des résidus normaux et mutés.
RESULTATS
La partie résultats de cette thèse est présentée en trois parties. La première partie
correspond aux résultats issus de la caractérisation génétique des anomalies moléculaires
responsables de l’HA dans la population Algérienne. Ces derniers sont présentés sous forme
d’un article original publié en 2013 dans le journal « Clinical and Applied
Thrombosis/Hemostasis ».
La deuxième partie s’intéresse aux mutations du gène F8 et le développement des

inhibiteurs anti-FVIII chez les patients hémophiles A Algériens. Les résultats de cette partie
sont publiées dans un article original parru en 2014 dans le journal « Journal of
Pharmacogenomics & Pharmacoproteomics ».
Enfin, la troisième partie est intitulée prédiction in silico des effets délétères des
mutations responsables d’HA dans la population Algérienne. Certains résultats de cette partie
sont publiés dans le premier article.
I. Caractérisation génétique des anomalies moléculaires
responsables de l’HA dans la population Algérienne :
identification de deux nouvelles mutations
Article I: accepté le 21 Octobre 2013

Titre: First Molecular Analysis of F8 Gene in Algeria: Identification of Two Novel Mutations
Auteurs: Meriem Abdi, Faouzia Zemani-Fodil, Mostefa Fodil, Meriem Samia Aberkane,
Hadj Touhami, Nadhira Saidi-Mehtar, Catherine Costa, Abdallah Boudjema
1. Introduction
Les progrès de génétique moléculaire permettent aujourd’hui l’identification des

mutations du gène F8 responsables de l’HA. Les techniques actuelles de mise en évidence de
ces mutations ont un intérêt majeur en particulier pour l’identification de ces dernières et de
leurs sites préférentielles dans chaque population.
En 2010, l’équipe du professeur Vinciguerra a souligné l’importance de la génétique

pour la prise en charge de l’HA (Vinciguerra et al, 2010). Deux ans plus tard, Jayandharan et
al. ont confirmé l’importance du rôle qu’apporte la génétique moléculaire pour le diagnostic
ainsi que la prise en charge thérapeutique des patients hémophiles (Jayandharan & Srivastava,
2012).
Actuellement, il est clairement établi que la recherche de mutations du gène F8

constitue un acte diagnostic et prédictif important pour l’HA. En effet, la détection de ces
mutations chez les patients permet en premier lieu de proposer à leurs familles un conseil
génétique permettant la détection des femmes conductrices ainsi qu’un diagnostic prénatal.
D’autre part, le type de mutation du gène F8 est connu depuis longtemps pour être un facteur
de risque majeur dans la survenue d’allo-anticorps inhibiteur. L’identification de ces
mutations permet de mieux orienter le choix du traitement offrant ainsi une meilleure prise en
charge thérapeutique des patients souffrant de cette complication.
En dehors des mutations récurrentes représentées par les micro-inversions des introns
1 et 22 (cf. chapitre V), la grande majorité des mutations décrites sont spécifiques à chaque
famille. De plus, ces mutations peuvent être localisées tout au long du gène F8 ce qui oblige
fréquemment les laboratoires de biologie moléculaire à analyser la totalité du gène F8. Toutes
ces caractéristiques compliquent l’identification des mutations responsable de l’HA.
Plusieurs études ont été réalisées afin de caractériser les mutations responsables de
l’HA dans plusieurs populations. Cependant, aucune étude du genre n’a été réalisée dans la
population Algérienne. Dans cet axe de recherche, nous rapporterons les fréquences des
micro-inversions des introns 1 et 22 du gène F8 retrouvées dans notre échantillon. Dans un
second temps nous décrirons les différentes mutations responsables de l’HA dans notre
échantillon tout en recherchant les particularités de notre population.
2. Résultats
Le principal objectif de ce volet de thèse était de détecter les mutations responsables

de l’HA chez 27 patients appartenant à 21 familles non apparentées. Les résultats sont
détaillés dans l’article publié inclus dans ce manuscrit pages : 105-113.
2.1. Les micro-inversions des introns 22 et 1
La micro-inversion de l’intron 22 a été recherchée par PCR LR. Cette micro-inversion

a été détectée chez 11 parmi les 19 patients non apparentées présentant une forme sévère de la
maladie (Article 1, tableau 2). Ce qui représente une fréquence égale à 57,89% dans notre
échantillon. Parmi ces 11 patients, 10 présentent une forme familiale de l’HA et un cas
sporadique.
D’autre part, la micro-inversion de l’intron 1 a été recherchée par deux PCR triplex.
Cette micro-inversion a été détectée uniquement chez un patient atteint d’une forme sévère de
l’HA (Article 1, tableau 2), ce qui représente une fréquence égale à 5,26% dans cet
échantillon.
Comme ces deux micro-inversions sont bien établies comme des mutations causales
de la forme sévère de la maladie, aucune autre enquête n’a été réalisée pour rechercher
d’autres types de mutations du gène F8 chez ces patients.
2.2. Les mutations ponctuelles
Le séquençage des 26 exons du gène F8 a permis la détection de six mutations

ponctuelles. Une description de ces mutations identifiées est rapportée dans le tableau 3
(Article 1). Ces mutations regroupent 2 mutations nonsenses (c.322A>T, c.5953C>T),
1 mutation au niveau d’un site donneur d’épissage (c.5219+1G>T), et 4 variations de
séquence (c.200A>C, c.3780G> C, c.2189G>A, c.6545G>A).
2.2.1. Les mutations non-sens
Le séquençage de l’ADN du patient HA18 a permis de mettre en évidence une

mutation ponctuelle de type transversion A>T à la position 322 dans l’exon 3 du gène F8
(c.322A>T). Au niveau protéique, cette mutation touche le codon 108 (89) provoquant ainsi le
remplacement de la lysine par un codon stop (p.Lys108*, Lys89X).
De même le séquençage de l’exon 18 du gène F8 a permis de mettre en évidence une

mutation ponctuelle de type transition C>T à la position 5953 de l’exon 18 (c.5953C>T) chez
le patient HA19. Cette mutation touche le codon 1985 (1966) provoquant ainsi le
remplacement de l’aa arginine par un codon stop (Arg1985*, Arg1966X).
2.2.2. La mutation au niveau d’un site d’épissage
Le séquençage de l’exon 14 du patient HA20 a permis d’identifier une substitution de

type transversion G>T à la position +1 de l’intron 14 (c.5219+1 G>T). Cette mutation est à
l’origine du changement du site donneur consensus d’épissage de (GT) en (TT).
2.2.3. Les variations de séquence
L’utilisation du logiciel Mutation Taster, nous a permis de classer les variations de

séquence identifiées en 3 mutations faux-sens causales et un polymorphisme. Les résultats
obtenus par ce logiciel sont représentés dans le tableau 7.
Tableau 7: Tableau résumant les résultats obtenus par le logiciel Mutation Taster.
Variation de séquence Prédiction par Mutation Taster

c.200A>C Disease-causing
c.2189G>A Disease-causing
c.3780G> C Polymorphism
c.6545G>A Disease-causing
2.2.3.1. Les mutations faux-sens
Le séquençage de l’exon 2 du gène F8 a permis d’identifier chez le patient HA22 une

substitution de type transversion A>C à la position 200 de l’exon 2 (c.200A>C). Ceci a pour
conséquence un changement de la seconde base du codon AAG en ACG responsable de la
substitution d’une lysine par une thréonine en position 67 (48) (p.Lys67Thr, Lys48Thr).
D’autre part le séquençage de l’exon 23 a permis d’identifier chez le patient HA25 une
substitution de type transversion G>A en position 6545 de l’exon 23 (c.6545G > A).
Cette mutation entraîne un changement de la seconde base du codon CGT à CAT responsable
de la substitution d’une arginine par une histidine en position 2182 (2163) (p.Arg2182His,
Arg2163His).
Tandis que le séquençage de l’exon 14 du gène F8 a permis de mettre en évidence

chez le patient HA21 une mutation ponctuelle de type transversion G>A à la position 2189.
Cette mutation provoque un changement dans la deuxième base du codon TGT en TAT en
position 730 (711) responsable du remplacement de l’aa cystéine par une tyrosine
(p.Cys730Tyr, Cys711Tyr).
2.2.3.2. Le polymorphisme
Pour le patient HA23, la seule variation de séquence détectée est une substitution de
type transversion en position 3780 de l’exon 14 (c.3780 C>G). Cette substitution provoque un
changement dans la troisième base du codon GAC (Acide aspartique) à GAG (Acide
glutamique) en position 1260 (1241) dans le domaine B (p.Asp1260Glu, Asp1241Glu).
2.3. Détermination du statut des mutations détectées
Une recherche bibliographique ainsi qu’au niveau des bases de données de l’HA
disponibles a été réalisée afin de déterminer si les mutations identifiées ont été préalablement
rapportées dans d’autres populations. Les résultats de cette recherche sont représentés dans le
tableau 8.
Tableau 8: Détermination du statut des mutations détectées.
Mutation Rapporté dans les bases Rapporté dans des Statut des
identifiée de données d’HA articles mutations
c.322A>T HAMSTerS / Rapportée
c.5953C>T HAMSTerS / Rapportée
c.5219+1G>T / / Nouvelle
c.200A>C HAMSTerS / Rapportée
c.2189G>A / / Nouvelle
c.6545G > A HAMSTerS Rapporté dans plusieurs Rapportée
CHAMP articles
Ainsi, quatre mutations ont été préalablement décrites dans la base de données
HAMSTerS. Il s’agit des mutations : c.322A>T, c.5953C>T, c.200A>C et c.6545G>A.
Tandis que les deux mutations (c.5219+1G>T et c.2189G>A) n’ont jamais été citées
dans les bases de données ou rapportées dans des articles. Ces mutations sont des nouvelles
mutations identifiées dans la population Algérienne et qui semblent être spécifique à cette
population.
2.4. Absence d’identification de mutation responsable de l’HA
Pour trois cas index présentant les critères diagnostiques de l’HA : deux cas avec la
forme sévère et un cas avec la forme modérée, la recherche de mutation au niveau du gène F8
est restée négative. Aucune mutation n’a été retrouvée au niveau du gène F8 des patients
HA23, HA24 et HA26. En effet, le séquençage de la région codante, du promoteur et de la
région 3’UTR du gène F8 a permis de confirmer l’absence de mutations ponctuelles au niveau
de ces régions. D’autre part, la recherche par MLPA de gros réarrangements du gène F8 de
type délétion ou duplication est également restée négative chez ces trois patients.
II. Mutations du gène F8 et le développement des inhibiteurs
chez les patients hémophiles A Algériens
Article 2: accepté le 18 Février 2014

