Microscopie

Semaine 13 septembre
Semaine 27 septembre
Cours 1
38) Il ya diff type d’eclairage
40)micro a epi-illumination :source de lumiere arrive par l’objectif pour exite
l’ech ensuite la lumiere est reflechi et repart :donc ici on ne traverse pas
reelllement l’ech,on parle aussi d’episcopie ( diastopie autre)exp :pour ce type
de micros il ya de lampes a mercure l’avantage de cette lampe c’est la lumiere
blanche tt les spectre sont représente et exite aussi dans les uv
44)raie laser=exite a une longuuere d’onde c’est une lumiere ici
monochromatique ,avantage des laser solide=ça ne chauffe

Cour 2-3
3) Les éléments du microscope
Oculaire grossisse fréquemment plutôt de 10x ,nécessaire de régler
l’écartement des oculaires, on peut rajoute dans certain oculaire une lame
d’étalonnage qui permet de faire des mesures.
6) on retrouve sur les objectif l’ouverture numérique (savoir ou ça se situe à
peu près) épaisseur des lamelles en générale entre 0,13 et 0,17.
7)ouverture numérique peut être définir de deux manières donc meilleur est
l’ouverture numérique ,plus l’objectif peut récupérer de la lumière.
8)problème des objectifs :aberration chromatique :ici lumière blanche si ça
passe par l’objectif il n’y a pas de pb mais quand ça passe en bordure on peut
avoir des phénomènes de réfraction , on n’a donc une mauvaise résolution de
l’image
9) avec correction on peut rétablir une focalisation de ces diff rayonnement sur
un point et avoir une image bcp plus nette ,on place donc une lentille
divergente qui va refocalise les points , il y a des qualités de verre diff(pas à
retenir)
10)il y a des mode achromate et Apochromat (diff structure)
11) aberration géométrique de planéité : plan qui va corrige souvent quand un
rayonnement passe en bord de lentille au lieu de ce focalise sur un point plan il
y a des rayonnements qui vont focalise un peu avant et parfois un peu après on
obtient donc pas quelque chose de plan et ces systèmes de correction permet
de les corrige.
14)les diff type de correct achromate=corrige sur 1 couleur Apochromate =
corrige sur plusieurs couleurs
15)le condenseur :sert à focalise la lumière sur l’échantillon et se règle
manuellement ,il ne récupère pas de la lumière mais fait passer la lumière
16)le condenseur de position sur le plan focale
Diagramme de champ permet de régler la largeur des rayonnements qui vont
traverser l’objet et arrive jusqu’à l’objectif, nécessite un bon réglage
20)diagramme d’ouverture : permet d’ajuste le cône de lumière a l’ON
L’ouverture numérique du condenseur doit correspondre à celle de l’objectif ici
exemple 0,4 et 0,4
ON est grand plus la distance de travail baisse
26)on parle de plan de vibration à partir d’une source lumineuse
28) quand on monte en longueur d’onde on baisse en énergie (inversement
proportionnel)
31) une onde se propage
33) interférence : (lorsque on parle d’onde lumineuse on peut aussi parle de
phase),ces ondes en opposition de phase peuvent se recombiner on parle
d’interférence destructrice ,si les onde sont en phase elles vont s’additionner
Réflexion diffuse :ce qui permet de voir des objets :la couleur que on voit elle la
couleur qui n’as pas été absorbe
39)absorption (on peut avoir des filtres d’atténuation de lumière bleu)
40)ici on voit que la vitesse baisse de plus en plus ,on peut définir diff milieu ou
angle de réfraction change suivant l’indice de réfraction (c’est la déviation d’un
rayonnement continue)
En moyenne la traverse d’un objet biologique induit un retard ¼ mais peu
perceptibles à l’œil nu
44)avec objectif a immersion d’huile il n’y pas de phénome de réfraction on ne
perd pas bcp d’onde.
Le verre un objet dispersif qui vas séparer des longueurs d’onde
On peut noter n=vitesse dans le vide/la fréquence x la longueur d’onde

Cours 4
L’énergie peut prévenir d’une onde lumineuse on parle de photoluminescence
c’est le cas de la microscopie.
Diapo 4) Chimiluminescence : la mol luminol qui vas être ajoute et qui sera le
substrat de la peroxydase ,cette peroxydase on peut l’associe a des anticorps
secondaires dans des manipulation de western blot ,donc la peroxydase en
présence de peroxyde d’hydrogène et de luminol il y aura oxydation de luminol
et qui ensuite pouvoir remettre de la lumière. C’est une application de
chimioluminescence.
Bioluminescence : c’est de la chimiluminescence dans un organisme vivant
exemple : la luciférase
Diapo 5) Fluorochrome : pour toute substance
chimique ,synthétique ,biologique(comme des protéines ) elles ont la capacité
d’emmètre à la suite d’une excitation à réémettre de la lumière donc on aura
pour cette molécule des longueurs d’onde qui permet d’exciter la mol et pour
faire qu’il y a absorption ,excitation et ensuite rémission (la lumière remise est
toujours dans des longueurs d’onde plus grand car il y a une perte d’énergie)
Diapo 6) exemple l’isothiocyanate (NITC) : c’est une molécule chimique que on
peut coupler a des anticorps secondaires ,la fluorescence est souvent du a la
présence de double liaison carbone dans les cycles ,ici on n’a le spectre
d’absorption ,ici on n’a un pic d’absorption ,elle est excitable dans la lumière
bleue et ce pic est optimale mais aussi optimale ailleurs (la hauteur du
pic(l’amplitude) traduit l’intensité lumineuse émit)
Déplacement de stokes :c’est ce décalage de spectre d’émission par rapport au
spectre d’excitation, (absorption et excitation se confond dans le cas des
fluorochromes et ensuite ce sont les spectres d’émission).
Diapo 8) ici on n’as une excitation qui ne se fait pas au max et qui se faite dans
la monte du spectre on existe ici à 440 , 460 ,on voit que le pic d’émission est
moins haut ,mais !il faut savoir que le pic d’émission est place au même endroit
mais il est moins haut (donc moins forte émission de lumière car l’excitation est
moins efficace mais le pic reste au même endroit) donc on excite au maximum
ou un peu en amont en fonction des longueur d’onde l’émission sera plus ou
moins importante mais dans les même couleur et positionne au même endroit .

