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Recherche

Culture axénique in vitro de 19 espèces de tourbe (Sphagnum L.)

comme ressource pour la biologie fondamentale, la biotechnologie et la paludiculture

, Volker
Melanie A. Heck1 Nico van Gessel1
M. Luth €Eva
1
,L. Decker1 et , Matthias Krebs2.3 , Mira Kohl2,3 ,
Anja Prager2,3 , Hans Joosten2,3 , Ralf Reski1,4,5
1 2
Biotechnologie végétale, Faculté de biologie, Université de Fribourg, Fribourg 79104, Allemagne ; Études des tourbières et paléoécologie, Institut de botanique et d'écologie du paysage, Université de

3 4
Greifswald, Greifswald 17487, Allemagne ; Greifswald Mire Center, Greifswald 17489, Allemagne ; CIBSS – Centre d'études intégratives sur la signalisation biologique, Université de Fribourg, Fribourg

5
79104, Allemagne ; Cluster d'excellence livMatS @ FIT – Centre de Fribourg pour les matériaux interactifs et les technologies bioinspirées, Université de Fribourg, Fribourg 79110, Allemagne

Résumé
Auteur de la correspondance : La culture de la sphaigne peut remplacer la tourbe par de la biomasse renouvelable et ainsi contribuer à atténuer le
Ralf Reski
changement climatique. De grandes quantités de matériaux de fonderie nécessaires ne peuvent être fournies que de manière durable
E­mail : ralf.reski@biologie.uni­freiburg.de
par culture axénique dans des bioréacteurs.
Reçu : 23 avril 2020 Nous avons établi des cultures axéniques in vitro à partir de sporophytes de 19 espèces de Sphagnum collectées
Accepté : 27 août 2020
en Autriche, en Allemagne, en Lettonie, aux Pays­Bas, en Russie et en Suède : S. angustifolium, S. balticum,
S. capillifolium, S. centrale, S. compactum, S. cuspidatum, S. fallax, S. fimbriatum, S. fuscum, S. li­ndbergii, S. medium/

Nouveau phytologue (2020) divinum, S. palustre, S. papillosum, S. rubellum, S. russowii, S. squarrosum,

est ce que je: 10.1111/nph.16922
Mots clés : arrêt du cycle cellulaire, changement climatique,
Codes­barres ADN, taille du génome, mousse de tourbe,
restauration des tourbières, culture de sphaignes,
Sphaigne magellanique.
S. subnitens, S. subfulvum et S. warnstorfii. Ces espèces couvrent cinq des six régions européennes
Sous­genres Sphagnum; à savoir, Acutifolia, Cuspidata, Rigida, Sphagnum et Squarrosa.
Leur croissance a été mesurée dans des cultures en suspension, tandis que leur ploïdie a été déterminée par
cytométrie en flux et comparée à la taille du génome de Physcomitrella patens. Nous avons identifié
espèces haploïdes et diploïdes de Sphagnum, ont constaté que leurs cellules sont principalement arrêtées dans le
phase G1 du cycle cellulaire, et n'a pas trouvé de corrélation entre la productivité des plantes et
ploïdie. Le codage à barres de l'ADN a été réalisé par séquençage des introns des gènes BRK1.
Avec cette collection, du matériel de fondage de haute qualité pour diverses applications à grande échelle, mais
également pour la recherche fondamentale sur la sphaigne, est disponible auprès de l'International Moss Stock Center.

et coll., 2020). Ensemble, l'impact sur le cycle C mondial fait

Introduction
Couverture des tourbières > 4 9 106 km2 , comprenant 3 % des terres émergées de la Terre
et la surface de l'eau douce (Joosten & Clarke, 2002), et contiennent
environ 30 % du carbone (C) mondial du sol (Gorham, 1991 ; Frolk­ing & Roulet,
2007). La plupart des tourbières des régions tempérées et boréales
des zones se sont formées et sont dominées par des tourbières; c'est,
mousses du genre Sphagnum (Clymo & Hayward, 1982;
Joosten et al., 2017). Ils accumulent de la matière organique morte
(« tourbe ») dans des conditions humides, anoxiques, acides et pauvres en nutriments,
réduisant ainsi l'activité microbienne et réduisant la pourriture
de matière organique. En conséquence, les tourbières vierges sont des puits de carbone ; que
Autrement dit, ils séquestrent plus de C qu’ils n’en émettent et fonctionnent comme
des magasins de C à long terme (Clymo et Hayward, 1982 ; Joosten et al., 2016).
Les scénarios de changement climatique supposent que les sécheresses prolongées,
les températures élevées et les dépôts accrus d'azote (N) (Gal­loway et al., 2008)
diminuent la croissance des sphaignes et
augmenter la décomposition, réduisant ainsi la quantité de C séquestré (Lim­pens et
La sphaigne, un modèle écologique important, attirant un public croissant
nombre de scientifiques. Par conséquent, la première ébauche du génome
séquences sont devenues disponibles récemment (Sphagnum fallax v.1.1 et
Sphagnum magellanicum v.1.1, http://phytozome.jgi.doe.gov/ ;
Weston et coll., 2018). Bien que les sphaignes soient de plus en plus
importance économique pour de nombreuses applications, notamment le traitement
des eaux usées (Couillard, 1994), en tant que capteurs de pollution atmosphérique
(Capozzi et al., 2016, 2017 ; Di Palma et al., 2019 ; Aboal et al.,
2020), et comme matière première pour les substrats de culture (Wichmann et al.,
2020), ils ne sont pas encore analysés de manière très détaillée.
La superficie mondiale des tourbières a été considérablement réduite
(10–20%) depuis 1800, notamment par drainage pour l'agriculture
et la foresterie. De plus, la tourbe sert à la production d'énergie et à
substrat pour l’horticulture (Joosten & Clarke, 2002). Drainage
conduit à la minéralisation de la tourbe et aux émissions ultérieures de gaz à effet de
serre (GES), tels que le CO2 et l'oxyde nitreux (Van Den
Pol­Van Dasselaar et al., 1999 ; Boon et coll., 2014 ; Carlson et coll.,

al., 2011 ; Norby et al., 2019). De plus, l’évolution des communautés microbiennes 2017). Alors que les tourbières drainées ne couvrent que 0,4 % du territoire
pourrait améliorer le passage fonctionnel du puits au système. superficie, ils représentent 32% des terres cultivées et près de 5%
source (Lew et al., 2019 ; Juan­Ovejero et al., 2020 ; Rewcastle des émissions anthropiques de GES à l’échelle mondiale (Joosten et al., 2016 ;