Titre: Factor 8 Gene Mutations and Risk of Inhibitor Development in Hemophilia A Algerian
Patients
Auteurs : Faouzia Zemani-Fodil, Meriem Abdi, Mostefa Fodil, Meriem Samia Aberkane,
Naima Mesli, Mohamed Belazaar, Malika Mehalhal, Yasmina Rahal, Hadj Touhami, Nadhira
Saidi-Mehtar, Abdallah Boudjema
1. Introduction
Le développement de produits recombinants et l’amélioration des

étapes de purification et d’inactivation/réduction virale des produits
plasmatiques ont fortement réduit le risque de contamination virale des
patients atteints de l’HA. Cependant, le risque de développement des
inhibiteurs anti-FVIII représente actuellement la complication la plus
grave chez ces patients. Ces inhibiteurs surviennent chez environ 10 à 15%
des patients hémophiles et dans environ 20 à 30% des patients atteints de
la forme sévère de la maladie (Astermark et al, 2006c). Le traitement
administré à ces patients devient alors inefficace et la prise en charge
par leurs médecins est rendue plus complexe.
Comme décrit dans la revue bibliographique de cette thèse, le

développement des inhibiteurs est un processus multifactoriel qui implique
des facteurs génétiques et/ou environnementaux. Le facteur de risque le mieux
caractérisé dans le développement des inhibiteurs est le type de mutation affectant le gène F8.
Aucune étude de ce type à notre connaissance n’a été entreprise dans la population Algérienne
ni dans l’ensemble des populations Nord Africaines.
Pour toutes ces raisons et dans cette deuxième partie d’étude, nous avons évalué la
corrélation entre le développement des inhibiteurs anti-FVIII et le type de mutations du gène
F8 préalablement identifiées dans l’article 1.
2. Résultats
Dans ce deuxième volet, nous avons dans un premier temps déterminé les fréquences
des mutations du gène F8 dans le groupe de patients développant des inhibiteurs. Dans un
second temps, nous avons recherché l’existence d’une éventuelle association entre les
mutations identifiées et le développement des inhibiteurs chez 24 patients hémophiles.
L’article 2 est inclus dans le manuscrit pages : 117-120.
La recherche des inhibiteurs en utilisant la technique Bethesda, nous a révélé le

développement des inhibiteurs chez 7 patients hémophiles dont 6 (85,71%) atteints de forme
sévère de la maladie. Parmi ce sous-groupe de patients, 14% étaient des forts répondeurs;
tandis que 86% étaient des faibles répondeurs.
A partir de ce résultat, nous avons rapporté que la fréquence de développement des

inhibiteurs dans notre échantillon est égale à 29,16%. Concernant le groupe de patients
présentant que la forme sévère de l’HA, la fréquence de développement des inhibiteurs est
égale à 27,27%.
Le statut développement des inhibiteurs de chaque patient étudié corrélé au type de

mutation du gène F8 est représenté dans le tableau 1, de l’article 2. Les anomalies
moléculaires responsables de l’HA ont été identifiées chez 20 patients du groupe étudié. Une
hétérogénéité significative dans la distribution de ces mutations dans le groupe de patients
développant des inhibiteurs a été mise en évidence. Dans ce groupe, la fréquence de la micro-
inversion de l’intron 22 était élevée (4/7). Pour le patient HA12, une mutation non-sens a été
retrouvée. Toutefois pour les deux patients restants, aucune mutation génétique n’a été
détectée.
Parmi le groupe de patients développant des inhibiteurs, la fréquence de mutations

dite fortement délétères était égale à 71,42%. Ce groupe de mutations regroupe quatre patients
avec la micro-inversion de l’intron 22 et un avec une mutation non-sens au niveau de l’exon 3
du gène F8 (c.322A> T, p.Lys108*).
L’analyse statistique de distribution des mutations du gène F8 dans les deux groupes
de patients hémophiles avec et sans inhibiteurs est représentée dans le tableau 2 (Article 2).
Après comparaison des distributions de chaque type de mutation du gène F8 testées entre les
deux groupes de patients avec et sans inhibiteur, il ressort qu’il n’existe aucune différence
statistiquement significative dans la distribution des fréquences de ces mutations entre les
deux groupes de patients (p>0,05) (tableau 2, article 2).
D’autre part, et afin de prédire les effets des mutations faux-sens préalablement
identifiées sur l’apparition des épitopes reconnus par les LB, deux logiciels de prédiction in
silico des épitopes ont été utilisés. Les résultats obtenus par les logiciels IEDB et BEPIPRED
ont permis d’exclure l’implication des mutations faux-sens identifiées dans cette étude dans
l’apparition des épitopes reconnu par les LB.
III. Prédiction in silico des effets délétères des mutations
responsables d’HA dans la population Algérienne
1. Introduction
Les effets délétères des nouvelles mutations identifiées (c.5219+1G>T, c.2189G>A) et

celle uniquement citée dans la base de données HAMSTerS (c.200A>C) sur la protéine FVIII
ont été prédits en utilisant sept logiciels bioinformatiques.
Ces logiciels permettent de prédire les effets des mutations en fonction de leurs types
et de leurs localisations au niveau des séquences nucléotidiques. Ainsi, l’impact de la
mutation intronique c.5219+1G>T sur le processus d’épissage a été étudié par les deux
logiciels HSF et ESE Finder. Tandis que les effets délétères des deux mutations exoniques
(c.2189G>A, c.200A>C) sur la structure/fonction de la protéine FVIII ont été prédits en
utilisant les logiciels I-Mutant 2.0, SIFT, Polyphen-2 et Align GVGD. Par la suite,
les structures 3D des protéines contenant ces dernières mutations ont été construites par
modélisation moléculaire en utilisant le logiciel Swiss Pdb Viewer.
2. Résultats
2.1. Analyse de la mutation c.5219+1G>T par HSF
Le résultat de l’analyse de la mutation c.5219+1G>T par le logiciel HSF est représenté

sur la figure 49. Le logiciel HSF a prédit l’abolition du site donneur d’épissage normal
(Figure 48). D’autre part, HSF a également prédit l’absence d’activation de site cryptique
dans cette région (Figure 48).
Figure 48 : Résultat de l’analyse de la mutation c.5219+1G>T par le logiciel HSF.

2.2. Analyse de la mutation c.5219+1 G>T par ESE Finder
Le résultat de l’analyse de la mutation c.5219+1G>T par le logiciel ESE Finder est

représenté sur la figure 49. Par comparaison entre la séquence normale et mutée du gène F8
(Figure 49 A et B), ESE Finder a prédit l’abolition des sites de fixation des deux protéines
SR : SRp40 et SF2/ASF (Figure 49.B).
Figure 49 : Représentation de distribution des motifs de fixation des cinq protéines SR au

niveau de la séquence normale du gène F8 (A) et celle contenant la mutation c.5219+1G>T
(B).
2.3. Résultats obtenus par le logiciel I-Mutant 2.0
L’analyse des effets des mutations faux-sens sur la stabilité de la protéine FVIII a été
prédite par le logiciel I-Mutant 2.0. Un exemple de résultat obtenu par ce logiciel est
représenté sur la figure 50.
Figure 50 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel I-Mutant 2.0.
Les résultats obtenus pour les deux mutations (c.200A>C, c.2189G>A) sont résumés
dans le tableau 9. I-Mutant 2.0 a permis de calculer la différence d’énergie (DDG) entre la
protéine normale et mutée. Les valeurs DDG calculées pour les deux mutations (c.200A>C,
c.2189G>A) sont respectivement égale à -1,26 et -0,49. Etant donné que ces deux valeurs sont
négatives, les deux mutations testées ont été considérées comme déstabilisante pour la
structure du FVIII.
Tableau 9 : Les résultats obtenus par le logiciel I-Mutant 2.0.
Mutation en c DNA Mutation au niveau DDG Prédiction par I-Mutant 2.0

protéique
c.200A>C Lys48Thr -1,26 Mutation déstabilisante
c.2189G>A Cys711Tyr -0,49 Mutation déstabilisante
2.4. Résultats obtenus par le logiciel SIFT
Un exemple de résultat obtenu par le logiciel SIFT est représenté sur la figure 51. Ce
résultat est présenté sous forme de deux colonnes. La colonne de gauche regroupe les aa qui
sont prédits intolérants pour une position donnée. A l’inverse, celle de droite regroupe les aa
qui sont prédits tolérants. Les aa sont colorés en fonction de leurs propriétés physico-
chimiques (Tableau 10).
Figure 51 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel SIFT.
Tableau 10: Les différentes propriétés physico-chimiques correspondant aux couleurs des aa
obtenus par SIFT.
Couleurs des aa Propriété physico-chimique
Rouge Basique
Vert Polaire non chargé
Noire Non polaire
Bleu Acide
Les résultats obtenus pour les deux mutations (c.200A>C, c.2189G>A) sont résumés
dans le tableau 11. Les deux mutations (c.200A>C, c.2189G>A), conduisant respectivement à
la substitution d’une lysine par une thréonine et d’une cystéine par une tyrosine, sont prédites
comme intolérantes. Ce résultat signifie que ces deux substitutions ont un impact entrainant
une perte partielle ou totale de la fonction protéique.
Tableau 11 : Les résultats obtenus par le logiciel SIFT.
Mutation en c DNA Mutation au niveau Prédiction par SIFT

protéique
c.200A>C Lys48Thr Intolérante (Intolerated)
c.2189G>A Cys711Tyr Intolérante (Intolerated)
2.5. Résultats obtenus par le logiciel POLYPHEN-2
La prédiction de l’impact de la mutation c.2189G>A sur la protéine FVIII par le

logiciel PolyPhen-2 nous a permis d’avoir les résultats présenté sur la figure 52. L’ensemble
des résultats obtenus par ce logiciel sont résumés dans le tableau 12.
Figure 52 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel PolyPhen-2.

Les deux mutations c.200A>C et c.2189G>A ont été prédites par le logiciel
PolyPhen-2 comme étant probablement délétères à la structure protéique (Probably damaging)
(Tableau 12). Ce logiciel a permis également d’obtenir le résultat d’alignement multiple par
comparaison avec toutes les espèces enregistrées sur UniProKB, ce qui nous a permis de
confirmer que les deux mutations siègent dans des régions conservées entre plusieurs espèces
(Figure 52).
Tableau 12 : Les résultats obtenus par le logiciel PolyPhen-2.
Mutation en c DNA Mutation au niveau Prédiction par PolyPhen-2

protéique
c.200A>C Lys48Thr Probablement délétère (Probably
damaging)
c.2189G>A Cys711Tyr Probablement délétère (Probably
damaging)
2.6.Résultats obtenus par le logiciel Align GVGD
Le logiciel Align GVGD a également été utilisé afin de prédire les effets des mutations
testées sur la protéine FVIII. Un exemple de résultat obtenu par ce logiciel est présenté sur la
figure 53.
Figure 53: Exemple de résultat obtenu par Align GVGD.

