Identification morphologique et moléculaire d’espèces du

genre Trichoderma isolées de différents sols Tunisiens.

N. Sadfi-Zouaoui1*, M. Rouaissi2, B. Essghaier 1, M.R. Hajlaoui2, M.R. Hermosa3 et A. Boudabous1

1
. Laboratoire de Microorganismes et Biomolécules Actives, Faculté des Sciences de Tunis, Campus universitaire, 2092 Tunisie ;
2
. Laboratoire de Protection des Végétaux, Institut National de la Recherche Agronomique de Tunisie (INRAT) 2049 Ariana
Tunisie ;
3
. Département de Microbiologie et de Génétique, Université de Salamanque, 37002 Espagne.

RÉSUMÉ

Le genre Trichoderma renferme des espèces connues en tant qu’agents de lutte biologique contre les champignons
phytopathogènes et comme source d’enzymes et de métabolites d'intérêts industriels. Dans le but d’exploiter le potentiel
biologique des Trichoderma indigènes, une étude a été entreprise pour établir une large collection d’espèces résidentes
dans les sols du nord Tunisien. En se basant sur l’aspect des colonies et la morphologie des fructifications, une collection
de 150 isolats a été subdivisée en 5 groupes phénotypiques. Cette identification morphologique a été confirmée par des
analyses moléculaires basées sur le séquençage de la région ITS1 de l’ADN ribosomal. Le pouvoir antagoniste de ces
espèces est en cours d’évaluation contre les moisissures de post- récolte des fruits et des légumes.

Mots-clés : Trichoderma - sol – phénotype – analyse moléculaire

ABSTRACT

Trichoderma is the most fungal strain used as biological control agent in agriculture, besides its production of enzymes
and secondary metabolites of biotechnological interest. With an aim of exploiting the biological potential of local
Trichoderma strains, a study was undertaken to establish a broad collection of species resident in north Tunisian soils.
Based on the aspect of colonies and morphology of fructifications, a collection of 150 isolates was subdivided into 5
phenotypic groups. This morphological characterization was confirmed by a molecular analysis based on the sequencing
of the ITS1 region of the ribosomal DNA. The antagonistic potential of these species is in the course of evaluation against
the post-harvest moulds of fruits and vegetables.

Key-Words: Trichoderma - soil – phenotype – molecular analysis

Introduction La majorité des espèces de Trichoderma sont

morphologiquement très semblables et difficiles à
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008