2020 Les auteurs Nouveau phytologue (2020) 1

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Il s'agit d'un article en libre accès selon les termes de la licence Creative Commons Attribution­NonCommercial­NoDerivs, qui autorise l'utilisation et
distribution sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée, que l'utilisation soit non commerciale et qu'aucune modification ou adaptation ne soit apportée.
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2 Recherche
Carlson et coll., 2017). Leifeld et coll. (2019) ont estimé qu’en
le biome mondial des tourbières est passé d’un puits net à une source nette
de GES dérivés du sol. De plus, ces chercheurs prédisent une émission cumulée des
tourbières drainées de 249,38 Pg de CO2.
équivalent d’ici 2100 si la tendance actuelle se poursuit.
La réhumidification des tourbières drainées diminue ces émissions et
peut même restaurer la fonction de puits de carbone (Joosten et al., 2016 ;
Wichtmann et al., 2016). Cependant, la réhumidification rend impossible l’utilisation
conventionnelle des terres basée sur le drainage (Wichmann et al.,
2017). Paludiculture, agriculture humide et foresterie sur tourbières,
permet de poursuivre l’utilisation des terres et de combiner la réduction des émissions
avec la production de biomasse. Cela comprend la culture traditionnelle des tourbières
(fauchage des roseaux, utilisation de litière) et de nouvelles approches d'utilisation
(Abel et al., 2013 ; Wichtmann et al., 2016).
La culture de sphaignes sur tourbières réhumidifiées est un exemple prometteur
de la paludiculture car elle produit de la biomasse de sphaigne en remplacement
pour la tourbe (Gaudig & Joosten, 2002 ; Gaudig et al., 2014, 2018). Il
diminue considérablement les émissions de GES en réhumidifiant les eaux usées
les tourbières, en évitant l’utilisation et l’oxydation de la tourbe fossile, et
en préservant les tourbières jusqu'ici non drainées pendant que le C stocke et coule
(Wichtmann et al., 2016 ; Gunther € et al., 2017). Sites potentiels
pour la culture de la sphaigne sont des tourbières dégradées et des plans d'eau acides
(Wichmann et coll., 2017).
Différentes conditions environnementales (par exemple niveau d'eau ou apport en
nutriments) et différentes exigences de la biomasse produite
faire appel à une variété d’espèces et de génotypes de mousse de tourbe en tant que fondateur
matériel pour les fermes de sphaignes (Gaudig et al., 2018). Le manque de matériel
fondateur suffisant constitue actuellement un goulot d’étranglement majeur pour le
mise en œuvre à grande échelle de la culture de la sphaigne. Dans l'UE,
Les espèces de sphaignes et leurs habitats sont protégés par le Conseil
Directive 92/43/CEE, contraignant la perception du fondateur
matériaux issus des habitats naturels. De plus, la culture commerciale de la sphaigne
nécessite du matériel de sphaigne sans contamination biologique indésirable (Gaudig
et al., 2018) et d'une
une constitution adaptée à son objectif. Clones de mousse établis à partir de
une seule spore ou plante partage les mêmes caractéristiques génétiques, physiologiques et
contexte environnemental, permettant la multiplication des
clones sélectionnés pour obtenir des rendements maximaux. Fondateur de sphaigne
un matériel de qualité contrôlée peut être produit dans des conditions aseptiques avec
des méthodes de culture tissulaire standard (Caporn et al.,
2017), mais probablement plus rapidement par la culture axénique en biore­
acteurs.
Une étape importante vers la production à grande échelle de tels
Le matériau fondateur était le développement d'un processus de production de
photobioréacteur axénique pour Sphagnum palustre, utilisant des
matériau généré à partir d’une seule spore (Beike et al., 2015). Sous
conditions de laboratoire standardisées, le taux de multiplication des
le matériau était jusqu'à 30 fois supérieur en 4 semaines. Premiers résultats avec ceci
clone a indiqué qu'il peut pousser dans un habitat naturel sans
étape de durcissement intermédiaire (Decker & Reski, 2020). Un autre
l’amélioration est l’établissement d’une prolifération de protonèmes
protocole pour Sphagnum squarrosum (Zhao et al., 2019). En plus
ces deux espèces, nous n'avons trouvé qu'un seul signalement de l'établissement
de cultures de S. fallax dans un bioréacteur (Rudolph et al., 1988). Ainsi,
il reste difficile de savoir si un ensemble d'espèces plus large peut être établi en tant
que souches axéniques de laboratoire. De plus, différentes sphaignes
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les espèces ont été décrites comme ayant des propriétés haploïdes, diploïdes ou même triploïdes.
gamétophytes, mais l'avantage évolutif de la polyploïdisation
reste pas clair. Une hypothèse vérifiable est que les espèces polyploïdes
croître plus rapidement, comme cela a été rapporté pour les angiospermes (Van Drunen
& Mari, 2018 ; Walden et coll., 2020).
Nous rapportons ici la mise en place de cultures axéniques in vitro
de 19 espèces de sphaignes appartenant à cinq sous­genres de mousse de tourbe et
comparer leur comportement de croissance, la taille de leur génome et leurs cellules.
faire du vélo. Avec cette collection, du matériel de fonderie de haute qualité pour
diverses applications à grande échelle, mais aussi pour les sphaignes de base
recherche, est disponible.
Matériels et méthodes
Décontamination des sporophytes et germination des spores
Nous avons collecté des sporophytes de 19 espèces de sphaignes sur le terrain
(Tableau 1) et les a stockés à 4°C. Le statut taxonomique du
Les clones de sphaigne medium/divinum doivent être clarifiés pour tenir compte des
informations taxonomiques (Hassel et al., 2018) après la collecte. Les capsules de
spores ont été stérilisées en surface et ouvertes avec
pince dans 1 ml de solution d’hypochlorite de sodium (NaClO). Le
solution a été fraîchement préparée avec de l'eau autoclavée avec deux
gouttes de Tween 20 pour 500 ml d'eau et une concentration finale de
soit 0,6, 1,2 ou 2,4 % de NaClO. L'incubation a été arrêtée à
différents moments entre 30 s et 7 min en transférant
100 µl de la suspension pour 1 ml d'eau autoclavée. De ceci
dilution, 500 µl ont été transférés dans une boîte de Petri stérile, qui
contenait l'un des milieux solides suivants : (1) Milieu Knop
(1,84 mM de dihydrogénophosphate de potassium, 3,35 mM de chlorure de potassium,
1,01 mM de sulfate de magnésium, 4,24 mM de calcium
nitrate, 45 µM de sulfate de fer(II) selon Reski & Abel
(1985) complété par des microéléments (ME ; 50 µM de borique
acide, 50 µM de sulfate de manganèse, 15 µM de sulfate de zinc, 2,5 µM
iodure de potassium, 500 nM de molybdate de sodium, 50 nM de cuivre
sulfate, 50 nM de nitrate de cobalt(II)) selon Schween et al.
(2003a), ou (2) Milieu sphaigne (milieu Knop avec ME,
0,3 % de saccharose et 1,25 mM de nitrate d'ammonium (NH4NO3))
selon Beike et al. (2015). Les boîtes de Pétri ont été scellées avec
Parafilm (Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne) et cultivé sous
conditions standards de croissance : chambre climatique, température de
22°C, régime photopériode de 16 h : 8 h, clair : sombre, et clair
s 1 fluorescents.
intensité de 70 5 lmol m2 fournie par les tubes
Les intensités lumineuses ont été mesurées avec un capteur quantique planaire
(Li­Cor 250 ; Li­Cor Biosciences, Bad Homburg, Allemagne).
Après la germination des spores, les protonèmes thalloïdes simples ont été séparés
et transférés dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant soit du solide
Knop ME ou milieu Sphagnum solide dans des conditions stériles
à l'aide d'aiguilles et d'un stéréomicroscope (Stemi 2000­C ; Zeiss, Jena,
Allemagne). Les assiettes contenaient l'un des supports suivants à servir
comme contrôles : (1) Knop ME complété avec 1 % de glucose et
12 g l1 gélose purifiée (Oxoid Ltd, Basingstoke, Royaume­Uni); (2) LB
(10 gl1 Bacto Tryptone (Becton, Dickinson & Co., Franklin
Lakes,l1NJ,
de USA), 10de
chlorure g l1
sodium (NaCl), 5 g l1 Bacto
Extrait de levure (Becton, Bacto
Dickinson
Agar& Co.) et 15 g (Becton,
Dickinson & Co.)); ou (3) gélose tryptique soja à 1 %
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Phytologue Recherche 3

Tableau 1 Sphagnum spp. clones en culture axénique avec les numéros correspondants de l'International Moss Stock Center (IMSC), la date et l'emplacement de la capsule de spores
collection.

Origine de la capsule de spores

Sphaigne sp. Numéro IMSC. Six meilleurs clones Date Emplacement

S. angustifolium S. 41114 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 7.1 1.1, 1.2, 2015­2007 Malpils (LVA)
balticum S. 41118 2.2, 3.3, 8.1, 9.5 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2016­2008 Laponie (SWE)*
capillifolium S. 41126 1.9, 1.49 1.2, 3.3, 6.4, 7.5 2015­2007 Fribourg, Schauinsland (DEU)*
centrale 41129 2016­2008 Sibérie, Surgut Polesye (RUS)
41134 9.6, 10.2 2016­2007 Malpils (LVA)
S. compactum S. 41137 3.1, 4.6, 5.1, 5.3, 6.1, 6.2 1.1, 1.4, 2018­2006 Bargerveen (NLD)
€ €

cuspidatus S. 41146 3.3, 3.4, 5.1, 5.2 2.1, 3.1, 4.1, 4.4, 2016­2007 Grundlenried ­ Rotseemoos (ÇA A DONNÉ)*

fallacieux 41151 4.5, 4.6 2017­2006 Pilote de culture de sphaigne : Rastede (DEU)
Origine : De Weribben (NLD)
S. frangé 40069 1.1, 2.1 2012­2006 Déménagements de magasin (SWE)

41154 6.1, 6.2, 6.4, 6.5 2015­2007 Malpils (LVA)

St. fuscum 41158 1.1, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2 2.1, 2.3, 2016­2008 Laponie (SWE)*
St. lindbergii St. 41167 3.1, 3.2, 3.3 3.1 2016­2007 Laponie (SWE)*
moyen/divin 40066 2012­2007 Déménagements de magasin (SWE)

41169 4.1, 4.2, 4.3, 5.1, 5.2 2016­2008 Sibérie, Yugra (RUS)
S. palustre 40068 2a, 12a 2012­2008 Lychen­Bohmshof (DEU)
41175 4.2, 4.3, 5.1, 5.2 2017­2006 Pilote de culture de sphaigne : Rastede (DEU)
Origine : De Weribben (NLD)
S. papillosum 41179 1.1, 2.2, 4.3 2016­2008 Sibérie, bourbier de Potanay Aapa (RUS)
41183 5.2, 6.1, 7.1 2017­2006 Pilote de culture de sphaigne : Rastede (DEU)
Origine : Ramsloh (DEU)
S. rubellum S. 40067 1.1, 2.1 2012­2006 Déménagements de magasin (SWE)

russowii S. 41191 1.1, 1.2, 3.1, 3.4, 3.5, 4.2 2.1, 5.2, 2016­2008 Sibérie, tourbière de Chistoye (RUS)
€

squarrosum 41193 5.3, 6.1 7.1 8.3 4.2, 2016­2007 Grundlenried­R € otseemoos (ÇA A DONNÉ)*

