UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE CHIMIE ORGANIQUE
_______

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME D’ETUDES

APPROFONDIES (DEA) EN CHIMIE ORGANIQUE
Option PRODUITS NATURELS

Présenté par

Narindra Maharomahavaly Rakotondramanana

Pour l’obtention du
CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE DES
FEUILLESOption Poivrea coccinea
Diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) en Chimie Organique
DE « Produits Naturels » DC.
(COMBRETACEAE)

Soutenu le 22 novembre 2007 devant la Commission d’examen composée de :

Président du Jury : Madame Marta ANDRIANTSIFERANA

Professeur Titulaire

Rapporteur : Madame Dorothée RAZAFIMAHEFA-RAMILISON

Professeur

Examinateur : Monsieur Adolphe Emmuel RAKOTOMANGA

Maître de Conférences

Antananarivo
2007
 UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE CHIMIE ORGANIQUE
_______

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME D’ETUDES

APPROFONDIES (DEA) EN CHIMIE ORGANIQUE
Option PRODUITS NATURELS

Présenté par

Narindra Maharomahavaly Rakotondramanana

Pour l’obtention du
CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE DES
FEUILLESOption Poivrea coccinea
Diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) en Chimie Organique
DE « Produits Naturels » DC.
(COMBRETACEAE)

Soutenu le 22 novembre 2007 devant la Commission d’examen composée de :

Président du Jury : Madame Marta ANDRIANTSIFERANA

Professeur Titulaire

Rapporteur : Madame Dorothée RAZAFIMAHEFA-RAMILISON

Professeur

Examinateur : Monsieur Adolphe Emmuel RAKOTOMANGA

Maître de Conférences

Antananarivo
2007
 “Celui qui demeure en moi et en qui je demeure porte beaucoup de fruits,
Car sans moi vous ne pouvez rien faire”.

Jean 15,5

« Dieusoitbéni,à jamais»

Je dédie ce mémoire :

A mes parents,
Je remercie Dieu de les avoir protégés pour être les témoins de ma
réussite

A mes frères et leurs épouses

Pour leur soutien moral et matériel pendant toutes mes années
d’études

A Monsieur Raharisoa Ndimby et sa famille,

Pour leur soutien moral et leur encouragement

REMERCIEMEMTS
 Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles
(LaCASN), Département de Chimie Organique, Faculté des Sciences, Université
d’Antananarivo. Au terme de ce travail, nous tenons à remercier vivement tous ceux qui ont
contribué à la réalisation de ce mémoire notamment :

Madame Marta ANDRIANTSIFERANA

Professeur Titulaire à l’Université d’Antananarivo
Responsable de la Formation Doctorale, Spécialité « Produits Naturels » Antananarivo
Directeur du Laboratoire de Chimie des Produits Naturels et Biotechnologies « LPNB »
Membre de l’American Society of Pharmacognosy “ASP”
Co-coordinateur du GDRI (Groupement de Recherche International) CNRS et Organismes
de Recherche à Madagascar sur « Biodiversité et Développement durable »
Expert en Chimie auprès du Comité CORUS (Coopération pour la Recherche Université et
Scientifique)- Ministère des Affaires Etrangères France
Coordonnateur de l’Action concertée FSP (Fonds de Solidarité Prioritaire-Coopération
Universitaire Franco-Malgache) 2007-2010 sur « Valorisation de la Biodiversité et de
l’Environnement par les molécules d’origine naturelle »

Malgré vos multiples occupations, vous avez bien voulu nous faire le grand honneur de
présider ce Jury. Nous tenons à vous exprimer notre reconnaissance pour l’enseignement et la
formation que nous avons reçus dans le domaine des Produits Naturels dont vous êtes le
Responsable
Veuillez trouver dans ce travail l’expression de notre profonde gratitude et de notre très haute
considération

Madame Reine Dorothée RAZAFIMAHEFA-RAMILISON

Professeur à l’Université d’Antananarivo, Membre du Conseil de Faculté, Consultante au
sein du Projet ICBG / programme « Découverte de Médicaments & Conservation de la
Biodiversité à Madagascar » de 2003 à 2006, Membre de l’Association pour le
développement de la RMN à Madagascar,

En témoignage de notre gratitude pour l’enseignement et la formation que vous nous avez
donnés. Vous nous avez proposés avec confiance le sujet dont vous avez assuré la direction
avec autant de compétence que de bienveillance. Nous avons toujours trouvé auprès de vous
accueil chaleureux et compréhension. Grâce à vos conseils et vos critiques, vous nous avez
initiés à la recherche.
Nous sommes très heureux de pouvoir vous exprimer notre profonde reconnaissance et
notre respectueuse déférence.

Monsieur Adolphe Emmuel RAKOTOMANGA

Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, ancien
Ministre de l’Enseignement Supérieur,

Vous avez accepté avec bienveillance de laisser vos nombreuses obligations pour siéger
parmi les membres du jury et d’être l’examinateur de ce mémoire. Vos critiques et vos
remarques nous serons très précieuses.
Veuillez accepter nos sincères remerciements

Madame Bakonirina RAZANAMAHEFA

Professeur Titulaire à l’Université d’Antananarivo,
Chef du Département de Chimie Organique de la Faculté des Sciences,
Responsable du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN)

Pour l’accueil chaleureux, la compréhension et la confiance que vous nous avez accordés
dans votre laboratoire et pour tout ce que vous nous avez donné tout au long de la réalisation
de ce travail. Veuillez agréer nos remerciements les plus sincères.

Madame Bakolinirina ANDRIAMIHAJA

Professeur à la Faculté des Sciences d‘Antananarivo
Vos guides et vos encouragements sans relâche nous ont apporté une aide inestimable
tout au long de ce travail. L’aide matérielle et le temps que vous nous avez consacrés nous
ont grandement soutenus dans la réalisation de ce travail.
Veuillez trouver dans ce travail l’expression de notre sincère et respectueuse
reconnaissance.

 Nos sincères remerciements vont aussi :

• à tous les Enseignants qui ont participé à notre formation.
 • aux membres du Comité de lecture :
Madame Amélie RAHARISOLOLALAO, Professeur Titulaire à l’Université
d’Antananarivo,
Madame Voahangy Vestalys RAMANANDRAIBE, Maître de Conférences à la Faculté
des Sciences de l’Université d’Antananarivo,
Monsieur Richard RASAMOELSENDRA, Maître de Conférences à la Faculté des
Sciences de l’Université d’Antananarivo,
• au Docteur Angèle MAMBU, Chercheur au Laboratoire du Muséum National
d’Histoires Naturelles de Paris, Dr Voahangy Vestalys RAMANANDRAIBE,
Mademoiselle Olga RAKOTONANDRASANA pour l’enregistrement des
spectres RMN et de masse.
• à Monsieur David RAMANITRAHASIMBOLA et son équipe, Chercheur au
Laboratoire de Pharmacologie de l’IMRA, pour avoir effectué les tests
biologiques.
• à Monsieur Heritiana RANARIVELO, Botaniste de California Academy of
Sciences, pour l’identification du matériel végétal.
• à l’association villageoise de tradipraticiens FIMARA qui nous a confié la
plante,
• à l’équipe de ICTE / MICET représenté respectivement par leur Directeur
Général Dr. Patricia WRIGHT et Dr. Benjamin ANDRIAMIHAJA, pour les
généreux appuis financiers et matériels qu’ils nous ont accordé.
• à l’équipe du Centre VALBIO et du Projet ICBG basé à RANOMAFANA en
particulier le Coordinateur Régional, Monsieur Pascal RABESON, pour
l’accueil chaleureux au centre et l’assistance aux travaux d’enquêtes
ethnobotaniques et de récolte sur terrain.
• à la National Institute of Health (NIH) à travers le Projet ICBG dirigée par le
Professeur Iwao OJIMA de State University of New-York, dans le programme
« Découverte de Médicaments & Conservation de la Biodiversité à
Madagascar »
• à tous nos collègues de travail au LaCASN
• à tous ceux qui de près de loin ou ont contribué à la réalisation de ce travail.
 Liste des abréviations
AcOEt : Acétate d’éthyle
Act : Acétone
APT : Attached Proton Test
:
CAE Crude Acetone Extract
CAS : California Academy of Sciences
CC : Chromatographie sur Colonne
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CH2Cl2 : Dichlorométhane
CI : Concentration Inhibitrice
cm : Centimètre
COSY : Correlation Spectroscopy
d : Doublet
DC. : De Candolle
DO : Densité optique
E : Est
ESI : Electrospray Ionization
EtOH : Ethanol
FeCl3 : Chlorure ferrique
g : Gramme
H : Hauteur
H2O : Eau distillée
H2SO4 : Acide sulfurique
HCl : Acide chlorhydrique
HCN : Acide cyanhydrique
Hex : Hexane
HgCl2 : Chlorure de mercure II
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HPLC : High Performance Liquide Chromatographic
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation
Hz : Hertz
I2 : Iode
ICBG : International Cooperative Biodiversity Group
J : Constante de couplage
KI : Iodure de potassium
l : litre
λ : longueur d’onde
LaCASN : Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles
m : Multiplet
MeOH : Méthanol
Μg : Magnésium
mg : Milligramme
MICET : Madagascar Institut pour la Conservation des Ecosystèmes Tropicaux
ml : Millilitre
mM : Milliméga
mn : Minute
N : Normalité
Na2 SO4 : Sulfate de Sodium
NaCl : Chlorure de sodium
NH4OH : Ammoniaque
NaHCO3 : Bicarbonate de sodium
NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
nm : Nanomètre
PBS : Phosphate Buffieride Solution
ppm : Partie par million
q : Quadruplet
Rdt : Rendement
Rf : Référence frontale
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
RMN 1D : RMN à une dimension
RMN 2D : RMN à 2 dimensions
RPMI : Rosewell Park Memorial Institute
RPSH : Rosewell Park Serum Human
S : Sud
s : Seconde
SF (νo) : Spectrometer Fréquence (fréquence du spectromètre)
SM : Spectrométrie de Masse
SW(ν) : Spectral Width (largeur spectrale)
t : Temps
T° : Température
TMS : Tétraméthylsilane
TOF : Time Of Flight
tpm : Temps par minute
Tr/mn : Tour par minute
tr/s : Tour par seconde
UI : Unité Internationale
UV : UltraViolet
Vmax : Vitesse maximale
V/V : Volume à volume
%
: Pourcentage
µl
: Microlitre
°C : Degré Celsius
13
C : Carbone 13
1
H : proton
δ : Déplacement chimique
Φint : Diamètre intérieur
 Table des matières

INTRODUCTION GENERALE 1

CHAPITRE I : GENERALITES

I.1. GENERALITES BOTANIQUES 2

I.1.1. LE GENRE POIVREA OU COMBRETUM 2

I.1.2. TRAVAUX ANTERIEURS SUR LE GENRE Combretum 3
I.1.3. POSITION SYSTEMATIQUE DE Poivrea coccinea DC. 5
I.1.4. DESCRIPTION BOTANIQUE 6
I.1.5. UTILISATIONS TRADITIONNELLES 8
I.1.6. LOCALISATION 8
I.1.7. NOMS VERNACULAIRES 8

I.2. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE 8

I.2.1. LES ALCALOÏDES 9

I.2.2. LES FLAVONOÏDES ET LEUCOANTHOCYANES 11
I.2.2.1. Test de Wilstater 11
I.2.2.2. Test de Bate-Smith 12
I.2.3. LES TANINS ET POLYPHENOLS 13
I.2.4. LES QUINONES 14
I.2.5. LES TRITERPENES ET STEROLS 15
I.2.6. LES SAPONOSIDES 16
I.2.7. LES POLYSACCHARIDES 17
I.2.8. LES HETEROSIDES CYANOGENIQUES 17

I.3. LES COMPOSES STEROÏDIQUES 18

I.3.1. BIOSYNTHESE DES STREROÏDES 19

I.3.1.1.Cyclisation initiale 19
I.3.1.2.Formation des stéroïdes 20

I.4. EXTRACTION 24

I.5. PREFRACTIONNEMENT ET ISOLEMENT 24

I.6. CHROMATOGRAPHIE 24

I.6.1. Nature des phases 25

I.6.2. Chromatographie Sur Couche Mince (CCM) 25
 I.6.3. Chromatographie sur Colonne (CC) 26
I.6.4. Chromatographie préparative 27

I.7. SPECTROMETRIE DE MASSE 27

I.8. RMN 29

I.8.1. TYPES DE SPECTRES 29

I.8.1.1. Spectres monodimensionnels 30
I.8.1.2. Spectres bidimensionnels 31

I.9. TESTS BIOLOGIQUES 33

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES

II .1. MATERIEL VEGETAL 34

II.2. MATERIELS TECHNIQUES 34
II.3. METHODOLOGIE D’APPROCHE, DE RECOLTE ET DE TRAITEMENT 36
PREALABLE DE LA PLANTE
II.4. MATERIELS ET METHODES DE CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE 36
II.5. METHODOLODIE D’EXTRACTION 42
II.6. PREFRACTIONNEMENT 44
II.7. ISOLEMENT DES PRODUITS NF31 ET NF32 44
II.8. METHODOLOGIE D’IDENTIFICATION DE NF31 47
II.8.1. SPECTROMETRIE DE MASSE 47
II.8.2. SPECTROSCOPIE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE 48
II.9. METHODOLOGIE DES TESTS BIOLOGIQUES 48
II.9.1. TEST ANTIPLASMODIAL 48
II.9.2. TEST DE CYTOTOXICITE 49

CHAPITRE III: RESULTATS ET DISCUSSIONS

III.1. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE 51

III.1.1. BAREME D’APPRECIATION DES RESULTATS 51

III.1. 2. TABLEAU RECAPITULATIF DES RESULTATS DU CRIBLAGE 51
PHYTOCHIMIQUE

III.2. EXTRACTION 53

III.3. PREFRACTIONNEMENT 53
III.4. ANALYSE PRELIMINAIRE DE L’EXTRAIT CH2Cl2-2 54

III.5. ISOLEMENT 56

III.6. ANALYSE SPECTRALE DE NF 31 60

III.6.1. SPECTRES RMN 60

III.6.1.1. Identification des spectres 60
III.6.1.2. Interprétation des spectres 61
III.6.2. SPECTRE DE MASSE 72

III.7. RESULTATS DES TESTS BIOLOGIQUES 74

CONCLUSION GENERALE 76

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES 77

ANNEXE I : Préparation des réactifs

ANNEXES II : Spectres
S1a /1b- Spectres de RMN 1H
S2 - Spectre APT
S3a / S3b - Spectres HSQC
S4a /S4b / S4c / S4d - Spectres HMBC
S5a / S5b- Spectres COSY
S6a / S6b- Spectres NOESY
S7a- Spectre de masse
 Liste des figures, des schémas et des tableaux
Pages
LISTES DES FIGURES

Figure 1 : Poivrea coccinea DC. 7

Figure 2 : Classement des alcaloïdes selon la structure du noyau hétérocyclique 10
Figure 3 : Exemples de flavonoïdes 12
Figure 4 : Exemple de tanins hydrolysables 13
Figure 5 : Exemple de tanin condensé 14
Figure 6 : Structure des triterpènes tétracycliques et stéroïdes 16
Figure 7 : Exemple de saponoside 16
Figure 8 : Exemple de polysaccharides 17
Figure 9 : Exemples d’hétérosides cyanogéniques 18
Figure 10 : Structure du perhydrocyclopentanophénanthrène 18
Figure 11 : Structure des stéroïdes 19
Figure 12 : Principe d’une source electrospray 47
Figure 13: Chromatogramme des extraits 54
Figure 14 : Chromatogramme de l’extrait CH2Cl2-2 55
Figure 15 : Chromatogramme de la fraction F3 (14-17) 57
Figure 16 : Chromatogramme du produit NF31 58
Figure 17 : Chromatogramme du produit NF32 59
Figure 18 : Principales corrélations observées en COSY 71
Figure 19 : Principales corrélations observées en NOESY 72
Figure 20 : Formule développée de NF31 74

