Iribar Amaia

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
U.F.R. SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
Ecole doctorale Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries
THESE
en vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

délivré par l’Université Toulouse III − Paul Sabatier
Discipline : Ecologie Microbienne
présentée et soutenue
par
Amaia IRIBAR
le 26 octobre 2007
Titre :
Composition des communautés bactériennes dénitrifiantes au sein

d’un aquifère alluvial et facteurs contrôlant leur structuration:
relation entre structure des communautés et dénitrification
Directeurs de thèse :
Jose Miguel SÁNCHEZ-PÉREZ et Frédéric GARABETIAN
JURY
I. ANTIGUEDAD Professeur Université du Pays Basque – EHU, Bilbao Examinateur
F. GARABETIAN Professeur Université de Bordeaux I Co-directeur de thèse
J. GARNIER Directeur de Recherche CNRS, UMR 7619 Sisyphe Rapporteur
S. HALLIN Professeur Associé Université des Sciences Agricoles d’Uppsala Examinateur
P. MEROT Directeur de Recherche INRA, UMR SAS Rapporteur
J.-L. ROLS Professeur Université Toulouse III - Paul Sabatier Examinateur
J.-M. SANCHEZ-PEREZ Directeur de Recherche CNRS, UMR 5245 Ecolab Co-directeur de thèse
M. TREMOLIERES Professeur Université de Strasbourg Présidente
Remerciments
Je remercie Monsieur Jean Luc Rols, Directeur du Laboratoire d’Ecologie des

Hydrosystèmes UMR 5177, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire pour les 3
premières années de cette thèse. Je remercie également Monsieur Eric Chauvet, Directeur du
Laboratoire d’Ecologie Fonctionelle (ECOLAB) UMR5245, pour m’avoir permis de
continuer et terminer cette thèse au sein de son laboratoire depuis janvier 2007.
A mon co-directeur de thèse Monsieur Jose Miguel Sánchez Pérez, j’adresse mes
remerciements pour m’avoir donné l’occasion de découvrir l’hydro-géochimie et pour son
accueil au sein de son équipe, à Toulouse. Je remercie mon autre co-directeur de thèse,
Monsieur Frédéric Garabetian, pour sa contribution rigoureuse à ma formation scientifique en
microbiologie, ses qualités humaines et son caractère aux accents latins.
Je remercie également Madame Josette Garnier du laboratoire de Structure et

Fonctionnement des Systèmes Hydriques Continentaux (SISYPHE) UMR 7619 et Monsieur
Philippe Mérot du laboratoire de l’INRA UMR Sol Agronomie Spatialisation de Rennes pour
avoir accepté de juger ce travail comme rapporteurs. Je remercie Madame Michelle
Trémolières Université de Strasbourg d’avoir présidé le jury et Monsieur Iñaki Antiguedad
Université du Pays Basque d’avoir accepté de juger un document qui n’est pas rédigé dans sa
langue maternelle.
Je remercie Madame Sara Hallin de m’avoir accueillie au sein de son groupe du

département de Microbiologie de l’Université Suédoise d’Uppsala (SLU) pour un séjour de 2
mois dans le cadre d’un échange ATUPS. Je la remercie pour l’intérêt qu’elle a porté à mon
travail jusqu'à avoir accepte de faire partie du jury de cette thèse. Au delà je remercie
l’ensemble du département de Microbiologie de la SLU pour son accueil et en particulier
Madame Karin Enwall pour son aide au laboratoire.
Je suis redevable envers l’ancien plateau technique composé par Madame Claude Mur
et Monsieur Daniel Dalger pour les dosages chimiques des eaux, pour leur aide toujours
sympathique et efficace et de maints encouragements. Je remercie Mademoiselle Isabelle
Vitte et Monsieur Frédéric Julien pour leur soutien sur le terrain et leur participation aux
analyses en chromatographie ; Je remercie Monsieur Nicolas Poulet, pour sa disponibilité
inconditionnelle et son apport a ce travail en matière d’analyses statistiques qui doivent
beaucoup à ses compétences. Enfin Monsieur Yvan Nicaise m’a apporté son soutien
inconditionel dans la partie «Biologie Moléculaire ». Sa générosité incommensurable et sa
bonne humeur m’ont beaucoup aidé au quotidien.
Pendant la durée de cette thèse au sein du laboratoire j’ai connu plusieurs personnes
qui sont restées ou ont quitté le laboratoire. Je conserve leurs amitiés précieuses, merci Emilie
L., Pierre, Fred Azemar, Malvina, Arthur, Sandrine, Hélène et les autres. Merci pour vos
coups de main quand j’ai eu besoin. A Uppsalla merci a Ingela, Karin N., Leticia, Harald,
Kristin, Anna-Ida pour leur accueil, enthousiasme et bonne humeur
Je garde un place particulière à Estéphanie Boulêtreau et Frédéric Santoul, pour leur

aide, soutien et amitié : « ¡Que dure muchos años ! ». J’ai une place pour cette famille
magnifique de Villemur, qui m’a sortie des bureaux parfois trop gris de l’UPS à son
accueillant jardin.
Un regard spécial à ma familia francesa pour son aide, sa générosité et l’amour donné.
Le file crée, qu’il ne se rompe jamais. « Bai pozik eta arro nagoela zuek ezagutu izanaz » (qui
dans ma seconde langue se traduirait par « ¡Que contenta y orgullosa estoy de haberos
conocido !).
Euskal Herriko nere Iribar sendia, Ama Aita et Asier, nere betiko lagunak Oihana,
Nora, Larraitz, Laura eta Amaia urrutitik gertura ibili direnak ere eskertzen ditut. Argiñe,
Haritz, Uxu, Aiora…mil esker zuen adiskidetasuna Toulousera gerturatzeagatik. Denbora
izango det laxter denoi bixita egiteko !
Azkenerako utzi dut gehien eskertzeko dudan pertsona, Laurent hitz nahikorik ez nuke
aurkituko egindako guztia eskertzeko, bikote, zuzentzaile eta lagun bezela. Nere eguneroko
maitasuna dezu trukean. Hemendik aurrera gurea da etorkizuna !
Euskal Herriko nere Iribar sendia, Ama Aita et Asier, nere betiko lagunak Oihana,
Nora, Larraitz, Laura eta Amaia urrutitik gertura ibili direnak ere eskertzen ditut. Argiñe,
Haritz, Uxu, Aiora…mil esker zuen adiskidetasuna Toulousera gerturatzeagatik. Denbora
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Azkenerako utzi dut gehien eskertzeko dudan pertsona, Laurent hitz nahikorik ez nuke
aurkituko egindako guztia eskertzeko, bikote, zuzentzaile eta lagun bezela. Nere eguneroko
maitasuna dezu trukean. Hemendik aurrera gurea da etorkizuna !
Sommaire
Sommaire
Sommaire .................................................................................................................... 1
Liste des abréviations................................................................................................. 6
Introduction ................................................................................................................ 8
Chapitre I. Relation entre la composition des communautés bactériennes et le

fonctionnement des écosystèmes : état de l’art...................................................... 14
1. Les communautés bactériennes.......................................................................... 15

1.1. Définition .................................................................................................... 15
1.2. Diversité des communautés bactériennes.................................................... 16
1.2.1. Définition de la biodiversité................................................................. 16
1.2.2. La diversité bactérienne ....................................................................... 16
1.2.3. La diversité fonctionnelle bactérienne ................................................. 19
1.2.4. La mesure de la diversité...................................................................... 20
1.3. Facteurs qui affectent la composition d’une communauté bactérienne dans
un aquifère.......................................................................................................... 21
1.3.1 Facteurs abiotiques................................................................................ 21
1.3.2. Facteurs biotiques................................................................................. 23
2. Rôle de la diversité sur le fonctionnement d’un écosystème ............................. 24
2.1. Des modèles théoriques aux études empiriques.......................................... 25
2.2. Comment mesurer l’intensité de la relation diversité/fonction ? Quels
processus et communautés bactériennes ont été étudiés ? ................................. 27
3. Le modèle d’étude : les communautés dénitrifiantes des agrégats naturels....... 28
3.1. La dénitrification ......................................................................................... 28
3.1.1. Définition ............................................................................................. 28
3.1.2. Où a lieu la dénitrification ?................................................................. 31
3.1.3. Les facteurs contrôlant la dénitrification dans le milieu aquatique...... 32
3.1.4. Service écologique et incidence agronomique de la dénitrification..... 34
3.2. Les bactéries dénitrifiantes.......................................................................... 35
3.3. Justification du choix du modèle : les communautés dénitrifiantes dans le
biofilm hétérotrophe d’un aquifère alluvial ....................................................... 37
1
Sommaire
3.3.1. Les aquifères alluviaux et leur fonctionnement ................................... 37

3.3.2. Les rôle des communautés bactériennes dans les aquifères alluviaux . 37
3.3.3. Justification du modèle......................................................................... 39
Chapitre II. Méthodologies...................................................................................... 42
1. Les Biofilms hétérotrophes (BH) de l’aquifère alluvial..................................... 43

1.1. Site d’étude.................................................................................................. 43
1.1.1. La Garonne........................................................................................... 43
1.1.2. Le site de Monbéqui............................................................................. 44
1.2. Échantillonnage........................................................................................... 48
1.2.1. Variabilité spatiale et temporelle de la dénitrification ......................... 48
1.2.2. Composition des communautés bactériennes libres et attachées ......... 50
1.2.3. Expérience de colonisation................................................................... 51
1.2.3.1. Choix des piézomètres .................................................................. 51
1.2.3.2. Préparation et installation des sachets contenant le substrat
artificiel ...................................................................................................... 52
1.3. Paramètres mesurés en analyse d’eau ......................................................... 53
1.3.1. Paramètres physiques ........................................................................... 53
1.3.2. Paramètres chimiques........................................................................... 53
1.3.2.1. Flux de carbone organique dissous et d’azote inorganique dissous
(FCOD et FNID) ........................................................................................ 54
1.4. Descripteurs de sédiments........................................................................... 54
1.4.1. Granulométrie....................................................................................... 54
1.4.2. Matière sèche (MS) et matière sèche sans cendre (MSSC) ................. 55
1.5. Mesure de la dénitrification......................................................................... 55
1.5.1. Dénitrification in situ (DNT)................................................................ 57
1.5.2. Activité enzymatique dénitrifiante (DEA) ........................................... 58
1.5.3. Calculs de production de N2O.............................................................. 58
1.5.3.1. Concentrations de N2O in situ....................................................... 59
1.5.3.2. Concentration de N2O traité in vitro ............................................. 60
1.6. Densité et composition des communautés bactériennes ............................. 61
1.6.1. Dénombrement des bactéries totales .................................................... 61
1.6.2. Caractérisation des communautés bactériennes totales et dénitrifiantes .. 62
2
Sommaire
1.6.2.1. Enrichissement des bactéries dénitrifiantes................................... 62

1.6.2.2. Choix des marqueurs : 16S ARNr et nosZ.................................... 63
1.6.2.3. Analyse moléculaire : PCR-DGGE............................................... 64
1.6.2.3.1. Extraction d’ADN .................................................................. 64
1.6.2.3.2. PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................ 65
1.6.2.3.3. DGGE .............................................................................................67
1.6.2.3.4. Séquençage et analyse phylogénétique des OTUs de DGGE .....68
1.6.2.3.5. Quantification par PCR en temps-réel ................................... 69
1.6.2.4. Diversité métabolique : BIOLOG EcoPlate .................................. 70
1.7. Unités d’expression des résultats ................................................................ 71
1.8. Méthodes Statistiques.................................................................................. 71
1.8.1. Tests non paramétriques....................................................................... 71
1.8.2. Régression linéaire multiple pas à pas ................................................. 71
1.8.3. Test d’imbrication (Nestedness test) .................................................... 72
1.8.3. Test de Mantel...................................................................................... 73
1.8.4. Carte auto-organisées (Self-Organizing Map SOM)............................ 74
1.8.5. La Régression partielle aux moindres carrés (PLS) ............................. 75
1.8.6. Analyse Canonique des Correspondances (ACC)................................ 76
2. Les Biofilms Phototrophes du lit de la rivière.................................................... 78
2.1. Echantillonnage........................................................................................... 78
2.2 Descripteurs de la biomasse épilithique ....................................................... 80
2.3. Activité dénitrifiante : DEA limitée en carbone.......................................... 80
2.4. Typage des communautés bactériennes ...................................................... 81
2.5 Quantification par PCR en temps réel.......................................................... 82
3. Analyse en Coordonnées Principales (ACoP).................................................... 82
Chapitre III. Variabilité spatio-temporelle des processus de la dénitrification

(DNT et DEA) au sein d’un aquifère alluvial ........................................................ 84
1. Introduction ........................................................................................................ 85
2. Résultats ............................................................................................................. 87
2.1. Dénitrification potentielle (DEA) dans l’eau et les sédiments .................... 90
3
Sommaire
2.2. Variabilité spatiale de la dénitrification au sein du sédiment alluvial (DNT

et DEA) .............................................................................................................. 91
2.3. Variabilité temporelle de la dénitrification (DNT et DEA) ........................ 96
3. Discussion ........................................................................................................ 102
4. Conclusions et perspectives ............................................................................. 105
Chapitre IV. Rôle fonctionnel des communautés bactériennes attachées et libres

dans l’aquifère alluvial........................................................................................... 108
1. Introduction ...................................................................................................... 109

2. Analyse des différences entre la composition des communautés attachées et
libres à l’intérieur (IHD) et à l’extérieur (OHD) de hot spots de dénitrification au
sein d’un aquifère alluvial .................................................................................... 111
3. Publication........................................................................................................ 113
4. Résultats complémentaires à la publication ..................................................... 152
5. Conclusion et perspectives ............................................................................... 155
Chapitre V. Etude de la structuration des communautés bactériennes attachées

à travers une expérience de colonisation au sein de l’aquifère alluvial............. 157
1. Introduction ...................................................................................................... 158

2. Relation entre la structuration des communautés bactériennes dénitrifiantes et la
dénitrification au cour d’une colonisation............................................................ 160
3. Publication........................................................................................................ 162
4. Résultats et analyses complémentaires ............................................................ 189
4.1. Relation colonisation/flux nutritif ............................................................. 189
4.2. Communautés 16S ARNr.......................................................................... 190
4.3. Imbrication des communautés 16S ARNr de BH ..................................... 192
4.4. Relation entre les communautés 16S ARNr et nosZ................................. 193
4.5. Structure des communautés dénitrifiantes................................................. 193
4.6. Analyse des CLPP (Community Level Physiological Profil) ................... 195
4.6.1. Analyse spatiale des CLPP................................................................. 195
4.6.2. Analyse temporelle des CLPP (Community Level Physiological
Profiles) ........................................................................................................ 196
4
Sommaire
5. Discussion ........................................................................................................ 200

Chapitre VI. Relation structure fonction au sein d’un

d’assemblage phototrophe: BP de rivière ............................................................ 206
1. Introduction ...................................................................................................... 207

2. Résultats ........................................................................................................... 208
3. Discussion ........................................................................................................ 219
Conclusion et perspectives générales.................................................................... 223

Annexes ................................................................................................................... 231
Références bibliographiques ................................................................................. 236
5
Liste des abréviations

ACC : analyse canonique des correspondances
ACoP : analyse en coordonnées principales
ADN : acide désoxyribonucléique
ARB : du latin Arbor (arbre)
ARNr : acide ribonucléique ribosomique
AWCD : average well color development
BH : biofilm hétérotrophe
BMU : best matching unit
BP : biofilm phototrophe
CLPP : community level physiological profiles
CPG : chromatographe en phase gaseuze
DAPI : 4',6-diamidino-2-phenylindole
DEA : activité enzymatique dénitrifiante ou dénitrification potentielle
DEA-LC : denitrification enzyme activity limited in carbone
DESUPS : diplôme des études supérieures de l’Université Paul Sabatier
DGGE : denaturing gradient gel electrophoresis
DNT : denitrification in situ
EDTA : l'acide éthylène-diamine-tétraacétique
FCOD : flux de carbone organique dissous
FNID : flux d’azote inorganique dissous
INRA : institut national de la recherche agronomique
MS : matière sèche
MSSC : matière sèche sans cendre
OTU : operational taxonomic unit
PCR : polymerase chain reaction
PLS : Partial Least Square
PRS : phosphate réactive soluble
6
PT : phosphate total
Ppmv : parties par million en volume
PRIP : prévention et réduction intégrées de la pollution
Pb : paire de base
QMJ : débit moyen journalier
RDNA : réduction dissimilative du nitrate en ammonium
Rpm : révolution par minute
SOM : self organizing map
T-RFLP : terminal-restriction fragment length Polymorphism
TE : tris d'acide éthylène-diamine-tétraacétique
TS : température du système
UV : ultra-violet
UPGMA : unweighted pair group method with arithmetic mean
7
Introduction
8
Introduction
Introduction
L’intervention de l’Homme sur le cycle de l’azote a continuellement

augmenté depuis 1860 avec l’évolution des pratiques agricoles et le développement
de l’industrie. Ce processus s’est surtout intensifié depuis la seconde partie du XXème
siècle. Les quantités des différentes formes d’azote réactif (e.g. NH4+, NH3, NOx,
HNO3, N2O, NO3-) générées par les pratiques agricoles ont été multipliées par 10 au
cours des dernières décennies (GALLOWAY et al. 2003). Dans les écosystèmes
aquatiques, l’augmentation d’un facteur 2 à 4 des concentrations en nitrate est
clairement associée aux activités humaines (SEITZINGER et KROEZE 1998) et a
considérablement augmenté le risque d’eutrophisation des eaux douces et marines
(MCISAAC et al. 2001 ; NIXON 1995). Parmi les différents écosystèmes aquatiques,
les zones riveraines revêtent un intérêt particulier par leur capacité à atténuer les
apports de nitrate du bassin versant à la rivière et, en conséquence, dans les
écosystèmes situés à l’aval (GALLOWAY et al. 2003 ; GILLIAM 1994). En effet, les
zones alluviales des grands fleuves constituent des zones d’interface entre le fleuve
et les écosystèmes terrestres adjacents et notamment les agroécosystèmes. Elles
constituent donc un des réceptacles du flux de nitrate d’origine agricole (fertilisants
azotés d’origine industrielle et organique). Ces zones de contact entre les eaux
souterraines et les eaux de rivière sont identifiées comme des zones clef pour la
rétention des contaminants diffus (LOWRANCE et al. 1984 ; PETERJOHN et CORRELL
1984 ; DAHM et al. 1998). Leur capacité à purifier les eaux souterraines de certains
de leurs polluants comme les nitrates (MAITRE et al. 2002) peut résulter de trois
processus principaux : l’absorption racinaire (JORDAN et al. 1993 ; O'NEILL et
GORDON 1994), la dilution (BÖHLKE et DENVER 1995 ; HILL et al. 2000) et la
dénitrification (GROFFMAN et al. 1992 ; PINAY et al. 1993). La dénitrification serait
le processus le plus important. D’autres processus alternatifs comme l’anammox
(JETTEN et al. 2001) ou la RDNA (Réduction Dissimilative des Nitrates en
9
Introduction
Ammonium) (TIEDJE 1988) peuvent concurrencer la dénitrification mais ils ont été
peu étudiés en milieu d’eau douce (BURGIN et HAMILTON 2007).
La dénitrification complète consiste en la réduction des nitrates (NO3-) en

azote gazeux (N2) via quatre séquences réductrices (NO3-→NO2-→NO→N2O→N2).
Ce processus a été identifié chez les bactéries depuis le XIXème siècle, par Gayon and
Dupetit (GAYON et DUPETIT 1886) et aujourd’hui est étudié dans des milieux très
différents, de la colonne d’eau marine (JAYAKUMAR et al. 2004) jusqu’à l’estomac
des vers de terre (HORN et al. 2006). Lors d’une réduction incomplète des nitrates, la
dénitrification peut générer de l’oxyde nitrique (NO) et du protoxyde d’azote (N2O).
Dans le cas d’une dénitrification complète (production de N2), le processus peut être
considéré comme un « service écologique » réduisant les charges de nitrates dans les
ressources d’eau, dans cas d’une dénitrification incomplète, au contraire, l’émission
de NO et N2O a un impact négatif, ces deux gaz contribuant à l’effet de serre et à la
destruction de l’ozone stratosphérique (BOTHE et al. 2007). Dans les écosystèmes
riverains, la dénitrification est une fonction qui permet l’élimination d’une partie de
l’excès d’azote dissous, diminuant les risques d’eutrophisation (GROFFMAN et TIEDJE
1989 ; WILLEMS et al. 1997 ; SABATER et al. 2003 ; VAN CLEEMPUT et al. 2007). On
estime que dans ces zones s’effectue par dénitrification l’élimination de 15 à 100%
des nitrates transportés à travers les sédiments alluviaux de l’aquifère (MCMAHON et
BÖHLKE 1996 ; RUFFINONI et al. 2003). De nombreuses études utilisant l’approche
biogéochimique ont permis au cours des années antérieures de mieux comprendre
l’importance et les facteurs de contrôle de la dénitrification dans les zones alluviales.
Elles ont par ailleurs suscité de nombreuses questions concernant les acteurs
biologiques de ce processus : les bactéries dites dénitrifiantes. Ce travail se base sur
certaines de ces questions : Quelle est la différence entre les communautés
dénitrifiantes libres et attachées ? Quelle est la dynamique spatiale et temporelle
(hautes et basses eaux) de ces communautés bactériennes ? Comment ces
communautés se structurent-elles, quels sont les facteurs qui contrôlent leur
10
Introduction
structuration ? Quelles est la relation entre la composition des ces communautés et la

dénitrification ?
Une nouvelle voie en Ecologie fonctionnelle consiste à décrire comment

interagissent les fonctions de l’écosystème, la dynamique des communautés et les
conditions abiotiques (LOREAU et al. 2001). Cette question concerne naturellement
les bactéries dont la contribution au fonctionnement des écosystèmes est reconnue
(SCHIMEL 1995). Or la contribution de la diversité bactérienne au fonctionnement des
écosystèmes est encore peu étudiée (BELL et al. 2005). Ce travail s’inscrit dans cette
logique en prenant les communautés bactériennes dénitrifiantes de différents
assemblages bactériens (bactéries libres et fixées de l’aquifère, bactéries des biofilms
phototrophes de rivière) comme modèle. La dénitrification est un trait assez répandu,
puisqu’on estime que 5 à 15 % des bactéries que l’on rencontre dans des milieux
naturels peuvent dénitrifier (TIEDJE 1988 ; CASELLA et PAYNE 1996 ; HENRY et al.
2006). Les différentes étapes de dénitrification (NO3-→NO2-→NO→N2O→N2) sont
catalysées par différentes enzymes que l’on regroupe sous l’appellation générique de
N réductases dont la distribution chez les Bactéries est polyphylétique (ZUMFT
1997) ; (PHILIPPOT et al. 2001). Les bactéries dénitrifiantes constituent un groupe
fonctionnel intéressant car composé par des bactéries de différents genres comme
Pseudomonas, Ralstonia, Alcaligenes, Paracoccus, Rhodobacter, Rubrivivax,
Thauera, Burkholderia, Bacillus et Streptomyces (ZUMFT 1992), sans que le
processus soit « trop » généraliste (par opposition, la dégradation des composés
carbonés est un processus redondant (tel que défini par WALKER (1992). D’autre
part, la dénitrification est relativement facile à mesurer en laboratoire (TEISSIER et M.
2002) ou in situ (ADDY et al. 2002). Enfin, l’apport des techniques de typage
moléculaire permettent d’explorer la diversité fonctionnelle par amplification
partielle des gènes codant pour les N réductases (SCALA et KERKHOF 1998 ; BRAKER
et al. 1998 ; HALLIN et LINDGREN 1999 ; THROBACK et al. 2004) et couplage à des
méthodes d’empreinte génétique; (RICH et al. 2003 ; ZHOU et al. 2002).
11
Introduction
En combinant des méthodes biogéochimiques et des méthodes de typage

moléculaire, nous avons étudié le rôle fonctionnel des communautés bactériennes
dénitrifiantes principalement au sein des Biofilms Hétérotrophes (BH) d’un aquifère
alluvial.
Ce manuscrit se compose de deux parties (Figure 1). La première partie

divisée en trois chapitres présente une synthèse bibliographique axée successivement
sur les études de la composition des communautés bactériennes, les facteurs qui
influencent leur composition et l’importance de la diversité sur les capacités
fonctionnelles des communautés. Le modèle d’étude, la communauté dénitrifiante et
la dénitrification sont aussi présentés. Dans le deuxième chapitre, nous décrivons les
caractéristiques métaboliques, moléculaires et écologiques des bactéries
dénitrifiantes afin de présenter en détail le modèle utilisé et les connaissances sur son
rôle dans le cycle de l’azote. Pour terminer cette partie, nous avons introduit le rôle
écologique des bactéries dénitrifiantes dans les systèmes aquatiques étudiés dans ce
travail.
La seconde partie est divisée en cinq chapitres. Le premier décrit la

méthodologie utilisée pour cette étude. Le deuxième porte sur la description des
patrons de la dénitrification dans une zone alluviale de la Garonne avec des
comparaisons de mesures de l’activité in situ (Dénitrification iN siTu-DNT) et de
l’activité enzymatique dénitrifiante (Denitrification Enzyme Activity - DEA). Afin de
pouvoir identifier les rôles respectifs des communautés bactériennes associées aux
compartiments eau et sédiment, nous avons comparé la composition des
communautés attachées au sédiment (biofilm) et libres dans l’eau souterraine au sein
des zones alluviales de forte et faible dénitrification. Ceci nous a dirigé pour le
quatrième chapitre vers l’étude de la structuration des communautés impliquées dans
la dénitrification dans l’aquifère alluvial, les communautés dénitrifiantes au sein du
BH. L’objectif était d’étudier la dynamique des ces communautés au cours d’une
expérience de colonisation afin de tester l’hypothèse que la diversité dénitrifiante
12
Introduction
explique l’hétérogénéité (patchiness) observée au niveau de la dénitrification dans

l’aquifère alluvial.
Chapitre III, IV et V Chapitre VI
Dénitrification (DNT et DEA) Dénitrification (DEA-CL)
Rôle fonctionnel
des bactéries
attachées et libres
BIOFILM HETEROTROPHE BIOFILM PHOTOTROPHE

Structuration de communautés Diversité communautés
bactériennes
Diversité Diversité Diversité Diversité
fonctionnelle taxonomique fonctionnelle taxonomique
Figure 1 : Schéma récapitulatif des problématiques abordées dans la partie expérimentale du

travail (chapitre III, IV, V et VI). DNT : dénitrification in situ ; DEA : activité enzymatique
dénitrifiante et DEA-LC : activité enzymatique dénitrifiante limitée en carbone.
Enfin, dans le chapitre VI nous avons étudié la relation entre la diversité

dénitrifiante et la dénitrification sur le biofilm phototrophe de rivière (BP) afin de
déterminer comment l’écosystème (rivière) et la composition de l’assemblage
(présence d’organismes phototrophes) agissent sur la sélection des bactéries
dénitrifiantes et les conséquences de cette action sur la dénitrification. La dernière
partie de ce travail est une synthèse des résultats acquis et une présentation des
perspectives qu’ils permettent d’envisager.
13
Chapitre I. Relation entre la
composition des communautés
bactériennes et le fonctionnement
des écosystèmes : état de l’art
Ce premier chapitre a pour objectif de présenter, avant la description des différentes

parties expérimentales, le contexte général dans lequel s’inscrit ce travail. Il décrit
les modèles utilisés, les communautés bactériennes dénitrifiantes, et donne un aperçu
de l’environnement dans lequel ces communautés ont été étudiées : les aquifères
alluviaux.
14
Ch. I : Etat de l’art
1. Les communautés bactériennes
1.1. Définition
Il est difficile de déterminer quand le terme de communauté a été utilisé pour

la première fois avec les bactéries, mais de nombreuses études ont décrit la
composition de communautés bactériennes présentes dans différents milieux,
aquatiques (CRUMP et al. 1999 ; DANG et LOVELL 2000 ; ARAYA et al. 2003) comme
terrestres (RANJARD et al. 2000 ; WEBSTER et al. 2003 ; RICH et MYROLD 2004).
En Ecologie, la communauté est généralement définie comme un ensemble de

populations, i.e. d’individus de différentes espèces qui coexistent en même temps et
au même endroit (BEGON et al. 1996). Mais cette définition est trop générale pour
être appliquée directement aux communautés bactériennes. En Ecologie
microbienne, le terme communauté peut désigner des assemblages d’espèces
bactériennes qui sont en interaction dans un même écosystème, milieu, habitat et/ou
qui partagent une même fonction. Dans notre manuscrit, le terme communauté sera
utilisé avec une connotation fonctionnelle en parlant par exemple de la communauté
dénitrifiante qui rassemble l’ensemble des bactéries partageant la capacité à
dénitrifier. Les assemblages qui sont présents dans un même milieu mais dans
différents micro-habitats peuvent également être désignés comme des communautés
différentes, par exemple les communautés libres (i.e. bactéries en suspension dans le
milieu aquatique) et les communautés attachées (i.e. bactéries incluses dans un
biofilm à la surface d’un substrat solide) décrites dans certains travaux (LEHMAN et
O'CONNELL 2002 ; BESEMER et al. 2005). Cette acception du terme sera également
utilisée dans ce texte.
15
1.2. Diversité des communautés bactériennes
1.2.1. Définition de la biodiversité

“La diversité biologique est la variabilité entre les êtres vivants de toutes
origines ; ceci inclut la diversité au sein des espèces, entre les espèces et des
écosystèmes”. Cette définition est celle retenue lors de la Convention de la Diversité
Biologique signée par plus de 150 nations à Rio de Janeiro en 1992 (CBD 2001).
Dans son acception la plus large, le terme de biodiversité fait donc référence à
l’amplitude de la variabilité du vivant. Il s’applique aux différents niveaux
d’organisation biologique, des gènes jusqu’aux écosystèmes en passant par les
individus, populations et communautés.
1.2.2. La diversité bactérienne
Les bactéries seraient plus de 1030 individus sur Terre (WHITMAN et al. 1998)
et même si l’on considère généralement que la diversité bactérienne ne représentent
qu’un faible pourcentage de la biodiversité globale (sur toutes les espèces identifiées
0,2% seraient des bactéries (CBD 2001), la grande diversité des ressources
énergétiques et voies métaboliques qu’elles utilisent leur confère un rôle majeur dans
le fonctionnement des écosystèmes. En microbiologie, la notion d’espèce (Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology 2nd edition, (2001)) est utilisée pour désigner une
collection de souches microbiennes qui partagent plusieurs propriétés similaires et
différentes de celles d’autres groupes de souches. Les Bactéries peuvent être classées
en trois groupes par exemple sur la base de leur morphologie : les Gram + (Bactéries
avec une paroi homogène composé de peptidoglycane), les Gram – (Bactéries avec
une paroi plus complexe composée d’une couche de petidoglycane et d’une
membrane externe) et celles qui ne sont pas dotées de paroi. Les autres
caractéristiques utilisées sont les caractéristiques biochimiques, la forme de la
cellule, la morphologie des colonies etc. Actuellement, la classification
16
phylogénétique basée sur les séquences de l’ARN 16S ribosomal (16S ARNr) illustre
l’hétérogénéité existant dans le domaine des Bactéries (Figure I.1).
L’étude de la diversité bactérienne est importante pour connaître la

composition génétique de la communauté, comprendre les patrons de distribution des
bactéries, améliorer la connaissance de ces communautés et gérer la diversité pour
permettre le fonctionnement et la viabilité des écosystèmes (OVREAS 2000).
Traditionnellement, le terme de diversité se réfère à une diversité dont l’unité de base
est l’espèce, cependant chez les bactéries plus que chez les autres organismes, définir
l’espèce est problématique en absence de véritable barrière aux flux de gènes.
L’utilisation du niveau taxonomique d’espèce chez les bactéries a cependant été
considérée comme pratique, pragmatique, commode et arbitraire (WARD 1998). La
diversité bactérienne décrit le nombre d’espèces bactériennes et leur abondance
relative dans une communauté, ou la quantité et la distribution de l’information
(génétique) dans la communauté (définition proposée par Atlas, 1984 cité par
TORSVIK et al. (2002)).
17
Figure I.1. Arbre phylogénétique basé les séquences de 16S ARNr montrant les
principaux phyla bactériens. Les triangles représentent les groupes d’organismes
apparentés, l’angle à la racine indique approximativement le nombre de séquences
disponibles et les limites représentent la plus courte et la plus longue branche à l’intérieur du
groupe. L’arbre a été reconstruit, évalué et optimisé en utilisant l’outil parcimonie dans le
logiciel ARB. Seule les positions de séquence partageant des résidus identiques à au moins
50% de toutes les séquences bactériennes ont été inclues dans le calcul. L’arbre a été
enraciné en utilisant toutes les séquences homologues disponibles et complètes chez les
Archaea et les Eucarya prises comme référence hors-groupe (représenté par la flèche). La
longueur des triangles représente la profondeur phylogénétique des lignées principales. La
barre correspond à 10% de divergence de la séquence estimée (extrait de LUDWIG et KLENK
(2001)).
La diversité des bactéries peut être étudiée au niveau phénotypique, sur la

base de leur composition en acides gras (pour revue cf. OVREAS 2000) mais aussi sur
la base de leurs propriétés métaboliques comme l’utilisation de différentes sources de
carbone (en utilisant le kit commercial Biolog par exemple, GARLAND et MILLS
(1991)).
18
Le développement des techniques de biologie moléculaire a recemment

permis d’aborder la diversité génotypique des communautés bactériennes. Le
développement des méthodes d’empreinte génétique - i.e. la DGGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis (MUYZER et al. 1997), la T-RFLP (Terminal-
Restriction Fragment Length Polymorphism (LIU et al. 1997) ou le clonage (MEAD
et al. 1991) – a permis de s’affranchir des techniques de culture très contraignantes
(accès à seulement 1% de la population totale (AMANN et al. 1995) et associées à des
biais inévitables (effet de sélection). Ces techniques de biologie moléculaire ont
également donné accès à une diversité bactérienne plus large que la seule diversité
cultivable dans les écosystèmes étudés. Elles restent cependant encore loin de
pouvoir fournir une idée de la diversité bactérienne dans sa globalité (WHITMAN et
al. 1998).
1.2.3. La diversité fonctionnelle bactérienne

Les mécanismes par lesquels la diversité influence le fonctionnement de
l’écosystème sont liés aux attributs des espèces plutôt qu’au nombre total d’espèces
présentes (GILLER et al. 2004). Certaines bactéries sont autotrophes, d’autres
hétérotrophes, certaines sont aérobies strictes, d’autres aérobies facultatives et
d’autre encore anaérobies. Parmi les hétérotrophes, on trouve même des
photosynthétiques. Les bactéries sont donc responsables de la majorité des processus
biogéochimiques dans les écosystèmes terrestres et aquatiques (BELL et al. 2005).
Elles recyclent la matière organique pour les plantes et autres organismes autotrophes
et sont même capables de dégrader des composés xénobiotiques. Au sein des
écosystèmes aquatiques, une de leur fonction est de dégrader la matière organique et
de recycler des éléments inorganiques (soufre, phosphore, azote) par des voies
métaboliques telles que la sulfatoréduction ou la dénitrification. Ainsi les bactéries
peuvent être groupées en fonction des voies métaboliques qu’elles sont capables
d’assumer - i.e. bactéries sulfatoréductrices, dénitrifiantes. La diversité fonctionnelle
peut donc être définie comme le nombre de processus ou fonctions qu’une
19
communauté est capable de réaliser (GASTON et SPICER 1998). L’isolation de

souches bactériennes a permis d’identifier les capacités fonctionnelles de
communautés bactériennes depuis (WINOGRADSKY 1948). Mais, depuis le
développement des marqueurs fonctionnels (gènes utilisés en typage moléculaire des
communautés bactériennes pour étudier la diversité fonctionnelle (TORSVIK et
OVREAS 2002) en biologie moléculaire, i.e. amoA pour les bactéries ammonio-
oxydantes, nirS bactéries dénitrifiantes, la diversité fonctionnelle des communautés
bactériennes cultivables et non-cultivables est accessible.
1.2.4. La mesure de la diversité
La description de la diversité impose que celle-ci soit quantifiée. Si en théorie

cette question peut paraître simple et se résumer à déterminer quelles entités sont
présentes (espèces, allèles) et par combien d’unités chacune est représentée (nombre
d’individus, nombre de copies) (GASTON et SPICER 1998), dans la pratique cette
quantification est généralement plus difficile. Par exemple, s’agissant de la
variabilité au sein d’une espèce, plusieurs critères peuvent être retenus pour définir
les différentes entités et la variabilité peut aussi bien être considérée sous l’angle de
la biochimie (ex. sérotypes), de l’écologie, (ex. la Brocadia anammoxidans capable
de nitrifier et dénitrifier (MULDER et al. 1995)), de la morphologie (ex. Vibrio
halioticoli à formes bacillaire et coco-bacillaire selon le type de milieu de culture
utilisé) ou encore au regard du rôle que cette variabilité joue sur les aspects
fonctionnels de l’espèce au sein d’une communautés donnée (ex. prédateur, proie). Il
n’existe pas de mesure unique qui puisse embrasser cette diversité (GASTON et
SPICER 1998).
Les méthodes moléculaires basées sur le marqueur 16S ARNr se sont

substituées aux méthodes de cultures en donnant accès aux bactéries non cultivables
(AMANN et al. 1995 ; MADSEN 2004). Néanmoins, la magnitude de la diversité
bactérienne est encore une source de débat (CURTIS et SLOAN 2004) et l’estimation
20
de celle-ci reste parmi les problèmes de l’écologie bactérienne actuelle (TORSVIK et

al. 2002).
La diversité α, ou diversité dans l’échantillon, est exprimée généralement à

l’aide de différents indices mathématiques. Parmi ceux-là, les indices de Simpson
(SIMPSON 1949) et de Shannon (SHANNON et WEAVER 1963) sont les plus utilisés
pour les communautés bactériennes. Ce sont des indices qui se basent sur le nombre
d’espèces et l’abondance relative de chacune : D = Σ (NS / NT)² (Simpson) et H = -
Σ [(NS / NT) x log2 (NS / NT)] (Shannon) ; NS :nombre d’individus par taxon et
NT=nombre total de taxons.
Pour comparer directement des échantillons deux à deux, et ainsi obtenir la

diversité β on utilise souvent les indice de Jaccard : J = [c / (a+b-c)] x 100 où a :
bandes présentes seulement dans l’échantillon A ; b : bandes présentes seulement
dans l’échantillon B et c : bandes totales communes aux échantillons A et B.
1.3. Facteurs qui affectent la composition d’une

communauté bactérienne dans un aquifère
1.3.1 Facteurs abiotiques
Comprendre les changements de composition des communautés bactériennes

passe par la détermination des facteurs qui affectent ces communautés. A l’échelle
locale, dans un écosystème, la disponibilité des ressources nutritives est un facteur
important. Une des premières études sur les communautés dénitrifiantes de l’aquifère
suggère que les communautés habituées à de fortes concentrations en nitrates
développent des réductases avec une capacité optimum (BEGTSSON et BERGWALL
1995). Récemment, l’utilisation des techniques moléculaires a permis à BESEMER et
al. (2005) de montrer que la composition des communautés bactériennes au sein d’un
21
aquifère alluvial dépend des concentrations en nutriments organiques et inorganiques

dans l’eau, en accord avec JUDD et al. (2006) qui a observé une forte relation entre le
taux de carbone organique dissous et la composition des communautés bactériennes
de rivière. Dans le cas des communautés bactériennes de lacs, plutôt que la
concentration, c’est le type de carbone disponible qui agit sur la composition des
communautés bactériennes d’après EILER et al. (2003).
Dans le cas des aquifères, la composition des communautés bactériennes peut

également varier en fonction de la disponibilité en carbone et des niveaux de
contamination par des composés xénobiotiques. RÖLING et al. (2001) montre que des
zones polluées par du benzène, du toluène, de l’éthyl-benzène et du xylène ont des
compositions bactériennes qui diffèrent de celles des zones non contaminées. Dans
une étude en milieu souterrain comparant deux milieux caractérisés par des
concentrations en herbicides contrastées, DE LIPTHAY et al. (2004) observe un impact
sur la structure (morphotypes, formes de colonies) mais pas sur les diversités
génétique et métabolique.
La perturbation de l’écosystème – i.e. un changement brutal et imprévisible

des caractéristiques de l’habitat – cause des changements importants sur les
communautés des différents organismes. Dans le cas des aquifères, une crue est
considérée comme une perturbation (BOULTON et al. 1998). En général, les
communautés bactériennes répondent aux perturbations du milieu comme les macro-
organismes, mais leurs taux de croissance généralement plus élevés permettent une
réponse plus rapide. Au cours de la perturbation ou dans les situations post-
perturbation, tous les taxons de la communauté ne sont pas égaux. Certains, par leur
capacité à s’adapter à la nouvelle situation, leur l’abondance relative avant la
perturbation peuvent prendre le dessus sur les autres et en conséquence accroitre leur
représentation au sein de la communauté. Dans une étude de l’effet des degrés et
types de perturbation (artificiellement crées) sur la composition des communautés
bactériennes. GRIFFITHS et al. (2004) soulignent l’importance des différents taxons
22
composant une communauté pour le maintient d’un processus dans un écosystème.

