Ecole Doctorales des Sciences de la Vie et de la Sant

THSE
Prsente en vue de lobtention du grade de Docteur en Sciences de lUniversit de Strasbourg
Discipline : Physiologie et biologie des organismes-populations-interactions

Prvention du stress oxydant dans le diabte et ses complications par des antioxydants dorigine naturelle

Prsente par Nathalie AUBERVAL

Soutenue le 24 septembre 2010

Membres du jury et invits :

Mme Sverine SIGRIST Mme Valrie SCHINI-KERTH M. Emmanuel ANDRS Mme Fabienne FOUFELLE M. Jean-Max ROUANET Mme Agns NEUVILLE-MCHINE Mme Nathalie JEANDIDIER M. Michel PINGET

PhD, responsable du laboratoire Professeur la Facult de Pharmacie Professeur en Diabtologie Directrice de Recherche INSERM Matre de Confrence Professeur en Anatomo-pathologie Professeur en Diabtologie Professeur en Diabtologie

Directrice de thse Co-directrice Rapporteur interne Rapporteur externe Rapporteur externe Examinateur Invite Invit

Je remercie Monsieur le Professeur Michel PINGET pour mavoir accueillie au sein de son laboratoire, le Centre europen dtude du Diabte, et pour mavoir soutenue tout au long de ces trois annes de thse.

Je remercie grandement Madame le Professeur Valrie SCHINI-KERTH pour avoir codirig ce travail et pour mavoir ouvert les portes de son quipe au sein du Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie de la Facult de Pharmacie. Jadresse galement mes remerciements aux membres du jury : - Madame Fabienne FOUFELLE, que jai eu loccasion dcouter lors dune confrence la SFD sur le stress du rticulum endoplasmique et dont la prsentation mavait normment plu, - Madame le Professeur Agns NEUVILLE-MCHINE, pour mavoir conseille en histologie et partag des observations sous le microscope, - Monsieur le professeur Emmanuel ANDRS, pour avoir eu lhonneur daccepter dvaluer ce travail de diabtologie, - Et enfin, Monsieur Jean-Max ROUANET, pour avoir galement accept de faire partie du jury et pour son travail sur les polyphnols. Je noublierais pas non plus dadresser mes profonds remerciements et ma sympathie Madame le Professeur Nathalie JEANDIDIER, qui a su me guider vers des choix judicieux et qui a su mapporter toute la comprhension et la rflexion mdicale qui pouvait me manquer, en tant que chercheur et non clinicienne. Je remercie tous ceux que jai pu ctoyer de prs ou de loin, je pense notamment aux chimistes de la facult de chimie de Strasbourg, Monsieur le Professeur Andr FOUGEROUSSE et Monsieur Philippe CHABERT, merci pour vos conseils et votre aide dans ce domaine. En faisant un petit dtour lHpital Civil, jadresse mes remerciements au Docteur Ccile DEHARVENGT, jai beaucoup aim travailler avec toi, lors de la mise en place du protocole stress oxydant sur les patients, merci de ton aide. Puis en continuant mon dtour par la facult de Pharmacie, je voudrais adresser ma gratitude Cyril, merci de ta gentillesse et de tes conseils fort aviss pour certaines manips ; Camille et Jean, un gros MERCI pour votre implication dans la mise au point difficile de la cytomtrie sur mes modles et Christian aussi pour toutes mes questions ennuyeuses sur le choix des fluorochromes !

De retour au labo, Le plus gros de mes mercis va ma responsable et directrice de thse, Sverine. Sache quil nest pas facile dcrire un remerciement, il y a beaucoup de choses dire mais je vais faire simple. Durant ces trois annes, tu mas guide dune main de matre et le rsultat est l aujourdhui, plus que positif, et pas uniquement au niveau professionnel. Merci pour ta confiance, tes conseils aguerris du dbut jusqu la fin de laventure. Comme tu dis, les bbs chercheurs ont du mal quitter le CeeD, je crois que tu vas avoir un exemple de plus Sache que pour certains (je dirais plutt certaines) dentre nous, tu reprsentes un modle de russite en conjuguant la fois, les plans professionnel et priv. Mais cela, tu le dois ta force intrieure, ne change pas. Souvent je me suis dit jaimerais tre un jour tre ce quelle est (je ne fayote pas, cest vrai !). Jaimerais aussi te remercier pour mavoir aide et ouvert la porte quand jen ai eu besoin, simplement Merci.

Que serait le labo sans ses joyeux lurons : William et Allan, les compres de toujours ; Kvin, courage, cest bientt ton tour ; une petite pense galement pour Rachid et Franois, pour lun la thse est acheve, pour lautre jespre que tu vas bientt finir ! Un petit mot aussi pour ne pas oublier notre animalier prfr, Claude. Merci pour toutes les btises et blagues que tu racontes (bien que tu ne sois pas le seul) et qui me font sourire. Je nai aucunement oubli les filles du labo !!! Elodie, trouve ici tous mes remerciements pour ta gentillesse, ton rendement ingalable au travail, cest grce toi que jai pu finir temps. Merci aussi pour lorthographe et la grammaire Nathalie R, merci davoir t ma copine de bureau pendant plusieurs mois, tout ce qui a attrait au chocolat me fera toujours penser toi ! Sabrina, merci davoir t avec nous, pendant un temps trop court mon avis, mais cela a t rel plaisir de te connatre ainsi que ta petite famille et la charmante Dd (qui me fait plus penser au cochon du jeu de loie), jespre quon ne soubliera pas ! Un gros Merciiiii tout particulier Nathalie S. Tu as su prendre sous ton aile la petite lorraine que je suis et me faire dcouvrir de superbes endroits et surtout de bons restos Merci pour cela, pour ton amiti et commence par une verveine le matin (lol). La dernire personne que je voudrais remercier, cest Stphanie. Je tai connue en pharma, et jai beaucoup apprci de travailler avec toi, la preuve aujourdhui, Stress Oxydant va continuer par toi et je suis fire que ce soit toi qui reprennes le flambeau ! Merci pour ton amiti, ton aide et ta gentillesse et promets moi de ne plus faire de cuves organes isols jusque 0h, jai eu la trouille ce coup-l.

Un gros merci aussi aux NewThera Girls, Gigi qui est partie au pays des horlogers et Akkiz, ma compagne de clin pour me remonter le moral : Merci ! Je noublie pas non plus Pierre et JeanChristophe. Une petite pense galement pour les stagiaires qui mont aid tout au long de ma thse, Alex, Emilie, Ramadhani et Marion, Merci pour votre implication.

Merci aussi tout le personnel de la grande maison IPS Strasbourg, je pense notamment aux filles de lASDIA, du rsoDIA, la communication et ladministration. Aux prsents et aux absents qui mont soutenu et aid ; Maman, Papa, Zazou et Xav, vous me manquez malgr la conjoncture. Enfin, je terminerais en remerciant la personne que jaime, Sylvain. Merci davoir suivi tout ce travail fatigant, et de ty tre intress, bien que la bio ne soit pas ta passion. A toi mon cur, merci pour ton aide quotidienne, ton soutien sans faille, dans les moments faciles, comme les difficiles, dans les moments de doutes et de remises en question. Merci davoir partag de nombreux moments avec moi, pourvu que a continue, et je nen doute pas. Enfin, Merci pour ton amour et ta gentillesse sans bornes.

Merci toutes les autres personnes que jai connu mais que je nai pas cites. Jespre navoir oubli personne, dans le cas contraire merci.

Sommaire
SITUATION DU PROJET DE RECHERCHE ................................................................................. 20 INTRODUCTION ............................................................................................................................. 22 I. Le diabte ................................................................................................................................... 22 A. Mtabolisme et contrle de la glycmie ................................................................................. 22 1. Maintien de la glycmie ..................................................................................................... 22 2. Le pancras les lots de Langerhans ................................................................................ 22 a) La fonction exocrine ........................................................................................................................ 23 b) 3. Glucagon et Insuline .......................................................................................................... 24 a) Le glucagon : structure, biosynthse, scrtion et mcanisme daction ..................... 24 b) Linsuline : structure, biosynthse, scrtion et mcanisme daction ......................... 26 La fonction endocrine ..................................................................................................................... 23

B. 1. 2. 3.

La pathologie diabtique ........................................................................................................ 29 Le diabte ........................................................................................................................... 29 La prvalence ..................................................................................................................... 30 Le diabte de type 1 ........................................................................................................... 31 a) Physiopathologie du diabte de type 1 .................................................................................... 31 b) c) d) Facteurs gntiques et facteurs dclenchants ...................................................................... 31 Production dauto-anticorps ........................................................................................................ 32 Mcanisme de destruction de la cellule ............................................................................... 32

4. a) b) c) d) e) C.

Diabte de type 2................................................................................................................ 34 Intolrance au glucose.................................................................................................................... 34 Cas particuliers de lintolrance au glucose : lhyperinsulinisme ................................. 34 Facteurs de risque ............................................................................................................................ 35 Mcanisme de linsulino-rsistance .......................................................................................... 36

Les complications lies au diabte ......................................................................................... 38 1. Les complications aiges ................................................................................................... 38 a) Lhyperglycmie................................................................................................................................ 38 b) a) b) 3. a) a) b) 2. Lhypoglycmie ................................................................................................................................. 38

Apoptose des cellules .................................................................................................................. 37

Les complications chroniques ............................................................................................ 39 Microangiopathies ........................................................................................................................... 40 Macroangiopathies .......................................................................................................................... 41 Pathologie associes au diabte de type 2 : la statose hpatique ..................................... 41 Gnralits .......................................................................................................................................... 41 Statose microvsiculaire et macrovsiculaire .................................................................... 42 Formation de la statose hpatique .......................................................................................... 43

D. Les traitements du diabte ...................................................................................................... 43 1. Linsulinothrapie et ses analogues ................................................................................... 43

2. 3. 4.

b) 5.

Les traitements mdicamenteux ......................................................................................... 49 a) Les antidiabtiques oraux (ADO) ............................................................................................... 49 b) Les incrtines et incrtino-mimtiques ................................................................................... 50

La greffe de pancras ......................................................................................................... 48 La transplantation dlots de Langerhans ........................................................................... 48 Les mesures hygino-dittiques ....................................................................................... 48 a) Lalimentation.................................................................................................................................... 48 Lactivit physique ........................................................................................................................... 49

II.

Le stress oxydant et le diabte ................................................................................................... 50 A. Le stress oxydant et les systmes de dfenses........................................................................ 50 1. Dfinition du stress oxydant .............................................................................................. 50 2. Les entits oxydantes et leur production ............................................................................ 51 a) La production des entits oxydantes au niveau cellulaire ............................................... 52 b) 3. a) b) c) 4. Les facteurs environnementaux comme source de ROS ................................................... 53 Rle physiologique des entits oxydantes ......................................................................... 53 Messagers intra et extracellulaire.............................................................................................. 54 Rgulation du tonus vasculaire et autre fonction du NO .................................................. 54 Dfense immunitaire et Burst Oxydatif ............................................................................ 54

Les cibles biologiques du stress oxydant ........................................................................... 55 a) Les lipides............................................................................................................................................ 55 b) c) d) Les acides nucliques...................................................................................................................... 56 Les protines ...................................................................................................................................... 57 Le stress oxydant et les pathologies ................................................................................... 58 Lischmie re-perfusion ................................................................................................................. 58 Lge....................................................................................................................................................... 59 Les maladies neurodgnratives ............................................................................................. 59 Le diabte ............................................................................................................................................ 59 Lathrosclrose................................................................................................................................ 58 Le cancer .............................................................................................................................................. 59 Les sucres ............................................................................................................................................ 58

5. a) b) c) d) e) f) B. 1.

Implications du stress oxydant dans le diabte et pathologie associe .................................. 60 Glutotoxicit lie lhyperglycmie .................................................................................. 60 a) Lauto-oxydation du glucose ........................................................................................................ 60 b) c) La voie des polyols ........................................................................................................................... 61 La voie de la PKC............................................................................................................................... 62 d) Glycation des protines et formation des AGEs ................................................................... 62 Dfenses antioxydantes des cellules ..................................................................................... 65

2. 3.

Stress oxydant et hyperinsulinisme (cas du diabte de type 2) .......................................... 64 Molcules pro-oxydantes et antioxydantes de la cellule ................................................. 64 a) Enzyme pro-oxydante : la NADPH oxydase ........................................................................... 64 b) Effet du stress oxydant sur linsulino-scrtion et linsulino-rsistance............................ 65 Prventions par les antioxydants ............................................................................................ 67

4. III.

A. Gnralits .............................................................................................................................. 67 1. Dfinition ........................................................................................................................... 67 2. Les systmes de dfenses antioxydants ............................................................................. 68 a) Les enzymes antioxydantes.......................................................................................................... 68 b) 3. 4. 5. Les systmes antioxydants non enzymatiques et leurs effets ........................................ 70 Pourquoi avons-nous besoin des antioxydants de lalimentation ?.................................... 74 Risques des antioxydants ................................................................................................... 76 Etudes pidmiologiques ................................................................................................... 76 a) Etudes ATBC et CARET ................................................................................................................... 76 b) B. Etude SU.VI.MAX ............................................................................................................................... 76

Les antioxydants dans le diabte ............................................................................................ 77 1. Les vitamines, coenzyme et oligo-lments ...................................................................... 77 2. Les composs dorigine naturelle non vitaminique ........................................................... 78 a) Les flavonodes en gnral ........................................................................................................... 78 b) Le curcumin ........................................................................................................................................ 79 Les polyphnols...................................................................................................................... 79 Gnralits sur les polyphnols.......................................................................................... 79 Le french paradox .............................................................................................................. 80 Quelques polyphnols du raisin ......................................................................................... 81 a) Le resvratrol (trans) ..................................................................................................................... 81 b) c) 4. 5. Le resvratrol cis .............................................................................................................................. 81 La procyanidine B2 .......................................................................................................................... 82

C. 1. 2. 3.

Leffet antioxydant des polyphnols .................................................................................. 82 Effet des polyphnols de vin rouge dans la pathologie diabtique .................................... 83 D. Le th ...................................................................................................................................... 83 1. Gnralits sur le th .......................................................................................................... 83 a) Les principes actifs .......................................................................................................................... 83 Effets gnraux de lEGCG ............................................................................................... 85 Effet du th vert et de lEGCG sur le diabte .................................................................... 87 E. Lexercice physique : oxydant ou antioxydant ? .................................................................... 87 OBJECTIFS ....................................................................................................................................... 90 MATERIELS ET METHODES......................................................................................................... 91 I. Etudes des antioxydants sur des cellules bta pancratiques ..................................................... 91 A. Matriels ................................................................................................................................. 91 1. Ligne cellulaire ................................................................................................................. 91 2. Molcules antioxydantes .................................................................................................... 91 3. Molcules induisant un stress oxydant............................................................................... 92 B. Mthodes ................................................................................................................................ 92 1. Viabilit cellulaire .............................................................................................................. 92 2. Dtection de lapoptose par cytomtrie en flux (Annexine V-PE) .................................... 93 3. Dtection de lapoptose par cytomtrie en flux (Caspase 8 et 9)....................................... 94 4. Mesure de la production de peroxyde dhydrogne par cytomtrie en flux (DCFH-DA) . 94 5. Etudes des gnes du stress oxydant et des dfenses antioxydantes par RT-qPCR array ... 95 6. Enzymes antioxydantes CAT et SOD ................................................................................ 97 7. Dtection des protines carbonyles par ELISA................................................................ 97 8. Mesure de la peroxydation lipidique .................................................................................. 98 9. Analyses statistiques .......................................................................................................... 99 II. Etudes des antioxydants in vivo chez le rat hyperinsulinique .................................................... 99 2. 3.

A. Mise au point du modle animal ............................................................................................ 99 B. Etudes des antioxydants et de lexercice physique .............................................................. 100 C. Mthodes .............................................................................................................................. 101 1. Masse des animaux et prparation des biberons dantioxydants / placbo ...................... 101 2. Sacrifices, prlvement des organes et dissections des artres ........................................ 101 3. Etudes biochimiques plasmatiques .................................................................................. 102 a) Dosage des protines totales .................................................................................................... 102 b) c) d) e) f) 4. a) b) 5. a) b) c) 6. Etude de la glycmie .................................................................................................................... 102 Dosage du C-peptide .................................................................................................................... 103 Dosage de la proinsuline ............................................................................................................ 103 Dosage des triglycrides ............................................................................................................. 104 Etude de linflammation par la protine C-ractive ......................................................... 104

Etude du stress oxydant.................................................................................................... 104 Dosage des lipides peroxyds par la mthode TBARS .................................................... 104 Dosages des protines carbonyles du plasma ................................................................. 105 Conglation et inclusions des organes prlevs ............................................................... 105 Conglation sec ........................................................................................................................... 105 Inclusions dorganes en paraffine ........................................................................................... 106 Conglation en OCT ...................................................................................................................... 106

Etudes histologiques ........................................................................................................ 106 a) Mise en vidence des plaques dathrome dans laorte ................................................. 106 b) c) Coupe au microtome et dparaffinage de lames ............................................................... 107 Coloration hmatoxyline / osine ......................................................................................... 107 d) e) Coloration au trichrome de Masson ....................................................................................... 108 Mise en vidence de ROS tissulaire ........................................................................................ 108

7. Etude immuno-histologique : immuno-marquage insuline .............................................. 109 8. Analyses statistiques ........................................................................................................ 110 RSULTATS ................................................................................................................................... 111 I. tude in vitro du stress oxydant et prvention par des antioxydants ....................................... 111 A. Mise au point du modle de stress oxydant.......................................................................... 111 B. tude des effets des antioxydants sur la viabilit des cellules ............................................. 113 C. Effet prventif des antioxydants .......................................................................................... 115 D. Etude de lapoptose par lannexine-V .................................................................................. 118 E. Etude de lapoptose par les caspases 8 et 9 .......................................................................... 119 F. tude de lexpression des gnes du stress oxydant ............................................................. 120 G. tude de lexpression des enzymes antioxydantes : catalase et superoxyde dismutase...... 123 H. Quantification de la production intracellulaire dH2O2 ........................................................ 125 I. Consquence du stress oxydant ............................................................................................ 127 1. Sur la quantit de lipides peroxyds ................................................................................ 127 2. tude de la carbonylation des protines .......................................................................... 129 II. tude in vivo de leffet des antioxydants sur un modle de rats intolrants au glucose .......... 131 A. Mise au point du modle de diabte de type 2 ..................................................................... 131 1. Effet des rgimes normocalorique ou hypercalorique sur la glycmie ............................ 131 2. Effet des deux rgimes sur la C-peptidmie .................................................................... 133 3. Effet des rgimes alimentaires sur la prise de masse des animaux .................................. 134 4. Effet des traitements sur lhistologie du pancras ........................................................... 135

a) b) c) 5. a) b) B. 1.

Coloration Hmatoxyline / osine ......................................................................................... 135 Mesure de la taille des lots aprs coloration Hmatoxyline / osine...................... 136 Coloration au trichrome de Masson ....................................................................................... 138 Effet des traitements sur lhistologie du foie ................................................................... 139 Coloration Hmatoxyline / osine ......................................................................................... 139 Coloration au trichrome de Masson ....................................................................................... 140

tude in vivo de leffet des antioxydants ............................................................................. 142 tude du stress oxydant.................................................................................................... 142 a) Dosage des lipides peroxyds par la mthode TBARS .................................................... 142 b) Effet des traitements sur la carbonylation des protines.............................................. 145 tude mtabolique............................................................................................................ 148 a) Masse des animaux ....................................................................................................................... 148 b) c) d) e) f) g) h) Glycmie plasmatique ................................................................................................................. 151 C-peptidmie ................................................................................................................................... 152 Pro-insulinmie.............................................................................................................................. 155 tude histologique du pancras .............................................................................................. 157 Marquage du pancras la DHE .............................................................................................. 166 Dosage des triglycrides ............................................................................................................. 169 Dosage de la protine C-ractive ............................................................................................. 172

2.

3. 4.

Complications cardiovasculaires : dpt de plaques dathrome dans laorte................. 174 Complication hpatique ................................................................................................... 176 a) tude de la masse des foies ....................................................................................................... 176 b) c) tude histologique par la coloration Hmatoxyline / osine ...................................... 178 Marquage du foie la DHE......................................................................................................... 182

Discussion in vitro ........................................................................................................................... 186 Discussion in vivo ............................................................................................................................ 193 Conclusions ...................................................................................................................................... 204 Perspectives ...................................................................................................................................... 206 Bibliographie .................................................................................................................................... 208 Communications .............................................................................................................................. 242 Valorisation des comptences, un Nouveau Chapitre de la thse .............................................. 244

Liste des abrviations

4-HNE ADO ADP ADN AEC AGEs AGNE ALAT AMPc AOC ARNm ASAT ATBC ATP AVC BB BER BSA CARET CAT CMH COX CPA Cu DAG DAISY DID DMF DMLA DNase

4-hydroxynonenal Anti diabtiques oraux Adnosine di-phosphate Acide DsoxyriboNuclique 3-amino-9-thyl-carbazole Advanced Glycation End products Acide gras non estrifi Alanine-Amino Transfrase Adnosine mono-phosphate cyclique Appellation dorigine contrle Acide ribonuclique messager Aspartate amino transfrase Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Adnosine tri-phosphate Accident vasculaire crbral Bio Breeding Base Excision Repair Bovine Serum Albumin -Carotene and Retinol Efficacy Trial Catalase Complexe majeur dhistocompatibilit Cyclo-oxygnase Cellule prsentatrice de lantigne Cuivre Diacylglycrol Diabetes Autoimmunity Study in the Young Diabte insulino-dpendant Dimthylformamide Dgnrescence maculaire lie l'ge Dsoxyribonuclase 9

DNID DPP-4 EGCG Fe G6P GABA GAD GK GLP-1 GLUT 4/2 GMPc Gpx GR GRPP GSH GSSG HIT-T15 HPLC HX IA-2 IAA IDF IFN IKK IL-1 IL-2 IMC iNOS ip IP IRS iv K+ kb kDa

Diabte non insulino-dpendant Dipeptidyl peptidase-4 pigallocatchine gallate Fer Glucose 6 phosphate -amino butyrique acid Glutamic acid decarboxylase Goto-Kakizaki Glucagon-like peptide-1 Glucose transporter Guanosine mono-phosphate cyclique Glutathion peroxydase Glutathion rductase Polypeptide li la glicentine Glutathion (forme rduite) Glutathion (forme oxyde) Hamster insulinoma T15 High Performance Liquid Chromatography Hypoxanthine Islet Antigen 2 Insulin Auto-Antibody International Diabetes Federation Interfron IB kinase Interleukine 1 Interleukine 2 Indice de masse corporelle Inductible NOS intra-pritonal Intermediate Peptides Insulin receptor substrate intra-veineux Potassium kilo base kilo Dalton 10

LDL MAPK MDA MIN-6 Mn MPFG MPO NAD+ NADP

+

Low Density Lipoprotein Mitogen-Activated Protein Kinase Malondialdhyde Mouse insulinoma Manganse Fragment proglucagon majeur Myloperoxidase Nicotinamide adnine dinuclotide (forme oxyde) Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate (forme oxyde) Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate (forme rduite) Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate oxydase Non alcoholic steatosis hepatitis Nucleotide excision repair Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Nitric oxyde Non Obese Diabetic Nitric oxide synthase Non significatif Organisation Mondiale de la Sant Oxygen Radical Absorbance Capacity Procyanidine B2 Phosphate-buffered saline Paraformaldhyde Phosphoinositide 3-kinase Protine kinase A Protine kinase C Polynuclaire neutrophile Poly Peptides Peroxisome proliferator-activated receptor Receptor of advanced glycation end products Resvratrol cis Reactive chlorine species Rticulum endoplasmique Rat insulinoma m5F Ribonuclase 11

NADPH, H+ NADPH oxydase NASH NER NFB NO NOD NOS NS OMS ORAC PB2 PBS PFA PI3K PKA PKC PN PP PPAR RAGE Rc RCS RE RINm5F RNase

RNS ROS Rt Se SOD STZ SU.VI.MAX TBA TBARS TCA TCR TMB TNF Tyr UI UV VLDL XO Zn

Reactive nitrogen species Reactive oxygen species Resvratrol trans Slnium Superoxyde dismutase Streptozotocine SUpplmentation en VItamines et Minraux Anti-oXydants Thio barbituric acid Thio Barbituric Acid Reactive Substances Trichloroactique acid T cell receptor ,,5,5-ttramthylbenzidine Tumor Necrosis Factor Tyrosine Unit internationale Ultraviolet Very Low Density Lipoprotein Xanthine oxydase Zinc

12

Liste des figures

Figure 1 : Reprsentation d'Haworth du D-glucose. .......................................................................... 22 Figure 2 : Anatomie du pancras. ...................................................................................................... 23 Figure 3 : Distribution des diffrents types cellulaires dans un lot de Langerhans (Cabrera et al., 2006). ................................................................................................................................................. 24 Figure 4 : Structure primaire du glucagon (Daprs G. Dolisi). ........................................................ 24 Figure 5 : Structure du proglucagon et synthse des diffrents peptides dans les cellules (Daprs Taylor et Francis group, 2010). .......................................................................................................... 25 Figure 6 : Mcanisme de scrtion du glucagon de la cellule (source personnelle). ...................... 25 Figure 7 : Voie de signalisation du glucagon dans la cellule hpatique (Daprs Jaspard E, 008). 26 Figure 8 : Structure primaire de linsuline (Daprs G. Dolisi). ........................................................ 27 Figure 9 : Transcription et traduction de linsuline (Raynal et Cortie, ouvrage Le diabte de type 2: aspect fondamentaux ). ................................................................................................................ 27 Figure 10 : Mcanisme de libration de linsuline de la cellule (source personnelle). ................... 28 Figure 11 : Transduction du signal par linsuline (source personnelle, daprs Voet & Voet, Edition deBoeck, 2005). ................................................................................................................................. 29 Figure 1 : Prvalence du diabte trait par dpartement en 007 (rgime gnral de lassurance maladie franaise ; Kusnik-Joinville et al., donnes INVS 2008). .................................................... 30 Figure 13 : Mcanisme de destruction auto-immune de la cellule dans le diabte de type 1 (modifi daprs Pirot et al., 2008). ................................................................................................... 33 Figure 14 : Hyperinsulinisme et diabte de type 2 (donnes personnelles). ...................................... 34 Figure 15 : Facteurs contribuant l'apoptose des cellules (Source personnelle). ........................... 37 Figure 16 : Les complications cardiovasculaires lies au diabte (Dossier Sant Diabte de type 2, GSK, 2009). ....................................................................................................................................... 39 Figure 17 : Thorie du double hit pour le dveloppement des NAFLD (Buqu et al., 2008). .......... 42 Figure 18 : Exemple de statose micro et macrovsiculaire (D'aprs le Dr Antonini, CHB- Hpital Paul Brousse). .................................................................................................................................... 42 Figure 19 : Etapes mtabolique conduisant la formation de la statose hpatique (Robichon et al., 2008). ................................................................................................................................................. 43 Figure 0 : Caractristiques des diffrentes classes danalogues de l'insuline (liste non exhaustive). ............................................................................................................................................................ 44 Figure 21 : Schma basal/bolus physiologique de l'insuline. ............................................................ 45 Figure 22 : Sites d'injections prfrentiels d'insuline ou analogues de l'insuline (Source : "Mon guide de l'injection" BD, 2009). ......................................................................................................... 45 Figure 23 : Photographie d'une pompe insuline externe, relie un cathter sous-cutan. ............ 46 Figure 24 : Photographie d'une pompe insuline implantable. ......................................................... 47 Figure 25 : Dispositif du pancras artificiel implant. ....................................................................... 47 Figure 26 : Dispositif du pancras artificiel pompe externe. .......................................................... 47 Figure 27 : Chaine respiratoire de la mitochondrie............................................................................ 51 Figure 28 : Schma rcapitulatif des sources des ROS, des enzymes impliques dans la dfense antioxydantes et des cibles biologiques (source personnelle). ........................................................... 52 Figure 29 : Raction de Fenton. ......................................................................................................... 53 Figure 30 : Schma de peroxydation lipidique (D'aprs Douste-Blazy and Mendy, 1988). ............. 55 Figure 31 : Types de lsions de l'ADN provoqus par les attaques radicalaires (d'aprs Favier, 2003). ................................................................................................................................................. 57 Figure 32 : Reprsentation selon la projection de Fischer du glucose et de sa forme ne-diol (Thornalley et al., 1999). ................................................................................................................... 60 13

Figure 33 : Voie des polyols et autres voies du catabolisme du glucose (Thse de C. Januel, 2003). ............................................................................................................................................................ 61 Figure 34 : Consquences de l'activation de la PKC induite par l'hyperglycmie (Brownlee, 2005). ............................................................................................................................................................ 62 Figure 35 : Formation des AGEs par la voie de Maillard (Thse de C. Januel, 2003). ..................... 63 Figure 36 : Reprsentation schmatique de la NADPH de type phagocytaire sous forme active (Ray and Shah, 2005).................................................................................................................................. 65 Figure 37 : Effet du stress oxydant sur l'insulino-scrtion. .............................................................. 66 Figure 8 : Mcanisme de rsistance linsuline induite par les ROS (source personnelle, daprs Voet & Voet, Edition deBoeck, 2005). .............................................................................................. 67 Figure 39 : Dsquilibre entre les molcules pro-oxydantes et les systmes de dfenses antioxydantes lors du stress oxydant (source personnelle). ............................................................... 68 Figure 40 : Pyramide des systmes de dfenses antioxydants (source personnelle). ........................ 68 Figure 41 : Formule semi-dveloppe du glutathion rduit (GSH). .................................................. 71 Figure 42 : Structure chimique de l'alpha-tocophrol ou vitamine E (d'aprs Flora et al., 2008). .... 71 Figure 43 : Structure l'acide L-ascorbique (d'aprs Flora et al., 2008). ............................................. 71 Figure 44 : Structure du -carotne (d'aprs Flora et al., 2008). ....................................................... 72 Figure 45 : Tableau des principaux flavonodes (Garcia-Lafuente et al., 2009). .............................. 73 Figure 46 : Tableau rcapitulatif mais non exhaustif des aliments les plus riches en antioxydants (Wu et al., 2004). ............................................................................................................................... 75 Figure 47 : Les diffrentes de polyphnols. ....................................................................................... 79 Figure 48 : Illustration du French Paradox (Olivier Danchin, 2000). ................................................ 80 Figure 49 : Formule du resvratrol trans ou trans-3, 4', 5' trihydroxystilbne (Orallo et al., 2002). 81 Figure 50 : Formule du resvratrol cis. .............................................................................................. 81 Figure 51 : Formule de la procyanidine B2 ou picatchine-(4 -8)-picatchine (Li and Jiang, 2007). ................................................................................................................................................. 82 Figure 52 : Les catchines du th (Higdon and Frei, 2003). .............................................................. 84 Figure 53 : Capacit antioxydante de l'EGCG Teavigo (DSM Nutritional Product). ...................... 85 Figure 54 : Chromatogramme des composants du th vert et du th noir (Stewart et al., 2005)....... 86 Figure 55 : Effet de l'exercice contre un stress sdentaire (adapt de Radak et al., 2000). ............... 88 Figure 56 : Analyses des rsultats par le logiciel Cytosoft 5.3. ......................................................... 94 Figure 57 : Plan de plaque des gnes Rat oxidative stress and antioxydant defense (PARN065A, SABiosciences) ........................................................................................................... 96 Figure 58 : Etude de deux solutions de Teavigo par HPLC. ............................................................ 100 Figure 59 : Nage des rats en piscine (source personnelle). .............................................................. 101 Figure 60 : Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes de peroxyde d'hydrogne pendant 30 minutes. ..................................................................................................... 111 Figure 61 Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes de streptozotocine (STZ) pendant deux heures..................................................................................... 112 Figure 6 : Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes dun mlange dhypoxanthine (HX) et de xanthine oxydase (XO) pendant une heure. ......................................... 112 Figure 6 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence dextrait de polyphnols de vin rouge. ............................................................................................. 113 Figure 64 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de resvratrol trans. .............................................................................................................................. 113 Figure 65 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de resvratrol cis. .................................................................................................................................. 114 Figure 66 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de l'EGCG. ............................................................................................................................................ 114 Figure 67 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de procyanidine B2. .............................................................................................................................. 115 14

Figure 68 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 40mol/L de peroxyde d'hydrogne. .................... 116 Figure 69 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 25mmol/L de STZ, pendant 2 heures. ................... 116 Figure 70 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 0,25mmol/L d'HX et 10mU/mL de XO, pendant une heure. ................................................................................................................................................ 117 Figure 71 : Quantification de lapoptose des cellules RINm5F en % en prsence de peroxyde dhydrogne pendant une heure et de cinnamaldhyde oxyd pendant 4 heures. ......................... 118 Figure 72 : Quantification de l'apoptose en % par l'activation des caspase 8 et 9 de cellules RINm5F soumises des concentrations de peroxyde d'hydrogne pendant 30 minutes. ............................... 119 Figure 73 : Quantification de l'apoptose en % par l'activation des caspase 8 et 9 de cellules RINm5F soumises un stress par le peroxyde d'hydrogne, en prsence ou non dantioxydants pr-incubs pendant une heure. ........................................................................................................................... 120 Figure 74 : Clustergramme de l'expression des gnes du stress oxydant. ....................................... 121 Figure 75 : Expression diffrentielle des gnes entre les groupes tmoin et soumis un stress oxydant par H2O2. ............................................................................................................................ 122 Figure 76 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par 40mol/L dH2O2 et en prsence ou non dantioxydants. ..................................................................................................................... 123 Figure 77 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par 25mmol/L de STZ et en prsence ou non d'antioxydants. ...................................................................................................... 124 Figure 78 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par un couple HX/XO et en prsence ou non d'antioxydants. ..................................................................................................................... 125 Figure 79 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence d'H2O2 40mol/L pendant 30 minutes, et/ou d'antioxydants pendant une heure. ................................................................................................... 125 Figure 80 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence de STZ 25mmol/L pendant 2 heures, et/ou d'antioxydants pendant une heure. ........................................................................................................................... 126 Figure 81 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence d'HX/XO pendant une heure, et/ou d'antioxydants princubs une heure. ............................................................................................................................ 127 Figure 82 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur des cellules RINm5F en prsence d'H2O2 40mol/L et/ou d'antioxydants. ............................................................................ 127 Figure 83 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur des cellules RINm5F en prsence de STZ 25mmol/L pendant deux heures, et/ou d'antioxydants pendant une heure. ....... 128 Figure 84 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur les cellules RINm5F en prsence de 0,25mmol/L d'HX et de 10mU/mL de XO pendant une heure, et/ou d'antioxydants princubs pendant 1 heure. .................................................................................................................. 129 Figure 85 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence d'H2O2 40mol/L pendant 30 minutes et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. .......................................................................................................................................................... 129 Figure 86 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence de 25mmol/L de STZ pendant 2 heures et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. .......................................................................................................................................................... 130 Figure 87 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence de 0,5mmol/L dHX associs 10mU/mL pendant 1 heure et/ou d'antioxydants princubs pendant 1 heure. .................................................................................................................. 131 15

Figure 88 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par l'alimentation normocalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. ............................................................................................................................... 131 Figure 89 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par l'alimentation hypercalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. ............................................................................................................................... 132 Figure 90 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par les alimentations normocalorique ou hypercalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. ........................................................................................ 132 Figure 91 : Mesure du taux de C-peptide plasmatique chez des animaux ND et HFD aprs deux mois de rgimes, en condition jeun et post-prandiale 30 minutes. ............................................... 133 Figure 92 : Mesure du taux de C-peptide plasmatique chez des animaux aprs 7 mois de rgimes ND ou HFD, en condition jeun ou post-prandiale. ....................................................................... 134 Figure 93 : Mesure de la masse des rats nourris par l'alimentation normocalorique ou hypercalorique, tout les mois, pendant 7 mois ................................................................................. 135 Figure 94 : Photographies de coupes histologiques de pancras de rats aprs coloration HE. ........ 136 Figure 95 : Mesure de la taille des lots de Langerhans, aprs deux mois de rgime ND ou HFD. 137 Figure 96 : Mesure de la surface des lots de Langerhans, aprs sept mois de rgime ND ou HFD. .......................................................................................................................................................... 137 Figure 97 : Photographies de coupes histologiques de pancras de rats aprs coloration au trichrome de Masson. ....................................................................................................................................... 138 Figure 98 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats aprs coloration HE. ............... 140 Figure 99 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats aprs coloration au trichrome de Masson. ............................................................................................................................................ 141 Figure 100 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire, mesur par la technique TBARS................................... 142 Figure 101 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs mois de rgime alimentaire et 1 mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. ................................................................................................................. 143 Figure 102 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 4 mois de rgime alimentaire et mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. ................................................................................................................. 144 Figure 103 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 5 mois de rgime alimentaire et mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. ................................................................................................................. 144 Figure 104 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 2 mois aux rgimes ND ou HFD. ........................................................................... 145 Figure 105 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ......................................................................................................................................... 145 Figure 106 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. ......................................................................................................................................... 146 Figure 107 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. ......................................................................................................................................... 147 Figure 108 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation ND ou HFD pendant deux mois....................................................................................................... 148 Figure 109 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation normocalorique (ND) entre deux et 5 mois de traitement antioxydant ou dexercice physique. .... 149 Figure 110 : Tableau prsentant les rsultats du t-test pour chacun des groupes ND versus ND solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.......... 149 Figure 111 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation hypercalorique (HFD) entre deux et 5 mois de traitement antioxydant ou dexercice physique. .... 150 16

Figure 112 : Tableau prsentant les rsultats du t-test pour chacun des groupes HFD versus HFD solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.......... 150 Figure 113 : Rsultats du t-test entre les groupes ND solvant versus HFD solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.................................................... 151 Figure 114 : Glycmie des rats en g/L aprs 2 mois de rgime ND ou HFD. ................................. 151 Figure 115 : Glycmie plasmatique en g/L de rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 4 mois, et pendant mois aux antioxydant et lexercice. .......................................................................... 152 Figure 116 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire............................................................................................................................ 153 Figure 117 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 153 Figure 118 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 154 Figure 119 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 155 Figure 120 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire............................................................................................................................ 155 Figure 121 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 156 Figure 122 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 156 Figure 123 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 157 Figure 124 : Photographies d'lots pancratiques de rats avant l'administration des rgimes. ........ 157 Figure 125 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis aux rgimes pendant 2 mois. ............................................................................................... 158 Figure 126 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant mois aux rgimes et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ............. 158 Figure 127 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes et pendant mois aux antioxydants ou lexercice .............. 159 Figure 128 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes et pendant mois aux antioxydants ou lexercice .............. 159 Figure 19 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, avant ladministration des rgimes (n=) .......................................................................................................................................................... 160 Figure 10 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs deux mois de rgime ND ou HFD. .......................................................................................................................................................... 160 Figure 11 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs trois mois de rgime ND ou HFD et un mois de traitement antioxydant ou dactivit physique. ............................................................. 161 Figure 1 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs quatre mois de rgimes ND ou HFD et deux mois de supplmentations en antioxydants ou en exercice physique. ........................ 162 Figure 1 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs cinq mois de rgime ND ou HFD et trois mois de traitement antioxydant ou dactivit physique. .......................................................... 163 Figure 134 : Photographie d'immunohistologie d'une coupe de pancras marque l'insuline, de rat avant l'administration des rgimes. .................................................................................................. 163 Figure 135 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 2 mois. .................................................................... 164 Figure 136 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant un mois. .............................................................................................................................. 164 Figure 137 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant 2 mois. ................................................................................................................................ 165 17

Figure 138 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant 3 mois. ................................................................................................................................ 165 Figure 139 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats ND (A) ou HFD (B), aprs 2 mois de rgime alimentaire. ................................................................................ 166 Figure 140 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 1 mois. ................................................................................................................................................. 167 Figure 141 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 2 mois. ................................................................................................................................................. 168 Figure 142 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant mois. ................................................................................................................................................. 169 Figure 143 : Taux de triglycrides plasmatiques en mmol/L, chez des rats nourris par une alimenation ND et HFD pendant 2 mois. ......................................................................................... 170 Figure 144 : Taux de triglycrides plasmatiques en mmol/L, chez des rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. .............................. 170 Figure 145 : Taux de triglycrides plasmatique en mmol/L, chez des rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 171 Figure 146 : Taux de triglycrides plasmatique en mmol/L, chez des rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. ..................................... 171 Figure 147 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 2 mois. .............................................................................................................................................. 172 Figure 148 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice........................................................... 173 Figure 149 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice........................................................... 173 Figure 150 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant mois aux antioxydants ou lexercice. .......................................................... 174 Figure 151 : Photographies d'aortes colores au rouge Sudan IV, de rats nourris pendant 2 mois par les rgimes ND ou HFD. .................................................................................................................. 175 Figure 152 : Photographies d'aortes colores au rouge Sudan IV, de rats nourris pendant 5 mois par les rgimes ND (gauche) ou HFD (droite). ...................................................................................... 175 Figure 153 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 2 mois. ................................................................................................................................ 176 Figure 154 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 3 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant un mois. .............................................................................................................................. 176 Figure 155 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 4 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant 2 mois. ................................................................................................................................ 177 Figure 156 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 5 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant 3 mois. ................................................................................................................................ 177 Figure 157 : Photographies de coupes histologiques du foie de rats avant l'administration des rgimes. ............................................................................................................................................ 178 Figure 158 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats colores la HE soumis aux rgimes ND ou HFD pendant 2 mois. .............................................................................................. 178 Figure 159 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 3 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant un mois. .............................................................................................................................. 179 18

Figure 160 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant 2 mois. ................................................................................................................................ 180 Figure 161 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant 3 mois. ................................................................................................................................ 180 Figure 162 : Scores de statose hpatique obtenus chez les rats au cours de l'tude. ...................... 181 Figure 163 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant 2 mois........................................................................... 182 Figure 164 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 1 mois. ................................................................................................................................................. 183 Figure 165 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant mois. ................................................................................................................................................. 184 Figure 166 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant mois. ................................................................................................................................................. 185 Figure 167 : Tableau rcapitulatif de l'expression des enzymes CAT et SOD (Mn) dans les trois conditions et/ou en prsence d'antioxydants. ................................................................................... 191 Figure 168 : Rcapitulatif des caractristiques d'un modle de rat diabtique de type 2, prsentant un stress oxydant et une statose hpatique, dvelopp au laboratoire. .......................................... 194 Figure 169 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur lapparition du stress oxydant chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B). ..................................... 196 Figure 170 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur les complications mtaboliques chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B). ..................................... 200 Figure 171 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur les complications hpatiques chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B). ........................................... 202

19

SITUATION DU PROJET DE RECHERCHE

Le diabte est une maladie considre par lOMS comme une pidmie et dont la prvalence a augment de faon trs importante au cours de ces dernires annes. Actuellement, prs de 285 millions de personnes dans le monde sont atteintes de diabte, dont plus de 3 millions pour la France. Selon la Fdration Internationale du Diabte (FID), si le taux de croissance actuel se poursuit, le nombre total de diabtiques dpassera les 435 millions dici 00, soit une augmentation de 54%. En plus de ces chiffres alarmants, il faut tenir compte des personnes qui ignorent quelles sont diabtiques car le dveloppement de la pathologie est silencieux et sournois. Le diabte est une maladie potentiellement mortelle responsable chaque anne dans le monde de prs de 4 millions de dcs. De plus, un mauvais quilibre du diabte est responsable de lapparition de complications cardiovasculaires par altration des vaisseaux sanguins, et reprsente : 3 6 fois plus de risques de dvelopper des maladies cardiaques, 25% des atteintes rnales ncessitant une dialyse, La premire cause de ccit, 50% des amputations des membres infrieurs.

De nombreuses tudes suggrent que le diabte saccompagne dun stress oxydant qui favorise le dveloppement de la maladie en perturbant linsulino-scrtion, en favorisant linsulinorsistance et les complications cardiovasculaires qui y sont associes. Ce stress oxydant est d une rupture de lquilibre physiologique qui existe dans lorganisme entre les molcules oxydantes et les systmes de dfenses antioxydants. En plus des dfenses antioxydantes prsentes dans lorganisme, lalimentation apporte de nombreux antioxydants notamment par les vitamines et les oligo-lments. Ainsi, une rupture de lquilibre alimentaire (dfaillance nutritionnelle, carence, alimentation trop riche) entrane le dveloppement du stress oxydant par diminution des systmes de dfense. Le dveloppement du diabte et du stress oxydant est troitement li la qualit de vie et aux modes alimentaires. En effet, dans nos socits modernes, la qualit de vie et de travail est augmente sans pour autant que lhygine de vie ne samliore. Notre mode de vie devient de plus en plus sdentaire et les gestes du quotidien sont assists pour diminuer leffort. Ainsi en un demisicle, les besoins nergtiques journaliers sont passs de 000 kcal 00 kcal (daprs le Bulletin Acadmique National de Chirurgie Dentaire, 007). De plus, lalimentation classique est devenue plus riche en protines, en graisses, en sucres (sodas) et pauvres en fruits et lgumes. La consommation moyenne de nourriture, en termes de calories, augmente de plus en plus dans le monde, particulirement dans les pays en voie de dveloppement. Ainsi, une vritable pidmie 20

dobsit apparat chez les enfants et les adolescents. Cette situation inquite de plus en plus les scientifiques et elle pourrait saggraver si les industriels et les pouvoirs publics ne sengagent pas ds maintenant dans des programmes de prvention multifactorielle (Bulletin Acadmique National de Chirurgie Dentaire, 2007). En rponse aux problmes lis lalimentation, lEtat franais a instaur des programmes de nutrition, comme le Programme National Nutrition Sant (PNNS), dont lun des objectifs prioritaires tait daugmenter la consommation de fruits et lgumes au moins cinq par jour. Lalimentation et notamment les fruits et lgumes renferment des antioxydants et certains dentre eux sont connus pour avoir un fort pouvoir antioxydant, comme par exemple, les baies rouges et noires, les pruneaux, le raisin, la tomate, les pinards et brocolisetc. Ce pouvoir antioxydant des aliments est intressant dans des tudes de prvention du stress oxydant associ aux maladies. Dans le cas du diabte, des tudes ont montr effectivement quune supplmentation en antioxydants naturels comme le cacao qui renferme des flavonodes amliorait la sensibilit linsuline (Grassi et al., 2005). Lobjectif de ce travail est de dvelopper de nouveaux outils thrapeutiques et prventifs bass sur la supplmentation par des antioxydants dorigine alimentaire pour prvenir le stress oxydant dans la pathologie diabtique.

21

INTRODUCTION I. Le diabte
A. Mtabolisme et contrle de la glycmie Tous les organes ont besoin de sucre pour fonctionner et le cerveau en est le plus gros consommateur (environ 100g par jour). Le glucose (cf. figure 1) est une des principales sources nergtiques mtaboliques et est dgrad dans le cycle de la glycolyse pour gnrer une molcule de pyruvate et de lnergie sous forme dATP. Les sources de glucose sont majoritairement exogne (origine alimentaire) mais aussi endogne.

Figure 1 : Reprsentation d'Haworth du D-glucose.

1.

Maintien de la glycmie

Une des fonctions importantes de lorganisme est de rguler la glycmie environ 1g/L soit 5mmol/L. Lorsque la glycmie est suprieure 1g/L, suite un repas, une hormone hypoglycmiante, linsuline, synthtise par le pancras est active et permet au glucose de rentrer directement dans les cellules par des transporteurs spcifiques ou dtre stock sous forme dunits rptes de glucose, le glycogne, par glycognogense. En revanche, lorsque la glycmie est trop basse (infrieure 1g/L), notamment aprs un effort, une hormone hyperglycmiante, le glucagon, synthtise galement par le pancras, va permettre de dstocker les rserves de glycogne, situes dans le foie et le muscle, par glycognolyse. Lors des hypoglycmies, ce sont notamment les rserves du foie qui sont sollicites : le glycogne est dgrad en glucose-6-phosphate (G6P) puis en glucose et celui ci est libr dans la circulation sanguine. 2. Le pancras les lots de Langerhans

Les hormones antagonistes, insuline et glucagon, sont synthtises par le pancras. Cet organe participe la rgulation de nombreuses fonctions biologiques. Situ en avant de l'aorte, de la veine cave et des veines rnales mais en arrire de l'estomac et du clon transverse, il s'tend transversalement du duodnum la rate. Le pancras est constitu de quatre parties : la tte, l'isthme, le corps et la queue. Il est vascularis notamment par les veines splnique et msentrique 22

infrieure. Le pancras est un organe particulier. Il sagit dune glande mixte la fois exocrine et endocrine (cf. figure 2). En effet, il participe la digestion du bol alimentaire par dversement des sucs pancratiques, mais il scrte aussi des hormones, comme linsuline et le glucagon.

Vsicule biliaire

Canal du choldoque

Canal de Wirsung

Queue du pancras Corps du pancras

Tte du pancras

Figure 2 : Anatomie du pancras.

a)

La fonction exocrine

La partie exocrine du pancras reprsente 98% du pancras total. Elle est constitue de canaux qui scrtent un fluide riche en bicarbonates et damas de cellules glandulaires pyramidales, appels acini. Ceux-ci contiennent des grains de zymogne (granules) renfermant des enzymes pancratiques inactives (trypsinogne) qui seront scrtes par exocytose dans le duodnum, par le canal de Wirsung. Le trypsinogne est lenzyme qui va permettre dactiver des enzymes protolytiques comme la trypsine, la chymotrypsine, la carboxypeptidase, des phospholipases (A...), des saccharases (-amylase) mais aussi des nuclases (RNase et DNase). Les scrtions pancratiques sont alcalines (pH compris entre 7,5 et 8,2) et permettent de terminer la digestion. b) La fonction endocrine

Comme toutes les glandes endocrines, le pancras synthtise des hormones qui sont libres dans la circulation sanguine o elles vont agir distance vers des tissus ou des cellules cibles (action paracrine). La partie endocrine ne reprsente que 1 2% du tissu pancratique et est constitue damas disperss, les lots de Langerhans. Dans un pancras humain sain, il y a environ 1 million dlots dont la taille varie de 100 500m contenant chacun entre 1000 et 3000 cellules (Quesada et al., 2008). Les lots contiennent quatre types de cellules scrtant chacune une hormone polypeptidique caractristique : l'insuline (hormone hypoglycmiante), synthtise par les cellules pancratiques, 23

le glucagon (hormone hyperglycmiante), scrt par les cellules , la somatostatine, produite dans les cellules , qui exerce un effet inhibiteur sur la scrtion de linsuline et du glucagon, le polypeptide pancratique synthtis dans les cellules PP. reprsentent environ 60%

La proportion de ces types cellulaires est variable : les cellules

de la masse pancratique totale, tandis que les cellules reprsentent 0%. Les cellules delta et PP, quant elles, sont trs minoritaires et correspondent chacune 5% de la masse totale du pancras. Leurs distributions au sein de llot est alatoire (cf. figure ).

Figure 3 : Distribution des diffrents types cellulaires dans un lot de Langerhans (Cabrera et al., 2006). Des observations de sections de 1m de tissus pancratiques immunomarqus sont ralises au microscope confocal. En rouge, apparaissent les cellules marques linsuline, en vert, celles marques au glucagon et en bleu celles produisant la somatostatine.

3.

Glucagon et Insuline a) Le glucagon : structure, biosynthse, scrtion et mcanisme daction

Dcouverte et dcrite pour la premire fois en 1923 (Kimball and Murlin), la squence en acides amins du glucagon nest connue que depuis 1950. Le glucagon est un polypeptide de faible poids molculaire de 3,5 kDa, compos de 29 acides amins (cf. figure 4).

Figure 4 : Structure primaire du glucagon (Daprs G. Dolisi).

24

La biosynthse du glucagon dbute par la transcription de son gne situ sur le chromosome humain, dune squence de 9,4kb (Lefebvre, 1995) en un ARNm codant pour le proglucagon, un peptide de 160 acides amins. Dans les cellules , le proglucagon est cliv au niveau des peptides intermdiaires (IP) par la prohormone proconvertase 2 (Rouill et al., 1995) pour donner trois peptides de plus petite taille (cf. figure 5) : le polypeptide li la glicentine (GRPP, rsidus 1-30), le glucagon (rsidus 33-61) et le fragment proglucagon majeur (MPFG, rsidus 72-158).

Figure 5 : Structure du proglucagon et synthse des diffrents peptides dans les cellules (Daprs Taylor et Francis group, 2010).

Le glucagon est produit par les cellules du pancras, uniquement lorsque la glycmie diminue de manire significative au-dessous de 0,65g/L. En effet, dans un tat de normoglycmie ou dhyperglycmie, le glucose empche les cellules de secrter du glucagon dans le sang. Mais lorsquil y a hypoglycmie, la scrtion dinsuline est bloque et linhibition des cellules est leve. La libration du glucagon par les cellules rsulte dune entre massive de calcium dans la cellule suite une dpolarisation membranaire (cf. figure 6). Le mcanisme nest pas trs connu chez lhomme, mais chez la souris, Gpel et al. ont montr que la libration du glucagon serait sous le contrle des canaux potassiques de type A et des canaux sodiques de type TTX pour le maintien du potentiel de membrane.

Figure 6 : Mcanisme de scrtion du glucagon de la cellule (source personnelle).

25

L'hormone rejoint les cellules cibles du foie par les vaisseaux sanguins et se fixe sur les rcepteurs spcifiques des hpatocytes. Il existe galement des rcepteurs au niveau rnal, cervical, adipeux et musculaire ainsi que sur les cellules . Le glucagon se fixe sur son rcepteur coupl aux protines G. La sous-unit de la protine G va stimuler ladnylate cyclase et augmenter la production intracellulaire dAMPc, induisant une activation des protines kinase (PKA). Cela provoque une acclration de la glycognolyse do une augmentation de la [G6P] intracellulaire. Le foie va hydrolyser le G6P en glucose grce Glucose-6-Phosphatase. Le mcanisme entrane une libration du glucose stock dans le foie qui en contient environ de 50g 100g (cf. figure 7).

Figure 7 : Voie de signalisation du glucagon dans la cellule hpatique (Daprs Jaspard E, 2008).

Le glucagon accrot la capture des acides amins par les hpatocytes et favorise ainsi la noglucognse partir des acides amins. De plus, le tissu adipeux va fournir des acides gras libres ncessaires aux muscles par lipolyse et celui-ci va les utiliser pour fabriquer des corps ctoniques, autre substrat nergtique en labsence de glucose. La glycmie est ainsi rtablie un taux normal. b) Linsuline : structure, biosynthse, scrtion et mcanisme daction

Cette substance a t dcouverte par Frederick Grant Banting et Charles Herbert Best dans le laboratoire de John James Richard MacLeod et suite aux travaux importants de Nicolas Paulescu (Rosenfeld, 2002). Banting et MacLeod ont t les laurats du Prix Nobel de physiologie et de mdecine en 1923 rcompensant leurs travaux. Linsuline est un peptide de 51 acides amins et se compose de deux chanes polypeptidiques : une chane A de 21 acides amins et une chane B de 30 acides amins, qui sont unies par deux ponts disulfures et un pont disulfure intra-chane dans la chane A (cf. figure 8).

26

Figure 8 : Structure primaire de linsuline (Daprs G. Dolisi).

Linsuline est synthtise dans les cellules

sous forme de pr-pro-insuline inactive. Chez

lhomme, elle est code par un gne se trouvant sur le chromosome 11. Aprs la transcription en ARNm du gne codant la pr-pro-insuline, lARNm est export du noyau vers le cytoplasme pour atteindre les ribosomes se trouvant la surface du rticulum endoplasmique (RE). La traduction de la pr-pro-insuline se ralise lentre du RE. La molcule subit alors un remodelage, acquiert sa structure quaternaire avec ses deux ponts disulfures et perd sa squence signal. La pro-insuline ainsi obtenue est constitue de 86 acides amins ayant un poids molculaire de 9kDa. Dans lappareil de Golgi, sous laction dune protase spcifique, la pro-insuline est clive pour donner le peptide-C (1 acides amins ayant un poids molculaire de kDa) et un peptide bicatnaire, linsuline dune taille finale de 51 acides amins et de poids molculaire de 6kDa (cf. figure 9). Ces deux peptides sont stocks dans des granules jusqu scrtion.

