Caractérisations Chimiques Et Biologiques D'extraits de Plantes Aromatiques

THSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE LUNIVERSIT DE TOULOUSE

Dlivr par lInstitut National Polytechnique de Toulouse Discipline ou spcialit : Sciences des Agroressources
Prsente et soutenue par Chaker EL KALAMOUNI Le 13 Dcembre 2010
Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes
JURY
Mme. Isabelle FOURAST M. Brahim MARZOUK Mme. Chantal MENUT Mme. Christine RAYNAUD M. Thierry TALOU M. Roland VEHR M.P.Rimantas VENSKUTONIS Professeur, Universit de Toulouse III Professeur, Centre de Biotechnologie, Tunisie Professeur, Universit Montpellier II Ingnieur de recherche, INP de Toulouse Ingnieur de recherche, INP de Toulouse Professeur, Ghent University, Belgique Professeur, Kaunas Univ of Technology, Lituanie Prsident Rapporteur Rapporteur Membre Membre Membre Membre
Ecole doctorale : Sciences de la Matire Unit de Recherche : Laboratoire de Chimie Agro-Industrielle Directeurs de Thse : Thierry TALOU et Christine RAYNAUD
A la mmoire de ma grand mre que dieu repose son me en paix A mes parents que dieu protge En tmoignage de ma profonde affection. Quils sachent que ce travail est en partie le fruit de leur soutien ; je leur suis trs reconnaissant. Leur fiert mon gard aujourdhui est pour moi la meilleure des rcompenses A Salma mon pouse qui ma toujours encourag
Madame Elisabeth BORREDON, je vous remercie pour votre accueil chaleureux au sein de votre laboratoire de recherche. Christine, merci pour votre disponibilit tout au long de ma thse et pour tout ce que vous mavez appris en chimie analytique notamment sur techniques chromatographiques. Merci de mavoir consacr du temps pour corriger ma thse, Vous mavez guid pendant ces quatre annes et clair sur les voies les plus intressantes prendre. Ce travail naurait pas t le mme sans votre encadrement. Thierry, merci de mavoir encourag afin de prendre des dcisions importantes dans ma vie professionnelle. Merci de mavoir fait autant voyager durant ma thse, Autriche, Lituanie et Grce et de mavoir fait participer des congrs internationaux, cela ma permis dchanger sur mes travaux de recherche. Jai apprci beaucoup votre amiti, votre dynamisme et votre bonne humeur tout au long de ma thse. Je tiens remercier le Professeur Rimantas VENSKUTONIS, de mavoir accueilli au sein de son laboratoire en Lituanie pour effectuer une bonne partie de ce travail. Je le remercie vivement pour sa collaboration et sa prsence parmi les jurys. Je remercie Professeur Isabelle FOURAST pour son aide botanique, et pour les sorties que nous avons effectu ensemble pour ramasser les plantes. Je la remercie pour sa prsence parmi les jurys. Je remercie Madame Chantal MENUT Professeur lUniversit de Montpellier, qui a bien voulu examiner ce manuscrit et juger ce travail. Je remercie Monsieur Brahim MARZOUK Professeur au centre de Biotechnologie de Borj-cdria en Tunisie, qui a bien voulu examiner ce manuscrit et pour sa prsence parmi les jurys. Je remercie Madame An ADAMS Professeur lUniversit de Gand, davoir accept notre invitation pour participer ce jury de thse.
Merci Graldine GIACINTI pour sa patience et ses conseils concernant la partie analytique. Jai beaucoup apprci sa disponibilit et ses conseils aviss. Merci Laure CANDY de mavoir aid durant les moments difficiles Je tiens remercier lensemble du personnel du laboratoire pour leur convivialit, Mireille, Isabelle, Karine, Marie-Christine, Emmanuelle, Didier et Anne pour leur disponibilit. Aux autres doctorants et collgues, bon courage pour la suite Merci mes proches notamment mes parents, ma belle famille, mes deux surs Abir et Stphanie, mes deux frres Nasser et Omar Sans vous, rien naurait possible, merci de votre soutien moral et de votre amour Enfin mes remerciements sont particulirement adresss Salma, mon pouse, qui est la personne la plus importante mon cur, de mavoir soutenu et patiemment rconfort et encourag durant ces quatre annes, qui ne pourront que rester inoubliables pour nous.
Table des matires

INTRODUCTION GENERALE .........................................................................................2 CHAPITRE I ........................................................................................................................5 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...........................................................................................5
Introduction........................................................................................................................................................... 7 I . Plantes aromatiques mdivales de la rgion de Midi-Pyrnes .................................................................. 9 I.1 . Historique.................................................................................................................................................... 9 I.2 . Les Milieux relictuels.................................................................................................................................. 9 I.3 . Notion de raret..........................................................................................................................................10 I.4 . Distribution botanique et mondiale des plantes aromatiques mdivales. .................................................10 I.4.1 . Famille des Astraces : morphologie, date dintroduction et distribution. .......................................10 I.4.2 . Famille des Lamiace : morphologie, date dintroduction et distribution ..........................................11 I.4.3 . Famille des Apiaces : morphologie, date dintroduction et distribution...........................................11 I.5 . Dmarche bibliographique de slection des plantes...................................................................................12 II . Etude bibliographique des cinq plantes aromatiques mdivales slectionnes.......................................22 II.1 . Achillea millefolium : informations botaniques, structurales et culturales................................................22 II.1.1 . Noms et origine.................................................................................................................................23 II.1.2 . Distribution nationale........................................................................................................................23 II.1.3 . Usage tonique stomachique ..............................................................................................................23 II.1.4 . Usage hmostatique ..........................................................................................................................24 II.1.5 . Usage emmnagogue ........................................................................................................................24 II.1.6 . Autres usages ....................................................................................................................................24 II.1.7 . Proprits physicochimiques et biologiques .....................................................................................25 II.2 . Tanacetum balsamita : informations botaniques, structurales et culturales..............................................26 II.2.1 . Noms et origine.................................................................................................................................27 II.2.2 . Distribution nationale........................................................................................................................27 II.2.3 . Diverses proprits............................................................................................................................27 II.2.4 . Usage pharmacologique....................................................................................................................28 II.2.5 . Usages divers ....................................................................................................................................28 II.2.6 . Cultures.............................................................................................................................................29 II.2.7 . Proprits physicochimiques et biologiques .....................................................................................29 II.3 . Calamintha grandiflora : informations botaniques, structurales et culturales ..........................................32 II.3.1 . Noms et origine................................................................................................................................33 II.3.2 . Distribution nationale........................................................................................................................33 II.3.3 . Historique de la dcouverte du Th dAubrac dans les Pyrnes .....................................................34 II.3.4 . Ecologie ............................................................................................................................................34 II.3.5 . Proprits physicochimiques et biologiques .....................................................................................35 II.4 . Myrrhis odorata : informations botaniques, structurales et culturales......................................................36 II.4.1 . Noms et origine.................................................................................................................................37 II.4.2 . Distribution nationale........................................................................................................................37 II.4.3 . Diverses proprits............................................................................................................................38 II.4.4 . Usages divers ....................................................................................................................................38 II.4.5 . Proprits physicochimiques et biologiques .....................................................................................38 II.5 . Monarda didyma : informations botaniques, structurales et culturales ....................................................40 II.5.1 . Noms et origine.................................................................................................................................41 II.5.2 . Distribution nationale........................................................................................................................41 II.5.3 . Diverses proprits............................................................................................................................41 II.5.4 . Usages divers ....................................................................................................................................41 II.5.5 . Proprits physicochimiques et biologiques .....................................................................................42

III . Techniques dextraction des fractions volatiles .........................................................................................43 III.1 . Techniques dextraction des huiles essentielles ......................................................................................43 III.1.1 . Hydrodistillation..............................................................................................................................43 III.1.2 . Hydrodistillation-extraction simultane ..........................................................................................44 III.2 . Techniques dextraction des composs organiques volatils (COV) .......................................................45 III.2.1 . Espace de tte statique (atmosphre confine) ................................................................................45 III.2.2 . Espace de tte dynamique................................................................................................................46 III.2.3 . Espace de tte pseudo-dynamique ...................................................................................................46 IV . Composition chimique des plantes aromatiques ........................................................................................47 IV.1 . Fraction volatile des plantes aromatiques ...............................................................................................48 IV.1.1 . Localisation et structure histologique des huiles essentielles ..........................................................49 IV.1.2 . Phnomnes physico-chimiques et facteurs produisant laltration des huiles essentielles ............50 V . Mthodes didentification chimique des huiles essentielles ........................................................................51 V.1 . Chromatographie en phase gazeuse monodimensionnelle .......................................................................52 V.2 . Chromatographie en phase gazeuse couple lolfactomtrie (CPG/O)..................................................52 V.3 . Chromatographie en phase gazeuse deux dimensions ...........................................................................53 V.3.1 . Chromatographie deux dimensions heart-cutting CPG/SM ...........................................................53 V.3.2 . Chromatographie totale CPG-2D......................................................................................................54 VI . Activits biologiques des plantes aromatiques ...........................................................................................54 VI.1 . Gnralits ..............................................................................................................................................54 VI.2 . Technique dextraction des antioxydants ................................................................................................56 VI.3 . Activits antioxydantes des plantes aromatiques : huiles essentielles, extraits aromatiques...................56 VI.3.1 . Oxydation et auto oxydation ...........................................................................................................56 VI.3.2 . Les antioxydants..............................................................................................................................58 VI.3.3 . Division des antioxydants par rapport leur mcanisme daction ..................................................59 VI.3.4 . Division des antioxydants suivant la nature chimique (naturel et synthtique)...............................60 VII . Mthodes dvaluation de lactivit antioxydante ....................................................................................63 VII.1 . Gnralits .............................................................................................................................................63 VII.2 . Quelques mthodes dvaluation de lactivit antioxydante..................................................................64 VIII . Huiles essentielles comme agents antimicrobiens ...................................................................................69 VIII.1 . Gnralits............................................................................................................................................69 VIII.2 . Mode daction contre les bactries .......................................................................................................70 IX . Mthode dvaluation de lactivit antibactrienne...................................................................................70 IX.1 . Technique en milieu solide (mthode de la diffusion en disque) ............................................................70 IX.2 . Technique en milieu liquide (mthode de dilution) ................................................................................71 IX.2.1 . La dilution en bouillon ....................................................................................................................71 IX.2.2 . La dilution en glose .......................................................................................................................71
CHAPITRE II.....................................................................................................................72 CARACTERISATION DES COMPOSES ORGANIQUES VOLATILS DE CINQ PLANTES AROMATIQUES MEDIEVALES ; EVALUATION DE LACTIVITE BIOLOGIQUE DES HUILES ESSENTIELLES ET DES RESIDUS DHYDRODISTILLATION ..............................................................................................72
Rsum ..................................................................................................................................................................74 Introduction..........................................................................................................................................................75 I . Composition chimique des huiles essentielles................................................................................................76 I.1 . Achillea millefolium : caractrisation de la fraction volatile des parties ariennes ....................................76

Etude cintique de lextraction par hydrodistillation dAchillea millefolium ....................................................76 I.1.1 . Composition chimique de lhuile essentielle dAchillea millefolium et discussion............................77 I.2 . Calamintha grandiflora : caractrisation des extraits des tiges et des feuilles...........................................82 I.2.1 . Composition chimique de lhuile essentielle de Calamintha grandiflora et discussion.....................82 I.3 . Tanacetum balsamita : caractrisation des extraits des tiges et des feuilles ..............................................85 I.3.1 . Composition chimique de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita et discussion ........................86 I.4 . Myrrhis odorata : caractrisation chimique des tiges et des feuilles .........................................................93 I.4.1 . Composition chimique de lhuile essentielle de Myrrhis odorata et discussion ................................93 I.5 . Monarda didyma : caractrisation chimique des tiges et des feuilles ........................................................96 I.5.1 . Composition chimique de lhuile essentielle de Monarda didyma et discussion ..............................96 II . Caractrisation sensorielle des huiles essentielles des cinq plantes aromatiques : Achillea millefolium, Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata et Monarda didyma .....................................99 II.1 . Pyramides Olfactives ................................................................................................................................99 II.1.1 . Les notes de tte................................................................................................................................99 II.1.2 . Les notes de cur..............................................................................................................................99 II.1.3 . Les notes de Fond .............................................................................................................................99 II.2 . Ralisation des Pyramides Olfactives.....................................................................................................100 II.2.1 . Pyramides Olfactives des 5 huiles essentielles des plantes aromatiques selectionnes ..................100 II.3 . Activit odorante des composs organiques volatils value par CPG-Olfactomtrie ...........................101 II.3.1 . Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE dAchillea millefolium ................................102 II.3.2 . Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Calamintha grandiflora .........................103 II.3.3 . Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Tanacetum balsamita.............................104 II.3.4 . Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Myrrhis odorata.....................................105 II.3.5 . Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Monarda didyma ...................................106 III . Activits biologiques des huiles essentielles et des rsidus de lhydrodistillation..................................107 III.1 . Introduction sur lactivit antioxydante.................................................................................................107 III.2 . Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles ................................................................108 III.2.1 . Evaluation de lactivit antioxydante des HE en utilisant la mthode Oxipress............................108 III.2.2 . Evaluation de lactivit antioxydante des HE via des mthodes spectrophotomtriques (dines et trines conjugues) .....................................................................................................................................115 III.3 . Evaluation de lactivit antioxydante des rsidus dhydrodistillation des 5 plantes aromatiques par la mthode de DPPH ...........................................................................................................................................120 III.3.1 . Principe de la mthode de DPPH...................................................................................................120 III.3.2 . Comparaison des activits antioxydantes des rsidus dhydrodistillation mesures par la mthode de DPPH. ....................................................................................................................................................123 III.4 . Evaluation de lactivit antibactrienne des huiles essentielles.............................................................126 III.4.1 . Evaluation de lactivit antibactrienne en utilisant la mthode de diffusion sur Agar.................127 III.4.2 . Evaluation de lactivit antibactrienne en utilisant la mthode de plaque de micro titrage. ........130
CHAPITRE III :...............................................................................................................132 MISE EN PLACE DUNE METHODOLOGIE INSTRUMENTALISEE DE CARACTERISATION RAPIDE DES HUILES ESSENTIELLES NATIVES ; APPLICATION PRE-INDUSTRIELLE A LAROMATISATION DES HUILES VEGETALES PAR LES PLANTES AROMATIQUES .................................................132
Rsum :..............................................................................................................................................................134 Partie I. Voie analytique ....................................................................................................................................135 Introduction : .....................................................................................................................................................135 (A) Premire approche analytique base sur une technique dchantillonnage classique couple un systme de sparation/dtection sophistiqu....................................................................................................136

I . Analyses des COVs mis par les feuilles par lintermdiaire de la CPG bidimensionnelle. ...................136 I.1 . Principe de la CPG bidimensionnelle ......................................................................................................136 I.1.1 . Sparations orthogonales..................................................................................................................137 I.2 . Matriels et mthodes ..............................................................................................................................138 I.2.1 . Echantillons......................................................................................................................................138 I.2.2 . Extraction des COV par SPME ........................................................................................................138 I.2.3 . Analyses chromatographiques des COVs par CPG-2D....................................................................138 II . Rsultats de lextraction et de lanalyse des COVs des feuilles de Tanacetum balsamita par SPME/CPG-2D...................................................................................................................................................139 (B) Deuxime approche analytique base sur un systme dchantillonnage coupl un systme de sparation/dtection classique...........................................................................................................................142 I . Description du systme..................................................................................................................................142 II . Comparaison du profil aromatique de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita et du profil CFDDHS/GC de la plante..........................................................................................................................................143 II.1 . Matriel et Mthodes ..............................................................................................................................143 II.1.1 . Concentration des COV par Headspace dynamique .......................................................................143 II.1.2 . Concentration des COV dune feuille non froisse par Headspace dynamique..............................144 II.1.3 . Isolement de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita ...............................................................144 II.1.4 . Analyses chromatographiques des extraits .....................................................................................144 II.2 . Rsultats de la comparaison entre une huile essentielle extraite par hydrodistillation et une huile essentielle native .............................................................................................................................................144 III . Conception dune cellule dextraction ddie CFD couple un systme de pigeage Headspace dynamique et semi-statique ...............................................................................................................................148 IV . Application du systme CFD lanalyse de la fraction volatile de Calamintha grandiflora ................149 IV.1 . Analyses chromatographiques...............................................................................................................149 IV.2 . Optimisation des conditions dextractions par CFD-SPME ou CFD-DHS...........................................149 IV.2.1 . Choix des fibres SPME : cintique dadsorption et dabsorption de la pulegone..........................149 IV.2.2 . Optimisation du froissement du vgtal ........................................................................................151 IV.2.3 . Observation microscopique au niveau du limbe des feuilles.........................................................151 IV.2.4 . Comparaison des fractions volatiles extraites par CFD-SPME et CFD-DHS et de lhuile essentielle ....................................................................................................................................................................152 Conclusion Partie I.............................................................................................................................................154 Partie II : Approche prindustrielle de laromatisation des huiles vgtales par les plantes aromatiques155 Introduction........................................................................................................................................................155 I . Matriels et mthodes....................................................................................................................................156 I.1 . Huile de tournesol ....................................................................................................................................156 I.2 . Prparation des chantillons feuilles fraches infuses dans lhuile de tournesol : HI.FF........................157 I.2.1 . Optimisation du temps dexposition de lhuile infuse et soumise aux ultrasons ............................158 I.2.2 . Prparation des infusions de plantes aromatiques fraches dans lhuile de tournesol ......................161 I.3 . Prparation dinfusions de plantes aromatiques sches dans lhuile de tournesol : HI.FS .....................161 I.4 . Prparation des infusions de plantes aromatiques sches et dhuile essentielle HI.HE.FS ....................163 I.5 . Analyses de lespace de tte des huiles infuses......................................................................................163 I.5.1 . Fibre SPME, choix de la fibre et conditionnement ..........................................................................163 I.5.2 . Prparation des huiles infuses analyser : extraction des COVs ...................................................163 I.5.3 . Analyse chromatographique des chantillons des huiles infuses ou aromatises...........................164 II . Rsultats et interprtations .........................................................................................................................164 II.1 . Evolution de la concentration des COVs mis des huiles aromatises ou infuses en fonction du temps .........................................................................................................................................................................164

II.1.1 . Evolution de la quantit de tanacetone dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par les feuilles sches de la Balsamite et son HE .................................................................................................164 II.1.2 . Evolution de la quantit du camphre (exprime par laire du pic ) dans d'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par les feuilles schs dA. millefolium et son HE ....................................................165 II.1.3 . Evolution, de la quantit de tanacetone dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par les feuilles fraches de Balsamite................................................................................................................165 II.1.4 . Evolution de la quantit de tanactone dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par les feuilles sches de la Balsamite..................................................................................................................166 II.2 . Rsultats de laromatisation par infusion de matire vgtale et par ajout dHE dans les huiles vgtales .........................................................................................................................................................................167 II.2.1 . Huile de tournesol aromatise par lHE dAchillea millefolium .....................................................168 II.2.2 . Huile de tournesol aromatise par lHE de Calamintha grandiflora ..............................................170 II.2.3 . Huile de tournesol aromatise par lHE de Tanacetum balsamita ..................................................172 II.2.4 . Huile de tournesol aromatise par lHE de Myrrhis odorata ..........................................................174 II.2.5 . Huile de tournesol aromatise par lHE de Monarda didyma .........................................................175 Conclusion Partie II ...........................................................................................................................................177
CONCLUSION GENERALE ..........................................................................................179 PARTIE EXPERIMENTALE .........................................................................................187

I . Techniques dextraction des huiles essentielles...........................................................................................189 I.1 . Diffrentes techniques dextraction des huiles essentielles......................................................................189 I.1.1 . Entranement la vapeur..................................................................................................................189 I.1.2 . Hydrodistillation ..............................................................................................................................192 Calcul de la teneur en matire sche et du rendement en huile essentielle.................................................192 I.1.3 . Hydrodistillation dAchillea millefolium ..........................................................................................194 I.1.4 . Hydrodistillation de Calamintha grandiflora ...................................................................................194 I.1.5 . Hydrodistillation de Tanacetum balsamita ......................................................................................195 I.1.6 . Hydrodistillation de Myrrhis odorata ..............................................................................................195 I.1.7 . Hydrodistillation de Monarda didyma .............................................................................................195 I.2 . Extraction des composs organiques volatils (COVs) .............................................................................195 I.2.1 . Microextraction en phase solide (SPME).........................................................................................195 I.2.2 . Choix de la fibre SPME ...................................................................................................................197 II . Analyses chimiques et sensorielles des huiles essentielles et des COVs ...................................................197 II.1 . Analyse par chromatographie phase gazeuse .........................................................................................197 II.1.1 . Dtecteurs .......................................................................................................................................198 II.2 . Les mthodes couples ...........................................................................................................................199 II.2.1 . Chromatographie en phase gazeuse / spectromtrie de masse ........................................................199 II.2.2 . Protocoles des analyses quantitatives et qualitatives des huiles essentielles...................................199 II.2.3 . Chromatographie en phase gazeuse / olfactomtrie (CPG/O).........................................................200 II.3 . Etablissement des pyramides olfactives..................................................................................................200 III . Extraction des antioxydants partir des rsidus dhydrodistillation ....................................................201 III.1 . Principe dextraction par soxhlet...........................................................................................................201 III.2 . Extraction des antioxydants...................................................................................................................202 IV . Evaluation de lactivit antioxydante des rsidus dhydrodistillation par la mthode de DPPH ........202 IV.1 . Prparation des chantillons doser .....................................................................................................202 IV.2 . Dosage spectrophptomtrique par la mthode du DPPH des solutions issues des rsidus dhydrodistillation ...........................................................................................................................................203 IV.2.1 . Calcul du pourcentage dinhibition (%I) et de la concentration inhibitrice minimale (IC50).........203 V . Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles ....................................................................204 V.1 . Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles par la mthode Oxipress..........................204

V.2 . Evaluation de lactivit antioxydante de lhuile essentielle par des mthodes spectroscopiques (dines et trines conjugus)............................................................................................................................................206 VI . Evaluation de lactivit antimicrobienne ..................................................................................................207 VI.1 . Evaluation de lactivit bactricide par la mthode de diffusion sur Agar............................................207 VI.2 . Evaluation de lactivit antimicrobienne par la mthode de micro dilution..........................................207
RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................209

Liste des Tableaux..............................................................................................................................................225 Publications et participation des congrs......................................................................................................227
Introduction
Introduction Gnrale
Introduction
Introduction La rgion franaise de Midi-Pyrnes possde une flore riche et peu valorise. Les environs dune grande rgion comme la rgion Midi-Pyrnes sont soumis de fortes pressions foncires comme le dveloppement de lhabitat rsidentiel, la progression et le renforcement des infrastructures et labandon de certaines pratiques agricoles. Les espaces qui abritaient traditionnellement une vgtation riche et diversifie ont tendance rgresser. Parmi cette vgtation qui se rarfie, on trouve les plantes aromatiques mdivales traditionnellement utilises par nos anctres pour laromatisation des aliments, les arts culinaires et les vertus mdicinales. Ces plantes ne sont pas valorises dun point de vue de leur potentiel chimique sensoriel ou biologique. Les plantes aromatiques sont prometteuses et constituent une grande source dantioxydants et dantibactriens naturels pour lindustrie agroalimentaire. En effet, loxydation des lipides dans les produits alimentaires induit non seulement une diminution de la valeur nutritive de laliment, mais aussi des effets reconnus nuisibles pour le consommateur et qui peuvent tre associs des risques de cancer chez lhomme. La prsence dantioxydants dans lalimentation est devenue essentielle pour la qualit et la scurit de laliment. Les effets ngatifs des antioxydants synthtiques encouragent leur substitution par des agents naturels. Diffrentes plantes aromatiques sont caractrises par la biosynthse de molcules odorantes qui constituent ce quon appelle les huiles essentielles (HE) connues depuis longtemps pour leur activit antiseptique et thrapeutique dans la mdecine populaire. La composition chimique des HE est assez complexe, les composs terpniques et aromatiques reprsentant les principaux constituants. On y trouve galement, et en faibles concentrations des acides organiques, des ctones et des coumarines volatiles. La nature de la fonction chimique du compos majoritaire (phnol, alcool, aldhyde, ctone) joue un rle prpondrant dans lefficacit de leurs activits biologiques. Les plantes mdicinales et aromatiques sont utilises depuis longtemps dans le processus de stress oxydatif et la lutte contre les maladies infectieuses. Mais la dcouverte des antioxydants synthtiques et des antibiotiques a provoqu le dclin de la mdecine base de plantes et la relgue un rang secondaire. Ceci nous a amen nous pencher sur ltude des activits odorante, antioxydante et antimicrobienne dextraits de plantes aromatiques oublies de la rgion de Midi-Pyrnes. Ce sujet nous a sembl dautant plus intressant que la flore des Pyrnes est extrmement riche en plantes aromatiques riches en huiles essentielles.
Introduction Dans le premier chapitre de ce manuscrit, nous avons recens une centaine de plantes aromatiques rgionales, partir desquelles nous avons slectionn, selon diffrents critres, cinq plantes aromatiques mdivales : Achillea millefolium, Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata et Monarda didyma. Le deuxime chapitre est consacr lappliation du principe dagro-raffinage sur les 5 plantes. Pour cela, des extractions de fractions volatiles (huile essentielle) et de fractions non volatiles (rsidu dhydrodistillation) ont t effectues. Des tudes physico-chimiques, sensorielles et biologiques des extraits obtenus ont t ralises pour caractriser les mtabolites secondaires prsents et juger de lintrt des fractions. Dans le troisime chapitre, du fait de la raret du vgtal tudi, nous nous sommes intress deux approches dvaluation rapide du potentiel aromatique des plantes huile essentielle ; dans un premier temps, au moyen dun chantillonnage classique coupl un dtecteur forte sensibilit comme la chromatographie bidimensionnelle et dans un second temps par un chantillonnage spcifique coupl un dtecteur classique pour lequel nous avons dvelopp un appareillage novateur dnomm Crushing Finger Device . Enfin, nous avons tudi la faisabilit dune application prindustrielle agroalimentaire des cinq plantes aromatiques. Des tudes doptimisation dinfusion et daromatisation dhuiles vgtales par leurs huiles essentielles ont t dveloppes dans cette dernire partie du chapitre.
Chapitre I : Etude Bibliographique
Chapitre I
Etude bibliographique
Introduction
La rglementation REACH met diffrents textes en vigueur pour les substances et prparations chimiques. Ces textes comprennent les rgles qui ont prvalu pour les propositions de classement de l'EFFA (European Flavor and Fragrance Association) en collaboration avec l'EFEO (European Federation of Essential Oils). L'industrie propose donc une harmonisation des classements pour qu'il n'y ait pas de facteur de concurrence sur des lments de scurit. Les huiles essentielles sont classes sur la base de rsultats de tests directs sur leurs proprits physiques, chimiques, toxicologiques et cotoxicologiques. Cependant, de nombreux rsultats ne sont pas disponibles ou trop anciens ou imprcis pour tre valables. En 2002, le comit du Codex alimentaire a transmis des normes de catgorie I concernant les
additifs alimentaires ainsi que les aromatisants la Commission afin quelles soient adoptes en tant que normes consultatives du Codex. Sur 60 normes dadditifs alimentaires, 42 normes dantiagglutinants (6), dexhausteurs darmes (17), ddulcorants (11) ainsi que dpaississants (8) ont t transmises afin dadopter de nouvelles limites concernant des mtaux lourds spcifiques comme le plomb et larsenic.
En 2009, ce mme comit a mis 342 spcifications, dont 317 pour des aromatisants et 25 pour des additifs alimentaires; 2 spcifications ont t retires. De plus, 50 additifs alimentaires ont t rviss (anti-agglomrants, aromatisants, dulcorants, paississants) pour leur teneur en mtaux lourds. Les consquences de ces classements vont conduire d'aprs l'EFFA la disparition force de 20% des formulations aromatisantes existantes, voire la remise en cause du concept d'aromatisant Identique-Nature. Ceci va donc accrotre la demande industrielle pour les aromatisants naturels, en particulier ceux labelliss WONF (With Other Natural Flavor), conomiquement plus rentables. Les agents aromatisants sont des molcules chimiquement dfinies pouvant tre naturelles lorsquextraites de plantes ou identiques aux naturelles lorsquon synthtise chimiquement une substance dj prsente dans une source naturelle. Enfin, elles peuvent aussi tre artificielles lorsquon synthtise des molcules qui ne sont pas prsentes dans la nature. Dautres procds sont mis en uvre dans la cration de nouveaux armes tels que les armes de Maillard et les armes de fume.
Chapitre I : Etude Bibliographique Prparations aromatisantes procd physique ou biotechnologique Naturels
Substances aromatisantes isoles & chimiquement dfinies Naturelles procd physique ou biotechnologique Identiques aux naturelles Artificielles
Synthse chimique
Armes de transformation Armes de Maillard
Armes de fume Extraits de fume (Rglement 2065/2003) Dans le cadre de la recherche de nouveaux aromatisants naturels type WONF (Identiques aux naturelles), et afin de combler la diminution rglementaire des aromatisants naturels prsents sur le march, il existe deux diffrentes voies de prospection. La premire voie concerne lexploitation du potentiel aromatique des plantes exotiques rares. Par exemple, les socits de secteur de lindustrie aromatique ont depuis quelques annes entrepris plusieurs expditions en Amrique du Sud ainsi quen Afrique occidentale (Neblina, IFF, Yves Rocher et TasteTrek, Givaudan) la recherche de nouvelles fragrances et saveurs La deuxime voie est la valorisation des plantes aromatiques mdivales ; ces dernires ne sont plus cultives et poussent ltat sauvage. Rares sont les tudes scientifiques ayant mis en vidence leurs potentiels aromatiques ou biologiques afin de favoriser leur culture parce quelles sont devenues menaces voire rares en fonction des rgions. Lobjectif de cette thse est l'application du concept dAgroRaffinage aux plantes aromatiques mdivales du patrimoine vgtal de Midi-Pyrnes. Ceci dans le but de valoriser de manire squence les diffrents constituants de la plante. Dans une premire tape, une tude bibliographique a t ralise partir danciens ouvrages botaniques ainsi que de rfrences bibliographiques afin de remonter des plantes rgionales utilises par nos anctres pour leurs activits odorantes, culinaires ou mdicinales. Dans une deuxime tape, des tudes physicochimiques, sensorielles et biologiques des fractions volatiles et non volatiles des plantes mdivales slectionnes ont t ralises pour juger de leurs proprits aromatiques et biologiques et de leur intrt dans le cadre des nouvelles rglementations europennes.
I. Plantes aromatiques mdivales de la rgion de Midi-Pyrnes

La rgion Midi-Pyrnes possde une flore riche et non valorise, ceci concerne tout particulirement les plantes aromatiques. Cette thse sinscrit dans le programme AROMATIC, qui vise la conception d'une nouvelle gnration daromatisants naturels labelliss WONF. Lexpdition MIPAROM (Midi-Pyrnes-Aromatique) a t conduite dans le cadre de cette thse afin de collecter et danalyser des varits de plantes aromatiques mdivales rgionales. I.1. Historique A la fin des annes 60, G.Bosc publiait son Guide dherborisation et de dtermination des vgtaux vasculaires de la rgion Toulousaine . Selon lauteur, cet ouvrage portait sur un rayon de 20 30 Km autour de Toulouse (Nature Midi-Pyrnes, 2004) . Les environs dune grande rgion comme la rgion Midi-Pyrnes sont soumis de fortes pressions foncires (dveloppement de lhabitat rsidentiel, progression et renforcement des infrastructures...) ou bien labandon de certaines pratiques agricoles. De nombreux espaces naturels sont dtruits au profit de zones industrielles ou rsidentielles proximit dune grande agglomration. Les espaces qui abritent traditionnellement une vgtation riche et diversifie ont tendance rgresser. I.2. Les Milieux relictuels Cette volution cre des milieux alors qualifis de relictuels (Nature Midi-Pyrnes, 2004) quil est possible de distinguer en deux types : 1. Des milieux naturels ou cologiquement riches qui ont pu perdre de leur intrt par rduction de leur superficie. La progression de lagglomration et de ses infrastructures laisse subsister des lambeaux boiss, quelques prairies humides isoles et de faibles surfaces, quelques pelouses sches sur des coteaux et quelques zones humides : ce sont alors des milieux rsiduels. 2. Des milieux qui ont t artificiellement crs par les activits de lhomme Des zones refuge se crent avec les diffrents amnagements tels que le talus routiers, les bords de routes et les fosss.
I.3. Notion de raret La notion de raret dune plante est dfinie de la manire suivante: Ce sont des plantes qui ont un statut national de protection (Arrt Ministriel fixant la liste des plantes protges sur le territoire national) ou qui sont inscrites sur le livre rouge de la flore menace de France. Ces plantes ont t limines lors de la premire slection. Ce sont des plantes rares ou peu frquentes localement. Il sagit de plantes menaces dans la zone tudie. Elles peuvent cependant tre plus frquentes et plus rpandues dans les zones voisines moins urbanises et moins agricoles. I.4. Distribution botanique et mondiale des plantes aromatiques mdivales. Les plantes aromatiques mdivales sont par dfinition des plantes sauvages en majorit non cultives, poussant en Europe, en Asie de lEst et en Amrique du Nord. La recherche bibliographique sur ces plantes mdivales montre quelles appartiennent essentiellement aux 3 familles botaniques suivantes : Astraces, Lamiaces et Apiaces. I.4.1. Famille des Astraces : morphologie, date dintroduction et distribution. La famille des Astraces (Composes) est la plus vaste famille de la division des spermatophytes, avec plus de 900 genres et au moins 12 000 espces rpandues sur toute la plante. Les composes sont relativement moins abondantes dans l'ancien monde que dans l'Amrique du Nord o elles forment environ un huitime de la flore vasculaire. Elles sont probablement apparues la fin du Ctac ou au dbut de l'Eocne, et le point d'origine parat tre la rgion andine de l'Amrique du Sud o elles constituent aujourd'hui un quart de la flore vasculaire. Les traits saillants de la distribution gographique de cette immense famille ont une grande porte biologique. Les tribus des Astres et des sneciones sont toutes cosmopolites ou peu prs. Les Cichories, les Cynares et les Anthmides appartiennent surtout l'hmisphre nord. Les Calendules et les Arctotides sont africaines. Les Vernonies, les Eupatories, les Hlianthes, les Hlnies et les Mutisies sont essentiellement amricaines. La grande tribu des Inules appartient surtout l'ancien monde. Les espces extra-tropicales communes aux deux hmisphres ne sont gure plus d'une quarantaine (Moreau, 1960). L'Afrique, l'Australie et l'Amrique occidentale paraissent possder les reprsentants les plus anciens du groupe. L'Afrique offre la plus grande varit
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Chapitre I : Etude Bibliographique de tmoins isols des types teints. L'Amrique andine possde quelques espces qui se rapprochent du type que l'on peut considrer comme le type primitif de la famille entire. La majorit des plantes mdivales que nous avons choisies est rpartie surtout en Europe, Asie et lAmrique du Nord. Une distribution gographique sauvage importante de cette famille existe aussi en Turquie, Canada, Inde, Iran et les pays Baltes (Ivancheva et al., 2003). I.4.2. Famille des Lamiace : morphologie, date dintroduction et distribution La deuxime famille botanique constituant les plantes mdivales est celle des Lamiaces (Labie). La forme de la fleur et la prsence dhuiles essentielles signent cette famille (Kaufmann et al., 1994). Cette famille de plantes angiospermes dicotyldones fleurs gamoptales irrgulires qui regroupe surtout des plantes herbaces et sous-arbustives rparties dans le monde entier. Les Lamiaces herbaces, annuelles ou vivaces, sont trs nombreuses et trs rpandues en France, exemple les Thyms, les Lavandes, les Romarins sont surtout abondants dans les rgions mditerranennes (Moreau, 1960).
Les Lamiaces comptent plus de trois mille cinq cents espces, quelque deux cents genres, rpartis en sept sous-familles. I.4.3. Famille des Apiaces : morphologie, date dintroduction et distribution La troisime famille constituant les plantes aromatiques mdivales est la famille des Apiaces (Apiaceae), appele anciennement Ombellifre (Umbelliferae). Elle comprend prs de 3000 espces rparties en 420 genres qui sont surtout prsentes dans les rgions tempres du monde. C'est une famille relativement homogne, caractrise notamment par son inflorescence typique, l'ombelle. C'est une vaste famille complexe regroupant des plantes herbaces annuelles, bisannuelles ou vivaces, et parfois des arbustes. Les feuilles sont alternes, souvent grandes et pennatifides (dcoupes en lobes profonds) mais aussi simples. Leur base est souvent engainante et largie (Moreau, 1960). La forme des fleurs a valu cette famille son ancien nom; ce sont des ombelles composes le plus souvent d'une ombelle primaire, avec ou sans bractes, dont chaque branche ou rayon porte une ombelle secondaire (ombellule) avec ou sans bractes secondaires (bractoles). Les fleurs sont souvent petites, cinq parties; les ptales toutes de mme taille ou nettement irrgulires, les fleurs externes d'une ombelle pouvant avoir des ptales externes nettement plus grands que les autres. Les fruits sont souvent dterminants pour identifier genres et espces se ressemblents. Du fait de leurs groupes de petites fleurs en
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Chapitre I : Etude Bibliographique ombelles qui offrent un abondant nectar et une bonne plate-forme datterrissage, les ombellifres sont particulirement apprcies par les insectes pollinisateurs. Cette famille riche en mtabolites secondaires prsente des intrts conomiques et mdicinaux, comportant des coumarines, flavonodes, composs actylniques et des lactones sesquiterpniques, ainsi quune grande richesse en huile essentielle. Cette famille de plantes est bien connue pour avoir une quantit importante dhuile essentielle dans la quasi-totalit de ses organes anatomiques. A nos jours, 760 constituants dhuiles essentielles ont t isols des apiaces (Moreau, 1960). I.5. Dmarche bibliographique de slection des plantes Une premire liste (I) comprenant une centaine de plantes aromatiques oublies de la rgion de Midi-Pyrnes a t tablie (Tableau 1), grce une recherche bibliographique faite partir danciens et nouveaux ouvrages botaniques et de quelques sites internet (Pailleux et al., 1899; Lieutaghi, 1966; De Gubernatis, 1976; De Gubernatis, 1976; Richard, 1992; Veyrat et al., 1997; Saule, 2002; Bertrand, 2003; Bertrand, 2004; Nature Midi-Pyrnes, 2004; Teuscher et al., 2005). Afin de limiter le nombre de plantes, les critres de rejets suivants ont t choisis :

Espce protge Existence dans lhuile essentielle de molcules toxiques ayant fait lobjet de peu dtudes
Plante ayant fait lobjet de nombreuses tudes scientifiques Absence dhuile essentielle dans la plante Existence sous forme arborescente
19 plantes ont alors t slectionnes (liste II) lors de cette seconde slection. Elles sont reprsentes en gras dans le Tableau 1.
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Tableau 1: Liste I des plantes aromatiques mdivales slectionnes, (*) : plantes correspondent la deuxime srie de slection
Nom Latin * Achillea millefolium
Nom Franais
Caractristiques
Achyranthes Aspera * Acinos alpinus Adiantum pedatum * Agastache foeniculum * Agnus-castus Agrimoinia eupatoria Alliaria officinalis Amaranthus retroflexus Anethum graveolens * Angelica archangelica
Achille millefeuille Plante vivace de taille moyenne ou assez leve (jusqu' 1m20), rhizome mettant des stolons, tige dresse simple ou rameuse, plus ou moins velue. Les feuilles rpandent un parfum agrable lgrement menthol Herbe des jeunes On conoit aisment que cette herbe ait pu devenir aprs une origine pareille un Talisman puissant Calament des Alpes Plante vivace de taille modeste (moins de 30cm) tiges couches ou redresses, rameuses la base Adiante L'adiante annonce la gurison Agastache Poivre des moines Aigre moine Alliaire Cette plante dgage un fort arme d'anis. Lodeur des branches de cette arbre combattait les penss impudiques Elle a une varit l'agrimoine odorante qui ressemble l'agrimoine eupatoire mais ses feuilles et ses fleurs sont odorantes Plante vivace odeur alliace surtout au froissement
Motif de slection non slection Retenue
Absence dhuile essentielle Retenue Absence dhuile essentielle Retenue Retenue Absence dhuile essentielle Toxicit de lhuile essentielle Absence dhuile essentielle Nombreuses tudes scientifiques Retenue Retenue
Amaranthe rflchie Une saveur "carne", inimitable Auelle odorante Anglique Anglique des bois Elle est distingue par son odeur forte. l'auelle tait un aromate chez les romains parfume agrablement les parfums Famille Apiace, pays dorigine : Amrique et Europe, odeur typique aromatique, saveur : sucre puis pice voir musque, amre et mme piquante Une saveur frache et un parfum "tendre" loin des canons habituels
* Angelica silvestris
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Nom Latin * Anthriscus sylvestris
Nom Franais Cerfeuil sauvage
Caractristiques Plante vivace de taille moyenne ou assez leve (jusqu' 1,50m) tige dresse, rameuse, nuds peu renfls. Feuille infrieures 3 fois divises. Fleurs blanches, trs aromatiques Son odeur est bien connue qui la diffrencie des autres, saveur lui a fait ses vertus mdicinales Plante vivace de taille moyenne ou assez leve (jusqu' 1,30m) Une espce de noisette parfume indienne Absinthium maximum, mre de toutes les herbes indiquant sa ressemblance avec labsinthe Les fleurs une fois dtach, on les fait scher le plus vite possible pour quils gardent leur couleur el leur parfum Odeur aromatique, lgrement poivre intensifie aprs frottement Une espce de roseau La plante frache est quasi inodore alors qu'aprs dessiccation elle acquiert une odeur trs fine due la coumarine Elle n'est autre que les cheveux hrisss, elle dsigne en sanscrit Jasminum hirsutum elle a une odeur repoussante et dsagrable Feuille et fleur qui offre des gots d'iode, d'esprit marin. tranges armes pour cette plante si loin de la mer. les graines reforment une huile aromatique
Motif de slection non slection Retenue
Apium graveolens Arbutus unedo Areca catechu * Artemisia vulgaris Arnica montana * Artemisia abrotanum Asipatra vana Asperula odorata Attahasaka Ballota nigra Borago officinalis Brassica nigra
Ache Gardien des portes Palmier btel Armoise Arnica Aurone Armes Asperule odorante
Nombreuses tudes scientifiques Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle Retenue Protge Retenue Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle Nombreuses tudes scientifiques Absence dhuile essentielle
Ballote ftide Bourrache Moutarde
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Nom Latin * Calamintha grandiflora Capsicum frutescens Cardamine pentaphyllos
Nom Franais Th dAubrac Poivre de cayenne Dentaire digite
Caractristiques Une saveur menthole et florale. Une plante que tout laguiolais se doit d'avoir en provision pour aborder la saison hivernale Odeur cre lgrement animale
Motif de slection non slection Retenue Nombreuses tudes scientifiques
Carlina acanthifolia
Carline artichaut
Carum carvi Cedrus
Cumin des prs Cdre
Chelidonium majus Terminalia tomentora *Chrysanthemum balsamita ou Tanacetum balsamita Cistus salviifolius Convallaria majalis
Chelidoine Oreille de chvre Balsamite Ciste feuilles de Sauge Muguet
Belle espce vivace de taille, moyenne (70cm au plus) rhizome Protge couvert de grosses cailles triangulaires caractristiques, tige simple, nue la partie infrieure, dresse, munie dans le haut de feuilles luisantes d'un beau vert Belle plante vivace dont le gros capitule se dveloppe mme le sol Protge au centre d'une rosette de feuilles tales, larges, dcoupes en segments garnis de fortes pines Lors de la cueillette, les parfums des feuilles sont particulirement Nombreuses tudes scientifiques prometteurs. Quant aux semences, elles explosent en saveurs anises Le cdre est un genre de conifre de la famille des pinaces, originaire Protge du Moyen-Orient, d'Afrique du Nord et de l'Himalaya, acclimat en Europe, comprenant des espces d'arbres majestueux, bois odorant, cime conique ou tale La plante entire exalte une odeur dsagrable Absence dhuile essentielle Odeur de la chvre Nomme communment au Moyen Age menthe coq, cette plante l'odeur de menthe Arbuste assez bas qui peut atteindre 80cm, pratiquement inodore, rameaux velus non visqueux, munis de feuilles court ptiole Inutile de prsenter l'inflorescence, ni de vanter son parfum, Le rhizome allong, solidement ancr au sol par plusieurs faisceaux de racines adventives, portant des fleurs odorantes en clochettes blanches Absence dhuile essentielle Retenue Forme arbrescente Toxicit de lhuile essentielle
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Nom Latin Crataegus oxyacantha Cucurbita pepo Discordia Galium verum
Nom Franais Aubpine Courge de sweet Herbe de haine Gaillet vrai
Caractristiques Les fleurs sont sches en un lieu bien ar pour jaunir et conserver leur odeur dlicate Petite courge aux armes de chtaigne Indienne
Motif de slection non slection Nombreuses tudes scientifiques Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle
Juniperus communis Geum urbarum Glechoma hederacea
Genevrier Benote Lierre terrestre
Espce vivace de taille moyenne (1m au plus) glabre ou velue dont les Absence dhuile essentielle tiges gnralement dresses, simples ou ramifies, sont munies de verticilles comptant 6 12 feuilles troites, allonges, bords enrouls, saveur du miel Odeur un peu camphre Nombreuses tudes scientifiques Les racines dgagent un fort parfum de girofle Plante vivace dont les longues tiges rampantes s'enracinent aux noeuds et donnent naissance des tiges florifres redresses de taille modeste (30cm au plus), feuille aromatique dont la saveur pics Plante de 50 60 cm de hauteur, sa racine contient une huile essentielle dont lodeur aromatique rappelle celle du clou de girofle, parfume plusieurs boissons, sche, elle perd ses armes Plante trs dcorative de taille mdiocre (50cm au plus) qui constitue des touffes denses avec des tiges ligneuses la base, tales ou redresses, trs rameuses, blanches-cotonneuses, odeur de curry Grande plante ombellifre vivace atteignant 50cm 1m50 dcouvrirez des armes de mandarine sur les jeunes tiges crues. L'odeur et la saveur des graines rappellent celles des feuilles de coriandre exotique dagrume de mandarine et de noix de coco Absence dhuile essentielle Absence dhuile essentielle
Geum urbanum
Helichrysum stoechas
La Benote bndiction tonique Immortelle
Absence dhuile essentielle
Nombreuses tudes scientifiques
Heracleum sphondylium
Berce commune
Nombreuses tudes scientifiques
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Nom Latin Humulus lupulus
Nom Franais Houblon
Hypericum perforatum Hyssopus officinalis Inula helenium Laurus nobilis Levisticum officinale Lilium sp Matricaria recutita Melissa officinalis * Meum athamanticum
Millpertuis Hysope Aune Laurier Liveche ou Ache Lis orang, safran Camomille sauvage Mlisse Cistre Monarde Cerfeuil musqu
Motif de slection non slection Longue liane (jusqu' 8m) qui se renouvelle tous les ans partir d'une Nombreuses tudes scientifiques souche ligneuse vivace. Sur des sujets distincts, se dveloppent les fleurs mles 5 tamines en grappes rameuses et les fleurs femelles servent aromatiser les bires Les feuilles, les fleurs soignent les "brlures" L'huile issue de la Nombreuses tudes scientifiques macration des sommits fleuries d'un rouge fonc est trs aromatique Trs aromatique Nombreuses tudes scientifiques Les racines prennent au schage une odeur d'Iris Parfum balsamique et pic Une puissance aromatique, elle est recommande pour restaurer l'apptit Connue par le nom : la fleur des fleurs Plante annuelle glabre, odeur prononce de camomille, de taille mdiocre (60cm au plus) sche perd rapidement son huile essentielle Un got anis si mystrieux. Pour nous, qui l'avons choisie pour illustrer notre image, elle est source de souvenirs, d'histoire et de sagesse Ses corolles dclinent des parfums citronns, des gots pics Tiges sucres et anises Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques Absence dhuile essentielle Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques Retenue Retenue Retenue
Caractristiques
* Monarda didyma * Myrrhis odorata
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Nom Latin Myrtus communis Narcissus pseudonarcissus
Nom Franais Myrte Narcisse jaune
Caractristiques Prince des vgtaux odorants, menthol
Motif de slection non slection Forme arborescente
Ocimum basilicum
Basilic
Origanum majorana Origanum vulgare
Marjolaine Marjolaine sauvage
Ds la fin de l'hiver jusqu'au dbut de juin en altitude, la floraison des Absence dhuile essentielle Narcisses relaie celle du Galanthe des neiges. Issu d'un bulbe assez gros, accompagn par 2 4 feuilles d'un vert un peu glauque, parfume des valles entires La multitude de varits propose aujourd'hui est phnomnale. Des Nombreuses tudes scientifiques parfums de citron, de rglisse, en passant par le camphre, l'anis, et leur usage offre une palette de saveurs inestimable agrable odeur parfume, voir pice Nombreuses tudes scientifiques Plante vivace dont les tiges rameuses dresses, munies de feuilles ptioles ovales, peuvent atteindre 60cm. Les fleurs roses accompagnes de bractes lancoles d'un rouge violac Odeur trs aromatique Exemple types de lgumes oublis, ses feuilles parfument les potages et ses petits fruits aplatis Espce vivace dont la taille peut atteindre 6m. A partir d'un rhizome ramifi et trs allong, s'lvent les tiges paisses, mais peu rsistantes, car non ligneuses un arbre plein de vie, le bourdonnement des abeilles et il embaume l'atmosphre. Un parfum, un got tout en finesse utilis pour les sucreries. Parfum agrable lgrement camphr Parfum brod d'insecte Odeur particulire aromatique voir pice Nombreuses tudes scientifiques
Pastinaca sativa Phragmites australis
Panais Roseau
Toxicit de lhuile essentielle Forme arbrescente
Robinia pseudacacia
Acacia
Forme arbrescente
Rosmarinus officinalis Rosa canina Ruta graveolens
Romarin Eglantier Rue
Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques
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Nom Latin Salvia officinalis Salvia pratensis
Nom Franais Sauge Sauge commune
Caractristiques Feuilles aromatiques voir camphr Plante vivace de taille moyenne (80cm au plus) tige simple ou peu ramifie. Les feuilles ne sont pas odorantes mais la hampe florale est recouverte dune substance collante qui dgage un parfum plaisant lgrement citronn la fois frais. Parfum de musc, ses fleurs donnent leur arme de muscat, vins parfums Exalte des armes de noisettes.
Motif de slection non slection Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques
* Sambucus nigra Sanguisorba minor Satureia hortensis Spiraea ulmaria
Sureau noir Pimprenelle Sariette Reine des prs Epiaire des bois
Retenue Absence dhuile essentielle
* Stachys sylvatica
Syzygium aromaticum Tagetes tenuifolia * Tanacetum vulgare
Girofle Tagette Tanaisie commune
odeur fortement pice et camphre avec de rminiscences de thym et Nombreuses tudes scientifiques d'origan Plante herbace vivace au port lgant do son nom de "Reine", Nombreuses tudes scientifiques rhizome rampant noueux et aux racines fibreuses, dont la taille va de 1 1,50 m. A force de se terrer au fond des bois, on jurerait quelle en a pris Retenue lodeur, lorsquon froisse entre les doigts ses feuilles velues sent fortement lhumus avec cependant une nuance menthole Odeur caractristique chaude pice, sucre, fortement aromatique Nombreuses tudes scientifiques Petites fleurs de couleur jaune au parfum de citron et d'orange Belle espce vivace, glabre, de taille assez leve (jusqu' 1m50) tiges droites, dresses, anguleuses, ramifies au niveau de l'inflorescence, munies de feuilles profondment dcoupes, feuillage trs aromatique Aromatique discrte, odeur trs lgrement alliaces, couleur blanc jauntre Nombreuses tudes scientifiques Retenue
Teucrium scorodania
Germandre
Toxicit de lhuile essentielle
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Nom Latin Thlapsi arvense
Nom Franais Tabouret
Caractristiques
* Thymus serpyllum
Urtica dioica
Valeriana officinalis
* Tussilago farfara Viola sp Zingiber officinale
Plante annuelle glabre, de 60cm au plus, qui met une odeur d'ail au froissement. La tige simple ou rameuse, dresse, est munie la base de feuilles ptioles, saveur piquante, odeur forte Thym pilosit Plante vivace basse (15cm au plus) longs stolons rampants sans Retenue variable, serpolet faisceaux de feuilles ; rameaux florifres velus sur 2 faces opposes seulement (hors entre-nud suprieur), feuilles plus grandes prs de l'inflorescence, trs aromatique. Grande ortie C'est une des espces les plus banales et les mieux connues cause de Absence dhuile essentielle ses feuilles et tiges hrisses de poils rigides qui provoquent des irritations douloureuses, got dharicot vert Valriane des collines Espce vivace souche courte trs odorante qui produit des stolons Nombreuses tudes scientifiques termins par des rosettes de feuilles. Les stolons sont souterrains avec des feuilles nombreux segments troits, trs odorants Tussilage Particularit de fleurir avant de produire ses feuilles, saveur Retenue aromatique proche de celle de la marguerite Violette Un parfum de sucrerie Absence dhuile essentielle Gingembre Plante herbace vivace besoin de beaucoup de soleil renferme plusieurs poils piquants Nombreuses tudes scientifiques
Motif de slection non slection Absence dhuile essentielle
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Chapitre I : Etude Bibliographique Une tude bibliographique gnrale a t effectue sur les 19 plantes aromatiques slectionnes dans la liste II, suite la volont de travailler sur le plus grand nombre possible de plantes pendant la thse, nous avons pu choisir 5 plantes aromatiques (Tableau 2) en suivant les critres de slection suivants : (I) les plantes peu tudies jusqu prsent et (II) la diversit des notes odorantes.
Tableau 2: Liste des 5 plantes aromatiques selectionnes
Nom Latin
Caractristiques organoleptiques
Nombre de publications scientifiques
Image
Achillea millefolium
Feuilles : parfum lgrement menthol
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Tanacetum balsamita
Feuilles : odeur de menthe forte
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Calamintha grandiflora
Feuilles : saveur lgrement menthole dominante florale 3
Myrrhis odorata
Tiges : sucre et anise
Monarda didyma
Corolles : parfum citronn, got pic
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II. Etude bibliographique des cinq plantes aromatiques mdivales slectionnes