Les Trichoderma spp. sont des champignons
cosmopolites, caractérisés par leur croissance
rapide, leur capacité d’utiliser divers substrats et
leur résistance à des agents chimiques nocifs (Klein
et Eveleigh, 1998). Ils constituent les éléments
prédominants de la mycoflore des sols de divers
écosystèmes (forêts, champs agricoles, prairies,
marécages, déserts, lacs salés ……) (Danielson et
Davey, 1973 ; Roiger et al., 1991 ; Smith, 1995 ;
cellulose des végétaux (Klein et Eveleigh, 1998). Le
genre Trichoderma renferme des espèces les plus
utilisées en tant qu’agents de lutte biologique
contre les phytopathogènes et comme source
d’enzymes et de métabolites secondaires d'intérêts
biotechnologique (Kubicek et Penttilä, 1998 ;
Sivasithamparam et Ghisalberti, 1998).
distinguer et elles ont été confondues pendant de
nombreuses années à l’espèce T. viride. Les
méthodes moléculaires, basées sur le
polymorphismes des séquences de l’ADN et les
amplifications par PCR, se sont montrées très utiles
dans la caractérisation des isolats de ce genre, tant
dans des études d'identification (Hjeljord et
Tronsmo, 1998) que dans l'élaboration de
classifications phylogénétiques (Kullnig-Gradinger
et al., 2002).
-------------------------------------------------------------------------------------
* Correspondance : Dr. Najla SADFI ZOUAOUI, Laboratoire de
Microorganismes et Biomolécules Actives, Faculté des Sciences,
Campus universitaire, 2092 Tunis ; Tunisie, Tel : 216 -70-850
553 ; Fax: 216-71-885 480, E-mail: sadfi.najla@planet.tn
9
 Les ADNr sont organisés en domaines d'unités
invariables répétées en tandem. Une unité est
constituée des trois plus grands gènes d'ARNr (18S,
5.8S, 28S) séparés par deux espaceurs internes
transcrits (ITS). Chaque unité est séparée d'une
autre unité par un espaceur intergénique non
transcrit (IGS) (Bruns et al., 1991 ; Henson et
French, 1993) (Fig. 1). On retrouve de 60 à 200
copies des répétitions en tandem par génome
haploïde chez les champignons (Bruns et al., 1991,
Fig. 1. Schéma de l’unité de transcription ribosomique de champignon.
A. Organisation en tandem des unités ribosomiques, B. Structure d’une unité ribosomique.
L'analyse des séquences de l’ADNr, y compris les
séquences des espaceurs internes transcrits (ITS),
ont été utiles dans des études taxonomiques de T.
longibrachiatum (Kuhls et al., 1997), T. harzianum
(Gams et Meyer, 1998), et de T. viride (Lieckfeldt et
al., 1999) ou de biotopes associés à la colonisation
de champignons cultivés (Belle et al., 1999 ;
Samuels et al., 2002).
La plupart des espèces connues de Trichoderma
ont été isolées d’Amérique du Nord, d’Europe
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Centrale (Bissett, 1991 ; Wuczkowski et al., 2003),
de Sibérie et des Himalayas (Kulling et al., 2000),
d’Asie du Sud-Est (Kubicek et al., 2003), de Chine,
d’Egypte (Gherbaway et al., 2004), et d’Amérique
Centrale et du Sud (Druzhinina et al., 2005). Aucune
étude rapportant la diversité des espèces de
Trichoderma en Tunisie n’a été jusque là effectuée.
Dans le but d’identifier les espèces de Trichoderma
rencontrées en Tunisie, une collection de 150
isolats a été obtenue à partir de différents sols du
Nord tunisien et classée en espèces en se basant sur
des critères morphologiques et l’analyse des
séquences ITS.
MATERIELS ET METHODES
10
Yao et al., 1992). De grandes variations génétiques
sont trouvées dans les ITS car leur évolution est plus
rapide que les portions géniques. Les ITS
permettent de différencier les espèces à l'intérieur
d'un genre ou parmi une population (Henson et
French, 1993; White et al., 1990). L'analyse des ITS
de plusieurs espèces de champignons a permis de
conclure à la validité ou non de l'emploi des critères
morphologiques utilisés dans l’identification des
espèces et la classification des champignons.
Echantillonnage et isolement
Une centaine d’échantillons ont été collectés de
différents écosystèmes de la Tunisie (sols forestiers,
sols agricoles, fruits d’arbres fruitiers et feuilles de
légumineuses). Chaque échantillon de sol (10g) a
été vigoureusement brassé avec 20 ml d’eau
distillée stérile afin de libérer les conidies et les
hyphes adhérant aux particules de sol. Une série de
dilution de 10-1 à 10-4 a été préparée pour chaque
suspension de sol. Une aliquote de 0.1 ml de
chaque dilution a été étalée sur les milieux PDA
(Potato dextrose agar, Difco) et MEA (Malt extract
agar, Difco) additionnés de 50 mg/l d’antibiotique
(ampicilline et streptomycine, Sigma). Les boites ont
été incubées à 25°C pendant 7 à 10 jours. Les
colonies de Trichoderma ont été purifiées suite à
des repiquages successifs sur milieu PDA.
Culture monosporale de Trichoderma
Une suspension sporale de chaque culture pure
de Trichoderma a été préparée après raclage des
spores en présence d’eau distillée stérile. Après une
série de dilutions et étalements sur milieu PDA puis
incubation pendant 48h à 25°C, les conidies
 germées et visualisées au microscope ont été
