LA FLUORESCENCE

MOLÉCULAIRE
 I/ INTRODUCTION
- Incandescence
(lumière chaude)

- Luminescence : latin
lumen = lumière
 Fluorescence

Billets de banque

Certaines empreintes digitales: billes de verre

avec sonde fluorescente associées à un corps
gras
Chimiluminescence: une réaction chimique

Les traces de sang peuvent

être détectés par
chimiluminescence

Les bâtons lumineux utilisent la chimiluminescence

Phosphorescence: qui porte la lumière
Bioluminescence: une enzyme, la luciférase
 FLUORESCENCE :
– terme introduit par Stokes

– La plupart des variétés de fluorine (CaF2)

émettent de la lumière
– En fait ce sont des impuretés contenues dans
les cristaux
 Applications principales
• Détection et dosages d’espèces intrinsèquement
fluorescents.
• HAP, PCB, drogues, médicaments etc
• Détection et/ou dosage à l’aide de sondes
fluorescentes.
• Ions métalliques, anticorps (ELISA), etc
• Puces ADN (DNA chip)
• Analyse directe ou après séparation (détecteurs
HPLC)
 II/ RAPPEL SUR L’ABSORPTION DE
LA LUMIÈRE UV-VISIBLE
• 2.1/ Loi de Beer Lambert
Fluorescence

hν
M M*
Réaction
PC

Bohr : E1 – E0 = hν = hc/λ CIS

Phosphorescence
• Transmittance : T = P/P0 (x100)

P0 P

• Absorbance : A = -log T = log P0/P

A = εlc
(pour une radiation monochromatique)
 2.1/ Les transitions
électroniques
Trois types de liaisons : σ, π, n

hν = ∆E = EBV -EHO

Transitions possibles

σ σ* : ε fort
π π* : ε fort
nπ* : ε faible
n σ* : ε faible
 Etats singulet et triplet
• Multiplicité de spin d’un état électronique
M = 2S +1
(S égal nombre quantique total de spin = Σsi)

S = ± 1/2

BV

HO
S0 S1 T1
 hν Règle de Wigner
• S0 S1

CIS

T1

Interaction entre champ magnétique produit par le mouvement

orbital de l’électron et son moment magnétique de spin.

La probabilité du CIS est proportionnelle à l’intensité du

couplage spin-orbite et inversement proportionnelle à la
différence d’énergie entre S1 et T1
 ∆E

S0 S1 T1

∆E = 20 - 40 kJ/mole pour transitions n π*

 CIS facilité et désactivation/triplet
∆E = 200 -300 kJ/mole pour transitions π π*
 Désactivation / singulet
2.2/ Les autres transitions
• Transitions vibrationnelles
– Une molécule est un vibrateur quantique (IR)
• Transitions rotationnelles
– Rotation d’une molécule autour de son centre
de gravité.
- Des variations d ’énergie toujours plus faible
(micro-ondes)

Etotale = Eél + Evib + Erot

2.3/ Principe de Franck-Condon

La transition électronique
est quasi-instantanée (10-16
à 10-15 s)

La transition de FC est dite

verticale.

La transition la + probable
est la transition de FC
FC est la plus intense
 III/ Processus de relaxation

Relaxations non rayonnantes; Vibrationnelle, CI et CIS

 Relaxation rayonnante
• Fluorescence

- Même multiplicité,
- FC,
-Raies de résonance
si: λabs = λfluo.
Il peut y avoir un décalage si les interactions
avec le solvant sont différentes entre l’état
excité et l’état fondamental

Principale transition : ππ*

 Déplacement de stockes

L’écart (exprimé en nombre d’onde) entre le maximum de la

première bande d’absorption et le maximum de
fluorescence est appelé déplacement de Stokes
 Phosphorescence
Multiplicité différente.

EN SOLUTION, IL FAUT REFROIDIR

Principale transition : nπ*

 IV/ Durée de vie des états excités et
rendement quantique
• 4.1/ Durée de vie des états excités.

• v, vitesse de désactivation d’un état excité

• v = -d[M*]/dt = Σki[M*]

– ki : constante de vitesse d’un processus de

désactivation du 1er ordre
• Par intégration (rappel cours 1A)
• [M*] = [M*]0e-Σkit

τ = 1/Σki  [M*]τ = [M*]0e-1

[M*]τ = [M*]0 x 0,3679

M*0

M*0/2
0,37M*0
M*0/4

τ
 4.2/ Rendement quantique de
luminescence
• Le rendement quantique de luminescence est défini
comme le rapport du nombre de photons émis au
nombre de photons absorbés.