Diapo 9) mol DAPI(mol chimique) : capable de ce fixe sur ADN ,avec une
excitation dans le UV et une émission en lumière bleu.
GFP(protéines pas chimique ) :émission en lumière vert
=>Donc ensemble de molécule que on peut coupler a des anticorps secondaires
Diapo 10) molécule fluorescente dans la nature ,auto-fluorescence dans les
tissus végétal vont être gênant
Chlorophylle :mol qui a des capacités dans la fluorescence (pb des c végétal il
peut y avoir des bruits de fond de mol auto-fluorescence )
Diapo 11) ici fluorochrome synthétique :dans la série des Alexa (mol très stable)
existe dans tt les longueurs d’onde .
Camdote basse sur les nm particule
Diapo 13) pas à retenir les chiffres: retenir qu’il y a des rendements quantiques
diffèrent suivant ces mol et pour la brillance il faut faire rentre le Coeff
d’extinction ,on voit de plus des rendements en brillance diffèrent.
Diapo 14 ) molécule fluorochrome peuvent être couple à des anticorps.
Diapo 15) les protéines fluorescentes :protéine purifie qui ont été excite
exemple :GFP (protéines qui prévient d’une méduse qui entraine une émission
dans le vert).
Diapo 16) trois cherche qui a travaillé sur cette GFP et ont obtenu des prix
Nobel de chimie
Diapo 18) comment est excite la GFP dans la méduse ? protéine aequorine qui
va jouer avec une luciférine qui en présence de d’O2 et de calcium la mol qui
est excite et qui permet d’exciter cette luciférine qui vas émet de la lumière
dans le bleu et cette lumière vas permettre d’excite la GFP présent dans la
méduse dont sur la partie gauche est représenter un phénomène de
biolumineuse dans lequel intervient l’aequorine, une luciférine qui est excite en
présence O2 et calcium et qui vas emmètre en lumière bleu pour cette fois ci
excite la GFP et là on passera en fluorescence. GFP : faire intervenir une phase
de bioluminescence !
Diapo 19) petite protéine ,elle a cette capacite de se replier en forme de
tonneau qui fait la protéine est relativement stable
Diapo 20) La GFP c’est une protéine pas chimique ! la GFP peut être considère
comme un fluorochrome et la partie responsable de la fluorescence est appelé
fluorophore (donc pour les autres mol le terme se confond la mol est à la fois
fluorochrome et fluorophore mais pas pour la GFP car pour la GFP le
fluorophore c’est en fait 3 acide aminé qui sont cyclise et oxyde et qui sont
responsable de la fluorescence post 65 66 67 on parle aussi de chromophore
car selon les variant de GFP on peut voir des émission dans des longueur
d’onde diffèrent.
Diapo 21) paramètre de la GFP : stabilité au niveau de la température et du ph
Peut résister à plusieurs agents dénaturants ,elle garde son chromophore actif
après fixation avec des aldéhyde ,GFP reste sous forme monomérique.
Diapo 22) LA GFP sauvage (native)a un pic dans les UV
Diapo 23) Ensuite il y a eu un travail de mutagenèse ponctuel donc la serine en
positionne 65 est remplacé par une thréonine donc par rapport à la GFP native
elle a une excitation dans le bleu et vert émission a donc gagne en efficacité.
Diapo 25) On peut aboutir à des dérives de GFP : YFP , BFP etc. avec des
rendements de brillance diffèrent.
Diapo 26) Discosoma sp (DsRED) :qui a un peu une structure comme la GFP
mais qui ont une fluorescente dans le rouge ,donc protéine avec fluorescent
dans le rouge ne sont pas les dérive de GFP mais sont dérive de cette protéine
DSred isole initialement de corail.
Diapo 28) le fluorochrome peut avoir des propriétés de fading :
(photoblanchiment)donc ici on n’a couplé anticorps a la mol FITC qui remet
dans le vert après avoir été excite dans le bleu et là on obtient l’excitation
pendant 5min on voit un phénomène de perte de fluorescence donc FITC
moins stable on peut aller jusqu’à perte de la fluorescence.
Bleaching : c’est irréversible ,on perd la fluorescence car oxydation du
fluorochrome en présence de lumière
Quenching : ça peut être réversible ,diminution par des molécule présent dans
la préparation
29)il faut toujours préserve ces fluorochromes et limité les éclairages .
Graphique :l’intensité en fonction du temps d’éclairage baisse rapidement ici
Alexa sont très stable ,on peut aussi jouer avec des anti-oxydants :qui permet
de stabilise
Cours 5
Diffèrent type de microscopie photonique :
1) Dans un microscope classique la lumière vient
par le bas sur la platine on parle de diascopies de
transillumination puisque la lumière a traversé
l’échantillon.

Le terme épi-illumination :vient d’épiscope c’est-à-dire va a arrivé par le dessus ,excite le fluorochrome et celui
vas remettre de la lumière . La source de lumière est au niveau de la lampe et donc la lumière par des jeu de
lentille de miroir va venir excite l’échantillon à travers l’objectif d’où le terme d’épi-illumination ,la lumière
est réfléchie retraverse l’objectif par des jeu de miroirs lentille , le fait que ce soit en épi-illumination minimise
et évite la lumière parasite donc ça permet d’avoir quelque chose avec un bruit de fond diminue.

3)Nécessite d’utilise des bloc filtre (car on n’a dit que la lumière d’excitation est une dans une longueur
d’onde et que la lumière d’émission est dans des longueur d’onde plus grande ce qui causse des décalages
de spectre d’émission par rapport au spectre d’absorption/excitation.
Donc système de bloc filtre qui va permettre de discrimine(sépare) entre la lumière d’excitation et
d’émission. Le bloc filtre il a 3 éléments :le filtre d’excitation et le filtre d’émission(arrêt) et le miroir
dichroïque. Et dons chaque bloc filtre va être adapte spécifiquement à un fluorochrome ,donc va falloir
choisir stratégiquement le bloc filtre.
Le miroir dichroïque : va servir a réfléchi la lumière d’excitation.
Filtre d’excitation :ne laisse passer que les longueurs d’onde dans le vert et ce rayonnement est réfléchi
par le miroir dichroïque ,travers l’objectif et viens excite le fluorochrome et le fluorochrome il a la
capacite de remettre dans le rouge
Le miroir dichroïque : a également la capacite de stopper la lumière réfléchie par l’échantillon donc le
miroir dichroïque on lui donne une valeur de longueur d’onde et en dessous de la longueur d’onde sera
stopper et ce qui sera au-dessus pourra traverse !
7) Diffèrent type de filtre qui existe :ici Narrow Pas laisser passer petite fenêtre de longueur d’onde(pic
étroit ) et c’est assez peu utilisé les autres avec le même principe :ici on récupère des courtes longueurs
d’onde

Long pass :c’est à partir d’une valeur en longueur d’onde c’est longueur peuvent traverse le filtre avant
cette valeur elle ne traverse pas ce filtre donc on récupère des grandes longueurs d’onde

Band pass( appelé fenêtre de longueur d’onde) : entre une valeur et une autre valeur on récupère les
longueurs d’onde , avant elle ne traverse pas , après elle ne traverse pas et ne traverse qu’entre 2
longueurs d’onde donner !
 9)on reprend l’exemple de la GFP sauvage ,pour excite ici on peut utiliser un filtre BP375-450 (BP :bande
pass)on laisse passer des longueurs d’onde qui permet de bien excite cette GFP sauvage ,on peut utiliser
un autre filtre pour récupère des longueurs d’onde réémise :c’est vraiment le pic d’émission de cette GFP
sauvage :donc ici on deux filtre (2bande pass),pour l’excitation et pour l’émission
Entre le pic d’excitation et le pic d’émission le miroir dichroïque a une valeur 475 et donc en dessous de
475 tout la lumière d’excitation sera bloquée ,ne pourra pas traverse donc ce qui est avant ne peut pas
traverse et ce qui est après traverse. Donc ça sert à éliminer la lumière réfléchie d’excitation pour qu’elle
ne traverse pas le miroir.