La stabilité de la communauté, c’est à dire l’absence d’extinction ou d’explosion
démographique de certaines espèces suite à une perturbation, dépend de la diversité
dans la communauté : plus la diversité est importante plus la communauté est stable
(LOREAU et al. 2003). L’hypothèse d’assurance temporelle propose que la
biodiversité joue le rôle d’une « assurance » face aux variations environnementales si
les espèces sont fonctionnellement complémentaires dans le temps. L’hypothèse
d’assurance spatiale applique cette idée dans une métacommunauté (somme de
communautés reliées par la dispersion), en considérant que la complémentarité
temporelle peut venir d’une complémentarité spatiale et de taux de dispersion
appropriés entre les communautés (LOREAU et al. 2003).
1.3.2. Facteurs biotiques

Parmi les facteurs biotiques qui affectent la composition des communautés
bactériennes, on identifie la plasticité métabolique et physiologique des
communautés. Ces facteurs biotiques ont souvent été étudiés à travers la
manipulation des concentrations en éléments nutritifs ou des conditions physiques du
milieu dans des expériences au laboratoire (PEACOCK et al. 2004 ; FINDLAY et al.
2003). Certain auteurs ont aussi testé la résistance des communautés (i.e. le maintien
de la diversité et de la fonction) face à différentes concentrations de contaminants
comme le nickel (LAWRENCE et al. 2004). Pour les communautés bactériennes de
biofilms hyporhéiques, la plasticité du métabolisme azoté, très répandue chez les
bactéries, permet l’assimilation de différentes formes d’azote et induit que les
variations des concentrations en azote sous ses différentes formes affectent la
composition métabolique mais pas la structure taxonomique (FINDLAY et al. 2003).
L’histoire de la communauté, c’est-à-dire, la séquence des arrivées d’espèces

dans la communauté peut aussi être un facteur qui agit sur la composition des
communautés bactériennes. LONG et KAREL (2002) soulignent l’importance de
23
l’histoire de la communauté : une espèce installée ayant de ce seul fait un avantage

sur d’autres espèces arrivant ultérieurement lorsque les ressources ne sont pas
limitantes. Cependant, cette étude a été réalisée avec des ciliés (Colpidium sp.,
Paramecium sp. et Tetrahymena sp.) et à notre connaissance il n’existe pas d’étude
similaire conduite sur des communautés bactériennes.
Les organismes unicellulaires grâce à leur petite taille, leur abondance et leur
plasticité métabolique sont peu contraints dans leur dispersion. Au début du XXème
siècle, les scientifiques ont commencé à s’intéresser à la distribution spatiale des
communautés bactériennes (BEIJERINCK 1913 ; BAAS BECKING 1934). Depuis, la
distribution des bactéries est considérée comme ubiquiste mais récemment plusieurs
études ont démontré l’existence de l’endémisme chez les procaryotes (pour revue cf.
RAMETTE et TIEDJE (2006)). La distribution géographique des communautés
bactériennes dépend de la spéciation, des extinctions et de la dispersion (RAMETTE et
TIEDJE 2006). La distribution des communautés bactériennes au sein d’un
écosystème donné est aussi la conséquence des exigences de niche des membres de
cette communauté. Les processus qui agissent sur la géographie des communautés
bactériennes comparée aux eucaryotes ont été récemment abordés par HORNER-
DEVINE et al. (2004).
2. Rôle de la diversité sur le fonctionnement d’un écosystème
“It appeared that a plot of ground sown with several different types of grass
was more productive than a similar plot with just one species of grass” remarquait
Darwin dans On the origin of species by mean of natural selection (1859). Il faisait
référence au travail de George Sinclair, chef des jardiniers du Duc de Bedford au
début du XIXème siècle qui, à partir de plantations combinant différentes espèces
végétales et différents types de sols dans le jardin de Woburn Abbey, a réalisé la
première étude expérimentale sur la relation entre biodiversité et fonctionnement
24
d’un écosystème (HECTOR et HOOPER 2002). Cependant, ce n’est que cent ans plus
tard, avec la publication de Biodiversity and ecosystem functioning (SCHULZE et
MOONEY 1994), que l’étude de la relation entre biodiversité et fonctionnement d’un
écosystème est devenue un enjeu majeur d’une discipline en passe de
s’imposer comme telle : l’ « Écologie fonctionnelle ».
Depuis que les extinctions d’espèces et leur introduction dans de nouveaux

écosystèmes connaissent un rythme inégalé du fait des activités humaines, la
biodiversité a été placée au centre de questions scientifiques et d’enjeux de politique
et de gestion (LOREAU et al. 2001 ; HOPPER et al. 2005 ; SRIVASTAVA et VELLEND
2005 ; DIVERSITAS 2005). Ceci est d’autant plus vrai que les changements de
biodiversité s’accompagnent parfois d’un impact clairement négatif d’un point de
vue anthropocentrique et utilitariste. Ainsi, la qualité des biens et services délivrés
par les écosystèmes (ecological service and goods sensu CHAPIN III et al. (2000))
peut être négativement affectée par une modification de leur biodiversité.
2.1. Des modèles théoriques aux études empiriques
L’observation répétée d’une relation entre modification de la biodiversité et

altération des biens et services produits par un écosystème conduit à s’interroger sur
la nature de cette relation et sur les mécanismes qui la déterminent ; ceci
particulièrement afin de prédire les conséquences de gains et pertes de biodiversité.
Dans ce contexte, la biodiversité additionnée ou perdue doit être abordée sur le plan
fonctionnel et l’étude de la relation entre la structure des communautés et le
fonctionnement de l’écosystème devient centrale. VITOUSEK et HOOPER (1993) ont
été les premiers à proposer des hypothèses expliquant la relation entre la biodiversité
et une fonction donnée au sein d’un écosystème. Les trois principales sont les
hypothèses de la redondance, du portefeuille et de l’idiosyncrasie (Figure I.2). Dans
cette figure, les graphes établissent la trajectoire que doit suivre une variable
25
représentant l’intensité d’un processus en fonction de trois modèles de relation à la

biodiversité. Dans le cas de l’hypothèse de redondance (i.e. redondance fonctionnelle
entre les espèces sensu (WALKER 1992), le processus étudié est peu affecté par
l’érosion de la biodiversité, chaque espèce étant capable d’assurer le processus
considéré à la place des espèces supprimées. Dans le cas de l’hypothèse du
portefeuille, par référence à un portefeuille d’actions, le principe retenu est celui
d’une additivité simple : chaque espèce assure une part du processus de façon
irremplaçable. Enfin, l’idiosyncrasie propose que les conséquences de la disparition
d’une espèce dépendent des conditions abiotiques du milieu, donc l’impact sur le
processus considéré sera variable.
Redondance Portefeuille Idiosyncrasie

Intensité de processus
Niveau Niveau Niveau

Perte de biodiversité Perte de biodiversité Perte de biodiversité
naturel naturel naturel
Biodiversité
Figure I.2. Représentations graphiques des hypothèses de la redondance, du
portefeuille et de l’idiosyncrasie régissant la relation entre biodiversité et fonction
d’un écosystème (modifié d’après (NAEEM et al. 2002).
Si ces modèles théoriques sont disponibles, leur validation empirique est

insuffisante. Notamment il reste à préciser dans quelles conditions et quels types
d’écosystèmes chacun peut être appliqué.
L’intérêt de coupler la biodiversité au fonctionnement de l’écosystème a été

récemment promu par (KINZIG et al. 2001). Toutefois, l’étude de la relation
biodiversité/fonction de l’écosystème et encore peu développée, surtout s’agissant du
domaine de l’écologie des micro-organismes.
26
2.2. Comment mesurer l’intensité de la relation

diversité/fonction ? Quels processus et communautés
bactériennes ont été étudiés ?
S’agissant des études de relation diversité/fonction, le but n’est généralement

pas de rechercher une relation entre espèces et processus, pour plusieurs raisons.
D’une part parce qu’une telle relation serait difficile à établir chez les bactéries pour
lesquelles la validité du concept d’espèce est mise en question. D’autre part, parce
que les méthodes de typage moléculaire citées plus haut ne permettent pas évaluer le
nombre d’espèces et de mesurer la diversité des complexes chez les procaryotes
(BENT et al. 2007). En revanche, ces techniques révèlent des informations nouvelles
sur l’écologie, la biogéographie et la microbiologie appliquée des assemblages
bactériens – i.e. les interaction conditions environnementales/communautés
bactériennes, le rôle fonctionnel des bactéries, la distribution des communautés
bactériennes, les interaction entre les différentes espèces, etc.
La plupart des études qui ont mis en évidence l’effet de la biodiversité sur le
fonctionnement de l’écosystème ont été réalisées dans des écosystèmes terrestres,
avec des plantes (TILMAN 1996 ; NAEEM et al. 1996). Pour les communautés
bactérienne, la relation entre structure de communautés et activité a été plus étudiée
dans les milieux terrestres tels que les sols (CAVIGELLI et ROBERTSON 2000 ;
HOLTAN-HARTWIG et al. 2000 ; HORZ et al. 2004). Les premières études qui ont
montré des couplages entre la diversité des communautés dénitrifiantes et activité
dénitrifiantes se sont basé sur des mesures de cinétiques de dénitrification dans des
sols géomorphologiquement similaires mais avec une occupation végétale et des
perturbations (labouré versus non labouré) différentes (CAVIGELLI et ROBERTSON
2001 ; HOLTAN-HARTWIG et al. 2000). Depuis, l’arrivé des techniques moléculaires a
permis de mieux développer cette approche de la relation structure/fonction. Mais
souvent le choix de processus trop généraux (les Broad processes cités par Schimel,
1995 – pris en charge par toute la communauté, tels la production bactérienne, la
27
respiration, la minéralisation de composants simples de carbone ou l’immobilisation

du carbone) n’a pas permis de trouver un couplage entre diversité et activité. De plus,
les études sont souvent réalisées sur des diversités bactériennes très complexes à
analyser (en terme de nombre d’espèce), ex. diversité des bactéries dans les sols
(RICH et MYROLD 2004 ; ENWALL et al. 2005). Récemment, une expérimentation sur
le rôle fonctionnel des bactéries en milieu contrôlé avec des assemblages
« artificiels » a été conduite avec l’objectif de trouver une relation espèce/processus
(BELL et al. 2005). A travers l’étude du processus de la respiration bactérienne, ces
auteurs confirment que les interactions synergiques entre les espèces bactériennes
ainsi que la composition des communautés sont des facteurs importants qui jouent
sur un rôle fonctionnel dans l’écosystème. Mais manipuler la biodiversité sans tenir
compte des conditions environnementales reste artificiel ou trompeur (WELLNITZ et
POFF 2001). La réponse fonctionnelle des bactéries dépend de l’assemblage dont
elles font partie (HANSEN et al. 2007) donc cette approche ne donne qu’une idée
partielle de la réalité.
3. Le modèle d’étude : les communautés dénitrifiantes des

agrégats naturels
3.1. La dénitrification
3.1.1. Définition
La dénitrification est un processus biologique qui participe au cycle de l’azote

(KNOWLES 1982 ; BOTHE et al. 2007) (Figure I.3). Même si certains eucaryotes
comme les champignons (ZUMFT 1997) et les foraminifères (RISGAARD-PETERSEN et
al. 2006) sont capable de dénitrifier, ce processus est principalement assuré par les
bactéries (ZUMFT 1997). Ce processus hétérotrophe, véritable « respiration des
nitrates », est une alternative à la respiration aérobie : en présence de faibles
28
concentrations d’oxygène ou en son absence, les nitrates jouent le rôle d’accepteur

final d’électron.
NO3-
Dénitrification Nitrification
Seulement procaryotes
Procaryotes et plantes
NO2-
NO2-
Anammox
NO, N2O, N2 Réduction assimilative

des nitrates
Fixation de l’azote NH4+

Assimilation de
Protéolyse
l’ammonium
glutamine
Composant N
Autres amino acides hétérocycliques
protéines
Figure I.3. Le cycle biologique de l’azote (extrait de BOTHE et al. (2007)).
La dénitrification consiste en une réduction séquentielle, en quatre étapes, des

nitrates en azote gazeux. Dans chaque étape différentes enzymes interviennent
(Figure I.4). La première étape consiste en la transformation des nitrates en nitrites.
Elle est catalysée par deux types de molybdo-enzymes : une nitrate-réductase liée à
la membrane (Nar) et une nitrate-réductase periplasmique (Nap).
29
+V +III +II +I 0
NO3- NO2- NO N2 O N2
NO3 - NO2- NO N2 O N2
Espace
Périplasmique
Nap Nir
nirK Nos nosZ
nirS
napA
Nor
norB Membrane
qnorB
Nar Cytoplasme
narG
NO3- NO2-
Figure I.4. Séquences réductrices de la dénitrification avec une représentation de la

localisation des enzymes par rapport à la membrane cytoplasmique. Nar : nitrate
réductase ; Nap : nitrate réductase liée à la membrane ; Nir : nitrite réductase ; Nor : oxyde
nitrique réductase, Nos : oxyde nitreux réductase. Les noms de gènes en italique codent
pour les sous unités catalytiques. Les composé dissous sont représentés en bleu et les
produits gazeux en orange. Les chiffres romains correspondent à la valence de l’azote dans
chaque molécule azotée. (modifié d’après (WALLENSTEIN et al. 2006).
La réduction des nitrites en oxyde nitrique est catalysée par deux enzymes de
structure et métaux prosthétiques différents : l’une avec du cuivre (Cu-Nir) et l’autre
avec du cytochrome cd1 (Cd-Nir). L’étape suivante consiste en la transformation de
l’oxyde nitrique en protoxyde d’azote. Cette étape est aussi catalysée par deux
enzymes : l’une reçoit l’électron du cytochrome c ou de la pseudoazurin (cNor) et
l’autre d’un pool de quinol (qNor). La dernière étape de la dénitrification, la
transformation du protoxyde d’azote en azote gazeux, est une étape pour laquelle on
ne connaît qu’une seule enzyme (Nos) localisée dans le périplasme des bactéries
Gram-. L’identification de cette enzyme a constitué une découverte méthodologique
majeure dans l’étude de la dénitrification (YOSHINARI et KNOWLES 1976).
30
La dénitrification est étudiée depuis longtemps car c’est un processus simple à

mesurer au laboratoire (TIEDJE 1994). Elle a été très étudiée dans les milieux
terrestres et aquatiques (pour revue cf. SEITZINGER et al. (2006)). Même si l’une des
premières études en milieu naturel a été réalisée dans le sol (NÕMMIK 1956), ce
processus est largement étudié dans les systèmes aquatiques (BRADLEY et al. 1992 ;
LOWRANCE 1992 ; BEGTSSON et BERGWALL 1995 ; ADDY et al. 2002 ; CLEMENT et
al. 2003, KELLOGG et al. 2005, LOWRANCE 1992). SMITH et DUFF (1988) ont été
parmis les premiers à identifier l’importance de la dénitrification dans les aquifères.
La plupart des études ont eu comme objectif la description des patrons de
dénitrification à l’échelle de l’écosystème (PINAY et al. 1993 ; BAKER et VERVIER
2004) et à l’échelle régionale (BURT et al. 2002 ; PINAY et al. 2007).
3.1.2. Où a lieu la dénitrification ?
Les modèles globaux qui décrivent la distribution spatiale de la dénitrification

au niveau des écosystèmes montrent que les sédiments des plateaux continentaux
assurent la plus grande part de la dénitrification (44%) suivis par les sols (22%) et les
zones océaniques en condition d’anoxie (12%) (SEITZINGER et al. 2006). Les
systèmes d’eau douce (aquifères, lacs, rivières) réaliseraient 20% de la dénitrification
totale et les estuaires 1% d’après (SEITZINGER et al. 2006). Un tel processus est aussi
utilisé comme mécanisme d’épuration dans des sites comme les zones humides
artificielles (VAN CLEEMPUT et al. 2007 ; KJELLIN et al. 2007).
Dans le continuum bassin versant/océan, les zones riveraines sont des

intermédiaires obligatoires lors du transport des nitrates provenant des terres
agricoles. La capacité des zones riveraines à réduire les intrants de nitrates dans la
rivière est essentiellement liée à la dénitrification (LOWRANCE 1992 ; SABATER et al.
2003). L’occurrence, l’intensité et les facteurs qui contrôlent la dénitrification entre
les différentes zones riveraines et au sein d’une même zone riveraine ont été très
étudiés (BURT et al. 1999 ; CLEMENT et al. 2002 ; GROFFMAN et CRAWFORD 2003) ;
31
SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ; PINAY et al. 2007). Cette information est indispensable
pour mesurer l’impact de l’activité humaine sur le cycle de l’azote et gérer et réduire
les conséquences environnementales associées aux pollutions azotées. Mais selon
BOYER et al. (2006) la modélisation de ce processus reste encore ardue à cause de la
variabilité des contrôles dominants de la dénitrification dans le temps et l’espace
(qui favorisent l’existence de « hotspots » et « hot moments » (MCCLAIN et al.
2003)) et du manque de connaissances sur les communautés bactériennes
responsables de ce processus.
3.1.3. Les facteurs contrôlant la dénitrification

dans le milieu aquatique
Les conditions requises pour que la dénitrification ait lieu sont d’abord la
présence de donneurs d’électrons, c’est à dire (généralement) de sources de carbone
organique, ensuite une anaérobiose stricte ou modérée qui régule l’activité
enzymatique (concentration en O2 environ <0,2 mg L-1), la présence de formes
azotées oxydantes comme les nitrates, les nitrites, les oxydes nitriques ou le
protoxyde d’azote et enfin la présence des bactéries capables de réaliser ce processus.
L’intensité de la dénitrification est donc susceptible d’être conditionnée par des
variations de ces différents facteurs abiotiques et biotiques, comme décrit ci-dessous.
L’influence de chaque facteur sur la dénitrification est dépendante du type

d’écosystème au sein duquel les interactions conditions
environnementales/dénitrification sont analysées. Parmi les facteurs
environnementaux qui affectent le taux de dénitrification, la production de N2O et/ou
de N2, le pH, le carbone, la température, la disponibilité des nitrates et nitrites, la
concentration d’oxygène ont été identifiés (KNOWLES 1982) mais aussi l’humidité, la
porosité, l’alternance gel/dégel, les cycles de séchage/remouillage dans le cas des
sols où la plupart de ces facteurs sont étudiés (pour revue cf. PHILIPPOT et al. (2007)).
Dans les cas des aquifère confinés, après le travail de (SMITH et DUFF 1988) où il est
32
démontré que la dénitrification est plus limitée par la disponibilité du carbone que
par les nitrates, BRADLEY et al. (1992) ont réalisé un des premiers travaux identifiant
le carbone comme principal facteur limitant de la dénitrification, parmi d’autres
comme les concentrations en nitrates et le pH ; ce résultat a été confirmé ensuite par
(HILL et al. 2000). Dans cette interface terrestre/aquatique, les processus bio-
géochimiques comme la dénitrification sont contrôlés par deux facteurs dominants
l’azote et le carbone (MCCLAIN et al. 2003). Ces facteurs sont eux même sous
influence de l’hydrologie ou d’autres conditions abiotiques (flux, profondeur, vitesse,
mélanges des eaux) qui modifient leur répartition et disponibilité. La dynamique des
flux qui distribuent les nutriments dans l’aquifère dépend fortement de sa
topographie (PFEIFFER et al. 2006). Ainsi la dénitrification diminue quand
l’éloignement à la rivière augmente (KELLOGG et al. 2005) car avec l’éloignement les
apports en carbone assurés par les eaux de surface diminuent (BRUGGER et al. 2001).
Les facteurs abiotiques régulent le taux de dénitrification de façon

instantanée, mais ils agissent aussi à long terme sur la composition des communautés
dénitrifiantes (sensu distal control (WALLENSTEIN et al. 2006)). Depuis que
CAVIGELLI et ROBERTSON (2000) et HOLTAN-HARTWIG et al. (2000) ont suggéré que
la composition des communautés dénitrifiantes est importante pour la dénitrification
in situ et l’émission de N2O, certains travaux ont conduit à des conclusions
différentes. Par exemple RICH et MYROLD (2004) étudiant le taux de dénitrification
et les communautés dénitrifiantes de différents types de sols, indiquent que la
composition des communautés dénitrifiantes n’explique pas la variabilité de
l’activité. Ce travail concernait des communautés issues de différents écosystèmes
(sédiments de rivière et sols). Ces mêmes auteurs ont également réalisé une étude sur
les communautés dénitrifiantes dans un transect de sol de la prairie à la forêt et
confirment que dans la forêt (où l’activité est la plus élevée) la diversité dénitrifiante
est plus importante.
33
3.1.4. Service écologique et incidence

agronomique de la dénitrification
La dénitrification en tant que processus écologique peut être perçue sous

différents angles. Elle peut être vue comme un « service écologique » puisque en
transférant une partie de l’azote des sols et des eaux polluées dans l’atmosphère sans
les faire transiter par le continuum aquatique rivière/océans (GALLOWAY et al. 2003),
elle épure les eaux. Par là, elle contribue à sauvegarder les écosystèmes aquatiques et
à préserver la santé humaine des effets délétères des nitrates. Car les nitrates sont la
principale cause d’eutrophisation dans les eaux continentales et marines (MCISAAC et
al. 2001 ; NIXON 1995) et leur toxicité aiguë et chronique justifie qu’en Europe les
doses maximales autorisées pour déclarer une eau potable soient de 50 mg L-1.
Le processus de dénitrification n’est cependant pas qu’un service écologique

et peut aussi être considéré sous un angle négatif. Ainsi, outre le fait que la
dénitrification est susceptible de réduire la production des cultures en dissipant les
amendements azotés (MOOGE et al. 1999), celle-ci est la principale source de N2O,
un gaz dont l’effet serre est 300 fois plus important que celui du CO2 et qui participe
à la destruction de l’ozone. 25% du N2O produits par dénitrification restent dans la
troposphère pendant plus de 100 ans (GALLOWAY et al. 2003). Les milieux
océaniques sont les principaux émetteurs de N2O mais d’autres milieux aquatiques
(rivières, estuaires, plateaux continentaux) représentent une part non négligeable
(35% soit 1,9 Tg N a-1) de cette émission (SEITZINGER et al. 2000). Dans les milieux
terrestres, les sols fertilisés sont aussi une source importante de N2O (jusqu'à 25% de
l’émission totale selon le PRIP - Prévention et Réduction Intégrées de la Pollution
(1994).
34
3.2. Les bactéries dénitrifiantes
La dénitrification est un trait biologique assez répandu chez les procaryotes. Il

a été identifié dans des groupes phylogénétiquement éloignés comme les Aquificae,
Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroides et Proteobacteria
(ZUMFT 1997). En conséquence, une simple affiliation taxonomique ne suffit pas à
dire si telle bactérie est dénitrifiante ou non.
De plus, parmi les bactéries dénitrifiantes, tous les genres ne sont pas
capables de réaliser l’ensemble des séquences de la dénitrification (TIEDJE 1994) ;
(PHILIPPOT et al. 2007). Certaines bactéries non dénitrifiantes (les bactéries nitrate
réductrices) partagent avec les dénitrifiantes la capacité à transformer les nitrates en
nitrites, l’une des étapes de la dénitrification, mais ne peuvent réaliser le processus
dans sa totalité. Des bactéries impliquées dans la dénitrification participent aussi à
d’autres processus comme la nitrification ou la fixation de l’azote (PHILIPPOT et al.
2007). Les bactéries dénitrifiantes peuvent être organotrophes, lithotrophes, ou même
phototrophes, suivant la nature de la source d’énergie utilisée. Dans le cas présent,
nous nous intéressons à la dénitrification effectuée par une grande partie des
bactéries anaérobies facultatives chimio-hétérotrophes.
Une des premières études sur la phylogénie des communautés dénitrifiantes a

été réalisée par (BETLACH 1982) qui s’est intéressé à la présence des différents gènes
codant pour les enzymes de la dénitrification chez les procaryotes. Il suggére que les
dénitrifiantes auraient un ancêtre commun, une bactérie pourpre photosynthétique.
Aujourd’hui, la diversité dénitrifiante est déterminée à l’aide de marqueurs
moléculaires utilisant des gènes fonctionnels codant pour les sous-unités d’enzymes
qui participent à la dénitrification (pour revue cf. (ZUMFT 1997) ou (PHILIPPOT 2002).
Les bactéries capables de transformer les nitrates en nitrites utilisent les enzymes Nar
et/ou Nap codées par les gènes narG ou narH (nitrates réductase liée à la membrane)
et napA (nitrate réductase périplasmique). Ces gènes sont présents chez un large
35
nombre de genres bactériens dénitrifiants (PHILIPPOT et HOJBERG 1999). Dans le

génome bactérien, ce sont les seuls gènes de dénitrification qui peuvent être
représenté par plus d’une copie (PHILIPPOT 2002). Ces gènes ont été décrits dans les
bactéries α-, β-, γ- et ε-proteobacteria ; les dénitrifiantes narG sont incapable
d’assurer une autre étape de la dénitrification (CHENEBY et al. 2003).
Les gènes nirS et nirK codent pour les cd1- et Cu-nitrite réductases qui
participent à la transformation des nitrites en monoxyde d’azote (PHILIPPOT 2002).
La présence de monoxyde d’azote et de concentrations basses en oxygène stimule
l’expression de nirS mais cette expression ne requière pas une anaérobiose complète,
contrairement au gène nirK (PHILIPPOT et al. 2001). Ces gènes ont été les plus
utilisés pour la caractérisation des communautés dénitrifiantes dans les milieux
terrestres et aquatiques (BRAKER et al. 2000 ; PRIEME et al. 2002 ; YOSHIE et al.
2004). Parmi les gènes les moins utilisés pour l’étude des communautés
dénitrifiantes, norB et qnorB codent pour les sous-unités catalytiques des deux
réductases qui participent à la transformation du monoxyde d’azote en protoxyde
d’azote, une réaction biologique particulière à cause de la création de liaison N-N.
(PHILIPPOT 2002). Comme pour le gène nirS, la présence de monoxyde d’azote
favorise l’expression de ces gènes. Peu d’auteurs utilisent ces gènes pour étudier la
diversité dénitrifiante (BRAKER et TIEDJE 2003 ; DANDIE et al. 2006). Enfin, parmi
les gènes qui codent pour la protoxyde d’azote réductase, un seul gène est identifié
comme marqueur fonctionnel. Cette étape de la dénitrification est la seule à avoir
cette caractéristique. La phylogénie des gènes nosZ est congruente avec les arbres
phylogénétiques 16S ARNr, sauf quelques exceptions expliquées par des transferts
latéraux (ZUMFT et KÖRNER 2007).
Le développement d’amorces adaptées à chaque gène (BRAKER et al. 1998 ;

HALLIN et LINDGREN 1999 ; BRAKER et TIEDJE 2003 ; THROBACK et al. 2004) a aidé
à obtenir une meilleure description des communautés dénitrifiantes. La plupart des
études se focalisent sur l’analyse d’un gène (SCALA et KERKHOF 1998 ; HENRY et al.
36
2004 ; HENRY et al. 2004 ; RICH et MYROLD 2004) ou de deux gènes qui codent une
même étape i.e. nirS et nirK (BRAKER et al. 2000 ; PRIEME et al. 2002) ; HEYLEN et
al. 2006). Seuls quelques récents travaux font exception (HENRY et al. 2006 ;
KANDELER et al. 2006) en intégrant à leur analyse les communautés dénitrifiantes
décrites avec chacun des gènes impliqués dans ces différentes étapes de la
dénitrification.
3.3. Justification du choix du modèle : les

communautés dénitrifiantes dans le biofilm hétérotrophe
d’un aquifère alluvial
3.3.1. Les aquifères alluviaux et leur

fonctionnement
Les zones riveraines constituent des zones de transition et de régulation des

flux de matière et d’énergie entre le cours d’eau et les zones adjacentes, entre les
eaux de surface et les eaux souterraines (PETERJOHN et CORRELL 1984). L’aquifère
alluvial est l’un des compartiments de la zone riveraine. Il est constitué par des
dépôts sédimentaires perméables de type gravier et sable, dont la porosité est saturée
d’une eau qui peut provenir soit de la nappe phréatique soit de la rivière (CREUZE DES
CHATELLIERS et al. 1994). Pour un instant donné, chaque point de l’aquifère est donc
caractérisé par une valeur de mélange de ces eaux d’origines différentes. Dans le
dépôt alluvial, les interactions entre les eaux provenant de la surface et les eaux
d’origine phréatique favorisent des processus biotiques qui régulent les stocks en
azote, carbone et phosphore, eux même conditionnés par l’hydrologie du système
(PUSCH et al. 1998). Dans une acception élargie, les aquifères alluviaux peuvent être
considérés comme des zones hyporhéiques, c’est la raison pour laquelle les deux
termes coexistent parfois pour désigner ce système dans la bibliographie
(STANDFORD et WARD 1993 ; HINKLE et al. 2001). Certains auteurs, tel que TRISKA
et al. (1989), utilisent une définition plus restrictive des zones hyporhéiques fondée
37
sur un pourcentage en eau de surface hyporhéiques qui doit être supérieur à 98%.
Dans notre cas, ce pourcentage variant d’un piézomètre à l’autre, nous avons préféré
utiliser le terme d’aquifère ou de zone alluviale.
Au sein d’une zone alluviale, la connectivité locale et instantanée varie. Cette

connectivité peut être appréciée à travers l’amplitude et la dynamique des variations
de niveau de nappe (STANDFORD et WARD 1993). Ainsi les zones fortement
connectées à la rivière ont des hiérogramme de profils similaires à celui de la rivière ;
a contrario, dans les zones le moins connectées le niveau de nappe ne varie pas ou la
variation est décalée dans le temps (WENG et al. 2003). Ainsi les zones alluviales
sont une composante du continuum hydrologique. Les conditions environnementales
qui règnent au sein d’un aquifère alluvial sont plus stables que celles qui
caractérisent la rivière. Les eaux qui y circulent sont peu turbulentes, ont des temps
de résidence longs (la vitesse moyenne de l’eau varie entre 0,3 et 1 mètre par jour
dans l’aquifère étudié (WENG et al. 2003), les sédiments y ont une structure stable, la
température y est peu variable et l’obscurité permanente (BRUNKE et GONSER 1997).
Dans ces zones de transition, la qualité de l’eau est fortement influencée par l’activité
microbiologique (PUSCH et al. 1998).
3.3.2. Les rôle des communautés bactériennes

dans les aquifères alluviaux
Au sein des aquifères alluviaux, les bactéries sont impliquées dans la

transformation de la matière organique et participent aux grands cycles géochimiques
des nutriments, notamment celui de l’azote (PUSCH et al. 1998). Le carbone
provenant de la rivière contient une fraction importante de carbone labile qui soutient
l’activité bactérienne (HENDRICKS 1996). Spatialement, les densités de ces bactéries
diminuent au fur et à mesure qu’augmente la distance avec la rivière (ELLIS et al.
1998 ; CRAFT et al. 2002). Toutefois, l’analyse des communautés bactériennes ainsi
que leur rôle fonctionnel dans les système souterrains n’a été abordée que de façon
38
récente par rapport aux communautés d’autres milieux, terrestres et aquatiques

(GHIORSE et WILSON 1988 ; CHAPELLE 1993 ; MADSEN et GHIORSE 1993). Plusieurs
études se sont intéressé à la différence entre communautés planctoniques et
communautés attachées au sédiment, montrant que la majeure partie de la biomasse
dans les aquifères vit attachée aux particules de sédiment (HIRSCH et RADES-
ROHKOHL 1990 ; ALFREIDER et al. 1997 ; RÖLING et al. 2001 ; GRIEBLER et al.
2002 ; BESEMER et al. 2005), comme elles vivent attachées à des supports dans la
plupart des milieux naturels (WATNICK et KOLTER 2000). Une étude récente a porté
sur la composition des deux types de communauté (attachée et libre) et les facteurs
qui influencent leur structuration dans un plaine alluviale : (BESEMER et al. 2005) qui
montraient l’importance de l’hydrologie et de l’interaction eau de rivière/eau
souterraine sur la régulation de la composition des communautés bactériennes.
Cependant, les connaissances sur leur composition, les facteurs qui influencent leur
composition et leur rôle fonctionnel restent peu précisées. L’accès difficile au milieu
souterrain pose un problème lors de l’échantillonnage et a sévèrement limité
l’avancement des travaux dans ce milieu (MADSEN et GHIORSE 1993). Plusieurs
auteurs ont contourné cet obstacle en introduisant des échantillons de milieux
stérilisé ou des substrats artificiels comme de billes en verre (HIRSCH et RADES-
ROHKOHL 1990 ; DODDS et al. 1996 ; CLARET 1998 ; GRIEBLER et al. 2001).
3.3.3. Justification du modèle
Pour ce travail de thèse, nous avons réalisé des expérimentations in situ avec
des agrégats microbiens fixés (biofilm) afin de déterminer le rôle fonctionnel des
communautés bactériennes dénitrifiantes. Les biofilms, sont distribués de façon
ubiquiste dans les milieux terrestres et aquatiques et sont responsables de divers
processus biogéochimiques. Les communautés des biofilms d’eau douce passent par
différents stades correspondant à des stratégies différentes d’exploitation des
ressources. Lors du stade initial, (JACKSON et al. 2001) observent la formation d’un
assortiment aléatoire d’espèces représentées chacune par un petit nombre
39
d’individus. Pendant cette période caractérisée par une faible intensité de

compétition, les espèces pionnières avec une croissance rapide sont favorisées.
Ensuite, lors d’un stade intermédiaire, la compétition entre espèces s’intensifie et
détermine la nature des assemblages : les espèces avec une croissance plus lente mais
de meilleures aptitudes à la compétition s’imposent. Enfin, le développement d’un
biofilm mature générant une architecture tridimensionnelle complexe génère de
nouvelles conditions environnementales au sein même du biofilm, permettant
l’installation de nouvelles populations adaptées à ces nouveaux micro-habitats. Les
communautés qui apparaissent aux différents stades de la succession ont une
composition différente avec des « stratégies » – ex. taux de dénitrification –
correspondant à ces étapes de succession
Nous avons choisi d’étudier le rôle fonctionnel des communautés

dénitrifiantes et leur structuration lors de leur développement (expérience de
colonisation) principalement dans les biofilms hétérotrophes des aquifères alluviaux.
Les résultats obtenus ont été analysés en regard de ceux obtenus sur un autre type de
biofilm, un biofilm phototrophe de rivière.
Les communautés bactériennes qui vivent dans les aquifères alluviaux ainsi
que dans la rivière catalysent un nombre important de processus parmi lesquels la
dénitrification (PUSCH et al. 1998). L’importance de ce processus est relativement
bien connue dans les zones alluviales (HILL et al. 2000) ainsi que dans la rivière
(TEISSIER et al. 2007) mais peu d’études se sont intéressé à la composition et au rôle
fonctionnel des communautés des bactéries dénitrifiantes dans ces assemblages (YAN
et al. 2003; CHENIER et al. 2006). En général, les communautés bactériennes des
biofilms hyporhéiques, (c'est-à-dire les communautés bactériennes attachées aux
sédiments dans l’aquifère alluvial) n’ont pas été autant étudiées que les biofilms
phototrophes de rivière (ELLIS et al. 1998). L’étude des dynamiques de composition
des communautés bactériennes dans des assemblages différents aidera à mieux
comprendre (1) la relation entre la composition des communautés et l’activité et (2)
40
la distribution de la dénitrification au niveau spatial et temporel. Les modèles de

dénitrification actuellement existant n’incluent pas les communautés dénitrifiantes de
ces communautés (BOYER et al. 2006), cependant la diversité et les densités sont des
facteurs importants à prendre en compte sur l’expression de la dénitrification
(HALLIN et al. 2007). A travers l’étude des assemblages naturels, nous pouvons
aborder les interactions entre les communautés, activités et conditions
environnementales, obtenant une meilleure interprétation de la relation
structure/fonction (WELLNITZ et POFF 2001). Pour l’étude de cette relation, la
dénitrification présente l’avantage d’être un processus largement distribué dans les
différentes sous-classes des Proteobacteria (ZUMFT 1997) avec de nombreuses
espèces capables de réaliser ce processus facultatif. La dénitrification est aussi un
processus connu pour varier spatialement et temporellement, que ce soit entre
différents écosystèmes ou au sein du même écosystème. Ces caractéristiques des
communautés dénitrifiantes et de l’activité de dénitrification en font un modèle
intéressant pour comprendre le couplage entre la structure des communautés et
l’activité.
41
Chapitre II. Méthodologies
Ce deuxième chapitre présente la méthodologie mise en œuvre pour les parties

expérimentales de ce travail de thèse. Il inclut une description détaillée des des sites
d’étude, des protocoles expérimentaux, des techniques de biologie moléculaire et des
analyses statistiques utilisées. Ce chapitre est sub-divisé en deux sections, la
première concernant les biofilms hétérotrophes d’aquifère alluvial, la seconde les
biofilms phototrophes de rivière.
42
Ch.II : Méthodologies
1. Les Biofilms hétérotrophes (BH) de l’aquifère alluvial
1.1. Site d’étude
1.1.1. La Garonne
La Garonne est une rivière située dans le sud-ouest de la France. Elle

unit l’Espagne avec la France puisque elle trouve sa source dans le massif granitique
de Maladeta (Pic d’Aneto 3404 m, Espagne) et que son embouchure se situe dans
l’estuaire de la Gironde à Bordeaux (France) (Figure II.1). La Garonne est le
cinquième fleuve de France avec un bassin versant de 57000 km2, un ordre de Stahler
de 8, une longueur de 600 km et un débit moyen annuel de 625 m3 s-1 à
l’embouchure à Bordeaux. La Garonne est divisée en plusieurs tronçons : La
Garonne montagnarde pyrénéenne, la Garonne du pied des Pyrénées centrales, la
Garonne du Salat jusqu’à l’Ariège, la Garonne entre l’Ariège et le Tarn, la Garonne
moyenne et la Garonne maritime. La Garonne moyenne (134 km) se situe à l’aval de
la confluence avec le Tarn jusqu’à la zone influencée par la marée dynamique de
l’Océan Atlantique. Le bassin versant de la Garonne est influencé par trois types de
crues : le type saison froide, le type méridional et le type océanique pyrénéen. Les
crues de type saison froide apparaissent de décembre à mars et sont générées par des
pluies de faible intensité mais de longue durée. Les crues de type méridional
apparaissent entre septembre et début novembre ; elles tiennent leur origine dans le
Sud du Massif Central et sont déclenchées par des pluies orageuses apportées par des
vents de Sud-Est. C’est à l’aval de la confluence avec le Tarn que l’onde de crue
menace réellement les zones riveraines garonnaises. Les crues océaniques
pyrénéennes se produisent surtout entre mi-avril et mi-juillet à la suite de pluies
paroxystiques sur les Pyrénées et sur le bassin versant exposé aux flux de Nord-
Ouest. Pratiquement toutes les crues sont d’origine pluvio-nivale.
43
Figure II.1. Localisation géographique de la rivière Garonne et du site d’étude

Monbéqui (France, région Midi-Pyrénées, département du Tarn-et-Garonne).
1.1.2. Le site de Monbéqui
La plaine alluviale de la commune de Monbéqui (82) est située dans un

méandre du cours moyen de la Garonne, à 40 km au nord de Toulouse (Figure II.1).
A cet endroit, le débit moyen annuel est de 200 m3 s-1 ; il varie entre 50 m3 s-1 et
4000 m3 s-1. La hauteur d’eau de la rivière varie alors entre 1 m (50 m3 s-1) et 8 m
(4000 m3 s-1). Les échanges de masses d’eau entre la rivière et l’aquifère dépendent
de la géomorphologie du site. Deux composantes majeures influencent le sens des
flux d'eau : une composante longitudinale, correspondant à la pente de la vallée
(1:1000) et une composante transversale qui correspond aux changements de niveaux
de l'eau de la rivière et de l’aquifère. Les eaux souterraines circulent du sud-est au
nord (Figure II.2) à travers des dépôts alluviaux issus de l’érosion des Pyrénées lors
de la dernière période glaciaire du Quaternaire. Ces alluvions reposent sur des
44
marnes imperméables et le niveau phréatique se situe habituellement entre deux et

sept mètres de profondeur. Il peut cependant s’élever rapidement jusqu’à la surface
pendant les crues.
Figure II.2. Représentation des écoulements souterrains dans la plaine alluviale de

Monbéqui avec des valeurs de débit journalier de la rivière de 150 (gauche) et 400 m3
s-1 (droite). Le trait noir épais représente la rivière. Les fronts hydrauliques sont signalés par
les isoclines numérotées selon leur altitude en mètre par rapport au niveau de la mer. Les
directions de flux de la nappe sont indiquées par les flèches noires (D’après WENG et al.
2003).
Au sein du méandre, près de la rivière, les échanges entre l’aquifère et la

rivière peuvent s’inverser quand les conditions hydrologiques de la rivière
correspondent à un débit supérieur à 1000 m3 s-1, par la création d’un phénomène de
by-pass entre l’amont et l’aval du méandre (WENG et al. 2003). La zone riveraine est
couverte majoritairement par des saules (Salix alba), des frênes (Fraxinus excelsior)
et une plantation de peupliers (Populus alba). Les terres agricoles au-delà de la zone
riveraine sont dédiées à la culture du blé, du tournesol et du maïs. Le lessivat des
nitrates dans les terres agricoles peut conduire à des concentrations de 15 mg L-1 N-
NO3- dans l’eau souterraine. Le site est équipé d’un réseau de piézomètres en
polyvinyle de 6,3 cm de diamètre, lesquels traversent les alluvions jusqu’à la molasse
45
Figure II.3. Photo aérienne du site de Monbéqui et localisation des piézomètres. Les
piézomètres sont colorés en fonction de l’étude dans laquelle ils ont été utilisés. Les
piézomètres bicolores ont été utilisés dans plusieurs études. Bleu : caractérisation de la
dénitrification in situ (DNT) et in vitro (DEA) (cf Chapitre III), Jaune : différences
fonctionnelles des communautés attachées et libres (cf Chapitre IV), Vert : structuration des
BH (cf Chapitre V). Les piézomètres figurés en blanc n’ont pas été échantillonnés.
Les mélanges d’eau de la nappe et de la rivière ont été cartographiés par (SANCHEZ
PEREZ et al. 2003b) pour un débit de la rivière de 200 m3 s-1 (Figure II.4).
Two-end-member mixing model (EMMA) Ce modèle permet de calculer les

proportions des eaux de nappe et de rivière en différents points de la zone. Il se base
sur les valeurs d’un élément conservatif (l’18O ou les chlorures, comme montré par
(SANCHEZ PEREZ et al. 2003b) observées à deux pôles : la rivière (r) et la nappe
agricole (na) (PINAY et al. 1998). Avec ce modèle, l’équation : [Cl-piézomètre] = [Cl-r] fr
+ [Cl-na] fna ; 1= fr + fna est résolue avec [Cl-piézomètre] : concentration en chlorures
dans le piézomètres, [Cl-r] : concentration mesurée dans la rivière et [Cl-na] :
concentration de chlorures mesurée dans la nappe agricole, fna et fr les fractions d’eau
46
provenant respectivement de la nappe agricole et de la rivière. Les pourcentages des

eaux de nappe et de rivière calculés pour chaque piézomètres permettent ensuite de
calculer les concentrations en COD et nitrates attendues, donc les pourcentages de
variation (% variation= (mesuré – calculé)/calculé*100.
Dans ces conditions, la teneur relative en eau de surface au sein de l’aquifère

suit un gradient de l’amont vers l’aval du méandre (Figure II.4 a). La cartographie
des pourcentages de variation des concentrations en COD se superpose à cette
cartographie du mélange des eaux, confirmant que le carbone est fourni par la rivière
(Figure II.4 b). En revanche, la cartographie des pourcentages de variations des
concentrations de nitrates montre un patron où apparaissent des zones relativement
localisées de forte diminution des teneurs en nitrates. Cette variabilité spatiale des
pourcentages de variation des concentrations de nitrates suggère l’intervention de
processus d’élimination biologique des nitrates tels que la dénitrification bactérienne
(Figure II.4 c).
47
Figure II.4. Pourcentages en eaux de surface dans la zone d’interface et variations des
concentrations de carbone organique dissous et nitrates. Cette description correspond
à une situation hydrologique avec un débit de la rivière de 200 m3 s-1. Les pourcentages en
eaux de surface sont calculés avec le modèle bipolaire EMMA (two-end-member mixing
analysis) basé sur les valeurs de l’18O dans la rivière et un piézomètre dans les terres
agricoles comme pôles. % de variation de COD et nitrates = (mesuré – calculé)/calculé
(d’après SANCHEZ PEREZ et al. (2003b)).
1.2. Échantillonnage
1.2.1. Variabilité spatiale et temporelle de la

dénitrification
Pour l’étape de caractérisation spatiale et temporelle de la dénitrification in

situ et in vitro à Monbéqui, treize campagnes de prélèvement ont été conduites à une
fréquence mensuelle entre mai 2004 et août 2005. Les échantillonnages et mesures
de dénitrification in situ ont été effectués sur les piézomètres p6, p10, p13, p18 et
p29 (Figure II.3) choisis pour couvrir le maximum de la variabilité hydrologique de
la zone et parce qu’ils sont représentatifs de conditions environnementales
contrastées d’après (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b). Les prélèvements et mesures ont
48
été effectuées dans des conditions hydrologiques variables (moyenne 166 m3 s-1, min
35 m3 s-1 et max 836 m3 s-1) (Figure II.5).
Les sédiments de diamètre inférieur à 2 mm sont prélevés avec une pompe

motorisée (30 à 120 L mn-1) équipée d’une crépine de maille 2 mm. Les eaux de
nappe sont prélevées avec une pompe électrique (8 L mn-1) après vidange des
piézomètres pendant 10 minutes à l'aide d'une pompe motorisée.
Figure II.5. Débits moyens journaliers de la Garonne du 01/09/2003 au 30/09/2005 et

positionnement des campagnes de prélèvement. La couleur des flèches correspond aux
différentes études menées. Bleu : caractérisation de la dénitrification in situ et in vitro (cf
Chapitre III), Jaune : différences fonctionnelle communautés attachées et libres (cf Chapitre
IV), Vert : structuration de communautés de BH (cf Chapitre V).
49
1.2.2. Composition des communautés

bactériennes libres et attachées
Pour l’étude sur la composition des communautés bactériennes libres et

attachées et leurs rôles fonctionnels respectifs, cinq piézomètres (p9, p10, p11, p17 et
p26) ont été sélectionnés parmi le réseau de piézomètres disponibles. Selon (WENG
et al. 2003), le piézomètre p17 est drainé par l’eau de rivière fraîchement infiltrée, les
trois autres (p9, p10, p11) sont drainés par un mélange des eaux de rivière et eaux
souterraines provenant de l’aquifère libre adjacent. Le piézomètre p26 est considéré
représentatif de l’eau de l’aquifère sur la base des calculs de mélanges des eaux.
Selon LAMBS (2000) ; SANCHEZ PEREZ et al. (2003b) et BAKER et VERVIER (2004), le
mélange des eaux dans le système suit le modèle bipolaire nommé « two-end-
member mixing model ». C’est modélé permet de calculer les mélanges eau de
surface – eau souterraine à l’aide d’un traceur conservatif (i.e. chlorures). D’après les
études précédentes sur ce site (SANCHEZ PEREZ et al. 2003a), les piézomètres p9 et
p17 sont localisés dans des zones de « hotspot » d’activité (Inside denitrification
hotspot – IHD) – 60% des nitrates sont éliminés et les taux de dénitrification in situ
varient entre 0,1 et 2,7 g N-N2O m3 j-1 – tandis que les piézomètres p10, p11, et p26
sont localisés dans une zone d’activité normale – il n’y a pas de diminution des
concentrations de nitrates et les taux de dénitrification varient entre 0,05 et 1,2 g N-
N2O m3 j-1. L’échantillonnage a été réalisé le 21 et 22 octobre 2003 pendant une
période de basses eaux (100 m3 s-1) (Figure II.5. flèche jaune). Cette situation
hydrologique correspond à un état de la rivière fréquent puisque un tel débit a été
observé dans 40 % des mesures journalières effectuées au cours des derniers 35 ans
de suivi par la Direction Régionale de l’Environnement
www.hydro.eaufrance.fr/accueil.html.
50
Les échantillons de sédiment et d’eau on été prélevés selon le même

protocole que pour la campagne de caractérisation de la dénitrification in situ et in
vitro (cf partie 2.1).
Tous les échantillons ont été conservés à 4°C et le transport au laboratoire

s’est fait dans un délai inférieur à 6h. Les échantillons prélevés pour des analyses de
biologie moléculaire ont été stockés à -80°C.
1.2.3. Expérience de colonisation
1.2.3.1. Choix des piézomètres
L’hydrologie dans le site d’étude engendre des conditions environnementales

variables aux différents points de la zone (WENG et al. 2003 ; SANCHEZ PEREZ et al.
2003b). Quatre piézomètres (p11, p14, p17 et p26) qui représentent des situations
contrastées ont été sélectionnés. Au sens où nous l’avons défini (cf. état de l’art), ces
piézomètres montrent une connectivité à la Garonne variable en fonction de leur
distance avec la rivière, avec une connectivité plus importante pour les piézomètres
proches de la rivière. La connectivité a été quantifiée par les vitesses hydrauliques
d’après le modèle hydrodynamique de (WENG et al. 2003). Trois des piézomètres
sélectionnés sont situés dans la zone active, c’est-à-dire dans la zone sous influence
de la rivière correspondant aux premiers 250 m vers l’intérieur du méandre et le
quatrième est situé à 1500 m dans la zone agricole, isolé de l’influence hydrologique
de la rivière (sauf crue cinquantenaire > 4000 m3 s-1) (Figure I.5).
51
1.2.3.2. Préparation et installation des

sachets contenant le substrat artificiel
Les sachets de substrat artificiel (20 cm x 2 cm) sont constitués de filets de

nylon d’une maille de 1 mm. Chaque sachet contient 20 g de billes en verre (Ø=2
mm) (Figure I.6). Le choix d’une maille de 2 mm a été motivé par la volonté de
limiter l’accès des billes aux macro-prédateurs peuplant les aquifères (Oligochètes,
Amphipodes etc., Figure II.7) et la nécessité de garantir l’écoulement de l’eau. Avant
leur installation, les sachets ont été traités aux UV germicides pendant 15 minutes
afin de les stériliser. Quatorze sachets ont été immergés dans la colonne d’eau au
fond de chaque piézomètre.
Figure II.6. Sachets de billes (à gauche) et détails des filets et billes (à droite, unité :
cm).
Figure II.7. Exemple de prédateurs peuplant l’aquifère alluvial de la Garonne.