LISTE DES SCHEMAS

Schéma 1 : Mécanisme de la réaction de Wilstater 11

Schéma 2 : Mécanisme de la réaction de Bate – Smith 12
Schéma 3 : Interconversion des dérivés anthracéniques 15
Schéma 4 : Mécanisme d’hydrolyse d’un hétéroside cyanogénique 18
Schéma 5: Cyclisation initiale du squalène 19
Schéma 6 : Devenir du 2,3-époxydosqualène 21
Schéma 7 : Principe de l’élimination des méthyles en 4 22
Schéma 8 : Exemples de modifications de la chaîne latérale en 17 des phytostérols 22
Schéma 9 : Enchaînements stéroïdiques de base rencontrés chez les végétaux 23
Schéma 10 : Protocole d’extraction de Poivrea coccinea 43
Schéma 11 : Diagramme de préfractionnement 44
Schéma 12 : Protocole d’isolement des produits NF31 et NF32 46
Schéma 13 : Diagramme d’obtention des extraits 56

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Localisation des six espèces de Poivrea 3

Tableau 2 : Résultats des travaux antérieurs 4
Tableau 3 : Liste des appareils, matériels et produits chimiques utilisés 35
Tableau 4 : Matériels et méthodes de criblage phytochimique 36
Tableau 5 : Barème utilisé pour l’appréciation semi-quantitative des résultats 51
Tableau 6 : Résultats du criblage phytochimique 51
Tableau 7 : Caractéristiques de l’extrait acétonique 53
Tableau 8 : Résultats du préfractionnement 53
Tableau 9 : Interprétation du chromatogramme de CH2Cl2 -2 55
Tableau 10: Interprétation du chromatogramme de la fraction F3 (14-17) 57
Tableau 11 : Caractéristiques et comportement chromatographique de NF31 58
Tableau 12 : Caractéristiques et comportement chromatographique de NF32 59
Tableau 13 : Identification des spectres 60
Tableau 14 : Résultats de l’interprétation du spectre S2 (APT) 62
Tableau 15 : Identification des groupements en 13C 63
Tableau 16: Résultats de l’interprétation des spectres S1, S2, S3a et S3b 63
Tableau 17 : Principales corrélations observées en COSY 70
Tableau 18 : Principales corrélations observées en NOESY 71
Tableau 19 : Comparaison des δ (ppm) 13C du β – sitostérol et de NF31 73
INTRODUCTION GENERALE
 L’île de Madagascar est située entre le 12 ème et le 26ème degré de latitude Sud, dans
l’Océan Indien. Elle est connue pour sa richesse biologique et végétale et notamment pour sa
flore endémique1,2.
A Madagascar, comme dans beaucoup d’autres pays, la médecine traditionnelle à base
de plantes coexiste avec la médecine moderne. Et la paupérisation, encore très importante dans
le pays, rend la médecine par les plantes plus accessible à la majorité de la population. Il est
donc indispensable d’exploiter ces plantes médicinales afin de les étudier et de donner une base
scientifique pour leur utilisation qui reste aujourd’hui encore fondée sur des connaissances
empiriques3. La détermination des activités biologiques des végétaux, la vérification et la
justification de leurs utilisations empiriques par l’homme constituent jusqu’à ce jour un
domaine de recherche et de ressource naturelle important.
C’est ainsi que, dans le cadre de la valorisation des ressources naturelles malgaches,
nous nous sommes intéressés à une plante, Poivrea coccinea DC. (Combretaceae), utilisée
traditionnellement pour ses propriétés variées. Les buts de cette étude sont d’isoler et
d’identifier des molécules de cette plante et de les tester biologiquement par la suite. Nos
travaux de recherches ont été réalisés au Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles
(LaCASN) sous la responsabilité du Professeur Bakonirina RAZANAMAHEFA

Pour mieux suivre l’exposé de ce travail, nous avons adopté le plan IMRED :
- Le premier chapitre est consacré à l’étude botanique de Poivrea coccinea et aux
généralités sur les différentes techniques d’extraction, d’isolement et de détermination
structurale.
-Le second chapitre regroupe les matériels et les détails des différentes méthodes utilisées
au cours de cette étude.
- Le troisième chapitre rapporte les résultats de nos travaux personnels notamment :
• Le criblage phytochimique
• L’isolement et la détermination de structure du produit NF31
• Les tests biologiques
Des références bibliographiques et des annexes terminent l’ouvrage.
1
SCHATZ, E.G., Flore générique des Arbres de Madagascar, Royal Botanical Gardens, Kew & Missouri
Botanical Garden, 2001, 4-7, 118-123.
2
BOITEAU, P., ALLORGE, L., Plantes médicinales de Madagascar, Ed 2000.
3
PERNET, J., MEYER, G., Pharmacopée de Madagascar, 1957.

1
 CHAPITRE I

GENERALITES
 I.1. GENERALITES BOTANIQUES 4, 5, 6

La famille des Combretaceae appartient aux plantes dicotylédones qui comprennent

près de 600 espèces réparties en une vingtaine de genres.
Dans la flore malgache, la famille des Combretaceae est représentée par 5 genres et 53
espèces endémiques.
Les 5 genres représentés à Madagascar sont:
 Lumnitzera
 Poivrea ou Combretum
 Calopyxis
 Terminaliopsis
 Terminalia

I.1.1. LE GENRE POIVREA OU COMBRETUM 7

Nous rapportons ci-après la description du genre Poivrea telle qu’elle a été décrite
par H. Perrier de la Bâthie :
« Lianes ou, par absence de support ou pyromorphose, arbustes à rameaux
sarmenteux. Feuilles opposées, rarement presque alternes, sans stipules, caduques.
Inflorescences diversement composées d’épis ou grappes simples; bractées étroites et
caduques. Réceptacle présentant successivement de bas en haut, au-dessus de l’articulation
qui surmonte l’ovaire : un tube cylindrique court ou très court qui reste attaché à la base de
la partie calicinale du réceptacle, lorsque celui-ci se détache de l’ovaire ; un nectaire
globuleux, ovale ou plus ou moins étroit, tapissé à l’intérieur d’un disque glanduleux, lisse,
noir et glabre, paraissant plus ou moins avorté, à cavité remplie de poils brisés lorsqu’il a
été visité par un insecte ; puis le tube calicinal plus ou moins élargi, campanulé, obconique
ou étroit, divisé au sommet en 4-5 lobes valvaires. Etamines 8-10 disposées en 2 séries,
celles de la série supérieure oppositipétales, celles de la série inférieure alternes ; filets
longs ou courts, incurvés ; anthères introrses, déhiscentes par 2 fentes longitudinales.

4
BACKER, C.A., BAKHUIZEN, V.D.R., Floria of Java, 1963, 968.
5
TARDIEU-BLOT, M.L., Typographie, 1954, 15-16.
6
JONGKING, C.C.H., ADANSONIA, B., Bull. Mus. Natl. Hist., 1995, 17,192.
7
PERRIER DE LA BATHIE, H., Flore de Madagascar et des Comores -151ème famille, combrétacées, 1999,
15, 3.

2
Ovaire infère 1-loculaire ; style subulé, tronqué ou capité ; ovules 2-3, anatropes, pendants
du sommet de la loge, à long funicule, dont un seul se développe.
Fruit sec, très facilement coupé, variable, arrondie ou 4-5 angles ou ailes, indéhiscent ou
parfois, à la fin, au cours de la germination de la graine, se divisant au sommet en 2-6
valves irrégulières. Graine une seule, pendante, plus ou moins oléagineuse, sans albumen ;
cotyles charnues, repliés –contortupliqués. »

Le genre Poivrea est représenté par 6 espèces qui sont endémiques de Madagascar.
Les localisations géographiques de ces 6 espèces sont rassemblées dans le tableau 1.

Tableau 1 : Localisation des six espèces de Poivrea

Espèces Localisation
Poivrea albiflora Ouest : Antsiranana
Poivrea phaneropetala Centre Ouest : Androna
Sud-est : Toliary

Poivrea villosa Ouest : Ambongo-Boina et Menabe

Poivrea grandidieri Ouest et Sud-ouest: plateaux et vallées
d’Isalo
Poivrea obscura Est : environ de Toamasina
Ouest : Ambongo-Boina
Poivrea coccinea ou Combretum Sud, à l’Est d’Ivohibe, centre-ouest, et
coccineum Sud-est de Madagascar (Ranomafana
Ifanadiana)

I.1.2. TRAVAUX ANTERIEURS SUR LE GENRE Combretum

Le tableau 2 rapporte quelques résultats des travaux effectués sur certaines éspèces du
genre Combretum.

Tableau 2 : Résultats des travaux antérieurs

3
 Résultats obtenus Localisation Référence Remarques
Plante géographique
Analyse chimique Activités

Afrique

[8] Fraction
[9] active :
AcOEt
 4,7-dihydroxy-2,6-
diméthoxyphénanthrèn
Combretum e
apiculatum  4,7-dihydroxy-2, 3,6-
triméthoxyphénanthrè
ne  Anti-
 2,6-dihydroxy-3, 4,7- inflammato
triméthoxy-9,10- ire
dihydrophénanthrène
 2, 6-dihydroxy-3, 4, 7-  Anti-
triméthoxyphénanthrè bilharziose
ne
 Anti-
Combretum cancéreux
hereroense
Combretum
mossambicens
e

 Anti-
Combretum  Triterpènes inflammato Afrique [10] Feuilles
imberbe pentacycliques ire et anti-
rhamnosides fongique

Combretum  Oléanane  Traitement

psidioides  Ursane de Congo [11] Racines
l’hémorroïde
Extraits
12
Combretum  Triterpènes  Cytotoxiqu [ ] méthano-
quadrangulare glucosidiques e [13] liques de
tiges
8
MC GAW, L.J., RABE, T., SPARG, S.G., JAGER, A.K., OLOFF, J.N., STADEN, J., An investigation on
the biological activity of Combretum species, Journal of ethnopharmacology, 2001, 75(1), 45-50.
9
LETCHER, R.M., NHAMO, L.R.M., Journal of the Chemical Society 1971, 3070 – 3076.
10
ROGERS, C.B., Pentacyclic triterpenoid rhamnosides from Combretum imberbe leaves, Phytochemistry,
1988, 27(10), 3217-3220.
11
KILONDA, A., BILA, B., OSOMBA, L., SUZANNE, T., FRANS, C., Acetylation products of pentacyclic
triterpene glucosides from Combretum psidioides, Phytochemistry, 2002, 3-21.
12
ADNYANA, K., TEZUKA, Y., ARJU, H., XIONG, Q., KADOTA, S., New triterpene glucosides from the
seeds of Combretum quadrangulare , Journal of Natural Product, 2000, 63(4),496-500.

4
  1α-L-
Combretum arabinosidehydroxycy [14] Feuilles
edwardsii cloartène acide
mollique
 Oleanène de type Extraits
Combretum triterpène glycoside dichloromé
padoides  24-éthylcholesta-7,  Anti- [15] thaniques
22,25-trièn-O-β- bactérien des feuilles
glucopyranoside

 Anti-
Combretum  tanins bactérien et [16] Extraits
molle  oléanane antifongique acétoniques
des tiges
Combretum  3β,16α-dihydroxy-
coccineum 13(17)-acide Madagascar [17]
mansumbinen-28- Maurice
oïque

Combretum  Flavonoïdes  Anti-

érythrophyllum bactérien [18]

I.1.3. POSITION SYSTEMATIQUE DE Poivrea coccinea DC.19,20

Poivrea coccinea DC. est une plante endémique de Madagascar.

Les classifications classiques des familles des Combrétaceae indiquent les affiliations
suivantes :
Règne : végétal
Sous règne : Tracheobionta
Classe : Magnoliopsida

13
BANSKOTA, A.H., TEZUKA, Y., PHUNG, L.K., MIWA, Y., TAGA, T., KADOTA, S., Cytotoxic
cycloartane-type triterpenes from combretum quandrangulare, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,
1998, 8(24), 3519- 3524.
14
ROGERS, C.B., Isolation of the alpha-hydroxycycloartenoidmollic acidalpha-L-arabinosidefrom
Combretum edwardsii leaves Phytochemistry, 1989, 28 (1), 279-281.
15
ROGERS, C.B., New mono and bi-desmosidic triterpenoids isolated from Combretum padoides leaves,
Journal of Natural Product, 1989, 52(3), 528-533.
ASRES, K., BUCAR, F., Antibacterial and antifungal activities of extracts of combretum molle,
16

Pub Med, 2005, 43(1), 15-20.

17
RASHEDUZZAMAN, C., NORIN, I., A hydroxylated mansumbinen-28-oic acid from Combretum
coccineum Biochemical Systematics and Ecology, 2004, 32, 443–445.
18
MARTINI, N.D., KATERERE, D.R., ELOFF, J.N., Biological activity of five antibacterial flavonoids
from combretum érythrophyllum, Journal of ethnopharmacology, 2004, 93(2-3), 207-212.
19
HUMBERT, J.H., Flore de Madagascar et des Comores .Poivrea coccinea DC, 1936,3(15) ,1828.
20
http://www.nbii.gov/education/index.html/taxonomycombretum coccineum, 2006.

5
 Division : Magnoliophyta
Ordre : Myrtales
Famille : Combretaceae
Genre : Poivrea
Espèce : coccinea

I.1.4. DESCRIPTION BOTANIQUE 21

Port : Liane dans les forêts ou arbuste à rameaux sarmenteux dans les lieux découverts.
Parties jeunes glabres ou glabrescentes ou avec quelques rares poils.
Feuilles : très variables, hétéromorphes, feuilles des rejets parfois très grandes jusqu’à
24cm x 12cm, largement oblongues ou plus étroites ; feuilles des rameaux florifères plus
petites, minces, souvent cuspidées.
Inflorescences : terminales, variables, en grappes ou en épis, allongés, denses ou lâches,
souvent groupés en panicules, en corymbes ou en cymes ; bractées très petites, linéaires,
rigides, très précocement caduques.
Fleurs : 20-25mm de long, ovaire glabre ou glabrescent, anguleux. Pédicelle : plus ou
moins court ou allongé ; Tube stylifère présent mais souvent très court ; nectaire étroit et
long.
Pétales : beau rouge, persistant souvent sur le sec, étroitement oblongs (4 x 2,3mm),
glabres, atténués en onglet à la base et aigus au sommet.
La floraison a lieu de mai en septembre.
Filets et anthères : beau rouge persistant souvent en herbier.
Graines : contiennent une matière grasse.
Etamines : longuement exserts.
Fruit : contour orbiculaire, comprimé, les deux faces presque planes, les ailes de 8mm de
large, lorsqu’il y en a 4, étant rapprochées par paire de chaque coté de la graine étroite et
fusiforme ; ailes papyracées, flexibles, striées du centre à la périphérie.

21
PERRIER DE LA BATHIE H., Flore de Madagascar et des Comores -151 ème famille, combrétacées, 1999,
16- 17.

6
Figure 1 : Poivrea coccinea DC.

7
 I.1.5. UTILISATIONS TRADITIONNELLES22

Poivrea coccinea DC. est utilisé en pharmacopée traditionnelle contre les maladies
vénériennes.
Les écorces, les racines et les fruits sont utilisés comme vermifuges et remèdes de maladies
très diverses.
Les graines contiennent des matières grasses et sont comestibles (voanjo). Elles sont
entièrement utilisées comme vermifuge, on les fait croquer aux enfants à raison d’une à
deux graines par année d’âge et on administre ensuite une purge.
L’infusion des feuilles est utilisée comme médicaments fébrifuges, diurétiques,
cholagogues et contre la fièvre liée au paludisme.

I.1.6. LOCALISATION

Poivrea coccinea DC. est largement répandue dans la partie Sud (forêt à l’Est
d’Ivohibe) au Centre Ouest et au Sud – Est de Madagascar.

I.1.7. NOMS VERNACULAIRES 18,23

Poivrea coccinea DC. est connu sous plusieurs noms vernaculaires :

• Babonga : dialecte tankarana
• Borosonify, Zanakibongo : dialecte betsileo, bara, tanosy.
• Halaitra, Tamenaka : dialecte sakalava, betsileo, betsimisaraka, tanala.
• Menakibongo, salaitsy, salaitra: dialecte tsimihety, sakalava, tanosy.
• Tsilaitra, voanjoala : dialecte merina, betsileo, bezanozano, tankarana.

