La spectrophotométrie

La spectrophotométrie
 La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui
consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une
substance chimique donnée, généralement en solution.

 Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière dans les

limites de proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert.

 La densité optique des échantillons est déterminée par un

spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde
d'absorption de la substance à étudier.
La spectrophotométrie
Applications
C'est une méthodologie extrêmement courante pour :

 déterminer la concentration d'une molécule

 suivre la cinétique de formation d'un produit au cours

d'une réaction enzymatique (en étudiant leur
évolution en fonction du temps )

 apprécier le degré de pureté d'une molécule purifiée

La spectrophotométrie
Avantages
Elle présente les avantages suivants :

 méthode facile à mettre en œuvre

 simplicité des mesures

 permet de déterminer la concentration de molécules

 permet de tester l'effet de divers paramètres (pH,

température, ...)
La spectroscopie d’absorption dans
l’UV et le visible
 La spectroscopie d’absorption dans l’UV et le visible est une
méthode très commune dans les laboratoires. Elle est basée sur
la propriété des molécules d’absorber des radiations
lumineuses de longueur d’onde déterminée.
- DOMAINE SPECTRAL
 Le domaine UV-visible s'étend environ de 10 à 800 nm.

visible : 400 nm (indigo)- 800 nm (rouge)

proche-UV : 200 nm - 400 nm

UV-lointain : 10 nm - 200 nm.
 1. Interaction lumière – matière
 La spectrophotométrie est l ’étude quantitative des interactions entre
la lumière et la matière.
 Lorsque de la lumière traverse une substance, elle est en partie
transmise et en partie absorbée .

 Si une substance absorbe dans le domaine visible(400nm<λ<800nm),

alors- elle- est-colorée. Elle prendra la couleur des radiations qui
parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs
absorbées.
 Généralisation:
Une solution colorée absorbe certaines longueurs
d’onde et la couleur de la solution perçue par l’œil
Lecture du cercle chromatique
correspond à la couleur complémentaire de celle qui
est absorbée par la solution.

 Les couleurs sont placées par ordre

croissant de longueur d’onde le long du
cercle.
 Deux couleurs complémentaires se
trouvent l’une en face de l’autre .
 Exemple : une solution de diode I2 absorbe
principalement les rayonnements de
longueur d’onde 454 nm (bleu violet) : la
solution est alors jaune Orangée (couleurs
complémentaires des rayonnements
absorbés, situées en face dans le cercle
chromatique) .
D’après ce tableau, recopier et compléter la phrase suivante :
La solution de diiode est de couleur jaune donc la couleur «
absorbée » par cette solution est bleue ce qui correspond à
des radiations de longueurs d’onde comprises entre 435 et 80
nm.
 Certaines solutions absorbent dans
l'ultraviolet (longueurs d'onde inférieures
à 380 nm), on parle alors de
spectrophotométrie UV.
 Principe

Soit une cuve de longueur ℓ contenant une solution d’une substance

colorée à la centration c.
Un faisceau de lumière monochromatique de longueur d’onde λ
traverse cette solution ;
soit Io(λ), l’intensité de ce faisceau à l’entrée de la cuve et Is(λ), son
intensité à la sortie.
L’absorption de cette lumière par la solution peut être caractérisée par
deux grandeurs : la transmittance et l’absorbance .
Principe(suite)
 La transmittance donne le pourcentage de lumière que
transmet la solution:

 L’absorbance A est Définie par:

 L’absorbance est une valeur positive, sans unité. Elle

est d’autant plus grande que l’intensité transmise est
faible.
LOI D’ABSORPTION DE LA
LUMIERE(Loi de Beer-Lambert)
La relation de Beer-Lambert décrit
que, à une longueur d’onde λ
 Soit un faisceaux lumineux
donnée, incident d’intensité
l’absorbance d’une Io ,
traversant une solution
solution est
de concentration
proportionnelleCà contenue
sa dans
une cuve d’épaisseur L.
concentration, et à la longueur
dulumière
 Une partie de la trajet optique (distance
sera absorbée parsur
l’échantillon
laquelle
alors que le reste la lumière
va être transmistraverse la d’un faisceau
sous forme
d’intensité I. solution, longueur de la cuve ).
>>> Loi de Beer-Lambert
 est l’absorbance ou la densité optique (sans
unité) de la solution pour une longueur d'onde λ ;

 (en mol.l) est la concentration de la substance

absorbante ;

 (en cm) est la longueur du trajet optique ;

 (en l.mol-1.cm-1) est le coefficient d’extinction

molaire de la substance absorbante en solution. Il
rend compte de la capacité de cette substance à
absorber la lumière, à la longueur d’onde λ.
L’absorbance A d’une solution d’une
espèce chimique dépend en général :
de sa concentration C dans la
solution ;
 de la longueur d’onde λ du
rayonnement incident : A = f(λ ) ;
 de l’épaisseur e de solution traversée
( plus e est grand, plus A est grand
et vice-versa ) ;
 de la nature de la substance
absorbante.
(Loi de Beer-Lambert) Suite
 La loi de Beer Lambert n’est valable que
si la solution est peu concentrée en
espèce colorée car à trop forte
concentration :
 Is est trop faible, et le spectrophotomètre
trop peu sensible pour donner des valeurs
cohérentes de A.
Le spectrophotomètre
 Un spectrophotomètre mesure l’absorbance d’une solution à une longueur d’onde
donnée. Un dispositif monochromateur permet de générer, à partir d’une source
de lumière visible ou ultraviolette, une lumière monochromatique,