Niphargus sp. à gauche et Haplotaxis gordioides à droite (identification N. Giani, photos : F.
Azémar).
52
Trois sachets choisis aléatoirement ont été retirés des puits après 3, 6, 9 et 15 mois
d’immersion (Figure II.5, flèches vertes). Chaque piézomètre constitue un cas
particulier représentatif de l’hétérogénéité des situations que l’on peut rencontrer
dans un tel aquifère. Les trois sachets constituent des réplicats dans chacune des
conditions environnementales locales (i.e. piézomètres) étudiées. Des échantillons
d’eau ont été prélevés simultanément pour la caractérisation des conditions
environnementales.
1.3. Paramètres mesurés en analyse d’eau
1.3.1. Paramètres physiques
La hauteur de nappe a été mesurée dans chacun des piézomètres et à chaque

date d’échantillonnage à l’aide d’une sonde de niveau. La concentration en oxygène
dissous, la température et la conductivité ont été mesurées avec des sondes WTW
Oxical-SL Cell Ox 325 Tetacon. Pour les mesures de potentiel redox, une électrode
Ag/AgCl a été utilisée, dont les valeurs ont été corrigées par rapport à des mesures
avec une électrode de platine en rajoutant 217 mV (pour une température moyenne
de 10°C) comme indiqué par le fabricant (Mettler-Toledo GmbH , Steinbach,
Allemagne).
1.3.2. Paramètres chimiques
Les échantillons d’eau de nappe et de rivière ont été filtrés avant leur analyse
à travers des filtres d’acétate de cellulose (taille de porede 0,45 µm) préalablement
rincés avec 100 mL d’échantillon. Les concentrations de toutes les formes d’azote
dissous (NO3-, NH4+ et NO2- = azote inorganique dissous, NID) ont été mesurées
selon les protocoles standardisés pour l’analyse d’eau (APHA 1992) à l’aide d’une
chaîne à flux continue (ALPKEM model Flow solution IV). Les concentrations de
53
chlorures et bromures ont été mesurées par chromatographie ionique (DIONEX).

Pour le dosage du carbone organique dissous, les échantillons d’eau ont été filtrés sur
des filtres GF/F pré-calcinés à 450°C pendant 4h, puis acidifiés (HCl, 6N). Ils sont
ensuite analysés à l’aide d’un catalyseur à platine à 650°C (Shimadzu, modèle TOC
5000).
1.3.2.1. Flux de carbone organique dissous et

d’azote inorganique dissous (FCOD et FNID)
Afin de déterminer les apports et le renouvellement du carbone et des

différentes formes d’azote, facteurs qui affectent la dénitrification, les flux de ces
éléments ont été calculés en multipliant dans chaque piézomètre les concentrations
observées par le flux hydraulique. Les flux hydrauliques ont été calculés avec le
modèle de WENG et al. (2003) pour chaque piézomètre. Le modèle simule les flux
d’eau (direction et quantité) à travers l’aquifère alluvial en fonction du débit de la
rivière. Il a été utilisé en état irrégulier à un pas de temps journalier. Avec les débits
moyens journaliers obtenus auprès de la DIREN Midi-Pyrénées, des débits pondérés
correspondant aux intervalles 0-3 mois, 3-6 mois, 6-9 mois et 9-15 mois ont été
calculés (phase transitoire). Le flux hydraulique calculé (FH) multiplié par la
concentration de COD et NID à chaque intervalle de temps d’échantillonnage fournit
les flux de COD et de NID correspondants.
1.4. Descripteurs de sédiments
1.4.1. Granulométrie
La caractérisation des sédiments a été réalisée par le classement des particules

qui les composent en fonction de leur taille. La méthode utilisée est adaptée aux
tailles comprises entre 0,375 et 2000 µm. Pour cette analyse, 20 g de sédiments ont
54
été utilisés. Ces sédiments sont exposés à trois traitements avec 50% d’H2O2 et un
avec 110% d’H2O2 pour oxyder la matière organique (JACKSON 1985). Le floculat a
été éliminé en ajoutant 40 mL d’HCl à 10% puis 40 mL d’une solution aqueuse
d’hexametaphosphate de sodium à 0,55%. L’échantillon a été agité pendant 6 h et la
granulométrie a été définie avec un granulomètre laser Coulter TM LS230 qui
mesure la taille des particules par diffraction de la lumière laser à 750 nm de
longueur d’ondes en 126 photopériodes de détection.
1.4.2. Matière sèche (MS) et matière sèche sans

cendre (MSSC)
Afin de déterminer les quantités de sédiment et de matière organique dans les

échantillons, nous avons utilisé une méthode qui combine la déshydratation des
échantillons et leur ignition. La quantité de MS a été obtenue après séchage (5g
105°C, 24 h). Pour la MSSC, 5 g de sédiment ont été calcinés (550°C 8h). La MSSC
est obtenue par la comparaison de la masse de cendres résiduelles à la matière sèche
initiale. Elle correspond à la matière organique combustible ou volatile. Cette
méthode rapide fournit un bon indicateur de la biomasse présente dans les sédiments,
comme cela a été vérifié avec les corrélations entre MSSC et ADN ou densité
bactérienne (DB) (MSSC= 0,0125 + 0,0265 DB, r =0,608, p = 0,036; et DB = 2,3958
+ 0,0429 DNA, r = 0,662, p = 0,019).
1.5. Mesure de la dénitrification
Parmi les différentes méthodes disponibles pour mesurer la dénitrification

(pour revue cf. GROFFMAN et al. (2006)), les approches basées sur l’utilisation
d’isotopes stables 15N sont en plein essor (MCMAHON et BÖHLKE 1996 ; ADDY et al.
2002 ; KELLOGG et al. 2005). La mesure vitesse d’accumulation du N2O après
traitement à l’acétylène (YOSHINARI et KNOWLES 1976) reste cependant largement
55
utilisée pour les mesures in situ et in vitro dans les écosystèmes terrestres et
aquatiques. Grâce à l’acétylène, l’enzyme N2O réductase est bloquée et l’incubation
donne comme produit final du N2O qui peut être dosé à l’aide d’un chromatographe
en phase gazeuse. Afin de mesurer une capacité enzymatique potentielle, les
incubations ont lieu en présence de carbone et nitrates en quantités non limitantes.
Les mesures d’activité enzymatique dénitrifiante (DEA, ou dénitrification
potentielle) et de dénitrification in situ (DNT) ont été réalisées en collaboration avec
I. Vitte dans le cadre de son mémoire de DESUPS (VITTE 2005). La possibilité d’un
blocage partiel de l’activité enzymatique, le blocage concomitant de la nitrification
(puisque l’acétylène inhibe aussi l’activité de l’ammonium monooxygènase)
constituent les principales limites de la méthode (voir TEISSIER (2001)).
2
3 4 5 Surface du
sol
Niveau
phréatique
1. Système Packer
1 2. Coussinet
2
3. Pompe péristaltique
4. Bidon
5. Lampe à acétylène
6. Traceur de dilution
Figure II.8. Schéma du dispositif pour la mesure de la dénitrification in situ. (D’après

(VITTE 2005). Les coussinets gonflables permettent de délimiter l’espace dans lequel a lieu
le prélèvement.
56
1.5.1. Dénitrification in situ (DNT)
Afin de réaliser des mesures d’activité dénitrifiante in situ dans la zone

saturée, la méthode de blocage à l’acétylène (YOSHINARI et KNOWLES 1976) a été
adaptée avec le dispositif appelé “ Packer” (SANCHEZ PEREZ et al. 2003a) ou “ Push-
pull” (ADDY et al. 2002) (Figure II.8). Ce dispositif comprends une pompe constituée
d’un tuyau de 10 m terminé par un embout muni de deux coussinets en caoutchouc
de (Ø 48 à 80 mm) gonflés à 105 Pa, de façon à maintenir le système à la même
profondeur pendant toute la durée de l’expérience et à isoler la partie latérale de la
zone saturée située entre les deux coussinets.
Ce dispositif est relié à une pompe péristaltique qui permet de prélever de

l’eau à une profondeur donnée dans le piézomètre. Dix neuf litres d’eau souterraine
ont été prélevés et stockés dans un bidon de 25 L. Un litre d’une solution de bromure
de sodium (traceur de dilution), à une concentration finale de 13,4 mg/L a été rajouté.
Ensuite, les 20 L ont été soumis à un bullage d’acétylène produit par réaction
exothermique entre de l’eau et des pierres de carbure de calcium (CaC) dans une
lampe à acétylène (matériel de spéléologie), pendant 30 minutes afin d’avoir une
concentration finale de 10% v : v nécessaires pour l’inhibition de la N2O réductase.
Ces 20 L ont été réinjectés dans le piézomètre à l’aide de la pompe péristaltique et
deux litres d’eau sont ensuite prélevés à différents temps (0, 15, 30, 60, 90 et 120
minutes). Lors de chaque prélèvement, 3 mL d’eau de nappe sont mélangés à 1 mL
de formol dans un tube vénoject (Terumo Scientific, NJ, USA). Le protoxyde d’azote
a été analysé par chromatographie en phase gazeuse (chromatographe GIRDEL,
63
Série 30, France équipé d’un capteur d’électron ECD Ni) avec une colonne de
Porapak Q (2 m avec 1/8 pouce de diamètre interne). La répétitivité de cette méthode
in situ a été testée au cours d’un travail précédent (VITTE 2004). Cette méthode est
représentative de la mesure de la DNT pour un même piézomètre, avec des
conditions physiques et chimiques identiques, i.e. nitrates, carbone organique
dissous, oxygène dissous, mélange eau nappe-rivière, etc. Cette technique est aussi
57
bien adaptée à la mesure de l’activité dans les différents micro-environnements

correspondants à différentes profondeurs.
1.5.2. Activité enzymatique dénitrifiante (DEA)
La Denitrification Enzyme Activity (DEA) ou activité enzymatique

dénitrifiante a été mesurée au laboratoire avec la méthode de blocage à l’acétylène
(YOSHINARI et KNOWLES 1976). Trois cents mililitres mL d’eau, pour les
échantillons d’eau, ou un mélange de 200 g de sédiments et 100 mL d’eau de nappe,
pour les échantillons de sédiment, ont été introduit dans des bouteilles de 500 mL.
Pour les échantillons correspondant à l’expérience de colonisation, 10 g de billes ont
été introduits dans une bouteille de 150 mL. Une solution à 50 mg C L-1 (acétate de
sodium) et 100 mg N L-1 (nitrate de sodium) est constituée pour mesurer une activité
de production de N2O en l’absence de limitation en subtrat carboné et nitrate (mesure
de potentiel enzymatique). L’oxygène a été éliminé en faisant buller de l’Hélium U
99,99% (Air liquide, France) pendant 10 minutes. Après avoir fermé hermétiquement
les bouteilles et fait le vide, la phase gazeuse des bouteilles est remplie avec de
l’hélium. De l’acétylène industriel sans acétone a été ajouté pour obtenir une
proportion finale de 10% d’acétylène dans la bouteille. Les bouteilles ont été
incubées à l’obscurité à 14°C en agitation modérée, ceci correspond à la température
moyenne annuelle de l’aquifère. Après 4, 24 et 48h d’incubation, 3 mL de gaz ont été
prélevés dans la phase gazeuse (après agitation vigoureuse) et stockés dans des tubes
vénoject (Terumo Scientific, NJ, USA). Le protoxyde d’azote a été analysé par
chromatographie en phase gazeuse.
1.5.3. Calculs de production de N2O
Les chromatogrammes obtenus par CPG fournissent des hauteurs de pic en

millimètres qui sont ensuite transformées en ppmv soit µL N2O L-1 à l’aide d’une
courbe étalon établi avec un standard de 1000 ppmv de N2O (Matherson Tri Gas,
58
USA). A partir de ces données, une série de calculs est appliquée pour obtenir la
masse de N2O produite.
1.5.3.1. Concentrations de N2O in situ
Rappelons que l’incubation se déroulant en phase liquide, on mesure le N2O

dissous dans une phase liquide. L’échantillon (3 mL d’eau de nappe) est stocké dans
un tube de 6 mL avec une phase liquide de 4 mL (1 mL de formol + 3 mL
d’échantillon) et une phase gazeuse de 2 mL. Pour la mesure, 200µL prélevés dans la
phase gazeuse après équilibration par agitation avec la phase liquide sont injectés
dans le chromatographe. Il s’agit de calculer les concentrations totales de N2O
présentes dans les tubes vénojects. Le détail des calculs est présenté ci-dessous :
Masse de N2O dans le Vénoject :
Masse de N2O des 4mL de phase liquide (1)

Masse de N2O des 2mL de phase gazeuse (2)
Masse de N2O de l’air introduit lors de l’équilibration (3)
(1) Masse de N2O des 4mL de phase liquide
La solubilité de N2O dans une eau de salinité de 0 0/00 à 22°C est de :

K0 = 2,705.10-2 mol L-1 atm-1
En unité de masse, cette solubilité est donc K0 = 1,190 N2O g/L à 22°C sous une
atmosphère de gaz pur.
Masse de N2O dans les 4 mL de la phase liquide = [N2O].10-6 * 1,190.10-3 * 4 (loi de
Henry) soit 4,76.10-9 [N2O] g.
(2) Masse de N2O des 2 mL de phase gazeuse
Masse molaire du N2O : 44 g.

A 22°C, température d’équilibration, le volume molaire d’un gaz est de 24,219 L.
PV = nRT d’où V = nRT/P ; V = (1 * 0,082057 * 295,15)/1 ; V = 24,219 L.
La densité de N2O est donc de 44/24,219 soit 1,817.10-3 g/mL par atmosphère.
Masse de N2O dans la phase gazeuse = [N2O].10-6 * 1,817.10-3 * 2 soit 3,634.10-9
[N2O] g.
59
(3) Masse de N2O de l’air introduit lors de l’équilibration (4 mL)
4 mL * 1,634.10-3 * 0,3.10-6 = 1,4706.10-9 g avec une concentration en N2O

atmosphérique égale à 0,3 ppmv.
Masse de N2O dans un litre de N2O pur = 1,634 g/L
Cette quantité est considérée comme négligeable.
Masse de N2O totale dans le tube vénoject :
(1) + (2) soit 4,76.10-9 [N2O] + 3,634.10-9 [N2O] soit 8,394.10-9 [N2O].
Les concentrations de N2O obtenues précédemment doivent être corrigées par

un facteur de dilution calculé à partir des variations de concentration du traceur Br-.
En effet, le volume prélevé et réinjecté par la suite dans le piézomètre subit une
dilution due à l’écoulement de la nappe à travers le piézomètre. Le facteur de dilution
correspond au rapport entre la concentration de Br- injectée et celle de Br-
échantillonnée au temp t, soit [Br-]t0 / [Br-]t. Les concentrations corrigées sont :
[N2O]t * [Br-]t0 / [Br-]t.
1.5.3.2. Concentration de N2O traité in vitro
Dans les bouteilles d’incubation, 300 mL correspondent à la phase liquide et

200 mL à la phase gazeuse. Lors des prélèvements pour la mesure du N2O produit, 3
mL d’échantillon sont prélevés dans la phase gazeuse. Ces 3 mL de gaz He + C2H2 +
N2O) ont été injectés dans un tube Vénoject de 6 mL (Terumo Scientific, NJ, USA).
Il est donc nécessaire, au préalable, d’appliquer un facteur de 2 aux concentrations de
N2O mesurées en CPG pour exprimer la dilution de l’échantillon dans le Vénoject.
Pour connaître la masse totale de N2O dans chacune des bouteilles, les calculs décrits
ci-dessous sont appliqués :
(1) Masse de N2O des 300 mL de phase liquide

La solubilité de N2O dans une eau de salinité de 0 0/00 à 22°C est de :
60
K0 = 2,705.10-2 mol L-1 atm-1

En unité de masse, cette solubilité est donc K0 = 1,190 N2O g/L à 22°C sous une
atmosphère de gaz pur.
Masse de N2O dans 300 mL d’eau : [N2O].10-6 * 1,190.10-3 * 300 soit 3,57.10-7
[N2O] µg.
(2) Masse de N2O des 200 mL de phase gazeuse

Masse molaire du N2O : 44 g.
A 22°C, température d’équilibration, le volume molaire d’un gaz est de 24,219 L.
PV = nRT d’où V = nRT/P ; V = (1 * 0,082057 * 295,15)/1 ; V = 24,219 L.
La densité de N2O est 1,817.10-3 g/mL par atmosphère de pression.
Masse de N2O dans 200 g de sédiments : [N2O].10-6 * 1,817.10-3 * 200 soit 3,634.10-
7
[N2O] µg.
(3) Masse de N2O totale dans la bouteille :

(1) + (2) soit 3,57.10-7 [N2O] + 3,634.10-7 [N2O] soit 7,204.10-7 [N2O].
1.6. Densité et composition des communautés

bactériennes
1.6.1. Dénombrement des bactéries totales
Pour estimer la densité totale de bactéries dans les échantillons, nous avons
utilisé une méthode de comptage basée sur la visualisation en microscopie à
fluorescence des cellules bactériennes marquées au DAPI (4', 6-diamino-2-
phenylindole-dihydrochloride) – un « colorant » qui s’intercale dans l’ADN. La
procédure utilisée était la suivante : 10 mL d’eau souterraine, 1,5 g de sédiment ou 1
g de billes de verres ont été stockés après avoir rajouté 10 mL d’eau milliQ aux
échantillons solides et 1 mL de formol (37%) à tous les échantillons. Pour récolter les
bactéries du sédiment et des billes, les échantillons ont été passés au bac à ultrasons
(15 min, 35 kHz, ELMA model Transonic T460) puis au vortex (3200 rpm)
(GARABETIAN et al. 1999). Ensuite, les cellules ont été réparties d’une façon
homogène sur le filtre (Nucléopore, membrane polycarbonate Black 0,22 µm) et
61
marquées au DAPI. Les bactéries ont été comptées au microscope à fluorescence

(Leitz Dialux 22 équipé d’un brûleur à mercure HBO-100/2 au grossissement x1250)
avec un filtre d’excitation de 270-380 nm et un filtre d’émission 410-580 nm.
1.6.2. Caractérisation des communautés

bactériennes totales et dénitrifiantes
Diverses méthodes ont été choisies pour étudier la composition taxonomique

et fonctionnelle des agrégats microbiens : PCR-DGGE, Real-Time PCR et Biolog
EcoPlates. Le choix des marqueurs et les détails de chaque méthode sont décrits dans
les sections suivantes.
1.6.2.1. Enrichissement des bactéries

dénitrifiantes
Une étape préalable d’enrichissement par milieu de culture sélectif a été

effectuée pour cibler le groupe fonctionnel des bactéries dénitrifiantes dans certains
échantillons naturels de sédiment et eau. Cette sélection s’opère en modifiant
l’abondance relative de la fraction cultivable du groupe ciblé au sein d’un
assemblage donné. Le principal biais provient donc du caractère hautement sélectif
des conditions de laboratoire qui ne permettent de révéler qu’une partie de la
diversité ciblée ; pour corollaire, les différences entre échantillons ont tendance à être
nivelées. Le milieu d’enrichissement (TIEDJE 1994) a été préparé en rajoutant
respectivement 50 et 100 mg L-1 de N-NO3- et C-CH3-COOH à une eau naturelle
filtrée sur 0,2 µm et autoclavée. Au moment de l’essai, 40 mL de cette solution
d’enrichissement ont été placés dans une bouteille de 500 mL avec 20 mL
d’inoculum prélevés dans les incubations d’eau et de sédiment. L’oxygène a été
remplacé par de l’Hélium (U 99,99%, Air liquide, France) et les bouteilles ont été
incubées pendant une semaine à l’obscurité à 14 °C. Deux repiquages successifs ont
été réalisés, dans les mêmes conditions (mêmes opérations), avec 20 mL de la culture
62
précédente. A l’issue de cette étape d’enrichissement, les bactéries ont été recueillies
par filtration (filtres en polycarbonate, 0,2 µm), stockées (-80°C) jusqu’à l’analyse
par typage moléculaire (PCR-DGGE basée sur les gènes codant pour l’ARNr 16S).
1.6.2.2. Choix des marqueurs : 16S ARNr et nosZ
Pour l’analyse moléculaire de la composition des communautés bactériennes

en PCR-DGGE deux marqueurs ont été retenus :
1. le gène codant pour l’ARNr 16S : un marqueur universel pour les membres
du domaine Bacteria. Pour le typage, les régions variables V3 et V5 de
l’ARNr 16S ont été amplifiées. Elles correspondent à des fragments
d’environ 550 pb. Les amorces utilisés étaient le EUB341F-GC; position 341-
357 et EUB907R ; position 907-926 (MUYZER et al. 1997)
2. le gène nosZ qui code pour la sous-unité catalytique de l’enzyme N2O

réductase. Pour le typage, les amorces utilisées étaient le nosZ-F, position
1169-1188, et le nosZ1622R-GC, position 1603-1622. Un fragment de 453 pb
était obtenu (THROBACK et al. 2004).
Pour la quantification des gènes des communautés totales et des différents

types de dénitrifiantes, les PCR en temps réel ont été effectuées au Laboratoire de
Microbiologie du Sol et de l’Environnement de l’INRA de Dijon avec les amorces
utilisées en routine dans ce laboratoire (Tableau II.1).
63
Tableau II.1. Présentation des gènes et amorces utilisées pour la PCR en temps-réel.
ND : non déterminé.
Amorces Position Fragment Références
341F 341-357 (LOPEZ-GUTIERREZ et al.

16S ADNr 195 pb
515R 515-536 2004)
nirK876F
nirK ND 165 pb (HENRY et al. 2004)
nirK1040R
nirSC3aF 916-935
nirS 425 pb (THROBACK et al. 2004)
nirSCR3cd 1322-1341
nosZ1F 1184-1203
nosZ 259 pb (HENRY et al. 2006)
nosZ1R 1443-1421
1.6.2.3. Analyse moléculaire : PCR-DGGE
1.6.2.3.1. Extraction d’ADN
Trois types de matrices ont été traitées : bactéries en suspension dans l’eau, bactéries
associées aux sédiments fins et biofilms adhérents sur des billes de verre. Les
échantillons d’eau (1L) et les surnageants obtenus à partir de 10 g de sédiment
(resuspendus 20 mn au vortex 3200 rpm dans 10 mL d’eau filtrée sur filtre de 0,22
µm) ont été concentrés sur des filtres en polycarbonate (taille de pore 0,22 µm). Pour
les billes de verre, dix grammes de billes mises en suspension dans 10 mL d’eau
filtrée (à 0,22 µm) ont été passés au vortex (3200 rpm) pendant 20 mn. La
suspension a ensuite été centrifugée (12 000 g à 4°C, 20 mn) et le culot a été
conservé et stocké à -80 °C jusqu’à l’extraction. Les culots de centrifugation ont été
traités directement et les filtres ont été découpés en lamelles avant de commencer
l’extraction.
64
Le kit commercial UltraClean Soil DNA kit a été utilisé (Bio101, Vista CA, USA)
pour l’extraction de l’ADN selon le protocole du fabriquant. Après extraction et
marquage au SYBR Green I (Sigma), l’ADN extrait a été quantifié par fluorimétrie
en se référant à une courbe étalon.
Dans une micro-plaque, 5 µL d’échantillon dans 95 µL de TE (10 mM Tris-Cl, pH
7,5, 1 mM EDTA) ont été déposés par puit avec 100 µL de SybrGreen 1/5000
(Sigma France). Un blanc contenant 100 µL de TE et 100 µL de SybrGreen a été
utilisé pour soustraire le bruit du fond. Une gamme étalon a été établie avec des
quantités d’ADN entre 2,5 et 200 ng. Les quantités d’ADN récoltées dans les
différents échantillons étaient en moyenne de 10 ng par gramme de sédiment, 441 ng
par litre d’eau et 36 ng par gramme de bille de verre. Lorsque les quantités d’ADN
obtenues étaient inférieures à 2,5 ng, elles étaient considérées comme nulles.
1.6.2.3.2. PCR (Polymerase Chain

Reaction)
La PCR est une technique qui permet d’amplifier le nombre de copies d’une
séquence spécifique d’ADN et donc de détecter la présence de celle-ci grâce à
l’accumulation des amplicons. Cette technique se base sur la répétition de cycles
l’élongation d’amorces – spécifiques du gène ciblée – grâce à une polymérase
thermorésistante. L’activité polymérase est contrôlée via un thermocycleur qui assure
les changements de température propres à obtenir les phases de dénaturation,
d’hybridation, d’élongation de l’ADN. Avec nos amorces, le protocole suivant a été
utilisé.
L’amplification du gène codant pour l’ARNr 16S a été réalisée dans un volume
réactionnel de 50 µL contenant 0,3 mg mL-1 de BSA, 200 µM de chaque
désoxynucléotide triphosphate (dNTP), 0,48 µM des amorces 341F-GC et 907R
(MUYZER et al. 1997), 10x Tampon PCR (500 mM KCl et 100 mM Tris-HCl), 3 mM
de MgCl2, 75 MM de Tris-HCl, 2,5 U de Taq polymérase (Promega, France) et 20 ng
65
d’ADN. Les amplifications ont été réalisées avec un thermocycleur Eppendorf

Mastercycleur. Le programme d’amplification (avec un touchdown) commence par
une dénaturation initiale de 5 min à 94°C, suivie de 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min
à 65-55°C (la température diminuant de 0,5°C par cycle pendant les premiers 10
cycles et restant à 55°C pendant les derniers 20 cycles) et 3 min à 72°C et enfin une
élongation finale de 5 min à 72°C (LYAUTEY et al. 2005).
L’amplification des gènes nosZ a été réalisée dans un volume réactionnel de

25 µL qui contenait 10x Tampon PCR (500 mM KCl, 15 mM MgCl2 et 100 mM
Tris-HCl), 1,5 mM MgCl2, 800 ng µL-1 BSA, 200 µM de chaque désoxynucléotide
triphosphate, 1,25 U de Taq polymerase (Promega, France), 1 µM des amorces de
nosZF et nosZ1622R-GC (THROBACK et al. 2004) et 5 ng d’ADN. Un programme
touchdown de PCR a été utilisé avec une dénaturation initiale de 2 min à 94°C, puis
35 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 58-53°C (en diminuant la température de 0,5°C par
cycle lors des les premiers 10 cycles, avant une série de 25 cycles à 53°C), 1 min à
72 °C et une élongation finale de 5 min à 72°C (ENWALL et al. 2005).
Pour chaque amplification, de l’ADN témoin (Escherichia coli pour le 16S

ARNr et Paracoccus denitrificans pour le nosZ) a été utilisé comme référence
positive et de l’eau milli-Q stérile comme référence négative.
Les produits de PCR ont été soumis à électrophorèse et quantifiés sur un gel
d’agarose à 1,65% à l’aide d’un marqueur de masse (Precision Molecular Mass
Standard, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Les rendements d’amplification obtenus
étaient en moyenne de 15 ng ADN amplifié/ng ADN extrait pour le sédiment, 21
pour l’eau et 35 pour les billes en verre. Les plus bas rendement ont été obtenus dans
les échantillons de sédiment où la présence d’acides humiques est susceptible
d’inhiber physiquement l’hybridation des amorces à l’ADN cible (WATSON et
BLACKWELL 2000).
66
Sur 16 échantillons correspondant à l’expérience de colonisation bactérienne

(Chapitre V), 4 échantillons n’ont pas donné de signal. Il s’agissait des
amplifications du gène nosZ, pour lesquels l’ADN cible était soit absent soit en
quantités en dessous du seuil de détection.
1.6.2.3.3. DGGE
Les différents fragments de 16S ADNr amplifiés par PCR sont séparés
lors d’une migration dans un gel d’acrilamide avec un gradient dénaturant. Cette
méthode permet de séparer, parmi les séquences dominantes, les fragments contenant
des séquences différentes (CASAMAYOR et al. 2000). Les séquences sont
matérialisées par des bandes dans le gel. Chaque bande ne correspond pas à une
espèce mais à un taxa puisque deux bandes peuvent co-migrer ou une même espèce
peut correspondre à deux bandes différentes (MUYZER et SMALLA 1998). La DGGE
perpendiculaire a été réalisée pour séparer les différents fragments amplifiés en
fonction de leur pourcentage en GC. Pour le gène codant l’ARNr 16S, 500 ng
d’ADN ont été chargés sur le gel composé de 6% (v/v) d’acrylamide : bis-acrylamide
(37.5:1) avec un gradient dénaturant 35 et 70% (sachant que 100% de dénaturant
correspond à 7 M d’urée et 40% de formamide déionisé). L’électrophorèse a été
effectuée à 150V pendant 12h ou 100V pendant 18h à une température constante de
60°C (MUYZER et al. 1997).
D’autre part, 300 ng des amplifiats de nosZ précédemment concentrés par

lyophilisation (3x10-1 mbar, de -40°C à -50°C) ont été chargés dans un gel composé
de 7% (v/v) d’acrylamide : bis-acrylamide (37,5 :1) avec un gradient dénaturant de
40 à 70%. L’électrophorèse a été effectuée à 130 V pendant 17h et une température
constante de 60°C. L’électrophorèse a été réalisée avec un appareil D-Code
Universal Mutation Detection System (Biorad).
67
Après migration, le gel a été marqué avec du SYBR Green (Sigma, France)
concentré deux fois et visualisé par transillumination UV. L’image des gels a été
capturée à l’aide d’une caméra CCD couplée au logiciel Biocapt V97.03 (Vilber
Lourmat) et ensuite analysée à l’aide du logiciel Bio-1D++/Bio-gene V97.06 (Vilber
Lourmat). Présence et absence des bandes sont ensuite comptabilisées pour chaque
piste correspondant à un échantillon. L’homologie entre échantillons est calculée
grâce à l’indice de similarité de Jaccard (JACCARD 1912) : J = [(c/(a+b-c)], où a est le
nombre de bandes de l’échantillon A, b le nombre de bandes de l’échantillons B et c
le nombre de bandes communes entre les échantillons A et B. A partir de la matrice
de similarité de Jaccard, le dendrogramme a été construit avec la méthode UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). Même si les bandes
détectées peuvent contenir plus d’un génotype, chaque bande détectée dans le profil
de DGGE est appelée Operational taxonomic Unit (OTU) selon le terme anglais
consacré.
1.6.2.3.4. Séquençage et analyse

phylogénétique des OTUs de DGGE
Parmi les bandes détectées dans le gel de DGGE, les plus intenses ont été
sélectionnées pour être séquencées. Les bandes dominantes excisées du gel de
DGGE ADNr 16S (enrichissement en dénitrifiantes) ont été placées dans un tube
Eppendorf stérile avec 20 µL d’eau stérile. L’ADN a été extrait de l’acrilamide avec
3 cycles consécutifs de congélation/décongélation (-20°C/37°C). Cinq microlitres de
la solution éluée ont été prélevés et utilisés pour une amplification comme définie
précédemment (cf 1.6.2.3.2.PCR). Une seconde DGGE a été effectuée pour vérifier
la pureté des bandes excisées. Les bandes qui contenaient des impuretés ont été
prélevées une deuxième fois et réamplifiées en utilisant les amorces 341F et 907R.
Les produits de PCR ont été purifiés avec le kit de purification QIaquick PCR
(Quiagen, France). Les PCR pour le séquençage ont été réalisées dans 25 µL de
68
mélange selon la procédure proposée par le fournisseur (Beckman Coulter) pour

ensuite séquencer les produits à l’aide d’un séquenceur automatique CEQTM 2000
Dye Terminator Cycle Sequencing.
Les séquences ont été comparées à la banque de séquences GenBank DNA

avec BLAST. L’alignement et la construction des arbres phylogénétiques ont été
réalisés avec le logiciel ARB (www.arb-home.de) (LUDWIG et al. 2004).
1.6.2.3.5. Quantification par PCR en

temps-réel
La PCR-en temps réel avec des amorces issues de gènes fonctionnels comme
nirS, nirK et nosZ est une méthode particulièrement avantageuse puisqu’elle est
rapide, précise et applicable aux échantillons naturels (PHILLIPOT, 2006). Cette
méthode est basée sur la détection et la quantification d’un marqueur fluorescent
(SYBR Green) dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité
d’amplicons générée pendant la réaction de PCR. Le nombre de cycle (Ct), à partir
duquel le signal de fluorescence est stable est une valeur proportionnelle au
logarithme de la concentration en ADN cible. Pour calibrer la PCR, une gamme
étalon d’ADN standard est utilisée.
Les essais de PCR en temps réel ont été réalisés dans un volume de 25 µL de
mélange qui contient du SYBR Green PCR Master MIX (QuantiTectTM SYBR
Green PCR Kit, QIAGEN, France), 1 µM de chaque amorce nirS, nirK, nosZ et 16S
ARNr (Tableau II.1), 100 ng de T4 gp 32 (QBiogene, France) et 1,25 µL d’ADN (à 1
ng µL-1). A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total est quantifiée par
mesure de la fluorescence généré par le SYBR Green. Les cycles thermiques,
l’acquisition des données de fluorescence et l’analyse ont été effectuées sur ABI
Prism 7900 selon les instructions du fabricant. Avec la quantification parallèle du
69
gène 16S ARNr, l’abondance relative de chaque type de dénitrifiante est obtenue (en
fonction du gène ciblé).
1.6.2.4. Diversité métabolique : BIOLOG

EcoPlate
L’analyse des Community Level Physiological Profil (CLPP ou Profils

physiologiques au niveau des communautés) a été conduite avec des microplaques
commerciales BIOLOG EcoPlate (Biolog, Inc., Hayward, CA). Cette méthode rapide
permet d’analyser l’utilisation de différentes sources de carbone par une
communauté bactérienne et donc de déterminer la diversité métabolique d’un
échantillon naturel. Sur une microplaque de 96 puits, 31 sources de carbones sont
testées simultanément en triplicat. Chaque puit contient un substrat carboné, un
colorant et des nutriments. Le tétrazolium qui change de couleur quand il est réduit
avec la source de carbone permet de détecter la respiration. Le protocole a été adapté
d’après (STEPHAN et al. 2000).
Un gramme de billes a été mélangé avec 1 mL de tétrasodium-pyrophosphate

à 0,2% et vortexé à 3200 rpm. Après avoir laissé reposer pendant 3 min, 150 µL ont
été prélevés et dilués 100 fois dans du NaCl à 0,9%. A partir de cette solution, 100
µL on été déposés dans chaque puit. Il a été vérifié que dans chacun des inoculums
utilisés les densités bactériennes étaient comparables et supérieures à 106 cellules par
gramme de billes. Les microplaques ont été incubées pendant 10 jours à 22°C à
l’obscurité. Les lectures sont réalisées après 1, 3, 5, 6, 8 et 10 jours dans un
spectrophotomètre pour la mesure de l’absorbance à 570 nm. A partir de 6 jours
d’incubation, les microplaques arrivent à un niveau d’absorbance maximum. Les
mesures à 5 jours ont donc été utilisées pour les analyses. Les données obtenues sont
normalisées par la division de chaque valeur d’absorbance par les AWCD (Average
Well colour development) moyennes de la plaque.
70
1.7. Unités d’expression des résultats
Pour les eaux souterraines et les sédiments alluviaux, des unités comparables
ont été obtenues avec la transformation des µg L-1 d’eau souterraine et µg g-1 de
sédiment en µg m-3 d’aquifère. Cette transformation a été conduite en utilisant la
porosité du sédiment (12%) et sa densité apparente 1,4 g/cm3. Ainsi, à une valeur de
1 µg L-1correspond une valeur de 120 µg m-3 d’après le calcul suivant : 1*1000=
1000 µg m3 *0,12=120 µg m-3 et à une valeur de 1 µg g-1 correspond une valeur de
1,4 Kg m-3 d’après le calcul suivant : 1*1,4=1,4 µg m-3.
1.8. Méthodes Statistiques
1.8.1. Tests non paramétriques
Les tests de Kruskal-Wallis et Mann Whitney ont été utilisés pour comparer
les échantillons entre eux ou deux à deux. Ces analyses ont été réalisées à l’aide du
logiciel SPSS 11.0.
1.8.2. Régression linéaire multiple pas à pas
La régression linéaire multiple a été utilisée pour analyser les liens entre les
DNT et DEA (variables dépendantes) et les variables environnementales (variables
explicatives). Cette méthode permet le calcul prédictif d’une variable expliquée (Y)
en fonction d’un modèle linéaire intégrant des variables explicatives. Les paramètres
du modèle sont calculés par la méthode des moindres carrés, comme pour le test de
régression linéaire simple. La méthode de calcul utilisée est la méthode « pas à pas »
qui consiste à introduire successivement des variables dans le modèle. Les variables
qui n’apportent pas de contribution sont éliminées. Toutes les variables ont été
transformées en log. Ces analyses ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS 11.0.
71
1.8.3. Test d’imbrication (Nestedness test)
“L’emboîtement” de la distribution des communautés (i.e. le fait que les

communautés s’ordonnent en une hiérarchie de sous ensembles, les moins
diversifiées étant un sous-ensemble des plus diversifiées ; Figure II. 9) à été évalué
grâce à un test de Nestedness (ATMAR et PATTERSON 1995). Cette méthode a été
utilisée afin de tester l’hypothèse que les communautés sont distribuées selon un
patron imbriqué déterminé par la proximité à la rivière (sources des bactéries), donc
que les communautés des piézomètres les moins connectés représentent un sous-
ensemble de la communauté du piézomètre le plus connecté. Le test d’imbrication a
été appliqué aux matrices de présence/absence des taxa dans les piézomètres
(matrices obtenues à partir des DGGE basées sur le 16S ADNr à 3 et 15 mois).
72
Figure II.9. (en page précédent) Illustration de l’hypothèse d’emboîtement des

communautés testées au niveau des piézomètres et analogie avec le modèle
Continent/île de la théorie des îles de (MACARTHUR et WILSON 1967). La matrice à droite
représente des communautés parfaitement imbriquées avec les valeurs de remplissage et
de température de matrice correspondantes.
Le programme “Nestedness Calculator” (http://www.aics-

research.com/nestedness/tempcalc.html) a été utilisé pour ce test. Il s’appuie sur un
modèle thermodynamique pour mesurer l’importance de l’ordre et du désordre dans
la matrice de présence/absence construite à partir de patrons de DGGE. Les colonnes
de la matrice représentent les bandes de la DGGE classées de la plus commune à la
plus rare. Les lignes représentent les piézomètres classés du plus riche au plus pauvre
en espèces. Le programme réarrange la matrice pour maximiser l’emboîtement,
calcule le remplissage (exprimé en %) et la température (T°) de la matrice. Ensuite il
calcule la probabilité de générer une matrice de température égale ou inférieure à
celle observée pour le jeu de données (ATMAR et PATTERSON 1995). Cette probabilité
est calculée en comparant la température de la matrice observées avec la température
du système (TS), définie comme la température moyenne de 1000 matrices
théoriques obtenues aléatoirement par des simulations de Monte-Carlo. L’un des
avantages de ce programme est que la température est indépendante de la taille de la
matrice (WRIGHT et al. 1998). Une matrice parfaitement imbriquée est une matrice
où les sites possèdent un sous-échantillon des espèces présentes dans les sites situés
au-dessus dans la matrice. Une matrice parfaitement imbriquée (Figure I.9) présente
un remplissage de 50% et une température T=0° (ATMAR et PATTERSON 1993).
1.8.3. Test de Mantel
La similarité entre les différents patrons de 16S ARNr ou de nosZ a été

évaluée avec le test de Mantel (MANTEL 1967). On construit une matrice de distance
à partir des distances de Jaccard (D= 1 − J ) séparant les deux profils de DGGE
(16S ARNr et nosZ). La distance est de 1 si les deux échantillons sont complètement
73
différents et de 0 si ils sont similaires. Le test de Mantel permet de calculer la

corrélation entre deux matrices de distances. Cette corrélation est testée
statistiquement en comparant le coefficient de corrélation obtenu à la distribution des
coefficients de corrélation calculés à partir de matrices théoriques générées
aléatoirement en permutant les données initiales (1000 permutations aléatoires de
lignes et colonnes). Les analyses ont été réalisées à l’aide du package ade4 (CHESSEL
et al. 2004) mise en œuvre avec le logiciel R (TEAM 2005).
1.8.4. Carte auto-organisées (Self-Organizing Map SOM)
L’algorithme Self-Organizing Map (SOM) a été utilisé pour classer les