41196 4.3, 2017­2005 Lande de Buddenhagener (DEU)

41197 7.2, 2017­2009 Styrie (AUT)
S. subfulvum S. 41201 7.4, 8.1, 8.5 1.1 1.3, 1.4, 2.1, 3.3, 2016­2008 Laponie (SWE)*
subnitens S. 40070 5.2, 2012­2006 Déménagements de magasin (SWE)

warnstorfii 41208 5.4 2016­2008 Sibérie, tourbière flottante du Rangetur (RUS)

Les six clones qui poussent le mieux sont répertoriés selon le nombre de capsules de spores et le nombre de clones individuels. Les chiffres en gras indiquent les clones qui poussent le mieux. Le
€

l'origine de la capsule de spores est indiquée par la date et le lieu de collecte. Les capsules de spores marquées d'un astérisque ont été fournies par Michael Luth ; tous les autres ont été fournis par les
auteurs. AUT, Autriche ; DEU, Allemagne ; LVA, Lettonie ; NLD, Pays­Bas ; RUS, Fédération de Russie ; SWE, Suède.

5gl1 NaCl) et 12 peptone l1 de caséine, 5 g l1 de glucose (15 g je suis peptone, conditions standards. Nous n'avons pas observé de gamétanges dans ces cultures.
g l1 d'agar purifiée (Oxoid Ltd). Ces tures.

les plaques ont été scellées avec du Parafilm et stockées et inspectées dans la pièce
température. Si aucune contamination ne s'est produite dans un délai de 4 semaines,
nous avons considéré une culture comme axénique. Ainsi, chaque ligne générée dérive de
une seule spore. Le matériel clonal de chaque lignée a été établi en séparant les
filaments.
Culture in vitro
Les gamétophores ont été cultivés sur milieux solides et en suspension. Pour la
Microscopie optique
Les gamétophores ont été analysés au stéréomicroscope (SZX7;
Olympus Corp., Tokyo, Japon) et un appareil photo (AxioCam ICc 1 ;
Zeiss). Les photographies ont été mises à l'échelle avec AXIOVISION 4.8 (Zeiss).
Des piles d'images avec différents points focaux ont été combinées avec
COMBINEZ 5.3 (Alan Hadley, https://combinezp.software.inf
ormer.com/).

culture sur milieu solide, des gamétophores ont été

transféré sur milieu Knop ME ou Sphagnum. Le Pétri
les plats ont été scellés avec du Parafilm et cultivés dans des conditions
standard.
Pour les cultures en suspension, les gamétophores ont été perturbés avec
forceps dans des bancs à flux laminaire et transférés dans 35 ml de milieu Sphag­
num dans des flacons Erlenmeyer de 100 ml. Les flacons étaient fermés
avec des bouchons en éponge de silicone Silicosen® (Hirschmann Laborger€ate,
Eberstadt, Allemagne) et agité sur un agitateur rotatif à 120 tr/min
(B. Braun Biotech International, Melsungen, Allemagne) sous
Détermination de la croissance
La croissance des plantes a été déterminée sur milieu solide ainsi qu'en suspension
(Fig. 1). Premièrement, la croissance de 16 clones maximum de chaque espèce a été
déterminé sur plaques de gélose avec Knop ME et Sphagnum
moyen. Les clones ont été sélectionnés au hasard parmi toutes les spores disponibles
gélules. Les 5 mm supérieurs de la pointe de chaque gamétophore
(le capitule) a été coupé, transféré sur un milieu solide et cultivé dans des conditions
standard pendant 4 semaines (Fig. 1). La croissance était

