ImageUP
forma-on
2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX




BD
FACSVerse


BD
FACSAria
III


Journée
de
Forma-on

et
Informa-on
6/11/2013

ImageUP
forma-on
2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX



•  Principe

•  Applica4ons

•  Tri

ImageUP
forma-on
2013


Qu’est
que
ce
la
cytométrie
en
flux?


•  Individuelle

•  Quan4ta4ve

•  Qualita4ve

•  Par4cules
en
suspension

•  Flux
liquide

•  Source
lumineuse

ImageUP
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2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX:
Principe


Fluidique Electronique

Optique
ImageUP
forma-on
2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX:

Analyses
MulLparamétrique

Paramètres

SSC Fluorescence


LASER
 FSC

•  FSC:
Forward
ScaDer—lumière
diffractée


 
Dépend
de
la
taille
et
de
la
surface
cellulaire


 


•  SSC:
Side
ScaDer—lumière
réfléchie
et
réfractée


 
Dépend
de
la
granularité
et
de
la
complexité
cellulaire

•  Fluorescence




 


ImageUP formation 2013

CYTOMETRIE EN FLUX:
Analyses Multiparamétrique
Paramètres
•  Fluorescence

FITC FITC
FITC
FITC

FITC
FITC
Nombre d’évènements

FITC
FITC
FITC

Intensité de fluorescence
ImageUP
forma-on
2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX:
Fluidique


Low Flow Rate High Flow Rate

ImageUP formation 2013
Fluidique

Vacuum
pump

Sheath
filter Laser intercept
Flow
cell

Loader
(plates or
tube racks)

Sample
Waste tank Sheath tank
injection
tube (SIT)
ImageUP formation 2013

Optique

Detector
Collection Optics arrays

Fiber optics

Collection lens
Laser Laser Laser

FSC diode
Lens Flow cell

Excitation optics Sample core

ImageUP formation 2013
Structure de collecte du signal:
Heptagones
507 LP
527/32
FITC
Signaux
d’émission Blank
du laser
bleu

665 LP 752 LP
700/54 783/56
PerCP-Cy5.5 PE-Cy7

560 LP
488/15
586/42
Side scatter
PE
ImageUP formation 2013
Fluorochromes
Configuration 4–2–2

Lasers Position PMT Fluorochromes Autres sondes

(nm) et filtres (nm)

488 (bleu) A (750 à 810 nm) PE-Cy7

B (>670 nm) PerCP, PerCPCy5.5 IP, PE-Cy5.5, 7-AAD
D (564 à 606 nm) PE (IP)
E (515 à 545 nm) FITC GFP, Alexa 488, CFSE
F (483 à 493 nm) Side Scatter (SSC)

633 (rouge) A (750 à 810 nm) APC-Cy7 APC-H7

C (650 à 670 nm) APC Alexa 633, Alexa 647

407 (violet) A (502 à 535 nm) AmCyan, V500 Pacific orange

B (425 à 475 nm) Pacific blue, V450 DAPI, Cascade Blue
Alexa 405
ImageUP formation 2013

http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp
ImageUP formation 2013

Système Electronique
Conversion signaux optiques en signaux digitaux
proportionnels

Analog to Digital
Conversion
Signal Digital data
Photon Out to memory
In

Voltage In

PMT Digitize Sample

Power Supply the pulse the pulse

Levels 0–1000 Volts

ImageUP formation 2013

Système Electronique
Analyse digitale

Field Digital
Programmable Signal
Gate Arrays Processor
Digital data
Computer
in memory
Area
Height

PE
FITC
ImageUP
forma-on
2013


CELLULE : Unités arbitraires

10 1024 900 Nombre

de
1 cellules

0 0

10 1024

2 450

0 0

10 1024

3 450

0 0

10 1024
900
4
0
0

10 1024

5 450
0
0
450 900

etc
ImageUP
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2013


Applica4ons
de
la
CMF

  Analyse
morphologique

  Immunophénotypage

  anLgènes
membranaires

  anLgènes
intracellulaires

  Analyse
du
contenu
en
ADN

  Cycle
cellulaire

  Viabilité

  ProliféraLon
cellulaire

  Suivi
de
l’ac4vité
géné4que
par
l’expression
d’un
gène

rapporteur
(GFP)

  Mesure
de
l’apoptose

  Phagocytose

  Stress
Oxyda4ve

  Flux
calcique

  Signalisa4on
cellulaire
…



ImageUP
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Analyse
morphologique

















Forward
ScaDer:
taille


Granulocytes

Monocytes

Lymphocytes













Side
ScaDer:
granularité

ImageUP
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Immunophénotypage

ACM anti-CD3 ACM anti-CD4 ACM anti-CD19 ACM anti-CD14

PE FITC APC PE-Cy5

PE FITC

CD3 ?
CD19 ?