II.1. Achillea millefolium : informations botaniques, structurales et culturales
Figure 1: Planche botanique dAchillea millefolium L. (Wilhelm, 1885)
Famille : Asteraceae Genre: Achillea Espce: Achillea millefolium L. Sous-espce: Achillea millefolium subsp. millefolium Varit : Achillea millefolium var. millefolium
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.1.1. Noms et origine Achillea millefolium L. (Asterace), qui est connue comme lachille millefeuille est distribue de faon sauvage en Amrique du nord et en Europe. Elle comprend plusieurs types ttraplode, hexaplode et plusieurs hybrides. Le genre Achillea est reprsent par 85 espces majoritairement rpandues en Europe, Asie et Amrique du Nord. LAchille millefeuille a t utilise comme herbe mdicinale (Orav et al., 2006), Le nom dAchille dsigne le hros grec Achille, qui a utilis dit on, cette plante sur le champ de bataille pour tancher le saignement des blessures de ses hommes. Elle panouit de mai la fin de lautomne ses fausses ombelles blanches, parfois roses, au long des chemins, des voies ferres, dans les terrains vagues, les cultures, les friches. Cette Astrace se distingue des Apiaces, avec lesquelles les non botanistes pourraient la confondre, par lexamen de ses petites fleurs qui sont en ralit des capitules et par le fait que leurs pdoncules communs ne partent pas dun mme point sur la tige principale. Ces caractres, joints ceux des feuilles, troites, bords presque parallles, folioles disposes sur deux rangs, et trs finement dcoupes, la rendent aisment reconnaissable. II.1.2. Distribution nationale
(Le rseau de la botanique francophone)
II.1.3. Usage tonique stomachique Herbe Militaire, Herbe Coupures, Herbe aux charpentiers, ces noms disent assez que lAchille millefeuille fut autrefois tenue en estime par ceux que leur profession exposait au coup de sabre ou au coup dherminette. Lusage interne de lAchille Millefeuille a fait lobjet
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Chapitre I : Etude Bibliographique dun grand nombre de travaux qui ont montr son utilit comme tonique amer, hmostatique, emmnagogue (AFSSAPS, 2009). On emploie les sommits fleuries dont la rcolte est possible tout lt. Linfusion 5% est utile dans les maux destomac aigus et chroniques. Linfusion et la macration ont aussi une heureuse influence sur la circulation sanguine. II.1.4. Usage hmostatique Employe lextrieur en topique sur les hmorrodes (Lieutaghi, 1966), les fissures anales, lachille se montre fort efficace et particulirement sur les hmorrodes en agissant non seulement par astringence mais aussi dune manire spciale et directe sur les vaisseaux et les nerfs du rectum et cette action est tout la fois astringente, tonique et sdative. II.1.5. Usage emmnagogue Dans les rgles douloureuses (Lieutaghi, 1966), insuffisantes ou supprimes par une cause accidentelle passagre (froid, motion, etc..) ou mme plus profonde (chlorose, affaiblissement etc..), lusage de linfusion concentre de lAchille millefeuille est dune efficacit reconnue et le flux menstruel peut se produire parfois une demi-heure seulement aprs labsorption. II.1.6. Autres usages LAchille millefeuille est une bonne plante de gazons que lon mle avantageusement aux Gramines. Des tontes frquentes doivent cependant lempcher de monter en fleur. Sa prsence est trs souhaitable dans les prairies temporaires quelle contribue enrichir, la prsence de plantes aromatiques et mdicinales dans les herbages ayant le meilleur effet sur la sant du btail (Lieutaghi, 1966). Aujourdhui, lAchille est utilise principalement dans le domaine mdicinal, parfois dans laromatisation de certaines bires.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.1.7. Proprits physicochimiques et biologiques Dans les 200 annes passes, lhuile essentielle dAchille millefeuille a t un sujet intressant pour plusieurs investigateurs. Les premires productions de lhuile essentielle furent en 1719 par Hoffman (Hoffman, 1935). Cependant Bley (Bley, 1928) est officiellement considr comme tant le premier qui a produit cette huile. Plusieurs recherches ont t cibles vers ltude de lazulne dans lhuile essentielle depuis la dcouverte de sa responsabilit dans la coloration bleue de lhuile essentielle (Weber et al., 2007). Oswiecimska (Oswiecimska, 1974) a dmontr que la prsence de lazulne ou des prcurseurs dazulne dans les diffrentes varits de lAchille est relie au nombre de chromosomes. Les ttraplodes produisent de lazulne ; par contre, les octaplodes et les hexaplodes nen produisent pas. Les auteurs ont concentr leurs travaux sur Achillea millefolium L. qui est une varit hexaplode donc ne produisant pas dazulne. La composition chimique de lhuile essentielle de lAchille millefeuille dpend du nombre de chromosomes de lespce, lhuile distille dune espce ttraplode, octaploide et hexaplode est caractrise par la prsence de chamazulne. Les di et ttraplodes contiennent des proazulnes, qui se transforment leur tour en azulne color. Lhuile distille de lEstonie et de Grce est riche en chamazulne (jusqu'au 25%) (Orav et al., 2006). Leffet du temps dhydrodistillation sur la formation de chamazulne et sur la variation de % des monoterpnes, monoterpnes oxygns, et les autres familles de terpnes a t tudi par Orav et al. (Orav et al., 2001). En effet, les auteurs ont remarqu que le pourcentage de monoterpnes diminue avec laugmentation de temps de lhydrodistillation (0,5, 1, 2 et 3 heures), par contre le pourcentage des monoterpnes oxygns reste stable. Le pourcentage de chamazulne augmente 3 fois plus en passant de 0,5 3heures dhydrodistillation (Orav et al., 2001). Orav et al. ont analys lhuile essentielle de lAchille millefeuille provenant de France (partie traite non prcise) leur rsultats montrent une quantit leve des monoterpnes oxygns (53,9-76,1%), principalement le camphre (jusquau 24,5%), ainsi les et -thujone (jusquau 26.8%), 1,8-cinole (jusqu'au 20,3%) et artemisia ctone (jusquau 10,1%).
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.2. Tanacetum balsamita : informations botaniques, structurales et culturales
Figure 2 : Planche botanique de Tanacetum balsamita (Le rseau de la botanique francophone)
Famille : Asteraceae Genre : Tanacetum Espce : Tanacetum balsamita L.
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II.2.1. Noms et origine Dorigine d'Asie occidentale. C'est une plante de climat tempr, largement naturalise en Europe, en Afrique du Nord et en Amrique du Nord. Le chrysanthme balsamique, figure 2 est originaire des rgions sud de l'Europe mais est maintenant cultiv un peu partout jusquen Amrique du Nord. Cette plante connue sous diffrents noms : herbe Sainte-Marie, Balsamita mas, maudin, Balsamita foemina, menthe-coq, et menthe de Notre-Dame. II.2.2. Distribution nationale
(Le rseau de la botanique francophone) II.2.3. Diverses proprits Cette grande compose vivace, parfois cultive dans les jardins, forme des peuplements souvent denses dans les terrains vagues, sur les dcombres, au long des voies ferres, des berges des chemins, dans une grande partie de la France (elle est rare dans lOuest, le Sud-ouest et le Midi (Lieutaghi, 1966). La balsamite fleurit tout lt ; on rcolte ses sommits au dbut de la floraison, les semences la maturit des capitules. Dtroits liens de parent unissent, dans la famille des astraces, la balsamite et la tanaisie. Lune originaire du Midi est cultive dans les jardins comme plante dornement, lautre abondante dans lle de France o on la rencontre sur les berges des rivires, le long des routes, dans les lieux pierreux (Leclerc, 1949). On pourrait mme les confondre nobserver que leurs nombreux capitules disposs en corymbes terminaux qui charment le regard par la teinte dun beau jaune dor de leurs fleurons, particulirement clatants chez la Tanaisie. Mais il suffit de comparer les feuilles des deux espces pour que devienne impossible toute erreur de confusion : presque glabre et dun vert fonc, pennatipartites. C'est-
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Chapitre I : Etude Bibliographique -dire profondment divises en segments rguliers disposs comme les barbes dune plume et dents sur leur bords. Chez la Tanaisie, elles sont, chez la Balsamite, dun vert cendr, pulvrulentes, de forme elliptique, les radicales portes par un long ptiole, celles qui garnissent la tige, sessiles. Au niveau de lolfaction, la fragrance si agrable de menthe ne permet pas de confondre avec celle de Tanaisie. II.2.4. Usage pharmacologique Aux dires du capitaine Bontemps quelle drle dide, on bon toubib, davoir assaisonn cette salade deau de dentifrice et de chicotin ! , en effet, son odeur de menthe sajoute une saveur dune agressive amertume (Leclerc, 1949). Cest ce que la plante renferme, surtout lpoque de la floraison, un principe amer qui sy trouve associ une huile essentielle obtenue par distillation. Quelques 200 ans plus tard, Murray et al. sexprimaient en ces termes sur le compte dune plante si merveilleuse : elle est inusite, bien que son odeur semble promettre quelque activit : je lis quelle fortifie lestomac, calme les coliques, favorise la menstruation, toutes choses qui nont rien de contraire la raison : on peut la prescrire dans les affections hystriques (Murray, 1792). Cette esquisse pharmacologique nous montre dans la balsamite un mdicament utile lestomac, au foie en le rendant plus apte remplir le rle capital qui lui est dvolu dans les actes fondamentaux du mtabolisme (Leclerc, 1949). Tanacetum balsamita L. est bien connue comme une herbe mdicinale. Elle a t utilise depuis des sicles par les gyptiens, les romains, et les grecs. Le nom de la balsamite est d au balsam herb c'est--dire la lgret et le plaisir de lodeur aromatique balsamique de lhuile, qui est prsent dans des poils scrteurs de la surface infrieure de la feuille (Leclerc, 1949). II.2.5. Usages divers Les semences de la Balsamite sont condimentaires ; on peut les rajouter faibles doses sur les viandes, les gibiers, dans les pts, dans les gteaux. Par macration dans lalcool, elles donnent une liqueur assez voisine de la chartreuse mais peu recommandable en raison des proprits convulsivantes de la plante (Leclerc, 1949). C'est une plante qui a dj t utilise dans le procd de brassage de la bire pour la conservation et pour y transmettre un got d'amertume. Les feuilles ont une senteur de menthe citronne qui se conserve trs longtemps mme une fois sches.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.2.6. Cultures La balsamite, rustique et vivace, vit trs facilement en terres fraches et fertiles, assez lgres. On la multiplie par clats de pieds ou par semis de graines en place au printemps. C'est une plante vivace, assez grande, jusqu' 1,2 m, exhalant un parfum agrable rappelant celui des menthes. Les feuilles sont simples, ovales, d'une consistance ferme et bords crnels. Les feuilles infrieures sont longuement ptioles, alors que les feuilles suprieures sessiles embrassent la tige. Les fleurs sont groupes en petits capitules, de 5 6 mm de diamtre, euxmmes groups en corymbes sur une tige dresse. La plante est vivace par sa tige souterraine rampante qui met des bourgeons. II.2.7. Proprits physicochimiques et biologiques Jaimand et al. ont travaill sur lhuile essentielle de la balsamite provenant de lIran (Jaimand et al., 2005) en sparant les diffrents organes (feuille, fleur et tige), les composs majoritaires qui constituent la composition des trois diffrentes huiles obtenues sont : actate de bornyle, pinocarvone, camphre et terpinolne, avec des variations quantitatives significatives en fonction de lorgane tudi. En 1968, Gockeritz a dfini 2 chmotypes de Tanacetum balsamita en fonction de la dominance du terpne (type camphre: Balsamita major (L.) Desf. Asch) et type carvone: Tanacetum balsamita (L.) Desf. var. tanacetodes (Boiss) Fiori (Goeckeritz, 1968). Dans la littrature de Bestman et al. en 1984, on a propos un 3me chmotype avec la dominance des deux composs carvone et camphre dans lhuile essentielle (Bestmann et al., 1984). En 1968, Gockeritz et al. ont analys lHE des feuilles de la Balsamite de type camphre (91%) (Goeckeritz, 1968). En 1938, Voight et al. ont analys la composition chimique de lHE de la balsamite type carvone (Voigt et al., 1938). En 1973, Juknevicien et al. ont tudi la variation de la composition chimique de lHE en fonction de phase de croissance de la plante ainsi que lorgane anatomique trait. Trois ans aprs, Paris et al. en 1976, ont identifi 1,3% de lHE dans les fleurs et 0,7% dans la partie arienne. Zielincka-Sowicka et al. ont identifi dans les feuilles 13 composs constituant 91% de la composition totale (camphre, bornol, isobornol, camphne, carvone, limonne et alphapinne) (Zielinska-Sowicka et al., 1970). Mounfared et al. ont analys lhuile essentielle de la partie arienne sche de la Balsamite provenant dIran (Tanacetum balsamita, L. ssp. balsamitodes (schultz Bip) Grierson [syn. non
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Chapitre I : Etude Bibliographique Chrysantemum balsamita (L.) Wild], 31 composs ont t identifis parmi lesquels la carvone (68%) constitue le compos majoritaire (Monfared et al., 2002). Baser et al. ont identifi la composition de lhuile essentielle ainsi que la distribution nantiomrique de plusieurs espces de Tanacetum parmi lesquelles Tanacetum balsamita(Baser et al., 2001) En 2000 Bylaite et al. ont tudi la variation de la composition de lhuile essentielle de Balsamita major (L.). Desf en fonction des diffrentes phases de croissance et de la partie hydrodistille (feuilles et fleurs) o le rendement en huile essentielle lev a t dtect durant la phase de floraison (Bylaite et al., 2000). On a remarqu quil ny a pas de variation considrable de la composition selon la phase de croissance lexception du dbut de la phase (mai) o le % de carvone est plus faible que celui de la bta thujone. En 2001, Gallori et al. ont analys la composition chimique de lHE et de leau aromatique des feuilles de la Balsamite dorigine Italienne (Gallori et al., 2001), et la carvone a t dtecte comme le compos majoritaire dans les deux parties. Il existe galement des travaux concernant lactivit insecticid de la Balsamite. Une vingtaine de composs actifs ont t identifis dans lHE pour leur forte activit insecticide contre les aphides (Bestmann et al., 1984). Todorova et al. en 1989, ont focalis leurs travaux sur la recherche des flavonodes dans la fraction O-dihydroxyphnolique de Balsamita major o on a identifi 5 composs comprenant les acides cafique, chlorognique et frulique (Todorova et al., 1989). 7 espces de Tanacetum de diffrentes origines gographiques parmi lesquelles Tanacetum balsamita, ont t analyses pour leur potentiel lev en flavonodes lipophiliques et polaires. La partie traite de la balsamite tait les feuilles o on a identifi 5 flavonodes (Williams et al., 1999). Dun autre ct, en 1996, Kubo et al. ont isol partir des fleurs sches de Tanacetum balsamita (Catinga-de-mulata) dorigine brsilienne un compos actif antimicrobien qui sappelle la Tanabaline (Kubo, 1995). En 2003, Nickavar et al. ont isol partir de la partie arienne de la balsamite dorigine Iranienne un flavonol (Nickavar et al., 2003) dont la structure est prsente dans la figure 7.
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Figure 3: structure chimique de 3',4',5,7-Tetrahydroxy flavonol
En se basant sur la nature du terpne dominant on peut identifier 4 chmotypes : type camphre, type carvone, type camphre-thujone et type carvone-thujone.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.3. Calamintha grandiflora : informations botaniques, structurales et culturales
Figure 4: Planche botanique de Calamintha grandiflora (Le rseau de la botanique francophone)
Famille : Lamiaceae Genre : Calamintha Espce : Calamintha grandiflora (L.) Moench
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.3.1. Noms et origine Utilis en infusion comme une tisane, le Th dAubrac est la plante la plus rare parmi les plantes slectionnes, Calamintha grandiflora (L.) Moench (Syn.Satureja grandiflora (L.) Scheele) voir les synonymes Melissa grandiflora L., Thymus grandiflorus Scop., Satureja grandiflora (L.) Scheele, Calamintha mariae, le Th dAubrac est une plante connue dans la rgion dAubrac au Massif Central en France. Elle appartient la famille des Labies, de taille (20-60 cm) et dune odeur forte et pntrante particulirement en juillet. Plante vivace de 20-50 cm., verte, poils pais, odeur agrable, souche stolonifre ; tige simple ; feuilles grandes, ovales, long ptiole, limbe plus long que large, fortement dent en scie dents profondes, triangulaires, tales ; fleurs rouge pourpre, trs grandes, peu nombreuses en verticilles carts, pdoncules communs plus courts que les feuilles ; calice long de 12-16 mm., vert, glabrescent, tube droit, poils de la gorge inclus, dents ingales, cilies ; corolle dpassant de 18 mm. La gorge du calice, tube arqu-ascendant ; carpelles ovodes, noirs. Avant les annes 1990 il nexistait pas dtudes chimiques dans la littrature concernant la composition chimique de son huile essentielle (Souleles et al., 1990).
II.3.2. Distribution nationale La distribution gographique de cette labie couvre l'Europe centrale et mridionale. D'aprs Grualbo, il s'agit d'une espce frquente dans le sud-est de la France (Grualbo et al., 1993), depuis le Massif Central jusqu'aux Alpes occidentales, tant aussi prsente dans les Pyrnes orientales et la Corse. Rcemment, Galland et al. ont aussi mentionn une sous espce comme tant prsente en Afrique du Nord (Rif et Atlas moyen) sous le nom de Calamintha grandiflora (L.) Moench subsp. Baborensis (Bali) Galland; les plantes nord-africaines prsenteraient la mme allure que celles d'Europe, mais seraient plus rduites, c'est dire, avec des feuilles, calice et corolle un peu plus courts.
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II.3.3. Historique de la dcouverte du Th dAubrac dans les Pyrnes Calamintha grandiflora est une espce rare aux Pyrnes, notamment sur le versant mridional. Sa dcouverte prolonge son aire de rpartition d'environ 200 km vers l'Ouest. Peut-tre d'autres citations pninsulaires telles Torrecilla de Alcafiiz (Teruel), Moncayo (Zaragoza), montagnes de Santander, etc. doivent se rapporter des confusions avec les espces du mme genre (Calamintha sylvatica) ou de la mme famille (Melissa officinalis)(Grualbo et al., 1993). II.3.4. Ecologie A peu prs tous les ouvrages consults indiquent la prfrence cologique de l'espce pour les forts ombrages et fraches des tages montagnard et subalpin, surtout htraies; cependant, la plante semble avoir t trouve dans les sapinires et mme les forts de pin crochets. Calamintha grandiflora est une espce rare aux Pyrnes (Grualbo et al., 1993) notamment sur le versant mridional. La dcouverte de cette labie dans les Pyrnes aragonaises autorise l'espoir de sa prsence possible dans des diffrentes enclaves de la valle de Boucharo. Si, au contraire, elle n'existait que dans cette population isole, elle courrait un risque de disparition au cas d'un largissement de la route forestire.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.3.5. Proprits physicochimiques et biologiques Dans la Littrature, il existe peu dtudes concernant la composition chimique de lhuile essentielle de Calamintha grandiflora. Deux espce et sous-espces de Calamintha ont t tudies dans la littrature ; les rsultats montrent une diffrence remarquable dans la composition chimique des deux huiles essentielles. La premire sappelle Calamintha nepeta (L.) Savi et a comme composs majoritaires : la pulgone, la menthone et lisomenthone. Lautre espce sappelle Calamintha nepeta (L.) Savi. Ssp. Glandulosa (Souleles et al., 1990) ; cette dernire contient dans son huile loxyde de pipritone, loxyde de pipritnone et le limonne comme composs majoritaires. Baser et al. ont travaill sur les feuilles de la Calamintha grandiflora (L) Monech [syn. Satureja grandiflora (L.) Scheele, Melissa grandiflora L., Clinopodium grandiflora (L.) Kuntze], le compos majoritaire de lhuile essentielle tait lisopinocamphone (52,59%) (Baser et al., 1993).
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.4. Myrrhis odorata : informations botaniques, structurales et culturales
Figure 5: Planche botanique de Myrrhis odorata (Le rseau de la botanique francophone)
Famille : Apiaceae Genre : Myrrhis Espce : Myrrhis odorata (L.) Scop.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.4.1. Noms et origine Plusieurs noms communs ont t attribus cette plante : cerfeuil perptuel, cerfeuil d'Espagne, fougre musque et cerfeuil musqu. Plante vivace de 50 cm 1 mtre, velue, odeur d'anis ; tige robuste, creuse, cannele ; feuilles grandes, molles, bi-tripennatisques, segments lancols, inciss-pennatifides ; fleurs blanches, en ombelles 6-15 rayons pubescents, dresss la maturit ; involucre nul ; involucelle 5-8 folioles lancoles, membraneuses, cilies, rflchies ; ptales obovales, margins, pointe courbe ; styles courts, rflchis ; fruit grand, oblong, long de 20 30 mm., comprim par le ct, acumin d'un noir luisant la maturit ; mricarpes 5 ctes gales, fortement carnes, tranchantes, creuses en dedans, spares par ds vallcules profondes, sans bandelettes. Prairies et bois des montagnes ; Vosges ; Jura ; Alpes ; Forez, Auvergne et Plateau central ; Corbires et Pyrnes. Europe centrale et mridionale. Le cerfeuil musqu est une plante indigne en Europe; son utilisation a connu du succs au XVme sicle puis elle a disparu des jardins, pour revenir la mode de nos jours, malgr sa difficult de multiplication. Les anciens attribuaient dj cette plante des proprits mdicales extraordinaires ; daprs Apule, elle tait un remde infaillible contre les blessures, la sciatique, lhypochondrie et autres maladies. Mais le cerfeuil musqu tait surtout une plante sacre dans les croyances populaires. II.4.2. Distribution nationale
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.4.3. Diverses proprits Le cerfeuil musqu est une plante herbace vivace de la famille des Apiaces cultive pour ses feuilles et ses graines au got sucr et anis, utilises comme condiments alimentaires (Hussain et al., 1990). Toutes les parties de la plante possdent le parfum et le got sucr de l'anis. Myrrhis odorata possde des proprits expectorante, diurtique et tonique. Elle contient une huile essentielle riche en anthole(Kudrzycka-Bieloszabska et al., 1970). Le cerfeuil musqu est une herbe vivace qui crot jusqu' 1 m de hauteur. Tiges dresses, creuses, trs ramifies. Les grandes feuilles, jusqu' 30 cm, molles, sont trs dcoupes, bi- ou tripennes, et ressemblent celle des fougres. Petites fleurs blanches groupes en ombelles larges et tales avec des rayons de 10 12 cm. Graines assez grandes, 25 mm. La plante se ressme facilement. II.4.4. Usages divers Le cerfeuil musqu est souvent confondu avec le cerfeuil dne (Anthriscus silvestris) qui est toxique. Le simple froissement des feuilles de Myrrhis odorata dgage une forte odeur anise rappelant la rglisse. Myrrhis odorata permet de diminuer la quantit de sucre utilis dans les plats sucrs (diabtiques) (Sawicka et al., 1999). Elle a une action digestive. Les feuilles fraches, crues, odeur anise caractristique, peuvent servir aromatiser les salades et crudits, omelettes et potages. Les graines sont utilises pour parfumer les desserts. II.4.5. Proprits physicochimiques et biologiques En 1982, Kubeczka et al. ont analys lhuile essentielle de la partie arienne de Myrrhis odorata et ont dtect 76,8 % danthole en compos majoritaire (Kubeczka et al., 1982). En 1990, Hussain et al. ont fait des tests organoleptiques afin de dcouvrir des agents sucrs issus des plantes. Parmi les plantes slectionnes se trouvait Myrrhis odorata o lon a identifi 85,48% de trans-anthole et 9,08% de mthyl eugnol (Hussain et al., 1990). En 1993, lHE des feuilles de Myrrhis odorata dorigine russe a t analyse par Tkachenko et al. o lanthole constitue le compos majoritaire (82-85%) (Tkachenko et al., 1993). En 1999, lHE des feuilles de cerfeuil musqu rcoltes en aot en Finlande a t analyse par Usitalo et al. ; La composition chimique est marque par la prsence de mthyl chavicol (2,64%), labsence de limonne, de caryophyllne et de germacrne. La prsence de monoterpnes oxygns tait remarquable (Uusitalo et al., 1999).
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Chapitre I : Etude Bibliographique En 2005, Rancic et al. ont analys lHE de Myrrhis odorata en priode de floraison ; le paracymne tait le compos majoritaire (62,0%) (Rancic et al., 2005). En gnral, la composition de lhuile essentielle de Myrrhis odorata est relativement semblable qualitativement lexception de lespce provenant de Finlande. Nanmoins, des diffrences quantitatives sont prsentes en fonction de lorigine gographique et de lorgane trait.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.5. Monarda didyma : informations botaniques, structurales et culturales
Figure 6: Planche botanique de Monarda didyma (Le rseau de la botanique francophone)
Famille : Lamiaceae Genre : Monarda Espce : Monarda didyma L.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.5.1. Noms et origine La Monarde ou Monarda (bergamote en anglais) est une plante vivace originaire d'Amrique du Nord ; elle constitue l'quivalent de notre menthe ; elle appartient la famille des Lamiaces, douce au toucher, elle dgage une forte odeur aromatique rappelant celle de la menthe et du citron. II.5.2 . Distribution nationale
(Le rseau de la botanique francophone) II.5.3. Diverses proprits Elle produit des tiges quadrangulaires, raides et dresses, vert rougetre. Les feuilles opposes sont d'un vert assez sombre ; elles ont une forme allonge, voire lancole et leur bordure prsente de petites dents. De mi-juin septembre, la floraison vient illuminer cette plante. Il existe une douzaine d'espces de monade ; les plus cultives sont Monarda didyma qui demande un sol humide et dont il existe de nombreuses varits fleurs blanches, roses, rouges ou violaces et Monarda fistulosa, plus grande (1,5 m) plus rsistante la scheresse et aux fleurs dans les tons pourpres, rouges ou violacs. II.5.4. Usages divers La Monarde est utilise pour aromatiser les plats et en infusion. On lui attribue des vertus mdicinales : diurtique, antifbrile, sudorifique, carminative et antiseptique grce au thymol qu'elle contient.
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Chapitre I : Etude Bibliographique II.5.5. Proprits physicochimiques et biologiques Monarda didyma dorigine franaise analyse en 1991 par Carnat et al. avait le linalol (64,574,2%) comme compos majoritaire. Ils ont analys lHE des feuilles et des fleurs sparment (Carnat et al., 1991). Un an plus tard Mazza et al. ont analys lhuile essentielle de plusieurs hybrides de lespce Monarda provenant de lhybridation entre deux espces M. fistulosa et M. didyma (Mazza et al., 1992). Une distribution de terpnes cycliques dans la majorit de ces hybrides a t rapporte. Rcemment Fraternale et al. ont analys lhuile essentielle de Monarda didyma dorigine italienne ; lhuile essentielle a t obtenue partir des tiges et feuilles ainsi que des fleurs. La composition de lHE provenant de la partie arienne (tiges et feuilles) est quasi semblable quantitativement et qualitativement celle obtenue partir des fleurs (Fraternale et al., 2006). En gnral, la composition chimique de lespce Monarda didyma, diffre selon lorigine gographique de la plante ; par contre, lorgane trait na pas dinfluence sur cette composition.
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III. Techniques dextraction des fractions volatiles

De manire gnrale, la distillation est un procd de sparation bas sur la diffrence de composition entre un liquide et la vapeur engendre (Garnero, 1996). La technique implique la condensation de la vapeur et la rcupration des fractions liquides rsultantes. On parle de distillation simple ou fractionne lorsquil sagit de liquides miscibles. On peut galement procder la distillation de liquides non miscibles. Cest le cas de lhydrodistillation des huiles essentielles.
III.1. Techniques dextraction des huiles essentielles III.1.1. Hydrodistillation Lhydrodistillation consiste immerger la matire premire dans un bain deau. Lensemble est port bullition et lopration est gnralement conduite pression atmosphrique. La distillation peut seffectuer avec ou sans recyclage communment appel cohobage. Lors de la distillation des huiles essentielles, plusieurs phnomnes sont la base dchanges de matire entre les phases solide, liquide et vapeur, do linfluence dun grand nombre de paramtres sur la qualit et le rendement de la production (Hajji et al., 1985). Les exprimentations conduites jusqu puisement du substrat en essence montrent que la dure de la distillation est plus longue pour les organes de plantes ligneuses que pour les herbaces. Cette diffrence est fortement lie la localisation des structures dlaboration ou de stockage des huiles essentielles pouvant tre superficielles ou internes. De ce fait, elles ont une influence sur le droulement de lhydrodistillation, c'est--dire sur les mcanismes successifs mis en jeu, et par consquent sur la dure. Dans le cas o ces structures sont superficielles, la membrane externe ou la cuticule qui constituent les seules barrires la libration de lhuile essentielle, est vite rompue bullition, les composs volatils sont aussitt vapors. Lorsque les HE sont sous-cutanes, elles doivent dabord diffuser travers lpaisseur du tissu vgtal avant dentrer en contact avec leau ou sa vapeur. Elles sont alors vapores comme dans le cas des secrtions superficielles. Ainsi durant la distillation, leau bouillante pntre dans les cellules vgtales et solubilise une partie de lHE de lappareil scrteur interne. La solution aqueuse charge de composs terpniques, diffuserait ensuite travers une paisseur de tissu, plus ou moins dense, selon
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Chapitre I : Etude Bibliographique lorgane, vers la surface extrieure o lhuile essentielle serait vaporise et entrane sous forme dazotrope. Cependant, on attribue le terme dhydrodiffusion ce type de transport contrl par la polarit des constituants. Elle serait responsable de la vitesse relative de la distillation des diffrents composs aromatiques, dpendant davantage de leurs solubilits dans leau que de leurs points dbullition. Si lhydrodiffusion constituait ltape limitante de lhydrodistillation, alors lordre de sortie des composs serait dict par leur polarit et non par leur volatilit (Acquaronne et al., 1998). Dans le cas de composs de volatilit et de polarit intermdiaires tels que les esters mono terpniques, ni la vitesse dhydrodiffusion ni la vitesse de vaporisation ne seront ngligeables. Lhydrodiffusion et la vaporisation ne constituent pas les seuls mcanismes mis en jeu lors de lhydrodistillation ; il faut leur associer la dcantation qui fait intervenir une vitesse de transfert de matire entre deux phases liquides. Lisolement de composs volatils aprs leur distillation est dtermin dans une large mesure par leur degr de solubilit dans leau. Par consquent, leau rsiduelle peut tre plus ou moins sature en constituants polaires selon la difficult de sparation des phases. Celle-ci peut avoir trois origines ventuellement combines : une partie de lhuile essentielle est dissoute dans leau, soit 1% environ de la fraction dcante, rarement plus de 2% et exceptionnellement suprieure 5% dans le cas de certains composs polaires phnoliques ; Une autre fraction est mulsionne le plus souvent dans 10% deau ; Enfin, une quantit est fortement mlange avec de leau et des molcules organiques tierces. A linterface huile/eau, elle peut tre suprieure 10%. Dans ces conditions, les pertes dues une mauvaise dcantation peuvent atteindre 25% et plus, de lessence recueillie. III.1.2. Hydrodistillation-extraction simultane La distillation la vapeur (Likens-Nickerson) combine les avantages de lhydrodistillation et de lextraction au solvant. Lhydrodistillation permet dviter lextraction des composs non volatils, et lutilisation en faible quantit dun solvant non miscible leau facilite lextraction des composs organiques (Pollien et al., 1998). Ce procd trs efficace, repose sur le chauffage en parallle de la matrice (dans leau) et du solvant. Les vapeurs sont diriges vers un extracteur central et se condensent sur un doigt
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Chapitre I : Etude Bibliographique froid. Les liquides sont collects et dcants dans la partie basse de lappareil, puis retournent dans leurs ballons respectifs. Lavantage principal de cette mthode rside dans ce recyclage, qui assure une faible consommation de solvant et la prconcentration de lextrait. Bien que tout solvant organique non miscible dans leau puisse tre utilis (en ajustant lappareil en fonction de sa densit), linconvnient majeur de cette mthode, tout comme pour lentranement la vapeur, rside dans la formation possible dartefacts dus au chauffage de la matrice en milieu aqueux (Chaintreau, 2001). Nanmoins, cette limite a conduit dvelopper des extractions sous pressions rduites des tempratures proches de la temprature ambiante (Pillonel et al., 2002). III.2. Techniques dextraction des composs organiques volatils (COV) Facilement automatisables, simples, les techniques de lespace de tte ou Headspace ne requirent pas de grandes quantits dchantillon (Kolb, 1999). La possibilit davoir des artfacts et de contaminations est trs faible si on manipule avec soin. La mthode consiste extraire les composs organiques volatils mis par un chantillon liquide ou solide (Pillonel et al., 2002; Pawliszyn, 2003). Pour cela, une petite quantit de lchantillon est place dans un flacon hermtiquement clos par un septum en PTFE/silicone. Un quilibre entre lchantillon et la phase gazeuse est ncessaire, une partie de cette dernire est prleve pour tre analyse, le plus souvent par Chromatographie en phase gazeuse (CPG). Pour les matrices peu odorantes, un chauffage lger peut tre appliqu pour atteindre plus rapidement lquilibre. Ces techniques sont complmentaires des mthodes dextraction aux solvants organiques. Cependant, la concentration relative des composs dans lespace de tte ne reflte pas leur concentration relle dans lchantillon (Matich et al., 1999). III.2.1. Espace de tte statique (atmosphre confine) Dans la technique de lespace de tte statique ou Static HeadSpace (SHS), la phase gazeuse en quilibre avec lchantillon est prleve laide dune seringue gaz ou dune boucle dinjection et injecte directement dans un chromatographe. Cette technique est parfaitement automatise, reproductible et trs utile pour un criblage rapide de nombreux chantillons (Kolb, 1999). Linconvnient majeur de cette mthode est la discrimination des composs selon leur volatilit, les composs les plus volatils saturant trs rapidement lespace de tte.
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Chapitre I : Etude Bibliographique Lespace de tte statique est gnralement utilis pour extraire et quantifier des composs trs volatils de matrices alimentaires (Fleming Jones et al., 2003). III.2.2. Espace de tte dynamique La mthode de lespace de tte dynamique ou Dynamic Headspace (DHS) (Da Costa et al., 2005) consiste entraner les composs volatils dun chantillon laide dun gaz vecteur inerte (azote ou hlium) et de les piger dans un tube en verre dsactiv ou en acier inoxydable rempli de carbone ou dun polymre organique poreux. Les polymres utiliss (Porapak, Carboxen, Tenax, Chromosorb) ont une grande surface spcifique et possdent tous la proprit de retenir faiblement les composs polaires de masse molaire peu leve. Le Tenax est le polymre le plus employ ; trs stable thermiquement et hydrophobe, il est peu slectif ce qui en fait un pige de choix pour extraire les COVs, puis les analyser par CPG (Pillonel et al., 2002). Pour faciliter la saturation de lespace de tte, les chantillons sont frquemment chauffs et/ou agits pendant lextraction. Les composs organiques retenus par le pige sont ainsi concentrs. Cependant, il est possible de dpasser la capacit du pige, ce qui peut conduire la perte de nombreux composs lors de lextraction. III.2.3. Espace de tte pseudo-dynamique Les techniques dadsorption ou dsorption sont trs utilises pour lanalyse des Composs Organiques Volatils (COV). Elles permettent lextraction et la concentration des composs volatils sans solvant. Elles sont bases sur la partition des composs organiques entre une phase aqueuse ou gazeuse et un film polymrique de faible paisseur. Dans ce groupe, on peut distinguer trois grandes techniques : la microextraction en phase solide (SPME), lextraction par adsorption en espace de tte (Headspace Sorptive Extraction, HSSE) et lextraction dynamique en phase solide (Solid Phase Dynamic Extraction, SPDE).
Microextraction en phase solide (SPME) Cette mthode dextraction prsente lavantage de regrouper toutes les tapes de la prparation dun chantillon (extraction, concentration, drivation et transfert au chromatographe) en un seul procd. En particulier, elle peut se rvler une meilleure mthode pour les analyses qui requirent des extractions longues et coteuses et ncessitent une grande consommation de solvants. Elle utilise une fibre de silice (1 2 cm de long) recouverte dun film polymrique pour extraire les composs organiques dun chantillon (Burgot et al., 2003). La SPME est une technique dextraction sans solvant trs simple et
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Chapitre I : Etude Bibliographique rapide qui est maintenant parfaitement automatise. Les fibres peuvent tre rutilises une cinquantaine de fois, ce qui en fait une technique peu onreuse. Cependant, loptimisation des conditions dextraction peut se rvler assez longue. En effet, il est ncessaire de dterminer la fibre la plus efficace, les temps et les tempratures dincubation et dchantillonnage, pour chaque chantillon. De plus, une fois ces conditions obtenues, il peut savrer difficile dobtenir des rsultats rpttitifs et reproductifs ce qui pourrait tre d un manque dhomognit entre certains lots de fibres. De par sa simplicit et son cot modr, la SPME est une bonne technique pour lidentification et la comparaison rapide et efficace darmes (Schmitt et al., 2005); elle est utilise pour lanalyse de nombreuses matrices alimentaires comme les produits laitiers (Lubbers et al., 2004), les fruits et lgumes (Wang et al., 2000). En effet, la quantit du compos cible adsorbe dpend fortement des conditions dextraction : temprature, temps dincubation et dextraction, agitation, volumes de lchantillon et de la phase gazeuse. Elle dpend galement de la nature, de lusure de la phase dextraction (perte de sa capacit dadsorption ou de sorption au cours du temps) et de la nature des autres constituants caractrisant le mlange.
IV. Composition chimique des plantes aromatiques