10) FITC et E-EGFP molécule que on excite dans le bleu et qui émet dans le vert on peut mettre un BP et
un LP qui permet de récupère tt ce qui est au-dessous de 515 ici pic d’émission en rouge et pic d’excitation
en orange.
13) Alexa 488 qui va emmètre dans le vert, on n’excite pas forcément au pic d’excitation mais un peu
avant !mais lorsque que on excite trop en amont la lumière émise devient trop faible pour pas
(chevauche) et bien discrimine entre le spectre d’émission et d’excitation ici la BP qui récupère la
lumière bleue puis le miroir tout ce qui est en dessous est stopper et au-dessus passe comme ici le
vert .on cherche le bon filtre adapte.
15)microscope Nikon Eclipse : on peut ouvrir le filtre avec 4 tigettes ,la lumière vient par le dessus
16) utilise pour la localisé des macromolécule ,acide nucléique etc.
17) filtre multi bande : on peut obverse 2 voire 3 fluorescences diffèrent ,ici peut excite 2 fluorochromes
18)microscope confocale : ce permet de faire des coupes optiques dans la cellule on devra récupère de la
lumière que du plan focal qui nous intéresse la lumière au-dessus et en dessous est stopper par un
système appelé Pinhole ,image est donc bien contraste ,donc l’intérêt de ce microscopique est de faire
des coupes optiques dans l’épaisseur de la cellule et ensuite de faire des empilements d’image pour
reconstituer un volume en 3D de la cellule !
20) dans le cas des microscope normale ( à fluorescence conventionnelle):on récupère la fluorescence pas
simplement du plan focal et crée un fond flou
Microscopie confocale :on n’a un système qu’on n’appelé pinhole c’est petit trou et ne traversera ce petit
trou que la lumière du plan focale que nous avons sélectionné et tt ce qui est au-dessus et en dessous ne
traverse pas on obtient bien quelque chose contraste et pas gêné par les lumières parasite.
De plus en microscopie conventionnelle on n’éclaire un champ large or en microscopie confocale on
éclaire un champ ponctuel en fait le microscope va balayer l’échantillon
21) graine de pollen microscope convent :on n’est gêné par la lumière qui vient du dessus ,dessous du
plan focal mais l’autre on voit mieux :on arrive à distinguer es structure ,on peut balayer bien dans les 3
axes
22) en microscopie confocal les source de lumière c’est des laser ,ici exp de plusieurs laser (attention
laser=une seule longueur d’onde, relai laser=une longueur d’onde de la lumière )
23) photomultiplicateur qui récupère la lumière rouge ou bleu ici
24) en confocale la lumière est acquis en noir et blanc et restituer en suite par colorisation !!
Ici on peut injecte la tubuline fluoresecnte (on peut faire des film)
25) on peut ensuite colorier ses image ,la on fait exprrime dans les cellules des genes ,
26) ici on mtn sur un immunomarquage a confocale
28 ) tableau diif en epi conv et epi confocale

vivant mort coupe colore fin epais refrigent fluorescent immnomarquage

Epi fluo conv Oui Oui oui non oui non nan oui oui
Epi flou oui oui oui non oui oui nan oui oui
confocale

Contrainte de penetrance ?oui il ya aura lorsque on fait de l’ummnomarqunafe dans les cellule fixer il faut
tenir compte des IGg
Il y a diif etpae pour réaliser une immunomarquage dans les cellules mort (a savoir)
 Il faut considere sont materiel biologique :cellules ont des propriete diiff par exp la cellules animale
adhere directement a la mb ou les fongique et les cellules vegetal possède des paroi donc cellules animale
a des etape en moins.

Protocole de fixation :il y a la paroi a traverse et le mb cytoplasmique a traverse

33) Le marquage direct n’est pas utilise en general mais le marquage secondaire oui, il ya plusieurs ac
secondaire qui se fixe

