METHODES D’ANALYSES SPECTROMETRIQUES

NOTIONS FONDAMENTALES

Les méthodes spectrométriques utilisent les propriétés spectrales de la lumière pour effectuer: des
études qualitatives et quantitatives des molécules dans différents milieux.

Propriétés de la lumière

Nature ondulatoire:

La lumière est un déplacement transversal d’ondes électromagnétiques.

Les ondes électromagnétiques sont définis par:

 La longueur d’onde λ: distance qui sépare 2 ondes

 Le nombre d’ondes ύ: nombre d’ondes par cm
 La fréquence υ: nombre d’ondes par seconde : une oscillation /sec = 1HERTZ

λ = C/ υ

 C : la vitesse de la lumière: 3.1010 cm/seconde

Domaines des ondes électromagnétiques:

Le spectre des ondes électromagnétiques est séparé en plusieurs domaines:

 Les ondes radio: λ > à 10-1m

 Les micro-ondes: 10-1m(dm) > λ > 10 -3 m (mm)
 Les ondes infrarouges: 10-3m(mm) > λ > 10 -6m (µm)
 Les ondes de la lumière visible: 8. 10-7m (800nm) > λ > 4.10 -7m (400nm)
 Les ondes ultraviolets: 4.10-7m (400nm) >λ > .10 8(10nm)
 Les rayons X compris entre 1nm et 1Å

NB: la lumière proche UV – visible ne représente qu’une petite partie des ondes électromagnétiques

Nature corpusculaire:

La lumière est constituée de photons (quanta lumineux).

Chaque photon est caractérisé par son énergie propre.

L’équation de Planck développe la relation entre: l’énergie et la fréquence vibratoire du photon

E= hυ

h: étant la constante de Planck

Sachant que λ = C/υ -> E = h C/λ

Il apparait que l’énergie du photon est inversement proportionnelle à sa longueur d’onde.

 Les rayons UV sont donc plus énergétiques que les IR

Domaines spectraux et applications en spectrométrie

Les méthodes d’analyses spectrométriques reposent sur des interactions entre les molécules et des
quantas lumineux d’énergies différentes.

Ces méthodes seront désignées selon les domaines spectraux utilisés.

Elles mettent en jeu selon l’énergie des quanta lumineux, différentes actions sur les molécules:
excitations électroniques, vibrations et rotations moléculaires.

L’absorption de la lumière UV-visible par des molécules conduit à l’excitation des électrons π ou n(pairs
d’électrons libres)

La mesure de l’intensité de la lumière résiduelle et ses variations en fonction de λ, est appelée:

spectrométrie UV-visible

L’énergie absorbée par les molécules est émise sous forme de chaleur avec retour des électrons à l’état
basal.

Par contre si une lumière est réémise (énergie de rayonnement) en réponse à la lumière incidente, il
peut s’agir d’une fluorescence mesurable par une méthode appelée : fluorimétrie

L’absorption de la lumière IR par les molécules provoque des oscillations entre les atomes. L’étude de
ces phénomènes renseigne sur la structure des molécules. C’est la spectrométrie en IR
Photométrie et spectrophotométrie d’absorption moléculaire en ultraviolet et visible

Ensemble de techniques physicochimiques dans lesquelles l’absorption de la lumière UV-visible par des
solutions est utilisée pour l’identification et l’évaluation quantitative de la substance dissoute.

Principe physico-chimique

La lumière est considérée comme un flux de photons d’énergie

E = hυ

L’absorption de la lumière UV –visible par des molécules conduit à l’excitation des électrons π ou n, passant
d’un état fondamental à un état excité.

L’énergie prise à la lumière est égale à la différence d’énergie entre les niveaux électroniques. C’est la
résonnance.

Différents états excités de la molécule sont possibles correspondants à des lignes d’absorption dans le spectre
lumineux. C’est le spectre de raies.

Cet ensemble de lignes d’absorption influencé par l’absorption des molécules de solvant et d’autres molécules
dissoutes, forme le spectre d’absorption de la molécule.

Quelques notions relatives à l’absorption moléculaire

Relation entre l’absorption de la lumière UV-visible et le système chromophore: Seules les molécules
qui contiennent des systèmes chromophores (doubles liaisons ou électrons libres) absorbent dans le proche
UV-visible.

Propriété mise à profit en spectrophotométrie.

Le spectre visible:

La lumière blanche est dite polychromatique car elle est formée de plusieurs domaines de longueurs
d’ondes.

Le spectre de la lumière visible s’étend de 380nm à 750nm.

Un prisme en verre ou en quartz décompose la lumière en ses différents constituants colorés.

La lumière qui correspond à un domaine très étroit de longueurs d’ondes est dite monochromatique.

