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RECHERCHE ORIGINALE
publié : 15 décembre 2020 doi :
10.3389/fmicb.2020.604964

Édité par:
Elvira Fiallo­Olivé,
Institut d'horticulture
subtropicale et méditerranéenne La
Diversité et structure du
Communautés bactériennes endophytes
Associé à Trois Terrestres
Espèces d'orchidées révélées par le
métabarcodage du gène ARNr 16S
Pasquale Alibrandi1,2, Sylvia Schnell2 , Silvia Perotto1 * et Massimiliano Cardinale2,3 *

Majoritaire, Espagne 1 2
Département des sciences de la vie et de la biologie des systèmes, Université de Turin, Turin, Italie, Institut de microbiologie appliquée,
3
Révisé par : Ivica Justus­Liebig­University Giessen, Giessen, Allemagne, et Département des sciences biologiques et environnementales
Z. Dimkic,´ Technologies, Université du Salento, Lecce, Italie
Université de Belgrade, Serbie David
Correa Galeote, Université
nationale autonome du Mexique,
Le microbiote endophyte peut établir des interactions mutualistes ou commensalistes au sein des
Mexique Roberta tissus de la plante hôte. Nous avons étudié le microbiote endophyte bactérien chez trois espèces
Fulthorpe, Université
d'orchidées méditerranéennes (Neottia ovata, Serapias vomeracea et Spiranthes spiralis) par
de Toronto Scarborough,
Canada métabarcodage du gène ARNr 16S. Nous avons examiné si les différentes espèces et organes
*Correspondance : Silvia d'orchidées, à la fois souterrains et aériens, influençaient les communautés bactériennes endophytes.
Perotto
Au total, 1 930 unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ont été obtenues, principalement des
silvia.perotto@unito.it
orcid.org/0000­0003­0121­1806
protéobactéries et des actinobactéries, dont le modèle de distribution indiquait que l'organe végétal
Massimiliano Cardinale était le principal déterminant de la structure de la communauté bactérienne. Le réseau de
massimoliano.cardinale@unisalento.it
cooccurrence n'était pas modulaire, suggérant une relative homogénéité du microbiote entre les
orcid.org/0000­0003­1421­722X
espèces végétales et les organes.
Rubrique spécialité : De plus, la diminution de la richesse et de la diversité des espèces dans les organes végétatifs
Cet article a été soumis à
Interactions microbiennes et virales avec
aériens peut indiquer un effet de filtrage par la plante hôte. Nous avons identifié quatre OTU
Plantes, centrales, dont trois déjà signalées comme taxons associés aux plantes (Pseudoxanthomonas,
une rubrique de la revue Rhizobium et Mitsuaria), tandis que Thermus était un membre inhabituel du microbiote végétal.
Frontières en microbiologie
L'analyse du microbiote de base a révélé une ascension sélective et systémique des communautés
Reçu : 10 septembre 2020
Accepté : 23 novembre 2020
bactériennes des organes végétatifs aux organes reproducteurs. Le microbiote central a également
Publié: 15 décembre 2020 été maintenu dans les graines de S. spiralis, suggérant un transfert vertical potentiel du microbiote.
Citation: Étonnamment, certains échantillons de graines de S. spiralis présentaient un microbiote endophyte
Alibrandi P, Schnell S, Perotto S et
très riche, avec un grand nombre d'OTU partagées avec les racines, une situation qui peut conduire
Cardinale M (2020) Diversité et structure
de l'endophyte à un processus de restauration putatif du microbiote associé aux racines dans la descendance. Nos
Communautés bactériennes associées
résultats indiquent que la communauté bactérienne s'est adaptée pour coloniser les organes de
Avec trois espèces d'orchidées terrestres
révélées par le métabarcodage du gène
l'orchidée de manière sélective et systémique, suggérant une implication active dans l'holobionte de
ARNr 16S. l'orchidée.
Devant. Microbiol. 11:604964.
deux : 10.3389/fmicb.2020.604964 Mots clés : endophytes bactériens, orchidées (Orchidaceae), microbiote, analyse métabarcoding, graines

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org 1 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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Alibrandi et al.
INTRODUCTION
Les plantes des écosystèmes naturels et agricoles interagissent avec une
multitude de micro­organismes qui colonisent à la fois les tissus internes et les
surfaces externes des organes végétaux souterrains et aériens (Compant et
al., 2019 ; Escudero Martinez et Bulgarelli, 2019). Ces communautés
microbiennes associées aux plantes sont collectivement connues sous le nom
de microbiote végétal (Marchesi et Ravel, 2015) et peuvent théoriquement
comprendre des souches pathogènes mutualistes, commensales et latentes
dans des plantes apparemment saines (Brader et al., 2017). Les bactéries et
les champignons, les composants dominants du microbiote végétal, peuvent
profondément influencer la croissance des plantes et leurs réponses aux stress.
Pour ces raisons, plusieurs études de la dernière décennie se sont concentrées
sur la structure et les fonctions du microbiote végétal, dans le but de les lier à
la forme physique des plantes et à la productivité des cultures (Bulgarelli et al.,
2013 ; Compant et al., 2019 ; Tian et al., 2020).
Les endophytes peuvent être définis comme des composants du microbiote
végétal qui colonisent les tissus végétaux sains internes et établissent des
relations non nocives avec leur hôte (Hardoim et al., 2015). Cette définition
inclut les endophytes mutualistes qui forment des structures reconnaissables
lors de la colonisation des plantes ­ tels que les champignons mycorhiziens
dans les racines des plantes terrestres et les rhizobiums dans les nodules des
racines des légumineuses ­ dont les interactions avec la plante hôte ont été
largement étudiées en raison de leur influence bénéfique sur la croissance des
plantes, la productivité et la santé (Das et al., 2017 ; Masson­Boivin et Sachs,
2018 ; Genre et al., 2020). Cependant, il existe de nombreuses preuves que
de nombreux endophytes apparemment commensalistes peuvent également
favoriser la croissance et la défense des plantes (Santoyo et al., 2016 ; Hossain
et al., 2017), mais l'écologie et les fonctions de ces endophytes bénéfiques sont
moins bien comprises.
En particulier, les bactéries endophytes favorisant la croissance des plantes
(PGP) peuvent favoriser la croissance des plantes par des mécanismes qui
incluent la libération de phytohormones (Patten et Glick, 2002 ; Glick, 2012,
1995 ; Rashid et al., 2012 ; Duca et al., 2014 ), la fixation de l'azote
(Govindarajan et al., 2008 ; Urquiaga et al., 2012), l'amélioration de l'acquisition
des nutriments minéraux (Malinowski et al., 2000 ; Rahman et al., 2005), la
production de composés favorisant la croissance (Glick et al., 1998 ; Taghavi
et al., 2009 ; Kumar et al., 2019) et une tolérance accrue au stress (Kohler et
al., 2008). De plus, une partie de la communauté endophyte bactérienne a
montré une tolérance envers les métaux lourds et les polluants, trouvant ainsi
une application importante pour la bioremédiation (Guo et al., 2010 ; Chen et
al., 2012 ; St˛epniewska et Kuzniar
´
, 2013). Les endophytes bactériens peuvent également protéger
la plante hôte contre l'invasion d'agents pathogènes et les maladies par des
activités directes de lutte biologique ou en induisant une résistance systémique
de la plante (Berg et Koskella, 2018 ; de Vrieze et al., 2018).
Le fait que seule une minorité des bactéries environnementales puisse être
cultivée en laboratoire a été un facteur limitant pour les microbiologistes de
l'environnement, limitant les connaissances sur les mécanismes d'interaction
entre le microbiote et la plante. Les technologies de séquençage de nouvelle
génération (NGS) ont permis des études à grande échelle indépendantes de
l'approche de culture, fournissant des détails sur la structure taxonomique,
l'abondance et les caractéristiques physiologiques potentielles des endophytes
microbiens associés aux plantes (Knief, 2014) . En utilisant ces outils
moléculaires, il est possible d'estimer l'évolution et l'adaptation de la
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Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes
microbes associés à l'hôte et de comprendre comment ils sont liés les uns aux
autres (Khare et al., 2018 ; Lucaciu et al., 2019).
Les orchidacées sont l'une des plus grandes familles de plantes sur Terre
(Christenhusz et Byng, 2016). Les orchidées poussent dans un large éventail
d'habitats et comprennent des épiphytes ainsi que des espèces terrestres. La
plupart des orchidées sont photosynthétiques à l'âge adulte, mais environ 200
espèces sont entièrement achlorophylles et dépendent de leurs partenaires
fongiques mycorhiziens pour la fourniture de carbone (Hynson et al., 2013).
Plusieurs espèces d'orchidées forestières développent des feuilles vertes mais
restent au moins en partie dépendantes des champignons mycorhiziens pour
l'approvisionnement en carbone (Selosse et Roy, 2009). Quelles que soient
leurs stratégies trophiques, les orchidées sont fortement dépendantes de la
relation avec les champignons mycorhiziens, et leur distribution est souvent
corrélée à la distribution de leurs partenaires fongiques mycorhiziens (McCormick et al., 2018)
En raison de leur importance dans la survie de ces plantes menacées, la plupart
des investigations microbiologiques sur les orchidées se sont concentrées sur
leurs associations mycorhiziennes, laissant de côté le rôle potentiel d'autres
partenaires microbiens. Les endophytes bactériens chez les orchidées ont été
principalement étudiés chez des espèces commercialement précieuses par
isolement après stérilisation de surface des racines et/ou des feuilles, et de
nombreux isolats se sont avérés à la fois augmenter la germination des graines
et favoriser la croissance des plantes (Tsavkelova et al., 2007 ; Faria et al .,
2013 ; da Silva et al., 2015 ; Gontijo et al., 2018 ; Herrera et al., 2020). En
revanche, les approches indépendantes de la culture ont rarement été
appliquées pour étudier les bactéries endophytes des orchidées, et les données
ne sont disponibles que pour les orchidées épiphytes Dendrobium officinale et
Dendrobium catenatum (Yu et al., 2013 ; Li et al., 2017 ) . Chez ces espèces
d'orchidées, des bactéries endophytes appartenant principalement aux
Proteobacteria ont été identifiées par PCR­DGGE et pyroséquençage, montrant
une diversité dans les racines et les tiges. De plus, le séquençage méta­nifH a
suggéré la présence de diazotrophes communs dans plusieurs tissus de D.
catenatum, qui pourraient jouer un rôle important dans l'apport d'azote (Li et al.,
2017). Ici, nous avons exploré les communautés bactériennes endophytes de
trois espèces d'orchidées terrestres, à savoir Neottia ovata (L.) Bluff & Fingerh,
Serapias vomeracea (Burm. F.) Briq. et Spiranthes spiralis (L.) Chevall. Nous
avons investigué différents organes végétaux afin de caractériser la diversité
taxonomique et la structure du microbiote associé, et d'identifier un microbiote
central. Il a déjà été découvert que les trois mêmes espèces d'orchidées
hébergent des endophytes avec un potentiel notable de promotion de la
croissance des plantes, tel qu'évalué par la culture et la caractérisation d'isolats
bactériens (Alibrandi et al., 2020). Sur la base de résultats sur d'autres espèces
végétales (Bulgarelli et al., 2013 ; Haruna et al., 2018), notre objectif était de
vérifier les hypothèses suivantes chez les orchidées : (i) les communautés
bactériennes endophytes créent des structures phylogénétiques distinctives
dans les différents organes de la plante, et (ii) les organes reproducteurs
(graines) représentent un réservoir d'endophytes transmissibles verticalement.
Pour tester ces hypothèses, deux comparaisons ont été réalisées : dans un
premier temps, nous avons comparé le microbiote bactérien associé aux
différents organes végétaux (racines, feuilles, tiges et capsules) des trois
espèces d'orchidées ; deuxièmement, nous avons inclus le microbiote des
graines de S. spiralis (la seule espèce pour laquelle des graines étaient
disponibles au moment de l'échantillonnage) pour analyser la distribution des
OTU uniques, partagées et centrales au sein de cette espèce.
Cette étude fournit de nouvelles informations sur la distribution des bactéries
dans différents organes des espèces d'orchidées terrestres,
2 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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Alibrandi et al. Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes

et met en lumière la fraction de la communauté bactérienne potentiellement TABLEAU 1 | Échantillons des espèces/organes d'orchidées étudiés dans cette étude.

transférée à la prochaine génération de plantes par transmission verticale,

Nom de l'échantillon Espèces d'orchidées Organe
soulignant un rôle possible des endophytes bactériens dans la conservation
des orchidées. (1–5)NO.pna.R Néottia ovata Racine

(1–5)NO.pna.L Néottia ovata Feuille

(1–5)NO.pna.St Néottia ovata Tige

MATÉRIELS ET MÉTHODES (1–5)NO.pna.C Néottia ovata Capsule

(1–5)SV.pna.R Serapias vomeracea Racine

(1–5)SV.pna.L Serapias vomeracea Feuille

Échantillonnage d'orchidées et
(1–5)SV.pna.St Serapias vomeracea Tige
stérilisation de surface Les espèces
(1–5)SV.pna.C Serapias vomeracea Capsule
végétales étudiées dans ce travail étaient Neottia ovata (L.) Bluff & Fingerh.,
(1–5)SS.pna.R Spiranthes spiralis Racine
Serapias vomeracea (Burm. f.) Briq. et Spiranthes spiralis (L.) Chevall., trois
(1–5)SS.pna.L Spiranthes spiralis Feuille
espèces d'orchidées méditerranéennes qui poussent naturellement en Italie.
(1–5)SS.pna.St (1– Spiranthes spiralis Tige
Des échantillons de racines, de tiges, de feuilles et de capsules des trois
5)SS.pna.C Spiranthes spiralis Capsule
différentes orchidées ont été récoltés pendant la floraison dans la région de Graine
(1–5)SS.pna.S Spiranthes spiralis
Ligurie (Italie), stockés sur de la glace dans des récipients stériles,
Pour chaque échantillon, cinq répliques biologiques (collectées à partir de différents individus végétaux) ont
transportés au laboratoire et conservés à 4◦C avant d'être traités (dans les 2
été analysées.
jours ). En outre, les graines de capsules stérilisées en surface (voir ci­
dessous pour la stérilisation) de S. spiralis ont également été analysées.
(Lundberg et al., 2013). Bien qu'il existe des PNA universels disponibles
Des échantillons de plantes provenant d'organes aériens (tiges, feuilles pour bloquer les séquences mitochondriales (mPNA) et plastidiales (pPNA)
et capsules) ont été stérilisés en surface par immersion progressive dans de des plantes, ils ne sont malheureusement pas efficaces sur un grand nombre
l'éthanol à 70 % pendant 1 min, puis dans de l'hypochlorite de sodium à 2,5 d'espèces végétales. Afin de sélectionner les PNA pouvant se lier au plus
% pendant 2 min et enfin dans de l'éthanol à 70 % pendant 1 min, suivi de grand nombre de séquences contaminantes, une analyse in silico des
cinq rinçages. dans de l'eau distillée stérile (Alibrandi et al., 2018). Les séquences mitochondriales et plastidiales issues d'un séquençage
échantillons de racines ont été soigneusement rincés à l'eau stérile, préliminaire a été réalisée. Plusieurs pinces PNA déjà testées sur certaines
soniqués et stérilisés en surface avec de l'éthanol à 95 % pendant 20 s, espèces végétales ont été évaluées, et le meilleur résultat in silico a été
suivis d'une immersion dans de l'hypochlorite de sodium à 5 % pendant 3 obtenu en utilisant la sonde universelle pPNA (5­GGCTCAACCCTGGACAG­3)
min et lavés sept fois avec de l'eau distillée stérile. De plus, nous avons selon Lundberg et al. (2013) et une sonde mPNA nouvellement conçue (5
obtenu les graines de S. spiralis à partir de capsules stérilisées en surface. ­CTACCGACGCTGGGG­3), respectivement, pour les séquences plastidiales
Les capsules stérilisées en surface ont été placées dans un tube Falcon et mitochondriales. Pour vérifier la réduction efficace des séquences dérivées
de l'hôte,
stérile, scellé et les graines ont été récupérées du fond du tube une fois les capsules quatre échantillons de racine, de tige, de feuille et de capsules de
écloses.
Cinq répliques biologiques, chacune prélevée sur différents individus de S. spiralis ont été amplifiés avec ou sans les pinces PNA : l'effet des pinces
plantes, ont été utilisées pour chaque organe d'orchidée, pour un total de 65 PNA sur l'abondance relative de la séquence bactérienne, plastidique et
échantillons. Les échantillons ont été nommés en fonction des espèces mitochondriale les lectures ont été évaluées par le test t de Student à l'aide
d'orchidées (NO pour N. ovata, SV pour S. vomeracea et SS pour S. spiralis) de SPSS 20 (IBM Corporation, Armonk, NY, États­Unis).
et des organes (R pour racine, L pour feuille, St pour tige, C pour capsule, S
pour graine ), les nombres indiquant la réplique biologique (tableau 1).

