Travail pratique 5

Techniques spéciales de
microscopie optique avec des
applications en médecine
Microscopie de fluorescence
Microscopie à contraste de
phase
Le microscope de fluorescence
 Fluorescence
Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains
systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent
se désexciter en émettant des photons.

excitation

La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus

grande que plus celle d’absorption et il est possible
de sélectionner spectralement la lumière émise →
microscopie de fluorescence
 Le principe de fonctionnement
 C’est un microscope optique qui utilise la fluorescence et
la phosphorescence à la place de l'absorption et de la
réflexion
 L'échantillon est éclairé par une lumière d'une longueur
d'onde spécifique qui est absorbée par les fluorophores.
 Les fluorophores émettent de la lumière d’une longueur
d'onde plus élevée (d'une couleur différente de la lumière
absorbée)
 La lumière utilisée pour l'éclairage est séparée de la
fluorescence émise (plus faible), en utilisant un filtre
spectral (protége les yeux de la lumière UV)
 Les composants du microscope de fluorescence

La lumière UV (de excitation)

Lampe à
vapeurs de
La lumière fluorescente
mercure /
lampe xénon

Les zones fluorescentes

apparaissent éclairée sur
un fond sombre
 La technique de l'examen à
•
fluorescence
L’ examen par transmission (transparence)
– sections transparentes qui peuvent être traversés par la lumière
– la fluorescence est induite dans toute la masse de la préparation (ce
qui permet l'observation des zones fluorescentes en le comparant
avec celles qui ne sont pas fluorescentes
– peut être combiné avec l’observation de l’image par absorption
(transparence) en lumière polychrome
• L’examen par réflection (éclairage superieur par
l’objectif)
– implique l’induction de la fluorescence sur la surface de la preparation
– est combinée avec l’examen de la préparation en lumière polychrome
par le processus de transmission
 Applications pratiques
• À l’aide de la fluorescence primaire (autofluorescence) – des substances qui
émettent spontanément la lumière visible lorsqu'elles sont irradiées par les rayons
ultraviolets (UV)

Certains virus: tel le virus de

Des pigments: la mosaïque du tabac
(fluorescence rouge - (fluorescence verte)
brune) –la lipofuscine dans
les myocytes cardiaques

La dent naturelle est autofluorescente

types fluorochromes d'utilisation
 Applications pratiques
• Imprégnation avec des fluorochromes différents

ARN (l’acridine
ADN
(l’acridine orange)
orange)

Chromosome X
(l'iodure de propidium,
Alexa Fluor, Texas
Red)

Chromosome Y
(SYTOX Green,
methyl green)

ADN à double brin (DAPI)

 La fluorescence

Application à la biologie
 La fluorescence

I. Principe de la fluorescence
II. Microscopie à épifluorescence
 Généralités
• Les fluorophores sont avant tout des chromophores
• Les chromophores sont des constituants moléculaires qui
absorbent la lumière hc/λ1,
Ce sont en général des composés aromatiques.

4n+2 e-

• Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à

une longueur d’onde différente hc/λ2
 Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ?

La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques

entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité.
La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de 10 -9 à 10-7 s
GFP : τ = 2,1 ns

Perte d’énergie

e-

Émission de fluorescence,
de plus faible énergie
Photon (plus grande longueur d’onde)
(lumière d'excitation)
 Diagramme de Jablonski (simplifié)

S1
T1
ENERGIE

ABS FL Relax th
Photoblanchiement
Phosp

S0

Eexc = Eem + chaleur (Eexc > Eem)

 λexc < λem
E = (hc)/ 
 Les molécules fluorescentes utiles en
biologie

• Des protéines

• De petites molécules aromatiques

• Des nanocristaux de semiconducteurs

 mRFP1 mRFP1
EBFP ECFP EGFP EYFP Ds Re d EBFP ECFP EGFP EYFP Ds Re d
100 100
HcRe d HcRe d

80 80

60
Intensité

60

40 40

20 20

0 0
350 400 450 500 550 600 400 450 500 550 600 650 700
UV bleu vert orange rouge UV bleu vert orange rouge IR
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)

Ex (nm) Em (nm) ε (M-1. cm-1) F brillance (ε . UA) pKa Remarque

wtGFP neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria
wtGFP phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria
EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu
ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan
EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert
EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune
-1
Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl
DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata
mRFP1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère
HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible GFP
Heteractis crispa
fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3