La composition chimique des plantes aromatiques est complexe et est constitue de deux fractions. La premire fraction dite volatile (COV) est prsente dans diffrents organes de la plante selon la famille ; cette fraction est compose de mtabolites secondaires qui constituent lhuile essentielle. Les plantes aromatiques ont la particularit de renfermer au sein de leurs organes scrteurs, des cellules gnratrices de mtabolites secondaires o il apparat clairement comment les molcules trs volatiles sont synthtises partir dunits mthyl-2-buta-1,3-dine (isoprne) et o les ractions daddition de ces units conduisent aux terpnes, sesquiterpnes, diterpnes et leurs produits doxydation tels que les alcools, aldhydes, ctones, thers et esters terpniques. Lensemble de ces produits sont accumuls dans des cellules scrtrices offrant la plante une odeur caractristique (Heinrich et al., 1983). La deuxime fraction dite non volatile de la plante, composs organiques non volatils (CONV), est compose essentiellement de coumarines, flavonodes (Cisowski, 1985), composs actylniques ainsi de lactones sesquiterpniques phnols ou polyphnols jouant un rle fondamental dans lactivit biologique de la plante (Kubeczka et al., 1982)
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Chapitre I : Etude Bibliographique IV.1. Fraction volatile des plantes aromatiques Les huiles essentielles sont des substances odorantes concentres, obtenues partir de plantes par entranement la vapeur deau, hydrodistillation ou expression (pression froid). Le terme huile essentielle a t invent au 16ime sicle par le mdecin suisse Parascelsus von Hohenheim afin de dsigner le compos actif dun remde naturel. Il existe aujourdhui approximativement 3000 huiles essentielles, dont environ 300 sont rellement
commercialises, destines principalement lindustrie des armes et des parfums (Essawi et al., 2000). La norme AFNOR NF T 75-006 dfinit lhuile essentielle comme: un produit obtenu partir dune matire premire vgtale, soit par entranement la vapeur deau, soit par hydrodistillation. Lhuile essentielle est spare de la phase aqueuse par des procds physiques . La majorit des huiles essentielles sont des liquides trs peu colors, volatils temprature ambiante. Les huiles essentielles dgagent une odeur caractristique et sont, en gnral plus lgres que l'eau tout en possdant des caractristiques hydrophobes. Ce sont des molcules lgres qui sont entranes par la vapeur d'eau lors de la distillation, l'huile se spare de l'eau du distillat mais une petite partie persiste dans l'eau et lui communique une odeur, on parle alors d'eau aromatique, rapprocher de l'hydrolat, eau distille aromatise (parfois artificiellement) laquelle on ajoute parfois de l'alcool, des stabilisants chimiques ou des conservateurs. L'utilisation par les humains des plantes aromatiques et donc des huiles essentielles est trs ancienne et assez universelle ; on s'en sert traditionnellement pour conjurer le mauvais sort, se soigner, se dtendre, aromatiser la nourriture, conserver les aliments. Les huiles essentielles contenues dans les herbes aromatiques sont responsables des diffrentes senteurs que dgagent les plantes. Elles sont trs utilises dans lindustrie des cosmtiques, de la parfumerie et aussi de laromathrapie. Cette dernire se veut une technique thrapeutique par le massage, les inhalations ou les bains en utilisant les huiles essentielles des plantes. Les huiles essentielles vont servir de signaux chimiques permettant la plante de contrler ou rguler son environnement (rle cologique): attraction des insectes pollinisateurs, action rpulsive sur les prdateurs, inhibition de la germination des graines, voire communication entre les vgtaux (mission de signaux chimiques signalant la prsence d'animaux herbivores par exemple). Ces huiles sont stockes dans des structures cellulaires spcialises (cellules huile essentielle, poils scrteurs (comme dans la menthe), canaux scrteurs) et ont vraisemblablement un rle dfensif : protection du bois contre les insectes et
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Chapitre I : Etude Bibliographique les champignons, action rpulsive contre les animaux herbivores (Heinrich et al., 1983). La concentration dans les plantes est en gnral faible, aux alentours de 0,1 2%, mais il y a des exceptions comme le clou de girofle avec 15% d'huile essentielle ou la noix de muscade, 515%. Parmi les familles vgtales les plus productrices dhuiles essentielles, on distingue les Lamiaces (famille du Thym, de la lavande, de la menthe, du basilic etc..), les Astraces (camomille, absinthe), les Myrtaces (Cannelle, Laurier), les Apiaces (coriandre). IV.1.1. Localisation et structure histologique des huiles essentielles Toutes les parties des plantes aromatiques peuvent contenir de l'huile essentielle.
les fleurs bien sur, exemples : oranger, rose, lavande ; le bouton floral (girofle) ou les bractes (ylang-ylang)
les feuilles le plus souvent, exemples : eucalyptus, menthe, thym, laurier, sarriette, sauge, aiguilles de pin et sapin
les organes souterrains, exemples : racines (vtiver), rhizomes (gingembre, acore) les fruits, exemples : fenouil, anis, picarpes des Citrus les graines : noix de muscade, coriandre. le bois et les corces, exemples : cannelle, santal, bois de rose. Les huiles essentielles sont produites par diverses structures spcialement diffrencies
dont le nombre et les caractristiques sont trs variables. les poils scrteurs pidermiques rencontrs souvent chez les Lamiaces, Graniaces et Verbnaces. Ils produisent les essences dites superficielles. les organes scrteurs sous-cutans comprenant des cellules et des poches scrtrices qui sont gnralement dissmines au sein du tissu vgtal chez les Myrtace, Rutaces, ainsi que des canaux scrteurs chez les Apiaces. La composition chimique d'une huile essentielle peut varier considrablement :

dans une mme plante selon les organes (feuille, fleur, fruit, bois) dans l'anne selon la saison pour une mme plante, selon les conditions de culture pour une mme espce vgtale (ensoleillement, humidit, longueur du jour, fertilit du sol),
selon les races chimiques (ou chemotypes) pour une mme espce (l'exemple classique est le thym avec 7 races chimiques).
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Chapitre I : Etude Bibliographique IV.1.2. Phnomnes physico-chimiques et facteurs produisant laltration des huiles essentielles Au cours de lhydrodistillation, le milieu aqueux possdant un pH compris entre 4 et 7 (rsultant de limmersion du matriel vgtal), atteint occasionnellement des valeurs infrieures 4 pour certains fruits. Les constituants de lessence native sont soumis aux effets combins de lacidit et de la chaleur, et peuvent subir des conversions chimiques (Morin et al., 1985). Lhuile essentielle rcupre est un produit qui diffre sensiblement de lessence originelle, dautant plus que lbullition est longue et le pH faible. La matire chimique prsente dans le vgtal fait lobjet de ractions chimiques diverses : hydrolyses, dprotonations, hydratations et cyclisations pouvant tre catalyses par des mtaux prsents ltat de traces dans la plante, provoquant des transformations chimiques des constituants (Koedam, 1982). Lhydrolyse desters est souvent la premire raction qui se produit durant le chauffage du vgtal. Elle conduit la formation dacides organiques qui leur tour catalysent les ractions de cyclisation et de dshydratation. La dgradation du sabinne donne un exemple des transformations chimiques de lhuile essentielle lors de lhydrodistillation. Les frquentes modifications chimiques du sabinne ont t tudies par Koedam et al. (Koedam et al., 1980). Ils constatrent quen milieu acide dilu ce compos se transforme en terpinn-4-ol, raction dj signale par Wallach et al. (Wallach, 1907).
Figure 7: Principales conversions chimiques du sabinne lors de l'hydrodistillation
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Chapitre I : Etude Bibliographique Divers auteurs ont confirm ce rsultat et montr que le rarrangement du sabinne produit en plus du terpinn-4-ol, de l-terpinne, du -terpinne, et du terpinolne reprsents dans la figure 7. Pour limiter les artfacts, Richard et al. prconisent de maintenir le pH proche de la neutralit et de minimiser la dure dhydrodistillation, quand bien mme, il est bien connu que la dgradation de la matire vgtale induit la formation dun milieu acide fortement tamponn. En rsum, parmi les constituants sujets aux artefacts, les auteurs signalent particulirement : les monoterpnes (mono et bicycliques), les alcools monoterpniques, les amino-acides soufrs et les oxydes sesquiterpniques. Les tapes successives conduisant lisolement dune essence et les diverses transformations susceptibles de laccompagner se traduisent par la modification de la teneur en certains constituants ou par la formation de nouveaux composs, do une grande variabilit de sa composition. De profondes modifications de lhuile essentielle peuvent intervenir lors de lexploitation des vgtaux depuis leur collecte jusqu leur transformation industrielle. La priode de rcolte, les conditions de transport, de schage et de stockage peuvent engendrer des dgradations enzymatiques. Les changements les plus importants interviennent lors de lhydrodistillation sous linfluence des conditions opratoires, notamment du milieu (pH, temprature) et de la dure dextraction. Dautres facteurs tels que les traitements survenus avant ou pendant lhydrodistillation (broyage, dilacration, dgradation chimique, pression, agitation) contribuent la variation du rendement et de la qualit de lhuile essentielle. Les variations de la composition des huiles essentielles provenant dun mme phnotype se dveloppant dans le mme environnement sont lexpression de diffrences gnotypiques. Elles peuvent tre attribues des hybridations, un polymorphisme gntique ou des mutations.
V. Mthodes didentification chimique des huiles essentielles

Une fois lextrait le plus reprsentatif obtenu, lanalyse permet didentifier et de quantifier les produits qui le composent. Les progrs des mthodes analytiques permettent didentifier rapidement un trs grand nombre de constituants.
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Chapitre I : Etude Bibliographique V.1. Chromatographie en phase gazeuse monodimensionnelle La sparation et lidentification des constituants volatils dun extrait prsente bien moins dalternatives que sa prparation. En effet, la CPG est la mthode de rfrence dans lanalyse des huiles essentielles et des COVs (Lehotay et al., 2002) ; elle permet lanalyse de mlanges, qui peuvent tre trs complexes, de nature et de volatilit trs varies (Arpino et al., 1995). V.2. Chromatographie en phase gazeuse couple lolfactomtrie (CPG/O) Les huiles essentielles obtenues renferment trs souvent des centaines de composs volatils. Le couplage CPG/O combine la sparation des composs volatils par CPG avec lvaluation olfactive. En sortie de colonne, une partie des composs lus est envoye vers un cne de dtection nasale qui permet lvaluation olfactive en mme temps que lenregistrement du chromatogramme. Tous les types de dtecteurs peuvent tre utiliss en parallle au port dolfaction, mais ce sont les dtecteurs FID ou de masse qui sont les plus frquemment utiliss. Afin dviter linconfort d aux effluents chauds et la dshydratation de la muqueuse nasale qui conduit une perte de sensibilit, de lair humide est ajout en sortie de cne (Hanaoka et al., 2000). Loprateur enregistre ses donnes olfactives grce divers dispositifs de saisie (bouton pressoir, curseur, enregistrement vocal) relis un ordinateur. La CPG/O trouve de nombreuses applications tant en Recherche et Dveloppement quen Contrle Qualit. En effet, un certain nombre de composs odeurs ngatives (off flavour) ne sont pas dtects par les instruments classiques. Dans ce cas, la CPG/O est un moyen trs efficace pour les mettre en vidence grce au faible seuil de perception du nez humain. Deux types de donnes peuvent tre obtenus lors dune analyse CPG/O. Tout dabord la sensation perue par lvaluateur qui est dcrite laide dun descripteur et lintensit de la perception.
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Chapitre I : Etude Bibliographique V.3. Chromatographie en phase gazeuse deux dimensions La chromatographie bidimensionnelle consiste coupler deux colonnes de polarits diffrentes pour avoir une sparation parfaite. Cette mthode est applique aux mlanges complexes prsentant de nombreuses co-lutions. Parmi les mthodes de chromatographie deux dimensions, on distingue la mthode dite par pigeage heart-cutting , note CPGCPG (Dunn et al., 2004), de la chromatographie totale, note GCGC (Dugo et al., 2005). V.3.1. Chromatographie deux dimensions heart-cutting CPG/SM La CPG-CPG tait la premire mthode de chromatographie bidimensionnelle (Dunn et al., 2004). Cette mthode consiste slectionner une fraction du chromatogramme qui est mal rsolu sur la premire colonne pour la sparer sur la seconde colonne (Schomburg, 1995) Cette mthode consiste utiliser deux colonnes, deux dtecteurs et un systme de pigeage (figure 8). Le plus souvent, la premire colonne est une colonne apolaire (PDMS) de dimensions classiques. La seconde colonne est alors polaire (PEG), mais bien plus courte et de plus faible diamtre pour permettre une lution rapide. Il est galement frquent dutiliser une colonne chirale comme seconde colonne (Marriott et al., 2003). Les deux colonnes peuvent tre places dans le mme four ou non. Le pigeage dune fraction la sortie de la premire colonne se fait le plus souvent laide dune trappe cryognique. Elle permet de stocker les composs lus de la fraction jusqu ce que la seconde colonne soit disponible pour lanalyse.
Figure 8: Sparation par une Chromatographie en phase gazeuse deux dimensions CPG-CPG
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Chapitre I : Etude Bibliographique V.3.2. Chromatographie totale CPG-2D La chromatographie totale, ou Chromatographie comprhensive GCGC, permet dtudier tous les composs lus de la premire colonne sur la seconde, non pas comme la CPG-CPG o une fraction subit une sparation sur la deuxime colonne. Elle a pour principe linjection continue de petites fractions lues de la premire colonne dans la seconde (Beens et al., 2005). Tout comme dans la CPG-CPG, on utilise deux colonnes de polarits diffrentes, la seconde ayant une dimension beaucoup plus faible (0,5 1,5 m, diamtre interne compris entre 0,1 et 0,25 mm, paisseur de film de 0,1 m) (Dalluge et al., 2003). Ainsi, les diffrentes fractions sont analyses et conduisent chacune de petits chromatogrammes. Lensemble des chromatogrammes enregistrs au cours de lanalyse est reprsent dans un diagramme deux dimensions, communment nomm contour plot, sur lequel labondance des composs dtects est traduite par des couleurs variables. lheure actuelle, le seul dtecteur de masse parfaitement adapt au couplage la CPG-2D est le dtecteur de masse temps de vol (GCGC/TOF-MS). Ce spectromtre possde la vitesse dacquisition des spectres (> 500 Hz), autorisant lenregistrement de 10 20 spectres par pic, ncessaire au couplage la CPG-2D.
VI. Activits biologiques des plantes aromatiques

VI.1. Gnralits Les aliments lipidiques ne peuvent tre stocks que pendant des priodes courtes cause de la rsistance insuffisante loxydation par loxygne. Dans les aliments schs, loxygne peut pntrer trs facilement dans la phase lipidique et la stabilit de ces aliments devient donc plus faible en prsence deau. Ainsi, la stabilit des aliments schs doit tre teste, et si ncessaire, la fraction lipidique doit tre prserve en rajoutant des antioxydants dans la formulation du produit alimentaire. Loxydation des lipides est une cause majeure de la dtrioration de la qualit des aliments contenant des matires grasses, do lutilisation devenue de plus en plus frquente des antioxydants. Les antioxydants synthtiques les plus utiliss sont le hydroxyanisol butyl (BHA) et lhydroxytolune butyl (BHT), ces deux composs sont assez volatils et se dcomposent rapidement des tempratures leves (Branen, 1975). Il existe de srieux problmes concernant lutilisation et la toxicit de ces deux produits synthtiques, tant au niveau de leur mtabolisme que de leur accumulation dans les tissus de lorganisme humain
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Chapitre I : Etude Bibliographique (Linderschmidt et al., 1986) ; ainsi les prparations dantioxydants naturels sont vivement recherches. Depuis lantiquit, les plantes aromatiques furent utilises le plus souvent par les parfumeries. Cependant, durant ces dernires dcennies, elles sont devenues sources dantioxydants naturels et dagents antimicrobiens (Bandoniene et al., 2000). Les huiles essentielles quant elles, ainsi que les extraits aromatiques ont t utilises pour leurs proprits antiseptiques. Dans lEgypte ancienne, les techniques de lembaumement utilisant les rsines aromatiques, ainsi que lHE, produisaient une inhibition puis une destruction de tous les microorganismes prsents, en assurant une conservation pratiquement infinie du corps. Dans les vieux ouvrages de mdecine, les rsines aromatiques ou lHE taient les principes actifs quon peut retrouver dans les diffrentes drogues vgtales ayant des proprits antiseptiques significatives. Dans les ouvrages les plus rcents, lutilisation des huiles essentielles dans laromathrapie laisse entrevoir une perspective dalternative aux mdicaments de synthse. Les plantes aromatiques possdent plusieurs activits biologiques, parmi lesquelles on peut citer les activits suivantes : * Fongistatique * Nmaticide * Bactriostatique * Insecticide * Herbicide * Antioxydante
Les huiles essentielles possdent de nombreuses activits biologiques. En phytothrapie, elles sont utilises pour leurs proprits antiseptiques contre les maladies infectieuses dorigine bactrienne. Cependant, elles possdent galement, des proprits cytotoxiques qui les rapprochent donc des antiseptiques et dsinfectants en tant quagents antimicrobiens. Dans des prparations pharmaceutiques, les terpnes phnoliques, comme le thymol et le carvacrol, sont souvent utiliss comme antiseptiques antibactriens et antifongiques. Le thymol est trs irritant, astringent et caustique. Dans les domaines phytosanitaires et agro-alimentaires, les huiles essentielles ou leurs composs actifs pourraient galement tre employs comme agents de protection contre les champignons phytopathognes et les microorganismes envahissant les denres alimentaires. Les huiles essentielles les plus tudies dans la littrature pour leurs proprits antibactriennes et antifongiques appartiennent la famille des Lamiaces : thym, origan,
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Chapitre I : Etude Bibliographique lavande, menthe, romarin, sauge, etcLHE de thym dEspagne (Thymus capitatus) est souvent rapporte comme tant parmi les huiles les plus actives. Dans notre tude, nous nallons nous intresser qu deux activits biologiques : les activits antioxydantes et antibactriennes VI.2. Technique dextraction des antioxydants Un extracteur de Soxhlet est une pice de verrerie utilise en chimie analytique et en chimie organique permettant de faire lextraction continue par solvant dune espce chimique contenue dans une poudre ou dans une matrice vgtale. VI.3. Activits antioxydantes des plantes aromatiques : huiles essentielles, extraits aromatiques. VI.3.1. Oxydation et auto oxydation Loxygne est le premier lment essentiel pour la vie, responsable du fonctionnement normal de tout le systme arobie (Namiki, 1990). Par contre lO2 est responsable dun nombre de processus doxydation suivi de mauvaises consquences comme le stress oxydatif (Dalton, 1995; Garcia-Plazaola et al., 1999), la dtrioration de la qualit des aliments (Finely et al., 1993; Hiramatsu et al., 1994; Frankel, 1996) ainsi que le dsordre de la sant humaine qui est reli loxydation des molcules biologiques (Bermond, 1990; Ramarathnam et al., 1995). Les substances doxydation peuvent avoir diffrentes structures chimiques que sont les protines, ADN, acides gras non saturs, cholestrol, phospholipide, etc.Aprs leau et lair, la nutrition est le troisime lment essentiel de la vie. Les lipides constituent les composs majeurs de notre nutrition, leur tude est donc un sujet trs important pour la protection contre loxydation puisquils sont des lments constitutifs des membranes cellulaires. En raison de leur insaturation, les lipides naturels sont trs sensibles loxydation. Le mcanisme doxydation le plus connu des lipides dans les aliments est lauto-oxydation. Ce mcanisme comprend trois phases, initiation, propagation et terminaison. La plupart des aliments contiennent des traces de mtaux rsultant de lemballage ou de stockage ou mme de la composition alimentaire. Des traces de mtal dans laliment avec des concentrations infrieures 0,5ppm sont suffisantes pour catalyser loxydation des lipides (Labuza, 1971; Larson, 1997). Le mtal le plus actif est celui qui est capable de subir une raction de transfert dlectron (Redox).
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Chapitre I : Etude Bibliographique RH + M R. + MH La consquence des mcanismes dinitiation est la formation de radicaux lipidiques et ce stade du processus sappelle Initiation de loxydation figure 9. La raction est lente et la concentration du radical au dbut est faible. Le mcanisme dtaill dans lequel le radical libre est form partir dun lipide est pour linstant en tude. La phase de propagation commence aprs que linitiation soit finie. Le radical libre gnr ragit trs facilement avec loxygne bi radicalaire pour produire le radical peroxyd (ROO), cette raction est rapide et la concentration en radicaux peroxyds augmente trs rapidement. Le radical peroxyd attaque dautres molcules lipidiques afin de produire des lipides hydro peroxyds (ROOH) et la prolifration des radicaux libres dans le systme. Le radical peroxyd (ROO) est considr comme la molcule cl dans la raction doxydation des lipides. Selon le degr de saturation du lipide, le radical peroxyd peut tre dissocier en des hydroxyles radicalaire (HO.) et alkoxyl (RO.) ; cette phase sappelle liaison (Branching) le radical hydroxyl est extrmement ractif (demie Vie 10-9s) (Pietta, 2000). Il attaque toute espce dans son entourage, ce qui va produire des milliers de radicaux libres et acclrer le processus doxydation. La dcomposition des hydroperoxydes donne lieu la formation de produits volatils faible poids molculaire, comme les aldhydes, les ctones, les hydrocarbures et les acides. Ces produits doxydation secondaire sont trs importants dans le domaine alimentaire, cause de lodeur quils produisent. Une trs faible quantit de lordre du ppb est capable de donner une odeur inacceptable pour laliment (Labuza, 1971). Les produits doxydation secondaires participent plusieurs ractions, comme loxydation, dcomposition, polymrisation, etc. Les produits obtenus partir de ces ractions affectent ngativement la couleur, la texture, et la qualit de laliment (Bermond, 1990). Ils peuvent ragir avec des protines et produire une dsactivation des enzymes (Decker, 1998). La prsence de ces radicaux instables dans notre organisme est en grande partie responsable du vieillissement prmatur de nos cellules et de la pathogense de nombreuses maladies telles que les tches sur la peau, le cancer, les maladies dgnratrices (sclrose en plaques et la maladie dAlzheimer).
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Chapitre I : Etude Bibliographique Raction dinitiation : Formation des radicaux peroxy (ROO), alkoxy (RO) ou alkyl (R). RH + O2 R + HOO Raction de propagation R + O2 ROO (Rapide) ROO + RH ROOH + R (Lente) RO + RH ROH + R Raction de Liaison ROOH RO + OH 2ROOH ROO + RO + H2O Raction de Terminaison R + R produits stables non radicalaire R + ROO produits stables non radicalaire ROO + ROO produits stables non radicalaire
Figure 9 : Prsentation schmatique du processus d'auto oxydation

VI.3.2. Les antioxydants Loxydation des lipides est un processus qui fait intervenir plusieurs types de ractions, une varit dintermdiaires chimiques et une multitude de facteurs. Cependant, plusieurs approches permettant de contrler loxydation sont possibles. En termes de protection et de prservation des aliments, diffrentes mesures pour contrler et minimiser loxydation de lipides sont recherches par les industries. Ceci implique le remplacement des acides gras polyinsaturs avec plus de lipides monoinsaturs et stables ; une hydrognation partielle des lipides polyinsaturs, le contrle du paramtre de stockage comme la limite daration, la minimisation des traces de mtaux, ainsi que des conditions de stockage appropris (Decker, 1998; Frankel, 1998). Nanmoins il est quasi impossible de maitriser pratiquement tous les facteurs qui provoquent loxydation. Cependant lajout des antioxydants peut prvenir ou ralentir le processus doxydation. Un antioxydant est un rducteur, mais un rducteur nest pas ncessairement un antioxydant (Prior et al., 1999). Le terme antioxydant a t formul comme une substance qui en faibles concentrations, en prsence des du substrat oxydable, ralentit ou 1995). empche Food
significativement
loxydation
substrats
matriels
(Halliwell,
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Chapitre I : Etude Bibliographique antioxydant est spcialement formul comme une substance qui, en faible quantit, est responsable du ralentissement de loxydation des composs facilement oxydables comme les acides gras. (Frankel et al., 2000). Cependant, derrire cette simple description se cache un phnomne trs complexe qui est celui de loxydation-antioxydation. Les antioxydants exercent leur protection diffrents stades de loxydation lipidique et par lintermdiaire de mcanismes diffrents. Une distinction doit tre prvue entre une courte et une longue protection de lantioxydant par rapport la cintique de raction (Antolovich et al., 2002). La classification de tous les antioxydants connus est difficile, ils sont classs gnralement par leur mcanisme daction ou par leur nature chimique. VI.3.3. Division des antioxydants par rapport leur mcanisme daction (i) Groupe I. Plusieurs noms ont t attribus ce groupe par exemple, antioxydants primaires, chain-breaking, pigeur des radicaux libres. Ce genre dantioxydants peut inhiber la raction dinitiation et la propagation de loxydation en participant au processus doxydation et en convertissant les radicaux libres vers leurs formes inactives. Les antioxydants primaires sont gnralement des composs phnoliques (AH) capables de donner un atome dhydrogne au radical libre et le convertir en un compos stable non radicalaire. Les antioxydants de ce groupe ragissent de faon prdominante avec les radicaux peroxyls, pour deux raisons : la concentration leve de ces radicaux et la faible nergie du groupement (ROO), en comparaison avec les autres radicaux comme le (RO) et la faible concentration du pigeur du radical libre dans laliment. Un pigeur du radical libre, mme des concentrations faibles, entre en comptition avec les lipides pour rendre le radical libre inactif par lintermdiaire dune raction de libration dun lectron, suivie dune dprotonation (Frankel et al., 2000). (ii) Groupe II. Les composs de ce groupe sont catalogus comme prventifs ou antioxydants secondaires. Ils englobent une large gamme de diffrentes substances chimiques qui inhibent loxydation des lipides par diffrents mcanismes et ne transfrent pas le radical libre sous sa forme non-radicalaire. Avec quelques exceptions, les antioxydants secondaires sont gnralement relis linhibition de facteurs initiant loxydation. Le groupe II inclut : des chlateurs de mtaux pro-oxydatifs, des dsactivateurs de loxygne singulet, des pigeurs de la molcule doxygne, inhibiteurs des enzymes pro-oxydative, enzymes antioxydantes et destructeurs des hydroperoxides.
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Chapitre I : Etude Bibliographique Parfois, quelques antioxydants peuvent exercer plusieurs fonctions anti-oxydatives, par exemple, lacide ascorbique peut tre un pigeur du radical libre, dsactivateur des oxygnes singulets dans une solution aqueuse et effectivement rgnrer du tocophrol. Plusieurs flavonodes sont des pigeurs de radicaux libres et chlateurs de mtaux (Miller et al., 1996).
VI.3.4. Division des antioxydants suivant la nature chimique (naturel et synthtique) Dans lalimentation, les antioxydants les plus utiliss sont des composs phnoliques (chainbreaking). Plusieurs antioxydants synthtiques [BHT, BHA], hydroquinone de butyle tertiaire (TBHQ) et gallate de propyle (PG) (figure 10-1, 2, 3, 4) et quelques composs naturels [tocophrol, acide ascorbique, Bta-carotne] (figure 11-5, 6, 7) sont officiellement autoriss pour lutilisation dans lalimentation. Cependant, des tudes toxicologiques ont jug certains antioxydants synthtiques comme sources de danger (Barlow, 1990; Evans et al., 1992). La recherche de nouveaux antioxydants naturels est lobjectif de nombreux industriels et scientifiques. Dans la littrature, des milliers de publications ayant pour sujet les antioxydants naturels ainsi que leur effet sur lorganisme humain peuvent tre consultes (Namiki, 1990; Wanasundara et al., 1994; Larson, 1997; Pietta, 2000; Moure et al., 2001). Quelques produits naturels sont dj exploits dans le march (Schuller, 1990). Par exemple lacide ascorbique, le tocophrol, lhuile de ssame, lhuile dolive (Pratt, 1980; Taga et al., 1984; Altarejos et al., 2005; Perez-Bonilla et al., 2006). Des recherches intensives sur plusieurs plantes on t entreprises, plusieurs composs actifs ont t isols et valus comme tant des antioxydants. Dans la majorit des cas le compos actif est un compos phnolique (Cuvelier et al., 1992; Marinova et al., 1992; Chen et al., 1997), des isoflavones, ou phenylpropanoides, de lacide phnolique (figure 11-8, 12) (Cuvelier et al., 1992; Marinova et al., 1992; Rice-Even et al., 1994; Chen et al., 1997), flavonodes (figure 11-14, 15) (Rice-Even et al., 1994; Heilman et al., 1995; Pietta, 2000), isoflavones (figure 11-16), catechine (figure 11-17) (Kanner et al., 1994), phenylpropanoide (figure 11-19), anthocyanidine (Wang et al., 1998), et chalcones. La proprit antioxydante des composs phnoliques est dtermine par sa richesse en lectrons libres, ce qui implique une libration facile de cet lectron suivie de la dprotonation de son groupe hydroxyle (Frankel et al., 2000). Chez les plantes, les substances naturelles se trouvent sous forme de mlange complexe, qui assure la protection de la plante contre le stress oxydatif d aux effets
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Chapitre I : Etude Bibliographique synergiques ou additifs (Pratt, 1980; Moure et al., 2001). Lutilisation des extraits de plantes ou de fractions enrichies est devenue aujourdhui une faon trs attractive pour prserver les aliments. De plus, il a t dmontr que plusieurs produits naturels (antioxydants) avaient des proprits mdicinales, par exemple : anti cancrigne, anti-inflammatoire (Madhavi et al., 1995). Cependant il faut contrler le fait que le produit naturel soit inoffensif. Par exemple, on a dmontr in vitro que quelques flavonodes peuvent tre mutagnes (Sahu et al., 1993).
Figure 10: Structures chimiques de quatre antioxydants synthtiques
Dun point de vue gnral, un antioxydant est une molcule qui diminue ou empche loxydation dautres substances chimiques en rompant la chane des ractions radicalaires. Et dun point de vue chimique, un antioxydant nest quun compos rducteur ; il va donc pouvoir ragir avec un oxydant pour le neutraliser. Les antioxydants vont alors rduire les radicaux libres en annihilant ainsi leur action. Les antioxydants sont capables de stopper les ractions en chane dcrites prcdemment et empchent donc la formation de molcules trs ractives ou provoquent llimination de ces espces avant lendommagement des constituants de la cellule.
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Figure 11: structures chimiques des antioxydants naturels
Tout organisme vivant possde un systme dantioxydants et denzymes qui agissent ensemble pour empcher lendommagement des composants des cellules comme lADN, les lipides et les protines. Par exemple, notre organisme est capable de produire, partir de lacide amin cystine, un antioxydant puissant, lacide alpha-lipoique, conduisant aux sels encore appels lipoates. De nombreux extraits de plantes, en particulier ceux qui sont riches en composs polyphnoliques, montrent certains effets antioxydants. Les plantes produisent de nombreux antioxydants pour se protger, tels le glutathion, la vitamine C, la vitamine E, ou des enzymes telles que la catalase, la superoxyde dismutase et certaines peroxydases. Les fruits et les lgumes sont bien connus pour tre riches en antioxydants. Les fruits notamment ceux dits rouges, tels les airelles, du fait de la prsence conjugue de vitamine C et de polyphnols, et pour les lgumes ayant la plus forte concentration en antioxydants ; on trouve la tomate, le cresson, lail, le chou vert, lpinard, la betteraveIl faut savoir que lors de la cuisson de ces aliments, certains antioxydants tels que la vitamine C sont inactivs, alors que dautres se transforment pour devenir plus actifs ou plus facilement absorbables par le systme digestif.
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VII. Mthodes dvaluation de lactivit antioxydante

VII.1. Gnralits Dans la littrature, plusieurs mthodes et techniques ont t trouves pour suivre ltat doxydation des lipides et ainsi valuer lactivit antioxydante (Shervin, 1968; Ragnarsson et al., 1977; Namiki, 1990; Frankel, 1996). En principe, si un compos montre une faible activit antioxydante in vitro, il est trs rare quil prsente une activit meilleure in vivo (Hanasaki et al., 1994). Les mcanismes doxydation et de prvention in vivo sont diffrents cause de la permabilit cellulaire et le processus de transport (Antolovich et al., 2002) et ne sont pas discuts dans cette thse. La majorit de ces mthodes contient des phnomnes chimiques, des processus physiques et des instrumentations incluant : Chromatographie GC, HPLC, ainsi que plusieurs techniques ; spectroscopies UV/Visible, IR, Fluorimtrie, SM, RMN. La plupart des procds analytiques exigent un prtraitement avant la mesure proprement dite. Ces mthodes couvrent les antioxydants primaires et secondaires. La plupart des mthodes mesure un paramtre particulier en fonction du temps, dautres mthodes enregistrent la vitesse doxydation (bombe oxygne, gain de poids, mesure des radicaux libres par EPR). Pour diminuer le temps danalyse, des tempratures leves sont appliques. Le stockage temprature ambiante est toujours utilis ; ainsi il est plus reprsentatif des circonstances de la vie relle de laliment. Pour simplifier le protocole exprimental et pour faciliter les tudes thoriques, des systmes modles ont t labors comme le -carotne bleaching test (Bocco et al., 1998). Quelques analyses permet de mesurer la quantit du produit intermdiaire ou final gnr par une oxydation (dines conjugus, TBARS). A cause de la proprit essentielle de lantioxydant (pigeur des radicaux libres), plusieurs mthodes ont t mises en place pour valuer lefficacit de lantioxydant piger les radicaux libres (ABTS, DPPH). Afin de choisir la bonne mthode, il faut savoir ce que lon va mesurer et valuer. Par exemple, la quantit des hydroperoxydes accumule doit tre mesure avant quils ne commencent diminuer ; aprs la dcomposition des hydroperoxydes, le degr doxydation de lchantillon doit tre mesur en se basant sur la formation des produits doxydation secondaire.
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Chapitre I : Etude Bibliographique VII.2. Quelques mthodes dvaluation de lactivit antioxydante Les avantages et les limites des mthodes dvaluation de lactivit antioxydante ainsi que les rfrences sont prsentes dans le tableau 3. Il est clair quil serait difficile de dvelopper une mthode qui prenne en compte tous les paramtres et qui soit applicable sur tous les substrats et les antioxydants.
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Tableau 3: Les avantages et les limites de quelques mthodes destimation de la stabilit des lipides et d'valuation de l'activit antioxydante
Mthodes Test de stabilit huile/graisses Gain de poids
avantages
limites
rfrence
+ simple performance + quipement commun + reproductibilit satisfaite
faible sensibilit formations des composs volatils qui affectent les rsultats
(Wanasundara et al., 1994; Pokorny et al., 1997; Frankel, 1998)
Bombe oxygne
+ reproductibilit excellente + mesure la vitesse doxydation + faible quantit dchantillon
TC trs leves Contamination provenant du tissu en papier couvrant lchantillon
(Huang et al., 2005)
Mthodes dvaluation des antioxydants HPLC Analyse de changement de la composition en acide gras + trs sensible + reproductible + information quantitative et qualitative sur les acides gras impliqus dans loxydation besoin de connaissance sur la nature et la rtention des composs analyss instruments coteux (Gebicki et al., 1989; Frankel, 1998)
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Valeur du peroxidation
+ Information sur les hydroperoxydes forms Non adaptable avec ltude avance de + Adaptable dans le milieu huileux loxydationhydro peroxyde commence se dcomposer
(Gebicki et al., 1989; Takao et al., 1994; Frankel, 1996; Zhang et al., 1996)
Titration iodometrique
+ Protocole analytique commun + Prcise + sensible
non adaptable avec le matriel biologique possibilit doxydation diode
(Gebicki et al., 1989; Takao et al., 1994; Yen et al., 1995; Zhang et al., 1996)
Dines conjugus
+ sensible + reproductible + rsultats ne dpend pas de la ractivit chimique + rapide + mesure une courte priode doxydation + faible quantit dchantillon + utilisation de mthode spectroscopique simple + adaptable avec les mulsions et lhuile.
Prsence dautre chromophore qui absorbe exige une oxydation douce pour viter la formation dhydroperoxide Non adaptable avec les huiles hydrognes qui contiennent des dines Absence dinformation sur la structure des composs
(Kanner et al., 1994; Frankel, 1998; Madsen et al., 1998; Prior et al., 1999; Antolovich et al., 2002)
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TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances)
+ Simple + Sensible, surtout pour les lipides poly insaturs + Prcise + utilisation de mthodes spectroscopiques simples + bonne corrlation avec lanalyse sensorielle des huiles vgtales + simple + rapide + sensible + utilisation des mthodes spectroscopiques simple
pas trop sensible pour les lipides mono et di insaturs les conditions de la raction affectent le dveloppement grande influence des paramtres de la raction (lumire, temprature, temps de chauffage, prsence des ions mtalliques ou des amines) protocole exprimental provoque parfois des artfacts non spcifique influence des conditions exprimentales les donnes obtenues ne sont pas relies directement ltat doxydation actuel mcanisme doxydation pas clair
(Moller et al., 1991; Yang et al., 1991; Jacobson, 1993; Miura et al., 1998)
B-carotne bleaching test
(Marco, 1968; Miller et al., 1993; Dapkevicius, 1998; Fukumoto et al., 2000)
Autres mthodes dvaluation des antioxydants ORAC (capacit dabsorbance du radicale oxygn) + spcifique + adaptable plusieurs antioxydants ncessite un dtecteur fluorimtrique non linaire en fonction du temps longue (Pieri et al., 1994; Cao et al., 1998)
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RPE (Rsonnance
+ la seule technique analytique qui dtecte les radicaux libres dans lauto oxydation + dtecte et value mme les radicaux de courtes dures de vie + enregistre la formation et la disparition des produits doxydation + trs faible quantit dchantillon + simple + rapide + non destructive + trs faible quantit dchantillon + rapide
ncessite des instruments sophistiqus lapplication directe sur loxydation des lipides est limite cause de la courte dure de vie des radicaux libres non spcifique non sensible
(Yang et al., 1991)
Paramagntique + slective Electronique)
IR (infrarouge)
(Frankel, 1998)
H-RMN
le changement de profils des acides gras a un effet sur loxydation primaire et secondaire non spcifique non sensible
(Wanasundara et al., 1994)
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VIII. Huiles essentielles comme agents antimicrobiens

VIII.1. Gnralits Depuis lAntiquit, les extraits aromatiques des plantes ont t utiliss dans diffrentes formulations, comme pour les mdicaments et la parfumerie (Heath, 1981). Les huiles essentielles ont t considres comme les agents antimicrobiens les plus efficaces prsents dans ces plantes. Les qualits antimicrobiennes des plantes aromatiques et mdicinales sont connues depuis lantiquit. Toutefois, il aura fallu attendre le dbut du 20ime sicle pour que les scientifiques commencent sy intresser. Ces proprits antimicrobiennes sont dues la fraction des huiles essentielles contenue dans les plantes. Il existe aujourdhui approximativement 3000 huiles, dont environ 300 sont rellement commercialises, destines principalement lindustrie des armes et des parfums. Mais la tendance actuelle des consommateurs rechercher une alimentation plus naturelle, a entran un regain dintrt des scientifiques pour ces substances (Essawi et al., 2000). Depuis deux dcennies, des tudes ont t menes sur le dveloppement de nouvelles applications et lexploitation des proprits naturelles des huiles essentielles dans le domaine alimentaire. Les effets antimicrobiens de diffrentes espces dherbes et dpices sont connus depuis longtemps et mis profit pour augmenter la dure de vie des aliments. Ainsi, les huiles essentielles, actuellement employs comme armes alimentaires sont galement connus pour possder des activits antimicrobiennes et pourraient donc servir dagents de conservation alimentaires, et ce dautant plus quils sont pour la plupart classs gnralement reconnus comme sains (Generally Recognized As Safe GRAS), ou approuvs comme additifs alimentaires par la Food and Drug Administration. Ils nont, par consquent, pas besoin dautorisation demploi dans les aliments ; cependant, des tudes pralables sont ncessaires afin de mieux cerner leur activit antimicrobienne. Les huiles essentielles ont un spectre daction trs large puisquelles inhibent aussi bien la croissance des bactries que celle des moisissures et des levures. Leur activit antimicrobienne est principalement fonction de leur composition chimique, et en particulier de la nature de leurs composs volatils majeurs (Sipailiene et al., 2006). Elles agissent en empchant la multiplication des bactries, leur sporulation et la synthse de leurs toxines. Pour les levures, elles agissent sur la biomasse et la production des pseudomycliums alors quelles inhibent la germination des spores, llongation du myclium, la sporulation et la production de toxines chez les moisissures.
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VIII.2. Mode daction contre les bactries Lactivit antimicrobienne des HE a fait lobjet dun grand nombre de publications lchelle internationale. Cependant, la majorit des travaux cits dans ces publications sarrtent au niveau de la mise en vidence de lactivit antimicrobienne de ces HE. Les tudes sur les mcanismes daction de cette activit sont en nombre ngligeable. Jusqu prsent, il nexiste pas dtude pouvant nous donner une ide claire et prcise sur le mode daction des HE. Etant donn la complexit de leur composition chimique, tout laisse penser que ce mode daction est assez complexe et difficile cerner du point de vue molculaire. Il est trs probable que chacun des constituants des HE ait son propre mcanisme daction Dune manire gnrale, leur action se droule en trois phases : * attaque de la paroi bactrienne par lhuile essentielle, provoquant une augmentation de la permabilit puis la perte des constituants cellulaires. * acidification de lintrieur de la cellule, bloquant la production de lnergie cellulaire et la synthse des composants de structure. * destruction du matriel gntique, conduisant la mort de la bactrie.
IX. Mthode dvaluation de lactivit antibactrienne

La technique utilise pour dterminer le pouvoir antimicrobien des HE a une grande influence sur les rsultats. Des difficults pratiques viennent de linsolubilit des constituants des HE dans leau, de leur volatilit et de la ncessit de les tester faibles concentrations. A lheure actuelle, lactivit antimicrobienne in vitro dune substance peut tre mise en vidence par un grand nombre de techniques classiques, aussi bien en milieu solide quen milieu liquide. IX.1. Technique en milieu solide (mthode de la diffusion en disque) La diffusion de lagent antimicrobien dans le milieu de culture ensemenc rsulte dun gradient de lantimicrobien. Quand la concentration de lantimicrobien devient si dilue quil ne peut plus inhiber la croissance de la bactrie teste, la zone dinhibition est dmarque. Le diamtre de cette zone dinhibition autour du disque de lantimicrobien est corrle avec la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour la combinaison particulire
bactrie/antimicrobien, la zone dinhibition correspond inversement la CMI de lessai. Gnralement, plus la zone dinhibition est importante, plus la concentration dantimicrobien ncessaire pour inhiber la croissance bactrienne des organismes est faible.
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Chapitre I : Etude Bibliographique La mesure manuelle des zones dinhibition peut prendre du temps. Les dispositifs automatiss avec zone de lecture sont disponibles et peuvent tre intgrs avec le rapport de laboratoire et les systmes de manipulation de donnes. Les disques devraient tre distribus galement de sorte que les zones dinhibition autour des disques antimicrobiens dans lessai de diffusion en disque ne se chevauchent pas et quainsi la zone dinhibition puisse tre dtermine. Gnralement cela peut tre effectu si les disques sont distants dau moins 24 mm de centre centre, bien que cela dpende de la concentration du disque et de la capacit de lantimicrobien diffuser dans la glose. IX.2. Technique en milieu liquide (mthode de dilution) Le but des mthodes de dilution en bouillon et en glose est de dterminer la concentration la plus faible de lantimicrobien test qui inhibe la croissance de la bactrie teste (la CMI, habituellement exprime en mg/mL ou mg/litre). Cependant, la CMI ne reprsente pas toujours une valeur absolue. La vritable CMI est un point entre la plus basse concentration qui empche la croissance de la bactrie et la concentration infrieure immdiate. IX.2.1. La dilution en bouillon La dilution en bouillon est une technique dans laquelle une suspension bactrienne ( une concentration optimale ou approprie prdtermine) est teste contre des concentrations variables dun agent antimicrobien dans un milieu liquide. La mthode de dilution en
bouillon peut tre effectue dans des tubes contenant un volume minimum de 2 ml (macrodilution) ou dans de plus petits volumes laide de plaques de microtitration (microdilution). Lutilisation de ces plaques avec un protocole document, y compris les prcisions sur les micro-organismes de rfrence appropri, peut faciliter la comparaison des rsultats entre analyses. IX.2.2. La dilution en glose La dilution en glose implique lincorporation dun agent antimicrobien dans un milieu glos des concentrations variables, en gnral une dilution en srie de 2 en 2, suivie de lensemencement dun inoculum bactrien dfini la surface de la glose de la bote.
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Chapitre II : Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation
Chapitre II
Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation
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Rsum
Les huiles essentielles obtenues par hydrodistillation des plantes aromatiques selectionnes ont t caractrises par analyse chimique puis sensorielle. Une pyramide olfactive a t tablie en dfinissant les notes de tte, de cur et de fond. Des analyses sensorielles par CPGSM-O ont permis de dcrire le profil aromatique des extraits. Lactivit antioxydante des huiles essentielles mais galement des rsidus dhydrodistillation a t value par trois mthodes diffrentes : Oxipress, mthode spectroscopique et DPPH. Enfin lactivit antibactrienne des huiles essentielles a t value par deux mthodes diffrentes : diffusion sur Agar et plaque de microtitration. Les rsultats de ces travaux montrent une activit antioxydante et une activite antibactrienne significative pour lensemble des cinq plantes.
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Introduction
Chacune des cinq plantes aromatiques slectionnes va tre fractionne par hydrodistillation. Les diffrentes fractions obtenues seront ensuite caractrises par des analyses chimiques, biologiques et sensorielles (voir schma ci-dessous).
Schma rprsentatif des diffrentes tudes effectues dans le chapitre II.
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I. Composition chimique des huiles essentielles

