Chap V Fluorescence Et Phosphorescence

Chapitre V.
Fluorescence et
phosphorescence
Description phénoménologique et
applications en sciences de la vie
Sommaire
Phénomène luminescente
Quelques éléments historiques et précisions vocabulaires
Les paramètres spectroscopiques
Spectre d’absorbance et d’émission
D’autres phénomènes inhérents à la fluorescence
Applications en biologie
Phénomène de luminescence
Rappel cas des atomes
Les différents états énergétiques des électrons
Exemple cas H d’un atome donné est discret (quantifié).
E (eV) Chaque O.A est associé à un niveau d’énergie
n→∞
discret.
n=5
Le changement d’O.A. vers un niveau d’énergie
plus bas est accompagné d’une quantité
hν = ΔE = E5 – E2
d’énergie libérée ΔE.
Lorsque l’énergie se libère sous la forme de
λ = hc/ΔE photons, nous sommes face à un
n=2 phénomène appelé luminescence.
n=1
(niveau fondamental)
Rappel cas des atomes
Exemple cas H Sans apport d’énergie la configuration
E (eV) électronique d’un atome est celle de l’état
n→∞ fondamental (niveau énergétique le plus
bas).
n=5
Pour qu’il y ait luminescence, il faut au
préalable fournir de l’énergie ΔE extérieure
pour passer à un niveau atomique excité.
Cela correspond à un changement d’O.A. vers
un niveau d’énergie plus élevé.
n=2 Cet apport d’énergie peut se faire sous formes
ΔEabs diverses…
n=1
(niveau fondamental)
Le phénomène de luminescence pour les
Cas des molécules molécules est analogue.
Cependant, en plus des niveaux électroniques, les
E (eV) molécules sont également décrit par d’autres
v3 niveaux énergétiques.
v2
v1 Les niveaux de vibration (Ev):
S1
v0 - liés aux liaisons non rigides entre les atomes.
ΔEe - les atomes vibrent naturellement les uns par

ΔEabs rapport aux autres.
- Ev sont aussi quantifiés.
v3 Les niveaux de rotation (Erot):
v2
v1 - lié à la possibilité aux molécules de tourner
S0 v0 autour de son centre de gravité
- négligeables dans les liquides et solides
C’est un phénomène radiatif (d'émission de photons) à partir d'un
atome ou d'une molécule dans un état électroniquement excité.
On distingue:
chimiluminescence : l'énergie apportée par une réaction chimique
exothermique
thermoluminescence : l'énergie apportée par chauffage
électroluminescence : l'énergie provient d'une décharge électrique
bioluminescence : l'énergie produite par une réaction enzymatique dans des
organismes vivants (bactéries, végétaux et animaux).
photoluminescence : l'énergie provient de l'absorption de photons
(fluorescence, phosphorescence)
7/4
Phénomene luminescente
Quelques éléments historiques
• 1845 (Sir John F.W. Herschel) : première observation de
la fluorescence
• 1853: G. G. Stokes nomma le phénomène
« fluorescence »
• 1871 : Découverte de la fluorescéine
• 1962: Isolation Green Fluorescent Protein (GFP) chez

Aequorea victoria par O. Shimomur (Nobel 2008)
Quelques précisions de vocabulaires
Molécules chromophores:
• Absorbe des photons dans la lumière visible
• Responsables de la coloration des éléments sans
rémission des photons
Molécules fluorescents
• Absorbe des photons dans la lumière visible/UV/IR
impliquant le passage à l’état excité des molécules
• Rémission des photons
Molécules phosphorescents
• Idem avec les fluorescents mais avec une durée de vie
plus important (quelques sec. ou minutes)
Paramètres spectroscopiques
Durée de vie de fluorescence τ
• durée de vie moyenne de l’état excité
• temps moyen pendant lequel une molécule fluorescent
demeure excitée.
Durée de vie de fluorescence τ
• durée de vie moyenne de l’état excité
• temps moyen pendant lequel une molécule fluorescent
demeure excitée.
I0 : Intensité d’émission initiale à l’issu de l’extinction

des sources d’excitation
I(t)= I0exp(-t/τ) : Intensité d’émission à l’instant t suit
une loi de décroissance exponentielle.
τ2
I0/exp(1) : l’instant où la durée de vie est définie.
τ1
τ de l’ordre de ns (10-9s) pour les molécules fluorescentes.

