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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
Ecole Doctorale de Valorisation des Ressources
Naturelles Renouvelables

THESE en vue de l’obtention du grade de

DOCTEUR de l’Université d’Antananarivo

Nouveaux limonoïdes naturels et

hémisynthétiques : effets
neuropharmacologiques inattendus
Par
RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina
Soutenue le 18 Décembre 2015 devant la commission d’examen :

Président : - Professeur RAMANOELINA Panja

Rapporteurs : - Professeur RAKOTOVAO Marcelle
- Professeur RAJAONARISON Bertille
Examinateurs : - Professeur RAFATRO Herintsoa
- Professeur WIKBERG Jarl ES
Directeurs de thèse : - Professeur RASOANAIVO Philippe
- Professeur RANDRIANTSOA Adolphe
 ii

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
Ecole Doctorale de Valorisation des Ressources
Naturelles Renouvelables

THESE en vue de l’obtention du grade de

DOCTEUR de l’Université d’Antananarivo

Nouveaux limonoïdes naturels et

hémisynthétiques : effets
neuropharmacologiques inattendus
Par
RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina
Soutenue le 18 Décembre 2015 devant la commission d’examen :

Président : - Professeur RAMANOELINA Panja

Rapporteurs : - Professeur RAKOTOVAO Marcelle
- Professeur RAJAONARISON Bertille
Examinateurs : - Professeur RAFATRO Herintsoa
- Professeur WIKBERG Jarl ES
Directeurs de thèse : - Professeur RASOANAIVO Philippe
- Professeur RANDRIANTSOA Adolphe
 iii

A Ramse Zokibe

« Par la grâce de Dieu je suis ce que je suis, et sa grâce envers moi n'a pas été vaine ; loin de là, j'ai
travaillé plus qu'eux tous, non pas moi toutefois, mais la grâce de Dieu qui est avec moi ».

1 Corinthiens 15 :10
 i

REMERCIEMENTS

Mes sincères remerciements vont à l’endroit de :

- Monsieur Panja RAMANOELINA

Professeur Titulaire à l’Ecole Supérieure des Sciences Agronomiques, Université
d’Antananarivo
Président de l’Université d’Antananarivo
Vous me faites le grand honneur de présider le jury de cette soutenance, malgré vos
lourdes responsabilités et votre emploi du temps très chargé. Je témoigne ici ma
gratitude et profonde reconnaissance.

- Madame Marcelle RAKOTOVAO

Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo
Directeur du Laboratoire de Chimie et de valorisation des Produit Naturels
Directeur de l’Ecole Doctorale « Valorisation des Ressources Naturelles
Renouvelable »
Sans votre encouragement et soutien, je ne suis pas arrivé au terme de ce travail. Vous
n’avez pas ménagé vos efforts et précieux temps pour faire le nécessaire pour que je
puisse m’inscrire au sein de l’Ecole Doctorale VRNR. Vous avez accepté d’être
chargé de la lourde tache d’examiner en avant-première mon manuscrit. Pour vos
aides et conseils efficaces, pertinents et arrivant toujours au moment le plus opportun
ainsi que pour vos attentions constantes aux autres, je témoigne ici toute ma gratitude
et profonde reconnaissance.

- Madame Bertille RAJAONARISON

Professeur Titulaire d’Enseignement Supérieur en Psychiatrie, Faculté de Médecine
Université d’Antananarivo
Neuropsychiatre des Hôpitaux
Chef de Section Santé Mentale au CHU de Soin et de Santé Publique d’Analakely
Malgré vos nombreuses obligations, vous me faite l’honneur d’apporter vos
compétences dans le jugement et la validation de ce travail.
 ii

- Monsieur Herintsoa RAFATRO

Professeur Titulaire de Pharmacologie et de Méthodologie de la recherche à la
Faculté de Médecine, Université d’Antananarivo
Chef de Département Vétérinaire, Faculté de Médecine, Université d’Antananarivo.
Vous me faite l’honneur de siéger dans le jury. Je vous en remercie et vous prie de
trouver ici l’expression de ma reconnaissance et sincères remerciements.

Je tiens à exprimer ma vive gratitude à mon directeur de thèse Monsieur Philippe

RASOANAIVO dit Ramse Zokibe, Professeur Titulaire à l’Ecole Supérieur Polytechnique
d’Antananarivo, Université d’Antananarivo ; Directeur Scientifique de l’Association-
Fondation Rakoto Ratsimamanga. Je voudrais lui adresser ma profonde reconnaissance pour
m’avoir patiemment et constamment appris, guidé, encouragé, stimulé mais aussi rassuré tout
au long de ce travail de thèse, avec une disponibilité remarquable. Qu’il trouve dans ces mots
le témoignage de mon admiration pour sa rigueur, son immense connaissance scientifique
ainsi que pour son incroyable enthousiasme. Merci Ramse!

J’adresse toute ma gratitude à Monsieur Adolphe RANDRIANTSOA, Professeur Titulaire à

la Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo, co-directeur de thèse pour ses conseils,
son écoute et surtout sa compréhension, sous l’impulsion duquel j’ai pu mener cette thèse.

Je témoigne ma reconnaissance à l'égard de Monsieur Fanantenanirainy

RANDIMBIVOLOLONA, Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences, Université
d’Antananarivo pour m’avoir initié à la recherche pharmacologique.

Ce travail a été réalisé grâce à de nombreuses collaborations. Je souhaiterai adresser mes vifs
et sincères remerciements à :

- Madame le Professeur RATSIMAMANGA Suzanne-Urverg Présidente de l’IMRA,

qui a bien voulu m’accueillir au sein de son Institut.

- Monsieur le Professeur WIKBERG Jarl Erik Sylvester du Département de

Pharmaceutical Biosciences, Université de l’Uppsala Suède pour la confiance qu’il a
manifestée à mon égard en acceptant de collaborer et de m’accueillir au sein de son
département. Il m’a dirigé et soutenue efficacement tout le long de ces années de travail et j’ai
pu bénéficier de sa riche expérience dans de nombreux aspects de la recherche.
 iii

- Monsieur le Docteur RASOLONDRATOVO Benoit de l’Université de Tuléar et son

équipe pour leurs aides pendant la collecte des plantes et les enquêtes ethnobotaniques.

- Madame le Professeur ROMAN Erika de Biomedical Center (BMC) de l’Université

de l’Uppsala et Monsieur le Professeur VAN DEN STEEN Philippe de l’Université
Catholique de Louvain pour leur accueil et assistance pendant mes stages de formation sur des
tests in vivo et de comportement des rongeurs au sein de leur département.

- Monsieur le Professeur FOSSEN Torgils de Bergen University de Norvège pour sa

collaboration et son aide précieuse en RMN et détermination structurale.

- Monsieur le Professeur PUGOVICS Osvalds, de l’Institute of Organic Synthesis de

Riga-Latvia et son équipe pour l’hemisynthèse des libiguins.

Mes chaleureux remerciements vont à toute l’équipe du Laboratoire de l’Immunologie de

l’Université Catholique de Louvain et du Département de Pharmaceutical Biosciences, de
l’Université de l’Uppsala ; tout particulièrement à Katrien Deroost, Aleh Yahorau et Sviatlana
Yahorava.

Mes vifs remerciements aux chercheurs et personnels de l’IMRA et de SOAMADINA en

particulier, toute l’équipe du Laboratoire Biothérapeutique : David, Mano, Christian, Gilde,
Fanja, Riana, Tahina, Nantenaina, Herizo, Bebe Marthe, Bebe Ravao et Nadia.

Je remercie les institutions qui ont financé mes voyages et séjours en Belgique et en Suède à
savoir : le CNRS (Centre National de Recherche Scientifique) France, dans le cadre du projet
Phytochik et la Fondation Internationale pour la Science (FIS) Suède.

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à toute ma famille et à mes amis pour leur
soutien permanent et leur encouragement ; à Mihaja et à Miantsa pour leur complice.

Je profite cette occasion pour exprimer les expressions de mes sentiments respectueux à Dada
sy Neny qui malgré leur moyen très limité n’ont pas ménagé leurs efforts pour m’encourager
et m’aider dans l’aboutissement de mes études. Que Dieu vous bénisse.

Tous ceux qui de prés ou de loin ont contribué à l’élaboration de ce travail et dont les noms ne
figurent malheureusement pas sur ces pages, qu’ils trouvent ici le témoignage de mon estime
et de ma gratitude.
 iv

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ................................................................................................................................ i
TABLE DES MATIERES ..................................................................................................................... iv
LISTE DES PUBLICATIONS, BREVETS, COMMUNICATIONS ORALES, POSTERS,
PARTICIPATION A DES COLLOQUES ET PRIX........................................................................... viii
LISTE DES FIGURES......................................................................................................................... xiii
LISTE DES TABLEAUX................................................................................................................... xvii
LISTE DES ABREVIATIONS .......................................................................................................... xviii
Introduction ............................................................................................................................................. 1
Chapitre I : CONTEXE, HISTORIQUE ET DEVELOPPEMENT DE
L’ETUDE
I.1. CONTEXTE ..................................................................................................................................... 4
I.1.1 Institut Malgache de Recherches Appliquées ................................................................................. 4
I.1.2 Laboratoire Biothérapeutique ......................................................................................................... 4
I.2. HISTORIQUE................................................................................................................................... 5
I.2.1. Le projet FADES (Fonds d’Appui pour le Développement de l’Enseignement Supérieur) .......... 5
I.2.2 Rencontre en Afrique du Sud.......................................................................................................... 5
I.2. VISITES, RECRUTEMENT ET STAGE ........................................................................................ 6
I.2.1. Visite du Professeur Jarl Wikberg à Madagascar .......................................................................... 6
I.2.2. Recrutement de Solofoniaina Razafimahefa au Laboratoire de Biothérapeutique ........................ 7
I.2.3. 2ème Visite du Pr Wikberg à Madagascar ....................................................................................... 7
I.2.3. Visite du Professeur Rasoanaivo à l’université d’Uppsala, Suède................................................. 9
I.2.4 3ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar .................................................................................. 9
I.2.5 4ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar ................................................................................ 10
I.2.6 5ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar ................................................................................ 11
I.2.3. Stage de Solofoniaina Razafimahefa à l’université d’Uppsala .................................................... 11
I.3. RECHERCHE DE FINANCEMENT (FUND RAISING) .............................................................. 12
I.4. RESEAUTAGE (NETWORKING) ................................................................................................. 13
I.5. CONTACT AVEC L’INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE .......................................................... 14
Chapitre II : GÉNÉRALITÉS SUR LA PHARMACOLOGIE ET LA
CHIMIE RELATIVES À L’ÉTUDE
II.1. CERVEAU ET COMPORTEMENT ............................................................................................ 15
II.2.1. Le système nerveux .................................................................................................................... 15
II.2.2. Système nerveux et comportement ............................................................................................. 18
a- L’hypothalamus......................................................................................................................... 18
 v

b- Le système nerveux autonome .................................................................................................. 19

c- Systèmes modulateurs diffus du cerveau .................................................................................. 21

II.2.3. Définition et concept du comportement...................................................................................... 23

II.2.2. Biogénèse des limonoïdes........................................................................................................... 25
II.2.3. Structure et classification des limonoïdes orthoesters ................................................................ 27
Chapitre III : MATERIELS ET METHODES
III. 1. DÉCOUVERTE ET HÉMISYNTHÈSE DES LIBIGUINS ....................................................... 29
III.1.1. Enquête ethnobotanique ............................................................................................................ 29
III.1.2. Collecte de Neobeguea mahafalensis........................................................................................ 29
III.1.3. Extraction aqueuse .................................................................................................................... 30
III.1.4. Fractionnement bioguidé et isolement de libiguins................................................................... 30
a- Fractionnement de R2C sur LiChroprep RP-18 ........................................................................ 31

b- Isolement des libiguins R306 et R310....................................................................................... 32

III.1.5. Elucidation structurale des libiguins ......................................................................................... 34

III.1.6. Hemisynthèse de libiguins et ses dérivés .................................................................................. 34
a- Hemisynthèse de Libiguin E à partir de phragmaline ............................................................... 34

b- Hemisynthèse des Libiguins A, C et D à partir de phragmaline ............................................... 35

III.1.7. Tests pharmacologiques ............................................................................................................ 36

a- Animaux .................................................................................................................................... 36

b- Test de toxicité aigue................................................................................................................. 36

c- Test sur organe isolé.................................................................................................................. 37

d- Test de comportement sexuel .................................................................................................... 37

III.1.9. Pharmacocinétique et étude préliminaire du mécanisme d’action de libiguin C (SAE5). ........ 42

a- Etude pharmacocinétique de la libiguin C administré à dose unique par voie intra-veineuse
chez les rats ....................................................................................................................................... 42

b- Etude cinétique in vivo de la libiguin C chez les rats................................................................ 43

c- Etude de la biodistribution de la libiguin C chez les rats .......................................................... 44

 vi

d- Etude in vitro de la liaison libiguin-récepteur ........................................................................... 45

III.2. DECOUVERTE FORTUITE DE DODOGUIN .......................................................................... 46

III.2.1. Extraction au dichlorométhane des écorces de racines de Neobeguea mahafalensis................ 46
III.2.2. Fractionnement chromatographique de l’extrait DCM ............................................................. 46
III.2.3. Isolement de dodoguin .............................................................................................................. 46
III.2.4. Elucidation de la structure de dodoguin .................................................................................... 47
a- Analyse de dodoguin sur HPLC ................................................................................................ 47

b- Analyse par CL/SM et détermination de la masse du dodoguin ............................................... 47

III.2.5. Test d’effet inducteur du sommeil de dodoguin........................................................................ 47

III.3. DECOUVERTE FORTUITE DE GIDRAGUIN ......................................................................... 49
III.4. ANALYSE DES RESULTATS ................................................................................................... 49
Chapitre IV : RESULTATS
IV.1. ETHNOBOTANIQUE................................................................................................................. 50
IV.2. BOTANIQUE .............................................................................................................................. 51
IV.3. PHYTOCHIMIE DES LIBIGUINS............................................................................................. 54
IV.3.1. Extraction aqueuse .................................................................................................................... 54
IV.3.2. Extraction chloroformique ........................................................................................................ 54
IV.3.3. Isolement et purification des libiguins ...................................................................................... 56
a- Fractionnement de R2C............................................................................................................. 56

b- Isolement des Libiguins............................................................................................................. 57

IV.3.4. Elucidation des structures des libiguins .................................................................................... 61

IV.4. PHYTOCHIMIE DE DODOGUIN ............................................................................................. 78
IV.4.1. Extraction dichlorométhane ...................................................................................................... 78
IV.4.2.Fractionnement de l’extrait DCM .............................................................................................. 78
IV.4.3. Isolement et purification de Dodoguin A.................................................................................. 78
IV.4.4. Détermination structurale de Dodoguin A ................................................................................ 79
IV.6.1. Effet sur organe isolé ................................................................................................................ 87
IV.6.2. Toxicite aiguë............................................................................................................................ 87
IV.6.3 Effet sur le comportement.......................................................................................................... 87
a- Effet de l’extrait aqueux RW sur le comportement sexuel des rats mâles ................................ 87

b- Effet des fractions issues de RW sur le comportement sexuel des rats mâles........................... 88

c- Effet de RW sur le comportement sexuel des souris mâles....................................................... 89

 vii

d- Effet de R2C administré par voie orale et sous-cutané à des doses croissantes sur le
comportement sexuel des souris mâles.............................................................................................. 90

e- Test de comportement sexuel sur les fractions issues de R2C .................................................. 91

f- Effet de R3004 à 4 mg/kg administré par voie orale et sous-cutanée ....................................... 92

g- Effet de R306 cristallisé au 4, 7, 14 et 21ème jour du traitement à des doses croissantes de 0,004
à 0,4 mg/kg ........................................................................................................................................ 93

h- Effet d’un produit hémisynthétique SAE5 ou libiguin C sur l’activité sexuelle des rats mâles 93

i- Effet inducteur du sommeil de la dodoguin sur les souris......................................................... 96

j- Effet d’un produit intermédiaire de synthèse LG1725 ou GIDRAGUIN sur le comportement

des souris ........................................................................................................................................... 98

IV.7. PHARMACOCINETIQUE ET PHARMACODYNAMIE DE LIBIGUIN C............................. 99

Chapitre V : DISCUSSION
V.1. PHYTOCHIMIE ......................................................................................................................... 102
V.2. DECOUVERTES PAR SERENDIPITE ..................................................................................... 105
V.3. ESSAIS PHENOTYPIQUES versus ESSAIS BASES SUR LES MECANISMES D’ACTION 107
V.4. PHARMACOLOGIE .................................................................................................................. 109
V.4.1. Comportement sexuel............................................................................................................... 109
V.4.2. Comportement agressif............................................................................................................. 113
V.4.3.Effet inducteur du sommeil ....................................................................................................... 114
V.4.4.Mécanisme d’action et relation structure activité...................................................................... 115
V.6. BREVETER OU PUBLIER ........................................................................................................ 117
V.7. DEVELOPPEMENT ET PRODUCTION .................................................................................. 118
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ......................................... 120
REFERENCES................................................................................................................. 122
ANNEXE
NOTRE NOUVELLE GAMME DE PHYTOMEDICAMENTS ............................................... I
 viii

LISTE DES PUBLICATIONS, BREVETS, COMMUNICATIONS ORALES,

POSTERS, PARTICIPATION A DES COLLOQUES ET PRIX

I- PUBLICATIONS

Publications se rapportant au sujet de thèse

1. Razafimahefa S., Mutulis F., Mutule I., Liepinsh E., Dambrova M., Cirule H., Svalbe B.,
Yahorava S., Yahorau A., Rasolondratovo B., Rasoanaivo P., ES Wikberg J. (2014)
Libiguins A & B: Novel phragmalin limonoids isolated from Neobeguea mahafalensis
causing profound enhancement of sexual activity. Planta Medica, 80: 306-314.

2. Grigorjeva L., Liepinsh E. ,Razafimahefa S., Yahorau A., Yahorava S.,Rasoanaivo P.,
Jirgensons A., E.S. Wikberg J. (2014) Semisynthesis of libiguin A and its analogues by
Trans-Lactonization of phragmalin. Journal of Organic Chemistry 79, 4148-4153.

Autres publications

3. Randrianarivo E., Rasoanaivo P., Nicoletti M., Razafimahefa S., Lefebvre M., Papa F.,
Vittori S., Maggi F.. (2013) Essential-Oil Polymorphism in the Resurrection Plant
Myrothamnus moschatus and Associated Ethnobotanical Knowledge. Chemistry &
Biodiversity; 10: 1987-1998.

4. Rasoanaivo P., Razafimahefa S. (2012) Innovative approaches to exploiting traditional

medicines in malaria. In: Drug discovery in Africa, Kelly Chibale, Mike Davies-Coleman,
Collen Masimirembwa Editors, Springer-Verlag Berlin Heidelberg: pages 265-292.

5. Mangoyi R., Hayeshi R., Ngadjui B., Ngandeu F., Bezabih M. , Abegaz B.,
Razafimahefa S., Rasoanaivo P., Mukanganyama S. (2010) Glutathione transferase from
Plasmodium falciparum – Interaction with malagashanine and selected plant natural
products. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 25: 854-62
 ix

II- BREVETS

Brevets se rapportant au sujet de thèse

1. WIKKBERG Jarl Erik Sylvester, RASOANAIVO Philippe, RASOLONDRATOVO

Benoit, RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina. Novel compounds and
pharmaceutical preparations. US Patent N° US 2010/0247593 A1, 30 September 2010.

2. WIKKBERG Jarl Erik Sylvester, RASOANAIVO Philippe, RASOLONDRATOVO

Benoit, RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina. Novel compounds and
pharmaceutical preparations. PCT Patent N° WO 2008/145996 A2, 4 December 2008.

Autres brevets

3. RASOANAIVO Philippe, RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina,

RANDRIANARIVO Emmanuel. Composition pharmaceutique comprenant l'huile
essentielle de Myrothamnus moschatus pour la prévention et les traitements des désordres
du cerveau. Brevet OMAPI N° 613, 20 Octobre 2014.

4. RASOANAIVO Philippe, RAZAFIMAHEFA Andriantiaray Solofoniaina.

Composition pharmaceutique et ses procédés de préparation pour usage immunostimulant.
Brevet OMAPI N° 640, 02 Octobre 2015.

III- COMMUNICATIONS ORALES

Communications orales se rapportant au sujet de thèse

1. Razafimahefa Solofoniaina, Bringing groundbreaking discovery into

commercialization: the case of Libiguins. Journées Recherche et Innovation et
Rentabilisation. 18-19 Juillet 2013, Akademia Malagasy. Antananarivo-Madagascar.

2. Razafimahefa Solofoniaina, Rasoanaivo Philippe, Innovation sur les médicaments

traditionnels améliorés à Madagascar. 8ème CIPAM, Colloque International des Plantes
Aromatiques et Médicinales. 29 Septembre au 04 Octobre 2014. Pointe à Pitre-
Guadeloupe.
 x

Autres communications orales

3. Razafimahefa Solofoniaina, Natural Products, Traditional Medicine and Drug

Discovery. Jeudi CYROI. 16 Mai 2013. CYROI. Sainte Clotilde-La Réunion.

4. Razafimahefa Solofoniaina, Paradigm shift to the investigation of antimalarial plants.

IFS grant report. International Foundation of Science.13 May 2011 Stockholm-Sweden.

5. Razafimahefa S., Raharinjato F., Lantomandimby J., Rasoanaivo P. et Ratsimamang S.

Ecologie, connaissances ethnomédicales et variations des activités biologiques : exemple
de deux Plantes médicinales malgaches. Symposium BIOMAD, 13-15 Octobre 2009
Antananarivo- Madagascar.

IV-POSTERS

1. Razafimahefa Solofoniaina, Rasoanaivo Philippe, Malaria sterilizing immunity obtained

with a plant extract combined to chloroquine. 6-9 Novembre 2012, 7ème CIPAM,
Colloque International des Plantes Aromatiques et Médicinales ; Saint Dénis-La Réunion.

2. Razafimahefa Solofoniaina, Rasoanaivo Philippe, Innovative approaches to exploiting

traditional medicines in malaria. Poster in African Network for Drugs and Diagnostics
Innovation (ANDI). 24-27 Octobre 2011. Addis Ababa- Ethiopie.

3. Razafimahefa S., Sambany M. C., Raharinjato F. H. and Rasoanaivo P. Shifting the

paradigm to the investigation of antimalarial plants; Poster in African Network for Drugs
and Diagnostics Innovation (ANDI). 11-13 Octobre 2010. Nairobi- Kenya

V- PARTICIPATION A DES COLLOQUES

Nationaux

1. Forum national de haut niveau sur la propriété intellectuelle. Organisé par l’Office
Malgache de Propriété Industrielle (OMAPI). 7-8 Mai 2012. Hôtel COLBERT
Antananarivo-Madagascar.
 xi

2. Atelier sur la rédaction des demandes de brevet d’invention. Organisé par l’Organisation
Mondiale de la Propriété Intellectuelle (OMPI) en coopération avec l’Office Malgache de
Propriété Industrielle (OMAPI). 17-19 Juin 2014. Hôtel COLBERT Antananarivo-
Madagascar.

Régionaux
3. Developing Novel Strategies for Natural Product-based Drug Discovery for Tropical
Diseases. Global Institute for Bioexploration-Africa (GIBEX-Africa). 03-06 November
2008. University of Cape Town - South Africa.

4. Herbal Trade forum. 4th World Congress on Medicinal and Aromatic Plants (WOCMAP).
International Convention Centre. 09-13 November 2008 Cape Town - South Africa

5. 5th Pan African malaria conference. 5th Multilateral Initiative on Malaria (MIM)
Conference. 2-6 November 2009. Nairobi-Kenya.

6. 3rd ANDI (African Network for Drugs and Diagnostics Innovation), Creating a
sustainable platform for R&D Innovation in Africa, 10-15 October 2010, Nairobi-Kenya.