I.1. Achillea millefolium : caractrisation de la fraction volatile des parties ariennes LAchille millefeuille utilise dans cette tude est de nature sauvage. Elle a t rcolte par cueillette dans la banlieue sud-est de Toulouse durant le mois de mai 2008. Lidentification botanique a t effectue par le Pr. Isabelle FOURAST. Un chantillon d'herbier a t dpos l'herbier du Laboratoire de pharmacognosie de la Facult de Pharmacie de Toulouse (Universit Toulouse III) sous le numro Ast 251 (2008) (I.F) . La partie arienne frache comprenant les sommits blanches fleuries a t hydrodistille pendant 3 heures afin dobtenir une huile essentielle de couleur jaune tendance verte. Le rendement dhydrodistillation est de 0,07 0,01 % par rapport la matire sche. La mthodologie ainsi que les diffrentes quantits utilises sont dcrites dans la partie exprimentale (cf. I.1.3). Lextraction de lhuile essentielle a t rpte six fois. Etude cintique de lextraction par hydrodistillation dAchillea millefolium Dans le but doptimiser la dure dextraction, nous avons tudi la cintique du rendement en huile essentielle par rapport la matire sche (figure 12).
rendement % matire sche
0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 1 2 3 4 5 6 7 dure de l'hydrodistillation (h)
Figure 12: Cintique d'hydrodistillation de l'Achille millefeuille en fonction du temps
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La vitesse dextraction augmente progressivement jusqu 3h pour atteindre un plateau. Le temps optimum de cette hydrodistillation est denviron 3h. En accord avec la bibliographie nous proposons de fixer la dure dhydrodistillation des plantes 3 heures. I.1.1. Composition chimique de lhuile essentielle dAchillea millefolium et discussion Aprs extraction par hydrodistillation des parties ariennes, la composition de lhuile essentielle est analyse par chromatographie en phase gazeuse ionisation de flamme couple la spectromtrie de masse (CPG-SM-DIF) (Clarus MS 500, Perkin Elmer). Le mode opratoire est dtaill dans la partie exprimentale (cf. II.2.2). Les rsultats analytiques sont regroups dans le tableau 6.
Lidentification est ralise laide des indices de rtention calculs sur la base des n-alcanes C5-C18, des spectres de masse obtenus en ionisation par impact lectronique (EI, 70eV) compares aux bases de donnes NIST 2005, Wiley 275 et des donnes de la littrature (Mclafferty, 2005). A partir de lAchille millefeuille poussant sous forme sauvage Toulouse, nous avons pu obtenir une huile essentielle par hydrodistillation de la partie arienne frache. Cette huile essentielle possde une odeur caractristique et forte de choux menthol. Le rendement de lhydrodistillation varie de manire significative selon lorigine de la plante et apparait relativement faible par rapport ceux obtenus par dautres auteurs (Kalinkina et al., 2000; Orav et al., 2001; Todorova et al., 2001). Il se rvle tre nanmoins similaire celui obtenu avec des espces indiennes (Shawl et al., 2002). Lintensit de la couleur dpend de la quantit de chamazulne prsent dans lextrait, ce dernier provient de la dgradation de la matricine durant lhydrodistillation (Orav et al., 2001).
Lhuile essentielle est un complexe mixte de 50 composs, parmi eux 45 composs ont t identifis constituant 96% de la quantit totale de lHE (Tableau : 4). La fraction de monoterpnes oxygns comme le camphre (12,6%), le sabinne (6,7%), le trans-actate de chrysantnyle (6,6%), le 4-terpinol (5%), lisocyclocitral (4,5%), leucalyptol (4%) et le bta-pinne (3,3%) constituent la majorit de la composition de lhuile essentielle, puis viennent les sesquiterpnes et les sesquiterpnes oxygns qui sont prsents 19%, comme le
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germacrne-D (11,73%) et le (E)-nrolidol (7,2%). La structure chimique des composs majoritaires est reprsente dans la figure 13.
Tableau 4: Rsultats
des analyses par CPG-DIF-SM de lhuile essentielle dAchillea millefolium issues de lhydrodistillation des parties ariennes IRa (FID) 800 849 926 935 952 974 981 1018 1025 1034 1058 1086 1099 1103 1119 1126 1138 1144 1151 1163 1139 1146 _ IRthb 790 854 927 939 954 975 979 1017 1026 1031 1060 1089 1097 1101 _ _ Identificationc Hexane-2,3-dione 3-hexne-1-ol hexanoate de mthyle alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne alpha-terpinne para-cymne 1,8-cinole gamma-terpinne terpinolne linalol nonanal isocyclocitral bta-terpinne ni trans-pinocarvol camphre 2,4,6-trimthyl-3cyclohexne-1carboxaldhyde, %d 0,05 0,22 0,18 1,70 1,60 6,72 3,28 0,70 0,82 4,03 1,71 0,35 1,78 0,61 4,48 0,39 0,28 0,55 12,64 1,76 CVe 8,05 16,67 13,84 8,05 8,09 10,46 8,69 8,29 10,09 9,28 10,55 6,82 12,09 11,49 10,36 4,26 22,57 22,18 11,38 11,37
Pics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IRa (TIC) 801 848 923 931 947 970 976 1015 1022 1030 1055 1083 1099 1103 1115 1122 1134 1138 1146 1160
21 22 23 24
1170 1179 1193 1228
1175 1183 1198 1228
1169 1189 1196 1236
bornol 4-terpinol cis-para menthane-2-one trans-actate de chrysanthnyle
2,25 4,70 1,46 6,55
10,20 3,90 7,66 13,32
78
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
a c
1280 1317 1355 1370 1382 1422 1447 1474 1487 1505 1509 1532 1547 1555 1567 1572 1584 1594 1598 1616 1626 1631 1644 1653 1661 1674
1285 1321 1355 1377 1385 1415 1462 1483 1496 1513 1517 1542 1553 1559 1574 1584 1596 1603 1610 1625 1638 1641 1654 1659 1669 1683
1289 _ _ 1377 _ 1419 _ 1485 1492 1514 1523 1546 1550 1563
actate de bornyle 1,3,8 p-menthatrine actate de linalol copane isoldne bta-caryophyllne cis-alpha-bisabolne germacrne-D mthyl-isognol gamma-cadinne delta-cadinne alpha-calacorne lemol (E)-nrolidol ni alcool caryophyllnique oxyde de caryophyllne ni
1,17 0,31 0,31 0,52 0,12 1,42 0,54 11,73 0,98 0,35 1,22 0,35 1,57 7,23 0,84 1,97 1,88 1,21 1,41 0,46 1,14 0,54 1,09 0,19 0,79 1,49
15,28 3,19 1,37 6,75 15,64 7,45 1,31 13,09 9,24 1,10 21,02 38,73 13,48 15,84 17,21 28,78 11,18 13,17 14,41 4,42 12,58 35,58 37,66 28,94 26,38 33,77
1572 1583
1596 1623
viridiflorol cderne-epoxide ni ni
1651 1652 1658 1686
bta-eudesmol cedr-8(15)-en-10-ol alcool patchoulique alpha-bisabolol
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18.
identification ralise partir des bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, pourcentage moyen sur 6 rplicats
NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard France et de la littrature

d e
coefficient de variation (%)
79
Sabinne
(E)-nrolidol
Camphre
Germacrne-D
Figure 13 : Structures chimiques de quelques composs majoritaires de l'huile essentielle de lAchille millefeuille
En comparant la composition de lhuile essentielle dAchille millefeuille provenant de la rgion toulousaine avec dautres huiles issues de diffrentes origines gographiques (Tableau : 5), nous avons observ que la plupart des composs majoritaires de lhuile essentielle ont t identifis par Orav et Shawl (Orav et al., 2001; Shawl et al., 2002). Lespce dAchille provenant du Canada possde la bta-thujone comme compos majoritaire (Hachey et al., 1990). La plupart des constituants de lhuile essentielle dAchille dorigine Iranienne sont des alcools sesquiterpniques comme le spathulnol, (Z) nrolidol, alpha-bisabolol et (E, E) farnsol. Lalpha-bisabolol est en faible pourcentage (1,49%) dans notre extrait. (Tableau 4, 5). Les pourcentages leves en germacrne-D, sabinne et actate de trans-chrysantnyle montrent une huile essentielle diffrente de celles tudies jusqu prsent et provenant de rgions gographiques diffrentes. Orav et al. (Orav et al., 2006) ont analys lhuile essentielle de lAchille millefeuille provenant de France (partie traite non prcise) qui contenait un pourcentage lev en monoterpnes oxygns (53,9-76,1%), principalement de camphre (jusqu 24,5%), ainsi que d et de la -thujone (jusqu 26,8%), dartemisia ctone (jusqu 10,1%) et de 1,8-cinole (jusqu' 20,3%) alors que seulement 4,0% de ce dernier a t dtect et identifi dans notre extrait.
80
Chapitre II : Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation Tableau 5: Variation des pourcentages des composs majoritaires des huiles essentielles de lAchille millefeuille provenant de diffrentes rgions du monde
Composs France USA Canada Grce Cuba Iran I alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne alpha-terpinne para-cymne limonne para-cymne 1,8 cinole gamma-terpinne terpinolne linalol alpha-thujone bta-thujone isocyclocitral camphre bornol cis-carvol alcool furfurilique 4-terpinol ascaridole Trans actate de chrysanthnyle bta-caryophyllne cis-alpha-bisabolne germacrne-D (E)-nrolidol spathulnol alcool caryophyllnique oxyde de caryophyllne alpha-bisabolol (E,E) Farnsol chamazulne 2,0 1,9 1,5 tr 6,6 1,4 0,5 11,7 7,2 1,7 1,6 6,7 3,3 0,7 0,8 4,0 1,7 0,4 1,8 4,5 12,6 2,3 4,7 8,2 6,0 5,5 7,3 10,7 9,7 20,6 0,4 11,4 4,3 5,8-6,8 1,8-2,1 1,2-1,5 1,63-2,19 1,31-1,9 1,7-2,5 4,9-8,8 0,94-0,99 1,3-1,9 9,4-19,5 2,1-3,01 9,7-24,7 3,2-5,4 0,4 0,4 0,3 7,0 7,4 10,5 0,5 8,1 1,1 47,2 1,9 tr 1,4 1,6 0,4 5,4 0,6 5,7 1,0 1,2 9,8 2,8 5,2 0,8 20,0 5,0 0,9 5,7 12,4 22,9 4,0 2,3-4,7 1,1-2,5 1,5-4,3 4-12,6 tr-0,7 0,7-1,5 5,3-12,5 0,2-2,1 0,2-0,4 4,1-13,1 11,5-13,2 1,9-4,5 0,7-3,5 0,3-1,8 2,6-4,8 tr-1,3 1,9-4,7 tr-0,8 0,7-1,3 Lituanie II 2,7-5,3 0,8-1,43 3,2-5,2 9,7-26,5 0,2-0,7 tr-1,9 5,3-10,6 0,2-1,7 tr-0,3 0,3-1,6 0,4-3,8 1,2-2,3 4,5-8 2,1-4,9 tr-0,4 0,6-1,5 1,1-2,5 0,4-0,5 9,8-20,1 III 1,9-6,9 tr-2,8 0,9-8,6 7,3-30,2 tr-1,5 tr-4 3,1-16,8 0,3-3,4 tr-0,6 tr-5,9 tr-7,6 0,9-7,6 3-8,7 0,5-4,2 tr-9,5 0,3-5,7 0,3-3,3 tr-1,7 tr-12,6 IV 2,1-5,1 0,4-1,6 2-8,5 5,5-12 0,2-1,4 0,7-1,3 4,4-8,8 0,8-3,8 0,1-0,9 0,6-4,4 0,4-6,6 0,9-5,5 3,2-7,5 2,1-6,3 5,5-13,5 0,5-2,7 2,8-6,3 0,2-2,8 0,1-4,8 0,7-4,1 0,1-2,2 tr-11,7 0-20,3 0-1,5 0,2-5,6 0-1,0 0,8-20,3 0-2,2 tr-9,5 0-26,6 0-11,0 0,1-24,5 0-9,2 0,2-4,0 0-0,8 0-12,5 0-6,0 0,2-5,2 0-5,1 0-42,0 Estonie
tr : Traces
81
I.2. Calamintha grandiflora : caractrisation des extraits des tiges et des feuilles Calamintha grandiflora [syn. Satureja grandiflora (L.) Scheele, Melina grandiflora L., clinopodium grandiflora (L.) Kuntze] ou encore th dAubrac est une plante de la famille des Lamiaces qui possde une odeur pntrante trs forte, particulirement en juillet. Calamintha grandiflora a t cultive sous serre pendant lanne 2007-2008 et rcolte en juillet 2008. La partie arienne frache comprenant les tiges et les feuilles a t hydrodistille pendant 3 heures afin dobtenir une huile essentielle de couleur jaune claire. Le rendement de lhydrodistillation est de 0.35 0,02 % par rapport la matire sche. Le mode opratoire est dtaill dans la partie exprimentale (cf. I.1.4). Lextraction de lhuile essentielle a t rpte trois fois. I.2.1. Composition chimique de lhuile essentielle de Calamintha grandiflora et discussion Lhuile essentielle a t dilue dans le pentane (10%v/v) et analyse par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse et lionisation de flamme (CPG-DIFSM) (Clarus MS 500, Perkin Elmer). Le mode opratoire est dtaill dans la partie exprimentale (cf. II.2.2). Lidentification ainsi que la quantification de lhuile essentielle a t ralise de la mme manire que celle dcrite pour lAchille millefeuille. 29 composs organiques volatils ont t identifis dans les extraits du th dAubrac. Ils constituent 93 % de la composition chimique totale de lhuile essentielle (Tableau : 6).
82
Chapitre II : Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation Tableau 6: Composition chimique de l'huile essentielle de Calamintha grandiflora
Pics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
IRa (TIC) 931 970 976 987 995 1027 1032 1068 1100 1148 1155 1168 1181 1191 1240 1251 1284 1301 1335 1370 1378 1413 1448 1474 1487 1499 1510 1568 1572 1599 1605
IRa (FID) 934 973 980 986 993 1029 1033 1070 1099 1150 1158 1169 1181 1193 1243 1255 1290 1304 1331 1362 1369 1397 1443 1477 1495 1501 1518 1578 1584 1611 1615
IRthb 939 975 979 991 991 1029 1037 1089 1091 1150 1153 1162 1183 1187 1237 1253
Identificationc alpha-pinne sabinne bta-pinne bta-myrcne 3-octanol limonne bta-trans-ocimne terpinolne linalol para-Menth-8-en-3-ol menthone isomenthone isomenthol no-isomenthol pulgone pipritone ni actate disomenthyle ni
%d 0,03 0,19 0,21 0,09 0,25 0,71 0,08 0,03 0,04 0,24 4,40 34,07 7,65 19,83
CVe 6,39 7,15 5,68 6,93 8,35 7,31 9,66 6,43 8,20 8,89 7,93 1,73 8,24 7,72
19,54 16,60 1,28 0,03 0,03 0,14 0,04 0,13 1,99 0,37 3,55 1,78 0,11 0,12 0,93 0,43 0,06 0,28 8,99 18,38 10,03 14,12 9,85 9,95 9,53 9,62 10,14 10,10 13,07 10,34 11,11 12,19 11,13 13,62
1305
1377 1388 1409 1447 1485 1500 1506 1514 1568 1583
copane bta-bourbonne caryophyllne santalne germacrne-D bicyclogermacrne alpha-farnesne gamma-cadinne actate disognol oxyde de caryophyllne ni ni
83
32
1646
1655
1654
alpha-cadinol
0,20
11,31
33 34 35 36 37 38 39 40 41
a c
1781 1786 1790 1802 1806 1810 1830 1850 1860
1786 1790 1795 1803 1806 1812 1835 1855 1862
ni ni ni ni ni ni ni ni ni
0,15 0,07 0,08 0,16 0,05 0,18 0,04 0,14 0,17
19,02 11,00 11,56 8,20 19,76 10,06 12,69 14,77 13,96
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18,
identification ralise partir des bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, pourcentage moyen sur 3 rplicats
NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature

d e
Les principaux composs chimiques qui constituent la fraction majoritaire de lhuile essentielle du th dAubrac, obtenue partir de lhydrodistillation des tiges et de feuilles (Tableau 8), sont lisomenthone (34,07%), le noisomenthol (19,83%), la pulgone (19,54%), lisomenthol (7,65%), la menthone (4,40%) et le germacrne-D (3,55%). La structure chimique de quelques composs majoritaires de lHE est reprsente dans la figure 14. Peu dtudes, ce jour, concernent la composition chimique de lhuile essentielle de Calamintha grandiflora. La composition chimique de lhuile essentielle de lespce dorigine grecque (Calamintha grandiflora (L). Moench) tudie par Souleles et al. est la plus similaire la ntre (Tableau 7). En effet cette espce (Souleles et al., 1990) prsente un extrait compos en majorit de pulgone (35,2%), de menthone (20,2%) et diso-menthone (15,2%), Nos extraits se distinguent galement de ceux tudis partir de lespce dorigine turque (Baser et al., 1993) (Calamintha grandiflora (L.) Monech) par Baser et al. majoritairement riches en isopinocamphone (52,59%) et actate de terpinyle (8,4%)
84
Chapitre II : Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation Tableau 7: Comparaison des composs majoritaires des extraits des feuilles de C. grandiflora France vs Turquie, Grce et C. Nepeta
COV
isomenthone 34,07
neoisomenthol 19,83 -
pulgone 19,54 35,2 75,5
menthone 4,4 20,2 5,3
Iso-
Oxyde de
Origine France Grce Turquie Serbie C. nepeta C. grandiflora
pinocamphone pipritone 52,59 tr 1,45 6,0
15,2 -
Une autre espce cependant de Calamintha a t trouve dans la littrature, il sagit de la C. nepeta (L.) Savi. ssp. nepeta var. suhisodonda (Borb) Hayek. Kitic et al. montrent que cette espce dorigine Serbe (Kitic et al., 2005) contient majoritairement de la pulgone (75,5%), de loxyde de pipritone (6,0%), de la menthone (5,3%) et du menthol (4,3%). Cette composition est trs diffrente de celle de notre extrait (Tableau : 6, 7)
Figure 14 : Structures chimiques de quelques composs majoritaires de l'huile essentielle du th dAubrac
I.3. Tanacetum balsamita : caractrisation des extraits des tiges et des feuilles Tanacetum balsamita [syn, Chrysanthemum balsamita L, Balsamita major (L,) Desf,] est une plante de la famille des Astraces, dodeur menthole. Pour cette tude, nous avons utilis deux origines diffrentes de matire vgtale. La premire est une espce sauvage rcolte Toulouse pendant le mois de Juin 2007. La deuxime origine de Tanacetum balsamita a t cultive sous serre doctobre 2007 juillet 2008. La partie arienne frache comprenant les tiges et les feuilles a t hydrodistille pendant 3 heures afin dobtenir une huile essentielle de couleur jaune. Les rendements dextraction pour lespce sauvage et pour lespce cultive sous serre sont respectivement 0,65 0,02 % et
85
0,53 0,02 % par rapport la matire sche. Le mode opratoire est dcrit dans la partie exprimentale. Lextraction de lhuile essentielle a t ralise trois fois.
I.3.1. Composition chimique de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita et discussion 34 COVs ont t dtects dont 27 ont t identifis dans lhuile essentielle de lespce sauvage, correspondant 96% de la composition totale de lextrait. Les composs majoritaires de lextrait sauvage sont la carvone (56,72%), la tanactone (9,08%), le germacrne-D (2,43%), le limonne (2,51%), et le bta-bisabolne (2,46%) (Tableau 8). 45 composs organiques volatils ont t dtects dont 38 sont identifis dans lhuile essentielle de lespce cultive sous serre correspondant 96% de la composition totale de lextrait. Les composs majoritaires sont la tanactone ou bta-thujone (83,57%), le 1,8 cinole (3,97%) et lalpha-thujone (3,3%) voir (Tableau 9). La structure chimique de quelques composs majoritaires de lHE est reprsente dans la figure 15. Plusieurs chimiotypes ont t identifis dans la littrature. En 1968, Gockeritz a dfini deux chmotypes de la Balsamita major en fonction de la nature du terpne prdominant : type camphre: Balsamita major (L.) Desf Asch et type carvone: Balsamita Major (L.) Desf. var. tanacetodes (Boiss) Fiori (Goeckeritz, 1968). Bestmann et al. en 1984, ont mis jour un troisime chimiotype possdant la double prdominance en carvone et camphre (Bestmann et al., 1984). Quelques auteurs (Voigt et al., 1938) ont analys la composition chimique de lhuile essentielle de Balsamite type carvone. En 1976, Paris et al. ont valu 1,3% lhuile essentielle des fleurs et 0,7% celle de la partie arienne, rendements proches de ceux de nos extraits. La carvone est le compos majoritaire et constitue 65 80% de la composition totale de lhuile essentielle. Un autre chimiotype camphre dorigine polonaise a t identifi par Zielincka-Sowicka et al. 13 composs ont t identifis dont le camphre hauteur de 91%. Le bornol, lisobornol, le camphne, la carvone, le limonne et lapha-pinne ont galement t identifis (ZielinskaSowicka et al., 1970).
Ces chimiotypes ont t galement identifis dans trois espces iraniennes : Jaimand et al. ont travaill sur lhuile essentielle de Balsamite provenant dIran (Tanacetum balsamita L. ssp. Balsamitodes (schultz_Bip.) Grierson) en sparant les diffrents organes
86
(feuilles, fleurs et tiges). Les composs majoritaires des trois diffrentes huiles obtenues sont lactate de bornyle (47,7% dans les feuilles), la pinocarvone (27,1% dans les feuilles), le camphre (9,3% dans les feuilles) et le terpinolne, (5,4% dans les feuilles) avec des variations quantitatives non significatives en fonction de lorgane anatomique tudi (Jaimand et al., 2005). Parmi ces 4 composs majoritaires seul le terpinolne est prsent dans nos extraits en trs faible proportion (0,09%) (Tableau 10). Mounfared et al. ont analys lhuile essentielle de la partie arienne sche de la Balsamite provenant galement dIran (Tanacetum balsamita L. ssp. Balsamitodes (schultz Bip) Grierson [syn, Chrysantemum Balsamita, pyre balsamita (L.) Wild], 31 composs ont t identifis (Monfared et al., 2002), o la carvone reprsente 68% (Tableau : 12) Enfin une troisime tude a t ralise en 2009, par Yousefzadi et al. sur une espce iranienne Tanacetum balsamita subsp. balsamita collecte durant la phase de floraison riche en carvone (51,0%), bta-thujone (20,8%) et alpha-thujone (3,2%) (Yousefzadi et al., 2009).
En 2001, Gallori et al. ont tudi la composition chimique de lhuile essentielle et de leau aromatique des feuilles de Balsamite (Balsamita suaveolens Pers. [syn. Chrysanthemum balsamita L. ; Tanacetum balsamita L.] dorigine italienne, o le carvone apparait comme le compos majoritaire des deux extraits (Gallori et al., 2001).
La variation de la composition chimique de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita (L.). Desf., dorigine lituanienne a t tudie en fonction des diffrentes phases de croissance de la plante et de la partie anatomique hydrodistille (feuilles et fleurs) par Bylaite et al. Le rendement optimal en huile essentielle a t obtenu pendant la phase de floraison (Bylaite et al., 2000).
87
Tableau 8: Composition chimique de l'HE de Tanacetum balsamita sauvage rcolte Toulouse pendant la priode de floraison
Pics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
IRa (FID) 917 932 954 959 1009 1013 1016 1086 1092 1103 1108 1121 1128 1140 1146 1152 1161 1169 1174 1179 1180 1203 1227 1159 1165 1483 1488 1489 1495
IRthb 939 954 975 979 1025 1029 1031
Identificationc alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne para-cymne limonne 1,8-cinole ni
%d 0,18 0,12 0,52 0,14 0,11 2,51 1,99 0,20 0,88 9,08 2,10 1,12 1,76 1,43 1,37 1,31 1,18 1,33 1,21 0,41 0,64 0,72 56,72 1,52 1,10 2,43 0,22 0,57 2,46
CVe 3,6 3,95 4,34 4,62 6,11 22,31 5,07 6,362 2,33 9,54 3,68 2,86 1,39 3,67 9,46 3,56 6,74 6,98 2,37 5,86 8,33 9,32 9,36 6,54 6,88 5,36 6,33 21,36 8,36
1102 1114
cis-thujone trans-thujone ni cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol
1145 1165 985 1169 1189
trans-verbnol pinocarvone trans-isolimonne bornol 4-terpinol ni
1196
myrthnal cis-dihydrocarvone
1229 1217 1243
cis-carvol trans carvol carvone cis-actate de carvyle ni
1485 1561
germacrne-D bicyclogermacrne ni
1531
bta-bisabolne
88
30 31 32 33 34
a c
1496 1502 1516 1593 1613
1514 1515
delta-cadinne trans-gamma-bisabolne ni ni
2,19 0,58 0,14 0,30 1,04
12,35 32,21 14,32 25,32 26,34
1654
cadinol
identification ralise partir des bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, NIST, pourcentage moyen sur 3 rplicats
Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature

d e
Tableau 9: Composition chimique de l'huile essentielle de la partie arienne de Tanacetum balsamita cultive sous serre
Pics IRa (TIC) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 933 973 979 987 991 1010 1017 1025 1033 1058 1072 1086 1099 1109 1128 1140 1144 1148 1151
IRa (FID) 934 973 981 985 991 1006 1017 1025 1034 1058 1072 1086 1095 1110 1122 1138 1147 1152 1158
IRthb 939 975 979 984 991 _ 1017 1026 1031 1060 1072 1089 1100 1102 1114 1138 1150 _ _
Identificationc alpha-pinne sabinne bta-pinne mentha-2,8-dine myrcne butyrate disoamyle alpha-terpinne para-cymne 1,8-cinole gamma-terpinne bta-terpinne alpha-terpinolne 2-mthyl-butyrate disoamyle cis-thujone trans-thujone 3-isothujanol para-menth-3-en-8-ol ni ni
%d 0,05 0,19 0,04 0,05 0,09 0,06 0,14 0,26 3,97 0,53 1,55 0,09 0,07 3,33 83,57 0,23 0,39 0,05 0,05
CVe 4,12 3,97 3,72 3,31 4,17 3,60 3,95 3,36 4,00 3,80 4,34 4,31 4,62 2,51 0,82 6,11 22,31 8,12 5,07
89
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
a c
1157 1165 1172 1183 1198 1251 1260 1288 1296 1303 1323 1329 1336 1352 1385 1395 1421 1474 1482 1496 1518 1560 1578 1656 1733 1788
1161 1167 1173 1184 1197 1252 1259 1287 1296 1302 1324 1329 1337 1351 1369 1393 1427 1478 1488 1502 1521 1563 1583 1663 1715 1790
_ 1165 1175 1184 1186 _ _ _ _ 1307 _ _ _ _ 1388 1394 1419 1477 1485 1500 1523 _ _ 1663 _ _
bicyclo[4,1,0] heptan-3-one,7,7 dimthyl-4 mthylne pinocarvone actate de santolinyle pinocarvol ocimne carvotanacetone 4-carne bicyclo[3,1,0] hex-2-ne,4-mthylne1-(1-mthylthyl) 3-carne,10-actylmthyl actate de dihydrocarvol ni ni ni ni alpha-bourbonne isobutanoate de phenylthyle caryophyllne gamma-gurjunne germacrne-D bicyclogermacrne delta-cadinne ni ni dihydro eudesmol pirtrinal ni
0,03 0,28 0,16 1,48 0,16 0,15 0,14 0,11 0,04 0,18 0,03 0,14 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,07 1,50 0,19 0,02 0,05 0,03 0,38 0,03 0,03
6,70 4,58 45,27 4,62 0,89 7,81 4,94 5,30 4,85 4,83 4,10 4,56 1,76 5,60 6,27 24,34 6,37 4,92 5,65 4,44 5,24 5,98 31,46 8,19 41,86 4,24
identification ralise partir des bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies pourcentage moyen sur 3 rplicats
Adams, NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature

d e
90
1,8-cinole
pinocarvol
Bta-thujone
Bta-terpinne
Figure 15: Structures chimiques des principaux composs majoritaires de l'huile essentielle de Tanacetum balsamita Tableau 10: Comparaison entre les principaux composs majoritaires de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita de diffrentes origines : France vs Iran, Italie, Lituanie et Turquie
Origine COV Terpinolne Alpha-thujone Bta-thujone Camphre Pinocarvone Carvone Actate de bornyle
France Espce sauvage 0,88 9,08 1,43 56,72 Espce cultive 0,09 3,33 83,57 0,28 -
Iran Jaimand et al. 5,4 9,3 27,1 47,7
Iran Mounfared et al. 1,1 68,0 -
Iran Yousefzadi et al. 3,2 20,8 0,7 51,0 -
Italie
Lituanie
Turquie
tr 15,61 2,10 1,00 43,54 -
289,8-1261,6 15,7-225,4 tr-16,1 932,9-7637,2 tr
11,7 1,2 0,5 52,4 tr
91
En complment des tudes ralises sur la composition chimique de lhuile essentielle, il existe quelques travaux concernant lactivit insecticide de la balsamite pour laquelle on a identifi et quantifi dans lhuile essentielle une vingtaine de composs actifs qui prsentent une forte activit insecticide contre les aphides (Bestmann et al., 1988). Ainsi 7 espces de Tanacetum de diffrentes origines gographiques dont Tanacetum balsamita ont t analyses pour leur potentiel lev en flavonodes lipophiles. (Williams et al. 1999). Cinq flavonodes ont t identifis dans les feuilles de T. balsamita L. : apignine, 6-mthyle ther scutellareine, 6-mthyl ther-hydroxy-lutoline, 6,3-dimthyle ther-6hydroxy-lutoline et le 6,7,4-trimthyle ther-6-hydroxy-lutoline (Williams et al., 1999). Dautre part, en 1996, Kubo et al. ont isol et dtermin la structure dun compos actif antimicrobien, le Tanabaline partir des fleurs sches de Tanacetum balsamita (Catinga-demulata) dorigine brsilienne (Kubo, 1995).
En se basant sur la nature des terpnes dominants on peut identifier quatre chimiotypes : type camphre, type carvone, type camphre-thujone et type carvone-thujone. La comparaison de nos rsultats avec ceux de la littrature, permet de conclure que lespce sauvage franaise et spcifiquement celle rcolte dans la rgion de Midi-Pyrnes se rapproche de lespce turque (voir tableau 10). Par contre, la prdominance de la tanactone et labsence de carvone dans les huiles essentielles des parties ariennes suggrent quil pourrait sagir dun cinquime chimiotype : le type tanactone. Ce chimiotype pourrait tre induit par les conditions de culture sous serre.
92
I.4. Myrrhis odorata : caractrisation chimique des tiges et des feuilles Les plantes appartenant la famille des apiaces sont riches en mtabolites secondaires. La plante, Myrrhis odorata, ou encore cerfeuil musqu a t cultive sous serre doctobre 2007 Mai 2008 et rcolte en juin 2008. La partie arienne frache comprenant les tiges et les feuilles a t hydrodistille pendant 3 heures afin dobtenir une huile essentielle de couleur jaune clair. Le rendement dextraction est de 0,48 0,02 % par rapport la matire sche. Le mode opratoire est dcrit dans la partie exprimentale (cf. I.1.6). Lextraction de lhuile essentielle a t rpte trois fois.
I.4.1. Composition chimique de lhuile essentielle de Myrrhis odorata et discussion 20 composs organiques volatils ont t identifis partir de lhuile essentielle de la partie arienne du cerfeuil musque. Ils constituent 96% de la composition totale de lextrait. Les composs majoritaires sont lanthole (75,12%), le germacrne-D (6,19%) le limonne (4,42%), le bicyclogermacrne (3,18%), lestragole (3,04%) et le caryophyllne (2,71%) (Tableau : 11). La structure chimique de quelques composs majoritaire de lHE est reprsente dans la figure 16. Ces rsultats danalyse sont proches de ceux trouvs dans la littrature par Kubeczka et al. en 1982 sur le taux danthole valu 76,8 % bien que lorigine de lespce analyse ne soit pas prcise (Kubeczka et al., 1982). Nos extraits sont lgrement plus riches en estragole, 3,04% contre 1,2% et dpourvu de bicyclogermacrne. En 1990, Hussain et al. quantifient 85,48% danthole et 9,08% deugnol mthylique dans des extraits de Myrrhis odorata Scop. (sweet cicely) cultive Chicago aux USA(Hussain et al., 1990) (Tableau : 12).
Tableau 11: Composition chimique de l'huile essentielle obtenue partir de la partie arienne de Myrrhis odorata
Pics 1 2 3 4 5 6
IRa (TIC) 934 973 979 987 1030 1047
IRa (FID) 936 974 982 986 1031 1045
IRthb 939 975 979 991 1029 1050
Identificationc alpha-pinne sabinne bta-pinne bta-myrcne limonne cis-ocimne
%d 0,03 0,02 0,02 0,63 4,42 0,32
CVe 25,53 21,05 8,25 3,12 3,90 1,03
93
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 19 22 23 24 25 26 27
a c
1059 1088 1199 1229 1253 1290 1376 1388 1404 1420 1457 1482 1489 1496 1504 1518 1562
1060 1088 1200 1228 1255 1292 1382 1393 1403 1428 1464 1490 1498 1503 1510 1523 1561
1060 1089 1196 -
gamma-terpinne terpinolne estragole cis-3 hexenyl isovalerate ni
0,24 0,04 3,04 0,01 0,06 75,12 0,05 0,10 0,17 2,71 0,22 6,19 0,01 3,18 0,48 0,10 2,74
6,03 8,46 1,01 18,30 10,77 0,03 10,15 1,40 6,21 1,36 1,96 0,19 29,95 3,11 13,54 8,52 2,95
1285 1419 1457 1485 1500 1506 -
trans-anthole ni ni ni bta-caryophyllne bta-farnesne germacrne-D ni bicyclogermacrne alpha-farnesne ni ni

d e
Limonne
Caryophyllne
Estragole
Bicyclogermacrne
Anthole
Figure 16: structures chimiques des composs majoritaires de l'huile essentielle de Myrrhis odorata
En 1993, lhuile essentielle des feuilles de Myrrhis odorata (L.) Scop. dorigine russe a t analyse par Tkachenko et al. Dans ces extraits lanthole constitue le compos majoritaire
94
(82-85%) avec le germacrne-D (2-2,9%) ; les quantits rencontres de ces molcules varient selon que la plante est en priode de floraison ou non (Tkachenko et al., 1993). Notre espce se rapproche le plus de lespce finlandaise identifie par Usitalo et al. Elle se distingue nanmoins par la prsence du germacrne et sa richesse en sesquiterpnes (Uusitalo et al., 1999) (Tableau 12). Finalement, Rancic et al. ont analys lhuile essentielle de Myrrhis odorata dorigine Serbe rcolte en priode de floraison. La composition est totalement diffrente de celle de nos extraits ainsi que de celles des autres huiles essentielles tudies dans diffrentes rgions gographiques o le p-cymne (62,0%) a remplac lanthole comme compos majoritaire (Rancic et al., 2005).
Tableau 12: Comparaison entre les principaux composs majoritaires de l'HE de Myrrhis odorata de diffrentes origines : France vs Serbie, Finlande, Russie et Amrique du Nord
Origine COV para-cymne Limonne Estragole Anthole Bta-caryophyllne Eugnol mthylique Germacrne-D Bicyclogermacrne Alpha-farnesne
France 4,42 3,04 75,12 2,71 6,19 3,18 0,48
Amrique du Nord 0,26 1,71 85,48 9,08 -
Russie 82,0 1,70 2,9 -
Finlande 0,08 2,64 83,10 1,01 -
Serbie 62,0 2,10 0,70 -
95
I.5. Monarda didyma : caractrisation chimique des tiges et des feuilles La plante Monarda didyma appartient la famille des Lamiaces. Dans le cadre de notre tude, elle a t cultive sous serre doctobre 2007 jusqu' juin 2008 et rcolte en juillet 2008. La partie arienne frache comprenant les tiges et les feuilles a t hydrodistille pendant 3 heures afin dobtenir une huile essentielle de couleur jaune clair. Le rendement de distillation est de 0,70 0,02 % par rapport la matire sche. Les conditions exprimentales sont dcrites dans la partie exprimentale (cf. I.1.7). Lextraction de lhuile essentielle a t rpte trois fois. I.5.1. Composition chimique de lhuile essentielle de Monarda didyma et discussion 26 composs organiques volatils ont t identifis dans lhuile essentielle obtenue partir de la partie arienne de la plante comprenant les tiges et les feuilles. Les principaux composs majoritaires sont le thymol (47,06%), leucalyptol (9,68%), le germacrne (4,04%), le limonne (3,46%), le p-cymne (2,78%) et le gamma-terpinne (2,68%) comme indiqu dans le Tableau 13. La structure chimique de quelques composs majoritaire de lHE est reprsente dans la figure 17.
Tableau 13: Composition chimique (%) de lhuile essentielle de Monarda didyma
Pics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
IRa (TIC) 925 933 951 973 979 987 1008 1017 1025 1030 1033 1058 1072
IRa (FID) 929 939 957 978 985 989 1012 1022 1029 1034 1039 1062 1076
IRthb 930 939 954 975 979 991 1003 1017 1026 1029 1031 1060 1073
Identificationc alpha-thujne alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne bta-myrcne alpha-phellandrne alpha-terpinne para-cymne limonne eucalyptol gamma-terpinne hydrate de sabinne
%d 0,35 0,88 1,39 5,53 1,05 1,10 0,10 1,04 2,78 3,46 9,68 2,68 0,55
CVe 2,2 3,0 2,8 1,2 2,0 0,9 1,6 2,0 0,8 0,9 1,3 1,2 1,2
96
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
a c
1086 1100 1120 1174 1182 1197 1238 1290 1376 1389 1421 1482 1507 1518
1091 1101 1124 1181 1188 1201 1241 1291 1385 1396 1431 1492 1507 1525
1089 1102 1128 1180 1189 1199 1235 1290 1388 _ 1419 1485 1506 1523
alpha-terpinne linalol chrysantnone bornol alpha-terpinol gamma-terpinol thymol-mthyl ether thymol bta-cubebne ni caryophyllne germacrne-D alpha-farnesne delta-cadinne
1,02 1,83 0,44 1,13 0,47 8,52 3,20 47,06 0,09 0,14 0,89 4,04 0,54 0,04
0,8 1,1 0,4 0,3 0,4 1,3 0,9 1,0 2,7 5,0 1,7 0,7 23,3 0,5

d e
Sabinne
Para-cymne
1,8-cinole
Thymol
Figure 17 : structures chimiques des principaux composs majoritaires de l'HE de la M. didyma
La composition chimique de nos extraits, compare celle de Monarda didyma dorigine franaise analyse, en 1991, par Carnat et al. est totalement diffrente car la teneur en linalol de cette dernire est prdominante avec 64,5 74,2%. Ces auteurs ont montr quil ny avait pas de diffrence qualitative entre lhuile essentielle des feuilles et celle des fleurs (Carnat et al., 1991). Nanmoins, une lgre diffrence quantitative apparait sur les teneurs en
97
eucalyptol et limonne relativement faibles, 0,6% et 0,3% respectivement. Un an plus tard, Mazza et al. ont analys lhuile essentielle de plusieurs hybrides Monarda provenant du croisement entre deux espces M. fistulosa et M. didyma dorigine Canadienne dont la composition chimique a t identifie. Une distribution de terpnes cycliques dans la majorit des hybrides a t identifie (linalol, graniol, thymol et carvacrol). Parmi les hybrides analyss, lhybride 75-1B riche en thymol (31,11%) (Mazza et al., 1992) possde la composition chimique la plus proche de nos extraits o la prsence en eucalyptol est aussi bien marque (14,11%) (Tableau 14). Notre extrait se rapproche de lextrait obtenu partir de lespce italienne analyse par Fraternale et al. Nos extraits se distinguent par une teneur en thymol lgrement diffrente (47,06% contre 57,3%), la prsence deucalyptol (9,68%) et une faible concentration en paracymne (2,8% contre 10,5% dans lextrait de Fraternale et al.) (Fraternale et al., 2006) (Tableau 14). Les rsultats de notre tude compars aux diffrentes donnes de la littrature confirment que la composition chimique de Monarda didyma varie selon lorigine gographique de la plante.
Tableau 14 : Comparaison entre les principaux composs majoritaires de l'HE de M. didyma provenant de diffrents pays
Origine COV Sabinne Para-cymne Limonne Eucalyptol Gamma-terpinne Linalol Thymol Germacrne-D
France Midi-Pyrnes 5,53 2,78 3,46 9,68 2,68 1,83 47,06 4,04
France Clermont Ferrand 5,0 11,0 0,3 0,6 5,3 64,5 3,2
Canada (hybride 75-1B) 1,41 3,01 14,11 1,46 31,11 0,49
Italie 10,5 1,3 9,3 0,6 57,3 1,1
98
II. Caractrisation sensorielle des huiles essentielles des cinq plantes aromatiques : Achillea millefolium, Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata et Monarda didyma
II.1. Pyramides Olfactives Lanalyse sensorielle des huiles essentielles peut se faire par diverses mthodes. Avant danalyser les huiles essentielles par lintermdiaire dune chromatographie en phase gazeuse couple un dtecteur olfactomtrique, des tests sensoriels sont ncessaires afin dtablir les pyramides olfactives relatives chaque extrait. Ltablissement dune pyramide olfactive consiste rprer les diffrentes notes dominantes dans lhuile essentielle comme on le ferait pour un parfum. On suit lvolution au cours du temps de lodeur des extraits aromatiques dposes sur une mouillette afin de dterminer les notes de tte, de cur et de fond. La procdure est dtaille dans la partie exprimentale (cf. II.3). II.1.1. Les notes de tte Elles sont constitues des notes olfactives les plus lgres, les plus volatiles, qui vont ressortir ds le dpart de lapplication, et disparatre rapidement entre quelques minutes et 2 heures. Exemple : les notes agrumes, les notes menthes. II.1.2. Les notes de cur Les molcules volatilit moyenne sont les notes de cur, elles ont une dure de vie de 2 10h et ont un rle tampon : prolonger la fracheur des notes de tte et annoncer la chaleur des notes de fond. Exemple : les notes florales, pices et aldhydes. II.1.3. Les notes de Fond Les notes de fond correspondent auxs molcules les plus lourdes, elles ont une dure de vie beaucoup plus longue de 8h plusieurs jours. Exemple : notes vanilles, boises, musques et ambres.
Les notes odorantes perues pourraient tre associes certaines molcules odorantes identifies dans les huiles essentielles.
99
II.2. Ralisation des Pyramides Olfactives Les pyramides olfactives ont t effectues par deux exprimentateurs. Une mouillette est trempe dans chaque huile essentielle dilue au 1/10 (v/v) dans de lthanol anhydre, puis flaire pour valuer les diffrentes notes de tte, de fond et de cur des temps dtermins : au temps 0, c'est--dire immdiatement aprs trempage, aprs 2 heures, 4 heures puis 24 heures.
II.2.1. Pyramides Olfactives des 5 huiles essentielles des plantes aromatiques selectionnes
Achillea millefolium
Tanacetum balsamita
Calamintha grandiflora
Myrrhis odorata
Monarda didyma
100
II.3. Activit odorante des composs organiques volatils value par CPG-Olfactomtrie Les huiles essentielles ont t analyses par chromatographie en phase gazeuse couple un dtecteur de masse et un dtecteur olfactomtrique (CPG-SM-O). La mthodologie, la programmation du four ainsi que les diffrents facteurs de dilution sont dcrits en dtail dans la partie exprimentale (cf. II.2.3). Le couplage CPG-Olfactomtrie combine la sparation des composs volatils par CPG avec lvaluation olfactive. En sortie de colonne, une partie des composs lus est envoye vers un cne de dtection nasale qui permet lvaluation olfactive en mme temps que lenregistrement du chromatogramme. Afin dviter la dshydratation de la muqueuse nasale qui conduit une perte de sensibilit de lexprimentateur, de lair humide est inject en entre du cne. Les donnes olfactives sont enregistres grce un bouton pressoir type potentiomtre qui envoie un signal un logiciel dacquisition (systme Gerstel). Afin de limiter toute subjectivit, il est ncessaire dutiliser un vocabulaire normalis pour dcrire les odeurs mais trs souvent les laboratoires utilisent un vocabulaire interne. Le Champs des odeurs introduit par J.N. Jaubert (Jaubert et al., 1987; Jaubert et al., 1987) trouve son intrt dans la formation des oprateurs et est bien adapt aux tudes CPG/O. Lanalyse en CPG-O a t effectue pour chaque huile essentielle en 3 rptitions au moyen de 2 juges avec 20 minutes environ danalyse sensorielle chaque fois. Les huiles essentielles ont t dilues au 1/10 dans le pentane, et 0,1L de cette dilution a t injecte. La programmation de la CPG est dcrite dans la partie exprimentale (cf. II.2.3).
101
II.3.1. Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE dAchillea millefolium TR (min) Notes Frquence de dtection [%], n=3 6,94 7,46 8,17 8,36 10,28 11,23 13,15 13,75 14,87 15,21 15,87 16,24 16,56 26,59 29,22 32,66 33,76 Bois pin Bois piquant Bois citronn Bois fort Eucalyptus Floral anis Bergamote Citron lger Citron lger Camphre Citron Poussire Agrume floral Bois pic Floral Anis Floral jasmin Bois pic 100 100 33 67 100 100 100 100 67 100 100 100 100 100 100 100 100 alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne eucalyptol gamma-terpinne linalol cyclocitral, isomre1 cyclocitral, isomre 2 camphre cyclocitral, isomre 3 bornol 4-terpinol bta-caryophyllne germacrne-D (E)-nrolidol viridiflorol
Florale
Composs
Menthole, Boise
Camphre, Boise
On remarque aussi que le nez ne dtecte pas lensemble des notes de lhuile essentielle. En effet, certaines odeurs peuvent tre masques par dautres odeurs intenses qui seraient lues avant, ou bien, le compos na pas dodeur dtectable, ou encore, il est une concentration en dessous du seuil de perception du nez humain.
102
II.3.2. Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Calamintha grandiflora TR (min) Notes Frquence de dtection [%], n=3 6,05 7,05 7,20 7,44 8,27 11,77 12,01 12,23 12,53 12,84 14,14 14,49 17,76 18,72 19,60 20,28 20,62 Bois pin Bois citronne Bois piquant Champignon Agrumes Floral bergamote Menthol lger Menthol lger Menthe poussire Menthol camphr Bois pic Menthe poivre Vert pic Bois Vert Floral anis Bois 100 100 100 100 100 100 67 100 100 100 100 100 67 100 100 100 100 alpha-pinne sabinne bta-myrcne 3-octanol limonne bta-linalol menthone isomenthone isomenthol no-isomenthol pulgone pipritone bta-bourbonne caryophyllne santalne germacrne-D gamma-cadinne Florale Menthole, Epice Boise, Citronne Composs
La majorit des composs identifis dans les extraits du Th dAubrac ont t perus par olfactomtrie. Ces rsultats danalyse sensorielle coupls ceux de lanalyse chimique permettent de mieux caractriser la pyramide olfactive des extraits de Calamintha grandiflora.
103
II.3.3. Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Tanacetum balsamita TR (min) 6,03 6,96 8,49 9,25 10,52 11,24 12,56 14 ,15 14,98 16,42 20,2 20,33 22,19 24,36 Notes Bois pin Bois citronn Eucalyptus Floral citron Th bois Th fort Vert camphr Fruit citron Floral Citron bois Bois Floral Bois soufr Sucr Frquence de dtection [%], n=3 75 100 100 100 100 100 75 100 75 50 25 100 75 100 Composs alpha-pinne sabinne 1,8-cinole gamma-terpinne alpha-thujone tanactone pinocarvone 4-carne ni alpha-bourbonne caryophyllne germacrne-D delta-cadinne dihydro eudesmol
Th sec (doux, infusion)
Menthole, citronne
Menthole, herbace
Le pic majoritaire est la tanactone, compos odeur caractristique de th et dpice. Pour cette huile essentielle, on observe aussi un retard de dtection de 30 secondes et un compos non identifi dtect environ 15 min.
104
II.3.4. Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Myrrhis odorata Frquence de dtection [%], n=3 100 67 67 100 100 100 100 100 100 100 67
TR (min) 4,50 5,30 7,42 8,42 12,80 15,67 18,56 20 20,29 20,69 22,09
Notes Bois Bois citron Vert piquant Agrumes Anis vert Anis fort Bois Floral Anis Bois Bois
Compos alpha-pinne sabinne bta-myrcne limonne estragole trans-anthole bta-caryophylne germacrne-D alpha-farnesne ni ni Boise Anise, boise
Frais, herbace
Le compos majoritaire de cette HE est lAnthole. Son odeur est tellement forte quelle persiste tout le long de lanalyse (aprs son lution). Elle cache ainsi certains composs qui le suivent. Cest pour cela que peu de composs odorants sont dtects chez Myrrhis odorata. Lcart de temps de rtention entre le pic chromatographique et la detection olfactive de la molcule est galement de 30 secondes.
105
II.3.5. Rsultats de lanalyse sensorielle en CPG-O de lHE de Monarda didyma Frquence de dtection [%], n=3 100 67 100 67 100 67 100 67 100 100 100 33 100 100
TR (min) 6,10 7,15 7,30 8,05 8,58 9,83 10,25 12,53 13,03 14,03 15,90 18,84 20,40 21,10
Notes Bois Bois vert Bois piquant Citronne Eucalyptus Floral citronn Bergamote Floral Citron vert Epice (thym lger) Thym Bois Floral Bois soufr
Composs alpha-pinne bta-pinne bta-myrcne alpha-terpinne eucalyptol gamma-terpinne linalol alpha-terpinol gamma-terpinol thymol-mthyl ether thymol caryophyllne germacrne-D delta-cadinne Boise Thym Citronne, menthole
Ces rsultats danalyse sensorielle coupls ceux de lanalyse chimique permettent de mieux caractriser les pyramides olfactives des 5 huiles essentielles tudies.
106
III. Activits biologiques des huiles essentielles et des rsidus de lhydrodistillation