Extraction d'ADN L' ADN Préparation de la bibliothèque et séquençage Ion Torrent du

total a été extrait séparément de chaque échantillon d'organe (racines,
feuilles, tiges, capsules et graines) de chaque espèce d'orchidée à l'aide du
kit Qiagen DNeasy (QIAGENR , Hilden, Allemagne) conformément aux
instructions du fabricant. L'intégrité des 65 échantillons d'ADN résultants a
été vérifiée par électrophorèse dans un gel d'agarose à 1 % et stockée à
­20◦C.
Pinces PNA Le
microbiote bactérien endophyte a été étudié par métabarcodage du gène
ARNr 16S (régions V3 – V4). Cependant, la caractérisation moléculaire du
microbiote à l'intérieur des tissus végétaux hôtes a été conditionnée par la
co­amplification de gènes d'ARNr mitochondriaux et plastidiaux extraits des
cellules végétales eucaryotes. Pour réduire ce problème, une approche
appropriée consiste à utiliser des pinces d'acide nucléique peptidique (PNA)
spécifiques à la séquence, qui se lient à l'amplification de l'ADN dérivé de
l'hôte et la bloquent.
gène bactérien de l'ARNr 16S L'ADN obtenu à partir de tous les
échantillons a été utilisé comme matrice pour le métabarcoding du gène 16
ARNr par séquençage Ion Torrent. Les régions hypervariables V4 et V5 des
gènes de l'ARNr 16S ont été amplifiées par PCR à l'aide des amorces 520
F (5 ­AYTGGGYDTAAAGNG­3 ) et 907 R (5 ­ CCGTCAATTCMTTTRAGTTT­3 )
(Claesson et al., 2009 ; Engelbrektson et al . , 2010). Deux réactions PCR
ont été réalisées.
Dans la première réaction, l'ADN de tous les échantillons a été amplifié, y
compris les pinces mPNA et pPNA pour réduire la co­amplification de l'ADN
de la plante hôte. La PCR a été réalisée à un volume final de 15 µl
comprenant les réactifs suivants : 10 ng d'ADN matrice, 3 µl de tampon 5x
KAPAHiFi (KAPABiosystems, Woburn, MA, États­Unis), mélange KAPA
dNTP 200 µM chacun, 5 pmol de chaque amorce chacun et KAPAHiFi
polymérase 0,3 unités.