Constituants colorés de la lumière blanche

 Le rouge : 750nm > λ > 650nm

 L’orange : 650nm > λ > 595nm
 Le jaune : 595nm > λ > 560nm
 Le vert : 560nm > λ > 490nm
 Le bleu : 490nm > λ > 435nm
 Le violet : 435nm > λ > 380nm

Absorption en fonction de la longueur d’onde

Une substance en solution, éclairée par une lumière blanche absorbe une partie de cette lumière.

Plusieurs radiations d’énergies différentes sont totalement ou en partie absorbées.

La solution prend la couleur de la lumière résiduelle.

Exemples:

Une solution aqueuse de carotène parait orange car elle absorbe les radiations: violette, bleue et verte
(400nm et 500nm). L’œil perçoit le mélange des couleurs des radiations résiduelles: jaune, orange et rouge.

Pour une mesure spectrophotométrique d’une solution de carotène , on choisira une radiation bleue ou
verte.
Autres exemples:

Le glucose dosé par la méthode de Trinder donne une réaction colorée rouge .

La substance obtenue,un dérivé du amino4 phénazone absorbe donc la lumière bleue- verte : λ = 505nm

Le phosphore dosé par la méthode au molybdate forme le bleu de molybdène qui absorbe la lumière rouge : λ
≥ 650nm

La mesure de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline utilise le paranitrophenylphosphate comme

substrat. Le paranitrophénol produit, de couleur jaune, absorbe principalement la lumière violette à 405nm.

LOI DE BEER-LAMBERT

Si un faisceau lumineux monochromatique d’intensité Iotraverse une solution d’une substance

absorbante de concentration C contenue dans une cuve de 1cm de trajet optique L, le faisceau lumineux I
transmis subit une diminution exponentielle en fonction de C et de L.

I = Io . e – εCL

C= concentration en mole/l ou en g/l

L= trajet optique en cm

ελ = coefficient spécifique de la substance pour une longueur d’onde donnée.Nommé:

 coefficient d’absorption molaire si la concentration est en mole/l

 coefficient d’absorption spécifique si la concentration est en g/l.

Conditions d’applications de la loi de BEER-LAMBERT:

La loi est applicable si:

 La lumière est monochromatique

 Le milieu est limpide (éviter la diffusion de la lumière par des particules en suspension)
 Le soluté ne réagit pas sous l’action de la lumière
 Le pH est constant durant le dosage(éviter les variations des charges électriques des molécules à doser)
 La concentration des solutions à doser est faible, de l’ordre du millimole.

Notation en logarithme népérien de la loi de BEER-LAMBERT

Notion d’absorbance et de transmittance ou transmission

I=Io. e-εcl -> I/Io = e-εcl

Ln I/Io = -εcl -> Ln I o/I = εcl

 Ln I0/I = densité optique(D.O) ou absorbance

D.O = ε .c. l

 La D.O est sans unité

 I/Io = transmittance ou transmission (T)
 T est exprimée en pourcentage
- si le milieu est transparent: I=Io T = 100%
- si le milieu est opaque: I=0 T= 0%

Appareillage:

Les appareils sont appelés des spectrophotomètres: si toute les longueurs d’ondes proche UV-visible,
existent. L’intervalle spectral peut aller de 200 à 1000nm.

Ces appareils sont appelés photomètres ou colorimètres si seules certaines longueurs d’ondes du
visibles sont utilisable

Schéma des éléments constitutifs d’un spectrophotomètre

Sources lumineuses (lampes)

Il en existe 2 sortes:

Des lampes à solides chauffés ou lampes à incandescence:

 Lampe à incandescence standard:

Un filament de tungstène porté à incandescence par un courant électrique, fournit des radiations lumineuses
dans le visible et l’infrarouge.

 Lampe halogène:

Lampe à incandescence remplie d’un gaz halogène(I2, CH3Br, CH2Br2).L’ampoule est en quartz(SiO2).

Elle est plus puissante que la lampe à incandescence standard et émet des radiations dans l’UV et le visible.

Lampes à décharge électrique dans les gaz raréfiés:

 Lampe à hydrogène ou à deutérium avec ampoule à quartz fournissant un spectre dans l’UV jusqu’à
375nm et un spectre discontinu dans le visible.
 Lampe à vapeur de mercure avec des gaz rares pour l’allumage (argon ou néon) dont la raie principale
est de 366nm.
 Lampe au xénon fournissant un spectre lumineux allant du visible à l’UV lointain.

Systèmes de sélection de longueur d’onde ou monochromateurs:

Ils permettent de séparer une radiation de longueur d’onde bien défini a partir d’un mélange de radiation.

Le pouvoir résolutif de ces monochromateurs est varié. Ils sont caractérisés par la bande passante ou
l’intervalle de longueurs d’ondes sélectionné par le monochromateur.