22
BOITEAU, P., « Collection nature » : Flore de Madagascar, Éditions Alzieu 1999, 427-428.
23
Journal d’agriculture tropicale et de botanique appliqué, Paris, 1916, 16(9-10), 409-416.

8
 I.2. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE 24, 25

C’est la première étape de l’étude chimique ; le criblage est une série de tests rapides,
simples et reproductibles qui permettent de détecter de façon qualitative les principales
familles de substances naturelles présentes dans un matériel végétal comme les alcaloïdes,
les flavonoïdes et leucoanthocyanes, les tanins et polyphénols, les triterpènes et stérols, les
saponosides, les hétérosides cyanogéniques et les polysaccharides. Il permet à la fois
d’orienter les recherches ultérieures et d’informer sur la nature des principes actifs de la
plante.

I.2.1. LES ALCALOÏDES 26

Les alcaloïdes ont dans leur structure un ou deux atomes d’azote hétérocyclique(s). Ils
présentent des caractères basiques plus ou moins marqués. Tous les alcaloïdes sont sous
forme de sels. Leur présence dans le matériel végétal est confirmée par des réactions de
précipitation. Ces réactions sont fondées sur la capacité qu’ont les alcaloïdes de se
combiner avec des métaux et des métalloïdes tels que le mercure, l’iode, le bismuth, le
tungstène… Dans la pratique, pour mettre en évidence la présence d’alcaloïdes dans le
matériel végétal, on utilise :
soit une solution iodo-ioduré ou « réactif de Wagner » qui donne un précipité rouge
orangé,
soit le tétraiodomercurate de potassium ou « réactif de Mayer » qui fournit un
précipité blanc jaunâtre,
soit le tétraiodobismuthate de potassium ou « réactif de Dragendorff » qui donne un
précipité orange.

La figure 2 donne un classement des alcaloïdes selon la structure du noyau hétérocyclique.

24
FONGH, H.S., MAUNG, T.W., FARN SWORTH, N.R., Phytochemical Screening plants, 1974, 32-35.
25
DEBRAY, M., JACQUEMIN, H., RAZAFINDRABAO, R., Travaux et documents de
l’ORSTM .Contribution à l’inventaire des plantes médicinales de Madagascar, Paris., 1971
26
BRUNETON, J., Pharmacognosie Phytochimie-Plantes médicinales, Technique et Documentation
Lavoisier –Paris-Londres-New-York, 2ème édition, 1993, 625.

9
10
Structure Noyau Exemple
hétérocyclique

CH3
Acyclique H2N C CH2 CH C
NH CH3
Galégine

N N
Conicérine
Pyridine

O OH

N N
H H
CH 3

Pipéridine Lobéline
Mono ou
polycycliques N

N H3CO
CHOH

CH CH2

Quinoléine Quinine

N
N
H H H

H
N
H H3CO2C
OH
Indole Yohimbine

Figure 2 : Classement des alcaloïdes selon la structure du noyau hétérocyclique

11
 I.2.2. LES FLAVONOÏDES ET LEUCOANTHOCYANES 26, 27, 28

Ces métabolites secondaires sont des composés phénoliques caractérisés par un

enchaînement C6 - C3 – C6. Dans les plantes, ils sont responsables de la coloration de
nombreuses fleurs et de certains fruits.
Les tests de Wilstater et de Bate-Smith29,30,31 permettent respectivement de mettre en
évidence les flavonoïdes et les leucoanthocyanes.

I.2.2.1. Test de Wilstater

En présence d’acide chlorhydrique et de tournures de magnésium, les flavonoïdes

donnent des produits de coloration variable extractibles par l’alcool isoamylique.
Le mécanisme de la réaction est décrit sur le schéma 1 :

OH OH
OH OH
HO O HO O
OH HCl/ Mg
OH
OH OH
OH O OH OH

M yricétol H
OH
OH
OH
OH HO O
- H2O OH
HO O
OH OH
OH OH O
OH H H

Delphinidol

Schéma 1 : Mécanisme de la réaction de Wilstater

I.2.2.2. Test de Bate-Smith

27
BROUILLARD, R., CHEMINAT, A., Flavonoids and Plant color, Plants flavonoids in biology and
Medicine II
28
HARBONE, J.B., SIMMONDS, N.W., The flavonoids, Academic Press, New York, 1988, 299-343.
29
RIBEREAU, G., Les composés phénoliques des végétaux, Dunod, 1968
30
.LEBRETON, P., JAY, M., VOIRIN, B., Chimie analytique sur l’analyse quantitative des flavonoïdes,
1967, 49, 375-383.
31
HARBONE, J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques plant analysis, I, Chapman and
Hall LTD, London, 2eme edition, 1973.

12
 L’utilisation de l’acide chlorhydrique concentré comme réactif dans le test donne la
coloration rouge des leucoanthocyanidols. Le mécanisme de la réaction correspondante est
présenté sur le schéma 2.

OH OH

OH OH

HO O HO O
HCl H
∆ OH
OH

OH OH OH O
H
Leucocyanidol H
OH
OH
OH
OH
HO O
HO O

O
OH
OH
OH

OH OH

OH OH

HO O HO O
-H
OH OH
H H
OH OH Cyanidol

Schéma 2 : Mécanisme de la réaction de Bate – Smith

Quelques exemples de flavonoïdes sont donnés sur la figure 3.

OH
B HO
O OH O

A A C CH B OH
A

O
O O
OH

2-phénylchromone Chalcone Aureusidine ﴾Aurone﴿

Figure 3: Exemples de flavonoïdes

13
 I.2.3. LES TANINS ET POLYPHENOLS32,26

Les tanins sont des composés phénoliques hydrosolubles présents dans les végétaux
supérieurs sous forme de polymères. D’après Swain et Bate Smith, les tanins sont des
substances naturelles qui ont des propriétés physiques et chimiques voisines de celles des
substances qui sont aptes à la préparation du cuir. Leur poids moléculaire est compris entre
500 et 3000. Ces substances présentent, à coté des réactions classiques des phénols, des
propriétés spéciales telles que l’aptitude à la précipitation des alcaloïdes, de la gélatine et
des autres protéines.
On peut classer les tanins en deux groupes :
Les tanins hydrolysables : ce sont des esters d’un sucre et d’un nombre variable de
molécules d’acides phénoliques comme l’acide gallique et l’acide ellagique.

OH

HO
O
O

O C HO O
HO HO O O OH
HO
OO
HO OH O
HO COOH O
HO O
C O OH
OH
HO O HO OH

HO OHHO OH
Acide gallique Acide ellagique
Pédunculagine

Figure 4 : Exemples de tanins hydrolysables

 Les tanins condensés ou tanins vrais sont des polymères flavaniques. Ils
sont constitués d’unités de flavan-3-ol liées entre elles par des liaisons
carbone-carbone.
Les tanins réagissent avec le chlorure ferrique : les tanins galliques et
ellagiques donnent des colorations et des précipités bleu noir et les tanins condensés, des
précipités brun verdâtre. Ils sont précipités de leurs solutions aqueuses par les sels de
métaux lourds et par la gélatine

32
SWAIN, T., BATE SMITH, E.C., Comparative Biochemistry, Masson éditeur, Academic Press, New York,
Masson éditeur, 1962, 3.

14
 OH

OH

HO O
OH

OH
OH
OH OH

OH O
OH
OH
OH
OH
OH OH
OH O
HO OH
OH
OH
OH
OH
HO OH

O OH
HO O
OH

OH
OH
OH
OH OH

OH O
OH

OH

OH

Prodelphinidol

Figure 5 : Exemple de tanin condensé

26, 33
I.2.4. LES QUINONES

Ce sont des composés oxygénés qui correspondent à l’oxydation de dérivés

aromatiques et qui sont caractérisés par un motif 1,4-dicétocyclohexa-2,5-diénique (para-
quinones) ou, éventuellement, par un motif 1,2-dicétocyclohexa-3,5-diénique (ortho-
quinones). Les quinones naturelles ont leur dione conjuguée aux doubles liaisons d’un
noyau benzénique ou à celles d’un système aromatique polycyclique condensé. Elles sont
issues de l’oxydation de phénols.
Diverses réactions colorées permettent de mettre en évidence les quinones. La
principale est la réaction de Bornträger, réaction que l’on obtient en dissolvant les quinones
en milieu alcalin aqueux : la solution prend une teinte vive variant, selon la structure et les
substituants de la quinone, de l’orangé–rouge au violet pourpre.

33
VAN DEN, A.J.J., LABADIE, R.P., Quinones, in “Methods in plant biochemistry”, 1990, 1, 451-491.

15
 Leurs squelettes de base peuvent être sous forme « oxydée » ou sous forme réduite.

O O

8 1
9 2
7
[O]

6 10 3
5 4
Anthrone
O

Anthraquinone
OH

Anthranol

Schéma 3: Interconversion des dérivés anthracéniques

I.2.5. LES TRITERPENES ET STEROIDES 26

Les terpènes sont issus de la condensation « tête-à-queue » d’un nombre variable

d’unités isopréniques.
Les triterpènes sont des composés en C30, acyclique ou polycyclique, résultant de la
combinaison de 6 unités isopréniques34.
En première approximation, il n’y a pas de différence fondamentale entre les
triterpènes et les stéroïdes, ces derniers pouvant être regardés comme des triterpènes
tétracycliques qui ont perdu, au minimum, trois méthyles. Initialement, c’est la présence
des méthyles en 4 et 14 qui a servi à distinguer les stéroïdes des triterpènes35.
Les réactifs de Liebermann Burchard et de Salkowski ont été mis à profit pour ces 2
classes de composés.

34
MAHATO, S.B., NANDY, A.K., ROY, G., Triterpenoids, Phytochemistry, 1992, 31, 2199-2249.
35
OURISSON, G., CRABBE, P., Les triterpènes tétracycliques, Ed, Hermann, Paris, 1961.

16
 Triterpène tétracyclique Stéroïde

21 22 24 27

20 23 25
12
11 13 17
26
19 18 16
1 14
2 9 15
10 8
7 30
3 4
5
6
29 28

Figure 6 : Structure des triterpènes tétracycliques et des stéroïdes

I.2.6. LES SAPONOSIDES 36,37

Les saponosides constituent un vaste groupe d’hétérosides très fréquents chez les
végétaux. Ils peuvent être classés en deux groupes selon la nature de leur génine : les
saponosides à génine stéroïdique et les saponosides à génine triterpénique. Ils sont
caractérisés par leurs propriétés tensioactives. En solution aqueuse, ils donnent une mousse
persistante. Le test d’hémolyse sert à confirmer la présence de ces composés.

OH
HO O OH
O
OH

OH OH

OH
Saponine de Starf ish
OH glycoside steroidique

Figure 7 : Exemple de saponoside

36
FRANCO, Z., FINAMORE, E., CATERINA, M., MINALE, L., Steroidal glycosides from the starfish
pistater giganteus, Journal of Natural Product, 1990, 53(4) 1000-1005.
37
FARNSWORTH, N.R., Phytochemical screening plants, Document of Department of Pharmacognosy,
University of Illinois, 1974, 35.

17
 I.2.7. LES POLYSACCHARIDES 26

Les polysaccharides sont des polymères de haut poids moléculaire résultant de la

condensation d’un grand nombre de molécules d’oses. Chaque ose est lié à son voisin par
l’intermédiaire d’une liaison osidique formée par élimination d’une molécule d’eau entre
l’hydroxyle hémiacétalique en C-1 d’un ose et l’un quelconque des hydroxyles de l’autre
molécule osidique.

CH3
-
O
O3 S
O
1

O
-
O3 S O
O
1
O SO3-
O 1
O
CH3 O CH3

(1-2)-α-L-fucose -4-Sulfate

Figure 8: Exemple de polysaccharide38

I.2.8. LES HETEROSIDES CYANOGENIQUES26, 39

Par hydrolyse, ils libèrent un ose et un intermédiaire cyanohydrine. Cette dernière,

instable, engendre de l’acide cyanhydrique et un composé carbonylé, aldéhyde ou cétone.
Les hétérosides cyanogéniques sont facilement détectés par un papier imprégné de
réactif (picrate de sodium) susceptibles de donner une réaction colorée avec l’acide
cyanhydrique; c’est le test de Grignard. Quelques structures d’hétérosides
cyanogéniques sont portées sur la figure 9.

38
BODARD, M., CHRISTIAEN, D., VERDUS, M.C., Bull. Soc, France, 1983, 36 (1-2), 1-14.
39
CHEYMOL, G., JAILLON, P., Hétérosides cardiotoniques, expansion scientifique, Paris, 1988, 358-387.

18
 H CN

R1 CN CN
O ß D -glucose

R2 O-ose
HO O ß D -glucose

tétraphylline A (S)-dhurrine

Figure 9 : Exemples d’hétérosides cyanogéniques

La réaction normale de ces hétérosides conduit à la libération de l’acide cyanhydrique.

R1 C N R1 C N R1
H2 0
+ Ose C O + HCN
R2 O-ose R2 O H R2

Schéma 4: Mécanisme d’hydrolyse d’un hétéroside cyanogénique

I.3. LES COMPOSES STEROIDIQUES 26, 40,41,42

Les stéroïdes forment une vaste famille chimique qui regroupe toutes les molécules
naturelles dont le squelette carboné polycyclique s'apparente au
perhydrocyclopentanophénanthrène avec une numérotation IUPAC spécifique.

12
13 17
11
16
1
10 9 8 14
2 15

3 5 7
4 6

Figure 10 : Structure du perhydrocyclopentanophénanthrène

40
MAHATO, S.B., NANDY, A.K., ROY, G., Triterpenoids, Phytochemistry, 1992, 31, 2199-2249.
41
CONNOLY, J.D., HILL, R.A., Triterpenoids, in” Methods in plant biochemistry”, 1991, 7, 331-360.
42
http:// www.universalis.fr/encyclopédie/Stéroides, 2005.

19
Les stéroïdes sont caractérisés par la présence de 27 atomes de carbone issus de la
cyclisation du 3S-2,3- époxy-2,3-squalène. Ce ne sont pas des terpènes mais ils présentent
des liens avec les triterpènes du point de vue de leur biosynthèse. Ils sont très répandus
dans la nature où on les rencontre à tous les échelons du règne végétal et du règne animal.
Ils comportent généralement des méthyles en C-10 et C-13 et souvent une chaîne alkylée
en C-17.

22 24
21 27
18 20 23 25
12
11 17 26
19 13
16
1
2 9 8 14
10 15

3 5 7
4 6

Figure 11 : Structure des stéroïdes

I.3.1. BIOSYNTHESE DES STEROIDES

I.3.1.1. Cyclisation initiale

Une séquence remarquable de couplage d’alcènes, au niveau intramoléculaire, est
observée dans la nature lors d’un tronçon de la voie biosynthétique conduisant au noyau
stéroïdique.
Dans ce processus, une molécule appelée squalène est oxydée grâce à une enzyme en
oxyde de squalène qui contient un cycle oxacyclopropane. L'ouverture enzymatique du
cycle de l'oxacyclopropane est catalysée par un acide.

[O]

2
3

H+ O

HO

Schéma 5 : Cyclisation initiale du squalène

20
 Les différences majeures entre stéroïdes et triterpènes sont d’ordre configurationnel et
liées à la conformation adoptée par l’époxysqualène avant la cyclisation :

 Si l’époxysqualène est maintenu dans une conformation chaise-bateau-chaise-

bateau, la cyclisation conduit à un cation protostane précurseur immédiat, par une
suite de migrations 1,2 protons, des cycloartanes et des cucurbitanes.

 Si la conformation de l’époxysqualène est chaise-chaise-chaise-bateau, la

cyclisation conduit à un cation dammarane qui peut se réarranger :
 soit par des migrations concertées conduisant au tirucallol et à l’euphol.
 Soit par formation d’un cycle supplémentaire ce qui conduit aux triterpènes
pentacycliques : oléanane, ursanes, lupanes, taraxastanes, etc.,
 soit former des composés tétracycliques dont le cycle D est hexacyclique.

