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Evaluation de l'activité antifongique de Trichoderma spp., Gliocladium spp. et


Aspergillus spp. contre Rhizoctonia solani par double culture et test de leurs
filtrats de culture

Article · January 2013

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5 authors, including:

Rabiaa Haouala Hayfa Jabnoun-Khiareddine


High Agronomic Institute of Chott Mariem Regional Research Center on Horticulture and Organic Agriculture (CRRHAB). Cho…
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Mejda Daami-Remadi
Regional Research Centre on Horticulture and Organic Agriculture, Chott-mariem,…
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Evaluation de l’activité antifongique de Trichoderma spp.,
Gliocladium spp. et Aspergillus spp. contre Rhizoctonia
solani par double culture et test de leurs filtrats de culture

1,2 2 3 3
ALAYA BEN SALEM Soumaya* , HAOUALA Rabiaa , JABNOUN-KHIAREDDINE Hayfa et DAAMI-REMADI Mejda
1
: Laboratoire de production végétale, Institut National Agronomique de Tunisie, Université de Carthage
2
: UR13AGR05-Agrobiodiversité, Institut Supérieur Agronomique de Chott-Mariem, Université de Sousse, 4042, Chott-
Mariem, Tunisie.
3
: UR13AGR09-Production Horticole Intégrée au Centre Est Tunisien, Centre Régional des Recherches en Horticulture et
Agriculture Biologique, Université de Sousse, 4042, Chott-Mariem, Tunisie.

RÉSUMÉ

Rhizoctonia solani est devenu une véritable menace de la culture de pomme de terre, en Tunisie. Les pratiques culturales
sont inefficaces et jusqu’à présent très peu de fongicides efficaces sont disponibles. Dans le présent travail, le pouvoir
antifongique des Trichoderma spp., des Gliocladium spp. et des Aspergillus spp. isolés à partir du compost, des racines de
Solanaceae et de la rhizosphère de la pomme de terre, respectivement, a été suivi in vitro contre R. solani. Leur effet
inhibiteur sur la croissance du pathogène a été évalué en se basant sur la méthode de double culture et en testant leurs
filtrats de culture. Dans l’essai de double culture, les intervalles des pourcentages d’inhibition assurés par les espèces
Trichoderma, Gliocladium et Aspergillus sont respectivement compris entre 27 et 33%, 12.34 et 12.59% et 7 et 12%. Les
observations microscopiques réalisées au niveau des zones de confrontations montrent que les espèces Trichoderma
agissent contre R. solani par mycoparasitisme et compétition tandis que le mode d’action des espèces Gliocladium a varié
entre mycoparasitisme et antibiose tout comme les espèces Aspergillus. Les filtrats de culture des agents antagonistes
utilisés montrent que les espèces Gliocladium assurent le meilleur potentiel inhibiteur sur R. solani.
Mots clés: Antagonisme, croissance mycélienne, filtrats de culture, lutte biologique, Rhizoctonia solani.

ABSTRACT

Rhizoctonia solani has become a real threat to potato crop in Tunisia. Cultural practices are inefficient and at present, very
few effective fungicides are available. In the present study, the antifungal potential of Trichoderma spp., Gliocladium spp.
and Aspergillus spp. isolated from compost, roots of Solanaceae and potato rhizosphere, respectively, was assessed in
vitro against R. solani. Their inhibitory effect against pathogen growth was evaluated by using the dual culture method
and testing of their culture filtrates. In the dual culture test, the percentages of inhibition induced by Trichoderma,
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Gliocladium and Aspergillus species varied, respectively, between 27 and 33%, 12.34 and 12.59%, and 7 and 12%.
Microscopic observations realized at the confrontation zone show that Trichoderma species act against R. solani by
mycoparasitism and competition while the mode of action of Gliocladium species ranged between mycoparasitism and
antibiosis as well as for Aspergillus species. The culture filtrates of antagonistic agents used showed that Gliocladium
species provide the best inhibitory potential against R. solani.
Keywords: Antagonism, biological control, culture filtrates, mycelial growth, Rhizoctonia solani.