Filtres colorés:

Ils sont en verre ou en gélatine. Leur pouvoir séparateur est médiocre. La bande passante est au mieux de
20nm.

Filtres interférentiels:

Ils sont formés par l’empilement de lames de verre sur lesquelles sont déposées des couches métallique
permettant de sélectionner certaines longueurs d’ondes .La bande passante est de 10nm
Les prismes:

Ils dispersent la lumière blanche dans le visible avec des prismes en verre et dans l’UV avec des prismes en
quartz. La bande passante est de 2 à 3 nm

Les réseaux:

Ce sont des blocs métalliques sur lesquelles sont tracés des raies fines parallèles permettant une dispersion
analogue voire supérieure aux prismes. L’orientation et la largeur du diaphragme (fente) permettent
d’améliorer la résolution.

Les cuves:

Elles sont en verre ou en plastique: lecture dans le visible, et en quartz: lecture en UV.

Trajet optique unique: 1cm

Variantes: ordinaires, microcuves, circulantes.

NB: - les cuves en verre ou en quartz doivent être propres et non rayées et celles en plastiques doivent
neuves.

- Les doivent être appariées( référence et échantillon)

La thermostatisation des cuves est assurée par: Un bain marie à eau circulante

Effet PELTIER :

Phénomène thermoélectrique se produisant dans des matériaux conducteurs de natures différentes liés par
des jonctions. L’une des jonctions se refroidit pendant que l’autre se réchauffe.

Les applications en biologie et en médecine sont nombreuses:

thermostatisation des cuves des spectrophotomètres, des fluorimétries de la plupart des automates de
biochimie , des appareils PCR …

Il est aussi à la base de systèmes de refroidissement: des thermocycleurs, des containers de transports
d’organes, systèmes de guidage LASER………….

Détecteurs:

Ils transforment le signal lumineux en signal électrique.

Cellule photoélectrique

Certains métaux portés à un potentiel négatif, libèrent un courant électrique sous l’action de la lumière.

Le courant électrique est souvent faible il doit être amplifié

Tube photomultiplicateur

Ensemble de grilles ou dynodes portées à un potentiel négatif avec des potentiels intermédiaires entre la
cathode( - ) et l’anode (+).

Sous l’effet de la lumière , les électrons arrachés à la cathode butent sur les dynodes et arrachent d’autres
élections d’ ou l’amplification du courant.

Photodiode et barrette de diodes:

Certains composants semi-conducteurs ont la capacité de détecter un rayonnement lumineux et de le

transformer en signal électrique.

Un alignement de photodiodes ou barrette de diodes permet une mesure simultanée sur toute l’étendue du
spectre UV-visible.

Ce qui permet d’obtenir un tracé rapide du spectre

Affichage:

Un galvanomètre mesure l’intensité du courant amplifié.

Le traitement de l’information (courant électrique) est traduit en D.O , en concentration ou en activité
enzymatique, etc. …….

Actuellement l’affichage est programmé par des logiciels informatiques au niveau des automates de biochimie
de même qu’au niveau des simples spectrophotomètres.

Résumé:

 Un photomètre est équipé de:

- 1 Lampe à tungstène ou halogène
- Filtre colorés
- Cellule photoélectrique, photodiode, photomultiplicateur
- Affichages divers
 Un spectrophotomètre est équipé de:
- Lampes: halogène, deutérium ou xénon
- Prismes ou réseaux
- Photodiode, barrette de diodes ,photomultiplicateur.
- Ils sont mono ou bi-faisceaux ( utile pour la réalisation de spectre d’absorption UV et visible)
- Affichages divers

Applications de la loi de BEER-LAMBERT:

 Détermination du coefficient d’extinction molaire

C’est une constante physique caractéristique d’une substance donnée à une longueur donnée.

Elle doit être déterminée avec la D.O la plus élevée du spectre d’absorption.
Soit une solution d’une substance x dont la concentration est de 20mmoles/l.

Mesurons la D.O en fonction de λ, la représentation graphique montre: plusieurs pics d’absorption à des λ bien
définis, caractéristiques de cette substance X.C’est le spectre d’absorption de la substance.

La mesure le coefficient d’absorption molaire doit être calculée avec la longueur correspondant au maximum
d’absorption (450nm).

Supposons que la D.O max est de 0.40 et sachant que :

D.O= εCl -> ε =D.O/Cl

ε λ 450nm =0.40/(20 * 10-3 mole/l * 1 cm) = 20l/mole-1cm-1

Pour une substance donnée ε varie unique avec la longueur d’onde.

Exemple:

Le paranitrophénol à un :- ε λ 410nm = 17 .10 3.mol-1cm-1

:- ε λ 405nm = 18.5 10 3.mol-1cm-1

 Mesure de la concentration:

Application la plus courante de la loi de BEER-LAMBERT.

