Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Universit Mentouri de Constantine Facult des Sciences de la Nature et de la Vie Dpartement des Sciences de la Nature et de la Vie
N DORDRE : N DE SERIE :

MEMOIRE
EN VUE DE LOBTENTION DU DIPLOME DE :

MAGISTER Option : Biochimie et Microbiologie Applique THEME

Etude des proprits biochimiques des polyphnols et tannins issus de Rosmarinus officinalis et Vicia faba L.

Prsent par : Melle SOUAD AKROUM

Devant le jury :

Prsident : Rapporteur : Examinateurs :

Mr. BOUSSEBOUA H. Mr. MERGHEM R. Mr. LAHOUEL M. Mr.BELKHIRI A.

Prof. Univ. Constantine Prof. Univ. Constantine MC. Univ. Jijel MC. Univ. Constantine

Anne universitaire 2005-2006

Introduction :
On a lo ngt emps emplo y des re mdes tradit io nnels base d e plantes sa ns savo ir quo i taient dues le urs act ions bnfique s. Aprs plu sie urs t udes, o n a su qu e lles t aie nt pour la ma jo rit at tribues aux co mpos s seco ndaire s do nt les alc alo d es, les terpnes et les co mpos s po lyphno liques. Les po lyphno ls sont en effet do us de mult iple s vertus t hrapeut iques ,

phar maceut iques, cosmtologiques et a gro aliment aires : ils jouent un r le trs impo rt ant , principale ment, da ns la lutt e contre les ca ncer s, les ma ladies

cardio vasculaires et la proxydat ion lipidique. E xpliqua nt de ce fait leur gra nde utilisat io n dans la fabricat io n des mdicaments. Ils int erviennent auss i dans la prot ect ion des p lantes contre les diffr ent es att aques micro biennes (surt out fo ngiques) risquant de c auser la pert e d une grande quant it de vgtat ion. En cosmtologie, ce s co mposs ph no liqu es so nt de premier ordre grce leur grand pouvo ir co lo rant et leur capacit rest it uer et protger les fibre s du co llagne. Notre contr ibut ion port e sur des po lyphno ls is sus de deux p lantes Rosma r inus offic ina lis et Vicia fa ba L. Des tudes phyt ochimiq ues bases principalement s ur l ext ract ion, la chro matographie sur co uche mince et la spectropho tomtrie de c es co mpo ss no us per mett ent une approche de la st ructure mo lcula ir e. Des testes ant ibactriens met tent en vidence l act ion de s fla vo no ide s et des tannins cont re Es cher ichia coli , Str epto coccus sp et P r oteus mir a bilis qui so nt des ger me s pat hog nes responsables de plus ieurs in fectio ns chez l ho mme. Les t annins de Vicia fa ba L. prouvent leur actio n ant inutr it io nnelle en prc ip ita nt in vitr o diffrent s co mposs o rgan iques prse nts da ns l alimentat io n. Asper gillus niger et P enic illium sp sont tests s ur des milieux bas e de t ann ins po ur essayer d e dmo nt rer leur apt itude s yn tht iser la t annase capable de d grader les tannins condens s. Enfin, des applicat ions ant iradicala ire s no us co nfir ment l act io n des favo no ides de Rosma r inus officina lis et des tannins de Vic ia fa ba L. contre les radicaux libr es.

Partie 1 : Bibliographie :
1* Quels sont les derniers rsultats de la recherche sur les polyphnols ? 1.1-Prsentation gnrale des polyphnols et de leurs proprits :
1.1.1- Que sont les polyphnols ? O les trouve-t-on ? Les po lyphno ls sont des mo l cules aro matique s synt ht is es par le s vgt aux et qu i appart ie nnent leur mt abo lisme secondaire. Ils part ic ip ent la dfense des plant es cont re les agr ess io ns enviro nneme nta les ; c est pourquoi 80% des co mposs phno liques sont ess ent ielle ment loca liss dans le s tissus pidermiques de la plant e. Ce sont des phytoconst itua nts, gnralement des pig me nts, respo ns ables des t int es aut omnales de s feuilles et des couleurs des fleurs et fru its ( jau ne, orange, ro uge .). Ils sont associs de no mbreux proces sus phys io lo g iques : cro issance cellu la ire, diffrenciat io n, organogens e, dor ma nce des bourgeons, floraiso n, t ubrisat io n (UNUP 1986). Ces co mpo ss jo uent aus si un r le impo rtant dans la qua lit alimenta ire de s fru it s et dt erminent aussi leurs saveur s (les tannins so nt l origine de la sensat ion d a st ringence des fruit s non mrs, les fla vones sont respo nsa ble s de l a mert ume d es Citr us et peuve nt donner naissance , par t ransfo rmat io n ch imique d es

dih ydrocha lco nes sa veur sucre (DRYUNE et al.1999). Les po lyph no ls so nt prsent s part out da ns les rac ine s, le s t iges, le s fleurs, le s feu ille s des vgtau x. Les principales so urces du po int de vue a liment aire so nt les l gumes feuille s, le s fr uits et les bo isso ns. Et du po int de vue mdic inal,

principale ment les labis et les co mposs (RESEMY 1998).

La bio synt hs e des flavo no ides s e fait par deux vo ies pr inc ipa le s qui so nt : La vo ie de l ac ide s hik imique : Dans cett e vo ie, les hydrates de carbo nes pro duisent lors de leur dgradat io n par la vo ie de s pe nto ses-P et la glyco lys e, l ryt hrose 4-P et le phospho eno l pyruva te respect ivement. Ces der niers sont l origine des co mposs phno lique s C 6 C 1 forma nt les t annins hydro lysable s et de la chalco ne qui est la mo lc ule de ba se de to us le s fla vo no ides et tannins condens s (SEIGLER 1998, HASL EM 1993, NAKANISHI et a l. 1975) 2

La voie de l acide malonique : La glycolyse ainsi que la -oxydation aboutissent la formation de l actyl CoA donnant le malonate. C est travers cette voie que s effectue la cyclisation des chanes polyctoniques, obtenues par condensation rpte d units Actate qui se fait par carboxylation de l actyl-CoA. Cette raction est catalyse par l enzyme actyl-CoA carboxylase (RICHTER 1993, SEIGLER 1998).

Comme tous les composs secondaires, les phnols sont impliqus troitement dans les rles dfensifs de la plante : - Dissuader les prdateurs : a- par les odeurs repoussant les herbivores, ex : les polyphnols des plargoniums. b- les plantes toxiques duquent les herbivores les viter pour ne pas tre broutes. - Attirer les pollinisateurs : les couleurs, mais aussi les odeurs attirent les insectes. Exemple : certaines orchides synthtisent des phromones sexuelles qui sont des substances volatiles mises par les insectes femelles pour attirer les mles. - Dcourager la comptition vis--vis d autres espces. On parle d alllopathie : certaines plantes mettent des substances pour inhiber la croissance des autres plantes. 1.1.2- Rle antioxydant des polyphnols. 1.1.2.1-Les radicaux libres: Notre organisme produit en permanence des radicaux libres en rponse des agressions environnementales (cigarettes, polluants, infections......). Les radicaux libres sont des espces chimiques trs instables qui jouent un rle dans l action de certains traitements anticancreux, de mme qu lorigine du vieillissement. Leur structure comprend un lectron clibataire qu ils cherchent apparier en attaquant et en endommageant les molcules voisines (ROBERT 2005). En ralit le radical libre vole un lectron une molcule stable qui son tour deviendra un radical libre, induisant ainsi une cration en chane. Cette chane de vols d'lectrons est cumulative et explique plusieurs maladies (FORTIN 2001-2003). Dans les membranes cellulaires, ces composs nfastes provoquent des peroxydations

lipidiques responsables de nombreux troubles lis ou non au cancer. Dans le noyau des cellules, ils coupent l ADN, ce qui entrane la mort cellulaire. C est le plus souvent une molcule d oxygne qui, directement ou par l intermdiaire d autres radicaux libres, donne 3

les espces radicalaires les plus ractives : le radical superoxyde et le radical hydroxyle. Le radical superoxyde peut tre dtoxiqu dans la cellule par une enzyme spcialise, mais le radical hydroxyle ne l est pas ; il est responsable des dommages molculaires les plus importants. Les radicaux libres sont produits par des mdicaments anticancreux (comme la blomycine ou la doxorubicine) ou par les rayonnements ionisants, ce qui dtermine leur activit cytotoxique. (ROBERT 2005). 1.1.2.2-Rle anti radicalai re des po lyph nols : Le polyphnols sont capables de piger les radicaux libres et d'activer les autres

antioxydants prsents dans le corps. Ce principe a t utilis dans la fabrication de plusieurs mdicaments, et dernirement dans celle de flavay (MASQUELIER 2006). Cette mme activit antioxydante permet aux polyphnols de rguler les radicaux bonmauvais (qui peuvent tre les deux), comme l'oxyde nitrique qui permet une bonne circulation sanguine, coordonne l'activit du systme immunitaire avec celle du cerveau et module la communication entre les cellules de ce dernier (FLORENTIN 2004,

MASQUELIER 2006). En raison de ces vertus, les composs phnoliques sont largement utiliss dans les domaines thrapeutiques et cosmtiques. 1.1.3- Quelles diffrences entre acides phnols, flavonoides, tannins ? Les polyphnols possdent plusieurs groupements phnoliques avec ou sans autres fonctions (alcooliques, carboxyles). Dans cette catgorie, on trouve de nombreuses substances, qui peuvent se classer en cinq groupes principaux : Les acides phnols : Ont une fonction acide et plusieurs fonctions phnols. Ils sont incolores et plutt rares dans la nature. Les acides phnols drivs de l acide benzoque sont trs communs aussi bien sous forme libre que combine ltat d esters ou d htrosides. Ex : l Acide gallique qui est un lment principal de la structure des tannins hydrolysables. (figure1).
CO OH CO O H CO OH C O OH

OCH3 Aci de b en zoq u e OH Aci de van il l iq u e

OH

OH

H 3 CO

OC H 3

OH Ac id e ga ll iq u e

OH Ac id e syrin g iq u e

Figure 1 : Exemple de quelques acides phnols de la srie benzoque.

Les acides phnols drivs de l acide cinnamique sont souvent estrifis. Les plus courants sont lacide saticylique, l acide cafque, lacide p -coumarique et l acide sinaptique. (NEWSLETTER. 2005). (figure2).
CH =C H= CO OH CH =C H -C O O H C H =CH -C O O H

HO Ac i de cin n am iq u e OH Aci de c af iq u e

H 3 CO OH Aci de f eru l iq u e

Figure 2 : Exemple de quelques acides phnols de la srie cinnamique.

Les flavonodes : Ont des couleurs allant du jaune clair au jaune or. Selon les dtails structuraux de leur squelette de base en C15, les flavonodes se divisent en 6 groupes : flavones, flavonols, flavonones , isoflavones, chalcones, aurones. Ces composs existent sous forme libre ou sous forme d htrosides. (HELLER1993). Les anthocyanes : donnent des couleurs trs varies : bleu, rouge, mauve, rose ou rouge. Toutes les anthocyanes sont charges positivement. Ceci est d leur structure de base commune : le cation flavylium ou 2 phenyl 1-benzopyrilium. (HELLER 1993). Les trois anthocyanes principales sont : * La plargonidine : a un OH en 4 et donne une couleur rouge-orange. * La cyanidine : a deux OH en 3 , 4 ou en 4 , 5 . Elle donne une couleur rouge magenta. *La delphinidine : a trois OH en 3 , 4 , 5 . Elle donne une couleur mauve. Les flavanes : sont sous forme de monomres (ex : la catchine) ou sous forme de polymres (dimres, trimresde catchine). On les trouve dans les corces vgtales. Les tannins : sont des macromolcules se divisant selon leur structure en deux groupes principaux : * Les tannins condenss : proanthocyanidines : qui sont des composs phnoliques htrognes. Ils se trouvent sous forme d oligomres ou polymres de flavanes, flavan-3-ols, 5 desoxy 3- flavonols et flavan-3,4-diols. Les polymres ont une structure hrisse d OH phnoliques, capables de former des liaisons stables avec les protines (figure 3) * Les tannins hydrolysables : sont des esters dacide gallique qui se lient aux molcules de glucose: un glucose se lie plusieurs molcules d'acide gallique (WAWIZYNIAK. 1999-2000). (Figure4). 5

OH OH HO HO O OH OH HO OH O HO OH HO OH O O HO OH OH OH OH HO O OH OH OH HO OH O HO HO OH O HO OH OH OH HO O OH OH OH HO OH OH HO O HO O OH OH OH OH OH OH OH O

OH

OH

proguibourtinidine

Profisetinidine

OH HO O

Prorobinetinidine
OH

Promelaccacidine

OH OH OH OH OH O

Procyanidine

OH HO

OH

OH OH OH

OH

Prodelphinidine

Figure 3 : Quelques proanthocyanidines slectionns. (SEIGLER 1998).

OH HO HO HO HO OH O O O O O O OH O O

Pedunculagine
O

HO OH

HO OH

OH

OH

HO HO OH HO HO
6

OH

O O O
2

OH OH O O O
1

O O O O

OH OH

HO HO OH

OH HO O O OH O OH OH O OH

Acide tannique N=0,1,2 ; c-1 galloyl peut tre absent

O O O O H O O O O HO HO OH O O HO OH HO H O O HO OH HO OH O O O O O O OH H H O O

O O O O O O OH O

HO OH OH

OH

Brevilagine 2
OH

Brevilagine 1

Figure 4 : Quelques tannins hydrolysables reprsentatifs (SEIGLER 1998).

1.2 - Quel est le potentiel des polyphnols dans le traitement des cancers ?
1.2.1- Prvention contre les cancers : Les substances polyphnoliques sont capables d activer les mcanismes naturels de dfense anticancreuse. En effet, les premiers stades de la phase d initiation cancreuse peuvent tre bloqus par la capacit des tissus cibles intercepter et mtaboliser les agents mutagnes. Des cellules comme les hpatocytes, synthtisent des enzymes dites de phase I (notamment des monooxygnases, telle que les cytochromes P-450) qui peuvent oxyder les substances mutagnes hydrophobes en produits constituants le substrat des enzymes de phase II (glucoronyl transfrases, sulfotransfrases) qui convertissent ces produits en espces hydrolysables facilement excrtables hors cellules. Les enzymes de phase I et II agissent galement dans la muqueuse intestinale. Elles sont synthtises sous l action des substances polyphnoliques trouves dans les lgumes, et aussi sous l action des isothiocyanates (drivs des glucosinolates). (JHONSON 1999, AMES et GOLD 1999). 1.2.2- Cas particulier : flavonoides et les tannins contre le cancer. *Les flavonoides contre le cancer : parmi les flavonodes les plus actifs sur les cellules tumorales, on cite la querctine et la catchine qui sont trs abondantes dans l alimentation : La querctine prvient la cancrogense, surtout le cancer de la peau et du colon. La prsence de 20% de querctine l alimentation chez les animaux diminue le cancer du colon et y prvient l apparition des cryptes anormales. Le mcanisme suggr est que la querctine joue le rle d un antagoniste des topoisomrases I et II produites par les cellules tumorales. La catchine, quant elle, est un inhibiteur de certaines ractions d oxydation donnant un DNA anormal,elle inhibe surtout la formation du 8-OHDG (8-hydroxydesoxyguanosine), un marqueur des dommages oxydatifs du DNA. La catchine est plus active que la vitamine E sur les radicaux libres. Elle est trs abondante dans le th sous forme d pigallocatechingallatre (EGCG). (BONCHY 2001). *Les tannins contre le cancer : * Les proanthocynidines, pris faibles doses et long terme procurent une protection contre le cancer du clon (NOMOTO 2004). Mais d une faon gnrale, les tannins ; hydrolysables comme condenss ; ne font pas qu augmenter la rsistance contre les diffrents cancers, ils ont mme une action anticancreuse qui diminue, et parfois mme, limine totalement les tumeurs. 8

Plusieurs travaux ont port sur cette activit. *Les tannins hydrolysables, tout comme les pigallocatchines ont montr une grande capacit supprimer les tumeurs. Ces deux groupes agissent en inhibant les mtalloprotinases matricielles (MMP), surtout les MMP-2 et MMP-9, alors que le -dglucose des tannins hydrolysables qui a ses groupement hydroxyles compltement substitus par les groupements galloyl forme des groupes (ex : l hexahydroxydiphenoyl) capables d liminer les invasions des cellules tumorales. (TANIMURA. 2005). * Les proanthocyanidines (PA) oligomriques causent une apoptose des cellules tumorales chez les individus humains atteints du cancer colorectal. Ceci en augmentant l activit de l enzyme Carpase-3 et en diminuant l expression de l RNA-VCL-2 ( NOMOTO 2004 , KIM 2005). Ces mmes composs (PA) jouent un rle dans l augmentation de l effet anticancreux de certains mdicaments. En effet, l action antitumorale des proanthocyanidines augmente celle des substances utilises habituellement, comme la doxorubicine (ZHANG 2005). * Les procyanidines, quant eux, ont montr une action protectrice contre le cancer du colon chez les rats et les humains. Chez les rats, ils inhibent le nombre total des cryptes tumorales de 50%. Ces polyphnols agissent en inhibant l'activit des Kinases 1 et 2 et l expression de leurs jonctions C-terminales, en activant lenzyme Carpase-3 et en diminuant la biosynthse du polyamine (GOSSE 2005).

1.3- Que devient-il des polyphnols ingrs dans lalimentation ? (biodisponibilit) :

Les polyphnols sont prsents dans la plupart des vgtaux. Leur nature chimique et leurs teneurs sont extrmement variables d une espce lautre et donc d un aliment lautre. Les jeunes feuilles de thier en contiennent environ 300 mg/g de matire sche et une infusion de th environ 200 mg. Ces valeurs peuvent tre compares la consommation moyenne quotidienne en polyphnols apporte par l ensemble des aliments d origine vgtale, qui est estime un gramme. Le th constitue donc, pour les buveurs rguliers, une source majeure de polyphnols. Ceux-ci sont galement prsents en concentrations importantes dans divers fruits (pomme, raisin) et boissons drives (jus de fruits, vin, cidre). Le th vert s en distingue cependant de tous ces produits par une concentration en catchines trs nettement suprieure (SCALBERT 2001). L effet sant ne peut tre dissoci de la biodisponibilit de ces micro-constituants. Les sites associs la biodisponibilit : estomac, intestin suprieur, colon permettent aux polyphnols d assurer la premire de leur fonction : leffet antioxydant des lipides (SFA 2005). 9

Afin de comprendre les effets de la consommation des polyphnols sur la sant, il est essentiel de connatre leur devenir dans l organisme une fois ingrs afin de dterminer s ils atteignent ou non les tissus cibles prsums. La biodisponibilit des polyphnols varie trs largement d une molcule l autre. Certains polyphnols sont bien absorbs travers la barrire intestinale et se retrouvent dans le sang. Leur concentration plasmatique est

maximale environ 2 heures aprs leur consommation. Cette concentration diminue ensuite pour atteindre une valeur nulle 6 9 heures plus tard. Elle ne peut tre maintenue leve que par une consommation renouvele au cours de la journe. L absorption des polyphnols est conditionne par leur diffrence de structure. Labsorption intestinale des polyphnols est d autant plus limite que leur masse molculaire est leve (SCALBERT 2001, SFA 2005). La part des polyphnols qui n'est pas absorbe travers l intestin grle, est cependant mtabolise en molcules aromatiques de faible masse molculaire par la microflore du clon. Ces mtabolites sont eux-mmes bien absorbs et apparaissent dans les urines 3 heures aprs consommation du th avec un pic d excrtion vers 10 heures (SCALBERT 2001). Les taux urinaires reprsentent 1 25 % des doses ingres en fonction de la nature des polyphnols (RESEMY 2001).Des tudes in vitro sur la microflore fcale humaine ont montr, que les polyphnols complexes taient dgrads en divers acides aromatiques, phnoliques et non phnoliques. Les polymres phnoliques non absorbs pourraient exercer des effets protecteurs au niveau du tube digestif o leurs concentrations peuvent atteindre des valeurs trs suprieures celles des catchines dans les tissus internes (SCALBERT 2001)

1.4- Dernires avances sur le rle bnfique des polyphnols face aux maladies cardio-vasculaires , hormonodpendantes,. :
Parmi les nombreuses actions prventives assures par les polyphnols, on cite : *Prvention contre les maladies cardiovasculaires (CV) : La consommation des polyphnols se traduit par une augmentation temporaire de la capacit antioxydante du plasma dans les heures qui suivent les repas. Au niveau des artres, ils prviennent l oxydation des lipoprotines de faible densit (LDL) (YAMANAKA 1996) vitant ainsi l athrosclrose (paississement des artres qui contribue rduire le flux sanguins et peut conduire l asphyxie des tissus irrigus). Les polyphnols inhibent l agrgation plaquettaire implique dans le phnomne de 10

thrombose, qui induit l occlusion des artres. Ainsi en prvenant l arthrosclrose et les risques de thrombose, ces composs limitent les risques d infarctus du myocarde (FLORENTIN 2004). De nombreuses tudes ont dmontr l action antioxydante des polyphnols, (NATURFORSH 2004, C. RESEMY 1998). On utilise mme ces composs comme nouvelle mthode de traitement de l hypercholestrolmie, l hyperlipidmie, l arthrosclrose et l ulcre

gastrique. (CHERUVANKY 2003, KHENNOUF 2004). *Prvention contre les maladies hormono-dpendantes; telle que l ostoporose : Ceci en modulant la rponse aux oestrognes endognes. Certains polyphnols et plus particulirement les isoflavones du soja ont une affinit remarquable pour les rcepteurs des oestrognes et sont qualifis pour cela de phyto-oestrognes. Les fruits et lgumes contiennent aussi des polyphnols tels que la querctine de l oignon ou le kaempherol de la chicore qui possdent galement des proprits pseudo-oestrogniques ou inhibent la perte osseuse chez la rate ovariectomise. Mais, de nouvelles tudes restent ncessaires pour confirmer ces effets chez l homme. (FLORENTIN 2004, BERTA-VAURALLEN 2005). *Action gastro protectrice des polyphnols : Les polyphnols, surtout les flavonodes comme la querctine et la rutine, ainsi que les acides phnoliques comme l acide caffique, l acide gallique, l acide gallique rduisent la surface des lsions gastriques produites par l andomthacine chez les rates, (acutissimine B, phillyraeodine A) isols et purifis de Quercus Suber , et Q. coccifera . (KHENNOUF 2004). *Flavonoides contre la radiotoxicit, la peroxydation lipidique et l atteinte

hmatologique : L effet antioxydant des flavonodes est largement utilis actuellement dans les industries thrapeutiques et pharmaceutiques (surtout pour la prparation des mdicaments : Daflon, Tannakan, Veinamitol (VIDAL 1996)). Ces composs sont connus pour leur rle prventif contre la cardiotoxicit (SADZUKA 1997), leur inhibition de la peroxydation lipidique et leur prvention contre l atteinte hmatologique. (LAHOUEL 2004). En effet, les flavonodes apportent une protection contre les radicaux libres en empchant leur liaison avec les lipides membranaires de cellules, ce qui se traduit par une diminution du malonyl dialdhyde (Peroxyde lipidique), et en protgeant la composition hmatologique, ceci en permettant une bonne rgnration rythrocytaire et une prvention contre la leucopnie et la thrombopnie observes en prsence des radicaux libres. (LAHOUEL 2004). 11

Les flavonodes ont une capacit capturer et dsactiver les radicaux libres (SIESS 2000, LOPEZ-LAZARO.2000). Cette activit antiradicalaire ncessite : -Une structure orthodiphnolique du cycle B des flavonodes. -Une double liaison en 2-3 conjugue avec la fonction 4-oxo, responsable de la dlocalisation d lectrons. -Les hydroxyles en position 3 et 5 qui permettent une activit antiradicalaire maximale. (LAHOUEL 2004).