 La lumière monochromatique incidente d’intensité Io traverse alors une cuve

contenant la solution étudiée, et l’appareil mesure l’intensité de la lumière
transmise. La valeur affichée par le spectrophotomètre est l’absorbance ,
 Le spectrophotomètre
 Un spectrophotomètre mesure l’absorbance d’une
solution à une longueur d’onde donnée. Un
dispositif monochromateur permet de générer, à
partir d’une source de lumière visible ou ultraviolette,
une lumière monochromatique, dont la longueur
d’onde est choisie par l’utilisateur.
 La lumière monochromatique incidente
d’intensité Io traverse alors une cuve contenant la
solution étudiée, et l’appareil mesure l’intensité de la
lumière transmise. La valeur affichée par le
spectrophotomètre est l’absorbance à la longueur
d’onde étudiée.
Le mot polychromatique signifie « de plusieurs couleurs ». Le
prisme et le réseau de diffraction dévient la lumière selon leur
longueur d'onde, et décomposent une lumière polychromatique en

Le spectrophotomètre
un éventail de lumières monochromatiques, que la vision humaine
perçoit chacune d'une couleur

1. source de lumière polychromatique

(lampe):
elle émet un faisceau de lumière en direction
du monochromateur.

- Sources lumineuses :
 lampe à décharge au deutérium :
domaine 190 à 400 nm

 lampe à filament de tungstène : domaine 350 à 800 nm

 lampe à décharge au xénon (très énergétique ) utilisée

dans le domaine UV et visible (domaine de 190 à
1 100 nm). Elle fonctionne sous forme de flash, au
moment de la mesure
 un système dispersif (qui décompose
la lumière blanche en radiations
monochromatiques (réseau) et
Le spectrophotomètre sélectionne une radiation donc une
longueur d’onde de travail )

2. Monochromateur :
un système qui sépare les
différentes longueurs d'onde
d'un faisceau lumineux.
. Il y a 2 types de
monochromateur :
 dispersion de la lumière par
un prisme
 diffraction de la lumière par
un réseau ou par un cristal
 Le spectrophotomètre (suite)
3-un porte-cuve: afin de placer la solution sur le trajet de
la lumière
3.1 Cuves :
 choisir le type de cuve adapté à la longueur d'onde :
 quartz pour les ultra-violets (190 - 400 nm)
 verre ou polystyrène pour le visible (400 nm - 800 nm)
 bien orienter la cuve par rapport à l'axe du faisceau
lumineux.
 supprimer toutes les bulles d'air.
 Nettoyer la cuve de l’appareil avant et après chaque
utilisation à l'eau ou au détergent.
 Attention à ne pas rayer les parois de la cuve lors de
l'entretien.
Le spectrophotomètre
4. Un photocapteur :

 c’est un élément photosensible (en général une diode) qui

transforme le signal lumineux en signal électrique.

 En effet, le flux lumineux transmis par la solution est dirigé

vers ce photocapteur qui fournit au détecteur électronique
un courant électrique proportionnel à la quantité de photons
du flux lumineux.
Le spectrophotomètre
5. Un calculateur:

il traite le signal électrique pour calculer l’absorbance qui

est proportionnelle à l’intensité du courant et donc liée
(par la loi de Beer-Lambert) à la concentration de la
solution.
Mesures Spectrophotométriques
1/ Détermination d’une concentration
On utilise souvent la spectrophotométrie afin de connaître la concentration
d’une substance dans une solution. L’absorbance est mesurée à l’aide d’un
spectrophotomètre.
A- Choix de la longueur d’onde de travail
 Exemple :
 Pour Br2
le spectre A =f(λ) est ci dessus .Pour étudier une solution de
dibrome, on se placera donc à λ=410 nm.
Mesures Spectrophotométriques
(suite)
 B- Déroulement de la mesure
 Afin d’étudier l’absorption de la lumière par une substance
colorée seule, il faut tenir compte du fait que de la lumière est
Absorbée également par la cuve et le solvant, il faut alors «
faire le blanc ».
Dosage par étalonnage d’une espèce
colorée en solution aqueuse:

 Par exemple pour doser la glycémie

d’un patient;
 L’étalon c’est une solution de glucose de
concentration connue, à partir de cette
solution mère on prépare des solutions
filles.
 On mesure l’absorbance de la solution
mère ainsi que les solutions filles.
 On trace par la suite la courbe mettant
en œuvre la variation de l’absorbance
en fonction de la concentration.
*interprétation de la courbe:
 On observe que c’est une droite qui
passe par l’origine A=f(C) donc
l’absorbance varie de façon
proportionnelle à la concentration.
 On mesure l’absorbance de notre
échantillon de concentration inconnue,
on copie cette A sur la courbe et on
déduit la concentration ou la glycémie
de notre patient.
 On peut aussi utiliser cet appareil pour suivre une
transformation chimique mettant en jeu une espèce
colorée :
 • On place le mélange réactionnel dans une cuve qui
est elle-même placée dans le spectrophotomètre.
 • On relève l’absorbance en fonction du temps puis on
trace A = f(t).
 • On utilise la proportionnalité entre A et c et on
remonte aux relations entre c = f(t) et x = f(t).