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TECHNIQUE INSTRUMENTALE
Olivier Haeberl, Bruno Colicchio*
Techniques damlioration de
la rsolution en microscopie de
uorescence : de la production des
photons au traitement des images
RSUM
Fluorescence
MOTS CLS
The uorescence microscope is the instrument of choice for biology, because of its unique possibilities of acquiring
data in 3-D within a living specimen. However, compared to other techniques, its resolution is still limited to about
150 nm laterally, and no better than about 350 nm longitudinally. This limits the study of small intracellulat
stuctures. We present some techniques to improve the resolution in far eld uorescence microscopy.
KEYWORDS
I - Introduction :
Lacquisition dune image multidimensionnelle en
microscopie optique requiert la matrise de nombreuses techniques, photonique (lasers), optique
(microscope), lectronique (dtection) et informatique (traitement des donnes). Une approche systme permet cependant didentier trois
tapes (gure 1). On peut en eet sparer dans la
chane dacquisition dune image, tout dabord les
*Groupe LabEl - Laboratoire MIPS - Universit de Haute-Alsace IUT Mulhouse - 61 rue A. Camus - F-68093 Mulhouse Cedex
Tl : 03 89 33 76 60 - Fax : 03 89 33 76 05 E-Mail : olivier.haeberle@uha.fr
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Technique Instrumentale
Figure 1
A)
Dcomposition en
blocs du processus
damlioration des
images en microscopie
optique.
B)
Figure 2
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DOSSIER BIOPHOTONIQUE
TECHNIQUE INSTRUMENTALE
Figure 4
Rponse impulsionnelle optique dun microscope de uorescence 4Pi de type C pour un objectif
douverture numrique 1,4.
Figure 6
Figure 5
NOTE
Ce travail a
t ralis en
concertation avec
le programme
Interreg III aid par
la Communaut
Europenne et
la rgion Alsace,
Programme
Rhin Suprieur
Centre Sud,
Rhnaphotonics.
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Technique Instrumentale
IV - Dconvolution
Lorsque le meilleur de linstrument a t obtenu,
on peut encore amliorer les donnes obtenues par
des techniques de dconvolution, utilises pour simultanment amliorer la rsolution des images,
et les dbruiter. Les mesures quantitatives sont
alors de bien meilleure qualit. Un problme des
Figure 7
Figure 8
Dconvolution tenant
compte de la variation
spatiale de la RIO. (a) :
objet original, (b) :
convolution variant
avec la profondeur,
(c) : dconvolution
classique, et (d) :
dconvolution MonteCarlo.
V - Conclusion
Ltude des spcimens biologiques en microscopie
optique ncessite de nouveaux dveloppements
visant amliorer encore la rsolution.
Trois axes sont activement explors. La matrise
des phnomnes dmission photonique par ingnierie de la Rponse Impulsionnelle Optique
permet de rduire le volume dmission, et donc
daffiner les plus petits dtails dtectables. La
comprhension des mcanismes de formation
des images, en particulier dans les spcimens h-
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DOSSIER BIOPHOTONIQUE
TECHNIQUE INSTRUMENTALE
trognes doit permettre de maintenir la qualit
des donnes acquises, par des solutions matrielles (optique adaptative) ou numriques (restauration des images). Enfin, lorsque le meilleur
de linstrument a t obtenu, on peut encore
amliorer la rsolution par dconvolution des
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