L’analyse des deux mutations par Align GVGD a permis de calculer les valeurs GV et
GD pour chaque mutation. Les valeurs de la variation de Grantham (GV) sont égale à 0,00 ce
qui signifie que les deux substitutions siègent au niveau d’une région fortement conservées
entre les espèces analysées. D’autre part, ce même logiciel nous a permis de calculer l’écart
de Grantham (GD) entre les aa sauvages et mutées. La valeur GD pour la mutation c.200A>C
est égale à 77,74 ce qui signifie que les propriétés physico-chimique entre la lysine et la
thréonine sont modérément conservée. Tandis que la valeur GD prédite pour la mutation
c.2189G>A est égale à 193,72. Ainsi, le remplacement d’une cystéine par une tyrosine est
prédit comme changement radical.
Le résultat de l’analyse des deux mutations par ce logiciel a permis de prédire que ces
dernières correspondent à la classe C65 : ces deux mutations sont prédites comme
interférentes avec la fonction du FVIII.
Tableau 13 : Les résultats obtenus par le logiciel Align GVGD.
Mutation en c DNA Mutation au niveau GV GD Classe prédite

protéique
c.200A>C Lys67Thr 0,00 77,74 C65
c.2189G>A Cys730Tyr 0,00 193,72 C65
2.7. Construction des structures 3D par le logiciel Swiss PDB Viewer
Les structures 3D des protéines FVIII normales et mutées ont été construites pour
chacune des mutations faux-sens en utilisant le logiciel Swiss PDB Viewer. La structure
cristallographique de la protéine FVIII a été extraite à partir de la base de données PDB sous
le code 3CDZ.
2.7.1. Paramètres analysés pour la prédiction des effets délétères des mutations faux
sens
2.7.1.1. Localisation des résidus substitués au niveau de la structure 3D du FVIII
Un des critères essentiels dans la détermination de la conséquence d’une nouvelle

mutation est sa localisation dans la structure 3D. La localisation des deux résidus substitués au
niveau de la protéine FVIII est représentée sur la figure 54.
La lysine en position 48 se trouve au niveau du domaine A1. Cet aa est engagée dans
une liaison hydrogène avec la lysine en position 12. Tandis que la cystéine en position 711 est
localisée au niveau du domaine A2. Cet aa forme un pont disulfure avec une autre cystéine en
position 630. Cette cystéine est également incluse dans un site de liaison au FIX (Lys707-
Asp714).
Figure 54: Localisation de la lysine 48 et de la cystéine 711 au niveau de la structure

cristallographique de la protéine FVIII.
2.7.1.2. Comparaison des changements structuraux de la protéine FVIII
Un autre critère qui doit être pris en considération dans les études de prédiction est le
changement structural de la protéine après introduction de la mutation. Ainsi et pour chaque
mutation, les deux structures 3D ont été comparées afin de déterminer tout changement
structural de la protéine.
 c.200A>C, Lys48Thr
La structure 3D de la protéine FVIII normale (Figure 55.A) a été comparée à celle

contenant la mutation Lys48Thr (Figure 55.B) afin de déterminer tous les changements
structuraux de la protéine. Comme présenté sur la figure 55, la substitution d’une lysine par
une thréonine ne provoque aucun changement structural visible au niveau de la protéine
FVIII.
A. B.
 c.2189G>A, Cys711Tyr
La structure 3D de la protéine FVIII normale (Figure 56.A) a été comparée à celle

contenant la substitution Cys711Tyr (Figure 56.B) afin de déterminer les changements
structuraux causés par cette dernière. En effet, le remplacement d’une cystéine par une
tyrosine provoque un changement structural très important au sein de la protéine FVIII
représenté par la rupture du pont disulfure Cys630-Cys711. D’autre part, l’aa tyrosine pourrait
s’engager dans une liaison hydrogène avec la serine en position 628.
A. B.
2.7.1.3. Comparaison des propriétés physicochimiques entre les résidus normaux

et mutés
Les différences de propriétés physicochimiques d’aa peuvent également expliquer les

effets délétères des mutations sur la structure ainsi que la fonction de la protéine FVIII.
Pour cela, une comparaison des propriétés physicochimiques entre les résidus normaux et
mutés a été réalisée.
Pour rappel, la mutation c.200A>C est responsable de la substitution de l’aa lysine par
une thréonine. Les structures de ces deux aa sont représentées dans la figure 57. Tandis que
les propriétés physicochimiques de chaque résidu sont résumées dans le tableau 14.
La figure 57 montre les structures schématiques de l’aa sauvage (à gauche) et le muté

(à droite). La partie commune (squelette) entre les deux aa est de couleur rouge. Tandis que la
chaîne latérale qui est unique pour chaque résidu est de couleur noire. Ces deux aa présentent
des propriétés chimiques particulières en raison de la nature de leurs chaînes latérales.
Figure 57 : Les structures schématiques de la lysine et la thréonine.
Les différences entre ces deux aa résident dans leurs tailles ainsi que leurs charges
(tableau 14). Ces différences peuvent entraîner un changement de conformation de la protéine
ainsi qu’une perte d’interaction avec d’autres molécules ou résidus au sein du FVIII.
D’autre part, la c.200A>C introduit un résidu neutre à la structure protéique ce qui

pourrait entraîner une perte de liaisons hydrogènes causant un mauvais repliement de la
protéine FVIII.
Tableau 14 : Les propriétés physicochimiques des deux aa lysine et thréonine.
Résidu Type Taille Accessibilité Hydrophobicité Charge

(annexe 5) (annexe 6)
Lysine Basique 146 Da Enfouie Hydrophile Positive
Thréonine Polaire non 119 Da Enfouie Neutre Neutre
chargé
La mutation c.2189G>A est à l’origine de la substitution d’une cystéine par une

tyrosine. Les structures de ces deux aa sont représentées dans la figure 58. Tandis que les
propriétés physicochimiques de chaque résidu sont résumées dans le tableau 15.
Les structures schématiques de l’aa sauvage (à gauche) et le muté (à droite) sont
présentés dans la figure 58. La partie commune entre les deux aa est de couleur rouge. Tandis
que la chaîne latérale qui est unique pour chaque résidu est de couleur noire.
Figure 58 : Les structures schématiques de la cystéine et la tyrosine.
Chaque aa à des propriétés physico-chimiques spécifiques à lui. Les différences de

propriétés physico-chimiques entre les deux aa résident au niveau de la taille ainsi que la
position au sein du FVIII (Tableau 15). De plus, la présence de groupement thiol uniquement
au niveau de la chaîne latérale de l’aa cystéine représente la principale différence. Toutes ces
différences pourraient causer un changement structural important à la protéine FVIII.
Tableau 15 : Les propriétés physicochimiques des deux aa cystéine et tyrosine.
Résidu Type Taille Position au Hydrophobicité Charge

sein du FVIII (annexe 6)
(annexe 5)
Cystéine / 121 Da Intermédiaire Hydrophobe Neutre
Tyrosine Aromatique 181 Da Accessible Hydrophobe Neutre
2.7.1.4. Comparaison de taille et orientation de chaine latérale des résidus
normaux et mutés
Pour chaque mutation, les deux structures 3D ont été superposées afin de déterminer
toutes différences de taille et d’orientation des chaînes latérales.
La structure de la protéine FVIII a été superposée à celle contenant la mutation

Lys48Thr afin de comparer la taille et l’orientation des chaines latérales entre les deux
résidus.
La comparaison de la chaine latérale de la lysine représentée en vert avec celle de la

thréonine représentée en rouge montre clairement la différence de taille entre les deux
chaînes. En effet, la chaîne latérale de la thréonine est plus courte que celle de la lysine.
Cette différence pourrait empêcher ou créer de nouvelles interactions moléculaires au sein de
la structure de la protéine FVIII.
Figure 59: Capture superposée des deux structures 3D du FVIII sauvage et mutée
(vue sur deux ongles différents à gauche et à droite). La protéine FVIII est représentée sous
forme ribbon de couleur grise. La chaîne latérale de l’aa lysine est représentée en vert
tandis que celle de l’aa thréonine est représentée en rouge.
Les deux structures 3D de la protéine FVIII normale et celle contenant la substitution

(Cys711Tyr) ont été également superposées afin de comparer la taille et l’orientation des
chaînes latérales entre les deux résidus cystéine et tyrosine.
La comparaison des deux chaînes latérales de la cystéine représentée en vert avec celle
de la tyrosine représentée en rouge montre clairement la rupture du pont disulfure.
La tyrosine étant libre à cet endroit pourrait s’engager à plusieurs interactions moléculaires au
sein de la protéine FVIII.
Figure 60: Capture superposée des deux structures 3D du FVIII sauvage et mutée
(vue sur deux ongles différents à gauche et à droite). La protéine FVIII est représentée sous
forme ribbon de couleur grise. La chaîne latérale de l’aa cystéine est représentée en vert tandis
que celle de la tyrosine est représentée en rouge.
DISCUSSION GENERALE
I. Caractérisation génétique des anomalies moléculaires responsables
de l’HA dans la population Algérienne : identification de deux
nouvelles mutations
Le principal objectif de cette partie d’étude était de caractériser les anomalies

moléculaires responsables de l’HA chez 27 patients appartenant à 21 familles non
apparentées. Pour cette raison, une stratégie d’étude moléculaire directe a été mise en place.
Cette stratégie repose sur la détection des micro-inversions de l’intron 22 et 1 par