repiquées individuellement, à l’aide d’une aiguille
sur milieu PDA et incubées pendant une semaine à
25°C. Un disque mycélien de 10 mm de diamètre de
chaque culture, dérivant d’un clone monospore, a
été ensemencé, sous hôte stérile, dans 100 ml de
milieu PDB (Potato-Dextrose-Broth, Difco) contenu
dans un Erlenmeyer de 250 ml. La culture liquide a
été ensuite incubée sous agitation à 110 rpm et
25°C pendant 7 à 10 j et le mycélium a été récupéré
par filtration et conservé à -20°C avant sa
lyophilisation.
Extraction de l’ADN génomique
L’ADN total a été extrait selon la méthode CTAB
développée par Doyle et Doyle (1987). avec
quelques modifications. Une quantité d’environ 0, 1
g de mycélium lyophilisé a été broyé en présence de
l’azote liquide. Le broyat a été mis dans un
Eppendorf de 1,5 ml, auquel 700 µl de tampon de
lyse (CTAB, 2%) additionné de 0.2% (w/v) -
mercaptoéthanol ont été ajoutés. Le mélange a été
mis en incubation pendant 40 min à 65°C au bain-
marie. Un volume égal de chloroforme alcool-
isoamylique (24 :1) a été ajouté. Après
homogénéisation du mélange et centrifugation (10
min, 13000 rpm à + 4°C), le surnageant a été
récupérée (environ 500 µl) dans un nouveau
Eppendorf stérile. L’ADN a été précipité
sélectivement en présence d’un volume égal
d’isopropanol à froid additionné de 10 % d’acétate
de sodium (3M, pH 8). Après incubation pendant 1
nuit à + 4°C et centrifugation (12000 rpm, 10 min à
+ 4°C), le surnagent a été jeté et le culot d’ADN a
été rincé deux fois avec 500 µl d’éthanol 70%. Après
centrifugation (12000 rpm, 2 min à + 4°C), le culot a
été dissout dans 100 µl de tampon TE. L’ADN
dissout a été traité avec 3µl de RNase (100 µg/ml)
pendant 1h à 37°C.
L’ADN a été ensuite précipité dans 600 µl
d’éthanol absolu (conservé à – 20°C) en présence
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de 30 µl d’acétate de sodium (3M, pH 8). Le culot a
été ensuite rincé avec 300 µl d’éthanol 70 % puis
séché sous la hotte pendant 2 h. L’ADN a été
ensuite repris dans 100 µl de TE puis conservé à -
20°C.
Amplification de l’ADN par PCR et séquençage
La région ITS (Internal Transcribed Spacer) de
l’ADN ribosomique a été amplifiée avec des
amorces universelles ITS1 et ITS4 (White et al.,
1990).
ITS1: 5’-TCGGTAGGTGAACCTGCG G-3’
ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Protocole d’amplification
La réaction d’amplification a été réalisée dans un
volume réactionnel de 25 µl contenant 5 µl de
tampon coloré Taq DNA polymerase 10X (Promega),
1.5 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP(20 mM), 2 µl de
chacune des amorces (20 pmoles/µl), 0.25 µl de Taq
DNA polymerase (5U/µl) (Promega) et 11.25 µl de
H2O bidistillée stérile. Le mélange ou mix a été
réalisé pour le nombre total des isolats, puis réparti
à raison de 23 µl/tube. Deux µl d’ADN (50 ng/µl) ont
été ajoutés en dernier au mélange réactionnel.
La réaction d’amplification a été réalisée dans un
thermocycleur (Biometra, Allemagne). Le
programme, de la PCR, établi a été composé d’une
pré-dénaturation à 95°C pendant 3 min suivie par
35 cycles consécutifs d’une dénaturation à 98°C
pendant 15 sec, d’une hybridation spécifique des
amorces à 59°C pendant 60 sec et d’une élongation
à 72°C pendant 2 min. Enfin une post-élongation à
72°C pendant 10 min.
Electrophorèse sur gel d’agarose
Un gel d’agarose à 1,5 % a été préparé avec un
tampon standard TBE 0,5× (4,5 mM Tris, 4,5 mM
d’acide borique et 1mM EDTA, pH 8) contenant 0,5
mg/ml de bromure d’éthidium. Cinq µl de
l’échantillon PCR a été mélangé avec 1 µl de
tampon de charge sur une feuille de parafilm. Les
échantillons et un marqueur de poids moléculaire
(100 pb) ont été chargés séparément dans les puits
du gel (moyen gel, cuve Eurogentec, Belgique).
L’électrophorèse a été effectuée à 100 V dans du
tampon TBE 0,5× pendant 40 min. Les produits
d’amplification ont été visualisés sous lumière UV,
grâce au bromure d’éthidium incorporé au part
avant dans le gel. Les photos ont été prises grâce à
un Gel doc de type Biorad.
Séquençage des ITS amplifiés
Les produits PCR (ITS amplifiés) ont été purifiés
TM
par centrifugation sur minicolonne (Wizard PCR
Preps DNA Purification System, Promega) selon le
protocole de la compagnie. Le séquençage a été
réalisé dans les deux directions avec les amorces
utilisées pour leur amplification dans un ABI 377
Prism sequencer automate (Applied Biosystems).
Analyse des séquences
Les séquences ont été initialement analysées en
utilisant le programme MegAlign inclus dans le
paquet informatique DNASTAR ; et, les alignements
des séquences ont été effectués en utilisant le
programme CLUSTALX 1.81 (Thompson et al., 1997).
Dans les alignements ont été incluses les
séquences, déposées dans des bases de données,
espèces ou génotypes représentants des différentes
sections du genre Trichoderma. Les analyses
phylogénétiques ont été effectuées avec le
programme PAUP (Phylogenetic Analysis Using
Parsimony, Version 4.0, UTILISE).
11
 Résultats & Discussion 9,00 Tr. 1
Tr. 4
Tr. 2
Tr. 5
Tr. 3
8,00