2020 Les auteurs Nouveau phytologue (2020)

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documenté photographiquement chaque semaine. Les photos étaient
transféré en images binaires et la zone a été évaluée en comptant les pixels (Fig. 1a)
à l'aide d' IMAGEJ v.1.51f (Wayne Rasband,
https://imagej.nih.gov/ij/). Outre le domaine de croissance, le
la hauteur du gamétophore ainsi que la forme et la couleur étaient visuellement
évalué pour sélectionner les six plus gros clones de chaque espèce après 4 semaines
de croissance. Ceux­ci ont ensuite été évalués pour l'augmentation de la biomasse.
en suspension.
Trois gamétophores par clone ont été transférés dans 50 ml
Milieu sphaigne en flacons Erlenmeyer de 100 ml et cultivé
dans des conditions standards pendant 6 semaines. Par la suite, le total
€
la biomasse a été récoltée par filtration avec un entonnoir Buchner et une pompe à
vide. Le matériau de mousse a été transféré dans un endroit pré­séché
(0,5 h à 105°C) plateaux de pesée en aluminium (K€ohler Technische
Produkte, Neulußheim, Allemagne) et séché pendant 2 h à 105°C.
Par la suite, le DW a été déterminé avec une échelle de précision
(CPA 3245 ; Sartorius, Göttingen, Allemagne) (Fig. 1b). Le clone
avec l'augmentation de DW la plus élevée de chaque espèce a été sélectionnée comme
clone le mieux cultivé.
Cytométrie en flux
Les niveaux de ploïdie des six clones les mieux développés de chaque espèce étaient
déterminé par cytométrie en flux (FCM). Les gamétophores étaient
haché avec une lame de rasoir dans 0,5 ml de 40,6 ­diamidino­2­phénylin­ l1 DAPI,
solution de dol (DAPI) (Carl Roth) contenant 0,01 mg
(a) Détermination sur milieu solide
4 semaines
(b) Détermination en milieu liquide
6 semaines
Fig. 1 Représentation schématique de la détermination de la croissance de Sphagnum spp. : (a) sur milieu solide ; (b) dans des cultures en suspension. (a) Gamétophores du
de même taille ont été transférés dans une boîte de Pétri et cultivés pendant 4 semaines. La croissance a été documentée photographiquement et la taille a été analysée par mesure de
zone assistée par traitement d'image à l'aide d' IMAGEJ. (b) Les gamétophores ont été transférés dans des flacons Erlenmeyer et cultivés pendant 6 semaines. La croissance était
déterminé par la mesure du poids sec (DW) de la biomasse.
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1,07 g l1 chlorure de magnésium hexahydraté, 5 g l1 NaCl,
21,11 gl1 Tris et 1 ml l1 Triton X­100. Ensuite, 1,5 ml
de solution DAPI ont été ajoutés et le matériau a ensuite été filtré.
un tamis de 30 µm puis analysé avec un Partec CyFlow®
Cytomètre en flux spatial (Sysmex Partec, G€orlitz, Allemagne),
équipé d'une LED UV de 365 nm. Physcomitrella patens pro­tonema a servi d'étalon
interne (modifié d'après Schween et al.,
2003b).
analyses statistiques
Pour déterminer les valeurs de signification entre les croissances du
clones, les données ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle, suivie par
Test de différence la moins significative protégée de Fisher, où ***, **,
et * désignent la signification au niveau de 0,1 %, 1 % et 5 %, respectivement. Les
analyses statistiques ont été réalisées avec GraphPad
PRISM® et les diagrammes ont été créés avec EXCEL 2016.
Extraction d'ADN
Pour l'extraction de l'ADN génomique, des gamétophores en suspension
les cultures ont été filtrées sous vide pendant 1 min. Jusqu'à 100 mg de tissu
a été perturbé dans un lyseur tissulaire (MM 400 ; Retsch, Haan, Allemagne), suivi
d'une extraction de l'ADN avec le GeneJETTM
Kit de purification d'ADN génomique selon les recommandations du fabricant
protocole (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Le
#
Mesure de la taille
Biomasse
la mesure
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L'ADN a été dissous dans 50 µl de tampon d'élution et la concentration a été mesurée
à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (ND­1000 ; Thermo Fisher Scientific).
Amplification de SpBRK1 à partir de l'ADN génomique
Pour l'amplification d'une partie du gène nucléaire BRK1 (homologue de
Pp1s35_157V6.1 ; Pp3c8_2740V3.1 ; Lang et al., 2018), les amorces flanquant l'intron
suivantes ont été utilisées : SpBRK1_fwd, TCAATGTGCGCCGTCTCTTTG ; et
SpBRK1_rev, GTGC TGAATTGGGCTTCCAAG (modifié d'après Beike et al., 2014).
L'amplification a été réalisée par PCR basée sur l'ADN polymérase Phusion (Thermo
Fisher Scientific) ou l'ADN polymérase Q5® (New Eng­land Biolabs, Ipswich, MA,
USA) selon le protocole du fabricant dans un volume réactionnel de 50 µl contenant
50 à 250 ng de génome. ADN. Les longueurs de produits attendues étaient d'environ
530 pb et 1350 pb.
Clonage de produits PCR, séquençage et analyse de séquence
Après isolement de l'ADN avec le kit d'extraction sur gel GeneJETTM (Thermo Fisher
Scientific) selon le protocole du fabricant, les produits de PCR ont été clonés dans
le vecteur pJET1.2/blunt à l'aide du kit de clonage moléculaire CloneJET (Thermo
Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant. . Après transformation d'Escherichia
coli, l'ADN a été extrait à l'aide du kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher
Scientific) en suivant le protocole du fabricant. Le séquençage de Sanger a été réalisé
par GATC Biotech (Eurofins Genomics, Constance, Allemagne) en utilisant les
amorces pJET­FP et pJET­RP.
Les chromatogrammes de séquence ont été analysés avec le CHRO­ MASPRO
v.2.1.9 (//www.technelysium.com.au/ChromasPro.html ). Plusieurs alignements de
séquences ont été générés à l'aide de CLUSTAL OMEGA (Madeira et al., 2019) et
visualisés avec JALVIEW (Waterhouse et al., 2009).
Résultats et discussion
Induction de cultures axéniques in vitro
La stérilisation en surface des capsules de spores est une méthode établie pour
démarrer la culture axénique in vitro (Beike et al., 2015). Les spores de sphaigne sont
encore viables après 13 ans lorsqu'elles sont conservées au froid, et elles peuvent
former des banques de spores persistantes dans la nature (Sundberg et Rydin, 2000).
Nous avons observé la germination des spores chez Sphagnum angustifolium et
Sphagnum fimbriatum après 3 ans de stockage à 4°C.
Cependant, nous avons décontaminé la plupart des sporophytes dans les 2 mois
suivant leur collecte. La concentration du détergent et la durée d'exposition ont été
ajustées individuellement pour chaque sporophyte. Nous n'avons pas trouvé de
corrélation entre les espèces ou le niveau de maturation des sporophytes et le temps
d'exposition pour une décontamination et une germination réussies des spores. Le
sucre a accéléré la germination des spores de toutes les espèces sauf Sphagnum
compactum, mais toutes les espèces sauf Sphagnum warnstorfii ont également germé
sur Knop ME. Filaments développés à partir de spores stérilisées après 2 à 20
semaines, avec de fortes variations au sein de
2020 Les auteurs
Nouveau phytologue 2020 Nouveau phytologue Trust
Recherche 5
chaque espèce. Les gamétophores simples ont été séparés et ensuite cultivés sur
milieu solide en tant que clones indépendants.
Beike et coll. (2015) ont montré que les plantes de S. palustre cultivées in vitro et
les plantes prélevées dans des habitats naturels présentent des caractéristiques
phénotypiques similaires. Cependant, dans cette étude, les gamétophores cultivés in
vitro étaient plus petits et les pousses avaient plus de feuilles lancéolées que les
feuilles cucullées et ovales des pousses des champs plus épaisses et plus lourdes.
Nous avons observé de telles caractéristiques morphologiques divergentes pour les
19 espèces de sphaignes cultivées in vitro (Fig. 2).
Les différences dans la germination des spores, le développement des plantes et la
morphologie des plantes entre les cultures de mousses axéniques et les mousses
cultivées en plein champ peuvent être dues, outre des facteurs abiotiques évidents et
la vitesse de croissance, aux effets du microbiome présent uniquement dans ces dernières.
La signalisation entre royaumes et entre clades via de petites molécules peut
influencer la morphologie de la sphaigne similaire à celle de P. patens (Kostka et al.,
2016 ; Decker et al., 2017 ; Vesty et al., 2020).
Sélection des clones les plus dynamiques Pour les
analyses ultérieures, nous avons réduit le nombre de clones par présélection sur
milieu solide. La culture sur milieu solide permet un stockage à long terme, tandis que
les cultures en suspension produisent des quantités plus élevées de biomasse (Beike
et al., 2015).
Nous décrivons ici en détail la sélection du clone le plus croissant pour Sphagnum
fuscum, tandis que les descriptions des autres espèces figurent dans le supplément
(informations complémentaires, figures S1 à S17). Les capitules de huit clones de S.
fuscum ont été cultivés sur Knop ME solide ou sur milieu Sphagnum solide (Fig. 3).
Deux clones ont été sélectionnés dans la capsule 1, quatre clones dans la capsule 2
et deux clones dans la capsule 3, tous collectés au même endroit en Suède.
Le milieu sphaigne comprend du Knop ME, du saccharose et du NH4NO3. Des
études antérieures ont décrit une amélioration de la croissance de la sphaigne par le
saccharose ou d'autres saccharides (Simola, 1969 ; Gra­ham et al., 2010 ; Beike et
al., 2015), ou une source d'azote (Simola, 1975 ; Beike et al., 2015). . La fertilisation,
en particulier l'ajout de N et de phosphore, peut affecter la morphologie de la sphaigne
(Fritz et al., 2012).
Les gamétophores sur milieu Sphagnum étaient plus compacts avec une couleur
vert plus foncé que les gamétophores sur Knop ME, comme illustré pour S. fuscum
sur la figure 3 (a II, b II). Nous avons constaté cet effet pour toutes les espèces de
Sphagnum dans notre étude.
Les six clones couvrant la plus grande surface étaient, par ordre décroissant, 2,2,
1,1, 3,2, 1,2, 2,3 et 3,1 sur Knop ME (Fig. 3a IV) et 1,1, 2,2, 2,3, 2,1, 3,2 et 2,5 sur
milieu Sphagnum (Fig. .3b IV). Les clones 1.1, 2.2, 2.3 et 3.2 figuraient parmi les six
meilleurs clones sur les deux supports, et les clones 1.2, 2.1, 2.5 et 3.1 figuraient
parmi les six meilleurs clones sur l'une des plaques. En cas de résultats ambigus, il a
été veillé à ce qu'au moins un clone de chaque zone géographique reste parmi les six
meilleurs clones afin de maintenir la plus grande variation d'écotype possible. Ainsi,
les clones 1.1, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1 et 3.2 ont été identifiés comme les six meilleurs clones
sur milieu solide et ensuite analysés en suspension. Ici, le clone 1.1 a produit
beaucoup plus de biomasse que les cinq autres clones (Fig. 4).
Cette forte variation de la productivité de la biomasse peut être due au fait que le
clone 1.1 de S. fuscum provient d'une autre spore.
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6 Recherche Phytologue

S. angustifolium Saint­Baltique S. capillifolium Centrale S

Saint­compact S. cuspitatus S. trompeur S. frangé

Saint­brun S. lindbergii St. moyen/divin S. palustre

S. papillosum Sainte­rubéole S. russowii S. squarrosum

S. sous­nitens S. subfulvum S. warnstorfii

Fig. 2 Images au microscope optique de gamétophores caractéristiques de Sphagnum spp. après 4 semaines de culture axénique sur milieu Sphaigne solide. Barres de 1 mm.

capsule que les cinq autres clones, ou parce que S. fuscum est dioïque 34,4 6 mg de DW (clone 2.2) à 226,6 7,3 mg de DW (clone 2.2)
(Cronberg, 1993). Une autre espèce dioïque, 2.4). La même chose a été détectée pour les espèces monoïques
S. angustifolium (Cronberg, 1993), a donné une forte variation S. compactum (Cronberg, 1993), où le clone 5.1 a donné cinq
biomasse provenant de clones germés à partir d'une capsule de spores, de fois plus de biomasse que le clone 5.3. Cependant, nous n'avons trouvé aucun

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Phytologue Recherche 7

(a) Je (a)II (a)III (a) 4, secteur St. Brown (et en

1.1 678 800

1.2 606
600

Superficie
2.1 371

(pixels)
2.2 766 400

2,3 450
200
2,5 327

3.1 430 0
0 7 14 21 28
3.2 620
Temps de culture (d)

(b) Je (b)II (b)III (b) 4, secteur St. Brown (b)V

1200
1.1 1065
1.2 521 900
2.1 582
600

Superficie
(pixels)
2.2 843

2,3 585 300

2,5 544
0
3.1 490
0 7 14 21 28
3.2 577 Temps de culture (d)

Fig. 3 Détermination de la croissance de Sphagnum fuscum sur (a) un Knop solide avec des microéléments et (b) un milieu Sphagnum solide. (I) Les capitules de huit clones
indépendants ont été coupés à une taille de 5 mm et transférés dans des boîtes de Pétri. (II) Gamétophores après 4 semaines de culture. (III) La taille des gamétophores a été mesurée en
comptant les pixels sur des images binaires à l'aide d'IMAGEJ. (IV) La zone (nombre de pixels) de chaque gamétophore (V) est indiquée sur l'axe des y ; l'axe des x montre le temps de culture
en jours.