1.5- Polyphnols en cosmtique.

Les polyphnols sont des colorants trs importants dans le domaine cosmtique (GOFFART 2002). Leur diversit de couleur (jaune, vert, bleu, rouge, rose.) permet la production d une large gamme de produits de maquillage, savoir les rouges lvres et poudres maquillantes (fars paupires, fars joues..etc). De plus, ces composs sont capables d activer la biosynthse du collagne et de jouer un rle imminent dans la lutte contre laltration de ses fibres, ralentissant de ce fait le vieillissement et permettant le maintien du tonus musculaire. En effet, rendu lipophiles par estrification avec les acides gras, les polyphnols drivs pntrent l'piderme et pigent les radicaux libres (ROULIER 2002, CASTIGNINO 2005). Mais malgr tous les avantages que peuvent fournir les polyphnols dans cette industrie, leur utilisation reste limite en raison de leur instabilit (perte ou changement de couleur, oxydation.) vis--vis des facteurs physicochimiques (temprature, lumire, pH.) et de leur raction avec les autres composs prsents dans les produits cosmtiques. Ceci est notamment le cas des anthocyanes (GOFFART 2002)

2* Flavonoides et tannins : biosynthse et importance: 2.1- Prsentation :

2.1.1- Les flavonodes: L appellation flavonodes rassemble une trs large gamme de composs polyphnoliques. Ce terme est d leur couleur jaune (=flavus, en latin). D ailleurs leur fonctions principales chez les vgtaux semblent tre attribues leur coloration (au del de la chlorophylle, des carotnodes et des btalanes), mme si leur prsence est parfois marque sous forme Leuco . Les flavonoides sont prsents dans toutes les parties des vgtaux suprieurs : racines, tiges, feuilles, fleurs, pollen, fruits, graines, bois certains sont plus spcifiques de certains tissus, 12

ex : les chalcones se trouvent plus frquemment dans les ptales de fleurs. 2.1.1.1-Biosynthse des flavonodes: Les flavonodes possdent un squelette de base 15 atomes de carbones (C) constitus de deux cycles en C 6 (A et B) relis par une chanes en C 3. Leur biosynthse se fait partir d un prcurseur commun : la chalcone (HELLER 1993, GRISBACH 1982). Cette chalcone de couleur jaune est mtabolise sous l action de l enzyme chalcone isomrase en flavanone : naringnine. C est sur cette dernire qu agit ensuite la flavone synthase ou la (2S)- flavanone-3-hydroxylase pour donner les flavones : apignine, dihydroflavonol et (2R-3R)- dihydrokaemphrol respectivement. Les deux enzymes cites fonctionnent diffremment ; la premire introduit la double liaison entre les carbones 2 et 3, tandis que la deuxime catalyse l hydroxylation du C3. Le dihydroflavonol en prsence de la flavonol synthase ou la dihydroflavonol-4- reductase, se mtabolise en flavonol, kaemphsol ou en flavan-3, 4- diol, leucoanthocyanidol respectivement. Ce dernier semble tre le prcurseur des flavan 3-ols et anthocyanidols. Le pelargonidol, sous l action de la 3-O-glycosyl-transfrase se transforme en

anthocyanoside: pelargonidol-3-glucoside (MARFAK 2003). Les composs de chaque groupe se distinguent par le nombre, la position et la nature des substituants (groupements hydroxyles, mthoxyles) sur les deux cycles aromatiques et la chane en C3 intermdiaire. A l tat naturel, on trouve souvent les flavonodes sous forme de glycosides. Une ou plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors glycosyles. La partie du flavonode autre que le sucre est dite : aglycone (MARFAK 2003). (figure 5). 2.1.1.2-Classification : Les principaux groupes de flavonodes peuvent tre dfinis et diffrencis comme suit : Flavones et flavonols : le cycle A de ces deux types de molcules est substitu par deux hydroxyles phnoliques en C 5 et en C 7. Ces hydroxyles peuvent tre libres ou estrifis. D autre part, le cycle B est substitu en C'4 ou di-substitu en C 3 ' et C4 ' par des groupements OH ou mthoxyles (OCH 3). Les flavonols se distinguent des flavones par un OH en C 3. (figures 6, 7).
8 7 6 5 2 1 9 O 2 1 10 3 4 OH 3
O

4 5

O (f i gu r e7 ) : sq u el et t e des f la van ol s

(figu re6 ) : sq Ou el et t e des f la von es

13

3 8 7 6 5 4 1
O

2 2 1 3 6 5

O F l a von es
O

O OH O F la van ol s Is of l a von es

(phnyl benzopyrones)
O O+

OH A n th oc yan id ol s

F la va n on es

(+ sucres = anthocyanosides)
OH
O

O
CH2

Cha l con e s

OH

C a tech in es (F l a van es)

Figure 5 : Schma de biosynthse de diffrentes classes de flavanodes (WAWIZYNIAK 1999-2000).

14

Flavanones et hydroflavonols : se caractrisent par l absence de la double liaison entre C 2 et C3 et par la prsence des centres d asymtrie. Les variations structurales sont de mme nature que celles dcrites dans le paragraphe prcdent. Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l hydroxylation de la position C3 .
8 7 6 5 1 9 O 10 4 2 2 1 3 6 5 3 4

O (figu re8 ) : sq u el et t e de s f la van on es

Flavan-3-ols, flavan-3, 4- diols et anthocyanidols : ces molcules sont toujours hydroxyles en C 3 et se caractrisent par l absence du groupe carboxyle en C 4 . Cette position peut tre libre (flavan-3-ols et anthocyanidols) ou hydroxyle (flavon-3, 4- diols). Les anthocyanosides sont caractrises par l engagement de l OH en C 3 dans une liaison hterosidique. On trouve parmi ces composs, le palargonidol-3, 4-O-glucoside et le cyamidol3-O-rutinose ou keracyanine. Les flavan-3-ols et les flavan-3, 4-diols sont souvent lorigine des polymres flavoniques appels proanthocyanidols ou tannins condenss. (SEIGLER 1998). ( figures 9,8 et 11).
R OH HO HO
O O

OH R OH

R OH

OH

OH

OH (figr e9 ) : sq u ele tt e d es f l avan -3 -ol s

(f igu r e1 0 ) : sq u el et t e des f l avan -3 , 4 -di ol s

OH OH HO O HO OH OH OH O OH O OH HO OH O O

OH OH

melacacidine

peltogynol

mopand

OH

Figure 11 : Melacacidine, un flavon-3, 4 diol, et autres composs relis. (SEIGLER 1998).

15

Chalcones et aurones : les chalcones ont leur noyau pyranique central ouvert et sont constitues par deux units aromatiques relies par une chane tricabone, ctonique, , insature. Le noyau B est assez frquemment non substitu, alors que les substitutions sur le cycle A sont plus souvent identiques celles des autres flavonodes. Les aurones sont caractrises par une structure de 2-benzylidne coumarone. (MARFAK 2003). (figure12).
OH HO OH

OH

(figu re1 2 ) : sq u ele tt e de s ch a lc on es

2.1.1.3-Intrts des flavonodes : Parmi les nombreux avantages de la prsence des flavonodes dans notre alimentation, on cite: -Inhibition des dcharges de l histamine, vitant ainsi la production des leucotrines inflammatoires. -Augmentation de la fluidit des membranes cellulaires. -Rduction des ractions inflammatoires et des allergies. -Rles antiviraux, antitumoraux, anticancreux. -Renforcement du tonus et de l lasticit des veines, surtout la diosmine et l hespridine qui amliorent la circulation priphrique, la rsistance capillaire et la permabilit vasculaire. -Diminution des symptmes de mnopause comme les bouffes de chaleur et la scheresse vaginale .Ce rle a t observ surtout pour les isoflavones du soja. (NUTRANEWS 2005. JOURNAL OF UROLOGY 2002). 2.1.2- Les tannins : Les tannins sont des composs phnoliques trs abondants chez les angiospermes, les gymnospermes (tannins condenss) et les dicotyldones (tannins hydrolysables) (SEIGLER 1998). Ces composs ont la capacit de se combiner et de prcipiter les protines. Ces combinaisons varient d une protine une autre selon les degrs d affinits (BLYTT et al. 1988, HAGERMAN 1989, HARBORN 1989, MOLE et WATERMAN 1987). Le terme tannin vient de la source de tannins utilise pour le tannage des peaux d animaux en cuir. (DICTIONARY AND ENCYCLOPEDIA 2005). Dans ce processus, les molcules de tannins se lient aux protines par des liaisons rsistantes aux attaques fongiques et 16

bactriennes. Le poids molculaire des tannins varie entre 500 et 2000 K Da (3000 pour les structures les plus complexes). (HAGERMAN ET BUTTLER 1981). Dans notre alimentation, lastringence est la qualit organoleptique qui indique la prsence des tannins. Elle a un rle important dans le choix des aliments (corrlation inverse entre les espces vgtales choisies et leur teneur en tannins) (MITJAVILA 1980). 2.1.2.1-Types et structures : Selon la structure, on a deux types de tannins : les tannins hydrolysables et les tannins condenss, dits aussi : proanthocyanidines. a/ Les tannins hydrolysables : sont forms par liaison de plusieurs acides galliques un carbonhydrate (gnralement le glucose). On parle de gallotannins. Aussi des units gallo yles peuvent tre ajoutes par liaisons esters, gnralement en position C3 de l acide gallique. Et les units d acide gallique voisines s accouplent formant les esters d acide hexahydroxydiphnique, dits : ellagitannins. Ces deux groupes, les gallotannins et les ellagitannins sont appels tannins hydrolysables. Comme leur nom l indique, ces composs peuvent tre dgrads en fragments simples (acides phnols et sucres ). L acide gallique provient de la -oxydation des composs C 6-C 3, comme l acide coumarique ou les acides oxygns correspondants. Mais, l acide shikimique est considr comme le meilleur prcurseur. (SEIGLER 1998). (figure 13). b/ Les tannins condenss : ce sont des proanthocyanidines , composs phnoliques htrognes: dimres, oligomres ou polymres du flavanes, flavan-3-ols, 5-flavanols, 5-deoxy-3-flavanols et flavan-3,4-diols (BUFFNOIR 1998). Ces composs ont tous comme prcurseur des flavonodes C 6 -C 3 -C 6 , et diffrent entre eux par le type de liaison, les monomres de flavonodes impliqus, la position strochimique des carbones 2, 3 et 4, les hydroxylations et la prsence ou non de substituants comme l acide gallique. Les deux groupes majeurs des proanthocyanidines sont les procyanidines et les

prodelphinidines. Les monomres constitutifs des procyanidines sont la catchine et l picatchine qui peuvent tre substitues par l acide gallique ou des sucres, gnralement en position 3 ou plus rarement en position 7. Ces monomres de prodelphinidines sont la gallocatchine et lpigallocatchine, mais on distingue galement des monomres de querctine et de myrictine. (BUFFNOIR 1998).

17

O HO

G = galloyl
HO OH OG
4 6

OH OH HO OH HO

O OG OG H HO OO

GO GO

- penta-O-galloyl-D-glucose liaison des groupes 4 et 6 galloyl

6

C - G = hexahydroxydiphenoyl

G G

O O
4

G O OG OG H G

O O
4

O OH OG H GO

GO

telemagrandine II, eugeniine liaison des groupes 2 et 3 galloyl

G G O
6

tlemagrandine I

G O
2

O
4 3

O O
4 3

G OG H

O
2

OH H

G O G

G O G

casuarictine

peduncudagine

G G

O O
4 3

O
2

H OG

G O G

potentilline

Figure 13 : Ellagitamnius forms par simple liaison des groupes galloyl. (SEIGLER 1998).

18

En s hydrolysant, les tannins condenss ne donnent pas de composs simples comme le glucose ou les acides phnols comme c est le cas pour les tannins hydrolysables, mais plutt des anthocyanidines. (BUFFNOIR 1998).

R OH HO O HO O
8 4

R OH

R OH

OH

3 and 5OH, 3-OH

flavanone R = H or OH
OH

n
HO OH

NADPH
R OH HO O OH OH OH OH HO R HO O
8 4

HO

O
4

R OH HO OH

NADPH

R OH HO

n=08 ou plus
OH

3,4-cis-diol reductases

NADPH
R OH HO O
8

R OH

HO

O OH OH

HO R

oligomres

flavan-3-ols

Figure 14 : proposition pour la biosynthse des oligomres de procyanidines. (SEIGLER 1998).

19

2.1.2.2-Proprits pharmacologiques des tannins : Plusieurs observations, chez les humains comme chez les animaux de laboratoires suggrent que les tannins exhibent un large spectre de proprits pharmaceutiques, thrapeutiques et chimioprotectrices dues leur proprit antiradicalaire (TOHGE 2005). En effet, les tannins protgent contre les toxicits induites par diffrents agents (hydrogne peroxyde, actaminophne, extraits contenus dans la fums du tabac), contre l hypercholestrolmie et les changements de la formule sanguine (ALT, BUN et CK). (CHARUVANKY 2004). Ils jouent aussi un rle dans la prvention contre les deux formes de mort cellulaire connues ; apoptose et ncrose, diminuant ainsi les dommages causs dans le DNA lors de ces 2 dernires. L action cytoprotectrice des proanthocyanidines est suprieure celle des vitamines C, B et btacarotne (RAY 2000).

2.2- Flavonoides et tannins comme antimicrobiens :

2.2.1-Activit antimicrobienne des flavonoides. 2.2.1.1- Activit antibactrienne des flavonoides : Une activit antibactrienne est connue pour les flavonoides. En effet, ils sont capables d inhiber la croissance de diffrents types de bactries : Sta phylococcus aureus (BABAYI 2004 ), Escher ichia coli (ULANOWSKA 2006) , Enterococcus feaca lis, Enteroba cter

cloa ceae, Heliotropium sinua tum, Proteus mira bilis (MODAK 2001, OKIGBO 2005, MAMATHA 2005, DIDRAK 1999). Chaque compos agit spcifiquement sur un ou plusieurs germes. Ex :l apignine ne

montre une faible activit que contre S.aur eus et la galangine une activit seulement contre cette mme espce (CUSHNIE 2003, BASILE 1999, MARTINI 2004). Aussi dans certains travaux, il est cit que les flavonoides extraits avec du mthanol 95% sont actifs sur certaines bactries, alors que ceux extraits avec du mthanol 60% de la mme plante ne le sont pas, comme c est le cas des flavonoides de Linum capita tum contre S.aur eus .( SLAVICA et al. 2004) La diffusion radiale est souvent utilise pour mettre en vidence cette activit, mais la mesure par le biais de cette mthode demeure difficile du fait que les zones sont parfois diffusionnelles (ILIC et al. 2004).

20

2.2.1.2-Activit antifongique des flavonoides : Comme la majorit des polyphnols, les flavonodes ont une activit antifongique trs puissante. L une des plus rcentes tudes sur cette activit est celle de ORTURNO (2005), qui dmontre l activit des flavanones glycosides et des polymthoxyflavones de Cirtus pa rasidi de Cir tus sinensis sur Penicillium digita tum. En effet, la naringinine, l hespridine, la nobiltine, la simensetine et la tangertine extraites de ces deux espces de Cir tus servent protger ces dernires contre les attaques de P. digita tum. (ORTURNO 2005). Aussi, les flavonodes de Conyza aegyptica L. ont une action fongicide et fongistatique sur diffrents agents de mycoses : Microsporum ca nis, M. gypseum, Tr ichophyton

mentagrophytes, Candida zeylanodes . (BATAWITA 2002). D autres flavonodes extraits de la poudre des inflorescences mles de Bora ssus dethiopum ont une activit contre des dermatophytes comme T. r ubrun grce des fractions flavoniques (GUANON 2003). 2.2.2- Activit antimicrobienne des tannins. 2.2.2.1- Activit antibactrienne des tannins : Les tannins ont une action antibactrienne puissante leur permettant d inhiber la croissance des bactries ruminales (dont certaines sont sporognes) comme Clostr idium a minophilum, Butyvibrio fibrisolvans, C.proteocla sterium (LEITAO 2005, CHATTERJEE et al. 2004), Ainsi que les bactries responsables de diffrentes infections chez l homme : E.coli, S.a ureus, Helicobacter pylori, Pr oteus mira bilis. L inhibition bactrienne par les tannins est dpendante de la structure et du degr de polymrisation de ces derniers, mais ceci n est pas toujours le cas (SIVAKUMARAN 2004). 2.2.2.2- Activit antifongique des tannins : Les tannins condenss comme les hydrolysables, ont une action inhibitrice contre les moisissures et les levures. Comme exemple, on a les proanthocyanidines du th qui ont montr un rle dans la protection de cette plante contre Exoba sidium vexans (PUNYASIRI 2005), et les tannins hydrolysables des diffrentes plantes qui agissent contre une large gamme de champignons filamenteux ( Epidermophyton floccosum, Microsporum cassis, Trichophyton rubrun, Penicillium ita licum, Aspergillus fumiga tus,) et de levures opportunistes ( Candida a lbicans, C. glabra ta , Cr yptococcus noformans ) (LATTE 2000). Cette action antifongique est couramment utilise pendant les oprations oenologiques lors de la manufacture des vins car les tannins polaires de ces derniers ont une grande capacit se 21

fixer sur les champignons nfastes. (MAZANRIC 2005).