Elle permet de doser une substance dans un milieu simple ou complexe.

Un milieu simple qui ne contient que la substance à doser est une éventualité rare. Il suffit de connaitre la
valeur de ε à une longueur d’onde donnée, mesurer la valeur de la D.O pour déduire la concentration.

Le dosage d’une substance dans un milieu complexe est plus fréquent.

Il faut alors développer des artifices techniques.

Le dosage d’une substance dans un milieu complexe est plus fréquent.

Il faut alors développer des artifices techniques:

Développer des réactions colorés par:

 Méthodes chimiques:
exemple : le dosage de la créatinine par l’acide picrique en milieu alcalin donne une réaction colorée
orange lue à 520nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration de la créatinine.

 Méthodes enzymatiques:

exemple: le dosage du glucose par la méthode de TRINDER(GOD-POD-PAP)

La D.O du produit coloré obtenu est proportionnelle à la concentration du glucose.

De nombreux substrats sont dosés par la méthode de TRINDER( OD-PAP)

Mesurer la diminution de la densité optique d‘un milieu complexe après dégradation de la

substance que l’on veut doser:

exemple: dosage de l’acide urique par l’uricase à 295nm.

On peut aussi quantifier une substance par l’intermédiaire de réactions enzymatiques auxiliaires utilisant des
déshydrogénases ayant le NAD le NADP comme coenzyme(réaction de WARBURG)

Sous forme réduite(NADH,NADPH), ces coenzymes absorbe à 340nm. Selon les réactions utilisées , on
mesurera la diminution ou l’augmentation de D.O

Exemple :dosage de l’urée par méthode enzymatique(Talke et Schubert):

Urée+H20 -> 2NH4+ + CO2

α cétoglutarate + NH4 + NADH -> L- glutamate + NAD + CO2

Identification et quantification d’une substance à l’aide de son spectre d’absorption:

On peut identifier une substance à l’aide d’un spectre spécifique caractérisé par des pics d’absorption
maximale à des longueurs d’ondes données.

Exemples:

- Identification des chromoprotéines: l’hémoglobine et la myoglobine.

 L’hémoglobine a un spectre à 2 pics d’absorption : 541nm et 577nm
 La myoglobine a un spectre à 3 pics d’absorptions: 418nm, 452nmet 582nm
- Identification des différentes structures du glycogène:

En présence d’iode les différentes structures du glycogène ont des spectres d’absorption différents:

 Le glycogène normal à 470nm et 480nm

 La dextrine limite absorbe à 440nm et 550 nm
 L’amylopectine absorbe à 520nm et 530nm.
Le pic d’absorption spécifique est aussi utilisé pour quantifier une substance

Exemples :

Quantifier l’ADN à260nm, zone maximum des acides nucléiques et contrôler la pureté de l’extraction (absence
de protéines) à 280nm

A260nm – A320nm

Le rapport R = = 1,8 à 2

A280nm- A320nm

Quantifier et suivre en continu l’élution des protéines en chromatographie à 278nm (cette absorption à
278nm correspond à la présence d’acides aminés aromatiques).

Ces dosages sont fait, soit:

 En point final : en mesurant la D.O à la fin de la réaction.

 En cinétique : en suivant l’évolution de la réaction par la mesure de la D.O en fonction du temps
pour quantifier une substance ou mesurer une activité d’une enzyme.

Etalonnage ou calibration

Toutes ces méthodes quantitatives nécessitent un étalonnage pour:

 Déterminer le domaine de linéarité de la mesure: domaine optimal de mesure: domaine ou la loi de

BEER LAMBERT est applicable (D.O proportionnelle à la substance à doser)

La zone optimale de mesure est située généralement, pour les méthodes manuelles pour des DO comprises
entre 0.1 ET 1.2.

 Le seuil de détectabilité de la méthode : pour les faibles valeurs de D.O la méthode manque de
sensibilité et les sources d’erreurs sont nombreuses

 La limite de linéarité de la méthode : pour les fortes concentrations la loi de Beer- Lambert n’est plus
applicable (la D.O n’est plus proportionnelle a la substance à doser)

COURBE D’ETALONNAGE
DISTRIBUTION RELATIVE DES ERREURS

 Actuellement l’étalon ou le calibrant est commercialisé.

Les industrielles en accord avec les sociétés savantes de chimie clinque(SFBC, IFCC ) et selon les
recommandation de la GBEA(pour la SFBC) proposent:

 des matériaux de référence certifiés (SRM=Standard Référence Material) pour:

 les substrats

 les enzymes (études faites par comité pour les Systèmes de référence d’enzymes ou C-RSE)

Exemple de calibrant: C. f. a. s (Calibrator for automated system).

La calibration des techniques automatisées est faite en usine au minimum par 6 points. Elle est contrôlée au
laboratoire par 2 points.