Figure 9 : Transcription et traduction de linsuline (Raynal et Cortie, ouvrage Le diabte de type 2: aspect fondamentaux ).

27

Le glucose circulant est en contact des cellules

via les capillaires sanguins et la lymphe importe le glucose

interstitielle. Lorsque la concentration en glucose sanguin augmente, la cellule foie. Le mtabolisme du glucose dans la cellule

grce un transporteur membranaire insulino-indpendant GLUT2, prdominant galement dans le augmente le rapport ATP/ADP ce qui induit la fermeture du canal potassique ATP dpendant et bloque la fuite dions potassium K+ (cf. figure 10). Cellule

Capillaire sanguin

Figure 10 : Mcanisme de libration de linsuline de la cellule (source personnelle).

Cela provoque une dpolarisation de la membrane de la cellule

induisant louverture des

canaux calciques voltage sensibles : le calcium entre dans la cellule et dclenche l'exocytose des vsicules contenant de l'insuline. Celle-ci passe dans le sang par transcytose (endocytose + exocytose) travers l'endothlium du capillaire. Linsuline libre permet daugmenter le captage du glucose par les adipocytes et les cellules musculaires. Ce phnomne est rgul par des mcanismes dexocytose et dendocytose des rcepteurs GLUT4 insulino-dpendant en prsence de lhormone. Dans le foie et le muscle, le glucose est stock sous forme de glycogne par le processus de glycognogense et il est utilis dans le cycle de la glycolyse dans les myocytes pour produire de lnergie. De plus, au niveau du tissu adipeux, elle induit un stockage des acides gras en favorisant la lipogense. La liaison de linsuline son rcepteur IR induit son autophosphorylation sur plusieurs rsidus Tyr de ses sous unit . Plusieurs protines dont Shc, Gab-1, le complexe APS/Cbl et les protines IRS, se fixent sur ces rsidus phosphoryls afin dtre eux-mmes phosphoryls par le rcepteur insulinique activ. Shc recrute Grb2 et sa protine associe Sos, ce qui active la protine Ras associe Raf1 pour activer les cascades de phosphorylation par la MAP kinase (MAPK). 28

Cette cascade rgule lexpression des gnes impliqus dans la prolifration cellulaire et la diffrenciation. La cascade PIK conduit des modifications de ltat de phosphorylation de plusieurs enzymes dont Akt et mTOR, permettant de stimuler la synthse de glycogne et de protines. La cascade PI3K, via PDK1, participe galement au contrle de la translocation du transporteur de glucose GLUT4 vers la surface de la cellule et donc laugmentation de la vitesse dentre du glucose dans la cellule (cf. figure11).

Figure 11 : Transduction du signal par linsuline (source personnelle, daprs Voet & Voet, Edition deBoeck, 2005).

B. La pathologie diabtique 1. Le diabte

Le mot diabte vient du grec dia-bano signifiant passer au travers . Le diabte est une maladie due une concentration anormalement leve de sucre dans le sang. LOMS le dfinit par une glycmie suprieure 1,26g/L (7mmol/L) caractristique jeun, confirme par deux prises de sang conscutives. Il existe 4 types de diabtes, dfinis par lOMS (1997) : le diabte de type 1 et 2 qui seront dcrits ci-aprs, les diabtes dits secondaires qui sont la cause de pathologies pancratiques, hpatiques, endocriniennes ou gntiques ; et enfin le diabte gestationnel. La glycmie anormalement leve rsulte dune carence totale ou partielle en insuline ou dune rsistance des tissus priphriques cibles linsuline, ayant pour consquence, une nonabsorption du glucose par les cellules et donc une hyperglycmie. La carence totale est la consquence dune destruction des cellules bta des lots de Langerhans par un mcanisme autoimmun, cest le diabte de type 1. Au contraire, le diabte de type correspond un dfaut de fabrication de linsuline par le pancras ou dune inaptitude des cellules utiliser celle-ci.

29

Lhyperglycmie provoque par ces deux types de diabte est responsable de nombreuses complications chroniques micro et macrovasculaires. Le diabte est une maladie grave puisquil est plac au 5me rang des causes de mortalit. 2. La prvalence

Maladie silencieuse et chronique, le diabte est une maladie mtabolique trs rpandue et classe dpidmie. Depuis quelques annes, la prvalence (nombre de cas observs dans une population rapports au nombre total dindividus de cette population) augmente fortement dans les pays riches, mais aussi dans les pays pauvres. En 2010, la prvalence globale du diabte dans la population mondiale est estime entre 6,6% et 7,9%, en incluant les patients intolrants au glucose. En 2010, le nombre de diabtiques est estim 284,6 millions avec une prdiction, pour 2030, 438,4 millions, soit une augmentation de 54%. La prvalence reste la plus leve au Etats-Unis (13,7% chez les hommes et 11,9% chez les femmes) avec un nombre de diabtiques de 26,8 millions, mais elle augmente beaucoup en Asie du sud-est et notamment en Inde, o le nombre de personnes atteintes est de 50,8 millions (donnes de lInternational Diabetes Federation, Montral 009). En France, en 2007, la prvalence tait de 3,85% en moyenne avec cependant des disparits inter-rgionales : la prvalence est plus grande pour le Nord-Pas-de-Calais (4,8%), la Picardie (4,7%), lAlsace et la Champagne-Ardenne (4,5%). Cette disparit est encore plus accentue dans les Dpartements dOutre-mer, notamment La Runion et la Guadeloupe avec des prvalences respectives de 7,8 et 7,3% (cf. figure 12).

Figure 12 : Prvalence du diabte trait par dpartement en 2007 (rgime gnral de lassurance maladie franaise ; Kusnik-Joinville et al., donnes INVS 2008).

30

En 2008, la France comptait 3 millions de diabtiques (6% de la population), les personnes prsentant un diabte de type 2 reprsentaient 90% des personnes atteintes, incluant 500 000 800 000 franais qui ignorent tre diabtiques. 3. Le diabte de type 1 a) Physiopathologie du diabte de type 1

Le diabte de type 1, autrefois appel diabte insulino-dpendant (DID) ou diabte juvnile, apparat le plus souvent de manire brutale chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Il se caractrise par une polyurie, une polydipsie et une polyphagie ayant pour consquence un amaigrissement malgr une prise de nourriture abondante. La glycmie est suprieure 2g/L avec prsence d'actone et de glucose dans les urines. Le diabte de type 1 reprsente 10% des cas de diabte (Daneman, 2006) et est une maladie auto-immune dans 90% des cas conduisant une destruction progressive et chronique des cellules . La maladie est prsente depuis plusieurs annes avant que les symptmes apparaissent. Cela a lieu lorsque plus de 70% des cellules b) sont dtruites (Pirot et al., 2008).

Facteurs gntiques et facteurs dclenchants

Le diabte de type 1 fait intervenir des facteurs de risque gntique. En effet, il correspond un dsordre polygnique, qui ne peut pas tre class comme dominant ou rcessif. Des tudes ont montr que chez le rat BB, la souris NOD et lhomme, le lien gntique le plus important concernait le complexe majeur dhistocompatibilit ou CMH (Pociot and McDermott, 00). Il est connu que des variantes gntiques des allles DR3, DR4, DQ2 et DQ8 codant des protines du CMH de classe II sont retrouvs chez le patient atteint de diabte de type 1. Plus de 90% des patients diabtiques de type 1 expriment les allles DR3DQ2 ou DR4DQ8 (Khardori and Pauza, 2003). Des tudes suggrent quil ny a que 0 50% de concordance pour le diabte de type 1, chez des jumeaux monozygotes (Redondo et al., 1999) et que laugmentation de lincidence du diabte de type 1, ces dernires annes, ne peut pas sexpliquer que par la susceptibilit gnique de la population (Jadane and Hober, 008). Cela laisse suggrer lexistence de facteurs environnementaux contribuant la pathognicit du diabte de type 1.

Ces facteurs environnementaux peuvent tre des toxines (drivs de nitrate) et des pathognes comme des entrovirus, parvovirus ou ceux responsables de la rubole et des oreillons (Van der Werf et al., 007). Des tudes pidmiologiques ont montr limplication dune infection virale congnitale, la rubole, dans le dveloppement du diabte de type 1. En effet, 20% des enfants ns de mres atteintes par la rubole ont dvelopp un diabte de type 1 (Khardori and 31

Pauza, 00). Le virus coxsackie B4 a galement t mis en cause lors dtude o celui-ci, isol de patients diabtiques de type 1, infectait in vitro des lots humains de patients non diabtiques, entranant un dfaut de la scrtion dinsuline stimule par glucose (Dotta et al., 2007). Les facteurs dclenchant un diabte de type 1 peuvent galement tre des constituants alimentaires comme le lait de vache introduit de faon prcoce dans lalimentation du nourrisson ou des mdicaments. c) Production dauto-anticorps

Dans 95% des cas de diabte de type 1, une tiologie auto-immune est retrouve. Les antignes cibles sont principalement lacide glutamique dcarboxylase (GAD65), un rcepteur tyrosine phosphatase protine like appel IA-2 pour Islet Antigen 2 et linsuline, IAA pour Insulin Auto-Antibody . Lenzyme GAD65 qui permet la conversion de lacide glutamique en acide -

aminobutirique (GABA) est implique dans la raction immunitaire du diabte de type 1 (Baekkeskov et al., 1990) car il a t mis en vidence une similarit entre la squence de la protine GAD65 et celle de la protine P2-C du virus coxsackie B4 (Kaufman et al., 1992). Ainsi le systme immunitaire reconnatrait tort les protines GAD65. La protine IA-2 ou encore appele ICA512 pour Islet Cell Autoantigen est une protine transmembranaire activit tyrosine phosphatase intrinsque, localise dans la membrane des granules scrtrices (Solimena et al., 1996). Enfin, linsuline est galement un antigne mis en cause dans la pathologie (Palmer et al., 1983). Les auto-anticorps sont spcifiquement dirigs contre la chane B de linsuline ou de la proinsuline (Khardori and Pauza, 2003). Les anticorps spcifiques des antignes de la cellule sont prsents avec une frquence

augmente chez des patients diabtiques de type 1 rcemment diagnostiqus (Santamaria et al., 1992 ; Bottazzo et al., 1974). La combinaison de ces anticorps peut tre utilise comme marqueur prdictif dun diabte de type 1 car ils apparaissent des mois voire des annes avant lapparition de troubles mtaboliques (Pihoker et al., 2005). De plus, ils sont galement doss dans le cas dun patient diabtique de type 2 devenu insulino-requrant. d) Mcanisme de destruction de la cellule

Le processus de recrutement des lymphocytes dans llot pancratique nest pas clairement compris, mais il implique la production de cytokines la fois par les cellules prsentatrices de lantigne (CPA), les cellules de lendothlium vasculaire et les cellules . Le schma figure 1 prsente un mcanisme simplifi de la destruction des cellules lors dun diabte de type 1.

32

Figure 13 : Mcanisme de destruction auto-immune de la cellule dans le diabte de type 1 (modifi daprs Pirot et al., 2008). Au niveau de la liaison des lymphocytes, les rcepteurs jaunes correspondent aux TCR, lovale bleu lantigne, le rcepteur rose (sur la CPA) la molcule du CMH de classe II, et le vert (sur la cellule ) la molcule du CMH de classe I. Enfin, la reconnaissance spcifique entre CPA et L T helper est assure par le CMH de classe II et la molcule CD4+ (orange) tandis que celle entre la cellule cytotoxique se fait par le CMH de classe I et le CD8+ (rose). et le L T

Les CPA prsentent lantigne de la cellule

au lymphocyte T (LT) helper (CD4+) naf via

la molcule du complexe majeur dhistocompatibilit (CMH) de classe II et au rcepteur TCR du lymphocyte T. Cela induit la production par la CPA dinterleukine 12 (IL-12) permettant la diffrenciation du LT en un LT mature. Celui-ci en retour scrte de linterleukine (IL-2) et de linterfron (IFN ), qui vont stimuler la production dinterleukine 1 (IL-1 ), de Tumor Necrosis Factor (TNF) et doxyde nitrique (NO), un radical libre. La scrtion de ces cytokines active les LT cytotoxique (CD8+) qui arrivent dans llot et qui entranent la scrtion, par les cellules , de chmokines. Le LT cytotoxique se lie la cellule par son TCR et via la molcule du CMH de classe I la surface de la cellule pancratique. De plus, il exprime sa surface la protine FasL qui va se lier au rcepteur Fas (de la famille des rcepteurs au TNF) de la cellule . Lactivation de la voie Fas induit lactivation des caspases, notamment celle de la caspase 8, et la mort cellulaire par apoptose. En parallle, ces LT dversent le contenu de leurs granules, qui contiennent le systme granzyme/perforine (Pearl-Yafe et al., 2007). La perforine gnre des pores sur la cellule , permettant la pntration dune protase srine, appele

granzyme qui va activer les caspases et induire la mort cellulaire par apoptose. Enfin, la fixation de 33

cytokines pro-inflammatoires comme le TNF, lINF

et lIL-1 , scrtes par les cellules

immunitaires (CPA et LT) sur leurs rcepteurs la surface de la cellule , induit lapoptose par diffrentes voies de signalisation dont la voie NFB (cf. figure 1). 4. Diabte de type 2

Le diabte de type 2, autrefois appel diabte non insulinodpendant (DNID) se manifeste chez ladulte aprs 40 ans. Ce type de diabte touche essentiellement des adultes mais la maladie est en forte progression chez les enfants. Il est trs rpandu et reprsente plus de 90% des cas de diabte. a) Intolrance au glucose

Lintolrance au glucose autrefois appele syndrome mtabolique ou syndrome X, correspond une hyperglycmie modre. Il sagit dun stade prcurseur du diabte o les patients atteints ont un risque plus lev de dvelopper par la suite un diabte de type 2. En 2010, 138 millions de personnes taient touches par lintolrance au glucose, majoritairement des personnes entre 40 et 59 ans. Un tiers de ces personnes, en revanche, sont ges de 20 39 ans (IDF Diabetes Atlas). b) Cas particuliers de lintolrance au glucose : lhyperinsulinisme

Lhyperinsulinisme est un tat qui perdure depuis au moins 10 ans avant que le diagnostic dun diabte de type ne soit tabli. Il est caractris par une insulino-rsistance, cest--dire une production dinsuline peu fonctionnelle ou une non-fixation de linsuline sur ses rcepteurs priphriques. Le glucose nest ainsi pas capt par les cellules, aggravant lhyperglycmie et ncessitant plus dinsuline. Le pancras va alors sadapter en augmentant la masse de cellules fonctionnelles (hyperplasie des lots), ce qui conduit un hyperinsulinisme. Cet tat pathologique existe bien avant lapparition du diabte de type . A terme, la production dinsuline spuise de par une glycmie de plus en plus difficilement quilibre et par lentre en apoptose des cellules , cest linsulino-dficience (cf. figure 14). Le patient diabtique doit alors recourir des injections dinsuline (insulino-requrance).

Figure 14 : Hyperinsulinisme et diabte de type 2 (donnes personnelles).

34

c)

Facteurs de risque Obsit et lipotoxicit

Dans 80 % des cas, le diabte est li une surcharge pondrale voire une obsit. Celle-ci se traduit par un indice de masse corporelle (IMC) suprieur 30. Les patients obses ont 10 fois plus de risque de devenir diabtique (Grimaldi A, Livre Diabte de type 2 , EMC Rfrence, 2004). Lobsit est notamment due au mode de vie actuel o les apports caloriques sont bien suprieurs aux dpenses nergtiques. En effet, le mode de vie de notre socit contemporaine est caractris par une augmentation de lingestion de graisses alimentaires et de glucose (boissons sucres). Il est estim plus de 1,1 milliard, le nombre de personnes en surpoids dans le monde dont 320 millions dobses (Diabetes atlas rsum, seconde dition IDF 00). En France, ltude Obpi Roche mene en 009, indique que la prvalence du surpoids et de lobsit chez les adultes de plus de 18 ans, est respectivement de 31,9% et 14,5% ; soit une augmentation de cette prvalence de +10,1% soit 5,9% par an depuis 12 ans. En 12 ans, 2 922 000 nouveaux obses ont t diagnostiqus avec une prvalence plus leve chez les femmes. Les rgions les plus touches sont le Nord et lEst avec des prvalences en 009 de 0,5% et 17%. Daprs cette enqute, les franais ont pris 900g par rapport 006 mais ,1kg par apport ltude de 1997. De plus, il est constat une augmentation significative de lIMC de 1kg/m et du tour de taille de 4,7 cm depuis 1997. Ltude montre galement quil y a fois plus de diabtiques de type en cas de surpoids et 7 fois plus en cas dobsit. Lobsit est caractrise par un tat chronique o le tissu adipeux ne peut plus stocker de faon normale les triglycrides ce qui a pour consquence le dpt de ces lipides dans des compartiments autres que ceux dvolus cette fonction, comme le tissu adipeux viscral, les muscles, le foie, le cur et le pancras. Cette accumulation provoque une drgulation et une dysfonction du tissu impliqu, appele lipotoxicit (Kusminski et al., 2009). Le tissu adipeux viscral libre une grande quantit d'acides gras libres, ce qui favorise la synthse hpatique des triglycrides et stimule la noglucognse hpatique. Au niveau musculaire, les acides gras libres sont oxyds en priorit par rapport au glucose, entranant une production accrue d'actyl coenzyme A qui inhibe en retour les enzymes de la glycolyse ; le tout contribuant laggravation de lhyperglycmie.

Les facteurs sociaux

La consommation de nourritures et de boissons riches en nergie, en graisses et en glucides est devenue une habitude dans nos socits modernes. De plus, la transition dun milieu rural vers un milieu urbain est associe des changements dans les habitudes alimentaires et les activits 35

physiques (Solomons and Gross, 1995). Dune part, les conditions de vie et de travail sont plus confortables, lorganisme est donc moins soumis des contraintes physiques. De plus, la sdentarit multiplie le risque de diabte par deux. Dautre part, les tendances alimentaires vont vers des aliments ou boissons ayant un index glycmique lev (haut pouvoir sucrant). Des tudes ont suggr que la probabilit de devenir obse est de 38% chez les sujets fminins qui boivent plus dun soda par semaine contre 18% chez celles qui boivent moins dun soda par semaine (Liebman et al., 00). Une autre tude a montr quune consommation en boissons sucres (58% de soda, 20% de jus de fruits, 19% de th et 3% de caf) a t significativement associe un surpoids (Nicklas et al., 2003). Ces prfrences pour une alimentation hypercalorique et cette sdentarit associes sont la cause dun environnement obsogne chez lhomme, qui peut engendrer des complications allant de linsulino-rsistance au diabte de type 2. Lhrdit

Le diabte de type 2 est une maladie galement prdisposition gntique, en plus de la prsence de facteurs sociaux ou environnementaux. Le risque de dvelopper un diabte chez un enfant ayant un des deux parents diabtiques est augment. De plus, chez des jumeaux monozygotes, la concordance de la maladie peut atteindre 90% (Grimaldi A, Livre Diabte de type 2 , EMC Rfrence, 2004). Lge Le risque de dvelopper un diabte de type augmente avec lge. En effet, la tranche dge la plus touche est celle des 40-59 ans (Diabetes atlas rsum, seconde dition IDF 2003). Chez le sujet g, il y a une baisse de linsulino-scrtion et une augmentation de linsulino-rsistance (Jackson, 1990).

La grossesse

Un diabte gestationnel est considr par lOMS (1997) comme un diabte part qui disparait aprs la grossesse. Cependant, celui-ci est un facteur de risque ultrieur dun diabte de type , de mme que la naissance dun enfant de plus de 4kg (ANAES, Principe du dpistage du diabte de type 2, Fvrier 2003). De plus, un enfant n de mre atteinte par un diabte gestationnel, a plus de risque de dvelopper un diabte de type et de souffrir dobsit (Grimaldi A, Livre Diabte de type 2 , EMC Rfrence, 2004). d) Mcanisme de linsulino-rsistance

Une des premires phases du diabte de type est linsulino-rsistance. Sa mise en place fait intervenir de hautes concentrations en acides gras qui sont librs par le tissu adipeux dans la circulation. Ces acides gras sont ensuite oxyds dans les tissus priphriques en actyl coenzyme A, 36

en diacylglycrol et en cramides, ce qui entrane laugmentation dune isoforme dune protine kinase C. Cette kinase phosphoryle le rcepteur IRS-1 sur les acides amins srine et thronine ce qui a pour consquence dinhiber la phosphorylation de la tyrosine qui est requise pour librer linsuline. Ainsi, la translocation des vsicules renfermant le transporteur GLUT4 est inhibe, le glucose circulant ne peut donc pas entrer dans les cellules (Schulman, 2000). Cela favorise lhyperglycmie ; le pancras va donc sadapter en produisant plus dinsuline. e) Apoptose des cellules

Dans les cellules , laccumulation des acides gras libres est toxique et cette toxicit passe par la formation de cramide, induisant laugmentation doxyde nitrique NO et lactivation de lapoptose (Shimabukuro et al., 1998). De plus, une concentration leve en glucose induit une apoptose mdie par lIL-1 sur des cellules dans un modle de rat diabtique de type (Donath et al., 1999), mais aussi sur des lots humains (Maedler et al., 00). Lhyperglycmie chronique est galement responsable de la formation despces ractives de loxygne, ROS pour Reactive Oxygen Species qui contribue avec lIL-1 la transcription du facteur NFB. De plus, le tissu adipeux scrte des hormones et des cytokines ayant des actions auto et paracrine. Les adipocytes peuvent secrter de la leptine, des antagonistes du rcepteur lIL-1 (Meier et al., 00), du TNF (Hotamisligil et al., 1995) et de lIL-6 (Fried et al., 1998). Ces facteurs sont tous augments dans lobsit et sont lis linsulino-rsistance (Donath et al., 2003) ; (cf. figure 15).

Figure 15 : Facteurs contribuant l'apoptose des cellules (Source personnelle).

37

C. Les complications lies au diabte 1. Les complications aiges a) Lhyperglycmie

Elle est caractrise par une augmentation importante du glucose dans le sang et se traduit par un desschement de la bouche, une soif extrme, un besoin frquent duriner, une somnolence accrue, des nauses et vomissements, associs une perte de poids. Ces symptmes ont des origines mtaboliques. En effet, la destruction des cellules dans le diabte de type 1 et diminue et inhibe la production dinsuline et il en rsulte une non pntration du glucose dans les cellules et par consquent une hyperglycmie. De plus, celle-ci saccompagne dune production hpatique de glucose par processus de noglucogense et de glycognolyse. Malgr la prsence de glucose, les cellules doivent trouver un autre substrat biologique pour produire de lnergie. Elles vont alors utiliser les acides gras et les acides amins. Ces derniers vont subir des ractions de dsamination et de transamination pour pouvoir entrer dans le cycle de Krebs. En parallle, les acides gras libres subissent le cycle de la -oxydation pour aller dans le cycle de Krebs. Cependant, lors de la oxydation, il y a formation de corps ctoniques toxiques (actone, -hydroxypyruvate et actoactate) qui se comportent comme des acides dans le sang et diminue considrablement le pH sanguin ; cest lacidoctose. Si celle-ci nest pas rapidement traite, elle peut provoquer une hypotension, une altration de la fonction myocardique, une vasodilatation crbrale et un coma, parfois mortel. De plus, l'hyperglycmie a pour consquence la non rabsorption du glucose par le tubule rnal, ce qui entrane une glycosurie. Elle induit galement une hyper-osmolarit extracellulaire, provoquant le passage de l'eau et du potassium de la cellule vers le compartiment extracellulaire. Les signes spcifiques de cette fuite hydrique sont la polyurie et la polydipsie. Si cette dshydratation nest pas soigne, elle peut engendrer un coma hyperosmolaire. b) Lhypoglycmie

Les symptmes qui caractrisent lhypoglycmie sont une faim insatiable, des tremblements et tourdissements, des troubles visuels associs des maux de tte et des changements de caractres, ainsi quune transpiration importante et une fatigue extrme. Elle peut survenir en cas dinadquation du traitement chez le patient diabtique de type 1 ou si le diabte est trs fortement instable. En effet, si les doses dinsuline sont trop fortes par rapport aux besoins (efforts physiques ou alimentation), la glycmie passe sous le seuil de 0,8g/L. Lorsque les symptmes apparaissent, il faut rapidement ingrer des glucides ayant un index glycmique lev (haut pouvoir sucrant) comme le sucre ou la confiture. Si lhypoglycmie apparait 38

pendant la priode daction dune insuline rapide, il est recommand dingrer des glucides ayant au contraire un index glycmique plus faible comme les fruits ou le pain pour remonter la glycmie. Parfois, il peut se produire des hypoglycmies svres pouvant entraner des pertes de connaissance. Le recours des injections intraveineuses de glucose ou de glucagon est indispensable pour rtablir la glycmie. 2. Les complications chroniques

Les complications chroniques du diabte reprsentent aujourdhui les causes essentielles de morbidit et de mortalit chez le patient diabtique. Lhyperglycmie long terme aboutit des lsions au niveau des vaisseaux lorigine de graves complications cardiovasculaires. Le risque de maladies cardiovasculaires est de 2 3 fois plus lev chez les diabtiques que dans l'ensemble de la population (Diabtes Atlas rsum, seconde dition 2003, IDF). Les lsions concernant les petits vaisseaux sont appeles microangiopathies. Elles touchent essentiellement le rein, lil, et certains nerfs priphriques. Au contraire, les atteintes des vaisseaux plus gros ou vaisseaux de conductance sont les macroangiopathies. Elles peuvent entrainer des accidents vasculaires crbraux (AVC) et des infarctus du myocarde (cf. figure 16). Ces complications cardiovasculaires peuvent aller jusqu des comas.

Figure 16 : Les complications cardiovasculaires lies au diabte (Dossier Sant Diabte de type 2, GSK, 2009).

39

a)

Microangiopathies

Les lsions microangiopathiques sont caractrises par lpaississement de la membrane basale des capillaires sanguins, ce qui a pour consquence : daugmenter la permabilit capillaire, ce qui provoque un exsudat (panchement de liquide de nature sreuse), daugmenter la fragilit du vaisseau et dinduire des hmorragies, dobstruer les capillaires ce qui provoque des lsions ischmiques.

Latteinte des petits vaisseaux est diffuse et elle aggrave les lsions causes par la macroangiopathies.

La rtinopathie diabtique

La rtinopathie diabtique constitue la premire cause de ccit dans les pays industrialiss avant lge de 65 ans (Fong et al., 2004). 95% des diabtiques de type 1 prsentent une rtinopathie au bout de 15 ans, contre 50% de patients diabtiques de type 2. Le diabte provoque des occlusions des capillaires de la rtine, une ischmie de la rtine et des hmorragies par rupture de la barrire hmato-rtinienne. Les ions et protines passent dans la rtine, entranant leau par osmose, lorigine de la formation dun dme. Les lipides et les protines peuvent galement passer et former un exsudat. Cela peut entraner une cataracte, un glaucome, des dmes maculaires voire une ccit totale. Dtects prcocement par un examen de fond dil, ces troubles peuvent tre bien traits par laser. Une fois les complications survenues, il est souvent trop tard, do la ncessit dun dpistage annuel. La nphropathie diabtique

La nphropathie diabtique peut voluer jusqu' l'insuffisance rnale. C'est la seule cause d'insuffisance rnale terminale conduisant la dialyse. Celle-ci augmente actuellement dans tous les pays industrialiss. 30% des diabtiques de type 1 prsentent une nphropathie diabtique au bout de 15 ans, contre seulement 15% des patients diabtiques de type 2. Le rein est un organe constitu dun rseau important de micro-vaisseaux, qui forment un filtre pour liminer les dchets et les toxines prsents dans le sang. Dans la pathologie diabtique, la capacit de filtration du glomrule rnal est altre, ce qui a pour consquence une accumulation des dchets dans le sang. Cela peut conduire au stade dinsuffisance rnale chronique. Les deux seules solutions pour filtrer le rein et remdier la nphropathie sont la dialyse et la transplantation rnale. La neuropathie priphrique Elle constitue la premire cause damputation non traumatique, car elle prdispose aux plaies des pieds en provoquant une perte de sensibilit (Singh et al., 2005). Le risque augmente avec la dure du diabte. 40

Latteinte est essentiellement due une ischmie. La neuropathie priphrique touche surtout les membres infrieurs et entrane des douleurs, des crampes et une diminution de la sensibilit ainsi que des plaies pouvant conduire des amputations, car le patient ne se rend pas compte qu'il a une blessure par l'absence de stimuli douloureux et laisse voluer la blessure. La neuropathie peut aussi toucher le systme nerveux autonome et provoquer des troubles de la digestion (diarrhe), du rythme cardiaque (hypotension) et des troubles dordre mictionnel et sexuel (impuissance). Latteinte peut galement tre due une dgnrescence axonale avec une dmylinisation.

Sensibilit lie aux infections

Un diabte mal quilibr favorise les infections bactriennes et mycosiques qui elles-mmes dsquilibrent le diabte en retour. La frquence des septicmies dorigine bactrienne est plus importante chez les patients diabtiques que dans la population non diabtique (Gin, 1992). La prolifration des germes est dune part favorise par leur apptence pour le sucre et dautre part, par laffaiblissement des dfenses de lorganisme (globules blancs) sous leffet de lhyperglycmie. Les infections rencontres sont des infections des appareils respiratoire, urinaire et gnital mais aussi des infections cutanes staphylocoques, des mycoses et furonculoses. b) Macroangiopathies

L'atteinte des artres coronaires est corrle l'anciennet du diabte mais surtout l'quilibre du diabte. En effet, un diabtique mal quilibr prsente un risque beaucoup plus important de dvelopper terme une maladie coronaire qu'un diabtique parfaitement quilibr. Cette atteinte coronaire est due une athrosclrose et peut s'exprimer sous la forme d'angine de poitrine encore appele angor et parfois d'infarctus du myocarde. Cette athrosclrose est engendre par lhyperglycmie chronique, mais elle peut aussi tre aggrave en prsence de facteurs tels que le tabagisme, des troubles lipidiques ou une hypertension artrielle. Les artres crbrales peuvent galement tre touches et donner lieu des accidents vasculaires crbraux. De mme, on peut assister lapparition dune inflammation des parois des artres (artrite) des membres infrieurs due latteinte des artres situes au niveau des jambes. 3. Pathologie associes au diabte de type 2 : la statose hpatique a) Gnralits

Le diabte de type saccompagne dans 80% des cas dune surcharge pondrale ou dune obsit. Linsulino-rsistance et lobsit qui laccompagnent sont des facteurs de risque pour le dveloppement des maladies du foie, les NAFLD pour non alcoholic fatty liver disease . Elles se caractrisent par un dpt de lipides dans le cytoplasme des hpatocytes. Lvolution des NAFLD 41

repose sur la thorie du double hit . La forme la moins avance est la statose hpatique qui correspond une accumulation bnigne et rversible de triglycrides dans le foie (premier hit) mais qui rend les hpatocytes plus susceptibles un second hit (cf. figure 17). Celui-ci correspond une rponse inflammatoire menant la stato-hpatite ou NASH (non alcoholic steatohepatitis). Celle-ci est caractrise par une statose macrovsiculaire associe une inflammation (Buqu et al., 2008) et parfois de la fibrose. La NASH peut elle-mme progresser en cirrhose (Caldwell et al., 1999) puis, dans les formes les plus svres, en hpatocarcinme (Ratziu et al., 2002 ; Yang et al., 2001).

Figure 17 : Thorie du double hit pour le dveloppement des NAFLD (Buqu et al., 2008).

La prvalence des NAFLD est en forte augmentation dans les pays industrialiss lie aux habitudes alimentaires. Parmi elles, la NASH a t identifie chez environ 5% de la population gnrale et chez 20 25% des patients obses (Brunt, et al., 1999 ; James and Day, 1998). a) Statose microvsiculaire et macrovsiculaire

Dans la statose, les dpts de lipides l'intrieur des hpatocytes peuvent constituer des petites gouttelettes que l'on appelle statose microvsiculaire. Dans ce cas, le noyau des hpatocytes est central et le cytoplasme est spumeux du fait de vsicules cliniquement vides mesurant moins de 1 mm (cf. figure 18A). A B

Figure 18 : Exemple de statose micro et macrovsiculaire (D'aprs le Dr Antonini, CHB- Hpital Paul Brousse).

42

En clinique, ce type de statose se traduit souvent par des nauses, des vomissements et un ictre dont l'volution peut conduire un coma, voire au dcs. Si les hpatocytes sont au contraire gonfls et que le noyau est dplac en priphrie, il sagit de la statose macrovsiculaire (cf. figure 18B) qui sera identifie chez le patient par une hpatomgalie sans douleur et qui est le plus souvent bnigne. b) Formation de la statose hpatique

Linsulino-rsistance favorise la lipolyse adipocytaire, librant ainsi une grande quantit dacide gras non estrifis (AGNE) qui sont capts par le foie. De plus, lhyperinsulinisme, lhyperglycmie mais aussi le stress oxydant favorisent la lipogense et la production dacides gras (AG). Ces derniers et les triglycrides (TG) peuvent alors sinfiltrer de manire diffuse dans le foie en formant des gouttelettes lipidiques ou tre excrts dans le sang sous forme de lipoprotines de trs faible densit ou VLDL (cf. figure 19).

Figure 19 : Etapes mtabolique conduisant la formation de la statose hpatique (Robichon et al., 2008).

D. Les traitements du diabte 1. Linsulinothrapie et ses analogues

Linsulinothrapie sadresse aux patients diabtiques de type 1 mais aussi aux patients diabtiques de type 2 devenus insulino-requrants. La production industrielle dinsuline a commenc ds 19 au Etats-Unis par le groupe pharmaceutique Eli Lilly. Les premires insulines taient purifies partir de pancras de buf et de porc. Dans les annes 1930, diverses prparations ont permis d'obtenir des formes d'action prolonge de l'insuline par cristallisation en prsence de zinc ou par prolongation du temps de 43

rsorption sous la peau par l'adjonction de protamine (insuline NPH). Les premires synthses chimiques russies de linsuline sont ralises en 1965. Ce nest quentre 1978 et 1981 que la production industrielle dinsuline humaine est rendue possible, par : hmisynthse (par des procds chimiques, un acide amin de linsuline porcine a t remplac pour obtenir la structure de linsuline humaine). biosynthse : le gne codant la fabrication de linsuline est insr dans un microorganisme qui va se multiplier et produire linsuline, qui sera ensuite purifie. Ces procds ont permis de disposer de quantits suffisantes dinsuline en excluant le recours aux sources animales. En 1990, les premires variantes dinsuline sont cres par modification de la composition de linsuline (changement dun acide amin par un autre, ajout de radicaux), ce qui permet de modifier la vitesse et la dure daction : ce sont les analogues de linsuline produits par biosynthse. Il existe aujourdhui 5 classes dinsuline en fonction de leur dure daction (cf. figure 20).

Noms Ultrarapides Humalog (Lilly) Novorapid (Novo Nordisk) Rapides Semi-lentes ou NPH Actrapid (Novo Nordisk) Insuman Basal (Sanofi Aventis) Umuline NPH (Lilly) Insulatard NPH (Novo Nordisk) Lentes Lantus (Sanofi Aventis) Levemir (Novo Nordisk) Mlanges HumalogMD Mix 2 (Lilly) Novomix 30 (Novo Nordisk)

Dlai Immdiat

Dure 3 heures

20 minutes 2 heures

5 heures 12 heures

Immdiat

24 heures

Rapide

18 24 heures

Figure 20 : Caractristiques des diffrentes classes danalogues de l'insuline (liste non exhaustive).

Les injections

Les injections danalogues de linsuline suivent majoritairement un schma dit "basal/bolus". Cette insulinothrapie associe lutilisation dinsulines lentes ou semi-lentes heures fixes pour maintenir le taux basal, lutilisation dinsulines rapides ou ultrarapides au moment des repas pour reproduire le pic dinsuline physiologique par un bolus (cf. figure 1). Ce schma dinsulinothrapie laisse une certaine libert au patient, mais il nest pas applicable tous. Chaque patient est trait au cas par cas ; le type dinsuline (analogues) et la dose choisis tant ceux qui permettent de normaliser la glycmie en vitant les hypoglycmies. 44

Figure 21 : Schma basal/bolus physiologique de l'insuline.

Les stylos insuline

De nos jours, linsuline nest plus administre par une aiguille et une seringue mais par des stylos injecteurs. Ces stylos peuvent tre pr remplis jetables ou rechargeables cartouches. Ils contiennent tous de linsuline 100 UI/mL. Les stylos couvrent toute la gamme des insulines. Grce un cadran analogique ou numrique qui indique les doses injecter (1 2 units au minimum), les stylos permettent un dosage simple et prcis de l'insuline. Ils sont lgers, faciles transporter et trs discrets dutilisation. Il y a diffrents sites dinjections prfrentiels en fonction du type dinsuline (cf. figure ). Les lieux privilgis sont le ventre, les bras et la cuisse. Les injections rptes peuvent tre la cause de douleurs, de ractions allergiques locales et de phnomnes datrophie / hypertrophie du tissu adipeux, qui poussent les chercheurs trouver une alternative aux injections cutanes rptes.

Figure 22 : Sites d'injections prfrentiels d'insuline ou analogues de l'insuline (Source : "Mon guide de l'injection" BD, 2009).

45

La pompe insuline externe

La pompe insuline externe est un petit appareil de la taille d'un tlphone portable, qui est reli un cathter sous-cutan. L'injection se fait de manire rglable (rglage du dbit d'insuline heure par heure) et continue en suivant un traitement de type "basal/bolus". En effet, de l'insuline rapide ou ultrarapide est administre en continu, correspondant l'insuline lente du schma classique. La pompe permet dadapter la dose en fonction des besoins, ce qui permet de rduire le nombre d'hypoglycmies svres, notamment pendant la nuit. Ce "dbit de base" est complt par des supplments d'insuline au moment des repas ou en cas d'hyperglycmie, qui sont galement administrs par la pompe. Les dispositifs comportent un rservoir-pompe externe et une interface de contrle informatise, connecte un appareil de perfusion. Par l'intermdiaire d'un cathter, le dispositif perfuse en continu une faible quantit d'insuline en sous cutan, selon un schma programm par l'utilisateur (cf. figure 23). Cependant le patient doit prendre sa glycmie et rguler le dbit d'insuline ce qui reste contraignant. Ce traitement est adapt tout le monde. Il est spcialement conseill aux femmes enceintes et aux enfants. Cependant, il a t rapport des risques dacidoctose en cas de panne de la pompe.

Figure 23 : Photographie d'une pompe insuline externe, relie un cathter sous-cutan.

La pompe insuline implantable

Ce systme associe une pompe en forme de disque situe sous la peau et un cathter interne situ dans labdomen ; lensemble est command par un botier externe (cf. figure 24). Le traitement par pompe implantable apporte des avantages complmentaires par rapport au traitement par pompe externe. La voie dadministration de linsuline est intra-pritonale au contraire de la premire qui est sous-cutane. De ce fait, linsuline a une action plus physiologique, elle est rsorbe plus rapidement et de faon rgulire avec un premier passage hpatique. Malgr la rduction significative des fluctuations glycmiques et lamlioration de la qualit de vie des patients diabtiques de type 1 (Renard and Schaepelynck-Belicar, 2007), ce systme ncessite un acte chirurgical lourd. De plus, il existe des risques dobstruction du cathter car linsuline peut se cristalliser induisant un dfaut de perfusion. 46

Figure 24 : Photographie d'une pompe insuline implantable.

Le pancras artificiel (dispositif interne et externe)

Le pancras artificiel permet de mesurer la glycmie de faon autonome et de sadapter linsulino-scrtion. Son but est de fonctionner en circuit ferm et autorgul. Il doit pouvoir ragir toute modification de la glycmie en ajustant l'administration d'insuline. Le systme repose sur la prsence dune pompe insuline et dun capteur de glucose. Linformation glycmique perue par le capteur est transmise par un cble sous-cutan la pompe insuline, qui va dlivrer lhormone. La pompe peut tre implante (cf. figure 25) ou externe (cf. figure 26). Les systmes les plus avancs sont en cours dessai clinique chez le patient diabtique. Ce systme semble tre bien accept par les patients et fiable. Il permettrait de rduire ou de supprimer compltement l'intervention humaine dans la prise en charge du diabte.

Figure 25 : Dispositif du pancras artificiel implant.

Figure 26 : Dispositif du pancras artificiel pompe externe.

47

2.

La greffe de pancras

La greffe de pancras chez les patients diabtiques de type 1 permet actuellement de normaliser durablement la glycmie en supprimant l'injection d'insuline, avec 82% des patients qui deviennent insulino-indpendants au bout de la premire anne post-greffe (Sutherland et al., 2001 ; 1999). Toutefois, la greffe de pancras est limite des patients devant subir une immunosuppression et une intervention chirurgicale pour la transplantation dun autre organe comme le rein. Ce n'est que dans des cas exceptionnels, lorsque tous les autres traitements ont chou et que les hypoglycmies deviennent invalidantes, que la greffe de pancras seule est propose. De plus, il existe dautres facteurs limitant la greffe de pancras, comme les problmes lis au recueil d'organe, les complications chirurgicales lies la transplantation d'organe et la mise en place d'un traitement immunosuppresseur chronique. 3. La transplantation dlots de Langerhans

Lors de la transplantation, les lots de Langerhans sont injects dans la veine porte pour quils rejoignent le foie comme site dimplantation. Grce aux amliorations des techniques disolement dlots depuis 1967, il est possible d'obtenir une quantit suffisante d'lots de Langerhans fonctionnels pour envisager la transplantation chez l'homme. En effet, ce nest qu partir de 1988, que la transplantation a connu un vritable essor avec lquipe de Ricordi. Leur mthode semiautomatique disolement dlots a permis damliorer les prparations de ceux-ci (Ricordi et al., 1988). De plus, en 000, lquipe canadienne dEdmonton a dvelopp un nouveau protocole immunosuppresseur permettant dobtenir une insulino-indpendance avec normoglycmie chez 80% des patients diabtiques de type 1 ayant reu une transplantation d'lots aprs un an de suivi (Shapiro et al,. 2000). Cependant cette technique se heurte de nombreuses difficults. En effet, comme il sagit dune greffe, il existe des risques de rejet qui sont accentus par la toxicit du traitement immunosuppresseur. De plus, pour une transplantation, il faut recourir 2 voire 3 pancras humains. Ainsi, les problmes de disponibilit de pancras limitent la transplantation un faible nombre de patients. 4. Les mesures hygino-dittiques a) Lalimentation

Pour amliorer le contrle glycmique des patients diabtiques (type 1 et 2), il est ncessaire de modifier et contrler leur rgime alimentaire. Une rduction du poids est souvent ncessaire. Cette modification du rgime alimentaire se fait avec laccompagnement de mdecins nutritionnistes ou de ditticiens. L'alimentation du diabtique doit tre quilibre parmi les 3 repas 48

quotidiens et comporter des glucides (environ 50% de lapport nergtique total), des lipides (5%), des protines (15%). Les glucides doivent provenir d'aliments faible index glycmique comme le riz, les ptes, le pain et les lgumes secs. Les graisses seront limites de prfrence aux graisses d'origine vgtale avec au maximum 5 10% dacides gras saturs et 0 5% dacides gras insaturs. Les sucres rapides tels que les boissons sucres, les confitures, les confiseries et les glaces sont bannir, de mme que le grignotage. Un rgime hypocalorique permet de rduire plus facilement le surpoids. En effet, des tudes indiquent que la meilleure alimentation pour prvenir la prise de poids, lobsit, le diabte de type et les maladies cardiovasculaires est une alimentation pauvre en graisse et en boissons sucres associe une grande quantit de glucides, de fibres, de crales et de protines (Astrup, 2005). b) Lactivit physique

Associe des rgles alimentaires spcifiques, la pratique dune activit physique rgulire est indispensable (marche, vlo, natation). Idalement, une activit de 45 minutes, jours par semaine voire tous les jours est requise. Cela permet de diminuer les besoins en insuline et linsulino-rsistance, de diminuer le taux de triglycrides par augmentation des rcepteurs aux LDL et daugmenter la dpense nergtique. Cependant, pour un patient diabtique de type 1, lexercice physique ne doit pas tre intense car il augmente le risque dhypoglycmie. 5. Les traitements mdicamenteux a) Les antidiabtiques oraux (ADO)

En gnral, les ADO sont prescrits aprs un chec des rgles hygino-dittiques durant 3 6 mois. Il existe 5 classes dADO, le traitement tant adapt chaque patient diabtique : Les biguanides (Metformine, Glucophage500, 850, 1000) : ils rduisent linsulinorsistance en favorisant laction de linsuline sur les tissus-cibles, en inhibant la noglucogense hpatique et en diminuant labsorption intestinale de glucose. Ils sont indiqus chez des patients en surcharge pondrale et sont prconiss chez des patients sans surcharge pondrale ou en association avec un autre ADO. Les sulfamides hypoglycmiants : ils stimulent la scrtion dinsuline (Diamicron). Les glitazones (pioglitazone et rosiglitazone) : ce sont des molcules qui amliorent la sensibilit linsuline et la fonction sur les rcepteurs PPAR . Les inhibiteurs des alpha-glucosidases (Glucor) ralentissent labsorption digestive des glucides complexes. Les glinides : ce sont des insulino-scrteurs qui stimulent le pic prcoce dinsulino-scrtion. 49 cellulaire, en diminuant linsulino-rsistance par action

Les ADO sont administrs majoritairement des patients diabtiques de type 2, mais certains ADO sont administrs chez des patients diabtiques de type 1, comme les biguanides et les inhibiteurs des alpha-glucosidase, pour retarder labsorption des glucides par lintestin. b) Les incrtines et incrtino-mimtiques

Les incrtines sont des peptides produits par les cellules L de lintestin, souvent associes des hormones et jouent sur la satit. La plus connue des incrtines est le GLP-1 (Glucagon-like peptide 1). Il est secrt par les cellules du jjunum et de lilon en prsence de nutriments dans lintestin, ce qui stimule la scrtion dinsuline et diminue la noglucogense hpatique. Cette hormone intressante a malheureusement une demi-vie trs courte car elle est rapidement dgrade par lenzyme dipeptidylpeptidase-4 ou DPP-4. Lintrt des scientifiques sest alors port sur le maintien de cette enzyme en dveloppant : - des analogues du GLP-1 rsistants la dgradation par lenzyme DPP-4, ce qui permet damliorer le contrle de la glycmie et davoir un rle positif sur la perte de poids, - des inhibiteurs de la DPP-4, permettant ainsi de retarder la dgradation du GLP-1.

La rgulation de la glycmie chez le patient diabtique doit tre fine et permettre le retour une homostasie glycmique. Malgr tous les mdicaments, traitements et mesures hyginodittiques qui ont t prsents dans ce chapitre, il reste difficile de rguler le taux de glucose dans le sang chez ces patients. Cette instabilit glycmique et lhyperglycmie chronique qui y est associe, favorisent le dveloppement du stress oxydant et des complications chez le patient diabtique. Le chapitre suivant prsentera les liens troits qui existent entre le diabte et ce stress oxydant.

II.

Le stress oxydant et le diabte

A. Le stress oxydant et les systmes de dfenses 1. Dfinition du stress oxydant

Dans une cellule eucaryote normale, lnergie ncessaire son fonctionnement se fait de faon arobie en utilisant des ractions doxydo-rduction. Ces ractions font intervenir des oxydants ou accepteurs dlectrons et des rducteurs ou donneurs dlectrons. Elles ont lieu dans la chaine respiratoire de la mitochondrie, qui fournit 90% de lnergie ncessaire (Rolfe and Brown, 1997). Dans cet organite intracellulaire, loxygne est laccepteur final dlectron aprs une cascade de ractions doxydo-rduction, faisant intervenir quatre complexes protiques. Lorsque loxygne

50

est transform en molcule deau, cela permet de gnrer de lATP (adnosine triphosphate), molcule haut potentiel nergtique (cf. figure 27).

Figure 27 : Chaine respiratoire de la mitochondrie.

Cependant % de loxygne nest pas rduit en eau ; il est dvi pour former des radicaux libres ou des espces drives de loxygne trs ractives (Koppenol, 001). Ces entits oxydantes sont physiologiquement maintenues en quilibre par de nombreux systmes antioxydants. Quand un dsquilibre apparat entre molcules pro-oxydantes et antioxydantes, en faveur des entits oxydantes, on parle alors de stress oxydant (Sies, 1991). Il peut tre la cause de systme antioxydant dfectueux ou dune quantit dentits oxydantes produites trop importante. 2. Les entits oxydantes et leur production

Les entits oxydantes sont souvent des radicaux libres, c'est--dire des espces chimiques qui possdent un lectron clibataire ou non appari sur la dernire couche lectronique. Cet lectron clibataire nest pas compens ce qui provoque des drglements dans leur champs magntique, rendant ainsi ces espces trs instables. Elles vont alors tenter de rcuprer des lectrons sur dautres molcules comme les substrats biologiques, en les oxydant. Il existe majoritairement trois grandes familles despces ractives : - Les espces ractives de loxygne ou ROS (Reactive Oxygen Species), issues de la rduction incomplte de loxygne, dont le prcurseur est lanion superoxyde O2-.. Il est lorigine de la formation dautres ROS tel que le peroxyde dhydrogne H2O2 et le radical hydroxyl OH.. Loxygne singulet 1O2 est galement une entit oxydante. - Les espces ractives de lazote ou RNS (Reactive Nitrogen Species) qui donnent entre autres des peroxynitrites (ONOO-), du monoxyde dazote NO. et le radical peroxyle (ROO.). - Les espces ractives du chlore ou RCS (Reactive Chlorine Species) comme lacide hypochlorique, HOCl. 51

Enfin, il existe dautres varits dentits oxydantes ou de radicaux, comme par exemple lacide hypobromique, HOBr. a) La production des entits oxydantes au niveau cellulaire

Le prcurseur des ROS, lanion superoxyde O2-. peut provenir de plusieurs sources cellulaires. Il est form aprs rduction de loxygne O2 par un lectron et en prsence dun cofacteur NADPH. Cet anion est trs instable et peut traverser la membrane plasmique (Mao and Poznansky, 1992). Les diffrentes enzymes permettant cette raction sont : la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, les cyclo-oxygnases ou COX, les lipo-oxygnases, les Nitric Oxyde Synthases (NOS), les enzymes du rticulum endoplasmique lisse (cytochrome P450) et celles de la chane de transport des lectrons dans la mitochondrie (Cai and Harrison, 2000) (cf. figure 29). Les NOS gnrent normalement du monoxyde dazote NO, mais lorsque la concentration de son cofacteur, la ttrahydrobioptridine (BH4) diminue, elle produit O2-.. De plus, le NO form par les NOS peut ragir avec lanion superoxyde pour former des peroxynitrites, un compos oxydant secondaire. Les superoxydes dismutase (SOD) vont ensuite dismuter lanion superoxyde en peroxyde dhydrogne H2O2 qui est relativement stable et peut diffuser au travers des membranes. Cette molcule donne ensuite via la raction de Fenton (non enzymatique) une entit trs ractive, le radical hydroxyle, OH.. Le peroxyde dhydrogne peut galement entrer dans une voie alternative et tre converti en eau par les enzymes catalase et glutathion peroxydase (cf. figure 28).

Figure 28 : Schma rcapitulatif des sources des ROS, des enzymes impliques dans la dfense antioxydantes et des cibles biologiques (source personnelle).

52

La raction de Fenton implique des mtaux de transition. Loxydation de lion ferreux (Fe2+) en ion ferrique (Fe3+) en prsence de peroxyde doxygne H2O2 gnre le radical hydroxyle, le plus puissant oxydant de la famille des ROS, car il ne peut tre dtruit enzymatiquement. A noter que la raction de Fenton peut se faire directement partir de lanion superoxyde pour gnrer le mme radical (cf. figure 29).

Figure 29 : Raction de Fenton.

b)

Les facteurs environnementaux comme source de ROS

Les facteurs environnementaux contribuent galement la formation dentits radicalaires ou de ROS. Une production beaucoup trop importante dentits ractives est observe dans le cas dintoxication aux mtaux lourds ou dans les phnomnes dirradiation. En effet, des tudes menes sur des plasmas denfants vivant dans des zones ptrochimiques pollues en Serbie ont montr une augmentation de 6% dun marqueur de peroxydation lipidique (malondialdhyde) et une diminution de 11% de lactivit de lenzyme SOD (Hatch, 010). De plus, des mtaux lourds comme le cadmium, le mercure ou larsenic sont souvent trouvs dans lenvironnement. LHomme y est de plus en plus expos que ce soit par le sol, lair ou leau. Des tudes ont montr que ces mtaux lourds ont la capacit de gnrer des espces radicalaires actives, provoquant des dommages cellulaires importants en diminuant les activits enzymatiques et en lsant la bicouche lipidique et les molcules dADN (Flora et al., 2008). Les radiations UV, notamment les UV B, provoquent des dommages au niveau de lADN (Sutherland, 1980). Les champs lectriques, lapport de xnobiotiques pro-oxydants et la prsence de cytokines pro-inflammatoires sont galement des sources de stress oxydant. En outre, des rsidus de la fume de cigarette, lalcool ou mme certains mdicaments sont une source importante de radicaux libres par oxydation des composs au niveau du cytochrome P450 (Favier, 2003). 3. Rle physiologique des entits oxydantes

De faon physiologique, les espces ractives radicalaires (OH.) ou non (H2O2), existent dans les cellules et dans les tissus des concentrations faibles mais mesurables (Halliwell and Gutteridge, 1989 ; Sies, 1993). Elles protgent, rgulent la cellule et permettent de maintenir une certaine homostasie de ltat redox de lorganisme. Lorsquelles sont produites dans un compartiment cellulaire spcifique, elles peuvent participer au fonctionnement de certaines enzymes, intervenir dans la dfense immunitaire, agir en tant que second messager cellulaire, 53

intervenir dans les voies de transduction du signal et ainsi rguler les fonctions cellulaires (Dikalov et al., 2007). a) Messagers intra et extracellulaire

Les radicaux libres ou les espces ractives constituent par eux-mmes un systme de transmission de signaux, qui serait apparu trs tt dans la vie (Favier, 2003). Ils peuvent tre considrs comme des messagers intra et extracellulaire car ils permettent dinduire des rponses cellulaires face de nombreux stress. Ces stress peuvent tre dorigine thermique ou induits par des radiations comme les ultraviolets ou par des xnobiotiques (pesticides, mdicaments), ce qui conduit lexpression de gnes de dfenses (SOD manganse, catalase...). Ils participent aux cascades de signalisation intracellulaire dans de nombreuses cellules comme les fibroblastes, les cellules endothliales, les cellules musculaires lisses et le tissu thyrodien (Drge, 2002). b) Rgulation du tonus vasculaire et autre fonction du NO

Le monoxyde dazote (NO) extracellulaire ou produit par les NOS, a la capacit de se fixer et dactiver la guanylate cyclase, produisant un second messager important lorigine de nombreuses rponses physiologiques, le GMPc (Gerzer et al., 1981). Dans les cellules musculaires lisses, lactivation de la protine kinase GMPc dpendante permet la phosphorylation et lactivation de canaux potassiques calcium dpendants responsables de la relaxation des vaisseaux (Archer et al., 1994). Le NO joue galement un rle dans linhibition de ladhsion plaquettaire (Radomski et al., 1987). c) Dfense immunitaire et Burst Oxydatif

Dans les leucocytes et notamment les polynuclaires neutrophiles (PN), les entits oxydantes participent trs activement la dfense de lorganisme par leur action toxique notamment sur les bactries par le phnomne de burst oxydatif . Dans un environnement inflammatoire, les PN sont attirs par des facteurs chimiotactiques et atteignent le lieu de linfection par diapdse. Ils phagocytent les microorganismes dans le phagosome qui fusionne avec les granules lysosomiales pour former le phagolysosome lintrieur duquel les particules infectieuses sont digres. Cette activation des neutrophiles permet la libration de protines cationiques, la lactoferrine et des enzymes hydrolytiques et protolytiques, et implique lisoforme phagocytaire de la NADPH oxydase, la myloperoxydase ou MPO (Serteyn, 2003) et la NOS. La NADPH oxydase relargue une grande quantit danions superoxydes qui sont ensuite dismuts en peroxyde dhydrogne dans la fente du phagosome qui contient du chlorure forte concentration. Ainsi, le peroxyde dhydrogne et le chlorure vont tre utiliss par la MPO pour former de lacide hypochlorique (HOCl), qui peut 54

ragir avec lanion superoxyde pour former le radical hydroxyle, qui va exercer son attaque oxydante (Serteyn, 2003). Le but est dliminer les micro-organismes en produisant des espces oxydantes capables de dtruire les capsules polysaccharidiques bactriennes rsistantes aux enzymes protolytiques (Babior, 1999 ; Babior, 2000). Le burst oxydatif est la premire ligne de dfense dans un environnement pathogne (Drge, 2002). 4. Les cibles biologiques du stress oxydant

Les entits oxydantes tant trs ractives, elles ragissent avec les premires molcules qu'elles rencontrent. Elles ont comme cibles les lipides, les acides nucliques, les protines et les sucres (Beckman and Ames, 1998). a) Les lipides

Les cibles des ROS sont principalement les acides gras polyinsaturs, en raison de la prsence de nombreuses doubles liaisons, comme l'acide linolnique ou l'acide eicosapentenoque. Les ractions radicalaires sont l'origine de la peroxydation lipidique qui se traduit in vitro par le rancissement. Le mcanisme radicalaire comporte trois tapes : linitiation, la propagation et la terminaison (Halliwell and Gutteridge, 1989).