PCR LR et PCR triplex. Ces deux méthodes sont faciles à réaliser, reproductibles,
sécurisantes (non isotopique) et remplacent l’analyse laborieuse et coûteuse par le Southern
blot. En absence de ces deux micro-inversions, nous avons procédé à une recherche par
séquençage de mutations dans la région codante du gène F8 suivie du promoteur et de la
région 3’UTR. Le cas échéant, une recherche des gros réarrangements du gène F8
(délétions ou duplications) a été effectuée par la méthode MLPA. Cette stratégie de détection
a permis l’identification des mutations responsables de l’HA chez 18 parmi les 21 familles
non apparentées.
La stratégie d’identification des mutations est similaire à celles utilisées par plusieurs
laboratoires de biologie moléculaire. Il existe cependant quelques différences mineures
reposant sur le choix des méthodes de criblage des mutations ponctuelles. Dans ce dernier cas,
le diagnostic est établi par une première méthode moléculaire de dépistage tels que la
méthode Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) (Ganguly et al, 1993; Williams
et al, 1998), La denaturing High Performance Liquid Chromatography (dHPLC)
(Fackenthal et al, 2005; Oldenburg et al, 2001), la High Resolution Melting Analysis (HRM)
(Lin et al, 2008) et la Chemical Cleavage of Mismatch (CCM) (Waseem et al, 1999).
Toutefois, toutes ces méthodes nécessitent une confirmation par séquençage de la région
portant le mésappariement.
A partir de 2005, la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sont passés au

séquençage direct du gène F8 actuellement considéré comme la technique de référence
(Keeney et al, 2005). En effet, le séquençage direct est le « gold standard » pour la détection
des mutations des gènes au niveau du chromosome X chez l’homme, avec une sensibilité
comprise entre 98% et 100%.
L’étude moléculaire du gène F8 a permis l’identification de huit différents types de
mutations responsables de l’HA. Ces mutations regroupent la micro-inversion de l’intron 22,
la micro-inversion de l’intron 1 et six mutations ponctuelles. Aucune délétion, insertion ou
tout autre réarrangement du gène F8 n’a été détecté dans cet échantillon de patients. De façon
générale, la plupart des mutations identifiées sont spécifiques à chaque famille à l’exception
de la micro-inversion de l’intron 22 qui est la plus fréquente.
En effet, la PCR LR a révélé la présence de la micro-inversion de l’intron 22 chez 11

parmi les 19 patients non apparentées présentant une forme sévère de la maladie.
Ce qui représente une fréquence égale à 57,89% dans notre échantillon. Cette fréquence est
légèrement élevée par rapport aux valeurs retrouvées dans la littérature (Tableau 16).
Les fréquences de la micro-inversion de l’intron 22 rapportées par plusieurs études réalisées
dans différentes populations varient entre 22,72 et 52,5 %.
En ce qui concerne les pays Arabes les études publiées se limitent à la Jordanie, la
Tunisie, le Liban, l’Egypte et l’Arabie Saoudite qui présentent respectivement les fréquences
suivantes : 52% (Awidi et al, 2010), 22,72% (Elmahmoudi et al, 2012), 29%
(Djambas Khayat et al, 2008), 23,3% (Abou-Elew et al, 2011) et 50% (Owaidah et al, 2009).
Un seul cas sporadique présentant la micro-inversion de l’intron 22 a été rapporté dans

notre échantillon. Cette micro-inversion a été probablement transmise à ce cas index par son
grand père maternel vu que la survenue d’un tel phénomène chez la mère est rare voire
impossible. Toutefois, c’est la détermination du statut conductrice de la mère qui permet de
savoir l’origine de cette micro-inversion.
D’autre part, la micro-inversion de l’intron 1 a été détectée chez un seul patient parmi
les 19 familles présentant une forme sévère de la maladie. Ce qui représente une fréquence de
cette micro-inversion égale à 5,26% dans notre échantillon. Cette fréquence est dans
l’intervalle indiqué par plusieurs études (0,3-11%) (Tableau 16).
Tableau 16: Tableau résumant les fréquences des micro-inversions de l’intron 22 et 1 rapportée
dans différentes populations.
Population Fréquence de la Fréquence de la Références
étudiée micro-inversion de micro-inversion de
l’intron 22 l’intron 1
Asie
Chine 51,3% 2,7% (Xue et al, 2010)
Inde 50,5% 2% (Jayandharan et al, 2005)
Iran 39% 2,4% (Boekhorst et al, 2008)
Corée 39,5% 2,6% (Hwang et al, 2009)
Taiwan 27,8% 5,2% (Chen et al, 2010)
Jordanie 52% 1 cas (Awidi et al, 2010)
Arabie Saoudite 50% 0% (Owaidah et al, 2009)
Liban 29% 2 frères (Djambas Khayat et al, 2008)
Amérique
Etats-Unis 32,2% 1,5% (Miller et al, 2012)
Venezuela 41% 0% (Albanez et al, 2011)
Costa Rica 45% 0% (Salazar-Sanchez et al, 2010)
Mexique (Mantilla-Capacho et al, 2007)
Nouvelle 53,8% 11% (Laurie et al, 2007)

Zélande
Europe
Allemagne 45% 2,52% (Oldenburg & Pavlova, 2006)
Autriche 33% 1,7% (Reitter et al, 2010)
Espagne 52,5% 3% (Casana et al, 2008)
France 47% 1,3% (Repesse et al, 2007)
Hollande 51,5% 0,3% (Gouw et al, 2011)
Hongrie 28,3% 0% (Andrikovics et al, 2003)
Italie 52% 2% (Margaglione et al, 2008)
Portugal 49% 3,7% (Silva Pinto et al, 2012)
Angleterre 38,9% 3,9% (Green et al, 2008)
Afrique
Tunisie 22,72% 0% (Elmahmoudi et al, 2012)
Egypte 23,3% / (Abou-Elew et al, 2011)
Lorsque nous avons comparé nos résultats avec les données antérieures issues des pays
arabes, la micro-inversion de l’intron 1 est plus élevée dans notre échantillon. Aucun patient
présentant cette micro-inversion n’a été détecté dans les populations Tunisienne et
Saoudienne. Toutefois, un cas présentant cette micro-inversion a été décrit dans la population
Jordanienne (Awidi et al, 2010) tandis que deux patients de la même famille ont été rapportés
dans la population Libanaise (Djambas Khayat et al, 2008).
Le séquençage des 26 exons du gène F8 a permis la détection de six mutations

ponctuelles : deux mutations nonsenses (c.322A>T, c.5953C>T), une mutation au niveau d’un
site donneur d’épissage (c.5219+1G>T) et trois mutations faux-sens (c.200A>C, c.2189G>A,
c.6545G>A).
La première mutation non-sens (c.322A>T) se traduit au niveau protéique par
l’apparition d’un codon stop en position 108 ne conservant qu’un fragment A1 de la protéine
FVIII dépourvue de l’intégralité des domaines A2, B, A3, C1 et C2.
La deuxième mutation (c.5953C>T), située au niveau de l’exon 18, entraine

l’apparition d’un codon stop en position 1985 (1966) de la chaîne d’aa correspondant à une
protéine dépourvue des trois domaines A3, C1, C2.
Ces deux mutations entraînent l’arrêt prématuré de la traduction donnant ainsi des
protéines courtes altérées fonctionnellement suite à l’absence des domaines importants requis
pour la structure du FVIII. Cependant, ces protéines tronquées ne sont jamais synthétisées ou
sécrétées dans la circulation grâce à l’implication du système Nonsense Mediated mRNA
Decay (NMD) (Byers, 2002; Khajavi et al, 2006).
En effet, le NMD est un processus permettant de dégrader sélectivement les ARNm

portant un codon stop prématuré, empêchant ainsi la traduction d’une protéine tronquée
potentiellement délétère (Baker & Parker, 2004). Ce système nécessite la reconnaissance des
codons stop prématuré par le complexe de jonction des exons (EJC). L’EJC se met en place
au cours de l’étape d’épissage des introns à 22 nucléotides en amont de la jonction entre deux
exons. Au cours de la traduction et lorsque le ribosome rencontre un codon stop en amont
d’un des complexes (EJC), il recrute des facteurs d’arrêt de la traduction (Conti & Izaurralde,
2005; Wen & Brogna, 2008). Ces facteurs liés au complexe EJC vont entraîner la dégradation
de l’ARNm via l’exosome.
Le séquençage de l’exon 14 a permis d’identifier chez un patient une substitution de

type transversion G>T à la première position de l’intron 14 (c.5219+1G>T). Cette mutation
est à l’origine du changement du site donneur d’épissage (GT) en (TT). Cette mutation est
nouvelle et n’a jamais été citée dans les bases de données ou rapportée dans des articles.
L’effet délétère de cette mutation a été prédit in silico et il sera discuté dans la troisième partie
de cette discussion.
D’autre part, Le séquençage des 26 exons du gène F8 a permis l’identification de

quatre variations de séquence.
Différents critères peuvent être définis pour différencier entre une mutation délétère
responsable de la maladie et un simple polymorphisme (Cotton & Scriver, 1998). Ces critères
sont basés sur le degré de conservation de l’aa, la nature du changement de l’aa, la prévalence
de la variation de séquence dans la population générale, la ségrégation de la mutation avec la
pathologie dans la famille et son analyse fonctionnelle. L’utilisation du logiciel Mutation
Taster regroupant les trois premiers critères, nous a permis de classer les variations de
séquence identifiées en 3 mutations faux-sens causales et un polymorphisme.
Ainsi, les trois variations (c.200A>C, c.2189G>A et c.6545G>A) ont été prédites par
Mutation Taster comme mutation causales, tandis que la variation (c.3780G>C) a été
considérée comme un polymorphisme.
Une variation de séquence est considérée comme un polymorphisme lorsqu’elle est

retrouvée dans la population générale à une fréquence supérieure à 1% ou lorsqu’elle est
répertoriée comme un polymorphisme dans les bases de données de variants (NCBI SNP
database, 1000 genomes project, Genome Variation Server, Exome Variation Server).
En ce qui concerne la variation c.3780G>C, elle a été répertoriée dans la base de données
NCBI SNP database sous le rs1800291 avec une fréquence de l’allèle mineur C égale à 0,246
dans la population générale.
Le séquençage de l’exon 2 a permis d’identifier chez le patient HA22 une substitution

de type transversion A>C à la position 200 de l’exon 2 (c.200A>C). Ceci avait pour
conséquence la substitution d’une lysine par une thréonine en position 67 (48)
(p.Lys67Thr, Lys48Thr). Cette mutation a été répertoriée en juillet 2012 dans la base de
données HAMSTeRS. Cependant, l’effet délétère de cette dernière mutation n’a pas été
étudié.
D’autre part, le séquençage de l’exon 14 du gène F8 a permis de mettre en évidence

chez le patient HA21 une mutation ponctuelle de type transversion G>A à la position 2189.
Cette mutation est responsable du remplacement de l’aa cystéine par une tyrosine en position
730 (711) (p.Cys730Tyr, Cys711Tyr). Cette mutation n’a jamais été citée dans les bases de
données ou rapportée dans des articles.
Les fonctionnalités des deux dernières mutations (c.200A>C, c.2189G>A) ont été
étudiées et seront également discutées dans la troisième partie de cette discussion.
Le séquençage de l’exon 23 a permis d’identifier chez le patient HA25 une

substitution de type transversion G>A en position 6545 de l’exon 23 (c.6545G>A).
Cette mutation entraîne un changement de la seconde base du codon CGT à CAT responsable
de la substitution d’une arginine par une histidine en position 2182 (2163). Cette mutation a
été décrite dans les bases de données HAMSTeRS, CHAMP et rapportée dans des articles.
Cette dernière semble être récurrente ; elle a été identifiée comme responsable de la
forme sévère d’HA chez plusieurs patients hémophiles appartenant à différentes populations
(Tableau 17). L’effet délétère de cette mutation revient essentiellement aux différences entre
les propriétés physico-chimiques des deux aa.
Tableau 17: Liste de publications rapportant la mutation c.6545G>A responsable de l’HA