Pour les mesures turbidimétriques, la calibration est refaite sur 6 points au laboratoire.

Toute fois un point étalon est parfois proposé dans les kits en manuel. Il s’agit d’un point choisi dans la zone
optimale de mesure.

Toute calibration doit être validée par des sérums de contrôle «normaux » et « pathologiques » testés sur
des méthodes de références et des méthodes recommandées certifiées.( voir cours sur le contrôle de qualité
et validation d’une technique).

On éliminera l’absorption non spécifique provenant du réactif ou du sérum en faisant respectivement un

blanc réactif ou un blanc sérum.

Certains automates préconisent une lecture de D.O avec la longueur d’onde principale, spécifique de la
substance à doser et une seconde lecture avec une longueur secondaire pour éliminer les absorptions
parasites.

Exemple: dosage de l’urée par méthode enzymatique (340nm:700nm)

Autres méthodes proches de la spectrophotométrie

LA REFLECTOMETRIE

Méthode de plus en plus utilisée car c’est une: méthode rapide de dosage sur bandelettes réactives ou
plaques analytiques (chimie sèche).

Elle consiste à mesurer l’absorption lumineuse provoquée au cours d’un passage d’une lumière
monochromatique à travers une phase solide (Gélatine ou autre polymère imprégné de réactifs), reposant sur
un support opaque réfléchissant la lumière.

L’échantillon à doser est déposé sur le feuillet supérieur de l’empilement de couches de réactifs secs.

Apres répartition de l’échantillon et incubation, il se développe une réaction colorée lue par réflectométrie.

Le faisceau incident est souvent perpendiculaire au support. La lumière réfléchie est détectée à 45 o par rapport
à ce plan.

Exemples d’automates de biochimie utilisant cette technologie :EKTACHEM KODAK, Vitros Ortho Clinical
Diagnostic…

La lecture simultanée de plusieurs bandes, sans interférence est possible grâce à la sélection des bandes de
longueurs d’ondes très précise par le système de réseaux. Les faisceaux lumineux émis sont lu au niveau
d’une barrette de diodes.

Photométrie des milieux troubles

Turbidimétrie

Principe :

La lumière transmise correspond aux rayons lumineux n’ayant pas rencontré de particules sur leur trajet.

En milieu trouble homogène, l’intensité transmise est fonction de la concentration de la suspension.

La loi de Beer-Lambert peut donc s’appliquer aux milieux troubles si:

 la taille des particules est faible et voisine de la longueur d’onde de la lumière incidente

 et la concentration des particules n’est pas très élevée.

 En turbidimétrie, on mesure donc la diminution de l’intensité lumineuse dans la direction de la

lumière incidente.

Appareillage :

 La turbidimétrie utilise un spectrophotomètre avec des longueurs d’onde comprises en général entre
620nm et 670nm

Les valeurs des absorbances ne sont pas reproductibles d’un appareil à un autre comme c’est le cas de
la spectrophotométrie en milieu transparent.

Le diamètre et la couleur du faisceau lumineux, le type de récepteur , la distance cuve-récepteur sont

autant de facteurs qui peuvent modifier le résultat obtenu.

Applications:

La turbidimétrie est largement utilisée en biochimie clinique .

Elle est adaptable sur tous les automates de biochimie pour le dosage des protéines spécifiques.

Exemples: -Hitachi, Intégra, Modular ( Roche diagnostic)

-Dimension EXL (Siemens, Dade-Behring )

-LX20(BECKMAN-Coulter)

-AU(Olympus)…………

Néphélémétrie :

Principe et appareillage :

 La néphélémétrie mesure la lumière diffusée et nécessite l’emploi d’un néphélémètre qui mesure la
lumière UV (250nm à350nm) diffusée dans toutes les directions par rapport à la lumière incidente.

 La mesure du faisceau diffusé est faite perpendiculairement au faisceau incident.

 La lumière monochromatique utilisée provient d’un rayonnement LASER (light amplification by

stimulated emission of radiation) provenant d’une lampe à xénon, à hélium ou à néon .

 Ce faisceau lumineux produit une forte densité d’énergie rayonnante, ce qui est particulièrement
adapté à la mesure de la lumière dispersée.
Applications:

Les applications sont nombreuses en biochimie clinique.

Elle est également utilisée pour le dosage immunochimique des protéines spécifiques.

Les néphélémètres sont automatisés.

Exemple:

- IMMAGE (Beckman-Coulter)
- BN Prospec (Dade – BEHRING,SIEMENS)

Turbidimétrie et néphélémétrie : quoi choisir?

La néphélémétrie est considérée comme la méthode de référence du dosage des protéines spécifiques.

Mais elle a un appareillage spécifique qui n’est pas présent dans tous les laboratoires de biochimie.