Figure 30 : Schma de peroxydation lipidique (D'aprs Douste-Blazy and Mendy, 1988). Linitiation dbute avec un radical hydroxyle (1) qui attaque lacide gras pour former un site radicalaire sur le carbone. Loxygne, par sa nature biradicalaire ragit sur ce site () et assure la propagation. Ensuite le radical peut tre transfr sur un autre acide gras, form un hydroperoxyde () et lacide gras radicalaire repart dans le circuit de peroxydation (4). Le radical form ltape peut se combiner avec une autre espce radicalaire et assurer la terminaison par formation dune liaison covalente.

55

La phase dinitiation dbute par une cassure homolytique dune liaison sous larrachement dun hydrogne (cf. figure 0). Pour raliser cette cassure, il faut un initiateur qui peut tre une molcule oxyde sous forme radicalaire. Les atomes impliqus partent chacun avec un lectron clibataire (atome de carbone d'une molcule d'acide gras, par exemple) ; il y a alors libration dune molcule deau et cration dun site radicalaire au sein de la molcule. Llectron clibataire va se dplacer dans la molcule et provoquer des rarrangements. La propagation est ralise par la fixation d'une molcule doxygne, qui ragit rapidement sur le site radicalaire. Le radical form peut soit ragir avec un autre acide gras formant ainsi un hydroperoxyde et un nouveau site radicalaire qui assure la propagation, soit ragir avec une autre entit radicalaire pour reformer une liaison covalente. Lhydroperoxyde form au cours de la raction peut galement tre oxyd en prsence de fer ferreux (Fe2+) ou dion cuivre (Cu2+) pour former des alcanes volatiles rapidement limins lors de la respiration (Favier, 2003) ou des aldhydes comme le malondialdhyde (MDA) et le 4hydroxynonnal (4-HNE). Ces agents alkylants trs puissants peuvent former des adduits avec les protines aux niveaux des rsidus lysine, histidine ou cystine, formant ainsi des bases de Schiff et des pontages intra et intermolculaires (Requena et al., 1996). Lattaque des lipides concerne les lipoprotines circulantes ou les phospholipides membranaires. Dans le premier cas, loxydation des lipides ou des lipoprotines circulants aboutit la formation de LDL (lipoprotines de densit lgre) oxyds qui peuvent tre capts par les macrophages et former des dpts lipidiques de la plaque dathrome. Dans le second cas, lattaque des phospholipides membranaires modifie la fluidit de la membrane et perturbe le fonctionnement des rcepteurs et transporteurs se trouvant leur surface (Favier, 2003). Laccumulation du MDA, associ aux lipides, va former des dpts dun pigment fluorescent de lipofuschines caractristiques des tissus des sujets gs (Chowdhury et al., 2004). Le MDA, le 4-HNE ou les LDL-oxyds sont retrouvs en grandes quantits lors des diffrents stades de lathrosclrose, lors datteinte chronique rnale et rtinienne chez les patients diabtiques, obses et insulino-rsistants (Palinski et al., 1989 ; Torzewski et al., 1998 ; Makita et al., 1996 ; Fraley and Tsimikas, 2006 ; Grimsrud et al., 2007). b) Les acides nucliques

Les dommages mdis par le stress oxydant au niveau de lADN sont de cinq types (cf. figure 31) : loxydation des bases, la formation de sites abasiques, dadduits intra-catnaires, des cassures des brins et des pontages ADN-protines (Cadet et al., 2002).

56

Figure 31 : Types de lsions de l'ADN provoqus par les attaques radicalaires (d'aprs Favier, 2003).

Au niveau de lADN, la guanine est trs sensible loxydation. Des bases modifies telles que la 8-oxoguanine, 8-nitroguanine et 8-oxoadnine peuvent entraner des coupures dADN ou des msappariements ayant pour consquence des mutations de lADN. Les attaques radicalaires peuvent avoir lieu au niveau de la liaison entre des dsoxyriboses et des bases puriques et pyrimidiques, formant un site abasique ou attaquer directement le dsoxyribose gnrant des coupures de chane simple brin (Favier, 2003). Des adduits peuvent galement se former avec des aldhydes mutagnes gnrs au cours de la peroxydation lipidique. Par exemple, le malondialdhyde peut se combiner avec des bases comme la guanine et former un adduit MDA-guanine. Les protines prsentes au niveau de lADN comme les histones ou les enzymes de rplication, sont la cible galement des entits radicalaires entranant la formation dadduits ou de pontage (Favier, 00). Les coupures simples ou doubles brins de lADN responsables de mutations peuvent aboutir la mort cellulaire (Imlay and Linn, 1988 ; Zastawny et al., 1998) si les systmes de rparation par excision de bases (BER) ou de nuclotides (NER), par exemple, sont dpasss et ne permettent plus la rparation de la cellule. c) Les protines

Les protines subissent des modifications au cours du stress oxydant, soit sous l'action des radicaux libres oxygns, soit en prsence de mtaux de transition (Stadtman, 1990 ; 1993). Il s'ensuit plusieurs types de modifications : fragmentation de la protine, oxydation des chanes latrales des acides amins et formation de liaisons croises entre deux protines (BonnefontRousselot et al., 2001). Tous les acides amins peuvent tre oxyds ; ainsi la mthionine peut se transformer en mthionine sulfoxyde et la tyrosine en nitrotyrosine. Les protines constitues de ces acides amins 57

oxyds peuvent ltre de faon irrversible ou non. En effet, dans le cas de loxydation des mthionines, celles-ci peuvent tre rgnres par des enzymes mthionine sulfoxyde rductase. Lattaque des radicaux sur les fonctions thiols (SH) des cystines conduit la formation de ponts disulfures (S-S) modifiant la structure de la protine. Ces modifications peuvent conduire la perte de la fonction ou de lactivit de la protine (Dean et al., 1997) et il en rsulte que les protines modifies deviennent plus sensibles laction des protases et sont donc limines par le protasome. d) Les sucres

En prsence de mtaux, loxydation du glucose peut librer des cto-aldhydes, du peroxyde dhydrogne (H2O2) et des anions superoxydes (OH.), et entraner la coupure de protines et leur glycation par attachement du cto-aldhyde (Wolff et al., 1989) formant un driv de produit de glycation avanc (AGE, Advanced Glycation End product). 5. Le stress oxydant et les pathologies

Une production importante de ROS joue un rle dans la pathognse de nombreuses maladies. Ils sont impliqus dans lischmie/re-perfusion, les maladies neurodgnratives, les cancers, linfarctus, le diabte, lhypertension mais aussi dans la formation des lsions vasculaires de lathrosclrose (Madamanchi et al., 2005 ; Mueller et al., 2005). a) Lischmie re-perfusion

Ce phnomne a beaucoup t dcrit au niveau du cur (Ceconi et al., 2003). Lors de lischmie, le glucose sanguin chute comme la glycolyse, la phosphorylation oxydative et la production dATP. La dpltion en ATP provoque dune part, une accumulation de lAMP responsable dune accumulation dhypoxanthine, et dautre part, une diminution de lactivit de la pompe Na+/K+ ATPase ncessaire au maintien du gradient dions sodium et potassium entre la cellule et le compartiment extracellulaire. Ce maintien ntant plus assur, une dpolarisation membranaire a lieu provoquant un entre massive de Ca2+ dans la cellule (Katsura et al., 1993) lorigine de la formation de ROS au niveau mitochondrial et de lactivation dune protase calcium dpendante comme la calpane (Budd, 1998). Les ROS associes la calpane, vont convertir la xanthine dshydrognase en xanthine oxydase dont laccepteur final dlectron est loxygne gnrant ainsi des anions superoxydes et H2O2 (Sorg, 2004). b) Lathrosclrose

Lathrosclrose est une atteinte des grosses et moyennes artres par une accumulation de graisses dans la paroi artrielle. Cette accumulation de graisses forme les plaques dathrome, qui sont composes de LDL oxydes. Suite une rponse inflammatoire, les monocytes et les LDL 58

pntrent dans le sous-endothlium vasculaire et les radicaux libres attaquent les LDL. Les LDL oxydes sont captes par les macrophages (monocytes activs), qui se transforment en cellules spumeuses. Celles-ci vont alors dgnrer et former une plaque. Les ROS participent galement la formation de la plaque fibreuse. Ils sont produits par des enzymes actives lors de ce processus (NADPH oxydase, NOS, xanthine oxydase). Ensuite, des lments thrombognes de la plaque sont librs et activent les plaquettes circulantes. Il en rsulte la formation dun thrombus par cascade de coagulation (Sorg, 2004). c) Le cancer

Les espces ractives semblent galement jouer un rle non ngligeable dans la cancrogense, puisquelles peuvent tre responsables de mutations dans l'ADN, ce qui constitue un facteur de risque dans l'initiation et le dveloppement du cancer (Migliore and Copped, 2002). Les radicaux libres interviennent dans lactivation des pro-carcinognes en carcinognes, crant des lsions de lADN, amplifiant les signaux de prolifration et inhibant des gnes suppresseurs de tumeurs, comme p53 (Favier, 2003). d) Les maladies neurodgnratives

Des tudes ont montr que dans des cerveaux de patients souffrant de la maladie dAlzheimer, beaucoup de marqueurs du stress oxydant taient retrouvs et il a t montr quils aggravaient les symptmes associs la maladie (Rao and Balachandran, 2002 ; Hardy and Selkoe, 2002 ; Mattson, 00). Dans la maladie de Parkinson, cest la dgnrescence des neurones dopaminergiques de la substance noire qui est responsable de la pathologie. Lauto-oxydation de la dopamine produit des anions superoxydes et du peroxyde dhydrogne dans cette mme zone crbrale. Les neurones dopaminergiques soumis de fortes concentrations en ROS peuvent dgnrer si les dfenses antioxydantes ne sont pas suffisantes (Sorg, 2004). e) Lge

Deux thories expliquent le vieillissement, lune gntique et lautre mtabolique. La premire rend compte de la diminution des tlomres aux cours de la rplication cellulaire et la seconde de laccumulation des dchets mtaboliques produits par lorganisme. Les marqueurs du stress oxydant sont levs chez les personnes ges (Finkel and Holbrook, 2000). Le vieillissement diminue les dfenses antioxydantes et augmente la production par les mitochondries de radicaux (Sohal et al., 2002). f) Le diabte

Lors de la pathologie diabtique, lhyperglycmie constitue un stress oxydant (Leverve, 00). Elle est responsable de laugmentation de la glycolyse qui par accroissement du potentiel de 59

membrane mitochondriale augmente la formation de radicaux. De plus, elle inhibe la glycraldhyde-3 phosphate dshydrognase ce qui diminue la formation du cofacteur rduit NADPH, H+ essentiel la rgulation de lhomostasie redox (Berger, 006). Le rle du stress oxydant dans cette maladie sera dtaill dans le chapitre suivant. B. Implications du stress oxydant dans le diabte et pathologie associe 1. Glutotoxicit lie lhyperglycmie

Les mcanismes de la toxicit du glucose au niveau des tissus cibles des complications du diabte sont multiples (Benhamou, 1991). Le glucose exerce son effet toxique et forme des ROS par diffrents mcanismes. Il a t montr chez des rats Goto-Kakizaki (GK), diabtiques de type 2, non obses, une augmentation des marqueurs du stress oxydant suite une hyperglycmie (Ihara, et al., 1999). Les mcanismes conduisant la formation de ROS sont notamment, le phnomne dautooxydation du glucose, la voie des polyols, la voie de la PKC et la glycation des protines avec formation des produits avancs de fin de glycation (AGEs). a) Lauto-oxydation du glucose

Lauto-oxydation du glucose a t dcrite par Wolff et Dean (1987). Le glucose dans sa forme linaire (projection de Fischer) possde une fonction aldhyde et une fonction hydroxyle adjacente en quilibre avec la forme ne-diol (cf. figure 32).

Figure 32 : Reprsentation selon la projection de Fischer du glucose et de sa forme ne-diol (Thornalley et al., 1999).

Cest sous cette dernire forme que le glucose est capable de faon isole de soxyder en prsence de mtaux de transition, aboutissant la formation dun radical anionique ne-diol. Ce radical peut ensuite ragir avec loxygne pour librer des anions superoxydes. Au cours de cette raction, il y a formation d-ctoaldhyde, qui peut ragir avec des mtaux de transition via la raction Fenton pour former des radicaux hydroxyles trs ractifs (Hunt et al., 1988 ; Wolff et al., 1991 ; Hunt and Wolff, 1991). 60

b)

La voie des polyols

A ltat de normoglycmie, le glucose est transform par lhexokinase en glucose-6phosphate pour rejoindre la glycolyse et la voie des pentoses phosphates. Cependant, dans le cas dune hyperglycmie, lhexokinase est sature (Gonzalez et al., 1984). Le glucose, de ce fait, saccumule dans les tissus priphriques et active une voie accessoire, la voie des polyols. Dans cette voie, le glucose est transform en sorbitol par laldose rductase, qui nest active quen prsence dune hyperglycmie, car elle possde une faible affinit pour le glucose (King and Brownlee, 1996). La raction a lieu en prsence du cofacteur NADPH, H+ issu de la voie des pentoses phosphates. Le sorbitol est ensuite transform en fructose par la sorbitol dshydrognase, dont le cofacteur est le NAD+ (cf. figure 33). Le sorbitol, qui ne peut pas franchir la membrane plasmique, saccumule dans la cellule, et augmente la pression osmotique, entranant une hyperosmolarit intracellulaire (Burg, 1995). La production accrue de fructose par cette voie peut galement stimuler la formation des AGEs grce au plus grand pouvoir rducteur du fructose par rapport au glucose (Suarez et al., 1988).

Pyruvate

Figure 33 : Voie des polyols et autres voies du catabolisme du glucose (Thse de C. Januel, 2003).

Lactivation de cette voie peut avoir des effets dltres (Brownlee, 2001). La principale consquence est la modification du statut redox intracellulaire rsultant de la baisse en NADPH, H+, au dtriment du fonctionnement de nombreuses enzymes antioxydantes comme la glutathionrductase, lascorbate-rductase et la NOS qui utilisent ce cofacteur (Bravi et al., 1997). Cette baisse de cofacteur et de GSH rduit augmente la sensibilit de la cellule au stress oxydant (Brownlee, 2005).

61

c)

La voie de la PKC

Une hyperactivit de la protine kinase C au cours du diabte dans de nombreux tissus est une des hypothses avances (King and Brownlee, 1996). Lhyperglycmie induit une synthse accrue de diacylglycrol (DAG) partir des intermdiaires de la glycolyse, qui est un cofacteur activateur des diffrentes isoformes de la PKC (Xia et al., 1994). Laugmentation de lactivit de lenzyme induit une augmentation de lexpression des gnes nfastes pour la cellule et au contraire, diminue celle des gnes bnfiques. En effet, elle augmente lexpression de facteurs vasoconstricteurs (endothline-1) en diminuant ceux vasodilatateurs (NO). Elle induit galement lexpression de gnes pro-inflammatoires et augmente la production de ROS par la NADPH oxydase (Brownlee, 2005) (cf. figure 34).

Figure 34 : Consquences de l'activation de la PKC induite par l'hyperglycmie (Brownlee, 2005).

d)

Glycation des protines et formation des AGEs Formation des AGEs

Un autre rle cytotoxique du glucose concerne la glycation lente non enzymatique des protines (Brownlee and Cerami, 1981). Le glucose (ou autre sucre rducteur) ragit avec la fonction amine N-terminal des protines ou dun acide amin, le plus souvent une lysine, ce qui permet la formation dune base de Schiff qui se rarrange en produit dAmadori. Cette raction est trs dpendante du temps dexposition au sucre et de la concentration de celui-ci. La formation de ces composs est rversible (Brownlee et al., 1984). Par la suite, les produits dAmadori se dgradent irrversiblement en -cto-aldhyde comme le 1 et 3-dsoxyglucosone, qui peut encore ragir avec des protines pour former des adduits fluorescents appels produits de Maillard (McLaughlin et al., 1980 ; Nojorge et al., 1987 ; Monnier, 1989) ; (cf. figure 35).

62

Figure 35 : Formation des AGEs par la voie de Maillard (Thse de C. Januel, 2003).

Les produits de Maillard sont aussi appels produits de glycation avances (AGEs) et sont fortement mutagnes. De plus, ils ne peuvent pas tre dtruits car le protasome ne peut dtruire les protines glyques. Ces produits saccumulent alors dans la cellule et peuvent entraner un dysfonctionnement de son mtabolisme, finissant par engendrer sa mort. La formation dAGEs est dpendante des ROS ; elle est augmente par la production de MDA et par la diminution de GSH rduit (Jain and Palmer, 1997). Une fois formes, les protines glyques produisent galement des anions superoxydes (Gillery et al., 1988). La glycation touche des protines comme lalbumine, les immunoglobulines, le fibrinogne, le collagne et les LDL. La protine glyque la plus connue est lhmoglobine glyque, HbA1c dont le taux est utilis en clinique comme indice du contrle mtabolique de la glycmie (Koenig et al., 1976).

Consquences de la glycation

La glycation peut provoquer une altration des activits enzymatiques (prsence dun rsidu lysine glyque au voisinage du site actif de lenzyme ou modification de la conformation de lenzyme), la formation dagrgats entre les protines (Brownlee et al., 1988) et la perte dune partie des proprits mcaniques de la paroi vasculaire par paississement de celle-ci et par diminution de la fluidit membranaire. La glycation au niveau des acides nucliques entrane des 63

cassures des chromosomes, une atteinte des processus de rparation, de rplication et de transcription. Entretien de ltat oxydant

La formation AGEs est source de ROS (Kennedy and Lyons, 1997). Au niveau du macrophage, des cellules endothliales, des fibres musculaires lisses et des fibroblastes, les AGEs peuvent se fixer sur des rcepteurs spcifiques appels RAGE (Receptor of Advenced Glycation End products). La liaison des AGEs au rcepteur RAGE des cellules provoque la formation de radicaux libres, notamment in vitro par activation de la NADPH oxydase, dans les cellules endothliales (Wautier et al., 2001). Cela a t dmontr in vivo par Thallas-Bonke et al. en 2008. La production de ROS intracellulaires est galement stimule par la liaison AGE/RAGE dans le cortex rnal (Coughlan et al., 2009). 2. Stress oxydant et hyperinsulinisme (cas du diabte de type 2)

Lhyperinsulinisme, comme laugmentation des acides gras et des glucides, gnre un stress oxydant. Linsuline inhibe la dgradation des protines oxydes par inhibition du protasome, ayant pour consquence une accumulation de protines oxydes dans la cellule (Facchini et al., 2000). Xu et Badr (1999) ont par ailleurs montr, chez des rats Sprague Dawley ayant une insulinmie 6 fois plus leve que la normale maintenue sur une semaine, une inhibition de loxydation des acides gras et de lactivit de la catalase. Linsuline stimule galement la production dH2O2 dans les cellules adipeuses en culture (Krieger-Brauer and Kather, 1992). Une autre tude a montr quune exposition accrue linsuline provoque une augmentation importante dO2-. dans les cellules endothliales (Kashiwagi et al., 1999). Linhibition de la catalase et la stimulation de la production dH2O2, permettent de dire que linsuline et a forciori lhyperinsulinisme entranent une production de ROS dans les tissus. 3. Molcules pro-oxydantes et antioxydantes de la cellule a) Enzyme pro-oxydante : la NADPH oxydase

Lenzyme pro-oxydante NADPH oxydase permet la gnration danions superoxyde par oxydation du NADPH, H+ en NADP+. Elle est exprime dans les cellules sur des cellules et al., 2005). Uchinozo et al. (006) ont montr que les cellules dlots de rat et in vitro de hamster syrien HIT-T15 (Oliveira et al., 2003) et de souris MIN-6 (Tsubouchi de rat exprimaient une NADPH

oxydase de type phagocytaire (cf. figure 36). Elles expriment les ARNm de diffrentes sous-units associes la membrane plasmique de la NADPH oxydase, Nox1, Nox2 (gp91phox), Nox4 et p22phox, et les sous units cytosoliques Noxo1 (homologue de p47phox) et Noxa1 (homologue de p67phox). 64

Figure 36 : Reprsentation schmatique de la NADPH de type phagocytaire sous forme active (Ray and Shah, 2005).

Des tudes ont montr une augmentation de Nox2 et Nox4 dans un modle de rats rendus diabtiques par injection de streptozotocine STZ (Etoh et al., 2003) et chez des rats et souris diabtiques de type 2 (Nakayama et al., 005). Lactivation de la NADPH oxydase rsulte en une augmentation du stress oxydant. b) Les cellules Dfenses antioxydantes des cellules

pancratiques sont trs vulnrables au stress oxydant de par leur dficience en

enzymes antioxydantes telles que la catalase, la superoxyde dismutase cuivre/zinc (Cu/Zn SOD) et la glutathion peroxydase (Grankvist et al., 1981 ; Lenzen et al., 1996) qui reprsentent la premire ligne de dfense contre le stress. De plus, elles prsentent une faible concentration en glutathion rduit GSH (Ammon et al., 1983). Des tudes ont montr quune surexpression de la Gpx, de la CAT et de la SOD cuivre/zinc dans des cellules insulino-scrtrices les protgeaient du stress oxydant (Tiedge et al., 1999 ; Kralik et al., 1998). In vivo, dautres tudes ont mis en vidence leffet protecteur dune surexpression de la SOD cuivre/Zinc chez une souris transgnique en augmentant la tolrance des cellules au stress oxydant induit par lalloxane (Kubisch et al., 1994 ; Kubisch, 1997). De plus, leffet diabtogne de la streptozotocine est diminu chez des souris transgniques surexprimant dans les cellules , la thiordoxine, une enzyme antioxydante (Hotta et al., 1998). Dans les cellules RINm5F, la surexpression de la catalase, de la Gpx et de la Cu/Zn SOD protge les cellules 4. contre la fragmentation de lADN induit par des cytokines (Lortz et al., 2000). Effet du stress oxydant sur linsulino-scrtion et linsulino-rsistance

Les ROS perturbent et inhibent linsulino-scrtion (Krippeit-Drews et al., 1994) en inhibant la transduction du signal du glucose dans les cellules . En effet, le peroxyde dhydrogne une dose de 1mmol/L sur des lots de souris, inhibe la scrtion dinsuline en diminuant le ratio 65

ATP/ADP intracellulaire. Par consquent, une activation des canaux potassiques ATP-dpendant entrane une hyperpolarisation membranaire (Krippeit-Drews et al., 1999) qui empche la libration de linsuline par la cellule 0,1 et 0,5mmol/L. (cf. figure 7). Ces tudes ont t confirmes sur des lots de rat (Kim et al., 1994) et humain (Jahr et al., 1995) avec des doses en peroxyde dhydrogne comprises entre

Cellule

Capillaire sanguin

Figure 37 : Effet du stress oxydant sur l'insulino-scrtion.

La baisse de la concentration en ATP est due une attaque des ROS sur les mitochondries. La mitochondrie est une des premires sources de ROS mais elle est galement sa principale cible. Elles peuvent inhiber la chane respiratoire (Shiva, 2004) et endommager des composs mitochondriaux comme lADN mitochondrial. Ce dernier est dpourvu dhistones et de systmes de rparation efficaces compar lADN nuclaire (Bohr, 00 ; Stevnsner et al., 2002). Il est donc plus sensible lattaque des espces ractives. LADN mitochondrial, une fois altr, perturbe galement le fonctionnement de la chane respiratoire, gnrant des ROS. De plus, dautres tudes ont montr que des produits de peroxydation lipidique comme le 4-HNE diminue la scrtion dinsuline (Miwa et al., 2000). Les ROS sont galement impliques dans linsulino-rsistance. Des tudes sur des cellules en culture dmontrent que les ROS inhibent la transduction du signal de linsuline. Elles empchent lautophosphorylation du rcepteur linsuline et par consquence celle de la protine IRS-1, conduisant un blocage des voies en amont de la PI3K. La translocation du rcepteur GLUT4 est 66

alors inhibe (Rudich et al., 1998) ne permettant pas lentre du glucose dans la cellule (cf. figure 38).

Figure 38 : Mcanisme de rsistance linsuline induite par les ROS (source personnelle, daprs Voet & Voet, Edition deBoeck, 2005).

En effet, des concentrations de lordre du micromolaire en peroxyde dhydrogne suffisent inhiber lautophosphorylation du rcepteur linsuline sur des cellules en culture (Hansen et al., 1999) entranant ou favorisant linsulino-rsistance.

III. Prventions par les antioxydants

A. Gnralits 1. Dfinition

Le terme antioxydant tait l'origine utilis pour dsigner les substances chimiques qui empchent les ractions avec l'oxygne. la fin du XIXe sicle et au dbut du XXe sicle les proprits des antioxydants ont t largement tudies pour leur utilisation dans les procds industriels afin de rduire, par exemple, la corrosion des mtaux. Les antioxydants, dans le cas prsent, sont des molcules naturellement produites par le corps ou bien apportes par lalimentation pour combattre les effets toxiques des radicaux lors du stress oxydant. La production des entits oxydantes est constamment en quilibre avec les systmes de dfenses antioxydantes (cf. figure 39). 67

Figure 39 : Dsquilibre entre les molcules pro-oxydantes et les systmes de dfenses antioxydantes lors du stress oxydant (source personnelle).

2.

Les systmes de dfenses antioxydants

Lorganisme est dot dun ensemble de systmes de dfenses antioxydantes trs efficaces afin de diminuer la concentration des entits oxydantes dans lorganisme. Le terme dantioxydant dsigne toute substance qui, prsente faible concentration par rapport celle du substrat oxygne, retarde ou inhibe significativement loxydation de ce substrat (Halliwell and Gutteridge, 1990). La nature des systmes antioxydants diffre selon les tissus et les types cellulaires et selon quon se trouve dans le milieu intracellulaire ou extracellulaire (Bonnefont-Rousselot et al., 2003). Il existe diffrents types de molcules quelles soient naturelles ou synthtiques et dont le mode daction repose sur un systme enzymatique (premires lignes de dfense) ou non (molcules pigeuses dlectrons) ; (cf. figure 40).

Figure 40 : Pyramide des systmes de dfenses antioxydants (source personnelle).

a)

Les enzymes antioxydantes

Les enzymes antioxydantes sont les premires lignes de dfenses contre les entits oxydantes. Leur rle est de diminuer la quantit de ROS prsentes dans la cellule. Parfois ces enzymes 68

ncessitent des oligo-lments (Cu, Zn, Mn, Se, Fe) comme cofacteurs pour pouvoir exercer leur activit enzymatique.

Les superoxydes dismutases (SOD)

Les SOD sont les premires enzymes intervenir dans la cascade des ROS. Ce sont des mtalloprotines qui catalysent la dismutation des ions superoxydes en peroxyde dhydrogne et oxygne, selon la raction suivante :

Il en existe trois isoformes dcrites chez les mammifres (Fridovich, 1995) : la SOD Manganse (Mn) dans les mitochondries, cuivre (Cu) ou zinc (Zn) dans le cytoplasme et les mitochondries, et des formes Cu/Zn SOD extracellulaires. Les deux dernires sont retrouves dans les vaisseaux sanguins. Il existe des molcules chimiques de synthse qui possdent cette activit enzymatique et sont permables aux membranes cellulaires. Elles sont appeles SOD mimtiques.

La catalase (CAT)

Le peroxyde dhydrogne gnr notamment lors de la dismutation de lanion superoxyde est dgrad par la catalase. Cette enzyme est forme de quatre chanes polypeptidiques, comportant chacune un groupe hme, qui constituent les sites actifs de la CAT. Pour catalyser la raction, latome de fer du groupement hme ralise une coupure htrolytique de la liaison O-O du peroxyde d'hydrogne, ce qui cre une molcule deau et un groupement intermdiaire Fe(IV)=O trs oxydant ; ce dernier peut ensuite oxyder une autre molcule de peroxyde d'hydrogne pour donner du dioxygne. Cette raction est illustre par les deux demi-quations suivantes :
H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)-E (1) H2O2 + O=Fe(IV)-E O2 + Fe(III)-E + H2O (2)

o E reprsente lhme de lenzyme

Lenzyme est essentiellement prsente dans les peroxysomes et dans les rythrocytes.

Les glutathions peroxydases (GPx) et glutathions rductases (GR)

La glutathion peroxydase est une enzyme forme de quatre sous-units contenant chacune un atome de slnium incorpor dans une molcule de slnocystine. La Gpx est prsente dans les liquides extracellulaires (sang) et dans les cellules au niveau du cytoplasme et des membranes. Elle assure la rduction du peroxyde dhydrogne en eau, des hydroperoxydes organiques (ROOH) en 69

alcools (ROH) et des espces radicalaires en espces non radicalaires, grce la prsence de glutathion rduit (GSH), selon le mcanisme suivant :

Les molcules toxiques sont ainsi transformes en molcules assimilables comme leau et lalcool. Dans chacune de ces ractions, une molcule de glutathion oxyde GSSG est obtenue. Pour que cette raction perdure, il doit y avoir un taux constant de GSH, ce qui est rendu possible par la glutathion rductase (GR). Elle catalyse la rduction du GSSG en GSH (ci-dessous), laide du cofacteur NADPH sous forme rduite (NADPH, H+). Le NADPH, H+ provient de loxydation du glucose-6-phosphate en 6-phosphogluconate par la glucose-6-phosphate dshydrognase, de la voie des pentoses phosphates.

b)

Les systmes antioxydants non enzymatiques et leurs effets

Les systmes antioxydants non enzymatiques sont des nutriments naturellement apports par lalimentation ou par des composs endognes. Ils peuvent avoir un rle de scavenger , cest dire quils ont la capacit de piger les entits oxydantes en captant leur lectron libre et en formant ainsi des entits plus stables qui pourront tre limines par dautres systmes antioxydants. Les principales molcules sont le glutathion (GSH), la vitamine E (-tocophrol), la vitamine C (acide L-ascorbique) et la vitamine A (carotnode). Les proprits antioxydantes des acides gras polyinsaturs et des flavonodes seront galement tudies.

Le glutathion (GSH)

Le glutathion est un tripeptide, form par la condensation d'acide glutamique, de cystine et de glycine : -L-Glutamyl cystinyl glycine (cf. figure 41). Cest le thiol intracellulaire le plus abondant. Il permet la conversion des ponts disulfures (R-S-S-R) des protines oxydes en deux fonctions thiols (R-SH). De plus, il pige le peroxyde dhydrogne et ragit avec loxygne singulet et le radical hydroxyle (Larson, 1988). Les formes GSH (rduite) et GSSG (oxyde) forment un couple doxydorduction trs important dans la cellule car il permet les changes dlectrons lintrieur de celle-ci. Des tudes ont montr son importance dans de nombreuses pathologies comme le cancer o une protine exercerait son effet anti-carcinogne en augmentant les 70

concentrations de GSH (Bounous, 2000). De plus, il protgerait des complications affrentes au diabte (Thornalley et al., 1996).

Figure 41 : Formule semi-dveloppe du glutathion rduit (GSH).

La vitamine E (-tocophrol)

La vitamine E, liposoluble, est un antioxydant membranaire. La forme la plus active est ltocophrol (Kamal-Eldin and Appelqvist, 1996) (cf. figure 42). Elle pige les radicaux libres organiques provenant de loxydation des lipides et contribue diminuer la peroxydation lipidique. La vitamine E peut mettre fin une raction radicalaire en se chargeant du radical. Devenue radicalaire, la vitamine E est relativement stable.

Figure 42 : Structure chimique de l'alpha-tocophrol ou vitamine E (d'aprs Flora et al., 2008).

La vitamine C (acide L-ascorbique)

La vitamine C pige lanion superoxyde, le radical hydroxyle, loxygne singulet et rduit le peroxyde dhydrogne en eau via lascorbate peroxydase (Noctor and Foyer, 1998). Elle permet de rgnrer la forme non radicalaire de la vitamine E. Lorsquelle est son tour oxyde, elle est rduite par lacide alpha lipoque ou par les ascorbate rductases ou excrte dans les urines. Sa structure est prsente ci-dessous (cf. figure 43).

Figure 43 : Structure l'acide L-ascorbique (d'aprs Flora et al., 2008).

De plus, cette molcule est connue pour avoir une incidence sur les facteurs de risques cardiovasculaires. De hautes concentrations plasmatiques sont associes une rduction du risque de maladies coronaires et de stnose carotidienne (Gale et al., 2001). Trout (1991) a report quune supplmentation faible en vitamine C diminue le taux de cholestrol total et augmente les HDL. 71

La prservation du pouvoir antioxydant des molcules est fondamentale. Par exemple, le fait dplucher une pomme rduit sensiblement sa capacit antioxydante car la peau est riche en vitamine C et en querctine. La rpartition des antioxydants dans laliment est diffrente dun produit un autre. Dautre part, la cuisson, qui est un phnomne doxydation, diminue le potentiel antioxydant de certains aliments. La vitamine C est notamment trs sensible la chaleur.

La vitamine A (famille des carotnodes)

Le prcurseur de la vitamine A est le -carotne (cf. figure 44). Les carotnodes pigent les molcules doxygne singulet (Stahl and Sies, 2002) formes par les radiations solaires. Grce leur longue chaine carbone, riche en doubles liaisons, ils sont galement de bons pigeurs de radicaux peroxyles. Une molcule de carotnode peut piger plusieurs espces radicalaires avant dtre dtruite (Stahl and Sies, 1997).

Figure 44 : Structure du -carotne (d'aprs Flora et al., 2008).

Les -carotnes ont des effets sur les cancers de la peau induits par des UV, sur les cancers oraux induits par le dimethylbenzanthracene (DMBA) et les tumeurs du colon induites par le dimethylhydrazine, chez des animaux (Krinsky, 1989). De plus, ils prsentent des effets dans les pathologies ophtalmiques. Des tudes ont montr que la consommation daliments riches en zaxanthine (carotnode contenu dans le mas et le chou fleur), rduirait de 93% les risques de dgnrescence maculaire lie lge (DMLA) et de 47% la survenue dune cataracte (selon ltude SU.VI.MAX). La lutine (carotnode prsent dans le jaune duf, les carottes, les oranges et les pinards) abaisserait quant elle de 69% les risques de DMLA. Dautre part, mme si certains aliments sont riches en -carotne antioxydant, lorganisme ne va pas en bnficier dans sa totalit. Ainsi, Van het Hof et al. (2000) ont montr que les feuilles dpinard coupes contiennent dix fois plus de -carotne que le brocoli et les pois. Cependant, la rponse plasmatique en -carotne est plus importante aprs avoir consomm le brocoli et les petits pois que les feuilles dpinard.

Cas des acides gras polyinsaturs

Les acides gras polyinsaturs sont des acides gras essentiels prsentant une ou plusieurs doubles liaisons partir du groupement mthyle terminal. Il existe trois grandes familles d'acides gras insaturs : n-3, n-6 et n-9 (position de la double liaison respectivement au 3me, 6me et 9me 72

carbone en partant de la fin de la chane). Les acides gras de ces trois sries sont des constituants fondamentaux de toutes les membranes cellulaires. Ils ont des rles majeurs dans tous les mtabolismes cellulaires et des effets bnfiques dans de nombreuses pathologies. En effet, l'tude italienne GISSI IV (1999) a montr qu'une supplmentation artificielle en omga-3 (sous forme de glules) chez des patients ayant fait rcemment un infarctus du myocarde diminue de faon significative leur mortalit globale de prs de 20% et celle lie aux maladies cardiovasculaires de prs de 0%. Dautre part, une tude dobservation mene aux tats-Unis et intitule DAISY (Diabetes Autoimmunity Study in the Young) a montr quune alimentation riche en acides gras omga-3 chez des enfants prdisposs un diabte de type 1, permettait de rduire le risque de dclencher lautoimmunit des lots (Norris et al., 2007). Les effets bnfiques des acides gras polyinsaturs suggrent une activit antioxydante de ces molcules. En effet, Mas et al. (2010) ont montr quune supplmentation en omga-3 et plus particulirement en acide icosapentanoque ou en acide docosahexanoque diminuaient le taux plasmatique disoprostanes F, un marqueur du stress oxydant. Dautres tudes suggrent que lhuile de poisson, riche en omga-3, module les effets aversifs de particules ariennes infrieures 2,5m sur la rgulation de la fonction cardiaque. Ce mcanisme impliquerait une diminution des ROS, lutilisation du GSH et une augmentation des enzymes antioxydantes (Cu/Zn SOD) plasmatiques (Romieu et al., 2008).

Cas des flavonodes

Les flavonodes sont une grande classe de molcules antioxydantes appartenant la famille des polyphnols. Il existe diffrentes sous-classes : les flavanols, les flavanones, les flavones, les isoflavones et les anthocyanes (cf. figure 45).

Figure 45 : Tableau des principaux flavonodes (Garcia-Lafuente et al., 2009).

Le curcuma ou curcumin (pice), qui contient de la curcumine (flavonode), diminue le stress oxydant par inhibition de la peroxydation lipidique et neutralisation des radicaux superoxydes et hydroxyles. De plus, un contact prolong des cellules endothliales daorte de bovin avec de la curcumine renforcerait la rsistance cellulaire aux lsions oxydantes (Motterlini et al., 2000). A faibles doses, elle a galement un effet hypocholestrolmiant sur des souris (Srinivasan and 73

Sambaiah, 1991). Chez lhomme, des tudes ont montr quelle permettait daugmenter le taux de HDL bnfique en rduisant le cholestrol total et la peroxydation lipidique (Soni and Kuttan, 1992). Elle prsente galement des proprits anticancreuses : une supplmentation en curcumine chez des patients haut risque de cancer a montr un effet chimioprotecteur pour le dveloppement des cancers dont ils souffraient (Cheng et al., 2001). Enfin, dans une pathologie comme l'uvite antrieure chronique (inflammation de la paroi vasculaire de l'il), la curcumine aprs 1 semaines de traitement, amliorerait les symptmes (Lal et al., 1999). A faible dose, elle inhibe galement la formation de la cataracte chimiquement induite sur des rats et des lapins (Awasthi et al., 1996). Le curcuma prsente de nombreuses proprits mais malgr le fait quil soit un antioxydant puissant, il prsente une faible biodisponibilit et est rapidement limin aprs ingestion. En effet, des tudes ralises chez des volontaires sains, des doses comprises entre 50 et 200mg ont montr que le taux de curcumin plasmatique retrouv nest que de 0,6ng/mL. Ainsi, pour augmenter sa biodisponibilit, il est possible de lui associer un autre constituent (liposomes, nanoparticules). Shoba et al. (1998) ont associ le curcumin (20mg) de la piprine (un alcalode du poivre noir), qui a permis daugmenter la biodisponibilit de 000%, tandis que des liposomes de curcumin/cholestrol/phosphatidylcholine, permettent daugmenter la survie des souris ayant un lymphome par augmentation de sa biodisponibilit (Kuttan et al., 1985). Les polyphnols dont font partie lpigallocatchine gallate du th vert et la procyanidine B2, ont galement des effets antioxydants majeurs qui seront dtaills dans les chapitres III. C et III. D de lintroduction. 3. Pourquoi avons-nous besoin des antioxydants de lalimentation ?

Lors dun stress oxydant, les dfenses sont satures et insuffisantes. Les apports exognes dantioxydants peuvent suppler cette insuffisance. En effet, la vitamine E, C, les carotnodes et les polyphnols apports par lalimentation ont des effets directs sur les constituants cellulaires et circulants (Evans and Halliwell, 2001). De plus, les oligo-lments comme le zinc, le slnium, le manganse ou le cuivre, apports par le bol alimentaire, permettent de faire fonctionner des enzymes antioxydantes comme les superoxydes dismutases (Evans and Halliwell, 2001). La plupart des antioxydants de lalimentation proviennent des vgtaux c'est--dire des fruits, des lgumes, des plantes ou des racines. Les antioxydants vont rduire les radicaux libres ; chaque molcule antioxydante ne peut ragir quavec un seul radical libre (Pelli and Lyly, 2003). De nombreux vgtaux contiennent des antioxydants. Souvent, la mesure de la capacit antioxydante totale (CAT) est ralise par la procdure ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity . Lunit ORAC est exprime en micromoles dquivalents de Trolox ou TE (driv 74

soluble de la vitamine E, permable aux cellules). Cette valeur mesure la capacit de laliment neutraliser le radical peroxyle. Il a t dmontr que, pour avoir un impact significatif sur la capacit antioxydante du plasma et des tissus, la consommation de molcules antioxydantes doit tre comprise entre 3 000 et 5 000 units ORAC (Prior and Cao, 1999). Wu et al., (2004) ont compar les capacits antioxydantes des aliments les plus consomms aux tats-Unis au travers des fruits, des lgumes, des fruits coques, des fruits secs, des pices et des crales. Ils ont tabli une liste des principaux lments riches en antioxydants (cf. figure 46). A ces aliments sajoutent dautres vgtaux, fruits ou pices comme le raisin sec, le raisin noir, les framboises, le kiwi, le pamplemousse rose, le chou fris, le chou de Bruxelles, les pinards, les brocolis, la betterave, les poivrons rouges et les oignons. Les pices telles que le gingembre, le curcuma, le poivre noir, la muscade et la vanille contiennent galement des antioxydants. Aliments
Petits haricots rouges (secs) Myrtilles sauvages Haricot rouge (sec) Haricot Pinto Myrtilles cultives Cranberry Artichaut (cuit) Mre Pruneau Framboise Fraise Pomme Red Delicious Pomme Granny Smith Noix de pcan Cerise Prune noire Pomme de terre Russet (cuite) Haricot noir (sec) Prune Pomme Gala 4181 4118 3903 CAT (mol ET) 13727 13427 13259 11864 9019 8983 7904 7701 7291 6058 5938 5900 5381 5095 4873 4844 4649

Figure 46 : Tableau rcapitulatif mais non exhaustif des aliments les plus riches en antioxydants (Wu et al., 2004). La capacit antioxydante totale (CAT) a t mesure en micromolaire dquivalent Trolox (ET).

75

4.

Risques des antioxydants

Un antioxydant peut devenir pro-oxydant et avoir leffet contraire de celui escompt partir du moment o la dose ingre est trop importante. Ainsi, lors des supplmentations, il ne faut pas dpasser les doses indiques. De plus, les antioxydants ingrs dans le bol alimentaire nont pas la mme biodisponibilit que sils sont ingrs sous forme purifie. Par exemple, une ingestion de 100mg de querctine par lalimentation augmente son taux sanguin, mais la prise de 100mg de querctine purifie augmente 10 fois son taux sanguin, dose qui devient alors toxique. Ainsi, le catabolisme oxydant de la querctine conduit la formation de produits secondaires, qui facilitent la formation des anions superoxydes et diminuent le GSH (Metodiewa et al., 1999). Des tudes ont galement montr que loxydation des polyphnols antioxydants gnre des anions superoxydes, du peroxyde dhydrogne et des complexes qui sont potentiellement toxiques (Sang et al., 2005). 5. Etudes pidmiologiques a) Etudes ATBC et CARET

Ltude ATBC est une tude de prvention des cancers du poumon par des alpha-tocophrol (AT) et du bta-carotne (BC), des doses de 50mg/jour et 20mg/jour respectivement, soit des doses 5 fois suprieures la dose recommande par le concile national de recherche amricain. Cette tude mene entre 1985 et 1993, en Finlande, a t mene sur plus de 29 000 hommes, dont des fumeurs. Les rsultats de ltude ont t plutt dcevants : aucun effet bnfique de la supplmentation en AT et BC pour la prvention des cancers du poumon na t observ. Au contraire, la supplmentation en BC chez les fumeurs sest avre tre nocive par augmentation du risque de dvelopper un cancer du poumon (ATBC Prevention Study Group, 1994). Une autre tude sur les facteurs de risque pour les cancers du poumon a dmarr fin 1994. Ltude amricaine CARET pour Beta Carotene and Retinol Efficacy Trial a test la combinaison de 0mg/jour de -carotne associe ou non 25000 UI/jour de rtinol ou vitamine A, sur un chantillon compos dhommes et de femmes, prsentant des risques accrus de dvelopper un cancer du poumon. Ltude a t stoppe plus rapidement car les molcules ne prsentaient aucun bnfice pour la sant. Au contraire, une augmentation de 28% des cancers et de 17% de dcs chez les personnes recevant les deux molcules a t observe (Omenn et al., 1996). b) Etude SU.VI.MAX

Une autre tude franaise a dmarr en 1994, ltude SU.VI.MAX pour SUpplmentation en VItamines et Minraux Anti-oXydants et sest poursuivie pendant 10 ans. Au contraire des deux prcdentes tudes, celle-ci a utilis des doses nutritionnelles en vitamine C (120mg) et E 76

(0mg) mais aussi en slnium (100g), zinc (0mg) et -carotne (6mg) sur 13000 sujets hommes et femmes. Le but tait de voir lincidence de ces molcules sur les cardiopathies ischmiques, les cancers et la mortalit. Les rsultats de cette tude montrent quil ny a pas de diffrences entre les groupes tmoins sans antioxydants et ceux recevant les molcules antioxydantes sur les cardiopathies ischmiques. De plus, les rsultats obtenus indiquent que le risque de cancers et de maladies cardiovasculaires tait davantage augment chez les hommes que chez les femmes, car leur niveau initial en bta-carotne tait plus bas au contraire des femmes qui ont une alimentation plus riche en fruits et lgumes. Chez les hommes recevant les antioxydants, le risque de cancer est diminu de 1%, de mme quune diminution de 7% du risque de dcs. Aucun effet chez la femme na t obtenu. La conclusion de cette tude de sant publique est quune alimentation riche en fruits et lgumes pargnerait au minimum 12 000 cancers chaque anne. B. Les antioxydants dans le diabte 1. Les vitamines, coenzyme et oligo-lments

De nombreux antioxydants sont utiliss dans la pathologie diabtique, notamment laide dune supplmentation en vitamines, coenzyme et oligo-lments. En effet, une tude a montr quune supplmentation en vitamine E permet de protger contre la glycation des protines et des radicaux libres (Davie et al., 1992 ; Sinclair et al., 1992). De plus, elle a des effets positifs sur laction de linsuline chez des patients diabtiques de type (Caballero, 199 ; Paolisso et al., 199). Elle permet de rduire la glycmie, lhmoglobine glyque (HbA1c), les triglycrides, les acides gras libres et le cholestrol total. La vitamine C est dun grand intrt galement car cet antioxydant hydrosoluble permet de rgnrer la vitamine E et le GSH. Une supplmentation en cette molcule permet damliorer la sensibilit linsuline (Paolisso et al., 1994). Cependant, des tudes ont montr quil ny avait pas deffet de la vitamine C chez des sujets tmoins (Hirai et al., 2000) et chez des patients diabtiques de type 2 insulino-rsistants, forte dose (Chen et al., 2006). De plus, des tudes ont rapport quune supplmentation en vitamine D pendant les premires annes de la vie diminue significativement le risque de dvelopper un diabte de type 1 (Hypponen et al., 2001 ; Stene and Joner, 00). Ltude DAISY ( Diabetes Autoimmunity Study in the Young ) a montr quune alimentation comprenant des acides gras riches en omga (acides gras polyinsaturs) tait associe une rduction du risque de dvelopper une auto-immunit au niveau de llot chez des enfants prdisposs gntiquement au diabte de type 1 (Norris et al., 2007). Lacide lipoque est un cofacteur notamment des enzymes du cycle de Krebs. Son rle antioxydant est moins connu que celui des vitamines E ou C. Sur des modles animaux de diabte de type 1 et , lacide lipoque amliore la sensibilit linsuline dans les cellules musculaires 77

(Peth, 2000). Il amliore galement cette sensibilit chez le patient diabtique de type 2 aprs administration intra veineuse (iv) ou per os (Evans and Goldfine, 000). Son mcanisme daction est inconnu, mais des donnes in vivo suggrent quil permet le maintien du GSH rduit en prsence du stress oxydant et quil empche lactivation des inhibiteurs des kinases (IKK ) permettant la restauration de la sensibilit linsuline (Evans et al., 2005). Ruderman et Prentki (2004) ont galement montr que lacide lipoque amliore linsulino-sensibilit en ayant un effet sur lAMP kinase. Enfin, Bouloumie et al. (1994) ont montr quune administration de GSH en infusion chez des patients diabtiques de type a galement un effet bnfique sur la sensibilit de linsuline. 2. Les composs dorigine naturelle non vitaminique

Outre la supplmentation en vitamines et oligo-lments, les cultures anciennes utilisaient les plantes ou la nourriture pour se prmunir des maladies. Ainsi, dans la mdecine traditionnelle indienne, lutilisation de lcorce dun arbre de la famille des fabaces, Pterocarpus marsupium roxb, tait utilise pour soigner le diabte. Mais dautres vgtaux ou fruits ont des proprits hypoglycmiantes comme le melon amer, le ginko, les ails et les oignons. En 1988, des tudes cliniques menes Mexico ont montr leffet hypoglycmiant du nopal, un cactus plus connu sous le nom de figuier de Barbarie (Frati-Munari, 1988). Le fenugrec a galement des proprits hypoglycmiantes dans le diabte de type 1 (Sharma, 1990) et les feuilles de bleuets dans le diabte de type 2 (Abidov et al., 2006) conduisent une diminution du LDL. Enfin la cannelle des doses de 1 6g, permet de diminuer les risques de complications cardiovasculaires en amliorant la sensibilit linsuline chez des patients diabtiques (Khan et al, 2003). Les cosses de haricot permettent galement de diminuer la glycmie car elles sont riches en flavonodes. a) Les flavonodes en gnral

Leur proprit est de piger les radicaux libres (effet scavenger) et dinhiber les enzymes prooxydantes iNOS induites par du LPS dans des macrophages en culture (Sarkar and Bhaduri, 2001). Ils permettent de rduire ou retarder lapparition de nombreuses maladies chroniques (Hung et al., 2004). Chez des patients diabtiques, ils rduisent les effets nfastes dus au stress oxydant et aux radicaux libres (Lean et al., 1999 ; Asgary et al., 2002). Le chocolat est un compos qui est riche en flavonodes antioxydants comme lpicatchine, les catchines et la procyanidine (Fraga, 2005). Grassi et al. (2005) ont tudi pendant 15 jours leffet de 100g de barres de chocolat noir, contenant 500mg de polyphnols et de 90g de chocolat blanc en barre, qui ne contiennent pas de polyphnols, sur quinze sujets sains. Le modle dhomostasie permettant dapprcier au mieux la rsistance linsuline (HOMA-IR) tait plus faible chez les sujets recevant le chocolat noir. De plus, lindex de sensibilit linsuline (QUICKY) tait amlior. 78

b)

Le curcumin

Le curcumin est connu pour avoir de nombreux effets antioxydants. Sur le diabte, Weisberg et al. (008), ont montr quune administration de curcumin chez des souris mles C57BL/6J obses (ob/ob) ayant reu une alimentation hypercalorique, amliore le contrle glycmique, la sensibilit linsuline et les taux plasmatiques de leptine et dadiponectine, dans ce modle de souris obse diabtique. Une autre tude a montr que les souris diabtiques (db/db) dont lalimentation est supplmente avec du curcumin (0,0%) ont une glycmie plus basse que les tmoins et perdent du poids (Seo et al., 2008). C. Les polyphnols 1. Gnralits sur les polyphnols

Les polyphnols reprsentent un groupe important de composs issus des plantes ayant des effets protecteurs envers de nombreuses pathologies, comme les maladies cardiovasculaires et les cancers. Il existe des composs non azots qui sont caractriss par la prsence dau moins un noyau benzne avec plusieurs groupements hydroxyle qui peuvent tre libres ou lis dautres fonctions chimiques (Escarpa and Gonzalez, 2001).

Figure 47 : Les diffrentes de polyphnols. (C=catchine ; EC = picatchine ; ECG= picatchine gallate ; EGCG= pigallocatchine gallate).

79

Ils peuvent tre classs en plusieurs groupes (Zern et al., 2005) selon la complexit de leur squelette (cf. figure 47) : les acides phnoliques (acides benzoques), les stilbnes dont le reprsentant le plus connu est le resvratrol, les xanthones, les coumarines, les isoflavonoides, les anthocyanes, les flavonodes et ses drivs (flavones) et les lignines. Lactivit antioxydante des polyphnols est due au caractre acide de la fonction phnol (donneur dhydrogne) et sa possibilit dtablir des liaisons hydrognes. Cela lui confre la capacit de complexer les mtaux, de se combiner des molcules nuclophiles et de faire des ractions doxydorduction (Rice-Evans, 1995). Leur possibilit de piger les radicaux libres est due leur fonction hydrogne. 2. Le french paradox

Le french paradox ou paradoxe franais est un terme utilis pour dsigner une apparente contradiction entre lhabitude alimentaire des franais et leur sant. Cette contradiction a t constate par lpidmiologiste St Lger en 1979, qui a fait le constat suivant : les franais, qui ont une alimentation plus riche en matires grasses et en vins (rgime mditerranen), taient en meilleure sant avec une rduction des maladies cardiovasculaires, que les personnes nayant pas ce rgime alimentaire dont notamment les amricains (cf. figure 48). En effet, il a t constat que le taux dinfarctus du myocarde tait de 80 pour 100 000, en France, tandis quil tait quatre fois plus lev aux tats-Unis (Legoy, 2002). Ce constat de paradoxe franais peut sexpliquer par la prsence dune quantit importante de polyphnols dans le vin et notamment de resvratrol, qui ont un effet positif, confirm par Renaud et al. (1998) et Chalopin et al. (2010).

Figure 48 : Illustration du French Paradox (Olivier Danchin, 2000).

80

3.

Quelques polyphnols du raisin a) Le resvratrol (trans)

Le resvratrol est un stilbne appartenant la famille des phytoalexines. Les phytoalexines sont des composs que certaines plantes produisent en rponse des agressions pathognes, comme lexposition aux rayons UV ou lozone. Essentiellement prsent dans la vigne, il est galement retrouv dans le Polygonum cupsidatum (liseron asiatique), mais aussi dans les fruits comme les raisins, les arachides, les mres. Le resvratrol se retrouve en quantit significative dans les vins rouges (environ de 5,4 mg/L de vin) car il est extrait au cours de la macration lors de la fermentation alcoolique. Il nest pas prsent dans les vins blancs. La forme chimique majoritairement retrouve et la plus stable est le resvratrol trans ou Rt (cf. figure 49).

Figure 49 : Formule du resvratrol trans ou trans-3, 4', 5' trihydroxystilbne (Orallo et al., 2002).

Le Rt possde des proprits anti-inflammatoires, antioxydantes et chimioprventives en modulant les voies de signalisation cellulaire (Kundu and Surh, 2004). Son caractre antioxydant est trs puissant ; il peut inhiber loxydation des lipoprotines de basse densit (LDL). Selon des tudes ralises partir de cellules endothliales de rat (Orallo et al., 2001), le Rt aurait un effet inhibiteur de la NADH/NADPH oxydase et de ce fait diminuerait la production danions superoxydes. b) Le resvratrol cis

Le resvratrol existe galement sous forme cis (stroisomre). Il est obtenu partir de la forme trans par irradiation UV (cf. figure 50).

Figure 50 : Formule du resvratrol cis.