120 déroulement de notre étude. Nous ne pouvons pas regrouper ces clones
dans une de ces espèces sur la base de la morphologie car ils diffèrent
légèrement entre in vitro et sur le terrain, comme décrit précédemment dans
80 le cas de S. palustre (Beike et al., 2015). On peut cependant les distinguer
* * par leur site de collecte, car la répartition géographique diffère.
*
*
* * *
*
*
* * * *
En conséquence, nos clones ne sont très probablement pas S.
* *
)B

40 magellanicum, car Hassel et al. (2018) suggèrent sa présence en Argentine

0 S. divinum ou S. medium, car les deux sont circumpolaires dans
1.1 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2
Clone Saint­Brun
Fig. 4 Biomasse (mg DW) de six clones de Sphagnum fuscum. La croissance des clones
a été déterminée dans des cultures en suspension en mesurant le DW après culture de
trois capitules dans des flacons contenant 50 ml de milieu Sphagnum pendant 6
semaines. L'axe des y montre la biomasse en DW ; l'axe des x montre le clone. Les
données représentent les valeurs moyennes avec les écarts­types de trois
répétitions biologiques (ANOVA P <0,0001). Le clone 1.1 a produit significativement
plus de biomasse que les clones 2.1***, 2.2***, 2.3***, 3.1*** et 3.2***.
Les astérisques représentent les résultats du test t de Student effectué en comparaison
avec le clone 1.1 (***, P <0,001).
corrélation entre la variation de productivité des clones individuels d'une
espèce et leur morphologie reproductive.
et au Chili uniquement. En revanche, nous avons collecté ces sporophytes
en Suède et en Russie. Par conséquent, nos clones sont très probablement
l'hémisphère Nord (Hassel et al., 2018). Comme les deux espèces sont
présentes dans des peuplements mixtes (Hassel et al., 2018), nous ne
sommes pas non plus en mesure de les séparer par site de collecte pour
le moment. Par conséquent, nous répertorions ici ces clones sous le nom
de S. medium/divinum. Pour résoudre cette incertitude à l’avenir, une
analyse détaillée avec différents marqueurs moléculaires (von Stackelberg
et al., 2006 ; Di Palma et al., 2016 ; Hassel et al., 2018) est nécessaire.
Cependant, nous notons que ces clones sont plus hétérogènes en termes
de morphologie, de couleur et de taux de croissance que les clones des
autres espèces de notre étude. Ceci suggère l'existence de deux espèces
dans notre collection S. medium/divinum. Si cette hypothèse est confirmée
par des analyses de génétique moléculaire à l'avenir, notre collection de
Sphaignes axéniques comprendrait 20 espèces au lieu de 19.

Pour capturer la diversité génétique, jusqu'à six clones les plus

performants par espèce provenant de différents sporophytes ont été
Arrêt du cycle cellulaire, taille du génome et ploïdie
déposés au Centre international des stocks de mousse (//www.moss­stock­center.org).
Tous les clones déposés, leurs numéros d'accession et l'origine du La teneur en ADN des noyaux (ploïdie) peut affecter la productivité, du
sporophyte (date de collecte, lieu de collecte) sont répertoriés dans le moins chez les animaux et les plantes à graines (Dhawan & Lavania, 1996 ;
tableau 1. Paterson et al., 2012 ; Chen, 2013). Habituellement, les espèces de
Le statut taxonomique des clones dérivés de sporophytes initialement Sphagnum ont des gamétophytes haploïdes et n = 19 chromosomes, mais
collectés sous le nom de S. magellanicum doit être clarifié à l'avenir car un il existe des formes diploïdes avec 38 chromosomes. Les deux nombres

nouveau concept d'espèce de S. magellanicum, S. medium et S. divinum de chromosomes existent pour les populations de certaines espèces
est devenu disponible (Hassel et al., 2018) au cours de la (Cronberg, 1993), et même des tourbières triploïdes ont été décrites (Karlin & Smouse,

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8 Recherche
2019 ; Kyrkjeeide et al., 2019). Outre le comptage des chromosomes, la
taille du génome de Sphagnum a été estimée par microscopie à absorbance
de Feulgen (Temsch et al., 1998). Le FCM a été appliqué pour déterminer
la teneur en ADN des mousses (Reski et al., 1994), y compris la sphaigne
(Melosik et al., 2005). Le pic majeur de l'étalon interne P. patens représente
les noyaux haploïdes dans la phase G2 du cycle cellulaire (Schween et al.,
2003a). Il a été fixé au canal 200, alors que le pic au canal 100 représente
les noyaux de G1. Un pic à 400 indique des noyaux diploïdes dans G2
(Schween et al., 2003a).
Notre analyse FCM n'a révélé qu'un seul pic pour les cellules
gamétophytes des 19 espèces de Sphagnum, mais à deux positions
différentes : soit un pic s'est produit autour de 100, soit un pic s'est produit
près de 200 (Fig. 5). Lorsque nous avons analysé des tissus à croissance
rapide, on pourrait s'attendre à ce que les noyaux d'un échantillon se
trouvent dans différentes phases du cycle cellulaire et produiraient ainsi
deux pics différents (G1 et G2) ainsi que des signaux intermédiaires pour
les noyaux en phase S. Nos résultats actuels confirment les résultats
similaires de Melosik et al. (2005) et suggèrent que les cellules
gamétophytes des 19 espèces de Sphagnum sont arrêtées principalement
soit en G1, soit en G2. Un arrêt similaire du cycle cellulaire se produit chez
P. patens (Reski et al., 1994; Schween et al., 2003a).
Dans une telle situation, le FCM ne peut pas préciser si un pic correspond
à G1 ou à G2. Ainsi, un pic à 200 pourrait résulter soit de noyaux haploïdes
en G2, soit de noyaux diploïdes en G1. Ainsi, nous avons considéré les
tailles de génome publiées basées sur le séquençage : la teneur en ADN
nucléaire de base de P. patens est de 0,53 pg, avec une taille de génome
estimée à 518 Mbp (Schween et al., 2003a), alors que la dernière taille de
génome de P. patens est de 0,53 pg. L'assemblage du génome de .patens
a donné 467,1 Mbp (Lang et al., 2018). Sur la base de la photométrie
d'absorbance de Feulgen, les espèces haploïdes de Sphagnum ont une
teneur en ADN comprise entre 0,392 pg et 0,506 pg, et les espèces
diploïdes ont entre 0,814 et 0,952 pg d'ADN (Temsch et al., 1998), avec un
rapport moyen de 1 : 1,92 entre la teneur en ADN dans haploïdes et
diploïdes (Melosik et al., 2005). Actuellement, deux séquences du génome
de Sphagnum sont accessibles au public. Selon cela, le génome de S.
fallax comprend environ 395 Mbp et celui de S. magellanicum environ 439
Mbp (DOE­JGI, http://phytozome.jgi.d oe.gov/). En supposant que dans
notre analyse FCM, les pics à 100 et à 200 représentent des cellules en
G1, les tailles estimées du génome varient entre 370 et 460 Mbp pour le
pic à 100 et entre 840 et 890 Mbp pour le pic à 200. Bien qu'il ne s'agisse
que d'approximations parce que le DAPI se lie aux séquences d'ADN riches
en AT (Dolezel et al., 1992), les valeurs des espèces de Sphagnum
caractérisées par un pic autour de 100 coïncident bien avec les tailles des
deux séquences génomiques disponibles. Nous concluons donc que les
cellules gamétophytes de ces espèces sont haploïdes et majoritairement
arrêtées en G1.
Bien qu'il soit une hypothèse évidente que les espèces avec un pic
autour de 200 sont diploïdes et arrêtées en G1, et non haploïdes et arrêtées
en G2, nous avons testé cette hypothèse par comparaison avec la littérature
sur l'haploïdie et la diploïdie chez Sphagnum et compilé les données dans
Tableau 2. Notre hypothèse est conforme aux données des 13 espèces
haploïdes S. angustifolium, Sphagnum balticum, Sphagnum capillifolium,
S. compactum, Sphagnum cus­pidatum, S. fallax, S. fuscum, Sphagnum
lindbergii, S. medium/ divinum , Sphagnum rubellum, Sphagnum subnitens,
Sphaigne
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subfulvum et S. warnstorfii, ainsi que les trois espèces diploïdes Sphagnum
centrale, S. palustre et S. russowii. Nos clones de S. fimbriatum, issus de
sporophytes collectés en Suède et en Lettonie, sont haploïdes. Sphagnum
fimbriatum a été signalé comme haploïde aux États­Unis (Bryan, 1955), en
Finlande (Sorsa, 1955, 1956), au Canada (Maass & Harvey, 1973) et en
Autriche (Temsch et al., 1998), alors que des spécimens diploïdes ont été
signalés. pour le Royaume­Uni (Smith & Newton, 1968). Nos clones de
Sphagnum papillosum établis à partir de sporophytes collectés en Russie
et en Allemagne sont diploïdes, ce qui est en accord avec le matériel
provenant du Royaume­Uni (Smith & Newton, 1968) et d'Autriche (Temsch
et al., 1998), alors que des spécimens haploïdes ont été signalés au
Canada ( Maass et Harvey, 1973). Nos clones de S. squarrosum
d'Allemagne et d'Autriche sont haploïdes, comme le matériel d'Autriche
(Temsch et al., 1998) et du Canada (Maass & Harvey, 1973), alors que des
spécimens diploïdes ont été signalés en Finlande (Sorsa, 1955, 1956).
Pris ensemble, nous concluons que les cellules gamétophytes de 19
espèces de Sphagnum sont principalement arrêtées en G1, du moins dans
nos conditions. Cela contraste avec l'arrêt G2 des cellules protonémiques
de P. patens. Une caractéristique importante de P. patens est la très haute
efficacité de la recombinaison homologue (HR) dans ces cellules. Cette
fonctionnalité facilite un ciblage génétique précis (GT), et donc une
ingénierie du génome avec une efficacité exceptionnelle (Schaefer & Zryd,
1997 ; Strepp et al., 1998 ; Hohe et al., 2004). Bien que la raison pour
laquelle P. patens ait une efficacité HR si élevée ne soit pas encore
entièrement résolue, deux hypothèses ont été avancées dès le début : soit
l'haploïdie, soit l'arrestation G2 est une condition préalable (Schaefer &
Zryd, 1997 ; Reski, 1998). Ces hypothèses peuvent être testées avec la
collection décrite ici : si l'haploïdie est suffisante, les espèces de Sphagnum
haploïdes mais non diploïdes devraient se prêter à un GT efficace.
Si l'arrestation G2 est une condition préalable, aucune des espèces décrites
ici ne se prête au GT. À notre connaissance, aucune transformation
génétique d’une espèce de Sphagnum n’a été signalée jusqu’à présent.
Étant donné que les protoplastes dérivés de cellules protonémiques sont la
cible privilégiée pour la transformation génétique chez P. patens, le rapport
sur l'induction de protonèmes chez S. squarrosum (Zhao et al., 2019) ouvre
la voie à de telles expériences à l'avenir.
Croissance en suspension
La productivité des sphaignes dans leurs habitats naturels varie selon les
avec une production de biomasse allant jusqu'à 1 450 g m2 espèces ,
moyenne de 260 g et des an , en fonction de la phylogénie avec une
préférences en matière de microhabitat (Gunnarsson, 2005). Pour comparer
la productivité sans l'influence du niveau d'eau ou de l'apport en nutriments,
nous avons testé la culture en suspension dans des conditions
standardisées afin d'identifier le clone ayant la meilleure croissance de
chacune des 19 espèces (Fig. 6). Pour comparer le comportement de
croissance des espèces, les inocula doivent être normalisés. En raison de
la variation de la taille des capitules des espèces de Sphagnum (Fig. 2),
le matériel d'inoculation a dû être ajusté. Les cultures in vitro facilitent la
reproduction grâce à la croissance végétative, car les mousses de tourbe
se régénèrent à partir de plusieurs parties de la pousse, comme les
capitules, les fascicules, les branches et les tiges, mais pas à partir des
feuilles (Poschlod & Pfaden­hauer, 1989).
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Phytologue Recherche 9