(un exemple de chaque population).
Nombre de Patient Population Référence

3 Anglaise (Theophilus et al, 1998)
1 Américaine (Laprise et al, 1998)
1 Espagnole (Vidal et al, 2001)
4 Turquie (Timur et al, 2001)
2 Canadienne Lillicrap et al (HAMSTeRS)
1 Australienne Arnold et al (HAMSTeRS)
1 Allemande (Bogdanova et al, 2007)
1 Espagnole (Casana et al, 2008)
1 Taïwanaise (Lin et al, 2008)
Nous avons par ailleurs rapporté l’absence d’identification de mutations causales chez
trois cas index présentant les critères diagnostiques de l’HA (14,28%). En effet, aucune
mutation n’a été détectée au niveau du gène F8 des patients HA23, HA24 et HA26 après
séquençage des 26 exons, du promoteur et de la région 3’UTR et recherche de grands
réarrangements de type délétion ou duplication par MLPA.
Il a été précédemment rapporté dans la littérature que chez environ 2 à 18 % des

patients atteints d’HA, aucune anomalie génétique n’est détectée (Bogdanova et al, 2007;
Jayandharan et al, 2005; Oldenburg et al, 2001; Santacroce et al, 2008; Vinciguerra et al,
2006). Plusieurs hypothèses peuvent être avancées afin d’expliquer ce résultat.
En effet, la première hypothèse stipule qu’il existerait une possibilité que les mutations
responsables de l’HA soient situées dans les régions non analysées du gène F8. Ces mutations
sont très probablement localisées dans des régions introniques ne flanquant pas les exons, càd
en dehors des séquences explorées habituellement. L’implication des variations introniques
dans l’HA est maintenant évident (Castaman et al, 2011; Inaba et al, 2013; Pezeshkpoor et al,
2013). Ces variations peuvent avoir des effets délétères sur l’épissage par l’activation des sites
cryptiques donneurs et accepteurs d’épissage générant des transcrits aberrants (Anczukow et
al, 2012; Castaman et al, 2010; Dehainault et al, 2007; Zimmermann et al, 2013a).
La deuxième hypothèse serait que les mutations responsables de l’HA chez ces
patients sont probablement situées au niveau somatique. En effet, une mutation ponctuelle au
niveau du gène F8 peut être présente uniquement dans les cellules hépatiques. Bien que des
mutations causant l’HA surgissent généralement dans les cellules germinales, une mutation de
novo peut également se produire au cours de l’embryogenèse précoce (Higuchi et al, 1988;
Leuer et al, 2001; Oldenburg et al, 2000). Compte tenu du trait familial de la maladie chez nos
patients, cette hypothèse a été éliminée.
Des facteurs épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN pourrait également

constituer une autre cause d’apparition de l’HA chez ces patients. La méthylation consiste en
l’ajout d’un groupe méthyle au niveau du carbone 5 d’une cytosine, le plus souvent au sein
des ilots CpG (Figure 61.A) (Jaenisch & Bird, 2003; Weber et al, 2007). Cette modification
de l’ADN génomique joue un rôle important dans la régulation transcriptionnelle des gènes.
Le caractère non-méthylé d’une cytosine est généralement considéré comme l’état naturel du
gène associé, lui permettant d’être prêt pour la transcription (Figure 61.B). A l’inverse, la
méthylation de l’ADN d’une région régulatrice va rendre cette dernière plus ou moins
accessible aux facteurs de transcription et va attirer des enzymes qui vont modifier localement
la structure et la composition de la chromatine. Ces deux mécanismes peuvent induire une
dysrégulation de l’expression du gène associé (Figure 61.C) (Brenet et al, 2011). Une étude
récente a suggéré que ces mécanismes de méthylation peuvent être impliqués dans
l’apparition de l’HA (Zimmermann et al, 2013b).
Figure 61: Représentation schématique du mécanisme de la méthylation, adaptée d’après
(Waggoner, 2007).
Un autre mécanisme plus général serait que le déficit en FVIII retrouvé chez ces
patients est probablement du à des mutations au niveau des gènes codants des protéines non
encore identifiées (Pezeshkpoor et al, 2014). Ces protéines peuvent être impliquées dans des
modifications post-transcriptionnelles ou traductionnelles, dans la synthèse, la sécrétion ou la
clairance du FVIII.
II. Mutations du gène F8 et le développement des inhibiteurs chez les
patients hémophiles A Algériens
Dans cette deuxième partie de thèse, nous avons dans un premier temps déterminé les
fréquences du développement des inhibiteurs dans notre échantillon. La recherche de ces
inhibiteurs en utilisant la technique Bethesda, nous a permis d’attester la présence des
inhibiteurs chez 7 patients hémophiles dont 6 (85,71%) atteints de forme sévère de la maladie.
A partir de ce résultat, nous avons rapporté que la fréquence de développement des

inhibiteurs dans notre échantillon est égale à 29,16%. Cette fréquence est supérieure à celle
retrouvée par Astermark et al. (10 à 15%) (Astermark et al, 2006c). Toutefois, la fréquence de
développement des inhibiteurs chez les patients atteints de forme sévère d’HA dans cette
étude (27,27%) est en accord avec ce qui a été rapporté par cette même équipe (20-30%)
(Astermark et al, 2006c).
D’autre part, nous avons étudié la corrélation entre le génotype des patients et le statut
de développement des inhibiteurs. Nous avons remarqué une hétérogénéité significative dans
la distribution des mutations dans le groupe de patients développant des inhibiteurs, avec une
fréquence élevée de la micro-inversion de l’intron 22 (4/7).
Nous avons également rapporté une fréquence très élevée (71,42%) des mutations
délétères dans le groupe de patients développant des inhibiteurs. Ces mutations délétères sont
représentées par quatre micro-inversion de l’intron 22 et une mutation non-sens (c.322A> T,
p.Lys108*). Ce résultat a été préalablement rapporté et expliqué par Astermark et al
(Astermark, 2006b). En effet, les mutations fortement délétères conduisent à une rupture de
tolérance pour les antigènes du FVIII chez ces patients. Cette dernière sera responsable de
l’installation d’une réponse immunitaire contre le FVIII thérapeutique une fois administré à
ces patients.
Par ailleurs, nous avons recherché l’existence d’une éventuelle association entre le
type de mutation du gène F8 et le développement des inhibiteurs chez 24 patients hémophiles.
Les résultats que nous avons obtenus montrent l’absence d’association entre le type de
mutation du gène F8 et le développement des inhibiteurs dans notre échantillon.
L’absence d’association retrouvée dans cette étude n’est pas en corrélation avec les
résultats obtenus par une étude réalisée sur la population Allemande (Oldenburg et al, 2002)
et une méta-analyse (Gouw et al, 2012). Ces deux études ont confirmé l’implication des
mutations fortement délétères du gène F8 dans le développement des inhibiteurs (Gouw et al,
2012; Oldenburg et al, 2002).
L’absence d’association retrouvée dans cette étude pourrait, d’une part, s’expliquer par
le faible effectif des patients; d’autre part, par la différence du mode et du régime
d’administration par les concentrées du FVIII thérapeutiques entre ces derniers.
Ces résultats nécessitent donc d’être confirmés sur un échantillon de patients plus importants.
Toutefois, les sept patients rapportés dans cette étude sont les seuls développant des
inhibiteurs recensés au niveau des CHU de la région Ouest d’Algérie. Il serait donc
intéressant d’élargir l’étude sur toute la population Algérienne.
La réponse immunitaire anti-FVIII dans l’HA est très complexe et variable.

De nombreux outils basés sur des approches innovantes sont actuellement disponibles afin de
contribuer à la compréhension de ces mécanismes. En effet, l’utilisation de la bioinformatique
dans un but de prédire et d’identifier les épitopes reconnus par les LB au sein du FVIII peut se
révéler très utile (Rosset et al, 2014). Deux logiciels de prédiction in silico ont été utilisés afin
de prédire les effets des trois mutations faux-sens sur l’apparition des épitopes.
Nos résultats montrent l’absence d’apparition de ces épitopes au sein des trois protéines
mutées. L’absence de développement des inhibiteurs chez ces patients corrèle parfaitement
avec ce résultat obtenu.
L’avancée dans la compréhension des facteurs de risques impliqués dans le

développement des inhibiteurs a permis d’offrir aux cliniciens des systèmes de stratification et
de prédiction de survenue de ces derniers. Ainsi, Ter Avest et ses collègues ont mi en place un
score permettant de prédire le risque individuel de survenue des inhibiteurs pour chaque
patient (ter Avest et al, 2008). Ce score cumulatif repose sur trois principaux facteurs de
risque : les antécédents familiaux (deux points), la présence de mutation délétère du gène F8
(deux points) et un premier traitement intensif (trois points) (ter Avest et al, 2008). Une valeur
nulle signifie que le patient présente un faible risque de développer des inhibiteurs, tandis
qu’une valeur supérieure à 3 signifie que le patient présente un risque élevé de développement
de ces inhibiteurs. Il serait ainsi facile de prédire le développement des inhibiteurs chez les
patients par leurs médecins avant l’inefficacité du traitement.
D’autre part, nous avons rapporté une fréquence égale à 44,45% de développement des
inhibiteurs dans le groupe de patients présentant la micro-inversion de l’intron 22.
Une fréquence légèrement élevée a été rapportée dans la population Costa ricaine
(Salazar-Sanchez et al, 2010). Tandis que plusieurs autres études ont rapporté des fréquences
faibles (Tableau 18).
Tableau 18 : Tableau résumant les fréquences de développement des inhibiteurs chez les
patients présentant la micro-inversion de l’intron 22.
Population Fréquence de développement des Références

étudiée inhibiteurs
Asie
Chine 3,5 % (Xue et al, 2010)
Inde 4% (Jayandharan et al, 2005)
Iran 20% (Boekhorst et al, 2008)
Liban 4,34% (Djambas Khayat et al, 2008)
Taiwan 12,5% (Chen et al, 2010)
Amérique
Etats-Unis 26,8% (Miller et al, 2012)
Costa Rica 50% (Salazar-Sanchez et al, 2010)
Mexique 21,4% (Mantilla-Capacho et al, 2007)
Europe
Allemagne 38% (Oldenburg & Pavlova, 2006)
Autriche 16,4% (Reitter et al, 2010)
Espagne 27% (Casana et al, 2008)
Hollande 15% (Gouw et al, 2011)
Italie 25% (Margaglione et al, 2008)
Portugal 7,7% (Silva Pinto et al, 2012)
L’absence de développement des inhibiteurs chez certains patients présentant la

micro-inversion de l’intron 22 a été retrouvée dans notre étude. De plus, ce même résultat a
été également observé dans plusieurs études (Tableau 18).
L’ensemble de ces constatations confirme que le type de mutation du gène F8 n’est

pas le seul facteur de risque et suggère l’implication d’autres facteurs génétiques dans le
développement de ces inhibiteurs. Des polymorphismes au niveau des gènes codant pour
différentes cytokines ayant des effets modulateurs de la réponse immunitaire ont été
impliqués. Des associations entre les polymorphismes des gènes du système HLA, du TNFA,
d’IL10 et du CTLA4 avec le développement des inhibiteurs ont été rapportées.
Les polymorphismes des trois premiers gènes HLA, du TNFA et de l’IL10 ont été rapportés
comme prédisposant tandis que le polymorphisme du gène CTLA4 était considéré comme
protecteur.
Hormis ces facteurs génétiques, plusieurs autres facteurs liés au traitement

(type de produit utilisé, intensité du traitement et les interventions chirurgicales) ont été
également impliqués (Franchini et al, 2013; Gouw & Fijnvandraat, 2013; Gouw et al, 2011).
Il serait donc intéressant de réaliser une étude d’association entre le type de mutation du gène
F8, les polymorphismes des gènes (HLA, du TNFA, d’IL10 et CTLA4) et le développement
des inhibiteurs anti-FVIII en stratifiant les résultats en fonction des facteurs liés au traitement.
III. Prédiction in silico des effets délétères des mutations responsables

de l’HA dans la population Algérienne
La nature de la mutation est fondamentale pour évaluer son caractère pathogène.