De nombreuses tudes montrent quil existe des diffrences quantitatives de l'activit des deux formes. Par exemple, l'isomre cis entrane une diminution plus grande dans l'accumulation plaquettaire induite par le collagne que l'isomre trans. Schneider et al. (2003) ont montr que le 81

resvratrol cis (Rc) trimthyl (afin de garder sa configuration cis) prsente un effet antiprolifratif sur des cellules de cancer du colon Caco-, 100 fois suprieur celui du Rt. Il semblerait, dune manire gnrale, que le Rt soit plus actif que le Rc (Leiro et al., 2004). c) La procyanidine B2

Elle prsente des effets intressants au niveau cardiovasculaire. Contenue dans les fruits (la pomme, le cacao, le raisin) et les vgtaux, la procyanidine B (PB2) est cependant, la plus abondante dans les ppins de raisins (cf. figure 51).

Figure 51 : Formule de la procyanidine B2 ou picatchine-(4-8)-picatchine (Li and Jiang, 2007).

Des tudes ont montr que la PB2 inhibait la formation de bases oxydes 8-oxodG sur une ligne de cellules leucmiques (HL-60) traites avec un systme gnrant du peroxyde dhydrogne (Sakano et al., 005). De plus, lorsquelle est additionne aux vitamines C, E et aux carotnodes, la PB augmente les capacits antioxydantes du plasma. (Holt et al., 2002). 4. Leffet antioxydant des polyphnols

Les composs polyphnoliques sont des molcules apportes par lalimentation. Il sagit dune grande famille de molcules organiques dont les plus connus sont les tanins et les flavonodes. Ils ont une structure particulire qui leur confre une activit de scavenger (Bors et al., 1990) et donc antioxydante. Des tudes ont montr que ces composs avaient des proprits antioxydantes plus importantes que la vitamine E et C (Rice-Evans et al., 1995 ; McKay and Blumberg, 2002). Les polyphnols ont montr leurs effets bnfiques sur la sant. Ils suscitent un grand intrt pour la prvention et le traitement du cancer (Chen et al., 2004), des maladies inflammatoires (Laughton et al., 2004), cardiovasculaires (Frankel et al., 1993) et

neurodgnratives (Orgogozo et al., 1997). Leur biodisponibilit ainsi que leur absorption est augmente en prsence dalcool ou de solvant alcoolique. Le resvratrol empche la dgradation des lipides et bloque de faon dose dpendante lentre des LDL oxyds dans la paroi vasculaire. De plus, il a des proprits 82

anticancreuses. Pozo-Guisado et al. (00) ont montr quil provoque lapoptose dans des cellules cancreuses ayant ou non le gne suppresseur de tumeur p53. De plus, le trans resvratrol est dgrad par le cytochrome P450 en un phyto-strogne (le piceatannol) qui a une activit anticancreuse (Potter et al., 2002). Il prsente galement une activit anti-inflammatoire. Aprs une lsion de la moelle pinire, une injection de resvratrol a permis de renverser la rponse inflammatoire aussi bien quun mdicament anti-inflammatoire comme la prednisone et dapporter une protection antiradicalaire (Yang and Piao, 2003). 5. Effet des polyphnols de vin rouge dans la pathologie diabtique

Al-Awwadi et al (2004) ont montr que des extraits de polyphnols de vin rouge franais Corbires (AOC) une dose de 200mg/kg pendant 6 semaines diminuaient la prise de poids et de nourriture ainsi que la glycmie dans les groupes tmoins et rendus diabtiques par une injection de streptozotocine intra veineuse 60mg/kg. De plus, il a t montr que le Rt possde un effet hypoglycmiant et hypolipmiant. Il permet de diminuer la prise de poids, la polyphagie et la polydipsie des animaux. De plus, il diminue la scrtion dinsuline et retarde lapparition de linsulino-rsistance chez des rats rendus diabtiques par injection de streptozotocine (Su et al., 2006). Enfin, chez des rats rendus diabtiques par injection de streptozotocine, des extraits de ppins de raisins contenant de la procyanidine B2 ont un effet hypoglycmiant (Pinent et al., 2004). D. Le th 1. Gnralits sur le th

Le th (Camelia sinsensis L) est la boisson la plus consomme dans le monde aprs leau. Cette plante est connue depuis plusieurs millnaires, en particulier dans les populations asiatiques, qui lui attribuent des proprits mdicinales. Il existe plusieurs types de th. Leur composition qualitative et quantitative est dpendante du mode de fabrication, du type de culture et du type de cueillette. Le th est particulirement riche en composs phnoliques, puisque ceux-ci reprsentent le tiers de la matire sche de la feuille (Balentine et al., 1997). a) Les principes actifs

Les feuilles de th contiennent surtout des flavonodes et des mthylxantines (cafine et thobromine). Les principales classes des flavonodes du th sont des flavanols et des flavonols, qui reprsentent 30 42 % de la masse sche des feuilles (Brown, 1999). Les flavonols du th sont la querctine, le kaempfrol, la myrictine et leurs glycosides (Cabrera et al., 2006). Parmi les flavanols, les catchines sont prdominantes. Les quatre principales catchines retrouves dans les feuilles de th fraches sont : lpigallocatchine-3-gallate ou EGCG (59 % des catchines),

83

lpigallocatchine EGC (19 %), lpicatchine-3- gallate ECG (1,6 %) et lpicatchine EC (6,4 %) daprs McKay et Blumberg (2002) (cf. figure 52).

Figure 52 : Les catchines du th (Higdon and Frei, 2003).

On trouve galement la vitamine C et les vitamines B1, B2, B3, B5, et B11. La vitamine E, tant liposoluble, nest pas retrouve dans linfusion de th, contrairement aux vitamines B et C qui sont hydrosolubles. Quant la vitamine C, elle nest prsente que dans le th vert, car elle est dtruite par le processus de fermentation. Cependant, comme elle est sensible la chaleur, elle est aussi dtruite lors de linfusion. La transformation du th vert entrane une perte de principes actifs. Les catchines incolores du th vert sont transformes en diffrents produits de couleur orange-jaune rouge brun, par une srie de ractions de condensation oxydative conduisant la formation dun grand nombre de composs polyphnoliques organoleptiques volatils. Loxydation des catchines en quinones actives est la premire modification observe au cours de la fermentation, catalyse par la polyphnol oxydase. Des biopolymres de flavonodes, les thaflavines, apparaissent ensuite. On les diffrencie en fonction du nombre de molcules dacide gallique estrifies. Les thaflavines sont reprsentes hauteur de 0, % dans le th noir. Elles sont colores en rouge et sont astringentes. Lacide gallique peut tre oxyd en quinone dacide gallique par la mme enzyme. Lactivit antioxydante du th pourrait tre due la prsence de flavonodes en particulier les catchines qui neutralisent les espces ractives de loxygne (Middleton et al., 2000). Les flavonodes peuvent galement chlater les ions mtalliques libres en particulier le fer et le cuivre, ce qui rduit la production despces ractives de loxygne catalyse par les mtaux (Miller et al., 1996) (Morel et al., 199). LEGCG et lECG, principales catchines du th vert sont des bons 84

pigeurs du radical peroxyde gnr par le systme hypoxanthine

/ xanthine oxydase. Les

catchines ont t classes en fonction de leur activit chlatante des mtaux : pigallocatchine (EGC) > picatchine gallate (ECG) pigallocatchine gallate (EGCG) > picatchine (EC) (Guo et al., 1996). Il semblerait que lEGCG ait la capacit antioxydante la plus leve par rapport aux autres classes dantioxydant et aux autres catchines (cf. figure 5 A et B). A B

Figure 53 : Capacit antioxydante de l'EGCG Teavigo (DSM Nutritional Product). A : la capacit antioxydante a t dtermine par mesure dquivalent Trolox (mmol/L). Les molcules sont testes 1mmol/L (adapt de van het Hof et al., 1997) B : la capacit antioxydante des catchines a t mesure par rsonance de spin lectronique (GA=acide gallique), adapt de Burns et al., (2000).

2.

Effets gnraux de lEGCG

De nombreuses tudes pidmiologiques ont associ la consommation de th des bnfices pour la sant et la prvention de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers, les maladies neurodgnratives ou lostoporose (McKay and Blumberg, 2002), (Rietveld and Wiseman, 2003), (Coimbra et al., 2006). Gupta et al. (001) ont montr sur des souris prsentant un cancer de la prostate quun mlange de catchine contenant 6% dEGCG permettait dinhiber le dveloppement des mtastases et de la tumeur. LEGCG inhiberait lenzyme cyclooxygnase-2 (Cox-2) sans affecter lexpression de Cox-1 (Hussain et al., 2005). Il protge galement contre des lsions neuronales et un dme crbral induits aprs une ischmie unilatrale crbrale chez des gerbilles (Lee et al., 2004) et prvient les lsions oxydatives et inflammatoires ainsi que le dpt de protines -amylodes dans la maladie dAlzheimer et serait un bon agent thrapeutique dans la maladie de Parkinson (Rezai-Zadeh et al., 2005 ; Mandel et al., 2008). 85

Au niveau cardiovasculaire, lEGCG protge la cellule endothliale et amliore le flux sanguin chez des patients souffrant datteintes coronaires (Widlansky et al., 2007). Elle active la eNOs qui libre le NO vasodilatateur. De plus, Nakagawa et al. (1999) ont montr quune administration dextrait de th vert, contenant majoritairement de lEGCG, inhibe loxydation des phospholipides dans le plasma humain et rduit loxydation du LDL-cholestrol chez lhomme (Miura et al., 2000 ; Yang et al., 2000). Enfin, lEGCG protge la peau humaine des dommages induits par les UV en restaurant le taux de GSH intracellulaire et lactivit de la Gpx (Katiyar et al., 001). De plus, cest la seule molcule des catchines qui est prsente dans le plasma en grande quantit (77 90%) tandis que les autres formes de catchines sont conjugues avec des acides glucuroniques ou des groupements sulfates (Chen et al., 1997), et ne sont donc pas disponibles pour exercer un effet antioxydant. Dautre part, ltat doxydation du th joue sur les proprits antioxydantes de celui-ci. Stewart et al. (2005) ont compar les profils chromatographiques du th vert et du th noir qui est oxyd de faon enzymatique, contrairement au premier. Le pic dEGCG est prsent uniquement dans le th vert (cf. figure 54 A) alors quil disparat du chromatogramme dans le cas du th noir (cf. figure 54 B). A

Figure 54 : Chromatogramme des composants du th vert et du th noir (Stewart et al., 2005).

86

La principale modification lorigine de la diffrence th vert / th noir est la disparition des catchines (85 %) au cours de la fermentation. Loxydation des feuilles de th diminue donc finalement la capacit antioxydante de la plante. 3. Effet du th vert et de lEGCG sur le diabte

Des tudes in vitro ont montr que les catchines du th prviennent lhyperglycmie en augmentant lactivit de linsuline et en protgeant les cellules par des cytokines sur les cellules du stress oxydant (Bolling et al., 2009). Elles permettent galement dinverser ou de rduire les dommages du stress oxydant induit (Han, 00). Plus rcemment, le rle du th comme modulateur de la sensibilit linsuline et facteur de prvention du diabte et de lobsit, a t voqu (Kao et al., 2006) (Wolfram et al., 2006). Waltner-Law et al. (00) ont montr que lEGCG mime linsuline en diminuant lexpression des gnes contrlant la noglucogense et donc en diminuant la production de glucose hpatique. De plus, il augmente la phosphorylation du rcepteur linsuline. Sur des modles animaux, lEGCG prvient la diminution de la masse des lots induite par des injections de STZ (Song et al., 2003) et rduit la prise de poids et de nourriture chez des rats obses insulino-rsistants associ un effet anti-lipognique et hypocholestrolmiant (Hasegawa et al., 2003). De par son fort pouvoir antioxydant, de nombreuses tudes ont t ralises sur lHomme, avec des effets divers. Ainsi Ryu et al (2006) ont montr que des patients diabtiques de type 2 namlioraient pas leur sensibilit linsuline aprs avoir bu pendant quatre semaines 9g de th vert. Un extrait de th vert administr pendant mois navait galement pas deffet non plus sur la glycmie, le taux dHbA1c et linsulino-rsistance chez 66 patients diabtiques (Fukino et al., 005), ni sur le glucose plasmatique et lHbA1c chez 97 patients souffrant dun diabte de type (Mackenzie et al., 2007). E. Lexercice physique : oxydant ou antioxydant ? Dans nos socits, l'inactivit physique est associe une augmentation de l'incidence de diverses maladies comme les maladies cardio-vasculaires, le diabte de type , l'obsit, latrophie musculaire, la maladie d'Alzheimer et de Parkinson (Booth and Lees, 2007). Lexercice physique favorise laugmentation des dpenses nergtiques et des activits oxydantes. Un exercice intensif augmente de 100 00 fois la consommation doxygne au niveau des muscles stris squelettiques et au niveau du myocarde et peut provoquer une augmentation de ROS (Davies et al., 1982). En consquence de l'augmentation de ces derniers, les lsions oxydatives des lipides, des protines et de l'ADN ont t signales la suite des pisodes dexercice (Alessio et al., 1988 ; Davies et al., 1982 ; Ikeda et al., 2006).

87

En raison de leur instabilit, les ROS sont parfois difficiles mesurer. Ils leur sont prfrs des marqueurs biologiques comme le taux de lipides peroxyds par la mthode TBARS dont le malondialdhyde fait partie. Le taux de ce dernier augmente de faon importante dans le muscle aprs un exercice maximal chez le rat (Brady et al., 1979 ; Davies et al., 1982). Des rsultats similaires ont t obtenus chez lHomme. Ainsi, les lipides peroxyds sont augments chez des coureurs de longue distance (Viinikka et al., 1984 ; Duthie et al., 1990). De plus, lexercice intense diminue les concentrations en vitamine E du foie et des muscles (Aikawa et al., 1984). Cependant, des diffrences sont observes en fonction de lintensit et de la dure de lexercice. Selon Lovlin et al. (1987), un exercice intense augmente la peroxydation lipidique tandis que de courtes priodes dexercice pourraient linhiber. Des tudes menes in vitro dans des muscles de souris suggrent une diminution de la production de lipides peroxyds avec un entranement et de lendurance (Alessio and Goldfarb, 1988). Il a t montr quun exercice rgulier augmente l'activit du protasome dans le myocarde et diminue le taux de protines carbonyles. A loppos, une administration dH2O2 pendant 2 semaines des rats sdentaires aboutit une activit accrue du protasome mais une augmentation de protines carbonyles (cf. figure 55). Ces donnes suggrent que l'exercice, au contraire dun stress oxydant provoqu chez des rats sdentaires, stimule les mcanismes de rsistance au stress oxydant en augmentant les systmes de dfenses antioxydantes (Radak et al., 2000).

Figure 55 : Effet de l'exercice contre un stress sdentaire (adapt de Radak et al., 2000).

Cette gnration de ROS lors dun exercice est importante car elle conduit un processus dadaptation, qui permet de diminuer les ROS de par laugmentation de l'activit des enzymes antioxydantes et du protasome pour la dgradation des protines oxydes (Radak et al., 2005). Il en rsulte que l'exercice diminue l'incidence des maladies associes aux ROS comme les maladies 88

cardiovasculaires, les AVC, la maladie d'Alzheimer et certains types de cancers (Radak et al., 2005 ; Mattson and Magnus, 2006 ; Mattson and Wan, 2005). Dans le diabte, des tudes ont suggr quune activit physique rgulire, modre, associe un quilibre alimentaire permet de retarder lapparition du diabte de type 2 chez des patients intolrants au glucose (Oppert, 005). Ils ont galement montr quaprs un exercice musculaire, il y avait une amlioration de la captation du glucose due une augmentation de linsulino-sensibilit qui persiste plusieurs heures aprs lexercice, et une meilleur efficacit des transporteurs GLUT 4 associe une augmentation de lhexokinase et de la glycogne synthase.

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OBJECTIFS

Le but de ce travail est de dfinir le rle propre du stress oxydant dans lapparition du diabte et de ses complications, de quantifier le stress oxydant et dvaluer leffet prventif dantioxydants dorigine naturelle. Dans un premier temps, une mthode de screening cellulaire sur des cellules insulinoscrtrices de rat (RINm5F) doit tre dveloppe. Cette approche permettra la slection dun ou de plusieurs antioxydants dorigine naturelle ayant les proprits de prvention les plus importantes, parmi un extrait de polyphnols de vin rouge de Corbires (AOC), un extrait de th vert contenant de lpigallocatchine gallate, le resvratrol cis et trans, et la procyanidine B2. Dans un second temps, le travail sest focalis sur la mise au point dun modle animal diabtique prsentant un stress oxydant. Ces animaux sont caractriss par la prsence dune intolrance au glucose et dun hyperinsulinisme chronique. Enfin le troisime objectif est de valider les antioxydants slectionns dans la premire partie de ltude, sur ce modle de rat intolrant au glucose, par son retentissement direct sur le contrle mtabolique et les marqueurs du stress oxydant, et indirect sur la statose hpatique dveloppe dans ce modle.

90

MATERIELS ET METHODES I. Etudes des antioxydants sur des cellules bta pancratiques
A. Matriels 1. Ligne cellulaire

Les cellules cancreuses dinsulinme de rat clone m5F ou RINm5F (ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, USA) sont issues dun clone de cellules RIN-m, qui produisent et scrtent de linsuline. Les cellules sont cultives en milieu RPMI-1640 (Sigma, St Louis, USA) supplment de 10% de srum de veau ftal (Sigma) et de 1% de solution antibiotique-antimycotique (ABAM, Gibco, Invitrogen, Grand Island, USA) comprenant 10 000U/mL de pnicilline G associe 10mg/mL de streptomycine et 5g/mL damphotricine B. Les cellules sont incubes 37C sous atmosphre enrichie 5% en CO2. Lorsque les cellules sont en phase de pr-confluence (80% de confluence), elles sont trypsines laide de trypsine EDTA 0,05% (Sigma). Le milieu est chang toutes les 48 heures. 2. Molcules antioxydantes

Les extraits de polyphnols de vin rouge (RWPs pour Red Wine Polyphenols) proviennent dun vin rouge franais (Corbires, AOC) et ont gracieusement t fournis par le Professeur M. Moutounet de lInstitut National de la Recherche Agronomique (Montpellier, France) et analyss par le Professeur PL. Teisseidre du Dpartement dnologie (Bordeaux, France). Les composs phnoliques de lextrait ont t adsorbs sur une colonne prparatrice, puis dsorbs laide dalcool. Llut ainsi obtenu a t doucement vapor et le rsidu a t lyophilis puis pulvris pour obtenir lextrait sec. Un litre de vin rouge produit ,9g dextrait phnolique, qui contient 471mg de composs phnoliques totaux par gramme dextrait, exprim en acide gallique. Les taux phnoliques de lextrait ont t mesurs par HPLC. Lextrait contient 8,6mg/g de catchine, 8,7mg/g dpicatchine, des dimres (B1 : 6,9mg/g ; B2 : 8,0mg/g ; B3 : 20,7mg/g et B4 : 0,7mg/g), des anthocyanines (malvidin-3-glucoside : 11,7 mg/g ; peonidin-3-glucoside : 0,66mg/g et cyanidine-3-glucoside : 0,06mg/g) et des acides phnoliques (acide gallique : 5,0mg/g ; acide cafique : 2,5mg/g et acide caftarique : 1,5mg/g). Une solution mre dextrait de polyphnols est prpare 10mg/mL dans 50% dthanol en diluant la poudre dans un mlange volume volume deau distille et dthanol 100%. Lpigallocatchine gallate (EGCG), forme pure dun extrait de th vert Teavigo (DSM Nutritional Product, Gland, Suisse) est prpare sous forme dune solution stock 10mg/mL en dissolvant la poudre dans du milieu pour la culture des cellules RINm5F. 91

Les molcules chimiques caractrises et utilises sont le resvratrol trans (Rt) (Sigma), le resvratrol cis (Rc) synthtis par un processus chimique par le Docteur P. Chabert du Laboratoire de Chimie des Polyphnols (Strasbourg, France). Les deux produits sont prpars de faon extemporane dans de lthanol 100%, respectivement des concentrations mres de 0mmol/L et 10mmol/L pour Rt et Rc. La procyanidine B2 (PB2), (Extrasynthse, Lyon, France) est prpare une concentration initiale de 10mg/mL dans du tampon Phosphate-Buffered Saline (PBS) (Gibco, Invitrogen) et conserve - 80C. Tous les composs antioxydants sont prpars labri de la lumire. 3. Molcules induisant un stress oxydant

Le peroxyde dhydrogne (H2O2), plus communment appel eau oxygne, est prpar extemporanment partir dune solution commerciale % (Sigma) qui est dilue dans du milieu de culture. La streptozotocine, STZ, (Sigma) sous forme de poudre est dissoute dans un tampon citrate 0,1mol/L pH acide (pH 4,). Un mlange dhypoxanthine (Sigma) et de xanthine oxydase issue de lait de babeurre (Sigma) est ralis en respectant un rapport de 1 pour 40 et est galement utilis pour induire un stress oxydant. Les deux molcules sont prpares sparment, lhypoxanthine (HX) est dilue dans du PBS et solubilise avec de lhydroxyde de sodium 5N et la xanthine oxydase est dilue dans du PBS galement. Les deux molcules sont conserves - 80C. B. Mthodes 1. Viabilit cellulaire

Le screening de molcules antioxydantes a t ralis laide dun test de cytotoxicit mesurant la viabilit cellulaire, le CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, Madison, USA). Il sagit dune mthode colorimtrique base sur la rduction du compos ttrazolium [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium, appel MTS en un produit color, le formazan. La raction est permise grce des enzymes de la famille des dshydrognases prsentes dans les cellules mtaboliquement actives. La quantit de formazan produite est proportionnelle lactivit cellulaire et peut tre extrapole la prolifration cellulaire. Les cellules sont pour cela ensemences dans des micro-plaques 96 puits traites (BD Falcon, Franklin Lakes, USA) raison de 0 000 cellules par puits dans un volume de 200L de milieu de culture supplment et incubes pendant 48 heures avant le test. Dans un premier temps, les molcules gnrant un stress oxydant sont testes seules. H2O2 est test de 0 50mol/L pendant 30 minutes, STZ de 0 50mmol/L pendant 2 heures et le couple HX/XO de 0 0,3mmol/L pour HX et 0 12mU/mL pour XO pendant une heure. Dans une 92

seconde partie, les antioxydants ont galement t tests seuls pendant une heure diffrentes concentrations : de 0 1000g/mL pour les RWPs, 0 1000mol/L pour Rc et Rt, et 0 1000g/mL pour ECGC et PB2. Enfin, dans une dernire partie, les tests ont t raliss avec une pr-incubation des molcules antioxydantes pendant une heure aux concentrations dcrites cidessus. Puis sont ajoutes des solutions de molcules oxydantes des concentrations finales de 40mol/L pendant 30 minutes pour H2O2, de 25mmol/L pour la STZ pendant 2 heures ou un mlange de 0,5mmol/L dHX avec 10mU/mL de XO pendant une heure. Aprs le traitement, les puits sont rincs laide de PBS, puis 100L de milieu de culture supplment et 20L de MTS sont ajouts. Les plaques de culture sont incubes 2 heures 37C en atmosphre enrichie 5% en CO2, et labsorbance est mesure 490nm sur un lecteur de microplaque 96 puits Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan). Les rsultats sont exprims en pourcentage de viabilit par rapport au tmoin ngatif qui correspond des cellules sans traitement. 2. Dtection de lapoptose par cytomtrie en flux (Annexine V-PE)

Les cellules sont cultives en plaque de 96 puits et le tmoin positif dapoptose (cinnamaldhyde oxyd ou acide cinnamique ou (E)-3-phnyl-2-propnal) est co-incub une concentration finale dans le puits de 0,25mol/L avec les cellules, pendant 48 heures. Les molcules oxydantes seules ou les composs antioxydants seuls ou les deux sont incubs au temps dtermins prcdemment. Puis 10L de ractif Guava Nexin (Millipore, Guava Technologies, Hayward, CA) sont ajouts pendant 15 minutes. Le ractif comprend deux fluorophores : la phycoerythrine (PE) couple lannexine-V et la 7 amino-actinomycineD (7AAD). Le premier marque les cellules en apoptose car dans cet tat, elles externalisent de la membrane les phosphatidylsrines, ligand de lannexine-V, par un phnomne de flip-flop. Le second marque les cellules mortes dune manire gnrale. Les cellules sont ensuite dcolles de leur support selon un procd confidentiel, dvelopp par lquipe du Dr CD. Muller de la Facult de Pharmacie (Illkirch, Strasbourg), et les plaques de tests sont insres dans le cytomtre en flux Guava Easycyte (Millipore). Les fluorophores sont excits une longueur donde de 488nm et rmettent une longueur donde dmission de 575 et 647nm respectivement pour PE et 7AAD. Cette technique permet de discriminer des cellules en apoptose prcoce (annexinV-PE positive / 7AAD ngatif) et des cellules en apoptose tardive (annexinV-PE positive / 7AAD positif). Pour chaque test, 200 vnements sont collects et les rsultats sont analyss avec le logiciel CytoSoft 5.3 (Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA), (cf. figure 56). Les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules apoptotiques (fluorescentes) par rapport au nombre total de cellules comptes.

93

Figure 56 : Analyses des rsultats par le logiciel Cytosoft 5.3. Les cellules marques de faon diffrente apparaissent dans les diffrents cadrans. Par exemple, des cellules non marques par liodure de propidium et le PE apparatront dans le cadran en bas gauche (A) au contraire des cellules ayant incorpores les deux fluorophores qui apparatront en haut droite (B). Les pourcentages de cellules dans chacun des cadrans sont ensuite calculs.

3.

Dtection de lapoptose par cytomtrie en flux (Caspase 8 et 9)

Les cellules RINm5F sont ensemences dans des plaques de 96 puits raison de 10 000 cellules par puits, dans 200L de milieu de culture et incubes 48 heures avant le test, 37C et 5% de CO2. Lapoptose des cellules est induite par des concentrations croissantes dH2O2, puis 10L de chaque caspase sont ajouts dans chaque puits : caspase 9-SR (sulforhodamine) et caspase 8-FAM (carboxyfluoresceine), mlanges et incubes une heure 37C (kit Guava Caspase 8 FAM et Caspase 9 SR, Guava Technologies Inc.). Puis 100L de tampon de lavage 1X sont dposs dans les puits, les plaques sont ensuite centrifuges 5 minutes 300g (24C). Aprs avoir retir le surnageant, 200L de tampon de lavage 1X sont ajouts et les cellules sont doucement remises en suspension, puis centrifuges 5 minutes 300g et le surnageant est retir. Enfin, 200l de solution de 7AAD sont ajouts et les plaques sont incubes 10 minutes temprature ambiante et dans lobscurit. Pour chaque test, 00 vnements sont collects et les rsultats sont analyss avec le logiciel CytoSoft 5.3 (Guava Technologies Inc.). Les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules marques au SR ou FAM par rapport au nombre total de cellules comptes. 4. Mesure de la production de peroxyde dhydrogne par cytomtrie en flux

(DCFH-DA) Les cellules RINm5F sont ensemences dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits traites (BD Falcon, Franklin Lakes, USA) raison de 500 000 cellules/puits dans un volume de 1mL de milieu de culture supplment pendant 48 heures. Les molcules oxydantes ou les composs antioxydants ou les deux sont incubs aux temps dtermins par le test de viabilit 94

cellulaire au Cell Titer. Puis le milieu est retir et 500L de milieu frais sont ajouts, additionns de ,7-Dichlorofluorescein diactate (DCFH-DA, Sigma) une concentration finale de 5M. La DCFH-DA, lorsquelle rentre dans la cellule, est dsactyle par les estrases de la membrane, puis la forme DCFH est transforme par le peroxyde dhydrogne intracellulaire en un compos fluorescent, le DCF. Les cellules sont incubes pendant une heure, puis le milieu est retir, les cellules sont laves au PBS et trypsines. Aprs centrifugation, les culots cellulaires sont dissouts avec 500L de PBS et 200L de suspension sont transfrs dans des micro-plaques de 96 puits. 10L diodure de propidium (PI) sont ajouts pendant 15 minutes et les plaques sont dposes dans le cytomtre Guava Easycyte avec une longueur donde dexcitation 488nm pour des missions respectives 647 et 530nm pour le PI et la DCF. Les donnes sont analyses avec le logiciel CytoSoft 5.3 (Guava Technologies Inc.), exprimes en pourcentage de cellules marques et compares au tmoin sans traitement. 5. Etudes des gnes du stress oxydant et des dfenses antioxydantes par RT-

qPCR array Les extractions dARN totaux ont t ralises avec un tampon dextraction TRI Reagent (Sigma, Steinheim, Allemagne) sur des cellules en culture aprs traitement. 5 minutes aprs ajout du produit, 200L de chloroforme Purex (Carlo ERBA Ractifs SDS, Peypin, France) sont ajouts et la solution est vivement mlange. Aprs repos de 10 minutes, les solutions sont centrifuges 12 000g pendant 15 minutes 4C (Centrifugeuse AllegraTM 21R, Beckman, Fullerton, CA, USA). La phase aqueuse est prleve et les ARN sont prcipits par ajout de 500L disopropanol (Fluka, Buchs, Suisse). Aprs 10 minutes dincubation temprature ambiante, les solutions sont centrifuges 12 000g pendant 10 minutes 4C (Centrifugeuse AllegraTM 21R, Beckman). Les ARN sont ensuite lavs par ajout dun mL dthanol 75% glac (Labonord, Templemars, France), puis centrifugs 7 500g pendant 10 minutes 4C. Le culot contenant les ARN est ensuite sch temprature ambiante pendant 5 minutes puis dissous par ajout de 0L deau milliQ (Millipore) et chauffage 55C dans un bain-marie sec pendant 10 minutes. Le dosage des ARN est ralis en les diluant au 1/50me dans de leau milliQ et labsorbance est mesure 260 et 280nm (spectrophotomtre Beckman DU530, Beckman, Fullerton, CA, USA). Le ratio A260/A280 rend compte de la puret de la prparation et doit tre proche de 2. La concentration en ARN est calcule en sachant quune unit dabsorbance 60nm quivaut 40g dARN simple brin/mL. Les ARNs sont ensuite transcrits par le kit RT First Strand Kit (SABiosciences, Frederick MD, USA). Les ARNs sont dbarrasss de potentiels contaminants dADN gnomique (ADNg) par ajout de L de tampon dlimination dADNg concentr 5X (GE) 1g dARN extrait, dans un 95

volume final de 10L, complt laide deau sans RNAse fournie par le kit. Cette solution est incube 42C pendant 5 minutes et place une minute dans la glace. 10L de solution cocktail de reverse transcription sont ensuite prpars par chantillon, en ajoutant : 4l dun tampon de reverse transcription concentr 5X (BC), 1L de primers hexamriques alatoires (P), L dun mlange denzyme de reverse transcription (RE) et L deau sans RNase. Le mlange est ensuite incub prcisment 15 minutes 42C et la raction est arrte par chauffage de la solution 95C pendant 5 minutes (thermocycleur iCyclerTM Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). LADN complmentaire (ADNc) ainsi form est directement utilis en tape de PCR ou conserv -20C. Ltude des gnes du stress oxydant et des dfenses antioxydantes est ralise laide dun kit RT ProfilerTM PCR Array Rat Oxidative Stress and Antioxydant Defense (PARN-065A, SABiosciences). Le kit contient une plaque 96 puits contenant les amorces spcifiques de 84 gnes impliqus dans le stress oxydant, 5 gnes de rfrences, des contrles de transcription, damplification dADNg et des contrles positifs (cf. figure 57).

Figure 57 : Plan de plaque des gnes Rat oxidative stress and antioxydant defense (PARN065A, SABiosciences) (RTC = reverse transcription control ; PPC = Positive PCR control)

Rapidement, 200ng dADNc (0L) dune condition de traitement sont ajouts 1,75mL de RT qPCR Master Mix (contenant la Taq DNA polymrase, les nuclotides et le Sybr Green qui sintercale dans lADN double brin) dans un volume final de ,55mL. 5L de ce mlange sont dispatchs dans les 96 puits qui sont ensuite recouverts par des capuchons. La plaque est centrifuge 0 secondes 400rpm et dispose dans le thermocycleur. Lamplication dADN est mise en vidence par intercalation du Sybr Green dans les doubles brins dADN. Le signal fluorescent est capt par le module optique MyiQTM (Bio-Rad). Le programme de qPCR ainsi que le plan de plaque sont prdfinis et lanalyse des rsultats est ralise sur linterface du site SABiosciences (http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). Les rsultats dexpression des gnes apparaissaient en nombre de fois par rapport au tmoin sans traitement. 96

6.

Enzymes antioxydantes CAT et SOD

Les extractions protiques ont t ralises avec un tampon de lyse contenant du Tris ultra pure pH 8 20mmol/L (Euromedex, Mundolsheim, France), du NaCl 137mmol/L NaCl (Sigma), de lIgepal CA-630 1% (Sigma), du PMSF ou phnyl mthyl sulfonide fluoride 31mmol/L (Eurobio, Les Ullis, France) et 10% de glycrol (Sigma) avec un inhibiteur de protase Complete Mini (Roche, Indianapolis, USA) dilu au 1/10me dans de leau distille. Dix L de XT sample buffer 4x (Bio-Rad, Hercules, USA) sont ensuite ajouts 50g de protines totales puis chauffs 5 minutes 95C et dposs sur un gel dnaturant SDS-PAGE CriterionTM XT 4-12% Bis-Tris gel (Bio-Rad). La migration est ralise dans un tampon XT MES Running buffer (Bio-Rad) 200V pendant 35 minutes. Ensuite, les protines sont transfres sur une membrane de nitrocellulose de 0,45m (Bio-Rad) dans un tampon de transfert Tris/glycine pendant 30 minutes 100V. Les membranes sont ensuite satures en utilisant la solution de blocage du kit WesternBreeze Chemiluminescent (Invitrogen, Grand Island, USA) pendant 30 minutes temprature ambiante sous agitation faible et rinces deux fois avec de leau distille. Elles sont ensuite incubes avec un anticorps primaire anti-catalase produit chez la souris dilu au 1/1000me, un anticorps primaire antiSOD produit chez le rat (Sigma) dilu au 1/1000me ou un anticorps monoclonal anti -actine produit chez la souris (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) dilu au 1/5000 dans la solution de blocage sur la nuit 4C. Les membranes sont ensuite laves 3 fois avec la solution de lavage du mme kit et lanticorps secondaire (anti-souris ou anti-rat) est ajout pendant 30 minutes. Les membranes sont nouveau rinces avec la solution du kit puis leau distille. La rvlation des membranes est ralise avec la combinaison dun substrat chimioluminescent (ECL) et dun initiateur de raction (enhancer) qui ragissent lenzyme couple lanticorps secondaire, la phosphatase alcaline (PAL). Les membranes sont ensuite exposes dans un systme de dtection ChemiDoc XRS (Bio-Rad) surmont dune camra (pendant 600 secondes) et les images sont captures et analyses par le logiciel Quantity One. Les expressions de la CAT et de la SOD sont normalises par rapport la quantit de -actine et les quantits sont exprimes en pourcentage par rapport au tmoin ngatif sans traitement. 7. Dtection des protines carbonyles par ELISA

Le dosage des protines carbonyles seffectue laide dun kit ELISA OxiSelect TM Protein Carbonyl (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA). Les groupements carbonyls des protines, fixes au fond des puits, rsultant dune modification covalente induite par les drivs radicalaires ou les espces ractives de loxygne, sont mis en vidence par raction avec la dinitrophnylhydrazine (DNPH) pour former une dinitrophnylhydrazone (DNP-hydrazone). Celleci va tre reconnue par un anticorps primaire anti-DNP IgG de lapin qui va fixer un anticorps 97

secondaire conjugu la HRP. La quantit de protines carbonyles est proportionnelle la quantit de substrat transforme par la HRP et les concentrations inconnues sont dtermines par droite dtalonnage de BSA oxydes. Rapidement, les cellules sont cultives en bote de Ptri 150mm (Iwaki, Asahi Techno Glass Corp., Tokyo, Japan) pendant 48 heures raison de 15.106 cellules par bote. Aprs induction du stress ou test des antioxydants ou des deux aux temps et doses dtermines, les cellules sont rinces au PBS et 500L de tampon de RIPA (Millipore, Temecula, CA, USA) contenant un inhibiteur de protase dilu au 1/10me (Complete Mini, Roche) sont ajouts. Les cellules sont dcolles laide dun grattoir cellules (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne), rcoltes et centrifuges. Cent L dchantillon contenant 10g/mL de protines ou de point de gamme de BSA oxyde, sont dposs dans une plaque 96 puits et incubs 4C pendant toute la nuit. Les chantillons sont ensuite lavs trois fois au PBS 1X et 100L de solution contenant le DNPH sont incubs pendant 45 minutes labri de la lumire et temprature ambiante. Les puits sont ensuite lavs 2 fois pendant 5 minutes avec du PBS 1X / thanol (v/v), puis 2 fois 5 minutes avec du PBS seul. La solution de saturation est ajoute aux chantillons et incube pendant une heure. Trois rinages sont ensuite raliss avec une solution de lavage fournie dans le kit. Les chantillons sont ensuite mis en contact avec 100L danticorps primaire anti-DNP produit chez le lapin dilu au 1/1000me dans la solution de saturation, et incubs pendant une heure temprature ambiante. Les puits sont rincs 3 fois comme vu prcdemment. Les chantillons sont ensuite mis en contact avec lanticorps secondaire anti-lapin coupl la HRP, pendant une heure, puis rincs 5 fois avec la solution de lavage. Cent L de substrat sont ajouts dans chaque puits, incubs 5 minutes puis 100L de solution darrt sont ajouts afin de stopper la raction. La lecture de labsorbance est ralise immdiatement 450nm sur le lecteur iMark (Bio-Rad, Marne-laCoquette, France). La quantit de protines carbonyles des chantillons est exprime en nmol/mg de protines totales. 8. Mesure de la peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique est mesure par la quantification du malondialdhyde libre (MDA), un produit de dgradation des ractions de peroxydation lipidique se formant lors de l'attaque des lipides polyinsaturs par des espces ractives de l'oxygne. La mesure du MDA dans chaque chantillon est ralise par spectrophotomtrie laide du kit BIOXYTECH MDA-586TM (Oxis Research, Foster City, CA, USA). Rapidement, les cellules sont mises en culture, raison de 15.106 par botes de Ptri de 150mm pendant 48 heures. Les cellules sont ensuite traites ou non avec les antioxydants et les molcules pro-oxydantes aux temps et concentrations pralablement dtermines. Les cellules sont lyses laide du tampon RIPA (Millipore), rcupres, centrifuges 98

 000g pendant 10 minutes 4C. Puis 1% de -mercaptothanol est ajout dans un microtube de 1,5mL 40L de surnageant cellulaire aprs centrifugation, pour viter loxydation. 2L de probucol y sont ajouts ainsi que 128L de ractif R1. Les microtubes sont vortexs rapidement et 30L de ractif R2 sont dposs avant de vortexer soigneusement les tubes et de les incuber 1 heure 45C dans un bain-marie sec. Les chantillons sont ensuite centrifugs 10 minutes 10 000g et labsorbance est dtermine 586nm (spectrophotomtre Beckman DU530, Beckman, Fullerton, CA, USA) pour calculer le taux de MDA libre partir dune courbe talon. Les rsultats sont exprims en mol/L par rapport au tmoin ngatif. 9. Analyses statistiques

Pour chaque test, les rsultats sont prsents par leur moyenne cart-type (avec n ). La significativit des tests statistiques est donne par les tests One Way Anova avec une comparaison de Student Newman-Keuls post hoc pour des chantillons indpendants plusieurs variables ou par un T-test pour des chantillons dpendants (une seule variable). Des valeurs de p<0,05 sont considrs comme statistiquement significatives.

II.

Etudes des antioxydants in vivo chez le rat hyperinsulinique

A. Mise au point du modle animal Pour ltude des antioxydants in vivo, le choix sest port sur des rats Wistar mles de 00g

(8-10 semaines) du centre dlevage DEPRE (Saint Doulchard, France). Les rats ont t bagus loreille et ont subi une quarantaine dune semaine avant de commencer ltude. Linduction dun hyperinsulinisme conduisant un diabte de type chez le rat est rendu possible grce un rgime alimentaire hypercalorique WESTERN RD (SDS, Special Diets Services, Saint Gratien, France). Ce rgime High Fat Diet (HFD) contient en valeur brute 21,4% de matires grasses ; 17,5% de protines ; 3,5% de fibres ; 4,1% de cendres (matires minrales) et 50% de sucre. Il sagit dun rgime hypercalorique (4,6kcal/g de nourriture) et hyperlipidique, compos dacides gras saturs (11,5%) majoritaires et dacides gras polyinsaturs en moindre quantit (7,16%). Par comparaison lalimentation des groupes tmoins Normal Diet (ND) de la socit SAFE (Augy, France) est de plus faible nergie (2,9kcal/g) et contient en valeur brute 3,1% de matires grasses ; 16,1% de protines ; 3,9% de fibres et 5,1% de cendres. Pour raliser cette tude, deux groupes danimaux ont t raliss de faon randomise : un groupe ND + eau (6 rats) et un groupe HFD + eau (10 rats). Les deux groupes ont t aliments avec ces deux rgimes pendant 7 mois et ont eu accs la nourriture et leau de boisson ad libitum. Les rsultats ont montr qu deux mois de traitement par rgime HFD, les rats prsentaient un hyperinsulinisme marqu. 99

B. Etudes des antioxydants et de lexercice physique Un rgime alimentaire de deux mois HFD suffit pour induire un hyperinsulinisme. Ainsi 135 rats ont t traits pendant deux mois avec de la nourriture HFD (65 rats) et ND (65 rats) et de leau ad libitum. Aprs cette priode, les animaux se sont vus administrer les antioxydants et faire de lexercice tout en continuant leur rgime alimentaire. Au sein des deux groupes initiaux, quatre sous-groupes ont t effectus de la faon suivante : Groupe ND + placbo (solvant) Groupe ND + RWPs Groupe ND + EGCG Groupe ND + Exercice Groupe HFD + placbo (solvant) Groupe HFD + RWPs Groupe HFD + EGCG Groupe HFD + Exercice

Chaque groupe comprend 15 animaux. Les polyphnols (RWPs) sont les mmes que ceux utiliss dans ltude in vitro. En revanche, lEGCG Teavigo utilise provient du mme fournisseur que dans ltude in vitro (DSM Nutritional Product, Gland, Suisse), mais na pas la mme teneur en EGCG. LEGCG utilise est 4 fois moins concentre que celle de ltude in vitro (cf. figure 58).

Ltude a t ralise sur une colonne (dimensions : l = 0,125mm ; = 4,0mm) en gel de silice octadcylsilyl pour chromatographie R (5 m), particules sphriques. La phase mobile est constitue de deux solvants (A : eau contenant 0,1% dacide formique et B : mthanol contenant 0,1% dacide formique). Le temps de rtention de lEGCG est de 22,5 minutes.

Figure 58 : Etude de deux solutions de Teavigo par HPLC.

100

En effet pour cette tude, 1,7g de produit fini commercial contient 50mg dEGCG. Les molcules sont administres dans les biberons raison de 50mg/kg/jour. Les biberons sont prpars pour deux jours en semaine et trois jours pour le week-end. Le solvant utilis pour diluer les poudres est de lthanol absolu ,%. Les biberons sont recouverts de papier daluminium pour que les molcules ne soient pas dtriores par la lumire. Le groupe placebo reoit uniquement du solvant comme boisson. Le groupe exercice reoit le placebo en boisson et effectue une nage force dans de leau ~C (cf. figure 59) pendant une heure, cinq fois par semaine, pendant toute la dure de ltude ( mois).

Figure 59 : Nage des rats en piscine (source personnelle).

C. Mthodes 1. Masse des animaux et prparation des biberons dantioxydants / placbo

La masse des animaux est releve une fois par semaine (le lundi) pendant toute la dure de ltude. 2. Sacrifices, prlvement des organes et dissections des artres

Des sacrifices ont eu lieu avant ladministration des antioxydants, du placebo et avant lexercice soit 10 rats au total (5 rats HFD et 5 rats ND). Puis 5 rats par groupe sont sacrifis chaque mois. Les rats sont endormis avec un mlange xylazine / ktamine soit 2,7mL de Rompun 2% (Bayer, Puteaux, France) ajout 10mL dImalgne 1000 (Mrial, Lyon, France) une dose de 100L/100g. Aprs vrification du stade de lendormissement des animaux (vibrisses inertes, perte du rflexe palpbral, non ractivit des stimuli externes), le rat est plac en dcubitus dorsal et une laparotomie mdiane xypho-pubienne des plans cutan puis musculaire est ralise. Aprs dgagement des tissus conjonctifs et graisseux autour de la bifurcation aorto-illiaque, lanimal est exanguin par ponction dans laorte, laide dune aiguille jaune Neolus 0G et dune seringue de 10mL (Terumo Europe, Louvain, Belgique). Le sang total recueilli est directement transvas dans 101

des tubes EDTA BD Vacutainer (BD, Plymouth, Royaume-Uni) puis centrifug dans une centrifugeuse Eppendorf 5810R (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne) pendant 30 minutes 4000g 4C. Le plasma dans la partie suprieure du tube est prlev et conserv dans des microtubes de 2mL -80C. Rapidement, le msentre est prlev et plac dans une solution de Krebs pH 7,4 (118mmol/L NaCl ; 4,7mmol/L KCl ; 1,18mmol/L KH2PO4 ; 1,17mmol/L MgSO4, 7H2O ; 1,25mmol/L CaCl2 ; 5mmol/L NaHCO et 11mmol/L glucose) jusqu dissection des artres sous loupe binoculaire. Puis le pancras est prlev suivi du rein, de la rate, de la graisse, du muscle gastrocnmien, du cur, du foie total et des deux yeux. En parallle, les aortes thoracique et fmorale sont prleves et places dans le Krebs. Les vaisseaux (aorte, artre msentrique et artre fmorale) prlevs et conservs dans du tampon Krebs sont rapidement dissqus sous loupe binoculaire afin de retirer le tissu conjonctif et adipeux sans lser lendothlium vasculaire. 3. Etudes biochimiques plasmatiques a) Dosage des protines totales

Les protines plasmatiques totales sont doses par la mthode de Bradford. Les chantillons sont au pralable dilus au 1/100me dans de leau distille. 10L dchantillons dilus ou de point de gamme de BSA sont dposs dans une plaque 96 puits non strile (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne), puis 200L de ractif de Bradford (Bio-Rad, Munich, Allemagne) dilu au 1/5me est ajout aux chantillons. La raction se poursuit dans le noir pendant 10 minutes, puis labsorbance est lue 595nm sur le lecteur de plaque 96 puits iMark (Bio-Rad). Les rsultats sont dtermins partir de la droite dtalonnage obtenue avec la BSA et sont exprims en mg. b) Etude de la glycmie

La concentration en glucose plasmatique est dtermine laide du kit de dosage Glucose RTU (BioMrieux, Marcy-ltoile, France). 10L de plasma sont dposs au fond dune semimicrocuve spectrophotomtre en polystyrne (Ratiolab, Dreieich, Allemagne) et 1mL de ractif glucose RTU est ajout. La raction se droule pendant 20 minutes temprature ambiante, puis labsorbance est lue 505nm au spectrophotomtre Beckman DU530. La glucose oxydase contenu dans le ractif catalyse de faon spcifique loxydation du glucose produisant ainsi de lacide gluconique et de leau oxygne. Cette dernire va ragir avec du phnol et de lamino-4 antipyrine pour former en prsence de peroxydase un produit de couleur rose, la quinonimine dont lintensit de coloration est proportionnelle la quantit de glucose prsente dans lchantillon. Les glycmies sont exprimes en g/L. 102

c)

Dosage du C-peptide

Le C-peptide reflte mieux la scrtion dinsuline par le pancras car celle-ci possde un temps de demi-vie extrmement court. Cest pourquoi, il est mesur dans le plasma par le kit ELISA C-peptide (Mercodia, Uppsala, Sude). Le test repose sur un dosage immunologique enzymatique du C-peptide par la technique de sandwich directe. Des anticorps monoclonaux fixs aux plaques de microtitration, lient spcifiquement un pitope du C-peptide. Aprs lavage, des anticorps anti-peptide C conjugus la peroxydase et dirigs contre un autre pitope se fixent sur le peptide et le surplus est enlev. Lenzyme transforme alors son substrat TMB (,',5,5'-ttramthylbenzidine) en un produit color bleu (milieu neutre) qui devient jaune lorsque la raction est arrte par ajout dacide. La quantit de ce produit jaune a un pic dabsorption 450nm et est proportionnelle la quantit de C-peptide, dtermine par courbe dtalonnage. Les points de gamme sont reconstitus avec 1mL deau ultra pure (milliQ). Puis 10L de plasma ou de points de gamme sont dposs en duplicate dans les puits. 50L de tampon Assay Buffer sont ajouts dans chaque puits et la plaque est incube une heure temprature ambiante sur un agitateur de plaque Titramax 100 entre 700 et 900rpm, (Heidolph Instruments, Schwabach, Allemagne). Les plaques sont ensuite laves 6 fois laide dune pissette contenant la solution de lavage. 100L de la solution d'enzyme conjugue sont ajouts dans chaque puits et incubs une heure temprature ambiante. Six lavages sont raliss et 200L de substrat TMB sont ajouts dans chaque puits pendant 15 minutes temprature ambiante. La raction est stoppe par ajout de 50L de solution neutralisante et les puits sont rapidement mlangs sur lagitateur avant dtre insrs sur le lecteur de plaque iMark 450nm. La C-peptidmie est exprime en pmol/L. d) Dosage de la proinsuline

Le dosage de la proinsuline est un dosage complmentaire de celui du C-peptide ou de linsuline. La proinsuline est dose dans des chantillons plasmatiques par le kit Rat/Mouse Proinsulin ELISA (Mercodia) dont le principe repose exactement sur celui du peptide C. Les points de gamme sont reconstitus de la mme manire, puis 50L de la solution d'enzyme conjugue sont ajouts dans chaque puits et 25L de plasma ou de point de gamme sont dposs en duplicate dans les puits correspondants. La plaque est incube deux heures temprature ambiante sur un agitateur de plaque Titramax 100. Les plaques sont ensuite laves 6 fois comme dcrit prcdemment et 200L de substrat TMB sont ajouts dans chaque puits et incub 30 minutes temprature ambiante. La raction est stoppe par ajout de 50L de solution neutralisante et les puits sont rapidement mlangs sur lagitateur avant dtre lus au lecteur iMark 450nm. La proinsulinmie est exprime en pmol/L. 103

e)

Dosage des triglycrides

Les triglycrides sont des esters dacide gras et de glycrol, prsents dans le sang et que lon retrouve dans le plasma. Leur quantit est anormalement augmente au cours dun diabte de type et lie lhyperinsulinisme. Le dosage des triglycrides est ralis laide du kit Triglycerides Quantification Kit (BioVision Research Products, Mountain view, CA, USA) sur des chantillons plasmatiques dilus au 1/50me dans le tampon triglycride fourni dans le kit. Une gamme de concentration de triglycrides est directement ralise dans une plaque 96 puits non strile laide dune solution standard 1mmol/L fournie, dans un volume final de 50L. 50L dchantillons plasmatique dilu sont galement dposs dans des puits correspondants. 1,5L de lipase est ajoute chacun des puits et la plaque est incube 20 minutes temprature ambiante. Un mlange de ractif comprenant 46L de tampon triglycride, L damorce triglycride et L dun mlange enzymatique sont ajouts par puits et incubs une heure temprature ambiante, labri de la lumire. Labsorbance est mesure 550nm sur le lecteur iMark. Aprs soustraction du zro de la gamme toutes les valeurs dabsorbance, la droite dtalonnage est trace. Les concentrations des chantillons sont dtermines en divisant les taux de triglycrides trouvs partir de la droite par le volume dchantillon initial avant dilution. Le taux de triglycrides sanguin est exprim en mmol/L. f) Etude de linflammation par la protine C-ractive

La protine C ractive ou CRP est une protine synthtise par le foie dans la phase aigu de linflammation. Cest un marqueur prcoce, sensible et spcifique de la raction inflammatoire. Dans le plasma des rats de ltude, la CRP est dose par le kit ELISA Rat C-Reactive Protein de chez Millipore (Temecula, CA, USA). Les chantillons plasmatiques sont dilus au 1/4000 me dans du tampon de lavage et incubs temprature ambiante pendant 30 minutes, comme les points de la droite dtalonnage. Les puits sont lavs 5 fois et lexcs est limin. 100L de solution conjugue contenant le second anticorps coupl la HRP, sont ajouts pendant 30 minutes temprature ambiante et les puits sont lavs 3 fois comme dcrit prcdemment. Le substrat (TMB) est ajout pendant 10 minutes temprature ambiante et la raction est stoppe par ajout de 100L de solution stop. Labsorbance est mesure 450nm sur le lecteur iMark et les concentrations plasmatiques en CRP des chantillons sont dtermines grce une droite dtalonnage. La concentration en CRP plasmatique est exprime en g/mL. 4. Etude du stress oxydant a) Dosage des lipides peroxyds par la mthode TBARS

Le malondialdhyde (MDA) est un produit de peroxydation lipidique, mais il existe d'autres entits radicalaires, qui peuvent galement se former au cours de la peroxydation lipidique. Ces 104

entits sont connues sous le nom de TBARS (Thio Barbituric Acid Reactive Substances). Cette mesure traduit une peroxydation lipidique globale. Le MDA est mesur en utilisant la raction de deux molcules d'acide thiobarbiturique (TBA) avec une molcule de MDA, 95 C en milieu acide pour former un adduit de couleur rose qui peut tre mesur par fluorimtrie ou spectrophotomtrie. La quantit de lipides peroxyds dun chantillon est dtermine laide dune courbe talon de MDA (Sigma). Cette technique permet de mesurer la peroxydation lipidique de faon globale tandis que le kit utilis in vitro, ne mesure que lentit majoritaire, savoir le MDA. Cent L de plasma ou de point de gamme de MDA sont dposs dans un microtube de 1,5mL et 00L dacide trichloroactique (TCA, Fisher scientific, Allemagne) 10% sont ajouts pour prcipiter les protines. Les tubes sont placs 15 minutes dans la glace, puis centrifugs 2200g pendant 15 minutes 4C (Centrifugeuse AllegraTM 21R, Beckman, Fullerton, CA, USA). 00L de surnageant sont transfrs dans un microtube de 1,5mL et 00L dacide thiobarbiturique (TBA, Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Allemagne) 0,67% sont ajouts. Le tout est plac dans un bain sec 95C pendant 1 heure. Puis 150L de solution sont dposs en duplicate en plaque de 96 puits non strile et labsorbance est mesure au spectrophotomtre iMark 550nm. La quantit de lipides peroxyds contenus dans lchantillon est exprime en mol/L par mg de protines prsentes. b) Dosages des protines carbonyles du plasma

Lintroduction de groupement carbonyls dans les protines sont des modifications induites par le stress oxydant. Ces groupements carbonyls peuvent ragir avec le 2,4-dinitrophnylhydrazine (DNPH) et conduire la drivatisation de la protine en 2,4-dinitrophnylhydrazone (DNPhydrazone). Le kit ELISA de dtection de protines carbonyles OxiSelectTM (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA) permet la formation de protines drivatises portant le DNP et lanalyse est ralise selon la technique de lELISA. Les chantillons plasmatiques, dilus une concentration finale de 10g/mL, ou les standards de BSA sont adsorbs (100L) sur une plaque de 96 puits 4C pendant la nuit. Lexprimentation suit exactement le protocole qui est dcrit dans le chapitre I.B.7 du Matriels et Mthodes . La lecture de labsorbance seffectue galement 450nm sur le lecteur iMark. La quantit de protines carbonyles des chantillons est exprime en nmol/mg de protines totales. 5. Conglation et inclusions des organes prlevs a) Conglation sec

Les organes prlevs sont coups en quatre morceaux, except les yeux, et les reins sont chacun coups en deux. Deux morceaux de tissus et des sections de vaisseaux sont mis dans des 105

micro-tubes de mL et plongs directement dans de lazote liquide (Linde, Velaine-en-Haye, France) et conservs -80C pour une conglation sec. Le but de ces prlvements est de constituer une tissuthque afin de procder des analyses de faon ultrieure. b) Conglation en OCT

Un morceau de chaque tissu restant ainsi que des sections de vaisseaux sont disposs dans des moules en plastique Histomold (Leica, Biosystems, Nussloch, Allemagne), recouverts dune colle physiologique Tissue Tek OCT (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) et congels avec de lazote liquide, puis conservs -80C. c) Inclusions dorganes en paraffine

Un morceau de chaque organe est directement imprgn dans une solution de paraformaldhyde 4% (Sigma) pendant quatre heures. Ensuite, les organes sont lavs deux fois 10 minutes avec du PBS 1X pH 7,4 (Euromedex, Mundolsheim, France) afin dliminer lexcdent de PFA. La paraffine ntant pas miscible au milieu aqueux, les organes sont ensuite dshydrats par des bains successifs et concentrs dthanol (Labonord). Ils sont tremps deux fois 10 minutes dans de lthanol 70%, puis trois fois 15 minutes dans de lthanol 95% et enfin deux fois 0 minutes dans de lthanol 100 %. Un milieu intermdiaire est galement requis car la paraffine nest pas non plus miscible lthanol. Pour cela, les organes sont plongs dans trois bains successifs de tolune (Labonord) pendant 15 minutes chacun. Ce solvant sert galement dclaircissant de la pice inclure. Les organes sont ensuite immergs dans trois bains de 20 minutes de paraffine Q Path Paraffin Normal (Labonord) pr-fondue 64C dans une tuve (Memmert, Schwabach, Allemagne) puis dposs dans des moules inclusions jetables Macrosette (Starlab, Bagneux, France) remplis de paraffine fondue. Une cassette dinclusion Macro Star V (Labonord) est identifie pour chaque organe issu de chaque animal, dpose sur le moule et recouverte de paraffine. Le tout est sorti de ltuve et dispos temprature ambiante pour refroidissement. Les pices sont facilement dmoules aprs avoir pass quelques heures dans le rfrigrateur et conserves temprature ambiante. 6. Etudes histologiques a) Mise en vidence des plaques dathrome dans laorte

Laorte de chaque animal, conserve dans une solution de Krebs et dbarrasse des tissus adipeux et conjonctifs, est dissque en deux de la crosse aortique aux bifurcations iliaques et est fixe sur une matrice glose. Le tissu est ensuite dshydrat pendant 5 minutes par de lthanol 70%, puis une solution de Sudan IV 0,9% (Sigma), dissoute dans 5% dthanol, 50% dactone (Labonord) et 15% deau distille, est ajoute, pendant 15 minutes sous agitation. Laorte est 106

ensuite rince par une solution dthanol 80% et des photographies sont ralises afin dobserver les plaques dathrome. b) Coupe au microtome et dparaffinage de lames

Avant la coupe des organes inclus en bloc de paraffine, ces derniers sont placs -20C pendant 10 15 minutes. Ils sont ensuite disposs sur un microtome Leica (Nusslach, Allemagne) et dgrossis en le coupant une paisseur de 10m. Les coupes dintrt sont ralises une paisseur de 4m. Chaque coupe est dlicatement dpose dans un bain-marie environ 50C et rcupre sur une lame porte-objet Superfrost (Menzel GmbH, Braunschweig, Allemagne). Chaque lame est dispose dans un porte-lame et celui-ci est plac ltuve (Memmert, Scwabach, Allemagne) 60C pendant une heure afin de faire fondre la paraffine. Le surplus de paraffine est enlev en trempant le porte-lame dans bains successifs de tolune pendant 5 minutes, bains dthanol 100% pendant minutes et un rinage dans de leau du robinet. Les lames sont directement utilises. c) Coloration hmatoxyline / osine

La coloration par de lhmatoxyline / osine est une technique qui permet dapprcier ltat basal dun tissu. Une fois que les lames du porte-lame sont dparaffines, celui-ci est tremp dans un bain dhmatoxyline de Harris (Labonord) pendant 0 secondes. Les lments basophiles des tissus vont alors prendre une coloration rouge-violette. Les lames sont rinces dans deux bacs deau du robinet successifs puis trempes et agites 2 3 fois dans un bain contenant 1% dacide chlorhydrique 32% (Riedel-de Han, Sigma Chemie, Seelze, Allemagne) et 99% dthanol 96% (Labonord) qui va lgrement dcolorer la prparation et donner une teinte orange la prparation. Les lames sont encore rinces avec de leau puis trempes dans une solution deau ammoniacale 0,25% (Ammoniaque 20%, Fisher Scientific, Leicestershire, Royaume-Uni) jusqu obtention dune couleur bleue (coloration violette des noyaux). Les lames sont rinces puis disposes dans un bain dosine filtre contenant ,15g dosine et 1,875g drythrosine (Ractif RAL, Martillac, France) pour un litre deau distille, pendant 10 secondes pour colorer les lments acidophiles du tissu. Aprs un rinage, les lames sont trempes dans trois bains successifs dthanol 100% (dcoloration) puis passes rapidement dans un bain de tolune. Les lames sont ensuite scelles avec une lamelle laide dune colle EUKITT (Kindler GmbH, Fribourg, Allemagne) et conserves dans des botes temprature ambiante jusqu analyse sous microscope.