Coefficient d’extinction (ou d’absorption molaire) ελ:
(1) M*
hν
M
(2)
M
Coefficient d’extinction (ou d’absorption molaire) ελ:
(1) M*
hν
M
(2)
M
• Reflète la probabilité d’absorption d’une molécule à une
longueur d’onde donnée
• entre 5000 cm-1 mol-1 à 250 000 cm-1 mol-1
• exemple
ε = 80 000 L cm-1mol-1 pour la fluorescéine à 488 nm
http://www.glenresearch.com/Technical/Extinctions.html
Rendement quantique φF hν
(1) M+
M*
(2)
M + (chaleur, d’autres formes d’énergie)
Rendement quantique φF hν
(1) M+
M*
(2)
M + (chaleur, d’autres formes d’énergie)
• rend compte de la compétition entre les phénomènes de
désexcitation radiatifs et non radiatifs.
• C'est la « « probabilité » » pour qu'une molécule excitée
émette un photon.
• φF = nombre photons émis (grandeur sans dimension)
nombre photons absorbés

Intensité de fluorescence
• nombre de photons émis par unité de temps dans des conditions
d'excitation données.
• proportionnelle
• au nombre de molécules fluorescents présents dans le milieu
• donc à la concentration.
• au coefficient d’absorption moléculaire du composé fluorescent
Spectre d'émission
• le courbe de niveau qui quantifie la lumière émise par le
composé en fonction des longueurs d'onde.
• caractéristique de l'atome ou la molécule et permet donc
une analyse qualitative .
• approximativement une image inversée (effet miroir) du
spectre d'absorption.
Spectre d'émission
Concrètement, on fait varier la longueur d’onde
d’observation, et relève l’intensité d’émission pour
chaque longueur d’onde.
Spectre d’absorption
• le courbe de niveau qui quantifie la lumière absorbée par
le composé en fonction des longueurs d'onde.
• caractéristique de l'atome ou la molécule et permet donc
une analyse qualitative et semi-quantitative
Concrètement, on « éclaire » les molécules avec une source

lumineuse à spectre continu (lumière blanche), et
quantifie les longueurs d’onde absorbées.
Le spectre d’absorbance
Quand un photon rencontre une molécule, il peut être:
• Réfléchi
• Transmis (il traverse)
• Absorbé
Seul les photons dont le quantum d’énergie correspond à

des niveaux d’énergie autorisés de la molécule peuvent
être absorbés.
Source blanche ou
source à spectre continu Spectre de Spectre de
lumière incident lumière transmise
Loi Beer-Lambert: Iλ = Iλ0 exp(-lεC)

Transmittance
I
T  100
I 0
varie de 0 à 100%
Absorbance/Densité optique
1 I 0 I
A  log10  log10   log10
T I I 0
Pour chaque longueur d’onde incidente, nous pouvons
définir une valeur de transmittance et une valeur
d’absorbance.
Transmittance
I
T  100
I 0
varie de 0 à 100%
Absorbance/Densité optique
1 I 0 I
A  log10  log10   log10
T I I 0
Loi Beer-Lambert  Aλ = k.l.ε.C

Spectre de Spectre de
Transmittance
Absorbance
On peut suivre l’absorbance (ou l’intensité d’émission) à une
longueur d’onde identifiée pour différentes concentrations.
Loi Beer-Lambert  Aλ = k.l.ε.C
Absorbance
Valeurs limites:
Remarque importante:
• La couleur d’un composé non luminescent est la
combinaison de l’ensemble des longueurs d’onde non
absorbés par le composé.
Le spectre d’émission
On observe l’émission de photons lors de la relaxation
radiative de la molécule:
L’observation se fait perpendiculairement

au trajet optique de source d’excitation
On observe l’émission de photons lors de la relaxation
radiative de la molécule:
Spectre de
lumière incident
L’observation se fait perpendiculairement