Les mutations non-sens et les micro-délétions entraînent généralement un décalage du cadre
de lecture responsable de l’apparition d’un codon stop prématuré. La présence de ce codon
stop prématuré empêche toute synthèse d’une protéine tronquée par la dégradation de
l’ARNm via le mécanisme NMD. Le caractère délétère de ces mutations est donc admis.
En revanche, les effets délétères des mutations faux-sens ou celles localisées au niveau des
sites donneurs et accepteurs d’épissage sont sujettes à discussion essentiellement si elles sont
responsables de forme sévère de la pathologie.
C’est la raison pour laquelle les effets délétères des deux nouvelles mutations
rapportées dans cette étude (c.5219G+1>T, c.2189G>A) et celle uniquement citée dans la
base de données HAMSTerS (c.200A>C) ont été prédits par différents logiciels
bioinformatiques.
L’impact de la mutation c.5219+1G>T sur l’épissage a été prédit à l’aide de deux

logiciels de prédiction in silico (HSF, ESE Finder). Le logiciel HSF permet d’évaluer l’impact
potentiel des mutations sur les sites donneurs et accepteurs d’épissage. Tandis que le logiciel
ESE Finder permet de prédire l’effet de la mutation sur les motifs de reconnaissance et de
fixation des protéines SR (SF2/ASF, SC35, SRp40 et SRp55).
L’épissage consiste à un regroupement des exons présents sur un pré-ARNm.

Ce processus nécessite la reconnaissance des exons, l’excision des introns, puis l’union des
exons pour former un transcrit mature. En dehors des sites consensus majeurs d’épissage (les
sites donneurs, les sites accepteurs d’épissage et le site de branchement), l’existence de sites
mineurs a été rapportée. Ces séquences mineures d’épissage recrutent des facteurs favorisant
ou défavorisant l’inclusion d’un exon. Les séquences ESE représente les sites mineurs
d’épissage les plus étudiés. Les ESE sont des éléments qui sont très variés en termes de
séquence et qui constituent des sites de fixation spécifiques de protéines régulatrices de
l’épissage, parmi lesquelles les protéines SR (Cartegni et al, 2003). Ces protéines sont des
facteurs d’épissage essentiels et multifonctionnels, requis à différentes étapes de l’assemblage
du spliceosome (Graveley, 2000).
L’analyse de la mutation c.5219+1G>T par HSF a prédit l’abolition du site donneur

d’épissage. De plus, ESE Finder nous a permis de prédire que cette mutation est responsable
de l’abolition de sites de fixation des deux protéines SR : SRp40 et SF2/ASF.
L’épissage aberrant associé a cette mutation c.5219+1G>T est donc du à l’abolition du

site donneur d’épissage et la disparition des sites de fixation des deux protéines SR : SRp40 et
SF2/ASF. L’utilisation du site donneur d’épissage de l’exon 13 et le site accepteur d’épissage
de l’exon 15 entraîne un saut d’exon 14 (Figure 62).
Figure 62 : Conséquence prédite de l’impact de la mutation c.5219+1G>T sur l’épissage.
Le saut de l’exon 14, probable conséquence de la modification du site donneur de

l’intron 14, résulterait en une délétion du domaine B. En effet, le domaine B est entièrement
codé par l’exon 14. Cette délétion entraînerait une modification conformationnelle avec une
perte de la fonction de la protéine. Une étude fonctionnelle et structurale de la protéine FVIII
reste nécessaire pour confirmer avec exactitude le rôle de cette mutation sur l’épissage.
D’autre part, le caractère pathogène des mutations faux sens a été évalué par différents
logiciels de prédiction in silico. Ainsi, Les effets délétères des mutations faux-sens sur la
stabilité ont été évalués par I mutant 2.0. Tandis que les effets de ces dernières sur la fonction
protéique ont été prédits par trois logiciels différents (SIFT, Polyphen et Align GVGD).
La stabilité d’une protéine est évaluée par le calcul d’énergie ; plus le champ de force
de l’aa est grand, moins la protéine est stable. D’autre part, les logiciels de prédiction des
effets de mutations sur la fonction protéique reposent sur trois approches de prédiction
(le calcul du score matriciel de Grantham, les différences des propriétés physico-chimiques et
l’analyse de l’état de conservation inter-espèces du résidu étudié). Les résultats obtenus par le
logiciel I Mutant 2.0 sont en faveur d’un effet déstabilisant des deux mutations sur la protéine
FVIII. De même, les logiciels (SIFT, Polyphen2 et AGVGD) ont prédit des effets délétères
des deux mutations sur la fonction de la protéine FVIII.
Toutefois, ces différents résultats obtenus sont généraux et ne spécifient pas les effets
exacts des deux mutations. C’est pour cette raison qu’une modélisation moléculaire en 3D par
le logiciel Swiss PDB Viewer a été réalisée.
La nouvelle mutation (c.2189G>A) a été prédite comme responsable de la rupture du

pont disulfure Cys630-Cys711 localisée dans le domaine A2. Seules les cystéines sont
impliquées dans la formation de cette liaison. En effet, un pont disulfure (S-S) est une liaison
covalente forte qui, par oxydation, réunit les fonctions thiol de deux cystéines dans une
protéine. Le remplacement d’une cystéine par un autre aa abolit cette dernière. La rupture du
pont disulfure (Cys630-Cys711) est responsable de la dissociation du domaine A2. Cette
dissociation représente un des mécanismes responsables de l’inactivation de la protéine FVIII.
D’autre part, la mutation c.200A>C a également été analysée par Swiss Pdb Viewer.
Les résultats obtenus ont montré que l’effet délétère associé à cette mutation réside
essentiellement aux changements des propriétés physico-chimiques des deux aa.
Ces changements sont responsables de perte des interactions moléculaires ayant des effets
déstabilisants au niveau de la structure de la protéine FVIII.
La combinaison de ces logiciels est très informative pour la prédiction in silico des
caractères délétères des nouvelles mutations. Les études structurales in silico permettent
d’évaluer le retentissement des mutations sur la structure ainsi que la fonction de la protéine;
il est intéressant d’en confronter les résultats d’étude in silico avec ceux des études
fonctionnelles afin d’évaluer les fonctionnalités des nouvelles mutations. Toutefois, cette
dernière approche est rarement utilisée en pratique de diagnostic génétique car elle est très
lente, coûteuse et nécessite une équipe spécialisée.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Au terme de ce projet de recherche, les anomalies moléculaires responsables de l’HA
dans l’échantillon constitué de 23 patients hémophiles appartenant à 18 familles ont pu être
caractérisées. Ces mutations regroupent la micro-inversion de l’intron 22, la micro-inversion
de l’intron 1 et six mutations ponctuelles. Aucune délétion, insertion ou tout autre
réarrangement du gène F8 n’a été détecté dans cet échantillon de patients. Toutes les
mutations identifiées dans cette étude sont spécifiques à chaque famille à l’exception de la
micro-inversion de l’intron 22 du gène F8 qui est la plus fréquente (57,89%). Deux nouvelles
mutations ont été détectées dans cette étude. Ces mutations n’ont jamais été décrites
auparavant et semblent être spécifiques à la population Algérienne.
Cette étude confirme que la grande majorité des mutations responsables de l’HA sont
des mutations spécifiques à chaque famille. C’est probablement la raison pour laquelle, de
nouvelles mutations sont encore dépistées malgré le séquençage extensif du gène F8 par de
nombreuses équipes depuis plus de 20 ans.
La suite logique de ce travail serait de proposer à toutes les femmes appartenant aux
familles à risque un test de détection du statut conductrice. La connaissance de ce statut
pourra, d’une part, rassurer les femmes non conductrices et d’assurer, d’autre part, une
meilleure prise en charge de la mère conductrice et de son enfant lors de l’accouchement.
Ce qui pourrait prévenir le risque de mortalité causé principalement par les hématomes et les
hémorragies intracrâniennes chez les nouveau-nés.
Cependant, la stratégie d’identification des mutations utilisée a permis la mise en

évidence des mutations responsables de l’HA chez uniquement 85,71% de l’échantillon
étudié. Pour les cas restants, le déficit en FVIII pourrait résulter d’une variation intronique,
d’une modification épigénétique essentiellement la méthylation de l’ADN ou à des mutations
des gènes dont le rôle n’est pas encore déterminés.
Les résultats obtenus dans la première partie d’étude confirment d’une part l’absence
de sites privilégiés de mutations au niveau du gène F8 et témoignent la complexité des
anomalies responsables de cette pathologie.
Compte-tenu de l’absence de mutation identifiée chez trois patients, nos travaux de

recherches futures vont s’orienter vers l’identification des anomalies moléculaires
responsables de l’HA chez ces patients.
Grâce au développement des techniques de séquençage haut-débit (le next generation
sequencing), il va devenir possible d’analyser l’ensemble des régions introniques du gène F8
et ainsi de caractériser les anomalies moléculaires à l’origine de cette pathologie.
Par conséquent, les travaux futurs devraient également étudier la méthylation de l’ADN chez
ces patients. Pour cela, un traitement des ADN au bisulfite suivi d’un pyroséquençage est
envisagé.
Les travaux réalisés lors de la deuxième partie de cette thèse ont permis de déterminer
les fréquences de développement des inhibiteurs dans notre échantillon. Ainsi, nous avons
rapporté l’absence d’association entre le type de mutation du gène F8 et le développement des
inhibiteurs dans cet échantillon. Toutefois, les résultats retrouvés restent à confirmer sur un
plus large échantillon.
Au jour d’aujourd’hui, les études de prédisposition génétique au développement des