Mesure de la taille des lots de Langerhans

Sur chaque coupe de pancras colore la HE, une moyenne de dix champs optiques contenant un ou plusieurs lots ont t photographis au microscope AxioSkop 20 (Carl Zeiss, 107

Allemagne) laide dune camra Nikon Digital Sight (Nikon, Tokyo, Japon) . Sur ces champs, la

surface des lots est mesure par le logiciel Nikon NIS Elements Br, version 3,00 SP7 (Nikon) et la
grosseur des lots est dfinie par les tailles suivantes :

Une taille infrieure 10 000m correspond un petit lot, Une taille comprise entre 10 000 et 30 000m correspond un lot moyen, Et une taille suprieure 30 000m correspond un gros lot.

Mthode dvaluation de la statose hpatique

Pour chaque coupe de foie, la statose est value par un systme de score pour les maladies du foie gras dorigine non alcoolique selon Kleiner et al. (2005) : - score 0 pour une statose infrieure 5%, - score 1, si elle est comprise entre 5 et 33%, - score 2, si elle est strictement comprise entre 33 et 66%, - score 3, si elle est strictement suprieure 66%. d) Coloration au trichrome de Masson

Cette coloration permet de mettre en vidence la fibrose dans des tissus. Les lames dintrt sont disposes dans une bote coloration (type Hellendahl) contenant une solution de Bouin (Sigma Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) et chauffes 56 C pendant 15 minutes dans une tuve (Memmert). La bote coloration est refroidie dans un bain deau du robinet, et les lames sont rinces leau du robinet pour enlever la coloration jaune. Elles sont ensuite trempes dans lhmatoxyline de Weigerts (Sigma) pendant 5 minutes et rinces dans de leau du robinet pendant 5 minutes puis leau distille. Les lames sont ensuite disposes dans la fuchsine acide (Sigma) pendant 5 minutes, rinces leau distille et places 5 minutes dans la solution dacide phosphotungstique / phosphomolybdique (Sigma). Les lames sont ensuite trempes dans une solution de bleu daniline (Sigma) et rinces plusieurs fois leau distille. Enfin, les lames sont places minutes dans lacide actique 1% (Labonord), dshydrates dans lthanol 95% (Labonord) et nettoyes dans le tolune, colles avec une lamelle Menzel Glser (Braunschweig, Allemagne). e) Mise en vidence de ROS tissulaire

La prsence despces ractives de loxygne est notamment lanion superoxyde O2-. peut tre mise en vidence par un marquage la dihydrothidine. Cette molcule a la proprit de soxyder en prsence danions superoxydes pour devenir de lthidium, une molcule fluorescente qui sintercale ensuite dans lADN. Le marquage est ralis sur des coupes de foie et de pancras ralises au cryostat 10m dpaisseur. Les coupes sont laisses temprature ambiante environ 108

15 minutes en chambre humide puis incubes en prsence de 2,5mol/L de DHE (Anaspec, Fremont, CA, USA) dilue dans du tampon PBS, en chambre humide et 37C pendant 30 min. Aprs un rinage au PBS et schage des lames, celles-ci sont observes au microscope fluorescence AxioSkop 0 (Carl Zeiss, Allemagne) avec une source dexcitation 488nm pour une mission 585nm. Des photographies sont ralises laide dun logiciel dacquisition dimages Nikon NIS Elements Br (Nikon) et la fluorescence de chaque champ dobservation est quantifie laide du mme logiciel et est exprime en pourcentage de fluorescence par rapport au tmoin (rats ND
recevant leau ou le solvant).

7.

Etude immuno-histologique : immuno-marquage insuline

Une fois les lames dparaffines, les sites antigniques sont dmasqus en incubant pendant 20 minutes 37C, les lames dans une solution de PBS 0,1% trypsine (Sigma) pr-chauffe 30 minutes 37C. Les peroxydases endognes sont ensuite limines en trempant les lames dans une solution dH2O2 3 % 4C pendant 10 minutes. Les lames sont ensuite rinces dans du PBS pendant 2 minutes et gouttes laide de papier absorbant. Elles sont disposes dans une chambre humide et 00L danticorps primaire anti-insuline produit chez la souris (Sigma) dilu au 1/1000me dans du PBS 1% BSA (Sigma) sont dposs sur chaque lame et celles-ci sont incubes une heure temprature ambiante (ou la nuit 4C). Les lames sont rinces 5 minutes dans du PBS et replaces dans la chambre humide aprs avoir t gouttes. Lanticorps secondaire anti-souris biotinyl (Sigma), produit chez la chvre et dilu au 1/200me est ajout (300L par lame) pendant 30 minutes. Les lames sont ensuite rinces 5 minutes dans du PBS et replaces comme prcdemment dcrit. Elles sont ensuite incubes 0 minutes avec une solution dextravidine-peroxydase (Sigma) dilue au 1/20me dans du PBS 1% BSA raison de 300L par lame, puis rinces dans du PBS pendant 5 minutes. La rvlation du couplage anticorps secondaire/peroxydase est ralise en plaant les lames plat dans la chambre humide et en les incubant 5 minutes avec 300L de solution de rvlation contenant : 200L de solution AEC stock (une pastille AEC dans 2,5mL de DMF) dans 3,8mL de tampon actate 0,05mol/L, avec 0L deau oxygne % (Riedel-de Han, Sigma Chemie, Seelze, Allemagne) ajouts extemporanment. La raction est stoppe en plongeant les lames remises sur le porte-lame dans un bain deau distille. Une contre-coloration dans un bain dhmatoxyline de Harris de 15 secondes est ralise pour colorer les noyaux. Un rinage rapide dans leau du robinet est effectu et les lames sont monts sous lamelles en milieu aqueux pour miscroscopie Aquatex (Merck, Darmstadt, Allemagne) et sont conserves temprature ambiante jusqu observation sous microscope AxioSkop 0.

109

8.

Analyses statistiques

La significativit des tests statistiques est donne par les tests One Way Anova avec une comparaison de Student Newman-Keuls post hoc pour des groupes dchantillons indpendants (plusieurs variables) ou par un T-test pour deux groupes dchantillons (une seule variable). Des valeurs de p<0,05 sont considres comme statistiquement significatives.

110

RSULTATS I. tude in vitro du stress oxydant et prvention par des antioxydants

A. Mise au point du modle de stress oxydant Linduction du stress oxydant sur un modle de cellules RINm5F a t ralise par trois traitements chimiques diffrents, sources despces ractives de loxygne : le peroxyde dhydrogne, la streptozotocine et un mlange hypoxanthine / xanthine oxydase. Les doses choisies pour la poursuite de ltude sont celles pour lesquelles la viabilit cellulaire est comprise entre 0 et 50%. Ainsi, une incubation de cellules RINm5F en prsence de peroxyde dhydrogne pendant 30 minutes des doses croissantes induit une perte significative de viabilit partir de 20mol/L (72,6 2,2% ; p<0,001) qui est maintenue jusqu 50mol/L. La dose choisie pour la suite de ltude est celle de 40mol/L o la viabilit cellulaire nest plus que de 1,5 0,9% (p < 0,001) ; (cf. figure 60).
120

Viabilit cellulaire (%)

100 80 60 40 20 0
0 1 5 10 20 25 30 40 50

*** *** *** *** ***

Concentrations en peroxyde dhydrogne (mol/L) Concentrations en peroxyde d'hydrogne (M) Figure 60 : Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes de peroxyde d'hydrogne pendant 30 minutes. *** : p < 0,001 ; peroxyde dhydrogne versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

Une incubation de 2 heures des cellules RINm5F en prsence de streptozotocine permet dinduire une perte de viabilit dose dpendante. Cette perte de viabilit devient significative partir de 5mmol/L (84,8 0,7% ; p < 0,01) et reste significative jusqu 50mmol/L. La dose retenue pour le reste de ltude est celle de 5mmol/L qui induit une perte de viabilit de ,0 ,8% (p < 0,001) ; (cf. figure 61). 111

120 100

Viabilit cellulaire (%)

**
80 60 40 20 0
0 1 5

*** *** *** ***

***

***

***

1 0

1 5

20

25

30

40

50

Concentrations en STZ STZ (m M) Concentrations en (mmol/L) Figure 61 Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes de streptozotocine (STZ) pendant deux heures. ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; STZ versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

Un stress oxydant induit par un mlange hypoxanthine / xanthine oxydase, avec un ratio conserv de 1 pour 40, permet de diminuer la viabilit cellulaire de faon croissante. Ainsi, la perte de viabilit devient statistiquement significative partir dun mlange de 0,5mmol/L dhypoxanthine associ 10mU/mL de xanthine oxydase (cf. figure 6). Cette dose sera conserve pour la suite de ltude : elle correspond une viabilit cellulaire de 45,9 18,5% (p < 0,001).

** ***

Figure 62 : Viabilit en % des cellules RINm5F en prsence de quantits croissantes dun mlange dhypoxanthine (HX) et de xanthine oxydase (XO) pendant une heure. ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; HX/XO versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=4).

112

B. tude des effets des antioxydants sur la viabilit des cellules Leffet des antioxydants a t test sur la viabilit des cellules RINm5F des doses croissantes pendant une heure. Ainsi, sur ces cellules, laddition dextrait de polyphnols de vin rouge ninduit pas de perte significative de la viabilit cellulaire (cf. figure 6).
160
Viabilit cellulaire (%)

140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 50 100 150 200 500 1000

Extraits de polyphnols de vin rouge (g/mL)

Figure 63 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence dextrait de polyphnols de vin rouge. NS ; Extrait de polyphnols versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

Le resvratrol trans induit, quand lui, une perte de viabilit significative au-del de 500g/mL (84,4 9,1% ; p < 0,05) ; (cf. figure 64). Cette perte de viabilit est galement dose dpendante car 1000g/mL de resvratrol trans, la viabilit cellulaire nest plus que de 18,4 17,2% (p < 0,05).

140

Viabilit cellulaire (%)

120 100 80 60 40 20 0 0 10 30 50 100 200 500 1000

* *

Concentrations en resvratrol trans (mol/L)

Figure 64 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de resvratrol trans. * : p < 0,05 ; Resvratrol trans versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3)

113

Le resvratrol cis prsente une perte de viabilit similaire son stroisomre. En effet, faibles concentrations, il ninduit pas de perte de viabilit des cellules. En revanche 500 et 1000g/mL, la perte de viabilit est significative (cf. figure 65). En effet, la viabilit cellulaire est de 64,9 3,2% (p < 0,01) et 6,7 1,1% (p < 0,001), respectivement pour les doses de 500 et 1000g/mL.
140

Viabilit cellulaire (%)

120 100 80 60 40 20 0 0 10 30 50 100 200 500 1000

**

***
Concentrations en resvratrol cis (mol/L)

Figure 65 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de resvratrol cis. ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; Resvratrol cis versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

Les rsultats obtenus avec lEGCG du th vert ne montrent pas de perte de viabilit des cellules RINm5F avec la molcule quelles que soient les concentrations testes (cf. figure 66). Au contraire, 500 et 1000g/mL, la viabilit cellulaire est significativement augmente 151,8 26,0% et 233,5 22,6% respectivement (p < 0,001).
300 250

*** ***

Viabilit cellulaire (%)

200 150 100 50 0 0 200

500

1000

Concentrations en EGCG (g/mL)

Figure 66 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de l'EGCG. ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; EGCG versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

114

Des rsultats similaires sont obtenus avec la procyanidine B2. En effet, aucune perte de viabilit nest observe. La PB induit mme une augmentation significative de la viabilit des cellules 200, 500 et 1000g/mL avec des viabilits respectives de 122,0 18,3% ; 133,5 6,3% et 139,9 17,0% (cf. figure 67). *** *** ***

Figure 67 : Viabilit des cellules RINm5F en % aprs une incubation dune heure en prsence de procyanidine B2. *** : p < 0,001 ; Procyanidine B2 versus tmoin sans traitement, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=3).

C. Effet prventif des antioxydants Leffet des antioxydants a ensuite t tudi sur les trois conditions de stress par ltude de la viabilit des cellules RINm5F. Les rsultats obtenus sont prsents figures 68 70. Sur un stress oxydant induit par 40mol/L de peroxyde dhydrogne pendant 0 minutes, les cinq antioxydants tests permettent de limiter la perte de viabilit cellulaire induit par le stress (cf. figure 68). Ainsi, en prsence de 40g/mol de peroxyde dhydrogne, la viabilit cellulaire diminue significativement 21,5 3,3% par rapport au tmoin sans traitement (100%) ; (p < 0,001). En princubant les cinq antioxydants sparment, la viabilit des RINm5F augmente de faon significative : - Les polyphnols (PP), une concentration de 150g /mL, permettent daugmenter la viabilit des cellules 62,2 3,2% (p < 0,001) en prsence de peroxyde dhydrogne par rapport au tmoin H2O2 seul (21,5 3,3%), Le resvratrol trans (Rt), augmente la viabilit 45,3 5,6% de faon significative (p < 0,01) par rapport au tmoin H2O2 seul, pour une concentration de 30mol/L, Son stroisomre, le resvratrol cis (Rc), 100mol/L, permet dobtenir une viabilit de 38,4 3,5%, significativement suprieure (p < 0,05) au tmoin H2O2 seul, Pour 500g/mL dEGCG, la viabilit cellulaire est significativement augmente (p < 0,001) 82,3 10,8% aprs un stress induit par H2O2, 115

En prsence de 500g/mL de procyanidine B2 (PB2), la viabilit des RINm5F est galement augmente de faon significative (p < 0,001) 50,5 3,2%. Parmi ces cinq antioxydants tests, les PP et lEGCG sont ceux qui prsentent la plus forte

prservation de la viabilit cellulaire aprs linduction dun stress par le peroxyde dhydrogne.
100

*** *** *** *

Viabilit cellulaire (%)

80 60 40
###

**

20 0 0mol/L H2O2 40mol/L H2O2 PP 150g/mL Rt 30mol/L Rc 100mol/L EGCG 500g/mL PB2 500g/mL

Figure 68 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 40mol/L de peroxyde d'hydrogne. ### : p < 0,001 ; Peroxyde dhydrogne versus tmoins sans traitement (0mol/L H 2O2), * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; Antioxydants versus peroxyde dhydrogne, t-test (n=3).

Des rsultats similaires sont obtenus pour un stress oxydant induit par la STZ pendant 2 heures. Comme dmontr prcdemment, en prsence de STZ 25mmol/L, la viabilit des RINm5F est significativement diminue 32,0 2,8% (p < 0,001) par rapport au tmoin sans traitement (100%) ; (cf. figure 69).
100

Viabilit cellulaire %)

80 60 40 20 0

** ***
###

**

0mmol/L STZ

25mmol/L STZ

PP 200g/mL

Rt10mol/L

Rc 30mol/L

EGCG 1000g/mL

PB2 500g/mL

Figure 69 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 25mmol/L de STZ, pendant 2 heures. ### : p < 0,001 ; Streptozotocine versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; Antioxydants versus streptozotocine, t-test (n=3).

Les rsultats montrent que : Les PP 200g/mL permettent de limiter la perte de viabilit cellulaire induite par la STZ. La viabilit obtenue est augmente significativement 50,6 0,9% (p < 0,001) par rapport au tmoin STZ seul (32,0 2,8%), 116

Le Rt, quand lui, ne permet pas de limiter la perte de viabilit des cellules, la viabilit tant de 34,8 1,6%,

En revanche son stroisomre, le Rc 30mol/L, limite de faon significative la perte de viabilit induite par la STZ, la viabilit obtenue tant de 54,7 10,3% (p < 0,01), LEGCG 1000g/mL augmente significativement la viabilit cellulaire 70,0 1,6% (p < 0,01), Enfin, la PB une concentration de 500g/mL nempche pas la perte de viabilit cellulaire induite par la STZ. La viabilit des RINm5F obtenue est de 31,0 5,7%. Daprs ces rsultats, lEGCG 1000g/mL, le resvratrol cis 30mol/L et les polyphnols

de vin rouge 200g/mL sont les molcules qui permettent de limiter la perte de viabilit induite par la STZ.

Dans le cas dun stress oxydant induit par un mlange de 0,5mmol/L HX et 10mU/mL de XO pendant une heure, la viabilit cellulaire est diminue 16,5 3,7% (p < 0,001) ; (cf. figure 70).
120

Viabilit cellulaire (%)

100 80 60 40
###

*** * ** *** **

20 0 0mmol/L HX + 0mU/mL XO 0,25mmol/L PP 150 g/mL HX + 10mU/mL XO Rt 10mol/L Rc 100mol/L EGCG 500/mL PB2 500g/mL

Figure 70 : Viabilit des RINm5F en % en prsence des molcules antioxydantes pr-incubes une heure avant l'induction d'un stress oxydant par 0,25mmol/L d'HX et 10mU/mL de XO, pendant une heure. ### : p < 0,001 ; Mlange HX/XO versus tmoin sans traitement, * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001 ; Antioxydants versus HX/XO, t-test (n=3).

La viabilit des RINm5F est significativement augmente en prsence des cinq antioxydants : Les PP, 150g/mL, permettent de limiter la perte de viabilit cellulaire. La viabilit est significativement augmente 34,5 3,9% (p < 0,01) par rapport au tmoin HX/XO seul. Le Rt 10mol/L, limite galement la perte de viabilit des RINm5F, car la viabilit obtenue est de 39,0 2,9% (p < 0,001), Une pr-incubation par 100mol/L de Rc permet daugmenter la viabilit cellulaire 50,2 12,5% (p < 0,05), 117

LEGCG 500g/mL permet dobtenir une viabilit cellulaire de 88,5 15,0% (p < 0,001) aprs induction du stress, La PB2 500g/L quand elle, augmente significativement la viabilit des cellules RINm5F 32,4 4,8% (p < 0,01) aprs linduction du stress. Daprs les rsultats obtenus, les cinq antioxydants permettent de limiter la perte de viabilit

des cellules RINm5F due un stress induit par 0,5mmol/L dHX et 10mU/mL de XO. Celui qui a la plus grande efficacit sur ce stress est lEGCG 500g/mL, suivi du Rc 100mol/L, de son strisomre 10mol/L, des PP 150g/mL et enfin de la procyanidine B2 500g/mL.

Dans les trois modles de stress oxydant mis en place, les deux antioxydants qui permettent de limiter la perte de viabilit due ces stress sont les polyphnols de vin rouge et lpigallocatchine gallate. Ces deux molcules sont donc choisies pour la suite de ltude.

D. Etude de lapoptose par lannexine-V Les rsultats obtenus par la mesure de viabilit, ont t approfondis par mesure de lapoptose via lannexineV-PE. Les rsultats obtenus montrent que le tmoin positif dapoptose, le cinnamaldhyde oxyd, induit une augmentation significative de lapoptose (99,5 0,7% ; p < 0,001) par rapport aux cellules non traites (1,5 0,0%) ; (cf. figure 71).
120 100

***

Cellules en apoptose (%)

80 60 40 20 0 Basal Basal * Cinamaldhyde oxyd 0,25mol/L* H2O2 50mol/L * H2O2 100mol/L *

Figure 71 : Quantification de lapoptose des cellules RINm5F en % en prsence de peroxyde dhydrogne pendant une heure et de cinnamaldhyde oxyd pendant 24 heures. Les toiles reprsentent les cellules ayant reu les fluorophores. *** : p < 0,001 ; basal versus cinnamaldhyde, t-test (n=3).

En revanche, lorsque les cellules sont traites par du peroxyde dhydrogne 50 ou 100mol/L pendant 0 minutes, on nobtient pas de variation significative du pourcentage de cellules en apoptose. En effet, 50mol/L, le nombre de cellules apoptotiques nest que de 6,5 ,8%, et 100mol/L, il nest que de , 0,3%. 118

E. Etude de lapoptose par les caspases 8 et 9 Compte tenu des rsultats obtenus sur la mesure de lapoptose induite par le peroxyde dhydrogne, et la vue du temps dincubation (30 minutes), une autre technique de cytomtrie a t utilise. En effet, pour mesurer plus prcocement lapoptose, une dtection de lactivation des caspases 8 et 9 a t ralise. Les rsultats montrent que le cinnamaldhyde oxyd (tmoin positif dapoptose), induit lactivation des deux caspases hauteur de 70,5% compar aux cellules sans traitement o seul 0,5% des cellules ont activ les deux caspases (cf. figure 72). Lorsque que les RINm5F sont traites pendant 0 minutes avec du peroxyde dhydrogne 25 et 50mol/L, le nombre de cellules apoptotiques ayant activ les caspases 8 et 9, sont respectivement de 6 et 10,9%.
70 60

Cellules en apoptose (%)

50 40 30 20 10 0 Basal * Cinamaldhyde oxyd 0,25mol/L* H2O2 25mol/L * H2O2 50mol/L *

Figure 72 : Quantification de l'apoptose en % par l'activation des caspase 8 et 9 de cellules RINm5F soumises des concentrations de peroxyde d'hydrogne pendant 30 minutes. Les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules apoptotiques ayant activ les caspases 8 et 9, par rapport au nombre total de cellules dtectes (n=2).

Le peroxyde dhydrogne activant les caspases 8 et 9, les antioxydants PP et EGCG ont t tests sur les cellules RINm5F (cf. figure 73). Les rsultats obtenus montrent que les PP seuls et lEGCG activent de faon trs limite les caspases 8 et 9 (,11 et 0,7%) par rapport aux cellules nayant pas subies de traitement (0,5%). Lorsque les PP et lEGCG sont pr-incubes pendant une heure avant linduction du stress, ils permettent de diminuer le nombre de cellules ayant activ les caspases 8 et 9 (0,9 et 1,5%) par rapport aux cellules soumises au peroxyde dhydrogne (10,9%).

119

12 10

Cellules en apoptose (%)

8 6 4 2 0 Basal * H2O2 50mol/L * PP 150g/mL* PP 150g/mL + EGCG 500g/mL * EGCG 500g/mL H2O2 50mol/L * + H2O2 50mol/L *

Figure 73 : Quantification de l'apoptose en % par l'activation des caspase 8 et 9 de cellules RINm5F soumises un stress par le peroxyde d'hydrogne, en prsence ou non dantioxydants pr-incubs pendant une heure. Les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules apoptotiques ayant activ les caspases 8 et 9, par rapport au nombre total de cellules dtectes (n=1).

Ces rsultats, bien que prliminaires, semblent confirmer que lapoptose joue un rle primordial dans la perte de viabilit des cellules suite un stress oxydant et leffet prventif des antioxydants. Cependant, compte tenu du nombre dexpriences, ils doivent tre confirms.

F. tude de lexpression des gnes du stress oxydant Ltude de lexpression des gnes du stress oxydant et des dfenses antioxydantes est prsente figure 74. Pour cette tude, trois conditions exprimentales ont t testes afin de cibler spcifiquement des gnes dintrt dont lexpression protique sera tudie dans une partie ultrieure. Les trois conditions testes sont : un groupe tmoin de cellules RINm5F sans traitement, un groupe de cellules soumises un stress induit par un mlange de 0,5mmol/L dHX avec 10mU/mL de XO et un dernier groupe constitu de cellules pr-incubes avec 150g/mL de PP et ayant subi un stress par lHX/XO. Les rsultats de la figure 74 montrent que la catalase (Cat) et la glutathion rductase (Gsr) sont surexprimes dans le groupe 1 (0,5mmol/L dHX avec 10mU/mL de XO pendant 1 heure) par rapport au groupe tmoin (groupe sans traitement), tandis que les enzymes superoxydes dismutase Sod1 et Sod2 sont sous-exprimes dans ce mme groupe par rapport au groupe tmoin.

120

Figure 74 : Clustergramme de l'expression des gnes du stress oxydant. Le groupe tmoin (Control group) correspond aux cellules sans traitement, le groupe 1 (group 1) aux cellules traites par 0,5mmol/L dHX avec 10mU/mL de XO pendant 1 heure, et le groupe 2 (group 2) correspond aux cellules princubes avec 150g/mL de PP suivis dun stress induit par lHX/XO. En se rfrant au groupe tmoin, les gnes apparaissant en rouge sont surexprims au contraire de ceux qui apparaissent en vert, qui eux sont sous-exprims.

Le dtail des gnes dintrt est prsent sur la figure 75. Pour chaque gne, un Ct ( Cycle Threshold ou cycle seuil) est dfini et permet de quantifier lADN. Ainsi, en comparant les Ct dun mme gne dans des conditions exprimentales diffrentes, un gne pourra tre sur- ou sousexprim. En prenant comme rfrence le groupe tmoin (sans traitement) et en considrant lexpression des gnes de ce groupe comme rfrents, lexpression des gnes est reprsente en nombre de fois augmente ou diminue dans le groupe 1 ou 2 : Lexpression de la catalase Cat est augmente de prs de 11, fois en condition de stress induit par HX/XO, alors quelle est diminue 0,6 fois en prsence de PP, par rapport au niveau tmoin. Lorsque les PP sont pr-incubs une heure avant linduction du stress, lexpression de cette enzyme est diminue de 4 fois par rapport la condition de stress induit par HX-XO.

121

Celle de la glutathion rductase Gsr, est augmente de 11,14 fois et lorsque les cellules sont pr-incubes avec des PP, lexpression de ce gne est diminue ,19 fois. Une diminution de 5 fois de lexpression de la Gsr est donc observe par rapport la condition de stress induit par lHX-XO.

En revanche, lexpression de lenzyme Sod1 (superoxyde dismutase soluble) est quasiment nulle (0,0007) en condition de stress tandis quavec une pr-incubation des PP suivie du stress, elle est augmente pour atteindre le niveau tmoin (1,16 fois). Entre ces deux groupes, lexpression de Sod1 est augmente de 1657 fois.

Dans le cas de Sod2 (superoxyde dismutase Mn mitochondriale), en condition de stress, son expression est fortement diminue (0,0049), voire quasiment nulle alors quen prsence de PP, son expression est lgrement augmente (0,14 fois). Laugmentation entre ces deux groupes est de 28 fois environ.

Enfin, pour la superoxyde dismutase Sod3 (enzyme extracellulaire), en prsence dHX/XO, son expression est diminue de 0,5 fois tandis quen pr-incubant les cellules avec des PP, son expression passe 1,06 fois. Lexpression de cette enzyme est donc augmente de 2 fois environ.
Groupe Tmoin Groupe 1 (HX/XO) Groupe 2 (PP + HX/XO)

Figure 75 : Expression diffrentielle des gnes entre les groupes tmoin et soumis un stress oxydant par H 2O2. Le groupe tmoin (Control group) correspond aux cellules sans traitement, le groupe 1 (group 1) aux cellules traites par 0,5mmol/L dHX avec 10mU/mL de XO pendant 1 heure, et le groupe (group ) correspond aux cellules pr-incubes avec 150g/mL de PP suivis dun stress induit par lHX/XO. Le groupe tmoin sans traitement est le groupe rfrent, le taux dexpression de ces gnes est de 1.

122

Cette tude na pour objectif que de cibler les modulations dexpression de gnes dintrt. Compte tenu des rsultats obtenus pour les gnes cits ci-dessus, ltude de lexpression de la catalase est dun rel intrt au vu des modulations de son expression en fonction des conditions exprimentales. De plus, une autre enzyme antioxydante, la Sod est galement intressante. Dune part, son expression gnique est augmente en prsence de PP et dHX/XO par rapport la condition HX/XO seule et dautre part, son expression est mitochondriale ; elle est susceptible de jouer un rle au niveau de la production des ROS par la chane respiratoire de la mitochondrie. Des rsultats similaires de modulation dexpression de ces deux enzymes ont t obtenus pour un stress induit par du peroxyde dhydrogne ; cependant, dans un souci de clart, ces rsultats ne seront pas prsents. G. tude de lexpression des enzymes antioxydantes : catalase et superoxyde dismutase Suite aux rsultats obtenus par PCR arrays, le choix de ltude de lexpression de protines impliques dans le stress oxydant sest port sur les enzymes antioxydantes catalase et superoxyde dismutase Mn mitochondriale. Lexpression de ces deux protines dintrt est normalise par rapport lexpression de la protine -actine et les rsultats sont exprims en pourcentage dexpression par rapport au tmoin sans traitement (100% dexpression). Dans le cas dun stress induit par 40mol/L de peroxyde dhydrogne, lexpression de la catalase est significativement diminue 80,4 5,7% (p < 0,01) par rapport au tmoin sans traitement (100%), (cf. figure 76).
Expression enzymes / -actine (%)
150
Catalase Superoyide dismutase

125 100 75 50 25 0 40mol/L H2O2 PP 150g/mL + 40mol/L H2O2 EGCG 500g/ml + 40mol/L H2O2

##

**

Figure 76 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la -actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par 40mol/L dH 2O2 et en prsence ou non dantioxydants. ## : p < 0,01 ; Peroxyde dhydrogne versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; Antioxydants + peroxyde dhydrogne versus peroxyde dhydrogne, t-test (n=3).

En revanche, lexpression de la SOD dans cette mme condition nest pas modifie par rapport au tmoin sans traitement (98,8 10,5%). En pr-incubant les PP 150g/mL pendant une heure puis en induisant le stress par 40mol/L dH2O2, lexpression de la CAT semble augmenter 123

(96,7 9,4%) par rapport au tmoin positif H2O2 40mol/L, mais cette variation nest pas significative. Lexpression de la SOD, quand elle, est significativement diminue (53,8 16,1% ; p < 0,01) par rapport au tmoin positif. Au contraire des PP, lorsque lEGCG est pr-incube une heure 500g/mL et que le stress est induit, lexpression de la CAT semble diminuer (61,8 15,%) par rapport au tmoin positif tandis que celle de la SOD nest pas modifie (108,7 15,6%). Lorsque le stress est induit par la STZ 5mmol/L pendant deux heures, lexpression de la CAT est significativement augmente 119,0 11,8% (p < 0,05) tandis que celle de la SOD est significativement diminue 82,1 7,7% (p < 0,01) par rapport au tmoin sans traitement (100% dexpression), (cf. figure 77). Une pr-incubation de PP pendant une heure, avant linduction du stress par la STZ, ne permet pas de moduler lexpression des deux enzymes (CAT : 123,2 7,9% ; SOD : 89,5 8,0%) par rapport au tmoin positif STZ 25mmol/L. En revanche, une pr-incubation de lEGCG augmente lexpression des deux enzymes par rapport au tmoin positif : la CAT est augmente 204,2 52,3% (p < 0,05) et la SOD 158,2 26,5% (p < 0,001).
Expression enzymes / -actine (%)
300
Catalase Superoxyde dismutase

250 200 150 100 50 0 STZ 25mmol/L PP 200g/mL + STZ 25mmol/L

* ***

# ##

EGCG 1000g/mL + STZ 25mmol/L

Figure 77 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la -actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par 25mmol/L de STZ et en prsence ou non d'antioxydants. # : p < 0,05 ; ## : p < 0,01 ; Streptozotocine versus tmoin sans traitement, * : p < 0,05 ; *** : p < 0,001 ; Antioxydants + streptozotocine versus streptozotocine, t-test (n=3).

Lors dun stress induit par 0,5mmol/L dHX et 10mU/mL de XO, lexpression de la CAT est fortement augmente 150,9 15,0% (p < 0,001) par rapport au tmoin sans traitement, contrairement lexpression de la SOD qui nest pas modifie (94, 9,%). Lorsque les PP sont pr-incubs avant le stress, lexpression des deux enzymes nest pas significativement modifie par rapport au tmoin positif HX/XO (CAT : 129,7 24,3% et SOD : 133,0 20,5%). En revanche, lorsque lEGCG est pr-incube une heure avant linduction du stress, lexpression de la CAT semble augmente (176,5 7,0%). Lexpression de la SOD est galement augmente de faon significative 191,7 19,4% (p < 0,01), par rapport au tmoin positif (cf. figure 78). 124

Expression enzymes / -actine (%)

250 Catalase 200 Superoxyde dismutase

**

###
150 100 50 0 0.25mM HX - 10mU/mL XO PP 200g/mL + 0.25mM HX 10mU/mL XO EGCG 500g/ml + 0.25mM HX 10mU/mL XO

Figure 78 : Expression des enzymes antioxydantes CAT et SOD en % rapporte celle de la -actine, dans les cellules RINm5F en prsence d'un stress induit par un couple HX/XO et en prsence ou non d'antioxydants. ### : p < 0,001 ; Mlange HX/XO versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; Antioxydants + HX/XO versus HX/XO, t-test (n=3).

H. Quantification de la production intracellulaire dH2O2 La mesure de la production intracellulaire dH2O2 a t ralise par la sonde DCFH-DA. La mthode utilise consiste crer un stress sur les cellules RINm5F puis dintroduire la sonde afin de quantifier lH2O2 intracellulaire produit en rponse au stress. Une augmentation significative de la production dH2O2 intracellulaire est observe en prsence de 40mol/L de peroxyde dhydrogne (11,1 ,7% ; p < 0,05) par rapport au tmoin sans traitement o 4,0 1,9% des cellules sont marques au DCF (cf. figure 79). *
#

**

Figure 79 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence d'H2O2 40mol/L pendant 30 minutes, et/ou d'antioxydants pendant une heure. # : p < 0,05 ; Peroxyde dhydrogne versus tmoin sans traitement (basal), * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; Antioxydants + peroxyde dhydrogne versus peroxyde dhydrogne, t-test (n=3).

Les polyphnols 150g/mL ou lEGCG 500g/mL incubs seuls ninduisent pas de modification de la production intracellulaire dH2O2 (2,4 1,3% et 3,3 0,7%) par rapport au tmoin sans traitement. En revanche, lorsque les PP sont pr-incubs avant linduction du stress, 125

une augmentation significative de la production intracellulaire dH2O2 est observe (19,2 3,3% ; p < 0,05) par rapport au tmoin positif, tandis que la pr-incubation de 500g /mL dEGCG avant linduction du stress permet de diminuer de faon significative la production dH2O2 intracellulaire (3,1 0,1% ; p < 0,01). Lorsque les cellules sont traites par 5mmol/L de STZ, la quantit dH2O2 intracellulaire produite est significativement augmente 9,0 0,4% (p < 0,05) par rapport au tmoin sans traitement (7,6 0,5%) ; (cf. figure 80).
30

##
Cellules marques au DCF (%)
25

20

15

10

# ###

**

Basal

STZ 25mmol/L

PP 200g/mL

PP 200g/mL + STZ

EGCG 1000g/ml

EGCG 1000g/ml + STZ

Figure 80 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence de STZ 25mmol/L pendant 2 heures, et/ou d'antioxydants pendant une heure. # : p < 0,05 ; ## : p < 0,01 ; ### : p < 0,001 ; Streptozotocine ou antioxydants seuls versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; Antioxydants + streptozotocine versus streptozotocine, t-test (n=3).

Une pr-incubation des PP seuls 200g/mL sur les cellules induit une augmentation significative de la production intracellulaire dH2O2 (21,8 4,7% ; p < 0,01) par rapport au tmoin sans traitement, contrairement lEGCG o une diminution de la quantit de peroxyde dhydrogne intracellulaire est observe (3,3 0,7% ; p < 0,001). En revanche, lorsque 200g/mL de PP sont pr-incubs avant linduction du stress, il ny a pas de modification de la production de peroxyde dhydrogne intracellulaire (10,8 ,4%) par rapport au tmoin positif de stress (STZ 5mmol/L), tandis que la pr-incubation de 1000g /mL dEGCG avant linduction du stress permet de diminuer de faon significative la production dH2O2 intracellulaire (4,4 1,4% ; p < 0,01). En prsence dun mlange de 0,5mmol/L dHX et de 10mU/mL de XO, la quantit dH2O2 intracellulaire est fortement augmente 58,5 30,9% (p < 0,05) par rapport au tmoin sans traitement (6,9 1,9%) ; (cf. figure 81). Une incubation des cellules en prsence de 150g/mL de PP ou de 500g/mL dEGCG seuls ne modifie pas la quantit dH2O2 produite avec des taux respectifs de 9,7 3,4% et de 9,8 6,0%, par rapport au tmoin sans traitement. Dans ce modle de 126

stress cellulaire induit par un mlange HX/XO, la pr-incubation de 150g/mL de PP ou de 500g/mL dEGCG a modifi la production intracellulaire dH2O2. En effet, les PP permettent de diminuer de faon significative la production de peroxyde dhydrogne 17,2 8,2% (p < 0,01) par rapport au tmoin positif. De mme, lEGCG permet de diminuer cette quantit dH2O2 intracellulaire 19,3 12,9% (p < 0,05).
Cellules marques au DCF (%)
100 80 60 40 20 0 Basal 0,25mM HX 10mU/mL XO PP 150g/mL PP 150g/mL + EGCG 500g/ml EGCG 500g/ml HX-XO + HX-XO

* **

Figure 81 : Quantification de la production d'H2O2 intracellulaire par analyse du pourcentage de cellules marques la DCF, en prsence d'HX/XO pendant une heure, et/ou d'antioxydants pr-incubs une heure. # : p < 0,05 ; Mlange HX/XO versus tmoin sans traitement, * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; Antioxydants + HX/XO versus HX/XO, t-test (n=3).

I.

Consquence du stress oxydant 1. Sur la quantit de lipides peroxyds

Les dgts cellulaires provoqus par le stress oxydant sur les macro-molcules biologiques ont t quantifis au travers de la mesure des lipides oxyds. Lors dun stress induit par 40mol/L en peroxyde dhydrogne, la quantit de lipides peroxyds est significativement augmente 1,7 0,2mol/L (p < 0,001) par rapport au tmoin sans traitement (0,3 0,1mol/L) ; (cf. figure 82).
2

###

Concentration en MDA (mol/L)

1,5

***
0,5

***

0 Basal H2O2 40mol/L PP 150g/mL PP 150g/mL + H2O2 EGCG 500g/mL EGCG 500g/mL + H2O2

Figure 82 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur des cellules RINm5F en prsence d'H 2O2 40mol/L et/ou d'antioxydants. # : p < 0,05 ; ### : p < 0,001 ; Peroxyde dhydrogne ou antioxydants seuls versus tmoin sans traitement (basal), *** : p < 0,001 ; Antioxydants + peroxyde dhydrogne versus peroxyde dhydrogne, t-test (n=3).

127

Les polyphnols seuls, 150g/mL, incubs une heure sur les cellules, augmentent galement significativement la peroxydation lipidique 0,7 0,3mol/L (p < 0,05) par rapport au tmoin. En revanche, en prsence dEGCG seule (500g/mL), le taux de peroxydation lipidique nest pas modifi (0,2 0,1mol/L) par rapport au tmoin sans traitement. Par contre, une pr-incubation de 150g/mL de PP avant linduction du stress, permet de rduire significativement la quantit de lipides peroxyds 0,5 0,mol/L (p < 0,001) par rapport au tmoin positif 40mol/L dH2O2. Des rsultats similaires ont t obtenus en prsence de 500g/mL dEGCG o le taux de lipides peroxyds est de 0,4 0,3mol/L (p < 0,001). En prsence de 25mmol/L de STZ, la quantit de lipides peroxyds est significativement augmente 1,6 0,3mol/L (p < 0,01) par rapport au tmoin sans traitement (0,5 0,2mol/L) ; (cf. figure 83). La prsence dantioxydants seuls (200g /mL de PP ou 1000g/mL dEGCG) ne modifie pas significativement la quantit de lipides peroxyds par rapport au tmoin ngatif. De plus, une pr-incubation des cellules avec les PP avant linduction du stress ne change pas le taux de MDA (1,9 0,4mol/L) par rapport au tmoin STZ. En revanche, en prsence de 1000g/mL dEGCG pr-incubs sparment avant linduction du stress, la quantit de lipides peroxyds
Concentration en MDA (mol/L)

augmente significativement (p < 0,01) 2,7 0,3mol/L par rapport au tmoin STZ seul. ** 3
2

##

0 Basal STZ 25mM PP 200g/mL PP 200g/mL + STZ EGCG 1000 g/mL EGCG 1000g/mL + STZ

Figure 83 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur des cellules RINm5F en prsence de STZ 25mmol/L pendant deux heures, et/ou d'antioxydants pendant une heure. ## : p < 0,01 ; Streptozotocine versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; Antioxydants + streptozotocine versus streptozotocine, t-test (n=3).

Enfin, lors dun stress induit par 0,5mmol/L dHX et 10mU/mL de XO, la quantit de lipides peroxyds obtenue est significativement augmente 1,2 0,4mol/L (p < 0,01) par rapport au tmoin sans traitement o le taux de lipides est de 0,5 0,2mol/L (cf. figure 84). La prsence seule de PP 150g/mL ou dEGCG 500g/mL ne semble pas avoir deffet sur la peroxydation lipidique car les taux sont respectivement de 0,47 0,02mol/L et de 0,4 0,2mol/L. La princubation des PP une heure avant linduction du stress ne modifie pas la quantit de lipides oxyds

128

(1,1 0,4mol/L) par rapport au tmoin positif (HX/XO), contrairement lEGCG 500g/mL, o le taux de lipides oxyds est significativement diminu 0,4 0,1mol/L (p < 0,01).
Concentration en MDA (mol/L)
2

1 ,5

##

0,5

**

Basal

Hx-Xo

PP 1 50g/mL

PP 1 50g/mL + Hx-Xo

EGCG 500g/mL

Figure 84 : Peroxydation lipidique par mesure du MDA en mol/L sur les cellules RINm5F en prsence de 0,25mmol/L d'HX et de 10mU/mL de XO pendant une heure, et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. ## : p < 0,01 ; Mlange HX/XO versus tmoin sans traitement, ** : p < 0,01 ; Antioxydants + HX/XO versus HX/XO, t-test (n=3).

EGCG 500g/mL +HxXo

2.

tude de la carbonylation des protines

Le stress oxydant provoque galement des dgts au niveau des protines par des phnomnes doxydation. La mesure des protines carbonyles sous leffet dun stress rend compte de ltat cellulaire des protines. Aprs avoir induit un stress par 40mol/L dH2O2 pendant 30 minutes, aucune augmentation significative de la quantit de protines carbonyles est observe (1,29 0,55nmol/mg de protines totales versus 0,80 0,57nmol/mg de protines totales du tmoin sans traitement) ; (cf. figure 85). Les PP seuls 150g/mL naugmentent pas le taux de protines carbonyles (0,6 0,4nmol/mg) et lEGCG ninduit pas galement daugmentation (1,46 0,80nmol/mg) significative de ce taux par rapport au tmoin sans traitement (basal). Lorsque les antioxydants sont pr-incubs une heure avant linduction du stress par H2O2, le taux de protines carbonyles semble augment (PP : 2,18 0,93nmol/mg ; EGCG : 2,68 1,17nmol/mg) par rapport la condition de stress seule (1,29 0,55 nmol/mg) mais les diffrences ne sont pas statistiquement significatives.
Protines carbonyles (nmol/mg)
4 3 2 1 0 Basal H2O2 40mol/L PP 150g/mL PP 150g/mL + H2O2 EGCG 500g/mL EGCG 500g/mL + H2O2

Figure 85 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence d'H 2O2 40mol/L pendant 30 minutes et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. NS, t-test (n=3).

129

Dans le cas dun stress induit par 5mmol/L de STZ, aucune augmentation du taux de protines carbonyles nest observe en prsence de STZ 5mmol/L pendant deux heures (0,5 0,08 nmol/mg de protines) par rapport au tmoin sans traitement (0,36 0,22nmol/mg) ; (cf. figure 86). La prsence seule des PP 200g/mL induit une augmentation significative (p < 0,05) de la quantit de protines carbonyles cellulaires (3,57 1,85nmol/mg) par rapport au tmoin contrairement lEGCG 1000g/mL o laugmentation observe (0,90 0,41nmol/mg) nest pas significative. Enfin, lorsque les PP sont pr-incubs une heure avant dinduire le stress par la STZ, aucune augmentation du taux de protines carbonyles nest observe (0,55 0,25nmol/mg) par rapport au tmoin positif STZ (0,5 0,08nmol/mg). En revanche, lEGCG pr-incube associe au stress par la STZ induisent une augmentation significative (p < 0,05) du taux de protines carbonyles (1,36 0,30nmol/mg) par rapport au tmoin positif STZ.
Protines carbonyles (nmol/mg)
6 5 4 3 2 1 0 B asal STZ 25mmo l/L P P 200g/mL P P 200g/mL + STZ EGCG 1 000g/mL EGCG 1 000g/mL + STZ

Figure 86 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence de 25mmol/L de STZ pendant 2 heures et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. # : p < 0,05 ; Antioxydants seuls versus tmoin sans traitement (basal), * : p < 0,05 ; Antioxydants + STZ versus STZ, t-test (n=3).

Lorsque le stress est induit par 0,5mmol/L dHX et 10mU/mL de XO, aucune augmentation de la quantit de protines carbonyles nest observe (0,7 0,05nmol/mg) par rapport au tmoin sans traitement (basal) o le taux est de 0,22 0,19nmol/mg de protines totales (cf. figure 87). En revanche, lajout des antioxydants seuls augmente la carbonylation des protines pour les PP 150g/mL (0,58 0,41nmol/L) et pour lEGCG 500g/mL (, 0,4nmol/mg) de faon significative (p < 0,001) par rapport au tmoin (0,22 0,19nmol/mg). Enfin, la pr-incubation dune heure des antioxydants avant linduction du stress par le couple HX-XO, induit une augmentation de la quantit de protines carbonyles de faon significative (p < 0,05) pour les deux molcules (PP : 0,97 0,42nmol/mg et EGCG : 3,27 1,23nmol/mg) par rapport au tmoin positif HX-XO (0,27 0,05nmol/mg).

130

*
###

Protines carbonyles (nmol/mg)

4 3 2 1 0 Basal PP 150g/mL PP 150g/mL HX + HX-XO 0,25mmol/L + XO 10mU/mL EGCG 500g/mL EGCG 500g/mL + HX-XO

Figure 87 : Protines carbonyles en nmol/mg de protines totales dans les cellules RINm5F en prsence de 0,25mmol/L dHX associs 10mU/mL pendant 1 heure et/ou d'antioxydants pr-incubs pendant 1 heure. ### : p < 0,001 ; Antioxydants seuls versus tmoin sans traitement (basal), * : p < 0,05 ; Antioxydants + HX-XO versus HX-XO, t-test (n=3).

II. tude in vivo de leffet des antioxydants sur un modle de rats intolrants au glucose
A. Mise au point du modle de diabte de type 2 1. Effet des rgimes normocalorique ou hypercalorique sur la glycmie

La glycmie des animaux a t mesure sur 7 mois dtude. Les rsultats montrent que les rats nourris avec lalimentation ND prsentent une glycmie de dpart de 0,76 0,05g/L et que celle-ci augmente de faon significative (p < 0,001) au cours de ltude (cf. figure 88), avec des valeurs de 1,32 0,13g/L ; 1,19 0,24g/L et 1,47 0,16g/L respectivement pour 2, 4 et 7 mois de rgime alimentaire.
2

Glycmie (g/L)

1,5
1

***

***

***

0,5
0 0 2 mois 4 mois 7 mois

Figure 88 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par l'alimentation normocalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. *** : p < 0,001 ; glycmie 2, 4 et 7 mois versus glycmie 0 mois, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=10 0 mois, 10 2 mois, 4 4 mois et 4 7 mois de rgime)

131

Lorsque les animaux sont nourris par une alimentation hypercalorique HFD, au cours de ltude, une augmentation significative de la glycmie est observe (cf. figure 89). * ***
2

*** ***

***

Glycmie (g/L)

1,5 1 0,5 0 0

2 mois

4 mois

7 mois

Figure 89 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par l'alimentation hypercalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. *** : p < 0,001 ; glycmie 2, 4 et 7 mois versus glycmie 0 mois, One Way ANOVA, Student-Newman-Keuls Method post test (n=6 0 mois, 6 2 mois, 5 4 mois et 3 7 mois de rgime).

En effet, la glycmie observe deux mois est augmente 1,39 0,23g/L (p < 0,001) par rapport la glycmie du dbut de ltude (0 mois) qui est de 0,8 0,05g/L. A 4 et 7 mois de rgime HFD, elles sont galement augmentes de faon significative (p < 0,001) respectivement 1,86 0,11g/L et 1,6 0,17g/L, par rapport au taux de glucose du dbut de ltude. De plus, les valeurs de glycmie sont significatives entre elles 2 et 4 mois (p < 0,001) et 2 et 7 mois (p < 0,05).

Lorsque les glycmies plasmatiques des animaux nourris par les alimentations ND et HFD sont compares (cf. figure 90), une augmentation significative (p < 0,05) de la glycmie des rats HFD (0,83 0,05g/L) est observe par rapport aux animaux ND (0,76 0,05g/L), au dbut de ltude (0 mois).
2,5 2

**

Glycmie (g/L)

1,5

#
1
0,5 0

2 mois
ND HFD

4 mois

7 mois

Figure 90 : Glycmie plasmatique en g/L des rats nourris par les alimentations normocalorique ou hypercalorique pendant 0, 2, 4 et 7 mois. # : p < 0,05 ; ND versus HFD 0 mois, t-test (n=10 et 6). ** : p < 0,01 ; ND versus HFD 4 mois, t-test (n=4 et 5).

132

Cette diffrence de glycmie entre animaux ND et HFD nest pas retrouve et 7 mois. Cependant, 4 mois, les rats HFD prsentent une glycmie significativement augmente 1,86 0,11g/L par rapport au animaux ND (1,29 0,24g/L).

2.

Effet des deux rgimes sur la C-peptidmie

La C-peptidmie a t mesure chez les animaux nourris par les rgimes ND ou HFD, aprs 2 et 7 mois de rgime, jeun ou aprs 30 minutes dune ralimentation (post prandiale 30 minutes). Les rsultats de la mesure du C-peptide montrent, quaprs deux mois de rgime, aucune diffrence significative nest observe entre la C-peptidmie jeun (969,96 297,33pmol/L) et celle post-prandiale (1278,67 258,19pmol/L) chez les animaux ND (cf. figure 91). En revanche, chez les animaux nourris par lalimentation HFD, la C-peptidmie post-prandiale est significativement augmente (2855,30 835,31pmol/L ; p < 0,01) par rapport celle jeun (1823,38 641,20pmol/L). De plus, le taux de C-peptide jeun est significativement augment (p < 0,01) chez les animaux HFD (1823,38 641,20pmol/L) par rapport aux animaux ND (969,96 297,33pmol/L). Il est galement augment de faon significative (p < 0,001) aprs une ralimentation de 30 minutes (post-prandiale) chez les animaux HFD (2855,30 835,31pmol/L) par rapport aux animaux ND (1278,67 258,19pmol/L).
##
Concentration Cpeptide (pmol/L)
4000

*** **

3000

2000

A jen Post prandial

1000

0 ND HFD

Figure 91 : Mesure du taux de C-peptide plasmatique chez des animaux ND et HFD aprs deux mois de rgimes, en condition jeun et post-prandiale 30 minutes.

** : p < 0,01 ; C-peptidmie jeun ND (n=6) versus C-peptidmie jeun HFD (n=10), t-test. *** : p < 0,001 ; C-peptidmie post-prandiale ND (n=6) versus C-peptidmie post-prandiale HFD (n=10), t-test. ## : p < 0,01 ; C-peptidmie jeun HFD versus C-peptidmie post-prandiale HFD, t-test (n=10).

133

Aprs sept mois de rgime alimentaire ND ou HFD, aucune diffrence nest observe entre les C-peptidmies jeun (1121,67 337,26pmol/L) et post prandiale (1911,67 667,22pmol/L) chez les rats ND, ainsi que chez les rats HFD ( jeun : 3100,5 1043,04pmol/L ; post-prandial : 3474,25 1073,05pmol/L) ; (cf. figure 92).
5000

Concentration Cpeptide (pmol/L)

4000

3000

A jeun
2000

Post prandial

1000

0 ND HFD

Figure 92 : Mesure du taux de C-peptide plasmatique chez des animaux aprs 7 mois de rgimes ND ou HFD, en condition jeun ou post-prandiale.