échantillons (dans ce cas, les communautés bactériennes, soit 16 échantillons) en
fonction des sources de carbone dégradées (31 types de sources). Les SOM sont un
modèle de neurones artificiels qui combine des aptitudes de groupement et
d’ordination. Les SOM sont reconnues comme un outil statistique robuste pour offrir
une représentation visuelle de la proximité entre des points situés dans des espaces à
grand nombre de dimensions. Cette méthode est spécialement intéressante pour
mettre en relation des patterns biologiques avec des conditions environnementales
(PARK et al., 2003). L’algorithm des SOM est fondé sur une procédure
d’apprentissage non surveillé (KOHONEN, 2001), lequel transforme les données
multidimensionnelles en cartes bidimensionnelles avec des topologies imposées. Les
SOM expriment les similarités entre les données en groupant les points au cours de la
procédure suivante:
- des échantillons virtuels (représentés par des hexagones) sont initialisés ;

chaque échantillon est placé de manière aléatoire sur une carte de taille prédéfinie
avec des sites virtuels auxquels est attribué une valeur.
- les échantillons virtuels sont actualisés d’une façon itérative : (i) un

échantillon de référence est choisi aléatoirement, (ii) les distances euclidiennes sont
74
calculées entre cet échantillon de référence et le reste des échantillons virtuels, (iii)
l’échantillon avec la distance minimale à l’échantillon de référence est retenu comme
« Best Matching Unit » (BMU), (iv) les autres échantillons sont réorganisés dans la
carte en fonction de cette BMU.
L’apprentissage est divisé en deux phases :
- Phase d’ordination (3000 pas) : les échantillons sont fortement réorganisés

de façons à modifier le voisinage de la cellule BMU.
- Phase de réglage (7000 pas) : les échantillons adjacents au BMU sont
légèrement réorganisés.
A la fin de l’apprentissage, les sources de carbone pour chaque échantillon

sont connues, la BMU est calculée pour chaque échantillon et chaque échantillon est
placé dans l’hexagone de la carte SOM qui lui correspond. La variabilité des données
a été évaluée à l’aide du logiciel SOM Toolbox v2 pour Matlab® ainsi que décrit par
(LEFLAIVE et al. 2005) (voir (VENSANTO et al. 1999) pour les instructions pratiques ;
téléchargement à partir de Laboratory of Information and Computer Science,
Helsinki University of Technology at the http://www.cis.hut.fi/projects/somtoolbox/).
1.8.5. La Régression partielle aux moindres carrés (PLS)
Afin d’identifier les variables environnementales qui expliquaient le mieux la

DEA, la régression PLS a été mise en œuvre. Cette méthode, couramment utilisée en
chimiométrie, est une alternative à la régression multiple lorsque les variables
explicatives sont corrélées (ce qui est le cas ici) rendant ininterprétables les
coefficients et leurs significativité. Cette méthode consiste en une régression linéaire
maximisant la covariance entre la variable à expliquer et des composantes
orthogonales calculées à partir de la matrice des variables explicatives. On
commence par effectuer la régression entre la variable à expliquer et la première
75
composante, on enlève la prévision de la variable à expliquer et la combinaison

prédictive des variables explicatives. On obtient une nouvelle variable à prédire,
résidu du tour précédent et de nouvelles variables prédictives indépendantes de la
combinaison déjà utilisée. Il s’agit donc dans un premier temps de déterminer le
nombre de composantes à prendre en compte dans le modèle. Pour se faire, à chaque
pas l’erreur de prédiction est calculée et on effectue une validation croisée type
« leave-one-out ». On retient le nombre de composante le plus bas possible affichant
une erreur de prédiction faible. Dans notre cas, l’erreur de prédiction a été évaluée
par la “Root Mean Squared Error of Prediction”. L’importance respective des
variables est estimée graphiquement à l’aide d’une projection des corrélations entre
le poids des variables et les composantes sélectionnées. Les variables sont
représentées dans un plan constitué par deux composantes et situées par rapport à
l’origine (intersection des deux axes) et deux cercles concentriques. La distance au
carrée entre l’origine et une variable correspond à la fraction de la variance de la
variable donnée expliquée par les composantes. Les rayons des cercles correspondent
respectivement à 50 et 100% de la variance expliquée (MEVIK et WEHRENS 2007a).
Les analyses ont été réalisées à l’aide du package ade4 (MEVIK et WEHRENS 2007b)
mis en œuvre avec le logiciel R (TEAM 2005)
1.8.6. Analyse Canonique des Correspondances (ACC)
L’ACC (TER BRAAK 1986) a été utilisée pour étudier les relations entre
communautés bactériennes et variables environnementales. L’objectif de cette
méthode est de traiter simultanément le tableau des variables environnementales et le
tableau des relevés taxonomique (dans notre cas présence/absence de OTUs) et
d’expliquer la structure de ce dernier par le premier. Un test de Monte-Carlo permet
d’évaluer la significativité de la décomposition de l’inertie du tableau taxonomique
selon les paramètres environnementaux. Ce test est basé sur la permutation des lignes
du tableau taxonomique et permet de comparer les valeurs observées et les valeurs
76
simulées. Les analyses ont été réalisées à l’aide du package ade4 (CHESSEL et al.
2004) mis en œuvre avec le logiciel R (TEAM 2005).
77
2. Les Biofilms Phototrophes du lit de la rivière
Les données utilisées pour cette partie proviennent de travaux précédents

(MEILLON 2002 ; LACOSTE 2003 ; LYAUTEY 2005). En conséquence, seul un résumé
rapide des méthodes utilisées par ces auteurs pour la description de la biomasse, la
composition des communautés et la mesure de l’activité dénitrifiante sera proposé
(pour des compléments d’information se référer aux articles cités). Dans le cadre de
cette thèse, nous avons réalisé toutes les analyses supplémentaires associées aux
communautés dénitrifiantes ainsi que le traitement statistique de l’ensemble des
données.
2.1. Echantillonnage
Les échantillons ont été prélevés sur la Garonne (en deux sites différents, à
Aouach (U1) et à Gagnac (D2) et sur Le Saint Perdoux (T). Aouach est situé à 36 km
à l’amont de Toulouse et Gagnac à 12 km à l’aval. Le Saint Perdoux est un affluent
indirect du Lot, lui même affluent de la Garonne. C’est un petit cours d’eau d’ordre 2
de faible largeur (< 10m), avec une hauteur d’eau < 30 cm, un débit moyen de 0,26
m3 s-1 et une surface de bassin de 1350 km2. Les principales caractéristiques physico-
chimiques sont récapitulées dans le Tableau II.2. Les biofilms ont été décrochés à
l’aide d’une brosse à dents stérile, mis en suspension dans un volume d’eau filtrée
(taille de pore 0,2 µm), puis homogénéisés (24000 t mn-1, Ulta Turrax modèle T2S,
Janle et Klunkel) afin d’obtenir une suspension homogène à aliquoter pour les
différents mesures.
78
Tableau II.2. Présentation des sites d’échantillonnage de biofilms phototrophes.
Sites
Unités Aouach (U1) Gagnac (D2) Saint Perdoux (T)
Saint Perdoux, Sud-Ouest de la
Rivière Garonne, Sud-Ouest de la France Garonne, Sud-Ouest de la France
France
Ordre de Strahler 6th 7th 2nd
Localisation 43°23’N - 01°18’E 43°42’N - 01°21’E 44°38’N - 02°03’E
Altitude m asl 182 120 211
Distance à la source km 305 352 12
Largeur m > 100 > 100 < 10
Profondeur maximale m >1 >1 < 0,5
Profondeur
m 0,5 0,5 0,2
d’échantillonnage
Moyenne annuelle du
m3 s-1 200 200 0,.26
QMJ
Données annuelles
O2 mg L-1 10,6 ± 1,4 9,7 ± 1,3 11,0 ± 1,5
Conductivité µS.cm-1 213 ± 55 219 ± 56 93 ± 18
pH 8,5 ± 1,1 8,0 ± 0,2 7,4 ± 0,2
NO3- + NO2- mg L-1 0,73 ± 0,12 1,33 ± 0,34 0,54 ± 0,10
NH4+ mg L-1 0,03 ± 0,02 0,43 ± 0,28 0,006 ± 0.006
PRS mg L-1 0,01 ± 0,01 0,08 ± 0,04 0,006 ± 0,004
PT mg L-1 0,03 ± 0,01 0,12 ± 0,05 0,024 ± 0,008
SiO2 mg L-1 4,11 ± 0,79 4,00 ±0,90 12,6 ± 1,5
COD mg L-1 1,3 ± 0,3 1,7 ±0,41 ND
Caractéristiques cours moyen, cours moyen, tête de bassin,
grand radier, grand radier, petit radier,
amont immédiat de Toulouse. aval immédiat de Toulouse. couverture de canopée 100%.
79
2.2 Descripteurs de la biomasse épilithique
Pour la quantification de la MS, de la MSSC et des densités bactériennes le

protocole est décrit dans LYAUTEY et al. (2003).
2.3. Activité dénitrifiante : DEA limitée en carbone
Des mesures de potentiel enzymatique de dénitrification (DEA) dans des

conditions d’anoxie où les nitrates sont en quantité non limitante permettent une
approche du potentiel hétérotrophe strictement bactérien, reflétant la disponibilité des
ressources pour les bactéries dans l’agrégat. Nous nous référons à ces mesures sous
le terme de « DEA limitée en carbone » (DEA-LC) car seuls des nitrates sont ajoutés,
pas de carbone. Les mesures de DEA-LC ont été effectuées au laboratoire à l’aide de
boîtes hermétiques en polymethyl-méthacrylate connectées à un système de
circulation d’eau avec une pompe péristaltique (flux 600 mL min-1) (Figure II.10).
3 1. Galet
2. Boîte d’incubation
3. Arrivée d’eau
7
4. Sortie d’eau
5. Seringue
6. Point d’échantillonnage
7. Pompe péristaltique
Figure II.10. Dispositif de mesure de la DEA limitée en carbone.
80
Ce travail a été effectué par (MEILLON 2002) dans le cadre d’un DESUPS.
L’appareil d’échantillonnage consiste en une seringue de 120 seringue a deux ports
fermes par des bouchons a juppe rabattable constituant des septa pour des
prélèvements et un piston qui permet de controler le volume d’eau avant et après
chaque prélèvement. Le protocole utilisé a été le suivant. Des galets colonisés par
environ 100 cm2 de BP ont été introduits dans les boîte et celles-ci ont été remplies
d’eau de nappe filtrée et enrichie en nitrates (KNO3 = 1 g L-1). Ensuite, les boîtes ont
été scellées et de l’acétylène a été ajouté jusqu’à obtenir une pression partielle de
10% (v :v) dans l’eau. La désoxygénation de l’eau a été réalisée à l’aide de 10 mL
d’une solution de sulfite de sodium (Na2SO3= 20 g L-1) préparée dans une seringue
pour éviter tout contact avec l’air. L’incubation a été réalisée dans une armoire
thermo-régulée à 20 °C, à l’obscurité. Pendant 1h 40min, 3 mL d’eau ont été
prélevés toutes les 20 minutes dans des Vénoject (Terumo Scientific, NJ, USA) avec
du formol. Dans les phases gazeuses de ces Vénoject, le N2O en équilibre avec la
phase liquide a été analysé à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse
(chromatographe GIRDEL, Série 30, France équipé d’un capteur d’électron ECD
63
Ni) avec une colonne de Porapak Q (2 m avec 1/8 pouce de diamètre interne). La
DEA-LC (production de N2O) est donnée par la pente de la droite de régression
linéaire entre les 5 prélèvements effectués. Lorsque la production de N2O n’était pas
linéaire la pente maximale a été utilisée.
2.4. Typage des communautés bactériennes
Ce travail a été effectué en utilisant les extraits obtenus par LYAUTEY (2005).
L’extraction, la quantification, l’amplification et l’analyse des patrons des
communautés totales (16S ARNr) avec la PCR-DGGE ont donc été réalisées par cet
auteur, selon les protocoles décrits dans LYAUTEY (2005). Les analyses concernant
spécifiquement les communautés dénitrifiantes dans le cadre de ma thèse ont en
81
revanche été réalisées avec le protocole décrit précédemment (cf 1.6.2.3.3 DGGE ;
voir 1.6.2.3.2. Choix des marqueurs : 16S ARNr et nosZ pour les amorces).
2.5 Quantification par PCR en temps réel
De même façon que pour le typage des communautés bactériennes, les

quantifications des gènes dénitrifiants et 16S ARNr ont été réalisées sur les extraits
provenant du travail de LYAUTEY (2005). Cette quantification a été effectuée à l’aide
de la méthode de PCR en temps réel précédemment décrite (cf 1.6.3.2.4
Quantification par PCR en temps réel ; voir 1.6.2.3.2. Choix des marqueurs : 16S
ARNr et nosZ pour les amorces).
3. Analyse en Coordonnées Principales (ACoP)
Les méthodes statistiques utilisées uniquement dans cette partie sont décrites
ci-dessous. Tous les tests statistiques ont été réalisés à l’aide de ADE-4 sous le
logiciel R (IHAKA et GENTLEMAN 1996).
Les structures des communautés bactériennes totales (16S ARNr) et

dénitrifiantes (nosZ) ont été caractérisées sous la forme de matrices de distances de
Jaccard. L’ACoP est une analyse de type « multidimensional scaling » où l’on
calcule les valeurs propres et vecteurs propres d'une matrice calculée à partir de la
matrice de distances, afin de déterminer la projection optimale d’un ensemble
d'objets dans un sous-espace de dimension donnée.
Afin de tester si les assemblages taxonomiques différaient selon la biomasse

ou selon les conditions physico-chimiques du site, une analyse inter-classes à partir
des ACoP a été réalisée (DOLEDEC et CHESSEL 1987 ; DOLEDEC et CHESSEL 1989).
Cette méthode permet de focaliser sur les différences entres groupes d’individus en
cherchant à maximiser la variance inter-classes. Un test sur permutations est réalisé
82
afin de déterminer si la variance inter-classe observée est significative. Pour ce faire

on permute les individus sans tenir compte des classes auxquelles ils appartiennent et
la variance inter-classe est calculée pour chaque permutation ; la variance inter-classe
observée est ensuite comparée à la distribution des inerties inter-classe simulées.
La congruence entre les communautés bactériennes totales et dénitrifiantes a

été étudiée à l’aide d’une analyse procustéenne de co-inertie. A l’origine, l’analyse
procustéenne est basée sur la rotation et la translation d’un nuage de points dans un
plan (donc en 2 dimensions) afin de l’ajuster sur un autre nuage de point. L’analyse
procustéenne de co-inertie permet d’analyser des structures à plus de 2 dimensions
(DRAY et al. 2003), comme ici dans le cas de la matrice issue d’une ACoP. La
statistique d’ajustement m² peut être assimilée à un coefficient de corrélation dans la
mesure où si m²=0 cela indique qu’il n’existe aucune structure commune entre les
communautés et si m²=1, les structures sont similaires. La congruence est ensuite
testée à l’aide d’un test par permutation de type PROTEST (JACKSON 1995) où le m²
observé est comparé à la distribution de m² simulés, calculés à la suite de
permutation des lignes d’une des matrices (DRAY et al. 2003).
Les analyses ont été réalisées à l’aide du package ADE-4 (CHESSEL et al.
2004) mis en œuvre avec le logiciel R (TEAM 2005).
83
Chapitre III. Variabilité spatio-
temporelle des processus de la
dénitrification (DNT et DEA) au sein
d’un aquifère alluvial
Où nous avons caractérisé les patrons spatiaux et temporels de la dénitrification in

situ (DNT) et de l’activité enzymatique dénitrifiante (DEA) dans l’aquifère alluvial
sur la base de mesures mensuelles acquises durant une année.
84
Ch. III : Distribution spatio-temporelle de la dénitrification dans un aquifère alluvial
1. Introduction
Dans le continuum bassin versant-océan, les systèmes où la dénitrification a

lieu se différencient en fonction des modalités faisant coïncider un apport de nitrates
et les conditions d’anoxie nécessaires à la dénitrification. Ainsi SEITZINGER et al.
(2006) distinguent trois groupes de systèmes : (1) ceux où les nitrates diffusent à
travers une zone dominée par un gradient stable d’oxygène jusqu’aux sites anoxiques
de dénitrification, (2) ceux où les nitrates sont transportés par advection vers une
zone d’anoxie et enfin (3) ceux où des conditions d’anoxie prenant place
périodiquement ou ponctuellement conduisent temporairement à la dénitrification.
Les aquifères alluviaux des zones riveraines peuvent être classés dans le déuxième
groupe : les nitrates infiltrés dans la nappe depuis les terres agricoles sont transportés
avec l’eau de nappe vers la rivière et les zones d’anoxie. Si la dénitrification a été
largement étudiée dans les différents compartiments de la zone riveraine (dans le sol
non-saturé (BURT et al. 1999 ; SABATER et al. 2003 ; HILL et al. 2004), dans le sol
saturé (BRÜSCH et NILSSON 1993 ; SEITZINGER et KROEZE 1998 ; CASEY et al. 2004)
et dans les eaux souterraines (ADDY et al. 2002 ; KELLOGG et al. 2005), la variabilité
spatiale et temporelle de la dénitrification reste peu expliquée. Plus que la couverture
végétale, la topographie (CLEMENT et al. 2002), la géomorphologie (SABATER et al.
2003), la pédologie (MAITRE et al. 2004) et l’hydrologie de la zone (MAITRE et al.
2002) participent au contrôle de la dénitrification sans que les mécanismes impliqués
soient élucidés. Certains patrons de variation spatiale de la dénitrification ont été
décrits. Sur un axe vertical, même si quelques auteurs ont suggéré l’absence de
dénitrification dans les sols riverains à partir de 60 cm de profondeur (PINAY et al.
1998 ; BURT et al. 1999), la dénitrification a ensuite été avérée jusque dans des
aquifères profonds (SEITZINGER et KROEZE 1998 ; SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ;
HILL et al. 2004 ; BAKER et VERVIER 2004). Sur un axe transversal, les taux de
dénitrification au sein des aquifères alluviaux diminuent au fur et à mesure
qu’augmente la distance à la rivière (KELLOGG et al. 2005), c’est à dire au fur et à
85
mesure que diminue le niveau de connectivité à la rivière.
La classification proposée par SEITZINGER et al. (2006) omet cependant que la

dénitrification n’est pas seulement guidée par la coïncidence temporelle ou spatiale
entre des apports de nitrates et des conditions d’anoxie. La présence de sources de
carbone est également un facteur important pour soutenir une dénitrification
hétérotrophe. Or, les infiltrations d’eau en provenance de la rivière à travers le
sédiment alluvial transportent des sources de carbone (BRUGGER et al. 2001) vers des
zones où ce facteur peut être limitant (BRADLEY et al. 1992 ; ADDY et al. 2002 ;
GROFFMAN et CRAWFORD 2003). Ces flux d’eau de rivière vecteurs de carbone
convergeant avec la masse d’eau chargée en nitrates issue des terres agricoles sont
susceptibles d’engendrer localement des zones de fortes activités de dénitrification
nommées Hot spots (MCCLAIN et al. 2003). D’autre part, des évènements
hydrologiques ponctuels générés par les variations de débit de la rivière peuvent
aussi agir sur l’intensité de la dénitrification. De tels évènements peuvent assurer les
apports d’un réactif manquant à la réalisation de la dénitrification, soit par un
relargage à partir de quantités stockées dans des horizons supérieurs du sol, soit par
de nouveaux apports en provenance de la rivière. L’activité serait alors
momentanément favorisée dans cette zone, on parle de Hot moments (MCCLAIN et al.
2003).
Dans l’aquifère alluvial de la zone riveraine de Monbéqui, la connectivité

avec la rivière influence les patrons spatiaux et temporels de la dénitrification in situ
(BAKER et VERVIER 2004). Les zones de forte déplétion de carbone correspondent à
des zones à fortes teneur en eau de rivière (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b).
Néanmoins, la répartition de la déplétion des nitrates, indicateur de la dénitrification
in situ, n’est pas en accord avec les patrons de déplétion du carbone. Ceci suggère
que des facteurs autres que le carbone peuvent déterminer l’activité dénitrifiante.
Même si la dénitrification est corrélée aux apports en carbone oxydable (HILL et al.
2000), d’autres exigences de la dénitrification comme la concentration de l’oxygène
86
(SEITZINGER et KROEZE 1998) ou les nitrates (PINAY et al. 1993) peuvent agir sur les
patrons de dénitrification. BAKER et VERVIER (2004) et SANCHEZ PEREZ et al.
(2003a) soulignaient l’importance des échanges entre l’eau de nappe et l’eau de
rivière. Cependant, peu de prélèvements ont été réalisés dans ces deux études (autour
de 5) et seulement deux conditions hydrologiques très contrastées ont été testées au
cours d’une même période de l’année (hiver-printemps).
Ce chapitre III de l’étude expérimentale a comme objectif de décrire le

fonctionnement biogéochimique de l’aquifère alluvial au niveau de la dénitrification
sur une période pluriannuelle et dans différentes conditions hydrologiques. Ceci
permettra d’identifier les zones et moments de forte activité de dénitrification et les
facteurs qui les conditionnent. Pour cela, nous avons effectué des mesures de DNT et
de DEA en parallèle, afin de décrire la variabilité spatio-temporelle in situ et in vitro
de la dénitrification dans l’aquifère alluvial.
2. Résultats
Pour interpréter les résultats obtenus il est nécessaire de connaître le contexte

hydrologique de chacune des campagnes de mesure et de chaque piézomètre au sein
de la zone d’étude. L’hydrogramme construit à partir des mesures de niveau de
nappe réalisées mensuellement sur le terrain reflète la connectivité de chaque
piézomètre avec la rivière (Figure III.1). Les piézomètres situés sur l’interface
nappe/rivière (p6, p10 et p13 et p18) sont sous l’influence du débit de la rivière
comme en attestent : (i) l’amplitude des variations du niveau de nappe (de 0,4 à 1,2
m) et (ii) la simultanéité des variations de débits de la rivière et du niveau de nappe
dans ces piézomètres (< 1-2 jours). Les niveaux de nappe dans ces piézomètres
suivent les variations de débit de la rivière (Figure. III.1). Dans les piézomètres p6 et
p18, le mélange des eaux comporte en moyenne 80% d’eau de rivière et 60% dans le
p10 et p13 (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b). En revanche, le piézomètre p29 situé dans
87
la nappe agricole est déconnecté de la rivière, sauf crues supérieures à 1000 m3 s-1.
Ce piézomètre est alimenté seulement par de l’eau de nappe (SANCHEZ PEREZ et al.
2003b).
3000 91
Débit journalier de la rivière m3 s-1
p6
2500 p10 90
p13
Niveau nappe m asl

2000 p18 89
p29
1500 88
1000 87
500 86
0 85
J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O
2004 2005
Figure III.1. Hydrogramme de la Garonne au niveau de Monbéqui (82) pendant la

période d’étude de 2004-2005 (trait continu) et variations des niveaux de nappe
phréatique dans les 5 piézomètres étudiés (points figurant les 5 piézomètres).
L’analyse en composantes principales effectuée avec les variables physico-

chimiques caractérisant les piézomètres a permis de rechercher les
ressemblances/différences entre piézomètres. Le positionnement des piézomètres
dans le plan des deux axes principaux sépare deux groupes de piézomètres en
fonction des conditions environnementales qui y règnent (Figure III.2) : un groupe
qui inclut les piézomètres p6 et p18, localisés à moins de 60 mètres de la rivière et un
second groupe composé par les piézomètres p10, p13 et le p29 localisés entre 150 et
1000 mètres de la rivière. Parmi les variables étudiées, l’oxygène, les nitrates, les
nitrites, les chlorures, le carbone organique dissous et le rapport entre carbone
organique dissous et azote minéral (COD/NID) expliquent plus de 50% du rayon du
cercle de corrélation. L’axe 1 est expliqué principalement par l’oxygène, les nitrates,
et le rapport COD/NID. Les piézomètres p6, p18 et le piézomètre p13 présentent des
teneurs en nitrate et oxygène moins importantes (moyennes de 1,7 mg L-1, 2,1 mg L-1
88
et 1,62 mg L-1 respectivement). L’axe 2 est expliqué par les Cl- qui reflètent la teneur
en eaux de surface dans le mélange des eaux. Les deux piézomètres les plus proches
de la rivière, p6 et p18, contiennent des pourcentages importants d’eau de surface par
rapport aux piézomètres p13, p10 et p29. Ces trois derniers piézomètres se
distribuent en fonction de leurs teneurs en nitrates et en oxygène qui, des piézomètres
p13 au p29, augmentent avec la distance avec la rivière. Parmi ces trois piézomètres,
le p13 a des concentrations de carbone organique dissous plus élevées (3,2 mg L-1
versus 1,3 et 0,9 mg L-1) qui le différencient des piézomètres p10 et p29 (Kruskal-
Wallis, p < 0,05).
axe2
pH
p18
p6 O2 NH4+
p29 axe1 Temp COD/NID
p10 NO3- MSSC
NO2-
Cl- COD
p13
% de variance expliquée
axe1 : 26%
axe2 : 18%
axe3 : 13%
1 10
Axes factoriels
Figure III.2. Analyse en composantes principales des conditions physico-chimiques

des piézomètres (p6, p10, p13, p18 et p29) de la zone alluviale de la Garonne à
Monbequi (a), cercle des corrélations (b) et distribution de la variance selon les
différents axes factoriels (c). Temp. : température ; Cond. : conductivité ; NO3- : nitrates,
NO2- : nitrites ; NH4+ :ammonium ; COD : carbone organique dissous ; COD/NID : rapport
carbone organique dissous et formes d’azote inorganique dissous avec NID = NO3- + NO2- +
NH4+ ; O2 : oxygène dissous ; MSSC : Matière sèche sans cendre.
89
2.1. Dénitrification potentielle (DEA) dans l’eau et les

sédiments
Afin d’évaluer la participation respective à l’activité de dénitrification des deux

compartiments de l’aquifère que sont l’eau et les sédiments, des mesures de la DEA
ont été réalisées au laboratoire sur l’eau et les sédiments issus des différents
piézomètres. Dans l’ensemble des piézomètres, la DEA obtenue pour l’eau est très
faible, avec des valeurs moyennes situées entre 0,4 et 6,47 mg N-N2O m-3 j-1. Pour
certaines dates de prélèvement, la DEA se situe même aux limites de la détection
voire est non détectable. La DEA est 1000 fois plus élevée dans les sédiments, avec
des valeurs moyennes situées entre 1697 et 6823 mg N-N2O m-3 j-1 (Figure III.3).
14 14000
12 EAU 12000 SED
mg N-N2O m-3 j-1
10 10000
8 8000
6 6000
4 4000
2 2000
0 0
p6 p18 p13 p10 p29 p6 p18 p13 p10 p29

(N=13) (N=13) (N=12) (N=13) (N=13) (N=13) (N=13) (N=12) (N=13) (N=13)
Figure III.3. Valeurs de dénitrification potentielle (DEA) dans l’eau et les sédiments
(SED) de l’aquifère alluvial de la Garonne à Monbéqui (82) mesurées pour 5
piézomètres (p6, p10, p13, p18 et p29) au cours de 13 campagnes réparties sur l’année
2004-2005. Les boîtes avec une lettre en commun correspondent à des activités non
significativement différentes (Mann-Whitney, p < 0.05). Pour chaque piézomètre sont
représentés par les limites basse et haute du rectangle gris : le 1er quartile (25%) et le
troisième quartile (75%) ; la médiane, par le trait horizontal au sein de ce rectangle, la valeur
maximale et minimale par les barres. Les cercles noirs sont des valeurs considérées comme
isolées parce que plus de 1,5 fois supérieures à la valeur de l’interquartile (règle de décision
imposée par le logiciel SPSS).
90
Sur la base de ces résultats, le signal de dénitrification dans l’eau est trop faible pour
avoir un impact significatif sur la fonction du système. Nous avons donc choisi de
concentrer notre recherche sur l’étude de la variabilité spatiale et temporelle de la
DEA dans les sédiments et d’établir une comparaison à la DNT mesurée in situ.
2.2. Variabilité spatiale de la dénitrification au sein du

sédiment alluvial (DNT et DEA)
Une nouvelle ACP a été construite en ajoutant la DEA et la DNT aux

conditions environnementales (Figure III.4). Parmi les variables étudiées, l’oxygène,
les nitrates, les chlorures, le carbone organique dissous, le rapport COD/NID, la
matière sèche sans cendre, la DEA et la DNT expliquent plus de 50% du rayon du
cercle de corrélation. La DNT et la DEA expliquent la distribution des points. Les
prélèvements des différents piézomètres sont distribués dans le plan factoriel selon
des groupes similaires à ceux apparaissant dans l’ACP précédente (Figure III.2).
L’axe 1 est expliqué par le carbone organique dissous, l’oxygène et la DNT. Cette
dernière variable explique le léger détachement du groupe de prélèvements issus du
piézomètre p13. L’axe 2 est expliqué principalement par les chlorures. Cette ACP
suggère que la DNT est conditionnée par l’absence d’oxygène et la présence de
carbone, facteurs qui sont particulièrement favorables à l’activité dénitrifiante dans le
piézomètre p13, où les taux de dénitrification (DNT et DEA) sont les plus élevés
(Figure III.5).
91
pH
p18 NH4+
p6 COD/NID
O2 COD
NO3- MSSC-
NO2-
Temp
DEA DNT
Cl-
p29
p10
% de variance expliquée
axe1 : 24%
p13
axe2 : 20%
axe3 : 16%
1 10
Axes factoriels
Figure III.4. Analyses en composante principales de la dénitrification in vitro et in situ

et des conditions physico-chimiques des piézomètres p6, p10, p13, p18 et p29 (a),
cercle des corrélations (b) et distribution de la variance selon les axes factoriels (c).
Temp.: température ; Cond.: conductivité ; NO3-: nitrates, NO2-: nitrites ; NH4+: ammonium ;
COD: carbone organique dissous ; COD/NID: rapport carbone organique dissous et formes
d’azote inorganique dissous avec NID = NO3- + NO2- + NH4+; O2: oxygène dissous ; MSSC:
Matière sèche sans cendre.
10000 5000 c
ab DEA DNT
µg N-N2O kg-1 séd j-1
8000 c 4000
ab
6000 b 3000
4000 2000
a
b
2000 1000
a b a
0 0
p6 p18 p13 p10 p29 p6 p18 p13 p10 p29

(N=13) (N=13) (N=12) (N=13) (N=13) (N=13) (N=11) (N=12) (N=11) (N=12)
Figure III.5. DEA et DNT par piézomètre dans l’aquifère alluvial de la Garonne à
Monbequi (82), campagnes réalisées en 2004-2005 dans 5 piézomètres (p6, p18, p13,
p10, p29). Les boîtes avec une lettre en commun correspondent à des activités non
significativement différentes (Mann-Whitney, p < 0,05). Pour chaque piézomètre sont
92
Sur 13 mois d’étude, la DEA et la DNT moyennes varient respectivement

entre 1212 et 4992 µg N-N2O kg-1 séd j-1 et 33 et 1704 µg N-N2O kg-1 séd j-1 (Figure
III.5). Par ailleurs, ces deux descripteurs de l’activité dénitrifiante sont
significativement corrélés (Figure III.6). Par piézomètre, la DNT représente 34% de
la DEA dans le piézomètre p13 tandis qu’elle représente respectivement 17, 18, 4 et
3% de la DEA des piézomètres p18, p10, p6 et p29.
5
p6
p18
log DNT (µg N-N2O kg-1 séd j-1)
4 p10
p13
p29
3
0
0 1 2 3 4 5
log DEA (µg N-N2O kg-1 séd j-1)
Figure III.6. Relation entre les taux de DEA et de DNT mesurés simultanément au
cours de 13 campagnes réalisées en 2004–2005 au sein de 5 piézomètres de la zone
alluviale de la Garonne à Monbéqui (82). L’équation de régression linéaire sur les
données transformées est : log DNT = 0,413 log DEA + 0,742 ; r²=0,44, p < 0,001)
La DEA et la DNT observées au niveau du piézomètre p13 sont

significativement plus élevées que celles observées dans les autres piézomètres au
cours de la période d’étude. Ceci suggère que ce piézomètre serait situé dans une
zone de dénitrification plus active avec, respectivement, des valeurs moyennes de
93
4992 et 1704 µg N-N2O kg-1 séd j-1 (Figure III.5). Ce piézomètre est localisé dans
une zone intermédiaire de l’interface nappe/rivière où les teneurs en nitrates, matière
sèche sans cendre et carbone organique dissous sont élevées (N-NO3- = 6,0 mg L-1,
MSSC = 7,0 g-1 kg-1 séd, COD = 3,2 mg L-1) alors que règnent des conditions
d’anoxie (O2 = 1,6 mg L-1). Le piézomètre p29 implanté dans les terres agricoles
correspond à un cas opposé car les taux de DNT et de DEA sont très faibles (1212 et
33 µg N-N2O kg-1 séd j-1 respectivement), les teneurs en oxygène et nitrates sont
fortes (O2 = 8,9 mg L-1 ; N-NO3- = 14,3 mg L-1) et les concentrations en matière
sèche sans cendre et carbone organique dissous sont faibles (MSSC = 4,9 g-1 kg-1
séd ; COD = 1,2 mg L-1). Pourtant ni la DEA ni la DNT mesurée au sein de ce
piézomètre au cours des années 2004-2005 ne sont significativement différentes de
celles mesurées dans le piézomètre p6, un piézomètre dont les caractéristiques sont
de plus faibles teneurs en oxygène et nitrates (O2 = 1,5 mg L-1 ; N-NO3- = 2,2 mg L-
1
). Seul le piézomètre p18 présente à la fois des valeurs de DEA et de DNT
significativement plus fortes que celles mesurées dans les piézomètres p29 et p6 tout
en étant significativement plus faibles que celles mesurées dans le piézomètre p13.
Pour identifier les facteurs qui conditionnent la DNT et la DEA, l’ensemble

des paramètres physico-chimiques inclus dans l’ACP a été testé statistiquement à
travers des régressions multiples pas à pas (Tableau III.1). La DEA est
principalement expliquée par la matière sèche sans cendre (r2=0,187).
L’incorporation du rapport COD/NID dissous (r2=0,276) permet d’expliquer 9% des
variations de la DEA par rapport au pas précédent. Dans le cas de la DNT, la
principale variable explicative est la teneur en carbone organique dissous (r2=0,226)
et la prise en compte de la MSSC explique 20% de plus de variation de la DNT (r2=
0,420).
94
Tableau III.1. Analyse en régression multiple pas à pas de la DEA et de la DNT

(variables dépendantes) et des variables environnementales (Température,
Conductivité, pH, Cl-, N-NO3-, N-NO2-, N-NH4+, O2, COD, COD/NID et MSSC) mesurées
simultanément au cours de 13 campagnes réalisées en 2004-2005 au sein de 5
piézomètres de la zone alluviale de la Garonne à Monbéqui (82). (*significatif à p< 0,05 ;
**significatif à p < 0,001).
Variable Variable
Pas r2 F Probabilité
dépendante explicative
DEA 1 MSSC 0,187 10,570 0,003*
2 COD/NID 0,276 8,582 0,023*
DNT 1 COD 0,226 13,452 0,000**
2 MSSC 0,420 16,304 0,000**
Nous avons groupé les activités des différents piézomètres en fonction de la

distance de ces derniers à la rivière. Pour cela, nous nous appuyons sur les analyses
des caractéristiques physico-chimiques des différents piézomètres couplées à leurs
distances à la rivière : les piézomètres p6 et p18 situés entre 50 et 60 mètres de la
rivière sont localisés dans le flux préférentiel d’eau de surface qui traverse le
méandre. Ils présentent des caractéristiques physico-chimiques différenciées (ACP
de la Figure III.2) et subissent de fortes amplitudes de variation du niveau de nappe
(Figure III.1). Les piézomètres p10 et p13 situés entre 150-300 mètres sont localisés
dans une zone intermédiaire et le piézomètre p29 situé à 1300 mètres est éloigné de
toute influence de la rivière puisqu’il est caractérisé par une faible réactivité
(amplitude et temps de réponse) aux variations de débit de la rivière. La zone
intermédiaire du méandre serait une zone à forte dénitrification, comme l’indiquent
les données de DEA et de DNT. Au contraire, la zone agricole (zone pour laquelle
nous ne disposons que d’un échantillonnage réalisé sur un piézomètre) serait
caractérisée par des taux de dénitrification (DEA et DNT) parmi les plus faibles
observés, avec en moyenne 1212 et 33 µg N-N2O kg-1 séd j-1.
95
10000 5000
b
DEA DNT
8000 4000
a b
6000 3000
c
4000 2000
a
2000 1000
c
0 0
50-60 150-300 1300 50-60 150-300 1300
(N=26) (N=25) (N=13) (N=24) (N=23) (N=12)
Distance à la rivière (m)

Figure III.7. DEA et DNT en fonction de la distance à la rivière, campagnes réalisées en
2004-2005 au sein de 5 piézomètres de la zone alluviale de la Garonne à Monbéqui
(82). Les boîtes avec une lettre en commun correspondent à des activités non
significativement différentes (Mann-Whitney, p < 0.05). Pour chaque piézomètre sont
2.3. Variabilité temporelle de la dénitrification (DNT et

DEA)
Les prélèvements ont été rassemblés en deux groupes sur la base des valeurs
de débits de la rivière (Figure III.10) : un groupe « hautes eaux », quand le débit était
supérieur à 200 m3 s-1 (200 est le débit moyen annuel de la Garonne dans le site) et
un groupe « basses eaux », quand le débit était inférieur à cette valeur. Les DNT et
DEA moyennes ont été calculées pour chacune de ces conditions hydrologiques
(Figures III.8) dans les piézomètres p6, p10, p13 et p18. Le piézomètre p29 a été
exclu du calcul puisque la hauteur de nappe y varie seulement pour des crues
supérieures à 1500 m3 s-1 (WENG et al. 2003). Les résultats montrent que la DNT est
significativement plus importante en conditions de hautes eaux. Par contre la DEA
n’est pas significativement différente entre ces deux modalités de conditions
hydrologiques.
96
10000 a
Hautes eaux

8000 Basses eaux
a
6000
c
4000 b
2000
N=19 N=28 N=19 N=32
DEA DNT
Figure III.8. DNT et DEA par piézomètre en conditions de hautes eaux (> 200 m3 s-1) et
basses eaux (< 200 m3 s-1). Campagnes réalisées en 2004-2005 au sein de 5
piézomètres de la zone alluviale de la Garonne à Monbéqui (82). Les boîtes avec une
lettre en commun correspondent à des activités non significativement différentes (Mann-
Whitney, p < 0.05). Pour chaque piézomètre sont représentés par les limites basse et haute
du rectangle gris : le 1er quartile (25%) et le troisième quartile (75%) ; la médiane, par le trait
horizontal au sein de ce rectangle, la valeur maximale et minimale par les barres. Les
cercles noirs sont des valeurs considérées comme isolées parce que plus de 1,5 fois
supérieures à la valeur de l’interquartile (règle de décision imposée par le logiciel SPSS).
Comme les principales variables explicatives de la DNT ne montrent pas de

différence significative entre hautes et basses eaux (5,6 et 6,0 mg L-1 de MSSC kg-1
séd, le 1,6 et 2,0 mg L-1 COD (Mann-Whitney, p > 0,05), le flux hydraulique
(différent entre hautes et basses eaux) pourrait être le facteur qui conditionne la mise
en place de ces activités.
Les patrons temporels de la DNT montrent des fluctuations plus importantes

d’un mois à l’autre dans l’ensemble des piézomètres. Les patrons temporels de la
DEA par piézomètre sont proches entre les différents piézomètres, avec des activités
plus importantes de janvier à août 2005 (Figure III.9). En janvier 2005, deux
campagnes (J et J2) ont été réalisées à une semaine d’intervalle dans les piézomètres
p6, p18 et p13: la première 4 jours avant la crue du 21 janvier 2005 (567 m3 s-1) et la
seconde 4 jours après cette crue. Les données de DEA et DNT ne montrent pas
97
d’effet immédiat de la crue (Figure III.9) en contradiction avec la diminution des

valeurs de MSSC et de COD observées une semaine après la crue (Figure III.10. a et
b). La DEA montre plutôt un effet à plus long terme. Le fait d’être en période de
recharge où de décharge de l’aquifère agit sur le taux de DEA (Figure III.8 et Figure
III.9 a). La série de petites crues observée à partir de novembre correspond à la
période de plus forte activité et à une tendance à l’augmentation de la MSSC et du
COD à plus long terme (4 mois). Ceci indique que la situation de recharge ou
décharge de l’aquifère conditionnerait la réponse biologique (activité, biomasse). La
variabilité de la DNT semble être expliquée plutôt par les conditions instantanées du
milieu avec des patrons temporels plus différents entre les piézomètres (Figure III.9
et 10). Les piézomètres les plus connectés à la rivière (p6, p18 et p13) montrent des
patrons similaires avec les plus fortes DNT en mars et mai 2005 (Figure III.9).
98
DEA DNT
16000 300
p6 p6
250
12000
200
8000 150
100
4000
50
0 0
16000 1200
p18 p18
1000
12000
800
8000 600
400
4000
200
µg N-N 2 O kg -1 sed j-1
0 0
16000 5000
p13 p13
12000 4000
3000
8000
2000
4000 1000
0 0
16000 500
p10 p10
12000 400
300
8000
200
4000
100
0 0
16000 100
p29 p29
80
12000
60
8000
40
4000 20
0 0
M J J A S O N D J J2 F M A M J J A M J J A S O N D J J2 F M A M J J A
2004 2005 2004 2005
Figure III.9. DEA et DNT au cours des années 2004 et 2005 au sein de 5 piézomètres (p6, p18, p13,
p10, p29) de la zone alluviale de la Garonne à Monbéqui (82). Valeurs mensuelles moyennes pour la
DEA±SE (n=3). Les barres représentent l’écart type. Les graphes représentant la DNT utilisent parfois
des échelles différentes en raison de la grande variabilité temporelle de cette valeur. Les traits en
pointillés sont utilisés pour unir deux points lorsque une mesure mensuelle n’a pas été réalisée entre ces
points. Les flèches noires indiquent la crue du 21 janvier 2005.
99
(a) 1000
Débit journalier rivière m3 s-1

décharge recharge décharge
800
600
400
200
14
p6
(b) 12
p10
p13
p18
10 p29
g MSSC kg-1 séd
0
10
(c) p6
p18
p13
8 p10
p29
COD mg L-1
0
10
(d) p6
p18
8 p13
p10
p29
6
COD/NID
M J J A S O N D J J2 F M A M J J A
2004 2005
100
Figure III.10. (en page précédente). Variations temporelles du débit journalier de la

rivière (a), de la MSSC (n=3) (b), du COD (c) et du rapport COD/NID (d) par piézomètre.
Campagnes réalisées en 2004 – 2005 au sein de 5 piézomètres de la zone alluviale de la
Garonne à Monbéqui (82). La ligne en pointillés dans la figure (a) matérialise la séparation
entre les débits journaliers de hautes eaux (>200 m3 s-1) et basses eau (<200 m3 s-1).
L’effet saisonnier a été analysé en calculant les pourcentages de

dénitrification (DEA et DNT) qui correspondent à chaque saison. Les saisons
comparées deux à deux montrent que la DEA est plus importante au printemps et en
été puisqu’en moyenne dans les 5 piézomètres suivis, de 28 à 46 % de la
dénitrification a lieu au cours de ces deux saisons (Mann-Whitney, p < 0,05) (Figure
III.11). En revanche, la DNT ne subit pas d’effet saisonnier (Figure III.11). Le
pourcentage de DNT à chaque saison était variable en fonction de chaque
piézomètre.
100 100 Automne