III.1. Introduction sur lactivit antioxydante Lutilisation des antioxydants synthtiques est un sujet trs tudi du fait de leur impact ngatif sur la sant humaine (Branen, 1975; Barlow, 1990). Plusieurs limites et restrictions ont t mises en place concernant leur utilisation, et leur substitution par des antioxydants naturels est devenue un enjeu scientifique. Les antioxydants bien connus et traditionnels sont ceux provenant du th, du vin, des fruits, des pices et dautres vgtaux (Kanner et al., 1994; Cao et al., 1998; Madsen et al., 1998; Wang et al., 1998). Plusieurs espces de plantes ont t impliques dans la recherche des nouveaux antioxydants (Economou et al., 1991). Quelques antioxydants naturels issus du romarin et de la sauge par exemple sont dj exploits et commercialiss en tant quadditifs nutritionnels antioxydants (Schuller, 1990). Loxydation des lipides est un processus complexe en chane produisant plusieurs types de radicaux libres. Loxydation est influence par la temprature, la lumire, lair, les proprits physiques et chimiques du substrat, ainsi que par la prsence de catalyseurs doxydation ou dinitiateurs tels que les mtaux dont une trace infrieure 0,5ppm est suffisante pour catalyser la raction doxydation (Chapitre I, paragraphe VI.3.1) Les antioxydants peuvent exercer leurs proprits de protection lors des diffrents stades du processus doxydation et par diffrents mcanismes. Il existe deux grandes types dantioxydants : les primaires et les secondaires ou prventifs (voir Chapitre 1, paragraphe VI.3.2). Plusieurs systmes modles doxydations acclres sont utiliss et diffrentes mthodes ont t dveloppes afin dvaluer lactivit antioxydante (Ragnarson, 1977 ; Frankel, 1993 ; Moure, 2001) (voir Chapitre 1, partie VII). Loxydation des lipides dans les produits alimentaires induit non seulement une diminution de la valeur nutritive de laliment, mais aussi des effets reconnus nuisibles pour le consommateur qui peuvent tre associs des risques de maladies cancrignes chez lhomme (Papas, 1999). La prsence dantioxydants dans lalimentation est devenue de plus en plus essentielle pour la qualit et la scurit de laliment. Limportance des antioxydants naturels comme additifs alimentaires est dj tablie. Les effets ngatifs des antioxydants synthtiques donnent lieu linterdiction de leur utilisation par les consommateurs et poussent les intrts scientifiques vers leur substitution par des agents naturels. Cependant, les produits naturels y compris les
107
antioxydants peuvent tre toxiques sous certaines conditions. Parfois certains dentre eux possdent des proprits fonctionnelles additionnelles : antibactrienne, antimutagne, etc Les plantes aromatiques sont prometteuses et constituent une grande source dantioxydants naturels pour lindustrie agroalimentaire (Yen et al., 1995; Kim et al., 2001) III.2. Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles Lobjectif de la prsente tude est de comparer lactivit antioxydante des huiles essentielles des plantes aromatiques oublies ainsi que de leurs rsidus dhydrodistillation en utilisant les mthodes suivantes : la mthode Oxipress, la mthode dvaluation des dines et trines conjugus et la mthode de dtermination de loxydation du radical 2,2-diphnyl-1picrylhydrazyl dite DPPH. La sensibilit, la rapidit, lapplicabilit ainsi que la mise en relation des rsultats sont discuts.
III.2.1. Evaluation de lactivit antioxydante des HE en utilisant la mthode Oxipress Les parties ariennes dAchillea millefolium, de Tanacetum balsamita L., de Calamintha grandiflora (L.) Moench, de Myrrhis odorata (L.) Scop, et de Monarda didyma ont t utilises dans cette tude. Ces plantes ont t cultives sous serre pendant lanne 2008 et collectes en juillet 2008 durant leurs stades de floraison. Les huiles essentielles ont t isoles par hydrodistillation et la composition chimique de chaque huile essentielle a t analyse (cf. chapitre 2, paragraphe II). Lactivit antioxydante des huiles essentielles a t dtermine dans lhuile de tournesol au moyen de lappareil Oxipress (Mikrolab Aarhus, Denmark). Cette mthode consiste valuer la consommation doxygne en mesurant la variation de pression dans une enceinte hermtiquement ferme et renfermant lchantillon doser ainsi que de loxygne. La technique exprimentale ainsi que les diffrentes valeurs exprimentales sont bien dtailles dans la partie exprimentale (cf.V.1) La priode dinduction (PI) de loxydation a t value au moment o la pression commence chuter (voir partie exprimentale cf. V.1). Le facteur de protection (FP) ainsi que lactivit anti-oxydante (AA) sont calculs partir des formules suivantes : FP = PIX / PIK AA = (PIX PIK) / PIBHT PIK
108
O : PIX est la priode dinduction de lchantillon avec additif ; PIK est la priode dinduction de lchantillon sans additif ; PIBHT est la priode dinduction de lchantillon contenant la rfrence BHT (hydroxy tolune buthyl) ;
huile de tournesol A.millefolium T.balsamita M.didyma M.odorata C.grandiflora BHT
6.8 6.6 6.4 Pression (bars) 6.2 6 5.8 5.6 5.4 5.2 5 0 1 2 3 T emps (h) 4 5 6 7
Figure 18: Oxydation de l'huile de tournesol 110C, 5 bars, en prsence de diffrentes huiles essentielles
La mthode Oxipress est une procdure avantageuse et performante pour laquelle aucun compos chimique na t utilis. Les courbes doxydation typiques obtenues sont prsentes dans la figure (18). La variation de la pression ainsi que la priode dinduction ont t mesures avec prcision. Dans le cas de lajout de lhuile essentielle dans lhuile de tournesol (huile vecteur), la chute de pression a t retarde dun temps T, indiquant leffet antioxydant de la substance ajoute dans lhuile vecteur. Les effets des huiles essentielles valus pour diffrentes concentrations de celles-ci (0,05% ; 0,1% et 0,2%) sont prsents dans le tableau (15). Lhuile essentielle de M. didyma montre une activit antioxydante plus efficace, en comparaison des autres huiles essentielles. Les huiles essentielles de M. didyma et dA. millefolium ont t les plus efficaces pour la stabilisation de lhuile de tournesol. Lefficacit des huiles essentielles diminue en fonction de lordre suivant : M. didyma > A. millefolium > C. grandiflora >M. odorata >T. balsamita pour des concentrations de 0,05%, 0,1% et 0,2%.
109
Chapitre II : Caractrisation des composs organiques volatils de cinq plantes aromatiques mdivales ; Evaluation de lactivit biologique des huiles essentielles et des rsidus dhydrodistillation Tableau 15: Activit antioxydante (AA) des huiles essentielles compare l'efficacit du BHT
Facteur de Espces []% protection (FP) Sans additif BHT M. didyma M. didyma M. didyma A. millefolium A. millefolium A. millefolium C. grandiflora C. grandiflora C. grandiflora M. odorata M. odorata M. odorata T. balsamita T. balsamita T. balsamita 0,00 0,02 0,2 0,1 0,05 0,2 0,1 0,05 0,2 0,1 0,05 0,2 0,1 0,05 0,2 0,1 0,05 1,00 1,47 1,73 1,37 1,29 1,71 1,29 1,17 1,63 1,22 1,18 1,61 1,2 1,17 1,41 1,2 1,1
Activit antioxydante (AA) 1,00 1,55 0,79 0,62 1,51 0,62 0,36 1,34 0,47 0,38 1,30 0,43 0,36 0,87 0,43 0,21
priode dinduction (PI) 4,26 5,02 3,97 3,74 4,96 3,74 3,39 4,73 3,54 3,42 4,67 3,48 3,39 4,09 3,48 3,19
CV (%)
0,04 0,01 0,01 0,01 0,05 0,05 0,05 0,02 0,02 0,02 0,12 0,12 0,12 0,04 0,04 0,04
PI : priode dinduction FP : facteur de protection CV : coefficient de variation (%), (n=3)
Lefficacit des huiles essentielles dans les conditions appliques (TC: 110C, P: 5 bars) est dans lordre dcroissant suivant : M. didyma (0,2%) > A. millefolium (0,2%) > C. grandiflora (0,2%) > M. odorata (0,2%) > T. balsamita (0,2%) > M. didyma (0,1%) > A. millefolium (0,1%) > C. grandiflora (0,1%) > M. odorata (0,1%) > T. balsamita (0,1%) > M. didyma (0,05%) > C. grandiflora (0,05%) > A. millefolium (0,1%) > M. odorata (0,1%) > T. balsamita (0,1%) Lhuile essentielle est un complexe mixte de composs naturels volatils. Ainsi, lactivit antioxydante totale de lhuile essentielle va dpendre de la prsence du compos actif dans cette huile ainsi que de sa concentration. Certains composs phnoliques comme le thymol
110
qui est prsent dans plusieurs huiles essentielles, particulirement celles isoles des plantes contenant le gne Thymus, prsentent une activit antioxydante leve cause de la prsence du radical hydroxyle libre dans sa structure chimique (figure 19). Cest le cas chez M. didyma qui contient 47,06% de thymol dans la composition de son huile essentielle (voir Tableau 13). Lactivit antioxydante de M. didyma a t teste via la mthode de DPPH par Fraternal et al. pour laquelle lHE a montr une activit antioxydante comparable celle du Trolox (Fraternale et al., 2006) (figure 19). Ce dernier est une molcule drive de la vitamine E et de rfrence pour la mesure du pouvoir antioxydant de mlanges complexes.
Figure 19: structures chimiques du Trolox et du Thymol
Lactivit antioxydante des huiles essentielles dpend galement de la concentration de cellesci. Dans le cas dune dose leve (0,2%) de M. didyma, dA. millefolium, de C. grandiflora et de M. odorata, lactivit de leurs huiles est comparable celle du BHT ajout une concentration de 0,02%. Dans la littrature, lactivit antioxydante dA. millefolium a t value par des mthodes autres que lOxipress, comme la DPPH (Candan et al., 2003) o il a t dmontr que lextrait mthanolique (fraction hydrophile) de lAchille millefeuille prsente une
activit (IC50 : 45,60g/ml) deux fois plus faible de celle du BHT (IC50 : 19,30g/ml). Par contre, lactivit antioxydante de lHE sest rvle tre plus efficace (IC50 : 1,56g/ml) que celle du BHT (IC50 : 19,30g/ml). Il faut se placer une concentration de 0,2% pour avoir une activit antioxydante dA. millefolium (FP=1,71) plus efficace que celle de la rfrence synthtique (BHT) utilise 0,02% (voir tableau 15). Ceci pourrait tre reli la prsence de composs phnoliques (voir Tableau 4). Il a t dmontr que l'efficacit antioxydative dans des sources naturelles, tait
111
en particulier lie la prsence de composs phnoliques. Ces derniers ont un rle important dans linhibition de lauto-oxydation des huiles (Ramarathnam et al., 1995). Dans le but de dtecter les composs bioactifs parmi les composs majoritaires identifis dans lhuile essentielle dA.millefolium, des tests dactivit individuelle ont t effectus par Candan et al sur les molcules suivantes : eucalyptol, camphre, bta-pinne, bornol, terpinne-4-ol et alpha-pinne. Aucune activit in-vitro na t dtecte pour ces composs. En conclusion, ces rsultats montrent quil existe une synergie entre les composs majoritaires de lhuile essentielle offrant cette huile une activit antioxydante globale efficace. Daprs la Figure 20, on peut conclure que lajout de 0,2% de lhuile essentielle dAchille millefeuille permet de prserver lhuile de tournesol et de retarder loxydation de celle-ci de deux heures 110C et sous 5 bars. Cela correspond une augmentation de la rsistance de lhuile de tournesol de 71%.
huile de tournesol huile de tournesol aromatise avec 0,2% HE
7 pression (bar) 6.5 6 5.5 5 0 1
Temps (h)
Figure 20: courbe d'oxydation de l'huile de tournesol en prsence de l'HE d'Achillea millefolium
Lactivit antioxydante du th dAubrac est trs semblable celle de Myrrhis odorata pour les diffrentes doses (0,05%, 0,1% et 0,2%). Sachant que le compos majoritaire du cerfeuil musqu est lanthole et quil est prsent 75%, on peut relier de faon quasi vidente lactivit antioxydante modeste de cette plante la prsence de ce terpne ou theroxyde apolaire (figure 21). Ceci est en accord avec les travaux de Freire et al. dans lequel lanthole rvle une activit anti-oxydante modeste (Freire et al., 2005).
112
Figure 21: structure chimique du Trans-anthole
Dans le cas du th dAubrac, les composs majoritaires de lHE sont : lisomenthone, lisomenthol et le no-isomenthol. Ces composs aromatiques par la prsence dun groupe hydroxyle (voir figure 22) sont responsables de grandiflora. lactivit antioxydante de Calamintha
Figure 22: structure chimique de l'isomenthol (trans) et du no-isomenthol (cis)
Daprs la figure 23, on remarque que la priode dinduction de lhuile de tournesol aromatise par lHE de C. grandiflora a t augmente de 30 minutes. La prsence de 0,1% de cette HE a t suffisante pour augmenter la rsistance de lhuile de tournesol dune valeur de 16% face loxydation. Ces rsultats montrent une activit antioxydante non ngligeable de Calamintha grandiflora alors quaucune tude nen a fait tat jusqu prsent dans la littrature.
113
huile de tournesol aromatis avec 0,1% de l'HE Huile de Tournesol
Pression (bars)
6.5 6 5.5 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps (h)
Figure 23: Courbe d'oxydation de l'huile de tournesol en prsence de l'HE de la Calamintha grandiflora
Il existe un nombre trs faible dtudes scientifiques qui font tat de lactivit antioxydante de Tanacetum balsamita. En 2000, Bandonienne et al. ont compar lactivit antioxydant de lextrait actonique de Balsamite avec dautres extraits des autres plantes aromatiques en utilisant diffrentes mthodes dont lOxipress (Bandoniene et al., 2000). Les facteurs de protection de lextrait actonique de la Balsamite ont t calculs partir des priodes dinductions. Si on compare ces rsultats ceux obtenus partir de lespce dorigine franaise, on remarque que lactivit antioxydante une concentration donne (0,2%) est lgrement plus leve (FP : 1,66) dans le cas de lextrait actonique que dans le cas de notre huile essentielle (FP : 1,41). Lextrait actonique contient galement des composs non volatils dont certains sont certainement susceptibles davoir une activit antioxydante. Dautre part, le facteur de protection est dpendant de la concentration pour lhuile essentielle, et dose indpendant pour lextrait actonique de la Balsamite tudie par Bandoniene et al. pour lequel le facteur de protection est relativement stable dans la gamme de concentration tudie. Il est ncessaire de signaler que lespce utilise par Bandonienne et al. possde la carvone comme compos majoritaire la diffrence de notre espce o la tanactone (bta-thujone) constituait 83,57% (voir Tableau 9).
114
III.2.2.
Evaluation
de
lactivit
antioxydante
des
HE
via
des
mthodes
spectrophotomtriques (dines et trines conjugues) Aujourdhui, la recherche se concentre sur l'extraction d'antioxydants naturels qui seraient moins toxiques et plus efficaces que les antioxydants synthtiques gnralement utiliss pour combattre le " stress oxydant ", qui possde priori un effet fortement pathologique. Dans des organismes vivants, la protection contre des radicaux libres et l'espce d'oxygne ractive est ralise par des enzymes antioxydatives, comme la glutathion peroxydase ou bien les vitamines, les pigments, les phnols et polyphnols. Des antioxydants synthtiques, comme le butylhydroxytolune (BHT) et le butylhydroxyanisole (BHA), sont bien connus pour la capacit quils ont d'arrter les ractions en chane de peroxydation dun lipide. Malheureusement, il a t montr qu'ils sont capables d'augmenter le risque des maladies cancrignes, de causer des dgts pulmonaires chez les souris, une ncrose du foie, des hmorragies ainsi que la mort des rats (Branen, 1975). cet gard, les flavonodes et d'autres polyphnols ont capt l'attention en raison de leur non toxicit et de leur potentialit pour la mise en uvre dans les rgimes alimentaires chez lhomme. Loxydation des lipides, autrement dit la peroxydation des acides gras polyinsaturs (PUFA) gnre une grande quantit de produits drivs comme les dines conjugus dont la coupure des doubles liaisons gnre des aldhydes. Le stress oxydant correspond une perturbation dans le fonctionnement du statut oxydatif intracellulaire. Cest un dsquilibre entre les systmes de dfense antioxydants et la production des radicaux libres oxygns. Les marqueurs du stress oxydant sont surtout les produits de loxydation des lipides : dines conjugus, hydroperoxydes, aldhydes, TBARS (tiobarbituric acid reactive substances). Lestimation des dines conjugus est dtermine partir de labsorption diffrentielle 234 nm. Les molcules comportant un dine conjugu sont caractrises par une absorption intense de lumire ( = 27000 mol-1 l.cm-1) entre 215 nm et 250 nm (max = 232 nm). La mesure de la quantit de dines conjugus dans les acides gras donne une indication sur le degr dinsaturation des acides contenus dans lhuile. Ainsi il existe plusieurs paramtres qui permettent de contrler lvolution de loxydation des huiles (voir chapitre 1, paragraphe VII.2), parmi eux, la valeur des acides gras (FFA, Free Fatty Acid Value), la valeur de peroxydation (PV, peroxidation value), les dines conjugus (CD) et les trines conjugus (CT). Les dines et les trines conjugus constituent de bonnes sources de mesures pour ltat doxydation des huiles (Dapkevicius, 1998).
115
Lobjectif de ce travail est dtudier limpact des huiles essentielles des plantes aromatiques oublies dans le retardement du processus doxydation de lhuile de tournesol. Lhuile de tournesol a t utilise comme huile vecteur. Nous avons prpar 5 chantillons de lhuile de tournesol aromatise par les cinq huiles essentielles deux concentrations diffrentes. Les quantits exactes ainsi que la procdure exprimentale et les paramtres sont dcrits en dtail dans la partie exprimentale (cf. V.2). Par la suite, laide de la mthode des dines conjugus, qui mesure le coefficient dextinction en fonction du temps et en fonction de chaque huile essentielle, on a pu distinguer limpact de chaque huile essentielle dans linhibition de la formation des dines ou des trines conjugus en travaillant deux longueurs dondes diffrentes (232nm et 268nm). Aprs 15 jours dincubation 80C des chantillons dhuiles aromatises, on remarque que lhuile essentielle de M. didyma a t la plus efficace comparativement aux autres huiles essentielles. Ainsi lordre defficacit de lactivit antioxydante des huiles essentielles tudies est le mme que celui observ en utilisant la mthode Oxipress.
huile de tournesol C.grandiflora BHT

2.5 2 1.5
M.didyma M.odorata
A.millefolium T.balsamita
%E
1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Temps (jours)
Figure 24: Contrle de l'volution de l'oxydation de l'huile de tournesol en fonction de la quantit de trines conjugus mesurs 268nm, (% de lHE dans lhuile de tournesol = 0,1%)
116
On peut remarquer quen aromatisant lhuile de tournesol avec 0,1% dhuile essentielle on a retard la formation des produits doxydation secondaire (trines conjugus). Lhuile de tournesol utilise a rsist loxydation secondaire pendant 8 jours. Au-del, les produits doxydation secondaire ont commenc se former (figure 24). En fonction de lactivit antioxydante de chaque huile essentielle, un retardement de la progression de loxydation est observ, sachant que toutes les huiles essentielles tudies ont t plus efficaces que la rfrence synthtique utilise (BHT). Si on travaille une concentration plus faible en huiles essentielles soit 0,05% (figure 25), lefficacit antioxydante diminue. Cependant lordre defficacit est le mme que celui obtenu dans les cas dajout de 0.1% de lHE. Toujours au-del de 8 jours, lvolution de loxydation dans les huiles aromatises commence progresser de plus en plus rapidement, contrairement lhuile de tournesol pour laquelle la formation des produits doxydation secondaire (trines conjugus) commence au-del dune journe 80C.

2.5 2
M.didyma M.odorata
%E
1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Temps (jours)
Figure 25: Contrle de l'volution de l'oxydation de l'huile de tournesol en fonction de la quantit de trines conjugus mesurs 268nm, (% de lHE dans lhuile de tournesol = 0,05%)
En mesurant labsorption la longueur donde de 232nm, on dtecte cette fois-ci les dines conjugus (figure 26). On remarque que la formation des dines conjugus a t plus rapide que celle des trines. Ds les premires heures, la concentration en produits doxydation primaire a augment dune faon trs rapide 80C. Cependant, la diffrence dactivit antioxydante entre les huiles essentielles est trs faible pour 0,05% dHE. La concentration en
117
dines conjugus forms lors de loxydation primaire est trs leve par rapport celle des trines conjugus.

16 14 12 10 8 6 4 2 0
0 2 4 6
M.didyma M.odorata
%E
10
12
14
16
Temps (jours)
Figure 26: Contrle de l'volution de l'oxydation de l'huile de tournesol en fonction de la quantit de dines conjugus mesurs 232nm, (% de lHE dans lhuile de tournesol = 0,05%)
En appliquant une dose dhuile essentielle deux fois plus leve (0,1%), on arrive distinguer des activits antioxydantes distinctes pour chacune des huiles essentielles. Par exemple, partir de la figure 27 on peut conclure que lhuile essentielle de M. didyma est la plus efficace en retardant le plus longtemps la formation des produits doxydation primaire, et lordre defficacit antioxydante est le mme que celui obtenue via la mthode Oxipress. En gnral, la mthode spectrophotometrique est trs performante, elle donne une ide trs rapide sur lvolution du processus doxydation, et permet de distinguer les deux stades doxydation primaire et secondaire. Cette mthode est plus avantageuse car on travaille dans des conditions plus proches des conditions de stockage des aliments (pression atmosphrique, T : 80C), que celles utilises pour lOxipress o les conditions sont acclres (T :110C, Pression : 5 bars). En outre, la mthode Oxipress permet de comparer dune faon plus fine la diffrence entre les activits antioxydantes, grce aux valeurs des facteurs de protection que lon peut calculer.
118

16 14 12 10
M.didyma M.odorata
%E
8 6 4 2 0
8 Temps (jours)
10
12
14
16
Figure 27: Contrle de l'volution de l'oxydation de l'huile de tournesol en fonction de la quantit de dines conjugus mesurs 232nm, (% de lHE dans lhuile de tournesol = 0,1%)
En appliquant ces deux mthodes de mesure nous avons pu observer que les cinq huiles essentielles possdaient une activit antioxydante significative avec des variations qui dpendent de plusieurs facteurs, comme ; le taux des composs phnoliques, les groupements fonctionnels donneurs dlectrons, les fonctions hydroxyles, ainsi que des synergies entre les composs actifs qui constituent chaque huile essentielle.
Ces rsultats positifs sur lactivit antioxydante des huiles essentielles suggrent des tudes plus approfondies de leur activit biologique, afin dlaborer des produits naturels de valeur pouvant tre commercialiss et substitus aux antioxydants existants.
Ces proprits antioxydantes obtenues partir des fractions volatiles des plantes aromatiques oublies, peuvent tre compltes et renforces par des activits biologiques des rsidus dhydrodistillation. Nous avons alors dcid de faire des extractions de ces rsidus par diffrents solvants pour valuer leur potentiel antioxydant.
119
III.3. Evaluation de lactivit antioxydante des rsidus dhydrodistillation des 5 plantes aromatiques par la mthode de DPPH III.3.1. Principe de la mthode de DPPH Loxydation des lipides contenus dans les aliments est responsable de la formation des mauvaises odeurs (off-odors) et des composs chimiques indsirables nocifs pour la sant humaine. Les antioxydants sont utiliss dans les industries alimentaires pour retarder le processus doxydation. Plusieurs tests ont t utiliss pour mesurer la rsistance des lipides face loxydation en prsence dantioxydants (cf. Chapitre I, paragraphe V.3.2). Ces tests sont gnralement adapts pour des milieux sous forme dmulsion lipidique. Lautooxydation est un phnomne lent, le processus de formation radicalaire inclut les ractions en chane, induction, propagation et terminaison. Pendant la priode dinduction, des radicaux alkyles sont forms et ragissent avec les molcules doxygne pour gnrer les hydroperoxydes et les peroxydes durant la phase de propagation. La phase de terminaison consiste lassociation des deux radicaux afin de former un produit stable. La majorit des tests consiste rduire la priode dinduction, en utilisant des tempratures hautes, et, ou des pressions fortes. A partir de ces tests, lactivit antioxydante de plusieurs extraits de plantes a t value en mesurant la consommation doxygne ou la production des hydroperoxydes ou autres produits de dgradations. La mthode de DPPH, consiste utiliser un radical stable, le 2,2-diphnyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, figure 28) dans du mthanol (dans la plupart des cas) (Dvaranauskaite et al., 2008). La rduction du DPPH est contrle en mesurant labsorbance de la solution une longueur donde caractristique (515 nm). A cette longueur donde le radical absorbe, mais aprs sa rduction par lantioxydant (AH) ou un autre radical, labsorption diminue. DPPH + AH DPPH-H + A DPPH + R DPPH-R Brand-Williams et al. ont mis trois hypothses qui expliqueraient lefficacit anti-radicalaire de plusieurs composs phnoliques (Brand-Williams, 1995). La premire hypothse consiste en une raction de donation dun hydrogne suivie de la dlocalisation du groupe substitu en para (voir figure 28, Raction 1). Le modle tait leugnol ; cette hypothse est valable pour tous les phnols qui possdent deux ou trois atomes dhydrogne sur le carbone en position para du groupe aromatique.
120
La deuxime hypothse consiste une dimrisation entre deux radicaux phenoxyles (figure 28, raction 2), comme dcrite par Pokorny et al. pour le phnol avec la position ortho et para. Aprs dimrisation, deux groupements hydroxyles rgnrent un transfert
intramolculaire de H, ce dernier peut ragir avec le DPPH.
Figure 28: Ractions proposes par Brand-Williams et al, de l'eugnol avec le DPPH
La troisime hypothse consiste en la complexation du DPPH avec un radical aryle (figure 28, raction 3) Il est connu que les polyphnols ont une activit antioxydante plus efficace que les monophnols, par exemple lacide cafique possde une activit antiradicalaire plus efficace que lacide coumarique (monophnol). Lacide gallique, un triphnol est plus actif que lacide protocatechique (ARP : anti radical power = 12,5 et 7,15 respectivement) (Brand-Williams, 1995)
121
Figure 29 : Mcanisme de rgnration de l'ortho-diphnol
La position du groupement hydroxyle est trs importante. Les composs qui possdent le groupement hydroxyle en position ortho et para ont une activit antioxydante trs forte en comparaison avec ceux qui possdent un groupement hydroxyl en position meta. Lefficacit des diphnols (position ortho et para) est due la stabilisation du radical (aryloxyle) par une liaison hydrogne ou par rgnration des autres diphnols comme il est indiqu dans la figure 29. Au dpart le DPPH est sous sa forme 2,2-diphnyl-1-picrylhydrazyl radicalaire. Ce radical a une couleur violette en raison de llectron non appari et de lazote. Aprs raction avec l'atome d'oxygne d'un capteur de radicaux, le DPPH-H rduit (2,2-diphnyl-1picrylhydrazin) qui est form est jaune (figure 30). Le changement de couleur peut tre suivi par spectrophotomtrie 517 nm.
Figure 30: Schma de transformation du DPPH de sa forme active celle inactive
122
III.3.2. Comparaison des activits antioxydantes des rsidus dhydrodistillation mesures par la mthode de DPPH. Les rsidus de chaque hydrodistillation, ont t extraits par lintermdiaire dun Soxhlet en utilisant trois solvants diffrents : le mthanol, lthanol, et lactone (figure 31). Lobjectif de cette tude tait de tester lactivit antioxydante des rsidus, de les comparer pour chaque plante et dvaluer lefficacit des diffrents solvants sur lextraction des composs antioxydants des rsidus dhydrodistillation. Le protocole exprimental de lextraction, les quantits et les diffrents paramtres utiliss sont dcrits en dtails dans la partie exprimentale (Cf. III.2).
Figure 31: Schma exprimental du protocole d'analyse chimique des HE et d'evaluation des activits antioxydantes et antibactriennes
Lactivit antioxydante des extraits de rsidus des plantes a t examine en comparant cette activit avec celle du rsidu dhydrodistillation du Romarin (Rosmarinus officinalis) connu comme rfrence antioxydant naturel et trait dans les mmes conditions.
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Pourquoi la comparaison avec le Romarin ? Le 30 juin 2008, lAutorit Europenne de Scurit des Aliments (E.F.S.A.) a rendu un avis indiquant que lutilisation dextraits de romarin en tant quantioxydant dans les aliments ne prsentait pas de risque pour la sant des consommateurs. Cet avis ouvre la voie ladoption officielle des extraits de Romarin dans la rglementation sur les additifs alimentaires, permettant de les tiqueter antioxydant : extrait de romarin . Cela rpond parfaitement aux exigences croissantes des consommateurs pour la naturalit des produits alimentaires.
Linhibition du DPPH radicalaire a t value pour chaque rsidu et pour chaque solvant et les rsultats sont prsents dans le Tableau16. Une valeur faible dIC50 indique une activit antioxydante forte. Le pourcentage dinhibition (% I) pour chaque rsidu a t calcul, les essais ont t raliss en triplicata et les rsultats sont exprims en ET (Ecart type), la valeur dIC50, la concentration de lchantillon ncessaire pour inhiber 50% du DPPH radicalaire a t calcule par rgression linaire des pourcentages dinhibition calcul en fonction de quatre concentrations diffrentes dchantillons prpars. (Cf. Partie Exprimentale, paragraphe IV.2.1).
Tableau 16: Activit antioxydante des extraits de rsidus d'hydrodistillation
IC50 (mg/mL) ET (n=3) Extraits Plante Achillea millefolium Monarda didyma Tanacetum balsamita Calamintha grandiflora Myrrhis odorata Rosmarinus officinalis
ET : cart type
Extraits Ethanoliques 1.17 0.08 1.85 0.11 2.53 0.15 2.69 0.16 2,70 0.14 1.19 0.08 Extraits Actoniques 1.22 0.13 2.01 0.12 2.6 0.12 2.9 0.21 2.95 0.13 1.25 0.14
Mthanoliques 0.45 0.09 1.54 0.12 1.84 0.1 2.54 0.12 2.60 0.13 0.95 0.08
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Daprs le tableau 16, on remarque que lactivit antioxydante du rsidu dAchillea millefolium a t la plus efficace parmi les autres. Lordre defficacit est le suivant Achillea millefolium > M. didyma > T. balsamita > C. grandiflora > M. odorata. Les extraits mthanoliques ont t lgrement plus efficaces que les extraits thanoliques et actoniques. Lactivit du rsidu dA. millefolium (0 .45mg/mL) a t plus efficace que celle de la rfrence naturelle Romarin (0.95 mg/mL). En 2003, Candan et al. ont montr que lactivit antioxydante de la phase polaire de lhuile essentielle tait plus intense (IC50 : 1,56g/ml) que celle de lextrait mthanolique (IC50 : 45,60 g/ml) de la plante entire, Achillea millefolium. Lactivit antioxydante de notre extrait mthanolique des rsidus dhydrodistillation dAchille millefeuille possde une activit 10 fois moins intense que lextrait mthanolique de la plante entire dorigine turque tudie par Candan et al. en 2003 (Candan et al., 2003). Nanmoins, nos rsidus dhydrodistillation possdent une activit antioxydante six fois suprieure celle du thymol (IC50 :13,3 mg/ml 0.19) test dans les travaux de Cavar et al. sur la plante Sariette en utilisant le thymol comme contrle (Cavar et al., 2008). A notre connaissance, aucune donne n'a t publie sur l'activit antioxydante utilisant le DPPH sur les rsidus dhydrodistillation de ces cinq plantes. La littrature dcrit des approches diffrentes pour la dtermination des activits antioxydantes des extraits de plantes. Ces approches mthodologiques diffrentes mnent des rsultats disperss, qui ne sont pas toujours comparables. Nous avons choisi la mthode DPPH en raison de sa simplicit, rapidit, sensibilit et de sa reproductibilit, mais aussi parce que les mesures IC50 exprimes en mg/mL sont comparables entre elles et non pas seulement celle dune rfrence.
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III.4. Evaluation de lactivit antibactrienne des huiles essentielles La dcomposition des denres alimentaires est un problme srieux en termes de scurit sanitaire, de valeur nutritive et de perte conomique pour lindustrie agroalimentaire. Depuis lantiquit, les aliments ont toujours t prservs par chauffage, schage, refroidissement ou fermentation. Depuis quelques annes, les conservateurs alimentaires synthtiques sont devenus largement utiliss et des techniques ont t dveloppes pour augmenter la dure de vie des produits. Cependant des conservateurs chimiques synthtiques, comme le benzoate, les nitrites et les sulfites posent des problmes en termes de scurit et de sant humaine. La recherche de nouveaux agents antibactriens dorigine naturelle soriente alors de plus en plus vers les acides organiques, les huiles essentielles ou bien les extraits vgtaux. Les plantes restent la source la plus commune d'agents antimicrobiens. Leur utilisation comme remdes traditionnels est la plus populaire pour 80 % de la population mondiale. En Asie, Amrique Latine et Afrique, plus de 35000 espces de plantes sont utilises des fins mdicinales. Les huiles essentielles, les pices ainsi que les plantes mdicinales sont connues depuis des sicles pour leur activit biologique, en particulier antifongique, antibactrienne et antioxydante. Ces proprits dpendent du chmotype de la plante qui dtermine la composition chimique de ses propres substances de rserve (Rauha et al., 2000). Ces dernires annes, les laboratoires pharmaceutiques ont beaucoup investi dans le dveloppement dextraits de produits naturels base de plantes pour contrecarrer la rsistance des microorganismes pathognes vis--vis dagents antimicrobiens classiques. Plusieurs tudes concernant les proprits antimicrobiennes des extraits de plantes, que ce soit dans un systme modle ou dans un produit commercialis peuvent tre trouves dans la littrature. Par exemple, Hao et al. en 1998 ont tudi lefficacit dextraits de plantes dans linhibition de lactivit pathogne de Aeromonas hydrophilia et Listeria monocytogenes dans les volailles cuisines et rfrigres (Hao et al., 1998). Friedman et al. en 2002 eux, ont tudi lactivit antibactrienne du thym, de lorigan et de la cannelle, vis--vis dEscherichia coli. Ils ont attribu lactivit antibactrienne de ces pices la prsence du thymol, du carvacrol, du cinnamaldehyde, de leugnol, du graniol, du citral et du mthyle chavicol (Friedman et al., 2002). Les terpnes, para-cymne et gamma-terpinne qui sont abondants dans la composition chimique de lhuile de Thym nont cependant pas deffet contre la Salmonella typhimurium. Jusqu prsent, il nexiste pas dtude qui puisse nous donner une ide claire et prcise sur le mode daction des HE. Etant donn la complexit de leur composition chimique, tout laisse
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penser que ce mode daction est assez complexe et difficile cerner du point de vue molculaire. Il est trs probable que chacun des constituants des HE ait son propre mcanisme daction. Shapiro et al. en 1994 ont dmontr que le thymol inhibe la voie de gnration de lATP (adnosine tri-phosphate) (Shapiro et al., 1994). Ulte et al. en 2000 ont montr que le carvacrol provoque galement un effet inhibiteur chez Bacillus cereus de lATP intracellulaire (Ulte et al., 2000), comme dans le cas du thymol. Une rduction du potentiel membranaire et du pH intracellulaire impacte sur le flux de potassium (intra et extracellulaire) qui endommage la membrane cytoplasmique. Lobjectif de cette dernire tude prsent dans ce chapitre est dvaluer lactivit antimicrobienne des cinq huiles essentielles via deux mthodes diffrentes. La premire est la mthode de diffusion sur Agar. Le taux defficacit de lHE vis--vis de chacune des bactries utilises est alors mesur par le diamtre dinhibition. La deuxime mthode est la Plaque de Microtitrage qui permet de calculer la concentration minimale inhibitrice (CMI) en huile essentielle ncessaire pour inhiber 50% des bactries. III.4.1. Evaluation de lactivit antibactrienne en utilisant la mthode de diffusion sur Agar Neuf bactries pathognes, cinq Gram positif, Bacillus subtilus, Bacilus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et quatre Gram ngatif, savoir Salmonella typhymurium, Salmonella typhymurium D338, Salmonella enteritidis, Salmonella agona et Escherichia coli, ont t utilises dans cette tude. Lactivit antibactrienne a t value par la mthode de diffusion sur agar. 10 L de solution mthanolique dHE 1,0 % et 0,5 % ont t ajouts dans les puits dagar. Le mthanol pur a t utilis comme un contrle dans des chantillons blancs. Aprs incubation, les diamtres d'inhibition ont t mesurs au moyen dun pied coulisse avec une exactitude de 0,1 mm. L'activit antibactrienne a t calcule en une moyenne de trois rptitions, pour chaque HE et pour chaque bactrie. Le protocole ainsi que les diffrentes quantits sont dcrites en dtail dans la partie exprimentale (cf. VI.1).
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Tableau 17: Activit antibactrienne des huiles essentielles mesure diffrentes concentrations et exprime en diamtre d'inhibition
M. didyma
C. grandiflora 1% DI ET 0,5% DI ET
A. millefolium
M. odorata 1% DI ET 0,5% DI ET
T. balsamita 1% DI ET 0,5% DI ET
Antibiotique
Bactries
1% DI ET
0,5% DI ET
1%
DI ET
0.5%
DI ET
sensi-disc
Bacillus subtilis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Salmonella typhimurium Salmonella typhymurium D338 Salmonella enteritidis Salmonella agona Esherichia coli
16,5 0,1 40 0,0 13,1 0,1
12,8 0,2 13,1 0,1 10,2 0,3
19,1 0,1 9,8 0,2 9,7 0,3
8,5 0,2 10,6 0,3 na
11.0 0,2 13.6 0,2 12.8 0,1
8.6 0,1 10.7 0,2 8.8 0,2
9,2 0,2 10,6 0,5 8,8 0,2
8,5 0,2 9,9 0,1 na
10,2 0,1 11,4 0,1 9 0,2
8,2 0,1 8,8 0,2 na
16,8 0,1 29,0 0,2 21,0 0,3
14,7 0,2 15 0,3
11,5 0,3 11 0,2
10 0,5 8,9 0,2
na na
na 9.2 0,2
na na
9,1 0,3 8,1 0,3
na na
8,5 0,2 8,4 0,2
na na
25,8 0,1 31,2 0,3
16,2 0,2 15,2 0,1 13,8 0,3 18,9 0,4
12,2 0,3 11,5 0,2 10,7 0,2 14,4 0,4
9,3 0,2 10,1 0,4 8,4 0,3 10,3 0,1
8,8 0,4 9,1 0,1 na na
na na 10.4 0,4 na
na na 9.1 0,3 na
9 0,5 8,1 0,5 na 10,2 0,4
na na na na
9,7 0,1 8,9 0,1 na 9,7 0,2
na na na na
34,0 0,1 32,2 0,3 20,8 0,3 26,4 0,2
DI : Diamtre dinhibition en mm, ET : ecartype, na : non active
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Un disque d'antibiotique de rfrence appropri a t appliqu sur chaque boite de ptri (ceftazidine/ l'acide clavulanique, 30/10 g; BBL, CAZ/CLA, 231753); ces disques ont servi de contrle positif efficace contre toutes les espces bactriennes utilises dans ltude. L'activit antimicrobienne des solutions mthanoliques d'HE a t value in vitro contre ces neuf espces bactriennes (Tableau 17). Les bactries Gram positif ont t plus sensibles que celles Gram ngatif, particulirement Bacillus cereus, qui tait l'espce la plus sensible vis--vis de lHE de M. didyma. Cette dernire, a montr une efficacit leve contre toutes les cultures microbiennes pour une concentration de 1%. Trs probablement le pourcentage lev de thymol dans la composition chimique de lHE de M. didyma a t le facteur favorable son activit antimicrobienne. Ces rsultats sont en accord avec ceux prcdemment publis sur les huiles essentielles riches en thymol, comme Thymus vulgaris aux proprits antimicrobiennes reconnues fortes contre des bactries pathognes diverses (Loziene et al., 2007). Les HEs de T. balsamita et M. odorata 0.5 % possdent les activits antimicrobiennes les plus faibles contre la majorit des bactries en comparaison avec les autres huiles appliques la mme concentration. Elles montrent une activit antibactrienne seulement contre Bacillus cereus et Bacillus subtilus. Lhuile essentielle de C. grandiflora a t la plus efficace contre Bacillus subtilus, cette huile sest montre plus active que lantibiotique utilis. La majorit des huiles essentielles tudies, prsentent une faible activit inhibitrice marque sur les deux espces de Salmonella. L'effet inhibiteur de lHE de M. didyma (1%) contre Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium et Staphylococcus epidermidis tait aussi bas que l'effet de l'antibiotique de rfrence; cependant, dans le cas de Bacillus subtilus, l'effet de lHE de M. didyma tait quivalent celui de lantibiotique. Lactivit antimicrobienne de lhuile essentielle dA. millefolium a t plus efficace contre Staphylococcus aureus et Bacillus cereus. Par contre, lhuile essentielle dA. millefolium nest pas active vis--vis dEscherichia coli. Ces rsultats sont trs cohrents avec la littrature et en particulier avec les travaux de Candan et al (Candan et al., 2003).
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III.4.2. Evaluation de lactivit antibactrienne en utilisant la mthode de plaque de micro titrage. Trois bactries pathognes ont t utilises dans cette tude, deux bactries Gram Positif, Bacilus cereus, et Staphylococcus aureus et une Gram ngatif, Salmonella typhimurium. Les huiles essentielles ont t dissoutes au 1/1000 (v/v) dans de lthanol. Des plaques de micro-titrage ont t utilises pour la dtermination de la CMI. La procdure exprimentale est dcrite en dtail dans la partie exprimentale (cf. VI.2 ). Le tableau 18 montre que lhuile essentielle de C. grandiflora est la plus efficace contre Bacillus cereus (CMI : 0,08 g/mL), rsultat cohrent avec les expriences de diffusion sur Agar. Par contre Bacillus cereus est la bactrie la plus rsistante vis--vis des quatre autres huiles essentielles. Salmonella typhimurium est la moins sensible parmi les trois bactries. Les activits antibactriennes des cinq huiles essentielles vis--vis de Salmonella sont presque quivalentes, mise part lhuile essentielle de M. didyma qui est lgrement plus forte (CMI : 0,12 g/mL). La rsistance de Staphylococcus aureus est plus forte vis--vis de lHE de T. balsamita comparativement aux quatre autres huiles essentielles.
Tableau 18: Concentration inhibitrice minimale (CMI) des huiles essentielles
Matriels
Bactrie/ CMI, g/mL Salmonella typhimurium ATCC14028 Staphylococcus aureus ATCC25923 0.12 0.31 0.15 0.12 0.15 0.47 Bacillus cereus ATCC10876 0.31 0.31 0.15 0.31 0.08 0.31
A. millefolium T. balsamita M. odorata M. didyma C. grandiflora Ethanol
0.15 0.15 0.15 0.12 0.15 0.31
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En comparant nos travaux avec ceux de Yousefzadi et al. dans lesquels la CMI de lhuile essentielle de T. balsamita a t dtermine vis--vis de Staphylococcus aureus, on remarque que notre espce est bien plus efficace vis--vis de cette bactrie que celle tudie par ces auteurs (CMI : 7,5 g/mL) (Yousefzadi et al., 2009). Lespce Iranienne tudie dans ces travaux possde la carvone comme compos majoritaire alors que dans notre cas, cest la bta-thujone. On remarque que lespce sauvage dorigine franaise, fournit une huile essentielle beaucoup plus efficace vis--vis des deux souches bactriennes, Staphylococcus aureus (CMI : 0,117 g/mL) et Bacillus cereus (CMI : 0,313 g/mL), par rapport lespce sauvage dorigine turque tudie par Candan et al. o la concentration inhibitrice minimale de cette espce vis-vis de ces deux bactries est gale 72mg/mL (Candan et al., 2003).
Ces travaux montrent que les huiles essentielles des plantes aromatiques oublies slectionnes dans la rgion de Midi-Pyrnes possdent des activits antioxydantes non ngligeables ainsi que des activits antibactriennes remarquables vis--vis de nombreuses bactries pathognes. Ces rsultats confirment lutilisation potentielle de ces 5 huiles essentielles dans le domaine agroalimentaire pour la conservation des aliments. Nanmoins, il faudra prendre en compte limpact organoleptique que pourraient amener les proprits aromatiques marques de ces huiles sur le produit final.
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Chapitre III : Mise en place dune mthodologie instrumentalise de caractrisation rapide des huiles essentielles natives ; Application pr-industrielle laromatisation des huiles vgtales par les plantes aromatiques
Chapitre III :
Mise en place dune mthodologie instrumentalise de caractrisation rapide des huiles essentielles natives ; Application pr-industrielle laromatisation des huiles vgtales par les plantes aromatiques
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Rsum :
Ce chapitre est compos de deux parties distinctes. La premire partie (Partie I) concerne lexploitation de deux voies analytiques de COVs pour contrecarrer la faible disponibilit de la matire vgtale, et accder une valuation rapide du potentiel aromatique de la plante. Pour cela, deux approches ont t envisages. La premire concerne lutilisation dun chantillonnage classique coupl un dtecteur forte sensibilit comme la chromatographie bidimensionnelle et la seconde concerne un chantillonnage spcifique ddi lanalyse des effluves mis par le froissement du vgtal dans un systme dnom Crushing Finger Device , CFD. La deuxime partie de ce chapitre (Partie II) est lapplication dans le domaine agroalimentaire des 5 plantes une tude de faisabilit daromatisation de lhuile de tournesol par macration.
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Chapitre III : Mise en place dune mthodologie instrumentalise de caractrisation rapide des huiles essentielles natives
Partie I. Voie analytique Introduction :