2.3- Dsagrments causs par l ingestion des tannins

2.3.1- Inhibition des enzymes digestives : Les tannins sont capables de se lier aux enzymes digestives et de les inhiber. Plusieurs de ces polyphnols ont une action sur l -amylase (KANDRA 2004), l -glucosidase (DOUGALL 2005), les protases (KICISKO 2004), la trypsine et les hmagglutinines (GILANI 2005, DE MEJIA 2005). L inhibition de ces enzymes cause un trouble de l activit du tube digestif et diminue la valeur nutritive des aliments ingrs qui ne pourront pas tre assimils. Deux extraits du sorgho et du mil chandelle ne prsentent aucune activit inhibitrice contre l -amylase, alors que d autres varits du sorgho, de mil chandelles, de millet des oiseaux et d leusine prsentent une activit apprciable ; ce qui indique que cette activit inhibitrice des enzymes digestives est propre seulement certains composs phnoliques. (ONUAA. 1995). 2.3.2- Effets antinutritionnels des tannins : Les tannins ont une grande capacit se lier d autres molcules prsentes dans l alimentation : polysaccharides (pectines, xyloglucon, amidon, cellulose.. (LE

BOUVERLLEC 2005, EUZEBY 2002), minraux (fer, argent. (CHAPLIN 1985)), vitamines, alcalodes . ( MITJAYILA 1980), mais surtout aux protines (ZIMMER 1996, MERGHEM 1996). Plusieurs tudes in vitro ont t menes sur cette action. Principalement par la diffusion radiale (HAGERMAN 1987) qui a dmontr que les proanthocyanidines naturels ainsi qu industriels (comme le quebracho) se liaient aux diffrents composs protiques et glucidiques. La BSA (bovin serum albumin), le gluten, l alpha-amylase et la btagalactosidase sont les principales protines utilises, et l amidon ainsi que la pectine les principaux polysaccharides (GEDIR 2005). Ces liaisons dpendent de plusieurs facteurs lis au milieu, la structure des molcules combinantes (exemple : l importance de la proline dans la structure des protines) (ZIMMER 1996), comme la nature hydrophile ou hydrophobe impliqus (ZHANG et al. 2002). Il a t dmontr que la liaison des protines aux tannins dans le rumen cause une diminution et la concentration des tannins

22

de la dgradation et de lassimilation de ces protines ce qui cause une perte de la valeur nutritive des aliments et provoque une malnutrition. A long terme, la grande teneur en tannins de l alimentation cause chez les ruminants une perturbation de la microflore du rumen (et donc de son activit), une limitation de l absorption du nitrogne, une diminution de l ingestion et mme une toxicit. Chez certains animaux, la prsence de microorganismes gastrointestinaux ayant une capacit dgrader les tannins limite ces effets nfastes (c'est le cas de: Str eptococcus ga llolytians, Lonepinella koa la rum, Selemomona rumina ntium ) (ZIMMER 1996, GOEL 2005, EUZEBY 2002). En ralit, ces microorganismes possdent une enzyme dite: tannase. Les effets antinutritionnels ont t observs aussi chez les rats, les poussins et le btail. En effet, on a remarqu qu une alimentation teneur leve en tannins a un effet ngatif sur la digestibilit des protines et des hydrates de carbone, et rduit la croissance, l efficacit de l alimentation, lnergie mtabolisable et la disponibilit biologique des acides amins. (GILANI et al. 2005, ONUAA 1995). La plante qui a permis de raliser une grande partie de ces recherches est le sorgho brun. Etant riche en tannins, ses graines ont montr une rsistance contre les oiseaux dvastateurs et les moisissures. Au cours de la maturation, la graine du sorgho brun devient trs astringente; cette qualit organoleptique est importante dans les rgions arides et semi-arides o les autres cultures chouent (ONUAA 1995). 2.3.3-Prsentation de la tannase : La tannase ou tannin-acyl- hydrolase, E.C (3.1.1.20), est une enzyme permettant la dgradation des tannins, qu'ils soient le K laugmente. Elle est efficace sur un large intervalle de temprature et de pH ce qui permet son utilisation dans plusieurs processus industriels (SABU 2004). La tannase n est produite que par un nombre restreint de micoorganismes (bactries, moisissures, levures). Actuellement, plusieurs travaux portent sur sa production et sa purification fin de pouvoir l utiliser dans 23 le domaine alimentaire. A cet effet, les condenss ou hydrolysables. Elle est optimale 40C,pH=6 et aprs 15 minutes dincubation. Les ions mtalliques comme le Zn, Mn, Cu, Mg, Fe inhibent son activit, seul

moisissures, tant trs disponibles et faciles cultiver, sont utilises ; surtout les espces d Aspergillus, Penicillium et Fusarium. (SABU 2004, MAKAPATRA 2005, PINTO 2001). Les aspergilles sont considres comme les meilleurs producteurs de tannase (ALBERTSE 2002)

3* Rosmarinus officinalis et Vicia faba L. comme source de polyphnols : 3.1- Prsentation et description :
3.1.1- Le romarin : Rosmarinus officinalis : Le romarin est un arbrisseau de la famille des labies (lamiaces), poussant l tat sauvage sur le pourtour mditerranen, en particulier sur sol calcaire. Il possde de nombreuses vertus phytothrapiques et est aussi une herbe condimentaire et une plante mellifre, ainsi qu un produit utilis en parfumerie. (WIKIPEDIA 2001). Son nom signifie en latin Rose de mer ; ros = rose et marinus : = marin. Description : Le romarin peut atteindre jusqu 1,50m de hauteur. Il est facilement reconnaissable en toute saison par ses feuilles persistantes sans ptioles, coriaces, plus longues que larges, vert sombre luisant sur le dessus et blanchtres sur le dessous. Leur odeur, trs camphre, voque l encens. La floraison commence en fvrier et se poursuit jusqu en juin. La couleur des fleurs varie du bleu ple au violet (rarement on trouve des fleurs blanches, ex : R.officina lis a lbiflorus ). Comme pour la plupart des lamiaces le fruit est un tetrakne (de couleur brune). (WIKIPEDIA 2001). 3.1.2- La fve : Vicia faba L. : La fve est une lgumineuse de la famille des fabaces. Les formes arborescentes prdominent dans les pays chauds et les formes herbaces dans les rgions tempres. Cette espce s accommode de tous les sols (sauf ceux trop secs), de prfrence argilo-calcaires, profonds et frais. C est une plante mditerranenne. Description : Les tiges sont simples, creuses, carres et dresses, tandis que ses feuilles sont composes, ovales, charnues, vert ple grises. Les fleurs sont de couleur blanche tachete de noir ou de violet. Elles se disposent en petites grappes l aisselle des feuilles. Cette espce est cultive pour ses graines renfermes dans des gousses charnues, vertes puis noires maturit. Les graines sont grosses, aplaties et jauntres. 24

Cest lune des plantes les plus anciennement cultives, haute de 30cm 1m suivant les varits. Elle ne se trouve pas l tat sauvage.

3.2- Diverses utilisations :

3.2.1- Diverses utilisations du romarin : -Cuisine : Le romarin est un aromate apprci, aux utilisations culinaires diverses. On l emploie dans les ragots et les civets, les soupes, les marinades, sur les grillades sous forme de feuilles sches. On s en sert aussi pour parfumer les flans et les confitures. Mais, la crme de romarin reste de loin la forme la plus utilise. -Phytothrapie : Le romarin est rput pour activer et faciliter les fonctions digestives, en particulier le travail de la vsicule biliaire (il est cholagogue, facilitant lvacuation de la bile). Il est galement antispasmodique, et son action stimulante sur le systme nerveux permet de le recommander pour traiter les divers cas d asthnie. Ces proprits phytothrapeutiques sont contenues dans les feuilles et les extrmits florales. -Parfumerie : l utilisation du romarin en parfumerie est trs ancienne. L essence est obtenue par distillation des feuilles des sommits fleuries. Cette plante est surtout utilise dans la composition des parfums masculins. (WIKIPEDIA 2001, RODZOKO 1999-2000). 3.2.2- Utilisation de la fve : La principale utilisation de Vicia fa ba L est alimentaire : les fves se consomment crues, dans ce cas les gousses sont cueillies demi-maturit, ou se conservent sec, et l les gousses se rcoltent quand elles sont noires. Si la cuisson est insuffisante ou la consommation est excessive, cette plante provoque de graves affections, en raison des substances toxiques qu elle contient (RENAUD et DUDONET 1996).

3.3- Constituants actifs :

3.3.1- Constituants de R.officinalis : *Huile essentielle : 1,8 cinole, alpha-pinne, camphre de romarin. La constitution de l huile essentielle varie selon la phase de dveloppement et lorigine des feuilles utilises pour l extraction. *Diterpnes : acide carnosolique, rosmadial. *Triterpnes et sterodes : acide alanolique, acide ursotique. *Lipides : n-alkanes, isolalkanes, alknes.

25

3.3.2- Constituants de V.vicia L: La fve est essentiellement alimentaire, renfermant des acides amins ncessaires et que l on ne trouve pas dans les crales. Elle contient aussi des vitamines, ex : C, PP, B1, B2, A, E et divers minraux dont le calcium, le cuivre, le fer, le magnsium Toutes ces proprits lui confrent des fonctions diurtiques, nergtiques, expectorantes, nutritives, reconstituantes et toniques.

3.3-Les polyphnols de R.officinalis et de V.vicia L.:

3.3.1- Acides phnols et flavonoides de R.officinalis : * Acides phnols : principalement l acide carnosique, carnosol, acide rosmarinique. Ils ont une grande action antimicrobienne qui change d une varit une autre du romarin.

Ce qui tmoigne du changement de la teneur en polyphnols. (MORENO 2006). * Flavonodes : Cette plante est trs riche en flavonoides, dont 07 sont principaux : lutoline (03 structures connues : 3 -0-bta -D-glucuronide,3 -0-(4 -0-acyl)-btaD-glucuronide, 3 -0-(3 -0-acyl)-bta- D-glucuronide), riocitrine, hespiridine, diosmine, isoscutellarin7-0-glucoside, hispidulin7-0-glucoside, genkwanine. Ces composs sont localiss dans les feuilles, les fleurs, les racines et les tiges. Leur concentration change durant l volution de la plante. La lutoline3-0-bta-D-glucuronide qui a t longuement tudie montre un pic de concentration aux environs de juin- aot. Ceci indique qu il y a une relation entre les phyto-rgulateurs et les flavonoides (DEL BANO et al. 2004, OKAMURA 1994) 3.3.2-Tannins de V. faba L. : Les tannins de Vivia fa ba L. sont en majorit localiss dans les tguments des graines. Des tudes ont montr la prsence de deux types principaux: -Des molcules de flavan-3-ols : (+)-catchine, (-)-picatchine, (+)-gallocatchine, (-)-pigallocatchine (MERGHEM 2004). -Des molcules leucodelphinidine. La nature des tannins de V.fa ba L. varie selon les varits de l'espce, sa maturit, sa localisation et ses conditions de croissance (UNUP 1986, DIXON 2005). de flavan-3,4-diols : Principalement la leucocyanidine et la

26

Partie 02 : Mthodes et applications :

1*Partie phytochimique : 1.1-Extraction des flavanodes :

Des ext rmit s fleur ies de Rosma r inus officina lis ont t cueillies en mai 2005 d e l u niversit de Const ant ine. Classificat ion classique du romar in: Rg ne: P lant ae. Div isio n: Magno liophyt a. Classe: Magno liopsida. Ordre: Lamia les. Famille: Lamiaceae. Genre: Rosma r inus Espce: Rosma r inus officina lis . Classificat ion phylognt ique: Ordre: Lamia les. Famille: Lamiaceae. Les flavano des sont ext rait s de ce vgt al sch et bro y (250g), par macrat io n dans u n mlange t hano l/ eau (80/20 : V/ V) quivalent 2400ml. Cet t e macrat io n se fait en t rois t emps, c'est --dire pendant t rois jour s successifs avec changement du so lvant chaque 24h (2400=800 x 3). Ceci pour per met t re une me illeure ext ract io n des co mposs flavo niques. Le volume total de ces macrations hydroalcooliques est filtr puis vapor sec sous agitation et chauffage rduit 35C (lthanol est trs volatil) dans un rotavapor. Le rsidu sec est repris dans 200ml deau distille bouillante qui aide la rcupration des composs rests accols aux parois du ballon dvaporation. Une d cant at ion de 24h est ncessaire pour liminer les boues, graisses et rsines r isquant de gner la suit e des oprat io ns, et rcuprer une phase aqueuse limpide.

1.2-Extraction des tannins :

Le mat r iel vgt al ici est les t gument s de graines de Vicia fa ba L. Seville cueilli en 2000,schs et bro ys finement . Classificat ion classique de la fve: Rg ne: P lant ae. Div isio n: Magno liophyt a. 1

Classe: Magno liopsida Ordre: Fabales. Famille: Fabaceae. Genre: Vicia L. Espce: Vicia fa ba L. Classificat ion phylognt ique: Ordre: Fabales. Famille: Fabaceae Les graines sont de couleur marron. L ext ract io n des t annins part ir de 30g de t gument s se fait avec un so lvant act o ne/eau (70/30 : V/V) de 350ml, en t rois macrat ions successives de 24 h chacu ne. On ajo ut e au so lvant , avant chaque macrat io n, 8ml d une so lut ion d e mt abisu lfit e de sodium (0.2%) pour vit er l o xydat io n des t annins. Le so lvant est ensuit e filt r avec du papier wat t man et vapor sec d ans l vapo rat eur rot at if (rot avapor). Ce rsidu sec est repr is dans 300ml d eau bo u illant e. Apr s u ne dcant at io n de t out e une nuit , on rcupre la phase limpide dgage d es pro du it s impur s.

1.3-Affrontements :partitions entre solvants :

Cet t e t ape per met de sparer les po lyphno ls selo n leur st ruct ure et leur degr de polymr isat ion ; en les affro nt ant avec plusieur s so lvant s allant du mo ins po lair e au p lus po lair e : -Affrontement avec l th er du pt role : per met d ext raire les impuret s

(co mpo ss non phno liques). Surt out les lip ides qu i r isquent de co mpliquer le s preu ves chro mat ographiques. -Affrontement avec l ther dithyliqu e : pour les ext rait s t hano liques, cet t e t ape per met d iso ler (de sout ir er) les co mposs phno liques simples t els que les acides p hno ls et les flavo nes lipophiles. Pour les ext rait s act oniques, elle sout ir e les t annins mo no mr iques. -Affrontement avec l actate d thyle : ent rane les aglyco nes, les mo no -Og lyco sides et part ielle ment les di- O- glyco sides prsent s dans les ext rait s

t hano liq ues. Et les t annins dimr iques des ext rait s act oniques.

-Affrontement avec le butanone (mt hyl-thyl- ctone (MEC)) et le butano l : cet t e t ape n est fait e que pour les ext rait s act oniques, per met t ant ainsi d ent raner les t annins t r imr iques, o ligomr iques et une part ie des po lymr iques. Ces affro nt ement s se fo nt dans des ampoules dcant er. La phase aqueuse et le so lvant (V/V) sont mlangs nerg iquement en laissant sort ir chaque fo is les gaz pro du it s. Apr s u n repos d une heure et demie, on rcupre sparment la phase eau et le so lvant ut ilis charg de ses co mpo ss spcifiques. Po ur chaqu e so lvant (chaque part it io n), on refa it deux t rois fo is cet t e oprat io n pour un ent ranement opt imal des groupes polyphno liques spars. Les p hases t her de pt role ne r enfer mant pas de co mposs phno liques so nt rejet es. Quant aux aut res phases, elles sont vapores sec avec le rot avap et

repr ises dans du mt hano l (4 5ml) pour le diagnost ic chro mat ographique. On prend aussi 4 5ml des phases aqueuses rest ant es (aprs plusieur s lavag es) cont enant les flavo no des et les t annins non ent rans. (Figure 15).

1.4-Chromatographie sur couche mince (CCM) :

La chro mat ographie sur couche mince est une mt hode facile met t re en u vre. E lle do nne l avant age de ncessit er peu de mat r iel et de fournir des rsu lt at s facilement int erprt ables et t oujours t rs reproduct ibles. (X. Bat aille 2000). A l o r ig ine, la CCM a t ut ilise pour la sparat ion des subst ances co lores (d o son no m). Aujourd hui, elle est co nsidre co mme une mt hode puissant e pour les analyses qualit at ives et quant it at ives. Au ssi, p er met -elle de suivre l vo lut ion d une ract io n et de t est er la puret d u n so lvant (V. Delme yda 2001). 1.4.1-Principe de la CCM : La sparat io n des const it uant s du dpt se fait l aide de deux phases : une p hase mo bile qu i est un so lvant ou un mlange de so lvant s. Et une phase st at io nnaire qu i est un ad so rbant maint enu sur une plaque de verre ou de plast ique r igide. L chant illo n analyser do it se t rouver dans un so lvant vo lat il (dans not re cas : le mt hano l). Le dpt se fait alors sur une ext rmit de la phase st at io nnaire. Les co nst it uant s de l chant illo n sont alors lus (ent rans) par la phase mo b ile qui mo nt e par capillar it ver s le haut de la plaque. (V. Delmeyda 2001).

Vgtal rejet Filtre

Matriel vgtal coup finement

3 macrations successives (Ethanol/eau : 8 / 2, ou Actone/eau 7 / 3)

Filtration des extraits runis

Evaporateur sec

Reprise avec 200ml dH2O

Dcantation

Phase limpide

Phase rejete

Affrontement lEther de ptrole Affrontement lEther diethylique Affrontement lactate dthyle

Solvant daffrontement Phase aqueuse

Affrontements

Evaporateur sec

Affrontement au butanone (seulement pour les tannins Phase aqueuse

Reprise dans 4 5ml de mthanol

4 5ml (metOH)

Phase butanone

Phase Actate dthyle

Phase Ether diethylique

Phase H2O

Fig ure 1 5 : Pr otocole d extr action des f lavonodes et tannins

1.4.2-Mode opratoi re : -Prpa ration de la phase stationnai re : Po ur la CCM des flavo no des, on ut ilise un gel de po lyamide DC6. (Le po lya mide fo r me des lia iso ns H avec les OH phno liques des flavo no des, grce ses fo nct io ns car bonyl-amide (GNU. 2006). Le gel est prpar en mlangeant 10g d e poudre de po lya mide dans 50ml d t hano l. Aprs t alement du gel sur les plaques en verre et schage, la phase st at ionna ir e devient prt e l ut ilisat ion. Po ur la CCM des t annins, on prpare un gel de silice en m langeant la poudre de silice avec d eau dist ille (30g/60ml). Le dosage se fait ici par t t onnement . Aprs t alement du gel sur les plaques en verr e et schage, ces der nires do ivent t re act ives par chauffage dans une t uve 100 C pendant 1 heure. La silice est un adsorbant fort qui ret ient les co mposs po lair es. -Choix de la phase mobi le (systmes solvants app rop ri s) : On essaie p lusieur s s yst mes so lvant s et on cho isit ceux qui do nnent les me illeur es spar at io ns ( migr at ions). a/ Les syst mes essays : -Po ur le su pport de polya mide : To lune / Mt hylt hylct one / Mt hano l : 4 / 3 / 3. To lune / Et hano l / Mt hano l: 4 / 3 / 3. To lune / Mt hylt hylct one / Et hano l : 2 / 1 / 1 To lune / Mt hylt hylct one / Mt hano l / Et her de pt ro le : 6 / 1 / 1 / 1. H2O/ Mt hylt hylct one / Mt hano l / Act ylct one : 12 / 3 / 3 / 1. - Po ur le support de silice : To lune / Act one / Acide for mique : 6 / 1 / 1. Act o ne / H2O : 55 / 45.

b/ Les syst mes cho isis : - Po ur le support de polyamide : To lune / Mt hylt hylct one / Et hano l /E t her de pt role : 2 / 1 / 1 / 1. Ce mlange de so lvant s est ut ilise pour la phase Et her dit hylique et la p hase Act at e d t hyle. H2O / Et hano l / Met hylet hylct one / Acide act ique : 13 / 3 / 3 / 1. Pour la phase eau. - Po ur le support de silice : To lune / Act one / Acide for mique : 6 / 6 / 1. Pour tout es les phases . 5

-Le dpt : Le d p t se fait linair ement de faon ponct uelle avec un capillaire (pipet t e cap illair e) usage unique (un cap illaire pour chaque phase). Le capilla ire do it t re po s perpend iculairement et prudemment sur la plaque pour ne pas grat t er le gel. On fait p lusieurs dpt s du m me chant illo n au mme endro it pour obt enir les pro du it s spars en grande quant it (ceci est ncessaire surt out lors de la CCM prparat ive). I l faut scher aprs chaque dpt avec un sche cheveux, p ar

exemp le. ( Figure 16).

Capillaire Plaque Dpts Ligne de dpt Dpt perpendiculaire

Fig ure 1 6 : D p t p our une CCM

- Dveloppement des p laques : Les p laques sont places dans la cuve de CCM, quand cet t e dernire est sat ure e n vapeur de so lvant d lut io n. Le bo rd de la plaque o a t effect u le dpt est t remp dans un fond du so lvant appro pr i, en prenant so in d vit er t out cont act ent re le dpt de l chant illo n et le mlange d e so lvant . Les d iffr ent s const it uant s de l chant illo n dpos migr ent avec des vit esses d iffrent es. Dans le cas idal, on obt ient aut ant de t ches que les const it uant s sur le t rajet de migrat ion du so lvant . (Figure 17).

Plaque de CCM

Vapeurs de solvant

Papier filtre

Solvant luant

Figure 17 : Cuve de CCM

- Visua li sation des tch es : -La visualisat ion se fait : -A l il nu. -Avec u n ract if spcifique de co lorat ion (Ex : vanilline). -Avec u ne lampe UV (254 et /ou 365nm) -En ut ilisant des plaques cont enant un mat r iau fluorescent (ex : s ilicat e de zin c act iv en manganse) et visualisat io n l aide de l UV : les const it uant s d e l chant illo n dsact ivent la fluorescence et deviennent de ce fa it facile ment dt ect ables. Dans no t re travail, la visualisat ion des t ches ( spot s) se fait sous UV 254 et /o u 365 nm dans une chambre no ire. Po ur les t annins, on fait aussi une rvlat io n des plaques analyt iques avec de la vanilline/ HCI et un chauffage 80 C pendant 30min. 1.4.3-Premire tape dan s l id entifi cation des flavanodes : Les spo t s flavo niques reprsent ant les const it uant s (du dpt ) spars so nt caract r iss par leur fluorescence ( couleur) sous UV et leur fact eur de rt ent io n (Rf). (Figur e 18)

migration Dpt

Tches avec diffrents Rf et diffrentes couleurs

Fig ure 1 8 : CCM analyt iqu e

- Relation : st ru ctu re flu orescence : L examen sous lumire ult ra- vio let t e fournit des infor mat io ns t rs import ant es sur la co nfig urat ion st ruct urale des mo lcules iso les. I l apport e des indicat io ns part icu lir es co ncer nant les subst it ut io ns. Le t ableau suivant rsume les relat io ns exist ant ent re la st ruct ure d un co mpo s flavo nique et sa fluorescence sous UV.