7. 4th ANDI Stakeholder’s Meeting and Donor Conference. African Network for Drugs and
Diagnostics Innovation. United Nation Conference Center. 24-27 October 2011. Addis
Ababa-Ethiopia

8. Tradition, Santé, développement économique. 7ème CIPAM ; Colloque International des

Plantes Aromatiques et Médicinales.06-09 Novembre 2012. Saint Dénis-La Réunion

9. 15th NAPRECA Summer School. 10-14 September 2012. Institut Malgache de

Recherches Appliquées. Antananarivo - Madagascar

Internationaux

10. Innovation et Tradition au cœur de la biodiversité des Caraïbes, 8ème CIPAM ; Colloque
International des Plantes Aromatiques et Médicinales. 29 Septembre au 04 Octobre 2014.
Pointe à Pitre-Guadeloupe.
 xii

VI-PRIX :

Prix se rapportant au sujet de thèse

1. Meilleur jeune inventeur 2014. Prix de l’Office Malgache de Propriété Industrielle

(OMAPI).
2. Meilleur jeune inventeur 2014. Prix de l’Office Mondial de Propriété Intellectuelle
(OMPI) :

Autres Prix

3. Best in Poster. African Network for Drugs and Diagnostics Innovation (ANDI) 2011.
Addis Ababa- Ethiopia

4. Innovation Award. African Network for Drugs and Diagnostics Innovation (ANDI) 2011,
Addis Ababa- Ethiopia.

5. Prix spécial du jury pour jeunes chercheurs. Colloque International sur des Plantes
Aromatiques et Médicinales (7ème CIPAM) 2012. Saint Dénis-La Réunion.
 xiii

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Institut Malgache de Recherches Appliquées ............................................................ 4
Figure 2 : Trois guérisseurs du sud de Madagascar ................................................................... 5
Figure 3 : Les conférenciers en séances plénières invités au 38ème Congrès de la Société
Sud-africaine de Pharmacologie. Bloomfontein, Afrique du Sud.............................................. 6
Figure 4 : Première rencontre du Pr Philippe Rasoanaivo et du Pr Jarl Wikberg à
Bloomfontein, Afrique du Sud ................................................................................................... 6
Figure 5 : Visite de courtoisie du Président de l’Université de Toliara ..................................... 7
Figure 6 : Interview d’un patient................................................................................................ 7
Figure7 : Rencontre entre Pr Philippe Rasoanaivo, Pr Jarl Wikberg et Pr Rado
Ramanampamonjy...................................................................................................................... 8
Figure 8 : Signature de la convention d’essai clinique............................................................... 8
Figure 9 : Première réunion scientifique à l’IMRA ................................................................... 8
Figure 10 : Extrait de l’accord de confidentialité....................................................................... 9
Figure 11 : Visite du Pr Rasoanaivo Philippe en Suède............................................................. 9
Figure 12 : Extrait de la convention de partenariat .................................................................. 10
Figure 13 : Deuxième réunion scientifique à l’IMRA ............................................................. 10
Figure 14 : Réunion avec Dr Kiban Cheuk le Responsable du Département Clinique
à l’IMRA ................................................................................................................................. 10
Figure 15 : Intervention du Pr Jarl Wikberg pendant la Colloque NAPRECA SUMMER
SCHOOL à l’IMRA ................................................................................................................. 11
Figure 16 : Etude des comportements des souris au Rega Institut en Belgique....................... 11
Figure 17 : Isolement de Libiguin sur HPLC en Suède ........................................................... 12
Figure 18 : Pr Jarl Wikberg a reçu le financement du projet BIO-X ....................................... 12
Figure 19 : Extrait du financement TWAS .............................................................................. 13
Figure 20 : Réunion entre Pr Jarl Wikberg, Dr Torgils Fossen de Bergen University de
Norvège et Pr Philippe Rasoanaivo (Norvège) ........................................................................ 14
Figure 21 : Réunion de consultation avec Dr Rakotoniaina Naritiana Directeur exécutif
SAGE, et Mr Ulrich Feiter ....................................................................................................... 14
Figure 22 : Organisation anatomo-fonctionnelle du système sympathique et du système
parasympathique....................................................................................................................... 17
Figure 23 : L'hypothalamus dans le cerveau ............................................................................ 19
Figure 24 : Organisation générale des trois grands types de sortie du système nerveux
central ....................................................................................................................................... 20
 xiv

Figure 25 : Système noradrénergique du locus coeruleus ........................................................ 21

Figure 26 : Système sérotoninergique des noyaux du raphé .................................................... 22
Figure 27 : Systèmes dopaminergiques nigrostrié et mésocorticolimbique............................. 22
Figure 28 : Principales composantes des systèmes cholinergiques centraux........................... 23
Figure 29 : Limonine................................................................................................................ 25
Figure 30 : Squalène époxyde précurseur des différents intermédiaires de triterpènes ........... 26
Figure 31 : Précurseurs biogénétiques des limonoïdes ............................................................ 26
Figure 32 : Différents types de limonoides montrant les différents degrés d’oxydation et
arrangement du squelette.......................................................................................................... 27
Figure 33 : Biosynthèse des limonoïdes orthoesters ................................................................ 28
Figure 34 : Collecte d’écorces de racine de Neobeguea mahafalensis .................................... 29
Figure 35 : Herbier de Neobeguea mahafalensis ..................................................................... 30
Figure 36 : Les différents paramètres pharmacocinétiques...................................................... 42
Figure 37 : Marquage de la libiguin avec un 11C ..................................................................... 43
Figure 38 : Préparation de l’écorce de Neobeguea mahafalensis ............................................ 50
Figure 39 : Etalage des remèdes traditionnels au bord des routes du Sud de Madagascar ...... 51
Figure 40 : Neobeguea mahafalensis (MELIACEA) ............................................................... 52
Figure 41 : Partie aérienne de Neobeguea mahafalensis.......................................................... 52
Figure 42 : Planche de Neobeguea mahafalensis..................................................................... 53
Figure 43 : Fruits de Neobeguea mahafalensis ........................................................................ 54
Figure 44 : Schéma de la procedure de fractionnement de RW............................................... 54
Figure 45 : Schéma de la procédure d’isolement et purification des libiguins ........................ 55
Figure 46 : Profiles HPLC de RA, RB, RC et R2C ................................................................. 56
Figure 47 : Profil chromatographique de R306........................................................................ 58
Figure 48 : Spectre UV de R306 .............................................................................................. 58
Figure 49 : Profil chromatographique de R310A et de R310B................................................ 59
Figure 50 : Spectres UV de R310A et de R310B..................................................................... 60
Figure 51 : Spectre proton de R306 ......................................................................................... 62
Figure 52 : Spectre RMN 13C de R306 .................................................................................... 63
Figure 53 : Spectre HMBC de R306. ....................................................................................... 65
Figure 54 : Corrélations HMBC de libiguin A......................................................................... 66
Figure 55 : Spectre NOESY de R306....................................................................................... 67
Figure 56 : Données NOESY : taches de corrélation de R306 ................................................ 68
 xv

Figure 57 : Structure de libiguin A (1) et libiguin B avec ses énol- (2a) et céto- (2b)
formes....................................................................................................................................... 69
Figure 58 : Spectre proton de R310 ......................................................................................... 72
Figure 59 : Spectre RMN 13C de R 310 ................................................................................... 72
Figure 60 : Spectre HMBC de R310 ........................................................................................ 74
Figure 61 : Corrélation HMBC du composé R310A................................................................ 75
Figure 62 : Spectre NOESY de R310....................................................................................... 76
Figure 63 : Données NOESY : taches de corrélations du composé R310A............................. 76
Figure 64 : Corrélation HMBC du composé R310B................................................................ 77
Figure 65 : Profil chromatographique de la Dodoguin A......................................................... 78
Figure 66 : Spectre UV de la dodoguin A ................................................................................ 79
Figure 67 : Spectre DEPT de la dodoguin A............................................................................ 80
Figure 68 : Spectre proton de dodoguin A ............................................................................... 82
Figure 69 : Spectre HSQC 1H-13C de dodoguin A ................................................................... 82
Figure 70 : Dodoguin A ........................................................................................................... 84
Figure 71 : Hemisynthèse de Libiguin E à partir de la phragmaline........................................ 85
Figure 72 : Hemisynthèse des Libiguins A, C et D.................................................................. 86
Figure 73 : Libiguin A et ses dérivés hemisynthétiques .......................................................... 86
Figure 74 : Effet de l’extrait aqueux RW à 60mg/kg/jour pendant 3 jours sur la FM des rats
mâles......................................................................................................................................... 88
Figure 75 : Effet des fractions R2C, R2X1 et R2P sur la FM des rats mâles .......................... 88
Figure 76 : Effet du RW à 60mg/kg sur la FM des souris mâles ............................................. 89
Figure 77 : Effet du R2C sur la FM des souris mâles administré par voie orale et sous-cutané à
4mg/kg pendant trois jours ....................................................................................................... 90
Figure 78 : Effet de la dose croissante de R2C sur la FM des souris mâles............................. 91
Figure 79 : Effet des fractions RA, RB et RC à 4 mg/kg sur la FM des souris mâles ............. 91
Figure 80 : Effet des fractions issues du RB à 4 mg/kg sur la FM des souris mâles ............... 92
Figure 81 : Effet du R3004 sur la FM des souris mâles administré par voie orale et sous-
cutané à 4mg/kg pendant trois jours......................................................................................... 92
Figure 82 : Effet du R306 cristallisé au 4, 7, 14 et 21ème jour du traitement à des doses
croissantes de 0,004 à 0,4 mg/kg.............................................................................................. 93
Figure 83 : Effet du SAE5 sur le temps de latence de la première montée.............................. 94
Figure 84 : Effet du SAE5 sur le temps de latence de première intromission ......................... 94
Figure 85 : Effet du SAE5 sur le temps de latence de l’éjaculation......................................... 95
 xvi

Figure 86 : Effet du SAE5 su la FM des rats mâles ................................................................. 95

Figure 87 : Efficacité copulatoire............................................................................................. 96
Figure 88 : FA et FM des souris traitées par gidraguin 0,4 mg/kg .......................................... 98
Figure 89 : Images de la tête d’un rat pendant 60 minutes par µTEP/TC.............................. 100
Figure 90 : Biodistribution de la libiguin C chez les rats à 10, 30 et 60 minutes .................. 101
Figure 91 : 1) Pseudrelone A2, 2) Neobegin.......................................................................... 102
Figure 92 : 1) sapelin E acetate, 2) grandifoliolenone, 3) ethyl acétate, 4) methyl angolensate,
5) mexicanolide et 6) khayasin.............................................................................................. 103
Figure 93 : Biogenèse des Libiguins ...................................................................................... 104
Figure 94 : Future évolution de la découverte de médicaments............................................. 108
Figure 95 : Structures de libiguin, dodoguin, gidraguin ........................................................ 116
Figure 96 : Le bloc phragmaline et l’-cétofurane ................................................................ 116
Figure 97 : La C-16/30 lactone ou la nature de la chaîne latérale.......................................... 116
Figure 98 : Prospectus de nos nouveaux phytomédicaments 2015 (Page 1) .............................II
Figure 99 : Prospectus de nos nouveaux phytomédicaments 2015 (Page 2) ........................... III
Figure 100 : Dangitsyl® ............................................................................................................ IV
 xvii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Spectres RMN 1H (600 MHz) et 13C (150.9 MHz) de R306, R310A et R310B... 69
Tableau 2 : Spectres RMN 1H (600 MHz) et 13C (150.9 MHz) de Dodoguin A ..................... 80
Tableau 3 : Corrélations dans le spectre 2D HMBC 1H-13C de Dodoguin A........................... 83
Tableau 4 : Effet de la dodoguin sur les comportements des souris ........................................ 97
Tableau 5 : Concentration plasmatique en libiguin C (ng/ml) en fonction de temps (h) ......... 99
Tableau 6 : Paramètres pharmacocinétiques de la libiguin .................................................... 100
 xviii

LISTE DES ABREVIATIONS

ACh : Acétylcholine
CNRS : Centre Nationale de Recherche Scientifique
COSY : Correlation Spectroscopy
DA : Dopamine
DCM : Dichloromethane
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
Ej : Ejaculation
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HPLC : Haute Performance Liquide Chromatographique
HRMS : High Resolution Mass Spectral
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence
IEc : Indice d’éfficacité copulatoire
In : Intromission
FA : Fréquence d’agressivité
FADES : Fonds d’Appui pour le Développement de l’Enseignement Supérieur
FIS : Fondation Internationale pour la Science
FM : Fréquence de montée
IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées
NA : Noradrénaline
NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire
SAGE : Service d’Appui et Gestion de l’Environnement
SNA : Système nerveux autonome
SNC : Système nerveux central
SNP : Système nerveux périphérique
SSC : Surface Sous la Courbe
TEP : Tomographie par Emission de Positons
TMS : Tetramethylsilane
TWAS : The Academy of Sciences for the Developing World
5-HT : la sérotonine
 1

Introduction
Conscience, intelligence, usage du langage, mémoire, émotion, les facultés donnant à
l'Homme sa spécificité unique dans la biosphère, dépendent d'un singulier système, le cerveau
qui est sans aucun doute le plus complexe produit issu de l'évolution du vivant (William H,
1986). Dans le cerveau, les neurones se communiquent entre eux à travers des molécules qui
activent des courants électriques en se liant aux récepteurs de leurs membranes (Snyder SH,
1984). Une anomalie dans le fonctionnement de n' importe quelle région cérébrale associée à
des circuits de régulation au niveau des récepteurs ou des courants électriques, risque de
conduire à un trouble de fonctionnement du cerveau. Ainsi, tromper, bloquer, saturer certains
de ces récepteurs ou courants électriques constituent quelques-unes des stratégies utilisées
pour la recherche de nouveaux médicaments contre les désordres du cerveau (Venault P et
coll., 1986).

Dans un entretien avec la revue L’EXPRESS paru en Mars 1999 (http://www.lexpress.fr

/informations/la-chance-joue-toujours-un-rôle-dans-la recherche_632814.html), le Docteur
Pierre POTIER disait : «Le cerveau sera le problème du XXIème siècle». Et d'après l'OMS, «La
maladie du cerveau se classe au troisième rang des maladies mondiales et devrait occuper la
première place d’ici 2030» (Marina M et coll. 2012). A Madagascar, dans le Programme
National de Santé Mentale (2002), le Dr Robinson Jean Louis, ancien ministre de la Santé
disait : « Les troubles mentaux figurent parmi les principales causes de morbidité et
d’incapacité dans le monde, et deviennent à Madagascar un véritable problème de santé
publique. Et pourtant, l’inclusion d’un véritable programme de santé mentale dans les
programmes de développement est encore trop rare pour ne pas dire oubliée ». L’ensemble
de ces remarques appelle à une sensibilisation pour une recherche et développement plus
soutenus de nouveaux médicaments pour la prise en charge des désordres du cerveau.

Par ailleurs, concevoir et développer de nouveaux médicaments est un processus complexe

(Gosselin D, 2009). Il l'est encore plus pour les médicaments dévolus au cerveau. Tout
d'abord, parce que celui-ci est séparé du sang par une barrière dite hémato-encéphalique qui
empêche le passage de nombreuses substances. De ce fait, beaucoup de médicaments
prometteurs se trouvent recalés parce qu'ils sont incapables d'atteindre le cerveau. En outre, le
problème des effets secondaires est bien plus délicat dès que l'on s'intéresse à notre organe
noble, car tous ne sont pas détectables par l'expérimentation chez l'animal.
 2

Les médicaments ont été découverts par deux approches fondamentalement opposées. La
première approche consiste à identifier une substance qui a l’effet physiologique désiré quand
elle est administrée à un être humain, un animal approprié, ou des cellules (approche
phénotypique). De telles substances peuvent être découvertes par hasard, par le
fractionnement de plantes ou d’autres produits connus pour avoir des propriétés médicinales,
ou en passant au criblage (screening) des produits naturels ou des bibliothèques de composés.
Le mode d’action de la substance est seulement identifié plus tard après une quantité
importante de travail supplémentaire. La seconde approche commence avec la connaissance
d’une cible moléculaire (target-based assays). Puis, on recherche des composés soit par
criblage, soit en concevant des molécules avec les propriétés désirées, qui se fixent à la
molécule cible et qui modulent ses propriétés. Après que de tels composés sont disponibles,
les scientifiques peuvent explorer leurs effets sur des cellules ou des organismes appropriés.
Beaucoup de résultats inattendus peuvent être rencontrés au cours de cette recherche, au fur et
à mesure que la complexité des systèmes biologiques étudiés se dévoile.

Pendant plus de deux décennies, néanmoins, les résultats attendus de cette dernière approche
réductionniste qui nécessite de gros investissement et des infrastructures plus sophistiquées,
ont été plutôt décevants. Ceci a conduit les industries pharmaceutiques à élaborer d’autre
approche plus holistique qui agit sur plusieurs cibles à la fois qui est l’approche
polypharmacologie (Swamidass SJ et coll., 2014). C’est pour cette raison que nous avons
privilégié l’approche phénotypique dans nos recherches sur les plantes médicinales.

L’objectif de cette thèse est d’étudier Neobeguea mahafalensis (Meliaceae) ainsi qu’identifier
ses constituants actifs dans le traitement du dysfonctionnement érectile et la perte de libido.
Ces symptômes qui font partie des troubles psychiques et neurologiques (Butler C et Zeman.
AZJ, 2005). Il s’agit d’une atteinte des sphères instinctivo-affectives affectant le
fonctionnement du cerveau ou plus généralement du système nerveux de façon progressive au
cours de leur évolution (Heaton JP, 2000). Ce qui nous permet de proposer une hypothèse que
ces constituants pourraient agir au niveau central.

Ce manuscrit comporte cinq chapitres :

Le premier chapitre décrira le contexte, l’historique et développement de l’étude.

Dans le second chapitre, nous allons développer les généralités sur la pharmacologie et la
chimie relatives à l’étude.
 3

Le troisième chapitre traitera les matériels et méthodes.

Et enfin en quatrième et cinquième chapitre, nous présenteront les résultats et la discussion

générale.

Et enfin, une Conclusion et les Références bibliographiques termineront notre dissertation.

 i

Chapitre I : CONTEXE, HISTORIQUE ET

DEVELOPPEMENT DE L’ETUDE
 4

I.1. CONTEXTE

I.1.1 Institut Malgache de Recherches Appliquées

L’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA) a été crée en 1957 par le Professeur
Albert Rakoto-Ratsimamanga ancien directeur de recherches au Centre Nationale de
Recherche Scientifique (CNRS) à Paris et pionnier de la recherche scientifique à Madagascar.
Son but était de créer un institut pour valoriser les plantes médicinales locales afin de pouvoir
soigner les populations défavorisées. Il a comme devise « Sublime est la science qui a pour
objet de conserver la vie ».

Figure 1 : Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA)

La richesse en biodiversité floristique et la place de la médecine traditionnelle dans la culture

malgache ont bien contribué à la découverte ainsi qu’à la mise au point des
phytomédicaments au sein de l’Institut. A l’heure actuelle, on compte une cinquantaine de
phytomédicaments et phytocosmétiques. Parmi lesquels, on peut citer le Madeglucyl premier
antidiabétique d’origine végétale, le Masy Calcium, le Ody Fery Meva, le Ody Vato, le
Pommade Phi., etc. Des efforts sont effectués pour enrichir les phytomédicaments
commercialisables à l’IMRA.

I.1.2 Laboratoire Biothérapeutique

Le paludisme a été le premier sujet de recherche au Laboratoire Biothérapeutique de l’IMRA

sous la direction du Professeur Philippe Rasoanaivo. Depuis 2004, il a élargi le thème de
recherche sur le cerveau et le comportement. C’est dans le cadre de ce thème que nous avons
entrepris l’étude du Neobeguea mahafalensis.
 5

I.2. HISTORIQUE

I.2.1. Le projet FADES (Fonds d’Appui pour le Développement de l’Enseignement

Supérieur)

En 2000, le Laboratoire de Chimie Appliquées dirigé par le Dr Benoit Rasolondratovo a reçu

un financement du projet FADES pour l’inventaire et valorisation des plantes médicinales de
la région Sud de Madagascar. Les enquêtes ethnobotaniques auprès des guérisseurs, en
particulier, Messieurs Longonanake, Mbehotoly, Esoavotse. (Fig. 2) ont permis de recenser
plus de 500 plantes médicinales de la région Sud de Madagascar. Il a été convenu dans le
cadre de ce projet que les tests biologiques seront effectués par l’équipe du Professeur
Rasoanaivo à l’IMRA, et Neobeguea mahafalensis a été proposé pour une étude approfondie.
La première récolte a été effectuée en Juillet 2004.

Figure 2 : Trois guérisseurs du sud de Madagascar

(Mrs Longonanake, Mbehotoly et Esoavotse)

I.2.2 Rencontre en Afrique du Sud

A l’occasion du 38ème Congrès de la Société Sud-africaine de Pharmacologie qui s’est tenu à

Bloomfontein du 24 au 27 Octobre 2004 sous le thème : « Trends in Drug Development », le
Pr Philippe Rasoanaivo a rencontré le Pr Jarl Wikberg de l’Université de l’Uppsala, Suède
(Fig. 3 et 4). Le Pr Wikberg est un spécialiste entre autres des récepteurs de la melanocortine
(Wikberg JES et Mutulis F, 2008). Ils ont discuté de la possibilité d’une collaboration sur un
sujet d’intérêt commun concernant l’étude d’une plante médicinale, Neobeguea mahafalensis,
utilisée dans la partie Sud de Madagascar pour le traitement de la dysfonction érectile des
personnes âgées.
 6

Figure 3 : Les conférenciers en séances plénières invités au 38ème Congrès de la Société Sud-
africaine de Pharmacologie. Bloomfontein, Afrique du Sud

Figure 4 : Première rencontre du Pr Philippe Rasoanaivo et du Pr Jarl Wikberg à

Bloomfontein, Afrique du Sud

I.2. VISITES, RECRUTEMENT ET STAGE

Il s’en suivit une série de visites entre les deux parties qui seront présentées par ordre
chronologique.

I.2.1. Visite du Professeur Jarl Wikberg à Madagascar

La première visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar remonte en Septembre 2004. Il était venu
pour une étude prospective dans la région de Toliara. A cette occasion, accompagné par le Pr
Philippe Rasoanaivo et le Dr Benoit Rasolondratovo, Maitre de Conférences à la Faculté des
Sciences de l’Université de Toliara, il a rencontré le Président de cette Université (Fig. 5) et a
interviewé quelques patients qui ont utilisé la décoction de la plante (Fig. 6).
 7

Figure 5 : Visite de courtoisie du Président de l’Université de Toliara (de gauche à droite : Pr

Philippe Rasoanaivo, Dr Benoit Rasolondratovo, le Président de l’Université, Pr Jarl)
Wikberg)

Figure 6 : Interview d’un patient

I.2.2. Recrutement de Solofoniaina Razafimahefa au Laboratoire de

Biothérapeutique

En Septembre 2005, Solofoniaina Razafimahefa a intégré l’équipe du Laboratoire

Biothérapeutique pour effectuer les tests préliminaires et toxicités de l’extrait aqueux de
Neobeguea mahafalensis.

I.2.3. 2ème Visite du Pr Wikberg à Madagascar

En Mai 2006, le Pr Wikberg est revenu pour la signature d’un accord avec le Pr Rado
Ramanampamonjy responsable du Service Gastro-Enterologie à l’Hôpital Joseph Raseta de
Befelatanana, pour une évaluation clinique d’un phytomédicament standardisé de Neobeguea
mahafalensis (Fig. 7 et 8).
 8

Figure 7 : Rencontre entre Pr Philippe Rasoanaivo, Pr Jarl Wikberg et Pr Rado

Ramanampamonjy

Figure 8 : Signature de la convention d’essai clinique

A la même période, nous nous sommes mis d’accord que tous les tests biologiques in vivo
seront effectués à Madagascar sous la responsabilité de Solofoniaina Andriantiaray
Razafimahefa (Fig. 9).

Figure 9 : Première réunion scientifique à l’IMRA (Pr Philippe Rasoanaivo, Pr Jarl Wikberg,
Dr Benoit Rasolondratovo et Solofoniaina Razafimahefa)
 9

Il a été aussi convenu que les résultats obtenus feront l’objet de sa thèse de Doctorat. Un
accord de confidentialité a été signé (Fig. 10).

Figure 10 : Extrait de l’accord de confidentialité

I.2.3. Visite du Professeur Rasoanaivo à l’université d’Uppsala, Suède

En Juin 2006, le Pr Rasoanaivo Philippe a effectué une visite dans le laboratoire Département
de Pharmaceutical Biosciences, Uppsala University afin de faire connaissance à l’équipe du
Pr Wikberg et d’évaluer les potentialités de collaboration entre les deux équipes en termes de
complémentarité (Fig. 11).

Figure 11 : Visite du Pr Rasoanaivo Philippe en Suède

I.2.4 3ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar

En Avril 2008, le Pr Jarl Wikberg était revenu une troisième fois pour la finalisation de notre
brevet et la préparation d’une stratégie de développement de notre recherche (Fig.12)
 10

Figure 12 : Extrait de la convention de partenariat

I.2.5 4ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar

En 2009, le Pr Jarl Wikberg est revenu à Madagascar pour le suivi de l’application et la

réalisation de notre projet (Fig. 13). Il a discuté avec le responsable du Département Clinique
de l’IMRA sur l’efficacité et la sureté de notre phytomedicament qui était déjà disponible et
en vente dans l’institut (Fig. 14).

Figure 13 : Deuxième réunion scientifique à l’IMRA (Dr Benoit Rasolondratovo,

Solofoniaina Razafimahefa, Pr Jarl Wikberg et Pr Philippe Rasoanaivo)

Figure 14 : Réunion avec Dr Kiban Cheuk le Responsable du Département Clinique à l’IMRA

 11

I.2.6 5ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar

Dans le cadre des échanges et formations des jeunes chercheurs africains, le Pr Jarl Wikberg
est venu à Madagascar pour participer à une colloque régionale NAPRECA SUMMER
SCHOOL qui s’est déroulé à l’IMRA en Septembre 2012. Comme étant un spécialiste dans la
recherche et développement de nouveaux médicaments, il a donné des cours et des
conférences sur les différentes approches et stratégies pour ramener la recherche au
développement (Fig. 15).

Figure 15 : Intervention du Pr Jarl Wikberg pendant la Colloque NAPRECA SUMMER

SCHOOL à l’IMRA

I.2.3. Stage de Solofoniaina Razafimahefa à l’université d’Uppsala

Le Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) France et la Fondation Internationale

pour la Science (FIS) Suède m’ont octroyé une bourse de stage pour trois mois.

Figure 16 : Etude des comportements des souris au Rega Institut en Belgique

 12

Ainsi, en début Mars jusqu’à fin Mai 2011, j’étais parti pour l’Université Catholique Rega
Institut de Louvain (Belgique) et Bio Medical Center de l’université d’Uppsala (Suède) pour
apprendre des différentes techniques de tests in vivo, en particulier le test de comportement
(Behaviour test), des techniques de chromatographie (HPLC) et de spectrométrie de masse
(Fig. 16 et 17).

Figure 17 : Isolement de Libiguin sur HPLC en Suède

I.3. RECHERCHE DE FINANCEMENT (FUND RAISING)

Pour bien développer nos recherches, les deux parties (suédoise et malgache) ont cherché des
financements. Elles ont rédigé des projets de recherches sur le développement des Libiguins,
et ont conclu deux projets dont le projet BIO-X financé par l’état suédois avec un montant de
3 millions de Couronnes suédoises (~400 000 USD) (Fig. 18).et un projet financé par le
TWAS avec un montant de 21 000 USD (Fig. 19).

Figure 18 : Le Pr Jarl Wikberg a reçu le financement du projet BIO-X

 13

Figure 19 : Extrait du financement TWAS

I.4. RESEAUTAGE (NETWORKING)

Des collaborations en termes de complémentarité de compétence avec plusieurs laboratoires

de différents pays ont été nécessaires pour la réalisation de ce projet. A l’Université
d’Uppsala et à l’IMRA, plusieurs laboratoires ont contribué à la réalisation des tests
biologiques. Le Département de Chimie de Bergen University de Norvège a collaboré avec
nous sur la détermination structurale (Fig. 20), et le Laboratory of Pharmaceutical
Pharmacology de Latvian Institute of Organic Synthesis a effectué l’hemisynthèse des
libiguins et ses dérivés.
 14

Figure 20 : Réunion entre Pr Jarl Wikberg, Dr Torgils Fossen de Bergen University de

Norvège et Pr Philippe Rasoanaivo (Norvège)

I.5. CONTACT AVEC L’INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE

Quelques industries pharmaceutiques ont été déjà intéressées au développement et

commercialisation de nos produits. Mais comme il s’agit d’une recherche issue de la
biodiversité malgache, nous avons respecté les lois et les réglementations en vigueur sur
l’exploitation de cette biodiversité. Un responsable d’une industrie pharmaceutique Sud-
Africaine est venu à Madagascar pour consulter le responsable du Service d’Appui et Gestion
de l’Environnement (SAGE) à propos du partage de bénéfices selon le protocole de Nagoya
(Fig. 21).