Diamètre de la colonie (mm )

Une collection de 150 isolats de Trichoderma 7,00

a été établie essentiellement à partir d’échantillons 6,00

5,00
de sol collectés de différents écosystèmes de la 4,00
Tunisie. Une identification préliminaire du genre a 3,00
été effectuée par l’analyse des caractères 2,00
morphologiques basés sur la vitesse de croissance 1,00
de la colonie (Fig. 2), la pigmentation et l’aspect du 0,00

conidiophore, des phialides et des conidies (Fig. 3, 18h 24h 38h 44h 48h

4). Cette analyse a permis de subdiviser la collection Temps

en 5 groupes phénotypiques.
Fig.2. Mesure de la croissance des colonies fongiques de
Trichoderma durant 48 h de culture sur milieu PDA

Fig. 3 Aspect macroscopique des colonies des isolats représentant les cinq groupes phénotypiques de Trichoderma.
(a): T. citrinoviride, (b): T. atroviride, (c): T. hamatum, (d): T. harzianum, (e): T. longibrachiatum

Fig. 4 Aspect microscopique du mycélium (a), des spores (b) et des phialides (c) de Trichoderma spp.

Ces caractéristiques morphologiques n’étaient pas seule bande d’environ 600 pb pour tous les isolats
suffisantes pour distinguer les espèces de de Trichoderma (Fig. 5). Les Trichoderma isolés ont
Trichoderma en raison des ressemblances été identifiés au niveau de l’espèce grâce à l’analyse
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008

morphologiques des colonies et des fructifications.
Les travaux pionniers de Rifai (1969) ont proposé de
distribuer Trichoderma dans neuf ensembles
spécifiques alors que la révision du genre
Trichoderma par Bisset (1991) avait inclus plusieurs
anamorphes d’Hypocrea établissant ainsi cinq
nouvelles sections, parmi lesquelles
correspondaient les ensembles déjà décris par Rifai.
Les données moléculaires dérivant de l’ADN et des
enzymes étaient très utiles pour une caractérisation
objective de Trichoderma comparativement aux
méthodes classiques (Lieckfeldt et
Muthumeenakshi, 1998). L’étude moléculaire que
nous avions menée a concerné 48 souches de la
collection. L’amplification par PCR a montré une
des séquences ITS (ITS1). L’identité des isolats est
présentée au Tableau 1. Sept isolats de sol forestier
ont été identifiés comme appartenant à l’espèce T.
harzianum. Nos résultats sont en concordance avec
les travaux de Wuczkowski et al. (2003) montrant la
prédominance de T. harzianum en sol forestier.
Cette espèce est largement exploitée dans la lutte
biologique contre les champignons
phytopathogènes à côté de Gliocladium virens et T.
viride (Papavizas, 1985 ; Samuels, 1996). T.
harzianum a été commercialisé sous forme de
biofongicide (Trichodex®) (Elad et al. 1995) et a
montré un grand pouvoir inhibiteur contre la
pourriture grise de la tomate (Utkhede et Mathur,
2002).