S. angustifolium Saint­Baltique S. capillifolium Centrale S

Saint­compact S. cuspitatus S. trompeur S. frangé

Saint­brun S. lindbergii St. moyen/divin S. palustre

S. papillosum Sainte­rubéole S. russowii S. squarrosum

S. subfulvum S. sous­nitens S. warnstorfii P. ouvert

Fig. 5 Signaux de cytométrie en flux de 19 espèces de Sphagnum et Physcomitrella patens après culture axénique sur milieu Sphagnum solide pendant 4 mois.
Physcomitrella patens a été utilisée comme étalon interne, le pic principal étant fixé au canal 200. Les numéros de canal (axe des X) reflètent la fluorescence relative.
intensité des noyaux colorés.

Nous avons perturbé les gamétophores avec des pinces et rempli des flacons avec vers une production optimisée de biomasse de S. palustre, mais il a été
50 mg FW (environ 3,6 mg DW ; voir Beike et al., 2015) et 35 ml non prouvé pour les autres cultures axéniques in vitro établies de
Milieu sphaigne. La composition nutritionnelle a été établie S. fimbriatum, S. magellanicum, S. rubellum et S. subnitens

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dix Recherche Phytologue

Tableau 2 Le niveau de ploïdie de 19 espèces de Sphagnum mesuré par cytométrie en flux (FCM) par rapport à la littérature.

Niveau de ploïdie

Ce
étude Bryan Destin Destin Smith et Newton Maas et Harvey Temsch et coll.
Sphaigne sp. FCM (1955) (1955) (1956) (1968) (1973) (1998)

S. angustifolium S. n n
balticum S. nnn
capillifolium S. n n
centrale S. 2n 2n 2n
compactum S. n n n n n
cuspidatum S. n n n n n n n
fallax S. n n
fimbriatum S. n n n n 2nn n
fuscum S. n n n n n
lindbergii S. n n n
magellanicum S. n 2n nn
medium/ n
divin
S. palustre 2n 2n 2n 2n 2n
S. papillosum S. 2n 2n n 2n
rubellum S. n n n n
russowii S. 2n 2n
squarrosum S. n 2n 2n nn
subnitens S. n n n n
subfulvum S. n n
warnstorfii n n n n

Les données de la littérature sont basées sur le nombre de chromosomes (Bryan, 1955 ; Sorsa, 1955, 1956 ; Smith & Newton, 1968 ; Maass & Harvey, 1973) ou sur la taille du génome.
détermination par photométrie d'absorbance de Feulgen et un cytophotomètre à balayage (Temsch et al., 1998). n, haploïde ; 2n, diploïde.

(Beike et al., 2015). Dans nos conditions, la biomasse augmente
variait de quatre fois (S. rubellum) à 80 fois (S. cuspidatum)
en 6 semaines (Fig. 6).
Le milieu Sphagnum convenait à la culture axénique in vitro de nombreuses
espèces de Sphagnum, dont S. cuspidatum.
(générant le gain de biomasse le plus important), S. fallax, S. papillosum et
S. squarrosum (Fig. 6). Le médium semble sous­optimal pour, pour
exemple, S. subnitens, l'espèce avec les productivités les plus élevées
sur 31 espèces de tourbe provenant de zones humides dominées par la sphaigne
(Gunnarsson, 2005). Cependant, dans notre étude, S. subnitens avait

350

300

250

200
)B

150

100

50

Acutifolia Cuspidé Rigide Sphaigne Squarrosa

Fig. 6 Augmentation de la biomasse de 19 espèces de sphaignes triées par sections après culture de 50 mg FW (environ 3,6 mg DW) de gamétophores dans des flacons de 35 ml
Sphaigne moyenne pendant 6 semaines. L'axe des y montre la biomasse (mg DW) ; l'axe des x montre les espèces de sphaignes. Les données représentent des valeurs moyennes avec des SD de trois
répétitions biologiques (n = 3).

