LP n°32 : Microscopies optiques (LP n°16 du Concours Externe Spécial)

Ugo Hincelin
Juin 2017

Niveau 3 Autres microscopies optiques 4

3.1 Microscope pour objet opaque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Licence 2 3.2 Microscope en champ sombre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.3 Microscopie optique de uorescence[5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.4 Haute résolution : microscopie optique à champ proche[2, 4, 3] . . . . . . . 6
Objectifs
4 Conclusion 7
 Appliquer les notions d'optique à un instrument : le microscope
 Construire et savoir utiliser un microscope 5 Questions / Commentaires 7
 Connaître diérents types de microscopie optique
Références
Prérequis [1] P. Grécias, J-P. Migeon, 1999, Tec&Doc Physique Sup. PCSI
 Optique géométrique [2] S. Houard, 2011, Optique - Une approche expérimentale et pratique, de boeck
 Diraction [3] R. Taillet, L. Villain, P. Febvre, 2008, Dictionnaire de physique, de boeck
 Optique expérimentale [4] JP. Perez, 2004, Optique - Fondements et applications, Dunod
[5] Sujet d'écrit Agrégation externe 2015 (faute de mieux...)
Table des matières
1 Introduction 2
2 Le microscope composé 2
2.1 Description [1] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2.2 Modèle optique et montage [1, 2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2.3 Puissance et grossissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.3.1 Puissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.3.2 Grossissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.4 Cercle oculaire et position de l'÷il . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.5 Profondeur de champ et réglage de la mise au point . . . . . . . . . . . . . 4
2.6 Ouverture numérique et limite de résolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1
1 Introduction  Distance invariante entre objectif et oculaire par xation au tube lié au support dit
 statif . Intervalle optique ∆ = F10 F2 (16 cm en général, standardisé).
Pour voir les objets lointains, nous utilisons des lunettes ou des télescopes an d'aug-  Miroir et condenseur pour concentrer la lumière sur l'objet
menter la quantité de lumière reçue et d'agrandir les images des objets. Pour voir les
objets proches à l'échelle microscopique, nous utilisons des microscopes. Il existe dié-
rents types de microscopes basés sur des phénomènes physiques diérents : microscope
optique, électronique (à balayage, à eet tunnel), à force atomique... Nous allons focaliser
sur les microscopies optiques. 2.2 Modèle optique et montage [1, 2]
L'oculaire sert de loupe dans l'examen de l'image A1 B1 donnée par l'objectif, donc A1
2 Le microscope composé se trouve entre F2 et O2 .
Inventé par les hollandais Jansen père et ls à la n du XVI siècle. L'idée principale est
d'observer, non pas l'objet directement comme avec une loupe, mais l'image agrandie que
donne, de l'objet, un autre système optique, appelé l'objectif. Le microscope forme donc
une image agrandie de l'objet à l'aide de plusieurs lentilles. Cas limite : A1 = F2 Expliquer le modèle optique en parallèle du montage.

2.1 Description [1]

Figure 2  Modèle cas limite [1]

Figure 1  Microscope optique [1]
Il comporte deux systèmes optiques : l'objectif et l'oculaire : Vision à l'inni, sans accommodation pour l'÷il normal.
 Objectif, placé près de l'objet, assimilé à une lentille mince convergente L1 de faible
distance focale f10 (usuellement entre 2 à 45 mm) donne une image fortement agrandie
 Oculaire, placé près de l'÷il, assimilé à une lentille mince convergente L2 (focale f20
entre 15 et 45 mm), sert de loupe pour voir l'image réelle fournie par l'objectif Cas général : A1 au voisinage de F2 Dans le cas d'une vision avec accommodation.

2
 0
 Mon microscope : Pi = Aα1 B1 AAB
1 B1
= 1 A1 B1
F2 AB = 1
200.10−3 × 9
1 = 45δ
 OdG : faible = 160, fort = 1600

2.3.2 Grossissement
Par dénition,
α0 α0
G= = dm = P dm (3)
α AB
avec

Figure 4  [1]
On dénit le grossissement commercial avec dm = 25cm = 41 m :
Figure 3  Modèle cas général [1]
∆ 1 ∆
Gc = dm = (4)
Bilan Image dénitive A B est 1) virtuelle, 2) agrandie, 3) renversée par rapport à
0 0 0 0
f1 f2 4 f10 f20
l'objet
2.4 Cercle oculaire et position de l'÷il
2.3 Puissance et grossissement Où placer notre ÷il pour avoir un maximum de lumière ?
2.3.1 Puissance C : centre du cercle oculaire
Φ0 : diamètre du cercle oculaire
Par dénition, la puissance est Φ : diamètre de la monture
α0 α 0 A1 B 1
P = = = P2 |γ1 | = Poc |γob | (1)
AB A1 B1 AB

L'oculaire fait oce de loupe (P2 ). La microscope amplie la performance de la loupe

d'un facteur |γob |.