Leucocyte FITC+ PE+ APC- PECy5-

CD4+ CD3+ CD19- CD14-

CD # : Cluster de différenciation
ImageUP
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Immunophénotypage


CD19+
CD3‐
 CD19+CD3+


CD19‐CD3‐
 CD19‐
CD3+


Lymphocytes
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Marquage
intracellulaire


Perméabilisa4on
des
cellules



FITC

Leucocyte

•  Sécré4on


•  Signalisa4on
…

ImageUP formation 2013

Viabilité
Cellules
THP1

+
 2.4 %
Thalidomide
(
#

conc.)

Incuba4on
48
HS

+

Iodure
de
Propidium

Intercalant

Imperméant


3.8 % 9.5 % 99.7 %

ImageUP
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2013

Apoptose:

Mise
en
évidence
des
différentes
étapes




Induc4on:

Condensa4on
T2h
 Fragmenta4on
T6h


T0


Chute
du
poten-el
membranaire
mitochondrial

(DiOC6)

Altéra-ons
de
la
membrane
plasmique
(Annexine
V)


Expression
des
caspases,
famille
Bcl‐2

Fragmenta-on
DNA
(TUNEL)

ImageUP
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Apoptose:
DiOC6


Détec4on
des
altéra4ons
de


poten4el
de
membrane


DiOC6:
carbocyanines


La
fluorescence
est
modifiée
selon

l’environnement
électrique


Cellules
JURKAT
+

Camptothecin
(18
HS)


ImageUP
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2013


Apoptose:
Annexine
V

Détec4on
des
altéra4ons
de
la
membrane
plasmique


Extériorisa4on
des
phospha4dyl‐sérines
(PS)


Annexine
V:
forte
affinité
pour
résidues
PS

Annexine
V
‐
APC


Cellules
JURKAT
+

Cellules
JURKAT

camptothecin
(4
HS)


ImageUP
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2013


Proliféra4on
cellulaire:
marquage
au
CFSE

CFSE:
CarboxyFluorescein
diacetate
Succinimidyl
Ester



Suivi
de
la
proliféra4on
lymphocytaire
dans

Charge
des
cellules
au
CFSE
 le
sang
périphérique


Distribu4on
équivalente
de
la
fluorescence
entre
les
cellules
filles
 J0:
cellules
arrêtes
en
généra4on

parentale
(mitomycin)



S-mula-on
de
la
proliféra-on

 (PHA)


J7:
généra4ons
successives


ImageUP
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2013


Phagocytose


FITC-Labeled Bacteries















FITC





















Neutrophile
ImageUP
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2013


Avantages
de
la
CMF


Analyse
quan4ta4ve


Sensibilité
de

détec4on


Rapidité


Analyse

mul4paramétrique


Tri

ImageUP
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2013


TRI


•  Principe

•  Introduc4on
au
système
BDFACSAria
III

•  Quelques
exemples…….

ImageUP
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TRI
:
Principe

ImageUP
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2013

ImageUP
forma-on
2013


TRI:
Principe

Déflec4on
électrosta4que
de
gouDes
chargées




‐
Les
cellules
sont
aspirées
de
l'échan4llon




‐
injectées
une
à
une
par
une
buse
dans
un

courant
con4nu
(forma4on
du
jet)

‐
Le
jet
se
rompre
pour
donner
des

gouDes
à
un
point
précis
appelé
«
break

of
point
»

‐
Chargement
de
goutes


‐
Les
goutes
sont
déviées
du
côté
de
la
plaque
de

polarité
opposée
et
collectée


En
appliquant
différent
niveau
de
charge

à
gauche
et
à
droite,
il
est
possible
de

trier
quatre
populaLons
simultanément

sur
le
BD
FACSAria
III.


ImageUP
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2013


TRI:
PRINCIPE


1‐
les
signaux
sont
analysées
au

3‐Charge
du
jet

point
d’intercep4on


4‐«
break
of
point
»

2‐
Décision

de
tri
selon
les



critères
définis
par
l'u4lisateur


5‐
plaques
de
déflec4on

électrosta4que:
déflec4on
de

gouDes
chargées




6‐
Les
goutes
non
chargées

passent
à
la
poubelle

7‐
Les
goutes
chargées
(par4cules

d’intérêt)
sont
collectées



ImageUP
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2013


TRI:
Principe

Stabilité
du
jet


Pression

Liquide
de
gaine


Fréquence
 Taille
de
la
buse


Amplitude

ImageUP
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2013


TRI:
Principe

Op4misa4on
de
paramètres



Pression

Taille
de
la
buse
 Fréquence

Liquide
de
gaine


Viabilité
cellulaire

Taille
de
la
 Pression
 Fréquence
 Type
cellulaire

buse
 Liquide
de
 




 gaine
 (KHZ)

(µm)
 (psi)
 




 


70
 70
 90
 Lymphocytes
T
non
ac4vés,
Lymphocytes
B,

Bactéries,
Levures.