Nous avons résumé sur le schéma 6 le devenir du squalène c'est-à-dire l’origine des
triterpènes et des stéroïdes.

I.3.1.2. Formation des stéroïdes

Le passage d’un squelette en C30 à un squelette en C27 ou moins, c'est-à-dire aux

stéroïdes, implique au minimum une déméthylation progressive en 4 et en 14 ; on note
également une rupture du cyclopropane et un déplacement de la double liaison engendrée
par cette rupture. Les deux méthyles en C-4 sont perdus par une suite d’oxydations (CH3
→ CH2OH → CHO → CO2H) terminée par une décarboxylation. Une oxydation préalable
de l’hydroxyle en 3 conduit à un α-cétoacide, ce qui facilite la décarboxylation finale. Le
méthyle en 14 est éliminé après oxydation sous forme d’acide formique.

21
 + O
H
2,3-époxydosqualène

R
H+ O H+ O R

H H

HO H
HO
R
R
Enz-X H
H H

R
R H
H
protostanes dammaranes

H
HO
H
HO

H
R R

H
H

X
HO
HO
Enz

euphol, tirucallol
triterpènes modifiés
R R
R

H H H

HO
HO HO

cucurbitanes stéroïdes triterpènes pentacycliques

cycloartanes

Schéma 6: Devenir du 2,3-époxydosqualène

22
 HO
4 O
HO
O
HO O H O
OH

HO O

Schéma 7 : Principe de l’élimination des méthyles en 4

Si, chez les animaux, la chaîne latérale reste intacte (choléstane) ou est tronquée
(cholanes en C24, prégnanes en C21…) voire même éliminée (androstanes en C19, œstranes
en C18) , chez les végétaux elle peut être fonctionnalisée et cyclisée (spirocétals,
alcamines,…), raccourcie (prégnanes) et fonctionnalisée (cardénolides,…) ou posséder un
ou deux carbones supplémentaires sous la forme d’un groupe méthyle (ou méthylène) ou
éthyle (ou ethylidène) fixé en C24.
L’introduction du ou des carbones supplémentaires de la chaîne latérale des stéroïdes
est le résultat de transméthylations impliquant la S-adénosylméthionine.

H3C S H H3C S

Schéma 8 : Exemples de modifications de la chaîne latérale en 17 des phytostérols

23
 Les principaux enchaînements stéroïdiques de base rencontrés chez les végétaux sont
donnés sur le schéma 9.

protostane cucurbitane phytostérols

cycloartane cholestane stigmastane, campestane

O O
N
O

prégnane
solanidane
O
O

N
X
O

spirostane (O)
spirosolane (N) cardanolide conanine

Schéma 9 : Enchaînements stéroïdiques de base rencontrés chez les végétaux

24
 I.4. EXTRACTION 43,44,45

L’extraction est une méthode utilisée pour extraire les produits contenus dans une
plante. Il existe plusieurs procédés d’extraction : la macération, la décoction, l’infusion et
la lixiviation.
La macération est un simple contact de la matière végétale avec le solvant pendant
un temps déterminé. En général, elle se fait à température ambiante sous agitation.
La décoction consiste à faire bouillir la matière végétale dans l’eau pour en extraire
les principes solubles.
L’infusion46 est un épuisement aqueux s’effectuant à température décroissante ; l’eau
est versée bouillante sur la substance et se charge en se refroidissant des principes
extractifs.
Par lixiviation, la poudre humectée est progressivement épuisée par des affusions
répétées de solvants frais, les surfaces de contact n’étant renouvelées que par le
déplacement du solvant sous l’influence de la gravité.

I.5. PREFRACTIONNEMENT ET ISOLEMENT

Le préfractionnement est une séparation grossière à partir des extraits bruts.

L’isolement est effectué pour isoler des produits à partir des extraits actifs. Tous deux
reposent sur les phénomènes d’adsorption. Le préfractionnement des extraits bruts et
l’isolement des produits nécessitent diverses techniques chromatographiques.

I.6. CHROMATOGRAPHIE 47, 48

La technique la plus utilisée pour la séparation et la purification en vue de

l’identification des composés organiques est la chromatographie. Elle est basée sur la
différence d’affinité des substances à analyser à l’égard de deux phases, l’une stationnaire
ou fixe, l’autre mobile.
On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées
ou celle des phénomènes mis en oeuvre dans la séparation.
43
TER SCHULTZ., KLOTZ, A., Extraktion, 1953, 3, 471- 525.
44
BUCHI., FEINSTEIN., The extraction, Pharmacognosy, 1936, 11, 121.
45
CHARONNAT, R., Extraction de solides par solvants, 2ème édition, 1962, 34.
46
http:/fr.wikipedia.org/wiki/infusion, 2007.
47
www.masterchimie1.u-psud.fr/chromatoweb/généralités/2007.
48
http://www.ac-nancy-noretz.fr/enseign/physique/CHIM/Chromato-gen.htm, 2007.

25
 I.6.1. NATURE DES PHASES

Phase fixe
La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitée,
permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes.
Ils peuvent être employés pour le remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité
et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une
plaque de verre ou d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie
sur couche mince ou CCM).
En chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et
thermiquement stable imprégnant un granulé poreux.

Phase mobile
La phase mobile est:
soit un gaz appelé gaz vecteur ou gaz porteur (ex: chromatographie en phase
gazeuse)
soit un liquide appelé éluant (ex: chromatographie sur couche mince ou colonne).

I.6.2.Chromatographie sur Couche Mince (CCM)49,50

Parmi les méthodes chromatographiques, la chromatographie sur couche mince

constitue une des premières approches pour l’étude de la composition des constituants
chimiques d’un extrait.
La chromatographie sur couche mince est basée principalement sur des phénomènes
d’adsorption. Elle est caractérisée par deux phases : la phase mobile et la phase
stationnaire.
La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse le long d’une
phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière
plastique ou d’aluminium. La phase stationnaire est un adsorbant et la séparation est basée
sur l’adsorption sélective des composants du mélange déposé à la surface du solide.

Principe
49
MAHUZIER, G., HAMON, M., Méthode de séparation, Collection des abrégés de Pharmacie, Chimie
analytique, 2ème édition, 1990, 177.
50
STAHL, E., JORK, H., Thin Layer Chromatography Spinger, Verlag, Academic Press Inc, Publishers, New
York, London 1969.

26
 Les échantillons sont solubilisés dans des solvants aussi peu polaires que possible et
très volatils, puis déposés sur la plaque de chromatographie.
La plaque préparée est introduite dans une cuve au fond de laquelle se trouve le
solvant de migration. L’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par
capillarité. La migration est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru la distance
souhaitée. Chaque tache est caractérisée par son Rf.

Rapport frontale ou référence frontale (Rf) 51

Le rapport frontal d’un composé est défini par le rapport suivant :

Distance parcourue par le composé

Rf = ------------------------------------------ avec (Rf <1)
Distance parcourue par le front de l’éluant

I.6.3. Chromatographie sur Colonne (CC)52, 53

Cette technique fait partie des techniques de chromatographie d’adsorption.

La chromatographie sur colonne est la méthode la plus efficace dans la séparation des
molécules. L’adsorbant ou phase stationnaire est un solide finement divisé : silice,
sephadex… et l’éluant est un liquide qui s’écoule de façon continu sur l’adsorbant. Le
remplissage de la colonne est important car de lui dépend la régularité de la
chromatographie. On distingue deux techniques de remplissage :
remplissage par voie humide : l’adsorbant est mis en suspension dans un volume
donné de la phase mobile. Le mélange homogène est versé dans la colonne.
remplissage par voie sèche : la phase stationnaire est versée directement dans la
colonne.
L'échantillon est déposé en haut de la colonne. Il y a deux types de dépôt :
dépôt liquide : l’échantillon est déposé en solution concentrée

51
MERCK, A.E., DARMSTADT., Révélateur pour la chromatographie en couches minces et sur papier.
Imprimerie de E. Merck, Darmstadt Allemagne RFA, 1980, 1-21.
52
MAHUZIER, G., HAMON, M., Méthode de séparation, Collection des abrégés de Pharmacie, Chimie
analytique, 2ème édition, 1990, 152.
53
BOURGEAIS, A., FLORENTIN, E., la chromatographie sur colonne.
«www.cultuesciences.chimie.ms.fr/dossiers-experimentale-analyse-article techcolonncdossier.html », 2002.

27
 dépôt solide : l’échantillon est dissous dans le minimum de solvant puis mélangé
avec une petite quantité d’adsorbant. Le solvant est ensuite éliminé.

Il faut prévoir une hauteur de 10 cm environ au-dessus de l'adsorbant pour placer le

solvant. La surface de l'adsorbant ne doit jamais être au contact de l'air.
On peut utiliser comme éluant un solvant unique (élution isocratique) ou un mélange
de solvants dont on accroît progressivement la polarité de façon à accélérer le déplacement
des composés. Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur
affinité pour l'adsorbant et leur solubilité.

I.6.4. Chromatographie préparative 54

La CCM préparative consiste à séparer de manière satisfaisante des quantités de

substance inférieures à 1g. On se sert de plaques recouvertes d’une couche de phase
stationnaire de 1mm. L’échantillon à séparer est déposé en un trait épais continu que l’on
recharge plusieurs fois.
Le développement de la chromatographie fractionne cet échantillon en bandes
parallèles. Ces bandes sont observées à la lumière UV puis révélées par pulvérisation d’un
réactif sur une partie de la plaque, l’autre partie étant soigneusement protégée ; les
localisations observées sont extrapolées à toute la plaque. Le recueil séparé de ces bandes
et leur élution par un solvant permet de recueillir quelques milligrammes de produit.

I.7. SPECTROMETRIE DE MASSE 55, 56

La spectrométrie de masse désigne une méthode d’analyse qui repose sur la

détermination structurale des composés organiques. Elle repose sur l’ionisation et la
fragmentation des molécules. Leur ionisation entraîne une accumulation d’énergie qui, en
se dissipant, peut provoquer la rupture des liaisons interatomiques et donner naissance à
des fragments caractérisés par le rapport m/z de leur masse à leur charge.

Le spectromètre de masse se compose de quatre parties :

54
MAHUZIER, G., HAMON, M., Méthode de séparation, Collection des abrégés de Pharmacie, Chimie
analytique, 2ème édition , 1990, 181.
55
BALDWIN, M.A., MC LAFFERTY., WOOG, F., Mass spectrum, 1973
56
http: // fr.wikipedia.org/ wiki/Spectrom%C3%A9trie_de_masse, 2007.

28
 • Le système d’introduction de l’échantillon : l’échantillon peut être introduit
directement dans la source, sous forme liquide (infusion directe) ou solide (canne
d’introduction directe, dépôt sur plaque MALDI, ...) ou encore par l'association à
une méthode séparative (chromatographie en phase liquide, chromatographie en
phase gazeuse,...).

• La source d'ionisation: elle consiste à vaporiser les molécules et à les ioniser.

Plusieurs types de sources existent et sont utilisées en fonction du résultat recherché
et des molécules analysées. On distingue :
o l'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la désorption-
ionisation chimique (DCI)
o le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou
ions (SIMS, LSIMS)
o le couplage plasma inductif (ICP)
o l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à
pression atmosphérique (APPI)
o l'électronébulisation ou électrospray (ESI)
o l'ionisation-désorption laser assistée par matrice (MALDI), activée par une
surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)
o l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART)

Les ions obtenus dépendent du mode d’ionisation. Dans la grande majorité des cas ces
méthodes d’ionisation donnent des pics quasimoléculaires MH+. en mode positif. On
constate également la présence des ions du type (M + ion métallique) tels que MNa+, MK+,
MCa+…

• L’analyseur : permet de séparer les ions en fonction de leur rapport masse/charge

(m/z). Il existe des analyseurs basse résolution : (exemple : le quadripôle (Q)) et des
analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes : le
temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier
(FTICR) …

29
 • Le détecteur et système de traitement : le détecteur transforme les ions en signal
électrique. Plus les ions sont nombreux, plus le courant est important. De plus, le
détecteur amplifie le signal obtenu pour qu'il puisse être traité informatiquement.

Suivant le type d'ionisation utilisé, un spectre de masse peut être caractéristique d'une
molécule. Ainsi en le comparant avec des banques de spectres, il est possible d'identifier la
molécule.

I.8. RMN 57,58,59,60,61,62

La structure des molécules isolées est déterminée principalement par la spectroscopie

de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Seuls les spectres utilisés dans ce travail ont
été pris en considération dans ce chapitre.
La RMN est basée sur l’absorption d’énergie par certains atomes dans des molécules
placées dans un champ magnétique. La méthode repose sur le magnétisme nucléaire.
Sous des conditions appropriées, dans un champ magnétique, un échantillon peut
absorber des radiations électromagnétiques dans la gamme des radiofréquences à des
fréquences dépendant des caractéristiques de l’échantillon. L’absorption est fonction de
certains noyaux présents dans la molécule. La différence dans la position d’absorption d’un
proton particulier par rapport à la position d’un proton de référence est appelée
déplacement chimique de ce proton particulier. En RMN du proton et du carbone 13, le
composé utilisé comme échantillon de référence interne est le tétraméthylsilane.
Le déplacement chimique reflète l’environnement électronique des noyaux. Des
protons dans des environnements chimiques « différents » ont des déplacements chimiques
différents.

57
MARTIN, L., MARTIN, J., Manuel de résonance magnétique nucléaire, Azoulay Editeur, Paris, 1971.
58
HAMON, M., PELLERIN, F., GUERNET, M., MAHUZIER, G., Abrégé de chimie analytique, Méthodes
spectrales et analyse organique, Tome 3, 2ème édition, 1989, 152-190.
59
FRIEBOLIN, H., Basic-One and Two-Dimensional NMR spectroscopy, 3è Edition, 1998.
60
NUZZILARD, J.M., Analyse structurale- RMN: helos.Univ-reims.fr/Labos/UPRESA, 2004, 6013.
61
GUNTHER, H., La spectroscopie de RMN. Principe de base, concepts et application des spectres de RMN
du 1 H et 13C en chimie, Masson Edition, Paris, 1994, 391.
62
MARTIN, M.T., La résonance magnétique nucléaire de 15N, en abondance Naturelle : développement et
applications aux petites molécules. Symposium Régional de L’océan Indien. La RMN au service de la
chimie. Antananarivo Madagascar, 1999.

30
Inversement, les protons qui sont dans le « même » environnement chimique auront le
même déplacement chimique

I.8.1. TYPES DE SPECTRES

On distingue plusieurs types de spectres selon les dimensions que l’on considère. Ainsi,
On a des spectres à 1 ou 2 dimensions.

I.8.1.1. Spectres monodimensionnels (1D)

 Spectre RMN 1H

Dans la pratique, tous les signaux des 1H apparaissent aux valeurs des δ (ppm)
comprises entre 0 et 15.
Les signaux peuvent se présenter sous forme de singulets ou sous forme de multiplets.
La surface du pic, mesurée par l’intégration, est proportionnelle aux nombres de protons
qu’elle représente.

 Spectre RMN 13C

Les déplacements chimiques couramment rencontrés dans les spectres 13C s’étendent
sur 240 ppm vers les champs faibles à partir du TMS.
Selon le mode d’enregistrement du spectre, les signaux d’un spectre 13C peuvent être
soit des multiplets soit des singulets. On distingue 2 types de spectres 13C :
- Spectre découplé large bande
- Spectre découplage hors résonance
Le découplage large bande est d’utilisation courante en spectroscopie de RMN du 13C.
En plus de la coalescence des multiplets, on peut enregistrer un gain d’intensité par l’effet
Overhauser nucléaire, mais on perd l’information sur le couplage. Par examen du spectre il
est possible de reconnaître le noyau qui ne porte pas de proton par la faible intensité de son
pic. S’il n’y a pas de chevauchement de signaux, le spectre permet de déterminer le
nombre de carbone dans la molécule.
Pour le spectre découplage hors résonance, à l’acquisition du spectre, on applique une
fréquence légèrement à droite du celle du TMS. Le découplage hors résonance donne un
spectre simplifié mais qui contient les informations de couplage résiduel 13C – 1H. On peut
facilement observer les multiplicités des bandes 13C, souvent sans recouvrement important
avec les autres signaux 13C.