Expression en fonction des caractéristiques du microscope Si l'image est à l'inni

on obtient la puissance intrinsèque Pi :
F10 A1
Formule de Newton du grandissement : |γob | = f10 = ∆
f10
0
Poc = Aα1 B1
= f10 donc
2
∆
Pi = (2)
f10 f20
 Avec f10 = 4mm, f20 = 4cm, ∆ = 16cm on obtient Pi = 100δ Figure 5  Cercle oculaire I10 J10 [1]

3
  Formule de conjugaison de Newton à L2 : F2 O1 .F20 C = −f20 2 donc Lien avec puissance intrinsèque [2] l=
f102 f20 2
∆2 dm = 1
Pi2 dm
ce qui donne :
f20 2 f02  grossissement faible : l = 0, 16mm pour Pi = 160δ
F20 C = = 0 2 (5)  grossissement élevé : l = 1, 6µm pour Pi = 1600δ
O1 F10 0
+ F1 F2 f1 + ∆
 Calcul pour mon montage microscope ?
. Avec f10 = 4mm, f20 = 4cm, ∆ = 16cm on obtient F20 C = 1cm => position de l'÷il
voisine de F20 .
0
 Formule de Descartes du grandissement à L2 : |γ| = ΦΦ = OO22OC1 = 16+4+0,4
5
' 0, 25.
Avec Φ = 1mm on obtient Φ = 0, 25mm < diamètre pupille de l'÷il (quelques mm).
0
2.6 Ouverture numérique et limite de résolution
2.5 Profondeur de champ et réglage de la mise au point Sur objectif, noté par exemple 10/0.22, grandissement/ouverture numérique.
Il existe une latitude de mise au point pour notre ÷il. Mettre au point signie amener
Parler du critère de Rayleigh.
A0 B 0 entre le punctum proximum (PP, environ 25 cm) et le punctum remotum (PR, à l'in-
ni) 1 en déplaçant l'ensemble rigide objectif/oculaire. Distance entre positions extrêmes Demi-angle θ au sommet du cône délimitant l'onde diractée par un diaphragme circu-
objet/objectif = profondeur de champ l. laire de diamètre d vérie : sin θ = 1, 22 λd (note 2 ). La taille de diraction est donnée par
la pupille de l'objectif. Le diaphragme est donc la taille de l'objectif. Démo dans le [2] par
Démontrons l'utilité d'une vis micrométrique pour le réglage exemple.

Démonstration (donner début et n) dm est la distance minimale de vision distincte

l = AR AP pour objet AR au PR et AP au PP. 0, 61λ0 λ0
Relation de conjugaison de Newton pour L1 et L2 : F1 A.F10 A1 = −f10 2 et F2 A1 .F20 A0 = ABmin = = 0, 61 (9)
n sin θ ω0
−f20 2
On cherche F1 A pour les deux cas et on fait la diérence des deux pour obtenir l =
F1 AP − F1 AR .
ω0 est l'ouverture numérique, caractéristique la plus importante du microscope
Cas limite : F10 A1 = ∆ et F2 A1 = 0 donc
Plus ω0 est grande, plus ABmin est petite.
−f10 2
F1 AR = (6) OdG : avec un objectif à immersion et UV-visible (nliq = 1, 50,ω0 = 1, 25, λ0 = 400nm)
∆
on obtient ABmin = 0, 2µm.
Cas général : F10 A1 = F10 F2 + F2 A1 = ∆ + F2 A1 et F20 A0 = −dm donc
−f10 2 −f10 2 −f10 2
F1 AP = = = f02
(7)
F10 A1 ∆ + F2 A1 ∆ + d2m
donc
3 Autres microscopies optiques
!
f102 f20 2 1 f102 f20 2
l = F1 AP − F1 AR = ... = ' (8)
∆2 dm 1+
f20 2 ∆2 dm Diérents phénomènes : par transmission (vu avant), réexion, diusion.
∆dm

Avec f10 = 4mm, f20 = 4cm, ∆ = 16cm et dm = 25cm, on trouve l = 4µm, il faut donc
régler par vis micrométrique.
2. Le nombre 1,22 correspond à la première annulation de la fonction de Bessel J1 (intervenant dans
1. L'÷il du myope a un PP plus petit et un PR qui n'est pas à l'inni le calcul de la gure de la diraction par une ouverture circulaire) divisée par π.