Figure 21 : Réunion de consultation avec Dr Rakotoniaina Naritiana Directeur exécutif SAGE

(au milieu) , et M. Ulrich Feiter (à droite)
 i

Chapitre II : GENERALITES SUR LA

PHARMACOLOGIE ET LA CHIMIE
RELATIVES À L’ÉTUDE
 15

II.1. CERVEAU ET COMPORTEMENT

L'intérêt et l'utilité d'étudier le cerveau et le comportement permettent non seulement de

comprendre nos origines mais d'aborder également la nature humaine afin de mieux saisir la
cause des troubles du comportement facilitant ainsi l'accès thérapeutique grâce aux progrès
effectués en neurobiologie et en neuropsychologie (cognitivisme).(William H., 1986).

Pour bien comprendre les notions relatives au comportement il faut bien connaître
l'organisation de la structure anatomique du système nerveux qui se compose du système
nerveux central comportant le cerveau et la moelle épinière, et du système nerveux
périphérique (Chapouthier G et Matras J.J., 1982).

II.2.1. Le système nerveux

Le système nerveux est un système biologique animal responsable de la coordination des

actions avec l'environnement extérieur et de la communication rapide entre les différentes
parties du corps (Simmons PJ, Young D, 1999).

Anatomiquement, le système nerveux est composé de deux parties distinctes reliées entre
elles :

 Le système nerveux central (SNC), formé de l'encéphale et la moelle épinière. C’est

le centre où sont traitées les informations et partent les influx nerveux de commande. C'est
donc la partie qui perçoit et décide.

 Le système nerveux périphérique (SNP) est fait des nerfs qui partent du SNC, se
ramifient et le relient aux organes sensoriels, aux muscles et aux glandes. On distingue : les
nerfs crâniens qui sont reliés à l’encéphale ; les nerfs rachidiens qui sont reliés à la moelle
épinière. (Sanes DH et coll., 2006).

Fonctionnellement, le système nerveux comporte deux parties :

 Le système nerveux somatique qui, grâce à des nerfs efférents (qui partent du SNC
vers les organes) commandent volontairement les muscles striés. C'est le système nerveux
contrôlé par la volonté.
 16

 Le système nerveux autonome ou végétatif, qui échappe à la volonté et, grâce à des
nerfs efférents, commandent les muscles lisses (muscles viscéraux), le muscle du cœur et les
glandes. C'est le système nerveux involontaire. Comme le système nerveux autonome doit
assurer l'homéostasie de l'organisme, c'est-à-dire la stabilité des conditions internes de notre
corps en dépit des nombreuses perturbations, il est lui-même constitué de deux systèmes de
commande antagonistes (Fig. 22) :

- le système nerveux (ortho)sympathique (dont les nerfs sont reliés par des synapses
adrénergiques) qui gère les réactions d'urgence en le préparant à l'effort, au combat ou
à la fuite (en accélérant le pouls, dilatant les pupilles, activant la sudation, stimulant la
respiration et la circulation sanguine, libérant des sucres rapides à partir des réserves
de glycogène du foie, etc.);

- le système nerveux parasympathique (dont les nerfs sont reliés par des synapses
cholinergiques) qui permet la conservation de l'énergie et l'accomplissement normal
des fonctions physiologiques (en ralentissant le pouls après l'effort, contractant les
pupilles, calmant la respiration et la circulation sanguine ; il active aussi la digestion et
l'excrétion en relâchant les sphincters et en activant les sécrétions digestives). Les
viscères reçoivent des nerfs de ces deux systèmes, l'un stimulant l'activité de l'organe,
l'autre l'inhibant.
 17

Figure 22 : Organisation anatomo-fonctionnelle du système sympathique et du système

parasympathique (www.neur-one.fr)
 18

II.2.2. Système nerveux et comportement

Pour illustrer le mécanisme physiologique du comportement, trois composantes du système

nerveux sont évoqués dont les effets s'exercent à distance et se prolongent dans le temps de
telle façon qu'ils sont à l'origine de nos comportements (Simmons PJ, Young D, 1999).

 L'une de ces composantes est représentée par une partie de l’hypothalamus : cette
région de l'hypothalamus sécrète directement des substances chimiques dans la circulation
sanguine, agissant sur toutes les fonctions du cerveau et du corps.

 Un autre exemple est représenté par le SNA. Il est contrôlé par l'hypothalamus, mais
il agit en dehors du SNC. Par un réseau extensif d'interconnexions dispersées dans tout le
corps. Le SNA contrôle simultanément les réponses de plusieurs organes internes, des
vaisseaux sanguins, et des glandes.

 La troisième composante fait partie intégrante du SNC et se compose de plusieurs

groupes de cellules caractérisées en fonction d'un neurotransmetteur qui leur est propre. Tous
ces groupes neuronaux se projettent à distance à travers des axones très divergents et ils ont
une durée d'action prolongée, par l'intermédiaire de récepteurs postsynaptiques principalement
métabotropiques. Il s'agit des systèmes modulateurs diffus du cerveau, régulateurs possibles,
entre autres choses, de l'humeur et du niveau de vigilance.

a- L’hypothalamus

L'hypothalamus est situé sous le thalamus, le long des parois du troisième ventricule. Il est
relié à l'hypophyse, suspendue à la base du cerveau, au dessus de la voûte représentant le
palais de la bouche par la tige pituitaire. Bien que ce petit groupe de noyaux ne représente que
1 % de la masse du cerveau, son influence sur la physiologie de l'organisme est immense
(Ghysen A, 2003).

L'hypothalamus peut être divisé en trois parties : latérale, médiane et périventriculaire (Fig.
23). Les parties latérales et médianes forment un réseau extensif de connexions avec le cortex
cérébral et le télencéphale, et exercent un contrôle sur certains types de comportement. La
zone périventriculaire est composée d'un mélange complexe de neurones exerçant différentes
fonctions.
 19

Figure 23 : L'hypothalamus dans le cerveau (www.neur-one.fr)

En outre, l'hypophyse est formée de deux lobes, postérieur et antérieur, contrôlés chacun de
façon très différente à partir de l'hypothalamus.

b- Le système nerveux autonome

La zone périventriculaire de l'hypothalamus ne contrôle pas seulement la sécrétion de

certaines hormones circulantes, mais aussi le système nerveux autonome (SNA). Le SNA a
déclenché toute une série de réponses physiologiques, y compris l'accélération du rythme
cardiaque et l'élévation de la pression artérielle, l'affaiblissement des fonctions digestives, et
la mobilisation des réserves de glucose.

Le système moteur somatique et le SNA représentent, à eux deux, l'ensemble des commandes
exercées par le système nerveux central. Le système moteur somatique joue un seul rôle : il
innerve et commande les fibres des muscles squelettiques. Le SNA exerce la tâche complexe
de contrôler tout autre tissu et organe du corps qu'il innerve (Fig. 24).
 20

Figure 24 : Organisation générale des trois grands types de sortie du système nerveux central
(www.neur-one.fr)

Les systèmes sympathique et parasympathique ont des fonctions parallèles, mais

l'organisation de leurs voies, ainsi que leurs neurotransmetteurs, sont très différents. Ils sont
généralement considérés comme exerçant une influence opposée sur leurs cibles communes.
Par exemple, le système sympathique est plus actif en période de crise, réelle ou imaginaire. Il
est associé aux comportements suivants : la combativité, la fuite, la peur ou encore le désir
sexuel. Le système parasympathique agit principalement, quant à lui, plutôt sur la digestion, la
croissance, la réponse immunitaire et les réserves énergétiques.

Prenons un exemple concret pour illustrer ce double contrôle exercé par les composantes
sympathique et parasympathique du SNA. L'érection du pénis est un processus que l'on peut
schématiquement considérer comme de nature hydraulique. Elle survient lorsque le pénis est
gorgé de sang, ce qui est déclenché et entretenu par l'activité parasympathique. Inversement,
l'orgasme et l'éjaculation sont commandés par l'activité sympathique. L'angoisse et
l'inquiétude, autrement dit le stress et l'activité sympathique qui l'accompagne, inhibent
l'érection et favorisent l’éjaculation ; ce qui fait qu'il est courant d'entendre des hommes
hyper-stressés se plaindre d'impuissance et d'éjaculation précoce.
 21

c- Systèmes modulateurs diffus du cerveau

Ce système est constitué d'un petit ensemble de neurones (quelques milliers). Chaque neurone
en influence beaucoup d'autres, car son axone très «branché» peut être en contact avec plus de
100000 neurones postsynaptiques distribués dans tout le cerveau.

Les principaux systèmes modulateurs du cerveau sont associés aux neurotransmetteurs

suivants : la noradrénaline (NA), la sérotonine (5-HT), la dopamine (DA), ou l'acétylcholine
(ACh).

Neurones noradrénergiques du locus coeruleus

Le locus coeruleus est impliqué dans les processus attentionnels, l'éveil, et les cycles veille-
sommeil, ainsi que dans l'apprentissage et la mémoire, l'anxiété, la douleur, l'humeur et le
métabolisme du cerveau (Fig. 25).

Figure 25 : Système noradrénergique du locus coeruleus (www.neur-one.fr)

Noyaux sérotoninergiques du raphé

Les groupes de neurones contenant de la sérotonine sont localisés dans les neuf noyaux du
raphé (Fig. 26). Les plus postérieurs, au niveau bulbaire, sont connectés avec la moelle et
modulent les messages sensoriels associés à la douleur. Les neurones sérotoninergiques du
raphé jouent aussi un rôle dans la régulation de l'humeur et de certains types de
comportements émotionnels comme dans le contrôle de l'agressivité.
 22

Figure 27 : Système sérotoninergique des noyaux du raphé (www.neur-one.fr)

Neurones dopaminergiques de la substance noire et du tegmentum mésencéphalique

ventral.

Deux groupes de neurones dopaminergiques présentent les caractéristiques des systèmes

modulateurs diffus (Fig. 27). L'un a son origine dans la substance noire (substancia nigra
dans le mésencéphale. Ces neurones se projettent sur le striatum (noyau caudé et putamen), où
ils facilitent l'initiation des mouvements volontaires. La dégénérescence des neurones
dopaminergiques de la substance noire est responsable de la maladie de Parkinson (Bunney
BS, 1984). Le deuxième groupe vient du mésencéphale ; représenté par un groupe de cellules
très proche de la substance noire, siégeant dans la partie ventrale du tegmentum
mésencéphalique (aire tegmentale nigro-striatale). Il est impliqué dans un système de
«récompense ».

Figure 27 : Systèmes dopaminergiques nigrostrié et mésocorticolimbique

 23

Voies cholinergiques du cerveau antérieur basal et du tronc cérébral

Il existe dans le cerveau deux systèmes cholinergiques modulateurs diffus majeurs, dont l'un
d'eux représente le complexe du cerveau antérieur basal. Ce complexe est impliqué dans la
régulation de l'excitabilité du cerveau en général durant l'éveil cortical et les cycles veille-
sommeil et pourrait aussi jouer un rôle particulier dans l'apprentissage et la mémorisation.

Le second système cholinergique diffus porte le nom de complexe cholinergique

pontomésencéphalotegmental, composé de cellules du pont et du tegmentum
mésencéphalique utilisant l'acétylcholine comme neurotransmetteur. Ce système influence
principalement le thalamus dorsal, où, avec les systèmes noradrénergique et sérotoninergique,
il régule l'excitabilité des relais sensoriels spécifiques (Fig. 28).

Figure 28 : Principales composantes des systèmes cholinergiques centraux (www.neur-one.fr)

II.2.3. Définition et concept du comportement

Le XIX° siècle voit apparaître les premières hypothèses sur les causalités du comportement ;
Waterton (1782-1865) parle d'abord d’adaptation des espèces. Wallace et surtout Darwin vont
plus loin en introduisant la notion de sélection naturelle dans L’expression des émotions chez
l’homme et les animaux en 1872. Ils considéraient qu’il existe une continuité entre l’homme et
l’animal pour les caractéristiques physiques et les états mentaux. La fonction mentale se serait
perfectionnée au cours de l’évolution de la même façon que les caractères physiques. Darwin
oriente alors l’étude du comportement dans les deux voies, la psychologie expérimentale et
l’éthologie (Fourcassie V, 2002).
 24

L'étude des mécanismes à l'origine des comportements voit le jour au XX° siècle. Une
première définition du comportement est donnée par Henri Pieron (1881-1964) en 1907 : le
comportement est l’ensemble des « manières d’être et d’agir des animaux et des hommes »
(Renck JL et Servais V, 2002).

Dans le Grand dictionnaire de la psychologie, Larousse 1994, Watson J. a défini « Le

comportement est l'ensemble des réactions objectivement observables qu'un organisme
généralement pourvu d'un système nerveux exécute en réponse aux stimulations du milieu,
elles-mêmes objectivement observables. ». Et pour Gallo A, « Le comportement est une
réalité appréhendable sous la forme d'unités d'observation, dont les actes, la fréquence et les
enchaînements sont susceptibles de se modifier ; il traduit en action l'image de la situation
telle qu'elle est élaborée, avec ses outils propres, par l'être que l'on étudie : le comportement
exprime une forme de représentation et de construction d'un monde particulier»

Le comportement des animaux, humains et non-humains, peut être décrit comme l'ensemble
des actions et réactions (mouvements, modifications physiologiques, expression verbale, etc.)
d'un individu dans une situation donnée. Ils sont contrôlés par leur système endocrinien et leur
système nerveux. La complexité du comportement d'un animal est en étroite relation avec la
complexité de son système nerveux (Northcutt RG, 1984)

Les principaux comportements fondamentaux sont les comportements alimentaire, sexuel,

maternel, social, d’agression, de défense ou fuite et d'inhibition de l'action lorsque la lutte ou
la fuite est impossible (Guarraci FA, 2009).

La phase d’appétence est le premier signe d’une disposition spécifique interne à l’action (état
physiologique, appelé aussi impulsion ou motivation). La phase consommatoire est la partie
opérante permettant d’arriver au rééquilibrage de l’homéostasie. C’est le but ou la finalité du
comportement. La phase d’atténuation et d’arrêt (désatisfaction) est indispensable pour
l’équilibrage des activités et apparaît avant même que l’équilibre homéostatique soit obtenu,
par l’action de différents mécanismes d’inhibition complémentaires. La phase d’atténuation
est suivie d’une période réfractaire (Sisk CL et Meek LR, 1997).

La disposition, la disponibilité et le désir spécifique à l’action abaisse le seuil d’excitation

pour certains stimuli déclencheurs liés à l’action et augmente le seuil d’excitation pour
d’autres stimuli déclencheurs pour d’autres actions. Par exemple, la faim active la sensibilité à
la chasse et réduit la sensibilité aux stimuli sexuels (Butler RA, 1958).
 25

II.2. LIMONOÏDES

L’histoire des limonoïdes remonte d’un siècle quand les scientifiques ont commencé à isoler
le limonine (Fig. 29), l’un des composants amer des agrumes (origine du terme limonoïde).
Les limonoïdes forment une famille homogène de tétranortriterpènoïdes. On les retrouve chez
les Rutacées, Cneoraceae, Ptaeroxylaceae et famille Simaroubaceae mais ils sont
particulièrement abondants et diversifiés structurellement dans la famille des Méliacées. Du
point de vue structure, les limonoides sont des formes dégradés de triterpène (Qin-Gang Tan
et Xiao-Dong Luo, 2011)

Figure 29 : Limonine

II.2.2. Biogénèse des limonoïdes

La biosynthèse des limonoides est via la voie de biosynthèse des terpenoides (Roy A et Saraf
S, 2006) en commençant par une cyclisation du squalène, qui se traduit par un ion
tétracyclique (Fig. 30), d’euphane et de tirucallane deux composés structurellement similaires
qui pourraient probablement être les précurseurs biogénétiques (Fig. 31). La dégradation par
oxydation de la chaîne latérale C-17 de l'un de ces noyaux résulte la perte des quatre atomes
de carbone et la formation du substituant -furanne. D’autres oxydations et réarrangements du
squelette dans un ou plusieurs des quatre cycles A, B, C et D donnent lieu aux différents
groupes de limonoïdes (Fig. 32) possédant différentes activités biologiques dans leur squelette
triterpénique (Dewick P M, 2001).
 26

Figure 30 : Squalène époxyde précurseur des différents intermédiaires de triterpènes

Figure 31 : Précurseurs biogénétiques des limonoïdes

 27

Figure 32 : Différents types de Limonoïdes montrant les différents degrés d’oxydation et

arrangement du squelette

II.2.3. Structure et classification des limonoïdes orthoesters

Les limonoïdes, étant tétranortriterpénoïde sont des composés stéréochimiquement

homogènes, avec une structure prototypique contenant un dérivé d'un précurseur avec un
squelette 4,4,8-triméthyl-17-furanylsteroide (L1). L'oxydation des cycles B 'et D' donne la
dilactonique L2 (les limonoïdes aux cycles B et D-seco), dont une recyclisation via couplage
de C-2 et C-30, forme un limonoïdes L3 de type mexicanolide. Au cours de ce processus, la
rotation du cycle A' se produit autour de la liaison C-9 à C-10 pour conférer la stéréochimie
indiquée sur le limonoïde L3 nouvellement formé. La promotion du couplage oxygène
radicalaire de C-29 et C-1 donne la polyhydroxyle phragmaline L4 avec un pont 4,29,1.

Des modifications de L4 peuvent également se produire pour donner L5, L6, L7 et L8 (une
séquence de réaction d'époxydation et de déshydratation catalysée par un acide a été proposée
pour la formation de L8 et de ses analogues). Ces composés sont caractérisés par la présence
de plusieurs groupes R-hydroxyles configurés, et l'acylation ultérieure d'un groupe hydroxyle,
suivi de la formation d'une fonction orthoester dans le groupe ester nouvellement formé avec
deux autres groupes hydroxyle donnent le 1,8,9- (Phragmaline) , 8,9,14- (Entandrophragmin),
 28

8,9,30- (Xyloccensin, Swietephragmin), et 8,9,11- (Tabularisin A,B,E,F) orthoesters. Les

voies possibles pour les biogénétiques de tous les limonoïdes orthoesters isolés et leurs
corrélations biogénétiques sont illustrées dans le Figure 33 (Shang-Gao Liao et coll., 2009).
Ces orthoesters peuvent être divisés en quatre classes sur la base des motifs de liaison de la
fonctionnalité de l’orthoester.

Figure 33 : Biosynthèse des limonoïdes orthoesters (Shang-Gao Liao et coll., 2009).

 i

Chapitre III :
MATERIELS ET METHODES
 29

III. 1. DÉCOUVERTE ET HÉMISYNTHÈSE DES LIBIGUINS

III.1.1. Enquête ethnobotanique

Les enquêtes ethnobotaniques ont été effectuées dans le cadre du projet FADES. Nous avons
demandé auprès des guérisseurs l’utilisation et la partie utilisée de Neobeguea mahafalensis
dans leur médecine traditionnelle. Des collectes et des recoupements d’informations ont été
effectués auprès de la population locale dans la partie sud de Madagascar et des herboristes de
la capitale. Nous avons enquêté sur la plante la plus utilisée et la plus vendue pour traiter le
dysfonctionnement érectile.

III.1.2. Collecte de Neobeguea mahafalensis

Les racines de Neobeguea mahafalensis ont été récoltées en Juillet 2004 à Antanimora/
Ambovombe (Fig. 34), dans la partie sud de Madagascar en vertu d’un permis
N°52/MINENV.EF/SG/DGEF/DPB/SCBLF/RECH délivré par le Ministère de
l’Environnement, des Eaux et Forêt. La collecte a été réalisée par l’équipe du projet FADES
de l’Université de Tuléar (Dr Benoit Rasolondratovo accompagné par ses étudiants Ms
Edmond SOLOMANA, François FIENENA, Ruphin FATIANY) et l’équipe de l’IMRA
dirigée par le Pr Philippe Rasoanaivo.

Figure 34 : Collecte d’écorces de racine de Neobeguea mahafalensis (Photo Ramse)

Pour préserver la biodiversité, nous avons choisi les vieux arbres qui sont déjà surexploités.
La plante a été identifiée par Monsieur Armand Rakotozafy de l’Institut Malgache de
Recherches Appliquées, par comparaison avec un échantillon authentique classé dans le
Département de botanique, Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza, Antananarivo. Un
 30

herbier (MADA_PR-01/2004) a été déposé à l'Institut Malgache de Recherches Appliquées,

Antananarivo (Fig. 35).

Figure 35 : Herbier de Neobeguea mahafalensis

III.1.3. Extraction aqueuse

Les écorces de racines de Neobeguea mahafalensis séchées à l'air libre ont été broyées et
plongées dans de l'eau bouillante à raison de 10g/l. Le mélange a été maintenu à l’ébullition
pendant 2 minutes, et laissé se refroidir et macérer pendant 16 heures avant d’être filtré. Le
filtrat a été lyophilisé jusqu’à l’obtention d’une poudre marron appelée RW.

III.1.4. Fractionnement bioguidé et isolement de libiguins

L’extrait RW pesant 10g a été dissout dans 500 ml d’eau distillée puis, un partage liquide-
liquide a été réalisé entre cette solution et 500 ml de chloroforme selon la procédure standard.
Le mélange a été ensuite laissé au repos pendant 20 heures pour permettre la décantation. Il en
résulte une séparation de trois phases dont une phase intermédiaire constituée de précipité.
Cette phase intermédiaire a été centrifugée et le résidu lavé plusieurs fois avec du chloroforme
et de l'eau, puis séché sous pression réduite jusqu’à l’obtention d’une poudre dénommée R2P.
 31

Les phases chloroformiques sont rassemblées et évaporées sur un évaporateur rotatif sous
pression réduite. L’extrait a été dissout ensuite dans 40 ml d'acétonitrile ; sa majeure partie a
été dissoute à l’exception d’un dépôt mineur analogue à une cire, appelé R2X1, qui a été
collecté séparément. Pour la solution d'acétonitrile, 60 ml d'eau distillée ont été ajoutées et le
mélange a été lyophilisé. Il en résulte une poudre blanche, appelée R2C.

Enfin, les phases aqueuses restantes ont été combinées, puis lyophilisées, ce qui a donné lieu à
une poudre duveteuse marron clair, appelé R2W.

Un fractionnement supplémentaire utilisant la chromatographie en phase inverse a été effectué

sur l’extrait R2C afin d’isoler les libiguins.

a- Fractionnement de R2C sur LiChroprep RP-18

L’extrait R2C pesant 190 mg a été dissout dans 15 ml d'acétonitrile et 35 ml d'eau distillée. Le
mélange trouble obtenu a été ensuite passé sur une colonne préparative de verre de 33 mm de
diamètre et 420 mm de hauteur, remplie de LiChroprep RP-18 (Merck Chemical Co.,
Germany) équilibré préalablement à 5°C dans acétonitrile/eau 30% et d'acide trifluoroacétique
à 0,1%. La colonne a été éluée par étape avec un mélange eau-acétonitrile-acide
trifluoroacétique, respectivement à 70/30/0,1 suivi de 60/40/0,1 ; 50/50/0,1 ; 40/60/0,1 à 1 L
de chaque, et enfin avec 30/70/0,1 à 1,5 L. La température de fonctionnement a été fixée à
5°C. Pour ce faire, la colonne a été enveloppée dans une glace. Le débit a été fixé à 1,5
ml/min et les fractions éluées ont été collectées dans des tubes de verre à 12 ml de chaque, à
partir de tube 1 jusqu'au tube 440. Toutes les 10ème de ces fractions collectées ont été
analysées sur HPLC utilisant une colonne analytique LiChroprep RP-18 (2,1 x 100 mm) avec
un gradient linéaire préparé d’acétonitrile/eau de 20 à 80% et de 5mM additif d'acétate
d'ammonium pendant 60 min ; le débit a été de 0,2 ml/min et la détection à 220 et 260nm. Les
profils chromatographiques ainsi obtenus ont été enregistrés pour une utilisation ultérieure.
Les tubes ont été regroupés en trois fractions comprenant les tubes de 1 à 257, 258-350 et
351-440, respectivement, et les fractions ainsi regroupées étaient lyophilisées, formant
respectivement les extraits RA, RB et RC. Les trois extraits ont été solubilisés chacun dans
100 ml de 50% d’acétonitrile pour RA et RB, et 70% d’acétonitrile pour RC puis lyophilisés.
 32

b- Isolement des libiguins R306 et R310

Afin d'isoler les libiguins pures, une écorce de racine de Neobeguea mahafalensis séche
pesant 772 g a été extraite selon la procédure standard décrite ci-dessus et a donné 6,68 g de
R2C qui à son tour font l’objet de plusieurs étapes de séparations chromatographiques.

La procédure a commencé par dissoudre les 6,68g de R2C obtenue dans 500 ml d’acétonitrile
et 1000 ml d’eau distillée. Une solution légèrement trouble a été obtenue et fractionnée sur
une colonne de Lichroprep RP-18 de 10 x 25 cm, pré-équilibrée par un mélange eau-
acétonitrile-acide trifluoroacétique à 70/30/0,1 à 5 °C. L'élution a été procédé avec un
gradient de polarité croissante d’eau : acétonitrile : l'acide trifluoroacétique 70 :30 :0,1,
60 :40 :0,1 ; 50 :50 :0,1 ; 40 :60 :0,1 30 :70 :0,1 à 4 L de chaque avec un débit de 10 ml/min.
A partir de l'élution avec 50% d'acétonitrile, des fractions de 60 ml de chaque ont été
collectées et lyophilisées. Cette séparation a été suivie par CL/MS utilisant du LiChroprep
RP-18 analytique (colonne 2.1 × 100 mm avec un gradient linéaire formé à partir d'eau et
d'acétonitrile (de 20% à 80%) + 5 mM d’additif acétate d'ammonium à 60 min, débit 0,2
ml/min, détection à 220 et 260 nm). Toutes les 10ème des fractions collectées ont été analysées
par HPLC et nous avons cherché à identifier les profils chromatographiques qui
correspondent au profil de la fraction RB, comme il a été décrit ci-dessus. A partir de l'élution
40 :60 :0,1 (eau : acétonitrile : l'acide trifluoroacétique) jusqu’à l’élution 30 : 70 : 0,1, les
fractions consécutives ont été rassemblées en fonction de leurs profils chromatographiques, et
soumis à des essais biologiques sur des souris mâles. Au total, 13 fractions regroupées ont été
testés dont R3001-R3012.