• ΦL = PL/PA 0< ΦL <1

• PL = kL[M*]
• PA?  hypothèse de l’état stationnaire
• d[M*]/dt = PA – (kL + kNL)[M*] = 0

• ΦL = kL/(kL + kNL) = kL.τ

 V/ Intensité de fluorescence

L’intensité de fluorescence =
nombre de photons émis par fluorescence

PF = ΦFPA = ΦF(P0 – P)

P0 P
T = P/P0 = 10-A =10-εlc
PA
P0 – P = P0 – (P0.10-A) = P0(1 – 10-A)
 • Donc PF = ΦF(P0 – P) = ΦFP0(1 – 10-A)

• ΦFP0(1 – 10-εlc)

•ΦFP0(1 –e2,303εlc)

Décomposition en série de Mac Laurin

PF = ΦFP0[2,303εlc – (2,303εlc)2/2! + (2,303 εlc)3/3!..]

Si solution diluée, (A<0,05)  les termes >1 sont ≈ 0

• PF = ΦFP0.2,303εlc

Si P0 constant  PF = Kc

Si A> 0,05, perte de linéarité

-On ne peut plus négliger les termes de degré sup.
-Autodésactivation (si c aug, collision aug, CI aug)
-Autoabsorbance (absorption de la raie
d’amission)
Un dosage par fluorescence est toujours
réalisée à partir de solutions diluées
 • Question:

Pourquoi les dosages par fluorescence

sont –t-ils plus sensibles que par
spectrométrie UV?
 VI/ Effets de la structure
moléculaire sur la fluorescence

• Questions : Quelles sont les molécules

qui présentent les caractéristiques voulues
pour une analyse par fluorescence?
• Alcanes?

• Cétones, aldéhydes, amines, acides etc?

• Cycles aromatiques?

Molécules rigides, cycliques possédant des liaisons π

Ces molécules fluorescent –t-elles?

N N
Pyridine Quinoline

F Cl Br I

Pf: 10 7 5 0
• Effets d’atomes lourds : provoque une inhibition
de la fluorescence
– (Augmentation du CIS)

• Substituants électro-donneurs sur le cycle

OH, OR, NH2, NHR, NR2
– En général ces groupements provoquent une
augmentation de ε et un déplacement
bathochromique des spectres d’absorption et fluo.
spectres souvent larges et peu structurés/HC
Rq: les électrons n sont directement impliqués dans
le système π aromatique
• - Substituants électro-accepteurs.
– C=O, nitro

– Pas toujours prévisible. Mais si transition S1 de type

n-π*  ΦF faible.
– Cela peut dépendre du solvant
– Si composé nitro  ΦF nul
Conclusion: En général la fluorescence est augmentée par la
présence de groupes ED et diminuée par les groupes EA
 Exemples de molécules fluorescentes

Eosine Y
fluorescéine

Rhodamine
Exemple d’émission de fluorescence du 6-bromoacétyl-
2-diméthyllaminonaphthaène

Que se passe t’il quand la polarité

augmente?

Le fluorophore est davantage polaire à l‘EE/EF

Spectre de fluorescence à différents pH du thifensulfuron-methyl
S CO2Me OMe
O S CO2Me OMe
N pKa=4 O N
SO2 N N N -
H H SO2 N N N
N H
N
Me
Me
30 345nm
pH 30
λexc=230nm
Intensité de fluorescence (u.a)

20
22

pKa=4

Intensité à 345nm
10 14

0 6
pH
270 330 λ/nm 390 450 0 4 8 12

Emission spectra of thifensulfuron-methyl vs wavelength: effect of pH.

Insert: (b) variation of fluorescence intensity as a function of pH (exc =
279 nm; em = 347 nm).