* : p < 0,05 ; C-peptidmie jeun ND (n=3) versus C-peptidmie jeun HFD (n=4), t-test. En revanche, le taux de C-peptide jeun est significativement augment (p < 0,05) chez les animaux HFD (3100,5 1043,04pmol/L) par rapport aux animaux ND (1121,67 337,26pmol/L), mais aucune augmentation significative nest observe au vu des cart-types obtenus, en condition post-prandiale entre les deux groupes danimaux (ND : 1911,67 667,22pmol/L ; HFD : 3474,25 1073,05pmol/L).

Chez les animaux HFD, lorsque les taux de C-peptide jeun et post-prandial sont compars et 7 mois, il en rsulte que laugmentation de C-peptidmie jeun observe 7 mois (3100,5 1043,04pmol/L) est significative (p < 0,05) par rapport celle observe 2 mois de rgime alimentaire (1823,38 641,20pmol/L). La C-peptidmie post prandiale des animaux HFD 7 mois (474,5 107,05pmol/L) nest pas augmente de manire significative par rapport celle des animaux 2 mois de rgime (2855,30 835,31pmol/L).

3.

Effet des rgimes alimentaires sur la prise de masse des animaux

La prise de masse corporelle des rats a t mesure tous les mois, pendant sept mois, dans les deux groupes de rgimes alimentaires (ND ou HFD). Au dbut de ltude, les rats prsentent des masses similaires dans les deux groupes (ND : 296,33 12,34g et HFD : 299,20 17,56g) ; (cf. figure 93). 134

900

800

* * * *** *** **

**

700

Masse (g)

600

ND HFD

500

400

300

200 0 1 mois 2 mois 3 mois 4 mois 5 mois 6mois 7 mois

Figure 93 : Mesure de la masse des rats nourris par l'alimentation normocalorique ou hypercalorique, tout les mois, pendant 7 mois

* : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p <0,001 ; Masse des animaux ND versus HFD de 0 7 mois, t-test.
(De 0 4 mois, n=6 animaux ND et n=10 animaux HFD et de 5 7 mois, n=3 animaux ND et n=47 animaux HFD).

A partir dun mois de rgime ND ou HFD, la masse des rats HFD est significativement augmente (p < 0,01) 460,3 24,99g contre 424,67 15,44g pour les ND. Cette augmentation significative de masse chez le groupe HFD se maintient tout au long de ltude. A mois, la masse des rats HFD est augmente de faon significative (p < 0,001) 536,80 37,66g par rapport aux rats ND (459,33 19,9g). A la fin de ltude (7 mois), la masse des rats HFD est de 739,50 65,87g, masse significativement augmente (p < 0,01) par rapport aux rats ND du mme temps (582,33 12,01g). 4. Effet des traitements sur lhistologie du pancras a) Coloration Hmatoxyline / osine

Les coupes histologiques de pancras de rats, nourris par lalimentation normocalorique ou hypercalorique, ont t ralises aprs 2 et 7 mois de rgime alimentaire et colores lhmatoxyline / osine (cf. figure 94). Aprs deux mois de rgime ND, les rats prsentent des lots pancratiques pour la plupart de forme ovode et de taille moyenne (cf. figure 94 A). En revanche, les animaux nourris avec lalimentation HFD pendant le mme temps, prsentent galement des lots de forme arrondie mais de taille un peu plus importante (cf. figure 94 B). De plus, ceux-ci montrent des espaces blancs sans cellules. Lorsque les rats sont nourris sept mois par le rgime ND (cf. figure 94 C), les lots pancratiques adoptent galement une forme arrondie et prsentent des trous. Ces caractristiques 135

sont galement mises en vidence, sur les lots de rats nourris par alimentation HFD pendant sept mois (cf. figure 94 D). De plus, dans ce groupe danimaux, la taille des lots semble augmente. A B

Figure 94 : Photographies de coupes histologiques de pancras de rats aprs coloration HE. Les animaux ont t nourris avec le rgime normocalorique pendant deux mois (photos A) ou sept mois (photos C) ; ou avec le rgime hypercalorique pendant 2 mois (photos B) ou sept mois (photos D).

b)

Mesure de la taille des lots aprs coloration Hmatoxyline / osine

La mesure de la surface des lots pancratiques, aprs coloration HE des coupes, a t ralise avec le logiciel de capture dimage et a permis un classement arbitraire des lots dans trois catgories distinctes : Une taille infrieure 10 000m correspond des petits lots, Une taille comprise entre 10 000 et 30 000m, correspond des lots moyens, Une taille suprieure 30 000m correspond des gros lots.

Les rsultats obtenus montrent que des animaux nourris par alimentation ND pendant 2 mois, ont majoritairement des lots de taille moyenne (46,7 17,2%), puis de petite taille (37,7 22,9%). Les gros lots sont peu prsents chez ces animaux (15,6 5,7%) ; (cf. figure 95). Les animaux nourris par le rgime HFD prsentent des tailles dlots similaires au groupe ND. En effet, le nombre dlots

136

de petite taille est de 44,3 11,1%, celui concernant les lots de taille moyenne est de 46,3 11,4% et enfin, les gros lots reprsentent 9,4 6,9% des lots totaux.
Pourcentage d'lots pancratiques
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ND HFD

Taille > 30000 m 10000<Taille < 30000 m Taille < 10000 m

Figure 95 : Mesure de la taille des lots de Langerhans, aprs deux mois de rgime ND ou HFD. Les proportions de taille des lots ont t estimes sur un nombre total dlots observs sur une mme section de pancras et rapportes 100%. NS ; Petit, moyen et gros lots de rats ND (n=3) versus rats HFD (n=4), t-test.

Lorsque les rats sont soumis au rgime HFD pendant 7 mois, le nombre de gros lots du pancras augmente (39,9 8,1%) alors que celui des petits lots diminue (12,6 9,1%), par rapport aux rats nourris au rgime ND (gros : 28,7 8,1% ; petits : 29,9 17,5%). Cependant, ces variations ne sont pas significatives compte tenu des carts-types obtenus (cf. figure 96). Le nombre dlots de taille moyenne des rats ND (41,4 5,1%) est similaire celui des rats HFD (47,4 Taille des lots aprs 7 mois de rgime alimentaire ND ou HFD 15,5%).
100%

Pourcentage d'lots pancratiques

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

ND HFD

Taille > 30000 m 10000 < Taille < 30000 m Taille < 10000 m

Figure 96 : Mesure de la surface des lots de Langerhans, aprs sept mois de rgime ND ou HFD. Les proportions de surface des lots ont t estimes sur un nombre total dlots observs sur une mme section de pancras et rapportes 100%. NS ; Petit, moyen et gros lots de rats ND (n=3) versus rats HFD (n=3), t-test.

137

Lorsque la proportion de surface des lots de rats ND est compare aprs 2 et 7 mois de rgime aucune diffrence statistique nest obtenue dans chacun des groupes. En revanche, chez les animaux HFD, aprs 7 mois de rgime, est observe une diminution significative (p < 0,05) du nombre dlots infrieurs 10 000m (12,6 9,1%) par rapport aux rats 2 mois (44,3 11,1%). De plus, le nombre de gros lots est, quant lui, augment de faon significative (p < 0,01) chez les animaux HFD aprs 7 mois dalimentation (39,9 8,1%) par rapport aux rats soumis au rgime seulement pendant 2 mois (9,4 6,9%). Les carts-types des graphiques nont pas t reprsents par soucis de clart.

c)

Coloration au trichrome de Masson

Les coupes histologiques de pancras de rats, quils soient nourris par lalimentation normocalorique ou hypercalorique pendant 2 et 7 mois ont galement t colores au trichrome de Masson (cf. figure 97). A B

Figure 97 : Photographies de coupes histologiques de pancras de rats aprs coloration au trichrome de Masson. Les animaux ont t nourris avec le rgime normocalorique pendant deux mois (photos A) ou sept mois (photos C) ; ou avec le rgime hypercalorique pendant 2 mois (photos B) ou sept mois (photos D).

Aprs deux mois de rgime ND, les lots pancratiques des rats ont une forme ovode et sont de taille moyenne (cf. figure 97 A). Les animaux HFD aliments pendant le mme temps, quant 138

eux, prsentent galement des lots de forme arrondie mais de taille plus importante (cf. figure 97 B). Lorsque les rats sont soumis un rgime ND pendant 7 mois (cf. figure 97 C), les lots adoptent une forme arrondie et prsentent aussi des trous. Ces caractristiques sont galement retrouves sur les lots de rats ayant reu lalimentation HFD pendant cette mme dure (cf. figure 97 D). De plus, que ce soit aprs 2 ou 7 mois de rgime alimentaire HFD (cf. figure 97 B et D), les lots semblent prsenter une augmentation de taille par rapport aux lots des rats nourris par le rgime ND (cf. figure 97 A et C). 5. Effet des traitements sur lhistologie du foie

Ltude histologique du foie a t ralise par les colorations HE et trichrome de Masson qui permettent dans ce cas prsent dvaluer respectivement la statose hpatique et lapparition de phnomne de fibrose. Le degr de statose est valu par le systme de score dcrit dans le chapitre II. B. 6. C de la partie matriels et mthodes (Mthode de Kleiner et al.). a) Coloration Hmatoxyline / osine

Les coupes histologiques de foie de rats, ayant reu lalimentation ND ou HFD, ont t ralises aprs et 7 mois de rgime alimentaire et colores lhmatoxyline / osine. Les rsultats montrent que le tissu hpatique des rats ND aprs 2 mois (cf. figure 98 A et B) et 7 mois de rgime (cf. figure 98 E et F) sont similaires : le cytoplasme des hpatocytes est ros et homogne, le noyau bien dfini et de couleur violette, et les hpatocytes sorganisent de faon radiale autour des veines centro-lobulaires du tissu. Le score pour ces coupes est alors de 0 puisquil ny a pas de statose. En revanche, aprs mois de rgime HFD, les hpatocytes sont gonfls et prsentent des vacuoles de gouttelettes lipidiques (cf. figure 98 C et D). Les noyaux sont moins visibles et parfois repousss la priphrie du cytoplasme. Ce sont les caractristiques dune statose hpatique qui est dautant plus prsente lorsque les rats sont soumis 7 mois de rgime HFD. Cette statose est suprieure 66% que ce soit 2 mois ou 7 mois de rgime HFD, le score est donc de 3.

139

Figure 98 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats aprs coloration HE. Les animaux ont t nourris avec le rgime normocalorique pendant deux mois (photos A et B) ou sept mois (photos E et F) ; ou avec le rgime hypercalorique pendant 2 mois (photos C et D) ou sept mois (photos G et H).

b)

Coloration au trichrome de Masson

Une coloration au trichrome de Masson a galement t ralise sur les coupes histologiques de foie, de rats soumis une alimentation ND ou HFD (cf. figure 99). 140

Figure 99 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats aprs coloration au trichrome de Masson. Les animaux ont t nourris avec le rgime normocalorique pendant deux mois (photos A et B) ou sept mois (photos E et F) ; ou avec le rgime hypercalorique pendant 2 mois (photos C et D) ou sept mois (photos G et H).

Aprs 2 (cf. figure 99 A et B) et 7 mois de rgime normocalorique (cf. figure 99 E et F), les hpatocytes sont colors en rouge tandis que les fibres de collagne sont colores en bleu. 141

Comme observ lors de la coloration HE du foie, les hpatocytes sorganisent de faon radiale autour des veines centro-lobulaires ou des espaces-portes. Cependant, aprs 2 mois de rgime HFD, le foie des animaux prsente galement des vacuoles de lipides dans le cytoplasme qui est gonfl (cf. figure 99 C et D). La statose est prsente ds deux mois de rgime et est accentue aprs 7 mois de rgimes HFD (cf. figure 99 G et H). Les scores de statose hpatique tablis pour chacune de ces coupes sont de 0 pour les animaux soumis au rgime ND 2 et 7 mois, et de 3 (> 66% de statose prsente dans le tissu) pour les animaux recevant lalimentation HFD et 7 mois. En dehors des espaces-portes ou des veines centro-lobulaires, il ny a pas de dveloppement de fibres de collagnes dans le tissu, ce qui traduit labsence de fibrose hpatique.

B. tude in vivo de leffet des antioxydants 1. tude du stress oxydant a) Dosage des lipides peroxyds par la mthode TBARS

Avant que les animaux ne reoivent leur rgime alimentaire respectif (ND ou HFD), le taux de lipides peroxyds a t mesur par la technique du TBARS. Les rsultats initiaux indiquent que les rats prsentent un taux de lipides peroxyds de 4,01 1,15mol/L/mg de protines. Aprs mois de traitement, les rats nourris par lalimentation HFD prsentent un taux de lipides peroxyds de 3,1 0,1mol/L/mg de protines contre 2,0 0,6mol/L/mg de protines pour les rats ND (cf. figure 100). De plus, le taux de lipides peroxyds est diminu de faon significative (p < 0,05) entre les rats leur arrive et aprs deux mois dalimentation ND.
5

Lipides peroxyds (mol/L/mg)

4 3 2 1 0 ND HFD

Figure 100 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire, mesur par la technique TBARS. NS ; Triglycridmie ND (n=4) versus triglycridmie HFD (n=3), t-test.

Lorsque les rats sont soumis trois mois de rgime alimentaire, ceux recevant lalimentation hypercalorique et le solvant ont un taux de lipides peroxyds (4,4 1,1mol/L/mg de protines) similaire celui des rats ND solvant (4,1 1,5mol/L/mg de protines) ; (cf. figure 101). Les 142

traitements par lEGCG et les PP pendant un mois ne modifient pas le taux de lipides peroxyds chez les animaux ND, car ceux-ci sont respectivement de 4,6 1,2mol/L/mg de protines et de 4,4 0,9mol/L/mg de protines, par rapport aux rats ND solvant (4,1 1,5mol/L/mg de protines). En revanche, lexercice semble augmenter le taux de lipides peroxyds 5,7 0,9mol/L/mg de protines par rapport aux rats ND solvant. Chez le groupe de rats nourris avec lalimentation HFD, les PP et lexercice, le taux de peroxydation lipidique est similaire celui du tmoin HFD solvant (4,2 1,5mol/L/mg de protines, 3,9 1,9mol/L/mg de protines et 4,4 1,1mol/L/mg de protines, respectivement). Seul lEGCG diminue de faon significative (p < 0,05) le taux de lipides peroxyds 1,6 0,3mol/L/mg de protines.
7 6 5 4 3 2 1 0 Solvant
Lipides peroxyds (mol/L/mg)

ND

HFD

EGCG

PP

Exercice

Figure 101 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 3 mois de rgime alimentaire et 1 mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. NS ; Lipides peroxyds ND solvant (n=4) versus lipides peroxyds HFD solvant (n=4), t-test. NS ; Lipides peroxyds ND solvant (n=4) versus lipides peroxyds ND EGCG (n=5) / PP (n=4) / Exercice (n=4), t-test. * : p < 0,05 ; Lipides peroxyds HFD solvant (n=4) versus lipides peroxyds HFD EGCG (n=3) / PP (n=4) /exercice (n=5), t-test.

Aprs 4 mois de rgime hypercalorique, les rats prsentent un taux de lipides peroxyds significativement augment (p < 0,01) 8,9 1,7mol/L/mg de protines par rapport aux rats ND solvant (4,0 1,6mol/L/mg de protines) ; (cf. figure102). Les rats ND prsentent un taux similaire de lipides peroxyds quel que soit le traitement utilis pendant 2 mois (solvant : 4,0 1,6mol/L/mg de protines ; EGCG : 4,9 1,8mol/L/mg de protines ; PP :

4,9 1,7mol/L/mg de protines ; exercice : 4,0 0,7mol/L/mg de protines). En revanche, chez les animaux HFD, les trois traitements permettent de diminuer de faon significative le taux de lipides peroxyds par rapport aux rats HFD solvant (8,9 1,7mol/L/mg de protines). En effet, le taux est de ,7 1,6mol/L/mg de protines pour lEGCG (p < 0,01), de 5,5 0,7mol/L/mg de protines pour les PP (p < 0,05) et de 4,6 1,6mol/L/mg de protines pour lexercice (p < 0,05).

143

12
Lipides peroxyds (mol/L/mg)

##

10 8 6 4 2 0 Solvant EGCG PP Exercice

**

ND HFD

Figure 102 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 4 mois de rgime alimentaire et 2 mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. ## : p < 0,01 ; Lipides peroxyds ND solvant versus lipides peroxyds HFD solvant, (n=4), t-test. NS ; Lipides peroxyds ND solvant versus lipides peroxyds ND EGCG / PP / exercice, (n=4), t-test. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; Lipides peroxyds HFD solvant versus lipides peroxyds HFD EGCG / PP / exercice, (n=4), t-test.

Enfin, aprs 5 mois de rgime alimentaire, il ny a pas de diffrence de concentration en lipides peroxyds entre les rats ND solvant (2,8 0,9mol/L/mg de protines) et HFD solvant (3,0 0,9mol/L/mg de protines) ; (cf. figure 103). Chez les rats ND soumis pendant 3 mois aux traitements antioxydants ou lexercice physique, le taux de lipides oxyds obtenus est similaire pour les rats recevant lEGCG (,7 1,7mol/L/mg de protines), les PP (2,7 0,4mol/L/mg de protines) et lexercice (,9 1,5mol/L/mg de protines) celui des rats ND solvant (2,8 0,9mol/L/mg de protines). Les rats HFD traits par lEGCG (,6 0,mol/L/mg de protines) ont galement un taux de lipides peroxyds similaire celui des rats HFD solvant. En revanche, les rats HFD traits par les PP ou faisant de lexercice ont des taux de lipides peroxyds significativement augments, respectivement 4,6 0,6mol/L/mg de protines et 5,6 1,8mol/L/mg de protines (p < 0,05).
8
Lipides peroxyds (mol/L/mg)

* *
ND HFD

6 4 2 0 Solvant EGCG PP

Exercice

Figure 103 : Taux de lipides peroxyds plasmatique en mol/L/mg de protines chez les rat ND et HFD aprs 5 mois de rgime alimentaire et 3 mois de traitement antioxydant ou dexercice, mesur par la technique TBARS. NS ; Lipides peroxyds ND solvant (n=5) versus lipides peroxyds HFD solvant, (n=4), t-test. NS ; Lipides peroxyds ND solvant (n=5) versus lipides peroxyds ND EGCG (n=4) / PP (n=4) / exercice (n=5), t-test. * : p < 0,05 ; Lipides peroxyds HFD solvant versus lipides peroxyds HFD EGCG / PP / exercice, (n=4), t-test.

144

b)

Effet des traitements sur la carbonylation des protines

Le taux de protines carbonyles, dans le plasma des rats avant lintroduction des rgimes alimentaires, a t mesur et les rsultats indiquent une concentration plasmatique en protines carbonyles de 0,36 0,12nmol/mg de protines. Aprs deux mois de rgime alimentaire, les animaux recevant lalimentation HFD prsentent une concentration plasmatique en protines carbonyles qui semble augmente par rapport aux rats ND (0,32 0,06nmol/mg de protines et 0,25 0,06nmol/mg de protines, respectivement) ; (cf. figure 104).
0,4

Protines carbonyles (nmol/mg)

0,3

0,2

0,1

0 ND HFD

Figure 104 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 2 mois aux rgimes ND ou HFD. NS ; Protines carbonyles ND versus protines carbonyles HFD, (n=4), t-test.

Lorsque les animaux sont soumis durant trois mois au rgime alimentaire, les rats HFD recevant le solvant prsentent un taux de carbonylation des protines augment de faon significative 0,205 0,045nmol/mg de protines par rapport aux rats ND (0,084 0,024nmol/mg de protines ; p < 0,05) ; (cf. figure 105).
Protines carbonyles (nmol/mg)
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Solvant EGCG PP Exercice

## $

*
$

ND HFD

Figure 105 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ## : p < 0,01 ; Protines carbonyles ND (n=4) versus protines carbonyles HFD (n=3), t-test. $ : p < 0,05 ; Protines carbonyles ND solvant (n=4) vs protines carbonyles ND EGCG / PP / exercice (n=3), t-test. * : p < 0,05 ; Protines carbonyles HFD solvant vs protines carbonyles HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

145

Chez les rats ND, un traitement par lEGCG pendant un mois, induit une diminution significative (p < 0,05) de la carbonylation des protines 0,037 0,010nmol/mg de protines par rapport aux rats ND solvant, tandis que les PP ne modifient pas ce taux (0,093 0,034nmol/mg de protines). Enfin, la pratique dune activit physique induit, quant elle, une augmentation significative (p < 0,05) de ce taux de protines carbonyles 0,167 0,057nmol/mg de protines. Dans le cas des rats HFD, ceux qui reoivent les PP pendant un mois, ont un taux de protines carbonyles qui reste similaire (0,185 0,054nmol/mg de protines) celui des rats HFD solvant. En revanche, ceux qui sont traits par lEGCG ont une diminution significative (p < 0,05) de leur taux 0,123 0,031nmol/mg de protines tout comme les rats pratiquant une activit physique o le taux de protines nest plus que de 0,098 0,044nmol/mg de protines.

En ce qui concerne les rats nourris pendant 4 mois avec ces rgimes, les rats HFD ayant reu le solvant pendant 2 mois, prsentent une augmentation significative (p < 0,01) du taux de protines carbonyles plasmatiques (1,08 0,21nmol/mg de protines) par rapport aux rats ND solvant dont le taux nest que de 0,49 0,02nmol/mg de protines (cf. figure 106).
Protines carbonyles (nmol/mg)
1,5

##
1,0

ND
0,5

$$

HFD

0,0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 106 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. ## : p < 0,01 ; Protines carbonyles ND versus protines carbonyles HFD, (n=3), t-test. $ : p < 0,05 ; Protines carbonyles ND solvant (n=3) versus protines carbonyles ND EGCG (n=4) / PP (n=5) / exercice (n=3), t-test. NS ; Protines carbonyles HFD solvant versus protines carbonyles HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

Les traitements des rats ND par les antioxydants EGCG (0,52 0,06nmol/mg de protines) et PP (0,41 0,21nmol/mg de protines) ne modifient pas le taux de protines carbonyles par rapport aux taux des rats ND solvant. En revanche, lexercice diminue de faon significative (P < 0,01) ce taux (0,31 0,06nmol/mg de protines) par rapport aux rats ND solvant. Concernant les animaux HFD, quils soient traits par les antioxydants ou quils fassent de lexercice, ils ne prsentent pas 146

de modifications du taux de protines carbonyles par rapport aux rats HFD solvant (EGCG : 1,12 0,13nmol/mg de protines ; PP : 1,16 0,04nmol/mg de protines ; exercice :

0,96 0,02nmol/mg de protines).

A la fin de ltude, lorsque les animaux ont t soumis 5 mois de rgime alimentaire, les rats HFD recevant le solvant prsentent un taux de protines carbonyles (0,27 0,18nmol/mg de protines) similaire celui des rats ND solvant (0,20 0,01nmol/mg de protines) ; (cf. figure 107).
Protines carbonyles (nmol/mg)
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 Solvant EGCG PP Exercice ND HFD

Figure 107 : Taux de protines carbonyles en nmol/mg de protines totales, dans le plasma de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; Protines carbonyles ND versus protines carbonyles HFD, (n=3), t-test. $ : p < 0,05 ; $$ : p < 0,01 ; Protines carbonyles ND solvant (n=3) versus protines carbonyles ND EGCG (n=4) / PP (n=4) / exercice (n=3), t-test. NS ; Protines carbonyles HFD solvant (n=3) versus protines carbonyles HFD EGCG (n=3) / PP (n=5) / exercice, (n=3), t-test.

Le traitement chez les rats ND par de lEGCG ne modifie pas le taux de protines carbonyles de ce groupe (0,16 0,03nmol/mg de protines) par rapport aux rats ND solvant (0,20 0,01nmol/mg de protines). En revanche, les PP et lexercice permettent de diminuer de faon significative la quantit de protines carbonyles par rapport aux rats ND solvant. En effet, les PP abaissent le taux de protines carbonyles 0,14 0,03nmol/mg de protines (p < 0,05) et lexercice 0,05 0,04nmol/mg de protines (p < 0,01). Dans le cas des rats HFD, un traitement par PP ou par lexercice semble diminuer la quantit de protines carbonyles (PP : 0,18 0,06nmol/mg de protines ; exercice : 0,06 0,02nmol/mg de protines) par rapport aux rats HFD solvant. Au contraire, le traitement des rats HFD par lEGCG semble augmenter le taux de protines carbonyles (1,62 1,72nmol/mg de protines) par rapport aux rats HFD solvant.

147

2.

tude mtabolique a) Masse des animaux

Les animaux des groupes ND et HFD ont t pess aprs un et deux mois de rgime alimentaire (cf. figure 108).
650 550

*** ***
ND + eau HFD + eau

Masse (g)

450 350 250 150 0 30 60

Temps (jours)
Figure 108 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation ND ou HFD pendant deux mois. *** : p <0,001 ; Masse des animaux ND versus HFD de 0 120 jours, t-test. (30 jours : n=59 animaux ND et n=46 animaux HFD ; 60 jours : n=68 animaux ND et n=51 animaux HFD).

Les rsultats obtenus montrent quaprs un mois de rgime HFD, on observe une augmentation de masse significative (p < 0,001) par rapport aux rats nourris par lalimentation ND. En effet, aprs un mois, les rats HFD psent 452,2 27,0g tandis que les rats ND ne psent que 389,1 26,1g. Cette diffrence de masse corporelle est maintenue entre les deux groupes, aprs 2 mois de rgime, les rats HFD ayant toujours une masse corporelle significativement augmente par rapport aux rats ND (552,6 40,7g versus 450,2 30,0g ; p < 0,001).

A partir de deux mois de rgime, les traitements (solvant, EGCG, PP, exercice) sont mis en place dans les deux groupes (ND et HFD). La masse des animaux est suivie jusqu 158 jours (5 mois et 3 semaines). Les rats ayant reu lalimentation ND ont une masse comprise entre 450, 0,0g au dbut de ltude et 54,7 47,1g la fin de ltude (cf. figure 109). Les rats traits par lEGCG, prsentent une courbe de masse similaire mais infrieure celle des rats ND solvant, avec des masses comprises entre 44,6 ,6g (dbut de ltude) et 57,5 8,g (fin de ltude). Au contraire, les rats ND + PP prsentent une prise de poids suprieure celle des ND solvant, avec des masses comprises entre 477,2 37,1g 60 jours et 551,3 53,8g 158 jours. Cette prise de masse nest pas significative, excepte au 95me jour dtude, o la masse des rats ND + PP est de 50, 4,6g (p < 0,05) alors que celle des rats ND solvant nest que de 498,8 4,8g (cf. figure 110). 148

800

Masse (g)

700 600 500 400 60 67 74 81 88 95 102 109 116 123 130 137 144 151 158

ND + solvant ND + EGCG ND + PP ND + Exercice

Temps (jours)
Figure 109 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation normocalorique (ND) entre deux et 5 mois de traitement antioxydant ou dexercice physique. * : p <0,05 ; ** : p <0,01 ; Masse des animaux ND EGCG/PP/Exercice versus ND solvant de 120 218 jours, t-test. (Les nombres danimaux utiliss pour les tests statistiques figurent dans le tableau, figure 110).

Lorsque les ND pratiquent une activit physique, la prise de masse au cours de ltude est faible. En effet, les rats psent 449,5 36,4g 60 jours et 476,2 55,8g aprs 158 jours. Cette diffrence de masse par rapport aux rats ND solvant devient significative partir du 74me jour dtude (p < 0,05) et se maintient jusquau 130me jour (p < 0,05). Au-del, la perte de significativit est lie la rduction du nombre danimaux (cf. figure 110).

Temps (jours)
n ND (solvant) n ND (EGCG) n ND (PP) n ND (Exercice) EGCG vs solvant PP vs solvant Exercice vs solvant

67
13 14 14 14 NS NS NS

74
14 13 15 13 NS NS p< 0,05

81
15 14 14 14 NS NS p< 0,01

88
13 15 14 15 NS NS p< 0,05

95
14 15 14 15 NS p< 0,05 p< 0,01

102
9 9 9 10 NS NS p< 0,05

109
9 9 10 10 NS NS p< 0,05

116
9 9 9 10 NS NS p< 0,05

123
10 9 9 10 NS NS p< 0,05

130
9 9 9 10 NS NS p< 0,05

137
5 4 4 5 NS NS NS

144
5 4 4 5 NS NS NS

151
3 4 4 5 NS NS NS

158
3 4 4 5 NS NS NS

Figure 110 : Tableau prsentant les rsultats du t-test pour chacun des groupes ND versus ND solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.

Les rats nourris par lalimentation hypercalorique HFD et recevant le solvant prennent du poids au cours de ltude puisquils psent 552,7 40,6g au 60me jour et 634,0 22,5g au 158me jour de ltude (cf. figure 111).

149

800 HFD + solvant

Masse (g)

700

HFD + EGCG HFD + PP HFD + Exercice

600

500 60 67 74 81 88 95 102 109 116 123 130 137 144 151 158

Temps (jours)
Figure 111 : Graphique prsentant la masse moyenne en grammes des rats nourris par l'alimentation hypercalorique (HFD) entre deux et 5 mois de traitement antioxydant ou dexercice physique. * : p <0,05 ; Masse des animaux HFD EGCG/PP/Exercice versus HFD solvant de 60 158 jours, t-test. (Les nombres danimaux utiliss pour les tests statistiques figurent dans le tableau ci-dessous).

Les rats HFD nourris avec de lEGCG ont une prise de masse suprieure celle des HFD solvant puisquils ont une masse de 545, 4,7g et de 67,6 49,8g, respectivement au dbut et la fin de ltude. Bien que la masse de ce groupe soit plus importante tout au long de ltude, elle nest cependant pas significative (cf. figure 112). En revanche, les rats recevant les PP de vin rouge dans leau boisson, prsentent une semaine aprs traitement, une masse significative infrieure (5,0 52,1g ; p < 0,05) celle des rats HFD solvant (568,1 43,2g). A partir du 123me jour, ils prennent du poids de faon significative (p < 0,05) par rapport aux rats HFD solvant (cf. figure 112). Cette significativit est retrouve au 137me et 144me jour dtude mais pas au 151me et 158me jour, d au nombre rduit danimaux la fin de ltude.
Temps (jours)
n HFD (solvant) n HFD (EGCG) n HFD (PP) n HFD (Exercice) EGCG vs solvant PP vs solvant Exercice vs solvant

67
13 14 14 14 NS p< 0,05 NS

74
13 13 14 14 NS NS p< 0,05

81
15 14 13 12 NS NS NS

88
14 15 14 15 NS NS NS

95
15 10 14 10 NS NS p< 0,05

102
10 10 10 9 NS NS p< 0,05

109
9 10 10 9 NS NS p< 0,05

116
9 9 10 8 NS NS p< 0,05

123
10 7 9 10 NS p< 0,05 NS

130
10 10 10 10 NS NS NS

137
5 5 5 5 NS p< 0,05 NS

144
5 5 5 4 NS p< 0,05 NS

151
3 5 5 4 NS NS NS

158
3 5 5 4 NS NS NS

Figure 112 : Tableau prsentant les rsultats du t-test pour chacun des groupes HFD versus HFD solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.

150

Enfin, concernant les rats HFD pratiquant une activit physique, la masse se stabilise au cours de ltude, puisquils psent 547,4 7,7g au dbut de ltude et 597,0 1,7g la fin. La masse des animaux pratiquant un exercice est significativement diminue par rapport aux animaux recevant le solvant, entre le 95me et le 116me jour de ltude (p < 0,05) ; (cf. figure 112). Lorsque les masses des rats ND solvant et HFD solvant sont compares au cours de ltude, une augmentation significative de la masse des animaux HFD solvant est observe par rapport aux rats ND solvant. En effet, au dbut de ltude (67me jour), la masse des rats HFD est augmente de faon significative (p < 0,001) 568,1 43,2g alors que les rats ND solvant ne psent que 459,4 4,4g. Cette significativit est maintenue jusquau 130me jour dtude, aprs, la rduction de significativit est lie une rduction du nombre danimaux, hormis au 158me jour o la diffrence de masse entre les deux groupes est significative (p < 0,05) ; (cf. figure 113).
Temps (jours)
n (ND) n (HFD) ND vs HFD

67
13 13 p< 0,001

74
14 13 p< 0,001

81
15 15 p< 0,001

88
13 14 p< 0,001

95
14 15 p< 0,001

102
9 10 p< 0,001

109
9 9 p< 0,001

116
9 9 p< 0,001

123
10 10 p< 0,001

130
9 10 p< 0,001

137
5 5 NS

144
5 5 NS

151
3 3 NS

158
3 3 p< 0,05

Figure 113 : Rsultats du t-test entre les groupes ND solvant versus HFD solvant, avec le nombre n danimaux de chacun des groupes, entre 67 et 158 jours dtude.

b)

Glycmie plasmatique

Avant ladministration des rgimes alimentaires ND ou HFD, la glycmie plasmatique des rats a t mesure ds leur arrive. Celle-ci est de 1,02 0,08g/L. Lorsque les animaux reoivent lalimentation HFD pendant 2 mois, la glycmie de ces rats est augmente significativement 1,13 0,1g/L (p < 0,05) par rapport aux rats ND (0,98 0,05g/L) ; (cf. figure 114).
1,4 1,2

Glycmie (g/L)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ND HFD

Figure 114 : Glycmie des rats en g/L aprs 2 mois de rgime ND ou HFD. * : p < 0,05 ; Glycmie ND versus glycmie HFD, (n=5), t-test.

151

Lorsque les rats sont soumis un rgime alimentaire pendant 4 mois (ND ou HFD), et reoivent leur traitement pendant 2 mois, des diffrences dans la glycmie sont observs (cf. figure 115). En effet, les rats HFD solvant prsentent une glycmie significativement augmente 1,97 0,25g/L par rapport aux rats ND (1,19 0,24g/L ; p < 0,01).
2,5

##
2

Glycmie (g/L)

1,5

***

***
ND HFD

0,5

0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 115 : Glycmie plasmatique en g/L de rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 4 mois, et pendant 2 mois aux antioxydant et lexercice. ## : p < 0,01 ; Glycmie ND solvant versus glycmie HFD solvant, (n=5), t-test. NS ; Glycmie ND solvant versus glycmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=5), t-test. *** : p < 0,001 ; Glycmie HFD solvant versus glycmie HFD EGCG / PP / exercice, (n=5), t-test.

Les rats nourris par lalimentation ND quel que soit le traitement quils reoivent pendant mois, ne prsentent pas de modification de leur glycmie par rapport aux rats ND solvant (Solvant : 1,19 0,24g/L ; EGCG : 1,02 0,09g/L ; PP : 1,13 0,18g/L et exercice : 1,01 0,12g/L). En revanche, les animaux HFD traits par lEGCG ou pratiquant une activit physique ont une glycmie qui est diminue significativement (1,25 0,18g/L et 1,36 0,07g/L, respectivement) par rapport aux rats HFD solvant (p < 0,001). Le traitement par les PP ninduit pas de modification de la glycmie (2,10 0,61g/L) par rapport aux rats HFD solvant.

c)

C-peptidmie

Au dbut de ltude, avant ladministration des rgimes, la C-peptidmie moyenne des animaux est de 446,5 60,8pmol/L. Lorsque les animaux sont soumis un rgime ND pendant 2 mois, la C-peptidmie est de 5, 07,9pmol/L. En revanche, ceux nourris par lalimentation HFD, pendant la mme dure, prsentent une C-peptidmie augmente de faon significative (p < 0,01) 1551,9 511,7pmol/L par rapport aux rats ND (cf. figure 116).

152

2500

C-peptidmie (pmol/L)

2000 1500 1000 500 0 ND

**

HFD

Figure 116 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire. ** : p < 0,01 ; C-peptidmie ND (n=5) versus C-peptidmie HFD (n=4), t-test.

Aprs mois de rgime alimentaire, les animaux nourris par lalimentation HFD ne recevant que le solvant, prsentent une C-peptidmie augmente de faon significative (1855,0 419,4pmol/L ; p < 0,001) par rapport aux rats ND recevant galement le solvant (711,5 128,1pmol/L) ; (cf. figure 117). Les rats nourris par lalimentation ND, quils soient traits par lEGCG ou par les PP, ne prsentent pas de diffrences significatives de la C-peptidmie (EGCG : 787,5 71,3pmol/L ; PP : 1027,0 317,2pmol/L) par rapport aux rats ND solvant (711,5 128,1pmol/L). En revanche, les rats ND pratiquant un exercice physique ont une Cpeptidmie significativement diminue 6,5 8,7pmol/L (p < 0,01). Les traitements lEGCG, aux PP ou lactivit physique induisent, chez des rats HFD, une baisse significative de la Cpeptidmie par rapport au rats HFD solvant. En effet, les rats HFD solvant ont une C-peptidmie de 1855,0 419,4pmol/L, alors quelle nest que de 118,8 10,4pmol/L (p < 0,05) pour les rats traits par lEGCG, de 747,0 47,7pmol/L (p < 0,05) pour ceux recevant les PP et que de 1181,3 329,9pmol/L (p < 0,05) pour les animaux pratiquant une activit physique (cf. figure 117).
2500

C-peptidmie (pmol/L)

###

2000 1500 1000 500 0 Solvant EGCG PP Exercice

* *
$$

ND HFD

Figure 117 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ### : p < 0,001 ; C-peptidmie ND solvant (n=5) versus C-peptidmie HFD solvant (n=5), t-test. $$ : p < 0,01 ; C-peptidmie ND solvant (n=5) versus C-peptidmie ND EGCG (n=5) / PP (n=5) / exercice (n=4), t-test. * : p < 0,05 ; C-peptidmie HFD solvant (n=5) vs C-peptidmie HFD EGCG (n=3) /PP (n=3) / exercice (n=4), t-test.

153

Lorsque les rats sont soumis 4 mois de rgime HFD solvant, ils prsentent une C-peptidmie augmente de faon significative 1629,5 491,9pmol/L (p < 0,01) par rapport aux rats ND solvant o la C-peptidmie nest que de 587,0 216,3pmol/L (cf. figure 118).
2500

C-peptidmie (pmol/L)

##

2000 1500 1000 500 0 Solvant EGCG PP Exercice

ND HFD

Figure 118 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. ## : p < 0,01 ; C-peptidmie ND solvant versus C-peptidmie HFD solvant, (n=4), t-test. NS ; C-peptidmie ND solvant versus C-peptidmie ND EGCG / PP / exercice, (n=4), t-test. * : p < 0,05 ; C-peptidmie HFD solvant (n=4) vs C-peptidmie HFD EGCG (n=5) /PP (n=5) / exercice (n=4), t-test.

Ces derniers, quils reoivent de lEGCG, des PP ou quils fassent de lexercice pendant deux mois, ne prsentent pas de diffrences significatives dans leur C-peptidmie (EGCG : 713,7 210,19pmol/L ; PP : 439 ,9 62,0pmol/L ; exercice : 466,7 123,8pmol/L) par rapport aux rats ND solvant (466,7 123,8pmol/L). De plus, les PP administrs aux rats HFD ne modifient pas le taux de C-peptide plasmatique (1650,3 49,1pmol/L) contrairement lEGCG (1057,0 88,2pmol/L) et lexercice (97,4 231,2pmol/L) o la C-peptidmie est significativement diminue (p < 0,05) par rapport aux rats HFD solvant (1629,5 491,9pmol/L).

Aprs 5 mois de rgime alimentaire, les rats HFD solvant prsentent toujours une Cpeptidmie augmente de faon significative (1400,7 339,8pmol/L ; p < 0,01) par rapport aux rats nourris par lalimentation ND solvant (449,9 99,6pmol/L) ; (cf. figure 119). Le traitement par de lEGCG ou la pratique dune activit physique pendant trois mois chez les rats ND ne modifie pas leur C-peptidmie (EGCG : 379,1 148,7pmol/L ; Exercice : 439,2 95,6pmol/L) par rapport aux rats ND solvant (449,9 99,6pmol/L). En revanche, les PP induisent une augmentation significative de la C-peptidmie des rats ND (896,4 266,5pmol/L ; p < 0,05) par rapport ceux qui reoivent le solvant. Enfin, chez les rats HFD, les traitements et la pratique dune activit ne modifient plus le taux de C-peptidmie des animaux nourris par alimentation hypercalorique. En effet, les Cpeptidmie obtenues sont de 5,4 68,6pmol/L pour les rats traits par lEGCG, de 1788,1 79,2pmol/L pour ceux traits par les PP et de 1536,1 98,0pmol/L pour ceux faisant de lexercice. 154

3000

C-peptidmie (pmol/L)

2500 2000 1500 1000 500 0 Solvant EGCG PP Exercice

##
ND

HFD

Figure 119 : Taux de C-peptide plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. ## : p < 0,01 ; C-peptidmie ND solvant versus C-peptidmie HFD solvant, (n=4), t-test. $ : p < 0,05 ; C-peptidmie ND solvant versus C-peptidmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=4), t-test. NS ; C-peptidmie HFD solvant (n=4) versus C-peptidmie HFD EGCG (n=4) /PP (n=3) /exercice (n=3), t-test.

d)

Pro-insulinmie

La pro-insulinmie des animaux avant ladministration des traitements est de 1,4 0,4pmol/L. Aprs administration des rgimes normocalorique ou hypercalorique pendant deux mois, la proinsulinmie des rats HFD est augmente de faon significative (p < 0,05) 21,6 10,9pmol/L par rapport aux rats ND solvant o le taux de pro-insuline nest que de 7,1 ,pmol/L (cf. figure 10). * 35
Proinsulinmie (pmol/L)
30 25 20 15 10 5 0 ND HFD

Figure 120 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats ND et HFD aprs 2 mois de rgime alimentaire. * : p < 0,05 ; Pro-insulinmie ND versus pro-insulinmie HFD (n=4), t-test.

Aprs 3 mois de rgime alimentaire, les rats HFD conservent cette augmentation de proinsuline plasmatique par rapport aux rats ND (cf. figure 121). En effet, les rats HFD ont une proinsulinmie augmente significativement 19,1 4,4pmol/L (p < 0,05) par rapport aux rats ND o la pro-insulinmie nest que de 5,1 ,pmol/L. Chez les rats ND, les apports en EGCG, en PP ou par lexercice pendant un mois ne modifient pas les taux de pro-insuline (EGCG : 4,0 1,5pmol/L ; PP : 6,4 4,1pmol/L ; exercice : 5,0 ,6pmol/L). De plus, les rats HFD traits par lEGCG semblent prsenter une augmentation du taux de pro-insuline plasmatique 29,1 1,4pmol/L. Au 155

contraire, un traitement par les PP et lexercice semble diminuer le taux de pro-insuline chez ces animaux (PP : 16,1 15,1pmol/L ; exercice : 9,9 6,8pmol/L).
Proinsulinmie (pmol/L)
35 30 25 20 15 10 5 0 Solvant EGCG PP Exercice

#
ND HFD

Figure 121 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. # : p < 0,05 ; Pro-insulinmie ND solvant (n=5) versus pro-insulinmie HFD solvant (n=4), t-test. NS ; Pro-insulinmie ND solvant (n=5) versus pro-insulinmie ND EGCG (n=5) / PP (n=5) / Exercice (n=4), t-test. NS ; Pro-insulinmie HFD solvant (n=4) versus pro-insulinmie HFD EGCG (n=3) /PP (n=3) /exercice (n=5), t-test.

Aprs 4 mois de rgime alimentaire, les rats soumis lalimentation HFD prsentent une augmentation significative (p < 0,05) du taux de pro-insuline 14,6 5 ,1pmol/L alors quil nest que de 4,6 3,89pmol/L chez les rats ND (cf. figure 122). Chez le groupe de rats ND, ceux recevant lEGCG, les PP et pratiquant lexercice pendant deux mois, ne prsentent pas dvolution dans le taux de pro-insuline plasmatique (EGCG : 4,0 2,0pmol/L ; PP : 3,7 2,7pmol/L ; exercice 3,4 0,8pmol/L) par rapport aux rats ND solvant (4,6 3,9pmol/L). Chez les rats HFD, les traitements par lEGCG, les PP et lexercice ninduisent pas de diminution significative du taux de pro-insuline (EGCG : 11,0 3,1pmol/L ; PP : 12,6 1,1pmol/L ; exercice : 9,9 4,2pmol/L).
Proinsulinmie (pmol/L)
25 20 1 5 10 5 0 Solvant EGCG PP Exercice

#
ND HFD

Figure 122 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. # : p < 0,05 ; Pro-insulinmie ND solvant versus pro-insulinmie HFD solvant, (n=4), t-test. NS ; Pro-insulinmie ND solvant versus pro-insulinmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=4), t-test. NS ; Pro-insulinmie HFD solvant (n=4) versus pro-insulinmie HFD EGCG (n=5) /PP (n=5) /exercice (n=4), t-test.

156

Lorsque les rats sont soumis un rgime hypercalorique pendant 5 mois, leur taux de proinsuline plasmatique est augment de faon significative (p < 0,05) 14,9 5,1pmol/L alors que celui des rats normocaloriques nest que de 6,0 ,8pmol/L (cf. figure 1).
Proinsulinmie (pmol/L)
30 25 20 15 10 5 0 Solvant EGCG PP Exercice

#
ND HFD

Figure 123 : Taux de pro-insuline plasmatique en pmol/L chez les rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. # : p < 0,05 ; C-peptidmie ND solvant (n=3) versus C-peptidmie HFD solvant (n=4), t-test. $ : p < 0,05 ; C-peptidmie ND solvant (n=3) versus C-peptidmie ND EGCG / PP / Exercice (n=3), t-test. NS ; C-peptidmie HFD solvant (n=4) versus C-peptidmie HFD EGCG (n=4) /PP (n=3) /exercice (n=3), t-test.

Chez les rats nourris par lalimentation ND, un traitement par de lEGCG et lexercice diminuent de faon significative (p < 0,05) la pro-insulinmie plasmatique des animaux, respectivement 2,3 1,0pmol/L et 1,1 0,5pmol/L, tandis que les PP ne modifient ce taux (5,5 ,4pmol/L) par rapport aux animaux ND solvant. Enfin, chez les animaux HFD, la pratique dune activit physique semble diminuer la pro-insulinmie (11,4 0,3pmol/L) par rapport aux rats HFD solvant (14,9 ,9pmol/L). LEGCG et les PP semblent, au contraire, augmenter la pro-insulinmie (18,9 8,0pmol/L et 17,1 5,3pmol/L, respectivement). e) tude histologique du pancras Coloration lhmatoxyline / osine (HE)

Lhistologie des pancras des rats de chaque condition et pour chacun des temps dtude est tudie par la coloration HE. Avant ladministration des rgimes ND ou HFD, les lots pancratiques des rats prsentent une forme ovode pour la plupart (cf. figure 124).

Figure 124 : Photographies d'lots pancratiques de rats avant l'administration des rgimes.

157

Aprs deux mois de rgime ND ou HFD, aucune diffrence histologique notable nest observe sur les lots pancratiques des rats des deux groupes danimaux (cf. figure 15 A et B). A B

Figure 125 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis aux rgimes pendant 2 mois. Les rats ont t nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant deux mois.

De plus, que les animaux soient nourris lalimentation normocalorique ou hypercalorique pendant 3 mois (cf. figure 126), 4 mois (cf. figure 127) ou 5 mois (cf. figure 18), on nobserve pas de modification de laspect histologique des tissus pancratiques en fonction des rgimes, du temps de ltude et de la supplmentation en antioxydants (EGCG ou PP) ou de la pratique de lexercice physique. Les donnes concernant le rgime ND supplment en antioxydants ou exercice ne sont pas prsentes, car les rsultats obtenus sont identiques aux animaux HFD tmoins (solvant) avec ou sans exercice et antioxydant. A B

Figure 126 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant 3 mois aux rgimes et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. Les rats ont t nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant trois mois. Les rats HFD ont bnfici dune supplmentationen EGCG 50mg/kg/jour (C) ou en extrait de polyphnols de vin rouge 50mg/kg/jour (D), ou ont pratiqu une activit physique (nage) pendant une heure de faon quotidienne (E).

158

Figure 127 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice Les rats ont t nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant quatre mois. Les rats HFD ont bnfici dune supplmentationen EGCG 50mg/kg/jour (C) ou en extrait de polyphnols de vin rouge 50mg/kg/jour (D), ou ont pratiqu une activit physique (nage) pendant une heure de faon quotidienne (E).

Figure 128 : Photographies de coupes histologiques colores la HE de tissu pancratique de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice Les rats ont t nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant quatre mois. Les rats HFD ont bnfici dune supplmentationen EGCG 50mg/kg/jour (C) ou en extrait de polyphnols de vin rouge 50mg/kg/jour (D), ou ont pratiqu une activit physique (nage) pendant une heure de faon quotidienne (E).

159

Mesure de la taille des lots de Langerhans

La taille des lots pancratiques a t mesure daprs les coupes histologiques de pancras colores la HE. La taille des lots est dfinie par la mesure de leur surface en m (cf. Matriels et Mthodes). Les rsultats montrent quavant lintroduction des rgimes alimentaires, le nombre moyen de petits lots est de 51,3 2,2% et celui des lots de taille moyenne est de 43,2 8,3% (cf. figure 129). Le nombre de gros ne reprsente que 2,8 4,8%.
100%
Pourcentage d'lots pancratiques

90% 80% 70% Taille > 30000 m 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 10000 < Taille < 30000 m Taille < 10000 m

Figure 129 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, avant ladministration des rgimes (n=3)

Aprs deux mois de rgime ND, le nombre de petits lots observs dans les pancras de ce groupe (43,7 15,5%) est similaire celui des rats HFD (49,8 14,7%) ; (cf. figure 130). Le nombre dlots de taille moyenne semble tre diminu chez les rats HFD (5,1 ,1%) par rapport celui des rats ND (47,9 14,9%). Au niveau des gros lots, une augmentation significative du nombre de gros lots est observe chez les rats HFD (25,1 14,4%) par rapport aux rats ND (8,4 0,7% ; p < 0,05).
100%
Pourcentage d'lots pancratiques

80% Taille > 30000 m 10000 < Taille < 30000 m 40% Taille < 10000 m

60%

20% 0% ND HFD

Figure 130 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs deux mois de rgime ND ou HFD. # : p < 0,05 ; Pourcentage de gros lots ND versus pourcentage de gros lots HFD (n=3), t-test.

160

Aprs 3 mois de rgime alimentaire, les rats HFD prsentent une rpartition des petits et des moyens lots en fonction de leur taille (25,8 15,1% et 60,0 7,%, respectivement) qui nest pas significativement modifie par rapport celle des rats ND (32,6 6,6% et 38,1 9,6%, respectivement) ; (cf. figure 131). En revanche, les rats HFD ont une augmentation significative du nombre de leurs gros lots (29,3 9,7%) par rapport aux rats ND (4,2 7,2% ; p < 0,05). Lorsque les rats ND reoivent lEGCG, les PP ou pratiquent une activit physique, aucune diffrence significative nest observe dans la rpartition des lots en fonction de leur taille (rsultats non montrs) par rapport aux rats ND solvant. Dans le groupe de rats HFD, que les rats soient traits par lEGCG ou les PP, aucune diffrence significative nest observe dans la rpartition de la taille des lots (petit : 34,1 13,8% ; moyen : 49,0 15,2% ; gros : 16,9 8,0% et petit : 46,1 18,7% ; moyen : 27,2 11,8% ; gros : 26,7 8,8%, respectivement) par rapport aux rats HFD solvant (petit : 32,6 6,6% ; moyen : 38,1 9,6% ; gros : 9, 9,7%). En revanche, lexercice modifie significativement la rpartition des petits et des gros lots. En effet, le nombre de petits lots chez les rats HFD pratiquant un exercice est augment 51,9 6,4% contre 32,6 6,6% chez les rats HFD solvant (p < 0,05). De mme que le nombre de gros lots est significativement diminu chez le premier groupe de rats (7,4 6,4%) par rapport au second groupe (29,3 9,7%). Aucune modification nest observe pour le nombre dlots de taille moyenne entre ces deux groupes (HFD exercice : 40,7 6,4% et HFD solvant : 38,1 9,6%).
100%
#

Pourcentage d'lots pancratiques

80% 60% 40% Taille > 30000 m 10000 < Taille < 30000 m Taille < 10000 m

*
20% 0% ND + HFD + solvant solvant HFD + HFD + PP HFD + EGCG exercice

Figure 131 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs trois mois de rgime ND ou HFD et un mois de traitement antioxydant ou dactivit physique. # : p < 0,05 ; Pourcentage de gros lots ND versus pourcentage de gros lots HFD (n=3), t-test. * : p < 0,05 ; Pourcentage de gros lots HFD solvant versus pourcentage de gros lots HFD exercice (n=3), t-test. * : p < 0,05 ; Pourcentage de petits lots HFD solvant versus pourcentage de petits lots HFD exercice (n=3), t-test.

161

Aprs 4 mois de rgime, la rpartition des lots des rats HFD ne semble pas tre modifie significativement (petit : 49,8 8,5% ; moyen : 31,8 15,8% ; gros : 18,4 7,3%) par rapport aux tmoins ND solvant (petit : 53,6 24,8% ; moyen : 38,2 18,1% ; gros : 8,1 8,3%) ; (cf. figure 1). Lorsque les rats ND sont traits par lEGCG, les PP ou lexercice, aucune diffrence significative nest observe dans la rpartition des lots en fonction de leur taille (rsultats non montrs) par rapport aux rats ND solvant. Chez les rats HFD, la supplmentation en antioxydant que ce soit en EGCG (petit : 44,6 24,0% ; moyen : 43,3 20,3% ; gros : 12,0 12,5%) ou en PP (petit : 39,4 24,8% ; moyen : 43,9 11,1% ; gros : 16,7 16,7%), ne modifie pas de faon significative la rpartition des lots par rapport au tmoin HFD. En revanche, les animaux traits par lexercice ne prsentent une diminution significative (p < 0,05) du nombre de gros lots par rapport aux rats HFD solvant (18,4 7, %). La proportion des petits et moyens lots nest pas modifie significativement (petit : 53,8 17,9% ; moyen : 46,2 17,9%). *
100% 90%

Pourcentage d'lots pancratiques

80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Taille > 30000 m 10000 < Taille < 30000 m Taille < 10000 m

ND + HFD + HFD + HFD + PP HFD + solvant solvant EGCG exercice Figure 132 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs quatre mois de rgimes ND ou HFD et deux mois
de supplmentations en antioxydants ou en exercice physique. NS ; Pourcentage de gros lots ND versus pourcentage de gros lots HFD (n=3), t-test. NS ; Pourcentage de gros lots HFD solvant versus pourcentage de gros lots HFD exercice (n=3), t-test. * : p < 0,05 ; Pourcentage de petits lots HFD solvant versus pourcentage de petits lots HFD exercice (n=3), t-test.

Enfin, aprs 5 mois dtude, les rats nourris par lalimentation HFD ne prsentent pas de modification significative de la rpartition des lots (petit : 41,0 18,8% ; moyen : 27,9 23,2% ; gros : 18,4 7,3%) par rapport aux rats ND solvant (petit : 43,0 11,4% ; moyen : 45,4 4,2% ; gros : 1,1 16,8%). Lorsque les rats ND reoivent lEGCG, les PP ou pratiquent une activit physique, aucune diffrence significative nest observe dans la rpartition des lots en fonction de leur taille (rsultats non montrs) par rapport aux rats ND solvant. Chez les rats HFD, lapport des antioxydants, EGCG et PP, ne modifie pas la rpartition des lots en fonction de leur taille (petit : 162

48,5 2,6% ; moyen : 28,0 20,6% ; gros : 27,7 16,6% et petit : 52,9 27,4% ; moyen : 21,8 10,0% ; gros : 5, 18,%, respectivement). En revanche, lexercice induit une modification significative de cette rpartition, par diminution du nombre de gros lots qui est de 0% chez les rats faisant de lexercice contre 1,1 16,8% chez ceux recevant le solvant. Cependant, aucune modification significative nest observe pour les lots de petite et de moyenne taille (39,4 18,3% et 56,4 14,3%, respectivement), (cf. figure 133).
100%

Pourcentage d'lots pancratiques

80% 60% 40% 20% 0% ND + HFD + solvant solvant HFD + HFD + PP HFD + EGCG exercice Taille > 30000 m 10000 < Taille < 30000 m Taille < 10000 m

Figure 133 : Pourcentage dlots en fonction de leur taille, aprs cinq mois de rgime ND ou HFD et trois mois de traitement antioxydant ou dactivit physique. NS ; Pourcentage de gros lots ND versus pourcentage de gros lots HFD (n=3), t-test. NS ; Pourcentage de gros lots HFD solvant versus pourcentage de gros lots HFD exercice (n=3), t-test. * : p < 0,05 ; Pourcentage de petits lots HFD solvant versus pourcentage de petits lots HFD exercice (n=3), t-test.