inhibiteurs apparaissent encore délicates compte-tenu de la rareté de cette complication.
Il apparaît donc nécessaire de poursuivre ce travail par l’élargissement du recrutement des
patients à tous les services d’hématologie au niveau du territoire Algérien.
Des études de grande envergure portant sur l’implication d’autres gènes du système
immunitaire (HLA, TNFA, IL10 et CTLA4) dans le développement des inhibiteurs seront
également envisageables. Ceci serait un apport à la compréhension des mécanismes
physiopathologiques à l’origine de cette complication dans notre population. Les résultats
de cette étude fourniront des informations précieuses pour les hématologues sur les risques
spécifiques du développement des inhibiteurs chez les hémophiles Algériens.
Une connaissance approfondie de la nature des facteurs de risque majeurs de cette
complication permettrait la définition d’une stratégie de prévention adaptée aux spécificités de
la population Algérienne.
Dans la troisième partie de cette étude, nous avons contribué à la compréhension des
mécanises moléculaires à l’origine du déficit de la protéine FVIII. Ainsi, les effets délétères,
des nouvelles mutations identifiées dans la première partie de cette étude
(c.5219+1G>T et c.2189G>A) et celle uniquement citée c.200A>C, ont été prédits en utilisant
une combinaison de logiciels d’étude in silico et de modélisation moléculaire en 3D.
La mutation c.5219+1G>T a été prédite comme responsable d’un saut de l’exon 14 qui
se traduit au niveau protéique par la délétion du domaine B. D’autre part, la mutation
c.2189G>A est responsable de la rupture d’un pont disulfure ayant comme effet la
dissociation du domaine A2 responsable d’une déstabilisation du FVIII. La mutation
c.200A>C a été prédite comme délétère au niveau de la structure ainsi que la fonction du
FVIII à cause des changements des propriétés physico-chimiques entre les deux aa. Ceci est
responsable de la perte des interactions moléculaires au sein du FVIII.
Cette étude a permis de démontrer l’efficacité de l’utilisation associée de plusieurs

outils prédictifs afin d’évaluer les effets délétères des nouvelles mutations. Ce protocole
pourra être utilisé pour la prédiction des effets délétères des mutations responsables de
plusieurs maladies génétiques.
La compréhension des mécanismes moléculaires associés aux différents

dysfonctionnements de la protéine FVIII est essentielle au développement de nouvelles
stratégies thérapeutiques. Les recherches concernant cette thématique sont actuellement
dirigées selon deux orientations. La première a pour objectif de corriger les anomalies
moléculaires sous-jacentes par thérapie génique. Tandis que la deuxième est destinée à
rechercher des molécules thérapeutiques du FVIII plus stables.
Les études in silico permettent d’évaluer le retentissement des mutations sur la

structure et la fonction de la protéine; il est intéressant d’en confronter les résultats d’étude in
silico avec ceux des études fonctionnelles afin d’évaluer les fonctionnalités des nouvelles
mutations.
ANNEXES
ANNEXE 1
Prescripteur :
Nom et prénom :
Intuition :
Formulaire de consentement éclairé pour participation à une étude génétique
A remplir si vous accepter de faire partie de cette étude

Nom :
Prénom :
Né(e) le :
Je soussigné certifie avoir reçu oralement les informations nécessaires pour

comprendre l’intérêt de cette étude et que ce qui me sera demandé de faire dans le cadre de
ma participation.
J’ai pris note des bénéfices de cette étude et accepte à cet effet de donner un
prélèvement sanguin.
Les données qui me concernent restent confidentielles et je n’autorise leur consultation
que par les personnes qui collaborent à cette recherche, sous la responsabilité du chercheur
investigateur. Ces données seront conservées dans un dossier confidentiel qui sera gardé par
le chercheur investigateur.
Les frais de l’étude seront pris en charge par l’investigateur.
Date : Signature :
ANNEXE 2
FICHE RENSEIGNEMENT HEMOPHILIE

A joindre impérativement à tout prélèvement d’ADN en vue d’un génotypage
d’hémophilie A
Identité du patient : Prescripteur :

Nom et prénom : Nom et prénom :
Date et lieu de naissance : Institution :
Hémophilie A □ Hémophilie B □
Taux du Facteur : activité coagulante :…………%
Cas : □ Sporadique
□ Familial
Sévérité : □ Sévère
□ Modérée
□ Mineur
□ Indéterminée
Anticoagulant circulant (inhibiteur) oui □
non □
Si oui, titrage :………………… □ < 5UB
□ > 5UB
Une étude familiale a-t-elle déjà été menée ?
Oui □ non□ ne sais pas □
Si oui dans quel laboratoire ?
…………………………………………………………………………………………………
Noms des autres hémophilies ou membres de la famille étudiés :
………………………………………………………………………………………………
Une mutation responsable de l’hémophilie a-t-elle déjà été identifiée ? Oui □ □ non
Si oui description de la mutation :…………………… …………………………………….....
ANNEXE 3
Extraction de l’ADN par le kit stratagene
Jour 1
 Décongeler les prélèvements à température ambiante du laboratoire
 Compléter avec la Solution de Lyse des Rouges (SLR) 1X jusqu’à 30 ml
 Mélanger par retournements
 Agitation 10 mn sur le Rotamix, de 20 trs/mn, ou agiter très violemment
 Mettre dans la glace pendant 15min
 Centrifuger 6 mn à 4°C, 3000 trs/min
 Vider le surnageant
 Recommencer 1 ou 2 fois le lavage (mettre dans la glace à chaque fois ; le temps que
la centrifugation d’une série d’échantillons soit terminée)
 vider le surnageant
 Laver les culots avec la 15 ml de la solution suivante (une fois) :
* 2.5 ml de la solution 1 du kit
* 5 ml d'eau
* 7.5 ml de SLR 1X
 Agitation sur le rotamix pendant 10 mn, ou agiter très violemment
 Centrifuger 6 mn à 4°C, à vitesse maximale entre 5300 trs/min et 6000 trs/min
Refaire un lavage si nécessaire
 Vider les surnageants (au maximun, si le culot ne se détache pas retourner le falcon
sur papier)
 Reprendre les culots avec 1,5 ml de solution 2
 Ajouter 4 µl de pronase (protéinase K 225ng/µl)
 Remise en suspension des culots avec une pipette Pasteur stérile
 Incuber une nuit à 37°C, au bain-marie
Jour 2
 Laisser les tubes 15 min à température ambiante
 Mettre les tubes 10mn dans la glace
 Ajouter 500µl de solution 3 dans chaque Falcon
 Agiter et bien homogénéiser, laissez dans la glace pendant environ 30 min
 Répartir 1.5 ml / eppendorf
 Centrifuger 15 mn à 4°C, 10000 trs/min
 Mettre 2 µl de Rnase (à –20°C) dans falcon 15ml
 Transférer les surnageants dans les falcons contenant la Rnase et agiter
 Incuber 15 mn à 37°C, au B.M
 Ajouter 4 ml d'éthanol absolu à –20°C
 Agiter doucement par retournements
 Laver les méduses à l'aide d'une pipette pasteur dans deux bains d'éthanol à 70°
 puis un bain d'éthanol absolu
 Déposer la méduse dans un eppendorf
 Sécher pendant 30 mn
 Réhydrater par du TE 1X (entre 100 et 400 µl, selon la taille de la méduse. Tapoter
l'eppendorf pour agiter).
 Laisser se réhydrater à 4°C
ANNEXE 4
Code Séquences des amorces des 26 exons du gène F8 Taille des

amplimères (bp)
5’UF8EX1 gtagcgcgacggccagtTAGCAGCCTCCCTTTTGCTA 480/514
3’UF8EX1 cagggcgcagcgatgacCTAACCCGATGTCTGCACCT
5’UF8EX2 gtagcgcgacggccagtCATTACTTCCAGCTGCTTTTTG 290/324
3’UF8EX2 cagggcgcagcgatgacTTTGGCAGCTGCACTTTTTA
5’UF8EX3 gtagcgcgacggccagtGCATGCTTCTCCACTGTGAC 299/333
3’UF8EX3 cagggcgcagcgatgacGCCACCATTACAAAGCACAC
5’UF8EX4 gtagcgcgacggccagtCATGTTTCTTTGAGTGTACAGTGG 372/406
3’UF8EX4 cagggcgcagcgatgacTTCAGGTGAAGGAACACAAATG
5’UF8EX5 gtagcgcgacggccagtTCTCCTCCTAGTGACAATTTCC 259/699
3’UF8EX5 cagggcgcagcgatgacCCCATCTCCTTCATTCCTGA
5’UF8EX6 gtagcgcgacggccagtGCGGTCATTCATGAGACACA 258/292
3’UF8EX6 cagggcgcagcgatgacCCGAGCTGTTTGTGAACTGA
5’UF8EX7 gtagcgcgacggccagtTGTCCTAGCAAGTGTTTTCCATT 400/434
3’UF8EX7 cagggcgcagcgatgacAATGTCCCCTTCAGCAACAC
5’UF8EX8 gtagcgcgacggccagtCACCATGCTTCCCATATAGC 484/518
3’UF8EX8 cagggcgcagcgatgacATGGCTTCAGGATTTGTTGG
5’UF8EX9 gtagcgcgacggccagtTTTGAGCCTACCTAGAATTTTTCTTC 300/334
3’UF8EX9 cagggcgcagcgatgacGGTATTTTAGAAACTCAAAACTCTCC
5’UF8EX10 gtagcgcgacggccagtTTCTTGTTGATCCTAGTCGTTTT 250/284
3’UF8EX1 0 cagggcgcagcgatgacGCTGGAGAAAGGACCAACATA
5’UF8EX11 gtagcgcgacggccagtCCCTTGCAACAACAACATGA 362/396
3’UF8EX11 cagggcgcagcgatgacTTTCTTCAGGTTATAAGGGGACA
5’UF8EX12 gtagcgcgacggccagtTGCTAGCTCCTACCTGACAACA 298/332
3’UF8EX1 2 cagggcgcagcgatgacCATTCATTATCTGGACATCACTTTG
5’UF8EX13 gtagcgcgacggccagtCATGACAATCACAATCCAAAATA 364/398
3’UF8EX13 cagggcgcagcgatgacCATGTGAGCTAGTGGGCAAA
5’UF8EX14A gtagcgcgacggccagtCTGGGAATGGGAGAGAACCT 567/601
3’UF8EX14A cagggcgcagcgatgacATGTCCCCACTGTGATGGAG
5’UF8EX14B gtagcgcgacggccagtGATCCATCACCTGGAGCAAT 599/633
3’UF8EX14B cagggcgcagcgatgacGGGCCATCAATGTGAGTCTT
5’UF8EX14C gtagcgcgacggccagtAGCTCATGGACCTGCTTTGT 695/729
3’UF8EX14C cagggcgcagcgatgacCATTCTCTTGGATTAATGTTTCCTT
5’UF8EX14D gtagcgcgacggccagtTCCAAGCAGCAGAAACCTATT 595/629
3’UF8EX14D cagggcgcagcgatgacAGTAATGGCCCCTTTCTCCT
5’UF8EX14E gtagcgcgacggccagtGGATGACACCTCAACCCAGT 570/604
3’UF8EX14E cagggcgcagcgatgacCCTTCCACGAGATCCAGATG
5’UF8EX14F gtagcgcgacggccagtTCCCTACGGAAACTAGCAATG 337/371
3’UF8EX14F cagggcgcagcgatgacATTTTGTCCCTCATTTATTGCT
5’UF8EX14G gtagcgcgacggccagtTTTTGTCCCTGAACGCTTGTG 408/442
3’UF8EX14G cagggcgcagcgatgacTCACAAGAGCAGAGCAAAGG
5’UF8EX15 gtagcgcgacggccagtTGAGGCATTTCTACCCACTTG 299/333
3’UF8EX15 cagggcgcagcgatgacCCAAAAGTGGGAATACATTATAGTCA
5’UF8EX16 gtagcgcgacggccagtTTTTGTCGTTATTGTTCTAC 468/502
3’UF8EX16 cagggcgcagcgatgacAAAGCTTCTTATTGCACGTAGG
5’UF8EX17 gtagcgcgacggccagtcAGGTTGGACTGGCATAAAAA 397/431
3’UF8EX17 cagggcgcagcgatgacCCCTGGATCAAGTCTCATTTG
5’UF8EX18 gtagcgcgacggccagtTGGTGGAGTGGAGAGAAAGAA 362/396
3’UF8EX18 cagggcgcagcgatgacAGCATGGAGCTTGTCTGCTT
5’UF8EX19 gtagcgcgacggccagtAACCAATGTATCTCATGCTCATTTT 248/282
3’UF8EX19 cagggcgcagcgatgacGGAAGAAAGCTGTAAAGAAGTAGGC
5’UF8EX20 gtagcgcgacggccagtTTTGAGAAGCTGAATTTTGTGC 228/262
3’UF8EX20 cagggcgcagcgatgacGAAGCATGGAGATGGATTCATTA
5’UF8EX21 gtagcgcgacggccagtCCACAGCTTAGATTAACCTTTCTCA 295/329
3’UF8EX21 cagggcgcagcgatgacTGAGCTTGCAAGAGGAATAAGTAA
5’UF8EX22 gtagcgcgacggccagtTCAGGAGGTAGCACATACAT 280/314
3’UF8EX22 cagggcgcagcgatgacGTCCAATATCTGAAATCTGC
5’UF8EX23 gtagcgcgacggccagtTTGACAGAAATTGCTTTTTACTCTG 294/328
3’UF8EX23 cagggcgcagcgatgacTCCCCCAGTCTCAGGATAACT
5’UF8EX24 gtagcgcgacggccagtACTGAGGCTGAAGCATGTCC 250/284
3’UF8EX24 cagggcgcagcgatgacCCCAACCACTGCTCTGAGTC
5’UF8EX25 gtagcgcgacggccagtTGGGAATTTCTGGGAGTAAATG 300/334
3’UF8EX25 cagggcgcagcgatgacAAGCTCTAGGAGAGGTGGTATTTTT
5’UF8EX26 gtagcgcgacggccagtCTGTGCTTTGCAGTGACCAT 557/591
3’UF8EX26 cagggcgcagcgatgacTTCTACAACAGAGGAAGTGGTGA
Code Séquences d’amorces du promoteur et 3’UTR Tailles des