Introduction la qualité marchande des tubercules et à la


diminution du rendement qui s’élève jusqu’à 50%
La pomme de terre est une culture vivrière (Häni et al., 1998).
stratégique dans le monde entier et en Tunisie en --------------------------------------------------------------------------------------
* Correspondance : ALAYA BEN SALEM Soumaya Laboratoire de
particulier, où elle occupe environ 16% de la production végétale, Institut National Agronomique de Tunisie,
superficie cultivée (Azzouz, 1996). Toutefois, cette Université de Carthage ; soumaya.abs@gmail.com
culture est soumise à plusieurs bio-agresseurs tel
que Rhizoctonia solani Kühn qui engendre de
sérieuses pertes économiques dues à l’altération de
3
Les symptômes induits par ce pathogène se Evaluation du pouvoir antagoniste par double
résument à la formation de chancres au niveau du culture
collet et des stolons, la mort des jeunes pousses, la
réduction du système racinaire et la formation de Les agents biologiques ont été testés par double
sclérotes sur les tubercules fils (El Bakali et Martin., culture avec R. solani. La technique consiste à
2006). Les tubercules infectés servent de sources repiquer dans une même boite de Petri, contenant
d'inoculum primaire pour les cultures suivantes le milieu PDA, un disque d’agar de 4 mm de
(Tsror (Lahkim) et al., 2001) et assurent la diamètre colonisé par le pathogène et un autre
contamination des sols (Lutomirska, 2007). Le colonisé par l’agent antagoniste à tester. Chaque
rhizoctone brun de la pomme de terre est favorisé traitement antagoniste est répété trois fois (trois
par un climat frais et humide après la plantation, boites par antagoniste). Dans les cultures témoins,
ainsi que par tous les facteurs qui retardent la levée les disques d’antagonistes sont remplacés par un
des plantes tels qu’une plantation profonde dans un disque de PDA. L’incubation est faite à 25°C et à
sol froid, l’utilisation de tubercules non prégermés, l’obscurité.
etc (Beauvallet, 2012). Jusqu’à maintenant, aucun Le pourcentage d’inhibition de la croissance radiale
des fongicides autorisés ne donne entière de R. solani est calculé en utilisant la formule
satisfaction dans la suppression des symptômes suivante [PI= ((R1- R2)/R1)*100, avec R1 :
(Yao et al., 2002). croissance radiale du pathogène dans la boite
En Tunisie, les variétés de pomme de terre les plus témoin et R2 : croissance radiale du pathogène dans
cultivées sont sensibles au rhizoctone brun (Daami- les boites de confrontation] (Royse et Ries., 1978).
Remadi et al., 2008; Djébali et Belhaj., 2010). Cette Les mesures de la croissance radiale, R1 et R2 du
maladie est surtout gérée par les pratiques pathogène, ont été réalisées après 48 h ou 72 h
culturales et le traitement chimique des tubercules d’incubation et ce, selon la vitesse de croissance de
en pré-plantation. La lutte biologique a donné des l’antagoniste testé.
résultats prometteurs (El-Kot et Belal., 2006). En Selon la méthode de Royse et Ries (1978), le mode
effet, des espèces de Gliocladium (Van den Boogert, d’inhibition (MI) déployé par chaque antagoniste
1996), de Trichoderma (Wilson, 2008), de est aussi évalué selon une échelle allant de 1 à 4 où
Verticillium et de Penicillium (Chand et Logan., 1= la croissance mycélienne de R. solani cesse suite
1984) ont été utilisées contre R. solani. Certains à la prolifération de l’antagoniste, 2= inhibition
auteurs ont également cité des espèces d’Alternaria partielle de la croissance mycélienne du pathogène
et d’Aspergillus (Feng et al., 2008). Dans le présent et de l’antagoniste mais les deux croissent
travail, nous proposons d’évaluer le pouvoir lentement l’un au-dessus de l'autre, 3= une
antifongique de trois espèces de Trichoderma, deux inhibition mutuelle à une distance inférieure à 2
espèces de Glicladium et de cinq espèces mm, 4= la croissance de R. solani est inhibée à une
d’Aspergillus contre R. solani. distance supérieure à 2 mm.