12
 Tableau 1. Origine et identité des isolats de Trichoderma.

Origine Isolat Espèce

Rhizosphère de sol forestier TNS 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18 T. harzianum

TNS 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 T. longibrachiatum

Rhizosphère de sol agricole
TNS 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 T. atroviride
TNS 28, 29 T. hamatum
TNS 30, 31, 32, 33, 34 Trichoderma spp.
Arbres fruitiers
Fruits de citronnier TNS 35, 36 T. hamatum
Fruits de pêcher TNS 37, 38, 39, 40, 44, 41, 42, 43 T. longibrachiatum
Légumineuses
Feuilles de fève TNS 45, 47 T. citrinoviride
TNS 46 T. hamatum
TNS 48 T. viride

Fig. 5. Séparation sur gel d’agarose (1.5%) des produits d’amplification par PCR de l’ADN des isolats de Trichoderma en
utilisant les amorces ITS1 et ITS4.
M: marqueur de poids moléculaire 100 pb, pistes 1-26 (isolats TNS1-TNS26); T: témoin négatif, pistes 27-48 (isolats
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TNS27-TNS48).
TNS 1-18 (isolats de sol forestier); TNS 19-34 (isolats de sol agricole); TNS 35-44 (isolés sur fruits de citronnier et de
pêcher) et TNS 45-48 (isolés sur feuilles de fève)

L’espèce la plus dominante de la collection souches séquencées, 14.58 % (7 isolats) sont

appartient à T. longibrachiatum (37,5 %), isolée de
sol forestier et de fruits. Les souches issues de sol
agricole (vergers d’Agrumes) appartiennent à T.
atroviride et à T. hamatum. Trois souches
appartenant à T. citrinoviride, deux à T. hamatum et
une à T. viride ont été aussi isolées de feuilles et de
fruits pourris. L’arbre phylogénétique établi à partir
de l’analyse des séquences des 48 souches a montré
que l’ensemble des isolats sont distribués dans les
trois grandes sections de Trichoderma. Des 48
classées dans la section Pachybasium, 31.25 % (15
isolats) dans la section Trichoderma et 43.75 % (21
isolats) dans la section Longibrachiatum (Fig. 6). Sept
isolats classés dans la section Pachybasium sont
groupés dans le complexe incluant T. inhamatum et
T. harzianum. Dans la section Trichoderma, 15
isolats sont inclus dans 3 groupes à savoir T.
hamatum, T. atroviride et T. viride et 18 isolats de
la section Longibrachiatum sont inclus dans les

13
 groupes T. longibrachiatum et T. citrinoviride
(Hermosa et al., 2004).
Cette étude a en effet montré une diversité
importante des espèces de Trichoderma en Tunisie.
Les représentants des trois sections de Trichoderma
on été identifiés à partir de l’analyse de souches
Fig. 6. Phylogramme basé sur les séquences de la région ITS1 du gène ARNr démontrant la position phylogénétique des
48 isolats (TNS 1-46) à l’intérieur des sections établies de Trichoderma (T.) (Hermosa et al., 2004).
Remerciements
Ces travaux ont bénéficié de fonds émanant du
Projet de Coopération Tuniso-Espgnole (n°
A/6826/06).
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
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14
issues essentiellement de sols forestiers et
agricoles. L’efficacité de ces souches contre des
pathogènes de post-récolte est en cours
d’évaluation. La collection locale sera élargie afin
d’inclure des isolats provenant d’autres niches
écologiques de plusieurs régions de la Tunisie.
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