31
  Spectre APT ou Attached Proton Test

C’est un spectre 13C totalement découplé du 1H, présentant des pics positifs pour les
CH3 et CH et des pics négatifs pour les CH2 et les C quaternaires.
I.8.1.2. Spectres bidimensionnels (2D)

L’expérience de RMN à deux dimensions appartient autant à la spectroscopie à

transformée de Fourier qu’à celle à impulsions et repose sur une succession de trois
intervalles de temps.
On distingue deux types de spectres 2D, les spectres homonucléaires et les spectres
hétéronucléaires. Les corrélations entre les noyaux concernés se traduisent par des taches
sur les spectres indiquant l’existence de couplage.

 Spectre homonucléaire

 COSY: Correlation Spectroscopy

Le COSY a pour objet de corréler les signaux de noyaux de même nature couplés
scalairement. Le spectre est en déplacement chimique sur les deux axes. Les pics
d’intersection indiquent les noyaux qui sont couplés entre eux et permettent une attribution
directe des protons voisins. Les taches sur la diagonale correspondent à celles du spectre
1
H 1D et celles en dehors de la diagonale sont les taches de corrélations.
Les spectres COSY indiquent les couplages entre protons géminés, protons vicinaux et
protons séparés par un nombre de liaisons plus important dans le cas de systèmes
conjugués.

H
H H
C
C C
H

Géminés vicinaux

 NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

32
Les taches de corrélation (pics hors diagonaux) traduisent, soit une interaction dipolaire,
donc une certaine proximité dans l’espace, soit un échange chimique. Les spectres NOESY
ressemblent fortement aux COSY, la proximité des protons est indiquée par les taches de
corrélation qui se situent de part et d’autre de la diagonale.
Les spectres NOESY sont utilisés pour établir la structure tridimensionnelle d’une
molécule, ils permettent de déterminer sa configuration et sa conformation.

 Spectres hétéronucléaires

 HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

En abscisse on obtient les δ (ppm) des 1H, en ordonnées ceux des 13C. Il s’agit d'un
spectre en mode inverse.
Le spectre donne la corrélation entre le (les) 1H et le carbone qui le (les) porte
(couplage 1J).

Il existe une variante de ce spectre, appelé HSQC : Heteronuclear Single Quantum

Correlation. Les deux spectres diffèrent par les séquences utilisées. Néanmoins, ils
s’exploitent de la même manière.

 HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Un spectre HMBC se fait en enregistrant des spectres protons sans irradier les
carbones. Ce spectre en mode inverse donne les corrélations entre les 1H et les carbones
séparés d’eux par 2 ou 3 liaisons (couplages 2J et 3J).

H C
C
C
C C

33
 Le nombre de liaisons qui sépare un proton présentant une corrélation avec un carbone
varie avec l’ensemble des paramètres favorisant la transmission du couplage : géométrie de
la molécule, électronégativité des substituants. Dans le cas de systèmes insaturés, des
corrélations entre 1H et 13C distants de 4 à 5 liaisons peuvent être mises en évidence.
Des corrélations de type 1J 1H-13C peuvent apparaître sur le spectre sous forme de
taches symétriques par rapport au δ du 1H.

I.9. TESTS BIOLOGIQUES 63,64

Les tests biologiques portent sur l’évaluation de l’activité antipaludique et de la

cytotoxicité des extraits de Poivrea coccinea.

• Test antiplasmodial :

Il s’agit d’un test in vitro fondé sur l’inhibition de l’incorporation de l’hypoxanthine tritiée
par les parasites Plasmodium Falciparum cultivés dans les hématies humaines. L’activité
des extraits est évaluée sur la base de la concentration inhibitrice 50 (CI50) c'est-à-dire la
concentration d’extrait de plante provoquant l’inhibition à 50% de croissance de la culture
parasitaire par rapport aux témoins non traités.

• Test de cytotoxicité :

Le test de cytotoxicité est effectué pour vérifier si la plante agit spécifiquement sur les
cellules parasitaires et ne présente pas d’activité cytotoxique.
Ce test a été réalisé sur des cellules cancéreuses P388 qui sont des cellules leucémiques de
souris. Ce sont des cellules en suspension.

63
LEBRAS, J.D., DELERON, H.J.F., Mesure in vitro de la chimiosensibilité des souches de Plasmodium
falciparum, 1982, 17-18.
64
LEBRAS, J.D., AL, C., 4-aminoquinolines be used against chloroquine resistant P. falciparum malaria,
Proceeding of the International Congress of Chemotherapy, Vienna, 1983, 76, 39.

34
35
 CHAPITRE II

MATERIELS ET METHODES
 II.1. MATERIEL VEGETAL

Les feuilles de Poivrea coccinea qui ont servi à notre étude ont été récoltées au mois de
mai 2006 dans la région de Bevoahazo, commune rurale de Ranomafana, district
d’Ifanadiana, dans la région de Vatovavy Fitovinany, de coordonnées géographiques :
S : 21°11’ 49,8 ’’
E : 47° 29’ 02,5’’
L’identification botanique de la plante a été effectuée par Monsieur Heritiana
Ranarivelo, botaniste à California Academy of Sciences basée à Antananarivo. Un herbier de
référence est déposé à la CAS – Tsimbazaza.

II.2. MATERIELS TECHNIQUES

La liste des appareils, des matériels de laboratoire et des produits chimiques est présentée
dans le tableau 3.

34
Tableau 3 : Liste des appareils, matériels et produits chimiques utilisés

35
Appareils et matériels de Utilisation Référence Observations
laboratoire
Brucker AMX
Spectromètre de RMN Analyses spectrales 400MHz
TOF/MS QSTAR
Spectromètre de masse Pulsar

Balance de précision Mesure de masses KERN EG 1500C 2 M Portée max : 300g

précises Précision: 10-3g

Mesure de masses - SALTER Portée max : 2kg

Balance analytique - Acculab® V-333 Précision: 10-1g

Broyeur Broyage du matériel PULVERIX Marseille

végétal Moteur UNELEC
asynchrone

Evaporateur rotatif Evaporation des HEIDOLPH vmax : 180 tr / mn

solutions Laborata 4010 t°(bain) : 20 à 180°C

Colonnes Préfractionnement, H : 35 cm et d : 2,5 cm

chromatographiques isolement et
purification

Cuves pour Chromatographies H : 22cm ; L : 22cm ;

chromatographie CCM, CP l : 9cm
ou bocaux

Plaques pour CCM Merck Silicagel 60 dimensions:20cmx20cm

chromatographie F254 sur feuille épaisseur : 0,2mm et
d’aluminium 1mm

Lampe UV Observation des UVGL- 25 minéral λ = 254 et 365 nm

chromatogrammes light® 50/60Hz, 230V
CCM, CP

Agitateur mécanique Agitation des solutions Kika Labortechnik Vmax : 10 tr /s

RW16 basic

Dessicateur Séchage des produits NALGENE∕ SYBRON Agent déshydratant

NO.5312 CaCl2

Verreries: erlenmeyers, béchers, cristallisoirs, entonnoirs, éprouvettes graduées, fioles à vide, ampoules à
decanter, pipettes graduées, pipettes pasteurs, tubes à essais, tubes à hémolyses.

Produits chimiques : 36
- Solvants : éthanol, méthanol, dichlorométhane, acétate d’éthyle, hexane,
acétone.
- Réactifs : Vanilline sulfurique (révélateur universel)
 II.3. METHODOLOGIE D’APPROCHE, DE RECOLTE ET DE
TRAITEMENT PREALABLE DE LA PLANTE

Le choix de la plante à étudier résulte d’une enquête ethnobotanique auprès des

tradipraticiens de l’association des guérisseurs traditionnels FIMARA de Ranomafana.
Les parties de la plante récoltées sont numérotées et mises dans des sacs. A chaque
récolte, on prélève un échantillon afin de constituer un herbier.
Avant tout traitement chimique, les différentes parties de la plante ont subi un séchage
préalable. Ce dernier est effectué dans une salle bien aérée, à l’abri de l’humidité et des
rayons solaires. Après séchage, elles sont réduites en poudre par broyage mécanique.

II.4. MATERIELS ET METHODES DE CRIBLAGE

PHYTOCHIMIQUE

Tableau 4 : Matériels et méthodes de criblage phytochimique

.

37
 Criblage Produits et Méthodes Tests Remarques
phytochimique réactifs

- Préparation de la solution hydroalcoolique

- HCl 12% 50g de poudre de plante et quelques grains de pierre ponce sont
- Ethanol 80% introduits dans un ballon contenant 200ml d’EtOH à 80% puis
- HCl 2N chauffés à reflux pendant 1h. Le mélange est refroidi sous
- NaCl courant d’eau puis filtré sur büchner. Le ballon est lavé 3 fois
- NH4OH avec 20 ml d’EtOH. Le filtrat et les solutions de lavage sont
- CH2Cl2 réunis. 240ml de solution hydroalcoolique sont ainsi obtenus.
- Réactif de L’équivalent à un gramme de plante est de 4,8 ml d’extrait.  Test de Précipité  présence probable
Dragendorff Wagner d’alcaloïdes
- Macération chlorhydrique
Alcaloïdes - Réactif de  Test de Mayer
5g de poudre de plante sont triturés dans 20ml d’une solution
Mayer  Test de
HCl 12٪ pendant 15 mn. Le mélange est filtré sur coton. Le
- Réactif de Dragendorff
Wagner filtrat obtenu est divisé en 4 parties égales réparties dans 4
tubes à essais. Les solutions sont soumises aux différents tests.

- Test préliminaire
120 ml de la solution hydroalcoolique équivalent à 25g de
plante sont placés dans un cristallisoir puis évaporés jusqu’à
l’obtention d’un résidu de consistance sirupeuse.On ajoute 5 ml
de solution HCl 2N puis on chauffe au bain pendant 5mn. La
solution acide obtenue est refroidie à la température ambiante
puis on y ajoute 0,5g de NaCl. Après agitation et filtration, le
 précipité est lavé avec un volume suffisant de HCl 2N.
- Test de confirmation
Il sera effectué surtout lorsque les 2 premiers tests sont positifs.
25g de poudre de plante sont humectés avec 55 ml de NH4OH
50% puis placés dans le corps d’un soxhlet.
Une extraction avec 200 ml de dichlorométhane est effectuée.
La solution obtenue est évaporée sous vide. L’extrait est ensuite
épuisé avec une solution de HCl 10%. Les alcaloïdes passent
sous forme de chlorhydrate dans la solution aqueuse. La
solution acide obtenue est alcalinisée avec NH4OH à 50%
jusqu’à pH =9. Les alcaloïdes repassent sous forme libre.
3 extractions au dichlorométhane sont de nouveau réalisées; les
phases organiques sont regroupées puis lavées à l’eau et
séchées sur Na2SO4. Après filtration et élimination du solvant,
l’extrait brut d’alcaloïdes totaux obtenu est repris avec HCl
10% puis soumis aux différents tests.

- Solution 9,6 ml de la solution hydroalcoolique équivalent à 2 g de plante

 Test de  Coloration rouge  présence de
hydroalcoolique sont évaporés à sec. Après refroidissement, les pigments de
Wilstater flavones
- Alcool l’extrait sont éliminés par épuisement avec 4 x 7,5 ml d’hexane.
Flavonoïdes et  Coloration rouge - pourpre 
isoamylique Le résidu est dissous dans l’éthanol à 80% puis la solution est
leucoanthocyanes présence de flavonols.
- Ethanol 80% filtrée. Le filtrat est réparti dans 5 tubes à essais puis soumis
 Coloration rouge - violacé 
- Eau distillée aux tests.
présence de flavanones et
- HCl concentré
flavanols

38
 - Hexane  Test de  Coloration rouge de la phase
- Tournure de Wilstater supérieure  présence de
Mg modifié flavones
- HCl concentré  Coloration pourpre  présence de
flavonols
 Test de Bate  Coloration rouge violacée 
Smith présence de leucoanthocyanes.
 Coloration rouge  présence de
 Addition de d’anthocyanes
HCl à froid

- Solution Une solution hydroalcoolique équivalente à 3 g de poudre de

 Test à la  précipité  présence de
gélatine polyphénols
hydroalcoolique plante est évaporée à sec. Le résidu est dissous dans 15 ml
- Eau distillée d’eau chaude. Après filtration, 4 gouttes de solution de NaCl
 Test à la  précipité  présence de tanins
- NaCl 10% 10% sont ajoutées. La solution obtenue est répartie dans 4 tubes
Tanins et
gélatine salée
polyphénols - Gélatine 1% à essais
- Gélatine salée
 Test avec  Coloration bleu-vert  présence
FeCl3 / MeOH de tanins condensés (catéchiques)
- FeCl3/MeOH
 Coloration noir bleuâtre 
présence de tanins hydrolysables
(galliques ou ellagiques)
 Incolore  absence de tanins

39
 - Solution 24 ml de solution hydroalcoolique équivalents à 5g de plante  Test de  Coloration bleu-vert  présence
hydroalcoolique sont évaporés à siccité. Après refroidissement, 5 ml d’hexane et Liebermann de stéroïdes
- Hexane une goutte d’acétone sont ajoutés pour dépigmenter l’extrait. Burchard  Coloration pourpre  présence de
- Na2SO4 Cette opération est répétée jusqu’à élimination des pigments. triterpènes
anhydre 10ml de dichlorométhane sont ensuite ajoutés. Le mélange est  Test de  Anneau de séparation rouge
- Acide picrique agité pendant 5 mn puis décanté. Après séchage sur Na2SO4 Salkowski présence de stérols insaturés.
- H2SO4 anhydre le mélange est filtré et le filtrat est réparti dans des  Test de  Coloration rouge  présence de
concentré tubes à essais Badjet-Kedde stéroïdes lactoniques
Stéroïdes et
terpénoïdes - FeCl3 10%  Test de Killer-  Anneau de séparation rouge
dans MeOH Killiani pourpre  présence de 2-
- Acide acétique desoxysucre
glacial  Test avec

- CH2Cl2 solution  Fluorescence bleue  présence de

- acide 3,5- chloroformique triterpènes
dinitrobenzoïque saturée  Fluorescence jaune  présence
d’antimoine de stéroïdes

 Coloration rouge violacée de la

- Solution 14.4 ml de la solution hydroalcoolique équivalents à 3g de  Test de
phase alcaline ﴾ phase inférieure﴿
hydroalcoolique plante sont évaporés à sec. 15ml d’eau distillée sont additionnés Bornträger
Quinones  présence de quinones
- Eau distillée pour dissoudre le résidu obtenu. Après filtration, le filtrat est
- éther extrait avec un mélange d’éther-CH2Cl2 3 ∕ 1 ﴾ v ∕ v﴿ dans une
diéthylique ampoule à décanter. La phase supérieure est transvasée dans un
- CH2Cl2 tube à essais puis additionnée de 5 ml de NH4OH. Le mélange

40
 est agité.
- NH4OH

-Poudre de
Un décocté est préparé avec 5g de poudre de plante. Le
 Précipité  présence de
polysaccharides
plante
mélange est filtré. Au filtrat sont ajoutés 3 volumes d’éthanol.
-Eau distillée
Polysaccharides
-Ethanol
et sucres 10 ml de Liqueur de Fehling sont ensuite ajoutés au filtrat. La  Test à la  Précipité rouge brique  présence
réducteurs solution est chauffée 10 mn aux environs de sa température liqueur de de sucres réducteurs
-Liqueur de d’ébullition puis refroidie. Fehling
Fehling

-Poudre de 1g de poudre de plante est introduit dans un tube à essais

Saponines  Hauteur supérieure ou égale à 3
plante contenant 10ml d’eau distillée. Après agitation vigoureuse
cm  présence de saponines.
-Eau distillée pendant 30s, le tube est placé verticalement pendant 30mn puis
on mesure la hauteur de mousse aux temps t ═ 0, et t ═ 30 mn.