85
 45
 47
 Lymphocytes
T
ac4vés,
cellules
plasma4ques,
NK,

NK‐T,
Monocytes,
mDC,
pDC,
cellules
souches.




100
 20
 20
 Cellules
4ssulaires,
Neurones,
Macrophages,



130
 10
 12
 


ImageUP
forma-on
2013


TRI:
Principe


Précisions

Pureté

Rendement

«
Single
Cell
»

ImageUP
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2013


BD
FACSAria
III

ImageUP
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2013


BD
FACSAria
III

Système
Op4que

Lasers


375
nm
 405
nm
 488
nm
 561
nm
 633
nm


ImageUP
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2013


BD
FACSAria
III

Système
de
collec4on


Le
module
ACDU
(automated
cell
deposi4on
unit)

ImageUP
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Le
BD
FACSAria
III
permet:



  Trier
sur
des
microplaques
de
24,
96
puits
ou
384
puits,
des
lames
ou
des
tubes.





  Trier
dans
des
condiLons
de
température
contrôlée

(4,
20,
37
et
42
°C)
et



dans
des
condiLons
asepLques.




  
Trier
à
différentes
pressions
(5
à
75
psi)
et
avec
quatre
tailles
de
buses
(70,
85,
100
et

130
µm)
pour
trier
divers
types
des
parLcules.





  l’analyse
simultanée
de
18
paramètres
(FSC,
SSC
et
16
fluorescences).




  l’acquisiLon
à
une
vitesse
maximale
de
70.000
évènements/sec.




  Trier
avec
un
maximum
de
pureté
ou
un
maximum
de
rendement
(pour
une
peLte
et

précieuse
populaLon)
ou
un
maximum
de
précision
pour
un
clonage.




  Récupérer
des
cellules
viables

ImageUP
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2013


Quelques
exemples…

Tri
des
lymphocytes
T
(CD3
+)
et
monocytes
(CD14
+)
à
par4r
de
CMN
de

sang
périphérique




Avant
Tri

Après
Tri

99.7
%


8.6
%



54.1
%


98.0
%

Après
Tri

ImageUP
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2013

Quelques
exemples…

Tri
des
cellules
GFP
+
à
par4r
de
lignée
transfectée


Avant
Tri

Après
Tri

97
%


31.7
%


67.9
%


Après
Tri


99.3
%

ImageUP
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2013


Quelques
exemples…


Am
J
Physiol
Cell
Physiol.
2010
June;
298(6):
C1326–C1342.


ImageUP
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2013


Stratégie
de
«
ga4ng
»:


Cellules
souches
de
sang
de
cordon


BV
421‐
CD38

SSC‐A


7‐AAD

Lineage
‐
viable


PBMC
 CD34+
CD38‐


FSC‐A
 FITC
lineage
cocktail
4
 APC‐
CD34


All
events


CD45
RA
–
CD90
+
 PBMC

BV
605‐
CD
90


BV
605‐
CD
90


Lineage
‐
viable

CD
49f+
CD90
+

CD34+
CD38‐


CD45
RA
–
CD90
+


CD
49f+
CD90
+


APC‐
H7
CD45
RA
 PE
CD
49f

ImageUP
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2013


CYTOMETRIE
EN
FLUX


Informa4ons
pra4ques…..


Responsables
et

contacts
 Localisa4on
 Matériel



 PBS

Adriana
Delwail
 
secteur
α
 Cytomètre
analyseur

Tél:
05
49
45
40
56
 BD
FACSVerse

Mail:
Adriana.
Delwail@univ‐poi4ers.fr

Niveau
1



 Salle
MS
Q24


 



Jean‐François
Jégou

Tél:
05

49
45
36
45

Cytomètre
trieur


Mail:
jean‐francois.jegou@univ‐poi4ers.fr


BD
FACSAria
III





ImageUP
forma-on
2013


Maintenant,
c’est
à
vous…..


•  Histogram
•  Dot plot
•  Contour plot
•  3D plots/isometric
•  Dot plot with projection