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org 3 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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Alibrandi et al.
Le programme PCR suivant a été utilisé : 3 min 95◦C , suivi de 35 cycles de (20
s 95◦C – dénaturation ; 15 s 78◦C – annelage PNA ; 30 s 55◦C – annelage
amorce ; 30 s 72◦C – allongement) et 5 min à 72◦C. Les produits de PCR ont
été visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose, puis utilisés comme matrice
pour la deuxième réaction de PCR. La deuxième PCR a été réalisée avec
l'amorce 520 F et 907 R comp, l'adaptateur (5 ­CCATCTCATCCCT
GCGTGTCTCCGACTCAG­3) et les codes à barres, avec KAPA2G Robust
HotStart Ready­Mix (KAPA Biosystems) comme décrit par Ambika Manirajan et
al . (2016). Les deux PCR ont été réalisées avec un MyCycler TM (Bio­Rad).
Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification QIAquick PCR
(QIAGEN GmbH) et ensuite purifiés avec le kit de purification d'ADN NucleoMag
NGS (MACHEREY­NAGEL GmbH & Co., KG) pour éliminer les contaminants
(nucléotides, amorces, adaptateurs, enzymes , additifs tampons et sels). La
concentration d'amplicon a été estimée en mesurant la fluorescence avec un
spectrophotomètre. Le séquençage Ion Torrent a été réalisé sur des produits de
PCR regroupés.
La PCR en émulsion (kit Ion PGM Hi­Q View OT2, Life Technologies) a été
réalisée avec Ion One Touch 2 (Life Technologies, Carlsbad, CA, États­Unis).
La qualité du produit final a été évaluée avec le kit de contrôle de qualité Ion
Sphere (Life Technologies, Carlsbad, CA, États­Unis) et chargé sur une puce
318 pour le séquençage (Life Technologies), à l'aide d'un séquenceur Ion PGM
(Life Technologies, Carlsbad, CA , États­Unis).
Les séquences ont été soumises à l'European Nucleotide Archive (ENA,
www.ebi.ac.uk/ena) sous le numéro d'accession PRJEB40289.
Analyse bioinformatique des séquences de métabarcodage Les données
de séquence brutes
ont été traitées avec QIIME, version 1.9 (Caporaso et al., 2010). Les séquences
ont été dérépliquées et attribuées à des échantillons spécifiques en fonction des
codes­barres correspondants, filtrées par longueur et qualité (longueur : 350­450
bp ; seuil de qualité : 20) et regroupées en unités taxonomiques opérationnelles
(OTU) avec uclust (Edgar, 2010 ) en utilisant un seuil d'identité de 97 %. Les
séquences chimériques ont été supprimées avec Chimera Slayer (contre
l'alignement de référence de la base Silva). Les séquences de référence pour
chaque OTU ont été attribuées à un groupe taxonomique par comparaison avec
la base de données Silva (version 132). Les singletons et les séquences de
contaminants (mitochondries et plastides) ont été éliminés.
Pour obtenir une classification plus précise, des arbres phylogénétiques ont
été construits en alignant les séquences de gènes d'ARNr 16S des OTU
pertinentes (telles que les taxons hub) sur les séquences de souches types des
genres les plus proches, en utilisant l'alignement Muscle implémenté dans le
logiciel megaX (Kumar et al., 2018). Les arbres phylogénétiques ont été déduits
avec les méthodes du maximum de vraisemblance, en utilisant RaxML
(probabilité axillaire randomisée maximale) telle qu'implémentée dans la
passerelle scientifique open source CIPRES1 . Mille rééchantillonnages
bootstrap ont été générés et des valeurs supérieures à 50 %
1https://www.phylo.org/
frontières en microbiologie | www.frontiersin.org
Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes
ont été présentés dans les succursales. Les arbres ont été visualisés et édités à
l'aide de l'iTOL open source (Interactive tree of life2 ).
La composition du microbiote a été comparée entre les différentes espèces
d'orchidées et organes analysés. Les abondances relatives des taxons ont été
calculées sur la table OTU sans aucune raréfaction ; les graphiques à barres
ont été tracés à l'aide du package ggplott2 dans la version 1.2.1335 du logiciel
R (Gergs et Rothhaupt, 2015 ; Wickham, 2016).
Les jeux de données ont été traités après différentes raréfactions : une seule
raréfaction (221 lectures par échantillon), basée sur l'échantillon avec le moins
de lectures, a été utilisée pour la comparaison de la diversité alpha entre les
trois espèces d'orchidées, tandis que trois raréfactions ont été utilisées pour la
comparaison des organes au sein de chaque espèce (2965, 1617 et 221 lectures
par échantillon pour N. ovata, S. vomeracea et S. spiralis, respectivement). La
richesse communautaire (indice « OTU observées »), la diversité (indice de
Shannon) et la diversité phylogénétique (indice PD) ont été calculées à l'aide du
script QIIME alpha_diversity.py ; le logiciel statistique R a été utilisé pour
effectuer une ANOVA avec le test post hoc Tukey HSD (p < 0,05).
Les différences de structure communautaire entre les espèces et les organes
ont été déterminées par ANOVA multivariée permutationnelle sur des matrices
de similarité de Bray­Curtis après 9 999 permutations et tracé (Mise à l'échelle
multidimensionnelle non métrique ­ NMDS ­ ordination). Les analyses ont été
effectuées à l'aide du script Qiime beta_diversity.py. Le NMDS et les boxplots
ont été calculés dans la version 1.2.1335 du logiciel R avec la fonction vegdist
dans les packages "vegan" et "ggplot2", respectivement. Les différences à p <
0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
OTU partagées et centrales Des études
récentes (Bulgarelli et al., 2012 ; Lundberg et al., 2012) ont défini une gamme
centrale d'espèces du microbiote associées aux espèces végétales comme
microbiote central taxonomique. Des UTO bactériennes partagées entre les
différentes espèces d'orchidées et entre les différents organes de chaque
espèce ont été identifiées. Dans ce travail, les OTU présentes dans 100 % des
espèces ou des organes ont été considérées comme appartenant au microbiote
central, tel que calculé avec le script QIIME compute_core_microbiome.py. Cela
a été considéré comme la fraction "stable" de la communauté suggérant des
rôles fonctionnels clés possibles pour l'hôte. Pour la visualisation et l'interprétation
de ces données, des diagrammes de Venn ont été générés à l'aide de l'outil en
ligne gratuit de l'Université de Gand3 .
Analyse du réseau de cooccurrence Pour identifier les OTU
centrales, une analyse de cooccurrence a été effectuée avec le logiciel Co­
occurrence Network Inference (CoNet ; Faust et Raes, 2016), en utilisant des
données non normalisées, comme recommandé, pour réduire l'effet de
composition ( Berry et Wider, 2014). Pour assurer la robustesse statistique,
seules les OTU avec plus de 50 lectures et se produisant dans au moins 20
échantillons ont été prises en compte. Les scores par paires ont été calculés
pour quatre mesures : les similarités de Bray­Curtis et Kullback­Leibler, et les
corrélations de Pearson et Spearman. Cent permutations (avec ligne
2https://itol.embl.de/
3http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/
4 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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Alibrandi et al.
mélange, rééchantillonnage et renormalisation pour les corrélations) et 100
scores bootstrap ont été générés. Les bords instables (en dehors des
centiles 2,5 à 97,5 de la distribution bootstrap) ont été éliminés. Les valeurs
p individuelles des quatre mesures ont été fusionnées avec la méthode de
Brown. Seuls les bords avec des valeurs de p corrigées du taux de fausses
découvertes (FDR) < 0,05 ont été retenus, et seulement s'ils étaient pris en
charge par au moins trois des quatre mesures.
La disposition du réseau a été générée avec l'algorithme "edge­forced
spring embedded", qui conduit à des réseaux non biaisés montrant des
nœuds interconnectés plus proches les uns des autres et des nœuds moins
liés placés en position extérieure. Les légendes du réseau ont été créées
avec le module complémentaire Cytoscape "Legend creator4 ". Les taxons
centraux ont été identifiés en notant le degré (nombre de connexions) par
rapport à la centralité d'intermédiarité et à la centralité de proximité, selon
Agler et al. (2016). L'identité taxonomique des OTU du hub a été confirmée/
améliorée par BLAST manuel.
RÉSULTATS
Sortie de séquençage, regroupement OTU et effet des bloqueurs de
PNA Le séquençage Ion Torrent a
généré 6 460 549 séquences brutes.
Après filtrage de la longueur et de la qualité, il restait 4 117 638 séquences,
qui ont été regroupées en OTU à un niveau de similarité de 97 %.
Les séquences mitochondriales et plastidiales et les singletons ont été
supprimés pour aboutir à 1 469 200 séquences totales
4http://apps.cytoscape.org/apps/legendcreator
FIGURE 1 | Fraction relative des séquences appartenant aux bactéries, aux plastides et aux mitochondries dans quatre échantillons d'orchidées, obtenue par métabarcodage des gènes
d'ARNr 16S sans bloqueurs de PNA, par rapport aux mêmes échantillons avec PNA.
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Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes
(Tableau complémentaire 1) regroupés en 1 930 OTU. Deux échantillons
(tous deux correspondant à des feuilles de S. spiralis) ont été éliminés en
raison du faible nombre de lectures (tableau supplémentaire 1).
L'ajout des sondes PNA a considérablement réduit l'abondance relative
des séquences de plastes par rapport aux mêmes échantillons sans sondes
PNA (test t, p = 0,0095), tandis que les séquences mitochondriales étaient
légèrement mais pas significativement plus élevées (p = 0,052) ( Figure 1 ).
L'abondance relative des séquences bactériennes a été significativement
augmentée dans les échantillons amplifiés avec des sondes PNA (test t, p
= 0, 00048; figure 1).
Composition du microbiote bactérien d'orchidées Pour identifier
les taxons associés
aux échantillons d'orchidées et analyser leur distribution dans les différentes
espèces et organes, deux niveaux taxonomiques (phylum et genre) ont été
considérés (Figure 2). Les deux phylums les plus représentés étaient les
Proteobacteria et les Actinobacteria, les Proteobacteria dominant (de 37 à
86 %) dans la plupart des échantillons d'orchidées. Les protéobactéries
étaient particulièrement abondantes dans les tiges de S. vomeracea (71,40
%) et dans les capsules de N. ovata, S. vomeracea et S. spiralis (85,72,
61,01 et 86,03 %, respectivement). De manière complémentaire, les
actinobactéries étaient dominantes dans les racines et les tiges de N. ovata
(50,02 et 48,47 %) et dans les graines de S. spiralis (48,95 %). Les
Firmicutes (de 1,26 à 16,83 %) et les Deinococcus­Thermus (de 0,29 à
7,14 %) étaient moins représentés mais répartis dans tous les organes et
espèces (Figure 2A).
En revanche, les acidobactéries étaient plutôt peu fréquentes, sauf dans
les graines de S. spiralis (9,59 %) (figure 2A).
5 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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FIGURE 2 | Répartition des taxons bactériens dans le microbiote des orchidées. Abondance relative des phylums bactériens prédominants du panneau (A) (> 1%) et des genres prédominants
(B) (> 0, 5%), tels qu'obtenus par métabarcodage du gène ARNr 16S des plantes d'orchidées (n = 5).

Parmi les genres, Cutibacterium a été distribué dans tous les échantillons pas de distribution claire des genres dominants (figure 2B). Tous les genres
(figure 2B). Ce genre était abondant dans les racines (31,02%), les tiges mineurs (<0,5 %) étaient principalement distribués dans les racines et les
(36,83%) et les feuilles (30,40%) de N. ovata, et moins représenté dans les graines de S. spiralis (Figure 2B, indiqué comme "autre"). La distribution et
capsules, dans lesquelles Pseudomonas (30,18%) et Luteibacter (28,77%) l'abondance des principales OTU (> 0,5 % du microbiote total des orchidées)
étaient les genres dominants. ont été utilisées pour créer une carte thermique. Le dendrogramme résultant
Chez S. vomeracea, Luteibacter (26,08 % dans la racine), Cupriavidus du regroupement hiérarchique unique n'a montré qu'une tendance partielle
(38,20 % dans la tige), Cutibacterium (29,50 % dans la feuille) et Limnobacter des échantillons à se regrouper par organe et/ou espèce (Figure 3).
(40,53 % dans la capsule) étaient les genres les plus abondants. Chez S.
spiralis, le modèle de distribution concernait principalement Pantoea et Diversité alpha et bêta L'ensemble de
Acinetobacter (33,83 et 21,79 % dans la capsule) et Cutibacterium (34,00 données a été traité pour obtenir trois sous­ensembles de données raréfiés.
% dans la tige), tandis que dans les feuilles il y avait Un premier sous­ensemble de données a été raréfié à 221 lectures et

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org 6 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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FIGURE 3 | Carte thermique des principales UTO bactériennes (>0,5 %) dans le microbiote des orchidées. Les échantillons ont été regroupés par espèce d'orchidée (rangée du haut) ou par organe (rangée du bas).
Les légendes à droite des figures indiquent le schéma de couleurs pour l'abondance, les espèces et les échantillons d'organes d'OTU transformés en journal.