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seulement une faible performance. Gaudig et coll. (2020) ont rapporté que S.
papillosum, S. palustre, S. fimbriatum et S. fallax se développent bien dans des
conditions riches en nutriments avec un approvisionnement en eau optimal dans une
expérience en serre. Dans cette étude, S. fallax avait la productivité la plus élevée et
S. papillosum la plus faible productivité aux niveaux d'eau élevés. La bonne
productivité de S. fimbriatum dans l'expérience en serre contraste avec sa productivité
comparativement faible en suspension dans notre étude. Sur le terrain, l'augmentation
de la biomasse est généralement plus importante dans les mares, moins dans les
pelouses et moins dans les buttes (Clymo, 1970), avec des espèces poussant dans
des tapis et des pelouses ombrotrophes, comme S. balticum, S. cuspidatum, S.
magellanicum et S. rubellum, ayant des productivités plus élevées que les espèces
à buttes, comme S. fuscum (Gunnarsson, 2005). Cela correspond à plusieurs études
qui ont montré que le taux de croissance de la plupart des espèces de sphaignes est
le plus élevé dans les nappes phréatiques juste en dessous du capitule,
indépendamment de l'espèce (par exemple Gaudig et al., 2020). Fait intéressant,
nous avons enregistré des taux de croissance plus élevés pour S. papillosum que
pour S. palustre, bien que l'inverse soit décrit pour les habitats naturels (Gunnarsson,
2005 ; Krebs et al., 2016). Étonnamment, la culture axénique in vitro améliore la
productivité de S. fuscum mais nuit à la croissance de S. rubellum.
Nous n'avons pas pu établir de corrélation entre la productivité et le sous­genre
taxonomique, car les quatre espèces les plus productives de notre étude
appartiennent à trois sous­genres différents (Cuspidata, Sphagnum, Squarrosa). Les
espèces des sous­genres Acutifolia et Rigida avaient une productivité moyenne
inférieure. Dans les habitats naturels, les espèces du sous­genre Cuspidata sont
plus productives que les espèces des sous­genres Acutifolia et Sphagnum
(Gunnarsson, 2005). Afin de clarifier les différences de productivité au niveau
génétique entre les sous­genres, il conviendrait d'examiner à l'avenir un plus grand
nombre d'espèces d'un sous­genre. Notre incapacité à détecter une corrélation entre
le sous­genre et le gain de biomasse peut refléter la situation sur le terrain. Piatkowski
& Shaw (2019) n'ont pas détecté d'influence de la phylogénie sur la majorité des
traits dans leur étude portant sur 15 espèces de Sphagnum et ont suggéré que le
contexte environnemental peut obscurcir le signal phylogénétique. Notre nouvelle
méthode crée un environnement artificiel mais standardisé pour 19 espèces de
sphaignes.
Il facilite la recherche pour mieux comprendre l’écologie des tourbières, car des
paramètres uniques tels que les nutriments et les conditions d’éclairage peuvent être
€
modifiés et testés. Récemment, Kuttim et al. (2020) ont signalé des augmentations
de la biomasse des espèces de sphaignes pendant les hivers boréaux. Par
conséquent, les études futures devraient également prendre en compte les gradients climatiques.
deux positions. Sphagnum capillifolium, S. compactum, S. rubellum, S. subnitens et
compte.
Une autre propriété génétique qui influence la productivité est la ploïdie (Otto &
Whitton, 2000), telle que décrite pour de nombreuses cultures agricoles (Henry &
Nevo, 2014). Dans notre étude actuelle, cependant, nous n'avons pas pu détecter
de corrélation entre la ploïdie et la productivité, car les diploïdes S. palustre et S.
papillosum figuraient parmi les six espèces à la meilleure croissance, mais les
haploïdes S. cuspidatum et S. fallax étaient les plus productives. . Les autres espèces
diploïdes, S. centrale et S. russowii, ont donné une augmentation moyenne. Étant
donné que la composition du milieu peut avoir affecté nos résultats, des études
futures sur des populations haploïdes et diploïdes de la même espèce utilisant des
milieux optimisés individuellement pourraient fournir de meilleures informations sur
la corrélation entre ploïdie et rendement. Alternativement, la polyploïdisation peut
avoir d'autres avantages que l'augmentation de la biomasse pure des sphaignes,
ou même des mousses en général.
2020 Les auteurs
Nouveau phytologue 2020 Nouveau phytologue Trust
Recherche 11
Code­barres ADN des 19 clones les plus performants
Pour discriminer de manière fiable nos espèces de Sphagnum, nous avons séquencé
des parties du gène nucléaire BRK1, qui est un marqueur établi pour les analyses
phylogénétiques et a été identifié comme un orthologue à copie unique dans de
nombreux génomes de plantes terrestres. Par exemple, BRK1 a été utilisé pour
résoudre les relations au sein de la famille des mousses Funariaceae sur la base de
son haut degré de conservation, comprenant un seul intron (Beike et al., 2014). En
revanche, nous avons remarqué que les assemblages génomiques de S. fallax v.1.1
et S. magellanicum v.1.1 (DOE­JGI, http://phy tozome.jgi.doe.gov/) comprennent
chacun deux homologues BRK1 (Sph­ falx09G049800.1 et Sphfalx18G024600.1 ;
Sphmag18G0743 00.1 et Sphmag09G052500.1), indiquant une duplication de gène
ou une polyploïdisation dans la lignée évolutive menant aux Sphag­naceae. Bien
que Sphfalx09G049800.1 et Sphmag18G074300.1 n'hébergent tous deux qu'un
seul intron dans leurs séquences codantes, Sphfalx18G024600.1 contient un intron
supplémentaire dans la région 50 non traduite, et l'isoforme de transcription majeure
Sph­mag09G052500.1 présente un exon supplémentaire de séquence codante.
Cependant, la transcription alternative Sphmag09G052500.2, à son tour, n'est
annotée qu'avec un seul intron. Ainsi, nous avons conçu des amorces qui se lient à
la séquence codante conservée flanquant les introns des deux gènes BRK1 (Fig.
S18).
Nous avons amplifié les fragments génomiques BRK1 pour tous les clones les
plus dynamiques, ce qui a abouti à deux produits : une séquence plus courte avec
des longueurs individuelles comprises entre 511 et 539 pb, et une séquence plus
longue avec des longueurs individuelles comprises entre 1 317 et 1 360 pb, en
conséquence de différentes longueurs d'intron des deux locus BRK1.
Pour plus de commodité, nous avons nommé le premier fragment « BRK1 court » et
le second « BRK1 long » (Tableau 3). BRK1 short discrimine 15 de nos 19 espèces
de Sphagnum, mais les séquences étaient identiques pour S. balticum et S. fuscum
ainsi que pour S. capillifolium et S. rubellum. Les espèces diploïdes S. centrale et S.
palustre partageaient une courte séquence BRK1 identique d'une longueur de 536
pb, mais elles ont toutes deux donné une deuxième séquence de 537 pb, que nous
avons utilisée pour les distinguer. La présence de deux séquences courtes de BRK1
indique une origine hybride plutôt qu'une polyploïdisation de S. centrale et S. palustre.
Les longueurs de séquence de BRK1 long sont les mêmes pour S. balticum et S.
fuscum ; cependant, nous avons trouvé des polymorphismes discriminants dans
S. warnstorfii, appartenant tous au sous­genre Acutifolia, avaient un long fragment
BRK1 de 1351 pb, qui, à l'exception de S. compactum, étaient identiques en
séquence. Par conséquent, aucune de nos séquences BRK1 ne peut faire la
distinction entre S. capillifolium et S. rubellum. Cependant, comme S. capillifolium
est trois fois plus productif que S. rubellum dans des conditions standards en
suspension, il est possible de discriminer ces deux espèces sur la base de
caractéristiques phénotypiques. Toutes les séquences ont été soumises à GenBank
(Tableau 3).
Les alignements de séquences sont compilés dans l'ensemble de données S1 pour BRK1 court et
dans l'ensemble de données S2 pour BRK1 long.
Ensemble, nous avons établi un code­barres ADN rapide et précis pour identifier
de manière fiable chacun de nos cultivars de Sphagnum à n'importe quel stade de
leur cycle de vie, à seulement deux exceptions près, qui nécessitent actuellement un
soutien supplémentaire par des caractéristiques phénotypiques. De plus, notre BRK1
Nouveau phytologue
(2020) www.newphytologist.com
 12

(FCM),
flux
en
cytométrie
par
mesuré
ploïdie
niveau
(1993),
Cronberg
sur
basé
d'élevage
système
le
genres,
sous­
les
compris
y
Sphagnum,
espèces
19
axénique
culture
la
de
récapitulatifs
Résultats
3
Tableau
Recherche

complémentaires.
figures
dans
détaillées
informations
des
avec
clones,
autres
cinq
jusqu'à
à
rapport
par
croissance
meilleure
la
ayant
clone
du
l'identification
spores,
capsules
de
nombre
le
et
analysés
clones
les

identiques.
séquences
marquent
astérisques
où
BRK1,
introns
des
GenBank
identifiants
et
séquence
de
longueurs
les
que
ainsi
mation,

Nouveau phytologue
de
Germination (fragment
sphaigne
de
barres
Code­

spores clones
six
parmi
croissance
meilleure
la
ayant
Clone GenBank)
identifiants
et
longueurs

(2020) www.newphytologist.com
croissance
Meilleure

d'élevage
Système par
Ploïdie Non. spores
de
Nombre plus
Beaucoup plus
beaucoup
Pas
Machine Translated by Google

sp.
Sphaigne genre
Sous­ 1993)
(Crnberg, FCM cloner gélules cloner que
productif que
productif court
BRK1 longue
BRK1 Chiffre

Dioïque
Cuspidata
angustifolium
S. Haploïde 2.4 7.1
2.5,
2.3,
2.2,
2.1, 537 1317 S1

MT900778 MT900755

Baltique
Saint­ dioïque
Cuspidata 16
Haploïde 1.2 9.5
8.1,
3.3,
2.2,
1.1, 537* 1352 S2

MT900779 MT900756

Haploïde 11 1.8 1.9,

1.5,
1.3,
1.2, 537* 1351* S3

dioïque 1,49 MT900780 MT900757

S
Centrale Polyoecious/
Acutifolia
capillifolium
S.
dioïque
Sphaigne Diploïde 14 10.2 9.6
7.5,
6.4,
3.3,
1.2, 537
536*/ 1349/1356 S4

MT900781/ MT900758/

MT900782 MT900759

rigide
compactum
S. Monoïque Haploïde 12 5.1 6.2
6.1,
5.3,
3.1, 4.6 534 1351 S5

MT900783 MT900760

cuspitatus
S. dioïque
Cuspidata Haploïde 15 5.2 5.1
3.4,
3.3,
1.1, 1.4 538 1338 S6