Cours 22/10 :mitose
Quand il y un dérèglement dans chaque de ces destine ceci crée des
dérèglements comme des cancer
4 phase principale du cycle cellulaire eucaryote
S :réplication de l’ADN duplication du matériel de la cellule
M :Division du noyau(matériel génétique) et division du cytoplasme qui a lieu
en fin de mitose
Qui aboutit à la formation de deux cellules fille parfaitement identique
Ces phases sont séparées par des phase G (G1 etG2) G=Gap
Ces phases vont permettre à la cellule de croit et de prépare la phase suivante
Quand une cellule n’est pas en mitose on dit qu’elle est en interphase (G1 G2
et S)
Cellules lors qu’elles sortent du cycle elle rentre soit en quiescence (de quelque
min voire tt leur vie) besoin d’être réactiver par des signaux
La sortie du cycle peut aussi être la différenciation cellulaire
Cycle mitotique ou cycle chromosomique=car ce que on voit c’est la
modification du génome
Noyau interphasique en phase G1 : a une quantité d’ADN haploïde
Duplication Pour arrive à G2 à des chromosomes a deux chromatide (diploïde)
et commence à se condense
En fin de prophase : il y a rupture de l’enveloppe nucléaire pas membrane et
entre en métaphase
En métaphase :les chromosomes on atteint leur maximum de
condensation ,alignement sur le plan équatorial
Anaphase : très rapide ,séparation des chromatide sœur, partage égale du
matériel génétique
Télophase : formation de la nouvelle enveloppe nucléaire de chacun des
noyaux des cellules filles et décondensation
Associe à la séparation du noyau on n’a aussi Séparation du
cytoplasme :cytocinèse ,cytodiérèse ,cytokinèse
D6)les cellules animales ou les levures lors de la cytocinèse vont être sépare par
un anneau contractile on parle de la formation d’un sillon de division
Or dans la cellule végétale ,pas d’étranglement mais Il va avoir construction
d’une paroi qui venir sépare les 2 cellules filles , et cette construction se fait
grâce à une formation appelé phragmoplaste (qui est constitué de
microtubule )qui vont permettre aux vésicules golgiennes de crée cette
nouvelle paroi
Ordre de grandeur 24 en moyenne , 10 a 30h animale ,
7) On peut aussi se focalise sur la quantité d’ADN par phase
Chromosome a 1 chromatide en G1(haploïde ou 2C)
Phase S (duplication)
G2(quantité 4C)
Séparation lors delà télophase on revient en phase haploïde
Peut-être identifie par de marquage d’ADN ou des cyrtométrie de flux(voir td)
8) check point : 3 points de contrôle ou de vérification vont assurer 3 choses :
-Vont faire en sort que chaque évènement ne se produisent qu’une cellules
fois ,
- vont en sort que l’ordre des événements soit unique et
-vont assurer que chaque évènement est irréversible pas de retour en arrière
Le bon déroulement d’une phase va dépendre du bon déroulement de la phase
précédente
Point de contrôle en G2 , G1(si tous les point vérifie peut passer en phase S )et
M(si tout est vérifiée la cellule peut sortie de la mitose)
Système de vérification de la croissance ,
Si tt ces points sont vérifiés , l’ADN continue en phase s
Spindle ou mitoctic ; veut dire fuseau
10)omnis cellula e cellula robert et Theodore l’avait déjà émis bien avant
Rudolf mais théorie a été attribué à Rudolf
1953 :ils ont utilisé du matériel végétale (tissu méristématique)et du
phosphate 32 ,ont pu montrer qu’il y avait 4 phases
Il on estime à 30 h la dure de mitose
Même à l’époque ils ont réussi a bien détermine la durée du cycle
53 : même année que Watson Crick
11) Paul nurse : a travaillée sur homologue de cdc2
Cycline :prot régulatrice est kinase
12) l’idée est de travailler sur du matériel homogène en termes de phase du
cycle cellulaire
L’idée est de génère des cellules synchronise par des cultures de cellules : sont
produit par des drogue qui sont réversible
Autre possibilité est de trier les cellules :grâce à une technique qui s’appelé le
fax qui combine un trier de cellules, et une cyrtométrie de flux de cellules
(FACS)
On utilise aussi des ovocytes :l’idée est de fusionne les cellules ,traitement
chimique au Pegg ou on utilise un choc électrique
La fusion de cellules résulte un hétérocaryon(cellules avec 2 noyau distinct
dans le cytoplasme)
Ils ont vu que la fusion entre S et G1 va induire G1 en S
Même avec S et G2 = là le noyau G2 continue son programme ,Même chose
avec G1 et G2
Donc dans le cytoplasme de la cellules S il y a un signal qui va induire la
transmission vers la phase S il y a une stimulation de la phase S
Cependant sur une cellule en G2 qui a déjà réplique sont ADN la stimulation ne
marche pas, il y aura un blocage de cette stimulation
13)on n’a fusionné une cellule en métaphase avec une cellules en interphase
Ici en G2=les chromosomes sont induits en mitose et rupture de l’env.
nucléaire
G1= il y aura quand une induction vers la mitose
On obtient des chromosomes a un seul chromatide
S= induction aussi
Donc il existe un signal dans les cellules mitotique qui vont induire quel que soit
le stade de la cellule induire la mitose
14) ovocyte : l’ovogenèse montre 2 arrêts normaux donc l’ovocyte de
grenouille lorsqu’il est produite il est bloqué en prophase de méiose1 ce
blocage va être levé s’il y a un signal de hormonales qui vas permettre la fin de
la méoise1 et méiose 2
Et c’est en métaphase de méiose 2 que se déroulera le 2eme arrêt, et ce
blocage ne pourra être levé que si un sperm vient féconde cet ovocyte
On voit donc qu’il y a des facteurs qui existe qui vont stimule la progression
de la méiose et des facteurs qui vont stopper
15)Masui et Markert il ont prélevé à partir d’un ovocyte mature bloque ne
métaphase 2 et injecte ce cytoplasme d’un ovocyte bloque en prophase 1
Ils ont observé l’induction de la mitose ( MPF)
Ils ont fait la même chose mais a partir de cellules d’embryon
Blastomère contrôle non injecte: embryogenèse c’est mise en place
Mais blastome injecte : reprise de la mitose et blocage en métaphase
MPF : il induit aussi la mitose
CSF : a été aussi mis en évidence
16)modèle levure va permettre d’identifier la nature de ces signaux , on peut
détermine dans quelle phase se trouve la cellules grâce à sa structure
Auteur vont génère les bandes de mutant à partir d’ONS qui va induire des
mutations
La mutation peut provoquer : la mort de la cellule
On peut génère des mutant conditionnelle , mutation conditionne par la
température (on parle de mutation thermosensible) , la mutation ne vas pas
s’exprime à température thermosensible donc la levure mutante va se
comporte comme une cellule sauvage
17) levure mutante va se comporte comme une levure sauvage cependant
cette levure mutant si on la place à une haute température on part de
température non permissible ou restrictive dans ce cas la mutation s’exprime
L’auteur on fait une réplication de leur structure, et vont voir à quel stade
s’arrête les cellules mutées
Donc on repart de la levure mutée ,on le maintien bien à température
permissible et on la transformer avec des plasmides qui sont porteur de gène
de levure sauvage (mutation de complémentation)
Levure s’arrêt tri en G1
Auteur ont identifié une centaine des gène CDC
Lorsque on applique une température non restrictive elles vont tous s’arrête
dans une même phase du cycle :caractéristique d’u mutant CDC
22)complexe CDK- cycline
Progression du cycle cellulaire est assure par l’activité cyclique des pot kinase
dite cycline dépendante, et que l’activité de ces CDK est conditionne par leur
interaction avec les cyclines
Donc c’est ce complexe qui aura une activité kinase qui va cible des substrats
23) CDK ont été identifié chez des levure initialement chez les levures il n’y a
qu’une seul CDK on parlera ce CDK1 , chez les mammifères et les plante il y a
plusieurs CDK implique dans le cycle cellulaire
Fonction des CDK est de phosphoryle un substrat , elle va constituer l’unité
catalytique du complexe, c’est kinase vont phosphoryle leur substrat sur un
résidu serine ou thréonine
Cdk présent une grande homologie ,tt les CDK pressent un site de liaison a la
cycline appelle pstaire
24) structure des cdk , les cdk sont des protéines , et sont représenter par 2
lobes un petit lobe qui correspond à la parie Nterm et gros lobe qui est
Cterm ,ces deux lobes vont délimiter un sillon et cela va correspondre au site
catalytique de cette kinase
De plus devant le site catalytique , l’entrée de ce sillon ,au sein de l’hélice on
observe une boucle T car elle joue un rôle important dans la fonctionne des cdk
La CDK2 est inactive à l’état car boucle T va bloque le site catalytique de la
kinase
25) au cours du cycle ,il y a différentes cyclines vont être exprime a un moment
donné ,de plus chez la levure il n’y a qu’une seul CDK donc c’est bien
l’association de la CDK1 avec l’une ou l’autre de ces cycline qui vas donner la
spécificité de phosphorylation au complexe CDK-cycline
Ces cyclines présentent également des domaines structuraux voir diapo
26) Cette régulation est transcriptionnelle et protéique dont réguler à 2
niveaux
Ont utilisé une drogue qui les bloque en phase s pour vérifier dans quelle
phase du cycle se trouve la cellule il utilise un test l’incorporation de thymidine
triécie , ils vont détermine l’index mitotique : c’est une frq, ration donc c’est
une frq de cellules en mitose :permet de savoir dans quelle phase du cycle se
trouve les cellules qu’il prélève
Il observe donc que Cycline A sont spécifique de la phase s
Et cycline B de la phase mitose
Autre :prot qui sont détecter  :par technique de western blot et il détecter 3
cyclines et les CDK et montre aussi que cycline A caractérise la phase S ,la
cycline E est associée à la transition G1/S
Les cdk au cours du cycle cellulaire sont exprimé de manière constante et
plutôt en excès par rapport aux cyclines
27) ici cycline B1 donc les cyclines B sont caractéristiques de la phase M ,on
observe NES connus pour transporte le noyau vers le cytoplasme , on voit la
localisation subcellulaire
De plus il y a 2 séquences(D-box et KEN-box) qui vont être reconnu par la
machinerie de protéolyse ubiquitine-dépendante
29)La formation des complexe CDK-cycline dépend de la disponibilité des
cyclines et donc on distingue les cycline G1/S lors de la transition G1 et S et
ensuite elles ne sont plus exprimées puis les cycline S qui commence à être
produit en fin de G1 jusqu’à début de la phase M et ensuite les cycline M(B)
dont la synthèse commence presque en fin de phase S ,ces cyclines vont
s’accumuler pendant toute la phase G2 pour avoir un pic d’expression en
mitose puis vont être dégrade subitement
Donc MPF= correspond au complexe CDK1-cycline B chez les vertèbres
31)2 niveaux de régulation activateur
1er niveau :il faut que la CDK interagisse avec son partenaire activateur la
cycline (ne suffit pas pour être active)
2eme niveaux :il va falloir que la CDK sont phosphoryle par CAK(une autre CDK)
va phosphoryle une thréonine
Cette activation par la CAK est elle-même conditionner par d’autre
phosphorylation , en fait des complexe CDK cycline comme MPF vont être
produit au niveau du cytoplasme et quand ils sont produits au niveau du ctyo il
sont inactif car ils sont au niveau de la CDK phosphoryle par des phosphates
inhibitrice se sont des phosphates(2P) positionne sur la thréonine 14 et Tyr 15
32) ces phosphates sont mis en place par une kinase appelé W1 :donc W1
entraine deux phosphates inhibiteurs sur la cellule
CDC25 qui vont spécifiquement hydrolyser ces phosphates inhibiteurs pour
permettre l’activation du complexe cdK
33)ces complexe cdk cycline sont accumule pendant l’interphase dans le
cytpo et sont inactive et c’est seulement quand un signal activateur va venir
qu’ils seront actifs et vont rentrer dans le noyau
34)on peut suivre la loc subcellulaire le signal est principalement
cytoplasmique
35) régulation négative :font intervenir des CKI , chez les vertèbres et les
plantes on n’a : 2 familles de CKI
37) lnk4 agit que sur la phase G1,chapote uniquement cdk
CIP/KIP elle chapote tout le complexe ,agit sur G1-S et S
42)protéolyse est sélective et irréversible
Ub qui va être active par E1 puis transporte à E2 puis à E3(assure la spécifié
de substrat)
39) 2 classes de E3Ub ligase
APC responsable de l’ubiquitination de cycline B