utilisé pour comparer les valeurs de diversité alpha des trois espèces les échantillons de S. spiralis étaient significativement différents dans les
d'orchidées et des organes de S. spiralis, tandis que deux autres sous­ indices de richesse et de diversité, mais pas pour la diversité
ensembles de données ont été raréfiés à 2 965 et 1 617 lectures pour phylogénétique (Figures supplémentaires 1G – I). En particulier, la
comparer les organes de N. ovata et S. vomeracea, respectivement. La richesse et la diversité des OTU (indice de Shannon) étaient
couverture de Good était> 99% pour tous les échantillons de N. ovata significativement plus élevées dans les échantillons de racines de S. spiralis, par rappor
(tableau supplémentaire 2),> 96% pour tous les échantillons de S. L'analyse d'ordination de mise à l'échelle multidimensionnelle non
vomeracea (tableau supplémentaire 3) et> 85% pour tous les métrique (NMDS) a montré un grand chevauchement dans le microbiote
échantillons de S. spiralis sauf deux avec 76 et 82 % (tableau de S. vomeracea et de N. ovata, tandis que les échantillons de S. spiralis,
supplémentaire 4). La diversité alpha du microbiote dans chaque en particulier les échantillons de racines, se sont regroupés séparément
échantillon a été analysée en tenant compte des OTU observées (Figure 5 ) . Ces résultats ont été confirmés par les comparaisons par
(richesse), de Shannon (diversité) et des indices de diversité paires ADONIS de la structure du microbiote entre les espèces d'orchidées
phylogénétique (tableaux supplémentaires 2 à 4). Le microbiote de S. et les organes (tableau 2). Bien que l'homogénéité de la dispersion de
spiralis a montré les valeurs les plus élevées dans tous les indices, par l'échantillon ait été réduite dans les groupes d'espèces, S. spiralis était
rapport aux deux autres espèces d'orchidées (figures 4A à C). Lorsque significativement différent de N. ovata et S. vomeracea. La dispersion des
les différents organes des trois espèces ont été considérés, il y avait échantillons était hétérogène dans les groupes d'organes, ce qui a montré
une tendance à la baisse des valeurs des indices de richesse, de des différences significatives à l'exception de la comparaison tiges­
diversité et de diversité phylogénétique le long d'une progression feuilles (tableau 2). L'analyse de la diversité alpha et bêta a également
verticale des racines aux capsules, les racines et les capsules étant été effectuée sans tenir compte du nombre différent de séquences par
significativement différentes pour la richesse et la capsule étant échantillon (ensemble de données non raréfié). Les résultats respectifs
significativement différente de tous les autres échantillons pour la diversité n'ont
(figures 4D àaucune
montré E). différence substantielle avec ceux obtenus avec les
La comparaison des mêmes indices dans les différents organes ensembles de données raréfiés (comparez la figure supplémentaire 2
au sein de chaque espèce d'orchidée a montré des différences avec la figure 4, la figure supplémentaire 3 avec la figure supplémentaire
significatives dans N. ovata (Figures supplémentaires 1A­C) et S. 1, la figure supplémentaire 4 avec la figure 5 et le tableau supplémentaire 5 avec le table
spiralis (Figures supplémentaires 1G­I), mais pas dans S. vomeracea
(Figures supplémentaires 1D–F). En particulier, la richesse en OTU
Microbiote central dans les trois espèces d'
était significativement plus élevée dans les échantillons de racines de
N. ovata, par rapport à la tige et à la capsule, alors que les échantillons orchidées
de racines et de feuilles étaient différents de la capsule pour l'indice de Shannon.
Enfin, les échantillons de racines et de tiges de N. ovata étaient
significativement différents dans l'indice de diversité phylogénétique. Racine et capsule

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org 7 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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FIGURE 4 | Comparaison des métriques de diversité alpha entre le microbiote de trois espèces d'orchidées méditerranéennes. Richesse (OTU observées), diversité (Shannon) et diversité phylogénétique
(PD) pour différentes espèces d'orchidées (A–C) et organes (D–F). ◦ indique les valeurs aberrantes. Différentes lettres au­dessus des barres indiquent des moyennes significativement différentes (test de
Tukey, p < 0,05) ; aucune lettre (panneau F) n'indique aucune différence statistiquement significative.

FIGURE 5 | Mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS) Visualisation graphique de la diversité bêta, en utilisant les distances Bray­Curtis, en séparant les échantillons par espèce/
organe d'orchidée. Les ellipses des tracés représentent les régions de confiance à 95 % pour les groupes d'espèces (stress = 0,24).

S. vomeracea et S. spiralis (141, 191 et 386, respectivement), alors que 195 OTU 86 et 87 OTU, respectivement), 298 et 144 ont été partagés entre deux et trois
étaient partagées entre les trois espèces (Figure 6A) ; ces derniers représentent le organes, respectivement, et 160 ont été partagés par tous les organes d'orchidées
« microbiote central de l'espèce ». (figure 6B) ; ces derniers représentent le « microbiote central des organes ».
Lorsque les organes de toutes les espèces ont été pris en compte, 691 OTU se Compte tenu du microbiote des différents organes de chaque espèce d'orchidée,
sont avérés être uniques aux racines, aux tiges, aux feuilles et aux capsules (429, 89, le nombre d'OTU uniques et partagées

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org 8 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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TABLEAU 2 | Comparaisons par paires ADONIS de la structure du microbiote entre les espèces
d'orchidées et les organes, calculées sur les mesures de dissimilarité de Bray­Curtis.
Comparaison des espèces
R2
Serapias vomeracea vs. Neottia ovata Serapias 0,0458
vomeracea vs. Spiranthes spiralis Neottia ovata vs. 0,1023
0,0945
Spirale de Spiranthes
Comparaison d'organes
Racines contre tiges 0,0831
Racines contre feuilles 0,0649
Racines vs Capsules 0,0897
Tiges vs Feuilles 0,0528
Tiges vs Capsules 0,1140
Feuilles vs capsules 0,0897
Les différences significatives sont mises en évidence en gras.
sont indiqués pour N. ovata (Figure 6C), S. vomeracea (Figure 6D) et
S. spiralis (Figure 6E). Ces OTU partagées correspondaient à un
pourcentage similaire du total des OTU identifiées pour N. ovata (11,46
%) et S. vomeracea (10,95 %), alors qu'un pourcentage inférieur (4,25
%) a été trouvé chez S. spiralis.
Les OTU partagées étaient taxonomiquement diversifiées (tableau
supplémentaire 6) et aucun phylum dominant n'a pu être identifié : les
fréquences relatives reflétaient celles de la communauté totale (figure 2). aériennes avec les pollinisateurs et souterraines avec les champignons
Les genres principalement associés aux plantes formaient le noyau du
microbiote des trois espèces d'orchidées, comprenant également des
taxons typiquement bénéfiques, tels que Agromyces, Bacillus,
Bradyrhizobium, Burkholderia, Comamonas, Luteibacter,
Methylobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Sphingomonas,
Stenotrophomonas et Variovorax, entre autres. (Tableau supplémentaire tissus souterrains et aériens. Les bactéries endophytes jouent
6). D'autres taxons étaient des membres d'Enterobacteriaceae ainsi
que d'autres taxons typiquement humains (Cutibacterium, Escherichia­
Shigella, Neisseria et Staphylococcus). Les phytopathogènes typiques étaient
Analyse du réseau de cooccurrence Soixante­ dix
nœuds (correspondant aux OTU) composaient le réseau d'interaction
bactérienne ; chaque nœud présentait 4 à 22 arêtes (corrélations
significatives). Au total, il y avait 465 corrélations (345 positives et 120
négatives). Dix­sept corrélations étaient significatives pour trois des
quatre méthodes de distance/corrélation calculées, tandis que 448
étaient significatives pour les quatre méthodes. Le réseau n'était pas
modulaire (figure 7A), indiquant ainsi une relative homogénéité du
microbiote à travers les espèces et les organes d'orchidées. Sur la base
des scores de connectivité (figures 7B, C), quatre OTU ont été
identifiées comme « taxons hub » (figure 7, nœuds étiquetés). Après
BLAST manuel, ils ont été identifiés au niveau du genre comme
Mitsuaria, Pseudoxanthomonas, Thermus et Rhizobium. Trois espèces
ont été décrites dans le genre Mitsuaria, et l'analyse phylogénétique
d'OTU72 a montré qu'il était plus proche de M. noduli et M.
chitinosanitabida que du M. chitinovorans récemment décrit ( Sisinthy
et Gundlapally, 2020; Figure supplémentaire 5).
Trois des OTU centrales avaient plus de corrélations positives que
négatives, tandis que l'OTU­72 (Mitsuaria) avait le même nombre (11)
de corrélations positives et négatives. Ces
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Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes
les OTU du hub représentaient 0,04, 0,37, 0,54 et 2,62 (Rhizobium,
Pseudoxanthomonas, Mitsuaria et Thermus, respectivement) du
microbiote total. Mitsuaria et Thermus ont été inclus dans le noyau du
Test d'ADON
microbiote de toutes les espèces, tandis que Pseudoxanthomonas et
valeur p Rhizobium ont été inclus dans le noyau de S. vomeracea et S. spiralis,
respectivement.
0,0608
0,0002
0,0002
Présence de bactéries endophytes dans les graines de
Spiranthes spiralis Pour étudier la possibilité
0,0049 d'une transmission verticale des composants bactériens du microbiote
0,0436 d'orchidées, des graines ont été obtenues à partir de capsules de S.
0,0010 spiralis stérilisées en surface, écloses à l'intérieur de tubes de faucon
0,1304 stériles. De manière assez surprenante, le métabarcodage du microbiote
0,0006 des graines a produit le plus grand nombre d'OTU (1 262), par rapport
0,0064 aux autres organes de S. spiralis (Figure 8). Dans l'ensemble, 911 OTU
étaient uniques aux racines, tiges, feuilles, capsules et graines (141,
16, 19, 26 et 709, respectivement), tandis que 30 OTU représentaient
le microbiote central de S. spiralis. Fait intéressant, les graines
partageaient un nombre nettement plus élevé d'OTU avec les racines
(288) qu'avec les autres organes (43 avec les tiges, 30 avec les feuilles et 26 avec le
DISCUSSION
En raison de leur dépendance à des interactions biotiques spécifiques,
mycorhiziens, les orchidées peuvent être prédisposées à devenir
menacées, en particulier dans un scénario de changement climatique
mondial ( Dearnaley et al., 2012). En plus de ces interactions bien
étudiées, les orchidées établissent également de multiples interactions
avec un microbiote végétal omniprésent qui colonise l'intérieur des
probablement des fonctions importantes pour leur hôte, et de nombreux
endophytes bactériens isolés à partir de tissus d'orchidées ont montré
absents. de promotion de la croissance des plantes. Par exemple,
un potentiel
des bactéries endophytes isolées de l'orchidée tropicale Dendrobium
nobile pourraient favoriser la germination des graines d'orchidées
(Tsavkelova et al., 2016), et des souches bactériennes isolées de
Cymbidium sp. pourrait favoriser l'acclimatation et/ou la croissance des
orchidées (Faria et al., 2013 ; Gontijo et al., 2018). Bien que ces
observations suggèrent des rôles importants du microbiote bactérien
des orchidées, on sait très peu de choses sur les communautés
microbiennes associées aux orchidées, le niveau de spécificité de leurs
interactions avec l'hôte, leur distribution dans la plante et leurs modes de transmissio
Ici, nous avons exploré l'association de trois espèces d'orchidées
terrestres avec leur microbiote endophyte. Notre analyse a ciblé les
différents groupes taxonomiques de bactéries qui peuplaient les organes
végétatifs et reproducteurs des orchidées, qui, à notre connaissance,
n'ont pas encore été étudiés en profondeur. En utilisant une approche
de métabarcodage basée sur NGS, nous avons révélé différents
groupes taxonomiques dans le microbiote de N. ovata, S. vomeracea et
S. spiralis, qui pourraient potentiellement jouer des rôles clés en
interagissant avec l'hôte. Les résultats ont confirmé notre première
hypothèse selon laquelle le microbiote est organisé en structures
phylogénétiques distinctes dans diverses espèces végétales et organes.
L'analyse de la diversité alpha et bêta a suggéré que les organes
étaient le principal déterminant de la composition bactérienne de
9 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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FIGURE 6 | Diagrammes de Venn montrant le nombre d'OTU bactériennes partagées entre les groupes d'échantillons. Les groupes d'échantillons sont indiqués sous forme d'étiquette sous chaque
diagramme.