φF (forme protonée) = 0,011 φF (forme déprotonée)= 0,0019

Spectre de fluorescence à différents pH,
de la sonde carboxy SNARF1

pKa = 7,5
 VII/ Raies de diffusion Rayleigh et Raman
• Diffusion Rayleigh (molécules)

En 1873, John William Strutt Lord Rayleigh (1842-1919) montra qu'un tel dipôle
électrique oscillant émet ou plutôt "rayonne" un champ électromagnétique dont la
puissance est donnée par la formule simplifiée suivante :
• Diffusion RAMAN
• 100 -1000 fois plus faibles que la diffusion
Rayleigh.
• Transfert d’une petite partie de l’énergie
de la radiation excitatrice aux molécules
de solvant sous forme d’énergie de
vibration (décalage vers le rouge).
• Pour chaque solvant, la différence
d’énergie entre les photons absorbés et
réémis est la même.
Diffusion Raylegh
(raie excitatrice)

Diffusion Raman
Positions des pics Raman, calculées pour
cinq λexc d’une lampe à vapeur de mercure

Excitation 254 313 365 405 Écarts

(nm) (cm-1)

Eau 278 350 416 469 3380

Ethanol 274 344 405 459 2920

Interêt: La diffusion Raman de l’eau sert de

test de sensibilité des fluorimètres
Diffusion Rayleigh :
Collision élastique entre le photon et les électrons de la molécule. Photons
diffusés à la même longueur d’onde que la longueur d’onde d’excitation. Elle
n’induit pas de perte d’énergie.
Diffusion Raman : Une partie de l’énergie est absorbée par la molécule qui
est convertie en mouvements vibrationnels et rotationnels. C’est une
collision non élastique.
Observation d’une émission à des longueurs d’onde supérieures à celles à
d’excitation. (moindre énergie)
(100 à 1000 fois plus faible
 VIII/ Instrumentation
• L’échantillon à doser se comporte comme
une source émettant dans toutes les
directions.

• La mesure sera donc faite dans une

direction perpendiculaire/ source primaire

• La mesure de l’intensité lumineuse se fait

soit à l’aide d’un PM soit d’une photodiode
 Schéma d’un spectrofluorimètre

Une lampe xénon est

souvent utilisée
 Spectre d’absorption,
spectre d’excitation et
spectre d’émission
Objectif : Trouver le meilleur couple
de λexc/λémission
1/ On enregistre le spectre UV; λmax
2/ On se place sur le fluo à λmax
3/ On enregistre le spectre fluo.
4/ On règle le monochromateur
d’émission à λmax de fluo.
On fait varier λexc.  spectre
d’excitation permettant un meilleur
choix final de la radiation excitatrice
Remarque: si on choisi une autre λ pour l’excitation, λmax fluo sera le
même mais l’intensité sera plus faible
 Exemples d’application
1/ Dosage du glyphosate (Round up)
• Problème : très soluble dans l’eau (12g/l)
et se dégrade facilement en libérant
l’AMPA.
 Dérivatisation:
FMOC ou autre
fluorophore et analyse par
HPLC/fluorescent

N - Glyphosate

λexc = 260 nm
λémission= 310 nm
Pour une sonde de fluorescence : Qu’est ce qu’un
bon fluorophore?

• Coefficient d’extinction important

• Fort rendement quantique (0,8-0,9)
• Faible rendement triplet
• Grand décalage de Stokes
• Absence de photolyse
 2/ Analyseur de dioxyde de Soufre
(SO2) par Fluorescence
• Une lampe à vapeur de zinc
très énergétique excite les
molécules de SO2.

• Ces molécules se désactivent

suivant un procédé radiatif.
• La mesure de cette émission
est proportionnelle à la
concentration en SO2.

• Un système à membrane
sélective élimine l'influence
des hydrocarbures sur la
mesure.
 3/ Analyse des NOx par
chimiluminescence.

• NO + O3  NO2 + O2 + photons

• 1/ Mesure du NO :

• 2/ Mesure du NO2 : l'air ambiant est envoyé dans un

four en molybdène chauffé à haute température où les
oxydes d'azote sont réduits en NO.

• NOx = NO + NO2 -> NO2 = NOx - NO

4/ Bioessais : Contrôle de la pollution

Rôle fondamental dans les

écosystèmes aquatiques
Spectrofluorimètre

Fibre
optique

hν hν’

S+E P+E
S = MUP
E = PA
5/ Microtox : bioluminescence
hν = 470 nm Utilisation de bacteries hν = 685 nm
bioluminescentes

Vibrio fischeri

Température = 15 °C. Présence de NaCl