3g de poudre de plante sont humectés avec de l’eau distillée

Hétérosides
-Poudre de  Test de  Coloration rouge du papier 
dans un erlenmeyer puis 1ml de dichorométhane est ajouté. Du
cyanogéniques plante Grignard présence de glycosides
papier Whatman préalablement trempé dans une solution de
-Eau distillée cyanogéniques
picrate de sodium est séché, puis suspendu au dessus de la
-picrate de
poudre de plante. L’erlenmeyer est ensuite bouché. Le résultat
sodium
est obtenu au bout de 3h.
- CH2Cl2

41
 II.5. METHODOLODIE D’EXTRACTION

La méthode utilisée pour l’extraction est celle qui a été convenue au sein du projet ICBG.
Après séchage à l’ombre, les feuilles de Poivrea coccinea sont réduites en poudre par
broyage mécanique.
100g de poudre de feuilles de Poivrea coccinea sont mis à macérer dans 1l d’acétone à la
température du laboratoire pendant 30 mn, sous agitation mécanique. La macération est
répétée deux fois. Après filtration, le résidu est abandonné une nuit dans 1l d’acétone. Les
solutions acétoniques sont regroupées puis le solvant est chassé par évaporation sous vide. 8g
d’extrait acétonique brut ont été ainsi obtenus.
Le protocole d’extraction est schématisé dans le diagramme ci-dessous :

42
 Poivrea coccinea
poudre de feuilles
100,0 ± 0,1 g

- Macération acétonique
v =1l
T° ambiante, t =30mn
- Filtration

Marc Filtrat 1

- Macération acétonique
v = 1l
T° ambiante, t = 30 mn
- Filtration

Marc Filtrat 2
Solution acétonique

- Macération acétonique
v = 1l - Évaporation sous
T° ambiante, t = 1 nuit vide
- Filtration T° = 30°C
V =180tr/mn

Marc Filtrat 3

Extrait acétonique brut

m = 8,0 ± 0,1g
Rdt = 8%

Schéma 10 : Protocole d’extraction de Poivrea coccinea

43
 II.6. PREFRACTIONNEMENT

Nous montons une colonne de silice par voie sèche, le poids de silice utilisé étant 5 fois
celui de l’extrait acétonique à chromatographier. L’échantillon est déposé sous forme solide.
L’élution est effectuée avec des solvants de polarité croissante (hexane, dichlorométhane,
acétate d’éthyle et acétone). Le volume utilisé pour chaque éluant est le double du volume
mort (2 x 75ml). Les différentes fractions obtenues sont ensuite évaporées à sec sous pression
réduite.
Le diagramme du préfractionnement est donné sur le schéma 11.

CAE Brut
8,0 ± 0,1g

-colonne:
(Φint: 2,5 cm ; H: 35 cm)
- Adsorbant : gel de silice 70 - 230mesh
- Eluants : Hex, CH2Cl2, AcOEt, Act

Extrait Extrait Extrait Extrait

Hex - 1 CH2Cl2 -1 AcOEt -1 Act -1

Extrait Extrait Extrait Extrait

Hex - 2 CH2Cl2 - 2 AcOEt -2 Act - 2

Schéma 11 : Diagramme de préfractionnement

II.7. ISOLEMENT DES PRODUITS NF31 ET NF32

696 mg d’extrait dichlorométhanique CH2Cl2-2 sont chromatographiés sur colonne de

silice. La mise en place de la phase stationnaire est faite par voie humide. Le poids de silice
utilisé est 30 fois celui de l’extrait à chromatographier. La silice mise en suspension dans un
mélange d’hexane et de dichlorométhane est versée dans la colonne contenant le même

44
solvant. La colonne est tassée par le mélange hexane-dichlorométhane. Elle doit être exempt
de bulles d’air et le plus homogène possible. L’échantillon est mis sous forme de pâte puis
déposé au sommet de la colonne. L’élution a débuté par CH2Cl2 pur suivi de gradient de
polarités avec AcOEt. Les fractions récoltées sont regroupées selon la similitude de leur profil
en CCM.

Cette séparation sur colonne de silice est suivie d’une chromatographie préparative.
Un dépôt d’échantillon sous forme de bande large est effectué sur une plaque
chromatographique de gel de silice. La plaque est ensuite déposée dans une cuve
chromatographique puis éluée avec le mélange CH2Cl2/ AcOEt (98 /2).
Après détection au rayonnement UV à 254nm et 365nm et révélation à la vanilline sulfurique
d’une partie de la plaque dans le sens de migration, la tache sous forme de bande
correspondant aux produits ciblés est soigneusement grattée puis reprise avec 10ml d’acétone.
Après filtration, le filtrat obtenu est évaporé à sec. Cette opération nous a permis d’isoler les
produit NF31 et NF32.
Le protocole est schématisé dans le diagramme ci-dessous :

45
 Extrait CH2Cl2 - 2
m =696 ± 1 mg

- Colonne de gel de silice 60 F254

- Eluant : CH2Cl2 / AcOEt de
polarité croissante

CH2Cl2
pur

F1 (1-6) F3 (14-17) F5 (20-27) F7 (33-45) F9 (50-57) F11 (60-66) F13 (70-78) F15 (93)

F2 (7-13) F4 (18-19) F6 (28-32) F8 (46-49) F10 (58-59) F12 (67-69) F14 (79-92)

- CCM préparative
- Eluant: CH2Cl2 / AcOEt (98/2)

NF31 NF33 NF35 NF37

NF32 NF34 NF36

Schéma 12 : Protocole d’isolement des produits NF31 et NF32

46
 II.8. METHODOLOGIE D’IDENTIFICATION DE NF31

La détermination structurale a été faite par la spectrométrie de masse et par la

spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). L’enregistrement des spectres a
été effectué au Muséum National d’Histoires Naturelles à Paris.

II.8.1. SPECTROMETRIE DE MASSE 65,66, 67,68

Le spectre de masse a été enregistré par electrospray en mode positif sur un spectromètre
de masse temps de vol QSTAR Pulsar I ( ESI – TOF – MS). La source d’ionisation est un
electrospray.
Dans cette technique, la "molécule cible" est diluée dans un solvant. La solution est
introduite sous pression dans un tube capillaire. A la sortie du tube capillaire, il se forme un
brouillard (spray). Les gouttelettes de ce brouillard sont chargées par un fort champ électrique
(4kV) puis dirigées vers le spectromètre de masse.

Figure 12 : Principe d'une source électrospray

Ensuite, le solvant de ces gouttelettes est évaporé par un courant d’azote et les molécules
de solvant, plus légères, sont pompées sous un vide élevé. Cette évaporation produit un
65
http:// www.u-psud.fr/orsay/formations/maîtrisechimie.nsf/massecoursch5.html, 2007.
66
http://www.astbury.leeds.ac.uk/introduction to mass spectrometry/Mstut/mstutorial.htm, 2007.
67
www.bio.espci.fr/fr/perso/vinh/CH3_esi.pdf, 1999.
68
www.bu.univ-nantes.frthesmed/pharm05,PHravily, 2005.

47
transfert des charges des molécules du solvant sur la molécule beaucoup plus lourde à étudier.
Il se forme alors des ions polychargés qui sont extraits, focalisés puis séparés suivant leur
rapport m/z.

Pour coupler un analyseur en temps de vol à une source d'ions, il faut pouvoir
échantillonner les ions au cours du temps, pour les introduire de façon discontinue dans
l'analyseur. L’analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, soumis à
une tension préalable, à parcourir une distance donnée. Tous les ions ont la même énergie
cinétique et ne diffèrent que par leur masse. Cette différence est à l’origine d’une différence
de vitesse telle que le temps de parcours dans l’analyseur est proportionnel à la masse de cette
particule : plus m/z est élevée, plus la vitesse est faible et donc plus le temps de parcours est
long.

II.8.2. SPECTROSCOPIE DE RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE

Les spectres de RMN 1H et 13C ont été enregistrés sur un spectromètre Brüker Avance
400. Tous les spectres RMN ont été enregistrés dans le chloroforme deutérié. Toutes les
valeurs des déplacements chimiques sont données par rapport au TMS pris comme référence
interne.
La résonance des protons et des 13C a été observée respectivement à 400,13 et 100,62
MHz. Les singulets, doublets, triplets, quadruplets et multiplets sont respectivement désignés
par les lettres, s, d, t, q, m.

II. 9. METHODOLOGIE DES TESTS BIOLOGIQUES 63, 64

II.9.1.TEST ANTIPLASMODIAL

Une souche de Plasmodium Falciparum appelé « soucheW2 : souche chloroquino

résistante » est utilisée pour faire ce test. Le milieu de culture RPSH est constitué de RPMI
1640 supplémenté de 25mM de NaHCO3 ; de 11mM de D- glucose, et de 10 % de sérum
humain décomplémenté par la chaleur. La culture est réalisée en présence de l’hématie
humaine saine à 37°C et à conditions microaérophiliques (c’est-à-dire en atmosphère
appauvrie en CO2).
La méthode semi- microtest de Desjardins légèrement modifiée est utilisée pour ce test.

48
 Le test commence sur le « stade trophozoïte jeune appelé aussi stade ring » de la
croissance parasitaire. Il est fait en triplicate pour chaque concentration testée. Le produit est
testé dans une proportion de 10% au maximum. Une plaque de 96 puits est préparée comme
suit :
 Une colonne de 6 puits ne contenant que de la suspension parasitaire (sans produits à
tester) sert de témoin.
 Une concentration de 10 µg.ml-1 a été d’abord testée. Si le pourcentage d’inhibition
provoqué par cette concentration s’avère intéressant (≥ 50%), la CI50 du produit est
ensuite déterminée en préparant une gamme de concentrations croissantes.
La suspension parasitaire est préparée avec un hématocrite final de 1% (taux des
hématies dans la suspension) et 1% de parasitémie.
Chaque puits occupe un volume de 200 µl. Après le remplissage des puits, la plaque a été
mise en incubation de 37°C pendant 18h. Ensuite, 0,5µCi de solution de l’hypoxanthine tritiée
[8-3H] est ajoutée par puits avant de remettre la plaque en incubation de 37°C pendant 24h. Ce
qui permet aux parasites de terminer son cycle de maturation. Le cycle est arrêté en
introduisant la plaque dans un congélateur à -30°C. Avant la collecte cellulaire, un passage à
l’étuve permet de décongeler la plaque, de provoquer la lyse des hématies et des parasites et
de libérer ainsi le complexe nucléoprotéine parasitaire.
La collecte est effectuée sur un appareil SKATRON AS type. Les contenus de chaque
puits ont été filtrés sur un papier Whatmann 934 AH. Le papier est séché et découpé en
rondelles. Une rondelle correspond à un puits. Les rondelles obtenues sont introduites dans
des tubes vials dans lesquels sont versés 2ml de xylène scintillant.
L’ensemble des tubes est placé dans un appareil LKB qui donne les valeurs CPM (coups par
minutes) de chaque tube, traduisant sa teneur en éléments radioactifs.

II.9.2.TEST DE CYTOTOXICITE

Le milieu de culture utilisé a la même composition que précédemment auquel sont

rajoutés 10% de sérum de veau fœtal, 100 UI de pénicilline, 100 UI streptomycine, 50ng/ml
de gentamycine et 10mM de mercaptométhanol. La suspension cellulaire est constituée de
cellule leucémique des souris et de milieu de culture. Une plaque de 96 puits est préparée
comme précédemment.
La plaque préparée est mise en incubation à 37°C pendant 72h puis le surnageant est
enlevé par centrifugation (10 à 1500tpm, 4°C). 200ml de solution de rouge neutre (10% dans

49
le milieu de cultures) sont versés par puits puis on laisse agir pendant 1h à 37°C. Le rouge
neutre est un colorant qui traverse uniquement la membrane des cellules vivantes. Après ce
délai, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS (1N). Un lavage consiste à une
centrifugation rejet de surnageant et à un rajout de PBS. Enfin, une dernière centrifugation a
permis d’enlever le surnageant. Puis 200 µl de laurylsulfates ont rajoutés dans chaque puits
pour lyser les cellules. Cette dernière étape est suivie d’une agitation pendant 10mn pour
avoir une solution homogène. Un spectrophotomètre (type Titertek) permet de lire la densité
optique (DO) de chaque puits qui est directement proportionnelle au nombre des cellules
vivantes.

50
 CHAPITRE III

RESULTATS ET DISCUSSIONS
 III.1. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

III.1.1. BAREME D’APPRECIATION DES RESULTATS

Tableau 5: Barème utilisé pour l’appréciation semi-quantitative des résultats.

Indice de mousse
Appréciation Précipitation Coloration
(hauteur après 30mn)
Aucun
- Négative 0 à 2cm
changement

+ Faible Faible 2 à 4cm

++ Abondante Franche 4 à 5 cm

Précipitation forte
+++ ou floculation Intense Supérieure à 5 cm
immédiate

III.1. 2. TABLEAU RECAPITULATIF DES RESULTATS DU CRIBLAGE

PHYTOCHIMIQUE

Tableau 6: Résultats du criblage phytochimique

Opérations Tests Observations Résultats

-
Mayer -
Macération -
chlorhydrique Wagner
-
Criblage des Dragendorff -
alcaloïdes Absence de -
Mayer précipité et de
trouble
Test préliminaire Wagner

Dragendorff

51
 Wilstater Coloration rouge ++
Criblage des
flavonoïdes et Wilstater modifié Coloration jaune orangé -
leucoanthocyanes
Bate Smith Coloration rouge violacée ++

Addition de HCl concentré Marron clair -

Gélatine 1 % Pas de précipité -

Criblage des
tanins et des
polyphénols Gélatine salée Pas de précipité -

FeCl3 Noir bleuâtre +++

Criblages des Bornstrager Phase alcaline : marron -

anthraquinones

Liebermann-Burchard Bleu-vert +++

Salkowski Anneau de séparation : -

Criblages des Vert clair
triterpènes et
stéroïdes Kedde Jaune -

Keller-killiani Rouge pourpre ++

Chlorure d’antimoine Jaune +++

Criblages des Hauteur de la mousse Hauteur de mousse après -

saponines après 30s : 0 30mn : 1mm

Décoction + EtOH Pas de précipité -

Criblages des
polysaccharides
et des sucres
Liqueur de Fehling Apparition de précipité +++
réducteurs
blanchâtre

Criblage des Sans changement de -

hétérosides Grignard coloration
cyanogéniques

52
Le tableau 6 nous montre que les feuilles de Poivrea coccinea renferment des flavonoïdes
et leucoanthocyanes, des tanins, des stéroïdes et des sucres réducteurs.

III.2. EXTRACTION

La macération à l’acétone de 100g de poudre de feuilles de Poivrea coccinea a permis

d’obtenir 8g d’extrait acétonique brut. Les caractéristiques de cet extrait sont données dans
le tableau 7.

Tableau 7: Caractéristiques de l’extrait acétonique

Extrait Aspect Couleur Masse Rendement (%)

Acétonique sirupeux Vert foncé 8,0 ± 0,1g 8

III.3. PREFRACTIONNEMENT

Après préfractionnement, les 8g d’extrait acétonique brut ont donné différents extraits
dont les caractéristiques ainsi que les masses respectives sont résumées dans le tableau 8.

Tableau 8 : Résultats du préfractionnement

Eluant Extrait Aspect de Couleur de Masse de Rendement

l’extrait l’extrait l’extrait (g) %

Hexane Hex -1 Sirupeux Orangé 1,303 ± 0,001 16,28

Hexane Hex -2 Sirupeux Jaune clair 1,038 ± 0,001 12,97

Dichlorométhane CH2Cl2 -1 Sirupeux Jaune foncé 1,594 ± 0,001 19,92

Dichlorométhane CH2Cl2-2 Sirupeux Noir verdâtre 0,696 ± 0,001 8,7

Acétate d’éthyle AcOEt -1 Sirupeux Vert foncé 0,711 ± 0,001 8,89

Acétate d’éthyle AcOEt -2 Sirupeux Vert clair 0,075 ± 0,001 0,93

Acétone Act -1 Sirupeux Vert noirâtre 0,471 ± 0,001 5,89

Acétone Act-2 Sirupeux Jaune 0,410 ± 0,001 5,12

verdâtre

53
Les chromatogrammes de ces différents extraits sont rapportés sur la figure 13.

Figure 13 : Chromatogramme des extraits

Adsorbant : gel de silice 60 F 254 sur support en aluminium
Eluant : CH2Cl2 pur
Observation : UV : λ 254nm et 365 nm
Révélation : vanilline sulfurique

III.4. ANALYSE PRELIMINAIRE DE L’EXTRAIT CH2Cl2-2

Le chromatogramme des extraits a montré que l’extrait CH 2Cl2-2 contenait un produit

majoritaire. Nous l’avons retenu pour la suite de notre travail. Le chromatogramme sur
couche mince de cet extrait et l’interprétation de ce dernier sont donnés respectivement sur
la figure 14 et le tableau 9.