le microbiote des orchidées. Il n'y avait en fait aucune preuve de habitat très différent qu'ils colonisent. N. ovata a été collecté dans les bois,
regroupement des communautés bactériennes selon les espèces végétales, tandis que S. vomeracea est une espèce d'orchidée des prés qui a été
et N. ovata et S. vomeracea étaient très similaires malgré la collectée sur des prairies pauvres, un habitat plus proche du

frontières en microbiologie | www.frontiersin.org dix décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964

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FIGURE 7 | Réseau de cooccurrence microbienne du microbiote des orchidées. (A) Les nœuds représentent les OTU, les bords représentent les corrélations positives (lignes bleues) ou
négatives (lignes rouges). La taille du nœud indique le degré (nombre de connexions) et la couleur du nœud indique la classe taxonomique, selon la légende. Les nœuds étiquetés
représentent les OTU du concentrateur. (B, C) Scores de connectivité des nœuds, basés sur le degré, la centralité d'intermédiarité et la centralité de proximité, utilisés pour identifier les OTU du
hub (nœuds étiquetés).

un supportant la croissance de S. spiralis. Cela contraste avec les études réalisées
sur différentes espèces d'Agave (Coleman­Derr et al., 2016) mais est cohérent avec
une étude récente sur les modèles de diversité des communautés bactériennes
endophytes de trois espèces de plantes de la forêt tropicale, où un chevauchement
important des communautés bactériennes a été observé. observé entre différents
organes végétaux et espèces végétales (Haruna et al., 2018). Des différences
significatives entre les organes végétaux ont en effet été détectées chez nos
orchidées, avec une nette tendance à la diminution de la diversité et de la richesse le
long de l'axe vertical, devenue significative lorsque les deux extrêmes (capsules et
racines) ont été comparés. Cette situation suggère un rôle actif des plantes d'orchidées
dans la sélection de taxons bactériens spécifiques, de plus en plus spécialisés en se
déplaçant du sous­sol vers l'aérien.
les pièces. Les endophytes des racines bactériennes proviennent probablement du
microbiote du sol et de la rhizosphère (Compant et al., 2010). Une fois qu'ils pénètrent
dans les tissus racinaires, les endophytes bactériens peuvent se propager et coloniser
les parties aériennes des plantes, bien que les bactéries endophytes puissent
également pénétrer dans les feuilles par les stomates (Senthilkumar et al., 2011).
Les bactéries endophytes dans les organes végétaux ne sont pas distribuées au
hasard, et certains embranchements dominants semblent être spécifiques à un tissu
ou à un organe. De nombreuses études, menées avec différents organes végétaux,
ont révélé des différences significatives dans la composition du microbiote endophyte
végétal (Bodenhausen et al., 2013 ; Romero et al., 2014 ; Akinsanya et al., 2015 ;
Maropola et al., 2015 ; Sarria Guzmán et al., 2016 ; Li et al., 2017 ; Tian et Zhang,
2017 ; Yang et al., 2017). Dans les trois espèces d'orchidées, Proteobacteria