amplimères (bp)
5'UF8Prom1 gTA gCg CgA Cgg CCA gT GAGCTCACCATGGCTACATTC
3'UF8 Prom1 CAg ggC gCA gCg ATg ACAATTTAAAACTATAAAGCGAGTCCTG 561
5'UF8Prom2 gTA gCg CgA Cgg CCA gT GGACCTAGGCCATGGTAAAGA
3'UF8 Prom2 CAg ggC gCA gCg ATg AC TGCAGAGCATTTTAAGGAACTTT 600
5'UF8UTR1 gTA gCg CgA Cgg CCA gT GTCACCTCTCCCTCCTCAGC
3'UF8UTR1 CAg ggC gCA gCg ATg AC TTCTACAACAGAGGAAGTGGTGA 313
5'UF8UTR2 gTA gCg CgA Cgg CCA gT GGAGAAACCTGCATGAAAGC
3'UF8UTR2 CAg ggC gCA gCg ATg AC TTGGCCATCACAAATTTCAA 596
5'UF8UTR3 gTA gCg CgA Cgg CCA gT TGCAAATGTGCATTTTTCTGA
3'UF8UTR3 CAg ggC gCA gCg ATg AC CCTCCAGCCCCCTTTACTAT 580
5'UF8UTR4 gTA gCg CgA Cgg CCA gT CCACCCCCATAAGATTGTGA
3'UF8UTR4 CAg ggC gCA gCg ATg AC CTGAAGAAACCAGCAGGAAAA 580
5'UF8UTR5 gTA gCg CgA Cgg CCA gT CCCCAAAGGTGATATGGTTTT
3'UF8UTR5 CAg ggC gCA gCg ATg AC TCAGTGTTCACATTTTTATTTCCA 230
ANNEXE 5
Tableau résumant les codes et les masses moléculaires des aa

(http://www.imgt.org/IMGTeducation/Aide-memoire/_UK/aminoacids/abbreviation.html )
Acide Aminé Abréviations Masse moléculaire (Da)

Alanine Ala A 89
Arginine Arg R 174
Asparagine Asn N 132
Aspartic acid Asp D 133
Asparagine or Aspartic acid Asx B
Cysteine Cys C 121
Glutamine Gln Q 146
Glutamic Acid Glu E 147
Glutamine or Glutamic acid Glx Z
Glycine Gly G 75
Histidine His H 155
Isoleucine Ile I 131
Leucine Leu L 131
Lysine Lys K 146
Methionine Met M 149
Phenylalanine Phe F 165
Proline Pro P 115
Serine Ser S 105
Threonine Thr T 119
Tryptophan Trp W 204
Tyrosine Tyr Y 181
Valine Val V 117
Da : Dalton
ANNEXE 6
Tableau résumant les caractères hydrophobes des aa
(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/learning-center/amino-acid-
reference-chart.html).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
A
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة التـــــعليم الــعالي و البحث الــعــلمي‬

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la

Soutenu le 11/09/2014, devant la commission d’examen composée de :

Qualité Nom et Prénom Grade Etablissement d’origine

Président Mme SAIDI-MEHTAR Nadhira Professeur USTOMB (Oran)

Cette thèse représente une contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la

‫اهليموفيليا (أ) ‪، PCR،‬الطفرات‪.F8 ،FVIII،‬‬

Mes remerciements s’adressent en premier lieu à Madame le professeur SAIDI-MEHTAR

Mes remerciements les plus respectueux vont à Monsieur le professeur BOUDJEMA

Mes remerciements s’adressent également à Monsieur le Professeur BABA-HAMED

Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur SAHRAOUI Tewfik. Vous me faites le

Je tiens également à remercier Monsieur le Professeur TOUHAMI Hadj. Vos compétences

Je remercie vivement Monsieur le docteur LE BONNIEC Bernard pour m’avoir si

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements:

3’UTR: Région 3’ non traduite

Figure 2 : Représentation schématique des différentes étapes d’hémostase primaire, adaptée

Figure 3: Représentation schématique du mécanisme de fibrinolyse, adaptée d’après (Boneu

Figure 4: Représentation schématique de la cascade de coagulation classique, adaptée d’après

Figure 5: Représentation schématique de l’étape d’initiation de la coagulation in vivo, adaptée

Figure 6: Représentation schématique de l’étape d’amplification de la coagulation in vivo,

Figure 7: Représentation schématique de l’étape de propagation de la coagulation in vivo,

Figure 8: Représentation schématique de la transformation de fibrinogène en monomère de

Figure 9: Représentation schématique des systèmes majeurs de régulation physiologique de

Figure 10 : Représentation schématique du système inhibiteur APC. A. Activation de la

Figure 11: Mode de transmission de l’HA. A. Descendance d’un homme hémophile,

Figure 14: Représentation schématique expliquant les étapes de synthèse et sécrétion du

Figure 15 : Représentation schématique de la structure primaire du FVIII.

Figure 16 : Représentation schématique des sites de clivage au niveau de la protéine FVIII

Figure 17 : Représentation schématique des sites d’activation et de la structure activée de la

Figure 18 : Représentation schématique des mécanismes d’inactivation de la protéine FVIII.

Figure 19: Représentation schématique de différents sites de clivage lors de l’inactivation

Figure 20: Représentation schématique du lieu et mécanisme de clairance. A. Constitution

Figure 21: Représentation schématique des structures tridimensionnelles du FVIII. D’après

Figure 22 : A. Structure tridimensionnelle des domaines A du FVIII. B. Structure

Figure 23 : Modèles moléculaires des domaines A. A. Composition des sous-domaines A,

Figure 25 : Représentation de la structure des domaines C du FVIII. A, d’après (Ngo et al,

Figure 27: Sites d’interaction du domaine C2 avec la membrane phospholipidique, d’après

Figure 28: Sites d’interaction impliqués dans la liaison du FVIIIa à la membrane

Figure 32: Représentation schématique du mécanisme responsable de micro inversion de

Figure 33: Représentation schématique du mécanisme responsable de la micro-inversion de

Figure 35: Représentation schématique des larges délétions responsables d’HA,

Figure 37: Mécanismes simplifiés de la réponse immunitaire responsable du développement

Figure 40: Représentation schématique des deux FVIII thérapeutique Kogenate®

Figure 42 : Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de

Figure 43: Représentation schématique du profil électrophorétique des résultats de détection

Figure 44: Représentation schématique du principe de détection de la micro-inversion de

Figure 45: Représentation schématique du profil électrophorétique des résultats de détection

Figure 46 : Représentation schématique du principe de séquençage, d’après (Read et al,

Figure 47 : Représentation schématique des différentes étapes de MLPA

Figure 48 : Résultat de l’analyse de la mutation c.5219+1G>T par le logiciel HSF.

Figure 49 : Représentation de distribution des motifs de fixation des cinq protéines SR au

Figure 50 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel I-Mutant 2.0.

Figure 51 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel SIFT.

Figure 52 : Exemple de résultat obtenu par le logiciel PolyPhen-2.

Figure 53: Exemple de résultat obtenu par Align GVGD.

Figure 54: Localisation de la lysine 48 et cystéine 711 au niveau de la structure

Figure 57 : Les structures schématiques de la lysine et la thréonine.

Figure 58 : Les structures schématiques de la cystéine et la tyrosine.

Figure 61: Représentation schématique du mécanisme de la méthylation, adaptée d’après

Figure 62 : Conséquence prédite de l’impact de la mutation c.5219+1G>T sur l’épissage.

Tableau 1 : Classification de la sévérité de l’HA selon les recommandations de la société