Cours 02/11/2021
On appilque pluto ades pett structure
14) B-glu en présence d’un substrat va donne quelque chose de
bleu ,c’est quelque chose de très discret
15)on eput révéler l’hybridation dans les tisssu
On eput aussi révéler un messager
17)marquage a l’or colloidal :
Technique on eput reintisifie le signal en ajoutant de l’argent
18) en negatif on voit mieux les image
Ici c’est negatif
19) or coll est plutôt colorer même en lumiere blanche ,les bille
peuvent avoir diff taille ,on eput faire des comarquage
20) on n’avait pas traite la polarisation
21) la polarisation
La lumiere vibre dans t les direction est inchorent garce a la
polisiration on va garderun plan de vibration de la lumiere car la
lumiere va vibre dans tt les sens
22) on selection un seul plan qui va donner une lumier coherent
23)Polarisation très utilise en geologie
On rajoute l’analyseur
24) quand le plan de vibration arrive perpendiculaire il ne peut pas
traverser
25) peututlise par micro constrante differeenciel
Ici on place un cristal anisotope le rayonnement va être divisere n 2
et prend un angle de 45°
Un plan de vibration arrive et division en 2 et la on va pouvoir
observe
Dans le syteme de pol en geologie il ont une platine tournant
26)lumiere est stocker par l’analyser o voit noir
Ici on peut avoir du passage de lumierer
Soit c’est stopper complement soit ca passe completement
27) on voit qu on fait bienla diff entre les 2
Donc en fnct du type de cristal on n’a une diff
28)on eput aussi s’en servi pour des objet biologique
Ici les grain d’amidon,pour ceratin structure on peut utiliser..
29) onpeut appliquer la pol a des truc fibrilliare
Polarisation vivant pas trj (donc oui ou non)
32) micros a constrate de phase
Aug les constrate des rayonnement qui ont été diffracet par
l’echantillon
Ici destructive mais également constructive
Decalege ¼ très peu pereceptible a l’œil :mais il y en a
Anneua de phase peut être ajouter
33) il ya une deviation des rayonnelent par diffraction cela permet de
faire passer ces rayonnement dans un anneau qui va les modifie
On peut sélectionner les position
34) la matiere en le bleu et les gris ers diff
Et en blanc c’ets vide
35) chaque anneau représenter..
Ce ne sont des micros diff tt ces système sont sur le même micros et
sélectionner ce que on veut
36) la lumier diffracteur passe au centre , on n’a pas le même decalge
de phase en bout de course
Declage de x= va enelevr de lumiosite sera plus grise
¼ par echantillon et ¼ par la plaque qui sont ajoute
Il traverse l’echant er est difracet permet de faire des interference
destructive et constructive
37) constrase de phase sont des variation eput perecpetible a l’œil
qui accentue ces retard de phase
38) il faut bien aligne l’anneau entre la source de lumiere et l’objectif
Coupe fin ou fine : preponderant pour les constraste de phase
Dic recomnade pour les cellules épaisse
Impression de relief mais qui n’est pas un vrai relief c’est un pseudo
relief
42)prisme permet de diviser le rayonnemente n deux ,si pas
d’interference on retombe sur le même plan de
44)c’est les transition de milieu que on va mettre en évidence
On altere du frsi claire et grsi noir c’est ca qui donne le relief
Résultante ets horizonatle et donc stopper a l’analyseur
45) si impression de relief on n’est en dic c’ets vrmt adaote pour les
cellules epias
Anneau de phase on reamplifie ,on constrate l’ech
49) MET
50) On peut être au même grossisement avec les deux optique
52)il ay la notion de traitement sur la MET
55)fixation =peut induire des modification ,on peut faire du
crudecapage
56) electron qui vont permet de genere l’image
57) la c’est du VRAI relief en MEB
COURS C.MEIGNIN
Signalisation cellulaire
2°) cellule eucaryote a un cytoplasme et un noyau
Il y a 2 compartiment cellulaire un ou il y a le noyau et
l’autre ou il y a...
Il y a plusieurs signaux facteur de croissance vont plutôt
induire la division cellulaire
Hormone= Ptt mol hydrophobe vont diffus dans les c
MEC= exp lame basale ,peut induire la différenciation de
cellules épithéliale est important dans la signalisation
Jonction cellulaire=interaction cellules-cellules
Envir= ça peut être des stimulus mécaniques ,le non soi ,les
virus etc…
Pour percevoir ces signaux il y a 2 possibilités :soit les
signaux sont petit et peu diffuse dans la cellule
Sont les cellules sont gros ,nécessite de récepteur qui vont
interagir avec le ligand le ligand ne rentre jms dans le c
Comment une c va interpréter la signalisation cellulaire :
Elle peut la transcrire , il peut y avoir une régulation
traductionnelle ,modification métabolique (la
métabolomique)
La signalisation va donc emmener une réponse ,il y a 5 grand
type de réponse cellulaire
Exp la survie=exp les neurones (des signaux qui permet de
maintenir ces c)
Migration= il y a des signaux qui permet la migration par exp
réorganisation du cytosquelette
Mort cellulaire au même plan que prolifération
7)moyen que fait une cellule pour fonctionner
Ligand sont à l’ext de la c ,elles sont secrètes , elles vont
interagir avec des mol mbnaire
La cellule émettrice et réceptrice
Ligand est oblige de sortir de la cellule pour interagir avec le
récepteur
Il y a des c qui sont alois fois émettrice et réceptrice exp les
lymp T
Sont capable de s’auto contrôle
8) paracrine : la cellule exprime le ligand ,il sort de la cellule
et réagir d’autre récepteurs
Active la transduction uniquement dans les cellules
réceptrices
GF= facteur de croissance
Les fibroblastes sont capables de recevoir un signal PDGF
Cellules endothéliales n’ont pas de récepteur PDGF
9) certain ligand a besoin de passer par la circulation
Ligand est secrète doit passer par la circulation ,par exp les
hormone de croissance ,chondrocytes
10) il va falloir que la c émettrice et réceptrice rentre en
contact
Ligand reste accroche à la c émettrice mais expose à l’ext de
la c , permet d’avoir une interaction directe avec une cellule
qui a son recep, cette voie est importante dans la mort
cellulaire
Généralement dans l’apoptose nécessite d’un contact direct
Prot appelé sheddase =Prot qui a une activité protéasique
permet de détache le ligand des cellules, permet la
maturation du ligand ,va donc couper
Exp : TNF qui induit l’apoptose
Voie Notch= par exp inhibition latérale
11) exp de protéase qui vont clive ces ligands :les prot Adam
Prot Adam sous famille de sheddase : domaine
cytoplasmique ,un domaine trans mb , domaine
métalloprotéase =domaine qui a l’activité enzymatique prot
Adam vont rester à la mb ne sont pas à l’ext
Tt est une question probabilité entre la rencontre entre le
ligand et le récepteur
Lorsqu’elles vont rencontrer un ligand elles vont le clive,
permet la libération du ligand
12) prot Adam :intervient partout , elles peuvent aussi
couper des récepteurs pour arrête la signalisation
13) plusieurs types de stimulation
Stimulation synaptique : stimulation d’un neurone
14)tt les flèche à l’intérieur sont la transduction du signal ,il