Hiver
80 80
Printemps
% DNT
% DEA
60 Été
60
40 40
20 20
0 0
p6 p18 p13 p18 p29 p6 p18 p13 p10 p29
Figure III.11. Pourcentages de dénitrification (DEA et DNT) attribués à chaque saison

des années 2004 et 2005 par piézomètre. Campagnes réalisées au sein de 5 piézomètres
(p6, p18, p13, p10, p29) de la zone alluviale de la Garonne à Monbéqui (82).
101
3. Discussion
Après environ cent ans d’études dédiées à la dénitrification et malgré de

nombreux progrès technologiques, des lacunes persistent dans les connaissances
quantitatives portant sur le taux de dénitrification dans différents écosystèmes et les
facteurs qui le contrôlent (DAVIDSON et SEITZENGER 2006). Dans les aquifères
alluviaux, la dénitrification permet l’élimination de 1 à 40 g d’azote par mètre carré
et par an (BRÜSCH et NILSSON 1993 ; VAN CLEEMPUT et al. 2007), mais
l’hétérogénéité hydrologique et les conditions physico-chimiques de ces systèmes
font que cette activité dénitrifiante est elle aussi très variable, à la fois au niveau
spatial et temporel. De ce point de vue, notre travail fournit de nouvelles
informations quantitatives sur l’activité de dénitrification en relation avec une échelle
temporelle – saisonnière et mensuelle – et, au niveau spatial, avec une macro-échelle
(au niveau du paysage) et une micro-échelle (au niveau des compartiments eaux -
sédiments). Ceci constitue une étape importante pour la construction et la validation
de modèles numériques de la dénitrification.
L’étude réalisée montre que la DNT varie entre 0,12 et 1,39 g N m-2 a-1 dans
l’aquifère alluvial. Ces taux sont comparables à ceux obtenus sur ce site au cours de
travaux précédents (SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ; BAKER et VERVIER 2004) ainsi
qu’aux valeurs obtenues dans d’autres aquifères alluviaux aux caractéristiques
similaires (ADDY et al. 2002 ; KELLOGG et al. 2005). Dans la zone riveraine, les taux
de DNT dans les sols non saturés (entre 5,6 et 30,5 g N m-2 a-1) sont supérieurs à
ceux de la zone saturée (PINAY et al. 1993 ; CLEMENT et al. 2002) quand les
conditions sont favorables pour la dénitrification dans les sols i.e. forts % d’humidité.
La teneur en matière organique diminue avec la profondeur dans les sols. Dans
l’ensemble, les taux de DNT observés dans les aquifères alluviaux ne sont pas
négligeables puisque 15 à 100 % des nitrates transitant de l’aquifère vers la rivière
102
seraient éliminés par dénitrification au sein de ces aquifères (MCMAHON et BÖHLKE

1996 ; RUFFINONI et al. 2003).
Le blocage à l’acétylène, méthode utilisé dans cette étude pour la mesure de

DNT, sous estimerait de 68 à 83% la dénitrification en comparaison avec la méthode
isotopique « nitrogen isotope pairing method» selon (SVENSSON 1997). Le blocage à
l’acétylène, mesure la Dn (transformation des nitrates ayant diffusé de la colonne
d’eau vers le site de dénitrification) et pas la Dw (dénitrification de nitrates et nitrites
provenant de la nitrification) puisque l’acétylène inhibe simultanément la
nitrification. En revanche, la méthode isotopique permet de mesurer la Dn et la Dw
(NIELSEN 1992). D’autre part, la méthode de blocage à l’acétylène ne mesure que la
transformation incomplète des nitrates en N2O. Cependant, dans le sol non saturé de
Monbéqui une étude récente montrait qu’en moyenne 81% des nitrates étaient
transformés en N2 à travers la dénitrification dans les différentes zones de la plaine
alluviale (CADIEU 2006)
Une partie de ce travail a été consacrée à la comparaison des activités in situ

et potentielle mesurées au laboratoire à l’aide de la méthode de blocage à l’acétylène.
La DNT a été mesurée avec une méthode validée pour sa répétitivité et son
adaptabilité à notre système (SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ; BAKER et VERVIER
2004). Cette méthode consiste en une adaptation de la méthode de blocage à
l’acétylène à l’aide d’un système dit push-pull ou Packer pour des mesures dans les
aquifères (ADDY et al. 2002 ; SANCHEZ PEREZ et al. 2003a). La DEA mesure le
potentiel de dénitrification de communautés dénitrifiantes placées dans des
conditions optimales (pas de limitation en carbone ni en nitrates) (GROFFMAN et al.
1992). Des études précédentes ont montré que la DEA est 5 à 48 fois plus importante
que la DNT dans certaines zones riveraines (PINAY et al. 1993 ; CLEMENT et al.
2002). Notre étude en accord avec ces résultats montre une DEA de 4 à 31 fois plus
importante. Cela indique que l’expression de l’activité dénitrifiante est contrôlée in
situ à différents niveaux de régulation, physiologique et écologique.
103
Pour aborder le niveau écologique des régulations de l’activité dénitrifiante,

les patrons de variation de la DEA ont été déterminés à une macro-échelle au niveau
spatial et temporel, mais aussi à une micro-échelle, au niveau des compartiments
eau/sédiment.
A cette micro-échelle, nous avons mis en évidence l’importance de la fraction

sédimentaire au sein de laquelle nous avons pu obtenir des vitesses de
dénitrifications représentatives de l’activité dénitrifiante (DNT) de l’aquifère alluvial.
Dans ces compartiments, la DEA dépend de la MSSC, ce qui suggère que la MSSC
serait à la fois un bon indicateur de la biomasse bactérienne et des ressources
organiques dont elle disposerait. On sait que les densités bactériennes, dont dépend
en partie la DEA (PHILIPPOT et HALLIN 2005), sont la cause des différences
observées au niveau de l’activité potentielle.
A macro échelle, la DNT varie en fonction de la température, du carbone, des

nitrates, l’oxygène et du pH (BRÜSCH et NILSSON 1993 ; PFENNING et MCMAHON
1997 ; RUST et al. 2000 ; HILL et al. 2000). Cependant, dans l’aquifère alluvial où se
mélangent les eaux de nappe et de rivière, ce sont principalement les distributions de
l’oxygène, des nitrates et du carbone organique dissous qui varient spatialement
(SANCHEZ PEREZ et al. 2003b). La variabilité spatiale des taux de DNT observée
s’explique par la présence de matière organique sous forme attachée aux sédiments
(MSSC) et dissoute dans l’eau (COD). La quantité et la qualité du COD varient en
fonction des infiltrations dans l’aquifère alluvial (BAKER et al. 2000). Le flux de
carbone organique dissous est plus important dans les zones influencées par l’eau de
la rivière (BRUGGER et al. 2001) où 25 % du carbone est biodisponible (MANN et
WETZEL 1995 ; CLARET et al. 2001). La dénitrification in situ – en accord avec la
DEA – révèle une zone de dénitrification nettement plus importante au niveau de la
zone intermédiaire (piézomètre p13 principalement) où les proportions respectives
des eaux de nappe et de rivière sont presque équilibrées (60% d’eau de rivière et 40%
d’eau de nappe (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b) et les teneurs en MSSC et COD sont
104
importantes (moyenne 7,0 g kg-1 séd et 3,2 g kg-1 séd). De plus, ces zones présentent
des pourcentages de matière organique très importants dans la zone non saturée
(CADIEU 2006). Aux périodes de hautes eaux, la nappe pourrait remonter jusqu'à la
surface du sol récupérant la matière organique du sol et enrichissant l’aquifère en
matière organique. Même si les nitrates n’expliquent pas la variabilité de la
dénitrification, les zones avec des teneurs proches en MSSC et COD fortement
influencées par la rivière (p6 et p18) ne sont pas caractérisées par les mêmes taux de
DNT. Les taux supérieur dans le p13 peuvent être expliqués par les différences de
concentration en nitrates, lesquelles sont plus élevées dans ce piézomètre (8,7
mg L-1).
Durant l’année, la DNT était plus élevée en conditions de hautes eaux tandis
que la DEA ne montrait pas de différence significative. Selon (BAKER et VERVIER
2004), la DNT est deux fois plus importante en période de crue. Dans notre travail,
les taux de DNT sont multipliés par 1,7 entre les périodes de basses eaux (4,0 µg N
L-1 min-1) et celles de hautes eaux (6,7 µg N L-1 min-1) dans les zones régulièrement
soumises à l’influence de la rivière (p6, p10, p13 et p18). En hautes eaux, le flux
hydraulique est multiplié par deux dans le piézomètre le plus influencé par la rivière
(WENG et al. 2003), ceci suggère qu’en période de hautes eaux le transport
longitudinal de COD, plus important, favoriserait la DNT. L’hydrologie est un
facteur important pour la DNT sans tenir compte de la saison de l’année.
4. Conclusions et perspectives
Ce travail souligne l’importance de considérer le rôle des aquifères alluviaux

sur l’élimination des nitrates à travers la dénitrification. Les taux de DNT ainsi que
de DEA mesurés confirment l’existence d’une capacité à éliminer les nitrates
provenant des terres agricoles avec des capacités très importantes dans les zones
favorables. Cependant, dans des études futures les processus alternatifs et peu étudiés
105
comme la RDNA (réduction dissimilative du nitrate en ammonium) ou l’Anammox

(oxydation anaérobique de l’ammoniaque) mériteront d’être inclus pour une
meilleure caractérisation du rôle de ces zones sur le cycle de l’azote. Des pré-requis
environnementaux identiques (i.e. anoxie, disponibilité des nitrates et des substrats
organiques) paraissent gouverner la mise en place de la RDNA et de la
dénitrification. Néanmoins, la dénitrification est favorisée dans des conditions
limitantes en carbone (KELSO et al. 1997) alors que (TIEDJE 1988) et (BONIN 1996)
suggèrent que la RDNA serait plus importante dans les milieux riches en carbone
avec une faible concentration de nitrates. L’anammox est un processus récemment
identifié et seulement deux études ont été réalisées sur les communautés et activités
en milieu d’eau douce (JETTEN et al. 2003 ; SCHUBERT et al. 2006) mais dans les
sédiment lacustres, ≈ 13% du N2 produit est attribué à ce processus.
Une des contraintes du système étudié réside dans sa complexité

hydrologique. La difficulté à obtenir des piézomètres qui puissent être considérés
comme des réplicats au sein d’un réseau de piézomètres pose donc des limites à une
approche in situ de la dénitrification. Pour cette étude, les piézomètres ont été choisis
sur la base de travaux précédemment effectués dans la zone (SANCHEZ PEREZ et al.
2003a ; BAKER et VERVIER 2004) pour avoir une représentation de la variabilité
hydrologique et fonctionnelle de la zone.
En dépit de ces contraintes, les mesures de DNT et DEA ont permis de décrire les
patrons spatiaux et temporels de dénitrification, confirmant l’existence de hot spots
(sensu MCCLAIN et al. (2003)) dans les zones régulièrement soumises à un mélange
équitable des eaux de rivière et de nappe. Dans ces zones, les variations de
conditions hydrologiques de la rivière contrôlent les apports en COD qui affectent la
DNT hot moments (sensu MCCLAIN et al. (2003)). Le COD peut être considéré
comme un facteur de « contrôle proximal » (sensu WALLENSTEIN et al. (2006)), i.e.
qui affecte la dénitrification instantanément). La MSSC qui quantifie la biomasse
bactérienne présente dans le sédiment est le seul facteur déterminant de la DEA mais
106
aussi un facteur qui contrôle la DNT avec le COD. L’influence de la MSSC sur la
DEA suggère que les différences de DEA peuvent être à la base des différences
observées dans les compartiments eau et sédiment. On sait que la biomasse
bactérienne dans les aquifères alluviaux vit essentiellement attachée au sédiment
(HIRSCH et RADES-ROHKOHL 1990). La présence d’une biomasse plus importante
favoriserait une activité plus élevée, mais ce facteur n’est pas seul impliqué. La
composition des communautés est également un point clef à prendre en compte
puisque il existerait une relation entre diversité et activité de communautés
(CAVIGELLI et ROBERTSON 2000 ; HOLTAN-HARTWIG et al. 2000).
La variabilité spatiale au niveau des paysages et des compartiments observée dans

cette première partie a été mise en relation avec le fonctionnement de ces zones et les
conditions environnementales particulières qui règnent dans chacune. Il reste que les
différences constatées au niveau de la DEA ne sont que partiellement expliquées par
des différences environnementales. Ces résultats incitent à s’intéresser à la
composition des communautés bactériennes impliquées dans la fonction de
dénitrification en sélectionnant des marqueurs de diversité adaptés.
La composition des assemblages libres dans l’eau souterraine et celle des

assemblages attachés au sédiment diffèrent (BESEMER et al. 2005), des activités
enzymatiques extracellulaires s’avèrent différentes dans ces deux compartiments
(LEHMAN et O'CONNELL 2002). Toutefois, à notre connaissance, aucune étude n’a
mis en évidence le rôle fonctionnel des communautés attachées et libres dans les
aquifères alluviaux.
107
Chapitre IV. Rôle fonctionnel des
communautés bactériennes
attachées et libres dans l’aquifère
alluvial
Cette partie concerne l’étude du rôle fonctionnel des communautés attachées au

sédiment ou libres dans l’eau souterraine de l’aquifère alluvial, à l’intérieur de hot
spots de dénitrification (IHD) et hors de ces hots spots (OHD). Une partie des
résultats présentés fait l’objet d’une publication sous presse dans la revue
Hydrobiologia sous le titre « Differentiated free-living and sediment-attached
bacterial community structure inside and outside denitrification hotspots in river-
groundwater interface » (HYDR 2412R1).
108
Ch. IV : Communautés bactériennes libres et attachées
1. Introduction
Dans les écosystèmes aquatiques d’eau douce, les bactéries existent

principalement sous trois formes : libres dans l’eau, attachées les unes aux autres
dans l’eau – formant des agrégats désignés sous le terme de « flocs » (HALL-
STOODLEY et al. 2004) – ou encore attachées à une surface organique ou inorganique
(SIGEE 2005), constituant alors un biofilm à la surface du substrat qui les accueille.
Parmi ces trois modes de vie, les assemblages de type biofilm sont dominants dans
les écosystèmes aquatiques (HALL-STOODLEY et al. 2004) et particulièrement dans
les aquifères (ALFREIDER et al. 1997 ; BEKINS et al. 1999 ; LEHMAN et al. 2001). Les
communautés sessiles sont impliquées dans des échanges cellulaires constants avec
la fraction libre (BATTIN et al. 2007). Dans le cas des aquifères, les bactéries ont
tendance à être attachées aux surfaces où s’accumule de la matière organique
biodisponible (GHIORSE et WILSON 1988 ; TRULLEYOVA et RULIK 2004). Cependant,
même si les bactéries attachées sont dominantes dans les aquifères, certains travaux
ont mis en évidence l’importance d’étudier l’ensemble des communautés présentes –
attachées et libres – pour accéder à une caractérisation satisfaisante des communautés
bactériennes des aquifères (ALFREIDER et al. 1997 ; LEHMAN et al. 2001 ; GRIEBLER
et al. 2002). Des différences entre la composition des communautés bactériennes
libres et attachées au sédiment ont été constatées dans un aquifère alluvial par typage
moléculaire (BESEMER et al. 2005), ainsi que des différences d’activité enzymatique
extracellulaire avec des activités spécifiques plus importantes dans les communautés
attachées (LEHMAN et O'CONNELL 2002). Des différences ont été mises en évidence
au niveau de la production bactérienne entre les communautés libres et attachées
dans divers milieux aquatiques d’eau douce (FRIEDRICH et al. 1999 ; LEHMAN et
O'CONNELL 2002) et marins (UNANUE et al. 1992 ; RIEMANN et al. 2000). Mais
savoir si ces différences fonctionnelles sont dues aux changements d’expression de
l’activité où à des changements de communautés qui affecteraient l’activité reste une
question ouverte.
109
Un processus écologique comme la dénitrification peut être affecté par une

réduction du nombre d’espèces ou du nombre de cellules qui y contribuent
(changement des communautés) (BELL et al. 2005). Mais une adaptation
physiologique des cellules présentes, sans modification des communautés, peut être
liée à leur plasticité métabolique ; la réponse fonctionnelle d’une bactérie dépendra
alors en grande partie de l’agrégat dont elle fait partie (HANSEN et al. 2007). A
travers la manipulation directe des assemblages bactériens, plusieurs études ont
montré une relation entre la composition d’une communauté et des fonctions données
d’un écosystème (KINZIG et al. 2001 ; BELL et al. 2005 ; JIANG et KRUMINS 2006).
Dans les tentatives de modélisation de la dénitrification, les communautés
bactériennes sont souvent considérées comme identiques dans les différentes
localisations (que ce soit à l’échelle du compartiment, de écosystème ou de la région)
(BOYER et al. 2006). Trop peu d’études abordent les communautés dénitrifiantes
d’un point de vue phylogénétique et fonctionnel (NOGALES et al. 2002 ; RICH et
MYROLD 2004 ; ENWALL et al. 2005) pour obtenir suffisamment d’informations sur
l’importance de prendre en compte la relation structure/fonction
(communautés/processus) et alimenter des modèles. Nombre d’études ont décrit les
conditions environnementales qui contrôlent la dénitrification mais une des
premières études à mettre en évidence l’importance de la structure des communautés
dénitrifiantes sur l’activité de dénitrification est basée sur la mesure des principales
étapes de la dénitrification de deux sols ayant subit des traitements différents (terres
labourées versus terres jamais labourées) dans des conditions environnementales
identiques (CAVIGELLI et ROBERTSON 2000).
Précédemment (Chapitre III), nous avons constaté des différences marquées

de dénitrification à une macro-échelle spatiale (zones de fortes et faibles activités) et
une micro-échelle (sédiments versus eau) dans la zone alluviale. Nous avons souhaité
comparer la composition des assemblages bactériens présents dans l’eau souterraine
de l’aquifère alluvial (fraction planctonique ou libre) à celle des communautés
bactériennes attachées aux sédiments alluviaux. L’objectif était de rechercher le rôle
110
respectif de chacun de ces assemblages en relation avec leur composition.
2. Analyse des différences entre la composition des

communautés attachées et libres à l’intérieur (IHD) et à
l’extérieur (OHD) de hot spots de dénitrification au sein d’un
aquifère alluvial
Traduction du résumé de “Differentiated free-living and sediment-attached bacterial

community structure inside and outside denitrification hotspots in river-groundwater
interface” sous presse pour le journal Hydrobiologia, Amaia IRIBAR, José Miguel
Sánchez-Pérez, Emilie Lyautey, Frédéric GARABETIAN HYDR2412R2.
Pour tester l’hypothèse que la dénitrification diffère dans les compartiments

sédiment et eau à cause de différences dans les compositions de communautés
bactériennes, cinq piézomètres ont été choisis, deux dans des zones de forte activité
de dénitrification (IHD) et trois dans des zones de faible activité (OHD). A l’aide de
descripteurs structuraux des communautés (typage moléculaire couplé ou non a une
étape d’enrichissement par culture) et de descripteurs fonctionnels (DEA), nous
avons cherché à décrire la relation entre diversité et fonctionnement des assemblages
dénitrifiant au sein de l’aquifère alluvial.
Les résultats confirment qu’une forte activité dénitrifiante potentielle (DEA)

est mesurée dans le compartiment des sédiments fins composés de sables à 98-99%
et d’argiles à 1-2% pour les piézomètres situés dans la zone IHD. Pour l’ensemble
des piézomètres échantillonnés, les valeurs de DEA varient entre 2 et 1389 mg N-
N2O m-3 j-1 pour cette fraction sédimentaire. Par contre, aucune activité enzymatique
dénitrifiante potentielle n’est détectée dans le compartiment eau (seuil de détection
0,32 mg N-N2O m-3 j-1).
La biomasse bactérienne attachée au sédiment est supérieure à la biomasse

bactérienne libre dans les 5 piézomètres échantillonnés et dans 3 cas sur 5 cette
111
différence est largement supérieure à l’intervalle de confiance de la mesure. Les

patrons de DGGE montrent qu’il existe des différences significatives entre la
composition des communautés bactériennes libres et attachées. L’analyse par PCR-
DGGE de la fraction cultivable des communautés dénitrifiantes obtenue à partir de
cultures d’enrichissement des sédiments ou de l’eau confirme ce résultat. Les
compositions des communautés libres et attachées étaient significativement
différentes (moins de 20% de similarité ; Monte-Carlo, p < 0,001), en accord avec les
résultats obtenus pour les communautés totales. Néanmoins, rien ne semble
différencier les communautés dénitrifiantes cultivables des sédiments provenant de
zones IHD de ceux provenant de zones OHD, en dépit d’activités dénitrifiantes
différentes.
A partir du gel de DGGE réalisé sur la fraction enrichie des bactéries

dénitrifiantes, les bandes les plus intenses ont été séquencées (14 sur 58). Les
séquences partielles de gène 16S ADNr obtenues ont pu être affiliées aux β et γ
Proteobacteries. La majorité des bandes séquencées (11 sur 14), sont présentes dans
les deux compartiments, eau et sédiments. Ces séquences présentent de faibles
distances génétiques avec des taxons comme Azoarcus sp., Pseudomonas spp.,
Dechloromonas spp. et Hydrogenophaga sp. dont la présence a déjà été détectée
dans des aquifères (AN et al. 2004 ; CAVALCA et al. 2004 ; CHO et al. 2003 ; RÖLING
et al. 2000).
Au sein du biofilm hétérotrophe qui entoure les particules de sédiment, les

conditions environnementales favorisent l’apparition de nouveaux habitats (JACKSON
2003). Par exemple, des micro-zones anoxiques peuvent être creés au sein du
biofilm, qui favoriseraient des processus requerrant ces conditions, comme la
dénitrification (HENDRICKS 1993 ; CRAFT et al. 2002). La formation de ce type de
micro-gradient peut expliquer les différences de réponse entre les communautés
libres et les communautés sessiles : d’une part parce qu’elle favorise l’expression de
la DEA et d’autre part via la sélection de bactéries dénitrifiantes.
112
3. Publication
Differentiated free-living and sediment-attached bacterial
community structure inside and outside denitrification hotspots in
the river-groundwater interface
Amaia Iribar*, José Miguel Sánchez-Pérez, Emilie Lyautey, Frédéric Garabétian
EcoLab - Laboratoire d’écologie fonctionnelle, UMR 5245 CNRS-UPS-INPT,
Université Paul Sabatier, Bâtiment 4R3 b2, 118 Route de Narbonne, 31062 Toulouse
Cedex 9 (France)
*Corresponding author:
E-mail: iribar@cict.fr
Tel.: +33 (0)5 61 55 73 48
Fax: +33 (0)5 61 55 60 96
Keywords: River interface, Garonne River, alluvial groundwater, biofilms,
colonization, denitrifiers, hyporheic zone, connected aquifer.
The original publication is available at www.springer.com
113
ABSTRACT
This study assessed the functional significance of attached and free-living bacterial
communities involved in the process of denitrification in a shallow aquifer of a
riparian zone (Garonne River, SW France). Denitrification Enzyme Activity (DEA),
Bacterial Density (BD) and Bacterial Community Composition (BCC) were
measured in two aquifer compartments: the groundwater and the sandy fraction of
the sediment deposit. Samples were collected in wells located inside (IHD) and
outside (OHD) identified hotspots of denitrification. Despite high BD values (up to
1.14 1012 cells m-3), DEA was not detected in the water compartment (< 0.32 mg N-
N2O m-3 d-1). The sandy fraction showed detectable DEA (up to 1389 mg N-N2O
m-3 d-1) and, consistent with BD pattern, higher DEA values were measured in IHD
zones than in OHD zones. The BCC assessed by 16S rDNA PCR-DGGE
(Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) partly
supported this result: attached and free-living communities were significantly
different (< 30% similarity) but patterns of BCC did not cluster according to IHD
and OHD zones. Targeting the denitrifying communities by means of a culture
enrichment step prior to 16S rDNA PCR-DGGE showed that the free-living and
sediment attached communities differed. Most sequences obtained from DGGE
profiles of denitrifying communities were affiliated to Proteobacteria and showed
low genetic distance with taxa that have already been detected in aquifers (e.g.
Azoarcus sp., Acidovorax sp. and Pseudomonas spp.). This study confirms that in the
aquifer the sediment-attached fraction exhibits different functions (DEA) from free-
114
living communities and suggests that this functional difference is related to the
communities’ structure.
115
INTRODUCTION
Nitrogen cycling has received considerable attention in riparian zones (Burt et al.,
1999; Hill et al., 2000; Clément et al., 2002; Duff et al., 2007). The river-
groundwater interface has been shown to contribute to nitrogen retention and/or
transformation in the land-river continuum (Sabater et al., 2003). This interface
participates in the purification of water thanks to its ability to eliminate nitrate during
their infiltration through the vegetation-soil system to the groundwater, and through
diffusion from the groundwater to the river (Pinay et al., 1998; Takatert et al., 1999;
Maître et al., 2002). Several studies have focused on the processes influencing
nutrient retention or elimination from the alluvial groundwater in riparian systems
(Peterjohn & Correll, 1984; Pinay et al., 1998; Sánchez-Pérez & Tremolieres, 2003;
Hill et al., 2000) and denitrification appears to be the most important process for
nitrate elimination (Haycock & Burt, 1993; McMahon & Böhlke, 1996; Hinkle et al.,
2001; Brettar et al., 2002) ranging from 1 to 40 g N m-2 yr-1 (Brüsch & Nilsson,
1993; Van Cleemput et al., 2007) unless other microbial processes such as
dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) or anaerobic ammonium
oxidation (Anammox) are taken into account (Burgin & Hamilton, 2007).
The process of bacterial denitrification is nearly exclusively a facultative trait in
bacteria. By means of denitrification, nitrate (NO3-) and nitrite (NO2-), which are
highly oxidised forms of nitrogen, are reduced into gaseous forms such as nitric
116
oxide (NO) and nitrous oxide (N2O), which may themselves be further reduced into
dinitrogen (N2). This process generally requires an anoxic environment and a source
of both organic matter and nitrate (Mosier et al., 2002). In previous work in the
Garonne River floodplain, Sánchez-Pérez et al. (2003b) demonstrated that the
organic matter fuelling denitrification is provided by the river. Spatial variations in
organic carbon and nitrate contents in groundwater at the studied site are correlated
with exchanges between the groundwater and the river. These results suggest that
nitrate derived from alluvial groundwater influenced by agricultural practices is
denitrified by bacteria in the presence of organic carbon derived from river water.
In aquifers, the major proportion of the bacterial biomass in groundwater is attached
to solid material and only a small fraction is free-living (Harvey et al., 1984; Bekins
et al., 1999; Lehman et al., 2001). As assessed by fingerprinting techniques, the
bacterial community composition (BCC) differs between sediment-attached and free-
living communities (Besemer et al., 2005) consistent with differences in extracellular
enzyme activities (Lehman & O'Connell, 2002). However, no study has clarified
whether differences between free living and sediment attached communities applied
to denitrification and denitrifying communities.
117
Our objective was to study the denitrification capability of sediment-attached and
free-living bacteria in alluvial groundwater (Garonne River, France). Our hypothesis
was that denitrification would differ between sediment and groundwater habitat, and
would be explained by differences in the bacterial community composition (BCC) of
sediment-attached and free-living assemblages. Five wells were selected, two inside
identified denitrification hotspots (IHD) and three outside hotspots (OHD), and in
each well, denitrification enzyme activity (DEA), total bacterial density (BD) and
BCC of both the total and cultivable denitrifying fraction of sediment attached and
free-living assemblages were assessed with the aim to explore their relationships. By
combining structural and functional descriptors of contrasted bacterial communities
(free-living vs sediment attached), exhibiting contrasted denitrification activity (IHD
vs OHD), this experiment was designed to approach the question of the link between
biodiversity and functioning for the denitrifying assemblages in the river-
groundwater interface.
MATERIALS AND METHODS
Study site
The study site is a riparian zone located within a meander of the Garonne River
(43°53’N, 1°43’E), 50 km northern Toulouse city (France) (Fig. 1). The Garonne
River is a 8th order river, 625 km long, with an annual mean discharge of 600 m3 s-1.
In the study site, annual mean discharge is 200 m3 s-1; low-water period discharge is
118
50 m3 s-1, flood discharge up to 4000 m3 s-1 and bank-full discharge 600 m3 s-1. The
average water depths are 1 m during low flow, 3.5 m for the bank-full discharge and
up to 8 m during floods. Throughout the studied zone, which represents about 0.49
km2, the groundwater flow is governed by the slope of the valley (1:1000), the water
table levels in floodplain terraces and the water level of the Garonne River. The
groundwater flows from south-east to north-west, with an average gradient of 1.5 10-
3
m m-1. The water table is at 2 to 6 meters depth in low-water periods, but can rise
rapidly to the soil surface during floods. In the floodplain, between 4 and 7 meters
thick layer of Quaternary sand and gravel overlie impermeable molasses deposits.
The riparian zone is covered by a stand of Populus alba and riparian vegetation
(Salix alba, Fraxinus excelsior). Beyond the riparian zone lies agricultural land
cropped with corn, sunflower and wheat. Nitrogen leaching of the fertilised soil leads
to concentrations exceeding 15 mg N-NO3- L-1 in the groundwater. The floodplain is
equipped with wells, constructed of 6.3 cm diameter polyvinyl chloride pipes, which
intersect the alluvium down to the molasse (Pinay et al., 1998; Lambs, 2000;
Sánchez-Pérez et al., 2003a, 2003b; Baker & Vervier, 2004) (Fig. 1).
Sampling and environmental variables
Five wells were selected (Fig. 1): well p17 is drained by freshly infiltrated river
waters, wells p9, p10 and p11 are drained by a variable mix of river waters and
groundwaters and well p26 is considered to be representative of the groundwaters of
119
the unconfined adjacent aquifer (Weng et al., 2003). The water mixing in this system
follows a two end-member mixing model (Lambs, 2000; Sánchez-Pérez & et al.,
2003b; Baker & Vervier, 2004). Using this model together with in situ denitrification
measurements, previous studies demonstrated that wells p9 and p17 are located
inside an hotspot of denitrification (IHD) – 60% of nitrate depletion and in situ
denitrification rates ranging from 0.1 to 2.7 g N-N2O m3 d-1 – while the wells p10,
p11 and p26 are located outside hotspot of denitrification (OHD) – no nitrate
depletion and in situ denitrification rates ranging from 0.05 to 1.2 g N-N2O m3 d-1
(Sánchez Pérez et al., 2003a and b). In the present study, the assignment of each well
to the IHD or OHD group was confirmed by calculating nitrate variation using the
two end-member mixing model and by measuring DEA on the sampling dates (21
and 22 October 2003).
Mixing of surface and subsurface water masses was estimated for each well by two-
end-member mixing model (EMMA) using chloride (Cl-) concentrations observed in
river water and the agricultural well (p26). EMMA solves the equations: [Cl-well] =
[Cl- SW] fSW + [Cl-GW] fGW ; 1 = fSW + fGW where fSW is the surface water fraction and
fGW is the groundwater fraction. This model assumes that there is no precipitation
input and that Cl- is chemically and biologically conservative. Measured river
chloride concentrations (Cl- SW) were 10.5 mg L-1 and 63.7 mg L-1 in agricultural
well (Cl-GW). Predicted N-NO3- concentrations were calculated based on a similar
EMMA, substituting observed surface water and agricultural well N-NO3-
concentrations (1.1 and 9.5 mg L-1 respectively) for Cl-. This allowed the estimation
120
of N-NO3-depletion (negative values) via uptake or denitrification or input (positive
values) compared to dilution by low N-NO3- content surface water.
Water physical and chemical conditions were characterized every 3 months from
2000 to 2004 at 16 sampling dates representing diversified hydrological conditions
(min = 50 m3 s-1 max = 764 m3 s-1 mean = 227 m3 s-1). Groundwater and sediment
samples for BD, BCC and DEA analysis were recovered on 21 and 22 October 2003,
between 3.5 and 5.0 m depth, during a river low-water period (100 m3 s-1). This
hydrological condition occurred with a frequency of 40% in the last 35 years
(Direction Régionale de l’Environnement www.hydro.eaufrance.fr/accueil.html) and
of 45% among the sampled dates from 2000 to 2004. Water samples were collected
from each well by pumping with an electric pump (8 L min-1), while sandy sediment
(< 2 mm) samples were recovered by pumping with a motor pump designed for
sediment (30-120 L min-1). Sediment layer composition is sandy down to 3 m depth
(Ruffinoni 1994).
Dissolved oxygen was measured using a WTW Oxical-SL Cell Ox 325, pH and
temperature using a WTW 197i and electrical conductivity using a WTW Tetacon
325. Redox potential was measured using platinum electrodes against Ag/AgCl
reference electrodes (Schott Gerate PT737 A). Measures were corrected adding 217
121
mV for the field (for an average temperature of 10°C) as indicated by the
manufacturer (Mettler-Toledo GmbH, Steinbach, Germany).
Water and sediment analysis
Water samples for determination of dissolved inorganic nitrogen (nitrate, nitrite, and
ammonium) and chloride concentrations were filtered on the field using 0.45 µm-
pore-size cellulose acetate membranes. Dissolved inorganic nitrogen was measured
in a segmented flow analyzer (ALPKEM model Flow solution IV) and chloride by
ionic chromatography (DIONEX model DX500) according to standardized methods
for water analysis (APHA, 1992). For dissolved organic carbon (DOC) analysis,
water was filtered in the field using pre-combusted (450°C for 4 h) GF/F filters, and
analyzed using a platinum catalyzer at 650°C (Shimadzu, Model TOC 5000).
Sediment samples (20 g) recovered the 21 and 22 October 2003 were successively
exposed to three treatments with 50% H2O2 and one with 110% H2O2 to remove
organic matter (Jackson, 1985). Flocculants were eliminated by adding 40 mL of
HCl at 10% and dispersed by adding 40 mL of a 0.55% aqueous solution of sodium
hexametaphosphate. Samples were stirred magnetically for 6 h and granulation was
determined using a Coulter TM LS230 laser granulometer equipped with a variable-
speed fluid module, which measures the size of waterborne particles by diffraction at
the laser light at 750 nm wavelength into 126 photodiode detectors. The instrument
measures particles in the size range 0.375 – 2000 µm.
122
Organic matter was determined as loss on ignition by combustion of dried samples
(pre-dried at 105°C to constant weight) at 450 °C for 8 h. The loss on ignition
organic matter values were then converted to organic carbon using a conversion
factor of 0.5 as proposed by Brinson et al. (1984).
Denitrification enzyme activity (DEA)
DEA in water and sediment collected on the 21 and 22 October 2003 was measured
by the acetylene block technique (Yoshinari & Knowles, 1976). Triplicate of
groundwater (400 mL) and/or sediment (mix of 300 g sediment plus 100 mL
groundwater) samples were incubated in 500 mL glass bottles adding Na-acetate (50
mg C L-1) and NaNO3 (100 mg N L-1). Oxygen in the liquid and gaseous phase was
removed by sparging with helium (Helium U 99.99% purity, containing 20 ppmv of
N2, Air Liquide, France). Acetone-free acetylene was added (AAS27 quality, Air
Liquide, France) at 10% v/v. Incubations were performed in the dark at 14°C for 20
h. The gaseous phase was sampled (3 mL) at initial and final incubation for N2O
analysis using a GIRDEL gas chromatograph equipped with an electron capture
detector (63Ni), Porapak Q columns (2 m long packed columns) using argon-methane
(90 - 10%, Air Liquide, France) as carrier gas.
123
Bacterial density and community composition analyses
For total bacteria counts, 10 mL water and 1.5 g sediment subsamples (wet weight)
from larger collected samples were used. An ultrasonic cleaner (ELMA model
Transonic T460-35kHz, Germany) was used to recover bacteria from the sediment
without lysing them. Cell staining using DAPI (4', 6-diamino-2-phenylindole-
dihydrochloride) was performed as described previously (Garabétian et al., 1999).
Counting was made with a Leitz Dialux 22 microscope (x 1250 magnification) fitted
for epifluorescence: HBO 100W mercury light source, with an excitation filter for
270-380 nm and barrier filter of 410-580 nm.
Comparable units were obtained for BD and DEA by transforming cell g-1 sediment
and cell mL-1 water into cell m-3 using porosity (12%) and bulk sediment density (1.4
g cm-3).
For total BCC analysis, DNA was extracted from a filter (3 L groundwater ; 0.22 µm
polycarbonate membranes, Millipore, Ireland) and/or 10 g sediment samples. DNA
extraction was performed using the phenol-chloroform method described previously
(Mouné et al. 2003). Amounts of extracted DNA were quantified by fluorimetry
(Fluroskan Ascent II; Labsystems, Helsinki, Finland) using SYBR Green (Sigma).
Extracted DNA was amplified by PCR using the universal Bacteria primers 341F-
GC and 907R (Muyzer et al., 1997) and 20 ng (water and sediment) or 50 ng
(enrichment samples from water and sediment) of template DNA using a protocol
124
described in Lyautey et al. (2005). DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
was carried out using D-Code Universal Mutation Detection System (BioRad). Five
hundred ng (natural samples from water and sediment) and 700 ng (enrichment
samples from water and sediment) of amplified DNA were set down in an acrilamide
gel containing a 35 to 70% urea and formamide gradient (100% corresponding to 7M
of urea and 40% of deionised formamide). The electrophoresis was run for 18 h at
100V at 60°C. The gel was stained for 30 min with SYBR Green (Sigma) and gel
image was captured using a CCD camera and Biocapt software (Vilber Lourmat) and
analyzed using Bio-1D++ software (Vilber Lourmat).
For approaching the BCC of the denitrifying bacteria, an enrichment culture step was
used to target this group by increasing their relative abundance in the groundwater
and sediment samples using a cascade of dilution and culture (Soriano & Walker,
1968). As proposed by Tiedje (1994), a 40 mL enrichment solution (0.22 µm filtered
well water containing 50 mg C L-1 Na-acetate, and 100 mg N L-1 NaNO3) was
inoculated with bacteria from a 20 mL portion of the supernatant of the DEA assay
extended for another 7 days. The culture was deoxygenated by sparging with helium
and lasted 7 days at 14°C in the dark. This last step was repeated once. Then 20 mL
of culture were harvested by centrifugation (14,000 g, 20 min, 4°C). The BCC of
these enrichment cultures representing the cultivable fraction of the denitrifying
bacteria from the groundwater or sediment samples was then assessed by DGGE as
125
described above, except for DNA extraction, which was performed using UltraClean
Soil DNA kit (Bio101, Vista CA, USA) as described by manufacturer. Predominant
DGGE bands were sequenced as described elsewhere (Lyautey et al., 2005).
Sequence analysis and phylogenetic tree was constructed with ARB software
(www.arb-home.de) (Ludwig et al., 2004). A total of 14 partial 16S rRNA gene
sequences were deposited in the GenBank sequence database under accession
numbers AY816197 to AY816210.
Data analysis
DGGE profiles were compared using presence and absence of different bands using
Jaccard coefficients. A matrix from the Jaccard similarity index J = [c/(a+b-c)] was
calculated, where a is the number of bands in sample A, b in sample B and C the
number of bands shared by sample A and B, and dendrogram was constructed using
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Average means).
DEA and bacterial richness were compared by Mann-Whitney tests using the SPSS
software 11.0, statistical significance level at p < 0.05. Statistical tests based on
cluster were realized using Monte-Carlo test (Kropf et al., 2004), statistical
significance level at p < 0.001.
126
RESULTS
Environmental conditions
Physical and chemical characteristics of groundwater for the wells selected in the
present study are summarized in Table 1. The different wells from IHD and OHD
zones showed no marked differences considering physical and chemical
characteristics except the p17 which presented low dissolved oxygen (1.2 mg L-1)
and nitrate (0.9 mg L-1) concentrations. Lower conductivity and nitrate concentration
and higher dissolved oxygen and DOC concentrations were recorded in river
compared to groundwater. Sediment collected in these wells had a sandy texture
(98 - 99% sand and 1 - 2% clay) and exhibited comparable organic carbon content
between 1.5 and 2 g C kg-1 of sediment.
In the present experiment, we ensured that hotspots of denitrification activity were
sampled by calculating the percentage of the nitrate variation rates based on water
mixing on the 21 and 22 October 2003 (Table 2). The results confirmed that in two
wells (p9 and p17) out of five, marked nitrate depletion indicate intense
denitrification activity.
Bacterial density (BD) and denitrification enzyme activity (DEA)
Bacterial densities were greater in the sediment compartment than in groundwater in
3 cases out of 5 (Fig. 2). Furthermore the DEA responses of the free-living and
127
attached communities were markedly different between the two compartments
(groundwater and sediment) (Fig. 3). No DEA was detected (detection threshold =
0.32 mg N-N2O m-3 d-1) in the groundwater, while DEA ranged from 2 to 1389 mg
N-N2O m-3 d-1 in the sediment (Fig.3). Note that during incubation for DEA
measurements, total bacterial numbers (= sample volume or mass x BD), ranged
from 0.4 x 109 to 3.7 x 109 cells and were similar for groundwater and sediment
assays. The DEA values recorded were significantly higher in IHD wells (p9 and
p17) than in OHD wells (p10, p11 and p26) (Mann-Whitney, p < 0.05) (Fig. 3).
Free-living and attached bacterial community composition
The BCC of the total communities of the two compartments were compared based on
DGGE profiles. DGGE profiles (BCC) were significantly differentiated between
sediment-attached and free-living communities (Monte Carlo, p < 0.001) (Fig. 4a).
Regarding the IHD / OHD groups of samples, no clear clustering pattern was
observed for either free-living or sediment attached samples sharing less than 30% of
bands.
As assessed by culture enrichment coupled to 16S rRNA genes DGGE, the BCC of
the cultivable denitrifying fraction of the communities was found to be significantly
different (Monte Carlo, p < 0.001) between free-living and attached communities
128
(Fig. 4b). Some bands of cultivable denitrifiers were shared by sediment and
groundwater communities (similarities 19%). Within the sediment cluster, average
similarities were lower than 35% and did not reveal any grouping pattern between
IHD or OHD samples. The most intense bands (14 out of 58) were excised and
sequenced. Sequenced bands are operational taxonomic units (OTU). All 16S rDNA
gene partial sequences proved to be affiliated with members of Proteobacteria (β and
γ subclasses). Out of the 14 sequenced bands, 11 were present in both groundwater
and sediment compartments and were clustered with bacteria like e.g. Azoarcus sp.
(OTU 9 AY816205), Pseudomonas spp. (OTU 6 AY816202 and OTU 13
AY816207), Dechloromonas spp. (OTU 8 AY816204 and 5 AY816201) and
Hydrogenophaga sp. (OTU 3 AY816199) (Fig. 5).
DISCUSSION
In this study we intended to combine structural and functional descriptors of free-
living and sediment attached bacterial communities. This would permit to study the
relationship between biodiversity and functioning for denitrifying bacterial
communities in a river-groundwater interface.
The DNA fingerprinting approach used to assess the BCC, PCR-DGGE based on
16S rRNA genes, has been recently introduced in microbial ecology (Muyzer et al.,
129
1997). Only dominant taxa (>1% of the relative abundance) are detected (Casamayor
et al., 2000). Each band detected in the lane of the gel would correspond to one
bacterial taxon. Co-migration of DNA fragments from different taxa to the same
position in the lane of the gel can however happen while separate bands can occur for
one taxon (Muyzer & Smalla, 1998). PCR-DGGE is a powerful tool to compare the
BCC of different samples, β–diversity sensu Forney et al. (2004) despite imprecision
caused by dominant population selection and bias caused by the inaccuracy of the
assumption that one band correspond to one bacterial taxon. This technique has been
successfully applied to monitor bacterial communities from various environments
e.g. soils (Enwall et al., 2005), river biofilms (Lyautey et al., 2005), sediments (An et
al., 2004), plankton (Casamayor et al., 2000) and groundwaters (Röling et al., 2000).
On the other hand, regarding the reliability of the obtained BCC, one of the critical
point is the sample size with respect to sediment spatial heterogeneity. In soils, 1 g
proved to be a good trade off to cover soil heterogeneity (Ranjard et al., 2003). The
amount of sandy sediment analyzed in the present study accounted for these
recommendations and was in the range of the sample size (0.25 to 10 g) employed in
previous studies on aquifer sediment (Islam et al., 2004; Röling et al., 2000). The
amount of metagenomic DNA used as PCR template is also critical for BCC analysis
of a natural assemblage (Lyautey et al., 2005). As comparable amounts of
metagenome (20 ng) were analyzed here for free-living and attached fractions,
differences between the two bacterial communities were unlikely to be due to
representativeness bias.
130
As the functional descriptor used, DEA measures the potential capacity of
denitrifying communities under optimal conditions (Groffman et al., 1992). Previous
studies comparing simultaneous in situ denitrification and DEA measurements
concluded that DEA was 18 to 34 fold higher than in situ denitrification, whereas
both methods described similar spatial and temporal patterns of activity (Clément et
al., 2002; Well et al., 2003). DEA values measured in the present study in
respectively IHD and OHD zones were consistent with previously measured in situ
patterns of denitrification activity (Sánchez-Pérez et al., 2003a, 2003b; Baker &
Vervier, 2004). Many factors such as denitrification or other microbial metabolisms,
plant assimilation and dilution account for changes in the alluvial groundwater nitrate
concentrations. In the studied riparian zone, however, the variation of nitrate
concentrations calculated by means of a two-end-member mixing model based on
chloride concentrations can be considered as a geochemical signature of
denitrification (Sánchez-Pérez et al., 2003b). The calculated variations of nitrate
concentrations indicated a strong elimination of nitrate in IHD zones. This was
consistent with measured DEA indicating that both approaches lead to the same
result. It can be assumed that the measured DEA satisfactorily relate to the functional
response (denitrification) of the studied communities.
As hypothesized, DEA measurements indicated important denitrifying capability in
the sediment compartment but not in the groundwater. In accordance, the BCC of
131
sediment-attached and groundwater free-living assemblages differed. Differences
between particle attached and free-living bacteria assemblages within the same bulk
have been reported for aquifers (Lehman et al., 2002; Besemer et al., 2005) but also
for other environments such as e.g. marine snow (Grossart et al., 2006), estuary
(Crump et al., 1999), marine or lake sediments (Friedrich et al., 1999; Ahn et al.,
2006). The growth and succession of free living bacterial populations colonizing the
surface of particles result in the formation of biofilms (Watnick & Kolter, 2000;
Wimpenny et al., 2000). In these biofilms, new environmental conditions (niches and
resources) are generated irrespective of conditions that prevail in the water (Jackson,
2003). For instance, the microzones of oxygen depletion generated by the
heterotrophic activity in the biofilm may favor anoxic metabolic activity such as
denitrification (Paerl & Pinckney, 1996). The facilitation of chemical microgradient
formation within sediment-bacteria aggregates, as in biofilms, explains why attached
and free-living bacteria communities in the aquifer exhibited different functional
composition and denitrification capability. In the studied aquifer, the free-living
bacterial populations likely provide the bacterial species that form the sediment-
attached assemblage and selection during the attachment process and later growth on
the substrate may thus explain the differentiation that was observed between free-
living and attached bacterial assemblages. Moreover, in the aquatic fraction,
denitrifying bacteria might represent a lower percentages of the total community
compared to sediment total community. Since environmental conditions (ex. higher
dissolved oxygen concentration) in this compartment are not favorable for their
132
development, except in one well (p17), this explains the undetectable DEA in the
water compartment.
In the natural assemblages studied, enrichment culture coupled to molecular
fingerprinting indicated that different communities of cultivable denitrifying bacteria
were present in the groundwater free-living and sediment-attached fractions, in
agreement with the differences observed for the total BCC. The enrichment culture
step was designed to target the functional community of denitrifiers. This approach
has been successfully used to target heterotrophic bacteria in a photoautotrophic
assemblage (Jonkers & Abed, 2003a, 2003b; Rafidinarivo et al., 2007). In
environmental bacteriology, main bias related to the use of culture is the selection of
the so-called cultivable fraction of the community (Barer & Harwood, 1999; Colwell
& Grimes, 2000). A part of the diversity, estimated to be higher than 90% in some
environments, is not detected by such culture and remains cryptic supporting the
interest of molecular approaches (Amann et al., 1995). Culture based communities
approaches are thus considered to give a poor estimate of the α–diversity sensu
Forney et al. (2004). The 14 OTUs (out of 58 detected bands) that were identified in
the present study should be considered as a limited set of the bacterial taxa
responsible for the denitrification in the studied zone. All were affiliated to a single
group of Bacteria: the Proteobacteria. Taxa exhibiting low genetic distance with
Azoarcus and Pseudomonas genus were found that have previously been recorded in
133
several aquifers (Röling et al., 2000; Cho et al., 2003; An et al., 2004; Cavalca et al.,
2004). By selecting a fraction of the cultivable community that grow in the
laboratory conditions, enrichment culture step might have favored the selection of
the same subset of strains in different assemblages. This approach may thus lessen
the differences that actually occur between two assemblages i.e. the β–diversity
sensu Forney et al. (2004). Conversely, when differences are evidenced between two
assemblages by enrichment culture techniques, reliable conclusions on the β–
diversity of the two assemblages can be drawn. With 11 of the 14 OTUs common to
sediment and groundwater compartments, it can be suspected that the enrichment
culture step may have lessened the differences between the two compartments.
Although free-living and sediment-attached assemblages showed similar groups of
bacteria, the structure of the communities was different. The groundwater and
sediments proved to harbor significantly different cultivable denitrifying
communities in relation with the DEA values.
Our study confirms that DEA differs between sediment and groundwater habitat
during the low flow period in the unconfined aquifer of the River Garonne. Moreover
differences in DEA would be explained by differences in the BCC of sediment-
attached and free-living assemblages in relation with the habitat conditions. To date,
none of the existing models to predict denitrification in riparian zones take into
account the biomass and/or the diversity of denitrifying bacteria (McClain et al.,
134
2003). Here we suggest that the structuring of communities as biofilm aggregate
likely facilitates denitrification expression and/or denitrifying strains’ selection.
Modelling biofilm development and associated bacterial community structuring and
functioning would thus be a way to include community dynamics in biogeochemical
models of the aquifers.
A new challenge in functional ecology is to describe how biodiversity dynamics,
ecosystem processes and abiotic factors interact (Loreau et al., 2001). This question
is equally relevant for microbial taxa (Schimel, 1995). By means of manipulation of
the diversity, the contribution of bacteria species diversity to ecosystem functioning
was revealed in artificial assemblages (Bell et al., 2005). In natural assemblages from
soil, denitrification rates were shown to be related to the putative BCC (Holtan-
Hartwig et al., 2000; Cavigelli & Robertson, 2001). The present study would support
these conclusions in aquatic assemblages. Monitoring the dynamics of BCC and
denitrification expression during a colonization experiment would allow in-depth
investigation on the role of communities structuring as biofilm in the denitrification
expression in such systems.
According to the hot spot hot moments’ hypothesis, variable hydrological flow paths
generate localized activity events that are not permanent (McClain et al., 2003). This
study was realized during a low water hydrological period, representative of 40% of
135
time during a year. As defined in this study, IHD and OHD zones may vary with
respect to e.g. the river discharge, precipitation events. This would also affect
attached communities maturation and denitrification capability. Further
investigations would be necessary to assess the functional significance of free living
and sediment attached communities over the entire hydrological cycle in the studied
riparian zone.
CONCLUSIONS
This study confirmed differences between free-living and attached bacterial
community composition, and showed that they had different functional significance
in the studied aquifer. Both BCC and denitrification can be linked to the structuring
of an attached community assemblage. Sediment-attached aggregates form new and
original habitats where e.g. anoxic metabolisms are favored. This conclusion would
need to be tested in in situ colonization experiments in order to show that attached
bacterial communities result from selection of populations originating from the free-
living community. In the aquifer, the interplay between the groundwater liquid
phase, which is responsible for transport, and the sedimentary solid phase, which is
responsible for biological transformation, would thus explain the occurrence of
activity hotspots and the link between diversity and activity.
136
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was funded by GIS ECOBAG (Groupement d’Intérêt Scientifique -
Ecologie et Economie du Bassin Adour Garonne), A. Iribar was supported by
FEDER (Fonds Européen de Développement Régional). We are grateful to C. Mur
and D. Dalger for water analysis and F. Julien for field assistance. We also thank the
two anonymous reviewers for constructive comments on a previous version of the
manuscript.
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TABLES AND FIGURES
Table 1. Environmental conditions in the five wells and adjacent Garonne River.
Data represent the average physico-chemical values of groundwater analysis from
the period 2000 to 2004 (N = 16 sampling interval of 3 months). All well and river
samples were recovered at the same date at different hydrological conditions
(min=50 m3 s-1 max=764 m3 s-1 mean=227 m3 s-1). IHD: inside hotspot, OHD:
outside hotspot, Temp: temperature, DO: dissolved oxygen, Cond: electrical
conductivity, Eh: redox potential and DOC: dissolved organic carbon. SD: standard
deviation.
IHD OHD Garonne
unit p9 p17 p11 p10 p26 River
Temp °C Mean 13.6 13.7 13.4 14.4 14 10.9