Spots co lo rs No ir

Types de flavonodes flavvo no ls 5, 6, 7 t ri - OH libres flavo no ls 5, 7, 8 t ri OH libres

Bru n no ir Vio let

3-OH absent ou 3-OH subst it u flavo nes 5-OH et 4 OH 7

flavo nes 3-OR et 5-OH, 4 OH flavo nes ou flavo no ls 5 OH avec 4 OH absent o u subst it u en 3 flavo nes 6- ou 8-OH Chalco nes, iso flavo nes, dihydro flavo no ls, flavono nes Bleu cla ir ( fluorescent ) flavo nes sans 5 - OH libr e flavo no ls sans 5 OH libres avec 3-OH subst it u Jau ne t erne, jaune orang flavo no ls 3 -OH libre avec ou sans 5 -OH subst it u Jau ne vert br illant Jau ne fluo rescent Jau ne ple 5 OH libr e ou 5 OH subst it u flavo no ls avec 3 OH libr e Dihydro flavono ls

Tablea u 1 : Relat ion entr e la flu or es cence et la str uctur e des f lavonodes (La hou el. 2005).

- Relation : st ructu re Rf : les relat io ns exist ant ent re le Rf et la st ruct ure des mo lcules apport ent aussi des renseig nement s sur la st ruct ure des po lyphno ls. Le co mport ement

chro mat o graphique en fo nct io n de la composit io n mo lculaire dans un so lvant alco o liq ue o u aqueux per met de ment io nner les premir es ind icat io ns concer nant la subst it ut io n de sque let t e de la mo lcule.
Distance entre lorigine (le dpt) et la tche du produit = Distance entre lorigine (le dpt) et le front du solvant

Rf =

A B

Front du solvant

A B

Ligne de dpt

Structure flavonique Augmentation des OH Glycosylation

Rf (rapport frontal facteur de rtention) Diminution du Rf dans un solvant lipophile Rf augmente dans un solvant aqueux Rf diminue dans un solvant alcoolique.

Hydroxyles mthyls Methylation d un OH en C 5

Rf augmente dans un solvant alcoolique Rf diminue dans un solvant alcoolique

Meterosides de flavones avec 3 OH libre Rf nul dans l eau

Tablea u 2 : Relation entr e le Rf et la str uctur e. ( A. Yaou 2001 ).

1.5- Chromatographie sur couche mince prparative :

E lle per met la spar at ion d une grande quant it de po lyphno ls afin de raliser d es t udes sp ect rales (spect roscopie IR, UV, spect romt r ie de masse). E lle se fait sur des plaques de CCM de 20x20c m. Le dpt se fa it le lo ng des p laques . Po ur chaque phase, on prpare 05 plaques. La migr at io n est ralise avec les m mes syst mes so lvant s que pour la CCM analyt iq ue (CCM prcdent e). Les po lyp hno ls spars se prsent ent alors, sous UV, sous for me de band es cont inues et parallles allant d une ext rmit de la plaque l aut re. (Figur e 19).

Plaque 20x20

migration Dpt

Constituants spars Dpt

Fig ure 1 9 : CCM pr par ative

Quand u ne t che est bien lo calise sur la plaque, on grat t e le gel son niveau et o n le d isso ut dans du mt hano l afin de sparer la t che du gel.

1.6-Filtration des solutions du gel :

La filt rat io n des so lut io ns mt hano liques des part ies du gel grat t es per met de spar er les po lyphno ls de ces der nires sur lesquelles elles se sont absorbes lo r s de la migr at ion du s yst me so lvant . Les so lut io ns de gel so nt mises dans des ser ingues relies des filt res. Ces dern iers ret iennent le gel en laissant passer le mt hano l charg des po lyphno ls spar s. Les so lut io ns mt hano liques obt enues alors sont prt es pour les sr ies spect rales ( id ent ificat ion spect rale). (Figure 20) 9

Seringue Gel gratt dans le mthanol

Filtre

Tube de rcupration Mthanol charg de polyphnols

Fig ure 2 0 : Syst me de f iltr ation

1.7-Spectrophotomtrie UV-visible :
L u lt ravio let (UV) ut ilisable en analyse s t end de 190 400nm, et le Vis ib le (Vis) de 400 800nm enviro n. (V. Delweyda 2000). 1.7.1- Dfinition de la Spect rophotomtri e : C est u ne explo it at io n quant it at ive et qualit at ive des int eract io ns pouvant exist er ent re une mat ire (at omes, io ns, mo lcules) et les rayo nnement s UV-Vis qu i la t raversent . Cet t e int eract io n est , plus exact ement , l absorpt io n des rayo nnement s par les mat ires t udies. (V. Delwe yda 2000). 1.7.2- Prin cipe : Quand u n faisceau lu mineux t raver se une so lut ion co lore avec une subst ance doser, la so lut ion absorbe la lumir e de couleur co mpl ment air e la sienne. La var iat io n de l int ensit lumineuse produit e alors nous per met de mesurer la co ncent rat io n selo n la lo i de Beer- Lamber t : DO = .e.c ,sachant que :

DO = Abs = log I 0 /I DO : Densit opt ique Abs : Ar bo rescence Io : Int ensit de la lumir e incident e : 100% I : Int ensit de la lumir e mergent e : % de I o . 10

e : Epaisseur de la cuve (en cm) c : Co ncent rat ion de la so lut ion en mo le/e. : Co effic ient d absorpt io n mo lcu la ire spcifique de .

Po ur une spect romt r ie, on ut ilise une lumir e sens iblement mo nochro mat iq ue co mme les lampes halo gnes qui do nnent des lo ngueurs d ondes dans le do main e UV-Vis. Cet t e analyse est int r essant e du fait qu elle per met de t ravailler sur de faib le s concent rat io ns et est non dest ruct ive vis-- vis de l chant illo n. (M. D. Gent r ie 2001). 1.7.3-Application s quantitatives : So nt t rs import ant es, se fo nt en appliquant la lo i de Beer- Lambert . Gnrale ment , pour ces applicat io ns, on ut ilise des cellules do nt le t rajet opt ique est de 1cm po ur facilit er les rsult at s et minimiser les r isques d erreur s. Deu x cas so nt possibles : -La su bst ance un ou plusieur s pics d absorpt ion caract r ist iques dans l UV-Vis. On fait alo rs un t alo nnage direct . -La su bst ance doser n a aucun pic caract rist ique. Et l, on effect ue une ract io n co lo re per met t ant le dosage. ( l int ensit de la co lorat ion est proport ionnelle la concent rat io n de l chant illo n). (M.D. Gent r ie 2001). 1.7.4-Application s qualitatives : Les spect res UV-Vis four nissent des infor mat io ns sur la st ruct ure mo lcula ir e, mais so nt surt out ut iliss pour une co nfir mat io n ou une ident ificat ion grce d es rg les emp ir iques et la co mparaiso n avec des spect res de rfr ence. (M. D. Gent r ie 2001). Dans le do maine UV-Vis, les lo ngueur s d ondes correspondent des diffrences d nerg ies (dE = E2 E1 = hc/ ) qui affect ent la rgio n des t ransit io ns lect ro niques = passage d une orbit ale d nergie E1 une orbit a le d nerg ie E2 p lu s leve. Le ret our de l t at excit l t at fo ndament al se fait par rest it ut io n sous fo r me d e lu mire et d E absorbe. (M. D.Gent r ie 2001). Chaqu e groupe de mo lcules (de st ruct ures) un spect re caract r ist iqu e per met t ant son ident ificat io n. Le spect re d absorpt io n UV-Vis des co mpo ss flavo niques dans le mt hano l prsent e deux maximums ou pics : le premier se sit u e ent re 320 et 380nm et correspond au cyc le B de la mo lcule ( for me cinna mo yle).

11

Le d eu xime se sit ue ent re 240 et 270nm, il correspo nd au cycle A ( fo r me benzo yle). (N. Heimeur. 2004).(Figure 21)
Ab s or b an c e B an de II B an de I B an de II B an de I

B A
C in n am o yle B en zo yle O

II I

Figure 21 : Spectre dabsorption dun flavonode

Les p ig ment s flavo niques donnent des spect res suscept ibles d t re modifis e n prsence de ract ifs io nisant s ou chlat ant s, comme l AlC l 3 , le NaOH... La bo nne int erprt at io n de ces modificat io ns combine celle des Rf et fluorescences per met une approche st ruct urale par fo is t ot ale. Le sp ect re d absorpt io n dans l UV-Vis des t annins est , quant lui, sit u ent re 250 et 300nm. I l se caract r ise par un seul pic aux environs de 270-280 nm. (R.A. Ananias et al. 2001). (G. Dut ruc-Rosset 2002). 1.7.5-Terminologi e utili se en spect roph otomt rie UV-Vi s : *Gro upement chro mophore : groupement s insat urs covalent s responsables d e l abso rpt io n. *Gro upement auxochro me : groupement s sat urs qui, quand il sont lis des chro mo pho res, l abso rpt io n. *E ffet bat hochro mique : dplacement des bandes d absorpt ion ver s des lo ngueurs d o nd es p lu s grandes. ( hypsochro mique) . *E ffet hyperchro mique : augment at io n de l int ensit d absorpt io n. ( hypo chro mique). nm 173 178 290 279 208 modifient la lo ngueur d onde et augment ent l int ensit de

Ch romophores Elmentai res > C=C (alcne) c C (alcyne) C=0 (ct one) CH=0 (ald hyde) COOH (acide)

12

CoCl (Chlorure d acide) CONH 2 (amide) COOR (Et her) NO 2 ( nit ro) N=N (azo mt ane)

220 220 211 214 338

Tablea u 3 : Ex emp le de qu elqu es pr incipa ux chr omop hor es ( Biologie et Mult imdia 2006).

1.7.6-Sri e spect rale des flavonod es : Cet t e sr ie de mesures spect rophotomt r iques en ajout ant des ract ifs io nisant s o u cht alant s per met pr inc ipale ment de prciser la prsence ou l absence d es subst it ut io ns sur le squelet t e flavo nique de base. - Premire srie : On t ire le spect re de la so lut io n mt hano lique o bt enue aprs grat t age du gel et filt rat ion. S i la co ncent rat ion est import ant e, on fait des dilut io ns avec le mt hano l. On ajout e cet t e solut ion se t rouvant dans le cuve du spect ophotomt re une p ince de NaOAc et on mlange. To ujo urs cet t e mme cuve, o n ajout e 2 goutt es d une so lut ion d acid e bo r iq ue (H 3 BO 3 ) 5%. - Deuxi me srie : On pr end un chant illo n de la m me so lut io n mt hano lique init ia le et on t ire le spect re d absorpt ion. On ajout e cet t e so lut ion, 5 gout t es d une so lut ion mt hano lique de AlC l 3 5%. On a jo ut e encore une gout t e d une so lut ion HCl 2 fo is nor male.

- Troisi me srie : On t ire le spect re toujours de la mme so lut io n flavo nique. Apr s l addit io n d une goutt e d une solut io n NaOH nor male, on t ire le spect re immdiat ement puis apr s 5 minut es.

Les flavo no des, co mme la major it des composs aro mat iques sont chargs de d iffrent s groupement s chro mophores qui lorsqu ils se co njuguent aux ract ifs d e la sr ie spect rale causent des dplacement s spect raux bat hochro miqu es, 13

hyp erchro miques, hypsochro miques ou hypochro miques (Bio logie et mu lt imd ia 2006). (Figure 22).
spectre spectre spectre

3 chantillons de la solution mthanolique contenant les flavonodes spars.

spectre

Addition de NaOAC (une pince)

spectre

Addition d AlCl 3 (5%) (5 gouttes)

spectre immdiat

Addition d NaOH (1N) (1 goutte)

spectre

Addition de l acide borique (5%) (2 gouttes)

spectre

Addition d HCl (2N) (1 goutte)

spectre aprs 5mn

Figure 22 :

Pr ot oc ole de la s r ie sp e ctr a le

1.8-Dosage des tannins :

Objectif : Not re o bject if de cet t e expr ience est de dt er miner la proport ion des diffrent s t annins prsent s dans les chant illo ns obt enus apr s affront ement l t her, l act at e, le MEC, le but ano l et l H 2 O. Dfin ition de la mthode : On ut ilise la mt hode de dosage But hanol/ HCl dcr it e par Bat h S mit h (1975). Cet t e mt ho de sert dt er miner la t eneur en t annins condenss. Ces der nier s en chau ffant le mlange but ano l/ HCl, se scindent par hydro lyse acide coupant les lia iso ns C 4 C 8 qui lient les mo no mres t anniques ent re eux et produisent ainsi des ant ho cyanes co lores facilement quant ifi es. Proto co le : On pr end la m me quant it des chant ill ons obt enus (des 05 phases) fin d e ne pas fau sser les proport io ns des rsult at s. Le ract if d e dosage est prpar en m langeant 95ml de but ano l avec 5ml d HCl. On prend 0,5ml de chaque chant illo n auquel o n ajout e 4,5 ml du ract if But ano l/HCl. On obt ient alors des dilut io ns 1/10.

14

Deu x rp t it ions pour chaque phase so nt ncessaires pour confir mer les rsu lt at s o bt enu s. Su ivant le m me pr incipe, on fait une sr ie de dilut io ns jusqu l o bt ent io n des d ilut io ns 1/20 pour la phase t her qui parat peu charge et 1/30 pour les aut res phases. On met les so lut ions dans un bain- mar ie bullit io n pendant 2 heures 90 C pu is o n refro id it avec de l eau pour stopper les ract ions d hydro lyse.

2*Activit antibactrienne des polyphnols extraits :

Cet t e act ivit est mise en vidence par la mt hode de diffusio n sur glo se ut ilise par (S.B. I lic 2004). Cet t e mt hode nous per met de dt er miner la sensibilit o u la rsist ance des bact r ies aux po lyphno ls, mais elle est peu efficace pour mesurer l act io n inh ibit r ice de ces der niers. Le pr incip e de cet t e mt hode est l or igine m me des t est s d ant ibio grammes. En effet , lo rs d e ces t est s, les disques sont imprgns d ant ibiot iques et dposs sur la sur face d es milieux de cult ur es so lides ensemencs. Ds l app licat ion des disques imp rgns de pr inc ipes act ifs (dans not re cas le s po lyp hno ls), ces der niers diffusent de manire unifor me si bien que les co ncent rat io ns so nt inver sement proportio nnelle la dist ance des disques (JP. Euzeby. 2005). D o le problme d es zones d inhibit io ns diffusio nnelles difficile s mesurer. L inh ib it io n, quand elle est prsent e, se manifest e par des zones de st r ilit aut o urs des pat chs imprgns de pr inc ipes act ifs. Ces zo nes so nt dit es : zo nes d inh ib it io n. Leur dia mt re nous per met d valuer le degr d act ion des co mpo ss t rait s sur la cro issance des bact r ies.

2.1-Variante de cette mthode :

Deu x var iant es de cet t e mt hode so nt souvent ut ilises : - La mt ho de des puit s : des t rous circulair es sont dcoups dans la glose. On y verse les so lut ions cont enant les pr inc ipes act ifs. L inhibit io n, ici, est calcule p ar mesure d e la dist ance ent re la limit e de la zone d inhibit io n et le bord du rser vo ir (du pu it ). L inco nvnient de cet t e mt hode est qu il est diffic ile de met t re t oujours la mme quant it de so lut ion dans les pu it s . Hors des erreurs minimes de l ordre d u micro lit re peuvent influencer nor mment le diamt re de la zo ne d inhibit io n. 15

Au ssi, il y a le r isque de dbordement . - La mt ho de des rser vo ir s : dans cet t e mt hode, au lieu d appliquer des pat chs o u de dco uper des t rous, on dpose des rservo ir s cylindr iques co nt enant la so lut io n act ive d e co ncent rat ion co nnue sur la sur face d agar. Cet t e mt ho de est plus difficile et dlicat e met t re en uvre que les aut res, mais o ffre l avant age de facilit er la mesure de la CMI (Concent rat ion Minima le Inhib it r ice). (M. L. Malignet t er-Muller 1995).

2.2-Standardisation :
Po ur facilit er cet t e mt hode et obt enir des rsult at s int erprt ables, il faut : - Ut iliser des milieux qui per met t ent la croissance de no mbreuses bact r ies, et ne cont iennent aucun inhibit eur ou ant ibiot ique r isquant d influencer les rsult at s. Gnrale ment , on ut ilise le milieu Mller- Hunt on enr ichi de 5% de sang de mo ut o n pour les st rept ocoques, et de 10% de sang de cheval pour les Helicoba cter . Po ur les anarobies, on remplace Mller-Hunt on par une glose Wilkins Chalgre n add it io nne de 5% de sang de mout on. Lo rs du manque de milieu, on peut facilit er ce t ravail en ut ilisant la glo se nut r it ive. - Le pH do it t re compr is ent re 6 et 7,4 (reproduisant au mieux le milieu int er ne du co rps anima l). - L paisseur de la glo se condit io nne la concent rat ion de la source du po lyphno l. E lle do it t re de 4mm. - La t emprat ure et la dure d incubat io n doivent t re fixes pour tous les ger mes, gnrale ment 35 37 C pendant 18 24h dans une at mosphr e nor male. (JP. Enzby. 2001).

2.3-Bactries tudies :
On a dcid de mener not re t ude sur des bact r ies pouvant t re pat hognes po ur l ho mme. Ceci pour met tre en vidence quel int rt mdical et bact r io logiqu e peu vent avo ir les flavo no des et les t annins prsent s dans not re aliment at ion. * Pro teus mirabilis : Est un bacille Gram ngat if, prsent dans l int est in de l ho mme. I l est pat hogne opport unist e, not amment chez les individus hospit aliss, cat ht r iss ou prsent ant des ano ma lies des vo ies ur inaires. Les in fect ions ur ina ires so nt les plus frquent es. E lles rsult ent so it d u ne in fect io n s yst mique so it d une infect ion ascendant e au cours de laquelle les bact r ies co lonisent t ape par t ape l ur t re, la vessie, l art re et fina lement les reins (J.P.Enzby. 2006). 16

* Sta phylococcus sp. coagulase (+) : Les st aphylocoques sont des cocci Gram posit if, causant des infect ions bact r iennes svres dont la prvalence est part icu lir ement leve en pat ho logie infect ieuse. I l co lo nisent la peau et les muq ueu ses, causent des int oxicat ions, des infect io ns ur ina ir es et dans cert ains cas l endo card it e infect ieuse (pro lifrat ion des ger mes au niveau des lsio n s

card iaqu es organiques prexist ant es). Les d ifficu lt s t hr apeut iques rsult ent de la mu lt irsist ance aux ant ibiot iques des so uches ho spit alires. (E l So lh Nevine 1999) (Vulgar is 2005-2006). * Escherichia coli : Est un ht e nor mal de l int est in de l ho mme. Cert aines souches so nt ino ffensives alor s que d aut res possdent des ger mes en plus le s rend ant cap ables de pro voquer des dia rrhes, des infect ions ur ina ir es et des sept icmies. Au ssi, il est ncessair e de signaler qu E.coli rest e considre co mme l un des agent s les p lus connus causant des infect ions nosocomia les.

2.4-Protocole d application :
- Rco lte et p rparation des souches test s : Les bact r ies proviennent du CHU de Const ant ine. Ces souches sont ensemences dans des bo u illo ns et incubes 35 C pour opt imiser leur cro issance. - Prpa ration des disqu es (patch s) : Des d isques de 0,5mm de dia mt re sont dcoups sur du pap ier Wat t man et aut o clavs pendant 20 minut es 120 C dans 10ml d eau dist ille. Les d isq ues sont t remps ensuit e dans les pr incipes act ifs considrs. - Les Principes acti fs : On dsig ne par les t er mes pr inc ipes act ifs les flavo no des et les t annins ext rait s de R.officina lis et V. fa ba . L. respect ivement . Po ur ces t est s ant imicro biens, on ut ilise les phases : Eau, Et her dit hylique et Act at e d t hyle de chaque plant e. Ces phases so nt vapores sec dans le rot avapo r et laves 03 fo is avec l eau dist ille. Les pro du it s de chaque phase so nt repr is dans 4ml d eau dist ille. Pour chaq ue no u vel ext rait , on fait deux dilut io ns. On arr ive t rois concent rat io ns

dcro issant es = C i n i t i a l e , C i / 2 et C i / 4 . (d0,d1,d2)

17

- Tmoin : po ur vr ifier la bonne mise au po int de cet t e mt hode, on pr pare des disq ues t mo ins impr gns de mt hano l et on les appliques sur 03 bo it es de pt r i ense mences par E. coli, Sta phylococcus sp et P . mir a bilis respect ivement . - Application : No s bact r ies so nt ensemences part ir du bouillo n nut r it if (BN) sur des bo it es d e pt ri co nt enant la glose nut rit ive (GN). L ensemencement se fa it par t ale ment de quelques go utt es de BN sur la glose avec un rt eau. Les d isques impr gns de po lyphno ls sont alors appliqus sur la sur face de la cellu le et les bo it es de pt r i sont incubes 35 C pendant 24h.