54
 Trait plein: observation sous lumière UV à
254nm
Trait en pointillés: observation sous lumière UV à
365nm
P Après révélation

Figure 14 : Chromatogramme de l’extrait CH2Cl2-2

Adsorbant : gel de silice 60F 254 sur support aluminium

Eluant : CH2Cl2 / AcOEt (95/5)
Observation : UV 254 nm et 365 nm
Révélation : vanilline sulfurique

Tableau 9: Interprétation du chromatogramme de CH2Cl2 -2

55
 (-) tache non observée
III.5. ISOLEMENT

Les masses des différentes fractions obtenues par fractionnement de l’extrait CH 2Cl2-2
sont données sur le schéma 13. La fraction F3 (14-17) a été retenue car d’une part, elle était le
moins complexe et d’autre part, elle contenait un produit majoritaire.

CH2Cl2-2
m = 696 ± 1 mg

N°tache 1 2 3 4 5 6

Observation Jaune - - - - Vert

à l’œil nu

Observation - - - - Bleu Noir

à 254nm vert

Observation - Rouge - Rouge - -

à 365nm
Observation
après Rouge - mauve - - -
révélation

Rf 0,25 0,46 0,65 0,81 0,88 0,9

56
 - Colonne de gel de Silice 60 F254 (0,063-0,200mm)
- Système : CH2Cl2 / AcOEt de polarité croissante

F1 (1-6) F3 (14-17) F7 (33-45) F9 (50-57) F11 (60-66) F13 (70-78) F15 (93)
F5 (20-27)
16±1mg 21±1mg 14±1mg 8±1mg 31±1mg 13±1mg 172±1mg
23±1mg

F2 (7-13) F4 (18-19) F6 (28-32) F8 (46-49) F10 (58-59) F12 (67-69) F14 (79-92)

76±1mg 13±1mg 42±1mg 71±1mg 77±1mg 65±1mg

37±1mg

- CCM préparative
- Système : CH2Cl2/ AcOEt (98/ 2)

NF31 NF33 NF35 NF37

7,0 ± 0,1mg 1,0 ± 0,1mg
2,0 ± 0,1mg 1,0 ± 0,1mg

NF34 NF36
NF32
2,0 ± 0,1mg
2,0 ± 0,1mg 3,0 ± 0,1mg

Schéma 13: Diagramme d’obtention des extraits

Le chromatogramme de cette fraction est donné sur la figure 15, son interprétation
dans le tableau 10.

57
 Trait plein: observation sous lumière
UV à 254nm

Trait en pointillés : observation sous

lumière UV à 365nm

P Après révélation

Figure 15 : Chromatogramme de la fraction F3 (14-17)

Adsorbant : gel de silice60F 254 sur support aluminium
Eluant : CH2Cl2/ AcOEt (98/2) (v/v)
Observation : UV 254 nm et 365 nm
Révélation : vanilline sulfurique

Tableau 10 : Interprétation du chromatogramme de la fraction F3 (14-17)

N°tache 1 2 3 4 5 6

Observation à - - Jaune - Jaune -

l’œil nu

Observation à - - - - Noir -
254nm

Observation à - - Rouge Rouge Rouge

365nm

Observation à mauve Bleu - - noir -

Après vert
révélation

Rf 0,39 0,53 0,56 0,74 0,80 0,82

58
 La purification par chromatographie préparative de la fraction F3 (14-17) nous a permis
d’isoler deux produits NF31 et NF32 de masses respectives 7mg et 2mg. Ces deux produits
se présentent sous forme de monotache en CCM.

P : Après révélation

Figure 16 : Chromatogramme du produit NF31

Adsorbant : gel de silice 60F 254 sur support aluminium

Eluant : CH2Cl2 100%
Révélation : vanilline sulfurique

Tableau 11 : Caractéristiques et comportement chromatographique de NF31

Observation UV
Aspect Couleur Rf à l’œil nu 254nm 365nm révélation

59
 Poudre blanche 0 ,43 - - - mauve

Trait en pointillés: observation sous lumière UV à 365nm

Figure 17 : Chromatogramme du produit NF32

Adsorbant : gel de silice 60F 254 sur support aluminium

Eluant : CH2Cl2 100%
Observation : 365 nm
Révélation : vanilline sulfurique

Tableau 12: Caractéristiques et comportement chromatographique de NF32

Observation UV UV
Aspect Couleur Rf à l’œil nu 254nm 365nm révélation

Poudre incolore 0 ,59 - - Bleu vert -

60
 III.6. ANALYSE SPECTRALE DE NF31

III.6.1. SPECTRES RMN

III.6.1.1. Identification des spectres

Le tableau 13 résume les résultats obtenus dans l’identification des spectres.

Tableau 13 : Identification des spectres

Spectre Identifications Conclusion /remarques

∆δ = SW/ SF = 3306,878/400,130 - Spectres RMN 1H 1D

S1a / 1b
= 8,26 ppm S1a : Spectre classique
SW : 3306,878Hz 0<δ< 8,26 ppm S1b : Agrandissement de la
SF : 400,130 MHz - Présence de multiplets zone 0,6 – 1,2 ppm
- Présence de courbe d’intégration

∆δ = SW/ SF = 17857,143 / 75,469 - Spectre RMN 13C 1D

S2
= 237 ppm - Spectre APT :
SW : 17857,143Hz 0<δ< 237 ppm Les signaux des Cq et CH2
SF : 75,469MHz - Présence uniquement de singulets sont négatifs et ceux des CH3
- Présence de pics négatifs et de pics et CH positifs
positifs

- Spectres RMN 2D en mode

inverse HSQC

- Dimension F1 : 0 < δ < 5,5ppm S3a : Agrandissement des

S3a /3b
zones 0-5,5 ppm et 0 –
- Dimension F2 : 0 < δ <125 ppm 120 ppm

S3b: Agrandissement des

zones 0 – 2,3 ppm et 0-55
ppm

informations à tirer:
H

61

- Dimension F1 : 0 < δ < 5,5ppm
S4a / 4b / 4c /4d
- Dimension F2 : 0 < δ <125 ppm
-
- Spectres RMN 2D en mode
inverse HMBC
S4a: Spectre entier
S4b: Agrandissement des
zones 0 – 5,5 ppm et 0-75
ppm
S4c: Agrandissement des
zones 0 – 2,5 ppm et 0-145
ppm
S4d: Agrandissement des
zones 0 – 2,5 ppm et 0-60
ppm

Informations à tirer :
H
H
C
C C C
C

- Spectres COSY
- Dimension F1 : 0 < δ < 5,5ppm S5a : Zones 5,5 – 5,5 ppm
S5b : Zones 3,7 – 3,7 ppm
- Dimension F2 : 0 < δ < 5,5 ppm Informations à tirer :
S5a / 5b H
1
- sur la diagonale RMN H, taches de C
corrélation symétriques par rapport à la
diagonale H

H
H

C
C

- Dimension F1 : 0 < δ < 5,5ppm - Spectres NOESY

S6a /6b
S6a : Zones 5,5 – 5,5 ppm
- Dimension F2 : 0 < δ < 5,5 ppm S6b : Zones 3,7 – 3,7 ppm

III.6.1.2. Interprétation des spectres

La première étape de notre étude consiste à repérer sur le spectre RMN 1H (S1a / S1b)
les signaux des protons pouvant être attribués sans ambiguïté par comparaison de leurs
déplacements chimiques avec les tables de référence. Ce spectre montre la présence :

62
  d’un multiplet relatif à un proton à δ 5,33 ppm qu’on peut assigner à un
proton éthylénique – CH =,
 d’un multiplet de un proton à δ 3,50 ppm pouvant être assigné à un CH
déblindé par un atome d’oxygène,
 de six méthyles résonnant respectivement à δ 0,99 (s) ; 0,90(d, J = 5.87 Hz) ;
0,83 ; 0,81 ; 0,79 et 0,66(s).

L’interprétation du spectre RMN 13C S2 (APT) a conduit aux relevés des données
présentées dans le tableau 14.

Tableau 14 : Résultats de l’interprétation du spectre S2 (APT)

Cq CH CH2 CH3
140,74 121,66 42,30 19,75
36,48 71,78 39,77 19,35
56,75 37,23 19,01
56,06 33,94 18,74
50,14 31,66 11,95
45,84 28,19 11,82
36,10 26,11
29,17 24,26
23,07
21,06

2Cq 8CH 10CH2 6CH3

La comparaison des valeurs de δ ppm avec celles données par les tables de référence
permet d’identifier quatre groupements.

Tableau 15 : Identification de groupements en 13C

δ (ppm) groupement

63
 140,74 C

121,66 CH
71,78 CH O

36,48 C

L’interprétation concertée des spectres S1 (1H), S2 (13C) et S3a / 3b (HSQC) conduit

aux valeurs des déplacements chimiques des protons et des carbones qui les portent
(tableau 16).

Tableau 16 : Résultats de l’interprétation des spectres S1, S2, S3a et S3b

CH CH2 CH3
δ(ppm) C 13
δ (ppm) H 1
δ(ppm) C 13
δ (ppm) H1
δ(ppm) C 13
δ (ppm) 1H
2,22
121,66 5,33 42,30 19,75 0,81
2,28
1,99
71,78 3,50 39,77 19,35 0,99
1,14
1,06
56,75 0,96 37,23 19,01 0,79
1,83
1,00
56,06 1,08 33,94 18,74 0,90
1,29
1,95
50,14 0,92 31,78 11,95 0,83
1,50
1,81
45,84 0,91 31,66 11,82 0,66
1.48
1,82
36,10 1,34 28,19
1,24
29,17 1,65 26,11 1,16
1,54
24,26
1,04
23,07 1,23
21,06 1,44
L’exploitation du spectre HSQC a mis en évidence la présence d’un groupe méthylène
résonnant à δ(ppm) 31,78 non visible sur le spectre 13
C. Par suite, s’il n’y a pas de
chevauchement d’autres signaux, NF31 serait formé de 2 Cq, 8 CH, 11 CH2 et 6 CH3 ; Ce
serait un composé à 27 atomes de carbone.
L’allure du spectre RMN proton et le nombre d’atomes de carbone dans le composé
suggèrent que NF31 serait un stéroïde.

64
L’analyse du spectre HMBC nous permet d’obtenir des informations sur les enchaînements
dans la molécule.

 Partant des taches de corrélation HMBC respectives des proton 1H5,33 et 1H2,22 – 2,28
1
H5, 33 C42, 30 (CH2) ; C36, 48 (Cq) ; C31, 66 et/ou C31, 78 (CH2)
1H
2,22
1H
2,28 C140, 74 (Cq) ; C 121,66 (-CH=); C71, 78 (-CH-O); C36, 48 (Cq) ; C31, 66 et /
ou C31, 78 (CH2)

On peut établir l’enchaînement suivant :

31.66
36.48
31.78
CH2
a1
140.74 31.78
HC CH2
71.78 31.66
O CH2 CH
42.30 121.66
2.22 5.33
2.28

 Corrélations des protons méthyliques à 0,99 ppm

1
H0, 99 C140, 74 (Cq); C 50, 14 (CH); C36, 48 (Cq); C37, 23 (CH2)

Les protons méthyliques résonnant à δ 0,99 ppm présentent des taches de corrélations
intenses avec les carbones à δ140,74, 50,14, 36,48 et 37,23ppm. Le groupe méthyle est
rattaché au carbone quaternaire saturé.
19.35
CH3
37.23 50.14
CH
31.66 CH2
31.78
CH2 36.48
a12
140.74 31.78
HC CH2
71.78 31.66
O CH2 CH
42.30 121.66

 Corrélations des protons méthyléniques à δ 1,95 et 1,81 ppm

65
 1
H1, 95 C140, 74 (Cq); C 121.66 (CH=); C 50, 14 (CH); C 31.78
1
H1, 81 C 42,30 (CH2) ; C36, 48 (Cq)

Le proton à δ 1,95 est porté par le carbone résonnant à δ 31.78. D’après le spectre S4d
(HMBC) il donne une tache de corrélation avec un carbone à δ 31.78. Par suite, il existerait
deux carbones résonnant à ce même endroit. Les corrélations observées permettent la
distribution des δ ppm et de fermer les cycles.

19.35
1.83
37.23 CH3
50.14
CH2 CH
31.66 31.78
1.81 CH2 36.48 C

140.74
a13
HC CH2 31.78
71.78 1.95
O CH2 CH 1.48
42.30 121.66
2.22
2.28

Les corrélations du proton à δ1,83 corroborent ces résultats.

1
H1, 83 C 140.74 (Cq); C 71,78 (CH-O); C 36,48 (Cq) ; C 31,66 (CH2) ; C 19,35 (CH3)

19.35
1.83
37.23
CH3
50.14
CH2 CH
31.66 31.78
1.81 CH2 36.48 C
a14
140.74
HC CH2 31.78
71.78 1.95
O CH2 CH 1.48
42.30 121.66
2.22 5.33
2.28

 Corrélations des protons méthyliques à δ 0,66 et 0,90 ppm

1
H0, 66 C56, 75 (CH) ; C56, 06 (CH) ; C42, 30 ; C39, 77 (CH2)
1
H0, 90 C56, 06 (CH) ; C36, 10 (CH) ; C33, 94 (CH2)

66
.

Le carbone à δ 42,30 ppm est corrélé avec les protons :

1
C42, 30 H5,33 ; 1H1,81 ; 1H1, 99 ; 1H1,82 ; 1H1,44 ; 1H1,14 ; 1H1.08 ; 1H0, 96 ; 1H0, 66
Dans le fragment de structure a14 seules sont vérifiées les corrélations avec les protons
1
H1,81 et 1H5,33. L’existence des autres corrélations n’est possible qu’à condition qu’il y ait
un autre carbone résonnant à δ 42,30 et ce carbone doit être un carbone quaternaire. Par
ailleurs, les protons méthyliques 1H0, 66 et 1H0, 90 sont corrélés au même atome de carbone
C56, 06. Ces arguments conduisent à l’enchaînement suivant :

1.29
0.90
1.00
18.74
33.94
CH3
CH2
.
11 82 CH 36.10
0.66 CH3 1.34
56.06
CH2
39.77
CH 1.08
b1
42.30
1.99
1.14
CH
56.75
0.96

 Corrélations des protons méthyléniques à δ 1.99 ppm

1
H1, 99 C56, 75 (CH); C50, 14 (CH); C42, 30 (Cq); C21, 06 (CH2); C11, 82 (CH3).
Les corrélations du proton 1H1, 99 permettent d’établir la jonction entre les motifs a14 et
b1, C50, 14 appartenant au motif a14.

67
 1.29
1.00
33.94
CH3
CH2
11.82 CH
39.77 CH3
1.99 56.06
CH2 CH 1.08
21.06
CH2 42.30
CH3
CH2 CH CH
C
CH2 50.14 C . 56.75
31 78 0.96

HC CH2 31.78
HO CH2 CH

Les corrélations de 1H1, 44 portés par C21, 06 corroborent cette jonction entre les deux
motifs et la présence du deuxième carbone à δ 31,78.
1
H1, 44 C50, 14 (CH) ; C42, 30 (Cq); C39.77 (CH2); C31.78 (CH).