Lors de ltude de la composition chimique des huiles essentielles des plantes aromatiques oublies et lvaluation de leurs activits biologiques, nous avons souvent t confront au problme de raret. Ainsi donc, nous devions faire face la difficult dapprovisionnement en plantes, except pour Achillea millefolium qui a t rcolte sous sa forme sauvage Toulouse. Nous avions des problmes pour obtenir des quantits suffisantes de matire vgtale ncessaire afin de pouvoir faire non seulement les exprimentations dhydrodistillation mais aussi les tests de bio-activit. Suite ce problme, nous avons dcid de dvelopper deux approches analytiques A et B. La premire (A) est base sur une technique dchantillonnage classique (SPME) couple un systme de sparation/dtection sophistiqu (CPG-2D/TOF), la deuxime (B) quant elle fait appel un systme dchantillonnage sophistiqu (CFD-DHS) coupl un systme de sparation/dtection classique (CPG-SM). Les plantes huiles essentielles dsignent des vgtaux odorants utiliss en parfumerie, cosmtique, culinaire et en mdecine douce dont les extraits aromatiques peuvent tre obtenus par entranement la vapeur ou par hydrodistillation de leurs feuilles ou de leurs fleurs. Cette phase d'extraction provoque la destruction par clatement des vsicules de stockage surfaciques qui contiennent les huiles essentielle ; nous avons imagin quune pr-valuation du potentiel aromatique des plantes pourrait tre ralise en mimant le froissement de la feuille entre les doigts pour librer les substances volatiles qui seront analyses par "sniffing". Nous nous sommes donc intress la mise au point d'un systme instrumental d'valuation rapide du potentiel aromatique de plantes huile essentielle bas sur l'analyse des effluves (HeadSpace). Un appareillage novateur dnomm "Crushing Finger Device" (CFD) (EL Kalamouni et al., 2010) bas sur le concept de "Scratch'n Sniff" a t mis au point afin de mimer instrumentalement le froissement de la feuille entre les doigts suivi du pigeage des composs volatils odorants mis en vue de leur analyse chromatographique ultrieure. Tanacetum balsamita a t choisie comme plante modle pour la mise au point du CFD. Dans ce chapitre nous avons dune part procd la comparaison du profil chromatographique de l'huile essentielle de feuilles fraches de la plante modle, obtenue par hydrodistillation avec celui des effluves de feuilles fraches et natives extraites par CFD et
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analys dautre part les effluves de feuilles fraches entires, concentres par SPME puis analyses en CPG-2D/TOF-SM.
(A) Premire approche analytique base sur une technique dchantillonnage classique couple un systme de sparation/dtection sophistiqu
I. Analyses des COVs mis par les feuilles par lintermdiaire de la CPG bidimensionnelle.
La premire approche aborde dans ce chapitre, est lutilisation dune technique dextraction en Headspace classique (SPME), couple un systme de sparation/dtection sophistiqu (CPG-2D/TOF). I.1. Principe de la CPG bidimensionnelle La CPG bidimensionnelle est une technique de sparation de chromatographie en phase gazeuse dans laquelle tous les composs lus dune premire colonne sont successivement soumis une sparation dans une deuxime colonne de slectivit diffrente. Les deux colonnes sont connectes en srie au moyen dun modulateur (figure 32) qui chantillonne leffluent de la premire colonne sous forme dimpulsions chimiques et les transfre en continu vers la deuxime colonne. La dure requise pour effectuer cette opration, appele priode de modulation, impose une deuxime sparation trs rapide (quelques secondes). Afin que chaque impulsion soit spare dans un temps inferieur la priode de modulation, on choisit une colonne courte et de faible diamtre interne (typiquement 1 m 0,1 mm d.i.). Le pic dlution issu de la premire colonne (A) est chantillonn par le modulateur. Chaque fraction est focalise puis injecte en continu dans la deuxime colonne. Le signal dtect correspond donc une succession de sparations ralises dans la deuxime dimension (B). En accolant ces chromatogrammes, le signal est reconstruit dans un plan de rtention deux dimensions qui sapparente une cartographie de lchantillon dans laquelle lintensit des pics chromatographiques est traduite par une dgradation de la couleur. Pour que la sparation CPG-2D soit effective, deux contraintes sont fixes pour le choix de la priode de modulation. On considre quun minimum de trois chantillonnages par pic lu de la premire dimension est ncessaire. Par ailleurs, si le temps de rtention dun
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compos dans la seconde dimension est suprieur la priode de modulation, alors son pic dlution appartient au cycle(s) de modulation suivant(s), ce qui entraine une mauvaise reprsentation du chromatogramme 2D conduisant a des problmes didentification et a une baisse de la rsolution.
Figure 32: Schma reprsentatif du modulateur d'une CPD-2D
I.1.1. Sparations orthogonales La sparation est dite orthogonale si les mcanismes de rtention dans chaque dimension sont indpendants lun de lautre. Cette condition est ralise par la mise en uvre de colonnes dont les phases stationnaires sont de natures chimiques diffrentes pour une sparation en programmation de temprature. Gnralement, les systmes de CPG-2D associent une premire colonne de type apolaire (dimethylpolysiloxane) une seconde colonne de type polaire (polyethyleneglycol, phenylmethylpolysiloxane ou cyclodextrine). La polarite dune phase stationnaire dsigne sa facult dvelopper des interactions spcifiques par effets lectroniques, striques ou chiraux. En CPG, le facteur de rtention dun solut est inversement proportionnel sa tension de vapeur. Si la premire sparation est ralise dans une colonne de type apolaire, les coefficients dactivit sont tous proches de lunit car il ny a pas dinteractions spcifiques. La rtention est gouverne uniquement par la tension de vapeur et les composs sont spars par temprature dbullition croissante. Dans la seconde
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colonne, polaire, la sparation est trs rapide (< 10 secondes) et a donc lieu dans des conditions pratiquement isothermes, compte tenu de la faible rampe de temprature (~ 2C/min). Les soluts injects dans la deuxime colonne tant lus de la premire dimension la mme temprature (TC), leur temprature dbullition na plus dinfluence sur la deuxime sparation et leur rtention est donc uniquement gouverne par leur coefficient dactivit. Le chromatogramme est donc structur selon les proprits physico-chimiques des constituants du mlange sparer : tension de vapeur dans un premier temps puis la polarit. Ainsi, lorganisation en bandes dlution spcifiques chaque famille chimique facilite lidentification des composs par la combinaison de deux informations indpendantes. I.2. Matriels et mthodes I.2.1. Echantillons Les feuilles de Tanacetum balsamita utilises pendant le pigeage en mode HeadSpace semi statique ont t coupes dlicatement partir des pots obtenus pendant la priode de fvrier 2008. I.2.2. Extraction des COV par SPME Une feuille de Tanacetum balsamita a t mise dans un vial serti avec un septum en tflon. Lclatement des vsicules a t induit par agitation par lintermdiaire dun barreau aimant. Les COVs mis par la feuille ont t pigs pendant 2 minutes par lintermdiaire de la fibre SPME de type Carb/PDMS (75m). I.2.3. Analyses chromatographiques des COVs par CPG-2D Les analyses des COVs pigs par la fibre SPME ont t faites par un CPG-2D/TOF Agilent 6890, aprs 2 minutes de dsorption de la fibre la temprature de linjecteur (280C). Le gaz vecteur est lhlium (Dbit 1ml/min) et la programmation de temprature pour la premire colonne (DB-5, 30m, 320m de diamtre intrieur et de 1m dpaisseur de film) est la suivante : 40C durant 5 minutes, un gradient de 4C/min jusqu'au 230C et 10 minutes disotherme 230C. La programmation de temprature pour la seconde colonne (DB-17 2.290m de longueur, 178 m de diamtre intrieur et de 0.30 m dpaisseur) quant elle est de 55C durant 5 minutes avec un gradient de 4C/min jusqu'au 245C et 10 minutes en isotherme 245C.
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II. Rsultats de lextraction et de lanalyse des COVs des feuilles de Tanacetum balsamita par SPME/CPG-2D
Lanalyse par CPG-2D de lextrait SPME des feuilles de la Balsamite conduit plusieurs milliers de composs organiques volatils, environ 4000 dans le cas dune feuille crase et 2000 dans le cas dune feuille entire non crase (voir figure 34 et 35). La coloration rouge dans la figure 33, rvle la concentration de la tanacetone. La CPG2D permet de dtecter les composs qui possdent les mmes temps de rtention en CPG classiques (mmes tempratures dbullition) et qui par la suite seront spars sous une deuxime dimension par ordre de polarit comme cest le cas pour le thymol et de lactate bornyle. Ces deux derniers composs obtenus ltat de trace dans le cas de la sparation sur une CPG, ont t dtects et spars en CPG-2D.
Figure 33: Coupe en 3D du profil chomatographique des effluves mis d'une feuille de Balsamite non crase
Lavantage de la CPG-2D, est davoir une facilit de classification aise par famille chimique, par ions communs mais aussi une diffrenciation en une seule tape de composs, mme ltat de traces, ayant les mmes points dbullition mais des polarits diffrentes.
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Monoterpnes
Sesquiterpnes
Figure 34: profil chromatographique en CPG-2D des effluves mis partir d'une feuille de Balsamite crase
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Figure 35: Profil chromatographique en CPG-2D des effluves mis partir d'une feuille de Balsamite non crase
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(B) Deuxime approche analytique base sur un systme dchantillonnage coupl un systme de sparation/dtection classique I. Description du systme
Dans un premier temps, les essais ont t mis au point sur un systme de simulateur de mastication commercial, (Mouth model equipment) en mode DHM (Dynamic Headspace and Mastication) (Wageningen University and research center, Dept. Agrotechnology and Food Sciences), Le racteur est une cellule en verre double enveloppe permettant une rgulation de la temprature (voir figure 36). La cellule peut tre balaye par un gaz vecteur (N2). Le gaz N2 entre via une connexion GL14 en bas du systme. Les COVs mis durant le froissement des feuilles et lclatement des vsicules sont entrans par le gaz inerte et piges sur le pige tenax. Le mouvement du piston lintrieur du systme, est rotatif et longitudinal, ce mouvement est contrl par une unit dalimentation stabilise variable, compacte tension continue ayant les caractristiques suivantes : Tension de sortie ..0-30 Vdc Courant de sortie...0-2,5A 76,8 rpm max
Afin dtudier l'huile essentielle native (quivalent l'odeur mise par la plante) et pour que le dispositif puisse mimer le froissement des feuilles entre les doigts, la base du piston a t modifie et dentele. Par explosion des vsicules de stockage situes sur la partie abaxiale des feuilles, une valuation rapide du contenu en huile essentielle native avec seulement deux ou trois feuilles peut tre effectue.
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Chapitre III : Mise en place dune mthodologie instrumentalise de caractrisation rapide des huiles essentiells natives
Figure 36: Stimulateur de mastication mode DHM (Wageningen University and Research Centre)
II. Comparaison du profil aromatique de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita et du profil CFD-DHS/GC de la plante
II.1. Matriel et Mthodes II.1.1. Concentration des COV par Headspace dynamique Deux feuilles fraches de Balsamite sont places dans le racteur du DHM thermostat 25C et balay par un courant dazote (100mL/min). Les feuilles sont ensuite froisses pendant 5 minutes au moyen dun piston tte en tflon ayant un dplacement linaire et rotatif. Les COV sont pigs par lintermdiaire dun pige Tenax situ dans la partie suprieure du DHM (figure 36). 3 rplicatas ont t effectus.
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II.1.2. Concentration des COV dune feuille non froisse par Headspace dynamique. Le piston a t enlev du dispositif pour se retrouver en condition dHeadspace dynamique. Des feuilles fraches ont t soigneusement places en vitant tous crasement des tissus. La cellule est balaye par un courant dazote 100mL/min pendant 5 minutes et thermo-state 25C. Ces expriences ont t reproduites trois fois. II.1.3. Isolement de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita 100g de feuilles ont t hydrodistilles pendant 3 heures 100C au moyen dun hydrodistillateur de 6 litres. Une huile essentielle jaune a t obtenue avec un rendement de 0,53%. Ces expriences ont t reproduites trois fois. II.1.4. Analyses chromatographiques des extraits Les piges Tenax ont t analyss au moyen dun CPG-SM-DIF (Perkin Elmer Clarus 500) quip dun thermodsorbeur TurboMatrix TD et dune colonne capillaire en silice fondue DB5 (0,25 mm x 30m, 0,25 m paisseur de film). Le gaz vecteur est de lhlium (1.3 mL/min) et la programmation de temprature: 30C durant 5 minutes, puis 5C/min jusqu'au 200C et 10 minutes 200C. Lidentification des composs est base sur les comparaisons des indices de rtention exprimentaux et bibliographiques et des spectres de masse exprimentaux et contenus dans les bases de donnes NIST 2005 et WILEY. Le gamma-terpinne a t utilis comme un standard interne pour valuer la concentration de composs organiques volatiles en g/Kg de matire sche mis dans le DHM. Les concentrations des COVs ont t estimes par rapport ltalon interne. La courbe dtalonnage a t effectue partir de 5 solutions mthanoliques de gamma-terpinne des concentrations diffrentes (2100, 420, 84, 16,8 et 3,3 g/L). 1 mL de chaque solution prpare a t directement inject par une seringue dans des piges Tenax. Les conditions de thermodsorbtion et de lanalyse chromatographique taient identiques celles appliques dans le cas des chantillons CFD-DHS/GC. II.2. Rsultats de la comparaison entre une hydrodistillation et une huile essentielle native huile essentielle extraite par
La composition de l'huile essentielle de Tanacetum balsamita de couleur jaune obtenue avec un rendement de 0,53 % sur une base de poids sec de matire vgtale. La bta thujone
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(tanacetone), est le compos principal tant dans l'huile essentielle (63,3 %) que dans le profil de COVs mis des feuilles non froisses (82,5 %) et froisses (67,7 %). Le rendement de COVS mis par les feuilles de costmary fraches augmente en suivant l'ordre suivant: DHM/ DHS > > DHS. La consquence du froissement des feuilles par DHM est l'explosion des vsicules de stockage de lhuile essentielle et la libration des composs volatils principaux de la plante dans le systme. La comparaison des profils chromatographiques de feuilles froisses (figure 38) et de feuilles non froisses (figure 39) a montr une augmentation du nombre de composs de notes de tte (4 20) (voir Tableau 19). Les composs volatils majeurs mis pendant le froissement de feuilles par DHM taient le 1,8-cinole (21 %), lalpha-thujone (3,3 %), le bta-terpinne (2,4 %), l'alpha-pinne (0,7 %), le gamma-terpinne (0,5%), le bta-pinne (0,4 %), 3-mthyle hexanal (0,3 %), l'alpha-thujne (0,2 %), et le pmentha-1,4 (8)-dine (0,2 %). Dans le cas de l'huile essentielle, les composs majoritaires taient le 1,8-cinole (27,5 %), lalpha thujone (4,2 %), germacrne-D (0,9 %), bta eudesmol (0,4%), terpinol-4 (0,6 %), l'alpha terpinol (0,2 %), le gamma-terpinne (0,1 %) et le bicyclogermacrne (0,1 %).
bta-thujone
alpha-thujone
1,8 cinole
Germacrne-D
Figure 37: Profil chromatographique de l'huile essentielle de Tanacetum balsamita obtenue par hydrodistillation
Ces rsultats prliminaires ont montr que les profils chromatographiques de lhuile essentielle (figure 37) et des composs volatils mis partir de feuilles froisses (figure 38) en
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utilisant le DHM prsentent des similitudes au niveau des notes de tte et de cur ; par contre, labsence des sesquiterpnes (notes de fond) a t bien marque.
Figure 38: Profil chromatographique des COVs des feuilles froisses de Tanacetum baslamita mis par DHM
Figure 39: Profil chromatographique des COVs des feuilles non froisses de Tanacetum balsamita mis par DHM
La bta thujone et le 1,8-cinole sont les composs majoritaires dans les deux extraits. Les notes de fond sont diffrentes, ceci tant li la technique d'extraction utilise : hydrodistillation ou espace de tte dynamique.
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Tableau 19: Principaux composs organiques volatils identifis partir de l'huile essentielle, des feuilles froisses et des feuilles non froisses de Tanacetum balsamita Pics 1 2 3 4 5 6 7 IR 738 742 791 857 879 926 933 Composs Volatils HE (n=4) % DHSa (n=3) % DHMb (n=4) % DHMc [c] g/kg/5min DHM CVd
3-mthyl-hexanal 0.3 0.5 11 2-mthyl-1-butanol 0.1 0.2 23 1-octne 0.4 0.5 15 3-hexn-1-ol 0.3 0.4 34 1-butanol, actate, 3-mthyl 0.1 0.1 17 alpha-thujne 0.2 0.1 23 alpha-pinne 0.6 0.7 0.9 12 bicyclo[3.1.0]hex-2-ne, 48 944 0.1 0.1 18 mthylne-1-(1-mthylthyle) 9 950 camphne 0.1 0.2 7 10 973 bta-terpinne 1.7 2.4 3.7 26 11 978 bta-pinne 1.5 0.4 0.5 9 12 989 cis-pinne-3-ol 0.1 0.3 25 13 1004 actate-3-hexne-1-ol 0.4 0.3 22 14 1012 ni 0.2 0.6 21 15 1017 ortho-cymne 0.4 0.5 18 16 1023 para-cymne tr 17 1031 1,8-cinole 21.3 4 27.5 12.6 21 18 1057 gamma-terpinne 0.1 0.5 0.6 13 19 1071 ni 0.3 20 1072 ni 0.2 21 1086 p-mentha-1,4(8)-dine 0.2 0.2 19 acide butanoique, 2-mthyl22 1100 0.2 0.3 49 3mthyl butyl ester 23 1107 alpha -thujone 4.9 9 4.2 1.1 3.3 24 1121 bta -thujone 103.8 27 63.3 82.5 67.7 25 1166 4-terpinol 0.6 26 1185 alpha-terpinol 0.2 27 1282 actate de sabinyle tr 28 1476 germacrne-D 0.9 29 1489 bicyclo-germacrne 0.1 30 1650 bta-eudesmol 0.4 ni : non identifi , acomposs volatils mis des feuilles non froisses , bcomposs volatils mis des feuilles froisses par DHM, cconcentrations des COVs mis en g/Kg/5min calcules par rapport ltalon externe (gamma terpinne), dcoefficient de variation %
Cette tude prliminaire a permis de dmontrer que le systme DHM modifi possde de relles potentialits pour une pr-valuation rapide du potentiel aromatique de plantes huiles essentielles.
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III. Conception dune cellule dextraction ddie CFD couple un systme de pigeage Headspace dynamique et semi-statique
Suite aux rsultats positifs obtenus par le systme DHM modifi, deux cellules dextraction CFD ont t spcifiquement conues pour ces analyses. La premire est couple un systme de Headspace semi statique ddi, pour concentrer les effluves mis par le froissement des feuilles sur une fibre SPME, la deuxime est couple un systme de Headspace dynamique. Dans les deux cas, la position des piges ou des fibres SPME est plus proche de la chambre de froissement que dans le systme DHM modifi (voir figure 40). Dans ce travail, nous avons compar le profil chromatographique de lhuile essentielle des feuilles de Th dAubrac (Calamintha grandiflora) obtenue par hydrodistillation non seulement avec celui des effluves de feuilles fraches traites et non traites par CFD, concentres sur pige tenax puis analyses en CPG-SM mais aussi avec celui des effluves de feuilles fraches entires extraites par SPME (PDMS, CAR/PDMS, DVB/CAR/PDMS). Les techniques dadsorption ou dabsorption sont trs utilises pour lanalyse des COVs. Elles permettent lextraction et la concentration des composs volatils sans solvant. Elles sont bases sur la partition des composs organiques entre une phase aqueuse ou gazeuse et un film polymrique de faible paisseur.
Figure 40: schma du CFD, le prlvement des COVs est effectu au niveau de la chambre de froissement (a) par une pige tenax ou (b) par une fibre SPME
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IV. Application du systme CFD lanalyse de la fraction volatile de Calamintha grandiflora

IV.1. Analyses chromatographiques Les piges tenax ont t dsorbs et analyss au moyen dun CPG-SM-FID (Perkin Elmer Clarus 500) quip dun thermodsorbeur TurboMatrix TD et dune colonne capillaire en silice fondue DB5 (0,25 mm x 30m, 0,25 m paisseur de film). Tandis que les fibres SPME ont t analyses au moyen dun Varian CP 3800 CPG-FID, et un Agilent 5973 Network CPG-SM. Le gaz vecteur est de lhlium (1.3 mL/min) et la programmation de temprature: 30C pendant 5 minutes, puis 5C/min jusqu'au 200C et 10 minutes disotherme 200C. Lidentification des composs est base sur les comparaisons des indices de rtention exprimentaux et bibliographiques et des spectres de masse exprimentaux et contenus dans les bases de donnes NIST 2005 et WILEY
IV.2. Optimisation des conditions dextractions par CFD-SPME ou CFD-DHS Trois paramtres ont t optimiss durant ce travail, la nature de la fibre SPME, le nombre de coups de froissement des feuilles ainsi que le temps de pigeage.
IV.2.1. Choix des fibres SPME : cintique dadsorption et dabsorption de la pulegone Pour tester le systme CFD sur la plante modle, Th dAubrac, nous avons utilis 3 types de fibres SPME (Carb, Carb/PDMS et DVB/Carb/PDMS), afin de savoir laquelle est la plus efficace ou la plus adapte aux composs organiques volatils mis lors du froissement des feuilles de la plante.
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8.E+05 7.E+05 6.E+05
PDMS CAR/PDMS DVB/CAR/PDMS
air du pic
5.E+05 4.E+05 3.E+05 2.E+05 1.E+05 0.E+00 0 5 10 15 20
Temps de pigeage (min)
Figure 41: Aire du pic de la pulegone en fonction du temps de pigeage et de la nature de la fibre SPME 20C
Les courbes dabsorption (cas du PDMS) ou dadsorption et dabsorption (CAR/PDMS et DVB/CAR/PDMS) obtenues par les diffrentes fibres en fonction de laire de la pulgone montrent quau bout de 10 minutes les fibres PDMS et DVB/CAR/PDMS atteignent leur seuil de saturation, alors quil faut 15 minutes pour la fibre CAR/PDMS. On saperoit que pour un temps de pigeage de 10 minutes la fibre DVB/CAR/PDMS a une capacit dabsorption plus leve que les deux autres fibres. Daprs la figure 41, on peut remarquer que la fibre SPME possdant trois phases tait la plus efficace vis--vis de la pulgone, mais aussi que le temps optimum de pigeage pour cette fibre est de 10 minutes. Cette fibre sera choisie pour la concentration des COVs mis par le froissement des feuilles.
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IV.2.2. Optimisation du froissement du vgtal Un couple de feuilles de Calamintha grandiflora a t dpos dlicatement dans la cellule, la fibre SPME est mont au dessus de la cellule (en position ferm), aprs froissement par 0, 10 et 15 coups de piston, la fibre SPME est mise en position ouverte pour piger dans la chambre de prlvement pendant 10 minutes temprature ambiante. La fibre DVB/Carb/PDMS est la plus efficace (figure 42).
1.6E+07 1.4E+07 1.2E+07 1.0E+07 8.0E+06 6.0E+06 4.0E+06 2.0E+06 0.0E+00 0 coups Carb/PDMS 10 coups 15 coups
Figure 42: concentration en pulegone en fonction de la nature de fibre utilise et du nombre de coups de piston effectus
DVB/Carb/PDMS PDMS
IV.2.3. Observation microscopique au niveau du limbe des feuilles
Figure 43: Micrographie (x400) dun fragment de limbe de la feuille de Calamintha grandiflora froisse gauche et non froisse droite.
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Daprs les figures 43, on peut remarquer que suite au traitement des feuilles de la Calamintha grandiflora par le CFD, les poils scrteurs ainsi que les vsicules ont t clats, favorisant ainsi la libration des COVs dans la cellule du CFD.
IV.2.4. Comparaison des fractions volatiles extraites par CFD-SPME et CFD-DHS et de lhuile essentielle Quarante COVs ont t identifis dans lhuile essentielle du Th dAubrac. Ils constituent 93 % de la composition chimique totale de cette huile. Les principaux composs de lhuile essentielle du Th dAubrac, obtenue par hydrodistillation des tiges et de feuilles sont prsents dans le Tableau 20. Lisomenthone (34,07%), le noisomenthol (19,83%), la pulgone (19,54%), lisomenthol (7,65%), La menthone (4,40%), le germacrne-D (3,55%), le bicyclogermacrne (1,78%) et le caryophyllne-Z (1,99%) sont les molcules les plus abondantes.
Tableau 20: Comparaison entre la composition chimique de lhuile essentielle extraite par hydrodistillation et celle de lhuile essentielle native extraite par CFD-SPME et CFD-DHS
Pics 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Composs hexanal cis-3-hexnol alpha-thujne alpha-pinne sabinne bta-pinne bta-myrcne 3-octanol limonne bta-trans-ocimne terpinolne linalol para-Menth-8-en-3-ol menthone
IRa 853 870 930 931 970 976 987 995 1027 1032 1068 1100 1148 1155
%b HE 0,03 0,19 0,21 0,09 0,25 0,71 0,08 0,03 0,04 0,24 4,40
%c CFD-SPME 2.53 0.18 1.46 2.38 4.17 2.06 2.07 0.54 0.86 1.37 0.25
%d CFD-DHS 3.32 6.12 4.02 3.56 0.89 1.37 2.57
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15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
isomenthone isomenthol no-isomenthol pulgone pipritone ni actate disomenthyle ni copane bta-bourbonne caryophyllne santalne germacrne-D bicyclogermacrne alpha-Farnesne gamma-cadinne actate disognol oxyde de caryophyllne ni ni alpha-cadinol ni ni ni ni ni ni ni ni ni
1168 1181 1191 1240 1251 1284 1301 1335 1370 1378 1413 1448 1474 1487 1499 1510 1568 1572 1599 1605 1646 1781 1786 1790 1802 1806 1810 1830 1850 1860
34,07 7,65 19,83 19,54 1,28 0,03 0,03 0,14 0,04 0,13 1,99 0,37 3,55 1,78 0,11 0,12 0,93 0,43 0,06 0,28 0,20 0,15 0,07 0,08 0,16 0,05 0,18 0,04 0,14 0,17
25.63 5.75 27.94 20.73 0.38 0.67 0.58 0.32 0.13 -
27.81 5.38 19.58 22.06 1.66 1.33 0.70 -
ni : non identifi, a indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18, b % des composs volatils de lhuile essentielle, c % des COVs mis par le froissement des feuilles et concentrs sur la fibre SPME (DVB/Carb/PDMS), d % des COVs mis par le froissement des feuilles et concentrs sur un pige Tenax
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Parmi les 40 composs organiques volatils identifis dans lhuile essentielle extraite par hydrodistillation, 21 composs ont t identifis dans le cas de CFD-SPME tandis que 15 composs ont t identifis dans le cas de CFD-DHS. On remarque la prsence de composs trs volatils, comme lhexanal, le cis-3-hexnol et lalpha thujene, ces trois derniers composs nont pas t identifis dans lhuile essentielle. Daprs le tableau 20 on peut remarquer labondance des notes de tte ainsi que les composs majoritaires de notes de cur. Labsence des sesquiterpnes (notes de fond) a t bien marque dans le cas des huiles essentielles natives.
Conclusion Partie I
Le "Crushing Finger Device" (CFD) montre de relles potentialits pour une valuation qualitative rapide des huiles essentielles contenues dans les feuilles de plantes aromatiques. La richesse des rsultats obtenus par SPME/CPG-2D permet dtablir un Finger Print complet des COV mis par les feuilles mais lutilisation complexe et coteuse de cette technologie limite son domaine dapplication dans la recherche.
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Chapitre III : Application pr-industrielle laromatisation des huiles vgtales par les plantes aromatiques
Partie II : Approche prindustrielle de laromatisation des huiles vgtales par les plantes aromatiques
Introduction
Laromatisation des huiles peut tre une des voies possibles pour largir le march des huiles vgtales. Pendant le processus daromatisation de lhuile, les volatils des pices incorpors diffusent dans lhuile et lui donnent un got et une odeur (Moldao-Martins et al., 2004). Un faible nombre dtudes scientifiques sont trouves dans la bibliographie traitant laromatisation des huiles vgtales par des plantes aromatiques (Kruma et al., 2006), sous les diffrents tats de la matire vgtale, frache ou sche infuses dans lhuile ou sous forme dhuiles essentielles. Dans ltude ralise dans le chapitre II sur les activits antioxydantes des huiles essentielles o lhuile de tournesol a t utilise comme huile vecteur, nous avons dmontr que les huiles essentielles tudies taient capable de protger lhuile de tournesol contre loxydation par loxygne (Somogyi, 2008). Au-del de cette activit biologique, nous avons voulu tudier limpact sensoriel de lincorporation de ces huiles essentielles ou de la matire vgtale entire sur les huiles vgtales notamment sur lhuile de tournesol. Lobjectif gnral de ces travaux est dlargir le champ dapplication des plantes aromatiques, via leur utilisation comme ingrdient darme dans les huiles vgtales assurant une activit biologique notable associe. Lobjectif spcifique a t de comparer trois diffrentes mthodes daromatisation des huiles vgtales notamment lhuile de tournesol. La premire en infusant la matire vgtale sous sa forme sche, la deuxime en infusant la matire vgtale sous sa forme frache, la troisime en aromatisant lhuile de tournesol directement par ajout de lhuile essentielle. Les feuilles ou les fleurs sches ou les feuilles fraches seront mlanges lhuile de tournesol pour obtenir deux essais dhuiles dites infuses qui seront compares un essai dhuile dite aromatise contenant de lhuile de tournesol et lhuile essentielle obtenue partir de chacune des plantes. Il faut signaler que peu dinformations sur les protocoles des diffrentes mthodes utilises dans lindustrie ont t trouves.
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La comparaison des trois mthodes se fera sur la base des composs volatils de lhuile de tournesol aromatise extraits par micro-extraction en phase solide (SPME) puis analyss en CPG/SM. tant donn que la finalit de ce projet est denvisager la production dune huile infuse ou aromatise un niveau industriel, ces analyses nous permettront dvaluer la mthode la plus avantageuse conomiquement et la plus transfrable lindustrie agroalimentaire.
I. Matriels et mthodes
Loptimisation des mthodes en termes de quantit de matire vgtale infuse et de temps de sonification appliqu, a t tout dabord teste sur le Basilic, puis transfre sur les autres plantes aromatiques slectionnes, Achillea millefolium, Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata et Monarda didyma. I.1. Huile de tournesol Cette huile vgtale, obtenue partir des graines de tournesol, est compose 98% de triesters dacides gras, le reste contenant entre autres des strols et des tocophrols. La composition en acides gras de lhuile de tournesol utilise pour lalimentation humaine est la suivante (en pourcentage massique) : Acide linolique (C18:2 -6 polyinsatur) 70% Acide olique (C18:1 -9 mono insatur) 20% Acide palmitique (C16:0 satur) 6% Acide starique (C18:0 satur) 5% Autres : 2% Lhuile de tournesol est une huile vgtale riche en acide gras essentiel omga-6 mais on note cependant sa pauvret en acide gras essentiel omga-3.
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Tableau 21: Proprits physicochimiques de l'huile de tournesol
Huile de tournesol Gnral N CAS N EINECS Proprits chimiques Indice diode Indice de saponification Matires non saponifiables Proprits physiques Temprature de fusion Proprits optiques Indice de rfraction ND40 1.466 1.468 Hydrogne : 32 35 C 125 144 ; Hydrogne : 70 75 188 194 0.4 1.4 % 8001-21-6 232-273-9
Lhuile de tournesol utilise est une huile commerciale conserve 4C afin dviter lautooxydation et la formation des composs volatils de dgradation.
I.2. Prparation des chantillons feuilles fraches infuses dans lhuile de tournesol : HI.FF Avant de raliser les chantillons qui seront utiliss pour les analyses, un chantillon modle a t prpar avec des feuilles de Basilic afin de trouver le temps optimum dexposition aux ultrasons. La mthode ultrasons favorise et intensifie le procd dclatement des vsicules tout en librant les COVs qui vont diffuser dans lhuile de tournesol et permettre son aromatisation. Aprs exposition aux ultrasons, lensemble est filtr afin denlever les feuilles. Lhuile ainsi aromatise est transfre dans des bouteilles hermtiquement fermes et stockes 4C avant les analyses chromatographiques.
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I.2.1. Optimisation du temps dexposition de lhuile infuse et soumise aux ultrasons Aprs avoir dtach les feuilles fraches de la tige, on les immerge dans un bcher contenant lhuile de tournesol. Lensemble est plac dans une cuve ultrasons de capacit de 3 litres et de frquence de 20 25 Khz, rempli avec un litre deau. (Voir figure 44). Pour dterminer le temps dexposition aux ultrasons le plus adquat, un chantillon 1% de feuilles fraches de basilic et de balsamite a t ralis avec les donnes suivantes : Volume dhuile dans le bcher : 100 mL Masse dhuile dans le bcher : 81,787 g Masse de feuilles fraches thorique : 81,787 * 1/100 = 0,81787 g Masse de feuilles fraches incorpores rellement : 0,835 g
Figure 44 : Cuve ultrasons de capacit 3 Litres
Une fois le bcher plac dans la cuve, il va tre successivement expos aux ultrasons de frquence 20 Khz, pendant 10, 20, 30 et 40 minutes. A chaque fois, une feuille prsente dans lchantillon sera prleve pour tre observe au microscope optique (Nikon Eclipse E600), afin de suivre lvolution de la structure des vsicules au cours du temps.
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Aprs 10 minutes dexposition aux ultrasons, la feuille prsente quelques lsions, reprables par certains endroits noircis. On suppose que les endroits noircis reprsentent le contenu de certaines vsicules qui auraient clat. (Figure 45)
Figure 45: Micrographie d'une feuille de Balsamite aprs son exposition 10 min aux ultrasons (20khz), avec un grossissement x 100
Daprs la figure 46, on peut remarquer que la feuille de Balsamite prsente un nombre plus important de lsions suite son exposition 10 minutes de plus aux ultrasons.
Figure 46: Micrographie d'une feuille de Balsamite aprs son exposition 20 minutes aux ultrasons (20khz), grossissement x 100
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Aprs 30 minutes aux ultrasons, on remarque que la majorit de la feuille est noircie laissant supposer lclatement de nombreuses vsicules. (Figure 47)
Aprs 40 minutes aux ultrasons (figure 48) lobservation microscopique ne montre pas de diffrence significative avec celle ralise aprs 30 minutes dexposition aux ultrasons.
Au vue des rsultats des observations microscopiques, le temps optimal est considr entre 30 et 40 minutes. Les extractions des 5 plantes seront donc exposes 35 minutes aux ultrasons.
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I.2.2. Prparation des infusions de plantes aromatiques fraches dans lhuile de tournesol Des chantillons des huiles infuses prpares partir de la matire vgtale ont t mis en place. Prparation des chantillons partir : Th dAubrac, Balsamite, Myrrhis et Monarde 1 % de feuille fraiches (35 min aux ultrasons) Une infusion 1% a t prpare partir des feuilles de plantes aromatiques dans l'huile de tournesol avec les quantits suivantes : Volume dhuile de tournesol : 1 L Masse dhuile : 906, 7 g Masse de feuille incorpore : 9, 0 g Masse de feuille thorique : 9, 067 g Frquence des ultrasons : 20 Khz Temps de sonification : 35 minutes
Lhuile de tournesol aromatise est filtre et conserve 4C dans des bouteilles hermtiquement fermes pour les analyses chromatographiques ultrieures
I.3. Prparation dinfusions de plantes aromatiques sches dans lhuile de tournesol : HI.FS La meilleure faon de commercialiser lhuile de tournesol aromatise est de faire apparaitre les feuilles immerges dans lhuile, qui vont offrir au fur et mesure leurs armes lhuile de tournesol en donnant un effet esthtique au produit. Pour prparer ces chantillons, les feuilles des 4 plantes aromatiques (Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata et Monarda didyma) et les fleurs dAchillea millefolium ont t pralablement dessches dans un dshydrateur alimentaire (figure 49) pendant environ 3 heures.
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Figure 49 : Dshydrateur alimentaire
Le dshydrateur envoie de lair chaud (environ 65C) partir du centre du plateau le plus bas et se propage sur tous les niveaux desschant ainsi les feuilles. Une petite aration situe au centre du plateau le plus haut permet dviter la condensation. Les feuilles et fleurs une fois sches sont conserves dans des petits bocaux en verre. Plusieurs chantillons dhuile de tournesol ont t prpars diffrentes concentrations en feuilles/fleurs sches (de 0,8 2%) et analyss intervalles de temps rguliers. Les chantillons sont prpars dans des bouteilles en verre de capacit de 100 ou 200 mL.
162
I.4. Prparation des infusions de plantes aromatiques sches et dhuile essentielle HI.HE.FS Les chantillons sont raliss en rajoutant 2% des feuilles sches et 0,1% de lhuile essentielle de chaque plante aromatique dans lhuile de tournesol Volume dhuile : 200 mL Masse dhuile : 174,06 g Masse de feuilles thorique pour 2 % : 174,06 * 2/100 = 3,4812 g Masse de feuilles relle incorpore dans lhuile : 3,48 g Masse dhuile essentielle thorique incorpore : 174,06 * 0,1/100 = 0,17406 g Masse dhuile essentielle incorpore rellement : 0,18 g I.5. Analyses de lespace de tte des huiles infuses I.5.1. Fibre SPME, choix de la fibre et conditionnement Les analyses en espace de tte ont t effectues par lintermdiaire dune fibre SPME trois phases DVB/CAR/PDMS (Divinylbenzne/Carboxen/Polydimthylsiloxane) possdant un revtement de 50/30 m, cette fibre bipolaire extrait les composs volatils et semi-volatils la fois. Le choix de cette fibre a t bas sur les rsultats obtenus dans la premire partie de ce chapitre sur le dveloppement du systme (CFD). Le conditionnement de cette fibre a t effectu via linjecteur de la CPG Varian (CP 3800), dans lequel on expose la fibre pendant 1 heure 250C. I.5.2. Prparation des huiles infuses analyser : extraction des COVs On prlve via une seringue 4 grammes dchantillon dhuile aromatise ou infuse (stock dans des bouteilles capacit 100 ou 200 mL). On dpose lchantillon prlev dans un vial de 5 ml qui sera clos par un septum et mis agiter pendant 5 minutes TC ambiante. On fait passer laiguille de la fibre (en position ferme) travers le septum ; par la suite, on fait descendre le piston (fibre en position ouverte) de faon exposer la fibre lespace de tte. On veillera ce que la fibre se retrouve toujours au mme niveau dans lespace de tte pour toutes les rptitions. Le temps optimum dadsorption est estim 10 minutes (rsultats obtenus dans la premire partie de ce Chapitre). Une fois ladsorption termine, la fibre est rtracte dans laiguille et injecte dans le chromatographe immdiatement. Les analyses ont t effectues en triplicata.
163
I.5.3. Analyse chromatographique des chantillons des huiles infuses ou aromatises Le chromatographe utilis est le CP 3800 Varian quip dune colonne capillaire DB5-MS (30m x 0,25 mm D.I, 0,25 m paisseur de film). Le gaz vecteur est lhlium (1.3 mL/min). Le temps de dsorption de la fibre dans linjecteur est de 3 minutes la temprature de linjecteur (250C). La programmation du four est la suivante : 30C durant 5 minutes, puis 5C/min jusqu'au 200C et 10 minutes 250C. La TC du dtecteur DIF est de 250C.
II. Rsultats et interprtations