SD 1.8 0.6 1.6 1.5 2.9 4.9
pH Mean 7.0 7.2 7.1 7.1 7.5 8.1

SD 0.2 0.2 0.3 0.3 1.5 0.4
DO mg L-1 Mean 4.1 1.2 6.8 4.0 6.6 11.0

SD 2.7 1.2 2.7 2.5 2.7 1.7
Eh mV Mean 294 185 349 279 313 272

SD 235 79 137 194 167 147
Cond µS cm-1 Mean 956 592 850 980 860 285

SD 139 166 131 123 78 31
DOC mg L-1 Mean 2.0 1.7 1.6 1.6 1.4 2.3

SD 0.3 0.6 0.8 0.6 0.6 0.8
N-NO3- mg L-1 Mean 10.2 0.9 14.8 13.8 13.4 2.3

SD 1.9 0.7 5.4 4.7 2.3 0.8
N-NO2- µg L-1 Mean 30.4 9.9 1.3 16.6 5.4 40.0

SD 42.1 13.4 2.8 24.4 14.0 34.6
N-NH4+ µg L-1 Mean 16.1 42.2 2.9 75.0 92.7 27.1

SD 19.5 6.6 4.8 13.6 15.8 19.6
Cl- mg L-1 Mean 48.9 20.3 67.2 67.3 62.5 18.1

SD 24.2 7.5 10.9 18.4 13.3 13.6
143
Table 2. Hydrological and biochemical characteristics of groundwater on 21 and 22

October 2003. IHD: inside hotspot of denitrification, OHD: outside hotspot of
denitrification. Garonne River and p26 were references for two-end member mixing
model so no variations are shown in the table. ƒSW: calculated surface water fraction
(see details in the text).
Observed Observed Predicted Variation rates
ƒSW
Cl- N-NO3- N-NO3- of N-NO3-
mg L-1 % mg L-1 mg L-1 %
Garonne River 10.5 100 1.1 7.8 -
p9 62.7 1 7.8 9.5 -17%

IHD
p17 14.6 92 0.02 1.7 -98%
p11 61.3 3 11.7 9.2 27%

OHD p10 62.4 1 10.9 9.4 16%
p26 63.1 0 9.5 9.5 -
144
Figure 1. Location of the study area and location of the study wells (outlined by a
square). The image on the right top square, represents hydraulic head (numbered
isoclines in m a.s.l.) for the mean annual river flow (200 m3 s-1). Striped circles
represent wells located in the river-groundwater-interface.
Figure 2. Attached (SED) and free-living (GW) bacterial densities ± confidence
interval in the different wells.
Figure 3. Denitrification enzyme activity of aquifer sandy sediment (0.4 – 2000 µm)
recovered from selected wells (mean ± SD, n=3). The same letters above the bars
indicate wells without significant differences (Mann-Whitney test, p < 0.05).
Figure 4. DGGE fingerprints of 16S rRNA in (a) natural bacterial communities and
(b) cultivable denitrifying bacterial communities selected by enrichment culture from
the alluvial aquifer. On the left gel pictures and on the right UPGMA dendrograms
constructed from presence-absence matrices from groundwater (GW) and sediment-
attached (SED) bacteria of the five wells (p9, p10, p11, p17 and p26) and of the river
(Gar).
Figure 5. Phylogenetic tree for the partial bacterial 16S rDNA sequences recovered
after excision of dominant DGGE bands from samples elaborated with denitrifying
enrichment culture medium. Tree was obtained using neighbour-joining method with
Methanobacterium formicicum as outgroup. Bootstrap values are based on 1000 runs
145
and are shown where > 50%. Similar trees were obtained using maximum-likelihood
and maximum-parsimony analyses.
146
Riparian forest 86.5
Poplar plantations
87
Agricultural lands
87.5
Toulouse
88
k
an
lb
ve
a
Gr
p11 200 m
p9
p26
p10
River Garonne p17
River
flow
N
Toulouse
10 km
250 m
Fig. 1.
147
2.0e+12
SED
Bacterial density (cell m-3) 1.8e+12
GW
1.6e+12
1.4e+12
1.2e+12
1.0e+12
8.0e+11
6.0e+11
4.0e+11
2.0e+11
0
p9 p17 p11 p10 p26
IHD OHD
Fig.2.
148
1600 b
1400
1200
mg N-N2O m-3 d-1 1000
800
600
400
200 a d cd
6 c
4 GW detection
2 threshold
0
p9 p17 p11 p10 p26
IHD OHD
Fig.3.
149
Similarity %
Gar SED
100 50 0
p10 SED
p11 SED
p17 SED
p26 SED
p10 GW
p11 GW
p17 GW
p26 GW
p9 SED
p9 GW
Gar W
p10 SED
a. p26 SED
p17 SED
Gar SED
p11 SED
Gar W
p17 GW
p26 GW
p10 GW
p11 GW
p9 GW
p9 SED
Dp17 SED
Dp26 SED
Dp10 SED
Dp11 SED
Dp10 GW
Dp11 GW
Dp17 GW
Dp26 GW
Dp9 SED
Dp9 GW
DGar W
100 50 0
b.
Dp10 SED
Dp17 SED
Dp11 SED
Dp9 SED
Dp26 SED
5
14 Dp9 GW
11
6 Dp10 GW
7 1 Dp11 GW
9 10 8 13 2
12
4 3 Dp26 GW
Dp17 GW
DGar W
Fig.4.
150
12 AY816209
8 AY816204
Ferribacterium limneticum
Dechlorimonas agitatus
5 AY816201
Azoarcus denitrificans
4 AY816200
Rhodocyclus purpureus
9 AY816205
7 AY816203 β-Proteobacteria
2 AY816198
19.D
13 AY816207
3 AY816199
1 AY816197
Hydrogenophaga taeniospiralis
Hydrogenophaga flava
14 AY816210
10 AY816206
Rhodoferax fermetans
Sphaerotilus natans
Neisseria cinerea
11 AY816208 γ-Proteobacteria
6 AY816202
Pseudomonas stutzeri
Methanobacterium
Spirosoma lingualeformicicium
Spirosoma linguale
Methanobacterium formicicium
Fig.5.
151
4. Résultats complémentaires à la publication
La principale réserve que l’on peut émettre sur cette partie de notre travail est
qu’elle a été réalisé au cours d’un échantillonnage ponctuel en condition de basses
eaux (débit de la rivière 100 m3 s-1) et sur 5 piézomètres. Même si ces conditions
représentent des conditions du système fréquemment observées, avec une fréquence
de 45% dans l’année, généraliser nos conclusions aux 55% restant est problématique.
Enfin les 5 piézomètres échantillonnés ont été choisis pour représenter des conditions
contrastées au sein de l’aquifère. Nous ne pouvons néanmoins pas assurer qu’ils
couvrent l’ensemble des conditions qui pourraient être rencontrées dans l’aquifère
étudié.
Des divergences de composition des communautés totales attachées et libres

ont déjà été observées par BESEMER et al. (2005), qui a suggéré que la structure des
communautés attachées était régulée par les interactions hydrologiques entre la
rivière et la plaine alluviale. De telles observations pouvaient être attendues dans la
mesure où nombre de travaux sur des biofilms de rivière (ARAYA et al. 2003) ou la
neige marine (GROSSART et al. 2006) révèlent également ce type de différence de
composition des communautés libres ou planctonique versus communautés fixées.
Reprenons les résultats du suivi de DNT et DEA (chapitre III) au cours

duquel la DEA a systématiquement été mesurée, sur des triplicats, dans l’eau et la
fraction fine des sédiments. (Figure IV.1). Sur l’ensemble d’un cycle hydrologique et
pour des piézomètres différents de ceux testés dans la publication (piézomètres p11,
p114, p17 et p26) les données indiquent (i) qu’il y a toujours une différence
d’activité entre eau et sediment, (ii) que cette différence est observée dans tous les
piézomètres. En l’absence d’information concernant la densité et la diversité
bactérienne au sein des différents compartiments, il reste délicat d’étendre nos
conclusions sur le lien qu’il pourrait y avoir entre diversité et denitrification au sein
152
de cet aquifère. On peut néanmoins considérer comme acquise la conclusion selon

laquelle, au sein de l’aquifère, c’est bien au niveau des communautés associées aux
sédiments que se développe la dynamique spatiale et temporelle de l’activité de
dénitrification. Que l’on ait pu démontrer, ponctuellement et localement, que des
assemblages différents soutiennent des potentiels d’activité différents nous semble
pouvoir constituer un mécanisme candidat pour l’explication des différences
fonctionnelles observées. En effet, le travail que nous avons réalisé est, à notre
connaissance, un des premiers à déterminer la composition des communautés
attachées et libres pour mettre en évidence leur rôle fonctionnel respectif dans le
cycle de l’azote.
153
20000 20000
p6 p10
15000 15000
10000 10000
5000 5000
20
40
10 20
0 0
20000 20000
p13 p18
mg N-N2O m-3 j-1
15000 15000
10000 10000
5000 5000
20 20
10 10
0 0
20000 M J O N D J J2 F M A M J A
p29 2004 2005
15000 mois
10000
5000 Eau
Sédiment
10
5
0
M J O N D J J2 F M A M J A
2004 2005
mois
Figure IV.1. Taux de DEA (N=3 ± SD) dans l’eau et les sédiments (SED) correspondant
au mesures entre 2004 et 2005 en différentes conditions hydrologiques au sein des
différents piézomètres. Les piézomètres p17 et p26 sont comparables au p18 et p29 dans
cette étude. NM : Non mesuré. Les dates sans barre correspondent à des mesures sans
détection d’activité.
154
5. Conclusion et perspectives
Les bactéries dénitrifiantes parviennent à coloniser différents milieux grâce à

leur capacité d’adaptation métabolique (respiration - dénitrification) aux conditions
environnementales (aérobie - anaérobie) (TIEDJE 1982). Mais leur participation au
cycle de l’azote dépend plutôt de leur habitat qui conditionne la structure de la
communauté dénitrifiante et sa capacité à dénitrifier. Cette partie de notre travail
souligne l’importance de la structure des communautés dénitrifiantes attachées aux
particules de sédiment en tant que responsables de la dénitrification dans les
aquifères alluviaux. Parmi le pool des bactéries libres, certaines vont s’attacher à la
surface de particules de sédiment pour créer un biofilm. Ces communautés attachées
vont générer de nouveaux micro-habitats, avec du carbone facilement disponible et
des conditions d’anoxie grâce auxquelles les communautés dénitrifiantes seront
stimulées dans leur capacité à respirer des nitrates. Ainsi au plan de son
fonctionnement, le compartiment de la pleine eau assure probablement pour
l’aquifère la fonction de transport (de nutriments et de propagules biologiques) alors
que le compartiment des sédiments est le siège des transformations biogéochimiques
des flux qui le traversent. De l’interaction entre ces deux compartiments résulterait le
fonctionnement de l’aquifère, à travers notamment la structuration des communautés.
Or, la composition et le fonctionnement d’une communauté évoluent au cours du
développement d’un BH. La prise en compte de la dimension temporelle nous a donc
semblé indispensable. A travers une expérience de colonisation, la dynamique des
communautés dénitrifiantes de l’assemblage fixé a été étudiée. La réalisation de cette
expérience de colonisation en milieu naturel a permis de déterminer les facteurs qui
influencent leur structuration.
Avec les enrichissements, les différences entre les communautés attachées et

libres ont été mises en évidence. Cependant, pour une comparaison de la diversité β
des communautés dénitrifiantes cultivables et non-cultivables au sein d’un BH il
155
serait utile d’appliquer des approches basées sur des marqueurs fonctionnels de la
diversité dénitrifiante en DGGE. Les enrichissements prouvent que les communautés
sont composées par des β-Proteobacteries, sous classe composée principalement par
des bactéries Gram–. Ceci nous a orienté vers le choix du marqueur fonctionnel nosZ.
Ce marqueur est décrit seulement chez les bactéries de type Gram– et il semble être
un bon descripteur des communautés dénitrifiantes dans les BH de l’aquifère.
L’enzyme nosZ n’a été détectée que chez les Proteobacteria Gram–. Ce gène est
méthodologiquement intéressant puisque (1) l’enzyme codée est la seule à participer
à la dernière étape de la dénitrification (transformation de N2O en N2), contrairement
aux autres étapes pour lesquelles au moins deux types des gènes sont impliqués
(PHILIPPOT 2002) ; (2) il représente principalement le groupe identifié dans l’aquifère
et enfin (3) parce l’étape qu’il permet d’assurer est la seule véritablement épuratrice
(les autres donnant des formes intermédiaires polluantes).
156
Chapitre V. Etude de la structuration des
communautés bactériennes attachées à
travers une expérience de colonisation
au sein de l’aquifère alluvial
A travers une expérience de colonisation, nous analysons la dynamique spatiale et temporelle

de la structuration des assemblages bactériens fixés de l’aquifère. L’objectif est d’étudier la
relation entre la composition des communautés dénitrifiantes du BH et la dénitrification
(DEA). Une partie des résultats présentés fait l’objet d’une publication en cours de rédaction
à soumettre à FEMS Microbiology Letters.
157
Ch. V : Structuration des communautés dénitrifiantes
1. Introduction
Les assemblages microbiens assurent un « service de dénitrification » dans les

zones alluviales (SABATER et al. 2003). Dans le chapitre précédent (Chapitre IV),
nous avons mis en évidence que les assemblages bactériens du BH sont les
principaux acteurs de la dénitrification au sein de l’aquifère alluvial de la Garonne.
Dans cette deuxième partie, l’objectif est d’analyser la structuration de ces
communautés bactériennes attachées, particulièrement des communautés
dénitrifiantes. Mettre en évidence une hétérogénéité spatiale dans la dynamique de la
structuration de ces communautés microbiennes, identifier les facteurs qui la
contrôlent nous ont semblé constituer des éléments à intégrer dans notre démarche.
La composition et le fonctionnement d’un biofilm changent au cours de sa

maturation1 (WATNICK et KOLTER 2000 ; WIMPENNY et al. 2000). S’agissant des BP,
à l’instar des communautés végétales, des « successions écologiques » ont été
décrites en milieux lentiques (JACKSON et al. 2001) et lotiques (LYAUTEY et al.
2005). En particulier, les souches aéro-anaérobies seraient favorisées dans les
biofilms matures (PAERL et PINCKNEY 1996).
Les répercussions fonctionnelles du changement de structure des

communautés peuvent être étudiés à travers le suivi d’une communauté se mettant en
place sur un substrat vierge (CLARET 1998 ; DANG et LOVELL 2000 ; KIORBOE et al.
2003 ; PEACOCK et al. 2004). Ce type d’expérimentation permet en effet de suivre
l’installation de communautés attachées et de décrire la dynamique de formation et
maturation de l’assemblage du biofilm. Trois phases principales sont généralement
mises en évidence pour les assemblages bactériens: (1) l’attachement initial durant
lequel se fixent les espèces pionnières de petite taille et à développement rapide, (2)
1
La maturation fait référence à l’étape qui consiste à la création d’une architecture complexe, canaux,
pores, et la distribution des bactéries à l’extérieur du biofilm pendant le développement du biofilm
STOODLEY P et al. (2002).
158
la colonisation primaire pendant laquelle apparaissent des espèces de taille

supérieure caractérisées par un développement plus lent et (3) la colonisation
secondaire durant laquelle s’établit un équilibre entre les populations bactériennes en
place, jusqu’à la formation d’une communauté climacique, stable (SIGEE 2005).
Pour les BH se développant au sein des aquifères, nous avons recensé

quelques expériences de colonisation (HIRSCH et RADES-ROHKOHL 1990 ; DODDS et
al. 1996 ; GRIEBLER et al. 2002 ; LEHMAN et O'CONNELL 2002 ; PEACOCK et al.
2004). Ces études ont abordé l’influence des communautés libres sur la colonisation
des substrats (HIRSCH et RADES-ROHKOHL 1990 ; GRIEBLER et al. 2002), l’influence
de la nature des sédiments sur la colonisation (augmentation de biomasse) et
l’activité enzymatique des communautés (LEHMAN et O'CONNELL 2002) ou l’impact
des sources de carbone sur la composition des communautés bactériennes (PEACOCK
et al. 2004). Mais à notre connaissance aucune étude en milieu naturel n’a porté sur
la dynamique des communautés bactériennes et leurs conséquences sur la
dénitrification. C’est l’objet du présent chapitre qui s’appuie sur un suivi pendant 15
mois de la colonisation de billes de verre immergées en 4 points distincts de
l’aquifère étudié dans la zone alluviale de la Garonne moyenne. Une partie de ce
travail a fait objet d’un projet de publication à soumettre à FEMS Microbiology
Letters. Des analyses et résultats complémentaires, non inclus dans le projet de
publication, sont également présentés.
159
2. Relation entre la structuration des communautés

bactériennes dénitrifiantes et la dénitrification au cour d’une
colonisation
Résumé de “Denitrification is spatially linked to colonization patterns of nosZ

genotypes in a river-groundwater interface”, en preparation, Amaia IRIBAR, Sara
HALLIN, José Miguel Sánchez-Pérez, Karin Enwall, Nicolas POULET, Frédéric
GARABETIAN.
Ce travail concerne l’étude de la dynamique de la colonisation des

communautés bactériennes dénitrifiantes en relation avec la dénitrification au sein de
l’aquifère alluvial. Notre hypothèse était que les conditions environnementales dans
l’aquifère, i.e. flux d’azote et carbone, agissent sur les patrons de colonisation par les
bactéries dénitrifiantes (composition des communautés et biomasse) et les
différences au niveau de la structure des communautés expliqueraient la répartition
de la dénitrification dans le système.
Cette étude analyse l’influence des flux de carbone et d’azote, des

concentrations en phosphates et oxygène dissous ainsi que de la température et du pH
sur la colonisation par des communautés dénitrifiantes (typage basé sur le gène nosZ)
de surfaces vierges (billes en verre) installées dans l’aquifère alluvial.
Nous avons cherché à mettre en évidence l’interaction entre les structures de

communautés bactériennes dénitrifiantes, la dénitrification et les conditions
environnementales.
En ce qui concerne la colonisation des billes de verre, l’augmentation de

biomasse était très faible dans notre expérience mais les valeurs étaient dix fois plus
importantes qu’à cinq mois, dans une étude de colonisation de (CRAFT et al. 2002).
Le maximum d’activité était observé au début de la colonisation, quand les valeurs
160
de biomasse étaient minimales ; ces maxima correspondent à des taux nettement

inférieurs à ce que l’on mesure dans les sédiments de l’aquifère.
La composition des communautés dénitrifiantes (typage DGGE nosZ) ainsi

que leur capacité à dénitrifier (DEA) s’expliquent par les flux de carbone organique
dissous et les concentrations en oxygène dissous. Ces variables contrôlent
principalement la répartition spatiale de la dénitrification. Ces données sont en
accord avec des travaux précédents sur le même site (BAKER et VERVIER 2004 ;
SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ; SANCHEZ PEREZ et al. 2003b) et les résultats obtenus
dans le chapitre III de ce manuscrit. On retrouve des maxima d’activité au niveau des
zones les plus actives au plan hydrodynamique qui correspondent à des zones
connectées à la rivière. Notons que ce type de patron a également été décrit dans
d’autres zones alluviales (POE et al. 2003, TOMASZEK et al. 1997). Le carbone est
fourni aux communautés dénitrifiantes principalement via l’infiltration de la rivière
dans l’aquifère (BRUGGER et al. 2001), contrôlant leur structuration et leur activité
dénitrifiante. C’est ainsi qu’une dynamique temporelle des flux nutritifs doit
vraisemblablement s’installer au rythme des phases de charge et de décharge de la
nappe. Ces phases étant elles-même controlées par l’alternance des périodes de
hautes et basses eaux de la rivière, les communautés ne bénéficieront pas, au cours
d’un cycle hydrologique, de conditions de ressources constantes. C’est ce qui
explique que nous n’observons pas de patrons de colonisation qui indiqueraient une
évolution temporelle structurée (type modèle de succession en biofilm de (JACKSON
2003) de la composition des communautés dénitrifiantes.
161
3. Publication
Denitrification is spatially linked to colonization patterns of nosZ

genotypes in a river-groundwater interface
Amaia Iribar1*, Sara Hallin2, Jose Miguel Sánchez Pérez1, Karin Enwall2, Nicolas
Poulet1 and Frédéric Garabétian1
1
Laboratoire d’Ecologie des Hydrosystèmes, UMR 5177 CNRS - Université Paul
Sabatier, 118 route de Narbonne, F-31062, Toulouse Cedex 9, France
2
Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Microbiology, Box
7025, SE-750 07 Uppsala, Sweden
*Corresponding author:
phone: +33 (0) 5 61 55 73 48
fax: +33 (0) 5 61 55 60 96
email: amaia.iribar@cict.fr
Keywords: River Garonne, floodplain, alluvial aquifer, biofilm, attached bacteria,

denitrifiers.
162
ABSTRACT
Through denitrification, attached bacterial communities reduce water nitrate loads
during transport from land to river. In an in situ colonization experiment, spatial and
temporal dynamics in composition of bacterial communities and denitrification
activity were studied in heterotrophic biofilms from an alluvial aquifer. Mesh bags
with glass beads were installed in different wells in an alluvial aquifer affected by
surface water fluxes from an adjacent river and biofilms were sampled throughout
the experiment. By combining structural (PCR-DGGE using nosZ genes) and
functional (Denitrification Enzyme Activity measures) descriptors, the denitrifiers
community structure of biofilms and their functional responses were studied.
Denitrifiers bacterial community composition developed on beads linked to
denitrification capability were dependant on dissolved organic carbon flux and
dissolved oxygen concentration, which were probably set by the river channel water
flow through the aquifer.
163
INTRODUCTION
Nitrogen pollution related to agricultural practice has increased ten-fold nitrate
concentration in aquatic ecosystems in recent decades (Galloway et al., 2003). As a
mean to control eutrophication in rivers, denitrification can remove nitrogen from
water flowing through the riparian zones (Sabater et al., 2003; Van Cleemput et al.,
2007). Denitrification is an anaerobic microbial respiration process in which nitrate
is reduced into nitrous oxide or nitrogen gas. It has been identified as the main
nitrogen removal process in alluvial aquifers, where flows of nitrate from agricultural
zones and dissolved organic carbon in water infiltrating the soil converge (Hill et al.,
2000). Thus, the interface between groundwater and surface water in the riparian
zones are important for nitrate reduction.
Understanding the interplay between environmental factors and the microbial

communities involved is crucial for managing nitrogen removal in alluvial
groundwater. In aquifers, bacterial biomass and activity have been shown to be
related to bacterial communities attached to surfaces rather than to free-living
bacteria (Alfreider et al., 1997; Griebler et al., 2002; Lehman & O'Connell, 2002;
Iribar et al, 2007). In these environments, both availability of carbon and nutrients
sources (Peacock et al., 2004; Besemer et al., 2005) and populations present in the
environment (Hirsch & Rades-Rohkohl, 1990) influence the community composition
of the biofilms.
We hypothesize that local environmental conditions in groundwater, i.e. carbon and

nitrogen fluxes in the alluvial aquifer, generates different patterns of colonization and
bacterial communities’ compositions that would explain the known patchiness of
denitrification in such system. The aim was to identify which environmental
variables could explain differences in denitrification activity and composition of the
bacterial denitrifiers community in biofilm colonizing surfaces in an alluvial
aquifers. Mesh bags with glass beads to be colonized were installed in four wells
164
located in a floodplain, each well representing a subset of various physical and

chemical conditions caused by the river-groundwater interface. The bags were
sampled four times over a 15 month period and simultaneous measurements of
physico-chemical conditions in each well allowed us to explore community ecology
in the aquifers.
MATERIALS AND METHODS
Study site
Microbial colonization was studied in alluvial groundwater of the River Garonne in
south-western France (Fig. 1). The sampling site was located in the mid-slope of the
river floodplain where the annual mean discharge is 200 m3 s-1, varying from 50 m3
s-1 in late summer to 4000 m3 s-1 during floods. The average water depths are 1 m
during low
flow, 3.5 m for the bank-full discharge and up to 8 m during floods. Throughout the
floodplain, the groundwater flow is governed by the slope of the valley (1:1000), the
water table levels in floodplain terraces and the water level of the River Garonne.
The groundwater flows from south-east to north-west, with an average hydraulic
gradient of 1.5 10-3 m m-1. The water table is at two to six meters m depth in low-
water periods, but can rise rapidly to the soil surface during floods. In the floodplain,
a four to seven-meter thick layer of quaternary sand and gravel overlie impermeable
molasse deposits. On the meander side, close to the stream, the exchange between
the aquifer and the river can be reversed by the creation of bypass phenomena
between the upstream and downstream of the meander (Weng et al., 2003). The
riparian zone is covered by Salix alba, Fraxinus excelsior and a stand of Populus
alba and agricultural fields. Nitrogen leaching from these fields leads to NO3- -N
concentrations exceeding 15 mg L-1 in the groundwater.
Experimental design and sampling
165
The floodplain is equipped with wells constructed of 6.3 cm diameter polyvinyl

chloride pipes, which intersect the alluvium down to the molasse layer (see Fig. S1 in
supplemental material). Four wells (labelled p11, p14, p17 and p26) known to
present high spatial heterogeneity regarding hydrology and environmental variables
were selected (see Tab. S1 in supplemental material) (Sánchez Pérez et al., 2003;
Weng et al., 2003). In each well, fourteen nylon mesh (1 mm) bags (20 cm x 2 cm)
filled with 20 g of 2 mm diameter glass beads (as artificial substrata to be colonized)
were installed in March 2004 (Fig. 2). Prior to installation, the bead-filled mesh bags
were sterilized 15 minutes by UV light. Then, three mesh bags were randomly
collected from each well 3, 6, 9, and 15 months after installation. These dates
correspond to the following daily mean flow of the river: 273, 50, 65 and 216 m3 s-1.
The three bags represent the three replicates of colonization in each of the four local
environmental conditions that were studied. In addition, groundwater was sampled in
each well using an electric pump (8 L min-1) to assess environmental variables, as
outlined below (see Table S1 in supplemental material). Samples were stored
refrigerated and were analyzed within 6 hours after sampling.
Environmental variables
Dissolved oxygen (O2), temperature and pH were measured in situ in each sampling
well using the WTW Oxical-SL Cell Ox 325 and the WTW 197i instruments.
Groundwater samples were filtered (0.45 µm) in the laboratory and concentrations of
nitrite (NO2--N) and nitrate (NO3--N) were measured according to a standard
colorimetric method (APHA, 1992). The sum of these fractions is the dissolved
inorganic nitrogen (DIN). Dissolved organic carbon (DOC) was determined in
filtered water (rinsed cellulose acetate filters) using a Shimadzu TOC 5000 carbon
analyzer. Chloride ions (Cl-) were analyzed by ion chromatography using a
DIONEX DX 500 and soluble reactive phosphate (SRP) concentrations were
measured according to Motomizu et al. (1983).
166
The hydrological model established by Weng et al. (2003) was used to calculate
water flow in each well during the study period. Daily mean river flow required by
the model was obtained by averaging daily mean values (provided by DIREN Midi-
Pyrénnées ; Direction Régionale de l’Environnement
www.hydro.eaufrance.fr/accueil.html) between sampling dates (0-3, 3-6, 6-9, and 9-
15 months). The calculated hydraulic flow (HF) was then multiplied with DOC or
DIN in each well and for each time interval, which resulted in the dissolved organic
carbon flux (DOCF) and dissolved inorganic nitrogen flux (DINF), respectively.
Denitrification enzyme activity (DEA)

Triplicate measurements of potential denitrification activity were performed using
the acetylene block technique (Yoshinari & Knowles, 1976). Colonized beads (10 g)
were placed in 150 mL serum glass bottles with a 10 mL of Na-acetate (50 mg C L-1)
and NaNO3 (100 mg N L-1) solution covering the beads. Oxygen was removed by
sparging the liquid phase with Helium (Helium U 99.99% purity, containing 20
ppmv of N2, Air Liquide, France) during 10 minutes. After closing the bottles,
vacuum was created, the gaseous phase of the bottles (about 130 mL) was filled with
helium. After addition of 25 mL acetone free acetylene AAS27 quality, Air Liquide,
France) at 10% v/v, the bottles were incubated at 16°C in the dark under moderate
shaking. After 24 h, a vigorous shaking ensured liquid and gaseous phase
equilibration and 3 mL of gas were sampled in the gaseous phase and stored (< 48h
at room temperature in the dark) in Venoject tubes (Terumo Scientific, NJ, USA) for
nitrous oxide analysis with a gas chromatograph (GIRDEL, Série 30, France)
equipped with an electron capture detector (ECD 63Ni) and Porapak Q columns (2m
packed columns) using argon-methane (90-10%, Air Liquide, France) as carrier gas.
Bacterial community composition analyses by PCR-DGGE of 16S rRNA and

nosZ genes
DNA was extracted from each of the three replicate bead bags sampled in every well
at all sampling dates. Prior to extraction, 10 g of colonized beads were suspended in
167
10 mL filtered water (0.2 µm), and vigorously shaked for 20 minutes. The retrieved
biofilm suspension was centrifuged (12 000 g at 4°C for 20 minutes) and the pellet
was stored at -80°C. DNA was extracted using UltraClean Soil DNA kit (Bio101,
Vista CA, USA) and quantified by fluorimetry (Fluoroskan Ascent II; Labsystems,
Helsinki, Finland) using SYBR Green (Sigma, France). The DNA yield was used as
an estimate of biomass.
PCR amplification of nosZ genes was performed with 3 x 5 ng of template DNA

using the protocol described by Enwall et al. (2005) for each replicate of DNA
extract, according to Throback et al. (2004). Prior to DGGE, nosZ amplicons from
the triplicate reactions were pooled and concentrated through freeze-drying (4-8 x 10-
2
mbar and -50°C; CHRIST alpha 1-2, Bioblock, Annecy, FR). The nosZ PCR
products were quantified in a 1.65% agarose gel using Precision Molecular Mass
Standard (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
After checking that loading 300 or 500 ng did not affect nosZ DGGE profiles,
samples were loaded onto a 7% acrylamide:bis-acrylamide (37.5:1) gel with a
denaturant gradient ranging from 40 to 70%. Electrophoresis was run during 17
hours at 130V and 60°C using D-Code Universal Mutation Detection System (Bio-
Rad Laboratories, Inc.). DNA was stained for 30 min with SYBR Green (Sigma,
France) to visualize bands in UV light (302 nm, transillumination). The gel images
were documented using a CCD camera and Biocapt V97.03 software (Vilber
Lourrmat, France) and band patterns were analyzed using Bio-1D++/Bio-gene
software 1D V97.06 (Vilber Lourrmat, France). All samples were treated in
triplicate, with one replicate per DGGE gel. Samples were named according to the
well number, colonization time and DGGE gel replicate (e.g. p14 9 a is the replicate
of the sample collected in well p14 after 9 months of experimentation that was
loaded in the DGGE gel “a”). Normalization of the 3 gels was performed using a
common complex sample covering the whole migration range. Even though a band
168
might harbor more than one genotype, each band detected in the profiles is from here
forth denoted as an Operational Taxonomic Unit (OTU).
Statistical analysis
Biomass and DEA spatial and temporal differences were tested using Mann-Whitney
test performed with the SPSS software v11.0. A presence-absence matrix was
generated from the DGGE banding profiles. The patterns were compared using
Jaccard similarity index (J = [c/(a+b-c)], where a is the number of bands in sample
A, b the number of bands in sample B and c bands found in both samples A and B. A
dendrogram was constructed using the unweighted pair-group method of arithmetic
averages (UPGMA) and Monte Carlo permutations tests (Kropf et al., 2004) were
used to test for differences between the clusters at p < 0.001. Partial Least Square
Regression (PLSR) was used to relate environmental variables and biomass to DEA.
PLSR is a technique that generalizes and combines features from principal
component analysis and multiple regressions. It is particularly useful when the
independent variables tested are correlated (Höskuldsson, 1988) as in our case
(results not shown). When necessary, variables were transformed using log, log² or
cube root to meet the assumption of normality. The PLSR gives components which
explain as much as possible of the variation of the independent variable (in our case
DEA). Cross-validation with leave-one-out procedure on the Root Mean Squared
Error of Prediction (RMSEP) was used to determine how many components to use in
the PLSR. The linkage of microbial community fingerprints (presence/absence of
OTUs) and environmental, biomass or DEA variable, was explored by Canonical
Correspondance Analysis (CCA) with Monte Carlo permutation tests. The Monte-
Carlo tests were based on 1000 random permutations of the data. Community
similarities were graphed by using ordination plots with scaling focused on inter-
sample differences (Jongman, 1995). This is a direct constrained ordination method
to explore statistically variability in a data set related to the environmental variables,
activity, biomass measured in bacterial communities Muylaert et al., 2002. PLSR and
169
CCA were performed with R software using the ADE4 package for PLSR and CCA
(http://cran.r-project.org/).
RESULTS
After 9 months of immersion, the biomass colonizing the beads was maximum in
wells p14 and p17 and significantly higher in those wells than in wells p11 and p26
(Fig. 2 a) . Thus different biomass accrual patterns were recorded in the wells p14
and p17 as compared to wells p11 and p26. Consistently, a significantly higher DEA
was measured on the beads that had been immersed for 3 months in the wells p14
and p17 than beads from wells p11 and p26 (Fig.2 b). In the time course however,
peaks of DEA (reached at 3 months) did not match with peaks of biomass (reached at
9 months) indicating that biomass and activity temporal patterns did not fit in the
wells. The variables which explain the variation of the DEA were searched with a
PLSR. Inspecting RMSEP, two components were conserved for PLSR analysis
(results not shown). The correlation loadings plots (Fig. 3) showed that the first and
second components accounted for 56% and 44% of the DEA variation respectively.
DOCF, as a measure of the resource supply, and O2, as a signature of the associated
microbial activity, were the two variables that were most correlated to the PLSR
component 1. This first component would thus represent a measure of a heterotrophy
potential. The higher the potential is, the higher the DEA. DINF and Cl, were the
variables that were most correlated to component 2 mainly reflecting the two end
members water mixing of river waters with N enriched groundwater. Groundwater
nitrate supply enable microbial DOC oxidation by denitrification.
In the DGGE analysis of nosZ genes, a total of 55 OTUs was detected (Fig. 4). No
nosZ amplicons were obtained at 6 and 9 months of colonization in wells p11 and
p26, and these samples were therefore excluded from the analysis. The dendrogram
of Jaccard similarities between nosZ genotypes exhibited two main clusters: the bead
colonizing assemblages retrieved from wells p14 and p17, on the one hand, those
170
form wells p11 and p26 on the other hand (Fig. 4). The denitrifier community
composition in wells p14 and p17 was significantly different from the communities
in wells p11 or p26 (Monte Carlo simulations, p < 0.001) sharing less than 20% of
similarity. Replicate generally clustered for the samples of wells p14 and p17
suggesting a temporal differentiation of the denitrifier communities retrieved from
the beads during the experiment. CCA showed that axes 1 and 2 explained 29.8%
and 17.3% of the variation (p<0.001) (Fig. 5 a). As already observed for DEA, the
strongest determinant of the denitrifiers community composition were DOCF and O2
differentiating the assemblages colonizing beads immersed in the well p14 and p17
from those of well p11 and p26 (Fig. 5 b). The water mixing as described by DINF
and Cl determined a differentiation of 3 and 15 months old nosZ communities in the
wells p14 and p17 (Fig. 5 c). Denitrifiers communities were plotted to biomass and
DEA using also CCA and results showed that in wells p14 and p17 DEA was
explained by bacterial community structure irrespective to biomass (Fig. 6 a and b).
Temporal patterns of DGGE profiles from 3 to 15 months explained the different
community responses in DEA under close hydrological conditions corresponding to
river daily mean flow 273 and 216 m3 s-1 (Fig. 6 c).
DISCUSSION
In groundwater, colonization experiments have been used to asses differences
between attached and free-living assemblages (Hirsch et al, 1990) , to study bacterial
attachment (Griebler et al, 2002) and community changes (Claret, 1998) ; (Dang et
al, 2000) ; (Kiorboe et al, 2003) ; (Peacock et al, 2004). The immersion of “clean”
surfaces in groundwater allowed us to describe spatially differentiated in situ
colonization patterns of bacterial communities. As expected, high (45 µg AFDM cm-
² month-1) and low (7 µg AFDM cm-² month-1) rate of beads colonization could be
related to organic carbon supply through water mixing with organic carbon rich river
water masses. The highest biofilm biomass recovered after during the experiment in
this study (22 µg AFDM cm-2) were 10 fold higher than those reported by Craft et al.
171
(Craft et al., 2002) after 5 months of colonization. Moreover DEA values measured
on the beads (from 0.06 to 7 ng N-N2O g-1 of beads h-1) were 10 times lower that
rates previously measured on the aquifer sediment (Iribar et al., in press). In alluvial
aquifers, flood and low water period promote recharge and discharge periods in the
groundwater and thus surface and groundwater mixing. Over the study period,
intense flood (1.5 times the annual mean daily discharge) occurred at the
experimentation start lasting for two months and limited flood event (1.1 times the
annual mean daily discharge) occurred after the ninth month of experimentation.
Community are thus likely to have experienced a “feast and famine regime” that
could explain low biomass and DEA values and discrepancies between their
temporal patterns. Biomass however neither explained DEA nor nosZ diversity
patterns. A spatial differentiation of the nosZ genotypes correlated with organic
carbon fluxes and oxygen depletion consistent with activity rates. Spatial DEA
values measured in the present study were consistent with patterns of denitrification
activity previously measured in situ patterns of denitrification activity in this system
(Sánchez-Pérez et al., 2003a, 2003b; Baker & Vervier, 2004). High denitrification
zones corresponded to zones in the immediate vicinity of the river, which
experienced more anoxic conditions and higher hydraulic flows. Decreasing
denitrification activities along the axe of the river water flow through the aquifer has
also been reported by in wetland systems (Tomaszek et al., 1997; Poe et al., 2003).
Even if both surface water infiltration (Brugger et al., 2001) and vertical percolation
(Brunke & Gonser, 1997) can supply groundwater bacterial communities with
organic carbon as suggested in previous work (Sánchez-Pérez et al., 2003a),
dissolved organic carbon flow is controlled by the hydraulic flow dependant upon the
distance to the river. This explains the higher denitrification rates and more important
bacterial biomasses in wells close to the river in our study site. Accordingly, (Battin
et al., 2003) showed that the establishment of important microbial biofilms was
governed by the water flow controlling biofilm thickness; thicker biofilm showed a
more active internal carbon cycle. This suggested that denitrification and denitrifier
172
presence would be favored by the presence of carbon and microanoxic zones as