Des fractionnements supplémentaires ont été faits sur la fraction R3004 sur colonne en phase
inverse sur l'appareil LKB semi-préparative. 20mg de R3004 ont été dissous dans 0,7 ml
d’acétonitrile et 0,7 ml d’eau distillée dans un tube à centrifugeuse de 1,5 ml. Après agitation
et centrifugation, un surnageant limpide a été obtenu et passé sur une colonne semi-
préparative Lichrosorb C18 (10 x 250 mm) (Merck) pré-équilibrée avec 62% d’acétonitrile
dans de l’eau. La colonne a été éluée avec le même solvant en mode isocratique avec un débit
faible de 5 ml/min et détection UV à 270 nm. Toutes les fractions ont été collectées et
regroupées de telle sorte que chaque lot correspond aux pics majoritaires dans les
chromatogrammes. Cela résulte au total 12 fractions appelées R300 – R311, qui ont été
diluées avec de mêmes volumes d’eau distillée puis congelées et lyophilisées.
 33

Une purification supplémentaire de R306 a été réalisée en deux étapes chromatographiques.

Tout d'abord, 2 mg de R306 ont été dissous, dans un tube à centrifugeuse de 1,5 ml dans 0,5
ml de l'isopropanol et 1 ml d'eau distillée. Le mélange a été agité et centrifugé. Le surnageant
clair obtenu a été introduit dans une colonne semi-préparative chirale Chirobiotic V (10 x 250
mm) (Astec, Sigma-Aldrich, USA) préalablement équilibrée avec 34% d’isopropanol dans de
l’eau. La colonne a été éluée avec le même mélange de solvants en mode isocratique avec un
débit de 1 ml/min et détection UV à 220 nm. La fraction correspondante à la partie centrale du
pic principal a été recueillie. Cette étape a été répétée dix fois de manière à purifier un total de
20 mg de R306 brut. Les fractions appropriées ont été regroupées et lyophilisées. Pour
éliminer le reste d’impureté, 1,2 mg de cette R306 ont été mis dans un tube à centrifugeuse de
1,5 ml et dissout dans 0,5 ml de l'isopropanol et 1 ml d'eau distillée. Le mélange a été agité et
centrifugé. Le surnageant clair obtenu a été introduit dans une colonne analytique Lichrospher
C18 (4,6 x 250 mm) (Merck) préalablement équilibrée avec 40% d'isopropanol/eau. La
colonne a été éluée avec le même mélange de solvant à un débit de 1 ml/min et détection UV
à 220 nm. La fraction correspondante à la partie centrale du pic principal a été collectée et
lyophilisée séparément. Cette opération a été répétée de manière à purifier la quantité totale de
R306 pratiquement pur obtenu ci-dessus.

Le contrôle final de la pureté du R306 a été réalisé par HPLC analytique sur un Waters
système (Millenium32 Workstation, 2690 Separation Module, 996 Photodiode Array
Detector) équipé d’une colonne de LISPRP18-5-3627 (Hichrom Ltd, England) (4,6 x 250
mm) utilisant eau/2-propanol (60:40) comme éluant en mode isocratique avec un débit de 0,7
ml/min et détection UV à 220 nm.

R310 a été également purifié suivant les mêmes étapes que R306. Il a été d’abord passé sur
une colonne semi-préparative Chirobiotic V (10 x 250 mm) préalablement équilibrée avec
34% d'isopropanol/eau et éluée avec le même mélange de solvants en mode isocratique avec
un débit 1 ml/min. L'étape a été répétée 12 fois de manière à purifier 24 mg de R310 brut
total. Après regroupement et lyophilisation des fractions collectées, le produit obtenu a été
passé sur une colonne Lichrospher C18 (4.6 x 250 mm) équilibrée avec de l'eau / isopropanol
(65:35). L’élution a été fait en mode isocratique avec le même mélange de solvant à un débit
de 1 ml/min et à une détection UV à 268 nm. Les fractions issues du pic principal ont été
collectées, regroupées puis lyophilisées.
 34

III.1.5. Elucidation structurale des libiguins

Les pouvoirs rotatoires spécifiques ont été mesurés sur un polarimètre Perkin-Elmer 241 à
20°C et 589nm.

Les spectres RMN ont été enregistrés dans CDCl3 à 25 °C sur un spectromètre Varian UNITY
INOVA 600 MHz équipé d'une sonde cryogénique, avec du TMS comme étalon interne. Les
déplacements chimiques ont été exprimés en ppm (partie par million) et calibrés par rapport
au TMS. Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz (Hz). La multiplicité des
signaux est donnée par les abréviations suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), m
(multiplet), q (quadruplet), et br pour large. L’attribution des signaux des protons et des
carbones a été effectuée à partir des expériences monodimensionnelles 1D (1H, 13C et DEPT-
135) et bidimensionnelle 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) en utilisant le logiciel
TopSpinTM et MeshtrenovaTM.

Les spectres de masses en haute résolution ont été réalisés sur les spectrométries de masse Q-
Tof2 et Perkin Elmer PE SCIEX API 150EX simple quadrupole.

Les spectres UV sont enregistrés dans le MeOH sur un spectrophotomètre Waters system
2690 équipé de photodiodes détecteurs 996 rayons.

III.1.6. Hemisynthèse de libiguins et ses dérivés

Nous avons développé une voie hemisynthétique courte de libiguin A et ses nouveaux
analogues libiguins C, D et E. Cela a été basé sur une aminolyse sélective de la lactone dans
la phragmaline avec MeONHMe et la promotion de la lactonisation par TMSOTf résultant de
l’amide de Weinreb avec le groupe 30-OH après oxydation ou la protection du groupe 17-OH.

a- Hemisynthèse de Libiguin E à partir de phragmaline

La première étape a consisté à ouvrir le cycle lactone, visant à préparer un dérivé d'acide
carboxylique relativement stable qui pourrait être utilisé pour former plus tard dans la
synthèse, le cycle lactone avec le groupe 30-OH. La réaction avec MeONHMe, HCl provoqué
par Me3Al a conduit à l'ouverture du cycle lactone, fournissant un composé intermédiaire 1
amide de Weinreb.
 35

L'étape suivante a consisté à une protection sélective du 17-OH sur le groupe 30-OH dans
l’intermédiaire 1. La protection sélective des groupes 3-OH et 17-OH sur 2-OH et 30-OH a
été obtenu par silylation du composé 1 avec le TESCl. Cela a fourni le composé 2 qui pourrait
être utilisé pour les études de lactonisation. Nous avons constaté que l'hydrolyse de l'ester et
l'amide Weinreb à la fois et le clivage concomitant du groupe TES de la 3-OH ont eu lieu
dans des conditions d'hydrolyse de base fournissant un acide dicarboxylique (composé 3). La
fermeture du cycle lactone et le rétablissement de la fonction ester du composé 3 a été réalisée
avec EDCl comme agent de condensation et MeOH comme solvant de réaction. Cela a
conduit au composé 4, la formule de base de libiguin. Une acétylation sélective du groupe 3-
OH dans le composé 4 a conduit au dérivé 5. Ensuite, la dé-protection du groupe TES dans
l’intermédiaire 5 a été étudiée sous diverses conditions. Un clivage du groupe TES a été
réalisé avec du TFA (trifluoroacétyle) conduit à un dérivé 6 (Libiguin E ou SAE4), nouvel
analogue de libiguins naturel A et B.

b- Hemisynthèse des Libiguins A, C et D à partir de phragmaline

Le retour facile de la réaction de trans-lactonisation de libiguin à la phragmaline lorsque le

groupe 17-OH n'a pas été protégé nous a incité à modifier la voie de l’hemisynthèse de
libiguin A. Nous avons procédé à l’oxydation du groupe 17-OH avant la formation de
l'anneau de lactone avec le groupe 30-OH. Pour préparer un substrat pour l'oxydation, le
groupe 3-OH dans phragmaline a été acylé avec du chlorure d'isobutyryle ou l'anhydride
acétique pour donner des intermédiaires 7a, b. Une aminolyse a été appliquée ensuite avec
MeONHMe HCl et le Me3Al pour provoquer l'ouverture sélective de la lactone dans les
intermédiaires 7a, b ; ce qui donne des amides de Weinreb 8a, b. Les groupes 30-OH dans les
composés 8a, b pressentent une faible réactivité à l'oxydation de Dess-Martin periodinane, qui
ont permis l’oxydation sélective du groupe 17-OH conduisant à des intermédiaires 9a, b. La
fermeture du cycle lactone avec le groupe 30-OH a été réalisée avec succès par activation
avec un acide de Lewis de l’amide de Weinreb. A part plusieurs investigations avec des
acides de Lewis, TMSOTf a donné le meilleur rendement du produit 10a (libiguin C ou
SAE5) et produit 10b (libiguin D ou SAE6), de nouveaux analogues de libiguin naturelle A.
Enfin, acylation du groupe 2-OH dans 10a a été obtenue par TMSOTf, et acylation avec
l’isobutyrique anhydride a donné le composé cible 11 (libiguin A).
 36

III.1.7. Tests pharmacologiques

a- Animaux

Des souris et des rats de deux sexes ont été utilisées pour évaluer les effets biologiques des
extraits et des limonoïdes isolés de Neobeguea mahafalensis.

Souris

Des jeunes souris mâles et femelles qui n’ont pas d’expérience sexuelle, de race SWISS,
âgées de 8 semaines et de poids moyen de 25 ± 2g ont été utilisées. A partir de la quatrième
semaine de leur naissance, ils ont été séparés de leurs parents et ont été casés séparément
selon leur sexe. Ces souris ont été nourries avec un aliment du commerce sous forme de
granulée nutritionnellement équilibré et abreuvées à volonté. Tous les quinze jours, elles ont
reçu un complexe polyvitaminé qui est incorporé dans leur eau d’abreuvage.

Pour les tests des comportements sexuels, les souris femelles ont été traitées avec 50 µg/kg de
β-œstradiol 48 heures avant le test, suivi de 2 mg/kg de progestérone 4 heures et demi avant le
test afin de les rendre réceptives aux souris mâles (McCarthy et coll., 2002).

Rats

Des jeunes rats males et femelles qui n’ont aucune expérience sexuelle de race WISTAR, âgés
de 8 à 12 semaines et de poids entre 250 à 400g ont été utilisés. A partir de cinquième
semaine de leur naissance, ils ont été séparés de leurs parents et ont été casés séparément
selon leur sexe. Les rats ont été nourries avec un aliment du commerce sous forme de
granulée nutritionnellement équilibré et abreuvées à volonté. Tous les quinze jours, ils ont
reçu un complexe polyvitaminé qui est incorporé dans leur eau d’abreuvage.

Pour les tests des comportements sexuels, les femelles ont été traitées avec 50 µg/kg de β-
œstradiol 48 heures avant le test, suivi de 2 mg/kg de progestérone 4 heures et demi avant le
test afin de les rendre réceptives aux mâles.

b- Test de toxicité aigue

Ce test a été effectué dans le but de déterminer et de quantifier les éventuels effets toxiques de
Libiguins chez la souris. Les animaux ont été mis à jeun 24 heures avant le début du test mais
 37

ont reçu de l’eau à volonté, et ont été répartis en quatre lots de 06 souris dont un témoin. Les
extraits RW et R2C ont été administrés par voie orale à des doses de 100mg/kg et 1000mg/kg.

Les signes de toxicité ainsi que le taux de mortalité ont été observés à : 05, 15, 30 minutes et à
01, 02, 03, 06, 24, 47 et 72 heures après l’administration des extraits (Irvin S., 1968)

c- Test sur organe isolé

Prélèvement et montage de l’organe

Le rat a été anesthésié puis sacrifié par section des carotides. L’aorte thoracique a été
rapidement isolée, délicatement nettoyée et débitée transversalement en anneaux de 2 à 3mm
de longueur.

Chaque anneau a été placé dans une cuve à organe isolé de 20ml remplie de liquide
physiologique de Krebs et Henseleit aéré par du carbogène (O2 95% et CO2 5%), avec un pH
de 7,4 à 37°C, dont la composition est la suivante (en mM) : NaCl 118,5 ; NaHCO3 25; KCL
4,75; MgSO4 1,2; CaCl2 1,36; KH2PO4 1,2 et Glucose 11,1

L’anneau a été tendu une première fois à 2 g sous une tension isométrique, puis laissé se
stabiliser pendant deux heures pendant laquelle le contenu de la cuve en solution de Krebs et
Henseleit a été renouvelé toutes les 30 minutes. L’anneau a été de nouveau tendu à 2 g et
stabilisé pendant 30 min. Chaque anneau a été sensibilisé par ajout de solution de Krebs
enrichie en KCl à 100mM dans le bain. Sur les aortes, la présence d’endothélium fonctionnel
est mise en évidence par l’effet relaxant de l’Acétylcholine à 10-6M.

Mise en évidence de l’effet vasorelaxant

La NA à 10-6M incubée dans le bain 30 minutes après la sensibilisation a été utilisée comme
agent contracturant. Quand le plateau de contraction fut atteint, l’extrait aqueux RW à des
concentrations croissantes et cumulatives allant de 0,5mg/ml à 2mg/ml a été injecté dans le
bain.

d- Test de comportement sexuel

Les tests de comportement ont été réalisés dans une chambre sombre à température ambiante
pendant la dernière période de luminosité du jour (15:00) jusqu’à la première période de nuit
 38

(19:00). La durée du test varie suivant le type de tests d’une à quatre heures (Jenkins W. J. et
Becker J. B., 2003).

Pour permettre aux mâles de s’adapter dans l’environnement du test, ils ont été introduits
chacun dans leur case respective (plexi glace de 36 cm x 33 cm x 24 cm de dimension) 30 min
avant les tests.

Les femelles ont été introduites dans chaque cage avec les mâles juste au début du test. Toutes
les femelles sexuellement non réceptives ont été écartées et échangées immédiatement par des
femelles sexuellement actives.

Pour faciliter les observations, des cameras de surveillance et un enregistreur DVR ont été
utilisés pendant les tests de comportement.

Les paramètres suivant ont été observés pour évaluer l’effet aphrodisiaque de l’extrait, des
fractions, des libiguins isolés du Neobeguea mahafalensis ainsi que les libiguins
hemisynthétiques et ses dérivés.

Fréquence de montée (FM) : normalement les souris et les rats mâles montent sur les
femelles par une position postérieure dorsale, et font un mouvement rapide de va et vient de
leur bassin pendant environ 300 millisecondes. Après ils descendent doucement et lèchent
souvent leur partie génitale surtout quand il y avait une intromission.

La montée est définie comme toute tentative de montée ou montée dans une position exacte
(postérieur dorsale) de la souris male sur la souris femelle avec ou sans intromission.

La fréquence de montée a été comptée pendant la période d’observation et servi comme

paramètre de base de la variation de l’activité sexuelle (Muschamp JW et coll., 2007).

Intromission (In) : définie comme toute intromission du pénis de souris ou de rats mâles
dans le vagin de souris ou de rats femelles avec ou sans éjaculation. Après chaque
intromission, les animaux se lèchent leur partie génitale et se reposent. Généralement, les
mâles ne remontent jamais immédiatement après chaque intromission. Il y a toujours un
temps de latence qui varie d’une espèce à d’une autre.

Le temps de latence avant la première intromission a été déterminé.

 39

Ejaculation (Ej) : Après pénétration vaginale profonde, le mâle reste sur la femelle pendant
environ 1 à 3 s. Des contractions rythmiques sont clairement visibles sur la partie postérieure
de l’abdomen du mâle et il s’accroche très fort sur la femelle. Après éjaculation, c’est la
femelle qui part et le mâle reste inactif pédant 4 à 7 minutes et se lèche sa partie génitale
(Whishaw IQ et Kolb B., 2005).

Le temps de latence d’éjaculation et le temps de latence de la prochaine monté ont été

enregistrés.

L’Indice d’efficacité copulatoire (IEC) a été calculé avec la formule suivante :

FIn
Iec   100
FM

d’où FIn est la fréquence d’intromission.

Test de comportement sexuel sur des rats traités avec l’extrait RW

Des rats ont été utilisés pour tester l’effet de l’extrait RW sur le comportement sexuel.
L’extrait a été dissout dans de l’eau distillée et a été administré par voie orale à 60 mg/kg avec
un volume de 10 ml/kg pendant trois jours consécutifs. Le lot contrôle a reçu de l’eau distillée
à 10ml/kg. Les tests ont été effectués à partir de 15 heures de l’après midi les premiers, aux
quatrièmes, septièmes et quatorzièmes jours. Pour les tests des premiers jours (J1), l’extrait a
été administré une heure avant le test. La durée du test a été fixée à quatre heures et le
paramètres à enregistrer est la fréquence de montées (FM) des rats mâles.

Test de comportement sexuel sur des rats traités avec les fractions issues de RW

Des rats ont été utilisés pour cibler la fraction avec laquelle réside l’activité recherchée. La
fraction dichloromethane (R2C) a été dissoute dans de l’huile d’olive et les deux autres (R2W
et R2P) dans de l’eau distillée. Les fractions ont été administrées pendant trois jours par voie
orale à dose unique de 10 mg/kg et de volume 10 ml/kg. Les tests ont été effectués au
quatrième, septième et au quatorzième jour du traitement. La FM pendant quatre heures a été
enregistrée pour évaluer l’activité aphrodisiaque des fractions.
 40

Test de comportement sexuel sur des souris traitées avec de R2C selon différentes voies à
des doses croissantes

Pour réduire le coût des expérimentations, nous avons utilisé des souris pour les tests
bioguidés afin d’isoler le principe actif responsable de l’activité dans la fraction R2C.

Dans un premier temps, nous avons testé l’effet du RW à 60 mg/kg administré par voie orale
pendant trois jours consécutifs chez les souris mâles. Les tests ont été effectués au quatrième,
septième et quatorzième jour. La FM pendant quatre heures a été enregistrée et comparée par
rapport au lot contrôle qui a reçu de l’eau distillée 10 ml/kg.

Pour optimiser l’effet et savoir la meilleur voie d’administration, nous avons comparé l’effet
de R2C administré par voie orale et par voie sous cutanée. Trois lots de 6 souris ont été
utilisés. Le premier lot a été traité par voie orale avec R2C à 4mg/kg pendant trois jours. La
même dose de R2C a été administrée pendant trois jours par voie sous-cutanée pour un
deuxième lot, et le lot témoin a reçu uniquement de l’huile d’olive par voie sous-cutanée.

Les volumes administrés ont été fixés à 1 ml/kg pour la voie sous-cutanée et 10 ml/kg pour la
voie orale.

Une troisième série de test de comportement a été réalisée pour évaluer l’activité en fonction
de dose de la fraction R2C. Les souris mâles ont été traitées par des doses croissantes de 0,4 -
4 et 40 mg/kg pendant trois jours consécutifs par deux voies différentes (sous-cutanée et
orale). Le lot témoin a reçu de l’huile d’olive par voie sous-cutanée. Les volumes administrés
ont été fixés à 1 ml/kg pour la voie sous-cutanée et de 10 ml/kg pour la voie orale.

Dans chaque série de test, la FM pendant quatre heures a été enregistrée et comparée par
rapport au lot contrôle.

Test de comportement sexuel sur des souris traitées avec les fractions issues de R2C

Trois fractions issues de R2C (RA, RB et RC) ont été testées sur des souris mâles avec une
dose de 4mg/kg et un volume de 1ml/kg pendant trois jours consécutifs par voie sous-cutanée.
La FM pendant quatre heures a été enregistré au quatrième, septième et quatorzième jour. Le
lot témoin a reçu de l’huile d’olive par voie sous-cutanée à un volume de 1ml/kg pendant trois
jours.
 41

Test de comportement sexuel sur des souris traitées avec les sous-fractions de RB

R3004 est l’une des fractions issue du fractionnement chromatographique de RB. Elle a été
dissoute dans de l’huile d’olive et a été administrée par voie sous cutanée et voie orale chez
des souris mâles à 4 mg/kg, pendant trois jours consécutifs. La FM pendant trois heures a été
au enregistrée au quatrième, septième et quatorzième jour.

Test de comportement sexuel sur des souris traitées avec les fractions issues de R3004

Trois fractions issues de R3004 (R303, R306 et R310) ont été testées sur des souris mâles
avec une dose de 0,4 mg/kg et un volume de 1ml/kg pendant trois jours consécutifs par voie
sous-cutanée. La FM pendant trois heures a été enregistrée au quatrième, septième et
quatorzième jour. Le lot témoin a reçu de l’huile d’olive par voie sous-cutanée à un volume de
1ml/kg pendant trois jours.

Test de comportement sexuel sur des souris traitées avec de R306 cristallisé aux 4ème et 7ème
jours du traitement à des doses croissantes de 0,004 à 0,4 mg/kg

R306 cristallisé a été dissout dans de l’huile d’olive et a été administré sous cutanée à 0,004;
0,04; 0,4 mg/kg et à 1 ml/kg pendant trois jours consécutifs chez les souris mâles. La FM
pendant trois heures a été enregistrée au quatrième, septième, quatorzième et vingt-et-unième
jour. Le lot témoin a reçu de l’huile d’olive par voie sous-cutanée à un volume de 1ml/kg
pendant trois jours.

Test de comportement sexuel sur des rats traités avec le produit hémisynthétique dénommé
SAE5 (libiguin C)

SAE5 a été dissout dans de l’huile d’olive et a été administré sous cutanée à 0,004; 0,04; 0,4
mg/kg et à 1 ml/kg pendant trois jours consécutifs chez les rats mâles. Le lot témoin a reçu de
l’huile d’olive par voie sous-cutanée à un volume de 1ml/kg pendant trois jours. La FM
pendant trois heures a été enregistrée au quatrième, septième et quatorzième jour.
 42

III.1.9. Pharmacocinétique et étude préliminaire du mécanisme d’action de libiguin C

(SAE5).

a- Etude pharmacocinétique de la libiguin C administré à dose unique par voie intra-

veineuse chez les rats

A cause de sa propriété, libiguin C a été préparée dans 10% de DMA (Dimethylacétamide),

10% de propylène glycol, 30% de HPBCD (hydroxypropyl--cyclodextrine) et 50% de
solution physiologique normale. Le pH final est de 5.

Trois rats bien nourris ont été utilisés et ont reçus chacun 5 mg/kg de libiguin C par voie
intraveineuse.

Les échantillons du sang ont été collectés au niveau de la veine caudale dans des tubes à
centrifugeuse étiquetées contenant un anticoagulant (EDTA) à 0,08 ; 0,15 ; 0,50, 1,00 et 1,50
heures. Les échantillons ont été centrifugés à 4000 rpm à 4°C pendant 10 minutes. Les
plasmas ont été transmis dans des tubes étiquetées et congelés dans un azote liquide à -80°C
avant l’analyse.

Les paramètres pharmacocinétiques illustrés dans la figure ci-dessous ont été calculés :

C0

t1/2

Figure 36 : Les différents paramètres pharmacocinétiques

 43

Le niveau d’exposition AUC ou SSC0-t (en gh/L) :

Le volume de distribution Vd (en litre) :

D’où D : dose administrée

(mg/kg), C0 : concentration
plasmatique initiale (mg/L).

La clairance Cl (L/h) :

D’où D : dose administrée

(mg/kg), AUC : niveau
d’exposition (gh/L).

La demi-vie t1/2 (h):

D’où Vd : Volume
de distribution (L),
Cl : clairance (L/h).

b- Etude cinétique in vivo de la libiguin C chez les rats

11
Les études cinétiques et pharmacodynamiques ont été effectuées en utilisant un traceur C-
libiguin et la technique de tomographie par émission de positons (TEP) (Antoni G et coll.,
2009).

11
Le marquage de la libiguin avec un C a été fait à partir d’un précurseur que nous avons
nommé libiguin H ou SAE1 un intermédiaire inactif dans l’hémisynthèse. Le processus a été
effectué en deux étapes. La première consiste une méthylation par [11C]méthyl triflate. Le
second, une estérification d’un groupement alcool libre de l’intermédiaire par un acide
isobutyrique anhydre (Fig. 37).
 44

O
O

OH
O
O11CH3
O
O
O

O 1. base/11CH3Tf O
O
O O
2. isobutyric acid anhydride O
O O
O O

HO OH O
OH

O
libiguin H libiguin [11C]-C

Figure 37 : Marquage de la libiguin avec un 11C

Des rats pesant 400 ± 12g, ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (3%) dans un mélange
50/50% d'oxygène et d'air. Un cathéter a été placé dans une veine caudale latérale. L'animal a
été ensuite placé sur un lit-caméra chaud et recouvert de plastique pour réduire la perte de la
11
température corporelle pendant l'expérience. La C-Libiguin a été administrée par IV en
bolus dans la veine caudale de l’animal. L'acquisition des données a commencé
simultanément et a duré 60 min. La respiration de l’animal a été surveillée pendant l'étude.
L'imagerie a été effectuée avec un scanner µTEP/TC (GE Triumph animal). Les images ont
été analysées en utilisant le logiciel PMOD (PMOD Technologies Ltd., Zürich, Suisse).

c- Etude de la biodistribution de la libiguin C chez les rats

Des rats pesant 400 ± 12 g, ont été utilisés pour les mesures ex-vivo de la distribution du
11
produit dans les organes. La C-libiguin à 10 MBq a été administré par voie IV en bolus.
Après 10, 30 et 60 min, respectivement, les rats ont été sacrifiés par exposition au gaz
carbonique (CO2) pendant 1-2 min, suivie d’une ponction cardiaque pour enlever le sang.
Immédiatement après, les organes cibles ont été excisés, pesés et leur radioactivité a été
mesurée avec un compteur à scintillation liquide à détecteur NaI (TI). La correction du temps
mort et la désintégration de radioactivité ont été appliquées et les valeurs d'absorption
d'organes ont été calculées comme Valeur Standard d’Absorption (VSA)
 45

ACT ( Bq g )
VSA 
DOSE ( Bq ) P ( g )

D’où ACT : la concentration de la radioactivité corrigée par la désintégration

physique ( Bq g ) ,

DOSE : la quantité administrée de la radioactivité (Bq)

P : Poids de rat (g)

Les organes analysés sont : le sang, le cœur, le poumon, le foie, le pancréas, la rate, les
glandes surrénales, les reins, les intestins (avec et sans contenu, et le gros intestin), la vessie,
des testicules, les muscles, les os (fémur), et le cerveau.

d- Etude in vitro de la liaison libiguin-récepteur

La liaison de 11C-libiguin a été étudiée chez le rat et dans des homogénats de tissus de cerveau
11
de rat. La liaison spécifique et non spécifique de C-libiguins a été évaluée en utilisant de
11
libiguin non marquée en tant que substance de blocage. La liaison de C-libiguin à des
particules des homogénats de cerveau et des fractions cytosoliques a été étudiée pour obtenir
un aperçu préliminaire sur la localisation subcellulaire du récepteur de libiguin (Bullitt E,
1990)
 46

III.2. DECOUVERTE FORTUITE DE DODOGUIN

III.2.1. Extraction au dichlorométhane des écorces de racines de Neobeguea

mahafalensis

La poudre des écorces de racines sèches pesant 3 kg a été macérée dans 5 litres de
dichloromethane (DCM) pendant 8 heures sous une forte agitation et à température ambiante.
La solution a été filtrée et le filtrat a été macéré une seconde fois dans 3 litres de DCM avec
les mêmes conditions.