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FIGURE 8 | Analyses des OTU bactériennes partagées et majeures dans le microbiote de Spiranthes spiralis. (A) Diagramme de Venn montrant des OTU uniques et partagées entre les
organes végétatifs et reproducteurs (racine, feuille, tige, capsule, graine). (B) Heatmap montrant les OTU bactériennes > 0,5 % des séquences totales ; les échantillons ont été regroupés par
organes d'orchidées (rangée du haut). La clé de couleur du bleu au rouge indique une abondance croissante en logarithme naturel des comptages, avec les OTU le long de l'axe Y et les échantillons
le long de l'axe X.
et les actinobactéries étaient les groupes dominants, quelle que soit l'espèce
végétale, mais avec des différences dans la distribution dans les organes de
la plante. De plus, la distribution des genres bactériens n'a pas déterminé un
regroupement clair par espèce/organe. Cela suggère un bon chevauchement
des membres clés de la communauté dans les différentes espèces d'orchidées,
dont certains pourraient être impliqués dans des processus essentiels, tels
que la fixation de l'azote ( Sun et al., 2004 ; Moyes et al., 2016 ; Puri et al. .,
2016).
Parmi les genres les plus représentatifs, on a identifié Cutibacterium,
largement connu comme commensal et faisant partie du microbiote cutané
humain. Cependant, une étude récente, à l'appui de nos données, a démontré
la présence de Cutibacterium comme endophyte des racines et des feuilles
dans les cultivars de blé Triticum spelta cv Rokosz et Triticum aestivum cv
Hondia (Kuzniar et al .
´ , 2020). Il est également très intéressant, comme le
rapportent Shaffer et al. (2018), que ce genre a été classé comme
endosymbionte hyphale d'un endophyte fongique foliaire (Fusarium concolor)
de Hybanthus prunifolius. Cet aspect mérite d'être approfondi par d'autres
études pour comprendre les rôles fonctionnels qui pourraient éventuellement
médiatiser les interactions tripartites avec les champignons mycorhiziens
d'orchidées.
Les autres genres les plus représentatifs, distribués différemment dans les
trois espèces d'orchidées, étaient Pseudomonas, Luteibacter, Cupriavidus,
Limnobacter, Pantoea et Acinetobacter qui sont inclus parmi les genres les
plus couramment trouvés comme endophytes bactériens (Marquez­Santacruz
et al., 2010 ; Romero et al., 2014 ; Shi et al., 2014). Les espèces de
Pseudomonas, grâce à leur polyvalence métabolique et leur ubiquité,
colonisent plusieurs habitats naturels en adoptant des modes de vie variés.
Ce genre a été identifié comme un groupe d'endosymbiontes chez les
orchidées terrestres australiennes
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(Wilkinson et al., 1989, 1994), et dans les racines des orchidées épiphytes
(Tsavkelova et al., 2004).
Le genre Pantoea est un groupe diversifié de bactéries que l'on trouve
couramment en association avec les plantes. Les endophytes de Pantoea ont
été principalement trouvés dans des plantes telles que la vigne, le pois, le riz
et l'orge (Bell et al., 1995 ; Elvira­Recuenco et van Vuurde, 2000 ; Mano et
al., 2007 ; Rahman et al., 2018).
Leur rôle potentiel en tant que PGP pour les plantes hôtes est bien
documenté, comme l'activité ACC­désaminase (Zhang et al., 2011), la
production d'hormones (Tsavkelova et al., 2007 ; Chalupowicz et al., 2009) et
les sidérophores (Loaces et al. al., 2011). Comme l'a démontré notre étude
récente (Alibrandi et al., 2020), les endophytes isolés des mêmes espèces
d'orchidées étudiées dans les travaux en cours, appartenant aux genres
Pseudomonas et Pantoea, peuvent utiliser différents mécanismes pour
favoriser la croissance des plantes. Des souches classées dans le genre
Luteibacter ont été trouvées en étroite association avec des plantes (Johansen
et al., 2005 ; Aamot et al., 2017) et des lichens (Cardinale et al., 2006). Dans
le genre Luteibacter, certaines souches ont également été caractérisées
comme des bactéries endohyphes au sein d'une gamme de champignons
ascomycètes (Arendt et al., 2016 ; Araldi­Brondolo et al., 2017). Ces
complexes bactériens/fongiques modulent plusieurs phénotypes fongiques, y
compris la possibilité que certains champignons agissent comme promoteurs
de croissance des plantes (Arendt et al., 2016 ; Araldi Brondolo et al., 2017).
Ce genre était principalement distribué dans les deux espèces d'orchidées (N.
ovata et S. vomeracea) qui ne présentaient aucune différence significative
dans la structure du microbiote, suggérant une colonisation dépendante de
l'espèce pour ce genre.
Des membres du genre Limnobacter ont souvent été détectés dans divers
environnements, tels que l'eau de mer de surface, l'océan profond, l'intestin
humain et les dépôts volcaniques (Lu et al., 2008 ;
12 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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Eloé et al., 2010 ; Rigsbee et al., 2011 ; Vedler et al., 2013).
Cependant, Limnobacter a été trouvé dans des graines de maïs (cultivar
Ngonda 108) à différents stades de croissance (Liu et al., 2013).
Nous avons identifié Limnobacter comme le genre dominant dans les
capsules de N. ovata, indiquant que ces bactéries ont tendance à coloniser
préférentiellement les parties aériennes des orchidées.
Les espèces de Cupriavidus ont été couramment isolées dans différents
habitats du sol, de l'eau, des nodules végétaux et des spécimens médicaux
humains (Coenye et al., 1999, 2003 ; Chen et al., 2001 ; Goris et al., 2001 ;
Sato et al., 2006 ). On sait que certaines souches isolées de différentes
espèces de mimosa poussant dans des régions distinctes de Chine, du Costa
Rica, de Taïwan et de Papouasie­Nouvelle­Guinée ( Chen et al., 2003 ;
Barrett et Parker, 2006 ; Elliott et al., 2009 ; Liu et al., 2011) induisent la
formation de nodules racinaires chez les légumineuses.
Le genre Cupriavidus a été trouvé principalement dans N. ovata et S.
vomeracea (plus abondant dans les tiges) et a été distribué dans les organes
aériens et souterrains. Ce résultat suggère que les membres de ce genre
sont capables de coloniser la plante entière quel que soit l'organe.
Acinetobacter comprend des bactéries hétérogènes, généralement des
saprophytes vivant librement et omniprésentes, associées à divers habitats,
par exemple, le sol, l'eau, les eaux usées, les humains, les éponges de
cuisine usagées, la nourriture et les animaux (Visca et al., 2011 ; Doughari et
al., 2011 ; Jung et Park, 2015 ; Cardinale et al., 2017). Acinetobacter est
également connu comme bactérie endophyte et promoteur de croissance des
plantes. Les souches d'A. calcoaceticus isolées des tissus du caféier étaient
capables de produire des phosphatases et des sidérophores (Silva et al.,
2012). De même, A. johnsonii isolé à partir de racines stérilisées en surface
de Beta vulgaris a montré la capacité d'augmenter l'absorption de N, P, K et
Mg et a produit la phytohormone auxine. Grâce à ces caractères, cette
souche PGP a pu favoriser la croissance de la betterave à sucre en
augmentant le rendement en saccharose et en fructose (Shi et al., 2011).
Nous avons trouvé le genre Acinetobacter distribué dans tous les organes de
S. spiralis, ce qui indique une préférence de l'espèce pour la colonisation
indépendamment de l'organe de la plante.
L'analyse des cooccurrences a identifié quatre OTU centrales, dont deux
sont des taxons typiques associés aux plantes, à savoir Pseudoxanthomonas
et Rhizobium. Le rhizobium forme généralement des symbioses fixatrices
d'azote avec les racines des légumineuses, mais est également capable de
favoriser la croissance des plantes non légumineuses (García­Fraile et al., 2012).Hardoim et al., 2012), le maïs (Liu et al., 2013) , tabac (Mastretta et al., 2009),
Mitsuaria est un genre au sein des Betaproteobacteriales qui comprend des
bactéries Gram­négatives, aérobies obligatoires, oxydase et catalase positives
(Amakata et al., 2005). A ce jour, seules trois espèces ont été identifiées : M.
chitosanitabida, isolée du sol (Amakata et al., 2005), M. noduli, isolée des
nodules racinaires de plantes poussant dans des sols contaminés par des
métaux lourds (Fan et al., 2018 ), et très récemment M. chitinivorans isolé de
l'eau de puits tubulaires (Sisinthy et Gundlapally, 2020). Les isolats de
Mitsuaria ont également été identifiés comme microbes associés aux plantes
à la fois dans la rhizosphère et comme endophytes végétaux des
monocotylédones et des dicotylédones (Nascimento et al., 2015 ; Huang et
al., 2017 ; Fan et al., 2018). Il a été rapporté que Mitsuaria a des effets de
lutte biologique contre les phytopathogènes, tels que Rhizoctonia solani et
Pythium aphanidermatum dans la tomate et le soja (Benítez et al., 2009).
Cette capacité peut être liée à la chitinase et à la chitosanase uniques qui
sont caractéristiques de Mitsuaria (Sisinthy et Gundlapally, 2020). Un effet
suppresseur des espèces de Mitsuaria a été
frontières en microbiologie | www.frontiersin.org
Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes
également démontré contre les maladies bactériennes causées par Ralstonia
pseudosolanacearum (Marian et al., 2018) et le stress hydrique chez
Arabidopsis thaliana (Huang et al., 2017). Il convient de noter que Mitsuaria
fait partie du microbiote central des trois espèces d'orchidées testées (tableau
supplémentaire 6) ; les multiples relations du genre Mitsuaria avec les autres
membres du microbiote de l'orchidée pourraient générer des effets
synergiques supplémentaires au bénéfice de l'hôte, comme récemment
suggéré dans une étude sur des plants de tomate (Marian et al., 2019) .
Thermus est un genre de bactéries thermophiles à Gram négatif
appartenant au phylum Deinococcus­Thermus. Comme son nom l'indique,
l'une de ses caractéristiques particulières est sa capacité à vivre dans des
environnements aux températures extrêmes. Des bactéries de type Thermus
ont été trouvées dans des systèmes hydrothermaux marins peu profonds et
profonds, ainsi que dans des sources de sulfate à faible teneur en sel (Huber
et Stetter, 2004). Il était donc surprenant de le trouver en tant qu'endophyte
d'orchidée, et plus encore en tant que taxon central. À ce jour, il n'existe
aucune étude sur l'interaction bactérie Thermus­plante, et cet aspect mérite
donc l'attention pour de futures études.
D'une part, le microbiote de base comprenait les OTU les plus abondantes,
dont la plupart étaient liées à des taxons bénéfiques pour les plantes.
Cependant, il était intéressant de noter que les OTU partagées entre les
racines et les autres organes ne concernaient que les OTU les moins
abondantes, suggérant un rôle important également pour les bactéries les moins abondante
Certains taxons microbiens présents en faible abondance sont appelés «
taxons satellites » (Hanski, 1982 ; Magurran et Henderson, 2003) et peuvent
être définis principalement en fonction de leur abondance locale et de leur
spécificité à l'habitat (Jousset et al., 2017). Il a récemment été suggéré que
les taxons présents en faible abondance pourraient réussir à contrecarrer les
invasions microbiennes indésirables dans les communautés du sol (Mallon
et al., 2015) et largement contribué à la production de composés antifongiques
volatils qui ont finalement protégé les plantes des phytopathogènes du sol
(Hol et al. ., 2015).
Les graines peuvent héberger le microbiote potentiellement héréditaire
par la prochaine génération de plantes, restaurant ainsi l'empreinte du
microbiote des plantes parentales. Le microbiote des graines a suscité un
intérêt croissant ces dernières années. Des bactéries associées aux
semences ont été détectées dans les semences de diverses espèces de
cultures, notamment le riz (Bacilio­Jiménez et al., 2001 ; Cottyn et al., 2001 ;
café (Vega et al., 2005), quinoa (Pitzschke, 2016), haricot commun (López­
López et al., 2010), vigne (Compant et al., 2011) , l'orge (Rahman et al.,
2018), la citrouille (Fürnkranz et al., 2012) et la luzerne (Charkowski et al.,
2001), ainsi que dans les plantes sauvages comme le cactus cardon
(Pachycereus pringlei) (Puente et al. , 2009), Eucalyptus spp. (Ferreira et al.,
2008), l'épicéa de Norvège (Picea abies) (Cankar et al., 2005) et l'arbre sud­
américain Anadenanthera colubrina (Alibrandi et al., 2018). De manière
surprenante, l'analyse du microbiote des graines de S. spiralis a montré que
ces organes reproducteurs constituaient la niche du plus grand nombre
d'OTU, environ le double de celle des racines (organes généralement
associés à une plus grande diversité microbienne). Cette découverte contredit
plusieurs études suggérant que le microbiote endophyte des graines a
tendance à être paucispécifique, généralement limité à quelques genres,
principalement Bacillus, Pseudomonas, Paenibacillus, Micrococcus,
Staphylococcus, Pantoea et Acinetobacter (Truyens et al., 2015) . Malgré la
plus grande diversité de microbiote, la
13 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964
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Alibrandi et al. Le Microbiote des Orchidées Méditerranéennes