Matériel et méthodes Evaluation du pouvoir antifongique des filtrats de


culture
Matériel fongique
Les filtrats de culture des agents antagonistes testés
L’agent pathogène, R. solani, a été isolé à partir des ont été également évalués pour leur activité
tubercules de pomme de terre montrant des antifongique contre R. solani en adoptant la
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symptômes typiques de rhizoctone brun. Il est méthode d’Anith (1997). En effet, chaque
cultivé sur le milieu PDA (Potato Dextrose Agar) antagoniste est cultivé dans le milieu PDB (Potato
additionné de 300 mg/l de sulfate de streptomycine Dextrose Broth) pendant 20, 30 et 40 jours. Les
(Sneh et al., 1991). Les cultures du pathogène filtrats de culture obtenus sont récupérés puis
utilisées sont incubées à 25°C et à l’obscurité centrifugés trois fois à 10000 tours/min pendant 15
pendant 2 semaines avant leur utilisation. min. Les surnageants recueillis sont filtrés à travers
Les champignons antagonistes testés sont un filtre millipore de 0,45 μm avant leur utilisation.
Trichoderma harzianum, T. viride, T. virens, Les filtrats sont additionnés au milieu de culture en
Gliocladium catenulatum, G. roseum, Aspergillus surfusion à raison de 2 ml par 10 ml de PDA soit
flavus, A. terreus, A. niger, A. nidulans et Aspergillus 20% v/v. Dans chaque boite de Petri, trois disques
sp.. Ils ont été isolés à partir du compost, des d’agar colonisés par R. solani sont repiqués d’une
racines saines de Solanaceae et de la rhizosphère façon équidistante. Les cultures témoins sont
de la pomme de terre. Les cultures fongiques additionnées d’un même volume de milieu PDB. La
utilisées sont incubées à 25°C et à l’obscurité croissance radiale des colonies de R. solani est
pendant une semaine avant leur utilisation. enregistrée après 48 h d’incubation à 25°C.

4
Résultats

Double culture

La figure 1 montre que les espèces de Trichoderma


ont inhibé de 27 à 33% la croissance mycélienne de
R. solani comparée au témoin non traité. Cependant,
le pourcentage d’inhibition enregistré avec les
espèces de Gliocladium est d’environ 12% tandis que
celui induit par les espèces d’Aspergillus a varié de 7
à 12%. L’inhibition de la croissance radiale du
pathogène par les espèces Trichoderma est
hautement significative comparée au témoin non
traité (P < 0,01). En effet, ces espèces ont contribué Figure 2 : Pourcentage d’inhibition de la croissance
aux pourcentages d’inhibitions les plus élevés et T. mycélienne de Rhizoctonia solani par Gliocladium spp. et
viride était l’espèce la plus efficace avec un Aspergillus spp. noté après 72 h d’incubation à 25°C.
N.B. Les barres attribuées de la même lettre ne sont pas
pourcentage d’inhibition de 33%. Ces résultats sont significativement différentes selon le test SNK à P ≤ 0,05
similaires à ceux trouvés par et Seema et Devaki
(2012). Les espèces de Gliocladium et d’Aspergillus
ont également réduit significativement la croissance
in vitro du pathogène (P < 0,01) avec une meilleure
efficacité enregistrée avec le genre Gliocladium et
plus précisément G. roseum qui a réduit de 12,6% la
croissance radiale de R. solani (Figure 2). Pour le
genre Aspergillus, les réductions les plus
importantes, de l’ordre de 12,09 et 11,08%, ont été
enregistrées avec A. flavus et A. terreus,
respectivement (Figure 2).
Les résultats de l’essai de la double culture Figure 3: Observation microscopique de l’interaction des
montrent que le contact entre les colonies des hyphes des antagonistes testés avec celles du pathogène.
Trichoderma spp. et celles de R. solani a eu lieu P : Pénétration du mycélium de l’antagoniste à l’intérieur de
après 48 h d’incubation et que ces agents celui de Rhizoctonia solani.
L : Lyse du mycélium de R. solani.
antagonistes testés ont réussi à proliférer et à E : Enroulement du mycélium de l’antagoniste autour de celui
envahir la colonie du pathogène (mode d’inhibition = de R. solani
1) (Tableau 1, Figure 4a). Les observations
microscopiques réalisées sur les hyphes du L’interaction mycélienne de R. solani avec les
pathogène prélevées au niveau de la zone de espèces de Gliocladium et d’Aspergillus, enregistrée
confrontation ont révélé l’enroulement des filaments après 72 h d’incubation, a montré un faible pouvoir
mycéliens (mycoparasitisme) autour de ceux du compétitif de ces antagonistes. Le mode
pathogène et la forte lyse de ce dernier (Figure 3). d’inhibition effectué par les deux espèces de
Gliocladium utilisées est MI=3 (Tableau 1).
Les observations microscopiques réalisées au niveau
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de la zone de confrontation de R. solani avec G.