3*Prcipitation des macromolcules nutritives par les tannins : 3.1-Objectif :

Dans cet t e expr ience, on t est e la prcipit at io n du BS A (Srum Bovin Albumin), du g lut en, et de l amidon caus par les ext rait s de V. fa ba L. Ceci pour met t re en vidence l act ion ant inut r it ionnelle des t annins condenss, sachant que ces dern iers ne so nt dgradables que par un pet it groupe de microorganis mes absent s chez l ho mme. Donc l liminat io n de ces po lyphno ls du corps ent rane avec elle les co mpo ss qui s y lient (surt out les prot ines) qui en t emps nor mal o nt une grande valeur nut rit ive.

3.2-Dfinition de la mthode :
Cet t e mt ho de a t ut ilise pour les t annins par Hager man (1987) et a t ensu it e repr ise par plusieur s t ravaux. Avec cet t e mt hode, on peut t est er la combinaiso n de diffrent s co mposs au x subst rat s se t rouvant dans le milieu glos. E lle est base sur la diffusio n des mo lcules ut ilises dans un gel d agar o u d ag aro se. La co mbinaiso n des mo lcule s t est es se t raduit par une pr cipit at io n dans les rg io ns de co nt act . On par le des zones d inhibit io n. Init ia lement , la diffusio n rad iale t ait ut ilise en immuno logie pour dt ect er la prsence des ant ignes et ant icorps dans un milieu, ou pour t est er l affinit qu ils o nt l u n po ur l aut re. Po ur les t est s immuno logiques, la prc ipit at ion peut se fair e sur milieu liquid e o u so lide.

18

Les milieu x liquides per met t ent surtout la mise en vidence de la co mbina iso n des deu x co mpo ss t udis, alor s que les milieux so lides apport ent en plu s la po ssib ilit d e mesur er le t aux de cet t e dernir e.

3.3-Les substrats utiliss :

- BSA : Bo vin Srum Albumin. E lle est considre pour signifier l albumine du sru m o u l albumine du plasma. Les albu mines o nt une basse t eneur en t r ypt ophane et mt hio nine et des t eneur s leves en cyst ine, acide, aspart ique, acide glut amique, lys ine et argin ine (G.L.Fr id li 1996). - Gluten : est une prot ine vgt ale rpandue surt out dans le mas. E lle est t rs ut ilise dans le do maine aliment aire, plus spcia lement en panificat ion ou elle sert faire mo nt er les pt es. Un grand no mbre de per sonnes est aller gique au glut en. - Amidon : est un po lysacchar ide polymr e de glucose t rs r pandu dans l aliment at io n. L amido n est un mlange d a mylo se linaire (rsidu de glucose unis par des lia iso ns (1, 4)) et d amylopect ine ramifie (rs idu de glucose unis par des lia iso ns (1, 4), mais avec que lques point s de r amificat io ns (1-6)). (B. D. Hames. 2000). L liminat io n de l amidon cause par sa liaiso n aux proant hocyanidines cause la pert e d u ne quant it nor me d nergie.

3.4-Protocole :
On prp are des so lut io ns aqueuses d agar (1% : on cherche un gel mou) qu o n port e bu llit io n pour per met t re la so lubilisat io n de l agar. Les co mpo ss dont on t est e la prcipit at ion sont ajout s (3%) la so lut io n prcd ent e : l amidon peut s ajout er avant le chauffage de la so lut io n du gel ; alo rs que pour les prot ines, il est ncessaire d at t endre un refro idissement presqu e co mplet aprs l bullit io n. Les mlang es sont ensuit e ver ss dans des bo it es de pt r i st r iles o on les la isse glifier. Po ur un meilleur rsult at , on met ces bo it es au rfr igrat eur pendant 24h 4 C. Des p at chs de 5mm sont st r iliss comme pour les t est s ant imicrobiens l aut o clave :120 C pendant 20min). (

19

Apr s leur refro idissement , ils sont impr gns des ext rait s t anniques : phase H 2 O, phase Et her dit hylique et phase Act at e d t hyle ,avec t rois dilut io ns po ur

chaqu e p hase : dilut ion init ia le, dilut ion 1/2, dilut ion 1/4. (do,d1,d2) Apr s app licat io n des pat chs sur les ge ls, on fer me les bo it es de pt r i avec du parafilm et on les incube 30 C pendant 72h. ( Figure 23)
Comp os s tu dis (BS A, Amidon, G lut en)

Agar

Eau dist ille Solut ion d agar (1%)

Ebullit ion au bain- mar ie Ajout des comp os s tu dis

Agitation

(**) Protocole d appli cation de la diffu sion radi ale

Ver s ement dans les b oit es de p tr i Pince Patch I ncubation (30 C/72 h) App lication des dis qu es (patchs) Figure 23 : Protocole dapplication de la diffusion radiale Refr oidiss ement pu is placement 4 C penda nt 24 h

20

G . Rema rque : On peut raliser dans cet t e expr ience diffremment : on prpare une so lut io n d ag ar (t o ujours pour un gel mou) qu on ne mlange pas cet t e fo is avec le s subst ances t udies. Les pr incip es act ifs ainsi que ces subst ances sont ajout s au gel sous for me d e so lut io ns dposes dans des t rous. Ces t rous sont for ms par un capilla ir e de 0,5 1 mm de d ia mt re. Un t ro u cent ral est ncessair e pour le pr incipe act if et six t rous pr iphr iques po ur les su bst ances. Les zones de prc ipit at io n appar aissent alors sous diffrent es fo r mes. Cet t e mt hode est dit e alors : diffusio n radiale bidimensio nnelle (diffusio n du pr incipe act if et des co mposs t udis) . (Figure 24)

21

I ncubation Diff r ents patchs 72h/30 C

Zone de pr cip itat ion Abs ence de pr cip itat ion

Mt ho de des pa tchs T r ous pr ip hr iqu es p our les car bones tu dies

T r ou centr al p our le pr incip e act if

I ncubation 72h/30 C

Mt ho de bidimens io nnelle (Mtho de des tro us)

L es diff r ent es zones de pr cip itat ion p ossibles

Fig ure 2 4 : Les deux mt hodes de la dif fus ion r adiale

22

4*Dgradation des tannins condenss par les moisissures : 3.1-Objectif :

Not re o bject if est d iso ler quelques moisissures du so l capables de dgrad er l acide t annique, qui est un t annin hydrolysable simila ire par ses caract r ist iqu es au x t annins condenss et de t est er ensuit e leur cro issance sur des milieux ne co nt enant que du Quebracho et du Tannin cht aigner (po lymres de cat chines ind ust r iels) co mme seule source de car bo nne.

3.2-Origine des moisissures :

Les mo isissures t udies so nt iso les d un so l de la wila ya de Jije l (p lu s exact ement E l-Ouana) plant de Quer cus suber connu pour son corce r iche e n t annins co ndenss ( Khennouf 2004).

3.3-Prlvement :
On m lang e 1g de so l avec 50ml d eau dist ille dans un er lenme yer, on ag it e pendant au mo ins 5min. On fait t rois dilu t ions en prlevant chaque fo is 0,5ml de la so lut io n prcdent e avec une pip et t e past eur et en ajout ant 4,5ml d eau dist ille. Avec la der nir e dilut ion, n ayant pas une grande charge microbienne, o n ense mence d eux bo it es de pt ri co nt enant de la glose S abouraud spcifique au x champ ig no ns, l incubat ion se fait 35 C pendant 72 heures.

3.4-Isolement des moisissures :

On prlve deux mycliu ms ayant mo nt r une cro issance prdo minant e dans les bo it es prcdent es et on les iso le avec plusieur s repiquages, toujours sur milieu Sabo uraud. L aspect macroscopique de ces deux mycliu ms nous la isse supposer qu il s ag it d u n Asp er gillus et d un P enicillium. Et l obser vat io n microscopique nous le confir me. En effet , o n a un A. niger et un P en icillium sp .

3.5-Ensemencement des milieux spcifiques :

- Milieu spci fiqu e avec de l acid e tannique : Ce milieu spcifique ( milieu A) a t ut ilis par (GAS. P int o 2001). Il ne co nt ient que de l acide t annique co mme source de car bone. Chacu n des deux myc liums iso ls pr cdemment est ensemenc sur des bo it es de pt ri co nt enant le milieu A. On incube ces bo it es 32 C pendant 72 heur es. (GAS. P int o 2001).

23

- Milieu spci fiqu e avec du Queb racho et du Tannin Chtaigner : On co nsid re que les espces qu i cro ient sur le milieu A so nt pourvues d u ne t annase et sont de ce fait suscept ibles de cro t re sur des milieux co nt enant le Quebracho et le Tannin cht aigner ( Milieu B et C respect ive ment ) la place d e l acide t ann ique. Do nc, o n prlve les mycliums ayant mo nt r une cro issance sur le milieu A et o n les ensemence sur B et C, ceci t out en les rensemenant toujours le milieu A et le milieu Sabo uraud pour une t ude co mparat ive. Les milieu x B et C proviennent d une modificat ion du milieu A. On les prpare avec les mmes co nst it uant s que ce der nier sauf pour la source de car bo ne qu o n chang e de l acide t annique, au Quebracho, puis au Tannin Cht aigner. Les bo it es de pt r i co nt enant les milieux A, B et C ensemencs par les espces consid res so nt alors incubes, t oujours 32 C pendant 72h. (Figure 25)

24

Sol Ens emencement sur milieu Sabour aud

Agitation Eau distill e Solut ion du s ol Sr ie de dilut ions

I ncubation 35 C/72 h

Pr lv ement des mycliu ms pr domina nts Obs er vat ion micr oscop iqu e (Essai d identif icat ion)

Is olement par r epiquages successifs sur milieu Sabour aud

Ens emencement sur milieu A Ens emencement sur le milieu A I ncubation 32 C/72 h Ens emencement sur le milieu B Ens emencement sur le milieu C I ncubation 32 C/72 h

Fig ure 2 5 : Pr otocole d is olement des cha mpignons dgr a dant les tannins condens s

25

5* Mesure de l activit antiradicalaire :

Objectif : Dans cet t e part ie, on t est e l act ion des chant illo ns flavo niques et t anniques sur le DPPH fin de savo ir s ils ont un r le ant iradicala ir e (scavenging act ivit y). Mthode : Le DPPH (1.1diphenyl2picr yl hydrazyl) est un rad ical libre st able qu on ut ilise pour remp lacer les radicaux libres produit s par les cellules en rpo nse des st ress ext ernes o u int ernes . On ut ilise co mme ext rait s act ifs les 03 phases flavoniques de Rosma r inu s o fficina lis , les 05 phases t anniques de Vi cia fa ba L. et les deux spot s 7 et celu i du dp t de la phase act at e flavo nique (prsent s en quant it suffisant es). Ces ext rait s so nt vapors sec fin de connat re leur s po ids secs r espect ifs pu is repr is dans l t hano l de t elle sort e avoir des concent rat io ns 1g/ l pour chacun. Proto co le : On prpar e u ne so lut io n t hano lique de DPPH 1 mo laire . On mesure l absorbance de 1,5 ml = 517 nm ( lo ngueur d onde d absorpt ion du DPPH), pu is on ajo ut e 15 l. d e l ext rait t est . La lect ure se fait alors chaque 15secondes jusqu st abilit de l absorbance. Co mme t mo in, on ut ilise la querct ine sous for me de so lut io n 1 mo laire. Le po urcent age d inhibit io n du DPPH par l ext rait est calcul co mme suit :

% inh = ( ABS

D PPH

- ABS

fi n a l e

/ ABS

D PPH

) * 100, (Bolskako va IV. 1998) avec :

% inh = Po urcent age d inhibit io n du DPPH. ABS ABS

DPPH fi n a l e

: Absor bance du DPPH 517 nm : La valeur st able de l absorbance aprs l ajout de l ext rait .

6*Analyse statistique :
On ralise une Anova (analyse d es var iances) pour t rait er les rsult at s obt enu s dans les part ies: ant imicrobienne et prcipit at io n des macro mo lcules. Cet t e analyse nous per met de savo ir s'il y a oui ou non des int eract io ns ent re les d iffrent s paramt res pr is en considrat ion (phases, dilut ions, plant es et

micro o rganis mes) et de les classer en groupes ho mognes. L'analyse DI A no u s per met une bo nne apprciat io n des act ions produit es par l'int eract ion de des deu x paramt res diffrent s. Le lo g ic iel ut ilis est STAT-ITCF: vers io n 4-copyr ight @ 1987-1988. 26

Partie 03 : Rsultats et discussions :

1*Partie phytochimique :
1.1-Les chanti llons obtenu s ap rs l ext raction : Apr s les ext ract io ns et les part it io ns ent re so lvant s, les phases t her dit hylique, act at e d t hyle, mt hylt hylct one, but ano l et H 2 O sont vapores sec et repr ises dans 5ml de mt hano l. Une part ie de ces chant illo ns est consacre aux preuves chro mat ographiques, l t ude sp ect rale et aux expr iences de dosage. A chaque chant illo n t annique recueilli, o n ajout e 2 gout t es d une so lut io n mt hano lique de mt abisulfit e d e sod iu m (0,02%) pour vit er l o xydat io n au cont act de l oxygne et de la lumire. L aut re part ie est vapore sec puis lave plusieurs fo is l eau dist ille afin d liminer t out e trace du mt hano l. E lle est consacre aux expr iences ant ibact r iennes et prcip it at ion des protines. Ici, l addit io n du mt abisulfit e de sod iu m est inut ile, vu que les chant illo ns sont ut iliss immd iat ement aprs les affro nt ement s et que ce co mpos r isque de fausser les r sult at s en se liant au x macro mo lcules lor s de la d iffusio n radiale ou en inhibant la cro issance d es bact r ies t udies. 1.2-Chromatographi e analytique su r couche min ce : La CCM analyt ique des ext rait s flavo niques est ralise sur le gel de po lyamid e DC 6 avec le syst me so lvant : Tol/ MEC/E t OH/EP (2/1/1/1). Ce der nier per met une bo nne sparat io n des const it uant s du dpt pour la phase t her d it hylique et act at e d t hyle. Surto ut po ur la deuxi me qui donne aut ant de t ches que de produit s const it uant s du dp t (tous les spot s obt enus y co mpr is le dpt se sont avrs t re des flavo no des, dont cert ains so nt plus pur s que d aut res). La phase H 2 O est mo ins bien sp are avec ce syst me. On refait donc la CCM pour cet t e phase avec des syst mes base d H 2 O pour sparer les glycosides qu elle cont ient . Le syst me cho isi est le suivant : H 2 O/Et OH/MEC/ AcOH : 13/3/3/1. - So us UV dans une chambre no ir e, on remarque que la phase t her dit hyliq u e donne 6 spo t s bien dist inct s. La phase act at e d t hyle 7 spot s et la phase H 2 O 6 spo t s aussi, la fluorescence et les Rf de ces t ches sont rsums dans le t ableau suivant :

53

Act at e Spots 1 2 3 4 5 6 7 D p t Rf 0,713 0,653 0,593 0,48 0,44 0,307 0,027 0 fluo res cence Violet mar r on Violet light Violet +++ Violet light Violet ++ Violet +++
Jaune vert light

Et her Spots 1 2 3 4 5 6 Rf 0,828 0,786 0,743 0,464 0,121 0,035 Fluorescence Jaune ver t
Vi ol et m a rr on

H2O Spots 1 2 3 4 5 6 Rf 0,893 0,771 0,586 0,286 0,207 0,057 fluo res cence Marr on br u n Violet ++ Violet + Marr on Bleu light Jaune mar r on

Violet light Violet Violet f onc Violet jau ne

Violet

D p t

Ver t mar r on

D p t

Br un

Solvant : 2/1/1/1 T ol/MEC/EtOH/EP UV : = 365nm T ableau 04: R su ltats de la CCM

Solvant : 2/1/1/1 T ol/MEC/EtOH/EP UV : = 365nm analyt iqu e.

Solvant : 13/3/3/1 H 2 O/EtO H/MEC/ AcO H UV : = 254nm

De ces rsult at s, on remarque que la phase act at e d t hyle a une const it ut io n flavo nique plus ho mogne (presque t ous les spot s sont vio let s) et plus r iche co mpare celle des phases t her dit hylique et H 2 O. La me illeure sparat ion du dpt de la phase H 2 O dans le syst me so lvant : 13/3/3/1 (H 2 O/Et OH/MEC/ AcOH) confir me qu elle cont ient pr incipalement des g lyco sides (plaque 1).

Plaque 1 : CCM analytique des flavonodes de R. officinalis

54

1.3-Chromatographi e bidimentionn elle des flavonodes : Cet t e CCM nous per met d avo ir une empreint e flavonique des ext rait s de Roma r inu s officina lis . Sur une p laq ue de po lya mide (20x20cm) , le dpt se fait sur le bas dro it de la p laque sur u ne lo ngueur de 1cm. La spar at ion est ralise en deu x dimensio ns : la premire avec le syst me : To l/ MEC/Et OH/EP (2/1/1/1) ent ranant les aglyco nes et la deuxi me avec le syst me : H 2 O/Et OH/MEC/ AcOH (13/3/3/ 1) ent ranant les glycosides. On o bt ient alors le cart ogramme su ivant :

Plaque 2 : CCM bidimensionnelle des flavonodes de R. officinalis

55

1.4-Chromatographi e p rparative su r couche min ce : Co nser vant toujours les mmes syst mes so lvant s, on prpare pour chaque phase 5 p laques de po lya mide (20x20cm). Ceci afin de rcuprer de gr andes quant it s de flavo no des pour les t udes spect rales. Apr s grat t age des spot s et filt rat io n, on obt ient des so lut io ns mt hano liques (5 ml chacu ne) do nt les couleur s var ient du t ransparent au marron passant par le jau ne et le jaune vert . L t ude sp ect rale de ces so lut io ns nous per met d apprcier la pur et et la propret de ces chant illo ns.

1.5-Analy se spect rale UV-Vi s : Dans le do maine [ UV-Vis ] , les so lut io ns mt hano liques de la phase t her d it hyliqu e donnent pour la major it un seul pic sit u ent re 203 et 207nm et qu i est par fo is acco mpagn d un pau lement . Ceci no us per met d en dduir e que cet t e phase ne co nt ient pas de flavo no des ( sau f un seu l co rrespondant au 3 e spot ) et de supposer que peut t re ces p ics reprsent ent des acides phno ls. Les so lut io ns mt hano liques de la phase act at e se sont rvles pour la plup art des so lut io ns flavo niques do nnant deux pics caract r ist iques dans le do maine [25 0400]n m. Les spot s donnent des pics plus dist inct s (donc plus purs). Les spo t s de la phase eau donnent des spect res caract r ist iques des flavono des mais do nt les pics, no n bien dist inct s, t mo ignent de l impuret des so lut io ns flavo no qu es et peut t re mme de la salet de cet t e phase qui peut cont enir enco re des rest es de lipides, boues, rsines Apr s avo ir t ir t ous les spect res mt hanoliques de ces t rois phases, on dcid e de raliser la sr ie spect rale pour ceux qui se rvlent plus net s et en quant it suffisant e. A savo ir, les spot s 2, 5, 6, 7, le dpt de la phase act at e d t hyle et les spo t s 1 et 5 de la phase H 2 O. Rema rque : les spect res t irs aprs l ajo ut du AlCl 3 et l HCl ne so nt pas pr is en consid rat io n, du fait que l AlCl 3 ut ilis est non anhydre donnant les mmes spect res que les so lut ions init ia les. Not re analyse repose donc sur les infor mat io ns appo rt es par la premir e et la t roisi me sr ie seule ment .

56

204

203

Spot 1

Spot 2

203

203

298

328

Spot 3

Spot 4

207

Spot 5 Fig ure 26 : Spectr es mt hanoliqu es des sp ots de la phas e t her

57

1.6-Rsu ltats de l analyse spect rale : 1.6.1- Le dpt de la phase actate : La sr ie sp ect rale de ce spot nous donne les rsult at s suivant s :
Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc + H 3 BO 3

285 275 284 256 (286)

330 390 329 347

Le spect re mt hano lique nous do nne deux bandes uniques respect ivement 285 n m et 330 nm. Tout es deux caract r ist iques d une flavo ne au no yau A po lysubst it u. (VOIRIN 1983). L add it io n du NaOH do nne un effet bat ho chro me et hypochro me de la bande I sans appar it io n de bande ent re 320 et 335, indiquant l absence d OH en 3 et 4 et la prsence d u n OR en 7. (MARKHAM 1982). L add it io n du NaOAc ne provoque pas d effet bat hochro me de la band e II co mpare au spect re mt hano lique : on a un OR en 7. Puis, l ajout du H 3 BO 3 donne un d p lacement bat hochro mique (17nm) indiquant la pr sence d un ort ho di-OH e n 3 et 4 . On suppo se donc une schmat isat io n de la mo lcule co mme suit :
R" ? RO O OH OH

?R OH O

Le OH en 3 est confir m par la fluorescence vio let t e sous UV. Cet t e st ruct ure milit e po ur une lutoline ; mo lcule t rs rpandue chez Rosma r i nus officina lis . (OKAMURA 1994). 1.6.2-Le spot 7 de la phase actate :
Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc + H 3 BO 3

290 269 289 290

330 382 328,5 338

Le spect re de cet t e phase nous do nne dans le mt hano l une bande II 290 n m ind iq uant que la no yau A est polysubst it u. La bande I 330nm et la fluorescence jau ne vert light sous UV laisse opt er pour une flavano l 3-OR. (MARKHAM 1982).