De ce fait, le dosage des protéines s’effectue sur des automates de biochimie utilisant la turbidimétrie .

En comparant ces deux méthodes , on notera qu’il n’y a pas de différence détectable entre ces deux méthodes
mises à part les protéines à faibles concentrations(IgE, chaines légères libres…) quelque soit la méthode
utilisée (turbidimétrie ou néphélémétrie), il n’y a pas de transférabilité directe des résultats malgré l’utilisation
du standard international CRM470 (standard des protéines spécifiques)

Il reste des progrès à faire : Consensus sur des arguments techniques et scientifiques:

- Choix des anticorps/épitopes

- Ratio antigène/anticorps
- Choix de la longueur d’onde de mesure
- Mode cinétique ou point final
- Température
- Tampon…

Dans ces conditions l’interprétation de résultats sera grandement fiabilisée.

FLUORIMETRIE

Généralités :

La fluorescence fait partie de phénomènes physiques appelés : luminescence.

La luminescence : c’est l’émission de photons obtenus lors du retour à l’état fondamental d’une molécule
portée au préalable à un état excité.

Ce phénomène est mis à profit dans la spectrométrie par luminescence qui regroupe des méthodologies se
distinguant par la nature de la source d’excitation.

Telles que :
Principe physicochimique :

Il s’agit de l’émission de la lumière à partir d’une molécule se trouvant à un niveau d’excitation électronique
obtenu par absorption de la lumière (UV, visible ).

Le processus de fluorescence peut être scindé en 3 étapes :

- Absorption d’un photon par une molécule qui passe d’un état fondamental à un état électronique
excité initial.
- Passage de l’état excité initial vers un état excité secondaire.
- Retour à l’état fondamental avec émission d’un photon (la fluorescence

Excitation de la molécule

 Etat singulet fondamental (So):

Les électrons présents dans un orbital sont apparies sous forme de

doublets et sont de spins apposés avec des niveaux de vibrations νo,ν1…νn

Etat excité:
Absorption d’un photon d’énergie E ex = hν ex

Transition de l’électron dans un orbital de plus haute énergie (S1,S2,..Sn)

Devenir de la molécule excitée :

-L’absorption d’un photon conduit à un e transition électronique vers S1Vn ……SnVn

V étant le niveau de vibration.

-De l’état excité, la molécule va rapidement en 10-4 à 10-11seconde passer à un état de vibration le plus
bas(V0),de façon non radiative. La perte d’énergie s’effectue sous forme de chaleur. On parle de relaxation de
vibration.

-A partir de S1V0, la molécule retourne vers S0V0 avec émission d’un photon moins énergétique que celui
absorbé en 10-8 à10-9 seconde : c’est la fluorescence.

hν em < hν ex => λ em > λ ex

Ceci correspond à la loi de Stockes.

Diagramme de Jablonski

A côté de la fluorescence d’autres phénomènes permettent la désexcitation de la molécule :

le phénomène de phosphorescence : avec passage de T1Vn vers S0Vn avec une durée de 10-3 à100sec…

La dissipation de l’énergie sous forme de chaleur impliquant la collision des molécules excitées avec celles
présentes dans le voisinage immédiat ou phénomène de quenching.

La molécule excitée S1 ou T1peut aussi transférer son énergie en une seule fois à une autre molécule dans
l’environnement, c’est la photosensibilisation.
Spectre de fluorescence : spectre d’excitation et spectre d’émission :

 Pour produire le phénomène de fluorescence, la lumière excitatrice doit renfermer une ou plusieurs
radiations de longueurs d’onde dites excitatrices spécifiques d’une substance donnée.
 La radiation spécifique correspond à l’axe d’une bande d’absorption de la substance considérée et en
solution à l’axe du spectre d’absorption.
 La lumière réémise correspond à une bande d’émission ayant pour axe la longueur de fluorescence
également spécifique de la substance.
 Le spectre d’émission est l’image dans un miroir du spectre d’absorption.
 La transition 0-0 explique la zone de recouvrement des deux spectres ou l’énergie d’absorption est
égale à l’énergie de fluorescence.

E ex = S1V0 = E em = S0VO

Spectres de fluorescence

Grandeurs caractéristiques du processus de fluorescence :

Il y a 3 paramètres fondamentaux :

- Le rendement quantique :Фf

- L’intensité de fluorescence If (λf) à la longueur d’émission
- Le temps de vie de fluorescence τ.

Nombre de photons émis par fluorescence

Rendement quantique Фf =

Nombre de photons absorbés

Facteurs réduisant le rendement:

- La température : ayant pour conséquence l’ agitation moléculaire.

 - Le pH et la polarité du solvant modifie la charge des composés étudiés
- La pureté des réactifs
- La concentration de la substance à doser augmente la photosensibilité et le phénomène de quenching.