catenulatum ont montré une lyse mycélienne alors
qu’en cas de double culture avec G. roseum, un
mycoparasitisme et une pénétration du mycélium du
pathogène ont été observés. Les différentes espèces
d’Aspergillus ont également montré différents
mécanismes de bio-contrôle. En effet, A. flavus et
Aspergillus sp. ont assuré le mode d’inhibition MI=4
(Tableau 1). La zone d’antibiose observée est claire
au niveau de la zone de confrontation (Figure 4c). Le
mode d’inhibition assuré par A. nidulans et A. terreus
est MI=3 (Tableau 1).
Figure 1 : Pourcentage d’inhibition de la croissance
Au niveau de la zone de confrontation, il y a eu une
mycélienne de Rhizoctonia solani par Trichoderma spp.
noté après 48 h d’incubation à 25°C. coloration du fond des colonies du pathogène
N.B. Les barres attribuées de la même lettre ne sont pas (Figure 4b) indiquant la sécrétion des métabolites
significativement différentes selon le test SNK à P ≤ 0,05. inhibiteurs et diffusibles dans le milieu de culture.
5
Quant à A. niger, il a pu proliférer au dessus de la microscopique de l’interaction in vitro entre cette
colonie du pathogène et assurer par la suite le espèce et R. solani a révélé des mécanismes
mode d’inhibition MI=1 (Tableau 1). L’observation d’enroulement.

a b c
Figure 4 : Différents modes d’inhibition exercés par les antagonistes utilisés contre Rhizoctonia solani
a : Prolifération de T. viride au dessus de la colonie de R. solani
b : Inhibition de la croissance de R. solani à une distance inférieure à 2 mm et coloration de la colonie du pathogène au niveau de la zone de
confrontation
c : Formation d’une zone d’antibiose au niveau de la zone de confrontation de R. solani avec Aspergillus sp

Tableau 1 : Modes d’interaction des colonies des antagonistes utilisés avec celles de Rhizoctonia solani lors de leur double
culture sur PDA.
Espèce fongique Mode d’inhibition Zone * Recouvrement Pourcentage
Trichoderma harzianum 1 d’antibiose
± + d’inhibition
31,90 (%)
T.
G. viride
catenulatum 1
3 ±_ +_ 33,05
12,34
T. virens 1 ± + 27,01
G. roseum 3 _ _ 12,59
Aspergillus flavus 4 + _ 12,09
A. niger 1 ± + 11,08
A. terreus 3 _ _ 7,05
Aspergillus sp. 4 + _ 6,80
A. nidulans 3 _ _ 8,82
*± : Formation d’une zone d’antibiose suivie de recouvrement, - : absence d’une zone d’antibiose,
+ : présence d’une zone d’antibiose.