Les phases organiques ont été rassemblées et évaporées à sec sous une pression réduite à
40°C sur un évaporateur rotatif BUCHI. L’extrait obtenu a été nommé « Extrait DCM »

III.2.2. Fractionnement chromatographique de l’extrait DCM

L’extrait DCM pesant 53 g a été soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice
utilisant une colonne de 60 cm de longueur et 10 cm de diamètre rempli de 1kg de gel de
silice (Merk).

L’extrait a été déposé sur le gel de silice après dissolution dans un minimum de volume de
DCM, et a été élué d’une manière isocratique par un mélange volume/volume
d’Hexane/Acétate d’éthyle 75/25. Les fractions éluées ont été collectées dans des tubes de
verre de 25 ml chacune, à partir de tube 1 jusqu’au tube 100. Chaque 10ème de fractions ont
été analysées sur une chromatographie sur couche mince (CCM) utilisant l’Hexane/Acétate
70/30 comme phase mobile et la plaque a été révélée à l’aide d’une lampe à UV à 254 et 366
nm et de l’acide phosphomolibdique comme réactif révélateur. Les fractions 78-85 qui
contiennent le Dodoguin ont été rassemblées et évaporées à 40 °C sous une pression réduite à
l’aide d’un évaporateur rotatif. Cette fraction a été nommée « Dormir ».

III.2.3. Isolement de dodoguin

Utilisant un mélange de DCM et de concentration croissante d’acétone (successivement 1, 2,

3, 4 et 5%) comme éluant, 1g de Dormir a été passé une seconde fois sur une chromatographie
sur colonne de gel de silice de 40 cm de hauteur et 1 cm de diamètre. Les fractions éluées ont
été collectées dans des tubes de verre de 25 ml chacune. Chaque 10ème de fractions ont été
analysées sur une CCM utilisant l’Hexane/Acétate (70/30) et acetone/DCM (5/95) comme
 47

phase mobile et la plaque a été révélée à l’aide d’une lampe à UV à 254 et 366 nm et de
l’acide phosphomolibdique comme réactif. Les fractions 31-50 qui contiennent le dodoguin A
ont été rassemblées et évaporées sous une pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif à
40 °C.

III.2.4. Elucidation de la structure de dodoguin

a- Analyse de dodoguin sur HPLC

Le contrôle final de la pureté du dodoguin a été effectué par HPLC analytique sur un Waters
système (Millenium32 Workstation, 2690 Separation Module, 996 Photodiode Array
Detector) équipé d’une colonne de LISPRP18-5-3627 (Hichrom Ltd, England) (4,6 x 250
mm) utilisant acetonitrile/eau avec un gradient allant de 55 à 100% d’acetonitrile comme
éluant avec un débit de 0,4 ml / min et détection UV à 220 nm.

b- Analyse par CL/SM et détermination de la masse du dodoguin

Les spectres de masses en haute résolution ont été réalisés sur une spectrométrie de masse Q-
Tof2 et CL/SM sur une spectrométrie de masse Perkin Elmer PE SCIEX API 150EX simple
quadrupole.

III.2.5. Test d’effet inducteur du sommeil de dodoguin

Les tests d’effet inducteur du sommeil ont été fait dans une chambre sombre à température
ambiante pendant la dernière période de luminosité du jour (15:00) jusqu’à la première
période de nuit (19:00) (Jenkins W. J. et Becker J. B., 2003). Le test a duré une heure.

Des souris de même sexe et de même âge de 8 semaines ont été utilisées.

Les produits ont été dissous dans de l’huile d’olive et ont été injectés par voie sous cutanée
avec les doses 1, 3, 10 mg/kg. Les souris ont été reparties en cinq lots de six souris. Chaque
lot a été placé dans une cage en plexi glace de 36 cm x 33 cm x 24 cm de dimension. Le lot
contrôle a été traité avec de l’huile d’olive avec un volume de 1 ml/kg. Le Valium Roche
10mg/2ml injectable a été utilisé comme produit de référence et a été administré par voie
intra-péritonéale avec une dose de 0,1 mg/kg.

Les paramètres suivant ont été enregistrés pour évaluer l’effet inducteur du sommeil de la
dodoguin.
 48

Ataxie : incoordinations motrices

 Temps du premier signe de l’ataxie après injection

 Nombre de l’ataxie pendant une heure

 Temps du dernier signe d’ataxie

Grooming : léchage, grattage, lavage du visage

 Nombre du grooming pendant une heure

Prayer : les deux pattes antérieures se collent comme ci le rongeur allait prier

 Temps de première prayer

 Temps de dernier prayer

 Total de nombre de prière pour chaque souris

Sommeil :

 Temps de commencement du sommeil

 Temps de fin du sommeil

 Durée du sommeil de chaque souris

 49

III.3. DECOUVERTE FORTUITE DE GIDRAGUIN

Gidraguin ou LG1725 est un produit intermédiaire de synthèse de Libiguin.

Le test de comportement pour évaluer l’agressivité des souris suit le même protocole que
celui du test de comportement sexuel.

Gidraguin a été dissout dans de l’huile d’olive et administré par voie sous-cutanée à la dose
0,4 mg/kg et un volume de 1ml/kg. La durée du test a été fixée à une heure. La fréquence de
montées (FM) et la fréquence d’agressivité (FA) ont été les paramètres à enregistrer.

III.4. ANALYSE DES RESULTATS

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± s.e.d. (Standard error deviation ou écart-type
réduit)

Les données ont été analysées avec le test paramétrique « t » de Student avec un degré de
signification de p<0.05.
 i

Chapitre IV : RESULTATS
 50

IV.1. ETHNOBOTANIQUE

D’après les enquêtes menées auprès des guérisseurs, Neobeguea mahafalensis est utilisé
essentiellement pour restaurer la fonction érectile défaillante chez les hommes âgés. Ils
utilisent surtout l’écorce de tige sous forme de décoction (Fig. 38).

La plante est connue sous de multiples noms vernaculaires tels que Handy, Hazolava,
Bemahova, Fipy et se vend sur tous les étalages des herboristes et au bord de la route du Sud
de Madagascar (Fig. 39).

Les populations locales utilisent aussi l’écorce de Neobeguea mahafalensis pour traiter les
maux de dos, les douleurs rhumatismale et lombaire. Selon la prescription des guérisseurs,
l’écorce est toujours mélangée avec d’autres plantes pour traiter l’impuissance. Voici le
cocktail le plus courant dans le sud de Madagascar : dans un litre d’eau, mélanger les
éléments suivants : une poignée d’écorces de tiges fraiches râpées de Katrafay (Cedrelopsis
grevei), une poignée d’écorces de tiges fraiches râpées de Handy (Neobeguea mahafalensis),
3 ou 4 pulpes de fruits de Kily (Tamarindus indicus). Prendre 3 fois par jour, matin, midi et
soir avant le repas 250 ml du liquide de décantation.

Au cours de l’enquête ethnobotanique, Mbehotoly, l’un des guérisseurs qui nous a donné les
informations a parlé de la racine. Il a dit que « peut être l’écorce de racine marche aussi pour
le traitement de l’impuissance »

Figure 38 : Préparation de l’écorce de Neobeguea mahafalensis

 51

Figure 39 : Etalage des remèdes traditionnels au bord des routes du Sud de Madagascar

IV.2. BOTANIQUE

Neobeguea mahafalensis est un arbre atteignant 12 à 20 m de hauteur et 40 cm de diamètre

(Fig. 40). Il plafonne le plus souvent à 30 – 35 cm de diamètre. Son fût est cylindrique à
section vaguement triangulaire, portant des traces des cannelures, souvent incliné avec bois de
réaction. L’écorce assez lisse, maculée dans les tons gris verdâtres, parfois oranges porte des
écailles planes et soudées se détachant irrégulièrement, parcourue de fissures longitudinales
sinueuses, fines et espacées, amères au goût. L’houppier est irrégulier avec des branches
tortueuses. Les feuilles sont alternes, souvent groupées au sommet des rameaux,
imparipennées, de 145 à 220 mm, comptant 7 – 13 folioles opposées, subopposées ou
alternes, de 40-60 sur 16-25 mm, pétiolées, à bord denticulés, à sommet aigu (Fig. 41). Son
inflorescence est en panicules lâches et pauciflores avec des fleurs petites, 4 mères,
unisexuées (Fig. 42). La feuillaison est en mi-août et mi-avril. La floraison est en début
octobre à début novembre et la fructification est en fin juin et mi-juillet.

Cette plante présente une floraison et fructification régulière. La récolte des graines se fait
avant la déhiscence en fin de mai à mi-juin par gaulage ou par lancement de bout de bois sur
un groupe de fruit. Le fruit est en capsule ligneuse, trigone, apicule et longues de 3 à 4 cm ;
les graines sont ailées. Les capsules sont suffisamment mûres lorsqu’ elles sont de couleur
marron (sèches) et commencent à se fissurer (Fig. 43).
 52

Figure 40 : Neobeguea mahafalensis (MELIACEA) (Photo Ramse)

Figure 41 : Partie aérienne de Neobeguea mahafalensis (Photo Ramse)

 53

Figure 42 : Planche de Neobeguea mahafalensis (JF Leroy, 1976)

 54

Figure 43 : Fruits de Neobeguea mahafalensis (Photo Ramse)

IV.3. PHYTOCHIMIE DES LIBIGUINS

IV.3.1. Extraction aqueuse

Par rapport au poids initial de la poudre de racine de Neobeguea mahafalensis, RW représente

un rendement de 37%. Il s’agit d’une poudre marron avec un gout très amer.

IV.3.2. Extraction chloroformique

Les résultats sont rapportés sur le schéma dans la figure 44.

Figure 44 : Schéma de la procedure de fractionnement de RW

La fraction active R2C représente 2,1% du poids total de RW. Il s’agit une poudre duveteuse
de couleur marron clair et d’un gout amer.
 55

Figure 45 : Schéma de la procédure d’isolement et purification des libiguins

 56

IV.3.3. Isolement et purification des libiguins

Les procédures et résultats sont rapportés sur le schéma dans la figure 45.

a- Fractionnement de R2C

A partir de 190mg de R2C, trois fractions ont été obtenues avec leur poids respectifs RA (53,1
mg), RB (83,9 mg) et RC (54,6 mg). Leurs profiles chromatographiques sont rapportés dans
la figure ci-dessous :

Figure 46 : Profiles HPLC de RA, RB, RC et R2C utilisant une colonne LiChroprep RP-18
(4,6 x 250 mm) éluée avec un gradient linéaire de 20% à 80% d’acétonitrile dans 5mM
d’acétate d’ammonium pendant 60 min, débit 1 ml/min, détection UV à 260 nm.
 57

b- Isolement des Libiguins

La quantité totale de R2C obtenu à partir de 772 g d’écorce de racine de Neobeguea

mahafalensis est de 6,68g. Parmi les 13 fractions présentant le même profil
chromatographique que RB, seul la fraction R3004 a une activité qui stimule la fonction
érectile. Des fractionnements supplémentaires et test bio-guidés ont conduit à l’isolement des
produits purs dénommés R303 (13 mg), R306 (20 mg) et R310 (24 mg). Après purification
ultime, le produit R303 a perdu son activité.

La première étape de purification du R306 par la colonne semi-préparative chirale Chirobiotic

V (10 x 250 mm) a donné 12mg de poudre blanche duveteuse pratiquement pur. La deuxième
étape par la colonne analytique Lichrospher C18 (4,6 x 250 mm) a conduit à une poudre
blanche duveteuse de poids total de 7,6 mg. La pureté finale du R306 est vérifiée par HPLC
(Fig. 47) et est dépassé de 99,5% et le produit que nous avons obtenu a été nommé libiguin A.
Il présente un pic de base avec un temps de rétention à 9,957 min. Son absorption maximale
est située à 198, 215 et 261 nm (Fig. 48).
 58

Figure 47 : Profil chromatographique de R306 sur LISPRP 18-5-3627 utilisant comme éluant
Isopropanol/eau (40:60) avec un débit de 0.7 ml/min;et detéction UV à 220 nm.

Figure 48 : Spectre UV de R306. Absorption maximale est située à 198, 215 et 261 nm
 59

La purification de R310 en deux étapes successives a donné un produit présentant un seul pic
essentiellement de R310. Au total 14 mg a été obtenu sous forme d'une poudre blanche. Le
produit ainsi isolé a été nommé libiguin B. Nous avons constaté qu’au repos à température
ambiante, et même à -20 °C et à -80 °C, R310 (libiguin B) n’est pas stable, mais se présenté
en deux formes interconvertibles, qui ont été dectecté sur HPLC analytique Les temps
d'élution des deux isomères sont de 11,8 et 16,4 min (respectivement R310B et R310A). (Fig.
49)
Leurs absorptions maximales sont à 208 et 269 nm pour R310A et à 209 nm pour R310B
(Fig. 50).

Figure 49 : Profil chromatographique de R310A et de R310B sur LISPRP 18-5-3627 utilisant

comme éluant Isopropanol/eau (40:60) avec un débit de 0.7 ml/min;et détection à 220 nm.
 60

Figure 50 : Spectres UV de R310A et de R310B. Absorption maximale à 208 et 269 nm pour

R310A et à 209 nm pour R310B.
 61

IV.3.4. Elucidation des structures des libiguins

En mode positif, le spectre de masse à haute résolution de R306 ou libiguin A indique un pic
de base [M+H]+ à m/z 699.2991 (calculé. 699,3017) correspondant à la formule brute
C37H46O13, ce qui implique15 degrés d’insaturation. Le spectre UV (max 198, 215 et 261 nm ;
Fig. 47) est caractéristique d’un chromophore cétonique furyle (Scott A I, 1964).

Les données de spectre RMN 1H et 13

C (Fig. 51 et 52) indiquent que sept des unités
d’insaturation correspondent à deux doubles liaisons et cinq groupes carbonyles. Les degrés
d'insaturation restant sont donc attribués à un bloc de structure octacyclique.

Les données RMN 1H dans le tableau 1 montrent en évidence que la structure de libiguin A
comprend trois groupements méthyles correspondant respectivement aux singulets à H 0.9,
H 1.10 et H 1.48. De plus, deux doublets de6H chacun déterminés par intégration résonant à
H 1.16 et à H 1.19 (J = 6.9Hz) ont été attribués à deux groupes isopropyle.

Sur le spectre HMBC, les protons du groupe méthyle apparaissant à H 1.48 montrent des
corrélations au groupe carbonyle C-17 et à un atome de carbone quaternaire à C 51.6, qui est
attribué à C-13, indiquant que l'unité furyle cétone est fixée à C-13. Le proton du méthyle
attribué à Me-18 présente également une tache de corrélation avec un méthine C 49.1,
attribué à C-14, dont le signal du proton apparaît comme doublet de doublet à H 1.96 (J = 8,1,
1,7Hz).

1
L'unité furyle cétone a été confirmée par RMN H avec trois doublets de doublets
caractéristiques d'un groupe furane 3-substitué à H8.06 (J = 1.4, 0.8Hz), H 6.79 (J = 1.9,
0.8Hz), et H7.41 (J = 1.9, 1.4Hz) et sont attribués respectivement à H-21, H-22 et H-23. Elle
a été également confirmée par les données HMBC dans lesquelles H-21 et H-22 ont montré
trois liaisons de connectivité avec le carbonyle C-17 à C199.0.
 62

Figure 51 : a) Spectre proton de R306, CDCl3, RMN 600 MHz, 250C

b) Spectre RMN 1H de R306 élargi entre 0,8 et 1,75 ppm

 63

Figure 52 : Spectre RMN 13C de R306, CDCl3, RMN 600 MHz, 250C

Une analyse complète des connectivités sur les spectres HMBC observés avec ce proton H-14
est alors essentielle pour construire la plupart des séquences de la molécule comprenant les
cycles C-D (Fig. 53). En effet, en plus des corrélations évidentes avec C-13 et C-18, H-14
montre une corrélation avec le carbone de méthylène à c 28.4 attribué à C-15, dont les
protons affichent un couplage vicinal avec H-14. Me-18 et H-14 montrent des corrélations
avec un carbone de méthylène à C 31.4, attribué à C-12. Les protons de CH2-12 sont apparus
comme multiplet, ce qui suggère la présence d'un carbone de méthylène adjacent imputable à
C-11.

Une analyse minutieuse des corrélations entre H-12 et un carbone à C 83.7, entre H-11 et H-
14 et des carbones au C 83.7 et C 79.7, et entre H-15 et un carbone à C 79.7 permet
l'identification de deux atomes de carbone quaternaires oxygénés attribués au C-8 (C 79.7) et
C-9 (C 83.7). H-14 en outre montre des corrélations avec un groupe carbonyle à C 169.0, et
un méthine à C 74.8. De son côté, le proton singulet de la méthine facilement identifiable à
H 5.87, correlle avec le groupe carbonyle à C 169.0 et C-8. Ce proton méthine est attribué à
H-30, qui est en outre en corrélation avec un carbone quaternaire oxygéné à C83.3, attribuée
à C-2.
 64

L'observation de ces corrélations, ainsi que celles déjà mentionnées ci-dessus (H-14  C-8,
C-15) a permis la mise en place de l’intégrité de structure du cycle C-D, qui comprend la
présence de l’anneau C-16 /30 δ-lactone.

Les protons du deuxième groupe méthyle à H 1.10 corrélés à C-9 sont attribués au Me-19. Ils
montrent également des corrélations à un atome de carbone quaternaire à C 46.6, attribué au
C-10, et un carbone quaternaire oxygéné à C 84.4. H-30 montre une corrélation à ce dernier
carbone, attribué à C-1. Le signal du proton du groupe méthyle à H 1.62 attribué à Me-32 et
le signal du carbone à C 118.6 attribué à C-31 sont caractéristiques d'une unité orthoacétate.
Bien que la position du groupe orthoacétate n'a pu être déterminée directement par les spectre
HMBC, on le trouve aux positions 1, 8 et 9 sur la base des déplacements chimiques de C-1, C-
8 et C-9 trouvés habituellement dans le phragmaline limonoïde1,8,9 orthoacétate (Saad MMG
et coll., 2003).

L'observation d'une paire caractéristique de doublets couplés au H 1.80 et H 2.00 (J =

11.1Hz), imputable aux protons méthylène-29, indique un type de phragmaline aux ponts 4,
29, 1 (Saad MMG et coll., 2003). Le dernier singulet méthyle au H 0.9 montre des
corrélations avec un atome de carbone quaternaire à C 46.3, à un atome de carbone de
méthine à C 35.9, et à un atome de carbone quaternaire oxygéné à C 83.3, attribuées
respectivement au C-4, C-5 et C-3,. Les deux protons méthines H-5 (H 2.54, dd, J = 9.8,
2.4Hz) et H-3 (H 5.37, s) en pivot confirment la structure et l'intégrité d’une unité de
norbornane et le substituant attaché. En plus des corrélations avec les carbones C-9 et C-19,
H-5 montre des corrélations aux C-1, C-29, C-4 et C-3, tandis que H-3 corrèle aux C-1, C-2,
et C-29. En outre, H-5 montre des corrélations avec un carbone de méthylène à C 33.6
attribuable au C-6 et un groupe carbonyle à C 172.3, ce qui indique que le groupe
carbométhoxy est attaché à C-6 comme observé dans plusieurs limonoïdes phragmaline. De
même, le groupe d’isobutyroxyl est attaché au C-3 par la corrélation entre H-3 et le carbonyle
à C 175.8.
 65

Figure 53 : a) Spectre HMBC de R306, RMN 600 MHz, indanone, 250C

b) Spectre HMBC élargi de R306 entre 6,3 à 8,8 ppm pour le proton et
entre 100 et 150 pour le carbone 13.
 66

Les clés des corrélations HMBC sont rapportées dans la Figure 54.

Figure 54 : Corrélations HMBC de libiguin A

La configuration relative de libiguin A a été déterminée à partir des données NOESY (Fig. 55
et 56). La rigidité de la partie orthoacétate donne une conformation bateau pour le cycle B. En
outre, la rigidité du squelette norbornane assemblé au cycle B impose une orientation α pour
le Me-19 et le groupe 2-isobutyroxyl. Ce dernier point est corroboré par la présence de taches
de corrélation NOESY entre les groupes méthyles de l'isobutyrate et Me-32. Les taches de
corrélations du Me-19/H-29a et H-29a/H-3 indiquent que H-3 adopte une orientation α. La
corrélation NOESY de H-29b/Me-28, Me-28/H-5, H-5/H-30 et H-30/H-11b indique que Me-
28, H-5 et H-30 présentent une orientation β. L'observation des taches de corrélation entre H-
12a/Me-18, Me-18/H-14, et Me-18/H-15 indique une orientation α pour Me-18 et H-14.
Libiguin A suit donc étroitement les orientations stéréochimiques typiques pour les
phragmalines limonoïdes orthoesters.
 67

Figure 55 : a) Spectre NOESY de R306, RMN 600 MHz, DMSO, 250C

b) Spectre NOESY élargi de R306 entre 1,95 à 2,95 ppm

 68

a
a

b a

Figure 56 : Données NOESY : taches de corrélation de R306 ou libiguin A.

L’interprétation concertée des données RMN 1D et 2D de la libiguin a suggéré que cette

molécule appartient à la série des limonoïdes type phragmaline1,8,9-orthoacétate, et par la
suite a conduit à l'attribution de la structure (1) pour ce composé (Fig. 57).
 69

Figure 57 : Structure de libiguin A (1) et libiguin B avec ses énol- (2a) et céto- (2b) formes

Les déplacements chimiques des protons et des carbones sont récapitulés dans le tableau 1.

Tableau 1 : Spectres RMN 1H (600 MHz) et 13

C (150.9 MHz) de R306, R310A et R310B
dans CDCl3
No R306 R310A (céto) R310B (énol)
(1H), multipl (J en Hz) (13C) (1H), multipl (J en Hz) (13C) (1H), multipl (J en Hz) (13C)
1 - 84.4 - 84.0 - 84.0
2 - 83.3 - 78.2 - 77.7
3 5.37, s 80.4 4.83, s 82.2 4.84, s 82.9
4 - 46.2 - 45.5 - 45.4
5 2.54, dd (2.4, 9.8) 35.9 2.84, dd (3.2, 8.8) 37.1 3.00, dd (2.3, 9.7) 37.0
6 pro-R 2.08, dd (9.8, 15.5) 33.6 2.37, dd (3.2, 15.5) 34.1 2.26, dd (3.2, 16.7) 33.7
pro-S 2.32, dd (2.4, 15.5) 2.44, dd (8.8, 15.5) 2.46, dd (9.7, 16.7)
 70

7 - 172.3 - 172.6 - 172.5

8 - 79.7 - 79.4 - 80.5
9 - 83.7 - 83.8 - 84.8
10 - 46.6 - 46.0 - 45.9
11 pro-R 1.39, m 25.0 1.96, m 24.3 1.92, m 23.3
pro-S 2.17, m 2.19, m 2.03, m
12 pro-R 1.83, m 31.4 1.50, m 32.0 1.50, m 30.9
pro-S 2.11, m 1.42, m 1.16, m
13 - 51.6 - 38.7 - 39.8
14 1.96, dd (1.7, 8,1) 49.1 2.79, d (0.8) 50.6 2.66, s 44.8
15 2.71, 2.73, m 28.4 3.80, d (0.8) 52.1 - 90.8
16 - 169.0 - 167.2 - 170.5
17 - 199.0 6.00, s 69.6 5.84, s 70.6
18 1.48, s 24.5 1.18, s 21.4 1.22, s 21.6
19 1.10, s 16.0 1.15, s 15.3 1.15, s 15.3
20 - 124.6 - 121.4 - 122.1
21 8.06, dd (1.4, 0.8) 147.1 7.55, dd (1.7, 0.8) 141.3 7.49, dd (1.7, 0.8) 140.7
22 6.79, dd (1.9, 0.8) 110.1 6.35, dd (2.0, 0.8) 109.3 6.39, dd (2.0, 0.8) 109.7
23 7.41, dd (1.9, 1.4) 143.4 7.35, dd (2.0, 1.7) 142.8 7.32, dd (2.0, 1.7) 142.5
28 0.9, s 15.0 0.96, s 14.8 0.95, s 14.6
29 pro-R 2.00 (11.1) 40.8 1.96, d (10.9) 39.6 1.92, d (10.9) 39.4
pro-S 1.80 (11.1) 1.79, d (10.9) 1.81, d (10.9)
30 5.87, s 74.8 5.25, s 75.8 5.32, s 74.4
31 - 118.6 - 118.6 - 118.5
32 1.62, s 21.3 1.55, s 20.7 1.57, s 20.9
CH3O- 3.51, s 51.7 3.73, s 52.0 3.69, s 51.9
2-isopropylcarboxyl- 2-acetyl- 2-acetyl-
C=O - 175.3 C=O - 170.6 C=O - 170.4
CH 2.59, septet (6.9) 35.1 CH3 2.22, s 20.3 CH3 2.27, s 20.5
CH3 1.19, d (6.9) 19.0
1.16, d (6.9) 18.5 17-acetyl- 17-acetyl-
3-isopropylcarboxyl- C=O - 169.5 C=O - 169.3
C=O - 175.8 CH3 2.01, s 21.1 CH3 1.97, s 20.5
CH 2.78, septet (7.4) 34.8
CH3 1.38, d (7.4) 18.6 15 -C(O)CH(CH3)2 15 =C(OH)CH(CH3)2
1.37, d (7.4) 18.9 C=O - 208.4 =C(OH) 13.84 182.8
CH 3.15, septet (6.8) 37.9 CH 2.94, septet (6.8) 29.9
CH3 1.16, d (6.8) 19.5 CH3 1.26, d (6.8) 18.2
1.04, d (6.8) 18.9 1.12, d (6.8) 20.4
 71

La formule moléculaire de R310 ou libiguin B est C37H46O14 basée sur son pic d'ion
moléculaire obtenu par SMHR à m/z 715,2953 (M+H)+ (calculé. 715,2967).