Pour éviter ces écueils, travailler dans les conditions suivantes:

- Faible température
- Faible concentration
- pH constant
- Pureté élevée des réactifs
- Préparation dans les mêmes conditions des étalons et des échantillons.

L’intensité de fluorescence :

L’intensité de fluorescence suit la loi de BEER- LAMBERT:

I F = I 0 (2,3 ελ .C .L) Фf

- If est proportionnelle à :
- I 0 : intensité de la lumière incident ( à retenir!!! )
- ελ : coefficient d’extinction molaire déterminée à la longueur d’onde
- d’ excitation. Plus ελ est grand plus l’intensité l f de la lumière émise est grande.
- L : l’épaisseur (trajet optique) de la solution traversée.
- Фf : rendement quantique

La relation précédente montre deux faits importants :

 L’intensité de la fluorescence If est dépendante de:

 l’intensité de la lumière incidente.

Deux sources lumineuses différentes conduisent à des If différentes alors que l’allure du spectre reste
constante.

Plus la source est intense plus les mesures pourront être effectuées avec une faible concentration.

Mais Il faut se rappeler que certains échantillons sont photosensibles. Cette photosensibilité augmente avec
l’intensité de I0 et devient source d’erreur.

La concentration C du composé à doser.

Mais à forte concentration, On observe une diminution de l’intensité de la fluorescence due à l’effet:

-filtre interne ou auto-absorption : réabsorption de la lumière par le composé lui-même quand sa

concentration est élevé et surtout quand il y a chevauchement entre le spectre d’excitation et le spectre
d’émission.

-excimère: un dimère de deux molécules du fluorophore à l’état excité. Le retour à l’état fondamental
provoque l’émission d’un photon à une longueur d’onde plus élevée que celle du fluorophore monomère. .
Temps de vie de la fluorescence τ :

Le temps durant lequel la molécule reste à l’état excité avant de retourner à l’état fondamental. Il renseigne
sur la structure de la molécule

Disparition de la fluorescence :

Les fluorophores peuvent être engagés dans plusieurs centaines de cycles "d’extinction-émission", avant
l’extinction de la fluorescence.

Le photoblanchiment est la disparition définitive de la fluorescence due à l’exposition prolongée de la

molécule à la lumière et l’oxygène

Il peut être atténué en limitant la durée d’exposition des fluorophores à la lumière ou en diminuant l’intensité
de l’énergie d’excitation.

Le quenching:

Le quenching dynamique : Lors de collision d’un fluorophore à l’état excité avec une molécule non fluorescente
présente en solution, le fluorophore lui cède son énergie sans émettre de lumière.

Le quenching statique : c’est la complexation du fluorophore avec un composé dans la solution.

Phénomènes optiques susceptibles d’agir sur le processus de fluorescence :

Il s’agit des effets Raman, Tyndall et Rayleigh.

 L’effet Raman est différent du phénomène de fluorescence.

Il est observé quelque soit la longueur d’onde du rayonnement électromagnétique.

Il se traduit par l’apparition de bandes d’émission séparées par des intervalles caractéristiques de la substance.

L’effet Raman du au solvant est parfois gênant.

 L’effet Rayleigh est la diffusion de la lumière après irradiation, avec la longueur de diffusion égale à la
longueur d’onde d’excitation.

 L’effet Tyndall est la diffusion latérale de la lumière par les petites particules en suspension.
Pour minimiser ces effets il faut choisir un monochromateur à bandes étroites sélectionnant la lumière
fluorescente uniquement.

APPAREILLAGE :

Il y a les fluorimètres et les spectrofluorimètres.

Les spectrofluorimètres permettent d’enregistrer les spectres de fluorescence en fonction de la longueur

d’onde

les fluorimètres utilisent les filtres colorés et permettent de travailler à longueur d’onde fixe.

 Sources lumineuses

Lampe à xénon : fournit un spectre continu de 200 à 800nm.

Lampes flash à xénon qui délivre un éclairage intense et bref limitant le phénomène de photoblanchiment.

 Filtres et monochromateurs

Les filtres colorés équipent les fluorimètres.

Les monochromateurs à réseau ou à prisme équipent les spectrofluorimètres

Le filtre primaire ou monochromateur d’excitation est placé entre la source lumineuse et la cuve.

Le filtre secondaire ou monochromateur d’émission est placé entre la cuve et le récepteur.

 Cuves :

Les cuves sont en quartz non fluorescent, polies sur les 4 faces ou cylindriques.

Il existe des cuves en matière plastique et des microplaques en polystyrène a fond plat a usage unique,
transparentes aux U V et opaque pour les mesures par réflectométrie.

 Photomultiplicateurs et photodiodes

Il existe des photodiodes sensibles dans certains intervalles de longueurs d’onde adaptées aux dosages à
effectuer.