MT900784 MT900761

trompeur
S. dioïque
Cuspidata 10
Haploïde 4.5 2.1 4.6
4.4,
4.1,
3.1, 537 1317 S7

MT900785 MT900762

frangé
S. Monoïque
Acutifolia Haploïde 1.1 6.4
6.1,
2.1, 6.5
6.2, 539 1321 S8

MT900786 MT900763

brun
Saint­ dioïque
Acutifolia Haploïde 1.1 3.2
3.1,
2.3,
2.2,
2.1, 537* 1352 S9

MT900787 MT900764

lindbergii
S. Monoïque/
Cuspidata Haploïde 2.1 3.3
2.3, 3.2
3.1, 536 1334 S10

dioïque MT900788 MT900765

moyen/
S. dioïque
Sphaigne Haploïde 3.1 5.2
5.1,
4.3,
4.2, 4.1 536 1356 S11

divin magellancium)
(S. MT900789 MT900766

palustre
S. dioïque
Sphaigne Diploïde 12a 2a 5.2
5.1,
4.3,
4.2, 537
536*/ 1352/1357 S12

MT900790/ MT900767/

MT900791 MT900768

papillosum
S. dioïque
Sphaigne Diploïde 12 6.1 7.1
5.2,
4.3,
2.2, 1.1 511/537 1354/1360 S13

MT900792/ MT900769/

MT900793 MT900770

rubéole
Sainte­ dioïque
Acutifolia Haploïde 1.1 2.1 537* 1351*

MT900794 MT900771

russowii
S. dioïque
Acutifolia Diploïde 12 4.2 3.5
3.4,
3.1,
1.2,
1.1, 536/536 1352/1355 S14

MT900795/ MT900772/

MT900796 MT900773

squarrosum
S. Monoïque
Squarrosa 16
Haploïde 5.2 8.3
6.1,
5.3,
2.1, 7.1 537 1356 S15

MT900797 MT900774
Nouveau

2020 Les auteurs

Phytologue

Nouveau phytologue 2020 Nouveau phytologue Trust

Machine Translated by Google
Nouveau

Phytologue Recherche 13

les données fournissent des indices sur une histoire évolutive complexe des Sphag­

Chiffre

S16

S17
naceae, y compris la polyploïdisation et l'hybridation.

Résultats récapitulatifs de la culture axénique de 19 Sphagnum

MT900775

MT900776

MT900777
espèces

longue

1351*

1351*
BRK1

1355
Les résultats des 19 espèces de Sphagnum, y compris les sous­genres et les
systèmes de reproduction, le niveau de ploïdie, l'identification des
le clone ayant la meilleure croissance, les longueurs de séquence des introns BRK1,
et leurs identifiants GenBank, sont compilés dans le tableau 3.
MT900798

MT900799

MT900800
identifiants
(fragment

GenBank)
longueurs
sphaigne
barres
Code­

BRK1
court

535

537

537
de

et

Conclusion

Outre P. patens en tant qu'organisme modèle établi, le développement d'autres

mousses modèles est inévitable pour l'environnement et
génomique évolutive, ainsi que pour clarifier des questions ouvertes,
comme la haute efficacité HR de P. patens. En raison du grand
beaucoup

nombre d'espèces de mousse de tourbe et leurs schémas clairs de différenciation

productif
plus
Pas

de niche, la sphaigne constitue un excellent complément (Shaw

3.3,
1.4,
que

8.1,
7.2,
4.3,
4.2,

5.4
8.5

et coll., 2016). Notre collection de mousse de tourbe crée une ressource pour le
intérêt croissant pour la recherche sur la sphaigne en vue d'établir une nouvelle usine
systèmes modèles. De plus, la mise en œuvre à grande échelle de
diverses applications peuvent s’appuyer sur la culture axénique in vitro de
La sphaigne comme matériau de fondation de haute qualité et à croissance rapide. Mise à l'échelle
Beaucoup

productif

cette méthode de culture facilitera une production à faible coût

plus

1.3,
que

2.1

processus. La culture de la sphaigne en bénéficiera en particulier, car le manque

des diaspores de sphaignes est l'un des plus gros problèmes et leur
l'achat est le facteur de coût le plus important pour l'établissement de Sphagnum
sites agricoles (Wichmann et al., 2017, 2020).
croissance

croissance
meilleure

Meilleure

cloner
clones
Clone
parmi
ayant

1.1
7.4

5.2
six
la

Remerciements
Ce travail a été soutenu par le ministère fédéral de l'Alimentation et
gélules
Nombre
spores

Agriculture (BMEL) (MOOSzucht, n° 22007216). Supplémentaire

de

le soutien est venu de la Fondation allemande pour la recherche (DFG)

Germination

spores

dans le cadre de la stratégie d'excellence de l'Allemagne (CIBSS – EXC­2189 –

cloner
Non.
de

ID du projet 390939984 ; livMatS – EXC­2193/1 – 390951807).

Nous remercions Anja Kuberski et Richard Haas pour
€
Haploïde

Haploïde

Haploïde

l'assistance technique d'experts, Michael Luth pour la fourniture de sporophytes,

Ploïdie
FCM
par

Greta Gaudig pour la discussion et Anne Katrin Prowse pour

16

14

relecture du manuscrit. Financement en libre accès activé

et organisé par Projekt DEAL.

Contributions d'auteur
monoïque
d'élevage

(Crnberg,
Système

MAH, VML, ELD et RR ont planifié et conçu la recherche.

1993)

MAH a réalisé des expériences et analysé les données. NvG analysé

données de séquence. M. Krebs, M. Kohl et AP ont collecté des sporophytes.
MAH, ELD et RR ont rédigé le manuscrit. HJ a révisé ce document.
polyoïque/
Monoïque
Acutifolia

Acutifolia

Acutifolia
dioïque
Sous­

Tous les auteurs ont discuté des données et approuvé la version finale du
genre

manuscrit.
continué)

ORCID
(A

subfulvum

warnstorfii
Sphaigne

Eva L. Decker https://orcid.org/0000­0002­9151­1361

Tableau

nitens
sous­
sp.

S.

S.

S.

Mélanie A. Heck https://orcid.org/0000­0002­0817­5679

3

2020 Les auteurs Nouveau phytologue (2020)

Nouveau phytologue 2020 Nouveau phytologue Trust www.newphytologist.com
Machine Translated by Google
14 Recherche
Hans Joosten https://orcid.org/0000­0001­8694­5811 Mira Kohl
https://orcid.org/0000­0002­5381­1961 Matthias Krebs https://
orcid.org/0000­0001­6336­ 327X Volker M. Luth € https://orcid.org/
0000­0002­2923­4236 Anja Prager https://orcid.org/
0000­0002­1750­0592 Ralf Reski https://orcid.org/0000­
0002­5496­6711 Nico van Gessel https://orcid.org/
0000­0002­0606­246X
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2020 Les auteurs
Nouveau phytologue 2020 Nouveau phytologue Trust
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Fig. S11 Détermination du clone de S. medium/divinum ayant la meilleure

Renseignements à l'appui croissance.
Des informations complémentaires supplémentaires peuvent être trouvées en
ligne dans la section Informations complémentaires à la fin de l'article. Fig. S12 Détermination du clone de S. palustre ayant la meilleure croissance.

Ensemble de données S1 Alignement de séquences multiples du court BRK1. Fig. S13 Détermination du clone de S. papillosum ayant la meilleure croissance.

Ensemble de données S2 Alignement de séquences multiples de BRK1 long.

Fig. S14 Détermination du clone de S. russowii ayant la meilleure croissance.

Fig. S1 Détermination du clone de S. angustifolium ayant la meilleure croissance.
Fig. S15 Détermination du clone de S. squarrosum ayant la meilleure croissance.

Fig. S2 Détermination du clone de S. balticum ayant la meilleure croissance.

Fig. S16 Détermination du clone de S. subfulvum ayant la meilleure croissance.
Fig. S3 Détermination du clone de S. capillifolium ayant la meilleure croissance.

Fig. S17 Détermination du clone de S. warnstorfii ayant la meilleure croissance.

Fig. S4 Détermination du clone de S. centrale ayant la meilleure croissance.

Fig. S5 Détermination du clone de S. compactum ayant la meilleure croissance. Fig. S18 Gènes cibles pour le criblage PCR tels que codés par les génomes de
S. fallax et S. magellanicum.

Fig. S6 Détermination du clone de S. cuspidatum ayant la meilleure croissance. Veuillez noter : Wiley­Blackwell n'est pas responsable du contenu ou de la
fonctionnalité des informations complémentaires fournies par les auteurs. Toute
question (autre que le matériel manquant) doit être adressée au bureau central
Fig. S7 Détermination du clone de S. fallax ayant la meilleure croissance. du nouveau phytologiste.

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