Quantum Dot 405/605 605 2 400 000

Absorption 0,40
Rendement Q 1 000 000 à valider
Représentation d’une protéine fluorescente
tétramérique (asFP595)
Chromophore
(GFP) :

-S-Y-G-

Maturation post-traductionnelle
du fluorophore de la GFP
Les marquages en immunofluorescence

fluorochrome

Anticorps secondaire

Anticorps primaire

Antigène
Echantillon
Coupe semi-fine
Représentation d’un fluorophore inorganique (Alexa
568)
 Exemple de quadruple marquage

DAPI ex em

Alexa 488

TRITC

Cy5

UV 400 500 600 700 nm IR

Fluorescence (% valeur initiale) Photoblanchiment (photobleaching, fading)

Alexa 488
Oregon Green 514

BODIPY
Oregon Green 488
Fluorescein

Temps
(secondes)
Spectre
continu
 Trajet optique
Microscope droit

Observation en lumière
transmise Observation en fluorescence Observation en fluorescence
avec un jeu de filtre avec un jeu de filtre
spécifique de la GFP spécifique de l’Alexa 568.
Exemple d’image en épifluorescence
(dendrites de neurone P-GFP)
C’est tout et c’est déjà pas mal !!!!
Principaux fluorochromes utilisés en microscopie
en épifluorescence et confocale
- immunofluorescence :
FITC, TRITC, lissamine rhodamine,
Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors
- ADN :
iodure de propidium, YOYO, Syto16,
chromomycine A3, mithramycine;
DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3
- mitochondie : sensible au potentiel
membranaire
Rhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3),
JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-
fixation possible)
- membranes :
FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers
anticorps de surface
- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de
propidium,… morphologie, avec DIC
- réticulum endoplasmique:
(non spécifique) DiOC6(5), GFP-
taggée
- appareil de Golgi : GFP-taggée,
anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour
végétaux)
- dépendance envers le pH :
carboxy-SNARF-1, BCECF
- dépendance envers le calcium :
Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed,
CalciGreen, Indo-1, Cameleon
- divers :
Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer
Yellow, chlorophylle,
- Protéines Autofluorescentes
Les paramètres caractéristiques d’un fluorophore :

• Spectre d’absorption : capacité à absorber la lumière (chromophore)

caractérisé par son maximum
e-
• Spectre d’émission : capacité à émettre de la lumière après excitation
caractérisé par son maximum
• Décalage de Stokes : mesure l’écartement des deux spectres précédents, en général on
préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift »
• Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole
de fluorophore (excitabilité) (λ donné)
• Rendement quantique Φ : probabilité qu’un fluorophore excité émette un photon
(efficacité de fluorescence) 0<Φ<1
• Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière
d’excitation donnée. B = ε x Φ

• Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore

• Durée de vie à l’état excité (pour certaines applications)
 Photo-activation
exemple : PA-GFP

Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656

 Quantum dot:
particule fluorescente non aromatique !!!

Core nanocrystals with size

between 3-8 nm
(CdSe, CdTe, CdS, ZnSe)

anorganic shell
(ZnS, CdS)

organic shell (silica/siloxane,

phospholipides, proteins)
10 - 15 nm
Ordre de grandeur - Q-dot
 Propriétés
Brillance = ε.ΦF

eGFP 33 000
• Forte brillance
Q Dot 1 000 000

ble ac h re s is tanc e o f Q-Do ts

Alexa 488

emission intensity
300

• Résistance au photoblanchiement sampling rate 26.7 Hz

Q-Dot
200

• Clignotement 100

0 20 40 60 t (s)

• Large gamme de spectre accessible en excitant

dans le domaine UV
 Exemple d’application :
suivi de molécules uniques

1 μm
 Le microscope à contraste de
phase
Le principe de fonctionnement
 La plupart des objets biologiques sont transparents→ la technique de
coloration → contraste différent

 Les tissus non colorés sont optiquement inhomogènes → ils ont un indice
de réfraction de la lumière différent → il y aura une certaine différence
de phase (trop petite pour être détectée par les yeux ou sur une photo)

 Dans la microscopie à contraste de phase, les différences de trajet optique

sont amplifiés par la plaque de phase → on voit une augmentation du
contraste

 Il est utilisé pour étudier la cellule vivante (les mouvements cellulaires ,les
changements dans la division cellulaire , l’endocytose, le mouvement des
cils et des fléaux, les réponses cellulaires à divers agents chimiques ou
physiques
la division cellulaire

Le tissu du cerveau humain

Méthodes de contraste optique

• fond clair

• contraste de phase

• contraste interférentiel (aussi appelé Nomarski)