Le courant produit transformé en tension par l’intermédiaire d’une résistance. Cette tension est amplifiée par
des amplificateurs pour avoir un signal utile. Les détecteurs sont reliés à des galvanomètres;

 Convertisseur analogique :

Le convertisseur analogique numérique permet d’enregistrer les données acquises dans la mémoire d’un
ordinateur équipé d’un logiciel prenant en charge le traitement des données.

Influence de l’appareillage sur les mesures :

  Sensibilité de l’appareil :

Elle est déterminée par la détectabilité du sulfate de quinine. On détermine la concentration minimale de
sulfate de quinine qui peut être détectée par l’appareil.

 Importance de la résolution :

Si la largeur de la bande passante du monochromateur est grande, on mesurera non seulement la fluorescence
mais également la diffusion et autres lumières parasites. Il faut donc des bandes passantes étroites.

 Influence de la température

L’intensité de la fluorimétrie diminue avec la température. Afin d’obtenir une bonne précision il faut lire les
dosages, les blancs et les étalons à la même température; pour cela Il faut un appareil thermostaté.

Applications en biochimie clinique :

Les applications sont nombreuses.

Les molécules chimiques fluorescentes sont des molécules rigides comme les composés aromatiques, les
composés avec doubles liaisons conjuguées, les hétérocycles condensés.

Le fluorophore est intrinsèque, la molécule à doser elle-même :

 Dosage des acides aminés et de leurs métabolites : Phénylalanine, tyrosine, histidine, sérotonine,
5HIAA
 Dosage des catécholamines, acide homovanilique….
 Dosage des médicaments et toxiques : Barbituriques, benzodiazépines, phénothiazines…

Le fluorophore est extrinsèque :la molécule à doser est rendue fluorescente en y greffant un
marqueur fluorescent: fluorescéine, rhodamine, coumarine, 4 methylumbelliferone(4-MU)

Applications( très nombreuses):

 Dosages enzymatiques ayant pour substrat des dérivés fluorescents (dérivés de la 4-MU).
 Dosage des peptides et des protéines: hormones, marqueurs tumoraux, récepteurs solubles, auto-
anticorps … par des méthodes immunométriques ou l’antigène ou l’anticorps est marqué par un
dérivé fluorescent….
 Application en génétique moléculaire par l’utilisation de sonde marquée par un dérivé fluorescent.
 Détection et dosage par des technologies (HPLC, CPG, électrophorèse en micrcapillaire…) couplées à
un détecteur par fluorescence.

Chimiluminescence et Électrochimiluminescence: autres techniques utilisant le luminescence

La chimiluminescence (CL) : (fig5)

C’est l’émission de la lumière UV, Visible ou IR par une molécule dont l’excitation électronique est obtenue
par une réaction chimique à température ambiante.

La chimiluminescence est de la conversion de l’énergie chimique en énergie radiative.

Il s’agit d’une réaction d’oxydoréduction qui produit un composé intermédiaire à l’état excité, et retour à
l’état avec émission de photon.’’
Exemple :- le luminol ou 3aminophtalylhydrazide qui réagit par oxydoréduction en présence d’ions ferriques
contenus dans le globule rouge, rendant les traces de sang luminescentes. Cette technique est utilisée lors de
recherche en criminologie

Exemple 2:l’automate Immulite 2000 de Siemens utilisela chimiluminescence.

Les Ac ou les Ag sont marqués par une enzyme: la phosphatase alcaline ayant comme substrat un produit
luminogène:

Le phosphate de dioxétane, qui sous l’action de la phosphatase alcaline libère un groupement phosphate un
anion instable.

Lors de son hydrolyse cet anion libère un photon.

La quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de phosphatase alcaline.

L’électro chimiluminescence (ECL) : (fig6, fig7)

L’ECL est la production de lumière par électrolyse .C’est un système fréquemment employé (automate ROCHE
elecsys 2010, e411…)

Le réactif le plus utilisé est le tri (2,2’-bipyridine) ruthénium II ou Ru ((bpy) 32+)

Le Ru ((bpy) 32+) est oxydé par l’anode en Ru ((bpy) 33+ qui est réduit à son tour parl’analyte en Ru ((bpy) 32+) * à
l’état excité .

Le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de lumière

Application de la CL et de l’ECL :

Les applications de ces méthodes sont très nombreuses en biochimie clinique, et dans le contrôle analytique
pharmaceutique etc …..

Les détecteurs de CL et de ECL sont couplés avec des technologies performantes telles que :

- l’HPLC,
- la CPG,
- l’EC (électrophorèse capillaire),
- la FIA (l’injection en flux continu), permettant la détection de produit à l’état de trace avec un temps
d’analyse réduit.