Effet des filtrats de culture âgé de 40 jours (Figure 5). Cependant, le maximum
d’inhibition, d’environ 40%, a été engendré par les
Les filtrats de culture des agents antagonistes testés filtrats des Trichoderma spp. et surtout celui de T.
ont montré un effet inhibiteur de la croissance harzianum (Figure 5). Quant aux Aspergillus spp., les
mycélienne du pathogène. Cette inhibition est pourcentages d’inhibition enregistrés ont varié
d’autant plus importante que l’âge des cultures entre 48 et 53% et dont les plus importants ont été
liquides utilisées est important (Figure 6). Les filtrats notés avec les filtrats de culture d’A. niger âgés de
des Gliocladium spp. ont donné les pourcentages 20 et 30 jours et ceux d’Aspergillus sp. issus de
d’inhibition les plus élevés (37%-63%) dont le plus cultures liquides de 40 jours d’incubation (Figure 5).
important a été induit par le filtrat de G. roseum
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Figure 5: Effet des filtrats de culture des antagonistes testés et de leur âge (20, 30 ou 40 jours) sur la croissance mycélienne
de Rhizoctonia solani.
N.B. 20 j : Filtrat de culture utilisé après 20 jours d’incubation, 30 j : Filtrat de culture utilisé après 30 jours d’incubation, 40 j Filtrat de
culture utilisé après 40 jours d’incubation. La dose testée est 20% (v/v).
PPDS (Âge des cultures utilisées x Filtrats de culture testés) = 20,743% à P ≤ 0,05.

6
Figure 6: Optimisation du pouvoir inhibiteur des filtrats de culture par l’augmentation de l’âge des cultures liquides

Discussion Conclusion

Les résultats de l’essai de la double culture Les deux essais d’évaluation du pouvoir antagoniste
montrent que les espèces Trichoderma peuvent des espèces fongiques utilisées ont révélé que les
utiliser différents mécanismes de bio-contrôle dont trois espèces de Trichoderma testées ont une
les plus importants sont l’antibiose, la compétition, activité basée essentiellement sur leur pouvoir
pour les nutriments et les sites d’infection, et le compétitif et mycoparasitaire (enroulement et lyse)
mycoparasitisme (Seema et Devaki, 2012). En effet, par contre les espèces de Gliocladium et Aspergillus
l’observation macroscopique montre que les trois ont montré un faible pouvoir compétitif mais une
espèces Trichoderma testées ont inhibé la importante sécrétion de métabolites bioactifs. Le
croissance mycélienne du pathogène et se sont test des extraits aqueux et organiques de ces bio-
développées à la surface des colonies de R. solani et agents ainsi que l’évaluation de leur effet sur la
l’examen microscopique de la zone de viabilité des sclérotes, structures de conservation et
confrontation montre des résultats similaires de dissémination du pathogène, pourrait mieux les
(mycoparasitisme et lyse) à ceux obtenus par valoriser en tant que source potentielle de
Barakat et al. (2007) (mycoparasitisme et lyse). molécules bioactives contre R. solani.
Les espèces de Gliocladium ont déployé des
mécanismes d’antibiose et de parasitisme direct. Références bibliographiques
Les genres Gliocladium et Trichoderma possèdent
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d’inhiber la croissance mycélienne de R. solani et Trichoderma spp. isolates from Palestine, H U Res J, Vol 3, pp:
1-15.
même de détruire les sclérotes (Vaish et Sinha.,
2006). Les mécanismes déployés par l’espèce A. Beauvallet. G, 2012, Des risques d’attaque de rhizoctone brun,
niger rejoignent ceux de Vaish et Sinha (2006). Pomme de terre, AVALIS-institut du végétal.
L’effet des filtrats de culture sur la croissance du Chand T, Logan C., 1984, Antagonists and parasites of
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 25, N° 73– juillet 2013

pathogène a varié selon l’agent antagoniste et au Rhizoctonia solani and their efficacy in reducing stem cancer
of potato under controlled conditions, Trans British Mycol
sein d’une même espèce fongique selon l’âge des
Soc, vol 83, pp: 107-112.
cultures liquides utilisées. En effet, l’efficacité des
filtrats était d’autant plus importante que l’âge des Daami-Remadi M, Zammouri S et El Mahjoub M., 2008, Effect of
the level of seed tuber infection by Rhizoctonia solani at
cultures était important. Ceci pourrait être expliqué planting on potato growth and disease severity, The African
par l’augmentation de la production des Journal of Plant Science and Biotechnology, vol 2, pp: 34-38.
métabolites antifongiques ou à l’augmentation de la Demirci.E, Dane.E et Eken.C., 2011, In vitro antagonistic activity
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par l’activité antifongique de leurs filtrats et leur varieties and the efficacy of two fungicides against
efficacité dans le contrôle biologique de ce Rhizoctonia solani attack, Crop Prot vol 29, pp: 998-1002.
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