y a plusieurs choses qui vont se passer dans le noyau et dans
le cytoplasme
15)le premier qui as montre les gènes et la drosophile c’est
Morgane= il a montré la preuve par expérience
Rita et Cohen = leurs travaux ont permis de connaitre les FC
Ont faire chez le bourgeon de membre chez la souris et chez
le poulet
Permet test biologique essentiellement sur les fibres
nerveuses
Premier FC qui a été isole est le NGF donc le bourgeon de
membre exprime NGF qui induit la prolifération des fibres
nerveuses
FC =ici sont des tt ptt mol
16)on essaye de comprendre quel facteur sont contenue
dans le sang
Ici n’a soit utiliser le sang ou les sous partie du sang : 2
possibilités
Avec le plasma =globule rouge et
Sérum= cellules ici ont exploser et se retrouve dans le cyto
donc tt ce qui a l’intérieur des globules rouge vont se
retrouve dans le sérum
Ils ont mis des fibroblaste NIH3T3 sur les cellules
Sur le sérum il y a une prolifération cellulaire
Interprétation= dans le sérum il y a un FC qui peut induire la
prolifération , en fait ce FC est synthétisé par les globules
rouges
17)on peut compter les cellules ,permet de déterminer la
croissance ou la prolif
On peut essayer de comprend l’effet mitogène avec
BRDU ,thymidine
18)MTT= mesure l’activité déshydrogénase des
mitochondries
19) mol fluorescent qui pénètre de façon rapide dans les
cellules
20)CFSE à savoir
21)c cible et leur action
Fibroblaste exprime les récepteurs du PDGF et le récepteur
du FGF
NGF induit plutôt la survie cellulaire
Il y a trj une combinaison ligand récepteur
22)facteur trophique= facteur qui induit la survie pas la
prolifération et la différenciation , si n on enlève cette voie
de signal on induit la perte des neurones ,on va arrêter de
réguler l’apopt
23)facteur chimiotactique :vont permettre au c de se
déplacer ,d’aller d’un endroit A à un endroit B
Si on injecte une grosse quantité de virus il va mourir ,il
injecte des chimiokines (cellules immunitaire ) puis réinjecte
la dose létale du virus =conséquence la cellule ne meurt pas
24)on obtient des cellules immunitaires qui sont tt issu des
mêmes cellules au départ
Un c est capable d’incorpore diff signaux et la somme de ces
signaux permet d’induire la prolif ou la différenciation
25) a qui servent ces FC
VEGF= implique dans l’angiogenèse
1ère étape dépend de chimiotactisme =résultant cellules
endothéliale va changer de former ,formation de
pseudopodes ,transformation permet réoriente le
cytosquelette
2 étapes = VEGF va induire la division cellulaire ,seul la c qui
a le pseudopode possède le récepteur VEGF
3 étapes= lorsqu’elle va se diviser elle va former des
vacuoles , et fusion vont permet au capillaire de faire une
nouvelle extension
26) on peut tester le VEGF en cellules = on met diff
concentration de ligand sur la cellule et on regarde la
radioactivité
Est-ce qu’il y a un effet de VEGF sur les cellules épithéliales
oui est ce qu’il y a trj un effet non pcq il faut un certain nbr
de récepteur VEFG active pour enclenche le système
Ensuit on arrive à un plateau car les récepteurs sont saturés
Il peut également avoir une décroissance avec des boucle de
rétrocontrôle lorsqu’il y a trop de signal
Cellules endo on les récepteurs de VEFG les fibroblastes
n’exprime pas le récepteur
27) pour regarder le prot qui exprime le ligand il va regarder
plutôt le mol pas les prot par exp l’ARN messager
Northern blot =pour ARN
Western blot=prot
Southern blot= ADN
Piste 1 2 et 3 sont en hypoxie (faible concentration en
oxygène=condition hypoxie)
Lorsqu’on enlève l’oxy il y a activation du VEGF
Les condition hypoxie vont induire la vascularisation :exp
une tumeur primaire
Comment est-ce que on peut voir si c’et les c tumorale qui
active les capillaires
28) 3 types cellulaires diff ici
Qu’est ce qui se passe si on bloque l’expression du VEGF ?
Comment il le bloque =il utilise des anticorps anti VEGF
Sur graphique formation d’une tumeur
On rajoute encore un anticorps anti-VEGF
Donc 2 possibilités soit l’hypothèse de vascularisation
(angiogenèse)est vrai soit c’est la prolifération des cellules
tumorales
29)si on rajoute l’ac n’affecte pas la prolifération des c’est
l’apport de vaisseau sanguin
C’est vrmt l’apport des vaisseaux sanguin qui affecte la
prolifération de la tumeur
30) première fois que on utilisait un anticorps thérapeutique
31)récepteur trj a al mb plasmique
Un récepteur est souvent composé de plusieurs
protéine(dimère ,homodimère, hétérodimère ),induit
FT :smad
32) nodal rôle dans l’assy droite gauche
33
2 diapos
Activation des récepteurs
Recp intra (hormone vont diffuse dans la c) et extra
cellulaire
3)P Chambon c’est qui a créé IGBMC
5) plusieurs hormones
6) récepteur nucléaire sont constitué : on un signal
d’adressage au noyau le NLS il vont activer directement la
transcription
Domain de liaison au ligand ,domaine de fixation à
l’ADN ,domaine de localisation nucléaire
7) ces recp sont trj dans le noyau on s’asure qu’il est inactive
on regarde sa conformation
Lorsque le ligand arrive il y a association des récepteur ,un
chgt de conformation ,chg du côté cytoplasmique du
recp(phosphorylation)
Prot coactive qui maintenir ces prot sous forme coactive
11)nécessité de faire des techniques avec des approche
structurel on prend la prot sans ligand et avec ligand , ici
ligand acide rétinoïque
12)recpt transmb
13) le recpt est très rarement sous forme dimère le ligand
arrive sa peut être un monomère ou un dimère ,il va
permettre de mettre ensemble les deux branches du
récepteur
Ligand va stabilise l’interaction entre les deux branches de
récepteur
C’est juste une histoire de probabilité et dans ce cas il aura
transduction du signal
15) EGF lui il est sous forme monomérique :pour active le
recpt
EGF qui vas activer une branche du récepteur , un autre EGF
qui vas activer l’autre branche du récepteur
Va induire un chg de conformation dans le
domaine cytoplasmique
Branche du récepteur qui va être active est phosphorylé
Phosphorisation de la partie cytoplasmique
48)modèle alternatif :ligand sous forme monomérique
change la dimérisation du récepteur
Diapo 2
Egf :Soit le ligand est sous forme monomérique
PDGF :Ou le ligand est déjà sous forme dimérique
2)Glycoprotéine qui vas aider à la formation du ligand
mature par exp le fgf ,pour que le ligand s’associe
correctement ,nécessite l’intervenante de prot ,prot trans
mb qui vas être associe à des sucres :protéoglycane ,va
permet de structure le ligand et le mettre sous forme
dimérique ,puis transduction du signal
3) Protéoglycane sont trj des disaccarides ,il en existe
plusieurs qui vont permettre soit de structure une c ,ou la
transduction du signal
Plusieurs formes de syndecance : existe sous plusieurs
formes, s’associe à ces disaccarides ,elle est
transmb ,présent à la surface ,permet d’associe le facteur de
croissance fgf
Betaglycan va permettre la transduction du signal par le tgfb
Protéoglycane :prot associe à des sucres
5)immuno- précipitation :
Exp le western blot