58

Les effet s bat hochro me et hyperchro me de la bande I et la st abilit du spect re e n prsence du NaOH so nt en faveur d un OH libre en 4 . L ajo ut du NaOAc ne do nne aucun effet sur la bande II infor mant de la pr sence d u n OR en 7. Le NaOAc addit io nn de H 3 BO 3 prsence d u n ort ho di-OH en 3 et 4 . On suppo se donc que cet t e mo lcule la st ruct ure suivant e :
OH R? RO O OH

mo nt re un dplacement

bat ho chro mique de la bande I co mpar au spect re mt hano lique t mo ignant de la

R" ? OH O

OR

Vu que le no yau A est polysubst it u, au mo ins l un de R et R" est prsent , sino n les d eu x. Mais la st ruct ure de base rest e celle d une qu erctine co nnue chez cet t e p lant e (DEL BANO 2004).

59

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

Fig ure 27 : Analys e sp ectr ale du dp t de la phas e actat e

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

Fig ure 28 : Analys e sp ectr ale du sp ot 7 de la phas e actat e

60

1.6.3-Le spot 6 de la phase actate :

Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc + H 3 BO 3

282 279 279 273

329 379 327 331

Dans le mt hano l on a une bande I 332nm et une bande II 284nm indiquant une flavo ne mo nosubst it u en B (Vo ir in 1983). Le spect re avec le NaOH donne u n effet bat ho chro me et hyperchro me st able t mo ignant d un OH en 4 et de l absence d o rt ho di- OH. L addit io n du NaOAc donne une bande I au lger dplacement hyp so chro mique indiquant un OR en 7. L ajout du H 3 BO 3 ne donne pas de dp lacement , donc pas d ort ho di-OH. Ces rsu lt at s sont en faveur d une apigni ne (DEL BANO 2004) H
RO O OH

H
OH O

1.6.4-Le spot 5 de la phase actate :

Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc / H 3 BO 3

277 no n prcis 277 275

327 376 324 327

La bande I 327nm et la bande II 277nm sont en faveur d une flavone au no yau A po lysu bst it u. L effet bat ho chro mique (+54nm) co mbin l effet hyperchro mique de la band e I aprs l ad d it io n du NaOH infor me d un 4 -OH. Le NaOAc et le H 3 BO 3 , une fo is a jout s, ne provoquent pas d effet bat hochro me des band es I et II. C'est --dire que not re mo lcule a un OR en 7 et ne cont ient pas d o rt ho di-OH sur le no yau B.
R" ? RO O OH

?R OH O

61

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

Fig ure 29 : Analys e sp ectr ale du sp ot 6 de la phas e actat e

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

F igure 30 : Ana lyse spectr a l e du spot 5 de la pha se a cta te

62

1.6.5-Le spot 2 de la phase actate :

Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc / H 3 BO 3

297 271 no n prcis 303

327 382 328 345

La so lut io n mt hano lique de ce co mpos donne une bande I 327nm et une band e II 297nm indiquant une flavo ne au no yau A po lysubst it u. Un 4 -OH est confir m par le dplacement bat hochro me de la bande I (+55nm) aprs l ad d it io n du NaOH. Le NaOAc, une fo is ajout au mt hano l, ne produit aucun effet sur la band e II affir mant u n OR en 7, et le H 3 BO 4 produit un effet bat hochro me de la band e I (18nm) ind iquant la prsence de deux OH adjacent s sur le no yau B. On suppo se donc cet t e st ruct ure :
R" ? RO O OH OH

?R OH O

1.6.6-Le spot 5 de la phase H 2 O :

Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc / H 3 BO 3 Le sp ect re mt hano lique donnant

298 271 289 291 une bande II

334 384 331 350 298nm indique un no yau A

polysu bst it u. La bande I 334nm ainsi que la fluorescence bleu light de ce co mpo s so us UV nous laisse hsit er ent re une flavo ne sans 5-OH libr e et une flavo no l sans 5-OH libr e avec un 3-OH subst it u. (YAOU 2001). Le NaOH ajo ut la so lut ion mt hanolique fa it apparat re un dplacement bat ho chro me de la bande I ( = +50nm). On a un OH en 4 . L add it io n du NaOAc ne provoque pas de changement affir mant un OR en 7. Et l effet bat ho chro me de la bande I aprs l ajo ut du H 3 BO 3 indique un ort ho di-OH en 3 et 4 .
RO R" O OH OH

R OR O

H (OR)

63

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

Fig ure 31 : Analys e sp ectr ale du sp ot 2 de la phas e actat e

MeO H

NaOH

NaOH + 5min

MeO H

Na OAc

Na OAc / H 3 BO 3

Fig ure 32 : Analys e sp ectr ale du sp ot 5 de la phas e H 2 O

64

Le Rf d e cet t e mo lcule (0,4) dans le sys t me : H 2 O/Et OH/MEC/ AcOH (13/3/ 3/1) no us in fo r me que cet t e mo lcule est glycosyle. E lle cont ient au mo ins un sucre li.

1.6.7-Le spot 1 de la phase H 2 O :

Solv ants utilis s Bande II ( nm) Bande I ( nm)

MeOH NaOH NaOAc NaOAc / H 3 BO 3

274 277 272 272

330 393 351

La bande I 330nm et la bande II 274 ainsi que la fluorescence marron d e ce spo t so us UV, nous infor ment qu il s agit d une flavano l. Et il est fort possib le qu o n ait un sucre en 3 vu que le Rf est de 0,9 dans le syst me

H 2 O/Et OH/MEC/ AcOH (13/3/3/1). Le NaOH provoque un dplacement bat hochro me t rs import ant de la bande I (+63 nm) indiquant la prsence d un OH en 4 . L add it io n du NaOAc provoque une dco mposit io n de la bande I indiquant la prsence d u n ort ho di-OH . L add it io n du NaOAc provoque une dco mposit io n de la bande I indiquant la prsence o rt ho di- OH en 6 et 7 ou en 7 et 8. (Markham 1982). Le lger dp lacement hypsochro me de la bande II confir me le OH en 7. Le H 3 BO 3 avec le NaOAc do nnent un effe t bat hochro me de la bande I infor mant de la prsence d un ort ho di-OH en 3 et 4 . On suppo se donc cet t e st ruct ure :
R OH O OH HO

R" OH O

OH (OR)

avec R et R = OH.

De ces rsu lt at s, on remarque que les pr incipaux flavo no des produit s par R. officina lis pendant la floraiso n sont des flavones et des flavo no ls, co mme l affir me DEL BANO (2004) et OKAMURA (1994). Les no mbr eux pics uniques obt enu s de la phase t her dit hylique nous laisse cro ir e que la cu eillet t e s est fait e avant l opt imum de floraiso n, une pr io de o on avait une grande product ion d acides phno ls (MORENO 2006). Au ssi o n peut confir mer de ces spect res que la phase act at e est t rs ho mogne. E lle co nt ient pr incipalement des flavo nes au no yau A po lysubst it u. 65

MeOH

MeOH

NaOAc NaOH

NaOH + 5min NaOAc / H 3 BO 3 Fig ure 33 : Sr ie sp ectr ale du sp ot 1 de la phase H 2 O

66

1.7-Rsu ltats de la CCM analytique des tannins : Po ur cett e CCM, on fait 5 dpt s correspondant aux 5 phases obt enues aprs le s part it io ns ent re so lvant s (Et her, Act at e, MEC, But ano l, H 2 O). On o bt ient ic i u ne mau vaise sparat io n des const it uant s du dpt avec t ous les syst mes so lvant s ut iliss. Le syst me : To lune/act one/ Acide for mique (6/6/1) est cho isi du fait qu il per met t e l appar it io n de t ranes t anniques sur la plaque. Ces der nir es, apr s vapor isat ion de la vanilline/ HCl appar aissent de couleur s : jau ne o rang e, orange et rouge, caract rist iques des t annins (P laque 3).

Plaque 3 : CCM analyt iqu e des tannins de V. fa ba L.

67

Ces rsu lt at s nous renseignent sur la difficult de la sparat ion des t annins par CCM. I l est peut t re prfrable de r aliser cet t e t ape par chro mat ographie sur co lo nne o u par HPLC. Po ur co nfir mer que nos ext rait s cont iennent rellement des t annins, o n fait u ne analyse sp ect rale des 5 phases dans le mt hano l. On obt ient alors des spect res u n seu l p ic se sit uant t ous aux environs de 280nm. Cec i nous confir me qu il s ag it effect ivement des t annins ( ANANI AS 2001, DUTRUC ROUSSET 2002). La p hase t her parait mo ins pure que les aut res phases. Co mme t mo in pour cet t e t ude spect rale, on ut ilise la cat chine caract r ise par son abso rpt io n 280nm ( et c est effect ivement le rsult at qu on obt ient ).

264

279

278

Ph a se E th er

Ph a se Act a t e

Ph a se ME C

278

Ph a se But a n ol

Ph a se H 2 O

Fig ure 34 : Spectr es mt hanoliqu es des p hases tanniqu es

1.8-Dosag e des tannins par la mthode b utanol/H Cl : Po ur le do sage des t annins condenss par la mt hode but ano l/ HCl, on a ralis les d ilut io ns su ivant es : Phase ther : 1/20 1/300 Phase actate : Phase H2O : 1/300 1/3000 Phase MEC : 1/3000

Phase butanol :

68

La mesure de l absorpt ion 550nm, qui est la lo ngueur d onde correspondant au max imu m d absorpt ion des ant hocyanes, donne les rsult at s su ivant s : (aprs avo ir ramen t o ut es les dilut ions 1/10). Phase ther : 0,984 23,67 Phase actate : Phase H2O : 14,58 40,8 Phase MEC : 145,8

Phase butanol :

On p eut reprsent er ces rsult at s sous for me de sect eurs angula ir es co mme suit :

Phase ther : Phase butanol : Phase actate : Phase H2O : Phase MEC :

Fig ure 35 : Sect eur angu lair e des absor bances des p has es tanniqu es

Les p hases peuvent t re donc classes selon leur concent rat ion en ant hocyanes : Phase MEC > phase H 2 O > phase but ano l > phase act at e > phase t her. On remarq ue que la phase t her reprsent e une t rs basse proport io n co mpare au aut res phases. E n d aut res t er mes, les ant hocyanes mesures dans cet t e phase so nt en t rs faib le quant it V. fa ba L. Seville 2005 co nt ient t rs peu de t annins mo no mr iques. La p hase ME C avec les valeurs suivant es : dilut ion : 1/20, Abs = 145,8 reprsent e la p lus grande proport ion des ant hocyanes mesurs. C'est --dir e que les t annin s ext rait s de V. fa ba L. Seville 2005 sont en grande major it des t annins t r imr iqu es et o ligo mr iques spar s par affront ement avec le MEC. On remarqu e que ces rsult at s sont en accord avec ceux de la CCM ana lyt ique : les faib les co lo rat io ns des t ranes correspondent aux faibles proport io ns (act at e et t her), et plus le co lorat ion devient int ense, plus l absorpt ion augment e. - L analy se spect rale : Apr s mlange de t out es les so lut ions d ant hocyanes (t out es les phases), o n vapo re sec au rot avapor. Le spect re d absorpt io n de la so lut ion mt hano liqu e o bt enue se prsent e sous for me de 2 pics sit us ent re 260 et 600nm ; p lu s exact ement 274nm et 546nm. Ce spect re est caract r ist ique des ant hocyanes (MARKHAM 1983) et plus spciale mnt des cyanid ines.

69

La ract io n avec le but ano l/HCl a do nc effect ivement effect u une hydro lyse acid e des liaiso ns C 4 -C 8 liant les mo no mres t anniques ent re eux, ce qui a per mis la libr at io n des ant hocyanes.

274

546

Fig ure 36 : Spectr e mt hanoliqu e apr s le dosage butanol/HC l

70

2*Rle antimicrobien des polyphnols :

L activit antibactrienne des polyphnols teste par la mthode de la diffusion sur gel nous donne les rsultats suivants : Plante Rosmarinus officinalis Phases Ether Dilutions d0 d1 d2 10 13 16 E. Coli Staphylococcus 8 12 15 sp. 9 7 0 P. mirabilis Plante Vicia faba L. Phases Ether Dilutions d0 d1 9 11 E. Coli Staphylococcus 11 11 sp. 15 10 P. mirabilis
d inhibition (mm).

Actate d0 d1 14 15 11 13 9 10

d2 16 0 0

H2 O d0 8 12 14

d1 14 8 12

d2 17 0 7

d2 11 11 8

Actate d0 d1 13 11 12 10 11 10

d2 8 9 10

H2 O d0 7 12 10

d1 11 11 10

d2 14 10 8

Tableau 5 : Rsultats obtenus par la mthode de diffusion sur gel exprims en diamtres des zones

Remarques :
* Les tmoins ont prouv le bon fonctionnement de cette mthode : le Quebracho donne des diamtres d inhibition se situant entre 12 et 15 mm pour la majorit et le Mthanol entre 15 20 mm. *Quand on a des zones diffusionnelles, on prend en compte la distance entre le milieu du patch et la colonie la plus proche (on a alors le rayon) et on multiplie par deux (pour avoir le diamtre).

Un premier aperu du tableau nous informe que toutes les phases (ther dithylique, actate d'thyle, eau) des deux plantes R. officinalis et V. faba L. ont montr un pouvoir inhibiteur contre les bactries testes. Mme si certaines dilutions donnent un rsultat ngatif, les autres dilutions des mmes phases montrent une prsence d'inhibition : c'est juste la concentration qui intervient. On peut donc admettre que nos extraits ont une action antimicrobienne vidente contre les pathognes utiliss. Conformment aux travaux de OKIGBO (2005) et MAMATHA (2005).

71

L'analyse de l'Anova nous donne le tableau suivant :

d. d. l (n-1) (degr de libert) F (Coefficient Fischer) de Probabilit

Plantes Microorganismes Phases Dilutions Plantes.phases Microorganismes.phases Microorganismes.dilutions Plantes.microorganismes.phases

Tableau 6 : Rsultats obtenus par l'Anova

1 2 2 2 2 4 4 6

0,48 5,67 0,06 2,75 0,08 1,21 4,59 2,90

0,4951 0,0081 0,9445 0,0789 0,9209 0,3279 0,0052 0,0236

Il est facile d'en tirer, que d'aprs l'Anova, les facteurs plantes, phases et dilutions n'ont pas d'effets significatifs. Les paramtres de ces facteurs sont classs dans un mme groupe A. Par contre, le facteur microorganisme est considr comme tant trs significatif.

2.1-Facteur "Plantes " : Groupe A A Moyenne (mm) 10,556 10.000 Nombre 27 27 Plantes V. faba L. R. officinalis

Tableau 7 : Regroupement des plantes

Les 27 applications de V. faba L. donnent une moyenne de 10,556mm ; celles de R. officinalis une moyenne de 10,000mm. Ces valeurs sont trs proches. les flavonodes de R .officinalis et les tannins de V. faba L. ont tous les deux une action inhibitrice sur E. Coli, Staphylococcus sp . coagulase (+) et P. mirabilis . De plus, d'aprs ce tableau, on peut leur attribuer des pouvoirs d'action similaire en intensit.

2.2-Facteur "phases" : Groupe A A A Moyenne (mm) 10,444 10,278 10,111 Nombre 18 18 18 Plantes Ether dithylique Aqueuse Actate d'thyle

Tableau 8 : Regroupement des phases

Les phases ther dithylique nous donne des zones d'inhibition d'une moyenne de 10,44mm, la phase actate d'thyle une moyenne de 10,11mm et enfin la phase aqueuse d'une moyenne de 10,27mm. L'cart entre ces moyennes ne dpasse pas 1mm, ce qui les classe dans le mme groupe A.

72

 Les polyphnols de R. officinalis et V. faba L. extraits l'ther dithylique (acides phnols, flavones et tannins monomriques) ont une action proche de ceux extraits avec de l'actate d'thyle (flavonodes aglycones, mono et di-O-glycosides et tannins dimriques) et de ceux qui sont rests dans la phase eau. En d'autres termes, les composs phnoliques de faibles poids molculaires agissent pratiquement avec la mme intensit que ceux ayant un poids molculaire important. La structure et le degr de polymrisation n'ont donc pas une grande influence sur cette action, comme le signale SIVAKUMARAN (2004). Ceci explique le fait que MORENO (2006) travaillant avec des acides phnols, BABAYI (2004) travaillant avec des flavonodes (aglycones et glycosides) et des tannins, et DIDRAK (1999) travaillant avec des tannins affirment tous que leurs composs respectifs ont une action antibactrienne vidente.

2.3-Facteur "dilutions" : Groupe A A A Moyenne (mm) 11,000 10,889 8,944 Nombre 18 18 18 Dilutions d0 d1 d2

Tableau 9 : Regroupement des dilutions

De ce tableau, l'Anova nous indique que les dilutions n'ont aucun effet inhibiteur ; c'est-dire, qu'un polyphnol agit de la mme faon quelque soit sa concentration. Mais, nous, on considre que puisque la diffrence entre la d 2 et la d 0 est suprieure 2mm, ce facteur est significatif. D'aprs le tableau 1 (des rsultats), ceci est vident . Les boites de ptri : R. officinalis, Staphylococcus sp. , phase H 2 O. R. officinalis, P. mirabilis , phase ther dithylique. R. officinalis, Staphylococcus sp. , phase actate d'thyle. R. officinalis, P. mirabilis , phase actate d'thyle.

Ces boites ont des d 2 donnant une absence d'inhibition, alors que les d 1 donnent un effet positif. Ce qui indique que la CMI se trouve entre d 2 et d 1 la d 1 tout comme la d 0 appartiennent l'intervalle actif de la concentration, et d 2 non. Un autre cas ; la boite : - V. faba L., E. coli phase ther dithylique. Ici la d 2 donne le mme rsultat que d 1 . C est--dire que l'activit maximale correspond une concentration d 1 la d 1 et la d 0 appartiennent un intervalle o la concentration est inversement proportionnelle l'activit inhibitrice, alors que d1 n'y appartient pas. 73

 Il est donc plus juste de classer d 0 et d 1 dans un groupe et d 2 dans un autre (deux groupes A et B).

2.4-Facteur "Microorganismes" : Groupe A B B Moyenne (mm) 12,167 9,611 9,056 Nombre 18 18 18 Microorganismes E. coli Staphylococcus sp. P. mirabilis

Tableau 10 : Regroupement des microorganismes

E. coli montre ici une grande sensibilit aux composs polyphnoliques avec une moyenne de 12,16mm. Staphylococcus sp et P. mirabilis sont aussi sensibles mais des degrs infrieurs : moyennes de 9,61mm et 9,05mm respectivement. Ces rsultats contredisent ceux obtenus par DIDRAK (1999). Ce dernier obtient une plus grande inhibition de Staphylococcus sp . que de E.coli en travaillant avec des tannins de diffrentes plantes (Mimosa, Valex, Salvia sp). De mme que BABAYI obtient une rsistance de E. coli aux extraits mthanoliques d'Eucalyptus et Terminalia contenant des flavonodes et des tannins. Ces rsultats laissent croire que les polyphnols agissent de la mme manire sur des bactries ayant des parois diffrentes( E. coli et P. mirabilis sont des Gram (-) alors que Staphylococcus sp. est Gram (+)). Et on 2.5-Facteur: Microorganismes dilutions : Cette interaction un effet significatif. On remarque qu'E. coli est sensible d'autant plus que la concentration diminue. Quand la concentration est importante (d 0 ), la sensibilit est faible ; en allant vers d 1 puis d 2 , on a une augmentation de la zone d'inhibition, donc la sensibilit s'accentue. Ce mme phnomne est observ par ULANOWSKA (2006) qui travaille avec diffrents flavonodes. Ce chercheur annonce que E. coli devient rsistante quand la concentration est suprieure 0,1 mM. Le fait qu'on obtienne dans notre travail une inhibition mme d 0 nous informe que notre extrait primaire (sans dilutions) est dj de faible concentration. Pour P. mirabilis et Staphylococcus sp la sensibilit est directement proportionnelle la concentration. C'est--dire, que plus on dilue plus la zone d'inhibition diminue. 2.6-Analyse des variables (DIA) : Microorganismes/phases E. coli - Actate d'thyle E. coli H 2o 74 Moyenne 15,000 13,000 Minimum 14,000 8,000 Maximum 16,000 17,000 Ecart 2,000 9,000 peut de ce fait supposer que cette action

inhibitrice ne concerne pas les structures spcifiques des parois bactriennes.

E. coli Ether dithylique P. mirabilis Actate d'thyle P. mirabilis H 2 O P. mirabilis Ether dithylique Staphylococcus sp . Actate d'thyle Staphylococcu s sp. H 2 O Staphylococcus sp . Ether dithylique

13,000 7,667 11,000 5,333 6,667 6,667 11,667

10,000 0,000 7,000 0,000 0,000 0,000 8,000

16,000 13,000 14,000 9,000 11,000 12,000 15,000

6,000 13,000 7,000 9,000 11,000 12,000 7,000

Tableau 11 : La DIA pour R. officinalis (rsultats en mm).