II.1. Evolution de la concentration des COVs mis des huiles aromatises ou infuses en fonction du temps Dans le but de suivre lvolution de la concentration en COVs dans lespace de tte de lhuile aromatise, nous avons effectu des analyses de lespace de tte de lhuile aromatise tous les 2 jours. La concentration du compos majoritaire a t suivie dans lhuile aromatise au cours du temps. Les graphiques ci-dessous ont t raliss en se basant sur la moyenne des aires de pics par 3 rptitions dchantillonnage. II.1.1. Evolution de la quantit de tanacetone dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par les feuilles sches de la Balsamite et son HE
aire du pic de la tanacetone
1,6E+05 1,4E+05 1,2E+05 1,0E+05 8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 2,0E+04 0,0E+00 5 7 11 Te mps (jours) 13 21 1,2E+05 9,3E+04 1,0E+05 9,1E+04 9,1E+04
Figure 50: Evolution de la quantit de tanactone prsente dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par 2 % de feuilles sches et aromatise par 0,1% de l'HE de la Balsamite en fonction du temps
164
Daprs la figure 50, on peut remarquer que la concentration de tanacetone en fonction du temps est relativement stable et aprs 3 semaines daromatisation lespace de tte de lhuile de tournesol garde une concentration quasi stable en tanacetone. II.1.2. Evolution de la quantit du camphre (exprime par laire du pic ) dans d'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par les feuilles schs dA. millefolium et son HE
3,0E+03 aire du pic du camphre 2,5E+03 2,0E+03 1,5E+03 1,0E+03 5,0E+02 0,0E+00 1 3 6 Temps (jours) 8 10 1,8E+03 1,9E+03 2,0E+03 2,0E+03 2,3E+03
Figure 51: Evolution de la quantit de camphre dans d'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par 0,1 % d'HE d'Achillea millefolium et par 0,2% des ses feuilles sches en fonction du temps
Daprs la figure 51, on remarque que la concentration en camphre dans lhuile aromatise par lhuile essentielle dAchille reste quasi stable en fonction du temps, ainsi mme aprs 10 jours daromatisation. II.1.3. Evolution, de la quantit de tanacetone dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par les feuilles fraches de Balsamite
aire du pic de la tanacetone
7,0E+02 6,0E+02 5,0E+02 4,0E+02 3,0E+02 2,0E+02 1,0E+02 0,0E+00 4 6 8 12 14 4,8E+02 4,0E+02 5,0E+02 5,0E+02 5,2E+02
Temps (jours)
Figure 52: Evolution de la quantit de tanactone dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par les feuilles fraches de Balsamite en fonction du temps
165
Daprs la figure 52 on remarque que la concentration en tanactone dans lespace de tte varie peu en fonction du temps ; ainsi, lhuile aromatise par les feuilles fraches de la Balsamite nest pas stable. II.1.4. Evolution de la quantit de tanactone dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par les feuilles sches de la Balsamite
2,5E+02 aire du pic de tanactetone 2,0E+02 1,5E+02 1,0E+02 5,0E+01 0,0E+00 5 7 11 Temps (jours) 13 17 8,2E+01 8,0E+01 8,9E+01 1,3E+02 1,8E+02
Figure 53: Evolution de la quantit de tanactone dans l'espace de tte de l'huile de tournesol infuse par 2% des feuilles sches de la Balsamite en fonction du temps
Daprs la figure 53, on remarque que la concentration en tanactone volue en fonction du temps. Aprs environ 3 semaines, la concentration a t double. Cette reprsentation montre la cintique de libration des COVs partir des feuilles sches macres dans lhuile de tournesol.
166
II.2. Rsultats de laromatisation par infusion de matire vgtale et par ajout dHE dans les huiles vgtales Les rsultats des analyses des huiles infuses partir de la matire frache (HI.FF) nont pas t positifs. En utilisant 1 % de matire frache infuse, on observe la prsence des 2 composs majoritaires de lhuile essentielle. Si on augmente le taux de matire frache 2% lhuile de tournesol devient trouble. Les molcules deau prsentes dans les feuilles passent dans lhuile vecteur et crent une mulsion. Lhuile ainsi obtenue nest pas stable. Nous avons alors abandonn cette mthode daromatisation qui conduit une huile aromatise non commercialisable. Dans le cas de lhuile infuse 1% de matire sche, aucun compos aromatique nest dtect dans lhuile. En doublant le taux de matire sche 2%, on observe la prsence dans lhuile de 2 3 composs majoritaires de lhuile essentielle. Une tentative daugmentation du taux dinfusion 3% a t effectue mais dans ce cas la quantit de matire vgtale par rapport la quantit de lhuile est trop importante et lhuile devient de couleur vert. Finalement lhuile a t aromatise par 0,1% dhuile essentielle pour chacune des plantes aromatiques et 2% de matire vgtale sche correspondante. Les rsultats daromatisation de lhuile de tournesol par lhuile essentielle sont prsents dans les tableaux ci-aprs. Pour chacune de ces huiles, les principales notes odorantes des huiles essentielles ont t perues.
167
II.2.1. Huile de tournesol aromatise par lHE dAchillea millefolium 12 COVs ont t identifis dans lespace de tte de lhuile aromatise par lAchille millefeuille dans les conditions SPME choisies. Les composs identifis sont 6 monoterpnes, 4 monoterpnes oxygns, 2 sesquiterpnes et un sesquiterpne lactone. Les composs majoritaires sont le camphre (31,23%), le germacrne D (17,73%), le sabinne (16,51%), lactate de chrysanthnyle (10,25%), le nrolidol (10,20%), la bta-pinne (9,28%), leucalyptol (9,35%) et le 4-terpinol (7,65%) (Voir tableau 22).
Tableau 22: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'huile essentielle d'Achille millefeuille et par ses feuilles sches
Composs hexane2,3-dione 3-hexne-1-ol hexanoate de mthyl alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne alpha-terpinne para-cymne 1,8-cinole gama-terpinne terpinolne linalol nonanal isocyclocitral bta-terpinne ni trans-pinocarvol camphre 3-cyclohexen-1-carboxaldhyde,2,4,6trimthyl bornol
IRa (TIC) 801 848 923 931 947 970 976 1015 1022 1030 1055 1083 1099 1103 1115 1122 1134 1138 1146 1160
IRthb 790 854 927 939 954 975 979 1017 1026 1031 1060 1089 1097 1101 _ _
%c HE HI/FS 0,05 0,22 0,18 1,70 1,60 6,72 3,28 0,70 0,82 4,03 1,71 0,35 1,78 0,61 4,48 0,39 0,28 +
%c HI/HE/FS nd nd nd 3,51 3,48 16,51 9,28 1,87 nd 9,35 3,48 nd 3,69 nd nd nd nd nd
CVd HI/HE/FS
12,89 14,29 8,98 11,36 12,98
14,87 17,36
5,89
1139 1146 _
0,55 12,64 1,76 +
34,23 nd
4,28
1170
1169
2,25
nd
168
4-terpinol menthan-2-one trans-actate de chrysanthnyle actate de bornyle 1,3,8 p-menthatrine actate de linalyle alpha-copane isoledne bta-caryophyllne cis-alpha-bisabolne germacrne-D methyl-isognol gamma-cadinne delta-cadinne alpha-calacorne lemol (E)-nrolidol ni alcool caryophyllenique oxyde de caryophyllne ni viridiflorol cderne-epoxide ni ni bta-eudesmol cedr-8(15)-en-10-ol alcool patchoulique alpha-bisabolol
a
1179 1193 1228 1280 1317 1355 1370 1382 1422 1447 1474 1487 1505 1509 1532 1547 1555 1567 1572 1584 1594 1598 1616 1626 1631 1644 1653 1661 1674
1189 1196 1236 1289 _ _ 1377 _ 1419 _ 1485 1492 1514 1523 1546 1550 1563
4,70 1,46 6,55 1,17 0,31 0,31 0,52 0,12 1,42 0,54 11,73 0,98 0,35 1,22 0,35 1,57 7,23 0,84 +
7,65 nd 10,25 nd nd nd nd nd nd nd 17,73 nd nd nd nd nd 10,20 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
16,58
22,69
10,69
14,72
1572 1583
1,97 1,88 1,21
1596 1623
1,41 0,46 1,14 0,54
1651 1652 1658 1686
1,09 0,19 0,79 1,49
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18,, bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, NIST,
Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature, cpourcentage moyen sur 3 rplicats, dcoefficient de variation (%), + prsence du compos organique volatil ltat de trace, nd : non dtcte
169
II.2.2. Huile de tournesol aromatise par lHE de Calamintha grandiflora 8 COVs ont t identifis dans lespace de tte de lhuile de tournesol dans les conditions SPME choisies dont 3 monoterpnes et 5 monoterpnes oxygns : lisomenthone (38,97%), le no-isomenthol (21,61%), la pulegone (17,87%), lisomenthol (9.14%), la menthone (6,28%), le limonne (2,86%), le 3-octanol (1,69%) et la bta-pinne (1,58%). On remarque la prsence majorotaire de la famille de menthone. Labsence des sesquiterpnes dans lespace de tte est due aux conditions dextraction. On retrouve le germacrne en tat de trace (voir Tableau 23)
Tableau 23: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'HE de Calamintha grandiflora et par ses feuilles sches IRa (TIC) 931 970 976 987 995 1027 1032 1068 1100 1148 1155 1168 1181 1191 1240 1251 1284 1301 1335 1305 %c HI/HE/FS nd nd 1,58 nd 1,69 2,86 nd nd nd nd 6,28 + 38,97 9,14 + + 21,61 17,87 tr nd nd nd 12,65 7,65 6,28 5,99 14,61 18,36 13,68 14,69 CVd HI/HE/FS
Composs alpha-pinne sabinne bta-pinne bta-myrcne 3-octanol limonne bta-trans-ocimne terpinolne bta-linalol para-Menth-8-en-3-ol menthone isomenthone isomenthol no-isomenthol pulgone pipritone ni actate disomenthyle ni
IRthb 939 975 979 991 991 1029 1037 1089 1091 1150 1153 1162 1183 1187 1237 1253
%c HE 0,03 0,19 0,21 0,09 0,25 0,71 0,08 0,03 0,04 0,24 4,40 34,07 7,65 19,83 19,54 1,28 0,03 0,03 0,14
HI/FS
170
copane bta-bourbonne caryophyllne santalne germacrne-D bicyclogermacrne alpha-farnesne gamma-cadinne actate disognol oxyde de caryophyllne ni ni alpha-cadinol ni ni ni ni ni ni ni ni ni
a
1370 1378 1413 1448 1474 1487 1499 1510 1568 1572 1599 1605 1646 1781 1786 1790 1802 1806 1810 1830 1850 1860
1377 1388 1409 1447 1485 1500 1506 1514 1568 1583
0,04 0,13 1,99 0,37 3,55 1,78 0,11 0,12 0,93 0,43 0,06 0,28
nd nd nd nd tr nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
1654
0,20 0,15 0,07 0,08 0,16 0,05 0,18 0,04 0,14 0,17
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18, indices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard,
France et de la littrature
c
pourcentage moyen sur 3 rplicats coefficient de variation (%)
+ : prsence du compos organique volatil ltat de trace nd : non dtcte
171
II.2.3. Huile de tournesol aromatise par lHE de Tanacetum balsamita 7 COVs ont t identifis dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par lhuile essentielle de Balsamite et de ses feuilles sches dans les conditions SPME choisies. 3 monoterpnes, 3 monoterpnes oxygns et 1 sesquiterpne ont t identifis dont la tanacetone (76,31%), leucalyptol (7,68%), la bta thujone (5,12%), la bta-terpinne (4,88%), le gamma-terpinne (3,14%), le germacrne-D (1,51%) et le sabinne (1,36%) (Tableau 24).
Tableau 24: Identification des COVs dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par lHE de Tanacetum balsamita et par ses feuilles sches IRa (TIC) 933 973 979 987 991 1010 %c CVd
Composs alpha-pinne sabinne bta-pinne mentha-2,8-dine myrcne isoamyl butylate alpha-terpinne para-cymne 1,8-cinole gamma-terpinne bta-terpinne alpha-terpinolne 2-mthyl-butyrate disoamyl cis-thujone trans-thujone isothujanol-3 para menth-3-en-8-ol ni ni
bicyclo[4,1,0] heptan-3-one,7,7 dimthyl-4 mthylne
IRthb %c HE 939 975 979 984 991 _ 0,05 0,19 0,04 0,05 0,09 0,06 0,14 0,26 3,97 0,53 1,55 0,09 0,07 3,33
HI/FS HI/HE/FS HI/HE/FS nd 1,36 nd nd nd nd nd nd + 7,68 3,14 4,88 nd nd 5,12 + 76,31 nd nd nd nd nd 4,32 3,87 11,58 10,28 11,69 9,68
1017 1017 1025 1026 1033 1031 1058 1060 1072 1072 1086 1089 1099 1100 1109 1102
1128 1144 83,57 1140 1138 1144 1150 1148 1151 1157 _ _ _ 0,23 0,39 0,05 0,05 0,03
172
pinocarvone actate de santolinyle pinocarveol ocimne carvotanacetone 4-carne bicyclo[3,1,0] hex-2-ene,4-methylne-1-(1-
1165 1165 1172 1175 1183 1184 1198 1186 1251 1260 1288 _ _ _ _
0,28 0,16 1,48 0,16 0,15 0,14 0,11 0,04 0,18 0,03 0,14 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,07 1,50 0,19 0,02 0,05 0,03 0,38 0,03 0,03
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 1,51 nd nd nd nd nd nd nd 22,87
mthylthyl) 3-carne,10-actylmthyl actate de dihydrocarvol ni ni ni ni alpha-bourbonne isobutanoate de phenylthyl caryophyllne gamma-gurjunne germacrne-D bicyclogermacrne delta-cadinne ni ni dihydro eudesmol Pirtrinal ni
a
1296
1303 1307 1323 1329 1336 1352 _ _ _ _
1385 1388 1395 1394 1421 1419 1474 1477 1482 1485 1496 1500 1518 1523 1560 1578 _ _
1656 1663 1733 1788 _ _
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18, indices de rtention thoriques (IRth) des librairies Adams, NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard,
France et de la littrature
c
pourcentage moyen sur 3 rplicats coefficient de variation (%)
+ : prsence du compos organique volatil ltat de trace, nd : non dtct
173
II.2.4. Huile de tournesol aromatise par lHE de Myrrhis odorata 5 COVs ont t identifis dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par lhuile essentielle de Myrrhis dans les conditions SPME choisies. 1 monoterpne, 2 monoterpnes oxygns et 2 sesquiterpnes dont lanthole (61,18%), le germacrne-D (13,10%), le limonne (10,29%), lestragole (8,56%) et le bta-caryophyllne (6,87%) (Voir tableau 25).
Tableau 25: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'HE de Myrrhis odorata et ses feuilles sches.
Composs alpha-pinne sabinne bta-pinne bta-myrcne limonne bta-cis-ocimne gamma-terpinne terpinolne estragole cis-3 hexenyl isovalerate ni trans-anthole ni ni ni bta-caryophyllne bta-farnesne germacrne-D ni bicyclogermacrne alpha-farnesne ni ni
a
IRa (TIC) 934 973 979 987 1030 1047 1059 1088 1199 1229 1253 1290 1376 1388 1404 1420 1457 1482 1489 1496 1504 1518 1562
IRthb 939 975 979 991 1029 1050 1060 1089 1196 -
%c HE 0,03 0,02 0,02 0,63 4,42 0,32 0,24 0,04 3,04 0,01 0,06
HI/FS
%c HI/HE/FS nd nd nd nd 10,29 nd nd nd 8,56 nd nd 61,18 nd nd nd 6,87 nd 13,10 nd tr nd nd nd
CVd HI/HE/FS
16,58
7,69
1285 1419 1457 1485 1500 1506 -
75,12 0,05 0,10 0,17 2,71 0,22 6,19 0,01 3,18 0,48 0,10 2,74
3,12
8,66
5,41
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18,, bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies
Adams, NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature, cpourcentage moyen sur 3
174
rplicats, dcoefficient de variation (%), + prsence du compos organique volatil ltat de trace, nd : non dtcte
II.2.5. Huile de tournesol aromatise par lHE de Monarda didyma La moiti des COVs identifis prsents dans lhuile essentielle de Monarda didyma ont t retrouvs dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par lhuile essentielle de Monarda et ses feuilles sches. 6 monoterpnes, 5 monoterpnes oxygns, et 2 sesquiterpnes ont t identifis dont thymol (34,79%), eucalyptol (14,31%), D-limonne (8,71%), sabinne (8,65%), O-mthyle-thymol (7,39%), germacrne-D (6,28%), gammaterpinol (5,63%), camphne (3,67%), caryophyllne (2.57%), alpha-pinne (2,36%), linalool (2,12%), alpha thujne (1,89%) et bta-pinne(1,63%) (Voir tableau 26).
Tableau 26: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'huile essentielle de Monarda didyma et par ses feuilles sches
Composs
IRa (TIC)
IRthb
%c HE HI/FS
%c HI/HE/FS 1,89 2,36 3,67 8,65 1,63 nd nd nd nd + + 8,71 14,31 nd
CVd HI/HE/FS 9,31 9,72 8,25 7,16 8.01
alpha-thujne alpha-pinne camphne sabinne bta-pinne bta-myrcne alpha-phellandrne alpha-terpinne para-cymne limonne 1,8-cinole gamma-terpinne
925 933 951 973 979 987 1008 1017 1025 1030 1033 1058
930 939 954 975 979 991 1003 1017 1026 1029 1031 1060
0,35 0,88 1,39 5,53 1,05 1,10 0,10 1,04 2,78 3,46 9,68 2,68
4,87 6,32
175
hydrate de sabinne alpha-terpinne linalol chrysantnone bornol alpha-terpinol gamma-terpinol thymol-mthyl ether thymol bta-cubebne ni caryophyllne germacrne-D alpha-farnesne delta-cadinne
a
1072 1086 1100 1120 1174 1182 1197 1238 1290 1376 1389 1421 1482 1507 1518
1073 1089 1102 1128 1180 1189 1199 1235 1290 1388 _ 1419 1485 1506 1523
0,55 1,02 1,83 0,44 1,13 0,47 8,52 3,20 47,06 0,09 0,14 0,89 4,04 0,54 0,04 +
nd
nd 2,12 nd nd nd 5,63 7,39 34,79 nd nd 2.57 6,28 nd nd 9,28 19,61 8,22 5,39 3,25 7,36
indice de rtention calcul partir des n-alcanes C5-C18,, bindices de rtention thoriques (IRth) des librairies
Adams, NIST, Agilent France, Wiley, Hewlett Packard, France et de la littrature, cpourcentage moyen sur 3 rplicats, dcoefficient de variation (%), + prsence du compos organique volatil ltat de trace, nd : non dtcte
176
Conclusion Partie II
Parmi les trois mthodes values une seule est retenir. Il sagit de celle combinant lhuile essentielle aux feuilles sches car elle offre le plus dintrt pour la production industrielle et la commercialisation. En effet, quelques gouttes dhuile essentielle (0,1%) suffisent pour retrouver en quantit importante les composs majoritaires de lhuile essentielle dans lhuile vecteur et daromatiser le produit. Quelques feuilles sches sont ncessaires pour appuyer le ct naturel de lhuile aromatise. Concernant les autres mthodes, celle utilisant les ultrasons aurait pu tre intressante car elle ncessite encore moins de matire premire que celle retenue mais elle nest pas gnralisable et applicable toutes les plantes. Effectivement il se peut quune mulsion se cre et rende lchantillon inexploitable au niveau industriel. La concentration des COVs mis en fonction du temps tait trs variable. Les feuilles sches quant elles ne sont pas exploitables lorsquelles sont introduites seules dans lchantillon car elles naromatisent pas suffisamment le produit. Quant lhuile essentielle incorpore seule dans lhuile de tournesol, elle aromatise trs bien le produit mais le fait que lhuile soit aussi limpide que lhuile de tournesol vierge pourrait poser problme quant lacceptabilit du produit par le consommateur.
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Conclusion gnrale
Conclusion gnrale
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Conclusion gnrale
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Conclusion gnrale Les objectifs scientifiques de ces travaux ont t dans un premier temps dappliquer le concept dagro-raffinage aux plantes aromatiques mdivales du patrimoine vgtal de Midi-Pyrnes, afin de valoriser de manire squence les diffrents mtabolites secondaires. Nous avons pour cela slectionn cinq plantes aromatiques mdivales : Achillea millefolium, Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata et Monarda didyma. Lanalyse chimique et sensorielle de la fraction volatile de ces plantes a t effectue. Les activits biologiques des extraits volatils et non volatils des plantes ont t values. Dans un second temps, confronts au problme de raret du vgtal tudi, nous avons dvelopp une mthodologie instrumentalise permettant dvaluer le potentiel aromatique des plantes partir dune seule feuille. Enfin nous avons essay dlargir le champ dapplication des plantes aromatiques, par leur utilisation en tant quingrdients darme dans les huiles vgtales assurant une activit biologique notable associe.
Lhuile essentielle dAchillea millefolium obtenue par hydrodistillation de la partie arienne frache est compose de 50 constituants dont 45 ont t identifis constituant 96% de la quantit totale de lhuile. Le bta-pinne (3,3%), le sabinne (6,7%), et leucalyptol (4%) assurent une note de tte menthole boise. Le camphre (12,6%), le trans-actate de chrysantnyle (6,6%), le 4-terpinol (5%) et lisocyclocitral (4.5%) assurent une note de cur camphre boise. Le germacrne-D (11,73%) et le (E)-nrolidol (7,2%) quant eux assurent une note de fond florale. Lhuile essentielle de lespce franaise de Calamintha grandiflora, obtenue partir de lhydrodistillation des tiges et de feuilles a t caractrise pour la premire fois. 29 composs organiques volatils ont t identifis et constituent 93 % de la composition chimique totale de lhuile essentielle. Le sabinne (0,19%) et le bta-pinne (0,21%) assurent une note de tte boise citronne, lisomenthone (34,07%), le noisomenthol (19,83%), la pulegone (19,54%), lisomenthol (7,65%), et la menthone (4,40%) assurent une note de cur menthole pice. Le germacrne-D (3,55%) amne une note de fond florale. Lhuile essentielle des deux origines de Tanacetum balsamita (sauvage et cultive sous serre) a t analyse. 34 composs ont t dtects dont 27 ont t identifis dans lhuile essentielle de lespce sauvage, correspondant 96% de la composition totale de lextrait. Les composs majoritaires de lextrait sauvage sont la carvone (56,72%), la tanacetone (9,08%), le germacrne-D (2,43%), le limonne (2,51%), et le bta-bisabolne (2,46%).
181
Conclusion gnrale 45 composs organiques volatils ont t dtects dont 38 sont identifis dans lhuile essentielle de lespce cultive sous serre correspondant 96% de la composition totale de lextrait. Le 1,8 cinole (3,97%) et lalpha-thujone (3,3%) assurent une note de tte
menthole citronne, la tanacetone ou bta-thujone (83,57%) fournit une note de cur menthole herbace, le germacrne-D (1,50%) et le bicyclogermacrne (0,19%) amnent une note de fond th sec (doux, infusion). Nous pouvons conclure que lespce sauvage franaise et spcifiquement celles rcoltes dans la rgion de Midi-Pyrnes se diffre de lespace cultive sous serre o la prdominance de Tanacetone et labsence de carvone dans les huile essentielles des parties ariennes de cette dernire suggre quil pourrait sagir dun cinquime chimiotype : le type tanactone induit par les conditions de culture sous serre. Lhuile essentielle de Myrrhis odorata est compose de 20 composs organiques volatils qui constituent 96% de la composition totale de lextrait. Les composs majoritaires, le sabinne (0,63%), limonne (4,42%) apportent une note de tte fraches herbace, lanthole (75,12%), le germacrne-D (6,19%), le bicyclogermacrne (3,18%), lestragole (3,04%) et le caryophyllne (2,71%) assurent une note de cur anise boise, deux derniers composs non identifis assurent une note de fond boise. Nous avons identifi 26 composs organiques volatils dans lhuile essentielle obtenue partir des tiges et les feuilles de Monarda didyma. Leucalyptol (9,68%), le limonne (3,46%) et le gamma-terpinne (2,68%) assurent une note de tte citronne menthole, le thymol (47,06%) apporte une note de cur thymol, le germacrne (4,04%) et le caryophyllne (0,89%) donnent une note de fond boise.
Lactivit antioxydante des huiles essentielles des plantes aromatiques oublies ainsi que de leurs rsidus dhydrodistillation a t value et compare en utilisant les mthodes suivantes : la mthode Oxipress, la mthode dvaluation des dines et trines conjugus et la mthode de dtermination de loxydation du radical 2,2-diphnyl-1-picrylhydrazyl. On a pu calculer le facteur de protection de chaque huile essentielle, ainsi on a pu conclure que lefficacit des huiles essentielles diminue dans lordre suivant : M. didyma > A. millefolium
> C.
grandiflora >M. odorata >T. balsamita pour des concentrations de 0,05%, 0,1% et
0,2%. On a remarqu que lactivit antioxydante des 5 huiles essentielles dpendait de leur concentration.
182
Conclusion gnrale Daprs cette tude nous avons pu dmontrer que laromatisation de lhuile de tournesol par ces huiles essentielles contribue prolonger la rsistance de lhuile vgtale contre loxydation par loxygne. Ceci a t valid en mesurant la priode dinduction de chaque huile essentielle. On peut conclure que lajout par exemple de 0,2% de lhuile essentielle de lAchille millefeuille permet de prserver lhuile de tournesol et de retarder son oxydation de deux heures 110C et sous 5 bars. Cela correspond une augmentation de la rsistance de lhuile de tournesol de 71%. Nous avons compar lactivit antioxydante des extraits de rsidus dhydrodistillation des 5 plantes via la mthode DPPH. Cette comparaison a t faite sur la base de la concentration minimale inhibitrice calcule pour chaque rsidu. Nous avons remarqu que lactivit antioxydante du rsidu dAchillea millefolium a t la plus efficace parmi les autres. Lordre defficacit est le suivant Achillea millefolium > M. didyma > T. balsamita > C. grandiflora > M. odorata. Les extraits mthanoliques ont t lgrement plus efficaces que les extraits thanoliques et actoniques. L'activit antimicrobienne des solutions mthanoliques d'huile essentielle a t value in vitro contre neuf espces bactriennes pathognes. Les bactries Gram positif ont t plus sensibles que celles Gram ngatif, particulirement Bacillus cereus, qui sest montr tre lespce la plus sensible vis--vis de lHE de M. didyma. Cette dernire, a montr une efficacit leve contre toutes les cultures microbiennes pour une concentration de 1%. Les solutions dHEs 0,5% de T. balsamita et M. odorata possdent les activits antimicrobiennes les plus faibles contre la majorit des bactries en comparaison avec les autres huiles appliques la mme concentration. Elles montrent une activit antibactrienne seulement contre Bacillus cereus et Bacillus subtilus. Lhuile essentielle de C. grandiflora a t la plus efficace contre Bacillus subtilus, cette huile sest montre plus active que lantibiotique utilis. L'effet inhibiteur de lHE de M. didyma (1%) contre Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium et Staphylococcus epidermidis tait aussi bas que l'effet de l'antibiotique de rfrence; cependant, dans le cas de Bacillus subtilus, l'effet de lHE de M. didyma tait quivalent celui de lantibiotique. Lactivit antimicrobienne de lhuile essentielle dA. millefolium a t plus efficace contre Staphylococcus aureus et Bacillus cereus. Par contre, lhuile essentielle de lA. millefolium nest pas active vis--vis dEscherichia coli.
183
Conclusion gnrale
Nous avons russi mettre en place un systme instrumental d'valuation rapide du potentiel aromatique de plantes huiles essentielles bas sur l'analyse des effluves. Un appareillage novateur dnomm "Crushing Finger Device" (CFD) bas sur le concept de "Scratch'n Sniff" a t mis au point afin de mimer instrumentalement le froissement de la feuille entre les doigts suivi du pigeage des composs volatils odorants mis. Ce systme a montr de relles potentialits pour une valuation qualitative rapide des huiles essentielles contenues dans les feuilles de plantes aromatiques. Grce ce systme la composition des notes de tte et de cur de lhuile essentielle native peut tre rapidement value. La richesse des rsultats obtenus par SPME/CPG-2D ainsi que lutilisation complexe et coteuse de cette technologie limite son domaine dapplication la recherche. Finalement, pour un objectif dapplication pr-industrielle, nous avons compar trois diffrentes mthodes daromatisation des huiles vgtales, La premire en infusant la matire vgtale sous sa forme sche, la deuxime en infusant la matire vgtale sous sa forme frache, et la troisime en aromatisant lhuile de tournesol directement par ajout de lhuile essentielle. Les rsultats des analyses des huiles infuses partir de la matire frache ne sont pas concluants. En utilisant 1 % de matire frache pour raliser linfusion, seulement un ou deux composs majoritaires de lhuile essentielle sont retrouvs dans lespace de tte de lhuile vgtale. Le passage 2% limite lutilisation de cette mthode cause de la formation dmulsions dues au passage de leau de la plante vers lhuile vgtale. Les feuilles sches ne sont pas exploitables quand elles sont introduites seules dans lchantillon car elles naromatisent pas suffisamment le produit. Dans le cas des huiles aromatises par les huiles essentielles, environ 50% des composs de lhuile essentielle sont retrouvs dans lespace de tte de lhuile de tournesol. Des tudes complmentaires pourront tre envisages dans plusieurs domaines. La composition chimique des rsidus dhydrodistillation devrait tre caractrise pour connatre les composs responsables de lactivit antioxydante des cinq plantes. Les concentrations inhibitrices minimales des cinq huiles essentielles pourront tre calcules pour mieux comparer nos rsultats avec les travaux de la littrature. Lactivit antioxydante individuelle de chaque compos devrait tre value par une mthode de couplage type on-line CLHP-DPPH-SM, pour savoir sil existe ou non une synergie entre ces composs pour donner la fin une activit antioxydante globale.
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Conclusion gnrale
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Conclusion gnrale
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Partie Exprimentale
Partie Exprimentale
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Partie Exprimentale
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Partie Exprimentale
I. Techniques dextraction des huiles essentielles

Malgr les progrs considrables raliss ces dernires annes dans le domaine de la chimie analytique, la caractrisation des huiles essentielles ou des COVs demeure un challenge. Lanalyse des COVs mis par une plante se droule en trois tapes : extraction des composs aromatiques, analyse de lextrait et traitement des rsultats pour identifier et/ou quantifier les COVs. Les composs organiques volatils sont gnralement prsents dans les matrices vgtales de trs faibles concentrations [de lordre du ppm (mg/Kg) ou du ppb (g/Kg)] et sont de polarits, solubilits, volatilits et stabilits trs variables. Les molcules odorantes sont constitues dun squelette hydrocarbon qui peut tre linaire, cyclique ou aromatique. Presque toutes les fonctions chimiques portes par ces chanes sont reprsentes : alcools, composs carbonyls (principalement les aldhydes), esters, thers, phnols et enfin drivs soufrs et htrocycles. I.1. Diffrentes techniques dextraction des huiles essentielles La matire vgtale est disperse dans de leau et place dans un ballon chauff directement (hydrodistillation) ou indirectement (distillation la vapeur) par de la vapeur deau. Les composs volatils et semi volatils sont entrans par la vapeur deau, qui est ensuite condense. On rcupre un surnageant nomm huile essentielle (HE), compose de molcules peu solubles dans leau. Dune faon gnrale, la distillation est un procd de sparation bas sur la diffrence de composition entre un liquide et la vapeur engendre (Garnero, 1996). La technique implique la condensation de la vapeur et la rcupration des fractions liquides rsultantes. On parle de distillation simple ou fractionne. Nous avons utilis deux techniques diffrentes dextraction : lentranement la vapeur et lhydrodistillation. I.1.1. Entranement la vapeur Le procd correspondant une distillation htrogne, met en jeu lapplication de deux lois physiques : La loi de Dalton: dans laquelle la pression du mlange de vapeurs est gale la somme des tensions de vapeur de divers constituants. PT = TH + TE
189
Partie Exprimentale La loi de Raoult: le rapport des quantits des entits distilles simultanment est fonction de la tension et des densits des vapeurs (donc des masses molculaires) la temprature de distillation choisie.
MoleH TH = MoleE TE
La relation de ces deux lois donne respectivement la pression totale et la composition des vapeurs en fonction des pressions partielles, do le calcul du taux de corps entran appel galement rapport dentranement :
R=
TH M 0 H PH = TE M 0 E PE
H et E dsignent respectivement lhuile essentielle et leau PT T
= Pression totale = Tension de vapeur
M 0 = Masse molaire
P = Poids
R = Rapport dentranement
La temprature dbullition dun mlange est atteinte lorsque la somme des tensions de vapeurs de chacun des constituants est gale la pression dvaporation. Elle est donc infrieure chacun des points dbullition des substances pures. Ainsi le mlange eau/huile essentielle distille possde une temprature infrieure 100C pression atmosphrique (gnralement proche de 100C en raison de la faible tension des constituants odorants) alors que les tempratures dbullition des composs aromatiques sont pour la plupart trs leves. La figure 54 montre lvolution de la temprature de codistillation dun mlange htrogne deau et dhuile essentielle.
190
Partie Exprimentale
Figure 54: Evolution des tempratures de distillation de leau et lhuile essentielle, et du mlange eau/huile essentielle en fonction de la pression du milieu
Pendant lentranement la vapeur, les liquides non miscibles semblent distiller simultanment comme sil sagissait de deux compartiments spars (figure 55), bien quen pratique, ils soient mls. Or leurs vapeurs constituent un gaz homogne. On parle alors de co-distillation. Dans les deux cas, reprsents dans la figure 1, si la pression partielle de leau est gale celle de lhuile ( P 0 E = P 0 H ), nous avons respectivement :
I Phase liquide : mole deau = mole dhuile Phase vapeur : mole deau = mole dhuile
II mole deau >mole dhuile mole deau = mole dhuile
La pression totale ( PT ) est indpendante des quantits deau et dhuile :

PT = P 0 E + P 0 H
O P 0 dsigne la pression partielle.
II
Figure 55: Rpartition de leau (E) et de lhuile essentielle (H) entre les phases liquide et vapeur en fonction de la pression lors de lhydrodistillation
191
Partie Exprimentale I.1.2. Hydrodistillation Lhydrodistillation consiste immerger la matire premire dans un bain deau. Lensemble est port bullition et lopration est gnralement conduite pression atmosphrique. La distillation peut seffectuer avec ou sans recyclage communment appel cohobage ;
.
Figure 56: Montage de lhydrodistillation (type clevenger)
Le montage de type Clevenger rprsent dans la figure 56 est compos de quatre parties principales : Le racteur, un ballon dans lequel on introduit la matire vgtale et leau La colonne, un cylindre en verre plac au-dessus du racteur qui recueille la phase vapeur Le rfrigrant dans lequel se recondensent les vapeurs Le vase florentin dans lequel vont dcanter les phases organique (huile essentielle) et aqueuse (eau aromatique). Calcul de la teneur en matire sche et du rendement en huile essentielle La teneur en eau et en matires volatiles (ou humidit) relative, est dtermine selon la norme franaise NF V 03-909. Elle correspond la perte de masse subie par lchantillon aprs chauffage dans une tuve 103 2 C jusqu poids constant. La teneur en eau et en matires volatiles est exprime en pourcentage massique :
% Eau =
m1 m2 * 100 = ( H ) m1 m0
192
Partie Exprimentale
O : m0 est la tare de la coupelle en g m1 est la masse de la coupelle et de la prise dessai avant chauffage en g m2 est la masse de la coupelle et du rsidu aprs chauffage jusqu poids constant en g
Exprime aussi en pourcentage en masse, la teneur en matire sche de lchantillon, se dduit de la valeur de H :
% Matire Sche = 100 H =
m 2 m0 *100 m1 m0
Trois mesures ont t effectues sur le mme chantillon. Ensuite le rendement de chaque hydrodistillation est calcul, en effectuant un rapport entre la masse de lhuile essentielle obtenue et la masse de la matire vgtale sche utilise.
193
Partie Exprimentale I.1.3. Hydrodistillation dAchillea millefolium

Une fois que la matire vgtale est rcolte, la partie arienne de la plante est rcupre et nettoye de la terre et des autres herbes contaminantes. Trie et nettoye, la matire vgtale est introduite dans un ballon de 5 litres aprs avoir t coupe en petits morceaux. Lextraction a t rpte 6 fois. La quantit deau et la masse de matire vgtale ont t identiques. Pour chaque extraction 500 g de la partie arienne ont t mixs avec 4 litres deau distille, puis hydrodistills pendant 3 heures. (Figure 57)
Figure 57: Hydrodistillation de l'Achille millefeuille
A la fin de lhydrodistillation lhuile essentielle de couleur jaune tendance verte est rcupre laide dune pipette pasteur, et mise dans un petit flacon bouchon en tflon tar afin de calculer le rendement.
I.1.4. Hydrodistillation de Calamintha grandiflora

Les sommits fleuries ont t enleves et 300 g de la partie arienne (tiges et feuilles) ont t coups en petits morceaux et introduits dans le ballon de 5 litres contenant 3 litres deau distille. Lensemble est distill pendant 3 heures, afin de rcuprer lhuile essentielle dans un flacon tar pour une analyse chromatographique ultrieure. Les conditions dextraction par hydrodistillation du Th dAubrac ont t rptes 3 fois.
194
Partie Exprimentale I.1.5. Hydrodistillation de Tanacetum balsamita

400 g de la partie arienne (tiges et feuilles) ont t coups en petits morceaux et introduits dans le ballon de 5 litres et mixs avec 3,5 litres deau distille. Lensemble est hydrodistill pendant 3 heures, afin de rcuprer lhuile essentielle dans un petit flacon tar stocke 4C pour une analyse chromatographique ultrieure. hydrodistillation de la Balsamite ont t rptes 3 fois. Les conditions dextraction par
I.1.6. Hydrodistillation de Myrrhis odorata

500 g de la partie arienne (tiges et feuilles) ont t coups en petits morceaux et introduites dans le ballon de 5 litres contenant 4 litres deau distille. Lensemble est distill pendant 3 heures, afin de rcuprer la fin lhuile essentielle stock 4C dans un flacon tar pour une analyse chromatographique ultrieure. Les conditions dextraction par hydrodistillation de Myrrhis odorata ont t rptes 3 fois.
I.1.7. Hydrodistillation de Monarda didyma

Les sommits fleuries ont t enleves et 480 g de la partie arienne (tiges et feuilles) ont t coups en petits morceaux et introduits dans un ballon de 5 litres contenant 4 litres deau distille. Lensemble est distill pendant 3 heures, un liquide jauntre (huile essentielle) est rcupr et mis dans un flacon tar et stock 4C pour une analyse chromatographique ultrieure. Les conditions dextraction par hydrodistillation de Monarda didyma ont t rptes 3 fois.
I.2. Extraction des composs organiques volatils (COVs) I.2.1. Microextraction en phase solide (SPME)
La micro-extraction en phase solide est une mthode complmentaire dextraction par la caractrisation des COVs. Elle prsente lavantage de regrouper toutes les tapes de la prparation dun chantillon (extraction, concentration et transfert au chromatographe) en un seul procd. En particulier, elle peut se rvler une meilleure mthode pour les analyses qui requirent des extractions longues et coteuses et ncessitent une grande consommation de solvants. La SPME utilise une fibre de silice (1 2 cm de long) recouverte dun film polymrique qui permet dadsorber ou dabsorber les composs organiques dun chantillon (Burgot et al., 2003). De nombreuses fibres polaires, apolaires ou mixtes sont actuellement disponibles (tableau 27). La fibre peut se rtracter lintrieur dune aiguille, qui est place dans un
195
Partie Exprimentale
support pour lchantillonnage et la dsorption. Lchantillon est plac dans un flacon serti par un septum en tflon. Laiguille perce le septum pour permettre lintroduction de la fibre dans lespace de tte de lchantillon ou son immersion dans un chantillon liquide. Une fois lextraction termine, la fibre est retire et dsorbe directement dans linjecteur dun CPG. La fibre est ensuite reconditionne par chauffage dans linjecteur pendant 5 15 min ou dans un module de conditionnement pour les chantillonneurs automatiques.
Tableau 27: Fibres disponibles pour lanalyse des COVs
TC maximale Nature de la phase stationnaire Polydimthylsiloxane (PDMS), 100 et 30m Polarit Apolaire dutilisation 280 Composs extraits Composs volatils Composs semiPolydimthylsiloxane (PDMS), 100 et 30m Polydimthylsiloxane/divinylbenzne (PDMS/DVB) 30/50 m Bipolaire 270 Apolaire 340 volatils et apolaires Composs volatils polaires Composs semiPolyacrylate (PA) 85 m Polaire 320 volatils polaires Composs gazeux et Carboxen/divinylbenzne (CAR/PDMS) 85m Carbowax/divinylbenzne (CW/DVB) 65 et 70 m Divinylbenzne/Carboxen/polydimthylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 50/30m Bipolaire 270 Bipolaire Polaire 320 260 trs volatils Composs polaires Composs volatils et semi-volatils
196
Partie Exprimentale
I.2.2. Choix de la fibre SPME

En effet, il est ncessaire de dterminer la fibre la plus efficace, les temps et les tempratures dincubation et dchantillonnage, pour chaque chantillon.
PDMS
8,E+05 7,E+05 6,E+05 5,E+05 4,E+05 3,E+05 2,E+05 1 ,E+05 0,E+00 0 5 1 0 1 5 20
CAR/PDMS DVB/CAR/PDMS
aire du pic
Temps de pigeage (min)
Figure 58: Aire du pic de la pulgone en fonction du temps de pigeage et de la nature de la fibre SPME 20 C
En
effet, la quantit du compos cible adsorbe dpend fortement des conditions dextraction : temprature, temps dincubation et dextraction, agitation, volume de lchantillon et de la phase gazeuse. Elle dpend galement de la nature, de lusure de la phase dextraction (perte de sa capacit dadsorption ou de sorption au cours du temps) et de la nature des autres constituants caractrisant le mlange Diffrents types de fibres SPME (PDMS, Carb/PDMS et DVB/Carb/PDMS) ont t testEs, afin doptimiser les conditions dextraction des composs organiques volatils mis par lcrasement des feuilles de Calamintha grandiflora dans le systme CFD.
II. Analyses chimiques et sensorielles des huiles essentielles et des COVs

Une fois lextrait le plus reprsentatif obtenu, lanalyse permet didentifier et de quantifier les produits qui le composent.
II.1. Analyse par chromatographie phase gazeuse

La sparation et lidentification des constituants volatils dun extrait prsentent bien moins dalternatives que sa prparation. En effet, la CPG est la mthode de rfrence pour lanalyse des huiles essentielles et des COVs (Lehotay et al., 2002) ; elle permet lanalyse de mlanges, qui peuvent tre trs complexes, de nature et de volatilit trs varies (Arpino et al., 1995). La
197
Partie Exprimentale
diversit des mthodes dinjection, de dtection et le grand choix de colonnes permettent des analyses de plus en plus efficaces. Comme toutes les mthodes chromatographiques, la CPG repose sur le principe de migration diffrentielle des constituants dun mlange travers une phase stationnaire. La CPG est base sur la partition des composs injects entre une phase stationnaire (liquide ou solide) et une phase mobile gazeuse. Durant leur passage travers la colonne, les composs analyss se rpartissent entre la phase mobile et la phase gazeuse suivant les rgles physico-chimiques de partition (gaz-liquide) ou dadsorption (gaz-solide). Chaque constituant du mlange analys parcourt la colonne chromatographique et en sort des temps diffrents (temps de rtention) sur la base de ses proprits physico-chimiques propres, de la nature de la phase stationnaire, de la longueur, du diamtre interne de la colonne, mais aussi de la programmation de temprature du four et du dbit du gaz vecteur. Le calcul dindice de rtention permet de saffranchir de la variabilit des temps de rtention avec les conditions opratoires (Castello, 1999). Pour un compos donn, il ne dpend que de la phase stationnaire et non des conditions chromatographiques, ce qui a permis la publication de banques de donnes dindices de rtention relatifs diffrentes phases
stationnaires(Kovats, 1958; Jennings, 1980; Davies, 1990; Adams, 2001). Le calcul sappuie sur le principe suivant : lorsquon injecte un mlange de composs appartenant une srie homologue de n-alcanes ou desters mthyliques linaires, les temps de rtention croissent linairement avec le nombre datomes de carbone (n) (alcanes ou esters) correspondants. Initialement dvelopp par Kovats en mode isotherme(Kovats, 1958), le calcul des indices de rtention a volu pour tenir compte de la programmation de temprature. Ainsi, lquation linaire dveloppe par Vandendool et Kratz(Vandendool et al., 1962) est utilise pour calculer les indices de rtention pour chaque compos analyss en programmation de temprature. La formule est base sur les temps de rtention de deux alcanes ( n et n + 1 atome de carbone) qui encadrent le compos inconnu (X) sur le chromatogramme :
IRX = 100n + 100[(tR(X) tR(n)) / (tR(n+1) tR(n))]
II.1.1. Dtecteurs
Le dtecteur FID sest impos comme un dtecteur universel de choix en CPG. En effet, il possde de nombreux avantages. Il est trs sensible presque tous les composs organiques, sa rponse est linaire en concentration et il montre une bonne stabilit de la ligne de base, son temps de rponse est rapide et il est simple dusage et dentretien.
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Partie Exprimentale II.2. Les mthodes couples II.2.1. Chromatographie en phase gazeuse / spectromtrie de masse
La simplicit du couplage entre ces deux techniques, les progrs accomplis dans le traitement en temps rel du signal, la constitution de banques de donnes de spectres de masse et le dveloppement des algorithmes de comparaison entre le spectre dun compos inconnu avec ceux rpertoris dans la banque sont lorigine de la gnralisation de lusage de la CPG/SM dans les laboratoires danalyse des composs aromatiques. La CPG sur colonne capillaire constitue une excellente mthode dintroduction de lchantillon dans le spectromtre de masse. Ainsi, la colonne capillaire est directement couple la source dions permettant lionisation en impact lectronique. Le couplage CPG/SM impose peu de contraintes techniques. Seul lhlium peut tre utilis comme gaz vecteur car les ions He+ forms lors de lionisation lectronique ninterfrent pas avec ceux de lanalyte en raison de leur faible rapport m/z. Tous les types dinjecteurs sont utilisables et les appareils actuels utilisent exclusivement des colonnes capillaires. la sortie du chromatographe, la colonne capillaire entre dans le spectromtre de masse, via une ligne de transfert qui est simplement un cylindre chauff une temprature suprieure la temprature finale programme pour lanalyse chromatographique. Le couplage avec un analyseur quadripolaire ncessite un vide de 104 105 mbar. Ce vide est ncessaire llimination des molcules rsiduelles comme lazote, leau, et les composs lus qui nauraient pas t ioniss et qui peuvent alors polluer le spectromtre de masse et gner lanalyse.
II.2.2. Protocoles des analyses quantitatives et qualitatives des huiles essentielles

Les huiles essentielles ont t analyses au moyen dun CPG-DIF-SM (Perkin Elmer Clarus MS 500) quip dune colonne capillaire DB5-MS (30m x 0,25 mm D.I, 0,25 m paisseur de film). La Quantit injecte est : 1L HE 10%v/v (Hexane). Le dbit dhlium dans la colonne tait de 1,3 mL/min. La Programmation en temprature du four : 30C durant 5 minutes, puis 5C/min jusqu' 250C et 10 minutes 250C. La temprature de linjecteur est de 250C et celle du dtecteur DIF est de 250C. On a appliqu un split de 50 : 1. Les spectres de masse sont enregistrs en mode dimpact lectronique avec une nergie dionisation de 70 eV. Lidentification des composs est base sur les comparaisons des indices de rtention exprimentaux (IR) et bibliographiques (Kondjoyan et al., 1996; Adams, 2001) et des
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spectres de masse exprimentaux et contenus dans les bases de donnes NIST 2005 et WILEY (275L).
II.2.3. Chromatographie en phase gazeuse / olfactomtrie (CPG/O)

Les huiles essentielles obtenues renferment trs souvent des centaines de composs volatils. Le couplage CPG/O combine la sparation des composs volatils par CPG avec lvaluation olfactive. En sortie de colonne, une partie des composs lus est envoye vers un cne de dtection nasale qui permet lvaluation olfactive en mme temps que lenregistrement du chromatogramme. Tous les types de dtecteurs peuvent tre utiliss en parallle au port dolfaction, mais ce sont les dtecteurs FID ou de masse qui sont les plus frquemment utiliss. Afin davoir un langage commun, il est prfrable dutiliser un vocabulaire normalis pour dcrire les odeurs. Le Champs des odeurs introduit par J. N. Jaubert (Jaubert et al., 1987; Jaubert et al., 1987) trouve son intrt dans la formation des oprateurs et est bien adapt aux tudes CPG/O. Les huiles essentielles obtenues ont t injectes (0.05l) sur un CPG-SM (Agilent 5973 Network) quip dune colonne DB5 (0.25mm x 30m, 0.25m), pour laquelle la programmation de temprature est la suivante : 30C durant 5 minutes, un gradient de 5C/min jusqu'au 250C et 10 minutes disotherme 250C. Les analyses ont t ralises en triplicata, par lintermdiaire de deux exprimentateurs (J): n = 2J x 1,5 rptitions ou n= 2J x 2 rptitions selon les cas.
II.3. Etablissement des pyramides olfactives

Elle consiste reprer les diffrentes notes dominantes dans lhuile essentielle comme on le ferait pour un parfum. On suit lvolution de lodeur des huiles essentielles sur une mouillette afin de dterminer les notes de tte, notes de cur et notes de fond. Une dilution de 1/10 dans lthanol anhydre pour chaque huile essentielle a t effectue. On trempe des mouillettes dans chaque solution dhuile essentielle dilue, et on suit lvolution des notes en fonction du temps. Lodeur volue dans le temps et ne laisse pas les mmes traces partir du moment o on commence sentir les mouillettes et quelques heures aprs. Suivant leur composition, certains effluves sont plus tenaces et dautres moins, les plus rsistants persistent et les plus phmres svaporent et disparaissent. Les diffrents lments constitutifs dune huile essentielle sont regroups dans les trois familles de notes olfactives.
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Dure approximative de persistance des notes - Notes de tte : de 0 2h00 - Notes de cur : de 2h00 4h00 - Notes de fond : de 4h00 jusqu' 24h00
Notes de Tte :
Cest la note que lon distingue en premier. Les lments constitutifs sont plutt phmres et lgers. Lodeur persistera jusqu' environ 2 heures. Ce sont les odeurs les plus perceptibles mais les plus volatiles. Elles sont gnralement fraches et vives et donnent la premire impression olfactive dune composition aromatique.
Notes de Cur :
Quand la note de tte commence sattnuer, la note de cur prend sa place. Elle peut durer entre 2 h et 4h. La note de cur est moins intense mais tient plus longtemps. Cest cette note qui constitue le cur du parfum, comme son nom lindique et qui donne le thme principal du mlange aromatique.
Notes de Fond :
Cest la note qui fait durer la composition aromatique dans le temps, qui laisse des souvenirs de celle-ci. Les notes de Tte et de Cur sappuient sur cette note de Fond qui peut durer jusqu' 24 h, voir plusieurs jours. Les ingrdients de cette note sont trs tenaces.
III. Extraction des antioxydants partir des rsidus dhydrodistillation

III.1. Principe dextraction par soxhlet
Un extracteur Soxhlet est une pice de verrerie utilise en chimie analytique et en chimie organique qui permet de faire lextraction continue par solvant dun solide (figure 59). Il se compose dun corps en verre (4) dans lequel est plac une cartouche en papier filtre pais (5), dun tube siphon (6/7) et dun tube dadduction (3). Le corps de lextracteur est plac sur un ballon (2) contenant le solvant dextraction. Les lextracteur surmont dun rfrigrant (9). Quand le ballon est chauff, les vapeurs de solvants passent par le tube adducteur, se condensent dans le rfrigrant et retombent dans le corps de ladducteur, faisant ainsi macrer les rsidus dans le solvant. Le solvant condens saccumule dans lextracteur jusqu atteindre le sommet du tube siphon, qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagn des substances extraites. Le solvant contenu dans le ballon senrichit progressivement en composs solubles. La taille du corps en verre tant limite, il peut tre ncessaire de raliser rsidus extraire sont placs dans
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plusieurs extractions successives pour rcuprer une quantit suffisante dextraits. Lextraction chaud peut dgrader certaines substances chimiques.
Figure 59: Soxhlet
III.2. Extraction des antioxydants