Libiguin B comprend deux formes interconvertibles (énol et céto) (Fig. 54) après une
séparation sur HPLC analytique (Fig. 49). Le spectre UV (Fig. 50) de la forme énol (2a) a
donné deux maximum d'absorption à 191 nm et 209 nm, et celui de la forme céto (2b) a donné
deux maximum d'absorption à 208 nm et 269 nm, ce qui indiquent la présence d'un groupe
furanyle et un énolyse 1,3-dicarbonylchromophore (Scott AI. 1964). L'examen préliminaire des
spectres RMN 1H et 13C de libiguin B suggère qu'il est un phragmaline limonoïde étroitement
liée à libiguin A. Toutefois, un dédoublement de signaux est observé qui indique qu’il a un
mélange de deux isomères dans un environ 1:2 ratio.

Lorsque les spectres RMN 1H de libiguin B (Fig. 58) est comparée à ceux de libiguin A, la
présence d'un singulet dédoublé supplémentaire à H 5.84 et H 6.00 est évidente, et aussi d'un
singulet à H 13.84, ainsi que deux singulets dédoublés méthyles au H 1.97 et H 2.01,
attribuable à des groupes acétyle. En outre, lors de la comparaison des spectres RMN 13C de
libiguin B avec ceux de libiguin A, le signal du groupe carbonyle C-17 est absent pour
libiguin B tandis que deux signaux de carbone quaternaires dans C 90.8 et C 182.8 sont
présents à leur place.
 72

Figure 58 : Spectre proton de R310, CDCl3, RMN 600 MHz, 250C

Figure 59 : Spectre RMN 13C de R 310, CDCl3, RMN 600 MHz, 250C
 73

Ces observations préliminaires suggèrent qu’un groupe acétoxy est présent au C-17 dans
libiguin B, et aussi un équilibre cétone-énol dans lequel le groupe hydroxyle est engagé dans
une liaison hydrogène forte.

L’interprétation concertée des spectres RMN 1D et 2D confirme ces hypothèses et conduit à

la cession des structures (2a et 2b) pour libiguin B (Fig. 54). Trois doublets de doublets à H
7.49 (J = 1.7, 1.8 Hz), H 6.39 (J = 2.0, 0.8 Hz), et H 7.32 (J = 2.0, 1.7 Hz) attribués
respectivement à H-21, H-22 et H-23, sont caractéristiques du cycle furane 3-substitué. En
outre, H-22 et H-21 montrent des taches de corrélations avec un atome de carbone de méthine
à C 70.6, qui est attribué au C-17. A son tour, H-17 apparaît comme un singulet à H 5.84
corrélé à C-21 (C 140.7) et C-22 (C 109.7) montre également des taches de corrélations avec
un groupe carbonyle à C 169.3, un carbone du groupe méthyle à C 21.6 et un carbone
quaternaire à C 39.8, indiquant la présence d'un groupe acétoxy en position C-17 et que
l'unité furanne est fixée au C-13 qui porte également Me-18. L'observation d'une tache de
corrélation entre H-17 et un carbone de méthine à C 44.8 dont le proton apparaît comme
singulet à H 2.66, a permis l'attribution du signal du carbone de méthine à C-14.

H-14 (H 2.66) montre des taches de corrélations avec des carbones à C 90.8, C 182.8 et C
170.5 alors que le proton déblindé à H 13.84 donne une tache de corrélation avec le carbone à
C 182.8. En outre, un groupe isopropyle est lié au carbone à C 182.8 sur la base de
l'observation des taches de corrélations entre les groupes méthyle et les protons méthines de
ce carbone. Ces taches de corrélations indiquent la présence d'une unité 1-isopropyl 1,3-
dicarbonyle enolysé. De son côté, le proton apparaissant sous forme de singulet à H 5.32 est
corrélé à un carbone à C 170.5 et à un carbone quaternaire oxygéné à C 80.5.

Basé sur les résultats avec libiguin A et la prise en compte de l’ensemble des ces taches de
corrélations, un C-16/30 δ-lactone est présent dans libiguin B, dans lequel le groupe carbonyle
est conjugué avec une fonction énol. Le signal du proton du groupe méthyle à H 1.57 affecté
à Me-32 et le signal du carbone à C 118.5 attribué au C-31 sont caractéristiques d'une unité
orthoacétate. Bien que la position du groupe orthoacétate ne puisse pas être déterminée
directement par des corrélations HMBC, il est situé aux positions 1, 8, et 9 sur la base de
comparaison des déplacements chimiques avec ceux de libiguin A. L'observation d'une paire
caractéristique de doublets couplés au H 1.81 et H 1.92 (J = 10.9Hz), imputable aux protons
méthylène-29, indique une structure pontée de type 4,29,1 phragmaline. Comme observé dans
 74

libiguin A, H-30 est corrélé en plus aux C-9 (C 84.8), C-2 (C 77.7) et C-3 (C 82.9). Le
déplacement chimique du signal de C-2 suggère l’absence d'un groupe acyle dans cette
position. Le deuxième groupe acétyle est attaché à C-3 par corrélation entre H-3 (H 4.84) et
le carbonyle du groupe acétyle (C 170.4).

Les déplacements chimiques des protons et carbones de la forme énol de libiguin B (2a) sont
présentés dans le Tableau 2, et les corrélations HMBC sont rapportées dans le Figure 60.

Figure 60 : Spectre HMBC de R310, RMN 600 MHz, indanone, 250C

 75

Figure 61 : Corrélation HMBC du composé R310A ou Libiguin B (2a)

La configuration relative de libiguin B (2a) est déterminée à partir des données NOESY (Fig.
62 et 63). Les taches de corrélations observées montrent des similarités à celles de libiguin A
(1), ce qui indique que tous les atomes de carbone asymétrique sont de la même configuration
que celle dans libiguin A. En outre, H-17 a adopté une orientation-β par observation des
taches de corrélations de H-17/H-30, H-17/H-12b, et H-17/H-5.
 76

Figure 62 : Spectre NOESY de R310, RMN 600 MHz, DMSO, 250C

Figure 63 : Données NOESY : taches de corrélations du composé R310A ou libiguin B (2a).

 77

La structure attribuée pour la forme céto de libiguin B (2b) est déduite de l'unité 1,3-
dicarbonyle énolysé, qui est en équilibre tautomère avec la forme 1,3-dicarbonyle. Ceci est
confirmé par les corrélations HMBC entre H-14 (H 2.79) et C-15 (C 52.1) et C-16 (C
167.2), ainsi qu'entre H-15 (C 3.80) et C-14 (C 50.6), et C-15 et le carbonyle à C 208.4.
(Fig. 64).

Figure 64 : Corrélation HMBC du composé R310B ou Libiguin B (2b)

 78

IV.4. PHYTOCHIMIE DE DODOGUIN

IV.4.1. Extraction dichlorométhane

53,7 g d’extrait brut ont été obtenu, soit 1,8% par rapport au poids initial de la poudre de
racine de Neobeguea mahafalensis. Nous l’avons nommé « extrait DCM ».

IV.4.2.Fractionnement de l’extrait DCM

La première purification sur chromatographie sur colonne de 53 g de l’extrait DCM a donné

4,8g d’extrait que nous avons nommé « Dormir ».

IV.4.3. Isolement et purification de Dodoguin A

Pour la dernière étape de purification, Dormir a subit une deuxième chromatographie sur
colonne de silice. 1g de Dormir a donné 231 mg de Dodoguin A.

La pureté finale de Dodoguin est vérifiée par HPLC (Fig. 65) et est dépassé de 95%. Il
présente un pic de base avec un temps de rétention à 28,4 min. Son absorption maximale est
située à 199,5 nm et 255 nm (Fig. 66).

Figure 65 : Profil chromatographique de la Dodoguin A

 79

Figure 66 : Spectre UV de la dodoguin A, absorption maximale à 199,5 nm et 255 nm

IV.4.4. Détermination structurale de Dodoguin A

L’analyse sur la spectrométrie de masse à haute résolution a donné sa masse molaire de

803.3485 M+H+ correspond à la formule brute C41H55O16 (calculé 803.3490).

Dans le spectre RMN 1H (Fig. 67) le substituant furanyl est identifié par les signaux des
protons à H 8,41 (H-21), H 6,68 (H-22) et H 7,75 (H-23) qui sont en corrélation avec les
signaux des 13C à C 147,36 (C-21), C 110,65 (C-22) et C 143,43 (C-23) dans le spectre 2D
HSQC 1H-13C (Fig. 68), en plus de l'atome de carbone quaternaire à C 124,74 observé dans le
spectre 1D 13C DEPT.

13
Le spectre 1D C DEPT de Dodoguin A montre la présence des 41signaux indiquant une
molécule fortement asymétrique. Les résonances 1H et 13
C de la structure de base de
Dodoguin A correspondent avec celles d’une partie de phragmaline limonoïde (Tableau 2).
Ceci a été confirmé par les corrélations des liaisons multiples observées dans le spectre 2D
HMBC 1H-13C (Tableau 3). Ces déplacements chimiques ont été confirmés par les multiples
corrélations observées dans le spectre 2D HMBC 1H-13C (Tableau 3). Les taches de
corrélations à  6,68 / 198,1 (H-22 / C-17) et  3,22 / 124,7 (H-14 / C-20) observent l’ion du
spectre 2D HMBC 1H-13C de Dodoguin A et confirment que le cycle furanyl est relié à C-17.
 80

Figure 67 : Spectre DEPT de la dodoguin A, CDCl3, RMN 600 MHz, 250C

Tableau 2 : Spectres RMN 1H (600 MHz) et 13C (150.9 MHz) de Dodoguin A dans DMSO-
D6 à 298K

No DODOGUIN A
( H),
1
multipl (J en Hz) (13C)
1 - 85.43
2 - 77.71
2-OH 3.71 , s
3 4.45 82.82
4 45.04*
5 2.38, dd (3.0, 9.1) 36.25
6A 2.44, dd (9.1, 15.0) 33.64
6B 2.26, dd (3.0, 15.0)
7 - 172.58
8 - 85.86
9 86.22
10 45.10*
11 5.38, dd (2.3, 3.9) 67.10
12a 2.64, dd (3.9, 15.7) 35.02
12b 2.18, dd (2.3, 15.7)
 81

13 - 47.44
14 3.22, dd (3.7, 7.2) 43.86
15a 3.38, dd (7.2, 17.3) 30.49
15b 2.89, dd (3.7, 17.3)

16 - 174.90
17 198.13
18 1.47, s 27.54
19 1.13, s 15.83
20 124.74
21 8.41, m 147.36
22 6.68, m 110.65
23 7.75, m 143.43
28 0.72, s 14.26
29a 1.79, (d 10.6) 38.79
29b 1.48, (d 10.6)
30 4.87, s 70.27
31 118.28
32 1.47, s
3-O-COCH(CH3)CH2CH3
C=O 174.84
CH 2.28, s 40.33
(CH3) 0.86, 7.2 15.83
CH2 1.60, m 25.40
1.28, m
CH3 0.83, t (7.5) 11.35
11-O-COCH3
C=O 168.93
CH3 2.10, s 20.76
30-O-COCH(CH3)2
C=O 172.80
CH 2.57 septet (7.0) 33.69
CH3 1.17, d (7.0) 18.42
CH3 1.13, d (7.0) 19.44
7-OCH3
OCH3 3.43, s 51.41
16-OCH3
OCH3 3.57, s 51.33
 82

Figure 68 : Spectre proton de dodoguin A, RMN 600 MHz, DMSO-D6 à 298K

Toutes les corrélations 1JCH de Dodoguin A ont été établies par le spectre 2D HSQC 1H-13C

Figure 69 : Spectre HSQC 1H-13C de dodoguin A, RMN 600 MHz, DMSO-D6 à 298K
 83

En outre, 7 systèmes de spin 1H individuels (1: 2-OH, 3-CH, 5-CH, 6-CH2, 30-CH; 2: 29-
CH2; 3: 11-CH, 12 CH2; 4: 14- CH, 15 CH2; 5: 21-CH, 22-CH-CH 23; 6: CH, (CH3), CH2,
CH3; 7: CH, CH3, CH3) sont identifiés dans les spectres RMN 1D et 2D de Dodoguin A.

La phragmaline type pontée 4,29,1 en tant qu'élément de base de structure de Dodoguin A est
identifié par la présence des doublets caractéristiques (Coombes et coll., 2003). Ces doublets
sont résultant du couplage 2JHH de H -29a ( 1,79, d 10,6 Hz) et H-29b ( 1,48, d 10,6 Hz), en
plus des multiples corrélations au  4,45 / 38,8 (H-3 / C-29),  0,72 / 38,8 (H-28 / C-29), 
1,79 / 85,4 (H-29a / C-1),  1,48 / 85,4 (H-29b / C-1),  1,79 / 45,0 (H-29a / C-4) ,  1,48 /
45,0 (H-29b / C-4),  1,79 / 77,7 (H-29a / C-2),  1,48 / 77,7 (H-29b / C-2),  1,79 / 82,8 (H-
29a / C-3) et  1,48 / 82,8 (H-29b / C-3).

Tableau 3 : Corrélations dans le spectre 2D HMBC 1H-13C de Dodoguin A.

2-OH C1, C2, C3, C30

3 C2, C3, C4, C5, C6, C28, C29, C30, 30-O-C=O
5 C3, C4, C6, C7, C9, C10, C19
6A C4, C5, C6, C7, C10
6B C4, C5, C6, C7, C10
11 C8, C9, C10, C12, C14, 11-O-C=O
12a C9, C11, C13, C14, C18
12b C9, C13, C17, C18
14 C2, C8, C9, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C30
15a C8, C13, C14, C15, C16
15b C8, C13, C14, C15, C16
18 C12, C13, C14, C17, C18
19 C1, C5, C9, C10
21 C20, C21, C22, C23
22 C17, C20, C21, C22, C23
23 C20, C21, C22, C23
28 C2, C3, C4, C5, C29
29a C1, C2, C3
29b C1, C2, C3
30 C2, C3, C8, C9, C30, 30-O-C=O
32 C31, C32
3-O-COCH(CH3)CH2CH3
CH 3-O-C=O, (CH3), CH2, CH3
(CH3) 3-O-C=O, CH, CH2
 84

CH2 3-O-C=O, CH, (CH3), CH2, CH3

CH3 CH, CH2
11-O-COCH3
CH3 11-O-C=O, CH3
30-O-COCH(CH3)2
CH 30-O-C=O, CH3, CH3
CH3 30-O-C=O, CH, CH3, CH3
CH3 30-O-C=O, CH, CH3, CH3
7-OCH3
OCH3 C7, 7-OCH
16-OCH3
OCH3 C16, 16-OCH3

L’interprétation concertée des données RMN 1D et 2D a suggéré que dodoguin A est un

limonoïde type phragmaline et par la suite conduit à l'attribution de la structure pour ce
composé (Fig. 70).

Figure 70 : Dodoguin A
 85

IV.5 HEMISYNTHESE DES LIBIGUINS ET SES DERIVES

Les étapes pour l’hémisynthèse des libiguin sont shématisées dans les Figure 71 et 72.

O
O

Me
Me

O OMe OH
O OMe OTES
Me O O
MeNHOMe*HCl Me
2 M Me3Al in Hex OMe TESCl,
O Imidazole, OMe 10 M aq KOH
phragmalin O O
N O
N
DCM, r.t. Me O O
Me DMFA, r.t. Me THF, r.t.
OH Me
Me OH
68% (22% rec.) 79% Me
OH
OH
OH
OTES
1 2

O O O

Me Me Me

OTES O OMe OTES OMe OTES

O OH Ac2O, DMAP O
O EDCI, DMAP Me
Me Me
MeOH, r.t. O DCM, r.t.
O O
O OH O O O O
O Me
Me Me
63% O 92% O
OH O O
Me in two steps Me Me
OH OH OH
OH OH OAc
3 4 5

Me O

OMe O CF 3
O
TFA Me

DCM, r.t. O
O O
Me
78% O O
Me
OH
OAc
6 (Libiguin E)

Figure 71 : Hemisynthèse de Libiguin E à partir de la phragmaline

 86

O
O

Me
Me
O OMe OH
O OMe O O
Me
Me
O OMe
a) i-Pr(=O)Cl, Py, r.t. O MeNHOMe*HCl N Dess-Martin
O O O
b) Ac2O, Py, r.t. O 2 M Me3Al in Hex Me periodinane
O
Phragmalin Me
OH
Me
OH DCM, r.t. Me DCM, r.t.
Me
OH
a) 93% OH 1
a) 90%
1 a) 39% (28% rec.) OR
b) 94% OR b) 71%
b) 45%
7a, R1= i-Pr(C=O) 8a, R1= i-Pr(C=O)
7b, R1= Ac 8b, R1= Ac

O O O

Guidraguin
Me Me
Me

O O O OMe O
O OMe O OMe
O Me
Me Me
OMe i-butyric anhydride O
O TMSOTf O TMSOTf O
O O N O O
O Me
Me Me
Me DCM, r.t. O DCM, r.t. O O
OH O Me
Me Me
OH OH O
1 a) 74% 1 a) 94% O
OR OR O O
b) 77% i-Pr
10a (Libiguin C) i-Pr
9a, R1= i-Pr(C=O)
9b, R1= Ac 10b (Libiguin D) 11 (Libiguin A)

Figure 72 : Hemisynthèse des Libiguins A, C et D à partir de la phragmaline et formation

d’un intérmediaire LG 1725 ou Guidraguin
La structure de base ainsi que les différents subtituants qui diffèrent les libiguins et dérivés
sont rapportés dans le schéma de la figure 73.
23
O
22
21
18 20
O 12
Me
CO2 Me 1 11 4
OR Me 19 13
17 R
Me Me 9 14
10 3
R
4 6 R
Me 5 O 8
MeO2 C 7 O 31 15
3
1
O
R 32 Me
OR O
2 O 4 29 30 16
O O
O O O Me 2
3 2
28 OR
1
Me OR

Libiguin A R1 = -C(O)i-Pr, R2 = -C(O)i-Pr, R3 = H, R4 = (=O)

Libiguin B R1 = -C(O)Me, R2 = H, R3 = -C(O)i-Pr, R4 = -OC(O)Me
Libiguin C R1 = -C(O)i-Pr, R2 = R3 = H, R4 = (=O)
Libiguin D R1= -C(O)Me, R2 = R3 = H, R4 = (=O)
Libiguin E R1= -C(O)Me, R2 = R3 = H, R4 = -OC(O)CF3
Figure 73 : Libiguin A et ses dérivés hemisynthétiques
 87

IV.6. EFFETS PHARMACOLOGIQUES

IV.6.1. Effet sur organe isolé

L’extrait RW ne provoque que 13,25 ± 5,5 % de relaxation de l’aorte isolé de rat précontracté
par le noradrenaline (NA) à 10-6M à la concentration de 2 mg/ml.

IV.6.2. Toxicite aiguë

Les extraits RW et R2C ne provoquent aucune mortalité chez les souris traitées jusqu’à une
dose de 1g/kg. Par contre, à partir de 500 mg/kg, une diminution de l’activité motrice ou
ataxie est observée. Les souris sont restées immobile pendant en moyenne deux à trois heures.

Une hyperémie au niveau des oreilles est observée aussi avec la dose 1g/kg.

La majorité des réflexes est maintenu : réflexe d’enfouissement, réflexe cornéen, réflexe de
redressement et réflexe après pincement.

Les souris retrouvent leur état normal après quatre heures de l’administration de l’extrait.

IV.6.3 Effet sur le comportement

a- Effet de l’extrait aqueux RW sur le comportement sexuel des rats mâles

L’écorce de tige de N. mahafalensis est utilisée dans la médecine traditionnelle malgache pour
traiter le dysfonctionnement érectile (Boiteau, 1979). Dans notre étude, nous avons testé
l’écorce de racine de cette plante. Les tests ont montré que l’extrait RW administré à
60mg/kg/jour pendant trois jours présente une activité stimulatrice du comportement sexuel
en augmentant le nombre de fréquence de montée des rats mâles par rapport au contrôle
(Fig.74). L’effet se manifeste à partir du quatrième jour de traitement et dure jusqu’au
quatorzième jour. L’effet est maximal au septième jour avec une fréquence de montée (FM)
égale à 10912,7. Les différences sont hautement significatives par rapport au contrôle avec
p0,01.
 88

FM

**

*
*

Jour

Figure 74 : Effet de l’extrait aqueux RW à 60mg/kg/jour pendant 3 jours sur la FM des rats
mâles (* p< 0,05, ** p< 0,01, n=6)

b- Effet des fractions issues de RW sur le comportement sexuel des rats mâles

Par la suite, nous avons fractionné l’extrait RW. Trois fractions ont été obtenues et testés sur
comportement sexuel des rats mâles. Les résultats sont rapportés sur la figure 75.

FM

Jour

Figure 75 : Effet des fractions R2C, R2X1 et R2P sur la FM des rats mâles (* p< 0,05, n=6)
 89

A 10 mg/kg, seule la fraction R2C augmente la FM des rats mâles. L’effet se manifeste au
quatrième jour après le traitement avec une valeur 92±11,5. Ce résultat est significatif par
rapport au contrôle (p<0,05). Cette activité persiste jusqu’au quatorzième jour.

La FM des rats mâles traités avec la fraction R2X1 diminue par rapport au contrôle. Ce
résultat est significatif avec P<0,05 au septième jour.

La fraction R2P ne présente aucune activité significative sur la FM des rats mâles.

c- Effet de RW sur le comportement sexuel des souris mâles

Comme chez les rats, RW administré à 60mg/kg/jour pendant trois jours présente une activité
stimulatrice du comportement sexuel en augmentant le nombre de la fréquence de montée des
souris mâles par rapport au contrôle. L’effet se manifeste à partir du quatrième jour et dure
jusqu’au quatorzième jour du traitement (Fig.76).

FM

*
*

Jour

Figure 76 : Effet de RW à 60mg/kg sur la FM des souris mâles (* p< 0,05, n=6)
 90

d- Effet de R2C administré par voie orale et sous-cutané à des doses croissantes sur le
comportement sexuel des souris mâles
Les résultats obtenus avec les deux voies d’administration ne présentent aucune différence
significative. La fraction R2C administrée par voie orale ou par voie sous-cutané augmente la
FM des souris mâle par rapport au contrôle. L’effet dure jusqu’au quatorzième jour du
traitement (Fig.77).

FM

Jour

Figure 77 : Effet de R2C sur la FM des souris mâles administré par voie orale et sous-cutané à
4mg/kg pendant trois jours (n=6)

L’effet de R2C est dose-dépendant jusqu’à la dose 0,4 mg/kg. A 4 mg/kg au 7ème jour, il y a
une diminution de 25% de l’effet par rapport à l’effet de la dose 0,4 mg/kg. La différence est
significative (Fig. 78).
 91

FM

*
*

Jour

Figure 78 : Effet de la dose croissante de R2C sur la FM des souris mâles (* p< 0,05, n=6)

e- Test de comportement sexuel sur les fractions issues de R2C

Trois fractions ont été obtenues à l’issue de R2C. Seule la fraction RB présente une activité
stimulante de l’activité sexuelle. Au 4ème, 7ème et 14ème jour après traitement, la fraction RB
augmente la FM des souris mâles par rapport au contrôle, la différence est significative.
L’effet est maximal au 4ème jour avec FM 91±12,7 (Fig. 79).

Jour

Figure 79 : Effet des fractions RA, RB et RC à 4 mg/kg sur la FM des souris mâles (* p<
0,05, n=6)
 92

f- Effet de R3004 à 4 mg/kg administré par voie orale et sous-cutanée

Parmi les 13 fractions issues du RB, seule la fraction R3004 augmente la FM des souris mâles
par rapport au contrôle. Au 4ème jour, la FM est de 108±17,4 et la différence est significative
avec p<0,05 (Fig. 80).

La voie d’administration ne présente aucune différence sur l’activité stimulatrice de l’activité

sexuelle de la fraction R3004 (Fig. 81)

FM

Jour

Figure 80 :Effet des fractions issues du RB à 4 mg/kg sur la FM des souris mâles (* p< 0,05,
n=6)

FM

Jour

Figure 81 : Effet de R3004 sur la FM des souris mâles administré par voie orale et sous-
cutané à 4mg/kg pendant trois jours (n=6)
 93

g- Effet de R306 cristallisé au 4, 7, 14 et 21ème jour du traitement à des doses croissantes

de 0,004 à 0,4 mg/kg

R306 est un produit pur issu de la fraction R3004. Le produit R306 dénommé Libiguin A
augmente la FM des souris mâles par rapport au contrôle. La différence est significative avec
p<0,05. L’effet est maximal aux quatrièmes jours et diminue mais persiste jusqu’aux
quatorzièmes jours du traitement.

FM
*
*

Jour

Figure 82 : Effet de R306 cristallisé au 4, 7, 14 et 21ème jour du traitement à des doses

croissantes de 0,004 à 0,4 mg/kg (* p< 0,05, n=6)

h- Effet d’un produit hémisynthétique SAE5 ou libiguin C sur l’activité sexuelle des
rats mâles
Après 3 jours de traitement avec SAE5, l’activité sexuelle des rats mâles a été testée aux 4, 7
et 14 ème jours de traitement. Comme on peut voir sur les figures 83 et 84, SAE5 à 0,04 et 0,4
mg/kg réduisent les temps de latence de la première montée et la première intromission. Avec
ces doses, les temps de latence de la première montée et la première intromission sont reduits
à moitié par rapport au lot contrôle. Cepedant, le traitement avec la dose 4 mg/kg n’affecte
rien sur ces deux paramètres. La différence avec le contrôle n’est pas significative.
 94

Temps (s)

*
*

Jour

Figure 83 : Effet de SAE5 sur le temps de latence de la première montée (* p< 0,05, n=6)

Temps (s)

*
*

Jour

Figure 84 : Effet de SAE5 sur le temps de latence de première intromission (* p< 0,05, n=6)

A la dose 0,4 mg/kg, nous pouvons observer que SAE5 provoque chez les rats mâles une
diminution de la durée de temps de latence de l’éjaculation (Fig. 85) mais, les résultats ne sont
pas significatifs (p>0,05) par rapport au lot contrôle. A la dose 4 mg/kg, SAE5 augmente
d’une manière significative par rapport au contrôle, le temps de latence d’éjaculation au J4 et
J7.
 95

Temps (s)
*

Jour

Figure 85 : Effet de SAE5 sur le temps de latence de l’éjaculation (* p< 0,05, n=6)

Au J4, SAE5 à 0,04 et 4 mg/kg augmente la FM des rats mâles par rapport au lot contrôle
(p<0,05). Les FM sont respectivement 65±5,8 et 59±6,3 contre 37±3,5 pour le lot contrôle.