Les graines de S. spiralis ont en outre filtré le noyau du microbiote (de 35 à 30 OTU) Cet aspect soutient en outre la preuve d'un rôle bénéfique du microbiote de
et confirmé notre deuxième hypothèse selon laquelle les graines pourraient l'orchidée pour l'orchidée hôte.

représenter un réservoir d'endophytes pouvant être transmis verticalement. Le résultat

Ce travail contribue à accroître nos connaissances sur la diversité du microbiote
le plus inattendu était le grand nombre d'OTU partagés entre les graines et les racines
bactérien des orchidées terrestres, ouvrant de nouveaux scénarios jusqu'alors
(Figure 8), qui était bien supérieur à la fraction du microbiote partagé entre les graines
inexplorés pour l'étude des holobiontes d'orchidées.
et les capsules. Il était curieux de constater que les capsules et les graines (qui sont
à l'intérieur des capsules) ne partageaient que 26 OTU, 10 fois moins que celles
partagées entre les racines et les graines. Comme ces OTU partagées n'ont pas été
identifiées dans les autres tissus d'orchidées au­dessus du sol, l'explication la plus
DÉCLARATION DE DISPONIBILITÉ DES DONNÉES
probable est qu'elles peuvent provenir de l'extérieur des plantes. Une hypothèse
Les ensembles de données présentés dans cette étude peuvent être trouvés dans
possible sur l'origine d'un microbiote de graines aussi abondant chez S. spiralis est
des référentiels en ligne. Les noms du/des référentiel(s) et le(s) numéro(s) d'accès
via le pollen. Les pollens de plantes sont une riche source de microbes (Ambika
peuvent être trouvés ci­dessous : https://www.ebi.ac.uk/ena , PRJEB40289.
Manirajan et al., 2016, 2018), et les bactéries introduites expérimentalement dans les
fleurs ont été récupérées dans le microbiome des graines (Mitter et al., 2017). Par
conséquent, les bactéries associées au pollen sont considérées comme contribuant
à l'assemblage du microbiote des graines (Rodríguez et al., 2018). De plus, la
CONTRIBUTIONS D'AUTEUR
pollinisation des plantes d'orchidées ne repose pas sur des grains de pollen
individuels, mais sur ce qu'on appelle la "pollinie" (grappes de grains de pollen PA a réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. SS a
étroitement agrégés), ce qui pourrait augmenter la charge microbienne à chaque contribué aux expériences et à l'interprétation des données, et a révisé le manuscrit
événement de pollinisation. de manière critique. SP a conçu l'étude, supervisé les expériences, validé les
données, rédigé et revu le manuscrit de manière critique. MC a conçu l'étude,
supervisé les expériences et l'analyse des données, et rédigé et revu de manière
Une autre origine possible est l'aérosol généré par la pluie lorsqu'elle touche le sol critique le manuscrit.
(Joung et al., 2017). Dans ce cas, les gouttelettes d'aérosol transportant les microbes
du sol pourraient atteindre les parties aériennes, adhérer aux tissus floraux collants Tous les auteurs ont contribué à l'article et ont approuvé la version soumise.
et être ensuite collectées dans les cavités florales plus que sur d'autres surfaces
végétales, où les pluies peuvent les chasser rapidement (Allard et al., 2020 ). Cette
découverte intéressante devrait être étudiée plus avant dans d'autres sites
d'échantillonnage, années et sur d'autres espèces d'orchidées, afin de généraliser si FINANCEMENT
les Orchidaceae peuvent être considérées comme une famille de plantes avec un
microbiome de graines abondant et ressemblant à des racines. D'autres études PA a été soutenu par un doctorat. bourse du ministère italien de l'éducation, de
seront également nécessaires pour vérifier la transmission verticale réelle des l'université et de la recherche (MIUR) et par une bourse de mobilité du service
microbes associés aux semences dans allemand d'échange (DAAD), numéro de bourse 57381332.
orchidées, ainsi que leur rôle dans la croissance et la santé des orchidées.

CONCLUSION REMERCIEMENTS

Dans cette étude, nous avons analysé le microbiote bactérien endophyte total associé Nous remercions Jacopo Calevo et Miriam Bazzicalupo (Turin, Italie) pour leur aide

à trois espèces d'orchidées terrestres. Nous avons trouvé que:
­ Les organes végétaux ont plus influencé la diversité et la structure de la
communauté endophytique que les espèces végétales.
­ La colonisation systémique du microbiote des orchidées a suivi un schéma
commun, avec une réduction de la diversité des racines aux capsules, ce qui
indique un rôle actif de la plante dans le processus de sélection du microbiome.
précieuse avec l'échantillonnage et Bellinda Schneider (Giessen) pour le soutien
avec le séquençage IonTorrent. Nous remercions Matteo Chialva, Francesco Venise
et Alessandro Silvestri (Turin, Italie) pour leur importante contribution sur l'utilisation
du logiciel R et la préparation de l'archivage des données de séquençage à haut
débit.

­ La grande diversité du microbiote des graines de Spiranthes spiralis, qui
recoupe notamment celui des racines, suggère un rôle des graines d'orchidées
comme vecteur de microbes pour restaurer le microbiome de la rhizosphère.
Ce
MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE
Le matériel supplémentaire de cet article est disponible en ligne à l'adresse : https://
www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb. 2020.604964/full#supplementary­material

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18 décembre 2020 | Tome 11 | Article 604964