Immuno-marquage du pancras linsuline

Limmuno-marquage de linsuline a t ralis sur des coupes de pancras danimaux nourris par alimentation ND ou HFD pendant deux, trois, quatre et cinq mois, avec une supplmentation en EGCG ou en PP ou avec la pratique dune activit physique. Avant ladministration des rgimes, les rats prsentent un marquage linsuline correct, mis en vidence par une coloration rouge (cf. figure 134).

Figure 134 : Photographie d'immunohistologie d'une coupe de pancras marque l'insuline, de rat avant l'administration des rgimes.

163

Les rsultats obtenus montrent quaprs deux mois de rgime HFD (cf. figure 135 B), on nobserve pas de diffrence de marquage linsuline dans les lots par rapport aux pancras danimaux nourris par alimentation ND (cf. figure 15 A). A B

Figure 135 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 2 mois. Les rats ont t nourris pendant deux mois par un rgime ND (A) ou HFD (B) et les cellules produisant linsuline apparaissent en rouge.

Des rsultats similaires sont obtenus pour des animaux nourris par lalimentation normocalorique ou hypercalorique aprs 3 mois (cf. figure 136), 4 mois (cf. figure 137) ou 5 mois (cf. figure 138), bnficiant ou non dune supplmentation en antioxydants ou pratiquant un exercice. En effet, aucune diffrence dans le marquage nest observe entre les groupes danimaux ND et HFD. Les rsultats des coupes dimmuno-marquage linsuline des animaux ND aux diffrents mois avec les traitements antioxydants ou lactivit physique ne sont pas prsents car ils sont identiques au tmoin ND. A B

Figure 136 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 3 mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant un mois. Les rats ont t nourris pendant 3 mois par un rgime ND (A) ou HFD (B). Les rats HFD ont reu pendant un mois, de lEGCG (C), des PP (D) et ont pratiqu une activit physique (E). Les cellules produisant linsuline apparaissent en rouge.

164

Figure 137 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant 2 mois. Les rats ont t nourris pendant 4 mois par un rgime ND (A) ou HFD (B). Les rats HFD ont reu pendant 2 mois, de lEGCG (C), des PP (D) et ont pratiqu une activit physique (E). Les cellules produisant linsuline apparaissent en rouge.

Figure 138 : Photographies d'immunohistologie de coupes de pancras marques l'insuline, de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par des antioxydants ou lexercice pendant 3 mois. Les rats ont t nourris pendant 5mois par un rgime ND (A) ou HFD (B). Les rats HFD ont reu pendant 3 mois, de lEGCG (C), des PP (D) et ont pratiqu une activit physique (E). Les cellules produisant linsuline apparaissent en rouge.

165

f)

Marquage du pancras la DHE

Les coupes de pancras des rats HFD et ND, supplments ou non en antioxydants ou pratiquant une activit physique ont t traites la dihydrothidine. Des animaux nourris par le rgime HFD pendant deux mois prsentent un marquage la DHE nuclaire similaire celui des rats ND (HFD : 109,21 21,86% ; ND : 100%) lors de lanalyse de la fluorescence dun chantillon gal (cf. figure 19). Cependant, lanalyse qualitative de la fluorescence montre une augmentation de fluorescence non significative entre les rats HFD (cf. figure 139 B) et les rats ND (cf. figure 139 A). A B

Fluorescence (% tmoin)

1 50 1 25 1 00 75 50 25 0 ND HFD

Figure 139 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats ND (A) ou HFD (B), aprs 2 mois de rgime alimentaire. NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test.

166

Aprs mois de rgime alimentaire HFD, une augmentation significative de lintensit de fluorescence de la DHE (118,42 1,77% ; p < 0,05) est observe par rapport aux rats nourris par lalimentation ND (100%) ; (cf. figure 140). Cette augmentation nest cependant pas observe sur les photographie du tissu des rats HFD (cf. figure 140 B) et des rats ND (cf. figure 140 A). Lapport des antioxydants et de lexercice pendant un mois, sur les animaux soumis au rgime ND pendant 3 mois, ne modifie pas lintensit de fluorescence de la DHE (EGCG : 128,30 40,88% ; PP : 110,13 25,14% ; exercice : 84,26 31,14%) par rapport aux animaux ND solvant (100%). Chez les rats HFD, aucune modification significative de la fluorescence nest observe, que ce soit de faon qualitative ou quantitative, pour les rats traits par lEGCG (15,5 6,09% ; cf. figure 140 C), les PP (146,98 40,69% ; cf. figure 140 D) ou par lexercice (exercice : 98,83 26,22% ; cf. figure 140 E), par rapport aux rats HFD solvant (118,42 1,77%). A B C D E

200

Fuorescence (% tmoin)

175 150 125 100 75 50 25 0 Solvant EGCG PP Exercice

#
ND HFD

Figure 140 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 3 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 1 mois. Rats ND (A), HFD (B), HFD + EGCG (C), HFD + PP (D) et HFD + Exercice (E). # : p < 0,05 ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

Lorsque les animaux sont soumis un rgime HFD pendant 4 mois, lintensit de fluorescence de la DHE obtenue est similaire celle des animaux nourris par lalimentation ND 167

(ND solvant : 100% ; HFD : 110,81 42,15%) ; (cf. figure 141). Ces fluorescences quantifies sont galement comparables, dun point de vue qualitatif, pour les rats HFD solvant (cf. figure141 B) et les rats ND solvant (cf. figure 141 A). Que les rats reoivent de lEGCG, des PP ou quils pratiquent une activit physique dans les deux groupes, on nobserve pas de modification de fluorescence dans le tissu pancratique de ces animaux par rapport leur tmoin solvant (ND EGCG : 136,41 34,14% ; ND PP : 108,59 17,21% ; ND exercice : 112,35 16,97% ; HFD EGCG : 97,49 19,51% ; HFD PP : 145,29 46,36% ; HFD exercice : 79,08 15,02%). Ces rsultats sont galement confirms dun point de vue qualitatif, dans le groupe des rats HFD recevant le solvant (cf. figure 141 B), lEGCG (cf. figure 141 C), les PP (cf. figure 141 D) ou pratiquant un exercice (cf. figure 141 E). A B C D E

200 175

Fuorescence (% tmoin)

150 125 100 75 50 25 0 Solvant EGCG PP Exercice

ND HFD

Figure 141 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 2 mois. Rats ND (A), HFD (B), HFD + EGCG (C), HFD + PP (D) et HFD + Exercice (E). NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

A la fin de ltude, le tissu pancratique prsente une augmentation significative du marquage fluorescent la DHE chez les rats HFD solvant (143,30 16,16% ; p < 0,05) par rapport aux rats ND solvant (100%) ; (cf. figure 14). Cette diffrence nest pas observe sur les photographies des tissus des rats ND (cf. figure 14 A) et HFD (cf. figure 14 B) Chez les rats ND, lexercice induit 168

une augmentation significative de la fluorescence (160,42 16,38% ; p < 0,01) alors que le traitement par les antioxydants ne semble pas modifier de faon significative cette fluorescence (EGCG : 98,52 20,07% et PP : 186,75 56,0%). Dans le cas des rats nourris par lalimentation HFD, quel que soit le traitement utilis, la fluorescence nest pas modifie de faon significative (EGCG : 124,92 21,64% ; PP : 171,10 67,31% ; exercice : 177,67 45,69) sur une analyse quantitative de trois chantillons, par rapport aux rats HFD solvant (143,30 16,16%). Cependant, les photographies prsentes ci-dessous montrent que le traitement par les PP et lexercice semblent induire une augmentation de la fluorescence (cf. figure 142 D et 142 E, respectivement) par rapport au solvant (cf. figure 14 B) et lEGCG (cf. figure 14 C). A B C D E

250

Fuorescence (% tmoin)

225 200 175 150 125 100 75 50 25 0

$$
ND HFD

Solvant

EGCG

PP

Exercice

Figure 142 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de pancras de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 3 mois. Rats ND (A), HFD (B), HFD + EGCG (C), HFD + PP (D) et HFD + Exercice (E). # : p < 0,05 ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. $$ : p < 0,01 ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

g)

Dosage des triglycrides

Avant ladministration des rgimes alimentaires ND ou HFD chez les rats, le taux de triglycrides plasmatiques a t mesur. Celui-ci tait de 0,94 0,06mmol/L. Puis aprs deux mois de rgimes HFD, les rats prsentent un taux de triglycrides plasmatiques significativement augment (p < 0,01) 8,5 ,4mmol/L alors que celui des rats ND nest que de 1,6 0,1mmol/L (cf. figure 143). 169

Triglycrides (mmol/L)

12 10 8 6 4 2 0 ND

**

HFD

Figure 143 : Taux de triglycrides plasmatiques en mmol/L, chez des rats nourris par une alimenation ND et HFD pendant 2 mois.

** : p < 0,01 ; Triglycridmie ND (n=3) versus triglycridmie HFD (n=4), t-test.

Aprs trois mois de rgime HFD, les rats recevant le solvant prsentent une augmentation significative (p < 0,001) de la triglycridmie plasmatique (6,2 1,2mmol/L) par rapport aux rats ND solvant (1,3 1,2mmol/L) ; (cf. figure 144). Les traitements par lEGCG, les PP et lexercice pendant un mois ne modifient pas le taux de triglycrides chez les animaux nourris par lalimentation ND (EGCG : 0,5 0 ,4mmol/L ; PP : 1,6 1,0mmol/L ; exercice : 1,0 0,5mmol/L) par rapport aux animaux tmoins ND solvant. En revanche, seuls les PP induisent une diminution significative (p < 0,01) du taux de triglycrides 3,9 0,7mmol/L chez les animaux HFD contrairement lEGCG (5,9 4,mmol/L) et lexercice (7,1 1,7mmol/L).
Triglycrides (mmol/L)
12 10 8 6 4 2 0 Solvant EGCG PP Exercice

###
ND

**

HFD

Figure 144 : Taux de triglycrides plasmatiques en mmol/L, chez des rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. ### : p < 0,001 ; Triglycridmie ND solvant (n=5) versus triglycridmie HFD solvant (n=4), t-test. NS ; Triglycridmie ND solvant versus triglycridmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=5), t-test. ** : p < 0,01 ; Triglycridmie HFD solvant (n=4) versus triglycridmie HFD EGCG / PP /exercice (n=5), t-test.

Lorsque les rats sont soumis aux rgimes pendant 4 mois, les rsultats obtenus montrent que le taux de triglycrides nest pas significativement diffrent entre les rats ND solvant (2,3 0,3mmol/L) et les rats HFD solvant (2,6 1,2mmol/L) ; (cf. figure 145).

170

Triglycrides (mmol/L)

5 4 3 2 1 0 Solvant EGCG PP Exercice ND

$$

$$$

$$$

HFD

Figure 145 : Taux de triglycrides plasmatique en mmol/L, chez des rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; Triglycridmie ND solvant (n=5) versus triglycridmie HFD solvant (n=4), t-test. $$ : p < 0,01 ; $$$ : p < 0,001 ; Triglycridmie ND solvant vs triglycridmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=5), t-test. NS ; Triglycridmie HFD solvant versus triglycridmie HFD EGCG /PP /exercice, (n=4), t-test.

Ladministration des antioxydants EGCG, PP et de lexercice pendant deux mois, induisent une diminution significative du taux de triglycrides plasmatiques chez les animaux ND, respectivement 1,3 0,3mmol/L (p < 0,01), 1,3 0,2mmol/L (p < 0,001) et 1,2 0,3mmol/L (p < 0,001) par rapport aux rats tmoins ND solvant (2,3 0,3mmol/L). En revanche, chez les animaux HFD, seuls lEGCG et lexercice semblent diminuer le taux de triglycrides plasmatiques respectivement 1,7 0,5mmol/L et 1,5 0,2mmol/L par rapport aux tmoins HFD solvant (2,6 1,2mmol/L). Enfin, les PP ne modifient pas le taux de triglycrides (3,0 0,9mmol/L) par rapport aux rats tmoins HFD solvant.

Aprs 5 mois de rgime alimentaire, aucune modification du taux de triglycrides plasmatique nest observe entre les rats ND solvant (1,6 0,6mmol/L) et les rats HFD solvant (2,1 0,4mmol/L) ; (cf. figure 146).
Triglycrides (mmol/L)

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Solvant EGCG PP Exercice ND HFD

Figure 146 : Taux de triglycrides plasmatique en mmol/L, chez des rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; Triglycridmie ND solvant versus triglycridmie HFD solvant, (n=5), t-test. NS ; Triglycridmie ND solvant versus triglycridmie ND EGCG / PP / Exercice, (n=5), t-test. NS ; Triglycridmie HFD solvant (n=4) versus triglycridmie HFD EGCG / PP /exercice, (n=5), t-test.

171

De plus, les rsultats obtenus chez les rats ND montrent que les traitements antioxydants et lexercice ne diminuent pas significativement le taux de triglycrides (EGCG : 1,8 0,4mmol/L ; PP : 1,5 0,4mmol/L ; exercice : 1,1 0,mmol/L). Chez les rats HFD, les traitements et lexercice ne modifient pas le taux de triglycrides (EGCG : 1,9 0,3mmol/L ; PP : 1,7 0,3mmol/L ; exercice 2,1 0,3mmol/L) par rapport aux rats tmoins HFD solvant (2,1 0,4mmol/L). h) Dosage de la protine C-ractive

Avant ladministration des diffrents rgimes, le taux de protine C-ractive (CRP, protein C-reactive ) chez les rats est de 226,16 12,49mg/mL. Aprs deux mois de rgime alimentaire, les animaux HFD prsentent une CRP de 45,77 6,44mg/mL qui nest pas significativement augmente par rapport aux animaux ND (221,55 20,47mg/mL) ; (cf. figure 147).
300

Protine C ractive (g/mL)

250 200 150 100 50 0 ND HFD

Figure 147 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 2 mois.

NS ; CRP des rats ND versus CRP des rats HFD, (n=3), t-test. Lorsque les animaux sont nourris par lalimentation HFD pendant mois, les rats ne prsentent pas daugmentation significative de la CRP (47,6 10,67mg/mL) par rapport aux rats ND solvant (230,39 24,35mg/mL) ; (cf. figure 148). Les animaux ND, quils reoivent pendant un mois de lEGCG, des PP ou quils pratiquent un exercice physique, ne prsentent pas de variations significatives du taux de CRP par rapport aux rats ND solvant (230,39 24,35mg/mL), qui est respectivement 247,98 23,42mg/mL, 254,85 8,41mg/mL et 236,77 19,34mg/mL. En revanche, chez les rats nourris par lalimentation HFD, ceux recevant lEGCG ont un taux moyen de CRP (205,83 14,53mg/mL) qui est significativement diminu (p < 0,01) par rapport aux rats HFD solvant (247,6 10,67mg/mL). Les PP nont, quant eux, pas deffet significatif sur la CRP (240,86 9,87mg/mL) (222,86 2,47mg/mL). 172 tandis que lexercice semble diminuer le taux de CRP

300

Protine C ractive (g/mL)

250

**
200
ND

150 100 50 0 Solvant EGCG PP Exercice

HFD

Figure 148 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 3 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 1 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats HFD solvant, (n=3), t-test. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats ND EGCG / PP / Exercice, (n=3), t-test. ** : p < 0,01 ; CRP des rats HFD solvant versus CRP des rats HFD EGCG / PP /exercice, (n=3), t-test.

Aprs 4 mois de rgime alimentaire, les rats HFD solvant ont une CRP de 244,87 20,16mg/mL, qui est similaire celle des rats nourris par lalimentation ND et recevant le solvant (239,26 18,15mg/mL) ; (cf. figure 149). Chez les rats ND, un traitement par de lEGCG, des PP ou lactivit physique, pendant mois, ninduit pas de modification du taux de CRP chez ces animaux (EGCG : 200,43 24,79mg/mL ; PP : 216,11 27,69mg/mL ; exercice : 231,45 1,19mg/mL). Aucune variation notable nest galement observe chez les animaux HFD quils reoivent de lEGCG (7,4 15,1mg/mL), des PP (48,71 7,98mg/mL) ou quils fassent de lexercice (224,95 33,28mg/mL) par rapport aux rats HFD solvant.
300

Protine C ractive (g/mL)

250 200
ND

150 100 50 0 Solvant EGCG PP Exercice

HFD

Figure 149 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 4 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 2 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats HFD solvant, (n=3), t-test. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats ND EGCG / PP / Exercice, (n=3), t-test. NS ; CRP des rats HFD solvant versus CRP des rats HFD EGCG / PP /exercice, (n=3), t-test.

173

Lorsque les rats reoivent lalimentation HFD pendant 5 mois, et le solvant pendant mois, leur taux moyen de CRP (224,95 17,64mg/mL) nest pas diffrent de celui des rats ND solvant (221,96 20,97mg/mL) ; (cf. figure 150). Les animaux ND recevant lEGCG, les PP ou faisant de lexercice ne prsentent pas non plus de modification de leur taux de CRP par rapport aux rats ND solvant qui est de 221,96 20,97mg/mL (EGCG : 229,45 32,14mg/mL ; PP : 222,04 20,72mg/mL ; exercice : 217,79 30,45mg/mL). Le mme constat est galement fait chez les rats HFD (EGCG : 241,88 11,78mg/mL ; PP : 234,89 13,35mg/mL ; exercice :

243,93 10,73mg/mL) par rapport aux rats HFD solvant.

300

Protine C ractive (g/mL)

250 200
ND

150 100 50 0 Solvant EGCG PP Exercice

HFD

Figure 150 : Taux de CRP plasmatique en g/mL, de rats soumis pendant 5 mois aux rgimes ND ou HFD et pendant 3 mois aux antioxydants ou lexercice. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats HFD solvant, (n=3), t-test. NS ; CRP des rats ND solvant versus CRP des rats ND EGCG / PP / Exercice, (n=3), t-test. NS ; CRP des rats HFD solvant versus CRP des rats HFD EGCG / PP /exercice, (n=3), t-test.

3.

Complications cardiovasculaires : dpt de plaques dathrome dans laorte

Aprs 2 mois de rgime alimentaire ND ou HFD, nous avons voulu voir si des plaques de lipides se dposaient dans les vaisseaux de nos animaux, en particulier chez les rats HFD, par coloration des aortes au rouge Sudan IV. Les rats ND ne prsentent pas de plaques dathrome dans laorte, ce qui est caractris par labsence de plaque rouge. Les animaux nourris par le rgime HFD ne prsentent pas non plus de plaques rouges (cf. figure 151).

174

Figure 151 : Photographies d'aortes colores au rouge Sudan IV, de rats nourris pendant 2 mois par les rgimes ND ou HFD. Les photographies ont t prises directement sur la boite de Ptri glose (ND : A et HFD : B) ou sous loupe binoculaire (ND : C et HFD : D).

Aprs 5 mois de rgime alimentaire, les rats soumis au rgime HFD ne prsentent pas de plaques rouges dans les aortes comme les rats ND (cf. figure 152). De plus, des rsultats similaires sont observs pour les temps dtude intermdiaires.

Figure 152 : Photographies d'aortes colores au rouge Sudan IV, de rats nourris pendant 5 mois par les rgimes ND (gauche) ou HFD (droite).

175

4.

Complication hpatique a) tude de la masse des foies

Aprs chaque sacrifice, les foies des rats ont t pess et rapports la masse de lanimal. Les rats nourris par lalimentation HFD pendant deux mois ont la mme masse du foie (3,9 0,7%) que les rats nourris par lalimentation ND (4,0 0,4%) ; (cf. figure 153).
Masse du foie (% de la masse de l'animal)
5 4 3 2 1 0 ND HFD

Figure 153 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 2 mois.

NS ; % de masse du foie de rat ND (n=5) % de masse du foie de rat HFD (n=4), t-test.

En revanche, aprs trois mois de rgime hypercalorique ou normocalorique, la masse de foie des rats HFD est augmente de faon significative 3,7 0,4% (p < 0,05) par rapport au tmoin ND dont la masse nest que de ,0 0,% (cf. figure 154). Les antioxydants et lactivit physique nont pas dincidence sur la masse du foie chez les animaux tmoins ND. En revanche, les polyphnols augmentent de faon significative la masse du foie des animaux HFD (3,6 0,1% ; p < 0,001) par rapport aux animaux tmoins ND + PP (,0 0,1%). Lexercice quand lui, diminue significativement la masse du foie des animaux HFD qui nest plus que de , 0,% par rapport aux animaux HFD ne recevant que le solvant (3,7 0,4%).
Masse du foie (% de la masse de l'animal)
4

***
#

ND HFD

0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 154 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 3 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant un mois. * : p < 0,05 ; Masse du foie de rat ND solvant versus masse du foie de rat HFD solvant (n=5), t-test. *** : p < 0,001 ; Masse du foie de rat ND + PP versus masse du foie de rat HFD + PP (n=5), t-test. # : p < 0,05 ; Masse du foie de rat HFD solvant versus masse du foie de rat HFD + Exercice (n=5), t-test.

176

Lorsque les animaux sont soumis 4 mois de rgime alimentaire ND ou HFD, la masse du foie total mesure lors du sacrifice est significativement augmente chez les animaux HFD solvant (3,5 0,2% ; p < 0,05) alors quelle nest que de ,1 0,% chez les animaux tmoins ND solvant (cf. figure 155).
Masse du foie (% de la masse de l'animal)
4

*
3

ND HFD

0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 155 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 4 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant 2 mois. * : p < 0,05 ; Masse du foie de rat ND solvant versus masse du foie de rat HFD solvant (n=5), t-test. * : p < 0,05 ; Masse du foie de rat ND + Exercice versus masse du foie de rat HFD + exercice (n=5), t-test. NS ; Masse du foie de rat HFD solvant versus masse du foie de rat HFD EGCG / PP / exercice (n=5), t-test.

Les antioxydants utiliss ne modifient pas la masse du foie des animaux ND solvant et HFD solvant, mais une augmentation significative de la masse du foie des rats soumis au rgime hypercalorique et lexercice est observe (,5 0,4% ; p < 0,05) par rapport aux rats ND soumis ce mme exercice (3,0 0,2%). A la fin de ltude, les animaux ne prsentent pas de modification de leur masse du foie quils soient soumis un rgime ND ou HFD, en prsence ou non dantioxydants, pratiquant ou non une activit physique (cf. figure 156). En effet, celle-ci reprsente environ 3% de la masse totale de chaque rat.
5

Masse du foie (% de la masse de l'animal)

4 3
ND

2 1 0 Solvant EGCG PP Exercice

HFD

Figure 156 : Masse du foie total rapporte la masse des rats soumis un rgime ND ou HFD pendant 5 mois et un traitement par des antioxydants ou la pratique dun exercice physique pendant 3 mois.

NS ; (n=5), t-test. 177

b)

tude histologique par la coloration Hmatoxyline / osine

Ltude histologique du foie a t ralise par la coloration HE et la statose est value par le systme de score dfini par Kleiner et al. (2005). Au dbut de ltude, avant ladministration des rgimes alimentaires, les hpatocytes des rats ne prsentent pas de gouttelettes de lipides (cf. figure 157). Le score de statose est de 0.

Figure 157 : Photographies de coupes histologiques du foie de rats avant l'administration des rgimes.

Les animaux suivant le rgime ND pendant deux mois ne prsentent pas de statose (cf. figure 158 A) contrairement aux animaux nourris par le rgime HFD (cf. figure 158 B). Cette statose reprsente entre 33 et 66% du tissu ce qui correspond un score de 2. A B

Figure 158 : Photographies de coupes histologiques de foie de rats colores la HE soumis aux rgimes ND ou HFD pendant 2 mois. Les rats ont t nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant deux mois.

Aprs 3 mois de rgime alimentaire ND, les animaux ne prsentent pas de statose hpatique (cf. figure 159 A), de mme que les animaux ND recevant soit lEGCG, soit les polyphnols de vin rouge, ou pratiquant une activit physique quotidienne (rsultats non montrs) pendant un mois. Cependant, les animaux recevant lalimentation HFD montrent des gonflements des hpatocytes, donc de la statose sur plus de 2/3 de la lame soit un score de statose de 3 (cf. figure 159 B). Le traitement par de lEGCG pendant un mois chez les animaux HFD ne modifie pas laspect histologique du tissu hpatique, les hpatocytes sont gonfls et prsentent des vacuoles de lipides.

178

Le rsultat est similaire ce qui a t obtenu pour le tissu hpatique de rats soumis au rgime HFD tmoin (solvant), le score pour cette coupe tant de 3 (cf. figure 159 C). A B

Figure 159 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 3 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant un mois. Les rats ont t nourris pendant 3 mois au rgime ND (A) ou HFD (B), et ces derniers ont reu pendant un mois, de lEGCG (C), des PP (D) ou ont pratiqu un exercice (E).

Lorsque les animaux reoivent des polyphnols de vin rouge pendant un mois en plus de lalimentation HFD, le tissu prsente de rares gonflements dhpatocytes, la statose est prsente mais dans une proportion comprise entre 5 et 33% (score 1) ; (cf. figure 159 D). Un rsultat similaire est obtenu pour les animaux pratiquant une activit physique avec un rgime HFD, la statose est fortement rduite (entre 5 et 33%) et correspond un score de 1 (cf. figure 159 F).

Lorsque les animaux sont soumis 4 mois de rgime ND, la statose est absente (score 0) et les hpatocytes sont dun point de vue histologique normaux (cf. figure 160 A). En revanche, lorsquils sont nourris par lalimentation HFD, plus de 66% de statose est prsente dans le tissu hpatique, ce qui correspond un score de 3 (cf. figure 160 B). Les animaux ND recevant les antioxydants ou faisant de lexercice pendant mois, ne prsentent pas de modifications du tissu hpatique par rapport aux rats tmoins ND solvant (rsultats non montrs). Lorsque ce sont les rats HFD qui reoivent les antioxydants ou qui pratiquent lexercice physique, aucune diffrence nest observe dans le tissu hpatique par rapport celui des rats HFD tmoins solvant (cf. figure 160 B). Les hpatocytes apparaissent gonfls avec des vacuoles de lipides que ce soit en prsence dEGCG

179

(cf. figure 160 C), de PP (cf. figure 160 D) ou dexercice (cf. figure 160 E). Pour ces trois conditions, le score de statose est de 3. A B

Figure 160 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant 2 mois. Les rats ont t nourris pendant 4 mois au rgime ND (A) ou HFD (B), et ces derniers ont reu pendant 2 mois, de lEGCG (C), des PP (D) ou ont pratiqu un exercice (E).

Lorsque les animaux sont soumis 5 mois de rgime ND, aucune statose nest visible pour les animaux de ce groupe (cf. figure 161 A). A B

Figure 161 : Photographies de coupes de foie de rats colores la HE et nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et ayant reu des antioxydants ou pratiquant une activit physique pendant 3 mois. Les rats ont t nourris pendant 5 mois au rgime ND (A) ou HFD (B), et ces derniers ont reu pendant 3 mois, de lEGCG (C), des PP (D) ou ont pratiqu un exercice (E).

180

Des rsultats similaires sont observs pour les animaux ND traits par lEGCG, les PP ou pratiquant une activit physique par rapport aux rats ND solvant (rsultats non montrs). Cependant, lorsque les animaux sont soumis au rgime HFD, la statose est prsente plus de 66% sur la lame (cf. figure 161 B). Les diffrents traitements (EGCG et PP) ainsi que lexercice, nont aucun effet sur le dveloppement de la statose (cf. figure 161 C, D et E) par rapport aux rats HFD solvant ; le score de statose pour ces trois conditions est de 3. Rcapitulatifs des scores de statose obtenus au cours de ltude : Au cours de ltude, les rats ND ne dveloppent pas de statose, au contraire des rats HFD, dont le score de statose est de 2, aprs 2 mois de rgime hypercalorique (cf. figure 162). Cette statose volue et devient diffuse sur tout le tissu hpatique aprs 3 mois de rgime, pour atteindre un score de 3.

Temps du rgime alimentaire Temps Antioxydants / exercice

ND + eau / solvant ND + EGCG ND + PP ND + Exercice HFD + eau / solvant HFD + EGCG HFD + PP HFD + Exercice

0 mois /
0 / / / / / / /

2 mois /
0 / / / 2 / / /

3 mois 1 mois
0 0 0 0 3 3 1 1

4 mois 2 mois
0 0 0 0 3 3 3 3

5 mois 3 mois
0 0 0 0 3 3 3 3

Figure 162 : Scores de statose hpatique obtenus chez les rats au cours de l'tude.

181

c)

Marquage du foie la DHE

Lvaluation du stress oxydant dans le foie a t ralise par la sonde DHE. Les rsultats montrent que les rats soumis au rgime HFD pendant 2 mois, prsentent une fluorescence rougetre des noyaux la DHE (111,50 38,48%) similaire celle des rats ND (100%) ; (cf. figure 163). Des diffrences visuelles existent entre les marquages du pancras des rats HFD (cf. figure 163 B) et des rats ND (cf. figure 16 A). Cependant, ces diffrences ne sont pas significatives lors de lanalyse de fluorescence sur un nombre dchantillon gal . A B

200
Fluorescence (% tmoin)

150 100 50 0 ND HFD

Figure 163 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND (A) ou HFD (B) pendant 2 mois. NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test.

182

Lorsque les animaux reoivent pendant mois lalimentation HFD, lintensit de fluorescence de la DHE (95,89 14,80%) est similaire celle des rats ND solvant (100%) ; (cf. figure 164). Le traitement des animaux ND par les antioxydants ne modifie pas de faon significative la fluorescence (EGCG : 94,98 16,77% ; PP : 121,06 22,74%) par rapport aux rats ND solvant. En revanche, lexercice induit une augmentation significative de la fluorescence (147,99 24,70% ; p < 0,05) par rapport au rats ND solvant. Dans le groupe de rats nourris par lalimentation HFD, quel que soit le traitement administr, lanalyse de la fluorescence des hpatocytes de ces animaux ne donne pas de rsultats significativement diffrents de ceux obtenus pour les rats HFD solvant (EGCG : 158,61 49,27% ; PP : 100,87 7,04% ; exercice : 146,78 78,5%). Dun point de vue qualitatif, les PP semblent diminuer la fluorescence (cf. figure 164 D) par rapport aux rats HFD solvant (cf. figure 164 B). LEGCG et lexercice semblent au contraire augmenter la fluorescence du tissu (cf. figure 164 C et E, respectivement).

250

Fluorescence (% tmoin)

200 150 100 50 0 Solvant EGCG PP

Exercice

Figure 164 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 3 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 1 mois. Rats ND (A), HFD (B), HFD + EGCG (C), HFD + PP (D) et HFD + Exercice (E). NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. $ : p < 0,05 ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

183

Aprs 4 mois de rgime HFD, lintensit de fluorescence de la DHE (10,4 26,92%) est similaire celle des rats ND (100%) ; (cf. figure 165, 165 B et A, respectivement). Dans le groupe des rats ND, lexercice physique induit une augmentation significative de la fluorescence (165,24 36,59%) par rapport aux rats ND solvant alors que les antioxydants ne modifient pas de faon significative cette fluorescence (EGCG : 132,08 22,15% ; PP : 161,93 51,04%). Chez les rats HFD, aucun des traitements utiliss ne semble modifier la fluorescence observe dans le tissu hpatique (EGCG : 10,7, 69 35,74% ; PP : 83,18 20,64% ; exercice : 94,28 7,08%) par rapport aux rats HFD solvant (103,43 26,92%). En revanche, dun point de vue qualitatif, les photographie semble montrer une diminution de la fluorescence du tissu en prsence de PP (cf. figure 165 D) contrairement au traitement par lEGCG (cf. figure 165 C) et par lexercice (cf. figure 165 E). A B C D E

250

Fluorescence (% tmoin)

$
200

150

100

50

0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 165 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 4 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 2 mois. Rats ND (A), HFD (B), HFD + EGCG (C), HFD + PP (D) et HFD + Exercice (E). NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. $ : p < 0,05 ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

184

A la fin de ltude, aprs 5 mois de rgime HFD, les rats ne prsentent pas de modification significative de la fluorescence due la DHE dans les hpatocytes (92,12 20,33%) par rapport aux rats ND (100%) ; (cf. figure 166). De plus, dans le groupe ND, le traitement par les PP augmente significativement la fluorescence (134,21 8,83%) par rapport aux rats ND solvant. Lexercice et lEGCG nont pas deffet sur celle-ci. Enfin, chez les rats HFD, aucun traitement ninduit de modification de fluorescence des hpatocytes des rats de ces groupes (EGCG : 115,06 25,23% ; PP : 102,61 21,87% ; exercice : 76,87 12,86) par rapport au solvant (92,12 20,33%). Ces donnes sont en accord avec ce qui a t observ dun point de vue qualitatif : que les rats HFD reoivent le solvant (cf. figure 166 B), lEGCG (cf. figure 166 C), les PP (cf. figure 166 D) ou pratiquent une activit (cf. figure 166 E), la fluorescence ne semble pas modifie. A B C D E

200

Fluorescence (% tmoin)

150

$$

100

50

0 Solvant EGCG PP Exercice

Figure 166 : Quantification de la sonde DHE en % sur des coupes de foie de rats nourris par alimentation ND ou HFD pendant 5 mois et traits par les antioxydants ou lexercice, pendant 3 mois. NS ; Fluorescence ND versus fluorescence HFD, (n=3), t-test. $$ : p < 0,01 ; Fluorescence ND solvant versus fluorescence ND EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test. NS ; Fluorescence HFD solvant versus fluorescence HFD EGCG / PP / exercice, (n=3), t-test.

185

Discussion in vitro
Les rsultats de viabilit des cellules RINm5F obtenus en prsence de trois molcules chimiques diffrentes et mesurs par la technique du Cell Titer, ont permis dtablir trois modles distincts de stress oxydant sur les cellules de rat. Ainsi, que lapport de molcules oxydantes soit direct comme avec le peroxyde dhydrogne H2O2 ou lanion superoxyde gnr par le couple enzyme substrat hypoxanthine / xanthine oxydase, ou que la gnration dentit oxydante au niveau mitochondrial soit induite par lajout dun compos comme la streptozotocine (antibiotique et anticancreux), des pertes de viabilit importantes ont t mises en vidence sur les cellules RINm5F des concentrations et des temps dincubation diffrents. Ainsi, le premier modle de stress oxydant a t dfini par lajout de 40mol/L de peroxyde dhydrogne pendant 0 minutes sur les cellules modle de cellules pancratiques de rat RINm5F. Sur un autre de rat (INS-1), Lee et al. (2008) ont utilis une dose plus forte, soit 200mol/L

de peroxyde dhydrogne pendant deux heures pour obtenir une mort cellulaire similaire ce que nous avons obtenu. De mme que Kimoto et al. (00) ont induit une perte de viabilit de cellules de souris (MIN-6) de 30% environ, en incubant les cellules pendant six heures avec 150mol/L alors que Rasilainen et al. (2002) ont obtenu des rsultats similaires aux ntres pour des doses de 50 et 100mol/L de peroxyde dhydrogne pendant une heure. Ces donnes semblent souligner lextrme sensibilit des RINm5F au peroxyde dhydrogne pour des doses et des temps dincubation variables. Le second modle de stress oxydant est dfini par 5mmol/L de STZ, pendant deux heures. Les donnes de la littrature ont montr que sur les RINm5F, dautres conditions de stress avec des doses plus faibles (5 et 10mmol/L) sur des temps plus long (24 heures), induisaient une perte de viabilit similaire ce que nous avons obtenus (Latha et al., 2004 ; Kang et al., 2007). Enfin, le troisime modle de stress oxydant mis en place est induit par 0,5mmol/L dHX couple 10mU/mL de XO, pendant une heure. Moriscot et al. (2003) ont utilis des concentrations similaires en HX et XO pour induire un stress oxydant sur les cellules INS-1. Ces rsultats sont galement en accord avec ceux obtenus par Tiedge et al. (1998).

Par ailleurs, cinq antioxydants, extraits ou molcules synthtiques, ont t choisis afin dtudier leur effet sur les cellules RINm5F. Le choix des molcules antioxydantes sest port sur : un extrait de polyphnols de vin rouge de Corbires (AOC), lpigallocatchine gallate, compos majeur du th vert, le resvratrol trans et son stroisomre cis, et la procyanidine B2. A faible concentration, les cinq antioxydants ont un effet positif sur la prolifration des cellules et/ou 186

sur lactivit mitochondriale des cellules RINm5F. En effet, une augmentation de la viabilit des cellules a t observe pour les PP jusqu 00g/mL et pour le Rt et le Rc jusqu 00mol/L. Kristl et al. (009) ont montr quavec de faibles concentrations en resvratrol, les capacits antioxydantes de cellules HEK293 taient amliores. En effet, au-del de ces concentrations, une perte de viabilit significative a t observe pouvant aller jusqu 80% de perte des cellules. A ces fortes doses, les molcules sont devenues pro-oxydantes, ce qui souligne le postulat que tout antioxydant ou molcule peut devenir pro-oxydant ou toxique si les doses utilises sont trop importantes. Ainsi, des tudes ont montr que certaines vitamines antioxydantes ou des polyphnols pouvaient avoir des effets pro-oxydants. Chedea et al. (010) ont soulign leffet pro-oxydant dun extrait de ppin de raisin en fonction de la dose et de la dure de ltude. Dautre part, Frankel et al., (1997) ont dmontr que de fortes concentrations en extrait de th vert induisaient une prooxydation. Enfin, les rsultats de Barbehenn et al. (2005) sur le tractus digestif de certains insectes, montrent quen prsence de mtaux de transition non absorbs et de hautes concentrations en phnols ingrs, des effets pro-oxydants sont induits. Cependant, pour la procyanidine B2 et lEGCG du th vert, aucune perte de viabilit na t dmontre dans notre tude. Pourtant, Suh et al. (2010) ont montr que des concentrations en EGCG comprises entre 5 et 100mol/L (2,3g/mL et 45,8g/mL) induisaient une perte de viabilit sur une ligne de cellules de hamster (HIT-T15). Yin et al. (2009) ont galement montr leffet pro-oxydant toxique de lEGCG sur des cellules neuronales aprs douze heures dincubation de la molcule 100mol/L. De mme pour la procyanidine B2 qui est utilise des doses beaucoup plus faibles que celles utilises dans notre tude. En effet, Cho et al. (2009) ont montr que la procyanidine B2 faible concentration protgeait de lapoptose et du stress oxydant induit par le 4-HNE (4-Hydroxynonenal), un lipide peroxyd, sur des cellules nerveuses PC12. Il semblerait que les RINm5F soient tolrantes ou rsistantes ces deux molcules, mme fortes concentrations, contrairement aux autres lignes cites.

Aprs avoir dtermin les gammes de concentration en antioxydants utiliser, ltude du pouvoir antioxydant des molcules a t ralise sur les RINm5F. Ltude des cinq molcules antioxydantes sur les trois modles de stress tablis a dmontr dune part, leffet prventif majeur de lextrait de polyphnols de vin rouge et de lextrait de th vert (EGCG) sur la viabilit des cellules RINm5F ; et dautre part, un effet moindre des trois autres antioxydants tests : le resvratrol cis et trans et la procyanidine B2. Les extraits de polyphnols utiliss contiennent dj du resvratrol (cis et trans) et de la procyanidine, mais cest la diversit et la richesse du mlange qui montre des effets plus importants sur les cellules. Ces donnes sont en accord avec la littrature car, dans lathrosclrose, Khan et al. (2002) ont montr quun extrait de polyphnols de vin rouge 187

pouvait rduire le dveloppement de cette pathologie de faon plus importante que les autres antioxydants du vin rouge tests seuls (anthocyanines, catchines, resvratrol et querctine). De plus, en 2000, Tedesco et al. ont montr quun extrait de vin rouge vieilli en ft de chne avait un effet protecteur plus important que le resvratrol et la querctine, lorsque des globules rouges taient soumis un stress oxydant par le peroxyde dhydrogne. Cela souligne le fait que les diffrents lments dun extrait peuvent produire des effets qui ne sont pas ncessairement des proprits des composants seuls et que les diffrentes classes de polyphnols ou molcules dune mme classe peuvent agir en synergie pour exercer un effet plus important. Cependant, dans le cas de lextrait de th vert, le contraire est observ. En effet, lextrait utilis est pur et contient lEGCG, qui a dmontr des effets majeurs voire suprieurs ceux de lextrait de PP. Dans ce cas-ci, leffet bnfique observ est uniquement du lEGCG. Tinahones et al. (2008) ont observ des modifications des fonctions vasculaires et une diminution de loxydation du srum, chez des femmes ayant consomm un extrait de th vert contenant 7% dEGCG et 5-10% de cafine. Dans cette tude, il a t tabli que leffet observ tait uniquement du lEGCG. Le rle important des catchines seules et en particuliers de lEGCG a galement t soulign par Coyle et al. (2008). Dans leur tude, aucun effet protecteur dun extrait de th vert na t observ sur une ligne cellulaire de la vessie stresse par le peroxyde dhydrogne, contrairement aux catchines seules et notamment lEGCG. Ces donnes soulignent la complexit de molcules et dactions, qui peut exister dans un extrait : tantt lextrait total a plus deffets que les molcules isoles de lextrait, tantt, une molcule est biologiquement plus efficace que lextrait total. Ds lors, pour la poursuite de ltude, nous avons choisi de ne garder que les deux extraits au fonctionnement, semble-t-il, oppos : les extraits de PP de vin rouge Corbires et lEGCG du th vert.

La prvention de la perte de viabilit observe avec les antioxydants en prsence des molcules induisant un stress a t dtermine par le test de viabilit au Cell Titer. Celui-ci reposant sur la mesure de lactivit de lenzyme dshydrognase mitochondriale, nous avons voulu confirmer les rsultats de viabilit par mesure de lapoptose des cellules RINm5F en prsence de molcules induisant un stress et/ou des antioxydants. La mesure de lapoptose est base sur lexternalisation des phosphatidylsrine et la fixation de lannexineV couple un fluorophore (PE). Cela devait permettre de mettre en vidence de lapoptose en prsence de stress, et une diminution de celle-ci en prsence des antioxydants. Les rsultats obtenus sur les diffrents modles de stress mis en place ne sont pas ceux attendus, car nous navons pas pu mettre en vidence de lapoptose, quelques soient les conditions. Ds lors, nous nous sommes intresss une autre technique pour mettre en vidence lapoptose des cellules. Celle-ci repose sur la mise en vidence dun processus apoptotique 188

 laide de lactivation des caspases pro-apoptotiques initiatrices que sont les caspases 8 et 9, au contraire des caspases effectrices que sont les caspases 3 et 7. La caspase 8 est normalement active par liaison dun ligand au rcepteur de la cellule (voie extrinsque). Cette caspase active par la suite la caspase effectrice de lapoptose. En revanche, la caspase 9 est recrute et active par un complexe, lapoptosome, lui-mme induit par un stress cytotoxique (voie intrinsque). Son activation dclenche galement lactivation de la caspase . Dans le cadre de ltude, nous nous sommes donc intresss aux deux caspases (8 et 9). Les rsultats prliminaires indiquent que le peroxyde dhydrogne augmente le clivage de la caspase 8 et particulirement de la 9. La prsence des antioxydants semble rduire le clivage des 2 caspases, ce qui souligne une diminution de lapoptose en prsence des antioxydants EGCG et PP. En accord avec ces rsultats, Zuo et al. (2009) ont induit un stress oxydant sur des cellules HeLa par du peroxyde dhydrogne et ont observ une augmentation du clivage de la caspase 9. Dautre part, Yao et al. (2008) ont observ une diminution du clivage de la caspase 9 induit par le peroxyde dhydrogne aprs traitement des cellules du cristallin humain par de lEGCG. Ces rsultats montrent que lintrt devra tout particulirement se porter sur cette caspase 9, car cest la voie privilgie pour induire lapoptose par des stress cyto-chimiques exognes. Tous ces rsultats dintrt doivent tre confirms par des exprimentations supplmentaires. Ayant constat un effet sur la viabilit ou lactivit mitochondriale des antioxydants sur les cellules RINm5F en prsence de molcules induisant un stress oxydant, nous avons ensuite quantifi ce stress laide dun marqueur DCFH-DA. Celui-ci est rduit en un compos fluorescent en prsence de peroxyde dhydrogne intracellulaire. En prsence dH2O2, de STZ ou dHX-XO, les cellules RINm5F produisent une plus grande quantit de peroxyde dhydrogne intracellulaire. Lorsquelles sont soumises une pr-incubation par les PP, des diffrences de rponses apparaissent en fonction du modle de stress. Ainsi, lors dun stress induit par le peroxyde dhydrogne, la prsence des PP augmente la production du peroxyde dhydrogne intracellulaire tandis que dans le modle de stress induit par la STZ, ils ne modifient pas cette production. En revanche, dans le cas du modle de stress induit par HX-XO, la quantit dH2O2 produite est diminue en prsence des PP et du stress. Cela souligne quen fonction de lentit chimique gnre par le stress sur les cellules RINm5F, la production dH2O2 intracellulaire est diffrente. Lhypothse mise est que les PP joueraient un rle de scavenger des entits oxydantes et particulirement de lanion superoxyde exogne gnr par le couple HX-XO, ce qui empcherait daugmenter la production dH2O2 intracellulaire due au stress. Cano et al. (2002) ont montr que diffrents polyphnols exercent une activit de scavenger vis--vis des anions superoxydes, ce qui a t confirm par Roussis et al., qui ont dmontr quun extrait total de vin rouge grec (Xinomavro) 189

avait une capacit scavenger importante pour le radical hydroxyle et lanion superoxyde. En ce qui concerne lEGCG, quel que soit le modle de stress mis en place, elle permet de diminuer la production intracellulaire dH2O2 due au stress. Ramadass et al. (2003) ont galement montr que lEGCG et la querctine (polyphnols du vin rouge) sont capables de prvenir laugmentation de la production intracellulaire dH2O2, induite soit par du peroxyde dhydrogne, soit par du polychlorobiphnyles sur des cellules endothliales. Cependant, Yang et al., 2000 ont dmontr que lEGCG est une source de peroxyde dhydrogne intracellulaire dans les cellules de lpithlium bronchique. Cette diminution de la production dH2O2 intracellulaire observe dans notre tude pourrait tre lie leffet scavenger de lEGCG pour le peroxyde dhydrogne (Tian et al., 2007) et plus particulirement des catchines du th vert sur lanion superoxyde (Nakagawa and Yokozawa (2002).

Sachant que les molcules induisent un stress et que les antioxydants modulent la fois la viabilit cellulaire et lapoptose, ltude sest poursuivie sur lanalyse des dfenses antioxydantes des cellules RINm5F face au stress oxydant. Dans un premier temps, lexpression des gnes du stress oxydant a t tudie par PCR arrays, que ce soit des gnes impliqus dans les dfenses antioxydantes, le mtabolisme des ROS ou dans les transporteurs de loxygne. Les rsultats ont montr des diffrences dexpression de nombreux gnes dont notamment ceux des enzymes antioxydantes catalase et superoxyde dismutase. En effet, en prsence dHX et de XO, lexpression gnique de la catalase est fortement augmente alors quen prsence de PP, cette expression est fortement diminue. Dans le cas des enzymes superoxyde dismutase, les trois formes (soluble, mitochondriale et extracellulaire) sont toutes sous-exprimes en prsence dun stress oxydant et lapport dantioxydant comme les PP permet daugmenter leur expression. A notre connaissance, ce screening des gnes du stress oxydant par PCR array, sur les RINm5F, est le premier ralis dans ce modle. Dans un second temps, nous nous sommes focaliss sur ltude de lexpression protique de deux enzymes antioxydantes CAT et SOD Mn, car cette dernire est prsente dans la mitochondrie qui est une source de ROS. Sur les trois modles de stress oxydant, lexpression des deux enzymes est trs diffrente. Lexpression de la CAT est globalement augmente en prsence des stress except pour celui induit par le peroxyde dhydrogne ; alors que celle de la SOD nest pas modifie dans le cas des stress au peroxyde dhydrogne et de lhypoxanthine/xanthine oxydase ; elle est diminue dans le cas dun stress induit par la STZ. Ces donnes sont confirmes par Kang et al. (2009). Par contre, on a pu observer quun traitement par les PP na un effet que sur le modle de stress par le peroxyde dhydrogne o lexpression de la CAT est restaure tandis que 190

celle de la SOD est diminue. Dans les deux autres conditions de stress, les PP nont en revanche pas deffet, alors que lEGCG augmente lexpression des deux enzymes (cf. figure 167).

Stress -

H2O2 PP EGCG -

STZ PP EGCG -

HX - XO PP EGCG

CAT SOD

Figure 167 : Tableau rcapitulatif de l'expression des enzymes CAT et SOD (Mn) dans les trois conditions et/ou en prsence d'antioxydants. : diminution de lexpression ; : pas de modification de lexpression ; : augmentation de lexpression. Lexpression de la CAT et de la SOD en prsence des antioxydants est compare au tmoin stress.

Lanalyse de ces donnes suggre que sous leffet dun stress, la cellule devrait palier ce stress en augmentant ses dfenses or dans le cas dun stress par le peroxyde dhydrogne, la CAT est au contraire diminue et dans le cas dun stress par lHX-XO gnrant des anions superoxydes, lexpression de la SOD nest pas modifie. Cela renforce le fait que les cellules RINm5F sont incapables de se dfendre contre le stress oxydant gnr et que lapport dantioxydants permet de les protger en augmentant les dfenses. En effet, il a t clairement mis en vidence dans ltude que les PP, dans le cas dun stress oxydant par le peroxyde dhydrogne, augmentent lactivit de la CAT mais pas celle de la SOD. Dans le cas dun stress par lHX-XO, lEGCG amliore lexpression de la SOD, ce qui est confirm par Murakami et al. (2002), mais aussi celle de la CAT pour pallier la gnration dH2O2 due la dismutation de lanion superoxyde par la SOD. Le mme profil dexpression est obtenu avec lEGCG dans un stress induit par la STZ. Les cellules RINm5F prsentant un stress oxydant amliorent leur viabilit, leur dfense antioxydante et diminuent la production de radicaux intracellulaires, en prsence dantioxydants. Dans cette dernire partie, nous nous sommes attachs regarder limpact des stress oxydants gnrs sur les macromolcules biologiques des cellules. Ainsi, dans un premier temps, la peroxydation des lipides a t mesure. Les rsultats montrent que dans les trois modles de stress, on observe une augmentation de la peroxydation lipidique, confirme par Latha et al. (STZ). La peroxydation est totalement abolie, en prsence de PP et dEGCG dans le modle de stress induit par le peroxyde dhydrogne. Par contre, lors dun stress induit par la STZ, aucun effet des antioxydants nest mis en vidence et lors dun stress induit par lHX-XO, seule lEGCG prvient la peroxydation des lipides. La technique de mesure de la peroxydation lipidique sest base sur la 191

formation dun adduit entre lacide thiobarbiturique (TBA) et le MDA. Cependant, cette technique est assez controverse puisque de nombreuses revues soulignent lhtrognit des rsultats obtenus, sappuyant sur le fait que le MDA nest pas le seul compos ragir en milieu acide et chaud avec le TBA (Gutteridge et al., 1974). Cest pourquoi certains prfrent parler de Substances ragissant avec lacide thiobarbiturique ou TBARS (Lefvre et al., 1998). Cest pour cette raison que nous avons mis en place un second test permettant de mesurer limpact du stress oxydant : la mesure des protines carbonyles. Les rsultats obtenus ne sont absolument pas interprtables ce qui remet en cause ce test. Cette quantification a t difficile mettre en place/ nous avions dans un premier temps utilis une autre mthode pour quantifier cette carbonylation, lOxyBlotTM. Celle-ci reposait sur la raction des protines carbonyles avec le DNPH (comme le kit utilis dans notre tude) puis sur lanalyse de la quantit de ces protines par Western Blot. Les rsultats taient galement ininterprtables. Cette approche dtude du stress oxydant nest sans doute pas une bonne mthode pour quantifier les protines carbonyles. Ainsi, il serait ncessaire de trouver des techniques plus spcifiques pour mettre en vidence les modifications protiques induites par le stress oxydant.

Les techniques mises en point au cours de ltude in vitro ont permis de faire un vritable screening de molcules antioxydantes et de voir leffet des molcules slectionnes dans la prvention de lapoptose et de la production dentits oxydantes mais aussi de regarder comment elles modulent lexpression des gnes et des protines impliques dans la dfense antioxydante. Enfin, cette tude a permis dapprcier limpact des antioxydants sur les consquences biologiques du stress oxydant dvelopp chez les cellules RINm5F. Ce travail a permis de dvelopper un vritable outil de screening molculaire qui pourrait sappliquer la recherche dautres molcules antioxydantes afin didentifier un compos qui pourrait avoir un meilleur effet que lEGCG ou les PP du vin rouge. Pour notre tude, nous avons slectionn deux molcules qui ont un intrt biologique de par les rsultats obtenus. Il est maintenant ncessaire de corroborer les rsultats obtenus in vitro, en testant ces deux antioxydants dintrt sur un modle de rat diabtique prsentant un stress oxydant. Cette tude a fait lobjet de la seconde partie de ma thse.

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Discussion in vivo
La discussion sera divise en deux parties : une premire partie sur la mise en place du modle diabtique et une deuxime sur leffet des antioxydants proprement dits sur ce modle de rat. Plus particulirement, cette seconde partie dtaillera les consquences des traitements, dune part sur le stress oxydant, dautre part sur le retentissement mtabolique, et enfin sur les complications hpatiques.

Mise en place du modle de rat diabtique de type 2

Le modle de rat diabtique qui a t dvelopp au laboratoire pour tester les antioxydants, est bas sur ladministration ad libitum dune alimentation hypercalorique High Fat Diet (HFD), pendant sept mois. Les rsultats de la mise en place de ce modle montrent que les animaux nourris par le rgime HFD prennent du poids de faon constante tout au long de ltude, traduisant dune obsit par rapport aux rats tmoins Normal Diet (ND). De plus, ces animaux prsentent un hyperinsulinisme marqu ds deux mois de rgime alimentaire, qui est li laugmentation du nombre de gros lots prsents dans le tissu pancratique. Ces donnes sont en accord avec la littrature car Raffaella et al. (2008) a identifi chez des rats mles Wistar adultes nourris pendant 7 semaines par de lalimentation HFD, la prsence dune obsit, associe une insulino-rsistance. De plus, les rats HFD prsentent une hyperglycmie qui apparat de manire progressive. Dautre part, une des consquences de ce rgime alimentaire est le dveloppement dune statose hpatique non alcoolique (NASH), qui est prsente sur plus de 66% du tissu. Cette NASH, de type microvsiculaire, est associe une accumulation de lipides et plus particulirement de triglycrides dans le cytoplasme des hpatocytes, et est rversible tant quelle ne prsente pas de phnomne inflammatoire. Bien quil existe dautres techniques pour induire un diabte de type chez le rat (injection de streptozotocine aprs rgime HFD, Zhang et al. (2003)), Lieber et al. (2004) ont galement mis au point un modle de rat dveloppant une statose hpatique par ladministration dune alimentation hypercalorique des rats Sprague-Dawley. Ces animaux prsentaient galement une insulino-rsistance. Pour rsumer, aprs deux mois de rgime alimentaire HFD, les rats deviennent obses, insulinorsistants et dveloppent une statose hpatique non alcoolique (cf. figure 168). Un modle similaire a t dcrit par Shen et al. (2007). Leurs rats Sprague Dawley aliments pendant 10 semaines par une alimentation HFD, deviennent obses et prsentent des troubles lipidiques. Ils ont 193

galement remarqu que des marqueurs du stress oxydant comme les enzymes antioxydantes SOD et glutathion peroxydase taient fortement diminues dans le plasma, concluant que le modle dvelopp par administration dune alimentation HFD induit un stress oxydant. Ainsi, dans le cas de notre tude, nos rats intolrants au glucose qui deviennent diabtiques, devraient reprsenter un bon modle de stress oxydant. Cest sur ce modle ainsi tabli que leffet des antioxydants EGCG et PP est test, ainsi que leffet dune activit physique quotidienne.