au trajet optique de source d’excitation
Spectre de
lumière émise
Intensité de fluorescence
• A une longueur d’onde d’excitation λ1a et à une longueur d’onde
d’émission λ2e (tant que D.O < 0.05 ):
Concentration
Rendement quantique (mol/L ou mol/cm3)
I 2e  k  I 1a   F    l  C
Coefficient d’absorption Trajet optique (cm)
(L mol-1cm-1 ou cm2mol-1)
Phénomène de Stokes
L’observation constate l’existence d’un
décalage entre le maximum du spectre
d’absorption et celui de l’émission.
Le décalage:
• λemis > λabs
• Eemis < Eabs
Δλ = λemis - λabs ou ΔE = Eabs - Eemis

correspond au déplacement de Stokes
Phénomène de Stokes
L’observation constate l’existence d’un
décalage entre le maximum du spectre
E (eV) d’absorption et celui de l’émission.
v3
v2
v1
S1
v0 Le décalage:
• λemis > λabs
ΔEabs ΔEe
• Eemis < Eabs
v3 Δλ = λemis - λabs ou ΔE = Eabs - Eemis

v2
v1 correspond au déplacement de Stokes
S0 v0
Lié à la relaxation non radiative impliquant

transfert d’énergie inter-moléculaire.
Présence des chromophores élémentaires dans les chaines
carbonées:
Présence des molécules fluorescentes dans les acides aminés,
proteines, etc…
Possibilité de greffage des fluorophores additionnels aux
molécules cibles pour leur marquage.
 Les molécules naturelles ne sont en général pas de
bons fluorophores
Dosages quantitatifs de substances
On choisit une seule longueur d’onde et suivre la variation

de l’absorbance (la densité optique) ou de l’intensité
d’émission en fonction de C, ou l.
• Construction d’une courbe d’étalonnage à partir de plusieurs solutés
de concentration connue de molécules absorbant.
• Cette courbe d’étalonnage relie la valeur de l’absorbance ou
d’intensité pour une longueur d’onde choisie à la valeur de
concentration pour un montage optique. (Loi de Beer-Lambert)
• En gardant le même montage optique, la mesure de l’absorbance
ou d’intensité d’un soluté quelconque permet de remonter à la
concentration de molécules absorbants.
Exemple Droite d’étalonnage de la concentration en sulfate de quinine
Exemple Droite d’étalonnage de la concentration en sulfate de quinine
Mesure de I d’une
solution de
concentration inconnue
Identification de la concentration à partir de la

courbe d’étalonnage
Marquages qualitatifs pour l’observation
Molécules cibles
+
Molécules fluorescents
source Molécules cibles Système

de + d’optique
lumière Molécules fluorescents (objectifs, lentilles)
source Molécules cibles Système

de + d’optique
lumière Molécules fluorescents (objectifs, lentilles)
Détecteur pour
observation
Exemple Marquage de l’appareil de Golgi avec Bodipy céramides
Cartographie d’intensité d’émission

fluorescente issue de la microscopie à
fluorescence
Localisation, identification et suivi

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Chapitre V.

ΔEe - les atomes vibrent naturellement les uns par

• 1962: Isolation Green Fluorescent Protein (GFP) chez

I0 : Intensité d’émission initiale à l’issu de l’extinction

τ de l’ordre de ns (10-9s) pour les molécules fluorescentes.

nombre photons absorbés

Concrètement, on « éclaire » les molécules avec une source

Seul les photons dont le quantum d’énergie correspond à

Loi Beer-Lambert: Iλ = Iλ0 exp(-lεC)

Loi Beer-Lambert  Aλ = k.l.ε.C

Loi Beer-Lambert  Aλ = k.l.ε.C

L’observation se fait perpendiculairement

L’observation se fait perpendiculairement

Δλ = λemis - λabs ou ΔE = Eabs - Eemis

v3 Δλ = λemis - λabs ou ΔE = Eabs - Eemis

Lié à la relaxation non radiative impliquant

On choisit une seule longueur d’onde et suivre la variation

Identification de la concentration à partir de la

source Molécules cibles Système

source Molécules cibles Système

Cartographie d’intensité d’émission

Localisation, identification et suivi

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