Formation des images en fond clair :
Interprétation en termes d’interférences

Un objet atténue la lumière le traversant :

E = t E0 cos(t –kz) avec 0<t<1 donc I = t² I 0 et l’objet apparaît plus sombre

En rouge : E0
En vert : E = tE0
En bleu : -(1-t)E0

Interprétation en termes d’interférences :

On peut interpréter cette atténuation comme due à la somme de l’onde incidente
non perturbée et d’une onde en opposition de phase (déphasage ) :

E = t E0 cos(t –kz) = E0 cos(t –kz) - E0 (1-t) cos(t –kz)

E0 cos(t –kz) + E0 (1-t) cos(t –kz + )
 II. Microscopie à contraste de phase
Imagerie d’objets de phase (objets transparents: cellules et microorganismes)
Transforme des petits déphasages en variation d’amplitu de

Échantillons minces non colorés sont transparents en fond clair.

Pourtant : suivant structure traversée par la lumière, différence de phase
différentes…
MAIS l’œil et les détecteurs ne sont sensibles qu’aux changements d’intensité
ou de couleur…
Pendant longtemps : fixations-colorations abîment les cellules, contraste de
phase les respecte
A. Formation des images en contraste de phase :
Les objets transparents (cellules et microorganismes, .. ) induisent un déphasage  du champ
électrique (en première approximation : pas d’absorption)
 = 2 (no-ne) e/ e épaisseur, (n o-ne) différence d’indice

 faible : ne = 1.36, n0 = 1.335, e =1m,  = /10

Après l’objet : E = E0 cos(t –kz + )

Interprétation en termes d’interférences : E = E0 cos(t –kz) cos E0 sin(t –kz ) sin 
E0 cos(t –kz) E0 sin(t –kz ) sin 

L’amplitude ne varie pas…

comment transformer cette variation de phase en variation d’amplitude ?
 Ajouter un déphasage de /2 (ou –/2) au champ non perturbé :

E = E0 sin(t –kz) E0 sin(t –kz ) sin sinsin(t –kz )

E = -E0 sin(t –kz) E0 sin(t –kz ) sin sinsin(t –kz )

Application : observation de cellules vivantes en culture, sans

traitement de fixation/coloration
En pratique :
condenseur à diaphragme annulaire : cône de lumière « directe » qui passe
ensuite à travers un objectif à anneau de phase
(déphasage /2 et atténuation de 60 à 90%)

Existence d’un halo clair autour des détails

sombres,sombre autour des détails clairs…
observation des contours gênée et précision des
mesures faible

Fond noir : contours OK, mais structure interne

peu révélée.
Passage de l’un à l’autre très utilisé.
Microscopie à Contraste Interférentiel Différentiel:
Méthode pour détecter des gradients
de phase pour les convertir en
variations d’intensité

Déplacement entre les deux faisceaux

inférieur au disque d’Airy
 Microscopie en fond noir
Les rayons provenant du condenseur
ne pénètrent pas dans l’objectif.
N’apparaissent que les zones qui
diffusent la lumière :

• contours des objets opaques

• variations brusques d’indice optique

Utilisée surtout pour l’observation

d’objets dont les structures présentent
d’importantes variations d’indice et
qui, faute de contraste, présentent
ne sont pas visibles en fond clair.

Élément d’optique : condenseur avec

diaphragme annulaire : cône de lumière.
 Microscopie en fond noir

• Objets plats à structures régulières (diatomées, radiolaires)

• Formations linéaires (flagelles, fibres, bactéries)
• Objets punctiformes ou linéaires dont la tailles est < à la limite de séparation
détrôné par contraste de phase (sauf quelques cas)
V. Éclairage de Köhler

Plans conjugués dans le chemin d’éclairage:

- Filament de la lampe
- Diaphragme d’ouverture du condenseur*
- Plan focal arrière de l’objectif*
- plan du point de l’œil

Plans conjugués dans le chemin de la formation

de l’image:
- Diaphragme de champ
- Plan objet (au foyer)
- Plan image intermédiaire
- Rétine de l’œil, ou CCD

*Plan où des éléments optiques sont insérés

dans les divers techniques de microscopie
Condenseur :
L’éclairage de Köhler permet d’obtenir des images de très bonne qualité
Éclairement optimisé: - illumination suffisamment intense de l’objet
- uniforme sur le champ de vision
Une amibe vue sous différentes techniques (à vous de reconnaître)