Rgimes

ND

HFD

Hyperglycmie Hyperinsulinisme = insulinorsistance Obsit Statose hpatique Stress oxydant

Figure 168 : Rcapitulatif des caractristiques d'un modle de rat diabtique de type 2, prsentant un stress oxydant et une statose hpatique, dvelopp au laboratoire.

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Etude des effets des antioxydants et de lexercice sur le modle dvelopp Effets sur le stress oxydant Dans une premire phase, les effets du rgime, des antioxydants et de lexercice ont t tests sur le dveloppement du stress oxydant. Les rsultats de la mesure des lipides peroxyds et des protines carbonyles montrent, dune part, que les animaux ds leur arrive, ont un taux de lipides peroxyds lev qui diminue aprs 2 mois de rgime ND. Cependant, la quantit de lipides oxyds et de protines carbonyles augmente lgrement pendant la dure de ltude. Il semblerait que ces observations soient en accord avec la littrature car Hashimoto et al. (2001) ont montr une augmentation des lipides oxyds plus importante chez des rats gs de 20 et 100 semaines par rapport des rats de 3 semaines. Notre tude tant mene sur 5 mois, les rats ND pourraient prsenter une augmentation des lipides oxyds en raison de lge des animaux. Concernant les rats recevant lalimentation HFD, ceux-ci dveloppent un stress oxydant progressif jusqu 4 mois de rgime alimentaire. En effet, le taux de lipides peroxyds et de protines carbonyles prsent dans le plasma est croissant du 2me au 4me mois dtude et est bien plus lev que pour les animaux ND (cf. figure 169 A). Des rsultats similaires ont t observs par Cederberg et al. (2001) sur un autre modle de rats diabtiques (rats Sprague Dawley ayant reu une injection de STZ). En revanche, au del de ces temps dtude, les animaux HFD semblent revenir des taux de protines carbonyles et de lipides peroxyds proches de ceux des animaux ND. Il y aurait une diminution de ces marqueurs au cours du temps chez les animaux HFD. A notre connaissance aucune donne de la littrature ne reporte une telle observation sur ce modle animal. Ladministration dEGCG 50mg/kg/jour, pendant un mois, aux animaux HFD, diminue le stress oxydant par diminution du taux de lipides peroxyds et de protines carbonyles. Des rsultats similaires et dose-dpendants ont t observs sur la diminution de la peroxydation lipidique par Yamabe et al. (006) mais sur un autre modle de rats diabtiques. Les rats recevaient de lEGCG pendant 50 jours des doses comprises entre 5 et 100 mg/kg/jour. LEGCG aurait donc un effet prventif sur ce paramtre aprs un mois dadministration. Cet effet sur les lipides peroxyds est maintenu aprs deux mois dadministration de lantioxydant. Cependant, partir de 3 mois, plus aucun effet nest observ par rapport au animaux HFD solvant. Cela peut sexpliquer par le fait que les animaux HFD solvant prsentent eux-mmes une diminution du stress oxydant, sans doute due leffet du solvant. En ce qui concerne les PP, 50mg/kg/jour, ils nont un effet positif que sur les lipides peroxyds 2 mois de traitement. Ces donnes sont en accord avec le modle de stress oxydant dvelopp par 195

Canali et al. (2000) par dpltion intestinale en zinc induit chez des rats, o les PP des doses de 30 60mg/jour semblent galement diminuer les lipides peroxyds. Les animaux HFD faisant de lexercice voient leurs marqueurs du stress oxydant se rduire par diminution dune part des protines carbonyles aprs un mois de traitement et dautre part, par diminution de la quantit de lipides oxyds 2 mois de traitement. Ces donnes sont en accord avec Gul et al. (2002) qui ont observ une diminution de la peroxydation lipidique chez des rats rendus diabtiques par injection de STZ et faisant de lexercice. Cependant dans notre tude, aucun effet positif plus long terme na t mis en vidence. En effet, il semblerait que les PP et lexercice augmentent le stress oxydant chez les animaux HFD par augmentation des lipides peroxyds aprs 3 mois dadministration ou de pratique de lactivit (cf. figure 169 B). Des rsultats identiques sur lhomme suggreraient que lexercice augmente les lipides peroxyds chez des patients diabtiques (Laaksonen et al., 1996). En rsum, il semblerait quaux doses utilises, les antioxydants et lexercice rduisent les marqueurs du stress oxydant de faon prcoce et court terme. Leffet est dautant plus marqu pour lEGCG qui diminue les deux marqueurs de faon concomitante, tandis que lexercice semble avoir un effet galement sur les deux marqueurs mais des temps diffrs. Enfin, les PP ne semblent rduire quun seul marqueur un temps donn avant de devenir potentiellement prooxydants. Cet effet oppos est galement retrouv aprs mois de traitement par lEGCG ou lexercice (cf. figure 169 B). A Temps (mois) de rgime lipides oxyds protines carbonyles B Rgime HFD (mois) Antioxydants / exercice (mois) Lipides oxyds Protines carbonyles HFD + EGCG 3 1 4 2 5 3 3 1 HFD + PP 4 2 5 3 HFD + Exercice 3 1 4 2 5 3 Groupe HFD compar au groupe ND 2 3 4 5

Figure 169 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur lapparition du stress oxydant chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B).

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Les flches descendantes en vert indiquent une diminution significative du paramtre tudi, une flche horizontale, une absence de modification significative du paramtre, et une flche rouge montante, une augmentation significative du paramtre tudi.

Effets sur le retentissement mtabolique

Cette diminution du stress oxydant, observe court terme, a des retentissements sur le diabte des animaux ainsi que sur une des complications associes au diabte, la statose hpatique. Tout dabord, les animaux recevant le rgime HFD dveloppent une obsit par une prise de poids massive et continue au cours de ltude. Cette augmentation de la masse corporelle est associe une augmentation de la glycmie, un hyperinsulinisme et une augmentation du taux de pro-insuline plasmatique (cf. figure 170 A). Milagro et al. (2006) ont galement montr que des rats Wistar nourris par alimentation HFD pendant 2 mois, prenaient du poids, augmentaient leur glycmie et leur insulinmie. Linstauration dune insulino-rsistance a galement t montre par Kern et al. (1990) suite 4 semaines de rgime HFD chez des rats Sprague Dawley. Le traitement des animaux HFD par de lEGCG ninduit pas de modification significative dans la prise de masse des rats (cf. figure 170 B) comme la montr Janle et al. (2005) sur des rats diabtiques ZDF avec des doses dEGCG comprises entre 50 et 15mg/kg. Cependant, cette molcule permet de diminuer lhyperinsulinisme et la glycmie aprs 1 et mois dadministration et semblerait abaisser le taux de pro-insuline. Yamabe et al. (006) ont galement montr leffet protecteur de lEGCG sur la glycmie de rats diabtiques et Bose et al. (2008) ont report une attnuation de linsulino-rsistance grce au traitement de souris diabtiques (induites par alimentation HFD) par lEGCG incluse dans lalimentation raison de ,g/kg. Les PP, quant eux, nont deffet qu 1 mois sur lhyperinsulinisme et ils ne limitent pas la prise de masse des rats HFD au cours de ltude (cf. figure 170 B). Des donnes similaires ont t obtenues par Agouni et al. (009) qui na pas observ deffet des PP sur la prise de masse de rats obses. Enfin, la pratique dune activit physique permet de diminuer la masse corporelle des rats sains (ND) mais aussi celle des rats dveloppant un diabte de type 2. Cet effet est associ une rduction de lhyperinsulinisme, de la glycmie et de lhyper-pro-insulinmie. Lactivit physique a galement montr une rduction de linsulino-rsistance de faon transitoire chez des animaux diabtiques HFD (Kern et al., 1990). Cependant, aprs 3 mois dexercice physique, son effet bnfique nest plus observ ce qui tend montrer quune activit physique sans mise en place dun rgime alimentaire appropri na quun effet limit sur le contrle mtabolique des animaux diabtiques (cf. figure 170 B).

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Les rsultats obtenus lors de ltude histologique du pancras montrent que les rats HFD prsentent un nombre de gros lots (suprieurs 30 000m) lev par rapport aux rats sains (cf. figure 170 A). Ladministration des antioxydants na pas deffet sur le nombre de gros lots au contraire de lexercice physique, qui permet de rduire ce nombre. Lhyperplasie des lots induite par lalimentation HFD semble rversible lorsque les animaux pratiquent une activit physique. La seule tude qui est en contradiction avec ces donnes est celle de Park et al., (2007) o ils ont montr que lexercice, chez des rats diabtiques par injection de STZ et faible supplmentation HFD, augmentait la masse de cellules . Cependant la mthode dinduction du diabte est diffrente entre les deux modles, ce qui pourrait expliquer les rsultats opposs obtenus. De plus, le marquage linsuline des lots ne permet pas de mettre en vidence un hyperinsulinisme de faon qualitative, chez les rats HFD. Par consquent, il est difficile de voir un quelconque effet des antioxydants ou de lexercice sur ce paramtre. La mesure du stress oxydant dans le tissu pancratique rvle une augmentation de la production de ROS intracellulaires aprs 3 et 5 mois de rgime HFD par rapport aux rats ND. Cependant, aucune modification notable de cette production de ROS intracellulaires nest observe, quel que soit le traitement utilis (EGCG, PP, exercice).

De plus, comme le modle animal dveloppe une obsit, le taux de triglycrides plasmatiques a t mesur et les rsultats montrent que le modle de rat HFD dveloppe une hypertriglycridmie au cours de ltude (cf. figure 170 A). Cette augmentation des triglycrides est diminue lorsque que les rats sont traits par des PP une dose de 50mg/kg/jour pendant un mois (cf. figure 170 B). Lorsque des doses plus faibles en EGCG sont utilises, leffet est retard. En effet, Agouni et al. (2009) ont montr que chez des rats ZDF prsentant un taux lev en triglycrides, un extrait de polyphnols de vin rouge (ProvinolsTM) 20mg/kg/jour rduisait ce taux aprs 8 semaines de traitement. Il semblerait que leffet observ soit dpendant du temps de traitement et de la dose administre. En revanche, les rats traits par lEGCG 50mg/kg/jour ne prsentent pas de diminution de la quantit de triglycrides plasmatiques. Ceci est en contradiction avec Roghani et Baluchnejadmojarad (2010) qui ont montr quune dose plus faible en EGCG (25mg/kg/jour) sur un modle de rat rendu diabtique par injection de STZ permettait de rduire cette quantit de triglycrides. Lexercice pratiqu chez les rats HFD ne permet pas quant lui, de diminuer la quantit de triglycrides plasmatiques (cf. figure 170 B).

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Enfin, des auteurs rapportent que des rats pouvaient dvelopper une athrosclrose des vaisseaux par simple alimentation HFD (Kaschina et al., 2004). En effet, Vacek et Machova (1979) ont montr que des rats Wistar dveloppaient une athrosclrose aprs 5 6 mois de rgime HFD, par coloration de sections daorte au rouge Sudan. Dans notre modle dtude, aucune plaque dathrome na pu tre mise en vidence dans les aortes des rats HFD quel que soit le temps de ltude. Cela peut sexpliquer par le fait que nos animaux ont t tudis sur une dure infrieure ou gale 5 mois.

Enfin, nous avons voulu voir si notre modle de rat diabtique prsentant un stress oxydant, dveloppait un processus inflammatoire aigu, au travers de la mesure de la protine C-ractive (CRP). Les rsultats montrent que les rats HFD ne prsentent pas de CRP augmente par rapport aux rats ND, au cours de ltude (cf. figure 170 A). De mme, les antioxydants et lexercice nont pas deffet sur la mesure de ce paramtre, except aprs un mois de traitement par lEGCG chez les rats HFD, o le taux de CRP est diminu (cf. figure 170 B). Ce rsultat semble tre en accord avec ceux de Lu et al. (2010) qui ont dmontr une baisse de la CRP chez des animaux diabtiques traits par des flavonodes. En rsum, lexercice semblerait tre le traitement ayant le plus deffets au niveau mtabolique chez les rats prsentant un hyperinsulinisme et un stress oxydant. Le second traitement prsentant galement des effets protecteurs et visibles, mais en proportion plus faible, est lEGCG administre une dose de 50mg/kg/jour. Enfin, il semblerait que les PP la mme dose que lEGCG aient un effet moindre et transitoire compars lexercice et lEGCG. Ainsi, des doses plus fortes en antioxydants administres sur des temps plus long pourraient amliorer les diffrents paramtres tudis et une combinaison de lexercice avec un traitement antioxydant pourrait galement avoir des effets plus importants que les traitements pris sparment.

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A Temps (mois) de rgime masse glycmie

Groupe HFD compar au groupe ND 2 3 4 5

C-peptide

ND

ND

pro-insulinmie

taille des gros lots triglycrides CRP

ROS intracellulaires

B Rgime HFD (mois) Antioxydants / exercice (mois) Masse Glycmie C-peptide Pro-insulinmie Taille des gros lots ROS intracellulaires Triglycrides CRP

HFD + EGCG 3 1
ND

HFD + PP 3 1
ND

HFD + Exercice 5 3
ND

4 2

5 3
ND

4 2

3 1
ND

4 2

5 3
ND

Figure 170 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur les complications mtaboliques chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B). (A) Les croix indiquent une augmentation significative du paramtre tudi. (B) Les flches descendantes en vert indiquent une diminution significative du paramtre tudi, une flche horizontale, une absence de modification significative du paramtre, et une flche rouge montante, une augmentation significative du paramtre. (ND, non dtermin).

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Effets sur les complications hpatiques La mise en place du modle dtude a montr que les rats dveloppaient une statose hpatique au cours de temps. Nous nous sommes donc intresss ce paramtre, chez nos animaux diabtiques de type 2, prsentant un stress oxydant. Les rsultats indiquent que les rats nourris par lalimentation HFD prsentent une masse de foie total plus leve aprs et 4 mois de rgime, par rapport aux rats nourris par lalimentation ND. Celle-ci est accompagne par la mise en place dune statose hpatique microvsiculaire ds 2 mois de rgime HFD, qui volue puis reste constante au cours de ltude (cf. figure 171 A). Le dveloppement dune statose hpatique a galement t mis en vidence chez des rats Sprague Dawley nourris par une alimentation HFD pendant 6 semaines (Kuzu et al., 2008). Notre tude a dmontr que lexercice et les PP ont un effet bnfique sur le dveloppement de la statose hpatique. En effet, aprs un mois de traitement, lapparition de la statose est retarde et lhistologie du tissu est quasiment similaire celle des rats tmoins (cf. figure 171 B). Les rsultats obtenus avec les PP et lexercice confirment les donnes obtenues respectivement par Feillet-Coudray et al. (2009) et par Rector et al. (008). Ils nont cependant quun effet prcoce dans cette tude. LEGCG quant elle, la dose utilise (50mg/kg/jour), ne permet pas de retarder le dveloppement de la statose. Des rsultats contradictoires ont t obtenus par Kuzu et al. (008), qui ont montr un effet protecteur de lEGCG plus forte dose (1g/L) pendant 6 semaines sur le dveloppement de la statose. Des doses suprieures en EGCG pourraient retarder lapparition de la statose. Lanalyse du stress oxydant dans le tissu hpatique na montr aucun effet du rgime HFD par rapport aux rats tmoins. Aucun effet des antioxydants et de lexercice, na galement t mis en vidence (cf. figure 171 A et B).

Pour rsum, seuls lexercice et les PP semblent retarder les effets dun rgime alimentaire HFD sur le dveloppement de la statose hpatique. Cela reste transitoire et aucun effet plus long terme nest observ. Il semblerait galement que, quel que soit le traitement administr et le rgime, ceux-ci nont pas deffet sur le dveloppement du stress oxydant dans le foie des animaux.

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A Temps (mois) de rgime masse des foies statose hpatique

Groupe HFD compar au groupe ND 2 3 4 5

ROS intracellulaires B Rgime HFD (mois) Antioxydants / exercice (mois) Masse des foies Statose hpatique ROS intracellulaires HFD + EGCG 3 1 4 2 5 3 3 1 HFD + PP 4 2 5 3 HFD + Exercice 3 1 4 2 5 3

Figure 171 : Rcapitulatif de l'effet du rgime sur les complications hpatiques chez le rat (A) et les effets des antioxydants et de lexercice sur le modle de rat HFD (B). (A) Les croix indiquent une augmentation significative du paramtre tudi. (B) Les flches descendantes en vert indiquent une diminution significative du paramtre tudi, une flche horizontale, une absence de modification significative du paramtre, et une flche rouge montante, une augmentation significative du paramtre.

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Synthse des rsultats Lanalyse globale des rsultats in vivo semble indiquer dune part, que les antioxydants agissent de faon prcoce et que sur un temps plus long, leffet oppos est observ. Dans le cas du stress oxydant, lEGCG permettrait une meilleure prvention du stress, suivie de lexercice et des PP. Concernant les complications mtaboliques, lexercice serait le meilleur moyen de prvenir les modifications engendres par lhyperinsulinisme et lhyperglycmie, suivi de lEGCG et enfin des PP. Cependant, au niveau des complications hpatiques, lEGCG na pas deffet contrairement aux PP et lexercice, mme si leffet bnfique observ est de courte dure.

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Conclusions
Le diabte est une pathologie grave qui est lie au dveloppement du stress oxydant. Ce concept de stress oxydant dcrit une situation dans laquelle la cellule ne contrle plus la prsence excessive de radicaux oxygns toxiques, situation que les chercheurs impliquent dans la plupart des maladies humaines (diabtes, cancers, inflammations, maladies neurodgnratives). De nombreuses tudes ont suggr que des composs permettaient de moduler (in vitro et in vivo) le stress oxydant impliqu dans linitiation, le dveloppement et les complications de certaines de ces maladies chroniques. Dans le cas du diabte, de nombreux composs dont des molcules antioxydantes, sont utiliss pour limiter le dveloppement du stress oxydant. Le but de cette tude tait de trouver de nouvelles approches thrapeutiques dans la prvention du diabte et de ses complications associes, en diminuant le stress oxydant dans cette pathologie. Pour cela, un screening de molcules antioxydantes a t ralis sur des cellules pancratiques de rat RINm5F, afin de slectionner le ou les meilleurs antioxydants. Ces antioxydants taient soit des composs purs comme le resvratrol cis et trans, la procyanidine B2, ou lextrait de th vert contenant majoritairement de lEGCG, soit des extraits comme lextrait de polyphnols de vin rouge. A lissue de ce screening, deux bons antioxydants ont t retenus : lextrait pur de th vert (EGCG) et lextrait de polyphnols de vin rouge. Ceux-ci ont montr avoir des effets protecteurs des cellules RINm5F soumises diffrents stress cellulaires, suivant de nombreux paramtres comme la viabilit cellulaire, lexpression des enzymes antioxydantes, les marqueurs du stress oxydant .

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Afin de corroborer ces rsultats in vitro trs prometteurs, ces deux molcules et extraits dantioxydants ont t tests sur un modle de rat rendu diabtique par administration ad libitum dune alimentation hypercalorique. Ces animaux dveloppaient au bout de mois de rgime, un hyperinsulinisme (stade en amont du diabte de type 2), une obsit, un stress oxydant et une statose hpatique. Les deux antioxydants ont t dilus dans un solvant et administrs dans leau de boisson une dose de 50mg/kg/jour. Afin de complter cette tude, un groupe danimaux a effectu pendant toute la dure de ltude une nage force ce qui reprsente notre tmoin exercice. Les rsultats obtenus pour cette tude in vivo sont assez dcevants de par lintrt port ces molcules et au vu des rsultats obtenus in vitro. Les rsultats sont assez mitigs en fonction des complications ou des marqueurs tudis. Chaque antioxydant et lexercice ont leur particularit daction et aucun na deffet positif sur tous les paramtres de faon simultane. Il semblerait que les antioxydants aient des effets transitoires (1 ou mois) et quaux doses utilises, ils prsenteraient des effets pro-oxydants plus long terme. Lexercice quant lui semble avoir des effets positifs mais nayant pas pu contrler la prise alimentaire des animaux, ceux-ci ont pu laugmenter en rponse leffort physique Cette tude a permis de dvelopper des techniques de screening et danalyse de molcules antioxydantes afin de les tester in vivo. Bien que prometteuse de par les rsultats obtenus in vitro, elle a t quelque peu dcevante et na pas permis de conclure rellement sur leffet des antioxydants ou de lexercice dans le modle de rat diabtique par alimentation hypercalorique. Cependant, il semblerait que lEGCG ait des effets intressants tout comme lexercice. Une combinaison des antioxydants et/ou de lexercice pourrait amliorer les paramtres tudis. Le schma ci-dessous rcapitule les effets obtenus in vivo court terme et sur quelques paramtres.

Vert : effet bnfique Rouge : effet dltre Noir : pas deffet

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Perspectives
Les perspectives de cette tude sont nombreuses et concernent les deux tudes. Elles peuvent sarticuler autour de quatre points : (1) Tout dabord, au niveau des rsultats de ltude in vitro. Grce aux mthodes de screening et danalyses de molcules antioxydantes mises au point au laboratoire, une des perspectives est de rechercher dautres composs ou molcules issus de lalimentation, qui pourraient avoir des effets protecteurs et prophylactiques dans la prvention du stress oxydant dans le diabte. Ainsi, il a rcemment t mis en place un projet collaboratif avec entre autre, lquipe dEric Marchioni de la Facult de Pharmacie de Strasbourg. Ce projet a pour but dvaluer le pouvoir antioxydant des fruits et lgumes cultivs en Alsace et den valider lactivit biologique dans la prvention du diabte et de ses complications. (2) Ensuite, au niveau de la mise en place de ltude in vivo. Du fait des rsultats obtenus sur les diffrents paramtres et de la grande variabilit interanimale observe au cours de ltude, il serait judicieux dans une prochaine tude daugmenter le nombre danimaux par groupe. De plus, nous avons observ que les doses dantioxydants utilises sont souvent infrieures ce qui est utilis dans la littrature. Dans le cas de lEGCG, par exemple, des tudes ont montr que des doses allant jusqu 500mg/kg/jour ntaient pas toxiques pour des rats (Isbrucker et al., 2006). Des doses plus leves seraient sans doute adquates pour observer un effet plus long terme. Enfin, du fait des rsultats particuliers obtenus et parfois propres chaque traitement, une tude combine des antioxydants et/ou de lexercice permettrait sans doute damliorer beaucoup plus de paramtres que dans ltude. Ainsi une future tude pourrait prendre en compte leffet de lexercice chez des rats HFD, en prsence dun rgime appropri (mesures hygino-dittiques) ou non.

(3) Amlioration de certains dosages. Que ce soit dans les exprimentations in vitro ou in vivo, nous nous sommes heurts diffrents problmes lis aux chantillons ou aux techniques utilises. En effet, dans ltude in vitro, lanalyse des rsultats des protines carbonyles na permis de tirer une conclusion sur ce paramtre, que ce soit par dosage ELISA (OxiSelectTM) ou par western-blot (OxyblotTM). Il serait prfrable de trouver un autre marqueur de latteinte protique ou valuer dautres paramtres du 206

stress oxydant comme la mesure de loxydation des bases nucliques (8-oxodsoxyguanosine ou 8oxoguanine). De plus, les rsultats dapoptose obtenus par cytomtrie sont prometteurs et doivent tre confirms. Dun point de vue in vivo, les rsultats de la glycmie mesure ne rendent pas compte de lquilibre glycmique. En effet, nos animaux nont pas t mis jeun ou en ralimentation au cours de ltude, il est donc difficile de pouvoir conclure sur ce paramtre. Des mesures de lHbA1c ne permettraient pas non de nous renseigner sur lquilibre glycmique, car elle mesure lquilibre sur une priode de 2 mois alors que les tudes ralises sur nos animaux ont des dures plus courtes. En revanche, le dosage de la fructosamine serait une bonne approche pour mettre en vidence une diffrence dans lquilibre glycmique entre les rats ND et HFD, puisquil prend en compte lquilibre sur semaines. Ces dosages seront prochainement raliss sur les plasmas des animaux. (4) Poursuite de ltude du stress oxydant dans dautres organes et tudier les complications vasculaires. Lanalyse du stress oxydant ralise sur les tissus devra tre confirme au niveau molculaire par ajout dun inhibiteur de ROS, le MnTMPyp (SOD mimetic manganese(III) tetrakis(1-methyl-4pyridyl)porphyrin) pour vrifier que les effets observs sont bien ds aux ROS. Ltude du stress oxydant sest focalise autour du pancras et du foie. Il serait galement intressant de regarder limpact du stress oxydant dans dautres organes atteints lors du diabte comme les yeux et les reins. Cela est possible grce la tissuthque labore au cours de ce travail. Enfin, ltude des complications cardiovasculaires pourrait tre ralise par lanalyse des marqueurs du stress oxydant dans les vaisseaux (aorte, artre fmorale et msentrique). Enfin, ltude de la dysfonction endothliale, initialement prvue dans notre travail, sera ralise. Elle pourra ainsi rendre compte de leffet dun rgime HFD sur la contraction ou relaxation des vaisseaux des animaux et de voir leffet des molcules antioxydantes et de lexercice.

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Communications
Communications orales (Grand Public) Dans le cadre de lassociation Vaincre le Diabte , chaque anne au Centre europen dtude du Diabte, les travaux en cours ont t prsents devant les bnvoles de lassociation, en vulgarisant aux mieux les termes scientifiques afin que la thmatique soit comprise de chacun : Stress oxydant et diabte (Juillet 2008)

Stress oxydant et diabte : les donnes in vitro (Juin 2009)

Stress oxydant et diabte : donnes des tudes in vivo (Juin 2010)

Communications affiches Effet antioxydant des extraits de polyphnols, de la procyanidine B2, de lpigallocatchine gallate, du resvratrol cis and trans sur des cellules RINm5F aprs un stress oxydant , Association de Langue Franaise pour l'Etude du Diabte et des Maladies Mtaboliques, Mars 2009, Strasbourg, France (Diabetes & Metabolism, March 2009, page A64) Mesures du pH et du rH du sang de rat par la mthode biolectronique de Vincent , Association de Langue Franaise pour l'Etude du Diabte et des Maladies Mtaboliques, Mars 2009, Strasbourg, France (Diabetes & Metabolism, March 2009, page A87) Antioxidant effects of polyphenols extract, procyanidin B2, epigallocatechin gallate, trans and cis resveratrol on RINm5F cells after oxidative stress , Gordon Research Conferences, Oxidative Stress and Disease, March 2009, Barga, Italia Protection des cellules

pancratiques : vers une nouvelle approche thrapeutique

antioxydante dans le diabte , Socit Francaise Dendocrinologie (SFE), octobre 2009 , dendocrinologie, page 40) Effet antioxydant des extraits de polyphnols de vin rouge et de th vert sur des cellules RINm5F aprs induction dun stress oxydant , 242 Nice, France (Anales

Socit Franaise de Diabtologie (SFD), Mars 2010, Lille, France Etude dun modle de rat rendu hyperinsulinique par une alimentation hypercalorique , N Auberval, N Jeandidier, M Pinget, S Sigrist Socit Franaise de Diabtologie (SFD), Mars 2010, Lille, France Antioxidative effect of green tea and red wine polyphenol extracts on RINm5F cells after oxidative stress induction , Europeen Society of Endocrinology (ESE), 24-28 avril 2010, Prague, Rpublique Tchque Effet antioxydant des extraits de polyphnols de vin rouge et de th vert sur des cellules RINm5F aprs induction dun stress oxydant , 5me Congrs International Gout-Nutrition-Sant VITAGORA, 23&24 mars 2010, Dijon, France

Prix Obtention du premier prix poster au 5me Congrs International Gout-Nutrition-Sant VITAGORA, 23&24 mars 2010, Dijon, France

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Valorisation des comptences, un Nouveau Chapitre de la thse

Au cours de ma troisime anne de thse, jai eu lopportunit de participer un bilan de comptences, intitul Valorisation des comptences, un nouveau chapitre de la thse . Ce programme dispens par lAssociation Bernard Grgory (ABG) sest ax autour de la dfinition des comptences techniques et transversales, de la rdaction dun CV et dun document qui a permis de synthtiser les tenants et les aboutissants de la thse, dfinie comme un projet de recherche, le mien. Cest pourquoi, je tenais ce que ce travail figure dans mon mmoire de thse. Une synthse du document a t prsente devant Madame Danile HAUG (Directrice du Service dInformation, Orientation et Emploi, reprsentante de lABG), Monsieur Bernard CHAPUS, mon mentor durant cette formation, et un directeur des ressources humaines. Je tiens remercier mon mentor pour tout son accompagnement et pour mavoir donne les outils ncessaires llaboration dun tel travail.

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Nathalie AUBERVAL
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Sant (ED 414) de Strasbourg Universit de Strasbourg Mentor : M. Bernard CHAPUS

Amlioration du statut des cellules du pancras par des antioxydants dorigine naturelle : rle du stress oxydant

Prsentation orale du NCT : le 9 juin 2010

Sujet de la thse : Protection des cellules thrapeutique antioxydante dans le diabte Directeur de thse : Dr Sverine SIGRIST Soutenance de thse : 24 septembre 2010

pancratiques : vers une nouvelle approche

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I. Le diabte, les enjeux scientifiques et la recherche.

Le diabte est une maladie silencieuse et chronique qui peut voluer sans que le patient ait conscience de sa pathologie. Dailleurs, le diabte est dj en place dj depuis 7 ans environ lorsque le diagnostic est tabli. Cette pathologie est caractrise par une augmentation persistante du taux de glucose dans le sang. Il existe deux types de diabte : le diabte de type 1 ou juvnile, il touche les enfants de plus en plus tt et est li une destruction des cellules produisant linsuline (cellules anticorps, le diabte de type 2 ou diabte de la maturit concerne en revanche souvent des personnes souffrant dobsit. Il est caractris par une mauvaise production de linsuline ou la nonreconnaissance de celle-ci par ses rcepteurs, cest linsulino-rsistance. Dans ce cas, le patient produit de plus en plus dinsuline pour rguler son hyperglycmie et cela va entraner au fur et mesure une destruction des cellules et donc une non-production dinsuline, on parle alors dinsulino-requrance ou insulino-ncessitance. En 1998, on comptait 143 millions de diabtiques dans le monde. Les prvisions pour 2025 font tat de 300 millions, dont 2,4 millions pour la France. Chaque anne 4000 nouveaux cas sont identifis en France et beaucoup dautres signorent. Lhyperglycmie qui accompagne les deux formes de diabte est quant elle responsable des complications cardiovasculaires. En effet, la forte quantit de sucre dans le sang endommage les petits et les gros vaisseaux. Ces atteintes sont appeles micro-angiopathies quand elles concernent les petits vaisseaux, les organes lss sont alors les reins, les yeux et les nerfs. Les macro-angiopathies concernent latteinte de plus gros vaisseaux comme laorte et sont responsables daccidents cardiovasculaires et dinfarctus du myocarde. De plus, dans cette pathologie, il a t dmontr que le stress oxydant, cest--dire la production anormale par le corps dentits oxydantes ou la production insuffisante de dfenses contre ces radicaux, aggrave le diabte en favorisant la production des radicaux, en perturbant linsulino-scrtion et en augmentant linsulino-rsistance. Le diabte, le stress oxydant et les complications cardio-vasculaires sont troitement lis, cest pourquoi nous avons cherch au laboratoire protger les cellules qui aggrave la pathologie. Dans la littrature scientifique, les antioxydants ont montr des effets protecteurs contre le stress oxydant et cela au niveau cardiovasculaire avec notamment comme chef de file le resvratrol, un des composants du vin rouge. En se basant sur ces tudes, nous avons choisi sur des modles de 246 contre le stress oxydant du pancras) par des auto-

stress de cellules , de tester leffet dantioxydants comme des extraits de vin rouge et de th vert. En parallle, des tudes conduites sur le petit animal consistaient administrer dans leau de boisson des antioxydants ayant montr un effet bnfique sur les cellules. Lobjectif de ce projet Stress Oxydant et DIabte (SODI) tait de dvelopper une nouvelle approche thrapeutique pour protger les cellules atteintes provoques par le diabte chez le patient. du stress oxydant et cela long terme et de pouvoir supplmenter lalimentation en composants antioxydants naturels pour allger les

II. Le projet SODI au Centre europen dtude du Diabte.

a) SODI et les collaborations
Au Centre europen dtude du Diabte, les diverses thmatiques du laboratoire sont regroupes autour du diabte et de ses complications cardiovasculaires. Le projet SODI est un projet qui a rellement dmarr en 007 avec le commencement de ma thse. Cest un projet original qui a sa place parmi ceux dvelopps au CeeD et cest le premier du Centre qui utilise des molcules dorigine naturelle. Cette thse a t dveloppe en collaboration avec Mme le Professeur V. Schini-Kerth du Dpartement de Pharmacologie et Physico-chimie de la Facult de Pharmacie de Strasbourg pour tout laspect cardiovasculaire et leurs connaissances dans le domaine du stress oxydant. Cela nous a permis dchanger des comptences techniques dans le domaine de lexprimentation animale et des tudes de molcules naturelles sur des cellules. Grce cette collaboration, ma directrice de thse et du laboratoire a initialis un projet dampleur europenne appel BIOFRUVE pour BIO-active compounds in FRUits and VEgetables . Il regroupait 10 quipes de 5 nationalits diffrentes comprenant des pidmiologistes, des biochimistes, des biologistes et des entreprises agroalimentaires : - CeeD, spcialis dans les tudes in vitro des proprits antioxydantes, les voies de signalisations et les tudes in vivo sur le contrle mtabolique, - ACTIA (Arial & WELIENCE) pour la slection des fruits et lgumes, la formulation des composs bioactifs, - CNRS, pour lextraction, le fractionnement et la caractrisation des composs bioactifs, - SNFT, un hpital britannique pour ltude clinique du comportement dittique des patients, - MRI, un centre allemand de Recherche de la Nutrition et des Sciences de lAliment, spcialis dans la dtermination des effets anti-inflammatoires et statosiques chez le rat, 247

- UNINA, une universit italienne spcialise dans la biodisponibilit et la biotransformation des aliments, - HACETTEPE, une universit turque pour la mesure de la capacit antioxydante des produits, - TUBITAK-ATAL, un institut turc menant des tudes pidmiologiques chez lhomme, - PLANTA, une PME autrichienne pour lisolation des constituants bioactifs, - HLP, une socit de consulting pour le management du projet. Lobjectif tait dvaluer leffet bnfique dune consommation de fruits et de lgumes dans la prvention du diabte et de linflammation, et de proposer de nouvelles formulations de nos aliments en privilgiant lapport dantioxydants dorigine naturelle. Le CeeD tait en charge du screening cellulaire de molcules laide de modles que javais mis au point au laboratoire. La demande de financement de ce projet avait t dpose devant la commission europenne mais le projet na malheureusement pas t accept. Enfin, en dehors de ce projet europen et comme nous ne disposions pas de tout le matriel ncessaire nos expriences, jai propos ma directrice dtablir une collaboration avec lquipe du Laboratoire dInnovation Thrapeutique dirige par le Docteur CD Muller. Cette quipe est spcialise dans le domaine de la cytomtrie en flux. Mon projet a requis cette technique, cest pourquoi nous avons eu besoin de leurs comptences et de leur savoir-faire qui sont un outil prcieux la ralisation de mon projet en particulier.

b) Pourquoi jai choisi le CeeD et SODI ?

Mon entre dans la recherche scientifique sest faite grce un coup de foudre pour une section de Sciences et Techniques de Laboratoire (STL) la fin du collge. Ds que jai vu des micro-organismes voluer sous le microscope, jai su que je voulais tre chercheur. Ds lors, jai entam un parcours long et parfois difficile au travers dtudes techniques (DUT) aprs le baccalaurat, puis plus gnral et approfondi grce au Magistre de Microbiologie et Enzymologie et au cursus Licence, Matrise et DEA que jai fait la facult des Sciences de Vanduvre-lsNancy. La prparation du doctorat a t pour moi une faon de pousser encore plus loin la recherche et lapprentissage des connaissances dans un domaine particulier (ici le diabte). Mon choix de cette entreprise et de ce sujet sest fait notamment grce mes expriences lors de divers stages dont la plupart avaient t fait dans le domaine du stress oxydant. Tout dabord, jai travaill sur les systmes de rgnration des protines contre le stress oxydant chez une bactrie puis sur des 248

cellules vasculaires en les protgeant par des molcules antioxydantes et enfin sur des cellules du pancras au CeeD.

III. SODI, la gestion et les cots.

c) Prparation et cadrage du projet
Pour ce projet, les facteurs de succs taient runis grce aux diffrents lments trouvs dans la littrature scientifique et du fait des donnes recueillies au laboratoire avant mon arrive. Il ne semblait pas prsenter de risque la fois sur le plan scientifique et financier. Comme voqu prcdemment, le projet SODI a t labor avec Mme le Professeur V. Schini-Kerth du Dpartement de Pharmacologie et Physico-chimie de la Facult de Pharmacie de Strasbourg. Sa connaissance dans le domaine cardiovasculaire, celui des polyphnols de vin rouge et son esprit critique en tant que non spcialiste du diabte, a permis dharmoniser au mieux les liens entre diabte et maladies cardiovasculaires. La thse a t finance sur les fonds propres du CeeD, cependant afin dallger les cots au laboratoire, nous avions dpos un dossier de bourse ANR (Agence Nationale de Recherche), qui malheureusement na pas t retenu. Pour ce projet, ainsi que tous ceux mens au CeeD, une chartre de confidentialit des rsultats a t signe par toutes les personnes internes au laboratoire ainsi que les stagiaires, afin dviter toute fuite de connaissances.

d) Conduite du projet
Ds mon arrive, jai t prise en charge par un post-doctorant et jai d faire un travail important de bibliographie scientifique afin de prsenter mon projet de thse incluant le matriel et les mthodes envisags, devant tout le personnel du laboratoire. Cependant, il ny avait pas de runion de projet rgulire en dehors des runions de laboratoire, il sagissait plus de courtes synthses aprs chaque exprience. Cette technique dencadrement fut malheureusement dsastreuse, nous reproduisions des exprimentations valides dans la littrature scientifique ce qui ma fait perdre prs de six mois de ma thse. Ds lors, la directrice du laboratoire a repris le projet en main pour que nous puissions avoir une chance de le mener bien et les choses se sont amliores. Nous avons alors fait des bilans rguliers (environ une fois par mois) et le travail fut bien mieux encadr. Au vu des circonstances, nous avons t obliges de focaliser ltude sur les cellules cellules diabte de type 2 chez le rat. uniquement au lieu des et des lots de Langerhans. En parallle, nous avons dbut la mise au point du modle de

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Enfin avec ma co-directrice de thse des entretiens rguliers ont t effectus (plusieurs fois par an) en dehors des petites runions de synthses.

e) Estimations des cots du projet SODI et source de financement

Le cot total dtaill de mes trois annes de thse figure en annexe 1. Elle prsente dune part le cot attribu au ressources humaines avec la participation de ma directrice de thse 10% et de moi-mme 100% de mon temps, sur une priode ans. A cela, sajoute, linvestissement dun post-doctorant 50% sur un an, dune technicienne 5% et dun animalier 0% pendant ans. Laide apporte par les diffrents stagiaires au cours de ma thse, a galement t pris en compte dans le cot total des ressources humaines qui slve 155810 euros. Les frais de fonctionnement du laboratoire incluant les frais de consommables de bureau, dexprimentations scientifiques (cnes de pipettes, tubes, anticorps) et kits de dosage (marqueurs du stress oxydant, C-peptide, insuline) ainsi que lamortissement du matriel constitue une grosse partie du cot de la thse. Il est estim dans mon cas, environ 51038 euros pour les trois ans. Au cours de ma thse, jai eu la chance de participer de nombreux congrs scientifiques nationaux et internationaux, en France et ltranger, qui mont permis entre autres choses damliorer mon anglais ! A cela sajoute les frais de formations (Equipier de Premire Intervention, Exprimentation Animale). Au total, les dplacements et formations reprsentent environ 9365 euros. Enfin, les frais lis aux diverses dpenses de linfrastructure et au cot de la documentation slvent environ 21954 euros. Au total, le cot de ma thse pendant ces trois annes revient 238167 euros (cf. tableau cidessous). Nature de la dpense
Ressources humaines Consommables Infrastructure Matriels (amortissements) Dplacements Formations Documentations

TOTAL

Montant (euros) 155810,13 47388,85 21651,47 3648,84 4683,16 4681,71 302,00 238166,16

Les sources de financements de ma thse proviennent exclusivement des fonds propres du Centre europen dtude du Diabte (laboratoire) qui est une structure but non lucratif. En 250

revanche, le CeeD est 100% actionnaire dune SAS (Socit par Action Simplifie), prestataire de service et dassistance pour le diabte (structure but lucratif) dont les bnfices sont intgralement reverss la recherche.

IV. La thse : quelles comptences, savoir-faire et qualits a-t-on dvelopp ou acquis ?

f) Dans le domaine dexpertise scientifique et technique
Lanalyse des rsultats obtenus lors de la thse est travail trs intressant car il ma permis de prendre du recul sur le projet lui-mme et davoir un avis plus critique sur les rsultats et perspectives. Par exemple, lobtention de plusieurs rsultats dexprimentations qui ne me semblaient pas pertinents voire mauvais se sont avrs tre cohrents au vu de la littrature scientifique. Ainsi le fait davoir un il et un esprit plus critique permet de mieux apprcier et juger des rsultats. Jai galement dvelopp quelques comptences dans lutilisation des tests statistiques avec notamment le logiciel SigmaStat et jai ainsi pu adapter des tests statistiques au nombre et aux types dchantillons. Enfin je voudrais souligner le domaine de lexpertise mdicale que je nai que ctoy car je ne suis pas de formation mdicale. En effet, la prsence de mdecins a permis de recentrer ltude dans des directions plus pertinentes que nous, en tant que scientifiques, ne pensions pas tudier. Par exemple, au CeeD jai eu la chance de ctoyer le service dEndocrinologie et de Diabtologie du Professeur M. Pinget et plus particulirement Mme le Professeur N. Jeandidier. Son expertise et sa connaissance des modles de diabte ont permis de nous orienter vers un modle dtude de diabte de type 2 chez le petit animal plus facile mettre en place et tout aussi intressant que le modle de diabte de type 1 que nous voulions tudier en premier lieu. Le problme du modle de type 1 dintrt est quil manque de reproductibilit et quil nest pas un vritable modle dinsulinodpendance. De plus lors de ltude in vivo, elle ma indiqu quil tait prfrable de prsenter des rsultats dune manire plutt quune autre (rapport Glycmie/C-peptide).

g) Connaissances acquises
De par mon exprience acquise lors de mes diffrents stages, jai su dvelopper une large connaissance dans le domaine du stress oxydant, la fois sur les bactries, sur des cellules musculaires et endothliales et maintenant sur des cellules insuline de rat. Cependant, le stress oxydant dans le diabte ne se limite pas cela, il saccompagne datteintes cardiovasculaires et jai

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ainsi pu me familiariser ltude de la ractivit des vaisseaux en cuve organes isols grce au Docteur S. Dal-Ros. Dune part, jai pu galement travailler sur le petit animal, en loccurrence le rat, pour ltude du modle de diabte de type . De par les travaux pratiques de pharmacologie et de toxicologie que jai effectu pendant mon DUT, jai pu mettre profit mes connaissances par exemple pour la prhension des animaux, la pose de cathters intraveineux et intrajugulaire, que japprciais particulirement. De plus, jai pu aider ma collgue la contention des rats lorsquelle faisait des injections. Jai acquis aussi une grande connaissance dans lanatomie viscrale des rats ainsi que dans le prlvement des diffrents organes dintrt. De plus, grce la formation Exprimentation Animale propose par lcole doctorale (ED 414, Sciences de la Vie), jai pu apprendre les notions dthique importantes concernant llevage et lutilisation danimaux dexprimentation. Jai pu galement apprendre la signification de certains comportements chez les rongeurs, et cela ma permis personnellement de me responsabiliser quand la surveillance et au bien-tre des animaux. Dautre part, jai dvelopp des connaissances approfondies dans le domaine de lhistologie, que je ne connaissais que peu auparavant. Jai t forme fixation des chantillons (paraformaldhyde et paraffine), la coupe des organes fixs ou congels par microtome ou cryostat, les colorations de base comme la coloration osine-hmatoxyline et lobservation des coupes sur de nombreux tissus, comme le foie ou le pancras. Jai galement appris faire de limmuno-marquage sur des coupes histologiques notamment celles de pancras pour lesquelles nous avons marqu spcifiquement les cellules produisant linsuline. Pour les tudes histologiques, jai eu recours lutilisation de lazote liquide. Lors de mon arrive, je me suis occupe des commandes et de la maintenance des niveaux en azote. Jai galement t forme la manipulation de ce liquide qui sans prcautions peut tre trs dangereux et entraner des lsions irrversibles. Au fur et mesure de la manipulation de ce produit, jai ainsi pu fortement diminuer mon aversion vis--vis de lazote liquide. Jai galement dvelopp et approfondi des comptences dans le domaine de la biologie molculaire au travers de lamplification dADN par PCR quantitative en temps relle (suivi en direct de lamplification des brins dADN) mais aussi au travers de techniques comme la PCR arrays qui permet de faire un screening de 84 gnes pour une condition exprimentale teste. De plus, jai t amene travailler dans le domaine de la chimie avec notamment M. le Professeur A Fougerousse, de la facult de chimie de Strasbourg. Grce son aide, jai pu mettre en place un dosage permettant de mesurer ltat rduit ou oxyd dchantillons sanguins de patients par la mesure du pH et dune constante rH. 252

Enfin, jai pu acqurir des connaissances dans un domaine que je ne connaissais pas : la cytomtrie en flux (CMF) ou cytomtrie capillaire. Grce lquipe du Docteur CD Muller et plus particulirement au Docteur J Peluso et Mlle C Gruber, jai appris connatre la technique de CMF, aussi bien sur les conditions de passage des chantillons, les prcautions prendre vis--vis de la maintenance de ces appareils fort onreux, mais aussi dun point de vue mthodologique o de nombreux contrles sont requis avant de procder au test dintrt.

h) Connaissances acquises dans la mthodologie et la conduite de projet

La conduite dun projet ncessite une certaine exprience. Tout au long de la thse, jai du prsenter mon travail la fois devant un public scientifique, notamment lors de congrs nationaux ou internationaux, mais aussi lors de rencontres avec les bnvoles de lassociation ou devant des lycens. Pour moi, le dfi le plus important pour un jeune chercheur est la vulgarisation scientifique. Une certaine rigueur et mthodologie sont requises pour pouvoir expliquer de manire simple mais pour autant prcise ce quest le diabte et le stress oxydant, dans le cas qui me concerne. Souvent lutilisation de schmas ou de photos permet dillustrer plus facilement les mthodes employes pour arriver nos rsultats. La formation professionnelle, Les Doctoriales, propose par lEcole doctorale est galement un trs bon exercice dans lapprentissage et llaboration dune mthodologie. De plus, pour moi, la prsentation du projet de thse devant des scientifiques doit suivre rigoureusement une mthodologie. En effet, chaque congrs, jai du envoyer des rsums des travaux selon un plan comprenant une introduction du sujet dans son contexte ainsi que le but de ltude, une partie courte, concise et prcise sur le matriel et les mthodes utiliss, puis une partie comprenant les rsultat qui est ensuite discute dans la conclusion. Chaque mthode utilise pour obtenir des rsultats dcoulait dune rflexion scientifique et logique, ce qui ma permis dobtenir le premier prix Poster au Congrs Vitagora Got Nutrition Sant, qui sest tenu Dijon le et 4 mars 2010. Le projet de thse lui-mme est bas sur une mthodologie prcise qui dcoule de la rflexion et de la logique. Par exemple, toutes les exprimentations ont commenc par des modles dtude in vitro, cela afin de pouvoir faire un screening de molcules avant de les passer sur un modle animal, plus coteux. De plus, chaque produit utilis lors des essais in vitro a fait lobjet dune validation, avant de passer aux tests suivants. Enfin, seuls les antioxydants ayant un rel potentiel ont t choisis pour tre administrs aux animaux.

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i) Mthode de travail et gestion du temps

Lors de ma thse jai t amen travailler en grande partie seule, je nai pas eu de problmes pour la gestion de mon temps ou de mes taches. Majoritairement les exprimentations taient planifies davance avec des temps de latence prvus en cas de reproduction dune ou de plusieurs manipulations. Je marrangeais pour commencer les expriences le plus tt possible dans la journe afin de pouvoir les interprter de suite. Concernant les mthodes de travail avec les collaborateurs (cytomtrie), chacune de mes visites la facult de Pharmacie tait prvue davance afin de ne pas perturber les activits de recherche des membres de cette quipe.

j) Savoir-faire administratifs organisationnels

Pour ma part, le savoir-faire organisationnel sest dvelopp avec le temps. Jai notamment organis des runions de collaboration avec lquipe de cytomtrie capillaire. Concernant le domaine administratif, je suis capable de remplir des bons de commande, de demander des offres de prix de kits de dosage ou de produits auprs des fournisseurs (tels que Tebu-bio ou Millipore). Jai galement fait appel plusieurs fois au service technique de chez Bio-Rad pour des soucis de calibrage dappareil PCR mais aussi pour des renseignements concernant des filtres de spectrophotomtre. Enfin jai galement eu recours au service technique de Millipore afin de rsoudre un problme li lutilisation dun kit de dosage des protines carbonyles.

k) Qualits personnelles
Dans le domaine de la recherche, il est parfois ncessaire davoir recours son imagination et de faire un peu de bricolage pour rsoudre certains problmes. Cela pour moi, fait appel la crativit et linventivit. Il mest arrive plusieurs fois, dtre confronte ce genre de situation. Lorsque jai effectu lamplification de gnes par la technique de PCR arrays, le protocole stipulait une tape de centrifugation des plaques. Cependant au laboratoire, nous ne disposions pas de support spcifique ces plaques dans la centrifugeuse. Jai alors trouv un moyen de les fixer (avec du scotch) sur un support non prvu cet effet. De plus, je suis extrmement rigoureuse, que ce soit dans les exprimentations mais aussi dans la tenue des pices du laboratoire dont je suis responsable, et jaime particulirement retrouver le matriel commun l o il doit tre ainsi que les stocks remplis. De mme quil est important pour moi de laisser une pice ou un matriel propre aprs utilisation, mais cela reflte plus du bon sens et du respect pour le travail des autres que de la rigueur.

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Cette rigueur se retrouve galement dans mon travail ou ma tenue du cahier de laboratoire. Lors du bilan de thse de deuxime anne organis la demande de lcole doctorale, jai su faire la synthse de tous les rsultats obtenus depuis environ 18 mois. Cela a t un gros travail, qui ma permis de prendre du recul sur la manire de conduire ma thse et de recadrer, le cas chant, les expriences ou de proposer de nouvelles stratgies dinvestigation. Le rsultat de ce comit fut largement positif et a t valid auprs de lcole doctorale. Au cours de ma thse, jai eu lopportunit dencadrer plusieurs tudiants de formations diverses. La premire fois, jai eu deux tudiants en mme temps et en plus de dcouvrir lencadrement, jai du faire face la gestion de ces deux personnes aussi bien dun point de vue exprimental (deux sujets diffrents avec des manipulations diffrentes) quhumain, avec des personnalits bien distinctes. Lors de cette exprience, jai pu comprendre ce qutait lencadrement au travers de la gestion du travail de ltudiant mais aussi du mien, car javais mes propres exprimentations mener en parallle. Cela demand un grand effort dorganisation au niveau exprimental et temporel. Cette riche exprience ma permis cette anne de reprendre une stagiaire qui va permettre de boucler en temps voulu ma thse. Enfin, jai particulirement su madapter au cadre dans lequel jai volu. En effet, jai eu loccasion et cela pendant plusieurs mois, de faire des exprimentations la Facult de Pharmacie avec le Docteur S. Dal-Ros, lors des tudes in vivo du modle de diabte de type 1. Toujours dans le mme lieu mais avec une quipe diffrente, jai su mintgrer lquipe de cytomtrie capillaire pour mener bien mes exprimentations dans ce domaine. Cela a impliqu, une certaine adaptabilit aux conditions et aux mthodes de travail parfois diffrentes de mon laboratoire, notamment en ce qui concerne la culture des cellules. Jai du emmener mon matriel et madapter ce nouvel environnement de travail. Toutes ces expriences mont permis dtablir des liens avec des chercheurs ou techniciens de laboratoire diffrents ou dentreprises de biotechnologie.

V. La thse : quels rsultats et impacts pour la recherche ?

Ce sujet tait au dpart un sujet nouveau qui devient de plus en plus intressant au vu des rsultats et dautant plus que le laboratoire a recrut une post-doctorante pour continuer la suite de mes travaux aprs mon dpart. Pour moi, ces travaux auront un impact pour la socit et plus particulirement pour les patients atteints de diabte. La finalit de mes rsultats tait de dmontrer la faisabilit dune supplmentation en molcules antioxydantes dorigine naturelle dans la prvention du diabte et donc dans la prvention des cellules produisant linsuline. A long terme, une telle supplmentation 255

pourrait diminuer la part de stress oxydant prsente dans cette pathologie et ainsi soulager le diabte. Enfin pour moi-mme, ce fut une riche exprience, bien quelle ne soit pas encore finie. Cela ma permis de dcouvrir un nouvel environnement de travail, de nouveaux collgues et surtout dapprendre de nouvelles techniques. Les rsultats obtenus au cours de la thse sont trs prometteurs mais comme il sagit dun sujet nouveau, plein dexpriences complmentaires restent faire.

VI. Aprs la thse : les pistes professionnelles

Savoir ce que lon peut faire aprs la thse reprsente un vritable challenge. Il sagit de bien identifier les comptences que lon a acquises et dveloppes au cours de ces trois annes. Cette formation a permis de me donner les moyens et les stratgies pour savoir se dfinir comme chercheur mais aussi savoir employer les mots justes devant des recruteurs ou des employeurs.

Piste n 1 : Charge de recherche pour un CHU Au cours de mes diverses enqutes professionnelles (entretiens avec de futurs recruteurs potentiels), jai t mise en relation avec mon ancien matre de stage de DUT, qui ma parl dun projet qui se menait sur les lymphocytes lunit de thrapie cellulaire du CHU de Nancy-Brabois. Suite cela jai contact le responsable du projet pour mieux connatre les tenants et les aboutissants de celui-ci. La situation est pour le moment en attente.

Piste n 2 : Post doctorat au CNRS galement sur un avenir court terme, jai la possibilit de faire un post-doctorat de 3 ans au CNRS de Cronenbourg (Strasbourg) sur le dveloppement dune insuline par voie orale. Le projet requiert un docteur ayant les comptences que jai acquises au cours de ma thse, comme lexprimentation animale, de bonnes connaissances en chimie dispenses par ma formation, mais aussi des capacits dencadrement. Le challenge pour moi serait de manager une quipe compose de technicien, ingnieur et tudiant en thse et de faire le lien entre les diffrentes tches qui incombent ces fonctions. La demande de financement de ce projet est en cours dvaluation et les rsultats devront tre connus ce mois-ci (juin 2010).

Piste n 3 : Enseignant-chercheur Dautre part, sur un plus long terme, je souhaiterais pouvoir faire des interventions dans des facults ou pouvoir faire de lenseignement dans les lyces ayant des formations techniques Sciences et Techniques de Laboratoire, spcialises en biologie gnie biologique. Ainsi pour 256

pouvoir toujours faire de la recherche, un poste de Matre de Confrences luniversit serait un bon compromis. Une des possibilits qui soffre moi est de passer les concours CNRS et INSERM, ce qui me permettrait galement de faire de lenseignement. La prochaine session pour dposer les candidatures est prvue en Janvier 2011.

Piste n 4 : Start Up Enfin, et lidal pour moi, serait de pouvoir dmarrer dans une petite start-up ayant pour but la recherche applique, o le dfi serait de monter des projets, des demandes de financements, pouvoir grer une quipe et sinvestir. Je me suis renseigne sur des structures qui pourraient requrir mes comptences. Je suis galement en contact avec un ancien du NCT qui travaille dans la socit Hartmann et qui pourra certainement maiguiller de manire un peu plus prcise dans cette voie.

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