proposed by (Tessier et al., 2007) for denitrification in river biofilms.
The functional group of denitrifiers being 5-15% of the Bacteria (Casella & Payne,
1996; Henry et al., 2006) is a relevant model to study diversity and activity
relationships as it is in charge of “denitrification service”. But studying diversity and
activity require incorporating environmental factors into analysis to provide a more
accurate examination of the reality (Wellnitz & Poff, 2001). This study aimed to
describe how dynamics of denitrifying bacterial community, denitrification activity
and abiotic conditions interact. Combining biogeochemical measurements and
molecular DNA-based techniques, structuring of attached bacterial communities
(particularly communities involved in denitrification processes) was monitored in
situ in an alluvial groundwater during a colonization experiment.
To conclude, denitrifiers bacterial community composition and denitrification

activity were dependant on the local environmental conditions (dissolved organic
carbon and dissolved oxygen), which were probably set by the river water flow
through the aquifer. In contrast to the total bacterial communities, the composition of
the nosZ communities was linked to site location rather than time during the
colonization experiment. Thus, the composition of this functional community
correlated to the denitrification ability of biofilms that developed in the wells.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was funded by GIS ECOBAG, A. Iribar was supported by FEDER and a
grant for foreign exchange from the University Paul Sabatier. We are grateful to C .
Mur, D. Dalger, I. Vitte, F. Julien, Y. Nicaise for helping with the analysis and field
work. Special thanks to F. Azemar for help in the “Haute Couture” part of this work
(design and sewing of the nylon mesh bags).
173
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177
FIGURES
Fig. 1. Map of the study site (43°53’N - 1°43’E) showing the River Garonne (black)
with the stream flow direction (white arrows) and the location of the wells (encircled
numbers). The groundwater flow (black arrows) and hydraulic head (numbered
isoclines in m.a.s.l.) for the mean annual river flow (200 m3 s-1) are shown in detail
in the right-hand image.
Fig. 2. DNA yields (a) and denitrification enzyme activity (b) of colonized glass
beads at 3, 6, 9 and 15 months, in wells p11, p14, p17 and p26 (mean ± SE, n=3;
ND=not detected). Bars with different letters above or underneath them are
significantly different from each other when compared temporally (a-d) or spatially
(A-E), respectively (Mann-Whitney test, p < 0.05).
Fig. 3. Correlation loading plot from PLS regression between environmental

variables and biomass (predictors) and DEA (dependant variable). Predictors
adequately describing the model are located far from the center of the circle and they
explain the component 1 or 2 depending to their proximity to the axes of each
component. O2: dissolved oxygen; DINF: dissolved inorganic nitrogen flux; DOCF:
dissolved inorganic carbon; Temp: temperature; DOC/DIN: dissolved carbon carbon
dissolved inorganic nitrogen ratio; Cl-: chlorides; SRP: soluble reactive phosphate.
Fig. 4. DGGE fingerprints of nosZ genes in bacterial communities colonizing the

glass beads in wells p11, p14, p17 and p26 at 3, 6, 9 and 15 months. Gel pictures
corresponding to one sample replicate are presented to the left and UPGMA
dendrograms constructed from presence-absence matrices calculating Jaccard
similarity index from all three replicates (a-c) are presented to the right.
178
Fig. 5. Ordination plots of CCA of DGGE nosZ (a,b) fingerprints according to

environmental conditions. The direction of an arrow indicates the steepest increase in
the variable, and the length indicates the strength relative to other variables. Results
are presented grouping samples accordingly to wells (b) and colonization time (c).
Temp: temperature, DOCF: dissolved organic carbon flux, DINF: dissolved
inorganic nitrogen flux, DOC/DIN: dissolved organic carbon dissolved inorganic
nitrogen ratio, O2: dissolved oxygen, Cl: Chloride, SRP: soluble reactive phosphate.
Fig. 6. Ordination plots of CCA of DGGE nosZ fingerprints according to biomass

and DEA. The direction of an arrow indicates the steepest increase in the variable,
and the length indicates the strength relative to other variables (a). Results are
presented grouping samples accordingly to wells (b) and colonization time (c).
179
14
11
26
17
500 m
Fig. 1.
180
160 10
c p17 d p17
a. p14 b. p14
ng N-N2O g-1 beads h-1

p11 8 p11
120 p26 p26
ng DNA g-1 beads
ab
cd
a 6
a
80 cd
d 4
ab ef c
40 f
ef h 2 e
e b f
gh g f b e
gh g ef
g b g
ND ND
0 0
AAAA BBCC DDEE FGFF AABB CCCC DD EEEE
3 6 9 15 3 6 9 15
months months
Fig. 2.
181
DINF
1.0
-
0.5 Cl
DOC/DIN DOCF
Comp 2 (44%)
Temp DNA
SRP
O2
0.0
pH
-0.5
-1.0
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
Comp 1 (56 %)
Fig.3.
182
Similarity %
100 80 60 40 20 0
p14 15 a
p14 15 c
p11 15 c
p17 15 c
p14 15 c
p26 15 c
p14 6 c
p17 3 c
p17 6 c
p17 9 c
p11 3 c
p14 3 c
p14 9 c
p26 3 c
p14 15 b
p14 9 a
p14 9 c
p17 15 b
p14 6 b
p14 6 c
p14 6 a
p14 9 b
p17 6 b
p17 6 c
p17 3 b
p17 3 c
p17 3 a
p17 6 a
p17 9 a
p17 9 c
p17 9 b
p17 15 a
p14 3 a
p26 15 a
p26 15 b
p26 15 c
p26 3 a
p26 3 c
p11 15 c
p26 3 b
p11 15 a
p11 3 a
p11 3 c
p11 3 b
p17 15 c
p11 15 b
Fig. 4.
183
17.3%
DINF A B p14-6
p11-3 C
O2 p11
p11-15
p14 p17-6
p17-3 p26-3
p14-9
Temp p26 p17-9p14-3

DOC/DIN p17 p14-15
p26-15
29.8%
DOCF
p17-15
SRP
pH
Fig. 5.
184
27% DEA
73% p26-3 p17-6 p17-3

p11-3
p26 p11
p17 p14-3
p11-15
p17-15 p14-6
p26-15
p17-9
p14
p14-9
p14-15
DNA
Fig.6.
185
6.3 cm
Surface
Unsaturated zone
ow
6.7 m
Fl
er
at
Mesh Bags
w
nd
Saturated zone
ou
max 2.5 m
Gr
min 0.8 m
River Flow
Molasse
Fig. S1. Schematic picture of the well design and location of mesh bags.
186
Table S1. Annual means of hydraulic and physical and chemical characteristics in wells p11, p14, p17 and p26.
p11 p14 p17 p26
Hydraulic conductivity 10-3m.s-1 1.5 5.7 6.2 0.8

Water level m asl 86.70 86.29 87.06 88.33
a
Water height m 7.7 3.7 6.7 5.1
Temperature °C 13.5 13.2 13.7 13.9

pH mg.L-1 7.1 6.9 7.2 7.3
Ehb mV 359 317 142 280
c -1
O2 mg.L 7.2 2.2 1.0 7.0
d -1
DIN mg.L 14.7 17.2 0.8 13.4
e -1
DOC mg.L 1.6 2.1 1.7 1.3
a
Measured from water table to molasses; bPotential redox; cDissolved oxygen; Dissolved Inorganic Nitrogen (sum of nitrites and nitrates)
e
Dissolved organic carbon.
187
Table S2. Physical and chemical parameters and biogeochemical fluxes in groundwater throughout the experiment recorded at
0, 3, 6, 9 and 15 months of colonization in wells p11, p14, p17 and p26.
Well Month Physico-chemical parameters Biomass Biogeochemical fluxes
a b c d
Temperature pH O2 Conductivity DIN DOC DOC/DIN SRP Cl- DNA HFe DOCFf DINFg
(°C) (mg L-1) (µS cm-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (ng g-1 (m3 d-1) (mg h-1) (mg h-1)
beads)
p11 0 12.0 7.1 8.6 853 14.7 1.5 0.10 0.002 57.5 0 ndf ndf ndf
3 13.2 7.0 7.4 962 14.7 1.3 0.09 0.002 65.8 25.1 0.0131 7.6 81
6 15.9 7.2 6.5 973 15.9 1.3 0.08 0.001 69.7 15.1 0.0137 7.5 88
9 15.0 6.9 7.5 970 15.7 1.3 0.08 0.001 68.8 15.9 0.0137 7.4 90
15 13.3 7.5 6.4 947 13.5 2.2 0.16 0.005 68.3 22.9 0.0130 9.3 79
mean 13.9 7.1 7.3 941 15.0 1.5 0.10 0.002 66.0 20 0.01 7.9 84
p14 0 12.5 6.9 1.3 1055 14.4 2.3 0.15 0.002 73.6 0 ndf ndf ndf
3 14.0 6.9 0.8 1124 13.8 1.4 0.10 0.002 75.5 39.6 0.7113 54.3 419
6 15.3 7.0 4.1 1086 15.8 1.4 0.09 0.002 76.9 95.0 0.7712 44.2 476
9 15.3 7.4 2.0 1083 17.7 1.3 0.07 0.005 76.2 114.7 0.7712 42.6 540
15 13.6 7.7 0.5 1128 14.7 2.3 0.15 0.009 81.7 48.2 0.4973 36.9 337
mean 14.1 7.1 1.8 1095 15.5 1.6 0.11 0.004 76.7 74 0.68 44.5 443
p17 0 13.5 7.2 0.6 781 1.4 2.1 1.54 0.003 25.6 0 ndf ndf ndf
3 13.3 7.1 0.4 673 0.8 1.1 1.34 0.003 24.5 24.8 0.9339 62.2 42
6 14.3 6.9 0.5 518 0.5 1.3 2.43 0.003 18.9 57.8 0.5261 27.1 13
9 14.3 7.2 0.1 576 0.5 1.6 2.77 0.001 19.5 71.4 0.5261 32.9 10
15 13.7 7.9 0.2 436 0.3 2.0 6.55 0.005 7.6 17.7 0.5374 40.3 9
mean 13.8 7.3 0.4 596 0.7 1.6 2.92 0.003 19.2 126 0.63 40.6 19
p26 0 13.7 7.2 4.7 934 15.4 1.4 0.08 0.001 65.3 0 ndf ndf ndf
3 13.0 6.6 8.7 902 13.2 1.0 0.06 0.001 70.6 10.1 0.0726 3.5 47
6 15.3 6.3 8.2 876 13.9 1.6 0.12 0.003 64.8 21.7 0.0802 4.3 48
9 15.3 6.1 8.7 866 13.4 1.0 0.07 0.001 60.6 9.1 0.0802 4.3 51
15 13.4 7.7 5.6 834 13.2 0.7 0.05 0.008 52.9 19.1 0.0728 2.6 46
mean 14.3 6.8 7.2 882 13.8 1.1 0.07 0.003 62.8 11 0.07 3.6 46
188
4. Résultats et analyses complémentaires
Ces analyses complémentaires non inclues dans le projet d’article sont

présentées afin d’en compléter les conclusions.
4.1. Relation colonisation/flux nutritif
Afin d’établir la relation entre les nutriments et l’augmentation de la

biomasse, exprimant la colonisation, nous avons réalisé des régressions linéaires
simples entre la quantité d’ADN (descripteur de la biomasse cf Matériel et
Méthodes) et le flux de carbone (Figure V.1 a) ainsi que le flux d’azote (Figure
IV.1 b).
2,4 2,4
log (ADN+1) (ng g-1 billes)
(a) (b)
log (ADN+1) (ng g-1 billes)
1,8 1,8
1,2 1,2
0,6 0,6
0,0 0,0
0,0 0,6 1,2 1,8 2,4 0,0 0,6 1,2 1,8 2,4 3,0
log (FCOD+1) (mg C m h )
-2 -1
log (FNID+1) (mg C m-2 h-1)
Figure V.1. Corrélation de Pearson entre la biomasse (ADN) et les flux de carbone
organique dissous (a) et flux d’azote inorganique dissous (b). Les équation des
régression sont : DNA = 0,623 x log (FCOD+1) + 0,675 r²=0,54 p<0,01 et DNA = 0,339 x
log (FNID+1) + 0,802 r²= 0,25 p<0,05. FCOD : Flux de carbone organique dissous ;
FNID : Flux d’azote inorganique dissous. p11 (□), p14 (●), p17 (∆), and p26 ().
Les résultats montrent que l’augmentation de la biomasse est fortement

corrélée au flux de carbone organique dissous (r²=0,54 ; p<0,01) contrairement au
flux de l’azote inorganique dissous avec une relation statistique (p<0,05) mais très
189
faible (r²=0,25). D’autre part, dans les régressions ADN-FCOD, les deux groupes
qui montraient des patrons de colonisation différents sont clairement séparés : le
p17 et p14 avec des augmentations plus importantes que dans le p11 et p26.
4.2. Communautés 16S ARNr
La composition des communautés bactériennes a été réalisée par typage

(DGGE) basé sur l’ADNr 16S. A l’examen du dendrogramme des distances de
Jaccard (Figure V.2), on constate que la durée de colonisation semble organiser le
regroupement des échantillons.
% Similarité
100 80 60 40 20 0
p14 3 b
p14 3 c
p14 3 a
p17 3 a
p17 15 a
p26 15 a
p11 15 a
p14 15 a
p17 6 a
p26 6 a
p11 6 a
p14 9 a
p14 6 a
p17 3 a
p17 9 a
p26 3 a
p11 9 a
p26 9 a
p14 3 a
p11 3 a
p17 3 b
p17 3 c
p26 3 a
p26 3 c
p26 3 b
p11 3 a
p11 3 b
p11 3 c
p14 9 a
p17 9 a
p17 6 a
p17 6 b
p17 6 c
p14 9 b
p17 9 b
p17 9 c
p26 15 c
p26 15 a
p26 15 b
p14 15 a
p14 15 b
p14 15 c
p11 15 b
p11 15 c
p14 9 c
p11 15 a
p17 15 a
p17 15 b
p17 15 c
p14 6 a
p14 6 b
p14 6 c
Figure V.2. Patrons de DGGE gènes nosZ des communautés bactériennes

colonisant des billes de verre dans les piézomètres p11, p14, p17 et p26 à 3, 6, 9 et
15 mois. A gauche la photographie du gel qui correspond à un replicat et à droite le
dendrogramme construit selon la méthode UPGMA correspondant aux trois replicats (a-
c) construits à partir des calculs des index de similarité de Jaccard.
190
Ainsi un groupe significativement différencié (Monte Carlo, p<0,001) réunit

l’ensemble des échantillons collectés après 3 mois de colonisation.
Si l’on reporte l’évolution au cours du temps du pourcentage d’homologie moyen

entre les échantillons prélevés dans les différents piézomètres (Figure V.3), on
constate que celui-ci diminue. Cela peut être interprété comme une
individualisation des communautés dans chaque piézomètre en fonctions des
conditions environnementales locales.
Notons que l’évolution des profils 16S ARNr selon un patron temporel marqué
confirme que les communautés bactériennes changent au cours de la colonisation
des billes de verre, données qui n’apparaissent pas si clairement à l’examen des
profils nosZ. Cependant les changements de composition des communautés
bactériennes ne permettent pas de dégager une loi de succession bactérienne
comme c’est le cas pour des biofilms de rivière (JACKSON et al. 2001) ; (LYAUTEY
et al. 2005).
50
Similarité
25
%
0
0 3 6 9 12 15
mois
Figure V.3. Similarités moyennes entre les patrons de DGGE 16S ARNr de chaque
piézomètre versus les trois autres aux différentes dates d’échantillonnage.
191
4.3. Imbrication des communautés 16S ARNr de BH
Le test de Nestedness permet de tester l’hypothèse selon laquelle les

communautés seraient distribuées selon un patron imbriqué déterminé par la
proximité à la rivière (i.e. que les communautés des piézomètres les moins
connectés représentaient un sous-ensemble de la communauté du piézomètre le
plus connecté). Les résultats montrent que les température moyennes des matrices
de présence/absence des communautés bactériennes organisées pour un maximum
d’imbrication (T=42,72° avec un remplissage de 46,2% et T=60,24° avec une
remplissage de 45,3% à 3 et 15 mois de colonisation, Figure V.4) ne sont pas
significativement différentes des températures moyennes des matrices théoriques
construites sur l’hypothèse d’une répartition aléatoire des taxas, telle que simulée
par le test de Monte-Carlo (500 itérations, T=37,72° et T=37,99°, p>0,07 pour les
communautés bactériennes à 3 et 15 mois).
p11 3 c 18
p14 3 c 17
p14 3 a 16
p17 3 c 16
p26 3 b 16
p11 3 b 15
p14 3 b 15
p17 3 b 15
p26 3 c 15
p11 3 a 14
p26 3 a 14
p17 3 a 13
12 10 10 10 10 9 9 8 8 8 7 7 7 6 6 6 6 5 5 4 4 3 3 3 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
p17 15 a 16
p17 15 b 14
p17 15 c 14
p11 15 c 13
p14 15 a 13
p14 15 b 12
p26 15 c 12
p11 15 b 11
p11 15 a 10
p14 15 c 9
p26 15 a 9
p26 15 b 8
8 8 7 7 7 7 5 5 5 5 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Figure V.4. Matrices des patrons de DGGE 16S ARNr organisées à l’aide de
Nestedness calculator. Les carrés noirs correspondent aux bandes détectées.
Ce test indique que les communautés correspondant au BH des différents

piézomètres et différents moments de prélèvement (3 et 15 mois) sont distribuées
192
au hasard au niveau spatial. Il complète ce que nous observions au niveau de la

dynamique temporelle de la composition des communautés 16S ARNr :
l’importance des conditions locales à l’échelle de la durée de colonisation étudiée.
4.4. Relation entre les communautés 16S ARNr et

nosZ
Le test de Mantel permet d’évaluer la congruence entre la composition des

communautés totales et celles des communautés dénitrifiantes. Les résultats
montrent une corrélation significative même si le coefficient de corrélation est
faible (r=0,31, p<0,001). Ceci suggère qu’au sein du lot d’échantillons analysés, la
composition des communautés dénitrifiantes (DGGE nosZ) est en partie liée à la
composition des communautés totales (DGGE 16S ARNr).
4.5. Structure des communautés dénitrifiantes
Dans la communauté bactérienne des BH des piézomètres fortement

connectés à la rivière, la proportion de bactéries dénitrifiantes est
significativement plus élevée (Mann-Whitney, p < 0,05) (Figure V.5).
% de copies des gènes dénitrifiants
a a b b
100
et non dénitrifiants
80
60
40
20
0
p17 p14 p11 p26
Figure V.5 : Proportion des communautés dénitrifiantes caractérisées par les

marqueurs nosZ, nirS, et nirK dans les communautés totales du biofilm
hétérotrophe des différents piézomètres (p17, p14, p11 et p26). Les barres
193
surmontées par une même lettre ne sont pas statistiquement différentes (Mann-Whitney,
p < 0.05).
Cette proportion (24% de la communauté totale) est quatre fois plus importante
dans les BH qui colonisent les billes immergées dans des piézomètres avec des
apports importants de carbone liés à leur connectivité avec la rivière. La
composition des communautés dénitrifiantes au cours de la colonisation change
pour tous les BH (Figure V.6). A 3 mois, les proportions de nosZ, nirS et nirK
sont comparables dans les BH qui se sont développés dans différentes conditions
environnementales (piézomètres), entre 64-79% de nirS, 19-33% de nosZ et 2-4%
de nirK (Figures V.6) mais la DEA est plus importante uniquement dans les BH
des milieux fortement connectés à la rivière (p14 et p17) à 3 mois de colonisation.
p17 p14 p11 p26 nosZ

2 2 3 4 nirS
nirK
19 26 33 25
3 mois 72 64 71
79
2 3
8 44 49
28 36
6 mois 38
60 89 28 15
1 2 8 6 10
19 18 16
9 mois
80 80 86 74
0,2 0,3 2 6 2
14
85,8 52 47,7 43 92
15 mois 55
Figure V.6 : Composition des communautés dénitrifiantes dans les piézomètres

p17, p14, p11 et p26 au cours de la colonisation. La proportion des types nosZ, nirS et
nirK par rapport au 16S ADNr total est donnée en pourcentages.
194
A 15 mois de colonisation, les densités de gènes sont comparables à celle

obtenues à 3 mois : 7,11 x 103 copies g-1 billes (à 3 mois 2,29 x 104) billes pour
nirK ; 1,01 x 106 copies g-1 billes (à 3 mois 9,05 x 105) pour nirS et 1,98 x 106
copies g-1 billes (à 3 mois 2,93 x 105) (Figure V.7). Néanmoins, la DEA était plus
importante à 3 mois.
1e+10
nirS
Copies de genes par ng de billes
nirK
1e+9 nosZ
16S
1e+8
1e+7
1e+6
1e+5
1e+4
1e+3
p17 t3
p14 t3
p11 t3
p26 t3
pT3
p17 t15
p14 t15
p11 t15
p26 t15
Piézomètres - Temps
Figure V.7 : Densités de copies des gènes dénitrifiants (nosZ, nirS, nirK) et gènes
16S ARNr dans du biofilm hétérotrophe de 3 et 15 mois.
4.6. Analyse des CLPP (Community Level

Physiological Profil)
4.6.1. Analyse spatiale des CLPP
L’impact quantitatif observé au niveau de la biomasse des BH, en fonction

de la connectivité des piézomètres avec la rivière, se manifeste également au
niveau de l’intensité de la consommation des substrats, AWCD, mesurée dans les
195
microplaques Biolog-ECO (Figure V.8 b). L’AWCD est significativement plus

basse pour le BH du piézomètre p26 isolé de la rivière pendant la durée de
l’expérience (Mann-Whitney, p < 0,05).
A côté de cet impact quantitatif, la connectivité a également un impact

qualitatif sur la diversité métabolique des communautés. L’analyse des profils
métaboliques des communautés microbiennes à travers la détermination du
nombre et du type de sources de carbone utilisées démontre que les piézomètres
p17, p14, et p11 sont caractérisés par une diversité métabolique plus importante.
Quand les diversités sont maximales, à 3 mois, les BH connectés à la rivière
utilisent entre 22 ± 1 et 25 ±1 sources de carbone face au p26 avec 2 ± 1 sources
de C dégradées (Figure V.8 a).
4.6.2. Analyse temporelle des CLPP (Community

Level Physiological Profiles)
D’un point de vue temporel, les communautés de l’interface nappe/rivière

montrent une diminution de l’AWCD pendant la période d’étiage (Figure V.8 a).
De même, la richesse métabolique diminue après 6 et 9 mois de colonisation,
entre 2 et 16 sources de carbone dégradées pour les BH influencés par la rivière et
entre 1 et 2 sources de carbone dégradées pour le p26 isolé de la rivière (Figure
V.8 b). A 15 mois, les apports de carbone augmentent avec l’accroissement du
débit de la rivière entre 9 et 15 mois (d’un minimum de 367 m3 s-1 le 21/12/05 à
un maximum 804 m3 s-1 le 18/05/05). La contiguïté de ces « petites » crues
favorise une diversification des communautés dans le piézomètre le plus éloigné
de la rivière, le p26. La diversité métabolique du piézomètre p26 à 15 mois est
proche (16± 2 sources de carbone dégradées) de celle des autres piézomètres
(entre 17 ± 1 et 27 ± 2 sources dégradées pour le p17 et p14 respectivement).
196
(a)
30 3000
Nbr de sources de C dégradés
Débit de la rivière (m3 s-1)

20 2000
10 1000
0 0
O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O
(b) 1,5 3000
Débit de la rivière (m3 s-1)

1,0 2000
AWCD
0,5 1000
0,0 0
O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O
mois
Figure V.8. Diversité des substrats dégradés (a) et densités optiques (b) par
piézomètre pendant la colonisation. (a) : Nombre moyen de substrats carbonés
dégradés, ± SE par micro-plaque ; (b) AWCD : Average Well Colour Development.
(Lecture des microplaques effectuée à 6 jours). Piézomètres p11 ( ), p14 (z), p17 (U),
et p26 ().
L’analyse par SOM montre qu’à trois mois de colonisation, les principales
sources consommées (DO>1,8) sont la N-acétyl-D-glucosamine, le D-Mannitol, le
Tween 40, la L-Asparagine, sauf dans le piézomètre p26. Pendant la période
d’étiage (mesures à 6 et 9 mois), les communautés dégradent principalement le
Glucose-1P et le D-Xylose, sauf le p14 qui dégrade surtout Glycogen, 2-
Hydroxybenzoic acid, L-Threonine, α-Cyclodextrin. (Figure V.9).
197
A 15 mois de colonisation, la distribution des communautés provenant de

différents piézomètres se révèle plus dispersée dans la carte de SOM. Les profils
métaboliques observés à 15 mois sont clairement distincts de ceux observés en
période d’étiage et les résultats montrent qu’ils sont plus proches de ceux obtenus
à trois mois.
198
N-acetyl-D-glucosamine D-mannitol Tween 40 Pyruvic acid methyl ester
(b) 1.850 2.020 2.130 1.120
0.954 1.100 1.130 0.573
(a) p14 6 a
p14 6 b p11 3 a
p14 3 a
p14 3 b
p14 15 a
p14 15 b
0.059 0.188 0.137 0.031
p14 6 c p11 3 b p17 3 b p14 15 c
L-Asparagine Tween 80 L-Arginine Putrescine
1.330
p17 3 a 1.950 1.850 0.801
1.050 0.962 0.685 0.404
p11 6 a p11 15 c p17 15 a 0.152 0.078 0.036 0.008
γ-hydroxybutiric acid D-glucosaminic acid Itaconic acid D-Xylose

p11 6 b p11 15 b p17 15 c 0.527
1.150 1.110 0.834
0.584 0.559 0.427 0.273

p17 15 b
p17 6 a p17 6 b p26 15 a p26 15 b
p26 15 c
0.018 0.008 0.020 0.018
p26 6 b p11 15 a D-cellobiose Glucose 1-Phosphate Glycyl-glutamic acid D,L-α-Glycerophosphate

p11 9 a
p11 9 b 1.940 0.986 1.180 0.182
p11 9 c
p26 3 b p11 6 c p14 9 a p17 9 a
p26 3 c p26 3 a p26 6 a p14 9 c p14 9 b p17 9 b 0.981 0.514 0.655 0.096
p26 6 c p17 6 c p17 9 c
p26 9 a
p26 9 a 0.019 0.042 0.125 0.010
p26 9 a
D-Galacturonic acid i-Erythritol L-Serine α-Cyclodextrin
1.810 0.542 1.910 1.410
0.908 0.277 0.980 0.712
0.000 0.012 0.052 0.010

Figure V.9 : Distribution des communautés bactériennes L-phenylalanine L-threonine Glycogen 2-Hydroxybenzoic acid
attachées aux billes dans la carte SOM (Self-Organizing 0.884 1.310 1.840 0.859
Map) en fonction des substrats carbonés dégradés.
0.448 0.679 0.925
(a) Analyse des densités optiques pour chaque source de 0.430
carbone. Chaque communauté est désignée sous une forme 0.012 0.050 0.011 0.000
(ex : p11 6a) indiquant respectivement le piézomètre, la date de 4-Hydroxybenzoic acid Phenylethylamine D-malic acid α-ketobutyric acid
prélèvement au cours de la colonisation et le réplicat. La flèche 1.210 1.030 1.390 0.307
grise représente la tendance générale de la consommation du 0.621 0.517 0.699 0.155
carbone au cours de la colonisation ; (b) Visualisation sur
0.003
chaque mini-map de la consommation par substrat à l’aide 0.029 0.007 0.000
d’une échelle de gris (foncé = densité optique élevée, clair = β-methyl-D-glucoside D-Galactonic Acid γ-Lactone α-D-lactose
densité optique basse). 1.800 1.950 1.060
0.926 0.981 0.531
0.048 0.016 0.000
199
5. Discussion
Les conditions environnementales, principalement le flux de carbone

organique dissous et les conditions anoxiques, déterminées par la connectivité
avec la rivière, contrôlent : la colonisation, la composition des communautés
bactériennes totales et dénitrifiantes, leurs diversités métaboliques et leurs
capacités de dénitrification. Les communautés bactériennes de BH provenant de
chaque piézomètre ont été modelées par des exigences différentes pour les
ressources nécessaires aux processus hétérotrophes, dénitrification inclue. Dans
cette zone alluviale, le carbone organique dissous est principalement apporté par
la rivière (SANCHEZ PEREZ et al. 2003a ; BAKER et VERVIER 2004). La
connectivité avec la rivière aurait également un rôle sur l’apport de cellules
bactériennes. (CRAFT et al. 2002 ; ELLIS et al. 1998) montrent que la densité
bactérienne au sein d’un aquifère alluvial diminue avec la connectivité avec la
rivière et (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b) suggèrent que dans la zone étudiée les
cellules bactériennes sont fournies par la rivière.
La théorie des îles – qui explique la distribution de la biodiversité en

fonction de la distance avec la source (MACARTHUR et WILSON 1967) – pourrait
expliquer la distribution de la diversité dans l’aquifère alluvial. Selon cette
théorie, la structuration des communautés du BH s’effectuerait principalement à
partir de bactéries en suspension provenant de la rivière et les communautés
montreraient une imbrication les unes dans les autres en fonction de leur niveau
de connectivité à la rivière. Néanmoins, cette hypothèse est rejetée lorsqu’elle est
testée avec le test de Nestedness qui démontre que les communautés des BH
correspondent à des biota isolés. A l’échelle de temps de l’expérimentation que
nous avons conduit (15 mois), le flux hydraulique ne semble pas organiser le
transfert de populations bactériennes d’un piézomètre plus connecté vers les
moins connectés à la rivière. Les communautés bactériennes colonisant le substrat
200
vierge proviennent vraisemblablement de sous-ensemble locaux des populations

d’une metacommunauté (CURTIS et SLOAN 2004) comme le suggèrent récemment
BATTIN et al. (2007) pour les BP de rivière. En effet la composition des
communautés bactériennes de BH varie au niveau spatial et temporel, au cours de
la colonisation mais le changement des communautés ne semble pas suivre le
modèle écologique de succession bactérienne décrit pour les biofilms par
JACKSON (2003). Avec la maturation (i.e augmentation de biomasse), les BH
provenant des différentes localisations se différencient au niveau de la
composition de communautés : la similarité entre les communautés bactériennes
(DGGE 16S ARNr) des BH diminue au cours du temps. Ceci pourrait s’expliquer
par une sélection des espèces selon la nature du substrat (verre) qui aurait pu
favoriser l’adhésion de certaines espèces parmi la communauté totale (HAYASHI et
al. 2001). De plus les propriétés de l’habitat à micro échelle durant la maturation
du biofilm jouent un rôle important sur les changements de la composition des
communautés bactériennes au sein de la nappe alluviale, lesquels temporellement
changent en fonction des conditions hydrologiques (BESEMER et al. 2005).
Contrairement à la diversité nosZ, les patrons de la diversité 16S ARNr ne

montrent pas une différentiation spatiale corrélée à la DEA. D’autre part, le
phénomène de transfert latéral de gènes dénitrifiants a pu influencer l’évolution
phylogénétique pour chacun des marqueurs (HEYLEN et al. 2006 ; HORN et al.
2006 ; DANDIE et al. 2006) comme le montre la corrélation significative (p <
0,001) mais faible (r=0,31) entre les communautés totales et dénitrifiantes.
La différentiation spatiale entre piézomètres, de la composition des

communautés dénitrifiantes (DGGE nosZ) et des patrons de diversité métabolique
(CLPP) étaient en accord avec la DEA. Les communautés localisées dans les
zones fortement connectées sont favorisées avec l’arrivée d’un carbone plus
biodisponible (FIEBIG et LOCK 1991). La proportion de carbone organique dissous
qui est biodisponible (BCOD) est de 19 à 54% dans les rivières (SERVAIS et al.
201
1989 ; ROMANI et al. 2004) et au sein des zones alluviales de 15% entre les zones
principalement drainées par les eaux d’aquifère et 25% dans le zones drainées
majoritairement par l’eau de la rivière (MANN et WETZEL 1995 ; CLARET et al.
2001). De plus, les CLPP confirment que la diversité métabolique des
communautés de BH est sensible à l’hydrologie de la rivière puisque la
distribution et la biodégradabilité du DOC dépendent de la connectivité avec la
rivière (BRUGGER et al. 2001). Pendant les périodes d’étiage (débit moyen de 90
m3 s-1, 6 mois de durée), la diversité métabolique diminue de façon importante
dans les zones connectées à la rivière (de 23 à 9 sources utilisées en moyenne).
Les bactéries subissent probablement un stress (i.e. manque de carbone) et
survivent en exploitant des substrats « résiduels », séquestrés dans le milieu
depuis les derniers épisodes de crues importants (21/01/05 et 18/05/05 avec des
débits de 2440 et 804 m3 s -1 respectivement). Il est envisageable alors que l’arrivé
de nouveaux apports, à 15 mois de colonisation, ne soit pas suffisante pour que les
communautés récupèrent des capacités à dénitrifier équivalentes à celles
observées à 3 mois. L’importance de la connectivité avec la rivière se reflète aussi
au niveau spatial : avec la distance l’influence des eaux de surface diminue,
l’amplitude de la variation de la nappe est moins importante (WENG et al. 2003) et
le pourcentage des eaux de surface sur la masse d’eau totale souterraine diminue
jusqu'à pratiquement 0% (à mettre en regard des 60 - 90% d’eau de surface aux
point proches de la rivière, (SANCHEZ PEREZ et al. 2003b)). Dans le piézomètre,
situé loin de la rivière (le p26 à 1440 m), les ressources carbonées sont peu
disponibles et la fraction biodégradable moins importante à cause de
l’éloignement avec la rivière. Pendant son transport transversal et horizontal à
travers le sédiment, la proportion de COD réfractaire augmente et donc la
proportion biodégradable, celle qui conditionne l’activité bactérienne (dont la
dénitrification) diminue (MARMONIER et al. 1995).
Enfin, la composition des communautés dénitrifiantes (nirS, nirK et nosZ) a

validé les résultats obtenus au niveau de la composition taxonomique des
202
communautés dénitrifiantes et de la DEA. Les proportions des communautés

dénitrifiantes relative à la somme des abondances des gènes 16S ARNr sont plus
importantes dans les piézomètres fortement connectés à la rivière. Les BH sont
principalement composés par des bactéries dénitrifiantes dotées des gènes nirS
et/ou nosZ. La faible présence de nirK semble être caractéristique du BH, en
opposition avec les observations sur d’autres écosystèmes comme les sols (HENRY
et al. 2006) ou les sédiments marins (BRAKER et al. 2000). Notamment, les BP de
rivière sont caractérisés par une proportion plus élevée de nirK (cf. Chapitre VI).
Cette expérience de colonisation a démontré que dans un aquifère non

confiné, contaminé par des nitrates, et limité en carbone, la diversité taxonomique,
métabolique et la composition des communautés bactériennes de BH sont
contrôlées par les conditions environnementales locales (flux de carbone
organique dissous et oxygène dissous) déterminées par la connectivité avec la
rivière c'est-à-dire un flux préférentiel d’eau de la rivière. Dans les BH résultants
de l’attachement d’un sous-ensemble des populations bactériennes d’une
métacommunauté, la communauté dénitrifiante constitue 25% de la communauté
dans les zones fortement connectées et 7% dans les zones non connectées. La
richesse dénitrifiante est comparable pour les différents BH (moyenne 15 OTU ±
5 en DGGE nosZ ) et n’explique donc pas les différences d’activité dénitrifiante.
En revanche, la composition des communautés dénitrifiantes et la biomasse des
BH sont corrélées à des taux de dénitrification plus importants dans les zones
connectées à la rivière. Dans un environnement de type BH, les micro-couches
anoxiques (PAERL et PINCKNEY 1996) favorisent le développement de bactéries
dénitrifiantes respirant des nitrates. Ceci est confirmé dans notre étude avec la
présence des bactéries dénitrifiantes plus importantes dans le BH le plus épais
mais l’activité ne montre pas une corrélation directe.
203
Selon le concept des ‘Hot spots, Hot moments’ (MCCLAIN et al. 2003) les flux
hydrologiques porteur des réactants nécessaires pour la dénitrification sont
variables dans le temps et l’espace ; ce qui génère des pics d’activité localisés et
ponctuels. Les zones fortement connectées à la rivière sont caractérisées par des
flux hydrauliques moyens de 0,63 ± 0,20 et 0,68 ± 0,13 m3 j-1, des variations de
nappe entre 2 et 3 m au moment des crues (WENG et al. 2003). Ces zones ont un
FCOD plus important (41 ± 14 et 45 ± 6 mg h-1) qui pourrait être augmenté
ponctuellement grâce aux crues. D’autre part, l’apport ponctuel du carbone par la
rivière pendant des épisodes de crue et les conditions de faible concentration en
oxygène activent les assemblages bactériens des piézomètres connectés à la
rivière et favorisent l’expression de la dénitrification.
Notre étude montre qu’au cours de la colonisation les changements des

communautés des différents BH sont très importants avec l’apparition de
nouveaux OTU. Cependant, la fréquence d’échantillonnage pourrait paraître trop
faible pour détecter d’éventuelles successions (JACKSON et al. 2001). Elle était
toutefois nécessaire pour disposer d’une biomasse analysable suffisante. Lors de
colonisation, la croissance de biomasse dans les aquifères alluviaux est très
généralement lente et les travaux doivent porter sur des périodes supérieures à un
an (BENNETT et al. 1996 ; GRIEBLER et al. 2002 ; ROBERTS 2004). D’autre part,
nous avons mis en évidence l’importance des génotypes nosZ sur la capacité
dénitrifiante. Des communautés spatialement distantes mais avec une composition
similaire montraient une capacité à dénitrifier similaire. Mais l’intensité de ce
processus dépend aussi des conditions locales (présence de C et N, ou absence
d’oxygène). Le couplage entre la diversité et l’activité a été étudié surtout dans le
sol et ceci constitue un des premiers travaux s’interessant à ce couplage au sein
d’un aquifère.
204
L’analyse complémentaire des séquences 16S ARNr, bien que coûteuse et

longue, aiderait à mieux comprendre l’écologie des agrégats étudiés. La
contribution des apparitions d’espèces dans la dynamique des changements des
communautés pourrait ainsi être reliée aux changements de fonctionnement au
sein du BH. Cependant, le but de notre travail étant de comparer les dynamiques
de communautés bactériennes soumises à des conditions hydrologiques variables
et de coupler ces dynamiques à l’activité observée, la composition taxonomique
précise de chaque communauté n’était pas un objectif. L’analyse des bandes de
DGGE identifiées en tant qu’OTU a constitué un bon compromis.
La complexité hydrologique du système, difficilement abordable, nous a

convaincu de la nécessité d’un retour à des expériences en milieu contrôlé (ex.
colonnes contenant du sables (DODDS et al. 1996) ou billes de verre (PEACOCK et
al. 2004). Un tel travail aiderait à tester les facteurs agissant sur la structuration
des communautés de BH. De plus, nous pourrions reproduire des replicats avec
exactement les mêmes conditions environnementales, ce qui est impossible en
milieu naturel.
Cette partie a traité le cas de BH, et une de nos conclusions est que la
diversité dénitrifiante concorde avec la dénitrification. Les conditions
environnementales du milieu agissent sur l’augmentation de la biomasse de ces
BH et la structuration de communautés bactériennes, ceci détermine la présence
de communautés dénitrifiantes. Dans la dernière partie, nous allons étudier les
communautés dénitrifiantes au sein d’un autre type d’assemblage bactérien, les
biofilms phototrophes. L’objectif est de déterminer si les résultats obtenus pour le
BH sont généralisables à d’autres types de biofilm ou au contraire si la dynamique
et fonctionnement de ces communautés dénitrifiantes sont propres aux biofilms
hétérotrophes de l’aquifère alluvial.
205
Chapitre VI. Relation structure
fonction au sein d’un
d’assemblage phototrophe: BP de
rivière
Dans ce dernier chapitre, nous analysons les communautés du biofilm