Au J14, seul l’effet de SAE5 à la dose 0,4 mg/kg persiste et significatif par rapport au lot
contrôle avec une valeur 55±7,4. La figure 86 rapporte ces résultats.

FM

**

*
*
*

Jour

Figure 86 : Effet de SAE5 su la FM des rats mâles (**p< 0,01,* p< 0,05, n=6)
 96

Comme illustré dans la figure 87, au J4 et J14, l’indice d’éfficacité copulatoire augmente chez
les rats traités par SAE5 à la dose 0,4 mg/kg par rapport au contrôle (p<0,05). Par contre,
l’administration de SAE5 à la dose 0,04 mg/kg diminue significativement l’indice de
l’éfficacité copulatoire au J4. La dose 4 mg/kg ne change pas l’indice d’efficacité copulatoire
des rats traités.

*
*
*

Jour

Figure 87 : Efficacité copulatoire (* p< 0,05, n=6)

i- Effet inducteur du sommeil de la dodoguin sur les souris

Par rapport au contrôle, les souris traitées par dodoguin présentent une diminution précoce de
l’activité motrice ou ataxie. Pour les doses 1, 3 et 10 mg/kg l’ataxie commence
respectivement à partir des 22,5±1,54 ; 16,67± 1,05 et 17,5±1,12ème min de test contre 25±1ème
min pour les souris contrôles. Il y a une différence significative par rapport au contrôle aussi
sur les nombres de grooming qui sont dose dépendante (3,5±0,65 ; 4,67±0,84 ; 5,83±0,83 et
6,17±1,22). L’un des premiers signes du sommeil chez les rongeurs qui est le « Praying »
apparait en moyenne à partir de 21,42 min chez les souris traitées. Les souris traitées
commencent à avoir sommeil à partir du 25,98ème min contre 30ème min±2,89 pour les souris
contrôles. Leur sommeil a duré en moyenne 8,34 ; 18 et 14,4 min respectivement pour les
doses 1, 3 et 10 mg/kg. Pour le lot contrôle, le sommeil a duré en moyenne 6,67 min.
 97

Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous :

Tableau 4 : Effet de la dodoguin sur les comportements des souris

Souris
Lot Paramètres Moyenne s.e.d
1 2 3 4 5 6
ti (min.) 20 - 20 20 25 20 25 1
Ataxie
tf (min.) 25 - 40 30 35 35 33 2,55
Nombre Grooming - - 2 4 5 3 3,5 0,65
ti (min.) - - - - - -
Parying
Contrôle

tf (min.) - - - - - -
t (min.) - - 35 - 25 30 30 2,89
Sommeil i
tf (min.) - - 40 - 35 35 36,67 1,67
ti (min.) 25 20 25 25 20 30 22,5 1,54
Ataxie
tf (min.) 35 40 45 45 45 45 42,5 1,71
Nombre Grooming 3 8 5 6 3 3 4,67 0,84
ti (min.) 23 27 - 30 25 - 26,25 1,49
Dodoguin

Praying
(1mg/kg)

tf (min.) 30 30 - 43 25 - 32 3,85
t (min.) 30 25 - 30 - - 28,33 1,67
Sommeil i
tf (min.) 35 35 - 40 - - 36,67 1,67
ti (min.) 15 15 15 20 15 20 16,67 1,05
Ataxie
tf (min.) 40 45 45 50 45 45 45 1,29
Nombre Grooming 7 5 6 9 3 5 5,83 0,83
ti (min.) 15 15 23 15 20 20 18 1,41
Dodoguin
(3 mg/kg)

Praying
tf (min.) 25 35 25 20 25 30 26,67 2,11
t (min.) 25 15 25 20 30 - 23 2,55
Sommeil i
tf (min.) 40 40 45 40 40 - 41 1
ti (min.) 20 15 15 20 15 20 17,5 1,12
Ataxie
tf (min.) 40 55 40 40 45 55 45,83 3
Nombre Grooming 7 11 3 3 6 7 6,17 1,22
(10 mg/kg)

ti (min.) 25 15 15 - 20 25 20 2,23
Dodoguin

Praying
tf (min.) 30 27 37 - 40 30 32,8 2,43
t (min.) 30 28 20 - 20 35 26,6 2,92
Sommeil i
tf (min.) 35 50 35 - 35 50 41 3,67
 98

j- Effet d’un produit intermédiaire de synthèse LG1725 ou GIDRAGUIN sur le

comportement des souris

Au J4, gidraguin provoque plutôt un comportement agressif chez les souris mâles traitées
que stimule l’activité sexuelle. Les résultats du lot traité sont hautement significatifs par
rapport au contrôle (p<0,01). La fréquence d’agressivité (FA)est importante par rapport à
la fréquence de montée (FM) qui sont respectivement 15±1,77 contre 7,67±4,37. Les souris
mâles agressives arrivent même à tuer certaines souris femelles pendant les tests. L’effet de
gidraguin diminue progressivement, au J7 et J14, les FA sont respectivement 4±1,08 et
0,88±0,53. Par contre, au fur et à mésure que la FA diminue, la FM des souris monte mais
les résultats ne sont pas significatifs par rapport au contrôle.

**

Jour

Figure 88 : FA et FM des souris traitées par gidraguin 0,4 mg/kg (**p< 0,01,* p< 0,05,
n=6)
 99

IV.7. PHARMACOCINETIQUE ET PHARMACODYNAMIE DE

LIBIGUIN C

IV.7.1. Etude pharmacocinétique de la libiguin C administrée par voie IV à dose unique

Les concentrations plasmatiques en libiguin C sont rapportées dans le tableau 5.

Tableau 5 : Concentration plasmatique en libiguin C (ng/ml) en fonction de temps (h)

Concentration plasmatique en libiguin C (ng/ml)

Temps (h) Rats Ecart-type
Moyenne Ecart-type réduit
R001 R002 R003
0,08 1971,9 1109,9 1197,6 1426,47 474,39 274,21

0,15 887,3 878,1 960,1 908,50 44,92 25,97

0,5 467,5 365,4 217,3 350,07 125,80 72,72

1 145,6 175 149,5 156,70 15,97 9,23

1,5 68,6 108,2 60,7 79,17 25,45 14,71

Au temps Tmax= 0,08 h, la concentration maximale Cmax est de 1426,47±274,21 ng/ml. La

concentration plasmatique en libiguin C diminue en fonction du temps. Au temps t= 1,5 h, la
concentration plasmatique est de 79,17±14,71 ng/ml.

Avec le poids moléculaire de 628,29 g, on peut calculer le niveau d’exposition (SSC) de la

libiguin C, sa clairance, son volume de distribution ainsi que sa demi-vie après administration
par voie IV chez les rats. Les résultats sont rapportés dans le tableau ci-dessous :

Tableau 6 : Paramètres pharmacocinétiques de la libiguin C

Cmax Tmax SSC0-1.5 Cl Vd T1/2

Rats (ng/ml) (h) (ng h/ml) (ml/min/kg) (l/kg) (h)
R001 1971,9 0,08 819,34 97,51 2,11 0,36
R002 1109,9 0,08 595,51 121,76 4,77 0,57
R003 1197,6 0,08 535,39 147,41 3,77 0,34
Moyenne 1426,47 0,08 650,08 122,23 3,55 0,42
Ecartype 474,39 0,00 149,63 24,95 1,34 0,13
s.e.d. 274,21 0,00 49,88 8,32 0,45 0,04
 100

La SSC ou surface sous la courbe permet d’apprécier le degré d’exposition de l’organisme à

la libiguin C. Sa valeur est de 650,08±49,88 ng.h/ml.

Sa clairance est rapide de 122,23±8,32 ml/min/kg avec une demi-vie de 0,42±0,04 heure soit
environ 25 minutes. Son volume de distribution est de 3,55±0,45 l/kg.

IV.7.2. Etude cinétique par µTEP/TC de la 11C-libiguin C

Sur les images accumulées pendant 0 à 60 minutes par le scanner µTEP/TC, les couleurs
bleues dominent sur la région frontale et centrale du cerveau du rat traité (Fig. 89). Il est
significatif que le cerveau présente une faible absorption des radioactivités que les autres
tissus environnants. La radioactivité est absorbée dans les environs du cerveau.

Figure 89 : Images de la tête d’un rat pendant 60 minutes par µTEP/TC

 101

IV.7.3. Etude de la biodistribution de la 11C-libiguin C

Après administration par voie intraveineuse d'une dose substantielle active, libiguin C est
apparu en grande quantité dans le foie et l'intestin. Cependant, seule une infime fraction de la
radioactivité administrée est apparue dans le cerveau (Fig. 90).

Figure 90 : Biodistribution de la libiguin C chez les rats à 10, 30 et 60 minutes (n=3)

IV.7.3. Etude préliminaire du mécanisme d’action de la libiguin C

SAE5 a été évalué sur 192 récepteurs potentiels cibles et des enzymes. Il s’agit parmi
l'ensemble diversifié de cibles des récepteurs de la sérotonine, de la dopamine, des
mélanocortines, les stéroïdes (les androgènes compris), les canaux L et N-calcium.
Cependant, SAE5 jusqu’à la forte concentration évaluée (10 µM) n'a montré aucun effet sur
l'une des cibles.
 i

Chapitre V : DISCUSSION
 102

V.1. PHYTOCHIMIE

Le premier point saillant de nos travaux est la découverte de limonoïdes avec une structure
originale non encore décrite auparavant, et caractérisée par un cycle C-16/30--lactonique.

Neobeguea mahafalensis a fait l’objet de nombreuses études scientifiques antérieures.

Plusieurs molécules ont été isolées et identifiées de cette plante. En particulier, des limonoïdes
de structures complexes tel que pseudrelone A2 ont été isolés de l’écorce de tige par des Sud-
africains (Mulholland et Taylor, 1988). La même équipe a poursuivi l’investigation de cette
plante avec un chercheur Malgache en utilisant d’autres techniques. Ils ont ainsi pu isoler
d’autres molécules dans l’écorce de la même espèce. Phytosterols, stigmasterol et β-amyrin
ont été isolés de l’extrait hexane-dichloromethane et Neobeguin de l’extrait hexanique (Fig.
91) (Randrianarivelojosia M. et coll., 1999).

En outre, trois triterpenoïdes en l’occurrence sapelin C, sapeline E acétate et

grandifoliolenone ont été isolés de l’extrait hexanique des écorces de graines de Neobeguea
mahafalensis. Trois limonoïdes connus, methyl angolensate, mexicanolide et khayasin, ont été
isolés de l’extrait acétate d’éthyle des graines (Fig. 92) (Naidoo D. et coll., 2003).

Figure 91 : 1) Pseudrelone A2, 2) Neobeguin

 103

Figure 92 : 1) sapelin E acetate, 2) grandifoliolenone, 3) ethyl acétate, 4) methyl angolensate,

5) mexicanolide et 6) khayasin.

A partir des racines de Neobeguea mahafalensis (Meliaceae), nous avons isolé deux
limonoïdes 1,8,9-ortoesthers de structure nouvelle, isolées pour la première fois chez le règne
végétal. Le cycle δ-lactone, usuellement dans la position C-16/17, a basculé vers la position
C-16/30. Nous les avons appelé LIBIGUIN A et LIBIGUINS B (de libido et neobeguea) (Fig.
57). LIBIGUIN B existe sous deux formes tautomères 2a et 2b.

Ce n’est qu’après la sortie de notre brevet en 2008 qu’une équipe chinoise (Jun L. et coll.,
2009) a publié dans Tetrahedron pour la première fois dans l’écorce de tige d’une plante
chinoise Chukrasia tabularis un limonoïde de type phragmaline de structure nouvelle avec un
cycle -lactone dans la position C-16/30.

Les limonoides type phragmaline sont des limonoïdes avec un cycle B,D-seco qui se trouvent
 104

uniquement dans les genres de la famille des Meliaceae. La plupart d'entre eux possèdent des
cycles caractéristiques A et B tricyclo[3.3.12,10.11,4]décane et plusieurs groupes -hydroxyle,
qui peuvent subir une acylation. Un groupe acétyle peut réagir avec deux groupes hydroxyles
pour former un orthoacétate. Le plus grand sous-type est la phragmaline 1,8,9-orthoester, qui
comprend deux classes principales représentées par les exemples de composés 3 et 4 (Fig.
93).

Les libiguins représentent ainsi une nouvelle classe de limonoïde type phragmaline 1,8,9-
orthoesters. Une relation biogénétique plausible pour les trois principales catégories de
limonoides type phragmaline est donnée dans la Figure 93. Il est important de noter que ces
trois classes de limonoïde type phragmaline 1,8,9-orthoesters co-existent dans Neobeguea
mahafalensis.

LIBIGUINS

Figure 93 : Biogenèse des Libiguins

 105

V.2. DECOUVERTES PAR SERENDIPITE

Le second point saillant de nos travaux est que les recherches concernant le
dysfonctionnement érectile que nous avons commencé avec Neobeguea mahafalensis ont
conduit finalement à des résultats inattendus touchant le cerveau et le comportement. Les trois
activités biologiques qui font l’objet de ce présent travail ont été les résultats du hasard ou de
serendipitous findings. L’écorce de racine de Neobeguea mahafalensis n’a jamais été utilisée
dans la médecine traditionnelle. C’est l’écorce de tige qui sert à de nombreux usages,
notamment pour les maux des dos, les douleurs rhumatismale et lombaire liées à la
blennorragie chronique et les remèdes aphrodisiaques. La décoction de cette écorce est
utilisée pour restaurer les fonctions génitales chez les personnes âgées (Debray, 1971 ;
Boiteau, 1979). Nous avons trouvé et montré que certains principes actifs dans la racine de
cette plante (les libiguins) stimulent la fonction érectile et la libido.

En plus, nous avons observé fortuitement que certaines fractions provenant des racines
colletées à des périodes déterminées de l’année induisent le sommeil chez la souris plutôt que
montrer des activités sur la fonction érectile. Le fractionnement bio-guidé a conduit à
l’isolement d’un produit actif que nous avons appelé DODOGUIN. Ainsi, selon la période de
collecte, on pourrait avoir une majorité libiguin ou une majorité dodoguin.

Indépendamment de l’activité inductive du sommeil, des dérivés de libiguins ont été

hemisynthétisés, dont un dérivé avec une chaîne latérale comme dans le cas de dodoguin.
Voulant montrer une activité sur la fonction érectile en mettant ensemble le mâle et la
femelle, nous avons observé fortuitement que le produit en question a montré une forte
activité agressive. Le mâle agresse la femelle jusqu’à la tuer. Nous l’avons appelé
GIDRAGUIN, de gidragidra en malgache qui signifie échauffourée.

On entend par sérendipité le hasard heureux qui permet à un esprit préparé de découvrir des
choses importantes auxquelles il ne pensait pas précisément (Jacques J, 1983). Un fait
particulier, une anomalie, le résultat d'une erreur de manipulation, attirent l'attention et
conduisent à une découverte importante (Ledermann F et Kohn A, 1991).

Dans le domaine de la psychopharmacologie, le premier antipsychotique a été découvert en

France vers 1950 dans les laboratoires Rhône-Poulenc. Il s'agit de la chlorpromazine
commercialisée sous le nom de Largactil®. A partir de phénothiazines à visée antipaludique,
le laboratoire a d'abord obtenu un antihistaminique sédatif la prométhazine ou Phénergan®
 106

puis une autre molécule, la chlorpromazine. Henri Laborit (1914-1995) chirurgien de la

Marine remarqua que la chlorpromazine avait des effets particuliers par rapport aux autres
médicaments utilisés dans le traitement des psychoses (Henri L et coll., 1952 ; Geller I et
coll., 1952).

L'acide valproïque (ou acide n-dipropylacétique) est aujourd'hui un des principaux

antiépileptiques et régulateurs de l'humeur (troubles bipolaires) ; commercialisé sous les noms
de Dépakine®, Dépakote®, et Dépamide® (Göttlicher M et coll., 2001). Sa découverte résulte
d'un hasard heureux et de la sagacité de ses chercheurs ; c'était le solvant dans lequel ils
solubilisaient certaines molécules supposées actives mais peu solubles dans l'eau.

Dans le domaine cardiovasculaire, le sildénafil ou Viagra ® a été introduit en thérapeutique

vers l'année 2000 par le Laboratoire Pfizer avec l'indication traitement du dysfonctionnement
érectile. Ce produit de synthèse n'a pas été conçu pour être actif dans cette indication mais
comme médicament à effet cardiovasculaire, antiangoreux ou antihypertenseur (Zusman RM
et coll., 1999). Au cours des essais cliniques il est apparu assez décevant sur le plan
cardiovasculaire mais un effet inattendu a été observé : les hommes qui en prenaient avaient
beaucoup d'érections. Cette constatation, a changé le cours de son développement. Le
Laboratoire Pfizer a dès lors axé ses recherches dans cette nouvelle direction en passant sous
silence la première orientation.

Les extraits de pervenche, Catharanthus roseus, appelés aussi Pervenche de Madagascar

lorsqu'ils ont été essayés, d'après les données traditionnelles, dans le traitement du diabète
chez l'animal, n'étaient pas efficaces sur ce modèle animal mais entraînaient une forte
leucopénie. C'est pour cet effet toxique qu'ils ont été introduits en thérapeutique comme
antinéoplasiques (Levêque D et coll., 1996).

Dans la littérature, les limonoïdes type phragmaline présentant la caractéristique avec un cycle
δ-lactone en C-16/30 ont été isolés d'une autre espèce de Meliaceae, Chukrasia tabularis var.
velutina (Li Y. et coll., 2011 ; Chen XL. et coll., 2012). Trois de ces composés avec des
structures proches de libiguin B ont été évalués sur des activités pharmacologiques
potentielles et se sont révélés être dépourvus d'effets cytotoxiques, ne présentent aucune
activité antimicrobienne et ne provoquant pas d'effet sur plusieurs enzymes évaluées (Chen
XL. et coll., 2012). Alors à notre connaissance, notre étude est le premier rapport scientifique
rapportant que les limonoïdes type phragmaline pourraient agir au niveau du système nerveux
 107

en stimulant l’activité sexuelle, induisant le sommeil et provoquant une forte activité

agressive.

Ces résultats ont été obtenus grâce aux essais phénotypiques sur animal intact.

V.3. ESSAIS PHENOTYPIQUES versus ESSAIS BASES SUR LES

MECANISMES D’ACTION

Des revendications des «effets aphrodisiaques» d'extraits de plantes sont très abondantes dans
la littérature ainsi que dans le folklore (Sumalatha K et coll., 2010 ; Kotta S et coll., 2013).
Cependant, la plupart des études ont rapporté seulement l'effet des extraits bruts d’une
manière non systématique, et sont pratiquement impossibles de juger quels principes sous-
jacents sont responsables des effets revendiqués.

La recherche de nouveaux médicaments a subi des évolutions importantes au cours du temps,

passant des essais in homo aux tests in silico. (Fig. 94). Ainsi, les tests in vitro ou in enzymo
ont été largement utilisés depuis deux décennies pour prouver l’activité aphrodisiaque des
extraits. Certains constituants actifs ont été isolés comme :

- la yohimbine, provoquant un effet adrénergique central indirect (Riley AJ, 1994)

- Les kraussianones avec un effet relaxant direct sur les muscles lisses du corpus
caverneux (Drewes SE et al. 2002)

- La protodioscine qui semble exercer son effet en augmentant les stéroïdes androgènes,
probablement en raison de ce que la protodioscine est métabolisé in vivo aux stéroïdes
androgènes tels que dehydroepiandrostenone et la dihydrotestostérone (Gauthaman K et
Ganesan AP, 2008)

- Et enfin les inhibiteurs de phosphodiestérases principe actif du fameux Viagra (Boolell

M et coll., 1996).

Par contre, les libiguins semblent être unique en raison de leur effet très puissant et de longue
durée, observable même à 21 jours après l'administration et une dose de l’ordre de
microgramme par kg.
 108

Figure 94 : Future évolution de la découverte de médicaments (Rasoanaivo P et Razafimahefa

S, 2012)

D'un point de vue pharmacologique, les effets sont réels en raison du fait qu'ils étaient dose
dépendant et que la relation structure-activité claire était présente. Les résultats montre que
libiguin A est 10 à 100 fois plus puissant que libiguin B, et ces résultats sont statistiquement
hautement significatifs par rapport au contrôle.

L’originalité de l’effet de libiguin est aussi très importante car il maintient l'activité sexuelle
sur une longue période de temps après l'introduction de la femelle. Normalement au début,
l’activité sexuelle est très élevée, mais ça va diminuer voire s’arrêter au fur et à mesure du
temps d’accouplement (Terranova Paul F, 2004). Toutefois, pour les animaux traités avec
libiguin, l'activité reste importante, même jusqu’à la troisième heure.
 109

L’approche que nous avons mené dans notre étude est l’inverse de celle de la majorité des
laboratoires qui a comme principal objectif la recherche de molécules ayant une forte affinité
pour des cibles protéiques présélectionnées, afin d’en modifier et d’en révéler leurs fonctions,
lorsque celles-ci sont inconnues ou mal connues (biologie chimique), ou de détecter des
candidats médicaments lorsque les connaissances déjà acquises sur ces protéines laissent
soupçonner leur implication dans des maladies (chimie médicale). Cette approche correspond
à la génétique chimique inverse (reverse chemical genetics) (Harvey AL et coll., 2010).

Les actions puissantes et durables des libiguins en font un candidat prometteur pour le
traitement de la dysfonction sexuelle. En outre, les libiguins peuvent apparemment être
administrés par voie orale ainsi que par voie parentérale avec la même efficacité, comme
indiqué par la similarité de l'efficacité de la fraction R2C administré par voie orale et sous-
cutanée.

V.4. PHARMACOLOGIE

Le cerveau et le comportement sont liés, et les troubles du comportement peuvent être

expliqués, voire traités à partir d’une bonne compréhension du cerveau (Carlton PL, 1963).
Comprendre comment le cerveau produit le comportement et la conscience reste une question
majeure posée à la science. Pour l’heure, elle demeure sans réponse claire (Brazier MAB,
1984).

V.4.1. Comportement sexuel

Le comportement sexuel comprend une large série de manifestations sociales et sexuelles

coordonnées et génétiquement préprogrammées, distinctes pour le mâle et la femelle qui
assure la reproduction des espèces (Dulac C et Kimchi T, 2007). Plusieurs régions du cerveau
sont impliquées dans le contrôle du comportement sexuel, y compris l'hypothalamus (région
préoptique, le noyau paraventriculaire et ventromédian de l'hypothalamus et de
l'hypothalamus latéral), le système limbique notamment l'amygdale médiale, le système
olfactif, le noyau du lit de la strie terminale du thalamus ; les systèmes de récompense, y
compris le système dopamine mésocorticolimbique, le noyau paragigantocellularis de la
moelle épinière(Spiteri T et al. 2009), et d'autres domaines. Dans l'ensemble le contrôle du
comportement sexuel et le contrôle de sa différenciation dans le comportement spécifique du
sexe est une question extrêmement complexe qui n’est pas encore bien élucidée. De
nombreux facteurs sont impliqués, qui comprennent les stéroïdes sexuels gonadiques, la
 110

dopamine, la sérotonine, les melanocortines, l’orexine, l’ocytocine, la galanine et le

cholecystokinine (Muschamp JW et coll., 2007). Cependant, les circuits neuronaux impliqués
dans le contrôle exact du comportement sexuel sont encore mal compris en comparaison par
exemple les circuits impliqués dans le comportement alimentaire (Wikberg JES et Mutulis F,
2008).

Comme illustré dans les figures 82-87, les libiguins stimulent le comportement sexuel des
souris mâles en augmentant la FM et le temps de latence de l’éjaculation et en diminuant le
temps de latence de la deuxième érection. Cette activité se manifeste avec une dose très faible
de l’ordre de microgramme par kilo. Les effets sont reproductibles, et ne se manifestent qu’à
partir du 4ème jour du traitement. Le traitement dure seulement 3 jours successifs mais les
effets augmentent progressivement jusqu’au maximum aux 7 ou 14 ème jours après
traitement. Les effets peuvent durer jusqu’aux 21ème jours après traitement et déclinent
lentement. Ces résultats montrent ainsi que la découverte des Libiguins nous a mis sur une
nouvelle piste de connaissance du nouveau système de régulation du comportement sexuel.
Ceci est une nouvelle découverte neurobiologique révolutionnaire qui ouvre une voie pour la
cartographie détaillée de la régulation centrale de comportement sexuel, un système de
régulation qui est encore très mal compris (Wikberg JES et Mutulis F 2008). En plus de cela,
il ouvre aussi la possibilité de développer de nouveaux types de médicaments pour le
traitement du dysfonctionnement érectile. Notre hypothèse est que les libiguins agissent
trophiquement sur un système de régulation sexuelle endogène. Le long temps de latence, la
longue durée de l’effet et la très haute puissance des libiguins appuient cette hypothèse. En
fait, à notre connaissance, il n’y a pas d’autre composé qui peut être administré en très faible
dose pour une courte période de temps et qui provoque un tel changement profond et durable
du comportement sexuel.

Ces résultats signifient que les libiguins se lieraient avec une très forte affinité sur une cible
dans le cerveau que nous avons appelée récepteur à libiguin.

Un des nos objectifs est d’élucider le mécanisme d’action des libiguins et de les développer en
médicaments pour le traitement de la dysfonction sexuelle. A cet effet, nous avons obtenu un
financement important d’Uppsala Bio, à travers le "Bio-X Award". Le prix est associé à une
subvention de 3 millions de couronnes suédoises, qui va servir à l’accomplissement de la
recherche académique et le développement industriel des libiguins. Nous avons obtenu le prix
Bio-X dans la féroce concurrence avec 34 autres projets, dont seulement notre projet et un
 111

autre ont été financé en 2011.

La subvention a été utilisée dans les études pharmacodynamiques et toxicologiques ainsi que
dans l’essai clinique des libiguins.

La caractérisation du récepteur à libiguin et la région de liaison de libiguin à son récepteur

facilitera le développement de nouveaux types de médicaments. La série actuelle de libiguins
sont apparemment des agonistes. Les antagonistes du récepteur à libiguin sont susceptibles de
réguler au niveau central l’atténuation des comportements sexuels, qui pourraient alors
révolutionner le traitement des déviations sexuelles, comme celui de la pédophilie, les
violeurs, les meurtriers sexuels et le désordre hypersexuel (de la dépendance au sexe).
Libiguin a donc le potentiel pour devenir un traitement médical efficace non seulement pour
la dysfonction sexuelle, mais aussi pour les déviations sexuelles.