Microorganismes/phases E. coli - Actate d'thyle E. coli H 2 o E. coli Ether dithylique P. mirabilis Actate d'thyle P. mirabilis H 2 O P. mirabilis Ether dithylique Staphylococcus Actate d'thyle Staphylococcus H 2 O Staphylococcus Ether dithylique

Moyenne 10,667 10,667 10,667 10,000 9,333 11,000 10,667 11,000 11,000

Minimum 8,000 7,000 9,000 10,000 8,000 8,000 9,000 10,000 11,000

Maximum 13,000 14,000 12,000 10,000 10,000 15,000 12,000 12,000 11,000

Ecart 5,000 7,000 3,000 0 2,000 7,000 3,000 2,000 0,000

Tableau 12 : La DIA pour V. faba L. (rsultats en mm).

Il en ressort de cette analyse ( DIA : action de la combinaison de deux facteurs) que : Les grandes zones d'inhibition sont enregistres pour la boite de ptri: - R. officinalis , E.coli , phase actate d'thyle avec une moyenne de 15mm. L'intervalle est de [14, 16]mm. Donc, E. coli est plus sensible aux flavonodes extraits par la phase Actate d'thyle le plus qu'aux autres polyphnols. Par contre, les plus faibles zones sont celle de la boite : - R. officinalis, P. mirabilis , phase ther dithylique avec une moyenne de 5,33mm qui est presque nulle si on tient compte du fait que le diamtre des patchs = 5mm. En d'autres termes, P. mirabilis n'est pas trs sensible aux polyphnols extraits par la phase ther dithylique (Acides phnols et flavones).

Toujours suivant les rsultats de la DIA: - E. coli est plus sensible aux flavonodes de R. officinalis rests dans la phase aqueuse et aux tannins de V. faba L. extraits par l'ther dithylique. - Staphylococcus sp coagulase (+) est plus sensible aux flavonodes de R. officinalis extraits par l'ther dithylique.

75

Ceci confirme les conclusions de CUSHNIE (2003) qui affirme que chaque compos agit diffremment sur les microorganismes. C'est--dire, qu'un compos peut avoir une action trs importante sur un germe et une action moindre, voire mme nulle sur un autre.

2.7-Conclusion : Les polyphnols ont une action inhibitrice contre E. coli , Staphylococcus sp et P.mirabilis . Donc, ils pourraient effectivement tre bnfiques en cas d'infections urinaires, de diarrhes ou d'autres pathologies dues ces germes. Ceci est le principe mme du travail de MAMATHA (2005) : Ce dernier a utilis des tannins extraits de diffrentes plantes mdicinales pour traiter les diarrhes causes par E. coli , Staphylococcus aureus et P. mirabilis .

Photo 01 : Faib le zone d inhib it ion p our la boit e de p tr i : V. fa ba L. / Ether dit hyliqu e / P . mir a bilis. / d 2 .

76

Photo 02 : Z one d inhib it ion de la b oit e de p tr i : V. fa ba L. / Ether dit hyliqu e / E. coli / d 0 .

Photo 03 : Z one difus ionnelle diff icile mes ur er pour la b oit e : V. fa ba L. / H 2 O / P . mir a bilis / d 2 .

77

Photo 04 : Agr andiss ement de la zone d inhibit ion de la boit e : R. officina lis. / H 2 O / Sta phylococcus sp. / d 0 .

Photo 05 : Z one d inhib it ion de la b oit e : V. fa ba L. / Ether dit hyliqu e / P . mir a bilis. / d 1 .

78

3*Prcipitation des macromolcules par les tannins:

Les rsultats obtenus avec la mthode tableau suivant: de la diffusion radiale sont rsums dans le

Tmoin Phase Ether dithylique Phase Actate d'thyle H2O d0 d1 d2 d0 d1 d2 0 0 25 16 14 12 8 BSA 0 18 15 14 14 11 7 Gluten 0 16 11 9 10 9 8 Amidon Tableau 13 : Rsultats obtenus sur boites de ptri (diamtres des zones en mm).

d0 12 7 9

Phase aqueuse d1 9 9 8

d2 7 10 7

D'aprs ce tableau, il est vident que les tannins ont une capacit de combinaison aux BSA, gluten et amidon. Dans certaines boites de ptri, la zone de prcipitation est trs importante et franche, comme c'est le cas de la boite : "BSA, phase ther, d 1 " qui exhibe une zone de 25mm (voir photo). Quand on a des zones diffusionnelles, on refait d'autres rptitions de la mme boite. Gnralement, ce problme disparat alors.

L'Anova nous donne le tableau suivant :

d. d. l (n-1) (degr de libert)

F (Coefficient de Fischer)

Probabilit (Prob.)

Substances Phases Dilutions

2 2 2

0,93 3,92 1,66

0,4126 0,0366 0,2162

Tableau 14: Degr de signification des diffrents paramtres .

Il ressort de ce tableau, que le seul paramtre significatif est celui des phases. Les substances donnant une probabilit (prob.) de 0,41 et les dilutions celles de 0,21 sont considres comme non-significatives. (Prob. >0,05).

3.1-Les paramtres "substances" :

Groupe A A A

Moyenne (mm) 11,667 10,222 9,889

Nombre 9 9 9

Substances Gluten BSA Amidon

Tableau 15 : Regroupement des substances

Le gluten donne une moyenne de 11,66mm, la BSA une moyenne de 10,22 mm et l'amidon celle de 9,88 mm. Ces rsultats sont trs proches et classent nos substances dans un mme groupe homogne 79

A. Mais, il est important de signaler que ces valeurs sont aussi leves, conformment au tableau des rsultats (tableau 13) : les tannins se lient aux gluten, BSA et amidon, comme dans les travaux de LE BOUVERLLEC (2005) et comme lannonce EUZEBY (2002), dans son article. LE BOUVERLLEC a travaill sur diffrents polysaccharides (cellulose, amidon, pectine) et affirme que les tannins se combinent ces derniers avec des liaisons noncovalentes. EUZEBY dans son article sur les tannins rejoint l'ide de HAGERMAN (1987) suivant laquelle ces composs phnoliques se combinent aux protines (vgtales comme animales) avec des liaisons covalentes. - L'effet antinutritionnel est donc mis en vidence ici. On remarque que le gluten et la BSA ont des moyennes suprieures celle de l'amidon : on peut suggrer que les tannins se lient de manire plus importante aux protines, conformment aux conclusions de ZIMMER(1996).

3.2-Le paramtre "phases" : Groupe A AB B Moyenne (mm) 12,556 10,556 8,667 Nombre 9 9 9 Substances Aqueuse Ether dithylique Actate d'thyle

Tableau 16 : Regroupement des phases

Dans ce tableau, l'Anova classe les phases en deux groupes diffrents. La phase aqueuse : groupe A avec une moyenne suprieure de 12,55mm. La phase ther dithylique : groupe AB avec une moyenne de 10,55mm. La phase actate d'thyle : groupe B avec une moyenne de 8,66mm. On remarque de ceci que la diffrence de moyenne entre deux phases du mme groupe est de presque 2cm, et elle est de presque 4cm pour les deux phases appartenant aux deux groupes diffrents (la phase aqueuse et la phase actate d'thyle). Ce qui explique que ce paramtre soit considr par l'Anova comme tant significatif. La phase actate d'thyle donnant les plus faibles rsultats laisse croire que les tannins dimriques qu'elle contient ont un faible pouvoir de combinaison aux composes tudis. La phase ther dithylique contenant principalement des tannins monomriques donne un pouvoir de combinaison moyen. Mais, la phase aqueuse contenant ce qui reste comme tannins (trimriques, oligomriques et polymriques) montre un trs grand pouvoir d'action.

80

Ceci s'explique peut tre par le fait que la liaison "tannin-substance" soit fonction de la structure et du degr de polymrisation des tannins. Mais, on arrive dans ce cas une contradiction, vu que la phase actate d'thyle donne des moyennes infrieures celles de la phase ther dithylique. Ou peut tre que l'effet de polymrisation n'est valable qu'aprs un certain nombre de monomres. 3.3-Le paramtre "dilutions" : Groupe A A A Moyenne (mm) 12,000 10,222 9,556 Nombre 9 9 9 Substances d0 d1 d2

Tableau 17 : Regroupement des dilutions

D'aprs l'Anova, ce paramtre est non-significatif. Mais pour nous les moyennes obtenues: d 0 : 12mm, d 1 : 10,22 et d 2 : 9,556 donnent un cart de 1,8mm entre d 0 et d 1 ce qui n'est pas ngligeable. On considre donc que la concentration du tannin a un effet significatif sur le taux de combinaison. Plus cette concentration augmente, plus le diamtre des zones d'inhibition est important : proportionnalit directe. Ce rsultat est la base des travaux de GEDIR (2005) et HAGERMEN (1987) qui se servent des diamtres des zones pour mesurer la concentration. Dans le tableau des rsultats , on a la boite ": BSA/ phase ther dithylique/ d 0 " qui donne une absence de zones. Ceci, nous laisse suggrer qu'il y a une concentration maximale partir de laquelle les tannins ne se combinent plus. C'est peut tre d l'effet strique signal par ZHANG (2002) qui a travaill sur la liaison de 10 tannins diffrents a un peptide. La combinaison selon ce chercheur est fonction de l'hydrophobicit et de l'encombrement strique :quand ces derniers sont importants, les tannins deviennent incapables de se lier au peptide utilis. 3.4-L'analyse des variables (DIA) : Cette analyse donne les rsultats suivants : Amidon phase actate d'thyle Amidon phase aqueuse Amidon phase ther dithylique BSA phase actate d'thyle BSA phase aqueuse BSA phase ther dithylique Gluten phase actate d'thyle Gluten phase aqueuse Gluten phase ther dithylique Moyenne 8,00 12,00 9,67 9,33 10,00 11,33 8,67 15,67 10,67 Minimum 7,00 9,00 8,00 7,00 6,00 8,00 7,00 14,00 7,00 Maximum 9,00 16,00 12,00 12,00 16,00 14,00 10,00 18,00 14,00 Ecart 2,00 7,00 4,00 5,00 10,00 6,00 3,00 4,00 7,00

Tableau 18: Rsultats de l'analyse DIA.(en mm)

81

L'amidon et le gluten se lient plus aux tannins de la phase aqueuse. La combinaison l'amidon et au gluten peut tre dpendante du degr de polymrisation des tannins. Et elle n'est significative pour l'amidon que quand le nombre de monomres dpasse 2. (9,67 et 8,00 sont des valeurs faibles). La combinaison est peut tre aussi dpendante de la diversit des structures tanniques (la phase aqueuse est un mlange de diffrentes structures), ou de quelques structures spcifiques ne se trouvant que dans la phase H 2 O. La BSA, quant elle, se lie pratiquement de la mme faon aux tannins des diffrentes phases. Par contre, on remarque, dithylique est un peu plus leve. On peut donc suggrer que la liaison tannin-BSA est inversement proportionnelle au degr de polymrisation. que la combinaison aux tannins de la phase ther

3.5-Conclusion : D'aprs les rsult at s de cet t e expr ience, on arr ive la conc lusio n que la co mbinaiso n des t annins aux po lymres organiques exist e, et qu'elle est peut t re dpend ant e de la st ruct ure, du degr de polymr isat ion des t annins, de la nat ure et st ruct ure de la subst ance organique, co mme le co nfir me LE BOUVERLLEC (2005). Les t ann ins causent donc une pert e de la valeur nergt ique de cert aines su bst ances (surt out prot iques) se t rouvant dans l'aliment at io n, et sont consid rs de ce fait co mme t ant ant inut r it io nnels. EL ADAWY (2000) a mis cet effet en vidence en ut ilisant les mmes subst rat s (BS A, Glut en, Amidon) ma is en suivant une aut re mt hode d'applicat ion.

82

Photo 06 : Z one de pr cip itation de la boit e : H 2 O / Glut en / d 2

Photo 07 : Agr andiss ement de la zone : H 2 O / BSA / d 2

Photo 08 : Agr andiss ement de la zone ; BS A / phas e t her dit hyliqu e / d 1

83

4*Dgradation des tannins par les moisissures :

4.1-Ensemen cement des boites : L ensemencement des bo it es de pt r i cont enant le milieu Sabouraud part ir de la so lut io n du so l donne aprs 3 jour s d incubat ions plusieur s t ypes de mycliums : vert s, no ir es, blancs... , de diffrent es st ruct ures : cotonneuses, granuleuses, poudreuses... ... On r emarque qu un myclium blanc, granuleux de fort e conidiognse no ire est t rs rpandu sur les bo it es. Sa grande vit esse de cro issance lui per met de s t aler sur de grandes sur faces du milieu. Un aut re mycliu m vert gris, au revers blanc, de st ruct ure dense et duvet euse est aussi t rs prsent sur les bo it es. Sa cro issance parait plus lent e mais t rs rpandu e (3 4 mycliu ms de 1,5cm de dia mt re dans une m me bo it e aprs 3 jo ur s d incu bat io n). On dcide de mener not re t ude sur ces deux mycliu ms qu on no mme

respect ivement : mycliu m 1 et myclium 2.

4.2-Iso lement des mycliums : Quelqu es repiquages successifs nous per mett ent d iso ler les mycliums 1 et 2. Sur le milieu Sabouraud, le myc lium 1 apparat sous for me de t halles blancs dresss avec une fort e conid iognse no ire et une st ruct ure are. Aprs 3 jo ur s d incu bat io n, il at t eint 5cm de diamt re, puis 7cm aprs 5 jours recouvrant ainsi la quasi-t ot alit de la bo it e. Le mycliu m vert gr is, quant lui prsent e une cro issance t oujours plus lent e : 2cm aprs 3 jours d incubat ion et 4cm apr s 5 jour s. Aux premier s t emps, le t halle est de co u leur vert clair, puis se t ransfo r me en vert gr is conser vant sa st ruct ure duvet euse et dense.

4.3-Observati on microscopique : Les mycliu ms iso ls so nt soumis une obser vat ion au microscope so us gro ssissement 10 puis 40 ; ceci pour essayer de dt er miner le genre et si possib le l espce des deux mycliums. Afin d avo ir une bonne appr ciat io n des st ruct ures on ut ilise une so lut io n d e lact o phno l.

84

Le mycliu m 1 : So us micro scope, ce der nier affiche un t halle clo iso nn avec des hyphes peu co lo res et t ransparent es. Les spores sont unicellulair es disposes en chape let s d ivergent s sur des st r igmat es glo buleux ; le t out port par des conidiophores no n ramifis. La for me des st r igmat es en t t e d pingle et la disposit io n des spo res no us per met t ent d ident ifier l espce : Asper gill us niger .

Le mycliu m 2 : I l app arat sous le microscope clo is onn, peu co lor et t ranspar ent . Les

conid io p ho res ne so nt pas ramifis et portent leur s ext rmit s des st r igmat es e n faisceau x et des spores en chapelet s. On peut ident ifier par cet t e obser vat ion le genr e P eni cillium. Les fruct ificat io ns rest ent d iffic iles obser ver ; on n arr ive pas dt ect er des st ruct ures bie n spar es caract r ist iques de l espce. No s deu x mycliums 1 et 2 correspondent donc A.niger et P eni cillium sp.

4.4-Croissance su r le mi lieu A : Sur ce milieu, A. niger se manifest e sous for me de t halle vert duvet eux au rever s gr is. Les co nidiophores, vert s ici, sont prsent s ds les premiers jours d incubat io n (pho t o 9). Aprs 10 jours d incubat ion, le myclium r ecouvre la t ot alit de la bo it e et se t ransfo r me en une st ruct ure plisses radialement .

Penicillium Sp , c onser ve la mme couleur et la m me t ext ure du t halle que sur le milieu Sabo uraud. Sa cro issance est plus lent e ; aprs 6 jours d incubat io n le t halle n at t eint que 3cm (phot o 11).

Ces rsu lt at s affir ment que ces deux espces A. niger et P enicillium sp sont t o ut es deu x capab les d ut iliser l acide t annique co mme seule source de car bo ne. Co nfir mant leur capacit produire la tannin-ac yl- hydro lase, confor mment au x t ravau x de S ABU (2004). La p lu s grande vit esse de cro issance d A. niger le place co mme me illeur pro duct eur de cet t e enzyme co mpare P eni cillium sp ne co nt redisant pas de ce fait les co nclusio ns de ALBE RTSE (2002) et PINTO (2001) affir mant que les

asperg illes so nt plus rent ables lors des ut ilisat io ns indust r ielles pour la product io n de la t annase sur des milieux ne cont enant que de l acide t annique. 85

4.5-Croissance su r les mi lieu x B et C : Sur ces milieux, les deux espces mo nt rent une croissance. A. niger do nne sur le milieu B un t halle blanc, dress, port eur de co nidiopho res no ir es. Le myclium cro it ici plus en haut eur que sur la sur face du milieu et p lu s en sur face qu en haut eur sur le milieu C . Cont rairement son aspect sur le milieu A, cet t e espce affiche une st ruct ure filament euse t rs are simila ire celle prsent e sur le milieu S abouraud (photo 12). Sauf qu ici, les t halles sont plus en haut eur et la conidognse est mo ins import ant e. La cro issance est visiblement t rs lent e. P eni cillim sp co nser ve le m me aspect sur les milieux B et C que sur les milieu x A et Sabo uraud : le t halle est vert clair au dbut puis devient vert gr is au revers blanc et la t ext ure est t oujours duvet euse. La cro issance, quant elle, devient enco re p lus lent e : aprs 6 jour s d incubat ion, le diamt re des mycliums n at t eint que 2,5cm (phot o 10). On en d du it que les t annases produit es par A. niger et P enici llim sp. sont tout es deu x cap ables d hydro lyser les t annins condenss en plus des t ann in s

hydro lysables (S ABU 2004 et MAKAP ATRA 2005). Cec i explique en part ie leur prsence d ans le so l ent ourant les ar bres de Quer cus suber aux corces r iches en t annins co ndenss ( KHENNOUF 2004).

4.6-Compa raison de la croi ssan ce : Les vit esses de cro issance des deux espces sur les milieux ut iliss (Sabouraud, A, B et C) peuvent t re classes co mme suit : Milieu sabo uraud > milieu A > milieu B milieu C. A. niger et P eni cillim sp. cro ient plus rapidement sur milieu Sabouraud du fait qu il co nt ienne des sources de car bo nes plus facile ment dgradables. I l reprsent e, en effet , un milieu idal pour la cro issance des mo is issures. La cro issance sur le milieu A est infr ieur e celle sur le milieu Sabourau d ind iq uant que nos mo is issures ut ilisent mo ins facile ment l acide t annique. E n ralit la t annase est une enzyme induct ible, s ynt ht ise seule ment quand il n y a que des t annins dans le milieu ( ALBERTS E 2002). Sur les milieux B et C, la cro issance est t rs faible co mpare aux aut res milieu x. Ceci no us infor me que les t annases produit es dgradent plus diffic ilement les t annins co ndenss. C est peut t re d leur grands degrs de po lymr isat ion.

86

4.7-Conclusion : A. niger et P enicillium sp. iso ls sont capables de dgrader les t annins co ndenss et les t annins hydro lysables. Ces deux espces produisent une t annin-acylhydro lase et peuvent de ce fait t re ut ilises pour la product ion indust r ie lle de cet t e enzyme. Dans ce but , il est prfrable d ut iliser l acide t annique, plut t qu u n t annin co ndens, co mme so urce de car bone du fait qu il per met t e de p lu s grandes vit esses de cro issances , et donc une meilleure product io n enzymat ique. D aut res t udes indiquent que l addit io n du glucose l acide t annique augment e enco re la product ivit . ( ALBERTSE 2002) .

87

Photo 9 : A. niger sur milieu A apr s 3 jour s d incubation

Photo 10 : P eniciullim sp sur milieu C apr s 6 jour s d incubation

Photo 12 : A. niger sur milieu B apr s 6 jour s d incu bation

Photo 11 : P enicillium sp sur milieu A apr s 6 jour s d incubation

88

5*Activit antiradicalaire des polyphnols :

Le spect ro photomt re nous indique que l absorbance init iale du DPPH 517nm est de 1.28 No s ext rait s une fo is a jout s la so lut io n de ce dernier, causent une diminut io n de l abso rbance et la st abilisent des valeur s minimales po urcent ages suivant s : Les ext raits flavoniques : Phase t her : 66,40% Phase act at e : 47,65 % Phase aqueu se : 82,81% Le spo t 7 de la phase act at e : 70,31% Le spo t du dpt de la phase act at e : 82,03% Les ext raits tanniques : Phase t her : 70,31 % Phase act at e : 82,03% Phase MEC : 78,90% Phase but ano l : 57,81% Phase aqueu se : 60,93% correspondant au x

La q uerct ine nous donne une abso rbance minima le de 0,28 , donc un pourcent ag e % inh. = 78,12% On remarq ue que nos ext rait s ont t ous diminu l absorbance du DPPH 517 n m t mo ig nant ains i de leur act io n de balayage. En effet , la diminut io n de l abso rbance correspond la diminut ion de la concent rat io n (Lo i de BEERLAMBERT) : La quant it du DPPH libre prsent dans la so lut io n 1 mo laire d iminu e do nc aprs l ajout des ext rait s. Ces der nier s sont capables de piger les rad icau x libr es. Les ext rait s : H 2 O des flavono ides, act at e et mt hylt hylct one des t annins et le spo t 7 de l act at e flavo nique do nnent les pourcent ages d act ivit plus levs qu e celu i de la q uerct ine, avec des valeur s se sit uant ent re 78,90 et 82,81%.Les aut res ext rait s do nnent des rsult at s infr ieurs. L ext rait act at e des flavo no ides quant lu i, do nne le pourcent age le plus faible (47,65 %). Ces rsu lt at s nous infor ment que les t annins de Vicia fa ba L. co mme les flavo no ides de Rosma r inus officina lis sont dot s d une act ivit ant iradicala ire 89

co mme l affir me FLORENTIN (2004) et TOHGE (2005). Cett e dernir e var iant d u n gro upe de co mposs un aut re (diffrence ent re les phases des diffrent es p lant es) et d'une mo lcule une aut re ( diffrence ent re les spot s 7 et celu i du dp t ). On exp liqu e de ce fait l'ut ilisat io n des co mposs po lyphno liques dans la fabr icat io n des mdicament s ant ir adicalaires ( flavay, daflo n). Cert ains de ces co mpo ss so nt aussi dous d'une act ivit ant io xydant e leur per met t ant d 't re ut iliss co nt re les diffr ent es ma ladies (cardio vascula ir es, peroxydat ion lipidiq ue, cancer) (NOMOTO 2004, LAHOUEL 2004, BONCHY 2001). Dans no t re t ravail, on n'est pas arr ivs au point de met t re en vidence le pouvo ir ant io xyd ant de nos ext rait s, on ne par le que du pouvo ir ant irad icala ire.