Co-immuno- même principe que western blot mais étape en
plus on ne prend pas tt les prot mais juste une partie, il y a
une sélection ,à gauche des extraits cellulaire des complexes
qui sont former ,on utilise un anticorps spécifique dirige
contre X, on utilise des bille ou colonne tt ce qui n’est pas
accrocher va descendre
On récupère X et tt les facteurs qui lui sont associe
6)FGFR (le récepteur)immuno- précis avec un anticorps
antifgfr puis western blot qui vas permettre de voir si on n’a
le récepteur ,on peut utiliser un anticorps qui reconnait
spécifiquement les tyrosine phosphoryle
On va incube les c ,soit avec le fgf ,soit avec des deux types
de disaccarides : héparine, disaccharide
Dans tt les conditions on n’a du fgf récepteur c’est normal , à
gauche il n’est pas phosphoryle ,à droite léger
phosphorylation
Combinaison de ligand fgf plus combinaison de sucre fait
que on va activer la phosphorylation case la dimérisation du
fgf avec l’héparine qui vas être au milieu
Pour activer le récepteur il faut phosphoryle la tyrosine
7)IL3 va s »’associer avance plusieurs branches de
récepteur ,on utilise de l’iode radioactif ,on introduit du DSS
permet des réaliser des pontages mais ici à la base de liaison
non covalente
On apercevoir 2 autre bande ce qui montre qu’il y a un seul
pontage qui a été réalisé mais de façon aléatoire
Alpha et beta car ils sont de poids moléculaire diff
On peut utiliser ma spectrométrie de masse :première étape
et de traitera avec la trypsine , puis à la fin pour chaque
peptide (ac) on n’a un spectre et une masse,
8)IL2 va agir avec 3 branches du récepteur , va cliver des
voies de signalisation
IL2 c’est une Ptt molle ,140aa ,il y a 3 Aa important dans
cette mol , tyrosine ,acide aspartique et glutamine
On peut réaliser entre des mutation , tyrosine permet
l’interaction avec la branche du récepteur alpha
Acide aspartique lui agit avec les récepteur beta ,la
glutamine est conserve au cours de l’évolution on doit teste
son importance
9)Pour teste la transduction du signal c’est de teste la
réponse cellulaire exp est ce que ça induit la réponse
cellulaire
Quand on faire des mutations on remplace l’aa on ne le
délète pas ,les IL2 mute en position 52,il y a trj de la
transduction
L’interaction avec la branche du récepteur alpha n’est pas
impliquée dans la transduction du signal en revanche la
réponse est plus faible ,donc branche alpha permet de
stabilise le ligand avec les récepteurs
Branche Beta :même explication donc la brache la branche
n’est pas nécessaire à la transduction du signal mais
nécessaire à la stabilisation du ligan et du recept
Alpha et beta n’intervient pas dans la transduction du signal
La glutamine en post 141 du ligand est essentielle pour la
transduction du signal (ici ligne en vert )montre bien que
c’est essentiel
10) Q141 réagir avec la 3 -ème branche du récepteur et
l’autre branche sert à stabilise les interactions
Gamma c’est lui qui permet la transduction du signal
11) dès qu’il y a interaction avec le ligand il y a remodelage
chgt de conformation et va permettre al transduction du
signal par gamma
Diapo 3
2)récepteur tyrosine kinase :sont les seul qui sont associe
avec une activité enzymatique ,domaine enzymatique
tyrosine kinase qui vont permettre la transduction du signal
Ces recp sont compose de 3 domaines
Domaine extra :association de 3 module possible (cystéine ,
fibronectine ,immuno- globuline)=domaine qui permette
l’interaction avec le ligand
Domain transmb
Domaine cytoplasmique=possède l’activité enzymatique ,soit
il est scindé en deux soit sur 1 seul =c’est domaine tyrosine
kinase ,permet des interaction prot prot
3)Bande de donner qui permet de rentre la séquence en
acide amine
4) si on prend recp Ykinase :domaine transmb sont de
domaine hydrophobe
5) on eput regarde si le recp est soit sous forme recp inactive
ou recp active ,on utilise des anticorps, on va faire un
immunomarquage DAPI
Si cellule non traite à gauche : les cellules expriment bien le
récepteur et est localise au niveau de la mb plasmique
Sur image en haut à gauche :le récepteur est présente sous
forme inactive
Les 2 images à droite :le recep est trj présent et est sous
forme active
Ou est-ce que le récepteur est localise ?
Ici cellules traite avec le ligand et c non traite avec le
ligand
D6) dimérisation du récepteur : on va utiliser le
récepteur de EGF
Savoir que c’est un recp Ykinase ,ici il y a tous les
domaine(domaine cyto,transmb,extrac ?)
On va modifie ce recep a créant des mutations(on n’ets
oblige de remettre le domaine transmb)
On utilsie soit la sauvage ,soit l’autre
On traite ces c avec de la ardiocativite et de la
methionine ,le fait de rajjoute de la M ,tt les prot qui
sont en synthese(neosynthse) vont integer ede la
radioactivite ,si radiocativite il y aura des pontage , on
fait ensuite un western blot apres pour detecetre
spécifiquement le gène, a gauche pas de DSS ,active ou
non par le ligand ,puis on ajoute du DSS qui va réaliser
des pontage entre les liaison cov ,on détecter trj a 170
et on détecter une autre branche a 340 =qui
correspond a 2 fois le récepteur
Le fait que on détecter encore a 17à signifie que soit le
pontage n’ets aps actif a 100% soit le recepteur est
toujours presnet
Prot tronque on mais du ligand et du DSS trois nouvelle
bande apparaissant = qui correspond a 340 pour le WT
et 290 sauvage tronque et 230 tronque tronque, donc
en ce qui concere l’interaction avec le récepteur :les
partie cytoplasmique et …sont complètement
indépendante
7) soit le récepteur fait de
l’autophosphorylation (chaque branche du recpetur est
independ ,chaque branche ets capable de phosphoyle
ces propre Y
Ou soit il va faire la trans P(le domaine va phospoyler
les Y de la branche qui est a cote , les deux domaine
communiquer l’un et l’autre
8) on fait la même expérience : le recpeteur est present
et non phoryle a 170 quand on ajoute du ligand il est
phospo on n’a eu brancehe en plus en 340 (montre que
il n’y a pas eu de pontage)
Quand on melange les recp tronque et suavage (on
eput pas voir la phospo sur une prot tronque car pas de
domaine cytoplasmique
Ici c’ets plutoy de la transphosphorylation , la phospos
du recepeteur EGF ce fait par transphosporylation
9)PDGFR :domaine immunoglobuline ,transmb et Y
kinase (scinde en 2) ,PDGF(ligand) déjà sous forme
dimère , induit la dimérisation et activation du
recept ,domaine cytoplasmique ou enzymatique est
enrichie par des Y :ces Y peuvent être phosphoryle dans
le domaine enzymatique et ça va réguler l’activité
enzymatique du récepteur
Si la phosphorylation se passe dans les domaines non
enzymatiques ces Y phosphorylé vont recruter des prot
cytoplasmique
Recept phospo = activation d’autre prot=activation des
kinases cytoplasmique ,il y a diff type d’aa peut être
modifie par les kinases ,modification post
traductionnelle ( qui apporte de la complexité a la prot
la conséquence physique va souvent être un chgt