phototrophe de rivière avec les outils mis en œuvre sur les biofilms hétérotrophes
de l’aquifère. En complément aux échantillonnages et analyses réalisés
antérieurement (LYAUTEY 2005, MEILLON 2002), notre apport à ce jeu de données
concerne les analyses par typage moléculaire de la diversité β des communautés
dénitrifiante (DGGE nosZ et RT-PCR).
206
Chapitre VI : Composition des communautés dénitrifiantes de biofilm phototrophe
1. Introduction
Les biofilms phototrophes de rivière (BP) sont des assemblages d’algues

microscopiques et bactéries. Principalement considérés comme des assemblages
de producteurs primaires, ils accueilleraient cependant selon certains auteurs
jusqu’à 90% de la biomasse bactérienne de certaines rivières (LOCK 1993)
hébergeant nombre d’activités bactériennes (EDWARDS et al. 1990). Parmi ces
activités, la dénitrification a été régulièrement étudiée (DUFF et al. 1984 ;
PFENNING et MCMAHON 1997 ; TEISSIER et al. 2007). Récemment, l’analyse de la
composition des communautés bactériennes de biofilms phototrophes de rivière a
montré que le développement de populations de bactéries nitrifiantes et
dénitrifiantes obéit à une logique de succession écologique (LYAUTEY et al. 2005).
Ces types fonctionnels de bactéries présentent en effet des aptitudes compétitives
par rapport aux conditions de ressources et d’oxygénation qui règnent dans
l’agrégat. Au rythme de l'alternance jour/nuit, l'activité algale induit en effet un
cycle d'oxygénation qui favorise tour à tour la nitrification, processus aérobie,
durant les phases éclairées et la dénitrification, processus anaérobie, durant les
phases obscures. Le carbone mobilisé par les producteurs primaires peut
également, sous forme d’exsudats photosynthétiques et/ou de lysats cellulaires
soutenir la dénitrification, processus hétérotrophe (SABATER et ROMANI 1996 ;
SOBCZAK 1996). Ainsi observe-t-on que l’activité dénitrifiante est
significativement corrélée à la biomasse de l’agrégat (TEISSIER et al. 2007). Ceci
suggère qu’au sein d’assemblages cohésifs (biofilm vrai), les communautés
algales (microphytes eucaryotes) contrôlent par un couplage fonctionnel la
dynamique de la diversité bactérienne dont la succession est orientée par les
ressources et habitats procurés par les microphytes.
Or les outils que nous avons utilisés pour caractériser la composition des
communautés bactériennes dénitrifiantes des assemblages de l’aquifère permettent
207
d’apporter des éléments de réponse à ces interrogations. Notre travail a donc porté
sur la mise en œuvre d’analyses complémentaires (DGGE et RT-PCR nosZ) sur
des échantillons existants pour lesquels des données concernant les communautés
bactériennes (LYAUTEY 2005) et l’activité de dénitrification (TEISSIER et al. 2007 ;
MEILLON 2002) étaient disponibles.
2. Résultats
L’analyse en composantes principales des données, permet de caractériser

les trois sites dans lesquels les BP ont été échantillonnés. Les deux premiers axes
principaux de l’ACP correspondent respectivement à 45 et 24% de la variabilité
totale (Figure VI.1 a). La plupart des variables expliquent plus de 50% de la
variabilité, à l’exception de la température et la matière sèche (Figure VI.1 b).
L’axe 1 est expliqué par les différentes formes d’azote inorganique (NO2-, NO3-,
NH4+), le phosphore total, les orthophosphates.
Les variables SRP et l’O2. expliquent les différences entre les trois sites
U1, D2 et T (Figure VI.1 c). Le site T est caractérisé par les faibles débits de la
rivière (0,01 m3 s-1) et de fortes concentrations de SiO2 (13,5 mg L-1 en moyenne
versus 4,3 mg L-1 dans le U1 et D2, Mann-Whitney, p<0,05). Les différences
entre U1 et D2 résident plutôt au niveau des nutriments, dont les nitrates, les
niveaux de concentration sont deux fois plus importants en D2 (1,3 mg L-1) par
rapport à U1 (0,7 mg L-1). L’analyse indique que chacun des sites correspond à
des conditions environnementales différenciées.
Les BP soumis à des conditions environnementales variables dans ces

différents sites montrent des biomasses variables. La MSSC est plus élevée en U1
et D2 (12 ± 8 et 13 ± 16 g m-2) qu’en T (2 ± 0,5 g m-2) (Mann-Whitney, p<0,05 ;
Figure VI.2) où les concentrations de nutriments sont supérieures (Tableau VI.1).
208
axe2
axe2
SiO2
NH4+
T SRP
NO2-
O2 TP
NO3-
Cond
axe1
axe1
D2 Temp
U1
MS
MES
4
Q30
(a) (b) 3
(c)
Q
2
Figure VI.1. Analyse en composantes principales des conditions physico-

chimiques des sites U1, D2 et T. Distribution des échantillons dans le plan
factoriel, les points correspondant à chaque site étant regroupés (a), distribution et
contribution de chaque variable à la variance totale (b) et pourcentage de variance
expliquée par chaque axe (c). Temp. : température ; Cond. : conductivité ; NO3- :
nitrates, NO2- : nitrites ; NH4+ :ammonium ; MS : matière sèche ; MES : matière en
suspension ; Q et Q30 : débit journalier et mensuel ; O2 : oxygène dissous ; SiO2 :
silicate ; SRP : phosphore réactif soluble.
Table VI.1. Concentrations en nutriments dans les sites U1, D2 et T (valeurs

moyennes, n=7 en U1, n=12 en D2 et n=4 en T). Les chiffres avec une lettre en commun
ne sont pas significativement différents (test de Mann-Whitney effectué sur les séries de
valeurs brutes, p<0,05).
U1 D2 T
µg L-1
N-NH4+ 17a 239b 3a
N-NO2- 10c 27c 3c
N-NO3- 692d 1154e 569d
SRP 22f 59g 8f
TP 43h 100i 22h
209
20 a a
15
MSSC (g m-2) 10
5
b
0
U1 D2 T
Figure VI.2. Biomasses moyennes des biofilms des sites U1, D2 et T. MSSC :
matière sèche en cendre. Les barres surmontées par une même lettre ne sont pas
statistiquement différentes (test de Mann-Whitney effectué sur les séries de valeurs
brutes, p<0,05).
Les patrons de biomasse dans les différents sites correspondent aux

patrons de DEA-LC avec des taux maximum de 22,6 mg N m-2 h-1 à D2 et
minimum de 0,007 mg N m-2 h-1 à T (Figure VI.3). La DEA-LC était
significativement inférieure dans les BP de T (Mann-Whitney, p<0,05 ; Figure
VI.3).
16
Nombre des cas
U1
12 D2
T
8
(a) (b) 4
6,000 18,0
aa
DEA-CL (mg N m-2 h-1)
DEA-CL (mg N m-2 h-1)
a 0
4,000 K M H
12,0
2,000 a
a
b
b
0,012 1,6
b
0,006 0,8 b
0,000 0,0
U1 D2 T K M H
Figure VI.3. Taux de DEA-LC dans les sites U1, D2 et T (a) et par classe de
biomasse (b). K=biofilm épais, M=biofilm moyen et H=biofilm fin (cf texte). Les barres
surmontées par une même lettre ne sont pas statistiquement différentes (Mann-Whitney,
p<0,05). L’histogramme en haut à droit représente la distribution des prélèvements dans
les trois classes de biomasse.
210
Les DEA-LC moyennes ont été calculées après avoir regroupé les
échantillons non plus en fonction du site où ils ont été prélevés mais en fonction
de leur biomasse. Trois groupes ont été différenciés en fonction de la MSSC : K,
biofilm épais (supérieur 26 g MSSC m-2); M, biofilm intermédiare (entre 7 et 26 g
MSSC m-2) et H, biofilm fin (≤ 7 g MSSC m-2). Les résultats confirment que les
échantillons présentant une biomasse supérieure à 26 g MSSC m-2 présentent une
DEA-LC significativement plus importante (Figure VI.3).
U1 04.04.02
U1 15.02.02
U1 30.04.02
U1 27.08.02
D2 27.08.02
D2 06.08.02
D2 15.02.02
U1 17.09.02
U1 06.11.02
D2 17.01.03
D2 04.03.02
D2 04.04.02
D2 30.04.02
D2 02.07.02
D2 23.07.02
D2 18.09.02
D2 06.11.02
D2 21.03.02
U1 17.01.03
T 25.06.02
T 18.07.02
T 28.08.02
T 26.09.02
% Similarité
DEA-LC 100 50 0
mg N m-2 h-1
22,6 D2 15.02.02
0,4 D2 17.01.02
0,7 D2 18.09.02
9,8 D2 04.03.02
3,9 D2 21.03.02
0,2 D2 02.07.02
0,3 D2 30.04.02
0,03 D2 23.07.02
0,5 D2 06.11.02
0,5 D2 04.04.02
2,6 U1 15.02.02
0,9 U1 30.04.02
0,1 U1 06.11.02
0,1 U1 17.09.02
0,3 U1 04.04.02
0,01 U1 17.01.03
0,2 U1 27.08.02
3,7 D2 27.08.02
2,6 D2 06.08.02
0 T 25.06.02
0,01 T 18.07.02
0 T 28.08.02
0,03 T 26.09.02
Figure VI.4. Photo de deux gels de DGGE nosZ à gauche et dendrogramme

correspondant aux profils de DGGE nosZ à droite. Le dendrogramme est construit
avec la méthode UPGMA à partir des index de distance de Jaccard calculés à partir de la
matrice de présence/absence. La DEA- LC mesurée pour les différents prélèvements est
indiquée.
La composition des communautés dénitrifiantes a été analysée pour les différents

BP aux niveaux intra- et inter-site. Les dendrogrammes correspondant aux profils
211
de DGGE nosZ montrent 3 groupes correspondants aux sites U1, D2 et T (Figure

VI.4). La similarité intra-site (>50%) des profils de DGGE nosZ est plus
importante que la similarité inter-site (<50%). Par contre, on ne met pas en
évidence de regroupement sur la base de la biomasse ou de l’activité de DEA-LC :
les prélèvements U1 15.02.02 ; D2 15.02.02 ; D2 04.03.02, D2 21.03.02, D2
06.08.02 et D2 27.08.02 avec les activités et biomasses les plus élevées se
répartissent dans différents groupes du dendrogramme (Figure VI.4).
La contribution des conditions environnementales et de la biomasse à la

composition des communautés totales (profils de DGGE 16S ARNr) a été
recherchée à l’aide d’une ACoP. Les résultats montrent que la composition des
communautés bactériennes est influencée par les conditions environnementales
(i.e. site de prélèvement) mais pas par la biomasse (Figure VI.5). Ces résultats
sont confirmés aussi dans la ACoP réalisée pour les communautés dénitrifiantes
(profils de DGGE nosZ) (Figure VI.6). La structure des communautés
bactériennes serait donc principalement régie par les conditions qui règnent là où
se développe le biofilm (Figure VI.5).
Afin d’étudier si les communautés totales et dénitrifiantes (16S ARNr et

nosZ) co-varient, une analyse procrustéenne a été réalisée à partir des patrons de
DGGE 16S ARNr et nosZ. Les deux empreintes sont fortement corrélées (r=0,59 ;
p<0,05) (Figure VI.7). Ceci suggère que la dynamique de la diversité génétique du
groupe fonctionnel des communautés dénitrifiantes serait à liée la dynamique de
la diversité taxonomique de la communauté bactérienne.
212
(a) (b)
H
H
(c) (d)
Figure VI.5. Analyse en coordonnées principales par site (a) et par classe de
biomasse (b) appliquée aux distances de Jaccard calculées à partir de la matrice
présence/absence de 16S ARNr. Les histogrammes (c) et (d) représentent les
distributions des variances obtenues lors des simulations de Monte-Carlo (p<0,001). Le
losange noir représente la variance observée ; La variance par site et la variance
associée à la biomasse expliquent respectivement 19,9 % et 11,6% de la variance totale.
K=biofilm épais, M=biofilm intermédiaire et H=biofilm fin (cf texte).
213
(a) (b)
(c) (d)
Figure VI.6. Analyse en coordonnées principales par site (a) et par classe de
biomasse (b) appliquée aux distances de Jaccard calculées à partir de la matrice
présence/absence de nosZ. Les histogrammes (c) et (d) représentent les distributions
des variances obtenues lors des simulations de Monte-Carlo (p<0,001). Le losange noir
représente la variance observée ; La variance par site et la variance associée à la
biomasse expliquent respectivement 24,8% et 11,3% de la variance totale. K=biofilm
épais, M=biofilm intermédiaire et H=biofilm fin (cf texte).
214
(a)
(b)
Figure VI.7. Analyse Procrustéenne des communautés totales et dénitrifiantes à

partir des distances de Jaccard calculées pour les matrices présence/absence de
16S ARNr et nosZ (a) Chaque rectangle correspond à un site et une date différente
(sites : U1, D2 et T). L’histogrammes (b) représente la distribution des variances
obtenues lors des simulations de Monte-Carlo (p<0,001). Le losange noir représente la
variance observée.
215
L’analyse des densités de gènes 16S ARNr et nosZ ne montre pas de différence
significative, par site ou par classe de biomasse, avec des valeurs moyennes de 3,4
- 3,5 x 10-3 et 1,5 - 1,9 x 10-6 copies de gènes par ng ADN pour nosZ et 16S ARNr
respectivement (Mann-Whitney, p < 0,05) (Figure VI.8 a et b). Il n’y aurait pas
« d’enrichissement » en nombre de copie de gène nosZ que l’on puisse relier à
une DEA-LC plus forte par site et ou par classe de biomasse épilithique.
(a) 1e+7 (b) 1e+7

16S a 16S a
Copies des gènes par ng d’ADN

Copies des gènes par ng d’ADN
nosZ a a nosZ
a a
1e+6 1e+6
1e+5 1e+5
1e+4 1e+4 b
b b b b b
1e+3 1e+3
U1 D2 T K M H
Figure VI.8. Densité des gènes 16S ARNr et nosZ dans les biofilms phototrophes
classés par sites (a) et par classe de biomasse (b). Les barres surmontées par une
même lettre ne sont pas statistiquement différentes (Mann-Whitney, p<0,05). K : biofilm
épais , M :biofilm intermédiaire et H : biofilm fin.
Plus largement, la composition du nombre de copies des différents gènes

impliqués dans la dénitrification (nirS, nirK et nosZ) a été comparée au nombre de
copies du gène 16S ARNr. Les résultats montrent cette fois que la proportion des
gènes nirS, nirK et nosZ dans les BP épais est significativement plus forte que
celle observée dans les BP fins (respectivement 8% et 3%) (Figure VI.9 b). Ces
résultats sont en accord avec les patrons de DEA-LC observés en fonction de la
biomasse (Figure VI.3 b). En revanche, aucune différence entre site n’est
observée, la proportion de gènes nirS, nirK et nosZ étant de 6% pour les sites U1
et T et 4% pour le site D2 (Figure VI.9 a). La contribution de chaque gène par site
et par classe de biomasse ne varie que très peu (Figure VI.10) ; le pourcentage de
nosZ reste inférieur à 10%, ceux de nirS et nirK autour de 35 a 45%.
216
(a) (b)
a a a a a b
dénitrifiantes et non dénitrifiantes 100 100
% des copies de gènes
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
U1 D2 T K M H
Figure VI.9. Proportion des gènes dénitrifiants nirS, nirK et nosZ par rapport à la
communauté totale (gènes 16S ARNr) par site (a) et par classe de biomasse (b). Les
barres surmontées par une même lettre ne sont pas statistiquement différentes (Mann-
Whitney, p<0,05). K : biofilm épais, M : biofilm intermédiaire et H : biofilm fin (cf. texte).
U1 D2 T
7 8 6
35 48 nosZ
nirS
(a) nirK
42
51
46
57
K M H
11 4 6
44 39
(b) 45
53 54
44
Figure VI.10. Structure des communautés dénitrifiantes par site (a) et par classe de
biomasse (b) (Proportions relatives à la communauté dénitrifiante). K : biofilm épais, M :
biofilm intermédiaire et H : biofilm fin (cf texte).
Au cours du temps, les proportions des gènes dénitrifiants varient. Sur le site D2,
où le plus de mesures ont été effectuées (n=12), les proportions de nosZ et nirK
sont significativement corrélées à la DEA-LC (corrélation de Spearman r2=0,659
p<0,05 et r2=0,753 p<0,01) (Figure VI.11). En revanche les proportions de nirS
semblent découplées de l’activité de DEA-LC mesurée (corrélation de Spearman,
r2=0,131, p<0,05).
217
25 1,6
nosZ % des copies de
20 gènes dénitrifiantes
1,2
15 DEA-CL
0,8
10
5 0,4
% des copies de gènes dénitrifiantes

DEA-CL mg N m-2 h-1
0 0
25 6
20
nirS 5
15 4
3
10
2
5
1
0 0
25 5
20 nirK
4
15 3
10 2
5 1
0 0
4 mars 02
30 avr 02
6 aout 02
27 aout 02
17 sépt 02
15 fév 02
20 mars 02
4 avr 02
2 jul 02
23 jul 02
6 nov 02
17 jan 03
Figure VI.11. Proportion des gènes dénitrifiants nirS, nirK et nosZ par rapport à la
communauté totale (16S ARNr) et évolution de la DEA-LC au cours du temps dans
le site D2.
218
3. Discussion
Ce chapitre ambitionnait d’aborder par une approche corrélative le lien

entre activité et structure des communautés bactériennes impliquées dans la
dénitrification au sein d’assemblages phototrophes. Les mesures de DEA-LC
utilisées dans ce travail constituent des mesures d’activité bactérienne reflétant la
disponibilité dans l’agrégat des ressources pour les bactéries puisqu’il s’agit de
mesures de DEA réalisées sans ajout de substrat organique. De ce point de vue, il
n’est donc pas surprenant d’observer que l’activité mesurée est significativement
plus forte pour les biofilms les plus « charnus ». Cela indique à la fois une plus
grande quantité d’enzyme de la dénitrification mais également une plus grande
disponibilité en composés susceptibles de soutenir une activité hétérotrophe et
conforte l’idée selon laquelle un basculement de la photoautotrophie à
l’hétérotrophie caractériserait la maturation de ces biofilms (BOULETREAU et al.
2006 ; TEISSIER et al. 2007). Etonnamment, les densités de gènes bactériens 16S
ARNr et nosZ ne reflètent pas ce phénomène. Rappelons cependant que la mesure
directe du nombre de copies d’un gène dénitrifiant ne représente qu’une mesure
d’un potentiel, indépendamment de son niveau d’expression (PHILIPPOT et HALLIN
2005). Cela peut également expliquer le découplage entre les deux mesures.
Au sein d’assemblages de type biofilm, un certain découplage est attendu

entre les organismes constitutifs de l’agrégat et les conditions régnant dans le
milieu où se constitue l’agrégat. C’est l’effet « isolant » du biofilm qui, durant sa
maturation, substitue de nouvelles conditions aux cellules qui le composent.
Pourtant nos résultats en accord avec ceux de (BRÜMMER et al. 2000 ; ARAYA et
al. 2003) ; LYAUTEY et al. 2003) indiquent que la diversité bactérienne de ces
assemblages phototrophes de rivière reflète également les conditions à l’échelle de
la station. Une part de la diversité bactérienne de ces biofilms serait donc
contrôlée par les conditions environnementales. On admet que les BP sont plutôt
219
dépendants des réponses des communautés algales qui elles-mêmes dépendent des
concentrations en nutriments et du régime hydrodynamique de la rivière (BIGGS
1996). La majorité des BP constituant notre jeu de données était des biofilms fins
(12 cas sur 23), les biofilms les plus épais (>26 g MSSC m-2) correspondent aux
sites riches en C, N et P (U1 et D2) où les plus importants taux de DEA-LC
étaient observés. En accord avec LAWRENCE et al. (2004), les biomasses étaient
plus importantes quand les concentrations en nutriments étaient plus élevées. On
peut alors penser que la capacité potentielle à dénitrifier des communautés n’est
pas directement liée à la composition des communautés bactériennes. Or la plus
forte proportion de dénitrifiantes (nosZ + nirS + nirK) au sein des biofilms épais
et la corrélation entre les densités relatives de certains de ces gènes avec la DEA-
LC confirment l’hypothèse selon laquelle les souches dénitrifiantes sont plus
favorisées par les conditions dans l’assemblage, dans le BP épais où la DEA-LC
est plus importante.
Les changements temporels de composition des communautés dénitrifiantes ne se

reflètent pas dans les proportions des types de dénitrifiantes (nirS, nirK et nosZ)
contrairement au BH qui montrait des proportions variables des gènes associés à
la dénitrification au cours de la colonisation. Les gènes nirK sont plus abondants
dans les BP alors que les BH se caractérisent, comme les sols par une faible
densité de gènes nirK (cf. Chapite V et HENRY et al. (2004)). La présence de nirK
pourrait être favorisée par la présence de végétaux (HALLIN, com. pers.). Nos
données étayent cette idée puisque dans ces assemblages où les algues sont
présentes les communautés nirK sont plus importantes.
Si les résultats obtenus dans cette partie sur les facteurs qui structurent les
communautés au sein des différents biofilms naturels sont comparables, la
220
composition des communautés dénitrifiantes pour les deux types d’assemblage

semble différente. La variabilité de la proportion de nirK, nirS et nosZ entre
biofilms hétérotrophe et phototrophe suggère que les communautés ne sont pas
composées des mêmes taxons puisque les différents gènes dénitrifiants sont
associées au niveau phylogénétique à des groupes bactériens différents (PHILIPPOT
2002). Une limite à la comparaison de ces deux types d’assemblage réside dans le
fait que les taxons impliqués dans la dénitrification n’ont pas été identifiés.
Néanmoins dans les deux cas, la dynamique de la diversité génétique du

groupe fonctionnel des communautés dénitrifiantes serait liée la dynamique de la
diversité taxonomique de la communauté bactérienne. Que ces deux diversités
soient emboîtées semble naturel. Mais la question reste posée de savoir jusqu’où
la diversité bactérienne contrôle la diversité dénitrifiante.
Un développement intéressant à ces approches consisterait à distinguer au

sein des communautés dénitrifiantes déjà décrites la part relative des dénitrifiantes
actives et dénitrifiantes non actives dans les deux types d’assemblage étudiés.
Ceci pour rapporter la capacité à dénitrifier aux populations bactériennes actives
et comprendre le déterminisme de l’activation. La Reverse Transcriptase PCR
utilisant des amorces issues de gènes dénitrifiants est une des méthodes
envisageables pour détecter les bactéries actives, celle-ci s’est déjà révélée
adaptée à des milieux avec de fortes activités (NOGALES et al. 2002). Une autre
possibilité serait l’utilisation de la méthode d’Immunocapture Bromodeoxyuridine
(Brdu) pour identifier les bactéries actives en combinaison avec la PCR-DGGE
avec des gènes dénitrifiants. Jusqu’à présent, cette méthode a été utilisée pour
caractériser la fraction active de communautés bactériennes totales (DGGE / gène
16S ARNr) (HAMASAKI et al. 2007), des développements méthodologiques
restent nécessaire pour adapter la méthode à la détection des seules bactéries
dénitrifiantes actives.
221
Conclusion et perspectives générales
Conclusion et perspectives
générales
222
De leur première description à nos jours, les bactéries dénitrifiantes restent les
principales responsables de la transformation - élimination des nitrates dans les
milieux aquatiques, même si d’autres métabolismes bactériens récemment
découverts comme l’anammox et la RDNA, partagent ce rôle (BURGIN et
HAMILTON 2007). Ces processus alternatifs à la dénitrification hétérotrophe seront
opportunément étudiés dans l’avenir, mais des connaissances restent à acquérir
concernant la dénitrification « classique ».
En résumé, nous nous sommes attachés à mesurer l’activité dénitrifiante et

à en décrire et interpréter la variabilité aux niveaux spatial et temporel, en
considérant par différentes approches les communautés bactériennes associées.
Nous avons confirmé l’importance de l’habitat et de la structuration des
assemblages naturels sur l’activité mesurée. Un certain nombre de conditions
doivent être satisfaites pour que cette activité se mette en place. Nous avons
identifié les facteurs les plus structurant à travers un suivi spatio-temporel d’une
année. Comme d’autres, nous avons alors souscrit à l’idée que la dénitrification
est un processus fortement localisé dans le temps et l’espace. La dynamique des
communautés bactériennes impliquées a donc été suivie par une expérience de
colonisation en prenant en compte cette spécificité. Nous avons constaté que les
ressources, probablement limitantes s’agissant du carbone, conditionnent la
structure des communautés, qui semble elle-même liée à leur capacité à
dénitrifier. De façon assez inattendue, nous avons mis en évidence un lien entre la
diversité génétique de gènes impliqués dans la dénitrification et diversité
taxonomique. Nous avons confirmé ce résultat un peu surprenant par l’analyse
d’un autre type d’assemblage microbien de rivière, le biofilm phototrophe. En
filigrane de ce travail, nous avons abordé par une approche corrélative sur des
assemblages naturels, les conséquences fonctionnelles de différences structurelles
223
de communautés (i.e. conséquences des différences de composition sur la capacité

dénitrifiante des communautés).
Pour synthétiser nos conclusions, nous dirions qu’au cours d’un cycle
hydrologique, la répartition spatiale et temporelle de la dènitrification dans
l’aquifère est contrôlée par les facteurs environnementaux de « contrôle
proximal » (sensu WALLENSTEIN et al. (2006)) comme la disponibilité du carbone
organique dissous (HILL et al. 2000). Ces facteurs sont contrôlés par les patrons
hydrologiques de la zone (MCCLAIN et al. 2003). Ainsi les résultats que nous
avons obtenus sur la variabilité spatiale et temporelle de la dénitrification
complètent un jeu de données utile pour la construction de modèles numériques à
venir. En comparant une approche in situ et une mesure au laboratoire du potentiel
de dénitrification, c’est d’abord une inter calibration validant la pertinence de
chaque mesure qui a été réalisée. Ainsi l’approche, au laboratoire, plus simple de
mise en œuvre, permet-elle de recueillir une image satisfaisante des patrons
d’activités. Cependant, la méthode de bloquage à l’acétylène, qui mesure la
production de N2O, ne permet pas de distinguer les différentes origines possibles
de cette production. L’utilisation d’une méthode isotopique utilisant l’isotope 15N
permettrait de suivre les différentes étapes de la dénitrification, d’idéntifier la
proportion d’azote dénitrifié et d’obtenir une dénitrification totale (dénitrification
des nitrates et nitrites diffusés de la colonne d’eau + dénitrification couplée à la
nitrification : Dw+Dn). D’autre part, l’élimination de nitrates dans les systèmes
aquatiques est également réalisée par des processus tels que la RDNA et
l’anammox. Ce dernier est encore peu étudié mais en milieu lacustre est
responsable de ≈13% de la production de N2 (SCHUBERT et al. 2006). La RDNA
est plus importante dans les milieux riches en carbone avec une faible
concentration de nitrates (TIEDJE 1988 ; BONIN 1996) et la dénitrification est
favorisée dans des conditions limitantes en carbone (KELSO et al. 1997). Les
conditions de ressources dans le milieu sont un facteur clef sur l’expression des
224
divers processus capables d’éliminer les nitrates qui seront « en compétition »

dans le même écosystème.
L’activité dépend de la biomasse bactérienne présente dans le sédiment,

ceci suggère l’importance d’intégrer les communautés bactériennes pour expliquer
la répartition (au sens de patchiness) de la dénitrification dans les aquifères
alluviaux. En effet dans les aquifères, la majeure partie des bactéries vivent
attachées au sédiment (HIRSCH et RADES-ROHKOHL 1990 ; LEHMAN et al. 2001) et
ont une capacité métabolique plus importante (LEHMAN et O'CONNELL 2002).
Dans les aquifères confinés et non confinés, les différences entre la composition
des communautés attachées et libres ont été établies (RÖLING et al. 2000 ;
BESEMER et al. 2005). En développant une combinaison des méthodes
d’enrichissement et de PCR-DGGE, utilisée dans d’autres études (JONKERS et
ABED 2003 ; JONKERS et al. 2003 ; RAFIDINARIVO et al. 2007), nous avons
confirmé la différence d’activité et de structure entre les deux fractions « eau » et
« sédiment » de l’aquifère. Ce résultat pose la question des relations entre la
structure de ces communautés et leur capacité de dénitrification. De précédentes
études avaient identifié que l’agrégation d’assemblage microbien en biofilm
expliquait de telles divergences entre fraction libre et fraction fixée des
microorganismes que l’on soit en eau douce (FRIEDRICH et al. 1999) ou en milieu
marin (UNANUE et al. 1992 ; RIEMANN et al. 2000). Nous avons avancé la même
explication : au cours de la maturation d’un biofilm, la formation d’habitats
nouveaux et originaux, comme par exemple la formation de zones anoxiques
favorisera la diversification métabolique de l’assemblage (PAERL et PINCKNEY
1996). Généralement dans tous les biofilms, la maturation de l’agrégat
s’accompagne de changement de composition et de fonctionnement (WATNICK et
KOLTER 2000 ; WIMPENNY et al. 2000). Un modèle de succession a été proposé
pour expliquer ces changements de communautés au sein des biofilms (JACKSON
2003). L’expérience de colonisation que nous avons conduite ne nous a pas
permis de valider ce modèle dans le cas des biofilms hétérotrophes de l’aquifère.
225
La raison en est très probablement que la colonisation par le biofilm a été très
limitée (pas de recouvrement total du support par exemple). Les causes peuvent
être techniques, le choix du verre comme support de colonisation, ou bien plus
écologiques, une durée d’expérimentation insuffisante compte tenu de la
dynamique des apports nutritifs. Néanmoins, comme moyen d’étudier la
dynamique d’installation des communautés (DANG et LOVELL 2000 ; BESEMER et
al. 2007), l’expérience de colonisation que nous avons conduite sur 15 mois
montre une forte hétérogénéité spatiale. Elle est inhérente au fonctionnement d’un
aquifère alluvial. Dans les aquifères, les interactions entre la phase liquide
responsable du transport des bactéries et des réactants, et la fraction sédimentaire,
responsable des transformations biogéochimiques expliqueraient l’apparition de
hotspots. La réussite des dénitrifiantes dans différents milieux a été attribuée à
l’oxygène et au carbone mais pas aux nitrates (TIEDJE 1982). En accord avec ces
conclusions, nos résultats confirment que les zones fortement connectées à la
rivière, qui montrent des apports de carbone plus importants et les plus faibles
taux d’oxygène, expriment une augmentation de la biomasse plus importante et
une communauté dénitrifiante plus similaire par rapport aux zones éloignées de la
rivière. Cette différentiation spatiale des communautés est en accord avec
l’activité dénitrifiante plus importante dans les zones connectées à la rivière, où la
biodisponibilité du carbone est très forte (BRUGGER et al. 2001). « Quelle est la
part des bactéries présentes dans le sédiment, qui sont importées de la rivière via
les flux hydrologiques traversant l’aquifère ? », « Comment se constitue
l’assemblage qui compose le BH ? » sont des questions qui influencent la
structuration des communautés dénitrifiantes auxquelles il conviendrait de
chercher des réponses.
En ce qui concerne la caractérisation des communautés bactériennes

impliquées dans les processus biogéochimiques étudiés, nous avons développé
dans ce travail différentes approches et/ou marqueurs : typage 16S ARNr,
enrichissement par culture sur milieu « dénitrifiantes » couplé à un typage 16S
226
ARNr puis séquençage des OTUs, typage nosZ et enfin détermination par PCR
quantitative de la densité de certains gènes d’intérêt : 16S ADNr, nosZ, nirS et
nirK. La démarche couplant culture d’enrichissement, typage et séquençage des
OTUs, fut la plus satisfaisante car elle nous a permis d’arriver quasiment à l’unité
taxonomique élémentaire, l’espèce. Mais cette démarche est lourde à mettre en
oeuvre. Dans ce travail, nous avons cherché à mettre en relation la composition
des communautés dénitrifiantes avec la dénitrification, sans tenir compte de
l’abondance relative de chaque taxa. Notre choix a été de travailler à l’échelle des
communautés, une échelle écologique adaptée au cas des bactéries, car chez ces
organismes la notion d’espèce reste difficile à manipuler. La technique de typage
que nous avons utilisée est quel que soit le marqueur, 16S ARNr ou nosZ, une
approche fiable et rapide de la β-diversité. Néanmoins, il serait intéressant
d’attribuer à nos séquences une identité spécifique sur la base de leur similarité,
afin de déterminer si les changements des communautés qui affectent l’activité
ont lieu dans des groupes phylogénétiques précis et mieux comprendre la relation
entre la structure de ces communautés et la dénitrification. Si l’on détaille les
marqueurs que nous avons utilisé, ils couvrent des aspects différents de la
diversité bactérienne : diversité génétique d’un gène fonctionnel qui n’a jamais été
retrouvé chez les bactéries gram positives pour nosZ, la diversité taxonomique
d’un vaste domaine, défini au niveau phylogénétique et non plus au plan
fonctionnel pour l’ADNr 16S. La distribution polyphylétique de la capacité de
dénitrification est très probablement la conséquence de transferts latéraux de
gènes dénitrifiants (DANDIE et al. 2006 ; HEYLEN et al. 2006). Malgré ces
distinctions, notre travail a montré une corrélation entre les patrons de diversité
obtenus avec ces deux marqueurs à l’échelle des communautés d’assemblages
naturels : les biofilms hétérotrophes de l’aquifère et les biofilms phototrophes du
lit de la rivière. Un autre niveau d’analyse de ces communautés dénitrifiantes aura
été l’approche par PCR en temps réel. Cette démarche autorise facilement la
comparaison entre différents assemblages naturels. Nous avons vu qu’au sein
d’échantillons de BH prélevés dans l’aquifère alluvial de la Garonne, les
227
communautés dotées de gènes nirK étaient peu présentes, comme dans le sol
(HENRY et al. 2004). Au contraire, dans les BP analysés, ce travail montre des
proportions au moins 10 fois moins importante de dénitrifiantes dotées de nirK.
Les différents gènes dénitrifiants sont associés au niveau phylogénétique à des
groupes bactériens différents (PHILIPPOT 2002) donc les différences de proportion
de chaque type de gène observées se traduisent comme des différences de
composition des communautés dénitrifiantes au sein des BH et BP. Cela montre
également que l’utilisation d’un seul gène participant à la dénitrification comme
nous l’avons fait dans ce travail en ciblant nosZ ne donne qu’une image partielle
de la communauté dénitrifiante. Les développements en cours au niveau
moléculaire – i.e. les travaux de THROBACK et al. (2004) qui a défini les amorces
nirS, nirK et nosZ pour la PCR-DGGE et d’HENRY et al. (2006) pour la
quantification en PCR en temps réel avec nosZ, entre autres –seront très utiles
pour étudier en totalité les communautés dénitrifiantes. Surtout il sera intéressant
d’orienter les études vers les communautés dénitrifiantes actives suivant en cela la
démarche de (NOGALES et al. 2002). Ceci permettra d’avoir une idée de la fraction
active et de sa composition afin de comprendre le déterminisme de leur activation.
La comparaison des deux assemblages nous a permis d’observer les

différences de composition des communautés dénitrifiantes et des similitudes au
niveau des facteurs qui les structurent. Les facteurs environnementaux qui
influencent la structuration des communautés dénitrifiantes au sein de
l’assemblage phototrophe sont en partie les mêmes que dans le BH (le carbone et
l’anoxie). Dans cet assemblage, les algues conditionnent ces paramètres
environnementaux par leur activité photosynthétique et leur croissance
(augmentation des biomasses), ce qui crée des conditions favorables pour
l’apparition des bactéries dénitrifiantes. Les algues dans les BP ont un rôle
« d’ingénieurs de l’écosystème » (JONES et al. 1994). Elargir cette comparaison à
d’autres assemblages comme les communautés bactériennes attachées dans le sol
serait une démarche intéressante. Elle est une suite logique de l’approche
228
corrélative que nous avons suivie pour comprendre la relation entre conditions
environnementales, composition des communautés et capacité de dénitrification.
Cette logique nécessite également la mise en œuvre de techniques de traitement et
d’analyse des données complexes et délicates à mettre en œuvre car elles ne
semblent pas toujours applicables à ce type de jeu de données : beaucoup de
variables, peu de cas observés. Nos résultats acquis en milieu naturel mériteraient
d’être validés en milieu contrôlé, puisque’il est possible que des variables
déterminantes de la structure des communautés n’aient pas été prises en compte
lors de nos analyses. Par exemple le type et la disponibilité du carbone organique
dissous biodégradable sont des variables à considérer comme nos résultats sur la
diversité métabolique le suggèrent. Un protocole expérimental basé sur le rétro-
croisement (transplantation d’une communauté X dans l’environnement de la
communauté Y et vice versa), déjà utilisé précédemment (BALSER et FIRESTONE
2005) serait un moyen intéressant de démontrer la relation entre la composition
des communautés bactériennes avec le fonctionnement de la communauté. Avec
cette première expérience, j’ai été confrontée aux difficultés méthodologiques de
l’échantillonnage en milieu souterrain en terme d’effort physique et de temps
requis. L’aquifère alluvial est un milieu très hétérogène et, contrairement à
l’appréciation généralement admise peut être considéré comme peu stable si l’on
se réfère à l’échelle des communautés microbiennes. Ce constat imposerait donc
dans des travaux ultérieurs une fréquence d’échantillonage plus élevée pour
détecter les fluctuations ponctuelles causées par la rivière, moments clefs qui
peuvent agir sur les communautés bactériennes et leur capacité fonctionnelle. Peu
de descripteurs hydrologiques ont été inclus dans ce travail, ce qui a engendré des
difficultés d’interprétation partiellement résolues en faisant appel à la
bibliographie et au modèle hydrologique décrit précédemment. De plus amples
connaissances sur les infiltrations d’eau de pluie vers l’aquifère alluvial, cause
possible de changement des conditions physico-chimiques dans le système sont
également nécessaires.
229
Toutefois cette étude a démontré l’importance de la composition des

communautés dénitrifiantes sur la répartition de la dénitrification dans l’aquifère
alluvial. Elle constitue une première étape dans la compréhension des relations
structure/fonction (structure des communautés dénitrifiantes/dénitrification) au
sein de cette zone en charge d’un service écologique majeur.
230
Annexes
231
232
233
234
235
Références bibliographiques
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TITLE : Denitrifier community composition in an alluvial aquifer and the
controlling factors of their structuration : relationship between community
structure and denitrification
ABSTRACT
To provide a better understanding of the relationship between denitrifying

bacterial communities composition and denitrification we investigated the
temporal and spatial patterns of denitrification activity inside the alluvial aquifer,
the composition of denitrifying bacterial communities in heterotroph biofilms
from this aquifer and factors that control these communities structuration.
Structural descriptors (PCR-DGGE based on 16S rRNA and nosZ genes, real-time
PCR 16S ARNr, nirS, nirK, nosZ and Biolog-ECO) and functional descriptors
(measure of in situ denitrification and potential denitrification) were used to find a
correlation between structure and function of bacterial communities. Results
shows that structure of these communities and denitrifying activity are linked. It
was shown that denitrification expressed by the bacterial communities depends
upon their habitats which control their structure and ability to denitrify:
communities attached to the sediment and free living communities in suspension
in the groundwater are differentiated. Then, focusing on attached communities, it
was shown that flux of carbon and absence/presence of oxygen, both spatially and
temporally varying according to the connectivity to the river, are the main factors
affecting structure of the denitrifying communities and metabolic diversity of
heterotroph biofilms. By correlating denitrifying bacterial community’s
composition and denitrification in natural bacterial assemblages, this work is a
first step to understand the structure/function relationships that may control
denitrification at the ecosystem scale.
AUTEUR : Amaia IRIBAR
TITRE : Composition des communautés bactériennes dénitrifiantes au sein d’un

aquifère alluvial et facteurs contrôlant leur structuration: relation entre structure
des communautés et dénitrification
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : laboratoire du CEMES - Salle de

conférences - 29, rue Jeanne Marvig - 31400 Toulouse le 26 octobre 2007
RESUME
Ce travail a eu comme objectif d’étudier corrélativement la répartition temporelle

et spatiale de la dénitrification dans un aquifère alluvial, la composition des
communautés bactériennes dénitrifiantes au sein des biofilms hétérotrophes de cet
aquifère et les facteurs qui contrôlent leur structuration. Des descripteurs
structuraux (PCR-DGGE, PCR-en temps 16S ARNr, nirS, nirK, nosZ ; Biolog-
ECO) et des descripteurs fonctionnels (dénitrification in situ et dénitrification
potentielle) ont été utilisés. Il a été démontré que la dénitrification assurée par les
communautés bactériennes dépend de leur habitat qui conditionne leur structure et
leur capacité à dénitrifier : les communautés bactériennes dénitrifiantes des
biofilms hétérotrophes colonisant les particules de sédiment sont les responsables
principales de la dénitrification et ont une composition differente de la celle des
communautés libres dans les eaux souterraines. La structuration des communautés
dénitrifiantes et la diversité métabolique de ces biofilms dépendent des flux de
carbone et la concentration d’oxygène, variables aux niveaux spatial et temporel
en fonction de la connectivité de la zone avec la rivière. En établissant des
corrélations entre composition des communautés bactériennes dénitrifiantes et
dénitrification au sein d’assemblages bactériens naturels, ce travail constitue une
première étape vers la compréhension des relations structure/fonction susceptibles
de régir la dénitrification à l’échelle de l’écosystème.
MOTS-CLES : La Garonne, aquifère alluvial, dénitrification, biofilm,

communauté dénitrifiante.
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : DOC. U. Fonctionnement des

Écosystèmes et Agrosystèmes
INTITULE ET ADRESSE DE L’U.F.R. ET DU LABORATOIRE : U.F.R.

Sciences de la Vie et la Terre, Laboratoire d’Ecologie Fonctionnelle ECOLAB
UMR 5245 (CNRS-UPS-INPT)

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UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER

U.F.R. SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

Ecole doctorale Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Discipline : Ecologie Microbienne

Composition des communautés bactériennes dénitrifiantes au sein

Jose Miguel SÁNCHEZ-PÉREZ et Frédéric GARABETIAN

Je remercie Monsieur Jean Luc Rols, Directeur du Laboratoire d’Ecologie des

Je remercie également Madame Josette Garnier du laboratoire de Structure et

Je remercie Madame Sara Hallin de m’avoir accueillie au sein de son groupe du

Je garde un place particulière à Estéphanie Boulêtreau et Frédéric Santoul, pour leur

Chapitre I. Relation entre la composition des communautés bactériennes et le

1. Les communautés bactériennes.......................................................................... 15

3.3.1. Les aquifères alluviaux et leur fonctionnement ................................... 37

Chapitre II. Méthodologies...................................................................................... 42

1. Les Biofilms hétérotrophes (BH) de l’aquifère alluvial..................................... 43

1.6.2.1. Enrichissement des bactéries dénitrifiantes................................... 62

Chapitre III. Variabilité spatio-temporelle des processus de la dénitrification

2.2. Variabilité spatiale de la dénitrification au sein du sédiment alluvial (DNT

Chapitre IV. Rôle fonctionnel des communautés bactériennes attachées et libres

1. Introduction ...................................................................................................... 109

Chapitre V. Etude de la structuration des communautés bactériennes attachées

1. Introduction ...................................................................................................... 158

5. Discussion ........................................................................................................ 200

Chapitre VI. Relation structure fonction au sein d’un

1. Introduction ...................................................................................................... 207

Conclusion et perspectives générales.................................................................... 223

Liste des abréviations

L’intervention de l’Homme sur le cycle de l’azote a continuellement

La dénitrification complète consiste en la réduction des nitrates (NO3-) en

structuration ? Quelles est la relation entre la composition des ces communautés et la

Une nouvelle voie en Ecologie fonctionnelle consiste à décrire comment

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