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1853 : C’est G.G. Stokes qui donna pour la première fois le nom de
fluorescence à ce phénomène.
Rhodamine
Qu’est-ce que la fluorescence ?
Diagramme de Jablonski
• La fluorescence moléculaire se produit quand une molécule,
après avoir absorbé un photon, revient à un niveau d’énergie
inférieur et donc émet un photon.
S0 Etat fondamental
Longueur d’onde
Le DAPI (Di Aminido Phenyl lndol) se fixe
spécifiquement sur l'ADN.
Eclairé en lumière violette (max 372nm), il
emet une fluorescence bleue (max 456nm)
ce qui permet de détecter et quantifier
l'ADN
NB :
Lorsque la molécule excitée passe à l'état triplet, il se produit le même
phénomène de relaxation. Mais comme le changement de spin est
quantiquement improbable, la duré de vie de cet état, T1, est plus longue
que pour S1., les collisions désactivantes sont nombreuses. Ainsi il est très
difficile, voire impossible, d'observer le phénomène de phosphorescence
dans un milieu liquide. Il est généralement observé dans des gaz ou des
solides.
Il existe deux composés appelés par ce nom, interchangeables dans leur utilisation :
- l'éosine Y ou tetrabromofluoresceïne, dérivé tetrabromé de la fluoresceine ;
- l'éosine B en est un dérivé dibromo dinitro.
famille des
hydrocarbures aromatiques polyc
ycliques (HAP)
,
organisé en quatre
noyaux benzéniques fusionnés
IF= *IA
soit :
Dans le cas d'une solution diluée nous avons la simplification qui donne:
f = f .N
Durée de vie du singulet excité le plus bas = tau: la constante de temps de
déclin de fluo, f
1 Toluène
2 Chloroforme
3 Acétonitrile
4 Éthanol
5 Méthanol
6 Eau
La solution de gauche est la solution aqueuse, celle de droite est diluée dans le
jus de citron.
Les Inhibiteurs
Phénomènes d’inhibition : tout processus qui amène une décroissance
de la fluorescence (Quenching)
Dans la majeure partie des cas, les unités sont des unités
arbitraire(u.a) permettant après un étalonnage de faire des
analyses précises puisque l'intensité mesurée en
fluorescence est proportionnelle à l'intensité incidente I0.
Dans le premier cas c'est une étude des états stationnaires car l'état excité est sans
cesse renouvelé.
Dans le deuxième cas c'est une étude du temps de vie de l'état excité lui-même qui
est observé.
Les deux méthodes donnent chacune des informations complémentaire sur l'étude
des états excités électroniques.
L'étude des temps de vie
La source d'excitation peut être une lampe Xénon pulsée pouvant atteindre la
milliseconde mais généralement c'est une source LASER monochromatique qui
permet d'avoir un signal beaucoup plus intense.
La détection des photons peut se faire par un photo multiplicateur, ou un compteur
de photon.
• L'étude des états stationnaire par contre, n'arrête pas l'excitation des
molécules. Ce qui est observée c'est l'émission pour une excitation
constante donnée « spectroscopie de fluorescence ».
• De nos jours avec les barrettes de diode et cellule CCD il est possible d'observer
l'ensemble des longueurs d'onde émise après une excitation
NB: Le CCD (Charge-Coupled Device, ou dispositif à transfert de charge) composant électronique photosensible
servant à convertir un rayonnement électromagnétique(UV, visible ou IR) en un signal électrique.
• Fluorimètre
Le fluorimètre est un spectromètre de luminescence polyvalent, contrôlé par ordinateur.
Il est équipé d’une source xénon pulsée et est capable de mesurer la fluorescence et
la phosphorescence ou la chimiluminescence et la bioluminescence.
PCR: Réaction en chaine par polymérase méthode de biologie moléculaire d'amplification d'ADN in vitro
La fluorescence du Texas Red est à 615 nm et son pic d'absoption maximale est à
589 nm ce qui fait qu'il est plus violet que rouge