La sexualité est dans un sens un état neurobiologique mental comme en témoigne le

comportement de l'individu (Coulonval L, 2010). La base neurobiologique de la sexualité est
que l’individu doit :

1) être sensible aux impressions qui affectent la sexualité,

2) traiter ces impressions de manière adéquate,

3) mettre en œuvre les résultats des processus perceptifs et cognitifs sous la forme d'un
contexte de comportement approprié.

La sexualité et le comportement sexuel impliquent l'intégration de fonctions perceptives,

cognitives et motrices (Berridge KC et Kringelbach ML, 2008). Derrière cette intégration, un
réseau neuronal complexe de mécanismes neuro-endocrinien interagit avec la
neurotransmission.

Des études sur le comportement sexuel supposent généralement une séquence d'expressions
de la sexualité. Deux concepts de base, une phase d’appétit et une phase de consommation,
sont généralement utilisés comme un modèle de travail (Sisk CL et Meek LR, 1997). Cela a
surtout été utilisé dans les modèles animales, mais le concept est valable aussi pour les
humains. La phase d’appétit est caractérisée par le désir et recherche de contact sexuel tandis
que la phase de consommation se caractérise par des comportements d'accouplement (Charlier
TD et Balthazart J, 2005). Les mécanismes neurobiologiques à la base de la phase d’appétit
 112

font partie du système de récompense du cerveau et sont donc communs à d'autres

comportements liés à la récompense, tels que l'apport alimentaire. Lorsque la phase
d'appétence a une orientation sexuelle claire, on parle de la motivation sexuelle ou libido
(Guarraci FA, 2009).

Les déviations sexuelles (paraphilie) comprennent un groupe de troubles psycho-sexuels qui

impliquent des fantasmes sexuels, les sentiments ou les activités impliquant un comportement
socialement inacceptable ou autodestructeur. La déviation sexuelle peut impliquer un enfant
ou un partenaire non consentant, et il peut causer des dommages physiques ou psychologiques
(Berner B et Briken W, 2007).

Le trouble hypersexuel est une maladie où l'individu est incapable de gérer son comportement
sexuel et est parfois appelé la dépendance sexuelle (Kafka MP, 2009). Le terme
comportement impulsif-compulsif sexuel est également utilisé (Mick TM et Hollander E,
2006). Dans le cas où la dépendance sexuelle et la paraphilie coexistent, le résultat peut être
grave, comme dans le cas de la pédophilie, parmi les tueurs et les violeurs sexuels en série. Il
est bien établi que la dépendance et la toxicomanie affectent les circuits du cerveau impliqués
dans le système de récompense, la motivation, la mémoire et le contrôle inhibiteur. Toutefois,
les mécanismes neurochimiques qui sous-tendent l'interaction entre les facteurs génétiques et
environnementaux résultant des différences individuelles entre la vulnérabilité et le
développement sont encore mal compris (Koob GF et Volkow ND, 2010). Une meilleure
compréhension de la base neurobiologique des troubles de dépendance sous-jacents et le
fonctionnement de base des systèmes de récompense du cerveau, en particulier en ce qui
concerne les aspects de motivation et le choix de la récompense est justifié. Il est probable que
des mécanismes similaires sont impliqués dans les propriétés de renforcement de la prise de
nourriture, le sexe, l'abus des drogues et le jeu. Les zones adjacentes du noyau accumbens et
pré optique médiane peuvent être impliqués dans la motivation sexuelle et la dépendance
(Plaznik A et coll., 1993 ; Goodson JL et Kabelik D, 2009).

Le traitement des déviations sexuelles est aujourd'hui problématique et est principalement

appliqué à la thérapie cognitivo-comportementale. Le traitement hormonal comme les anti-
androgènes est utilisé dans une certaine mesure, mais il donne des effets gênants et
indésirables (gain de poids, l’hypertrophie des glandes et un risque accru de maladies cardio-
vasculaires) et est une méthode controversée de traitement (Berner B et Briken W, 2007).
 113

Notre hypothèse actuelle est que les libiguins interagissent avec un système biologiquement
très important pour la régulation de comportement sexuel. Comme brièvement mentionné ci-
dessus la régulation centrale de comportement sexuel implique de multiples zones du cerveau
sur lesquels les libiguins peuvent exercer de différents contrôles. L’élucidation des
mécanismes impliqués dans cette régulation conduira à une meilleure compréhension de ces
systèmes, ainsi que potentiellement de nouveaux composés avec des actions antagonistes qui
sont capables d’atténuer la régulation de sexualité en cas de son dérèglement.

V.4.2. Comportement agressif

Le comportement agressif est un caractère complexe qui est communément divisé en

affective, hostile et le type d'agressions orientée vers un but (Adams DB, 1979). Chez les
rongeurs, l'agression est généralement exprimée comme des menaces latérales. L’individu se
précipite vers l'adversaire (généralement dirigé vers le flanc ou l'arrière), cliquète la queue,
attaque et chasse en mordant l’agressé tout en ayant des postures défensives verticaux
(Blanchard RJ et Blanchard DC, 1977).

Ethologiquement, l’agression joue un rôle dans la protection du territoire et des ressources,

comme la nourriture et l'eau. L’agression montre aussi le dimorphisme sexuel dont les motifs
sont généralement pour assurer les possibilités d'accouplement chez les rats et les souris
mâles. En outre, en état normal, les rats et les souris mâles expriment rarement un
comportement agressif envers les femelles (Blanchard RJ et coll., 1980).

L’origine du comportement agressif est dans le SNC où plusieurs domaines tels que le cortex
préfrontal et l'hypothalamus, le périaqueducale gris et l'amygdale du mi-cerveau sont
impliqués (Kavoussi R et coll. 1997). Par exemple, l'hypothalamus du rat a été cartographié
par une stimulation électrique dans plus de 400 régions, ce qui a montré que l'agression mâle-
mâle étant inductible dans les régions périfornicale, antérieure, latérale et ventromediane de
l’hypothalamus. Ces zones qui ne font pas partie des noyaux anatomiques habituellement
utilisés dans les subdivisions de l'hypothalamus (Kruk MR et coll., 1983). c-Fos est l’une des
premières études d'expression génique directe qui indique l'implication du cortex préfrontal,
l’aire pré optique médiane, le septum latéral, les parties antérieure, ventromédiane et latérale
de l’hypothalamus, le noyau paraventriculaire, l’amygdale avec d'autres sites de l'agressivité
(Murillo-Rodriguez E et coll., 2007 ; Takahashi A et Miczek KA, 2013). Il y a aussi les études
knock-out qui impliquent le rôle très important du canal Ca2+ type N, dont la suppression du
 114

celui-ci résulte l’hyperagressivité des souris (Kim C et coll., 2009). Par rapport aux
médiateurs chimiques, les rôles des neurotransmetteurs excitateurs comme le GABA, la
sérotonine et la dopamine sont impliqués dans le comportement agressif (Almeida RM et
coll., 2005). Beaucoup d’études utilisent la technique de microinjection d’agents
pharmacologiques actifs directement dans le cerveau pour provoquer le comportement
agressif. Par exemple, la microinjection de L-glutamate dans la région hypothalamique
(Brody JF et coll., 1969) et l’injection de GABAB agoniste du baclofen dans le noyau dorsal
du raphé qui intensifie l’agressivité des rats (Takahashi A1 et coll., 2010).
Les stéroïdes des gonades sexuels présentent aussi des rôles importants dans le comportement
agressif. Exemple, le traitement des rats mâles pubères avec un propionate de testostérone et
ses dérivés provoque leur agression envers les femelles après provocation (Audet MC et coll.,
2009).

Notre découverte de nouvelle molécule qui provoque une agressivité spontanée sans aucune
provocation peut orienter les recherches neuropharmacologiques dans une nouvelle approche.
Comme dans le cas de libiguin, dodoguin pourrait agir sur un nouveau site ou récepteur que
nous avons appelé récepteur à dodoguin. L’étude approfondie de son mécanisme d’action
pourrait donner quelques explications pour élucider certains mystères du cerveau.

V.4.3.Effet inducteur du sommeil

La majorité de sédatifs et hypnotiques agissent sur le récepteur GABA A, (plus précisément

sur des sites différents et de différentes manières pour des différentes classes de composés),
provoquent l’ouverture des canaux chlorures, ce qui conduit à hyperpolarisation neuronale qui
résulte la sédation et l’hypnose (Schenck CH et coll. 2002). Les barbituriques, les
benzodiazépines, gluthetimide, clométhiazole, acides valérénique, l'acide valérique et
plusieurs autres composés agissent par l'intermédiaire de ce récepteurs, et même pour les gaz
anesthésiques sont censées à agir en partie à GABA A (Nima N et coll., 2011). En outre, les
composés sédatifs comprennent une variété de composés agissant par l'intermédiaire d'autres
mécanismes comme les anticholinergiques, les antihistaminiques, les antagonistes des
récepteurs de la sérotonine, les α-anti-adrénergiques, les agoniste α2-adrénergiques et les
antagonistes de récepteurs de la dopamine.

Les agonistes GABAA sont surtout utilisés pour le traitement de l'anxiété, mais ils présentent
un inconvénient majeur car ils causent de la dépendance. Il est très nécessaire de trouver des
 115

composés avec de nouveaux mécanismes d'action qui ne disposent pas de tel problème. Nous
avons récemment trouvé un nouveau composé que nous avons appelé dodoguin (figure 1) qui
induit le sommeil chez les rongeurs. Des tests préliminaires que nous avons entrepris sur
dodoguin nous a permis de savoir que dodoguin n’agit pas sur les récepteurs GABAA.,
indiquant potentiellement un nouveau mécanisme d'action pour le composé.

V.4.4.Mécanisme d’action et relation structure activité

11
Nous avons développé une étude cinétique par µTEP/TC de la C-libiguin C. Après
administration par voie IV d'une quantité substantielle active, libiguin C est apparu dans
l'intestin, qui, conjointement avec la connaissance de l'absorption intestinale du composé
indique qu'il subit une circulation entéro-hépatique. Cependant, seule une infime fraction de la
11
radioactivité administrée est apparue dans le SNC. La clearance de C-libiguin C était aussi
rapide avec une demi-vie d'environ 25 minutes. Ces données peuvent indiquer qu'il s’agit d’un
métabolite de la libiguin qui est le principe actif et que ces métabolites perdent l'étiquette 11C
avant qu'il pénètre dans le SNC, ce qui rend ainsi invisible dans les études par µTEP.

Les libiguins, dodoguin et gidraguin sont des limonoïdes 1,8,9-orthoesters(Fig. 95).

 116

AcO
O
O O

O
O
O

O OMe
O

O
O OH O

Figure 95 : Structures de libiguin, dodoguin, gidraguin

Le bloc phragmaline et l’-cetofuranne (Fig. 96) seraient deux prerequisites pour la fixation
sur les récepteurs.
O

O
O O

O
O
O

O
O OH

R1

Figure 96 : Le bloc phragmaline et l’-cetofuranne

La C-16/30 lactone ou la nature de la chaîne latérale portée par le carbone 14 serviraient à

induire une réponse biologique spécifique.

Structure partielle requise Structure partielle requise Structure partielle requise

pour la sexualité pour l’induction du sommeil pour l’agressivité

Figure 97 : La C-16/30 -lactone ou les chaînes latérales

 117

V.6. BREVETER OU PUBLIER

Pour être brevetable, une invention se doit obéir à trois critères de brevetabilité (Art. L. 611 -
10 du Code de la Propriété Intellectuelle) :

Nouveauté (novelty)

Caractère inventif (non-obviousness)

Applications industrielles.(Industrial applications)

La nouveauté doit se comparer avec l’état des connaissances actuelles. Lorsqu’une

information est divulguée, celle-ci n’est plus nouvelle ; elle fait partie du patrimoine public.
En d’autres termes, une publication scientifique antérieure à une demande de dépôt de brevet
rend celle-ci caduque (Rozek R, 1993). Inversement, un brevet nécessite une certaine
confidentialité imposant un moratoire de fait sur toute publication.

Le brevet est nécessaire à la recherche afin d’attirer les investissements dont elle a
cruellement besoin. Par ailleurs, le progrès scientifique passe par la publication, évitant ainsi
une sans cesse réinvention de la roue. Par conséquent, la publication et le brevet ont la même
finalité, mais sont apparemment incompatibles. Apparemment seulement, car il est préférable
de considérer ces outils comme étant complémentaires. Preuve en est, un brevet fait quoiqu’il
arrive l’objet d’une publication automatique 18 mois après le dépôt de sa demande. Il suffirait
de ne pas publier avant la publication de la demande officielle de dépôt, et de manière
générale, veiller à ne pas divulguer d’informations qui seraient absentes de la demande de
brevet pour concilier ces deux outils.

Le brevet, au même titre que la publication doit être considéré avant tout comme un
instrument de valorisation de la recherche, permettant les collaborations publiques-privées.

Les brevets sont considérés comme particulièrement importants compte tenu des coûts élevés
et des risques inhérents à la R&D et du fait que cette recherche développement peut
déboucher sur des inventions potentiellement utilisables par tous les pays. Il est aussi admis
que le niveau de protection conféré aux inventions peut avoir une influence sur
l’investissement étranger, le transfert de technologies et la recherche (notamment sur les
programmes communs de recherche et la recherche visant à répondre à des besoins locaux).
 118

Les brevets permettent de conférer des monopoles reconnus par les pouvoirs publics et limités
dans le temps, qui jouent le rôle de mesures d’incitation et de récompense pour les inventions
utiles.

Pour valoriser nos résultats, nous avons choisi de breveter avants de publier. Un brevet a un
caractère juridique indiquant qu’on est propriétaire d’une invention et possède le monopole de
son exploitation. Les publications scientifiques dans les peer review journals internationaux
garantissent la valeur scientifique de ces publications. Breveter avant de publier ou publier
sans breveter est un choix qui dépend de la politique de recherche de chaque chercheur.

V.7. DEVELOPPEMENT ET PRODUCTION

Le coût de la recherche augmente très fortement, et corrélativement le nombre de produits

nouveaux qui voient le jour chaque année diminue, une vingtaine en moyenne au cours des
dernières années (Forcier JM, 2010). La situation est encore plus difficile dans le domaine du
médicament et des produits de santé en général. A titre d’exemple, la mise sur le marché d’un
nouveau médicament exige un investissement sans cesse plus élevé et nécessite un temps de
plus en plus long, pour répondre aux exigences réglementaires.

Entre la découverte dans le laboratoire (public ou privé) d’un « candidat médicament » et le

moment où, reconnu efficace et sans danger, on le trouvera dans une officine, le cheminement
est long et rempli d’obstacles. Au bout du processus, il en restera un sur plusieurs milliers
testés, après l’intervention d’un nombre considérable d’acteurs scientifiques, médecins,
patients, mais aussi financiers, juristes, etc.

L’augmentation des coûts et les difficultés pour parvenir à réaliser et mettre sur le marché le
produit qui sera le « nouveau médicament » exige de l’industrie pharmaceutique à adopter un
nouveau mode d’organisation et de relation avec son environnement pour optimiser des
moyens techniques et financiers. Le modèle américain dit « extended company » semble être
le plus efficace actuellement : il se base sur une organisation dynamique en réseau qui
orchestre toute une série de mode d’action complémentaires, externalisation, collaboration,
contrats, licences ; associant un à plusieurs industriels de la pharmacie, des petites entreprises
et des groupes de recherche académiques, qui peuvent répondre aux besoins d’un ensemble
que l’on pourrait nommer « Big Pharma » (Gregory T, 2011). Dans notre cas, nous avons
contacté 18 industries pharmaceutiques dans le monde, et à ce jour deux de ces industries ont
accepté notre condition de collaboration pour le développement des libiguins. La première est
 119

une firme pharmaceutique sud africaine qui a travaillé depuis longtemps sur les plantes
médicinales et les phytomedicaments et le second un laboratoire pharmaceutique chinois.

Professeur Thomas Oduiambo, celèbre chercheur Kenyan, disait “The knowledge acquired
within four walls of our institutions does not bear any significant relevance with the practices
of the larger society”. L’objectif de l’IMRA a été d’emmener la recherche et les découvertes
au stade de la commercialisation. Pour cela, il dispose d’une unité de production. Et nous
avons formulé un nouveau phytomedicament dénommé Dangitsyl® à base de préparation
traditionnelle, (ANNEXE).
 120

CONCLUSION GENERALE

ET

PERSPECTIVES
 120

Ce travail rentre dans le cadre de l’exploration et de la valorisation de la médecine

traditionnelle malgache. Neobeguea malafalensis jouit d’une longue réputation pour la prise
en charge du dysfonctionnement érectile des personnes âgées. Nos travaux ont conduit à
l’identification de deux nouveaux constituants pharmacologiquement actifs appartenaient au
groupe des limonoïdes de type phragmaline 1,8,9 orthoacetate, et que nous avons nommé
LIBIGUIN A et LIBIGUIN B. Une propriété pharmacologique qui les distingue des autres
médicaments aphrodisiaques par son effet retard (l’effet pharmacologique se manifeste à
partir du 4ème jour), ainsi que la durée d’action (jusqu’à 21 jours ou plus). Ceci sous-entend un
mécanisme d’action différent de celui des molécules existantes qui agissent au niveau
vasculaire. On est donc en présence de molécules de structures originales douées d’une
activité pharmacologique nouvelle. Ils répondent à la définition de New Chemical Entity
(NCE) dans le processus de découverte et de développement de nouveaux médicaments. Un
dérivé de la Libiguin A, que nous avons dénomme SAE5 est actuellement en développement
pré-clinique dans un laboratoire asiatique. En parallèle, nous avons mis au point un
phytomédicament sous le nom commercial Dangitsyl® qui est disponible aux points de vente
de l’IMRA/SOAMADINA.

Un autre volet pertinent de nos travaux est la découverte par serendipité. Le premier point
concerne la découverte fortuite de l’effet inducteur de sommeil d’un limonoïde que nous
avons appelé DODOGUIN. Suivant la règle fondamentale de l’extraction par solvant : « Le
semblable se dissout dans le semblable », l’extraction aqueuse extrait sélectivement les
constituants polaires et également certaines molécules lipophiles qui sont chélatées par ces
molécules polaires. Dans le but d’isoler d’éventuelles limonoïdes apparentés aux
LIBIGUINS, nous avons étudié la fraction lipophile, et c’est fortuitement que l’effet inducteur
de sommeil de la DODOGUIN a été observé. Le second point concerne l’observation fortuite
de l’effet agressif très puissant d’un intermédiaire d’hémisynthèse que nous avons nommé
GIDRAGUIN. Suivant une règle générale dans la recherche de nouveaux médicaments, nous
avons testé presque tous les intermédiaires de synthèse sur le test de comportement sexuel, et
c’est de cette façon que cette activité agressive a été trouvée d’une façon inattendue.

La présente thèse de doctorat est une thèse de pharmaco-chimie. Elle comprend une
composante phytochimie pour l’isolement, l’élucidation de structure des constituants
biologiquement actifs et leur l’hémisynthèse ainsi que celle de leurs dérivés, et une
composante pharmacologie pour la mise en évidence des activités biologiques. Ceci reflète la
relation étroite entre la chimie et la pharmacologie dans la découverte de nouveaux
 121

médicaments.

Il est tentant de spéculer que les effets pharmacologiques de comportement des phragmalins
que nous avons découvert sont les facettes de systèmes comportementaux qui se sont
développés au cours de l'évolution à partir d'un ancêtre commun, à savoir un élément
génétique qui a évolué en plusieurs récepteurs de structures similaires contrôlant différents
traits de comportement sur lesquels nos limonoïdes aux structures étroitement apparentées (ou
leurs métabolites) agissent. Ceci est bien sûr hautement spéculatif, mais présente une
possibilité intrigante. Trouver le mécanisme moléculaire de l'action des agents
pharmacologiques n’est pas une tâche facile et nécessite des efforts et des ressources
importants. Il est possible que des mécanismes similaires soient impliqués dans la physiologie
de l’alimentation, le sexe, l'abus des drogues et l'agression. Les limonoïdes de type
phragmaline offrent une opportunité unique pour la compréhension de ces mécanismes. C’est
dans cette direction que nous orientons actuellement nos travaux en cours dans le cadre d’un
réseautage en termes de complémentarité.
 108

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http://www.lexpress.fr/informations/la-chance-joue-toujours-un-rôle-dans-la recherche_6328
14.html

http://www.neur-one.fr
 i

ANNEXE
 I

NOTRE NOUVELLE GAMME DE PHYTOMEDICAMENTS

Depuis début 2015, cinq phytomedicaments sont mis au point dans le laboratoire
Biothérapeutique dont Dangitsyl® ; la pomade Fenosoa® pour le traitement du lourdeur de
jambe et de la varice ; Fanalarofy® et Fanalanendo® pour le traitement de l’épilepsie et de
migraine et le dernier Tanjake® pour la prise en charge de la fatigue chronique et des maladies
responsables de l’altération de l’état général (Fig. 98 et 99).

Le laboratoire Biothérapeutique de l’IMRA a choisi la voie d’amener la recherche au

développement pour que nos résultats puissent avoir d’impacts positifs et contribuer dans
l’amélioration de la santé publique.
 II

Figure 98 : Prospectus de nos nouveaux phytomedicaments 2015 (Page 1)

 III

Figure 99 : Prospectus de nos nouveaux phytomedicaments 2015 (Page 2)

 IV

Dangitsyl® 30mg est une solution buvable à base d’un extrait standardisé de Neobeguea
mahafalensis et un arôme naturel. La posologie est d’une cuillerée à soupe chaque matin
pendant trois jours consécutifs. Il est indiqué dans le traitement du dysfonctionnement de
l’érection et de la libido.

Figure 100 : Dangitsyl®

 i

Nouveaux limonoïdes naturels et hémisynthétiques : effets neuropharmacologiques inattendus.

Par Razafimahefa Andriantiaray Solofoniaina
Tel. : +261 32 05 07 093 E-mail: solofoniain@moov.mg
Abstract
Neobeguea mahafalensis is an endemic plant of Madagascar known in traditional medicine for its
various empirical usages. It is its use in traditional medicine for the management of erectile
dysfunction that prompted us to investigate this plant. To this end, we found that the decoction of root
barks of Neobeguea mahafalensis (Meliaceae) displayed an extraordinary high potency and
remarkable long duration in augmenting sexual activity in male rodents. Bioassay-guided fractionation
led to the isolation of two pharmaco-active constituents, which turned out to be novel 1,8,9-
orthoacetate phragmalin limonoids that we named LIBIGUINS A and B, with unprecedented C-16/30
δ-lactone ring. Chemical structures were established by the interpretation of their 1D and 2D NMR
data. In vivo pharmacological tests showed that, starting with a treatment from 0.004 - 0.4 mg/kg/day
for three consecutive days, they induced a long-lasting augmentation of both intensity and duration of
mounting behaviour in male rodents’ animals, the effect lasting for up to 11 days post-treatment;
LIBIGUIN A being markedly more potent than LIBIGUIN B. This is the first time that limonoids are
reported to have such an effect. These results can lead to novel therapies for treatment of sexual
dysfunctions. Moreover, they can serve as an entry for the elucidation of the central physiological
control of mating behaviour, which is still not well mapped out. In investigating the lipophilic extract
of the roots, we found unexpectedly that a fraction induces sleep in mice. We isolated one active
compound we termed DODOGUIN. Finally, the semisynthesis of LIBIGUIN A and its close analogs
was performed by the trans-lactonization of phragmalin. Among the semisynthetic intermediates, we
unexpectedly observed one compound that causes strong aggression of male mice towards female
mice. We named this compound GIDRAGUIN.
These result confirm the traditional use of this plant and conduct us to the discovery of new natural
and semisynthetics limonoids and these pharmacological activities.
Key words: Neobeguea mahafalensis, limonoids, sexual-enhancing activity, sleep-induced activity,
aggression.

Résumé:
Neobeguea mahafalensis est une plante endémique de Madagascar connue dans la pharmacopée
traditionnelle pour ses multiples usages médicinaux. C’est son utilisation en médecine traditionnelle
pour la prise en charge du dysfonctionnement érectile qui nous a incité à réaliser cette étude. Avec des
tests de comportement sexuel chez les rongeurs mâles, nous avons trouvé que la décoction de l’écorce
de racine de cette plante a présenté une activité extraordinaire. Il a été observé que cette activité
sexuelle est non seulement d’une puissance remarquable mais également d’une durée prolongée. Des
fractionnements bio-guidés ont conduit à l’isolement de deux constituants actifs qui se sont avérés être
de nouveaux limonoïdes de type phragmaline 1,8,9-orthoacétate que nous avons nommé LIBIGUINS
A et B. Ils possèdent un noyau δ-lactone en C16/30 trouvé pour la première fois dans les règnes
végétal et animal,. Leurs structures chimiques ont été établies par RMN 1D et 2D. Des tests
pharmacologiques in vivo ont montré qu’un traitement avec une dose de 0,004 -. 0,4 mg / kg / jour
pendant trois jours consécutifs augmentent significativement à la fois l'intensité et la durée de l’activité
sexuelle chez les rongeurs mâles. L'effet dure jusqu’à 21 jours après le traitement. LIBIGUIN A est
significativement plus active que LIBIGUIN B. A notre connaissance, c’est la première fois qu'on
découvre les propriétés aphrodisiaques des limonoïdes de type phragmaline. Ces résultats peuvent
conduire à de nouvelles thérapies pour le traitement du dysfonctionnement érectile. En outre, ils
peuvent servir à l'élucidation du mécanisme de contrôle physiologique centrale du comportement
sexuel, qui n’est toujours pas bien défini jusqu’ici. En étudiant la fraction lipophile de la plante par
extraction avec le dichlorométhane, nous avons trouvé de façon inattendue qu’une fraction induit le
sommeil chez la souris. Nous avons isolé un produit actif majoritaire appartenant au groupe des
limonoïdes de type phragmaline, et que nous avons dénommé DODOGUIN. Enfin, l’hémisynthèse de
la LIBIGUIN A et de ses analogues a été réalisé par trans-lactonisation de la phragmaline. Parmi les
produits intermédiaires d’hémisynthèse, nous avons observé fortuitement qu’un produit provoque une
forte agressivité des souris mâles vis-à-vis des souris femelles. Nous l’avons nommé GIDRAGUIN.
Ces résultats confirment l’utilisation traditionnelle de cette plante et nous a conduit à la découverte de
nouveaux limonoïdes naturels et hémisynthétiques et leurs effets pharmacologiques.
Mots clés: Neobeguea mahafalensis, limonoïdes, activité sexuelle, sommeil, agressivité.