Suite lhydrodistillation des plantes, les rsidus dhydrodistillation sont rcuprs du ballon filtr afin denlever leau, et schs pendant 4 heures dans une tuve 80C. Environ 30 g de rsidus dhydrodistillation schs de chaque plante sont introduits dans le corps en verre, o du coton a t introduit en bas du corps afin dviter le passage de la matire vgtale dans le ballon contenant 100 mL du solvant organique. Le systme est chauff reflux pendant 6 heures, jusqu la dcoloration de la matire vgtale. Pour chaque plante, trois diffrents solvants ont t utiliss pour lextraction (mthanol, thanol et actone), les extractions ont t faites en triplicata.
IV. Evaluation de lactivit antioxydante des rsidus dhydrodistillation par la mthode de DPPH
IV.1. Prparation des chantillons doser
Suite lextraction soxhlet des rsidus dhydrodistillation, le solvant organique de couleur vert fonc enrichi en antioxydants est rcupr, et concentr par vaporation sous vide pendant une demi-heure. Un liquide visqueux est obtenu puis concentr nouveau pendant
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une heure sous azote liquide jusqu' vaporation totale du solvant. Un extrait visqueux de couleur verte trs fonce est alors obtenu. 20 mg de cette matire visqueuse sont dissouts dans 500L de solvant organique (mthanol, thanol ou actone, suivant le solvant avec lequel lextraction a t faite), lensemble est mis dans un vials puis soumis aux ultrasons pendant 15 minutes afin de favoriser la dissolution totale de la matire visqueuse. On prpare 6 chantillons de concentrations dcroissantes partir de la solution mre obtenue aprs dissolution complte de lextrait. La couleur des solutions prpares diminue progressivement jusqu' obtention dune solution transparente.
IV.2. Dosage spectrophptomtrique par la mthode du DPPH des solutions issues des rsidus dhydrodistillation
La mthode de DPPH, consiste utiliser un radical stable, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) dans du mthanol (la plupart des cas). La rduction du DPPH est contrle en mesurant labsorbance de la solution une longueur donde caractristique (515 nm). A cette longueur donde le radical absorbe, mais aprs sa rduction par lantioxydant (AH) ou un autre radical, labsorption diminue(Dvaranauskaite et al., 2008). On prpare une solution pour laquelle on dissout 1,2 mg dans 50 mL de mthanol, par suite labsorbance de la solution de couleur rouge violette est de 0,8 = 515 nm. Les dosages sont effectus dans des microcuvettes en quartz (OS), o on mlange 2 ml de la solution de DPPH avec 50L de la solution doser. Labsorbance est ensuite mesure aprs 30 minutes. Les mesures ont t faites en triplicata.
IV.2.1. Calcul du pourcentage dinhibition (%I) et de la concentration inhibitrice minimale (IC50)

I est calcul suivant la formule suivante : % I = ABS30 ABS0 ABS30 O : ABS30 : absorbance t=30 min ABS0 : absorbance t= 0 min La concentration inhibitrice minimale (IC50) est estime par extrapolation I=50% en traant la courbe % I = f ([concentration]), (voir figure 60).
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Variation du pourcentage d'inhibition (%I) en fonction de la concentration y = 17,209x

60 50 40 %I 30 20 10 0 0 1 2 3 concentration (mg/mL)
Figure 60: estimation de lIC50
R = 0,9878
V. Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles

V.1. Evaluation de lactivit antioxydante des huiles essentielles par la mthode Oxipress
La mthode Oxipress est trs avantageuse car elle ne ncessite pas de phase de prtraitement dchantillon. La capacit de lantioxydant protger laliment ou la matire lipidique est mesure. Les rsultats sont reproductibles et facilement interprtables et comparables grce des paramtres physiques calculs via cette mthode. Lhuile de tournesol a t utilise comme vecteur, ou comme matrice lipidique. Des modles dhuiles infuses ont t prpars, dans lesquels lhuile essentielle est mlange en proportions massiques diffrentes (0,05, 0,1 et 0,2%) avec de lhuile de tournesol en appliquant 5 minutes dultrasons. Lappareil Oxipress (Mikrolab Aarhus) est quip de deux cellules de mesure en acier (figure 61). Lchantillon (huile infuse) est dos 0,001g prs directement dans un tube racteur en pyrex. Ce dernier est plac dans une cellule en acier, dans laquelle, on applique un lavage loxygne, deux trois fois, avant de serrer la cellule et dappliquer une pression en O2 constante de 5 bars. Ensuite lensemble, cellule et racteur est plac dans un thermostat spcifique rgl 110C o le changement de la pression en fonction du temps est enregistr.
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Robinet doxygne Thermostat
Cellule en Acier
Figure 61: systme Oxipress
La priode dinduction est calcule en fonction du temps ncessaire pour que la pression commence chuter brusquement. Elle est mesure via le point de rencontre des deux tangentes de la premire et la deuxime partie de la courbe sur la figure 62. Pour l'analyse des huiles comestibles, les conditions optimums sont les suivants : 5,0g dchantillon, soumis une pression de 0,5 MPa et une temprature de 110C. Les analyses ont t excutes en triplicata. L'cart-type dans tous les cas tait compris contre 0,1 et 1 % en moyenne. Un blanc (huile de tournesol) a t prpar, dans une cellule adjacente dans les mmes conditions, sans ajouter dadditif. Les changements de la priode d'induction (PI) en fonction de chaque huile essentielle aux 3 concentrations diffrentes ont t dtermins. Le facteur de protection (PF) (Bandoniene et al., 2000) de lhuile de tournesol ainsi que les activits antioxydantes (AA) des huiles essentielles ont t calculs par lintermdiaire des formules suivantes : PF = PIX/PIK; AA = PIX- PIK /PIBHT- PIK ; O: PIX: priode dinduction de lchantillon en prsence de ladditif (huile essentielle), h; PIK: priode dinduction de lchantillon en absence de ladditif, h; PIBHT: priode dinduction de lchantillon en prsence du BHT, h ;
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Evolution de la pression d'oxygne dans le racteur d'oxipress

6.8 6.6 6.4 6.2 6 5.8 5.6 5.4 5.2 5 0 1 2 3 4 5 6 7 huile de tournesol huile infus
pression (bar)
temps (h)
Figure 62: Cintique de l'oxydation de l'huile de tournesol en prsence ou pas d'un additif, 110C et 5bars
V.2. Evaluation de lactivit antioxydante de lhuile essentielle par des mthodes spectroscopiques (dines et trines conjugus)
Des modles dhuiles infuses ont t prpars, en mlangeant les huiles essentielles dans de lhuile de tournesol des concentrations massiques diffrentes (0,05 et 0,1%) en appliquant 5 minutes dultrasons pour chaque cas. Les huiles infuses sont places dans des cuves hermtiquement fermes, quon introduit dans une tuve 80C, pour un dosage spectromtrique ultrieur. A chaque mesure, on prlve 0,05 g de chaque huile infuse, cette dernire sera dilue et mlange avec lhexane dans une fiole jauge de 25 mL. Les solutions prpares sont mesures dans des micro-cuvettes de quartz laide dun spectrophotomtre (Varian Cary 219), en utilisant lhexane comme blanc. Labsorbance est mesure une longeur donde de 232 nm (dines conjugus) et 268 nm (trines conjugus). Labsorbance (E) est calcule pour 1% de solution suivant la formule suivante (Miliauskas, 2006): E1% = A x C-1 x d-1 O : A : absorbance mesure C : concentration de lchantillon g/100mL d : diamtre de la microcuvette, 1cm
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VI. Evaluation de lactivit antimicrobienne

VI.1. Evaluation de lactivit bactricide par la mthode de diffusion sur Agar
Neuf bactries ont t utilises pour valuer lactivit antimicrobienne via la mthode dAgar(Sipailiene et al., 2006). Des bactries Gram positif, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, et Gram ngatif pathognes, Salmonella typhymurium, Salmonella typhymurium D338, Salmonella enteritidis, Salmonella agona et Escherichia coli. Les bactries ont t ensemences dans de lAgar (CM 325 Oxiod) et laisses pendant 24 heures 37C. Aprs culture, un inoculum des cellules bactriennes est introduit dans un bouillon nutritif et mix via un minishaker MS 1 (Wilmington, USA). Les suspensions cellulaires ont t ajustes suivant la norme McFarland N 0.5 Standard. Les suspensions bactriennes dissoutes dans 2 mL de liquide nutritif sont mlanges avec lAgar. 10 ml de la solution dAgar sont dposs dans des boites de ptri (90 mm). Une fois lAgar glifi, des puits de 8 mm sont cres dans lesquels 10L de solution mthanolique dhuile essentielle deux diffrentes concentrations massiques (0,5 et 1%) sont introduites via des micropipettes jauges. Certains puits ont t remplis par du mthanol afin de connatre leffet du solvant. Aprs une incubation dune nuit 37C, les diamtres dinhibition sont mesurs par lintermdiaire dun pied coulisse 0,1 mm prs. Les essais ont t effectus en triplicata pour chaque huile essentielle et pour chaque espce bactrienne.Lantibiotique (ceftazidine/clavulanic acid, 30/10g (BBL, CAZ/CLA, 231753) a t utilis comme rfrence. Un disque dantibiotique a t dpos sur chaque boite de ptrie.
VI.2. Evaluation de lactivit antimicrobienne par la mthode de micro dilution

Deux bactries Gram positif, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et une Gram ngatif, Salmonella typhymurium ont t utilises dans cette mthode. L'activit antimicrobienne a t dtermine par des essais de micro-titrage sur des plaques de microtitration (Holo et al., 1991). Chaque puits de plaque de microtitration (Sarstedt, Nmbrecht, Allemagne) contient 50 L dune solution thanolique dhuile essentielle et 150L des solutions dilues de bactries cultives pendant 12 heures. Les plaques ont t incubes 37C pour 24 heures. La croissance microbienne a t dtermine par absorbance 620 nm en utilisant un lecteur de microplaque (Multiskan Ascent, Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK). La concentration minimale inhibitrice (CMI) reprsente la concentration de lhuile essentielle ncessaire pour inhiber 50% de la croissance des bactries
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Liste des Tableaux
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Tableau 1: Liste I des plantes aromatiques mdivales slectionnes, (*) : plantes correspondent la deuxime srie de slection................................................................................................................... 13 Tableau 2: Liste des 5 plantes aromatiques selectionnes..................................................................... 21 Tableau 3: Les avantages et les limites de quelques mthodes destimation de la stabilit des lipides et d'valuation de l'activit antioxydante................................................................................................... 65 Tableau 4: Rsultats des analyses par CPG-DIF-SM de lhuile essentielle dAchillea millefolium issues de lhydrodistillation des parties ariennes ........................................................................................... 78 Tableau 5: Variation des pourcentages des composs majoritaires des huiles essentielles de lAchille millefeuille provenant de diffrentes rgions du monde ...................................................................... 81 Tableau 6: Composition chimique de l'huile essentielle de Calamintha grandiflora ........................... 83 Tableau 7: Comparaison des composs majoritaires des extraits des feuilles de C. grandiflora France vs Turquie, Grce et C. Nepeta.............................................................................................................. 85 Tableau 8: Composition chimique de l'HE de Tanacetum balsamita sauvage rcolte Toulouse pendant la priode de floraison ............................................................................................................. 88 Tableau 9: Composition chimique de l'huile essentielle de la partie arienne de Tanacetum balsamita cultive sous serre ................................................................................................................................. 89 Tableau 10: Comparaison entre les principaux composs majoritaires de lhuile essentielle de Tanacetum balsamita de diffrentes origines : France vs Iran, Italie, Lituanie et Turquie ................... 91 Tableau 11: Composition chimique de l'huile essentielle obtenue partir de la partie arienne de Myrrhis odorata .................................................................................................................................... 93 Tableau 12: Comparaison entre les principaux composs majoritaires de l'HE de Myrrhis odorata de diffrentes origines : France vs Serbie, Finlande, Russie et Amrique du Nord................................... 95 Tableau 13: Composition chimique (%) de lhuile essentielle de Monarda didyma ............................ 96 Tableau 14 : Comparaison entre les principaux composs majoritaires de l'HE de M. didyma provenant de diffrents pays .................................................................................................................................. 98 Tableau 15: Activit antioxydante (AA) des huiles essentielles compare l'efficacit du BHT ...... 110 Tableau 16: Activit antioxydante des extraits de rsidus d'hydrodistillation .................................... 124 Tableau 17: Activit antibactrienne des huiles essentielles mesure diffrentes concentrations et exprime en diamtre d'inhibition ....................................................................................................... 128 Tableau 18: Concentration inhibitrice minimale (CMI) des huiles essentielles.................................. 130 Tableau 19: Principaux composs organiques volatils identifis partir de l'huile essentielle, des feuilles froisses et des feuilles non froisses de Tanacetum balsamita ............................................. 147 Tableau 20: Comparaison entre la composition chimique de lhuile essentielle extraite par hydrodistillation et celle de lhuile essentielle native extraite par CFD-SPME et CFD-DHS ............ 152 Tableau 21: Proprits physicochimiques de l'huile de tournesol....................................................... 157 Tableau 22: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'huile essentielle d'Achille millefeuille et par ses feuilles sches................................................................ 168 Tableau 23: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'HE de Calamintha grandiflora et par ses feuilles sches .......................................................................... 170 Tableau 24: Identification des COVs dans lespace de tte de lhuile de tournesol aromatise par lHE de Tanacetum balsamita et par ses feuilles sches.............................................................................. 172 Tableau 25: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'HE de Myrrhis odorata et ses feuilles sches............................................................................................ 174 Tableau 26: Identification des COVs dans l'espace de tte de l'huile de tournesol aromatise par l'huile essentielle de Monarda didyma et par ses feuilles sches ................................................................... 175 Tableau 27: Fibres disponibles pour lanalyse des COVs................................................................... 196
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Publications et participation des congrs

Publications EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, P.R. Venskutonis, Talou Thierry (2009), Screening of antioxidant and antimicrobial activities of Midi-Pyrnes Medieval Aromatic Plants Chemine Technologija, 3 (52), pp: 69-73 Communications par affiche avec actes publis et comit de lecture EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, Talou Thierry (2010), Native vs extracted essential oil: from chemical composition to biological activities, 12th International ACS Flavour Conference, 2529 Mai 2009, Skiathos (Grce) Royal Society of Chemistry, 326, Recent Advances in Food and Flavor Chemistry. Ed. C-T Ho, C.J. Mussinan, F. Shahidi and E.Tratras Contis, pp: 369-378 EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, P.R. Venskutonis, Talou Thierry (2010), Design of an Artificial Crushing Finger Device for Rapid Evaluation of Essential Oils from Aromatic plants leaves, 12th International Weurman Flavour Research Symposium, 1-4 Juillet 2008, Interlaken (Suisse) Expression of Multidisciplinary Flavour Science. Ed. Imre Blank, Matthias Wst, Chahan Yeretzian, pp: 525-528 Communications orales avec actes sur rsum EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, Talou Thierry Evaluation des activits anti-oxydante et antibactrienne dhuiles essentielles de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes , Journe Jeunes Chercheurs- Socit Franaise de Chimie, 29 Avril 2009, Toulouse (France) EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, Talou Thierry screening of antioxidant and antibacterial activities of Midi-Pyrenees medieval aromatic plants , 4th Baltic Conference of Food Science and Technology, 12-13 Mai 2009, Kaunas (Lituanie) Communications par affiche avec actes sur rsum EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, Talou Thierry, MPAROM Trek: Collect and Analysis of Midi-pyrnes Medieval Aromatic Plants 38th International Symposium on Essential Oils (ISEO), 9-12 Septembre 2007, Graz (Autriche). EL Kalamouni Chaker, Raynaud Christine, Talou Thierry, Evaluation du potentiel aromatique des plantes huiles essentielles 27mes Journes Internationales Huiles Essentielles de Digne, 26-27 juin 2008, Dignes les bains (France), obtention du prix du Meilleur Poster. EL Kalamouni Chaker, Dobravalskyte Diana, Berdague Jean-Louis, Tournayre Pascal, Raynaud Christine, Talou Thierry, CFD-DHS/GC vs SPME/GC-2D: 2 approches pour une valuation rapide des plantes huiles essentielles Journes Armes, 2-3 Avril 2009, INRA de Dijon, (France)
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ISSN 1392 1231. CHEMIN TECHNOLOGIJA. 2009. Nr. 3 (52)
Screening of antioxidant and antimicrobial activities of Midi-Pyrenes aromatic plants

C. El Kalamouni, C. Raynaud, T. Talou
SENSORIC Agro-industrial Chemistry Laboratory UMR 1010 INRA/INPT, Universit de Toulouse INP Toulouse, ENSIACET, 118 Route de Narbonne 31077, Toulouse, France
P. R. Venskutonis
Department of Food Technology, Kaunas University of Technology, Radviln pl. 19, LT-50254 Kaunas, Lithuania E-mail: rimas.venskutonis@ktu.lt Received 17 July 2009; Accepted 2 September 2009
The antioxidant activity of essential oils from aerial parts of four plants, namely Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata and Monarda didyma, from the Midi-Pyrenes region of France were determined by the Oxipress method, and the antimicrobial activity of each oil was evaluated against nine bacteria species. All tested essential oils were able to retard the oxidation of sunflower oil, and their antioxidant capacity decreased in the following order: M. didyma > C. grandiflora > M. odorata > T. balsamita. The antioxidant activity of the essential oils was dose-dependent and in case of the highest dose (0.2%) of M. didyma, C. grandiflora and M. odorata it exceeded the antioxidant capacity of the synthetic compound BHT added at a concentration of 0.02%. Antimicrobial activity tests showed that Gram-positive bacteria to be more sensitive the Gram-negative, especially Bacillus cereus which was the most sensitive species for M. didyma essential oil at a concentration of 1%. M. didyma oil possessed an inhibitory effect against all test cultures. Most likely the high percentage of the strong antimicrobial agent thymol in M. didyma oil was the main factor for its pronounced antimicrobial activity.
Introduction
Aromatic, medicinal and spicy plants are an immense and sustainable source of natural compounds with various beneficial properties. Therefore, such materials have been used since ancient ages for various applications, particularly healing of diseases, flavouring of foods and formulation of fragrances. Some of these plants nowadays are grown commercially and serve for the production of a variety of ingredients. However, some of medicinal and aromatic herbs for some reasons have not found wider application and sometimes are referred to as forgotten plants. Taking into account the increasing demand for natural ingredients that might be used as food additives, components of functional foods and nutraceuticals as well as for other applications, it is reasonable to revise the forgotten plants by assessing their applicability and benefits using modern scientific analysis methods. The Midi-Pyrenes region of southwest France has a rich and so for poorly valorized wild vegetal heritage, including a remarkable diversity of aromatic and medicinal plants. Recently, the MIPAROM Trek initiative has been conducted to collect and analyse various regional and forgotten aromatic plants, including such species as Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata, Calamintha grandiflora and Monarda didyma. The first phase in the assessment of these plants includes analysis of their essential oils, antioxidative properties and antimicrobial activity. The essential oil composition and properties of plants grown in various regions of the world and selected for this investigation have been studied previously. For
instance, it was reported that essential oil of T. balsamita grown in Iran contained carvone and -thujone as the main constituents; the results of the antimicrobial activity of the essential oil according to the disc diffusion method and minimal inhibition concentration (MIC) values indicated that the oil exhibited moderate to high antimicrobial activity against eight Gram-positive and Gramnegative bacteria (Bacillus subtilis, B. pumulis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae) and three fungi (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger) [1]. In anoher study, essential oil of T. balsamita subsp. Balsamita from Turkey contained trans-chrysanthenol, chrysanthenyl acetate, linalool oxide, camphor and 1,8-cineole as the major components. The antimicrobial activities of the oil and two antibiotics against Gram-positive and Gram-negative bacteria and two yeasts were investigated in vitro, and the results showed the oils to possess moderate activities against all test microorganisms [2]. This example clearly shows that a remarkable diversity in the chemical composition may be characteristic of the same plant species, particularly of those grown in different parts of the world. The chemical composition and antimicrobial activities of essential oil isolated from M. odorata were investigated against seven bacterial and six fungal species. Activity against bacteria and C. albicans were investigated by the bioautographic test on TLC plates, while all the other fungi were tested by the microdilution test. M. odorata oil showed the lowest effect as compared with commercial products [3]. The composition of C.
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grandiflora essential oil had been previously studied [4, 5], however, no reports were found in the available literature sources on the antimicrobial and antioxidant properties of this species. Oxidative and microbial deterioration are the main processes damaging huge amounts of foods. Lipid-containing foods can be stored for a limited time period because of their insufficient resistance to oxidation. Moreover, in dry foods, which are more stable from the microbiological point of view, oxygen can easily enter the lipid phase, and the stability of such foods in many cases is substantially lower than in the presence of water. Therefore, the stability of dry foods should be carefully tested and, if necessary, the lipid fraction should be protected by adding antioxidants. During storage of oils, fats and other fat-containing foods, lipid oxidation is still a major cause of food quality deterioration in spite of a wide use of several antioxidants. The most widely used synthetic antioxidants butylhydroxyanisole (BHA) and butylhydroxytoluene (BHT) are quite volatile compounds and easily decompose at high temperatures [6]. There are some serious problems concerning the safety and toxicity of some synthetic antioxidants related to their metabolism and possible absorption and accumulation in body organs and tissues [7]. Therefore, development of preparations based on the antioxidative properties of natural compounds is highly desirable. The antioxidant extracts isolated from various herbs were reported to be effective in retarding the development of rancidity in oils and fatty foods; however, the antioxidant activity of these extracts depends on the concentration and chemical structure of antioxidatively active components in the raw materials. Since ancient times, aromatic plants have been widely used as flavourings; however, during the last few years they have become a source of natural antioxidants and antibacterial agents [8]. Essential oils are considered among the most important antimicrobial agents present in plants and may possess also antioxidant and anti-inflammatory activities. The increasing antibiotic resistance of some pathogens that are associated with diseases is another major concern. Therefore, there has been increasing interest in developing a new type of effective and nontoxic antimicrobial compounds. Several authors have proposed essential oils as natural preservative agents [9]. In the present study, a preliminary screening of antioxidant and antimicrobial activities of Midi-Pyrenes aromatic plants grown in France, namely Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata and Monarda didyma, was carried out. Essentials oils from these plants were added to sunflower oil, and oxidative deterioration was measured by the Oxipress method. The antimicrobial activities of the essentials oils were evaluated against nine pathogenic bacteria present in various foods.
or sweet cicely (Myrrhis odorata L. Scop.), largeflowered calamint (Calamintha grandiflora L. Moench.) and bergamot, also known as scarlet beebalm, scarlet monarda, oswego tea, or crimson beebalm (Monarda didyma L.) were used in the study. The plants were collected in Midi-Pyrenes (south west of France) in AprilMay 2008 at the vegetation phase which is considered preferable in terms of the functional properties of herbs. Essential oils were isolated from ground plants by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus. The antioxidant activity of the essentials oils was determined in sunflower oil, using an Oxipress apparatus (Mikrolab Aarhus, Denmark): in the course of oxidation, oxygen consumption is evaluated by measuring changes in its pressure in a hermetically sealed 200 ml vessel containing oxygen and a sample. Five grams of sunflower oil (pure, with essential oils and with the synthetic antioxidant BHT) were placed in the reactor which was connected to the pressurized oxygen cylinder; first, it was washed with oxygen and afterwards filled with oxygen to reach the defined initial pressure (0.5 MPa). The experiments were carried out at a temperature of 110 C in triplicate. The relative standard deviation was in the range of 0.1 to 3%; in rare cases when it was higher, additional measurements were performed. The induction period (IP) of oxidation was read at the time when the pressure began to decrease abruptly (the end was measured from the cross-section point of tangents of the first part and the subsequent part of the curve recording the pressure changes, as evident from Figure). The protection factor (PF) value of sunflower oil in case of using essential oils and their antioxidant activities (AA) were calculated by the following formulas:
PF = IPX ; IPK AA = IPX IPK ; IPBHT IPK
where IPX is the induction period of a sample with an additive, h; IPK is the induction period of a sample without additive, h; IPBHT is the induction period of a sample with containing the synthetic antioxidant BHT, h.
Materials and methods

The aerial parts of costmary, also known as alecost, balsam herb, Bible leaf (Tanacetum balsamita L.), cicely
Fig. Sunflower oil oxidation curves at 110 C
Nine food spoilage bacteria, including Gram-positive, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus
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aureus, Staphylococcus epidermidis, and Gram-negative pathogens, namely Salmonella typhymurium, Salmonella typhymurium D338, Salmonella enteritidis, Salmonella agona and Escherichia coli, were used in this study. The antimicrobial properties were evaluated by the agar diffusion method. Bacteria were grown in plate count agar (CM 325, Oxoid) for 24 h at 37 C. After cultivation, test culture cells were mixed using an MS1 mini shaker (Wilmington, USA) and the cell suspensions were adjusted according to McFarland no. 0.5 standard. The suspension of bacteria cells in saline (2 ml) was introduced into the dissolved um agar media; 10 ml of each bacteria culture was pipetted into a 90 mm Petri dish. Eight-millimeter diameter wells were pushed in the agar and filled with methanolic solutions of oils. The plates were incubated overnight at 37 C. A 10 l volume of 1.0 and 0.5% methanolic solutions of the essential oils was added to the agar wells. Pure methanol was used as a control in blank samples for bacteria. After incubation, the inhibition zones were measured with calipers to an accuracy of 0.1 mm, and the effect was calculated as a mean of three replicate tests. An appropriate reference antibiotic disc was applied on each plate depending on the test microorganisms (ceftazidine/clavulanic acid, 30/10 g; BBL, CAZ/CLA, 231753); they served as a positive control which is effective against all species used in the study.
of thymol, and it may explain the comparatively high antioxidant activity of this additive. The chemical composition of the essential oil obtained from M. didyma had been analysed previously, and thymol was also found as the main component constituting more than 50% in the total oil. The antioxidant activity of the oil was evaluated by the DPPH test where the oil showed an effect comparable to Trolox, and by lipid peroxidation test where the activity of the oil was similar to that of BHT [10]. Antioxidant activity of the essential oils was dosedependent, and in case of the highest dose (0.02%) of M. didyma, C. grandiflora and M. odorata it exceeded the antioxidant capacity of BHT added at a concentration of 0.02%. The main components in the essential oils of C. grandiflora, T. balsamita and M. odorata were menthone, -thujone and anethol, respectively.
Table 1. Antioxidant activity (AA) of essential oils as compared with the effect of BHT and their effect on the stability of sunflower oil, expressed in protection factor values (PF) Species Without additive BHT M. didyma Conc. % 0.00 0.02 0.2 0.1 0.05 C. grandiflora 0.2 0.1 0.05 M. odorata 0.2 0.1 0.05 T. balsamita 0.2 0.1 0.05 PF 1.00 1.47 1.73 1.37 1.29 1.63 1.22 1.18 1.61 1.2 1.17 1.41 1.2 1.1 AA 1.00 1.55 0.79 0.62 1.34 0.47 0.38 1.30 0.43 0.36 0.87 0.43 0.21
Results and discussion

The oxipress method, which was used to evaluate the antioxidant activity of essential oils, is a very convenient procedure performed without using any chemicals. Typical curves of oxidation are presented in Figure. The change of pressure at the end of the induction period can be rather precisely measured and, as shown in Figure, in case of adding plant essential oil to sunflower oil, the pressure drop was delayed for some period of time, indicating the antioxidative effect of the added substance. The effects of the applied essential oils at 0.05, 0.1 and 0.2% concentrations are summarized in Table 1; the essential oil of M. didyma was found to be the most effective natural antioxidant measured by the Oxipress method as compared with other essentials oils used in this experiment. The effectiveness of the applied essentials oils decreased in the following order: M. didyma > C. grandiflora > M. odorata > T. balsamita. Essential oils are complex mixtures of volatile natural compounds, and their total antioxidant capacity depends on the presence of the most active components and their concentration in the oil. For instance, such phenolic compound as thymol, which is present in many essential oils, particularly in those isolated from plants belonging to the genus Thymus, possesses high antioxidant strength due to the presence of the phenolic hydroxyl group. It was also suggested that the presence of an electron donating group in ortho position to the hydroxyl moiety may be crucial for exerting an effective antioxidant activity. M. didyma essential oil contained up to 50%
Antimicrobial activity of the methanol solutions of essentials oils was evaluated in vitro against nine bacteria species known to cause infections in humans (Table 2). Gram-positive bacteria are more sensitive than Gramnegative, especially Bacillus cereus, which was the most sensitive species in case of using M. didyma essential oil at a concentration of 1%. M. didyma oil showed the inhibitory effect against all test cultures. Most likely the high percentage of the strong antimicrobial agent thymol in M. didyma essential oil was the main factor for its pronounced antimicrobial activity. It is in agreement with the previously published results; e.g., thymol-rich essential oils from Thymus pulegioides were strong antimicrobial substances against various pathogenic bacteria [11]. The fungicidal activity of Thymus vulgaris oil correlated also with the content of thymol [12]. The antifungal activity of M. didyma oil was evaluated against four phytopathogenic fungi through a direct contact with by agar diffusion method and with the fungistate action of
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the vapors using the micro-atmosphere method. The most sensitive fungus was Rhizoctonia solani in the first test
and Botrytis cinerea in the second [10].
Table 2. Antimicrobial activity of the essential oils at different concentrations, expressed in the diameter of inhibition, mm; na not active M. didyma Bacterial species 1% Bacillus subtilis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Salmonella typhimurium Salmonella typhymurium D338 Salmonella enteritidis Salmonella agona Esherichia coli 16.5 40 13.1 14.7 15 16.2 15.2 13.8 18.9 0.50% 12.8 13.1 10.2 11.5 11 12.2 11.5 10.7 14.4 1% 19.1 9.8 9.7 10 8.9 9.3 10.1 8.4 10.3 0.50% 8.5 10.6 na na na 8.8 9.1 na na 1% 9.2 10.6 8.8 9.1 8.1 9 8.1 na 10.2 0.50% 8.5 9.9 na na na na na na na 1% 10.2 11.4 9 8.5 8.4 9.7 8.9 na 9.7 0.50% 8.2 8.8 na na na na na na na sensi-disc 16.8 29.0 21.0 25.8 31.2 34.0 32.2 20.8 26.4 C. grandiflora M. odorata T. balsamita Antibiotic
T. balsamita and M. odorata oils at 0.5% possessed a weaker antimicrobial activity against the majority of test bacteria as compared to other essentials oils applied at the same concentration; they showed antibacterial activity only against Bacillus cereus and Bacillus subtilis. Comparing Salmonella spp., Salmonella agona was the most resistant species; the smallest zones of inhibition were measured in case of the majority of applied essential oils. C. grandiflora oil applied at a concentration of 1% was the most effective antimicrobial agent against Bacillus subtilis as compared with the other oils. The inhibitory effect of M. didyma oil (1%) against Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium and Staphylococcus epidermidis was halt as low as the effect of the reference antibiotic compound; however, in case of Bacillus subtilis, the effect of M. didyma oil was equal to that of the antibiotic compound.
Foundation (grant No. V-42/2009) and the Agency for International Science and Technology Development Programmes in Lithuania (grant No. 31V-136.
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3.
4. 5. 6. 7. 8.
Conclusions
A preliminary screening of the bioactivity of Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata and Monarda didyma essential oils showed the volatile fractions of these plants to possess antioxidant activity in vegetable oil and antimicrobial activity against various pathogenic bacteria. These results suggest the need of the further studies of these plants to assess their wider application in the production of valuable ingredients. Further studies should be focused on the nonvolatile fraction of plant materials.
9. 10.
11. 12.
Acknowledgements
This study was performed in the framework of the bilateral FrenchLithuanian programme "Gillibert" and supported by the Lithuanian State Science and Studies
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C. El Kalamouni, C. Raynaud, T. Talou, P. R. Venskutonis VIDURIO PIRN AROMATINI AUGAL ANTIOKSIDACINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO PIRMINIS VERTINIMAS Santrauka
Vidurio Pirnuose augani aromatini augal Tanacetum balsamita, Calamintha grandiflora, Myrrhis odorata ir Monarda didyma eterinio aliejaus antioksidacins savybs buvo tirtos oksipres metodu, o antimikrobinis aktyvumas vertintas naudojant 9 bakterij ri kultras. Nustatyta, kad eterinis aliejus
sultino saulgr aliejaus oksidacijos greit: tirt augal antioksidacinis aktyvumas majo tokia tvarka: M. didyma > C. grandiflora > M. odorata > T. balsamita. Eterinio aliejaus antioksidacin galia taip pat priklaus nuo eterinio aliejaus koncentracijos: pavyzdiui, 0,2 % M. didyma, C. grandiflora ir M. odorata pried poveikis buvo didesnis, palyginus su sintetiniu antioksidantu BHT, kurio koncentracija buvo 0,02 %. Gramteigiamos bakterijos buvo jautresns eterinio aliejaus poveikiui negu gramneigiamos. Pavyzdiui, M. didyma eterinis aliejus slopino vis bakterij kultras, taiau 1 % koncentracijos tirpalas buvo efektyviausias slopinant Bacillus cereus augim. Didel stipraus antimikrobinio junginio timolio koncentracija io augalo eteriniame aliejuje tikriausiai yra pagrindin jo iskirtinio antimikrobinio aktyvumo prieastis.
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Expression of Multidisciplinary Flavour Science
DESIGN OF AN ARTIFICIAL CRUSHING FINGER DEVICE FOR RAPID EVALUATION OF ESSENTIAL OILS FROM AROMATIC PLANTS LEAVES
C. EL KALAMOUNI1,2, C. Raynaud1,2, and T. Talou1,2
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LCA Universit de Toulouse ; INP ; LCA (Laboratoire de Chimie AgroIndustrielle); ENSIACET, 4 Alles Emile Monso, F-31029 Toulouse, France INRA (Laboratoire de Chimie AgroIndustrielle) ; F-31029 Toulouse, France
Abstract A special designed apparatus based on Scratch' n Sniff concept was developed for copying the crushing of aromatic plants leaves between fingers. The so-called Crushing Finger Device (CFD) was equipped with a TENAX trap for a rapid analysis of emitted volatiles by GC-MS. The CFD efficiency was presently evaluated by comparison of chromatographic profiles obtained with crushed, uncrushed leaves and essential oil of costmary (Tanacetum Balsamita) fresh leaves, chosen as model plant. Introduction A decade ago, several treks (NEBLINA, TASTETREK) were performed by companies of aromatic industry sector both in South-America and West-Africa in order to investigate the aromatic potentialities of rare exotic plants for novel flavours and fragrances formulations. As Midi-Pyrenees region (Southwest of France) has a rich and unvalorised wild vegetal heritage, especially for aromatic and medicinal plants, the MIPAROM Trek was conducted in order to collect and analyse various regional medieval (aka forgotten) aromatic plants, e.g. Achillea millefolium, Tanacetum balsamita, Agastache foeniculum, Meum athamanticum, Chrysantemum balsamita, Myrris odorata, Calamintha gradiflora. As a consequence of a global bibliographical survey study based on historical books, library archived documents and computerized data banks, a list of 20 regional plants to be investigated has been precised [1]. But as such plants being rare or their harvesting problematic as they were protected, sampling could be limiting. We have developed a strategic approach based either on the use of a specific/high effective sampling system with a classic detection or a classic sampling with a specific/ultra sensitive detection. If this last methodology was based on the coupling of SPME to Comprehensive GC (GCxGCTOFMS) (current works) the first ones was based on a self designed apparatus [2], allowing to copy the crushing of leaves between fingers used by farmers or flavourists to sensorially evaluate the odour of aromatic plants. The so-called Crushing Finger Device (CFD) was based on a modified artificial mouth and has the objective to perform a rapid evaluation of essential oil content with only a couple of leaves through a controlled Dynamic HeadSpace (DHS) concentration of volatiles emitted by crushed fresh leaves. In the present paper we report the comparison of the chromatographic profiles of essential oil of leaves of our model plant, costmary (Tanacetum Balsamita), with the ones obtained with leaves without crushing (DHS) and with leaves processed by CFD-DHS.
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Experimental Materials. Costmary (Tanacetum Balsamita) plants using in the present study were collected at their optimum biological stage in Midi-Pyrenees area (south West France) in April-May 2008. Dynamic HeadSpace with crushing (CFD/DHS). Two or three entire fresh leaves of costmary corresponding to 500mg were placed in the glass cell of the CFD thermostated at 25C. A flow of purified nitrogen (100 ml/min) passed through the leaves for 5 min to trap the volatiles into a TENAX TA trap positioned at the top of the device. The crushing of leaves was set up by a motorized Teflon piston having transverse and rotative movements. 4 replicates were performed Dynamic HeadSpace without crushing (DHS). The CFD piston was removed from the device and fresh leaves were carefully placed without damaging tissues. Operating conditions were applied as described before with 3 replicates performed. Isolation of essential oil (EO). 100g of the aerial part of fresh costmary plants was hydrodistilled for 3h at 100C by using a Clevenger-type apparatus in order to obtain essential oils. 4 replicates were performed. Gas chromatographic analysis. Volatile analysis (EO) were performed with a Hewlett Packard 5890 SERIES II gas chromatograph equipped with FID and an Agilent 5973 Network GC-MS. (DHS, DHS/CFD) analysis were performed with a Perkin Elmer Clarus 500 GC-MS-FID equipped with a TurboMatrix TD thermodesorber. A fused-silica DB5 (0.25mm x 30m, 0.25m film thickness) was used throughout this study. Temperature program used was: 30C for 5min, then 5C/min up to 200C and 10 min isotherm at 200C. -Terpinene was used as standard to estimate the concentration of volatiles compounds in CFD in g/kg of dried material. Identification of volatiles was based on comparison of their retention times with those of authentic samples (calculated RI based on n-hydrocarbons series kit) and on computerized matching with commercial mass spectra data bank (NIST 2005 and WILEY) and Adams library [3]. Results The composition of the yellow coloured essential oil obtained with a yield of 0,53% on a dry weight basis, was conform to literature [4-8] while thujone (cis and trans isomers) and 1,8-cineole were the main identified volatiles (Table 1). trans-Thujone was reported as the main compound of both essential oil (63.3%) and emitted volatiles from uncrushed (82.5%) and crushed ones (67.7%). The yield of emitted volatiles by fresh costmary leaves was by increasing order: CFD / DHS >> DHS. The consequence of the crushing of the leaves by CFD was the explosion of the vesicles of storage of essential oil and the release of the main volatile compounds of the plant in atmosphere. The comparison of the GC-profiles of crushed leaves (Figure 1A) versus leaves without crushing (Figure 1B) showed an increase of number of top notes compounds (4 to 20). The major volatiles emitted during the crushing of leaves were 3-methylhexanal (0.3%), -thujene (0.2%), -pinene (0.7%), -terpinene (2.4%), -pinene (0.4%), 1,8-cineole (21%), -terpinene (0.5%), pmentha-1,4(8)-diene (0.2%) and cis-thujone (3.3%). In case of essential oil, the minor compounds reported were 1,8-cineole (27.5%), -terpinene (0.1%), cis-thujone (4.2%), terpineol-4 (0.6%), germacrene D(0.9%), bicyclo-germacrene (0.1%), terpineol (0.2%), and -eudesmol (0.4%) and could be assimilated to back notes components generated during hydrodistillation.
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Table 1. Volatile compositions of essential oil, uncrushed and crushed fresh leaves of Tanacetum balsamita
Peak 1 2 3 4 5 6 7 8 Volatile Compound Hexanal, 3-methyl 1-Butanol, 2-methyl 1-Octen 3-Hexen-1-ol 1-Butanol, 3methylacetate -Thujene -Pinene bicyclo[3.1.0]Hex-2-ene, 4-methylene-1-(1methylethyl) Camphene -Terpinene -Pinene cis-Pinene-3-ol 3-Hexen-1-ol, acetate NI o-Cymene p-Pymene 1,8-Cineole -Terpinene N.I. N.I. p-Mentha-1,4(8)-diene Butanoic acid, 2-methyl3 ethylbutylester cis-Thujone trans-Thujone 4-Terpineol -Terpineol Sabinyl acetate Germacrene-D bicyclo-Germacrene -Eudesmol RI (DB-5) 738 742 791 857 879 926 933 944 EO (n=4) % DHS (n=3) % CFD (n=4) % 0.3 0.1 0.4 0.3 0.1 0.2 0.7 0.1 CFD [c] g/kg/5min 0.5 0.2 0.5 0.4 0.1 0.1 0.9 0.1 CFD [c] SD % 11 23 15 34 17 23 12 18
0.6
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
950 973 978 989 1004 1012 1017 1023 1031 1057 1071 1072 1086 1100 1107 1121 1166 1185 1282 1476 1489 1650
1.7 1.5
0.1 2.4 0.4 0.1 0.4 0.2 0.4 21 0.5 0.2 0.2 0.2
0.2 3.7 0.5 0.3 0.3 0.6 0.5 21.3 0.6
7 26 9 25 22 21 18 4 13
tr 27.5 0.1 0.3
12.6
0.2 0.3 4.9 103.8
19 49 9 27
4.2 63.3 0.6 0.2 tr 0.9 0.1 0.4
1.1 82.5
3.3 67.7
tr : Trace (<0,1%), NI : unidentified
Figure 1. CFD/DHS-GC profile of crushed leaves (A) and DHS-GC profile of uncrushed leaves (B)
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These preliminary results showed that GC profiles of essential oil (Figure 2) and volatiles emitted from crushed leaves (Figure 1A) by using the CFD had similarities for top and heart notes (cis-, trans-thujone and 1,8-cineol as major constituents) but also differences, especially for back notes components due to the extraction technique used (hydrodistillation vs dynamic headspace).
Figure 2. GC profile of Essential Oil of Tanacetum balsamita. The coupling CFD/DHS, demonstrated the potential for rapid evaluation of essential oils from aromatic plant leaves. Indeed, this novel system allowed having a representative finger-print of fresh plant volatiles with similar top and heart notes than the essential oils (qualitatively and quantitatively). Comparison of results obtained with fresh costmary leaves by CFD/DHS-GC/MS vs SPME-GCxGC/TOFMS is in progress. The generalization of its use with various medieval aromatic plants from Midi-Pyrnes is suggested. Coupling of CFD/DHS and CFD/SPME with Fast-GC and GC-O for quality control and aroma key compounds identification purposes is being carried out. References 1. 2. El Kalamouni C. INP Toulouse Doctorate Thesis, in progress. Talou T., El Kalamouni C. and Raynaud C. (2008) Rapid evaluation of essential oil quality based on instrumentalized crushed fresh leaves volatiles assessment. French Patent trading. Adams R.P. (2001) Identification of Essential Oils Components by Gas Chromatography/Quadrupole Mass Spectroscopy. Allured Publishing Corporation, Carol Steam, IL. Voigt R.F., Rogers C.H., Fischer E.B. (1938) J. Am. Phar. Ass., 27: 643-654. Bylaite E., Venskutonis R., Roozen J., Posthumus M. (2000) J. Agric. Food Chem. 48: 2409-2414. Gallori S., Flamini G., Bilia A., Morelli I., Landini A., Vincieri F. (2001) J. Agric. Food Chem. 49: 5907-5910. Monfared A., Davarani S., Rustaiyan A., Masoudi S. (2002) J. Ess.Oil Res. 14: 1-2. Baser K.H.C., Demirci B., Tabanca N., Ozek T., Goren N. (2001) Flav. Frag. J. 16: 195-200.
3.
4. 5. 6. 7. 8.
528

Caractérisations Chimiques Et Biologiques D'extraits de Plantes Aromatiques

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THSE

DOCTORAT DE LUNIVERSIT DE TOULOUSE

Prsente et soutenue par Chaker EL KALAMOUNI Le 13 Dcembre 2010

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

Table des matires

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

CONCLUSION GENERALE ..........................................................................................179 PARTIE EXPERIMENTALE .........................................................................................187

Caractrisations chimiques et biologiques dextraits de plantes aromatiques oublies de Midi-Pyrnes

RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................209

Chapitre I : Etude Bibliographique

Chapitre I : Etude Bibliographique

Chapitre I : Etude Bibliographique

Chapitre I : Etude Bibliographique Prparations aromatisantes procd physique ou biotechnologique Naturels

Armes de transformation Armes de Maillard

Chapitre I : Etude Bibliographique

I. Plantes aromatiques mdivales de la rgion de Midi-Pyrnes

Chapitre I : Etude Bibliographique

Nom Latin * Achillea millefolium

Motif de slection non slection Retenue

Nom Latin * Anthriscus sylvestris

Nom Franais Cerfeuil sauvage

Motif de slection non slection Retenue

Ballote ftide Bourrache Moutarde

Nom Latin * Calamintha grandiflora Capsicum frutescens Cardamine pentaphyllos

Nom Franais Th dAubrac Poivre de cayenne Dentaire digite

Motif de slection non slection Retenue Nombreuses tudes scientifiques

Carum carvi Cedrus

Cumin des prs Cdre

Chelidoine Oreille de chvre Balsamite Ciste feuilles de Sauge Muguet

Nom Latin Crataegus oxyacantha Cucurbita pepo Discordia Galium verum

Nom Franais Aubpine Courge de sweet Herbe de haine Gaillet vrai

Juniperus communis Geum urbarum Glechoma hederacea

Genevrier Benote Lierre terrestre

La Benote bndiction tonique Immortelle

Absence dhuile essentielle

Nombreuses tudes scientifiques

Nombreuses tudes scientifiques

Nom Latin Humulus lupulus

Nom Franais Houblon

* Monarda didyma * Myrrhis odorata

Nom Latin Myrtus communis Narcissus pseudonarcissus

Nom Franais Myrte Narcisse jaune

Caractristiques Prince des vgtaux odorants, menthol

Motif de slection non slection Forme arborescente

Origanum majorana Origanum vulgare

Marjolaine Marjolaine sauvage

Pastinaca sativa Phragmites australis

Toxicit de lhuile essentielle Forme arbrescente

Rosmarinus officinalis Rosa canina Ruta graveolens

Romarin Eglantier Rue

Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques Nombreuses tudes scientifiques

Nom Latin Salvia officinalis Salvia pratensis

Nom Franais Sauge Sauge commune

* Sambucus nigra Sanguisorba minor Satureia hortensis Spiraea ulmaria

Retenue Absence dhuile essentielle

Syzygium aromaticum Tagetes tenuifolia * Tanacetum vulgare

Girofle Tagette Tanaisie commune

Toxicit de lhuile essentielle

Nom Latin Thlapsi arvense