Les taches de corrélations en HMBC des protons portés par le carbone C33, 94 situé en
bout de chaîne ne pouvant être attribuées sans ambiguïté, pour compléter la structure de
NF31 nous avons exploité les corrélations des méthyles à δ 0.79 et 0.81 ppm
1
H0, 79 C45, 84 (CH); C29, 17 (CH); C19, 75 (CH3).
1
H0, 81 C45, 84 (CH); C29, 17 (CH); C19, 01 (CH3).

Les corrélations des deux méthyles avec les deux carbones C29, 17 et C45, 84 est en faveur
d’une structure isopropylique. Par ailleurs, la forte intensité de leur corrélation avec C 29, 17
est une preuve de la proximité de ce noyau avec ces méthyles.
19.01 0.90
1.65
CH3 45.84
29.17
CH
CH
CH3 d
19.75

 Les corrélations du proton méthinique à δ 1.65 sont :

68
1
H1, 65 C45, 84 (CH); C26, 11 (CH2); C23, 07 (CH2); C19, 75 (CH3); C19, 01 (CH3)
Elles permettent d’introduire deux nouveaux éléments sur le motif d. Le proton

méthylique à δ 0.83 corrèle avec C23, 07. Ces résultats conduisent à l’enchaînement d1.

1.16
19.01 CH2 26.11
CH3 1.65 0.90
29.17
CH
CH 45.84 d1
CH2 CH3
CH3 23.07 11.95
19.75

Les corrélations de 1H1, 16 avec C36, 10 et C33, 94 permettent de relier les deux motifs c et d1

33.94
CH3 1.16
CH2
CH2 26.11
CH
CH3 36.10 CH3
CH
CH2 CH 56.06 CH
CH2 CH2
CH3 CH3
CH2 CH CH CH3
CH2 C 56.75

HC CH2 e
HO CH2 CH

A cette étape, il reste à localiser les deux carbones méthyléniques C 28, 19 et C24, 26. Les
corrélations des protons 1H1, 82 et 1H1, 04 portés respectivement par C28, 19 et C24, 26 sont :
1
H1, 82 C56, 06 (CH); C42, 30 (Cq)
1
H1, 04 C56, 75 (CH); C42, 30 (Cq); C31, 78 (CH)
Comme les deux carbones à δ 56.06 et 56.75 ont encore tous deux une valence libre,
en complétant ces valences libres avec les deux méthylènes, nous aurons la distribution des
déplacements chimiques dans f et la fermeture du cycle.

69
 33.94
CH3 26.11
CH2
CH3 CH2
CH 36.10 CH3
CH2
CH 56.06 CH
CH2 42.30
CH
CH3 28.19
CH2 1.82 CH2
CH2 CH3
CH 56.75 CH
CH2
CH2 31.78CH 24.26 CH3
1.04
f
HC CH2
HO CH2 CH

En revenant au spectre RMN 1H, on observe un singulet à 5,28 ppm que l’on peut
attribuer à un proton hydroxylique.
Les corrélations trouvées à partir des spectres COSY et NOESY corroborent les
enchaînements trouvés dans le motif f. Les résultats des interprétations respectives des
deux spectres sont portés sur :
 le tableau17 et la figure 18 pour le COSY,
 le tableau 18 et la figure 19 pour le NOESY.
Dans ces tableaux seules les principales corrélations observées sont représentées. Les
corrélations observées en COSY ne sont plus figurées dans le tableau 18.

Tableau 17: Principales corrélations observées en COSY

70
 5,33

3,50

2,28

2,22

1,99

1,95

1,82

1,81

1,65

1,54

1,50

1,48

1,44

1,24

1,14

1,08

1,06

0,96

0,91

0,81

0,79
1
H
1
H

5,33    

3,50    

2,28   

2,22     

1,99  

1,95   

1,82   

1,81 

1,65   

1,54    

1,50   

1,48   

1,44 

1,24  

1,14 

1,08  

1,06 

0,96 

0,91 

0,81 

0,79 

: Corrélation intense  : Corrélation faible

71
 CH3
CH2
CH3 CH2 0.81
CH CH3
1.08
1.44
CH2
1.14 CH CH
CH2 0.91 CH
1.99
CH3 1.65
1.81 1.06 CH2 1..82 CH2
CH2 0.96 1 24 CH3 0.79
H CH CH CH 1.54 2
CH CH3
1.48 H
3.50
HC CH2 1.50
1.95
HO CH2 2.22 C
2.28
H
5.33

Figure 18 : Principales corrélations observées en COSY

Tableau 18 : Principales corrélations observées en NOESY

3,50

2,28

2,22

1,99

1,48

1.06

0,99

0,90

0,66
1
H
1
H

3,50 

2,28 

2,22 

1,99  

1,48 

1,06 

0.99 

0,90 

0,66 

0.90
CH3
1.99 CH3
H H 0.66

1.06 0.99
H H CH3
1.48 H

H
CH 72
H 1.95
3.50
HO H
H H 1.50
2.28 2.22
 Figure 19 : Principales corrélations observées en NOESY

NF31 est un composé de formule C29H50O de masse moléculaire 414g/mol. Sa structure

est celle d’un stéroïde apparentée au phytostérol. La comparaison des déplacements
chimiques de ses 13C avec les données de la littérature nous a permis de l’identifier au β –
sitostérol (Tableau 19, page 73).
La structure trouvée est en accord avec les résultats du criblage phytochimique.

III.6.2. SPECTRE DE MASSE

Les spectres ESI présentent en général un ensemble de pics correspondant aux ions
multichargés de type [M+nH]n+ où M correspond à la masse moléculaire de la molécule
analysée, et "n" au nombre de charges portées par cette molécule ionisée. Les sels
perturbent le processus d'électrospray et forment une série d'adduits de type (M+Na)+,
(M+K)+, (M+H+Na)2+ …, ce qui complique le spectre et diminue la sensibilité.
En ESI-TOF, il arrive de temps en temps qu'une impureté soit mieux ionisée que le
produit. Ainsi, dans notre cas, le pic observé à m/z = 413,2667 correspond à [M+Na]+du
phtalate* qui donne un pic quasimoléculaire (M + H)+ à m/z 391,2844 soit une masse
moléculaire de 390 g/mol.
La présence du pic à m/z = 397,3834 confirme la masse moléculaire 414g/mol de
NF31. En effet, il peut être attribué à l’ion (M – H2O + H) +.

* Impureté due à l’appareil (note du manipulateur)

Tableau 19 : Comparaison des δ (ppm) 13C du β – sitostérol et de NF31

C β – sitostérol 69 NF31

73
 δ (ppm) 13C δ (ppm) 13C
1 37,23 37,3
2 31,66 31,6
3 71,78 71,7
4 42,30 42,3
5 140,74 140,7
6 121,66 121,5
7 31,78 31,9
8 31,78 31,9
9 50,14 50,1
10 36,48 36,5
11 21,06 21,1
12 39,77 39,8
13 42,30 42,3
14 56,75 56,7
15 24,26 24,3
16 28,19 28,2
17 56,06 56,1
18 11,82 11,9
19 19,35 19,4
20 36,10 36,1
21 18,74 18,8
22 33,94 33,9
23 26,11 26,2
24 45,84 45,8
25 29,17 29,2
26 19,75 19,8
27 19,01 19,0
28 23,07 23,1
29 11,95 11,9

En résumé :
NF31 est un composé de formule brute C29H50O de masse moléculaire 414g/mol. Sa
formule développée s’écrit :

69
BLUNT, J.W., STOTHERS, J.B., Org. magn. reson. 1977, 9, 439.

74
 H 3C

CH 3 H
H
12
11 13 17
CH 3 16
9 14
1 8
2 15
10

HC3 7
4 5
HO
6

Figure 20 : Formule développée de NF31

C’est un stéroïde du type phytostérols dont le nom systématique est :

17 – (5-éthyl-6-méthylheptan-2-yl)-10,13-diméthyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-
tétradécahydro-1H-cyclopenta[α]phénanthrèn-3-ol

III.7. RESULTATS DES TESTS BIOLOGIQUES

Des tests antiplasmodiaux ont été effectués avec les différents extraits obtenus lors du
préfractionnement.

TEST ANTIPLASMODIAL TEST DE CYTOTOXICITE

NATURE DES % % d’inhibition
EXTRAITS d’inhibition CI50 (10µg/ml) CI50
(10µg/ml)

Hexane-1 51.41 8.31 4,09

Hexane-2 18.41

CH2Cl2 -1 11,82

CH2Cl2 -2 21.62

AcOEt-1 22.69

AcOEt-2 10.22

75
 Act-1 16.86

Act-2 8.27

D’après ces résultats, c’est la fraction Hexane-1 qui présente la meilleure activité
antiplasmodiale. A 10µg/ml, elle provoque une inhibition de la croissance parasitaire de
l’ordre de 51,41%. L’effet cytotoxique de cette fraction est plus de 12 fois (12,57) moins
prononcé que l’activité antiplasmodial. Ce qui nous permet de dire que l’activité inhibitrice
de cette fraction hexanique1 pourrait être spécifique du parasite de Plasmodium
falciparum.

76
CONCLUSION GENERALE
 Notre mémoire est consacré à l’étude d’une plante endémique de Madagascar de la
famille des Combretaceae, Poivrea coccinea, issue de la pharmacopée populaire et utilisée
comme fébrifuge et contre la fièvre liée au paludisme.

Réalisé dans le cadre de la préparation du DEA de Chimie Organique, ce travail nous a

permis d’une part, de nous familiariser davantage avec les différentes techniques utilisées au
laboratoire de chimie organique et de nous initier à des méthodes de tests biologiques et,
d’autre part, à appliquer pratiquement nos connaissances à la détermination structurale d’un
produit par spectroscopie RMN.

Une partie de cette étude a été consacrée à des données bibliographiques sur la
description botanique, la répartition géographique et les utilisations traditionnelles des plantes
de la famille des Combretaceae en général et de l’espèce étudiée en particulier. Diverses
techniques utilisées au laboratoire y ont été également développées.

Le criblage phytochimique effectué selon la méthode de Fongh a montré que les feuilles
de Poivrea coccinea renferment des flavonoïdes et leucoanthocyanes, des tanins, des stéroïdes
et des sucres réducteurs. Ces résultats corroborent la présence de ces substances naturelles
dans le genre poivrea décrites dans les travaux antérieurs.

La séparation des différents constituants a été réalisée par les techniques

chromatographiques classiques : chromatographie sur colonne, chromatographie préparative.
Elle a permis d’isoler deux produits dont l’un a été identifié au β-sitostérol après
interprétation de ses spectres de RMN 1D et 2D (1H, 13C, COSY, HMQC, HMBC, NOESY),
et de son spectre de masse. Cette structure stéroïdique du type phytostérol est en accord avec
les résultats du criblage phytochimique. Elle a été confirmée par comparaison des données
spectrales du produit avec celles de la littérature.

Si les phytostérols jouent un rôle important dans la physiologie du végétal, leurs

éventuelles propriétés pharmacologiques ne retiennent guère l’attention. Il nous parait donc
important de déterminer la structure du second produit puis de le tester afin de savoir s’il
possède une activité biologique. Dans le cas où aucune activité n’est trouvée nous nous
proposons de continuer l’étude de la plante afin de trouver son principe actif.

76
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ET WEBOGRAPHIQUES
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80
ANNEXE I
 Préparation des réactifs

- Réactif de Dragendorff

Solution A
1,7g de sous nitrate de bismuth, 20 g d’acide tartrique dissous dans 30 ml d’eau distillée.
Solution B
8 g d’iodure de potassium dans 20 ml d’eau distillée.
Révélation
Au moment de l’emploi, on mélange 2,5ml de la solution A et 2,5ml de la solution B, on
ajoute 2,5 ml de solution aqueuse d’acide tartrique 20% à ce mélange.

- Réactif de Wagner
On pèse 2g d’iodure de potassium et 1,27g d’iode. On mélange ces produits dans un
erlenmeyer de 250 ml puis on y ajoute 100 ml d’eau distillée. Le mélange est agité jusqu’à
dissolution complète du soluté.

- Réactif de Mayer
On dissout 1,35g de chlorure mercurique (II) dans 94ml d’eau, on y ajoute 5g d’iodure de
potassium. Le mélange est agité et on ramène à 100ml le volume total avec de l’eau
distillée.
- Préparation de la gélatine
On met en suspension 1g de gélatine dans 100ml d’eau.
- Préparation de chlorure de sodium à 10%
On dissout 10g de chlorure de sodium dans 100ml d’eau distillée.
- Préparation de la gélatine salée
On mélange un volume de la solution de la gélatine à un volume égal de la solution de
chlorure de sodium.

- Réactif de Kedde
D’une part, on dissout 2g d’acide 3,5-dinitrobenzoïque dans 100ml de méthanol.
D’autre part, 5,6 g de potasse sont dissous dans 100ml d’eau distillée (Solution 1N)
Pulvérisation :
Au moment de l’emploi, on mélange à volume égal la solution d’acide et de potasse.
- Réactif de Keller-Killiani
On dissout 10g de chlorure ferrique dans 100ml d’eau distillée. Au moment de l’emploi, on
mélange 0,3ml de la solution précédente à 50ml d’acide acétique glacial. On prélève 3ml
du mélange pour le test de Keller-Killiani.

- Chlorure ferrique à 10 % dans le méthanol

On dissout 1g de chlorure ferrique dans 10ml de méthanol en agitant et en chauffant
jusqu’à dissolution complète.

- Préparation de la vanilline sulfurique

Solution A
3 ml d’acide sulfurique concentré dans 50 ml d’éthanol.
Solution B
3 g de vanilline dans 50 ml d’éthanol
Au moment de l’emploi, on mélange à volume égal les solutions A et B.
Les mélanges doivent être conservés au frais dans un réfrigérateur pour éviter la
détérioration.
ANNEXE II
S1a : Spectre de RMN 1H
S1b : Spectre de RMN 1H
S2a : Spectre APT
S3a : Spectre HSQC
S3b : Spectre HSQC
S4a : Spectre HMBC
S4b : Spectre HMBC
S4c : Spectre HMBC
S4d : Spectre HMBC
S5a : Spectre COSY
S5b : Spectre COSY
S6a: Spectre NOESY
S6b: Spectre NOESY
S7a: Spectre de masse
Auteur Narindra Maharomahavaly Rakotondramanana

Adresse Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles, Ampasampito

Département de Chimie Organique, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo,
BP 906, 101 Antananarivo Madagascar

E-mail valori4@yahoo.fr

Téléphone 261 33 11 886 76

Titre Contribution à l’étude chimique des feuilles de Poivrea coccinea DC.

(COMBRETACEAE)

Nombre de pages: 80
Nombre de figures: 20
Nombre de schémas: 13
Nombre de tableaux: 19
Nombre d’annexes : 2

Résumé

Poivrea coccinea est une plante endémique de Madagascar utilisée traditionnellement pour traiter la fièvre
liée au paludisme. Le criblage phytochimique effectué sur Poivrea coccinea a montré la présence de tanins et
de composés flavonoïdiques et stéroïdiques. L’interprétation concertée des spectres de RMN 1D (1H et 13C),
2D (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) et du spectre de masse nous a permis d’identifier le produit isolé de
l’extrait dichlorométhanique au β - sitostérol.
Les extraits hexaniques de Poivrea coccinea ont montré une activité antipaludique.

Mots –clés Poivrea coccinea, Combretaceae, stéroïdes, β-sitostérol, antipaludique, RMN, masse

Abstract

Poivrea coccinea is an endemic plant of Madagascar. It is used in traditional medicine for the treatment of
malaria. Phytochemical screening performed on the Poivrea coccinea showed that it contained flavonoïds and
steroïds compounds and tanins. From CH2Cl2 extract, β-sitostérol was isolated and its structure was
established by 1D, 2D NMR techniques (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) and mass spectra.

Key words Poivrea coccinea, Combretaceae, stéroïds, β- sitostérol, antimalarial, NMR, mass

Directeur de mémoire

Dorothée RAZAFIMAHEFA RAMILISON

Professeur
Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN), Ampasampito,
Département de Chimie Organique, Faculté des Sciences - Université d’Antananarivo

Lot IVF 132 bis Ambatomitsangana

101 – Antananarivo
Tél : 22 605 03
E-mail : dorazafimahefa @ yahoo.fr