90

Conclusion gnrale:
Dans no t re t ravail, les t udes phyt ochimiques menes sur les deux plant es Rosma r inu s officina lis et Vicia fa ba L. nous ont mont r que ces deux plant es cont enaient pr inc ipale ment des flavono des de t ypes flavo ne et flavo no l pour la premire p lant e R.officina lis et des t annins de t ype procyanidines pour la deuxime.

nous a effect ivement

confir m la prsence de la lut o line,

l ap ig nine et la querct ine qui lui sont connues. Les app licat ions ralises sur Escher i chia coli , Sta phyl ococcus sp et P r oteu s mir a bili s nous ont dmo nt r que les flavono des du ro mar in ains i que les t ann in s de la fve so nt dous d une act ivit inhibit rice sur ces pat hognes. Les t ann ins de la fve ont aussi mo nt r leur grand pouvo ir de co mbina iso n au x macro mo lcules nut r it ives, expliquant de ce fait leur act io n ant inut r it ionnelle. Asper gillu s niger et P eni cillium sp ont aussi prouv leur capacit lut t er co nt re cet t e act io n en se dveloppant sur des milieux ne co nt enant que des t annin s condenss co mme seule source de carbo ne, indiquant ainsi leur apt it ude produ ir e la t annase. En der nier lieu, on a dmo nt r dans ce t ravail le r le ant ir adicalaire de no s polyp hno ls cont re le DPPH qui est un radica l st able reprsent ant les radicau x libre qu i p euvent exist er dans les cellules animales.

91

Rfrences bibliographiques:
-Albertse EH.2002. Cloning, expression and caracterization of tannase from Aspergillus species. (Magister). -Ananias RA, Haluk JP, Mongel E, Zonlatian A. 2001. Dictionnaire du hertre Fagus Sylvatica lors d'un schage conventif basse temprature. Cahiers scientifiques du bois. 15 30. -Babayi H. Kolo I, Okogum JI.2004.The antimicrobial activities of methanolic extracts of Eucalyptus camaldulensis ans Terminalia catappa against some pathogen microorganisms. Biochemisten: 16(2):102105.. -Bahorun T.1997. Substances naturelles actives: la flore mauricienne, une source dapprovisionnement potentielle. -Basile A,Giordano S, Lopez Saez JA,Cobianchi BC. 1999. Antibacterial activity of pure flavonods isolated from mosses. Phytochem : 2 (8) : 1419-82. -Bataille X. 2000. LIVRE interactif de chimie. -Batawita K, Kokon K, Akpagona K, Koumaglo K, Bouchet P. 2002. activit antifongique d'une espce en voie de disparition de la flore togalaise : Conyza aegyptiaee (L) Ait. Var. lineariloba (DC) O. Hoffum (Asteraceae). -Vanrullen IB. 2005. Scurit et Bnfices des photo-estrognes apports par l'alimentation. Recommandation. -Blytt HJ, Guscar JK, Buttler LG. 1988. Antinutritional effects and ecological significance of dietary condensed tamniu may not be due to binding and inhibiting digestive enzyme. J. Chem. Ecol. 14 (5):14551465. -Bolskakova IV. 1998. Antioxidants properties of number of plant extracts. Biofisika 43 (2):186-188. -Bruce AN, Gold LS. 1999. La recherch mensuelle n324 : 46-61. -.Chaplin AJ. 1985. Tamnic acid in histology and historical perspective. Stain-Technol.. 60 (4) : 219-31. -Chatterjee A. 2004. Inhibition of Helicobacter pylor ; in-vitro by various berry extracts with enhanced susceptibility of clarithromycine. Mol. Cell. Biochem., 265(1-2) : 19 26. -Cheruvanky H. 2004. Method for treating hepercholesterolemia, hyperlipidemia and artherosclerosis. Unitet Stat Pat:6 (4): 733-799 -.Cushnie TP, Hamilthoh VES, Lamb AJ. 2003. Assessement of the antimicrobial activity of selected flavonods and consideration of discrepancies between previous reports. Microbiol Res :158(4):281-9 -De Mejia EG. 2005. Tannins, Trypsin inhibitors and lectin cytotoxicity in therapy (Phaseolus ocutifolins) and common (Phaseolus vulgaris). Plant Food Hum Nutr: 60(3):137-45 -Del Bano MJ, Lorento J, Castillo J. 2004. Flavonod distribution during the development of leaves, flower, stems and roots od Rosmarinus officinalis. Postulation of a biosynthetic pathway. J Agric Food: 32(16):4987-92 -Delmeyda W. Remise jour 2000. mthodes de chimie analytiques et instrumentales (cours). -Delmeyda W. 2001. Mthodes analytiques en chimie instrumentale (site).chromatographie sur couche mince. -Dictionary and Encyclopedia. 2005. Produced by Lexico Publishing Group. Science direct. Com (cite). -Didrak M. 1999. antimicrobial activities of the extracts of various plants (Valex, Mimosa bark, Gallnut pownders, Salvia sp, and Phlomis sp). Journal of biology. 23: 241-248. -Dixon RA, Yuxie DE, Sharma SB. 2005.Proanthocyanidins : a final fronter in flavod research ? New Phytol: 165(1): 9-28 - Druyne T. 1999. Condensed vegetable tannius :biodiversity in structure and biological activities. Biochemical Systematies and ecology. : 27.(4): 445-459. -Efstathiou C. 1999. Monographies : plantes andiradicalaires. -El Adawy TA, Rahma EH, El-badawy AA, Sobihah TY. 2000. Effet of soaking process on nutritional quality and protein solubility of some legume seeds. Nahrung: 44(5): 339-43 -Euzby JP. 2002. Dictionnaire de bactriologie vtrinaire. -Euzby JP. 2002. Dictionnaire de Bactriologie vtrinaire. Lonepinella, Lonepinella kaolarum (Lonepinella koalarum : tannin protin complex degrading Enterobacteria(T. PCDE)).

-Euzby JP. Remise jour 2005. Dictionnaire de bactriologie vtrinaire (site). Evaluation in-vitro de la sensibilit des bactries aux antibiotiques. -Euzby JP. Remise jour. 2006. Dictionnaire bactriologie vtrinaire (site). -Masquelier J. 2006. Flavay, for a healthy mind body: (site). More from 50 years of Research Reveals the Health benefits of Flavay. -Florentin E (Relu). 2004. fruits et lgumes, polyphnols et sant. -Fortin F. 2001-2003. F2M International (site) L'indpendance pour la beaut et la sant. -Friedli GL. 1996. Bovin Sexum Albumin (BSA) and soluble wheat protein (SWP). Food Hydro :10(2) : 255-261 G.N.U. Free documentation licence. 2006. Projet de Wikipdia. (site) Gedir JV, Sporns P, Hudson RJ. 2005. Extraction of condensed tannins from cervied feed and feces and quantification using a radial diffusion assay.J.Chem.Ecol:31(12): 2761-73 Gentrie D. 2001. TP de chimie (site). Gilani GS, Cockell KA, Sepher E. 2005. Effects of antinutritional factors on protein digestibility and amino acids availability in foods. J. AOAC. Int.: 88 (3) : 967-87. Goel G, Puniya AK, Agnilar CN, Singh K. 2005. Interaction of gut microflora with tannins in feeds. Naturw.:92(11): 497-503 Gosse F, Guyot S, Roussi S, Labstein A, Fisher B, Seiler N, Raul F. 2005. Chemoproventive properties of apple procyanidins of human colon cancer-derived metastatic SW620 cells and in a rat model of edon carcinogenesis. Carcinogenesis: 26 (7) : 1291 5. Grisebach H. 1982. Anthocyanidins as food colors.641-679 Guanon D, Nitriema JB, Sourabi S, Traor LK, I, Guisson IP, Kondogbo B. 2003. Etude in vitro de l'activit antifongique d'extraits des influrescences mles de Borassus aethiopum (Mart.) Arecaceae. Hagerman AE 1987. Radial diffusion method for determining tannin in plant extract. Journal of chemical. Ecology 13: 437-449. .Hagerman A.E , L. G. Buttler. 1981. The specifity of proanthocyamidins-protein interactions. J. Biol. Chem.: 256 (44):494-497. -Hagerman AE. 1989. Chemistry od tamniu protein complexation in chemistry and significance of tannins (R. W. Hemingway and J. J. Karchesy. Eds), Plenum Press: 323-333. -Harborne JB. 1989. Recent advances in chemical ecology. Nat. Prod-Rep.: 25(7): 85-109. -.Haslam E. 1993. Skikimic acid, metabolism et metabolites.Jhon wiley and sons ( ed.) 4: 331-343. -Heimeur H. 2004. Les polyphnols de Pyrus mamorensis (Rosaceae). -Heller W, Forkmann G. 1993. The flavonods advances in research since 1986. -Ilic SB, Konstrantinovic SS, Todorovic ZB. 2004. Antimicrobial activity of bioactive component from flower of Linum capitatum Kit. Physics, chemistry and technology : 3(1), page : 73-77. -James BD , Hooper NM, Honghton JD. 2000. l'essentiel en biochimie (Livre). -Jhonson I. 1999. antioxydants et anticancreux. Biofutur .:186: 14-15. -Journal of Urology. 2002. 168, (3) : 2070. -Kandra L, Gyeman G, Zajaez A, Batta G. 2004. inhibitory effects of tamnius of human salivary -amylase. Biochem. Biophys. Res commun. 319 (4): 1265-71. -Khennouf S. 2004. Gastropropectives of polyphenolic compounds from Quercus Suber in rats and mice. J.Agric.Food.Chem:51(5):1469-73 -Kim YJ, Park HJ, Leem MJ, Chung JH, Kim HK. 2005. anticancer effects of oligomeric proanthocyanidines on human colorectal cancer cell line. SNU-C4. Agric.Food.Chem: 91(21): 7805-9 -Kocisko DA. 2004. Evaluation of new cell culture inhibitors of protease resistant prion protein against serapie infection in mice. J. Gen. Verol. 85 (8): 2479 83.

-Lahouel M, Boulkour S, Segueni N, Fillastre JP. 2004. Effet protecteur des flavonodes contre la toxicit de la vinblastine, du cyclophosphamide et du paractamol par inhibition de la peroxydation lipidique et augmentation du glutathion hpatique. Heama. :7 (3) : 313-320 -Lahouel M. 2005. Interactions flavonodes - mitochondrie et rle de la propolis dans la prvention de l'apoptose induite par certains mdicaments anticancreux. (thse de doctorat). Universit Constantine. -Latte LP, Kolodziej H.2000. Antifungal effects of hydrolysable tannins and related cpmpounds on dermatophytes, mould fungi and yeasts. Naturforch 55(5-6): 467-72 -Le Bourvellec C, Bouchet B, Renard CM. 2005. New-covalents interactions between procyanidins and apple cell wall material. Part III : Study on model polysaccharides. Biochem. Biophys. Acta. 1725 (1) : 10-8. -Le Bouverllec C. 2005. Non-covalent interaction between procyanidins and apple cell wall material. Part III : study on model. Biochem Biophys Acta 1725(1): 10-8 -Lefont R. Remise jour 2006. Mthodes physiques de sparation et d'analyse et mthodes de dosage des biomolcules. Site : Biologie et multimdia. Leitao DP, Polizello AC, Ito IY, Spadaro AC. 2005. Antibacterial screening of anthocyanic and proanthocyanic fractions from cramberry juice. J Med Food: 8(1):36-40 .-Lopez-Lazaro M 2000. Two new flavonol glycosides as DNA topoisomerase I poisons. Naturforch: 735 (11-12): 898-902 -Makapatra K. 2005. purification, characterization and some studies on secondary structure of tannase from Aspergillus awamori nakazawa. Process biochemistry. : 40( 40) : 3251-3254. -Mamatha B. 2005. Screening of medicinals plants used in Rural Indian Folk medicine for treatement of diarrhea. -Marfak A. 2003. Les aurones sont caractrises par une structure de 2-benzylidne conmaronne. -Marfak A. 2003. Radiolyse gama des flavonodes. Etude de leur ractivit avec les radicaux issus des alcools : formation de depsides. -Markham KR. 1982. Techniques of flavonodes identification. Academic Press (ed.) : 6-10. -Martini A, Katerere DR, Eloff JN. 2004. Seven flavonods with antibacterial activity isolated from Combretum erythrophyllum. J Ethnopharmacol:93 (2-3): 207-12 -Mazauric JP, Salmon JM. 2005. Interactions between yeast less and tannins and related compounds on demathophytes, mould fungi and yeasts. -Mc Dougall GJ, Shpiro F, Dobson P, Smith P, Blake A, Stewart D. 2005. different polyphenolic compound of soft fruits inhibit -amylase and -glucosidase. J. Agric.Food.Chem. : 53 (7): 2760 6. -Melignetter-Muller ML. 1995. Mthode de prcipitation des aptitudes de croissance des populations de microorganismes. (thse de doctorat). Universit Claude Bernard. Lyon-1. -Merghem R .1996. Les facteurs antinutritionnels (FAN) phnoliques de Pisum Sativum L. et de Vicia faba L. (Leguminosae) : Aspects structuraux gntiques et phnotiques.Thse Doctorat. Univ. Claude Bernard Lyon.Univ. Constantine. -Merghem R, Jay N, Burn N, Voirin B, 2004. Quantitative analysis and HPLC isolation and identification of procyanidins from Vicia faba L. Phytochem.Anal. : 15:95-99. -Mitjavila S. 1980. Problmes nutritionnels lies la presence de tannins dans les aliments. -Modak B. 2001. Activadad antibacteriana de flavonodes aslados des exudado resinosd de Heliotropium sinnuatum. Efecto del tipo de estructura. Bol Soc Quin: 47(1): 366-421 -Mole S, Waterman PG. 1987. A critical analysis of techniques of measuring tamnius in ecological studies. II. Techniques of biochemically defining tamnius. Oecologia.: 72: 148-156. -Moreno S, Scheyer T, Romano CS. Nojnov R. 2006. Antioxydant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. Free Rad Res: 40(2): 223-31

-Nakaniski K, Goto T, It S, Nabri S, Nozo S. 1975. Natural products chemistry. Academic Press (ed.) : 2: 218. -Naturforsch S. 2000. Phenolic constituents from lichen Parmotrema stuppeum. Naturforsh : 55(11-12) : 1108-22 -Nevine ES. 1999. Portail institute Pasteur. Rapport d'activit de l'unit staphylocoques pour l'anne 1999. -Newsletter N8. (site) 2005. Elment actifs du mois, par l'quipe Parabolic biologicals. -Notomo H, Ligo M, Hamada H, Kojjima S, Isuda H. 2004. Chemoprevention of colorectal cancer by group seed proanthocyanidin is accompanied by a decrease in protiferation and increase in apoptosis. Nutr. Cancer. ; 49 (1): 81 8. -Nutranews : Science, nutrition, prvention et sant. Dc. 2005. (site).Chimio prvention naturelle du cancer. A. Bouchy. -Nutranews : Science, nutrition, prvention et sant. Dcembre 2005. (Site). Directeur de la publication : L. Freeman. -Okamura N, Haraguchi H, Hashimoto S, Yagi A. 1994. Flavonods in Rosmarinus officinalis leaves. Phytochem:37(5):463-6 -Okigbo RN, Mbajinka CS, Njoku CO. 2005. antimicrobial potentials of (UDA) xylopia aethopica and Occinum gratissimum L. some pathogenous of man. -ONUAA : Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture. Rome. 1995. -Orturno A, Baidez A, Gomey P, Arenas MC. 2005. Citrus perasidi and Citrus sinensis flavonods : Their influence in the defense mechanism against Penicillium digitatum. -Pinto GAS, Leite SGF, Terz SC, Couri S. 2001. Selection of tannase producing Aspergillus niger strains. Brazilian Journal of Microbiology. 32. (1):75-79. Punyasiri PA, Abeysinghe SB,Kumar V.2005.Performed and induced chemical resistance of tea leaf against Exobasidium vexans infections. J Chem Agri:31(6):1315-24 -Ray SD, Wong V, Rinkovsky A, Bagohi M, Raje RR, Bagh D : .2000. Unique organoprotective properties of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cadmium chloride induced nephrotoxicity dimethylinitrosamine (DMN) induced splenotoxicity and mocap-induced neurotoxicity in mice. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. ; 107 (1-2): 105 28. -Renaud V, Dudouet C. 1996. Le potager. -Rsmy C. 1998. Les lgumes et fruits sources de micronutriments protecteurs. -Rsmy C. 2001. Des questions complexes. Equation-Nutrition N12. (APRIFEL). Inra. -Richter . 1993. Mtabolisme des vgtaux. Physiologie et Biochimie : 322-323 -Robert J. Remise jour 2005. Dictionnaire des cancers de A Z. -Rodzko V. 1999-2000. Abcdaire de phytothrapie. -Rosset GD(directeur gnral de l'OIV). 2002. Tannins nologiques. -Roulier G. 2002. La mthode naturelle anti-ge. -S.F.A.: Socit Franaise des Antioxydants. 2005. Conte vendu de la confrence polyphnols 2005 (23 et 24 novembre 2005). Institut des corps gras. ITERG. -Sabu A, Kiram S, Parday A. 2004. Purification and characterization of tannin-acyl-hydrolase from Aspergillus niger ATCC 16620. Bioresour Technol:96(11): 1223-8 -Sadzuka Y, Sugiyama T, Shimoi K, Kinae N, Hirota S. 1997. Protective effect of flavonods on doxorubicin induced radiotoxicity. Toxicoll Lett: 92(1) :1-7 -Scalbert A. 2001. Polyphnols du th : Sources alimentaires, consommation et biodisponibilit. -Seigler SD. 1998. Plant secondary metabolism (livre).

-Siess MH, Le Bon AM. Canivence-Lavier.2000.Mechanisms involved in the chemoprevention of flavonods. -Sivakumaran S, Molan AL, Meagher LP, Kolb B. 2004. Variation in antimicrobial action of pranthocyamidins from Dorycrium rectum against rumen bacteria. Phys Chem: 5(3):106-111 -Tanimura S, Kadomoto R, Tanaka T, Zhang VJ, Kouno I, Kohno M. 2005. Suppression of humor cell invasiveness by hydrolysable tannins (plant polyphenols) via the inhibition of matrix metalloproteinase -2/-9 activity. Biochem. Biophys. Res. Commun ; 330 (4) : 1306 13. -UNUP:The United nations university press (UNUP) 1986. Food and Press nutrition bulletin. -Tohge T, Ohme M, Takagi M, Yamazaki M, Saito K, 2005. enhanced radical scavenging activity of genetically modified Arabidopsis seeds. Biotechnol. Lett. ; 27 (5): 297-303. -Ulanowska K .2006. Differential antibacterial activity of genistein arising from global inhibition of DNA, RNA and protein synthesis in some bacterial strains. Arch. Microbial. 184 (5): 271-8. -Voirin B.1983.Spectral differenciation of 5hydroxy-3-methoxyflavones with mono-4, di 3,4 or 3,4,5 substituted B rings. Phytochem.22.p:2107-2115 -Wawizyniak JJ. 1999-2000. L'essentiel de la chimie organique. (cours). -Wikipdia. 2001. L'encyclopdie libre. -Yamanaka N, Samu O, Nagao S. 1996. Grean tea catechins such as (-) epicatechin and (-) epigallocatechin accelerate Cu+2 induced low density lipoprotein oxidation in propagation phase. -Yaou A. 2001. Contribution l'tude des composs favoniques d'une labie : le Teucrium polium (thse de magister). Universit Constantine. -Zhang XY, Tanaka T, Betsumiya Y, Kusano R. 2002. Association of tannins and related polyphnols with the peptide gramicidins. Chem..Pharm.Bull ; 50 (2) : 258-62. -Zhang WY et al. 2005. Proanthocyanidin from grape seeds potentiates anti-tumor activity of doxorubicin via immunomodulatory mechanism Int. Immunopharmacol. : 5 (7-8): 1247 57. -Zimmer Z, Cordesse R. 1996. Influence des tannins sur la valeur nutritive des aliments des ruminants. Prod Anim : 9(3) : 167-179