4
3.1 Microscope pour objet opaque 3.3 Microscopie optique de uorescence[5]

La uorescence est l'émission de lumière par une molécule immédiatement après son
excitation lumineuse, en général à une longueur d'onde plus grande. Les photons émis lors
de l'émission de uorescence n'ont pas de direction privilégiée. Il s'agit donc de choisir un
objectif de grande ouverture numérique.

Dans un microscope de uorescence, on trouve généralement, en plus des éléments d'op-

tique conventionnels, un ltre d'excitation, un ltre d'émission et un miroir dichroïque
ltrant. L'objectif joue le double rôle de focaliser la lumière incidente sur l'échantillon et
de collecter la lumière que celui-ci renvoie.

Le ltre d'excitation sélectionne la longueur d'onde excitatrice des uorophores de

Figure 6  [4] l'échantillon, le ltre d'émission sélectionne la longueur d'onde de la lumière de uo-
rescence produite par l'échantillon et le miroir dichroïque ltrant rééchit très bien les
Lame semi-transparente. Réexion de la lumière. Très utilisé en métallographie. radiations excitatrices tandis qu'il transmet très bien les radiations d'émission.

3.2 Microscope en champ sombre

Figure 7  [4]

Rayons directs arrêtés. Diusion de la lumière (si taille objet ~ λ alors diusion de Mie)
par l'objet. Seuls les rayons diusés atteignent l'÷il. On voit les corps diusant sur fond
sombre. => contraste amélioré Figure 8  Schéma de montage[5]

5
 Figure 9  Transmission en fonction de la longueur d'onde[5]

Figure 10 

3.4 Haute résolution : microscopie optique à champ proche[2, 4, 3]

Prix Nobel 2014 : Eric Betzig, William Moerner et Stefan Hell pour le développement
de la microscopie à uorescence à très haute résolution. On allume une image puis l'autre,
et on fait la somme des deux, et on dépasse le critère de Rayleigh, génial ! On dépasse la limite de résolution du microscope composé.

6
 4. Utiliser une excam pou montrer en direct ce qu'on voit avec un microscope de labo
(si les deux sont disponibles). Changer les réglages en live et montrer l'inuence.
5. Idée à faire passer : on voit avec l'÷il mais on mesure avec une caméra. Dans ce
dernier cas, l'objectif est enlevé. On met la caméra en A1B1, l'image intermédiaire.
6. Grossissement : terme le plus moderne.
7. Profondeur de champ et ouverture numérique : termes importants à bien expliquer.
8. Début de la présentation : montrer de belles images de zoom, comme dans le [2]
9. Montrer un objectif et expliquer les écritures. Il y a en fait à l'intérieur plusieurs
lentilles (6, 7, 8) pour corriger les aberrations (ab. chromatique, aplanéité car on veut
Figure 11  [4] au foyer un champ plan, ab. sphérique) => voir le site web de Nikon, la marque
japonaise.
Années 1980
10. Tous les objectifs sont maintenant corrigés avec l'objet AB sur le foyer. On a l'image
Phénomène : réexion totale frustrée
à l'inni. On met alors une lentille tube (donc dans le tube) à 160 mm.
Pointe constituée d'une bre optique de diamètre nanométrique approchée à quelques
nm de la surface d'un dioptre.
Dioptre éclairé par l'autre face et réexion totale.
Fibre capte une onde évanescente (onde stationnaire spatialement amortie, amplitude
qui décroît exponentiellement).
Détails accessibles plus ns que l'onde diractée. Résolution OdG nm.

4 Conclusion
Nous avons vu dans le détail le microscope combiné. Nous avons abordé quelques tech-
niques diérentes, notamment une technique à haute résolution.
Si on s'éloigne de l'optique pour aller vers le microscope électronique, on peut obtenir
des images d'objets microscopiques grâce à l'analyse de leur interaction avec un faisceau
d'électrons.
Microscope électronique en transmission : principe similaire du microscope optique mais
utilise les propriétés ondulatoires des électrons. Le faisceau d'électron est diracté en
traversant l'échantillon, et des lentilles magnétiques permettent de reconstruire l'image
comme en microscopie optique. Résolution bien meilleure car longueur d'onde de de Broglie
inférieure aux longueurs d'onde optiques.

5 Questions / Commentaires
1. Dire qu'on fera les calculs en TD, et donc qu'on passe du temps sur les explications
et les schémas.
2. Montrer l'image d'une source avec les yeux puis avec le microscope, par exemple
utiliser une caméra sur mon microscope monté.
3. Parler de l'éclairage du microscope... Quoi dire exactement ?