conformationnelle , elles vont moduler la fnct mais pas
acquérir une autre fonction)
Messager secondaire : Domaines SH2 ou PTB dans les
domaines kid (non catalytique)=leur présence montre
que la prot réalise des interactions avec les Y
phosphorylé
D10)interaction dans les domaines non catalytiques
3 protéines :
- PI3Kinase =hétérodimère compose de P85 et P110
-GAP
-PLCY
Ce sont des messagers secondaires : qui sont des prot
cytoplasmique qui sont recruter sur ces Y phosphorylé
et qui vont permettre la transduction du signal ,elle
tous des domaine SH2 et interagie avec des Y phos
D11) La tyrosine kinase va phospo Y ,domaine SH2 sont
spécifique des Y phosphorylé du la présence de la
poche riche en arg qui permet d’interagir avec un cycle
aromatique de la Y
D12) phospo sensible : domaine qui interagisse avec de
molécule qui sont phosphorylé( SH2 PTB)
Domaine PH :elle interagisse avec des lipide phospo
14-3-3 interagisse avec des serine ou thréonine phospo
D14) T. Hunter : ici prot qui ont été digère ,et on fait
migre en fonction de la taille et de la charge (2D)
Il rajoute du P32 pour voir les phos ,puis fais un
changement de PH permet la séparation de ces 2 aa
montre ce ne sont pas les thréonines qui sont
phosphorylé mais les Y
74) PLC gamma : veut dire phospholipase C : c’est un
prot qui va couper des lipides
75) un des lipide cible est le PIP2 ,qui vas être clive en
DAG (reste au niveau de la mb plasmique)et IP3 (part
dans le cytoplasme) .Les deux vont avoir une fonction
complémentaire :Dag va activer la PKC(kinase
cellulaire) et IP3 va permettre le relargage du calcium
au niveau du RE et calcium va pouvoir active le PKC
17) libération de IP3 permet d’ouvrir des canaux calciques ,et
le calcium va interagir avec l’autre kinase qui est la pkc sui vas
pouvoir phos des prot
19) on utilise des sondes fluorescence (pas d’ac)pour détecter
le calcium cytoplasmique
20) les recept sont sensible à la concentration ext du calcium=
boucle rétrocontrôle pour arrêter la vague calcique et vont
inhiber les canaux
21)ionophore permet d’activer la libération du calcium du RE
et il n’y a pas de conséquence sur la prolifération cellulaire
Les deux mol DAG et IP3 doivent avoir un effet ensemble
22) fixation du calcium change de conformation
23) on utilise des mol fluorescente pour voir ce changement
de conformation
24) il faut savoir que ce n’est pas n’importe quel Y qui fixe le
mssg secondaire ,on sait exactement quel Y va fixer un mssg 2
Conséquence du recrutement de la PLCY sur le PDGFR on
peut par exp une mutation en bloquent la position 1009 ou
on peut faire un mutant PLCY
25) la PI3K : elle cible le phopoinositol en position 3 du cycle
sur la couche interne des mb cytoplasmique et va le phos
PI3K va phos PI4 en PI34
Ou encore PI45 et PI345
29)PI3K va transformer PIP2 en PIP3 qui va recruter des prot
comme PDK1 et PKB qui sont des kinase PDK1 va phos PKBAkt
ce qui va changer sa conformation et va repartir dans le
cytoplasme et va phos BAD (qui définir un destin cellulaire)
31) PH :domaine implique dans la reconnaissance des lipides
membranaire
( voir cours L1SPS SUITE)
115)src=prot tmb domaine SH2 ,phosphorylation sur les
tyrosines et la laisser en conformation ouvert ,puis autre
phosphorylation qui permettre un repliement et inhiber l’act
des Yk
PHS active vers une PHS inactive, dimérisation va entraine
l’interaction avec la protéine SRC,PHS dans le domaine YK qui
permet de maintenir ouvert et de stabilise
6)CSK :enzyme qui permet la PHS ,mutant du csk le tube
neural ne peut pas ce devp ,CSK n’est pas essentiel à la
formation des première organe la preuve on n’est arrivé
jusqu’au tube neural
On peut utilise du P32 la radioactivité et leur interaction sur
les prot,l’henolase cible de la famille des SRC on peut regarde
la PHS sur ces Prot, ici 3 mutants
Csk fait la PHS cible tt les Y de la famille SRC
Récepteur des intégrines n’ont pas d’activité enzymatique
utilise d’autre prot
(Voir cours L1SPS)
Apoptose
16) en MEB on peut observer la nécrose avec gonflement et
apoptose avec des corps apoptotique
17)clivage internucléosomale dans l’apoptose : on voir ici une
digestion de l’ADN
18)si on regarde au cours du temps ,on induit l’apoptose dans
les lymp qui ont recp appelé FAS qui active l’apoptose
Temps optimaux :6H pour clivage entre les nucléosomes
19) CAD qui coupe ADN entre les nucléosomes
20) on peut visualiser les cellules apoptotiques en
cyrtométrie de flux ( petite taille ,en aug en granulométrie )
21)En cyrtométrie de flux on peut aussi marquer l’ADN avec
une mol appelé Hoechst qui va marquer les extrémités et
permet de visualiser ADN ,pop réduit en taille et aug le
marquage heochst
22)aussi marquage tunel : on utilise un nucléotide marque et
une enzymatique appelé la terminal desoxy transfe qui
permet de mettre un nucléotide marquer sur les extrémités
3’OH de l’ADN
Il faut savoir que tous les événements en cyrtométrie de flux
sont compte (on peut avoir des c positive et négative)
Quand on regarde les c normale :ce sont des c négatif pour le
marquage tunel ,on peut fixer un seuil tel que tous ce qui est
à gauche est négatif et tout ce qui est droite positif
23)marquage PS :apparait en première peut voir la cinétique
DIAPO 2 APOPTOSE
3 )Elégance avantage :peut-être congeler
1090 c former à la naissance et 131 perdus par apoptose
4) apoptose ce n’est pas quelque chose par défaut c’est
quelque chose qui est induit ,programme ,on peut le tester
en prenant des insectes en métamorphose : schéma : J19
perte de masse musculaire du a l’apoptose, si on traitre avec
de ActD(actinomycine D)=qui va inhibe la transcription (on
inhibe la perte de masse musculaire)donc l’inhibition de la
transcription permet d’éviter l’apoptose donc apoptose est
quelque chose de programme et qui nécessite la transcription
Apoptose permet d’éliminer des c qui n’ont pas de fonction
et permet de modelé certain tissu
6) formation des membres passe par apoptose (on peut
utiliser acridine orange ),ou des marquage tunel
Apoptose sert de morphogène
8)acini mammaires : J6 cellule à l’intérieur de la sphère sont
éliminer par apoptose on peut utiliser les marquage EB, DAPI
10)apoptose peut donner une divergence de structure :
précurseur vont donner naissance trj a 4 motoneurones et
une cellule épithéliale et ceci est répète 12 fois ,c’est trj P1 P4
P5 P8 P9 P12 qui vont perdre certaines cellules
11) dimorphisme sexuel : canaux de Müller vont être
maintenu chez les femelles et perdu par apoptose chez les
males
Apoptose élimine des c en excès
13)au niveau de la moelle épinière ,on voit une partie de
motoneurone qui sont éliminé ,qui ont été produit en excès
Elimination de c anormales
16)sélection positive : sélection les c qui ont eu une
interaction avec le complexe peptide-CMH tout celle qui
n’ont pas eu cette interaction seront éliminer par apoptose
Sélection négative :permet d’éliminer les c qui sont anormale
ou dangereux pour organisme
18)si enlève Fas on inhibe l’apoptose